CN111057761A - Charge综合征致病基因chd7突变检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CHARGE综合征致病基因CHD7突变检测试剂盒。试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。使用本发明所述试剂盒检测患者是否存在CHD7基因NM_017780:c.6756‑6757delAG突变，从而诊断CHARGE综合征发生的原因，该试剂盒将有利于临床上开展CHARGE综合征患者的CHD7基因突变筛查工作，为CHARGE综合征患者的诊断提供依据。

Description

CHARGE综合征致病基因CHD7突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及在临床诊断CHARGE综合征中应用的CHD7基因缺失突变(c.6756-6757delAG)的分型检测试剂盒。

背景技术

CHARGE综合征是一类累及多器官的罕见先天性缺陷，其表现具有高度多样性。CHARGE综合征的诊断主要依据临床症状，最早由Blake等提出，之后由Verloes修正，主要标准包括：1、眼畸形；2、后鼻孔闭锁；3、半规管发育不良；次要标准包括：1、颅神经及脑干病变；2、下丘脑一垂体功能异常；3、耳畸形及听力障碍；4、纵膈器官发育不良；5、智力低下。具备上述3个主要标准症状，或2个主要标准症状及2个次要标准症状，即为典型的CHARGE综合征；具备2个主要标准症状及1个次要标准症状，为部分型；具备2个主要标准症状，或1个主要标准症状及2个次要标准症状，为非典型。CH ARGE综合征发病率为1/8000到1/10000，30％的患者在五岁前死亡。

2004年Vissers等首次报道了CHD7基因在CHARGE综合征发病中的重要作用。目前CHD7是CHARGE综合征的主要致病基因，60％以上患者存在CHD7基因突变。其中无义突变占44％，移码突变占34％，剪接位点突变占11％，错义突变占8％，CHD7基因外显子缺失或包含CHD7在内的8ql2.1微缺失少于5％。由于大多数突变都会产生提前终止的截短蛋白，所以单倍剂量不足最有可能是其致病机制。人CHD7基因位于染色体8q12.1，基因组全长189kb，编码的CHD7蛋白由2997个氨基酸构成，相对分子质量约340kD。CHARGE综合征的典型畸形主要发生于胚胎发育的第4～9周，为视网膜发育、口咽膜破裂、心管形成、耳蜗形成的关键时期。胎儿胚胎发育早期，CHD7基因于神经管、未分化的神经上皮和神经嵴起源的间质中等多处组织器官中高度表达，之后只在眼、耳及嗅觉系统等处表达，这也是CHARGE综合征常见的畸形部位。CHD7基因突变被认为是儿童半规管未发育的主要原因。

CHARGE综合征的小鼠模型Whirligig小鼠(Chd7whi/+)，在CHD7的第11外显子发生杂合无义变异，Chd7whi/+小鼠胚胎表现有心血管缺陷、腭裂和鼻后孔缺陷等；成年Chd7whi/+小鼠表现有明显的转圈行为，可观察到体重显著低于对照组，干性角膜结膜炎、外阴发育异常及阴蒂异常等。由于CHD7基因的突变种类多样，每个位点变异后对蛋白的功能影响不同，患者的临床表型会出现差异。目前尚未见关于CHD7基因c.6756-6757delAG突变信息的报道。该位点的检测对于患者病因的明确具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CHARGE综合征致病基因CHD7突变检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含人CHD7基因第31号外显子NM_017780:c.6756-6757对应的碱基。

优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。

优选的，所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：

CHD7-F-1:5’-GCCAGATGATGGTAGGTACA-3’；

CHD7-R-1:5’-TTAGGTGCTATAAGGTGCGA-3’。

优选的，所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：

CHD7-F-2:5’-GAGAGGGTACTGGAACAAGC-3’；

CHD7-R-2:5’-GCTATAAGGTGCGAGAGCAA-3’。

利用上述试剂盒检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的方法，包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，以上述PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人CHD7基因第31号外显子NM_017780:c.6756-6757的碱基的缺失情况进行分型鉴定。

优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列(Gene ID:55636)进行比对，确定待测个体对应于人CHD7基因第31号外显子NM_017780:c.6756-6757的基因型或等位基因类型。

优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型AG/AG、突变杂合型AG/--或突变纯合型--/--，其中“--”表示缺失。

上述试剂盒在CHARGE综合征病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测来自于待测样本(患者的CHD7基因片段)中对应于人CHD7基因第31号外显子的碱基是否存在NM_017780:c.6756-6757delAG突变，从而判断该患者CHARGE综合征发生的遗传性原因。其中，CHD7基因发生c.6756-6757delAG突变，导致CHD7基因的开放阅读框发生移码，肽链的合成提前终止，无法形成功能正常的蛋白。

本发明的有益效果体现在：

本发明所提出的试剂盒可用于快速地检测CHD7基因特定突变位点，通过检测来自患者的DNA样本中是否存在CHD7基因c.6756-6757delAG突变，可以判断该患者的CHARGE综合征发生原因，进而为临床诊断提供依据。

本发明所提出的试剂盒在用于CHARGE综合征的诊断时：1)本发明将为在CHARGE综合征患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；2)通过产前诊断筛查，明确胎儿是否携带c.6756-6757delAG杂合突变，降低聋儿的出生率，为社会和家庭减轻负担。

附图说明

图1为CHD7基因编码区氨基酸的保守性分析：突变位于CHD7基因第31号外显子NM_017780:c.6756-6757，用方框圈起来的是影响到的氨基酸。

图2为PCR反应流程图：示出了反应条件(反应温度和时间)，其中↓表示每个循环降低0.5℃。

图3A为待测个体CHD7基因测序结果图：示出了突变杂合型序列，箭头所指为突变位点位置。

图3B为待测个体CHD7基因测序结果图：示出了野生型序列，箭头所指为突变位点位置。

图4为扩增产物的电泳图谱：泳道1为Marker，泳道2为扩增的目标序列(987bp)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，以下实施例用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明应用二代测序对CHARGE综合征患者及其家属进行候选基因筛查，发现某CHARGE综合征患者CHD7基因发生的自发突变NM_017780:c.6756-6757delAG。该患者的全身检查结果是：智力运动发育落后、双侧感音神经性耳聋、双侧前庭、半规管畸形发育、左眼脉络膜缺损、左侧视神经发育不良、大血管环及动脉导管未闭、双侧额颞部蛛网膜下腔稍宽。患者的基因型是c.6756-6757delAG杂合突变(AG/--)，父母未携带致病突变，CHD7基因突变与CHARGE综合征表型共分离。CHD7基因突变相关的CHARGE综合征以常染色体显性遗传的方式传递。目前已经报道的与CHARGE综合征相关的突变有很多种，尚无c.6756-6757delAG突变的报道。CHD7基因c.6756-6757delAG突变发生后，会引起CHARGE综合征，而且患者之间表征差异较小。CHD7基因c.6756-6757delAG突变对于CHARGE综合征患者病因的明确具有重要的临床意义。

上述突变(NM_017780:c.6756-6757delAG)使位于CHD7基因第31号外显子的碱基发生了改变，开放阅读框发生移码，肽链的合成提前终止，无法形成功能正常的蛋白。该位点在各个物种之间是高度保守的(图1)。

上述突变(NM_017780:c.6756-6757delAG)可采用多种检测突变的方法来进行，例如PCR(聚合酶链反应)-测序法、标记的CHD7基因DNA探针杂交法、限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。其中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：

1)采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组DNA；

2)以该DNA为模板，以针对CHD7基因第31号外显子设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；

3)将得到的PCR扩增产物进行目标片段测序分析，将测序所得到的序列与CHD7基因参考序列(Gene ID:55636)进行比较，确定待测个体CHD7基因是否存在c.6756-6757delAG突变；

4)根据以上结果判断待测个体是否为CHD7基因突变c.6756-6757delAG导致的CHARGE综合征。

在上述步骤2)中使用的PCR引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计：通常为15～30个碱基，GC含量为45～50％，在适当的温度下与末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。

上述步骤2)所得到的PCR反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的CHD7核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。

根据检测方法的不同，用于检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂盒中，除了包括PCR反应试剂，还包括检测PCR扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。

试剂盒容器内装有用以检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于PCR反应试剂，例如，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。

实例1

通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用蛋白酶降解法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primer5.0设计引物(引物扩增目标序列包含人CHD7基因第31号外显子，引物设计参考Gene ID:55636，扩增目标片段大小为987bp)，以基因组DNA为模板，BIORAD My Cycle热循环仪上进行PCR扩增。测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3730DNA测序仪。测序得到的序列与Genbank中的序列(Gene ID:55636)比较，确定CHD7基因c.6756-6757delAG突变。具体如下：

(一)待测血样提取与CHD7基因编码区的PCR扩增

1、待测对象血样DNA的制备

1.1研究对象

对100例耳聋患者及100例正常对照按照下述方法进行CHD7基因的突变检测。

其中，正常对照是无CHARGE综合征家族史的身体健康受试者，对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5～10mL，采集时间是2019年1月。

1.2基因组DNA提取

1.2.1实验前准备及重要注意事项

(1)向蛋白酶K中加入制定用量的Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K(蛋白酶K)勿长时间室温存放，避免反复冻融，以免影响其活性。

(2)所有离心操作均在室温下完成。

(3)血样样品的储存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存最多10天，对于某些实验例如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，将血液样品在2～8℃储存不超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。

1.2.2操作步骤

1)低速离心至血样分层，用移液枪去除上层血清，注意不要吸取或损坏中间层的黄膜层。

2)将全部血细胞转移至5mL离心管中，加入红细胞裂解液至总体积为4mL，上下颠倒混匀20次至沉淀充分分散。

3)6500g离心10min，弃去上清。

4)加入3mL Buffer FG1，涡漩振荡15s，使沉淀充分分散。

5)6500g离心10min，弃去上清，将离心管倒扣在干净的吸水纸上，吸干水分。

6)配制DNA提取液与蛋白酶K的混合液，混合比例为DNA提取液:蛋白酶K＝100:1，混合后涡漩振荡15s充分混匀，按需配制，现配现用。

7)向样品中加入配制好的DNA提取液与蛋白酶K的混合液1mL，立即充分涡漩振荡1min，直至溶液无团块。

8)将样品置于65℃水浴锅中温育15min，其间颠倒混匀3次，至样品颜色从红色变成淡绿色，说明蛋白完全消化。

9)向样品中加入2mL异丙醇，颠倒混匀10次至可见白色絮状沉淀。

10)取干净无菌的1.5mL离心管，做好标记，加入500μL预冷的75％乙醇。

11)用干净无菌的1mL移液器tip头挑取步骤9)中的白色絮状沉淀转移至步骤10)中准备好的75％乙醇中，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，注意不要倒掉白色絮状沉淀。

11)再次加入500μL预冷的75％乙醇，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，吸干。

12)打开管盖，室温干燥15min，至所有液体完全挥发。

13)加入380μL DNA溶解液，置于65℃水浴/金属浴中温育2h，同时进行振荡使DNA充分溶解。

14)分光光度计定量及检测纯度。

15)-20℃保存DNA。

2、CHD7基因编码区的PCR扩增

2.1引物序列

使用Primer5引物设计软件，参考序列(Gene ID:55636)，序列合成后用于此检测，设计完成时间为2019年2月：

上游引物CHD7-F-1:5’-GCCAGATGATGGTAGGTACA-3’；

下游引物CHD7-R-1:5’-TTAGGTGCTATAAGGTGCGA-3’。

使用该引物进行PCR扩增所获得的片段大小为987bp。

2.2PCR反应体系的建立(表1)

表1.CHD7基因的PCR反应体系

其中，PCR扩增使用天根公司PCR Mix。

反应条件：PCR反应在BIORAD My Cycle热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示：

1)94℃预变性4分钟；

2)94℃变性30秒，61℃(起始退火温度，后每个循环降低0.5℃)退火30秒，72℃延伸40秒，12个循环；

3)再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30个循环；

4)反应结束后再72℃延伸5分钟，4℃保存。

PCR产物电泳流程：

1)配胶(1％琼脂糖)：称取0.4g琼脂糖，悬浮于40mL×TAE中(500mL锥形瓶)。

2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。

3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μL，10mg/mL)，摇匀。

4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250mL胶液全部倒入平板，插入梳尺。

5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TAE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

6)加样：用移液器按规定格式加样，最后加入MarkerDL2000。

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相。经过电泳后，有6条带可见，MarkerDL2000(TaKaRa)片段长度分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，DL2000的总浓度是300ng/5μL。电泳时取5μL DL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取5μL(PCR产物)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的大小及含量(参见图4)。

(二)CHD7基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量

PCR扩增产物的纯化(96孔板法)：

1)PCR扩增产物电泳结束后，在长波365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔号中。

2)4000rpm离心1min，加入500ul溶胶液，盖上封口膜，65℃水浴15min，定时。

3)检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μL混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600～800rpm震荡5min。

4)将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

5)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μL 8道电动移液器向每孔移入500μL洗液，盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

6)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μL 8道电动移液器向每孔移取500μL 70％乙醇盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

7)弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm水平震荡5min。

8)离心至1000rpm，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min。

9)2μL样品与6μL 1.4X溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，按照A01-H01的竖向顺序横向点入，中间空出2孔，分别加入1μL、2μL量的DL2000，300V电泳11min。

10)将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像，图像必须保证marker条带清晰。

11)对照纯化前后胶图，根据PCR定量标准在PCR记录表上标注每孔扩增产物纯化后所得测序模板的浓度并稀释至指定浓度，对回收后电泳无条带的样品按照4μL样品+5μL1.4X溴酚蓝再次电泳鉴定。

12)将稀释后上述模板离心2min，离心至4000rpm，标记Lims系统模板状态，确认提交前需要再次核对上述模板状态，确认无误后将上述模板4℃冰箱保存。

(三)纯化的CHD7基因PCR扩增产物的直接测序

1、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求见表2。

DNA纯度：OD260/OD280＝1.6～2.0。

DNA浓度：PCR产物10ng/μL。

表2.DNA用量

PCR产物长度(bp)	测序反应加入模板量(ng)
		100～200	1～3
200～500	3～10
		500～1000	5～20
1000～2000	10～40
		>2000	40～100

2、测序反应

1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如96孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

3)目前的反应体系为5μL，各种试剂加入量如表3所示。

表3.CHD7基因PCR扩增产物的测序反应体系

其中，BDT为美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的荧光染料。5×GCbuffer是美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的缓冲液。

4)样品放于PCR仪(热循环仪)上，所作反应的过程见表4。

表4.CHD7基因PCR扩增产物的测序反应过程

5)反应完的样品要及时从PCR仪(热循环仪)上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

3、测序反应物的纯化和测序

1)向每孔中加入20μL 80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；

2)在每孔中加入30μL 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

3)重复步骤2)再两次；

4)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

5)加入5μL甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

6)上机前95℃变性5min，放置冰上2min，离心后上ABI 3730测序仪。

测序结果如图3A、图3B所示。100例患者中，1例CHARGE综合征患者的CHD7基因检测发现为c.6756-6757delAG杂合突变。对100名听力正常者(正常对照)的筛查中未发现c.6756-6757delAG突变。

(四)检测耳聋相关基因CHD7突变位点(c.6756-6757delAG)试剂盒及其应用

1、试剂盒的组成

(1)扩增用引物：

上游引物CHD7-F-1:5’-GCCAGATGATGGTAGGTACA-3’；

下游引物CHD7-R-1:5’-TTAGGTGCTATAAGGTGCGA-3’；

(2)PCR扩增用PCR Mix 2×

(4)dNTP 2.5mM

(5)Big-Dye mix(美国应用生物系统公司(ABI)生产)

2、使用方法

1)PCR扩增

用软件Primer 5.0针对CHD7基因的第31号外显子设计PCR引物，反应条件见图2。

2)PCR产物纯化

PCR产物电泳，凝胶纯化及电泳定量。

3)测序反应及验证

以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在BIORAD My Cycle热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABI 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与正常序列(Gene ID:55636)比较，以确定突变是否存在。

实例2

扩增引物(设计完成时间2019年2月)如下，其他同实例1(以下引物扩增的目标序列包含人CHD7基因第31号外显子，引物设计参考Gene ID:55636)：

上游引物CHD7-F-2:5’-GAGAGGGTACTGGAACAAGC-3’；

下游引物CHD7-R-2:5’-GCTATAAGGTGCGAGAGCAA-3’。

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> CHARGE综合征致病基因CHD7突变检测试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gccagatga tggtaggtaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttaggtgcta taaggtgcga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gagagggtac tggaacaagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gctataaggt gcgagagcaa 20

Claims (9)

1.一种用于检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含CHD7基因NM_017780:c.6756-6757对应的碱基。

2.根据权利要求1所述一种用于检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。

3.根据权利要求1所述一种用于检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。

4.根据权利要求1所述一种用于检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：

CHD7-F-1:5’-GCCAGATGATGGTAGGTACA-3’；

CHD7-R-1:5’-TTAGGTGCTATAAGGTGCGA-3’。

5.根据权利要求1所述一种用于检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：

CHD7-F-2:5’-GAGAGGGTACTGGAACAAGC-3’；

CHD7-R-2:5’-GCTATAAGGTGCGAGAGCAA-3’。

6.一种检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于CHD7基因NM_017780:c.6756-6757的碱基进行分型鉴定。

7.根据权利要求6所述一种检测CHD7基因c.6756-6757delAG突变的方法，其特征在于：所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列进行比对，确定待测个体对应于CHD7基因NM_017780:c.6756-6757的基因型或等位基因类型。

8.根据权利要求7所述一种检测CHD7基因NM_017780:c.6756-6757delAG突变的方法，其特征在于：根据比对确定的基因型包括野生纯合型AG/AG、突变杂合型AG/--或突变纯合型--/--。

9.一种如权利要求1所述的试剂盒在CHARGE综合征病因学分析中的应用。

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