CN115806989B - 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用。sgRNA为可以对突变的5号外显子进行删除的两个sgRNA，或可以对突变的5号外显子进行切割的单个sgRNA。载体为将sgRNA克隆至质粒上，然后包装为病毒。本发明针对这5号外显子的突变情况，对突变的5号外显子进行删除或进行原位切割，通过AAV局部递送CRISPR系统，使dystrophin蛋白能恢复表达；为5号外显子突变的杜氏肌营养不良症患者提供了特异性的靶序列，具有较高的打靶效率，从而纠正dystrophin mRNA的阅读框，恢复dystrophin蛋白的部分表达，为实现基因编辑个性化治疗提供可能。

Description

针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用。

背景技术

杜氏肌营养不良症(DMD)是一种X染色体连锁隐性单基因遗传的肌肉疾病，新生男婴发病率为1/3500。患者一般在3～5岁发病，并逐渐失去自主行动能力，大多20岁左右死于心肺功能衰竭。经过20年的努力，发现了杜氏肌营养不良症的致病原因是缺乏功能性的抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)，其治病基因是DMD，dystrophin蛋白也是第一个被证明会引起肌营养不良症的突变蛋白。目前该病尚无有效的治疗方法。DMD疾病的发生是由功能性dystrophin蛋白缺乏或者功能性不完整的dystrophin蛋白表达引起的，因此恢复dystrophin蛋白功能或表达是一种显而易见的治疗方法。靶向dysrophin蛋白的基因疗法可以在DNA、pre-mRNA或mRNA水平进行设计，从而改善靶蛋白的表达水平从而发挥改善疾病表型的作用。然而，DMD基因治疗面临着许多挑战。首先，人体肌肉组织非常丰富，有超过500多种的骨骼肌，占我们体重的30％～40％，并且几乎所有的骨骼肌都受dystrophin蛋白的影响；此外，肌纤维是有丝分裂后的组织，肌纤维和纤维束都被多层结缔组织肌膜包裹，阻碍了外源物质的进入，如干细胞，病毒载体和非病毒载体纳米材料等；其次，骨骼肌受损从胎儿期就开始了，骨骼肌的变性、炎症，增生、坏死、相互交替发生，直至增生不能够补偿坏死的，而且是不可逆转的；DMD基因突变类型复杂多样，因此，DMD的基因治疗的效果一直还有待提高和改善。

随着基因编辑技术的发展，CRISPR/Cas9基因编辑技术的进步大大加快了基因治疗策略的发展，它的出现有可能治疗一系列无法治愈的单基因疾病和复杂疾病，为永久性纠正致病基因提供了强大的工具。利用这些基因编辑技术开发的基因疗法要么基于致病基因的敲除，要么基于内源性突变基因的修复。为了能够让这些技术真正的造福人类，科学家们正在努力克服重重困难，试图将这些技术推入进人体临床试验。然而，基因编辑技术能够完全实现人类遗传疾病的基因治疗之前，挑战仍然存在。在过去的几十年里，递送蛋白质和核酸研究领域发展递送技术和系统对基因编辑系统的成功递送起到了至关重要的作用，包括用于基因治疗的病毒载体，有逆转录病毒(Retrovirus)、腺病毒(Adenovirus,Ad)、疱疹病毒载体H(Herpesvirus vectors)和腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)以及非病毒载体。在病毒载体中，AAV成为了第一个被批准用于临床应用的病毒载体系统。由于对人类疾病的分子机制理解的增强和基因传递技术的进步，利用AAV病毒载体递送的基因治疗在一些疾病中取得了显著疗效。近几十年中，基于AAV病毒载体的基因治疗被认为是安全有效的。尽管，AAV具有包装能力大小有限，生产成本高，中和抗体等因素的影响，使其成功推广到许多其他人类疾病的时候面临挑战，但是通过对AAV载体的改造有望能够克服基因治疗中的障碍。

然而利用AAV-CRISPR方法进行在体基因治疗，仍面临巨大的挑战。近几年，科学家们已经利用AAV递送CRISPR系统已经在DMD小鼠、狗和人类突变的细胞中成功纠正DMD基因，恢复dystrophin蛋白的表达及改善病理表型。尽管基于CRISPR基因编辑技术的出现极大地促进了DMD疾病动物模型的治疗，但缺乏具有患者相同突变的合适动物仍然是一个主要挑战，高度模拟临床患者的动物模型可能会加速精确基因编辑治疗的发展。为了证实CRISPR编辑治疗在大型哺乳动物中的安全性和有效性，未来需要进行大规模、长期和全面的临床前的研究。所以，建立与人类遗传及生理结构更为接近的DMD猴模型，并开展临床前研究，被认为是突破临床转化的理想途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用。本发明针对DMD基因5外显子的突变从而导致dystrophin蛋白不表达的DMD-Ex5^Mut猴模型，通过利用AAV递送CRISPR基因编辑系统(AAV/CRISPR)，修复突变的5号外显子，从而恢复具有功能的dystrophin蛋白。在DMD-Ex5^Mut猴模型中，利用AAV/CRISPR在DMD猴模型(DMD-Ex5^Mut)中，进行了局部基因治疗的探索。2015年，我们团队利用CRISPR/Cas9技术靶向5号外显子进行DMD基因敲除，获得5号外显子突变的F0代猴模型。经过几年的努力，我们团队利用辅助生殖技术，获得了5号外显子突变稳定遗传的F1代DMD猴模型。DMD猴模型具有与患者相似的病理表型，生理生化指标肌酸激酶CK异常升高，且运动功能异常。DMD猴模型除了可以监测疾病进展的生物标志物、发病进程、评定新药物的治疗效果，还可以建立新的治疗手段，如用患者自身干细胞进行的基因、细胞治疗法、利用基因编辑与AAV病毒载体相结合的活体基因修复治疗等。利用AAV/CRISPR实现DMD-Ex5^Mut猴模型的局部基因治疗。根据猴模型的突变情况，设计了两种基因修复策略，一种是利用CRISPR技术设计一对高效的sgRNA，对突变的5号外显子进行删除，使DMD基因形成一个开放的阅读框，恢复具有部分功能的dystrophin蛋白的表达。该方法中尽管在5号外显子5'的Mk-Ex5-sgRNA1(SEQ ID NO:1)与人源5号外显子5'的Ex5-sgRNA1(SEQ ID NO:2)相差一个碱基，但是都能够与5号外显子3'的Ex5-sgRNA4(SEQ ID NO:5)能够共同作用，分别删除猴和人的5号外显子，纠正5号外显子的突变，从而恢复dystrophin mRNA阅读框。另外一种修复策略是靶向突变的原位置，进行原位切割，引入碱基的随机插入和缺失，重新构建阅读框，从而恢复dystrophin mRNA阅读框。此外，我们的DMD DMD-Ex5^Mut猴模型的具体突变情况，分别是-1bp、-2bp和-5bp。针对这三种具体的突变情况，我们设计的相对应的三个sgRNA，分别是Ex5-sgRNA^Del-1bp、Ex5-sgRNA^Del-2bp和Ex5-sgRNA^Del-5bp(SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.8)。通过上述两种基因修复策略，纠正5号外显子的突变，为实现基因编辑治疗DMD临床转化提供高效的靶向sgRNA。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA，所述sgRNA为可以对突变的5号外显子进行删除的两个sgRNA；所述两个sgRNA为Mk-Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4的组合，或Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4的组合，或Ex5-sgRNA2和Ex5-sgRNA3的组合；所述Mk-Ex5-sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Ex5-sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Ex5-sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Ex5-sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述Ex5-sgRNA4的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA，所述sgRNA为可以对突变的5号外显子进行切割的单个sgRNA，所述单个sgRNA为Ex5-sgRNADel-1bp、Ex5-sgRNADel-2bp、Ex5-sgRNADel-5bp中的一种；所述Ex5-sgRNADel-1bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述Ex5-sgRNADel-2bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述Ex5-sgRNADel-5bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种载体，所述载体为将权利要求1或2所述的sgRNA克隆至质粒上，然后包装为病毒。上述的载体，进一步的，所述质粒为pX458质粒。上述的载体，进一步的，所述病毒为pAAV。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的载体在制备治疗DMD的基因药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA。首先通过利用CRISPR技术分别针对5号外显子设计了一个高效的sgRNA，获得了具有5号外显子突变的DMD猴模型(简称DMD-Ex5^Mut猴模型)。申请人针对这5号外显子的突变情况，设计了两个基因修复的方法，其中一种是利用CRISPR的方法设计一对高效的sgRNA，对突变的5号外显子进行删除，使DMD基因形成一个开放的阅读框，恢复具有部分功能的dystrophin蛋白的表达；另外一种是在靶向的原位置进行原位切割，碱基的随机插入和缺失，重新构建阅读框，恢复正常的碱基读码，从而恢复dystrophin的蛋白，同时也保留了DMD基因中与actin结合域的主要功能部分。通过AAV局部递送CRISPR系统，使dystrophin蛋白能恢复表达。而这些修复的策略中使用的sgRNA序列(SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.8)是完全同源的，其中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2是相同位置的sgRNA尽管有一个碱基的不同，但是这两个分别都能靶向人和猴的DMD基因组序列，具有较高的编辑效率。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2分别和SEQ ID NO:5都能够共同删除人和猴的5号外显子。另一种基因修复策略，是针对5好外显子特定的突变位点，设计了三个特定的sgRNA(SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.8)，特定靶向，引入碱基的插入和缺失，从而构建新的开放阅读框，恢复dystrophin蛋白表达。这些sgRNA的筛选为5号外显子突变的杜氏肌营养不良症患者提供了特异性的靶序列，具有较高的打靶效率，从而纠正dystrophinmRNA的阅读框，恢复dystrophin蛋白的部分表达，为实现基因编辑个性化治疗提供可能。

(2)本发明提供了一种载体，利用CRISPR/spCas9系统，使用AAV双载体病毒作为治疗载体，更具有针对性，安全性更高。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例1、2或3中CRISPR/Cas9介导sgRNA切割5号外显子的示意图。

图2为本发明实施例1至2中人和猴的DMD基因5号外显子序列及其两侧(3'和5'端)序列的比对及其sgRNA的序列。

图3为本发明实施例4中AAV/CRISPR系统病毒载体的示意图。

图4为本发明实验一中在体外筛选筛选DMD猴模型5号外显子修复的PCR检测结果。

图5为本发明实验一中在293T细胞筛选DMD猴模型5号外显子修复PCR检测结果。

图6为本发明实验二中体外筛选筛选DMD猴模型5号外显子修复的PCR检测结果。

图7为本发明实施例5中短期免疫抑制方案计划图。

图8为本发明实验三中AAV/CRISPR系统病毒注射DMD猴模型后的DNA修复效率PCR检测结果。

图9为本发明实验三中AAV/CRISPR系统病毒注射DMD猴模型后的DNA修复效率PCR检测结果。

图10为本发明实验四中AAV/CRISPR系统病毒载体注射DMD猴模型后的mRNA修复效率，RT-PCR检测结果。

图11为本发明实验六中AAV/CRISPR病毒载体注射DMD猴模型后，两种基因修复策略免疫组化染色结果。

图12为本发明实验五中AAV/CRISPR系统病毒载体注射DMD猴模型后，两种基因修复策略western blot结果。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

本申请的sgRNA是针对5号外显子突变的DMD猴模型(主要是在5号外线中缺失1bp、2bp或者5bp)，设计对应策略的sgRNA序列，设计基因修复策略如图1所示。根据DMD基因5号外显子及其两侧的内含子序列以及CRISPR/spCas9系统的特点，在5号外显子的3’端和5’端寻找到合适设计20bp的sgRNA序列，基因修复策略1(△Ex5)和基因修复策略2(*Ex5)如图1所示，基因治疗策略1(△Ex5)具体是两个sgRNA对突变的5号外显子进行删除，从而恢复mRNA的阅读框。基因治疗策略2(*Ex5)是单个sgRNA对突变的5号外显子进行切割，利用CRISPR/Cas9切割产生DSB缺口从而会引入碱基的插入或缺失，从而重构mRNA的阅读框，恢复dystrophin蛋白的表达。

实施例1：

一种针对猕猴DMD基因5号外显子突变的sgRNA，采用基因治疗策略1，通过设计两个sgRNA对突变的5号外显子进行删除，从而恢复mRNA的阅读框。本实施例的sgRNA为Mk-Ex5-sgRNA1、Ex5-sgRNA4。Mk-Ex5-sgRNA1是针对猕猴DMD基因5号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体为：ATCAACCTGTTAAAGAGAAGGGG。Ex5-sgRNA4是针对猴或者人源DMD基因5号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；具体为：CAGGTAAGAATCCTGATGAATGG。本发明利用CRISPR的方法设计一对高效的sgRNA(sgRNA为Mk-Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4)，对突变的5号外显子进行删除，使DMD基因形成一个开放的阅读框，恢复具有部分功能的dystrophin蛋白的表达。

实施例2：

一种针对人DMD基因5号外显子突变的sgRNA，采用基因治疗策略1，通过设计两个sgRNA对突变的5号外显子进行删除，从而恢复mRNA的阅读框。本实施例的sgRNA为Ex5-sgRNA1、Ex5-sgRNA4。Ex5-sgRNA1是针对人源DMD基因5号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；具体为：AATCAACCTGTTAAAGAAAGGGG。Ex5-sgRNA4是针对猴或者人源DMD基因5号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；具体为：CAGGTAAGAATCCTGATGAATGG。本发明利用CRISPR的方法设计一对高效的sgRNA(sgRNA为Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4)，对突变的5号外显子进行删除，使DMD基因形成一个开放的阅读框，恢复具有部分功能的dystrophin蛋白的表达。

实施例3：

一种针对猕猴DMD基因5号外显子突变的sgRNA，采用基因治疗策略1，通过设计两个sgRNA对突变的5号外显子进行删除，从而恢复mRNA的阅读框。本实施例的sgRNA为Ex5-sgRNA2和Ex5-sgRNA3。Ex5-sgRNA2是针对猕猴或者人源DMD基因5号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体为：CAGGTTGATTTAGTGAATATTGG。Ex5-sgRNA3是针对猴或者人源DMD基因5号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；具体为：TCAGGATTCTTACCTGCCAGTGG。本发明利用CRISPR的方法设计一对高效的sgRNA(sgRNA为Ex5-sgRNA2和Ex5-sgRNA3)，对突变的5号外显子进行删除，使DMD基因形成一个开放的阅读框，恢复具有部分功能的dystrophin蛋白的表达。

图2为本发明实施例1至3中人和猴的DMD基因5号外显子序列及其两侧(3'和5'端)序列的比对及其sgRNA的序列。A为人和猴的DMD基因5号外显子序列及其两侧(3'和5'端)序列的比较；B为猴的四个sgRNA的具体位置及其序列(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5)；C为人源的两个有效sgRNA序列(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5)。由上述比对，可以看出SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同位置的sgRNA尽管有一个碱基的不同，但是这两个分别都能靶向人和猴的DMD基因组序列，具有较高的编辑效率。SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2分别和SEQ ID NO:5都能够共同删除人和猴的5号外显子。

实施例4：

一种载体，将实施例1至3中的sgRNA序列克隆至pX458质粒获得pX458-spCas9-sgRNA-EGFP载体，并将构建的质粒pX458-spCas9-sgRNA-EGFP分别再COS7细胞或者293T细胞中转染进行sgRNA效率的验证，最后将筛选效率高的sgRNA(Mk-Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA1)序列克隆到同一个到pAAV载体上，其结构示意图如图3中的pAAV-U6-Mk-Ex5-sgRNA1-U6-Ex-sgRNA5-CMV-EGFP或者是pAAV-U6-Mk-Ex5-sgRNA1-U6-Ex-sgRNA5-CMV-EGFP。然后包装为AAV9血清型的病毒，病毒滴度为1E+13vg/ml，然后按照100ul/管进行分装。

其具体的方法包括以下步骤：

(1)设计引物：根据实施例1的sgRNA的DNA序列合成正义链和反义链引物，正义链的5’-端加CACC，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加CACCg；在反义链的5’-端加AAAC，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C。表1是sgRNA正/反义链引物序列。

表1：sgRNA正/反义链引物序列

(2)双链退火：

2.1、取表1中的正义链引物、反义链引物分别用RNase Free water稀释至100μmol得到正义链引物溶液和反义链引物溶液。取4.5μl正义链引物溶液、4.5μl反义链引物溶液、1μl的NEB Buffer2混合，形成双链退火体系。

2.2、将双链退火体系进行双链退火处理，具体为：在PCR仪中进行反应，其PCR程序为：95℃，3min；95℃～85℃，每个循环降-2℃，每个循环是1s；85℃～25℃，每个循环降-0.1℃，每个循环是1s；4℃保存；形成粘性末端的双链sgRNA。

(3)质粒线性化：

3.1、提取无内毒素质粒pX458(购买于addgene，货号48138)，按照试剂盒E.Z.N.A^TMEndoFee Plasmid Mini KitⅡ(Omega.货号D6950-02)说明书进行处理。

3.2、采用BbsⅠ酶对pX458质粒线性化处理，具体为：取5μL 10×Buffer、2.5μLBbs1、5μg pX458，用RNase Free H₂O补充至50μL得到酶切体系。将酶切体系放入37℃水浴锅中反应3h之后加入loading buffer终止反应得到反应产物。

3.3、将上述反应产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳之后，切胶回收线性化质粒pX458，具体操作按照试剂盒EasyPure PCR Purification Kit(全式金，货号EP101-02)进行操作。回收之后测定浓度，放置-20℃保存备用。

(4)连接转化：

4.1、使用全式金的试剂盒T4 DNALigase(FL101-01)，连接体系为：

退火双链sgRNA：2μl；线性化载体pX458：50ng；T4 DNA Ligase：1μl；5ⅹT4 DNALigase Buffer：2μl；RNase Free H₂O：补充至10μl。

4.2、在PCR仪器中，25℃，反应10min得到连接产物。

4.3、取一支Trelief ^TM5a感受态细胞(100μl/支)冰上融化，与10μl上述连接产物，轻轻吹打混匀，冰上静置5min。42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。

4.4、向离心管中加入500μl无抗性LB培养基，取200μl均匀涂布到含Amp⁺的固体平板中，37℃培养箱倒置培养过夜。

4.5、每个sgRNA挑取2～3个单克隆，加入到5ml的Amp⁺LB培养基中进行扩大培养。

4.6、上述扩大培养的菌液送sanger测序，使用人源的U6进行分别测序。

4.7、将正确的克隆菌液扩大培养，提取去内毒素质粒，得到pX458-spCas9-Mk-Ex5-sgRNA1-EGFP质粒、pX458-spCas9-Ex5-sgRNA2-EGFP质粒、pX458-spCas9-Ex5-sgRNA3-EGFP质粒、pX458-spCas9-Ex5-sgRNA4-EGFP质粒。

(5)细胞转染：

5.1、提前一天将COS7细胞或者HEK293T细胞铺六孔板。用Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen,货号11668-027)分别将4.7中获得的人源sgRNA质粒(pX458-spCas9-Ex5-sgRNA1-EGFP和pX458-spCas9-Ex5-sgRNA4-EGFP)转染HEK293T细胞；而猴源的sgRNA质粒(pX458-spCas9-Mk-Ex5-sgRNA1-EGFP、pX458-spCas9-Ex5-sgRNA2-EGFP、pX458-spCas9-Ex5-sgRNA3-EGFP、pX458-spCas9-Ex5-sgRNA4-EGFP)分别单独转染COS7细胞，且其中pX458-spCas9-Mk-Ex5-sgRNA1-EGFP和pX458-spCas9-Ex5-sgRNA4-EGFP，pX458-spCas9-Ex5-sgRNA2-EGFP和pX458-spCas9-Ex5-sgRNA3-EGFP分别共同转染COS7细胞。

5.2、转染72小时之后，提取细胞的基因组DNA，具体操作按照试剂盒Genomic DNA Purification Kit进行提取(Omega，货号A1120)。

实验一：检测实施例1至3中采用基因治疗策略1的sgRNA在细胞水平的编辑效率。

将实施例4步骤5.2中获得的的基因组DNA，进行PCR检测，获得sgRNA在细胞水平的编辑效率。具体步骤如下：

1、设计引物：从NCBI数据库中下载人源和猴源DMD基因组序列，以及猴源的DMDcDNA序列，并找到5号外显子序列，利用Primer6软件进行引物的设计，引物具体如下表2所示。

表2：PCR引物表

其中，Mk-Ex5-F和Mk-Ex5-R是根据猴源DMD基因组序列设计的；H-Ex5-F和H-Ex5-R是根据人源DMD基因组序列设计的；RT-Mk-Ex3-9-F和RT-Mk-Ex3-9-R是根据猴源的DMDcDNA序列设计的。

2、反应体系：5×PrimeSTAR GXL Buffer：10μl；dNTP Mixture(2.5mM each)：4μl；Mk-Ex5-F/H-Ex5-F：2μl；Mk-Ex5-R/H-Ex5-R：2μl；DNA基因组：1μl；PrimeSTAR GXL DNAPolymerase：1μl；H₂O：30μl。

3、PCR程序为：95℃预变性5min；40个循环；98℃变性10sec，64℃退火15sec(SEQID NO:19-20)；55℃退火15sec(SEQ ID NO:21-22)；72℃延伸30sec，72℃延伸10min。

4、PCR产物纯化回收之后，进行sanger测序，挑取单克隆进行测序，测序引物为SEQID NO:25。

图4为体外筛选筛选DMD猴模型5号外显子修复策略1的PCR检测结果。

图中A为在COS7细胞水平分别转染基因治疗策略1(△Ex5)的四个sgRNA质粒，以及Mk-Ex5-sgRNA1+Ex5-sgRNA4和Ex5-sgRNA2+Ex5-sgRNA3质粒共同转染的PCR结果。B分别为Mk-Ex5-sgRNA1、Ex5-sgRNA2、Ex5-sgRNA3、Ex5-sgRNA4的PCR产物的sanger测序峰图；C为在COS7细胞水平Mk-Ex5-sgRNA1、Ex5-sgRNA2、Ex5-sgRNA3、Ex5-sgRNA4四个sgRNA对靶位点的单克隆编辑效率的分析。结果显示四个sgRNA的编辑效率依次分别是88.9％、44.4％、57.9％和72.2％。D为Mk-Ex5-sgRNA1+Ex5-sgRNA4和Ex5-sgRNA2+Ex5-sgRNA3共同转染之后的，能够删除5号外显子效率结果，结果显示，Mk-Ex5-sgRNA1+Ex5-sgRNA4和Ex5-sgRNA2+Ex5-sgRNA3共同转染之后的，能够删除5号外显子效率分别依次是39.13％和7.69％。综上述试验结果，最终选择Mk-Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4最为最终基因治疗策略1的高效sgRNA组合。

图5为在293T细胞筛选DMD猴模型5号外显子修复效率PCR检测结果；图中A为将人源的Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4的质粒在293T细胞共同转染后的结果，图中能够看到PCR产物中有一条短的条带，为5号外显子删除之后的小条带。B为sanger测序比对的结果。从sanger测序的结果能够看到Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4共同作用，能够有效的删除5号外显子。

综上，图4和图5的结果说明，不论是针对人源或者猕猴的DMD基因5号外显子序列，Mk-Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4，或者Ex5-sgRNA1和Ex5-sgRNA4都能够有效删除突变的5号外显子。

(6)病毒包装：将Mk-Ex5-sgRNA1、Ex5-sgRNA4的序列给病毒包装公司(广州派真生物)，按照图3的载体图谱构建到pAAV载体上，然后包装为AAV9血清型的病毒，病毒滴度为1E+13vg/ml，然后按照100ul/管进行分装，得到AAV9-U6-Mk-Ex5-sgRNA1-U6-Ex5-sgRNA4-CMV-EGFP。

实施例5：

一种针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA，采用基因治疗策略2，使用单个sgRNA对突变的5号外显子进行切割，利用CRISPR/Cas9切割产生DSB缺口从而会引入碱基的插入或缺失，从而形成新的开放的阅读框，恢复dystrophin蛋白的表达sgRNA具体为Ex5-sgRNA^{Del -1bp}、Ex5-sgRNA^Del-2bp、Ex5-sgRNA^Del-5bp中的一种。

Ex5-sgRNA^Del-1bp是针对猴或者人源DMD基因特异性5号外显子点突变，缺失-1bp设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；具体为：TGGAAATCATAAACTGATCTTGG。

Ex5-sgRNA^Del-2bp是针对猴或者人源DMD基因特异性5号外显子点突变，缺失-2bp设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；具体为：ATGGAAATCATAAACTGACTTGG。

Ex5-sgRNA^Del-5bp是针对猴或者人源DMD基因特异性5号外显子点突变，缺失-5bp设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；具体为：TAGATGGAAATCATAAATCTTGG。

一种载体，将实施例3中的三个sgRNA(Ex5-sgRNA^Del-1bp、Ex5-sgRNA^Del-2bp和Ex5-sgRNA^Del-5bp)通过体外转录的方式(引物采用下表3中的引物)，形成mRNA-sgRNA。通过体外切割试验和胚胎水平的试验，验证这三个sgRNA对突变的5号外显子进行切割，利用CRISPR/Cas9切割产生DSB缺口从而会引入碱基的插入或缺失，从而形成新的开放的阅读框。最后将验证有效率的sgRNA(Ex5-sgRNA^Del-1bp、Ex5-sgRNA^Del-2bp和Ex5-sgRNA^Del-5bp)序列分别克隆到pAAV载体上，其结构示意图如图3中的pAAV-U6-Ex5-sgRNA^Del-1bp-CAG-mCherry、pAAV-U6-Ex5-sgRNA^Del-2bp-CAG-mCherry或者pAAV-U6-Ex5-sgRNA^Del-5bp-CAG-mCherry所示。然后包装为AAV9血清型的病毒，病毒滴度为1E+13vg/ml，然后按照100ul/管进行分装。

实验二：检测基因修复策略2的sgRNA在体外的编辑效率。

(1)以线性化的spCas9质粒(pT7-Cas9 vector，购自Biomics Biotech)为模板，进行体外转录spCas9-mRNA，具体步骤为：

1.1、使用XbaⅠ酶酶切pT7-Cas9质粒，获得线性化质粒：将盛有酶切体系的PCR管放置37℃水浴，反应2～3h得到线性化的pT7-Cas9质粒。酶切体系：10×Buffer：5μL；XbaI：2.5μL；pT7-Cas9：10μg；RNase Free dH₂O：补充至50μL。

1.2、纯化：为了更好的除去pT7-Cas9线性化模板中含有的RNA酶和无机物，在含有线性化pT7-Cas9的50μl酶切体系中，加入2μl RNAsecure^TM(Ambion，货号AM7005)并充分混合得到混合物。

1.3、将混合物于PCR仪中在60℃下孵育10分钟，然后冷却至室温；然后使用QIAGE的试剂盒MinElute PCR Purification Kit(28004)进行纯化处理；纯化好的线性pT7-Cas9，取1ul测浓度，保存-20℃用于后续的体外转录的模板。

1.4、根据试剂盒mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit(Ambion，货号AM1345)的使用说明，使上述纯化好的线性pT7-Cas9在体外转录合成Cas9-mRNA，将体外转录的Cas9-mRNA安装1ul/管的分装在PCR管中，放置-80℃冰箱保存，用于后续的胚胎注射试验中。

(2)体外合成sgRNA-mRNA：

2.1、根据试剂盒GeneArt^TM Precision gRNA Synthesis Kit(Invitrogen,货号A29377)的使用说明，使用表3中的引物合成三个sgRNA的mRNA(Ex5-sgRNA^Del-1bp、Ex5-sgRNA^Del-2bp和Ex5-sgRNA^Del-5bp)。

表3：sgRNA-mRNA的引物

2.2、体外转录合成：将sgRNA-mRNA安装1μl/管的分装在PCR管中，放置-80℃冰箱保存，用于后续的胚胎注射试验和体外切割试验中。

(3)体外切割试验：

3.1、血液和细胞的基因组提取。分别对5号外显子不同突变的DMD猴模型(-1bp、-2bp、-5bp)进行肝素钠抗凝管进行静脉采血1ml，然后按照试剂盒Genomic DNAPurification Kit(Omega，货号A1120)提取血液基因组，将基因组放置-20℃冰箱保存，待扩PCR时候作为模板使用。

3.2、PCR扩增获得目的片段。血液中DNA水平的检测与细胞检测(1.3)完全相同，参考1.3中的引物SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:26，然后根据表7中的PCR体系进行配置，PCR产物进行纯化回收之后，放置-20℃保存，待后续实验使用。

(4)Cas9切割反应：

4.1、将根据试剂盒Guide-it sgRNA Screening Kit(Clontech，货号632639)使用，在PCR管中配置下列反应体系：Target-specific sgRNA(50ng/μl)：10μl；dNTP Mixture(2.5mM each)：4μl；Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease(500ng/μl)：2μl。

4.2、将上述反应体系混匀，在PCR仪中37℃孵育5min形成Cas9/sgRNA复合物。

4.3、在PCR管中配置下列反应体系：PCR产物(100–250ng)：10μl；15X Cas9Reaction Buffer：4μl；15X BSA：2μl；RNase Free Water：2μl；Cas9/sgRNA复合物：30μl。

PCR程序为：37℃，60min；80℃，5min；4℃forever；程序结束之后，加入loadingbuffer终止反应，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳跑胶。

(5)胚胎注射：利用DMD猴模型(-5bp)进行超排取卵，然后通过体外受精之后，将sgRNA-mRNA和spCas9-mRNA注射到胚胎中，胚胎发育到囊胚时进行，将胚胎收集，冻存于-80℃中。

(6)利用REPLI-Single Cell Kit(QIAGEN，货号150345)试剂盒对单个胚胎进行基因组扩增；得到基因组后，根据自己设计的目的序列设计引物，进行PCR扩增，送PCR产物进行一代测序，如果发现在sgRAN位置发现有重叠峰，可以挑单克隆分析突变情况。

(7)病毒包装：将Ex5-sgRNA^Del-1bp的序列给病毒包装公司(广州派真生物)，按照图3的载体图谱构建到pAAV载体上，然后包装为AAV9血清型的病毒，病毒滴度为1E+13vg/ml，然后按照100ul/管进行分装得到pAAV-U6-Ex5-sgRNA^Del-1bp-CAG-mCherry、pAAV-U6-Ex5-sgRNA^Del-2bp-CAG-mCherry或者pAAV-U6-Ex5-sgRNA^Del-5bp-CAG-mCherry。

图6为体外筛选筛选DMD猴模型5号外显子修复策略2的PCR检测结果。图中A为针对DMD猴模型不同突变(缺失-1bp、-2bp、-5bp)的具体sgRNA的序列；B为在体外切割试验验证sgRNA(-1bp)、sgRNA(-2bp)、sgRNA(-5bp)的有效性PCR结果，如果sgRNA在体外能够有效切割目的基因组片段，胶图中就会产生小的条带，这两个小的条带大小加起来等于PCR产物的条带大小。C为利用Ex5-sgRNA^Del-5bp靶向-5bp缺失的胚胎，总共有18个胚胎，PCR结果；D为18个胚胎PCR产物的sanger测序结果，其中6个胚胎能够产生有效的编辑。Ex5-sgRNA^Del-5bp在胚胎水平效率为33.3％。

实施例7：

一种实施例2的载体在治疗DMD猴中的应用。利用5号外显子突变的DMD猴模型(主要是在5号外线中缺失1bp，DMD^Del-1bp)进行局部多点注射，多个时间点取材，对不同时间点基因治疗的有效性进行了评估。

发明人利用CRISPR/Cas9技术获得了一只5号外显子突变的雌性嵌合体，然后再通过辅助生殖技术对其进行超排取卵，获得的F1代的一只雄性猴DMD^Del-1bp猴模型。在基因治疗前该模型具有典型的DMD疾病表型，肌酸激酶CK异常升高，dystrophin蛋白不表达，具有细胞大小不一，核中心化、活动量显著下降等病理表型。这是首次利用DMD模型开展了AAV/CRISPR局部基因治疗的探索，我们主要展示了其能够通过两种基因修复策略(策略1是删除5号外显子形成In-frame，策略2是通过碱基的插入或者缺失形成Reframe，能够有效的恢复dystrophin蛋白的部分表达。具体应用方法包括如下步骤：

(1)给免疫抑制：按照图7的方法进行短期免疫抑制方案，泼尼松龙在AAV给药前3天以4mg/kg每天口服给药，AAV病毒注射后1周继续以这个剂量给药；AAV注射第二周每天(SID)以2mg/kg口服持续给药1周；AAV注射第三周每天以1mg/kg口服持续1周；AAV注射第四周每天以0.5mg/kg口服持续1周；最后一周隔天(EOD)以0.5mg/kg持续1周。

(2)病毒注射：病毒注射前使用0.1ml/kg速眠新，0.1ml/kg舒泰进行肌肉注射麻醉动物。然后将左右侧的肱三头肌、股四头肌、胫前肌处的毛剔除干净，然后使用1ml注射器将溶解混合好的病毒(AAV9-miniCMV-spCas9和AAV9-U6-Mk-Ex5-sgRNA1-U6-Ex5-sgRNA4-CMV-EGFP的混合病毒，AAV9-miniCMV-spCas9和

AAV9-U6-Ex5-sgRNA^Del-5bp-CAG-mCherry的混合病毒)缓慢注射到图7中的相应的肌肉部位，每个部位的病毒总量是按照2E+12vg(1E+12vg/每个病毒)进行注射。其中使用基因修复策略1(△Ex5)的AAV9-miniCMV-spCas9和AAV9-U6-Mk-Ex5-sgRNA1-U6-Ex5-sgRNA4-CMV-EGFP的混合病毒注射右侧的肱三头肌、股四头肌、胫前肌，三个肌肉块；而使用基因修复策略2(*Ex5)的AAV9-miniCMV-spCas9和

AAV9-U6-Ex5-sgRNA^Del-5bp-CAG-mCherry的混合病毒注射左侧的肱三头肌、股四头肌、胫前肌，三个肌肉块。

(3)肌肉活检样本处理：对于肌内多点局部注射，在注射后2、4和8周进行分别进行肌肉活检。使用0.1ml/kg速眠新，0.1ml/kg舒泰进行肌肉注射麻醉动物之后迅速收集病毒注射部位的肌肉；然后分别做以下处理：蓍树胶包埋剂将组织包埋，然后用液氮冷却下的异戊烷速冻，切成7μm的切片，用于组织学和免疫荧光分析。剩余的未固定的部分被快速冷冻在液氮中，然后在液氮下用金属组织粉碎机磨成粉末，提取DNA、RNA和蛋白。

实验三：检测DNA水平的突变。

肌肉组织DNA水平的检测与实验一的细胞检测完全相同，参考表2中的引物SEQ IDNO:25-SEQ ID NO:26，然后根据实验一的PCR体系进行配置，PCR产物进行纯化回收之后，进行TA克隆测序(测序引物SEQ ID NO:25)，根据单克隆的sanger测序结果统计突变情况。

图8为AAV/CRISPR系统病毒注射DMD猴模型后基因治疗策略1的DNA修复效率PCR检测结果；图中A为策略基因治疗策略1(△Ex5)的三个时间点取材之后DNA基因组进行PCR结果；B为A的sanger测序峰图，发现只有在第二周取材的时候有效率；C为A中PCR产物的2周取材时候的单克隆测序结果。图9为AAV/CRISPR系统病毒注射DMD猴模型后基因治疗策略2的DNA修复效率PCR检测结果；图中A为策略基因治疗策略2(*Ex5)的三个时间点取材之后DNA基因组进行PCR结果，结果发现无编辑效率；C为RT-PCR产物的sanger测序峰图，发现只有在第二周取材的时候有效率，D为RT-PCR产物的TA克隆测序结果，其编辑效率为26.32％。

实验四：检测mRNA水平的突变。

采用反转录方法制备cDNA，根据试剂盒的方法PrimeScriptTMII 1st StrandcDNA Synthesis Kit(Takala，货号6210A)获得cDNA；然后以cDNA为模板进行RT-PCR，RT-PCR的引物为表3中的SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:30。具体的PCR体系如下：5×PrimeSTARGXL Buffer：10μl；dNTP Mixture(2.5mM each)：4μl；RT-Mk-Ex3-9-F：2μl；RT-Mk-Ex3-9-R：2μl；cDNA：1μl；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase：1μl；H₂O：30μl。PCR程序为：95℃预变性5min；40个循环；98℃变性10sec，58℃退火15sec(SEQ ID NO:23-24)；72℃延伸30sec，72℃延伸10min。然后纯化回收，进行TA克隆测序(测序引物SEQ ID NO:23)，根据单克隆的sanger测序结果统计突变情况。图10为AAV/CRISPR系统病毒载体注射DMD猴模型后基因治疗的RT-PCR检测结果；图中A为基因治疗策略1(△Ex5)的三个取材时间点的RT-PCR检测及其单克隆效率，显示在mRNA水平，只有在2周的时候有效率；B为对A中2周的条带进行切胶测序的结果，确定5号外显子删除的同时也会引起6号外显子的缺失。C为基因治疗策略2(*Ex5)的三个取材时间点的RT-PCR检测及其单克隆效率；确定两种基因修复策略，在mRNA水平，只有在2周的时候有效率。

实验五：免疫组化检测dystrophin蛋白表达水平。

7μm切片用Dystrophin抗体(Abcam,兔抗，货号ab15277，按照1:1000稀释)进行染色，基因修复策略1(△Ex5)的DMD猴模型组织使用驴抗兔IgG H&L Alexa555(Abcam，货号ab150074，按照1:500稀释)进行染色；而基因修复策略2(*Ex5)的DMD猴模型组织使用驴抗兔IgG H&L Alexa/>488(Abcam，货号ab150073，按照1:500稀释)进行染色。图11为AAV/CRISPR病毒载体注射DMD猴模型后，两种基因修复策略都能够恢复dystrophin蛋白的部分表达，免疫组化染色结果；图中A为基因治疗策略1(△Ex5)的三个取材时间点的免疫组化结果；图B为基因治疗策略2(*Ex5)的三个取材时间点的免疫组化结果。

实验六：Western blot检测dystrophin蛋白表达水平。

每个样本上样50μg，使用6％的PAGE胶进行凝胶电泳，然后80V，30min；然后100V，90min；当lodging buffer跑出胶外，且目的蛋白或者内参蛋白跑到合适位置时停止电泳；然后用5％脱脂牛奶(使用TBST缓冲液配置)室温封闭1小时；转模的条件为60V，30min，然后再80V，80min；采用Dystrophin(抗肌萎缩蛋白)抗体(Abcam，兔抗，货号ab15277，按照1:1000稀释)，Vinculin(粘着斑蛋白)抗体(CST，兔抗，货号：13901，按照1:1000稀释)；进行一抗4℃过夜孵育，用TBST洗涤3-5次后，再在使用acti-rabbit IgG,HRP-linked antibody(CST，货号7074)进行孵育2h，最后进行显色。从图12可以看出：两种基因修复策略都能够恢复dystrophin蛋白的部分表达。图A为基因治疗策略1(△Ex5)的三个取材时间点的westernblot的结果图以及dystrophin蛋白与内参蛋白vinculin相对表达量的比对分析；图B为基因治疗策略2(*Ex5)的三个取材时间点的western blot的结果图以及dystrophin蛋白与内参蛋白vinculin相对表达量的比对分析。

Claims (5)

1.一种针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA，其特征在于， 所述sgRNA为可以对突变的5号外显子进行切割的单个sgRNA，所述单个sgRNA为Ex5-sgRNA^Del-1bp、Ex5-sgRNA^Del-2bp、Ex5-sgRNA^Del-5bp中的一种；

所述Ex5-sgRNA^Del-1bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述Ex5-sgRNA^Del-2bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述Ex5-sgRNA^Del-5bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体为将权利要求1所述的sgRNA克隆至质粒上，然后包装为病毒。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述质粒为pX458质粒。

4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述病毒为pAAV。

5.一种权利要求2至4中任一项所述的载体在制备治疗DMD的基因药物中的应用。