CN111607641B - 致先天性膜性白内障的新基因突变位点的分子标记及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疾病相关突变基因领域，公开了一种致先天性膜性白内障的新基因突变位点、检测方法及应用，具体涉及LIM2的基因突变c.388C>T(p.R130C)，以及首次发现的该基因常染色体显性遗传的遗传方式，同时公开了这种先天性膜性白内障致病基因LIM2突变检测试剂盒。本发明所述试剂盒检测患者是否存在LIM2基因c.388C>T突变，从而提供了一种有效的进行先天性白内障基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，该试剂盒将有利于在临床上通过产前诊断筛查及新生儿LIM2基因突变的普遍筛查，对诊断先天性膜性白内障患儿早期进行手术和训练康复干预，降低不可逆性的终身视力低下；也为预防性生育后筛查提供依据。

Description

致先天性膜性白内障的新基因突变位点的分子标记及其试 剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种致先天性膜性白内障的新基因突变位点的分子标记及其试剂盒。

背景技术

先天性白内障(congenital cataract,CC)是指出生前即存在、或出生后逐渐形成的在出生后一年内发生的晶体部分或全部混浊。CC在全球的发病率为1～15/10,000，占儿童致盲眼病的第2位。CC由于在胚胎期晶状体代谢异常而导致其自身透明度下降，任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。

在已发现导致先天性白内障的100多种基因异常中，有39个与仅表现导致单纯白内障相关。而在这39个基因异常中，有一半以上基因突变位于编码晶状体蛋白相关的位点，15％位于缝隙连接蛋白相关位点，分别有5％位于中间丝和水通道蛋白相关位点，其余的10％位于其他基因位点。

遗传性白内障在先天性白内障中约占8.3％-25％的比例。其遗传方式包括常染色体显性遗传，常染色体隐性遗传和X连锁遗传三种。先天性白内障的临床表型复杂多样，根据晶状体混浊的部位和形态，大致可分为前极性、后极性、皮质性、绕核性、核性、麓状、粉尘状、多形态和全白内障等十余种。

膜性白内障最早报道于1833年，是一种以晶状体扁平，几乎没有纤维细胞为特征的，造成婴幼儿视轴区屈光介质严重混浊，从而导致早期视觉剥夺以及可发生终身不可逆性视力低下的先天性白内障类型。关于膜性白内障相关的单基因突变的报道很少。据我们所知，在一个中国家系中位于CRYBB2第6外显子上的c:465G>C的突变和一个在两个巴基斯坦近亲家系中发现的位于1p34.3-p32.2染色体上的突变与膜性白内障相关。

LIM2基因(Chromosome 19q13.41,GenBank accession number,NM_001161748.1)位于第19号染色体长臂上13区41带，约包含3万9千个碱基，具有5个外显子结构，负责编码一种晶状体纤维细胞的特有膜蛋白MP20(integral membrane protein 20)。

LIM基因编码的MP20蛋白是第二大晶状体膜蛋白，是pfam00822家族蛋白成员之一，由173个氨基酸构成，由四个螺旋状跨膜片段，一个胞内闭环、两个胞外环和胞内的氨基和羧基端组成，其与缝隙连接蛋白构成成熟晶状体纤维细胞中最重要的细胞间物质沟通及离子传递的通道。

在对LIM2基因突变的动物模型和先天性白内障家系的研究中发现：经四乙亚基硝基脲诱导的To3白内障小鼠MP20的氨基酸改变位于第一跨膜段、三个LIM2基因突变的先天性白内障家系的氨基酸改变均位于穿梭跨膜段，Aca47白内障小鼠的MP20氨基酸改变位于第一胞外段。

而本发明报道的LIM2突变造成的氨基酸改变位于MP20的第二胞外环上。通过全外显子组基因测序发现：此突变是位于LIM2第4个外显子区域的第388位碱基由胞嘧啶转换为胸腺嘧啶,该突变导致MP20蛋白的130位氨基酸由精氨酸转变为半胱氨酸(p.R130C)。而该突变在家系正常人及阴性对照人群中均未发现。

国外学者在两个中东先天性白内障家系和一个南亚先天性白内障家系中发现了LIM2基因异常，均为常染色体隐性遗传。此突变来源家系患病成员自幼年即出现双眼晶状体核部混浊同时晶状体变薄、甚至呈膜状，伴有眼球震颤和不同程度的近视改变，遗传方式亦不同于既往发现已知的三个LIM2相关突变，为常染色体显性遗传方式。

全外显子组测序(WES，whole-exome sequencing)是利用序列捕获技术，将全外显子区域DNA捕捉并富集后，进行高通量测序的基因分析方法。与传统的连锁分析、候选基因关联分析技术相比，外显子组测序技术针对基因组内编码蛋白质的外显子区域，目标集中，测序深度和精度更高，且能弥补其不能有效检测稀有变异的缺陷且能获得更精确的基因定位。正因其一系列的优点自其2008年发明以来，WES在遗传性疾病筛查方面应用日趋广泛。在眼科疾病的基因病变筛查领域也自2010年以后有诸多报道。

由于已报道人类家系中先天性白内障相关的LIM2基因突变在不同种族间呈现出明显的多样性，不同地域、种族的优势等位基因有所不同，所以发现不同地域人种各自所特有的突变位点显得尤为重要。目前，尚缺乏此类针对东亚人群的LIM2基因突变位点的报道。

确定新的先天性膜性白内障相关基因的致病突变，对开展先天性白内障的分子诊断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了对先天性膜性白内障相关LIM2基因突变进行检测，从而提供了一种致先天性膜性白内障的新基因突变位点的分子标记及其试剂盒。

本发明通过采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族的先天性膜性白内障患病家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现的LIM2基因(参考序列基因ID：3982)上的c.388C>T(p.R130C)常染色体显性遗传方式突变与先天性膜性白内障有关，并通过共分离实验等方法验证了这一变异，扩大了对LIM2相关突变遗传方式的认识，也拓展了对先天性膜性白内障发病机制的研究方向，更有可能为CC患者治疗提供全新的理论依据，为开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。

因此，本发明涉及先天性白内障基因的突变，具体为:LIM2基因的c.388C>T(p.R130C)。

在第一方面，本发明涉及先天性白内障的生物标记物，即LIM2的突变，所述生物标记物是具有如下的突变LIM2基因或MP20蛋白:c.388C>T(p.R130C)。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种致先天性膜性白内障的新基因突变位点，该突变基因位点为LIM2基因cDNA编码区的388位单核苷酸：c.388C>T。

一种检测致先天性膜性白内障的新基因突变位点的试剂盒，所述试剂盒用于检测此LIM2基因突变；

该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含LIM2基因编码区第388位所对应的碱基。

进一步的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。

进一步的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。

进一步的，所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：

LIM2-F1:5’-CAGAGACAATGGCCAATTAC-3’

LIM2-R1:5’-GAGCCCAACACCCTACTCTC-3’

进一步的，所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：

LIM2-F2:5’-AGACAGCATCGCATACTGGA-3’

LIM2-R2:5’-AATCCCTGCGAAGAACGTCA-3’

一种致先天性膜性白内障的新基因突变位点的检测方法，其用于检测LIM2基因c.388C>T突变；包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于LIM2基因编码区第388位的碱基进行分型鉴定。

进一步的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列进行比对，确定待测个体对应于LIM2基因编码区第388位的基因型或等位基因类型。

进一步的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型C/C、突变杂合型C/T或纯合突变型T/T。

该试剂盒在先天性膜性白内障病因学分析以及相关治疗中的应用。

与现有技术相比，本发明所具有的优点和有益效果是：

本发明涉及致先天性膜性白内障的新基因突变位点，即LIM2的突变，所述基因突变位点具有如下的突变LIM2基因或MP20蛋白:c.388C>T(p.R130C)。

本发明涉及致先天性膜性白内障的新基因突变位点的试剂盒，使用该试剂盒并通过检测待测样本(来自于患者的LIM2基因片段)中对应于人LIM2基因(参考序列基因ID:3982)编码区第388位是否存在c.388C>T突变，从而判断该患者先天性膜性白内障发生的遗传性原因。其中，LIM2基因的c.388C>T突变引起位于MP20蛋白第二胞膜外段第130位由精氨酸转变为半胱氨酸(p.R130C)。

本发明所提出的试剂盒可用于快速地检测LIM2基因特定突变位点，通过检测来自患者的DNA样本中是否存在LIM2基因c.388C>T突变，可以判断该患者的先天性膜性白内障发生原因，进而为临床诊断提供依据。

本发明涉及致先天性膜性白内障的新基因突变位点的试剂盒，该试剂盒将有助于快速、高效地在更大范围的先天性膜性白内障患者人群中进行突变位点的检测，为先天性膜性白内障开展早期临床干预提供重要的指导。

本发明将为在先天性膜性白内障患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；同时，可以通过产前诊断筛查及新生儿LIM2基因突变的普遍筛查，对诊断先天性膜性白内障患儿早期进行手术和训练康复干预，降低因干预过迟造成的不可逆性的终身视力低下，为社会和家庭减轻负担。

本发明通过采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族的先天性膜性白内障患病家系进行了全部外显子区域的高通量测序，发现常染色体显性遗传方式的c.388C>T突变(同源氨基酸序列的进化研究结果表明，该突变位点具有高度保守性，100名正常人的筛查中未检测到该突变，说明这一突变与先天性膜性白内障相关)，进而提供检测LIM2基因c.388C>T突变的试剂盒。

本发明提供了一种有效的进行先天性白内障基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，该试剂盒将有利于在临床上通过产前诊断筛查及新生儿LIM2基因突变的普遍筛查，对诊断先天性膜性白内障患儿早期进行手术和训练康复干预，降低不可逆性的终身视力低下；也为预防性生育后筛查提供依据。

附图说明

图1为该患病家系的先天性膜性白内障临床表型。

图2为先天性膜性白内障家系图。空白圆形：正常女性；空白方形：正常男性；实心圆形：女性患者；实心方形：男性患者；实心带斜线：已过世患者；箭头所指为家系内先证者。

图3为LIM2基因编码区核苷酸与氨基酸的对照：位于LIM2第4个外显子区域的第388位碱基由胞嘧啶转换为胸腺嘧啶,该突变导致MP20蛋白的130位氨基酸由精氨酸转变为半胱氨酸(p.R130C)。

图4为PCR反应过程示意图：示出了反应温度和时间，↓表示每个循环降低0.5℃。

图5A为LIM2基因测序结果图：杂合突变序列(患者序列，CT)，红格表示突变位点位置。

图5B为LIM2基因测序结果图：野生型序列(CC)，兰格表示突变位点位置。

图5C为LIM2基因突变型与野生型的碱基及编码氨基酸对比。

图6为突变位点处氨基酸物种保守性分析：突变位点为红框所标识位置。

图7为PCR扩增产物的电泳图谱：中央泳道为Marker，1-8及9-13泳道为13个抽血提取的DNA样本扩增的目标序列。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，以下实施例用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

LIM2基因突变相关的先天性膜性白内障以常染色体显性遗传的方式传递。本发明应用WES的方法对我国一四代先天性膜性白内障家系进行筛查，发现LIM2基因存在c.388C>T杂合突变，导致先天性膜性白内障。目前报道的人类白内障LIM2基因突变有3余种，尚无c.388C>T突变的报道。

参见图3，上述突变(c.388C>T)位于LIM2基因编码区的第388位碱基发生由C到T的转换(MP20蛋白第二跨膜区，野生型LIM2基因的标准序列可以参考，ID:3982)，使得第130位精氨酸转变为半胱氨酸(p.R130C)。参见图6，该位点在各个物种之间是高度保守的。

检测上述突变(c.388C>T)可采用多种检测点突变的方法来进行，例如PCR(聚合酶链反应)测序法、标记的LIM2基因DNA探针杂交法、限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。其中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：

1.采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组DNA；

2.以该DNA为模板，以针对LIM2基因编码区第388位碱基附近设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；

3.将得到的PCR扩增产物进行直接测序分析，将测序所得到的序列与LIM2正常基因的序列(基因ID:3982)进行比较，确定待测个体LIM2基因是否存在c.388C>T突变；

4.根据以上结果判断待测个体是否为LIM2基因突变c.388C>T导致的先天性膜性白内障。

在上述步骤2中使用的PCR引物可以依据已知的基因核苷酸序列设计：通常为15～30个碱基，GC含量为45～50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。

上述步骤2所得到的PCR反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的LIM2核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。

根据检测方法的不同，用于检测LIM2基因c.388C>T突变的试剂盒中，除了包括PCR反应试剂，还包括检测PCR扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。

试剂盒容器内装有用以检测LIM2基因c.388C>T突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于PCR反应试剂，例如，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。

实施例1

本实施例采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族常染色体显性遗传的先天性白内障患病家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现LIM2基因上的c.388C>T(p.R130C)突变与先天性膜性白内障有关，并通过共分离实验等方法验证了这一变异。具体如下：

1.样本采集

先天性白内障家系包含26个成员，其中先天性白内障患者11名(图1)。在家系中选取8位先天性白内障患者和5位正常对照作为外显子测序样本(表1)。

表1.先天性白内障家系样本基本情况表

家庭成员	性别	年龄	裸眼视力右/左	晶状体混浊情况
					Ⅱ:1	M	56	20/20；20/20	透明
Ⅱ:2	F	59	20/100；20/63	膜性白内障
					Ⅱ:3	F	54	LP/LP	膜性白内障
Ⅱ:5	M	51	20/667；20/800	膜性白内障
					Ⅱ:6	F	49	CF/30cm/HM/20cm	膜性白内障
Ⅱ:7	M	50	20/25；20/20	透明
					Ⅲ:6	M	23	20/500；HM/20cm	膜性白内障
Ⅲ:7	F	25	20/20；20/20	透明
					Ⅲ:9	F	29	20/160；20/400	膜性白内障
Ⅲ:11	F	26	20/63；20/50	膜性白内障
					Ⅲ:12	M	27	20/12.5；20/12.5	透明
Ⅳ:3	M	6	20/800；20/250	膜性白内障
					Ⅳ:5	F	3	20/40；20/50	透明

2.实验技术流程

1)DNA提取：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取第一个家系成员外周静脉血8ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。

加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2)外显子捕获与测序：

全外显子组测序是一种新型的基因组分析技术,只需针对全基因外显子区域的DNA即可，取该家系中3名患者的基因组DNA，由北京安诺基因科技有限公司应用NimbleGen(44Mb)target enrichment system收集人类基因组的外显子区域，应用Illumina GenomeAnalyzer II平台对富集的外显子文库进行Illumina GA高通量测序，共捕获了99.5％目的基因。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的protocol进行测序，测序平台为IlluminaHiseq2000，读取长度为90bp，样本的平均测序深度为100×。

将这些突变数据经过基因共分离后，进行数据库过滤：Exome AggregationConsortium(ExAC,http://exac.broadinstitute.org),千人基因库(http://www.internationalgenome.org)以及Exome Sequencing Project(ESP,https://esp.gs.washington.edu/drupal))，再通过突变基因数据库(whole-exome SIFT,PolyPhen2 HDIV,PolyPhen2 HVAR scores from dbNSFP version 3.0a)有害性预测，得到一个候选位于外显子区域非同义单核苷酸突变LIM2(c.388C>T)。

实施例2

作为对实施例1的进一步验证，提供了如下的实施例。应用Sanger直接测序法在该家系内进行突变验证，证实其与表型共分离，以常染色体显性遗传方式传递；同时，与100例正常当地人群外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。

1.直接测序法验证该家系内患者LIM2基因的突变

1)PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

表1.LIM2基因的PCR反应体系

其中，PCR扩增使用天根生化科技有限公司PCR Mix(Taq酶、缓冲液、dNTP)。

反应条件：PCR反应在BIORAD My Cycle热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图4所示：

①94℃预变性4分钟；

②94℃变性30秒，61℃(起始退火温度，后每个循环降低0.5℃)退火30秒，72℃延伸40秒，12个循环；

③再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30个循环；

④反应结束后再72℃延伸5分钟，4℃保存。

2)PCR产物电泳流程：

①配胶(1％琼脂糖)：称取0.4g琼脂糖，悬浮于40mL×TAE中(500mL锥形瓶)。

②溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。

③凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μL，10mg/mL),摇匀。

④铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。

⑤上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TAE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

⑥加样：用移液器按规定格式加样，最后加入Marker DL2000。

⑦走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

⑧定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5cm至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相。经过电泳后，有6条带可见，Marker DL2000(TaKaRa)片段长度分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。取5μL DL2000和5μL PCR产物进行电泳。根据PCR产物电泳后的条带位置与DL2000条带位置的比较，判断PCR产物的大小，参见图7。

3)LIM2基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量

PCR扩增产物的纯化(96孔板法)：

①PCR扩增产物电泳结束后，在长波365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔号中。

②4000rpm离心1min，加入500μL溶胶液，盖上封口膜，65℃水浴15min。

③检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μL混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600～800rpm震荡5min。

④将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

⑤弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μL 8道电动移液器向每孔移入500μL洗液，盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

⑥弃废液，重复步骤⑤。

⑦弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm水平震荡5min。

⑧离心至1000rpm，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min。

⑨2μL样品加6μL 1.4X溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，marker DL2000取5μL，300V电泳11min。

⑩将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像，图像必须保证marker条带清晰。DL2000的总浓度是300ng/5μL，经过电泳后，根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR纯化产物的含量。

4)纯化的LIM2基因编码区PCR扩增产物的直接测序

①纯化的PCR扩增片段的纯度与用量要求

DNA纯度：OD260/OD280＝1.8～2.0。

DNA浓度：PCR产物10ng/μL。

DNA用量与PCR产物长度对应关系如表2所示：

表2.DNA用量

PCR产物长度(bp)	测序加入量(ng)
		100～200	1～3
200～500	3～10
		500～1000	5～20
1000～2000	10～40
		>2000	40～100

②测序反应

i.测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如96孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

ii.为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

iii.目前的反应体系为5μL，各种试剂加入量如表3所示。

表3.LIM2基因PCR扩增产物的测序反应体系

其中，BDT为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。iv.样品放于BIORAD My Cycle热循环仪上，所作反应的过程见表4。

表4.LIM2基因PCR扩增产物的测序反应过程

v.反应完的样品要及时从PCR仪(热循环仪)上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

③测序反应物的纯化和测序

i.向每孔中加入20μL 80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；

ii.在每孔中加入30μL 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

iii.重复步骤2)再两次；

iv.将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

v.加入5μL甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

vi.上机前95℃变性5min，放置冰上2min，离心后上ABI3730测序仪。

测序结果如图5A、图5B所示；图5C为LIM2基因突变型与野生型的碱基及编码氨基酸对比。

实施例3

检测CC相关基因LIM2突变位点(c.388C>T)试剂盒及其应用

1.试剂盒的组成

1)试剂盒1：检测突变LIM2基因的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是LIM2基因的突变c.388C>T或MP20蛋白的突变p.R130C，其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA编码区序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置。所述检测突变LIM2基因的试剂盒包括如下引物：

扩增用引物p1：

LIM2-F1:5’-CAGAGACAATGGCCAATTAC-3’

LIM2-R1:5’-GAGCCCAACACCCTACTCTC-3’

扩增用引物p2：

LIM2-F2:5’-AGACAGCATCGCATACTGGA-3’

LIM2-R2:5’-AATCCCTGCGAAGAACGTCA-3’

试剂盒2：检测突变LIM2基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是LIM2基因的突变c.388C>T，所述探针与突变LIM2基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA编码区序列上的区域互补：LIM2基因cDNA编码区序列第388位。

利用上述试剂盒1检测突变LIM2基因的具体步骤为：按照实施例2的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述LIM2基因的外显子特异性引物进行PCR反应，反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后基于测序序列是否具有c.388C>T突变，有效地检测本发明的LIM2基因突变的生物标志物在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患先天性白内障。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 致先天性膜性白内障的新基因突变位点的分子标记及其试剂盒

<130> 2022

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgtacagct tcatgggtgg tggcctgttc tgtgcctggg tggggaccat cctcctggtg 60

gtggccatgg caacagacca ctggatgcag taccggctgt cagggtcctt cgcccaccag 120

ggcctgtggc ggtactgcct gggcaacaag tgctacctgc agacagacag catcgcatac 180

tggaatgcca cccgggcctt catgatcctg tctgccctat gcgccatctc cggcatcatc 240

atgggcatca tggccttcgc tcatcagcct accttctccc gcatctcccg gcccttctct 300

gctggcatca tgtttttttc ctcaaccctt ttcgtcgtgt tggccttggc catctacact 360

ggagtcaccg tcagcttcct gggccgccgc tttggggact ggcgcttttc ctggtcctac 420

atcctgggct gggtggcagt gctcatgacg ttcttcgcag ggattttcta catgtgcgcc 480

taccgggtgc atgaatgccg gcgcctgtct acaccccgct ga 550

Claims (1)

1.一种致先天性膜性白内障的新基因突变位点的分子标记，该突变基因位点为LIM2基因cDNA编码区的388位单核苷酸：c.388C>T；该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基础上发生的突变，核苷酸序列第388位碱基由C突变为T。

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