CN115209953A

CN115209953A - 减轻缺血再灌注损伤的合成物和方法

Info

Publication number: CN115209953A
Application number: CN202080089985.3A
Authority: CN
Inventors: B·K·布拉尔
Original assignee: Jaan Biotherapeutics LLC
Current assignee: Jaan Biotherapeutics LLC
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2022-10-18
Also published as: EP4048398A1; WO2021081006A1; US20220307028A1

Abstract

在某些实施例中，提供了预防、抑制、减轻或治疗心脏缺血再灌注损伤的治疗合成物和方法。所述治疗合成物可包含多种微小RNA(miR)拮抗剂。在某些实施例中，所述方法包括在心脏缺血事件之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物。所述方法可包括缺血心脏组织再灌注。

Description

减轻缺血再灌注损伤的合成物和方法

相关专利申请

本申请要求2020年2月26日提交的第62/981531号、2020年1月15日提交的第62/961418号、2019年11月19日提交的第62/937429号以及2019年10月21日提交的第62/923612号美国临时申请的优先权。这些申请的全部内容通过本发明的整体引用，明确成为本发明的一部分。

关于联邦政府资助研发的声明

本发明根据由美国国立卫生研究院授予的第1R43HL137416-01A1号合同以及由美国国立卫生研究院授予的号第1R41HL134387-01A1号合同在政府的支持下完成。政府对本发明享有一定的权利。

序列表参考

以电子格式提交本申请以及序列表。所述序列表的文件名称为“Sequence_Listing_68BX-306236-WO”，创建于2020年10月20日，大小为40.0千字节。电子格式序列表中的信息通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。

技术领域

本发明通常涉及生物化学和医学领域。更具体地，本发明公开了预防、抑制、减轻或治疗心脏缺血再灌注损伤的方法。

背景技术

心脏病包括一系列病症，包括但不限于心肌病、心肌梗死以及需要心肌再生的缺血性心脏病。缺血性心脏病是工业化世界中发病和死亡的一个主要原因。据了解，心脏病谱内的各种病症由不同细胞类型(如心肌样细胞)的致病变化(通过改变一系列复杂的生化途径导致)引起。例如，可通过改变心肌样细胞基因表达，实现某些与心脏病有关的病理变化，此类改变会导致心肌样细胞肥大，心肌样细胞生存和收缩受损。因此，心脏病治疗发展的一个持续挑战是确定适用于各种类型心脏病的有效疗法，例如，通过促进心脏内的内源性心肌细胞分裂和修复受损心肌。

心脏缺血是一种以向心肌或心肌层提供的血流和氧气减少为特征的病症，是可能最终导致心脏病发作或心肌梗死的心血管疾病的一个标志。心血管疾病还可能导致血流受限以及向其他身体部分供应的氧气减少，从而导致各种器官和组织(包括大脑)发生缺血性损伤，可能导致卒中。缺血发作后的血流重建或再灌注以及受影响区域再氧合对限制不可逆性损伤至关重要。但是，再灌注也会带来潜在的破坏性后果，如再灌注损伤，这是由于缺血发作后的冠状血流恢复以及再灌注时活性氧和活性氮类的产生和积累造成的。缺血再灌注损伤的生化特征在于，在缺氧事件期间氧气耗尽，导致细胞内钙水平增加，然后是在再灌注时进行再氧合，同时产生活性氧类。心肌梗死后，再灌注损伤可能占心脏损伤的50％。心血管疾病在美国乃至全世界流行，因此迫切需要开发可有效预防、减轻或抵消由心脏缺血事件引起的缺血和缺血再灌注损伤的方法和合成物。还迫切需要开发全新、更有效的疗法和治疗剂来治疗由心脏缺血事件引起的缺血和缺血再灌注损伤。

发明内容

本发明包括预防、抑制、减轻或治疗心脏缺血性再灌注损伤的方法。在某些实施例中，所述方法包括：在心脏缺血事件之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。所述方法可包括：缺血心脏组织再灌注。

本发明包括治疗心肌梗死的方法。在某些实施例中，所述方法包括：在缺血心脏组织再灌注之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。在某些实施例中，心肌梗死是一种心脏缺血事件。

本发明包括在心脏缺血事件后诱导心肌样细胞再生、心脏修复、血管发生和/或心肌样细胞分化的方法。在某些实施例中，所述方法包括：在缺血心脏组织再灌注之前、期间或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

本发明包括治疗与FHL1和/或TNNT2调节异常相关的疾病或病症的方法。在某些实施例中，所述方法包括：向有需要的受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

本发明包括治疗受试者肾脏病症和/或防止受试者肾脏受损的方法。在某些实施例中，所述方法包括：向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

在某些实施例中，所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种包括抗miR-99a，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:47、48、50、52和54的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施例中，所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-100-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7a-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7c-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在某些实施例中，所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种包括抗miR-99a，相对于选自SEQ ID NO:47、48、50、52和54的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-100-5p，相对于选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7a-5p，相对于选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7c-5p，相对于选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。

在某些实施例中，至少一种所述抗miR包含选自修饰核苷间键、修饰核苷酸和修饰糖部分及其组合的一种或多种化学修饰。在某些实施例中，所述一种或多种化学修饰包括修饰核苷间键。在某些实施例中，所述修饰核苷间键选自硫代磷酸酯、2'-O-甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。在某些实施例中，所述修饰核苷间键包括硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施例中，所述一种或多种化学修饰中的至少一种包括修饰核苷酸。所述修饰核苷酸可包括锁核酸(LNA)。所述锁核酸(LNA)可包含在修饰抗miR的一端或两端。在某些实施例中，所述修饰核苷酸包括锁核酸(LNA)化学修饰、肽核酸(PNA)、阿糖核酸(FANA)、类似物、衍生物或其组合。在某些实施例中，所述一种或多种化学修饰中的至少一种包括修饰糖部分。在某些实施例中，所述修饰糖部分为2'-O-甲氧基乙基修饰糖部分、2'-甲氧基修饰糖部分、2'-O-烷基修饰糖部分、双环糖部分或其组合。在某些实施例中，所述修饰糖部分包括2'-O-甲基糖部分。

在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体为病毒载体。在某些实施例中，所述病毒载体为慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含：(a)一个与SEQ ID NO:59-64中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列；(b)一个与SEQ ID NO:86-89中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列；或(c)一个与(a)和(b)所示SEQ ID NO中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:85的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂由相同表达盒或载体进行编码。在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂由不同表达盒或载体进行编码。

在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:101的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述表达盒包括一个强诱饵(TuD)盒，其包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂进行编码的核苷酸序列。在某些实施例中，所述TuD盒包含与核苷酸序列(对一种或多种miR-99a拮抗剂进行编码)可操作连接的一个或多个启动子序列，可选地，所述一个或多个启动子序列包含H1启动子和/或U6启动子。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含两个或多个TuD盒。在某些实施例中，所含克隆载体或表达载体包含两个或多个TuD盒的治疗合成物的有效剂量比所含克隆载体或表达载体包含一个TuD盒的治疗合成物的有效剂量至少约少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或这些值之间的一个数字或范围)。在某些实施例中，所述TuD盒包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:98的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:99的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:100的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

在某些实施例中，所述治疗合成物是一种药物合成物。在某些实施例中，在心脏缺血事件发生前施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在心脏缺血事件期间施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在缺血心脏组织再灌注前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时或约96小时施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在缺血心脏组织再灌注时施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在缺血心脏组织再灌注后施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在缺血心脏组织再灌注后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20天施用所述治疗合成物。

在某些实施例中，所述治疗合成物包含多种微小RNA(miR)拮抗剂，其中，所述给药包括皮下给药、全身给药和/或冠脉内给药。在某些实施例中，所述治疗合成物的施用剂量为约0.08mg/kg、约0.24mg/kg、约0.81mg/kg、约1.22mg/kg、约2.44mg/kg、约3.25mg/kg、约4.06mg/kg、约4.89mg/kg、约5.69mg/kg、约6.50mg/kg、约7.32mg/kg或约8.13mg/kg。在某些实施例中，所述治疗合成物包含多种微小RNA(miR)拮抗剂，其中，所述给药包括脑室内给药和/或心肌内给药。在某些实施例中，所述治疗合成物的施用剂量为约0.004mg/kg、约0.012mg/kg、约0.0405mg/kg、约0.061mg/kg、约0.122mg/kg、约0.1625mg/kg、约0.203mg/kg、约0.2445mg/kg、约0.2845mg/kg、约0.325mg/kg、约0.366mg/kg或约0.4065mg/kg。在某些实施例中，与所述治疗合成物的静脉内给药相比，所述治疗合成物的皮下给药可提高生存率，并降低心脏血栓的发生率。在某些实施例中，所述治疗合成物包含一个病毒载体，其中，所述给药包括采用约2.5×10¹²vg(病毒基因组)/kg、约2.5×10¹³vg/kg、约2.5×10¹⁴vg/kg或约2.5×10¹⁵vg/kg剂量的静脉内全身给药和/或冠脉内给药。在某些实施例中，所述治疗合成物包含一个病毒载体，其中，所述给药包括脑室内给药和/或心肌内给药。在某些实施例中，所述治疗合成物的施用剂量为约0.125×l0¹² vg/kg、约0.125×l0¹³ vg/kg、约0.125×l0¹⁴ vg/kg或约0.125×l0¹⁵ vg/kg。在某些实施例中，通过单次给药来施用所述剂量。在某些实施例中，通过多次给药来施用所述剂量。

所述方法可包括：向受试者重复施用所述治疗合成物。所述重复施用可包括向受试者施用一个或多个附加剂量的所述治疗合成物。在某些实施例中，所述重复施用包括在缺血心脏组织再灌注后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天和/或约20天向受试者施用一个或多个附加剂量的所述治疗合成物。

所述方法可包括：向受试者施用有效量的至少一种附加治疗剂或至少一种附加疗法，实现联合疗法。在某些实施例中，在单独制剂中施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法的每一种，或在单一制剂中同时施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法。在某些实施例中，按顺序施用、同时施用和/或交替施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法。在某些实施例中，所述至少一种附加治疗剂或疗法选自：艾地苯醌、依普利酮、VECTTOR、AVI-4658、阿塔鲁伦/PTC124/Translarna、BMN044/PRO044、CAT-1004、微型肌营养不良蛋白AAV基因疗法(SGT-001)、半乳糖蛋白-1疗法(SB-002)、LTBB4(SB-001)、rAAV2.5-CMV-微小肌营养不良蛋白、谷氨酰胺、NFKB抑制剂、肌聚糖蛋白、δ(35kDa肌营养不良蛋白相关糖蛋白)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达、通过CRISPR/Cas9系统进行的基因组编辑、旨在重新引入肌营养不良蛋白基因功能重组版本的任何基因递送疗法、外显子跳跃疗法、无义突变的通读策略、细胞疗法、肌营养相关蛋白上调、肌肉生长抑制素抑制、抗炎药/抗氧化剂、机械支持装置、生物药物、基因疗法或治疗性基因调节剂、肌营养不良症的任何标准疗法及其组合。在某些实施例中，所述至少一种附加治疗剂或疗法选自：经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术、溶栓疗法、抗血小板疗法、肝素、华法林、纤维蛋白溶解剂、氧疗、血管舒张剂、止痛药、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、糖蛋白拮抗剂、他汀类药物、醛固酮拮抗剂、植入式心脏除颤器(ICD)或其任何组合。

在某些实施例中，缺血心脏组织再灌注包括经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术、溶栓疗法、抗血小板疗法、肝素、华法林、纤维蛋白溶解剂、氧疗、血管舒张剂、止痛药、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、糖蛋白拮抗剂、他汀类药物、醛固酮拮抗剂、植入式心脏除颤器(ICD)或其任何组合。在某些实施例中，所述受试者为哺乳动物(例如，人类)。在某些实施例中，所述受试者患有或疑似患有心脏病，其中，所述心脏病为心肌梗死、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心力衰竭(例如，充血性心力衰竭)、缺血性心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、酒精性心肌病、病毒性心肌病、心动过速性心肌病、应激性心肌病、淀粉样变心肌病、致心律失常性右心室发育不良、左心室致密化不全、心内膜弹力纤维增生症、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣狭窄、二尖瓣反流、二尖瓣脱垂、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣反流、三尖瓣狭窄、三尖瓣反流、先天性疾病、遗传性疾病或其任何组合。在某些实施例中，所述受试者受选自以下几项的一种病症影响：酒精性心肌病、冠状动脉疾病、先天性心脏病、影响心脏的营养性疾病、缺血性心肌病、高血压性心肌病、瓣膜性心肌病、炎症性心肌病、继发于全身代谢性疾病的心肌病、扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、限制型心肌病(RCM)、致密化不全心肌病、主动脉瓣上狭窄(SVAS)、血管瘢痕形成、动脉粥样硬化、慢性进行性肾小球疾病、肾小球硬化症、进行性肾衰竭、血管闭塞、高血压、狭窄、糖尿病性视网膜病变或其任何组合。在某些实施例中，所述心脏缺血再灌注损伤包括心脏缺血损伤、心脏再灌注损伤或其组合。

在某些实施例中，与对照受试者相比，所述给药减轻了心脏缺血损伤、心脏再灌注损伤或其组合。在某些实施例中，与对照受试者相比，在给药后约5分钟至约365天的时间点(例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟、约1天、约2天、约4天、约6天、约8天、约10天、约20天、约30天、约40天、约50天、约60天、约80天、约100天、约120天、约140天、约160天、约180天、约200天、约220天、约240天、约260天、约280天、约300天、约320天、约340天、约360天、约365天或这些值之间的一个数字或范围)，所述给药使肌酸激酶水平降低至少约1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或这些值之间的一个数字或范围)。在某些实施例中，所述心脏缺血再灌注损伤包括由心脏缺血事件、再灌注损伤或其组合引起的损伤。在某些实施例中，所述心脏缺血事件包括以下一项或多项：心肌梗死、冠状动脉旁路移植术(CABG)、心脏搭桥手术、心脏移植术和血管成形术。在某些实施例中，所述心脏缺血事件包括使用以下器械的血管介入手术：支架、激光导管、动脉粥样硬化切除术导管、血管镜检查器械、β或γ辐射导管、冠状动脉旋磨术器械、涂层支架、放射性球囊、可加热线、可加热球囊、可生物降解支架撑杆、可生物降解套管或其任何组合。

在某些实施例中，在给药后约5分钟至约365天的时间点(例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟、约1天、约2天、约4天、约6天、约8天、约10天、约20天、约30天、约40天、约50天、约60天、约80天、约100天、约120天、约140天、约160天、约180天、约200天、约220天、约240天、约260天、约280天、约300天、约320天、约340天、约360天、约365天或这些值之间的一个数字或范围)，所述给药引起以下一种或多种情况：(1)与对照受试者相比，生存率提高；(2)与对照受试者相比，受试者的肾功能得到改善；(3)与对照受试者相比，血尿素氮(BUN)水平降低；(4)与对照受试者相比，受试者左心室的瘢痕减少和/或受试者左心室的局部室壁运动得到改善；(5)与对照受试者相比，舒张末期容积和/或收缩末期容积减少；(6)与对照受试者相比，射血分数增加；(7)与对照受试者相比，心肌样细胞和/或mRNA(对分化心肌样细胞肌肉结构和功能中所涉及的蛋白进行编码)的数量增加；(8)与对照受试者相比，Ank2、Kdm6a、Grk6、Klhl15、Adam22、Pfkp、Gorasp2、Ralgps1、Inppl1、Kdm3a、Kit、Sort1、Dvl2、Sema6d、Tead1、B4galnt2、Ltbp4、Osbpl9、Nfe2I1、Tnnt2和Fhl1中一项或多项的mRNA水平和/或蛋白水平增加；(9)与对照受试者相比，Asph、Map6、Zfp120、Ctnnd1、Eya3、Tnnt2、Kdm3a、Myo18a、Ncoa6、Slc25a13、Rpe、Ralgps1、Gimap1、Myo5a、Zeb2、Arap1、Nt5c2、Phldb1、Ttn、Camta2、Mef2c、Slk、Uimc1、Mthfd1I、Mtus1、Ythdc1和Eif2ak4中一项或多项的mRNA水平和/或蛋白水平降低；以及(10)与对照受试者相比，心肌样细胞形成、心肌样细胞增殖、心肌样细胞周期活化、心肌样细胞有丝分裂指数、肌丝密度、边界区壁厚或其任何组合中的一项或多项增加，上述情况的倍数变化为至少约1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或这些值之间的一个数字或范围)。在某些实施例中，所述给药诱导内源性心肌样细胞再生。在某些实施例中，与对照受试者相比，所述给药增强了受试者的心脏功能。增强心脏功能可包括以下一项或多项：(i)改善左心室功能；(ii)改善短轴缩短率；(iii)改善射血分数；(iv)减少舒张末期容积；(v)减少左心室质量；以及(vi)使心脏几何结构正常化；或(vii)其组合。在某些实施例中，所述给药对体重和/或心脏重量无显著影响。在某些实施例中，所述给药不会导致以下一项或多项：心律失常、后收缩(AC)以及收缩失败(CF)。

在某些实施例中，所述治疗合成物增加FHL1和/或TNNT2的mRNA水平和/或蛋白水平。在某些实施例中，所述疾病或病症与一个或多个FHL1突变和/或一个或多个TNNT2突变相关。在某些实施例中，所述疾病或病症为肌营养不良症或肌营养不良症样肌肉疾病。所述肌营养不良症可能与肌萎缩侧索硬化症(ALS)、腓骨肌萎缩症(CMT)、先天性肌营养不良症(CMD)、杜氏肌营养不良症(DMD)、Emery-Dreifuss肌营养不良症(EDMD)、遗传性和内分泌肌病、肌肉代谢性疾病、线粒体肌病(MM)、强直性肌营养不良症(MMD)、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)或其组合相关。在某些实施例中，所述疾病或病症为肢带型肌营养不良症、X连锁肌病伴姿势性肌萎缩(XMPMA)、还原体肌病(RBM)、肩胛腓骨(SP)综合征或其任何组合。在某些实施例中，所述疾病或病症为肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、扩张型心肌病(DCM)或其任何组合。所述肥厚型心肌病可为家族性肥厚型心肌病。

在某些实施例中，所述肾脏病症与受试者肾功能相关。在某些实施例中，所述肾脏病症选自：急性肾病(AKD)、急性肾损伤、急性和快速进行性肾小球肾炎、肾病综合征的急性表现、急性肾盂肾炎、急性肾衰竭、特发性慢性肾小球肾炎、继发性慢性肾小球肾炎、慢性心力衰竭、慢性间质性肾炎、慢性肾病(CKD)、慢性肝病、慢性肾盂肾炎、糖尿病、糖尿病性肾病、纤维化、局灶性节段性肾小球硬化症、古德帕斯彻病、糖尿病性肾病、遗传性肾病、间质性肾病、高血压性肾硬化症、IgG4相关性肾病、间质性炎症、狼疮性肾炎、肾炎综合征、尿路部分梗阻、多囊性肾病、进行性肾病、肾细胞癌、肾纤维化、肾移植后的移植物抗宿主病和血管炎。在某些实施例中，所述损伤与以下一项或多项相关：手术、放射性造影剂成像、放射性造影剂肾病、心血管手术、心肺转流术、体外膜肺氧合(ECMO)、球囊血管成形术、诱导性心脏或脑缺血再灌注损伤、器官移植、肾移植、败血症、休克、低血压、高血压、肾灌注不足、化疗、给药、肾毒性药物给药、钝力外伤、穿刺、毒药或吸烟。

在某些实施例中，所述治疗合成物与选自以下几项的肾治疗剂联合施用：地塞米松、类固醇、布地奈德、曲安奈德、抗炎剂、抗氧化剂、去铁胺、铁胺、锡络合物、锡卟啉络合物、金属螯合剂、乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA-Fe络合物、二巯基琥珀酸(DMSA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、青霉胺、米诺环素、强的松、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、霉酚酸、西罗莫司、环孢菌素或他克莫司抗生素、铁螯合剂、卟啉、血红素、维生素B12、Nrf2通路激活剂、巴多索龙、ACE抑制剂、依那普利、甘氨酸聚合物、抗氧化剂、谷胱甘肽、N乙酰半胱氨酸、化疗剂、QPI-1002、QM56、SVT016426(QM31)、16/86(第三代铁他汀类药物)、BASP siRNA、CCX140、BIIB023、CXA-10、碱性磷酸酶、Dnmtl抑制剂、THR-184、锂、福莫特罗、IL-22、EPO、EPO衍生物、促红细胞生成素刺激剂、阿法依泊汀、阿法达依泊汀、PDGF抑制剂、CRMD-001、阿曲生坦、托伐普坦、RWJ-676070、阿巴西普、Sotatercept、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷类、非甾体抗炎药(NSAID)、利尿剂、他汀类药物、抗衰老药物、皮质类固醇、糖皮质激素、脂质体、肾素、血管紧张素、ACE抑制剂、凋亡介质、纤维化介质、靶向p53的药物、Apaf-1抑制剂、RIPK1抑制剂、RIPK3抑制剂、IL17抑制剂、IL6抑制剂、IL23抑制剂、CCR2抑制剂、硝化脂肪酸、血管紧张素阻滞剂、ALK3受体激动剂和视黄酸。

在某些实施例中，所述治疗合成物与选自以下几项的肾保护剂或肾预防剂联合施用：噻嗪类、布美他尼、依他尼酸、呋塞米、托拉塞米、葡萄糖、甘露糖醇、阿米洛利、螺内酯、依普利酮、氨苯蝶啶、坎利酸钾、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪、加压素、两性霉素B、乙酰唑胺、托伐普坦、考尼伐坦、多巴胺、多佐胺、咖啡因、茶碱、可可碱、他汀类药物、抗衰老药物、纳维克拉、奥巴克拉、皮质类固醇、强的松、倍他米松、氟氢可的松、脱氧皮质酮、醛固酮、可的松、氢化可的松、倍氯米松、莫米松、氟替卡松、泼尼松龙、甲基强的松龙、曲安奈德、糖皮质激素、地塞米松、类固醇、布地奈德、曲安奈德、抗炎剂、抗氧化剂、非甾体抗炎药(NSAID)、去铁胺、铁、锡、金属、金属螯合物、乙二胺四乙酸(EDTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、青霉胺、抗生素、氨基糖苷类、铁螯合剂、卟啉、Nrf2通路激活剂、巴多索龙、ACE抑制剂、依那普利、甘氨酸聚合物、抗氧化剂、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、PDGF抑制剂、锂、铁死亡抑制剂、维生素B12QPI-1002、QM56、SVT016426(QM31)、16/86(第三代铁他汀类药物)、BASP siRNA、CCX140、BIIB023、CXA-10、碱性磷酸酶、Dnmtl抑制剂、THR-184、锂、福莫特罗、IL-22、EPO、EPO衍生物、促红细胞生成素刺激剂、阿法依泊汀、阿法达依泊汀、PDGF抑制剂、CRMD-001、阿曲生坦、托伐普坦、RWJ-676070、阿巴西普、Sotatercept、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷类、非甾体抗炎药(NSAID)、利尿剂、他汀类药物、抗衰老药物、皮质类固醇、糖皮质激素、脂质体、肾素、血管紧张素、ACE抑制剂、凋亡介质、纤维化介质、靶向p53的药物、Apaf-1抑制剂、RIPK1抑制剂、RIPK3抑制剂、IL17抑制剂、IL6抑制剂、IL23抑制剂、CCR2抑制剂、硝化脂肪酸、血管紧张素阻滞剂、ALK3受体激动剂、SGLT2调节剂和视黄酸。

在某些实施例中，所述治疗合成物可改善选自以下几项的一个或多个受试者肾功能标志物：受试者体内的血尿素氮(BUN)减少、受试者血液中的肌酐减少、受试者的肌酐清除率提高、受试者体内的蛋白尿减少、受试者的白蛋白:肌酐比降低、受试者的肾小球滤过率提高、受试者尿液中的NAG减少、受试者尿液中的NGAL减少、受试者尿液中的KIM-1减少、受试者尿液中的IL-18减少、受试者尿液中的MCP1减少、受试者尿液中的CTGF减少、受试者尿液中的胶原蛋白IV片段减少、受试者尿液中的胶原蛋白III片段减少、受试者尿液中的足细胞蛋白水平降低(其中，所述足细胞蛋白选自肾病蛋白和足突蛋白)、受试者血液中的胱抑素C蛋白减少、受试者血液中的β-微量蛋白(BTP)减少以及受试者血液中的2-微球蛋白(B2M)减少。

附图说明

图1A-1H显示了本发明所提供的合成物和方法的非限制性示例性设计及其相关数据。图1A显示了病毒抑制剂设计JBT-miR2。在不受任何特定理论约束的情况下，在某些实施例中，TuD为人工RNA链，其miRNA结合结构域被认为可通过互补碱基配对，将miRNA隔离到稳定的复合物中，从而禁用特定RNA干扰途径。简而言之，TuD为包含一个反义miRNA结合结构域(诱饵)的RNA单链或包含两个miRNA结合结构域的稳定茎-环。图1B显示了JBT-miR2在海拉细胞中的体外表达(如GFP表达所示)。在无血清培养基中进行六小时感染。在六小时感染后加入5％血清。在感染后7天进行成像。图1C-1E显示了海拉细胞中pMIR-REPORT miRNA表达报告基因系统上的归一化/β-半乳糖苷酶折叠miRNA AntagomiR活性的平均值：(图1C)JRX0116在miR-99结合位点的活性；(图1D)JRX0104在Let-7a结合位点的活性；(图1E)JRX0104在Let-7c结合位点的活性。这些图是使用复样进行的两次实验的代表性均值。图1F-1H显示了新生大鼠心室心肌样细胞中pMIR-REPORT miRNA表达报告基因系统上的归一化/β-半乳糖苷酶折叠miRNA AntagomiR活性的平均值：(图1F)JRX0116在miR-99结合位点的活性；(图1G)JRX0104在Let-7a结合位点的活性；(图1H)JRX0104在Let-7c结合位点的活性。这些图是使用复样/孔(每次实验)进行的两次实验的代表性均值。

图2A-2C为本发明所述实验程序的非限制性图示。图2A-2B为再灌注时(第1组；图2A)以及再灌注后两周(第2组；图2B)给予JBT-miR2或加扰对照病毒的小鼠程序的非限制性图示。图2C为再灌注时给予JN-101或运载体的小鼠程序的非限制性图示。

图3A-3B显示了使用本发明所提供的方法和合成物获得的非限制性示例性ECHO数据。图3A：第1组：再灌注时经JBT-miR2处理小鼠的代表性超声心动图(第1组)。图3B：第1组：IR后2周和8周均匀分布在左心室周围的50个节点的复合区域应变，表明8周时在节点21-38之间延伸增强，这与左心室梗死相对应。

图4A-4C显示了与对经JBT-miR2或对照品处理的小鼠进行的MRI实验有关的数据。图4A：使用MRI，从基底到心尖，根据9个独立的堆叠切片重建LV心内膜形状，空间分辨率为0.5mm。通过最小二乘法程序，舒张末期(ED)和收缩末期(ES)的形状均拟合为扁长球体，其表面有300个等距节点。然后，计算ED和ES之间每个节点的空间位移，并根据舒张末期表面积(EDSA)对总体LV大小进行归一化，从而提供心肌缩短(收缩)的有限元测度。图4B：通过由扁长球体拟合定义的每个相应节点处的平均数据，获得复合图像。从形貌结构上，LV ES形状采用颜色编码，反映了较低到较高程度的节点位移情况。注意单次施用JBT-miR2后2周小鼠前心尖部梗死区域的位移值较低(较浅蓝色)。图4C：以图形化的方式表示数据，将红色节点位移归一化到移至JBT-miR2处理一致性线以上的ED表面积(EDSA)。

图5A-5D显示了与对经JN-101或运载体处理的小鼠进行的MRI实验有关的数据。图5A为再灌注时在2周时成像(舒张期成像)的经JN-101处理小鼠的代表性超声心动图。图5B显示了IR后2周和8周均匀分布在左心室周围的50个结节的复合区域应变，表明8周时在结节21-38之间延伸增强，这与左心室梗死相对应。图5C为通过由扁长球体拟合定义的每个相应节点处的平均数据获得的复合图像。从形貌结构上，LV ES形状采用颜色编码，反映了较低到较高程度的节点位移情况。注意单次施用JN-101后4周小鼠前心尖部梗死区域的位移值较低(较浅蓝色)。图5D显示了以图形化的方式表示的数据，其中，将红色节点位移归一化到移至JN-101处理一致性线以上的ED表面积(EDSA)。

图6A-6D显示了与组织学分析有关的数据。图6A：对福尔马林中的组织进行大体检查，并进行解剖放在盒中，并包埋在石蜡中。使用马松三色(2号和5号)或3-Plex IF(MHC、DAPI和H3P)对六个4uM切片进行染色。未对1号和4号切片进行染色。图6B：上图显示了再灌注时经对照品处理小鼠(第1组)与再灌注时经JBT-miR2处理小鼠的连续切片。图6C：6个切片/心脏/小鼠(N＝3(对照品)，N＝5(经JBT-miR2处理))的组织区域瘢痕大小(mm2)的ImageDX定量。图6D：上图为从存在IR损伤并在再灌注时经对照病毒处理的小鼠中采集的心脏切片的2倍和10倍放大图像，在给药后8周进行组织学分析，下图包括以相似的方式经JBT-miR2处理的小鼠。与经对照病毒处理的小鼠相比，MHC阳性绿色细胞增加，这表明经JBT-miR2处理切片中的分化心肌样细胞增加。

图7A-7B显示了与代谢血液功能检测有关的数据。对从经对照病毒(N＝4)或JBT-miR2病毒(N＝4)处理的小鼠中采集的末梢血进行评价，以进行全面的代谢血液功能检测。在施用JBT-miR2病毒后6周，血尿素氮(BUN)(图7A)和肌酸激酶(CK)(图7B)的循环水平显著降低。图22A-22B显示了全面的代谢血液功能分析。

图8A-8L显示了与使用本发明所述的方法和合成物进行的NGS实验有关的数据。从经对照病毒(N＝2)或JBT-miR2(N＝2)病毒处理并进行NGS的小鼠的心脏左心室中分离总RNA。图8A-8D显示了与心脏mRNA表达变化有关的数据。图8A是一个火山图，显示了与经对照病毒处理的小鼠相比，经JBT-miR2处理的心脏中的64种已知mRNA均上调。与对照病毒相比，经JBT-miR2处理的心脏中的86种mRNA均下调。图8B为显示了经JBT-miR2和对照病毒处理的心脏中的mRNA表达变化一致的热图。图8C显示了《京都基因与基因组百科全书》(KEGG)中mRNA的上调数据。图8D显示了《京都基因与基因组百科全书》(KEGG)中mRNA的下调数据。图8E-8H显示了与心脏IncRNA表达变化有关的数据。图8I-8L显示了与心脏TUCP表达变化有关的数据。23A-23F显示了其他表达变化数据。

图9A-9L显示了与第1组(图9A-9F)和第2组(图9G-9L)中经JBT-miR2或加扰对照品处理的小鼠有关的血液动力学数据。

图10A-10F显示了与再灌注时施用JN-101有关的血液动力学数据。

图11A-11G显示了与再灌注后2周施用JN-101有关的血液动力学数据。观察到与梗死面积减小相关。此数据表明形成了功能性电耦合肌细胞。这些数据表明，在心脏病发作后，JN-101在压力下使心脏功能正常化。

图12显示了第1组小鼠的H和E染色心脏切片。

图13显示了与人U6启动子QPCR有关的数据。

图14A-14F显示了与经JBT-miR2处理小鼠的体重和心脏重量有关的数据。

图15显示了与JBT-miR2对人心室心肌样细胞的致心律失常性潜力有关的数据。

图16A-16D显示了与JN-101对处死时体重的影响有关的数据。

图17A-17D显示了与JN-101对处死时心脏重量的影响有关的数据。

图18A-18D显示了与JN-101对处死时心脏重量与体重之比的影响有关的数据。

图19A-19C显示了与JN-101对心脏重量与体重之比的影响有关的数据。

图20A-20D显示了与心肌细胞面积和胞质分裂迹象有关的数据。如图20A所示，在第25天，经JN-101处理小鼠(N＝4只小鼠，10mg/kg)与经运载体处理小鼠(N＝4只小鼠)的心肌细胞大小相同。进行苏木精和伊红染色，并在40倍放大、约15000个心肌细胞/载玻片/小鼠的条件下通过ImageDx计算细胞面积。如图20C所示，与经运载体处理的小鼠(N＝4)相比，在注射JN-101(15mg/kg)后15天，小鼠(N＝4)的双标记H3P/ARK阳性细胞数量增加。

图21A-21D显示了与JN-101皮下(SC)给药小鼠和JN-101静脉内(IV)给药小鼠的生存曲线有关的数据。

图22A-22B显示了与第1组(图22A)和第2组(图22B)经JBT-miR2处理小鼠的代谢血液功能检测有关的数据。

图23A-23F显示了与使用本发明所述的方法和合成物进行的NGS实验有关的数据，这些数据表明选择mRNA表达变化上调(图23A)，表明选择mRNA表达变化下调(图23B)，表明IncRNA表达变化上调(图23C)，表明IncRNA表达变化下调(图23D)，表明TUCP表达变化上调(图23E)，以及表明TUCP表达变化下调(图23F)。

图24显示了与未受伤小鼠的代谢血液功能检测有关的数据。

图25显示了与1-Plex、2-Plex和3-Plex阳性细胞定量有关的数据。

图26显示了与心肌细胞面积定量有关的数据。

图27为本发明所提供的方法和合成物的非限制性示例性示意图。

图28A-28C显示了与JBT-miR2对区域归一化位移(Displ/EDSA)的影响有关的数据(与对照病毒和未经处理的小鼠相比)：处理(垂直)与加扰对照品(水平)方案(图28A)、无处理的重复方案(图28B)以及叠加图(图28C)。

图29A-29F显示了与靶向微小RNA递送诱饵以促进缺血再灌注小鼠模型整体恢复的单一AAV2/9有关的数据。

图30A-30B显示了与促进缺血再灌注小鼠模型整体恢复的JN-101有关的数据。

图31A-31F为有关本发明所提供的合成物设计的非限制性示例性示意图。图31A显示了在本发明所提供的某些合成物(例如，JBT-miR2)中使用的pAV-U6-GFP载体和插入片段。图31B显示了在本发明所提供的TuD设计中使用的非限制性示例性序列(SEQ ID NO:86和89)。图31C显示了插入pAV-U6 GFP的非限制性示例性TuD盒(SEQ ID NO:98)。可将本发明所述的一个或多个TUD盒插入一个克隆载体或表达载体中(例如，在两个ITR序列之间克隆)。图31D显示了白蛋白填充片段设计1(SEQ ID NO:99)，图31E显示了ADD填充片段设计2(SEQ ID NO:100)。图31F显示了JBT-miR2核苷酸序列(SEQ ID NO:101)的一部分。

具体实施方式

在以下具体实施方式中，将参照附图，附图构成其一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则相似的符号通常表示相似的组成部分。具体实施方式中所述的说明性实施例、附图和权利要求并不旨在对本发明进行限制。在不脱离本发明所提供的标的物的精神或范围的情况下，可使用其他实施例，也可进行其他改变。很容易理解，可在各种不同的配置下安排、取代、组合、分离和设计本发明的各个方面(如本发明所述以及如附图所示)，所有这些内容均在本发明中进行了明确考虑，并构成本发明的一部分。

所有专利、已发表专利申请、其他出版物以及GenBank和本发明所提及的其他数据库的序列均通过本发明有关相关技术的整体引用，成为本发明的一部分。

在某些实施例中，提供了预防、抑制、减轻或治疗心脏缺血再灌注损伤的方法。在某些实施例中，所述方法包括：在心脏缺血事件之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。所述方法可包括：缺血心脏组织再灌注。

在某些实施例中，提供了治疗心肌梗死的方法。在某些实施例中，所述方法包括：在缺血心脏组织再灌注之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。心肌梗死可以是一种心脏缺血事件。

在某些实施例中，提供了在心脏缺血事件后诱导心肌样细胞再生、心脏修复、血管发生和/或心肌样细胞分化的方法。在某些实施例中，所述方法包括：在缺血心脏组织再灌注之前、期间或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

在某些实施例中，提供了治疗与FHL1和/或TNNT2调节异常相关的疾病或病症的方法。在某些实施例中，所述方法包括：向有需要的受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

在某些实施例中，提供了治疗受试者肾脏病症和/或防止受试者肾脏受损的方法。在某些实施例中，所述方法包括：向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

本发明包括增强心脏功能、降低死亡率、减少心脏容积和/或减少缺血再灌注损伤后瘢痕大小的方法。在某些实施例中，所述方法包括：在心脏缺血事件之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。所述方法可包括：缺血心脏组织再灌注。

定义

除非另有定义，否则本发明所用的技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员公知的相同含义。参见Singleton等人，《微生物学与分子生物学词典》第2版，约翰·威利父子出版公司(纽约州纽约，1994年)；Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港出版社(纽约州冷泉港，1989年)。在本发明中，以下术语定义如下。

除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”也包括复数指称对象。例如，术语“一个分子”包括一个或多个分子，包括其混合物。在本发明和所附权利要求中，术语“和/或”可为单数或具有包含性。例如，在本发明中，“A和/或B”可包括所有以下替代选项：“A”、“B”以及“A和B”。

在本发明中，术语“约”具有大约的普通含义。如果从上下文来看近似程度并不清楚，则“约”是指在所提供值±10％的范围内，或四舍五入到最近的有效数字，在所有情况下，均包含所提供值。如果提供了范围，则所述范围包含边界值。

“给药”是指向受试者提供药剂或药物合成物，包括但不限于由医疗专业人员给药以及自行给药。

“胃肠外给药”是指通过注射或输注进行给药。胃肠外给药包括但不限于皮下给药、静脉内给药、肌肉内给药、动脉内给药和颅内给药。“皮下给药”是指皮肤下给药。“静脉内给药”是指向静脉内给药。“动脉内给药”是指向动脉内给药。

术语“氨基酸”是指天然和合成氨基酸以及与天然氨基酸功能相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸包括由遗传密码编码的氨基酸以及随后进行修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然氨基酸的基本化学结构相同的化合物，例如，与氢、羧基、氨基和R基结合的碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物包含修饰R基(例如，正亮氨酸)或修饰肽骨架，但保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指与氨基酸的一般化学结构不同但功能与天然氨基酸相似的化学化合物。术语“非天然氨基酸(non-naturallyoccurring amino acid)”和“非天然氨基酸(unnatural amino acid)”是指自然界中并不存在的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。

在本发明中，可使用其公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示氨基酸。同样，可使用其公认的单字母代码来表示核苷酸。

“反义化合物”是指其核碱基序列可与靶核酸杂交的一种化合物。在某些实施例中，反义化合物是其核碱基序列与靶核酸互补的一种寡核苷酸。

术语“互补”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸能够与第二多核苷酸中的另一个核酸形成碱基对。例如，序列A-G-T与序列T-C-A互补。互补性可为部分互补性，其中，仅某些核酸根据碱基配对进行匹配，如果所有核酸均根据碱基配对进行匹配，则为完全互补性。术语“蛋白”、“肽”和“多肽”可互换使用，表示一种氨基酸聚合物或一组两种或多种相互作用或结合的氨基酸聚合物。在本发明中，这些术语包括其一个或多个氨基酸残基为相应天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。

短语“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸系列。对于特定核酸序列，保守修饰变体是指对相同或基本相同氨基酸序列进行编码的核酸，如果核酸不对氨基酸序列进行编码，则是指基本相同的核苷酸序列。由于基因密码具有简并性，因此，大量功能相同的核酸均可对任何给定蛋白进行编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均对氨基酸丙氨酸进行编码。因此，在由密码子指定丙氨酸的每个位置，在不更改编码多肽的情况下，可将所述密码子更改为上述任何相应密码子。此类核酸变异为“沉默变异”，这是保守修饰变异的一种。本发明所述对多肽进行编码的任何一个核酸序列也描述了核酸的每一种可能沉默变异。本领域的普通技术人员应认识到，可对核酸中的每个密码子(不包括AUG(通常是蛋氨酸的唯一密码子)和TGG(通常是色氨酸的唯一密码子))进行修饰，以产生功能相同的分子。因此，相对于其表达产物，而非相对于实际探针序列，对多肽进行编码的核酸的所有沉默变异均隐含在每个所述序列中。此外或可替代地，与参考多核苷酸相比，变体可包括在5'端、3'端和/或一个或多个内部位点删除、取代、添加一个或多个核苷酸。可使用本领域已知的常规技术(例如，聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)来检测变体和参考多核苷酸之间的序列相似性和/或差异。变体多核苷酸还包括合成衍生多核苷酸，如通过定点诱变产生的多核苷酸。一般而言，本发明所公开的特定多核苷酸变体(包括但不限于miRNA)与通过本领域的技术人员已知的序列比对程序确定的参考多核苷酸的序列一致性至少为约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或以上。

在两种或多种核酸或蛋白的情况下，术语“相同”或“一致性百分比”是指两个或多个序列或子序列相同或具有相同的指定核苷酸或氨基酸百分比(例如，当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对实现最大一致性时，指定区域的序列一致性为约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)，通过使用下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过人工比对和目视检查测得此类百分比。参见NCBI网站ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。此类序列被称为“实质相同”。此定义还指或可适用于检测序列的补体。此定义还包括进行删除和/或添加的序列以及进行取代的序列。通常在长度至少约为50个氨基酸或核苷酸的区域、长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域或给定序列的整个长度上存在序列一致性。

在本发明中，术语“构建体”是指任何重组核酸分子，如表达盒、质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、线状或环状噬菌体、单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，它们从任何来源衍生而来，能够进行基因组整合或自主复制，并包含核酸分子，所述核酸分子的一个或多个核酸序列以功能上可操作的方式连接，例如，可操作连接。

术语“转染(transfection)”或“转染(transfecting)”是指使用非病毒或基于病毒的方法将核酸分子引入细胞中的一个过程。所述核酸分子可以是对整个蛋白或其功能部分进行编码的序列。核酸载体通常包含蛋白表达所必需的元件(例如，启动子、转录起始位点等)。非病毒转染方法包括不将病毒DNA或病毒颗粒用作递送系统从而将核酸分子引入细胞中的任何适当转染方法。示例性非病毒转染方法包括但不限于磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声孔效应、热休克转染、磁转染和电穿孔。对于基于病毒的方法，本领域已知的任何一种有用病毒载体均可用于本发明所述的方法。病毒载体的示例包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。在某些方面，根据本领域已知的标准程序，使用逆转录病毒载体将所述核酸分子引入细胞中。

当涉及部分核酸或蛋白时，术语“异源”表明，所述核酸或蛋白包含在自然界中彼此不具有相同关系的两个或多个序列。例如，通常以重组的方式产生所述核酸，包含来自不相关基因的两个或多个序列，旨在产生一种新的功能核酸，例如，来自一个来源的启动子以及来自另一个来源的编码区。同样，异源蛋白表明，所述蛋白包含在自然界中彼此不具有相同关系的两个或多个序列(例如，融合蛋白)。

术语“基因”应用广泛，是指对蛋白进行编码或可转录成功能RNA的核酸分子的任何片段。基因可包括进行转录但不是最终的成熟和/或功能RNA转录物一部分的序列，对蛋白进行编码的基因可进一步包括进行转录但不进行翻译的序列，例如，5'未翻译区(5'-UTR)、3'未翻译区(3'-UTR)、内含子等。进一步地，基因可选进一步包含其表达所需的调控序列，此类序列可以是不进行转录或翻译的序列。基因可从各种来源(包括从目标来源克隆，或根据已知或预测序列信息合成)获得，并且可包括旨在具有所需参数的序列。

术语“核苷间键”是指相邻核苷之间的共价键。

术语“核碱基”是指能够与另一个核碱基进行非共价配对的杂环部分。

“核苷”是指与糖连接的核碱基。“连接核苷”是指通过共价键连接的核苷。“核苷酸”是指其磷酸基与核苷的糖部分进行共价连接的核苷。

“miR拮抗剂”是指旨在干扰或抑制miRNA活性的一种药剂。在某些实施例中，miR拮抗剂包含靶向miRNA的反义化合物。在某些实施例中，miR拮抗剂包含修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸的核碱基序列与miRNA或其前体的核碱基序列互补。在某些实施例中，miR拮抗剂包含干扰或抑制miRNA活性的小分子等。

“miR-9a-5p拮抗剂”是指旨在干扰或抑制miR-9a-5p活性的一种药剂。“miR-100-5p拮抗剂”是指旨在干扰或抑制miR-100-5p活性的一种药剂。“Let-7a-5p拮抗剂”是指旨在干扰或抑制Let-7a-5p活性的一种药剂。“Let-7c-5p拮抗剂”是指旨在干扰或抑制Let-7c-5p活性的一种药剂。

“修饰寡核苷酸”是指相对于天然末端、糖、核碱基和/或核苷间键存在一种或多种化学修饰的寡核苷酸。

“修饰核苷间键”是指与天然核苷间键不同的任何变化。

“硫代磷酸酯核苷间键”是指核苷之间的键，其中一个非桥接原子为硫原子。

“修饰糖”是指与天然糖不同的取代和/或任何变化。

“修饰核碱基”是指与天然核碱基不同的任何取代和/或变化。

“5-甲基胞嘧啶”是指使一个甲基连接至5位置从而进行修饰的一种胞嘧啶。

“2'-O-甲基糖”或“2'-OMe糖”是指在2'位置存在O-甲基修饰的一种糖。

“2'-O-甲氧基乙基糖”或“2'-MOE糖”是指在2'位置存在O-甲氧基乙基修饰的一种糖。

“2'-O-氟糖”或“2'-F糖”是指在2'位置存在氟修饰的一种糖。

“双环糖部分”是指通过两个非偕环原子的桥接进行修饰的一种糖。

“2'-O-甲氧基乙基核苷”是指存在2'-O-甲氧基乙基糖修饰的2'-修饰核苷。

“2'-氟核苷”是指存在2'-氟糖修饰的2'-修饰核苷。

“2'-O-甲基”是指存在2'-O-甲基糖修饰的2'-修饰核苷。

“双环核苷”是指存在双环糖部分的2'-修饰核苷。

在本发明中，术语“miR”、“mir”和“miRNA”可互换使用，是指微小RNA，这是一类小RNA分子，能够与编码RNA杂交并调控其表达。在某些实施例中，miRNA是前体miRNA被Dicer酶切割的产物。本发明所提供的这些术语是指形成双链RNA的核酸，当在与基因或靶基因相同的细胞中表达时，所述双链RNA能够减少或抑制基因或靶基因的表达。所述核酸的互补部分进行杂交，形成双链分子，通常具有实质或完全一致性。在一个实施例中，“微小RNA”是指与靶基因具有实质或完全一致性并形成双链miRNA的核酸。在某些实施例中，本发明所述的miRNA通过与互补细胞mRNA进行相互作用，从而干扰互补mRNA的表达，抑制基因表达。在某些实施例中，本发明所述双链miRNA的长度至少约为15-50个核苷酸(例如，所述双链miRNA的每个互补序列的长度为15-50个核苷酸，所述双链miRNA的长度约为15-50个碱基对)。在某些实施例中，所述长度为20-30个碱基核苷酸，优选长度为约20-25个或约24-29个核苷酸，例如，长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在本发明的某些实施例中，所述微小RNA选自miR-9a-5p、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p或实质上类似于选自miR-9a-5p、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p的微小RNA。

在本发明中，术语“抗miRNA”可与术语“抗miR”互换使用，是指能够干扰或抑制一个或多个靶微小RNA的一种或多种活性的寡核苷酸。在某些实施例中，所述抗miRNA为化学合成寡核苷酸。在某些实施例中，所述抗miRNA为小分子。在某些实施例中，所述抗miRNA为miR反义分子。“种子区”是指天然miRNA序列5'端的核苷酸2-6或2-7。

术语“miRNA前体”是指源自基因组DNA并包含非编码、结构化RNA(包含一个或多个miRNA序列)的转录物。例如，在某些实施例中，miRNA前体为前体miRNA。在某些实施例中，miRNA前体为初级miRNA。

“前体miRNA”或“前体miR”是指具有发夹结构的非编码RNA，包含miRNA。在某些实施例中，前体miRNA是初级miR被双链RNA特异性核糖核酸酶(被称为Drosha)切割的产物。在不希望受到任何特定理论约束的情况下，人们认为，在细胞质中，前体miRNA发夹被RNaseIII酶Dicer切割。这种内切核糖核酸酶与所述发夹的5'端和3'端进行相互作用，并切断连接3'臂和5'臂的环，产生长度约为22个核苷酸的不完美miRNA:miRNA双链体。虽然所述双链体的每条链均可能作为功能miRNA，但是，人们认为，通常仅一条链包含在RNA诱导沉默复合物(RISC)中，其中，miRNA与其mRNA靶点进行相互作用。剩余链(有义链)将降解。所述RNA诱导沉默复合物或RISC是一种多蛋白复合物，特别是核糖核蛋白，包含单链RNA(ssRNA)片段(如微小RNA(miRNA))或双链小干扰RNA(siRNA)的一条链。

“调节”是指功能或活性扰动。在某些实施例中，调节是指基因表达增加。在某些实施例中，调节是指基因表达减少。在本发明中，术语“微小RNA调节剂”是指能够调节微小RNA(例如，let-7a、let-7c、miR-100、miR-99)表达水平的一种药剂。在某些实施例中，所述微小RNA调节剂由核酸编码。在其他实施例中，所述微小RNA调节剂为小分子(例如，化学化合物或合成微小RNA分子)。在某些实施例中，与不使用微小RNA调节剂时的表达水平相比，所述微小RNA调节剂降低了微小RNA的表达水平。如果与不使用调节剂相比，所述微小RNA调节剂降低了微小RNA的表达水平，则所述微小RNA调节剂为微小RNA拮抗剂。在某些实施例中，与不使用微小RNA调节剂时的表达水平相比，所述微小RNA调节剂增加了微小RNA的表达水平。如果与不使用调节剂相比，所述微小RNA调节剂增加了微小RNA的表达水平，则所述微小RNA调节剂为微小RNA激动剂。

在本发明中，术语“心肌细胞”包括从心肌层(如人心肌层)获得或心肌层中存在的任何细胞和/或在物理上或功能上与心肌层相关的任何细胞。在本发明所公开的某些实施例中，心肌细胞为心肌样细胞。

术语“核苷酸”包括天然核苷酸以及非天然核苷酸。因此，“核苷酸”不仅包括含嘌呤和嘧啶杂环化合物的已知分子，而且包括其杂环类似物和互变异构体。其他类型的核苷酸的非限制性示例为含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶、N6,N6-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷的分子以及US5,432,272中所述的“非天然”核苷酸。术语“核苷酸”旨在包括上述所有示例及其类似物和互变异构体。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本发明中可互换使用，是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和补体。术语“多核苷酸”包括核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的一个单位，例如，单体。核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰版本。本发明所考虑的多核苷酸示例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括siRNA)以及包含单链和双链DNA及RNA混合物的杂交分子。此术语还包括含已知核苷酸类似物或修饰骨架残基或键的核酸，此类核酸类似物的存在形式为合成、天然和非天然形式，具有与参考核酸相似的结合特性，且代谢方式与参考核苷酸类似。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯以及2'-O-甲基核糖核苷酸。因此，术语“核酸”和“多核苷酸”包括含磷酸二酯键或修饰键的核酸，如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥接硫代磷酸酯或磺内酯键以及此类键的组合。术语“核酸”和“多核苷酸”还特别包括由除五种生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基组成的核酸。

在本发明中，术语“可操作连接”表示两个或多个序列之间的功能连接。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如，启动子)之间的可操作连接为功能连接，使目标多核苷酸能够进行表达。在这种情况下，术语“可操作连接”是指放置调控区和需转录的编码序列，使所述调控区可有效用于调控目标编码序列的转录或翻译。在本发明所公开的某些实施例中，术语“可操作连接”表示一种构型，其中，相对于对多肽或功能RNA进行编码的序列，将调控序列放在适当位置，使控制序列指导或调控mRNA(对多肽和/或功能RNA进行编码)的表达或细胞定位。因此，如果可介导核酸序列转录，则启动子与核酸序列存在可操作连接。可操作连接元件可以是连续的或非连续的。

术语“启动子”、“启动子区”或“启动子序列”在本发明中可互换使用，是指能够结合RNA聚合酶从而在5'-3'(“下游”)方向上引发基因转录的核酸序列。所述启动子的特异性序列通常决定了启动子的强度。例如，较强的启动子会引起较高的转录起始率。当RNA聚合酶与启动子结合是所述基因转录的直接原因时，基因在启动子的“控制下”或“受其调控”。所述启动子或启动子区通常为RNA聚合酶提供识别位点以及正确转录起始所需的其他因子。可从基因的基因组副本的5'未翻译区(5'UTR)中分离启动子。可替代地，可通过合成产生或通过改变已知DNA元件来设计启动子。本发明还考虑了将一个启动子的序列与另一个启动子的序列组合的嵌合启动子。可将启动子用作调控元件，用于调节可操作连接多核苷酸分子的表达，例如，多肽的编码序列或功能RNA序列。除由RNA聚合酶以及其他转录因子(优选)识别的序列之外，启动子还可包含调控序列元件，如影响可操作连接基因转录的czs元件或增强子结构域。在某些实施例中，启动子可为“组成型启动子”。在某些实施例中，可以“组织特异性”或“组织优选”的方式调控启动子，使其仅在转录特定组织类型的可操作连接编码区时激活。在某些实施例中，出于治疗目的，所述启动子可为组织特异性启动子，支持心脏和骨骼肌细胞转录。这方面的其他信息可见PCT专利出版物WO2004041177A2，所述专利出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。在某些实施例中，启动子可包含“天然”或“合成”组装核酸序列。

转染基因可在宿主细胞中瞬时或稳定表达。在“瞬时表达”时，所述转染核酸不会整合到宿主细胞基因组中，在细胞分裂时，不会转移到子细胞。由于其表达仅限于转染细胞，随着时间的推移，所述基因的表达可能丢失。相比之下，在对所述基因和赋予转染细胞选择优势的另一个基因进行共转染时，转染基因可稳定表达。此类选择优势可抵抗对细胞产生的某种毒素。通过宿主基因组的转座子介导插入，可进一步实现转染基因的表达。在转座子介导插入期间，所述基因以可预测的方式位于两个转座子连接序列之间，允许插入宿主基因组，并在随后切除。

术语“抑制剂”、“阻遏子”或“拮抗剂”或“下调剂”在本发明中可互换使用，是指会导致靶基因表达或活性水平可检测降低(与对照品相比)的物质、药剂或分子。与对照品相比，抑制表达或活性可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更少。在某些实施例中，与对照品相比，抑制作用为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。在某些实施例中，拮抗剂为抗miR。

在本发明中，“治疗”是指为应对患者表现出的疾病、障碍或生理病症或应对怀疑患者可能存在的疾病、障碍或生理病症而进行临床干预。治疗的目的包括但不限于减轻或预防症状、减缓或阻止疾病、障碍或病症进展或恶化和/或缓解疾病、障碍或病症。“治疗”是指治疗和/或预防性措施。需要治疗的受试者包括已受疾病、障碍或不良生理病症影响的受试者以及应预防所述疾病、障碍或不良生理病症的受试者。在本发明的某些实施例中，术语“治疗”、“疗法”和“改善”是指神经退行性疾病或神经元损伤等症状的严重程度降低。在本发明中，术语“治疗”和“预防”并不是绝对术语。治疗可指延迟症状发作、改善症状以及改善患者生存期、增加生存时间或生存率等或其组合。可将治疗的效果与未接受治疗的个体或个体池或治疗前或治疗期间不同时间的相同患者进行比较。在某些实施例中，与给药前的个体或未接受治疗的对照个体相比，个体疾病或病症的严重程度可降低至少10％。在某些实施例中，个体疾病或病症的严重程度降低至少25％、50％、75％、80％或90％，或在某些实施例中，使用标准诊断技术不再可检测。

在本发明中，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有利或理想生物学和/或临床结果的量。在某些实施例中，此术语是指足以改善给定疾病或症状的治疗剂量。例如，对于给定参数，与对照品相比，治疗有效量可增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％。也可以用增加或减少“几倍”来表示疗效。例如，治疗有效量的作用可至少为对照品的1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍。

术语“受试者”、“患者”、“需要治疗的个体”等可互换使用，除非另有说明，否则是指作为治疗、观察或实验对象的哺乳动物受试者。在本发明中，“哺乳动物”是指属于哺乳纲的受试者，包括但不限于人类、家畜和农场动物、动物园动物、竞技动物和宠物。哺乳动物的非限制性示例包括人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、绵羊、狗、马、猫、牛、山羊、猪以及其他哺乳动物物种。在某些实施例中，所述哺乳动物为人类。在某些实施例中，所述哺乳动物不是人类。此术语并不一定表示受试者确诊患有特定疾病或病症，通常是指受试者在医疗监督下。“怀疑患有……的受试者”是指受试者出现某种疾病或病症的一个或多个临床指标。在某些实施例中，所述疾病或病症为肌营养不良症(MD)。

“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶点”均指拮抗剂可靶向的核酸。“靶向(Targeting)”是指与靶核酸杂交并产生预期作用的核碱基序列的设计和选择过程。“靶向(看见没，，)”是指核碱基序列允许与靶核酸杂交，产生预期作用。在某些实施例中，预期作用为靶核酸减少。

在本发明中，术语“变体”是指序列实质上类似于参考多核苷酸(或多肽)的多核苷酸(或多肽)。在多核苷酸的情况下，与参考多核苷酸相比，变体可包括在5'端、3'端和/或一个或多个内部位点删除、取代、添加一个或多个核苷酸。可使用本领域已知的常规技术(例如，聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)来检测变体和参考多核苷酸之间的序列相似性和/或差异。变体多核苷酸还包括合成衍生多核苷酸，如通过定点诱变产生的多核苷酸。一般而言，多核苷酸变体(包括但不限于DNA)与通过本领域的技术人员已知的序列比对程序确定的参考多核苷酸的序列一致性可至少为约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或以上。在多肽的情况下，与参考多核苷酸相比，变体可包括删除、取代、添加一个或多个氨基酸。可使用本领域已知的常规技术(例如，蛋白免疫印迹法)来检测变体和参考多肽之间的序列相似性和/或差异。一般而言，多肽变体与通过本领域的普通技术人员已知的序列比对程序确定的参考多肽的序列一致性可至少为约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或以上。

在本发明中，“包含(comprising)”与“包括(including)”、“containing(包含)”或“以…为特征”是同义词，具有包含性或开放性，且不排除其他未列举的要素或方法步骤。在本发明中，“全部包含”不包括权利要求所述合成物或方法中未指定的任何要素、步骤或成分。在本发明中，“基本包含”包括不会在实质上影响权利要求所述合成物或方法的基本和新颖特性的材料或步骤。本发明中有关术语“包含”的任何复述(特别是在合成物组分说明或方法步骤说明中)包括基本包含和全部包含所列举组分或步骤的合成物和方法。

在本发明所述方法或过程的某些实施例中，除非明确列举时间顺序或操作顺序，否则可按任何顺序执行各个步骤。此外，在某些实施例中，除非以明确的权利要求语言表明应单独执行步骤，否则可同时执行所指定的步骤。例如，在某些实施例中，可在一个操作中同时执行进行X的权利要求所述步骤以及进行Y的权利要求所述步骤，所得过程在权利要求所述过程的字面范围内。

(a)、(b)、(i)等章节标题仅仅为了便于阅读本说明书和权利要求，因为在本发明中仅将其用于组织目的，不应解释为限制所述标的物。在本说明书或权利要求中使用标题，并不要求按字母或数字顺序或其提供顺序执行各个步骤或要素。本申请中引用的所有文件或文件部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文)通过本发明的整体引用，明确成为本发明的一部分。

本领域的普通技术人员理解，出于任何及所有目的，如在提供书面描述方面，本发明所公开的所有范围也包括任何及所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围均可轻松视为足以描述并将相同范围分为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本发明所讨论的每个范围很容易分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域的技术人员也理解，“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言均包括所列举的数字，并且指可随后分为上述子范围的范围。最后，本领域的技术人员理解，一个范围包括每个单独成员。因此，例如，包括1-3个物品的一组是指包括1个、2个或3个物品的多组。同样，包括1-5个物品的一组是指包括1个、2个、3个、4个或5个物品的多组。

I.心脏病和微小核糖核酸(MIRNA)

心脏病是一种存在多个类别或类型(例如，缺血性心肌病(ICM)、扩张型心肌病(DCM)、主动脉瓣狭窄(AS))的疾病，并且许多都需要独特的治疗策略。因此，心脏病不是一种单一疾病，而是一系列通过不同发病机制由不同细胞类型(例如，心肌细胞)引起的病症。心脏病治疗的挑战一直是对特定心脏病类型实施特异性疗法、使有效性最大化、使毒性最小化。因此，心脏病分类的改进对心脏病治疗进展至关重要。在本发明中，心脏病包括以下非限制性示例：心力衰竭(例如，充血性心力衰竭)、缺血性心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、酒精性心肌病、病毒性心肌病、心动过速性心肌病、应激性心肌病、淀粉样变心肌病、致心律失常性右心室发育不良、左心室致密化不全、心内膜弹力纤维增生症、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣狭窄、二尖瓣反流、二尖瓣脱垂、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣反流、三尖瓣狭窄、三尖瓣反流、先天性疾病、遗传性疾病或其组合。

心脏细胞再生：在整个20世纪，人们认为，人类心脏是一种终末分化有丝分裂后器官，损伤后无法修复。这一观点在2001年受到了挑战，当时，在心肌梗死后，心肌样细胞发生了明显的有丝分裂。其他人的研究证实，成年哺乳动物心脏可在损伤后引起原始的再生反应，在使用靶向特定信号通路的化学化合物后，成熟分化的单核哺乳动物心肌样细胞重新进入细胞周期。

miRNA(也称为miR)是保存在植物、动物和某些病毒中的非编码RNA小分子，在RNA沉默和转录后基因表达调控中发挥作用。1993年发现，miRNA是遗传调控的一个重要进化组成部分。miRNA通过碱基配对和mRNA分子内的沉默互补序列发挥作用，从而调节靶蛋白表达和下游信号通路。可靶向60％人类基因的人类基因组中存在1000种已知的miR。在动物中，通过约60bp的发夹前体(前体miRNA或前体miR)，由两种RNAse III酶Drosha和Dicer将miRNA从较大的初级转录物(初级miRNA或初级miR)加工成成熟形式(miRNA)。将成熟miRNA装入50核糖核蛋白复合物(RISC)中，在此处，其通常通过碱基对相互作用引导靶mRNA的下调。初级miRNA由RNA聚合酶II进行转录，并预计由转录因子以可诱导的方式进行调控。虽然某些miRNA进行普遍存在的表达，但是其他miRNA仅具有有限的发育期、组织或细胞类型特异性表达模式。

之前在心肌组织中进行了测量，结果表明，miRNA在心肌生长、纤维化和重构中发挥调控作用，更详细的说明见下文。特别是，核糖核酸干扰(RNAi)技术是一个重点研究领域，用于开发心脏病的新疗法，研究证明了腺相关病毒(AAV)在体内递送寡核苷酸的效用。在一次注射后长达3个月内，微小RNA(miR)let-7a/let-c和miR-99/100的两种单独AAV2/9病毒表达拮抗剂可在缺血性小鼠心脏中诱导心肌样细胞增殖。对经病毒递送的miR拮抗剂处理的小鼠心脏细胞和组织进行了转录组学和转化分析，结果表明，心脏发育、增殖以及肌肉结构和功能中所涉及的基因和蛋白表达存在差异，这意味着通过靶向这些miR，人心肌细胞和DMD模型中可产生相似的再生效应。

RNAi技术可采用多种形式，但是，通常以碱基对短发夹(sh)RNA(shRNA)的形式在细胞内实现，通过内源性miR通路，可将所述碱基对短发夹RNA加工成约20个碱基对的小干扰RNA。常用方法是通过病毒向miR递送互补序列。AAV载体是心血管肌肉基因递送的最佳载体，因为它们a)不包含刺激免疫应答的病毒蛋白编码序列；b)无需活跃的细胞分裂，即可进行表达；以及c)较腺病毒载体具有显著优势，因为其重组基因可在体内肌细胞中稳定、长期表达。基因的病毒递送正在开发中，用于治疗DMD，包括AAV 1-γ肌聚糖蛋白载体(作为LGMD疗法)、重组(r)AAV2.5载体(用于递送微小肌营养不良蛋白)和rAAV(恒河猴血清型74)。

如本发明所述，miRNA拮抗剂抑制靶miRNA的机制不受任何限制。例如，在某些实施例中，核酸拮抗剂可与靶miRNA序列形成双链体，并阻止从其前体中适当加工成熟miRNA产物，或可阻止成熟miRNA与其靶基因结合，或可导致初级miRNA、前体miRNA或成熟miRNA降解，或可通过某些其他机制发挥作用。

let-7a/c和miR-100/99：通过研究斑马鱼和新生小鼠的心脏再生机制，科学家们发现，心脏再生是一种主要由心肌细胞介导的过程，即成熟心肌样细胞去分化，然后增殖和进一步再分化。表观遗传重构和细胞周期控制是控制其再生过程的两个关键步骤。Aguirre等人(《细胞-干细胞》，2014年；15(5):589-604)报告了一项非常相关的研究，其中研究了心脏再生的潜在机制，并确定了一系列重点参与斑马鱼心脏再生的miR。在序列中和3'UTR结合位点，重点关注出现显著表达变化并保存在脊椎动物中的这些miR，可识别聚集在两个明确基因组位置的两个miR家族(miR-99/100、let-7a/c)。miR-99a/Let-7c-5p簇在调控脊椎动物心肌细胞形成中的普遍作用支持了这一发现。基于MIRANDA的miR-UTR结合预测表明，miR-99/100与斑马鱼FNTβ(法尼基转移酶的β亚基)和SMARCA5(染色质亚家族a第5成员的SWI/SNF相关基质相关肌动蛋白依赖性调控因子)之间发生强烈的相互作用，将miR家族与心肌样细胞中的细胞周期和表观遗传控制联系起来。值得注意的是，在哺乳动物心脏发育早期，miR-99/100和let-7a/c水平较低，会促进心脏质量快速增长，但在发育后期呈指数增加，FNTβ和SMARCA5蛋白水平相应降低，从而阻断了心肌样细胞的进一步增殖。对受损的人类心脏组织进行了事后分析，结果表明，这些miR是成年人心脏再生的保守障碍。对新生小鼠心肌样细胞(将两种病毒递送的拮抗剂转导到let-7a/c和miR-99/100)进行的RNA-seq转录组学分析揭示了表观遗传重构、脱甲基作用、心脏发育、增殖以及代谢途径、肌肉结构和功能(出乎意料地)所涉及基因的差异。的确，miR-let 7a/c和miR-99/100抑制分别靶向1072个和47个基因。

II.发明合成物

微小RNA拮抗剂

本发明包括包含多种microRNA(miR)拮抗剂的合成物的实施例。在本发明中，“miR拮抗剂”是指旨在干扰或抑制miRNA活性的一种药剂。在某些实施例中，miR拮抗剂包含靶向miRNA的反义化合物。在某些实施例中，miR拮抗剂包含修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸的核苷酸序列与miRNA或其前体的核苷酸序列互补。在其他实施例中，miR拮抗剂包含干扰或抑制miRNA活性的小分子等。在某些实施例中，miR拮抗剂为miR-99a拮抗剂。在某些实施例中，miR拮抗剂为miR-100-5p拮抗剂。在某些实施例中，miR拮抗剂为miR-Let-7a-5p拮抗剂。在某些实施例中，miR拮抗剂为miR-Let-7c-5p拮抗剂。例如，本发明所公开的miR拮抗剂可用于提供预防、抑制或减少心肌层(例如，心肌组织、心肌细胞)中靶基因表达的合成物和方法。因此，本发明所公开的某些实施例涉及将本发明所述的miR拮抗剂用于心脏病(包括心力衰竭)评价和治疗方法中。

根据本发明的这一方面和其他方面实现所述合成物的实施例可包括以下一个或多个特征。在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂包括4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50种miR拮抗剂或由上述任意两个值所界定范围内的许多拮抗剂。在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂包括选自以下几项的一种或多种：miR-99a拮抗剂、miR-100-5p拮抗剂、miR-Let-7a-5p拮抗剂、miR-Let-7c-5p拮抗剂及其组合。在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂。在某些实施例中，每个miR拮抗剂组中的数量与所述多种miR拮抗剂相同。在某些实施例中，每个miR拮抗剂组中的数量与所述多种miR拮抗剂不同。

因此，在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂包括至少一种miR拮抗剂，其核苷酸序列与本发明所公开的一种或多种miR拮抗剂的序列一致性为或约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。例如，在某些实施例中，所述miR拮抗剂包含或全部包含一个核苷酸序列，此核苷酸序列与本发明所公开的一种或多种miR拮抗剂的序列一致性为至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或以上。在某些实施例中，所述miR拮抗剂包含或全部包含一个核苷酸序列，此核苷酸序列与本发明所公开的一种或多种miR拮抗剂的序列一致性为至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或以上。在某些实施例中，所述miR拮抗剂包含或全部包含一个核苷酸序列，此核苷酸序列与本发明所公开的一种或多种miR拮抗剂的序列一致性约为85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。

在某些实施例中，所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种包括抗miR-99a，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:47、48、50、52和54的一个序列的序列一致性至少约为或约为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。在某些实施例中，所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-100-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列的序列一致性至少约为或约为80％、85％、90％、95％、96％、97、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7a-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个序列的序列一致性至少约为或约为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7c-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列的序列一致性至少约为或约为80％、85％、90％、95％、96％、97、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。

在本发明所公开合成物的某些实施例中，以下一项或多项适用。在某些实施例中，所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种包括抗miR-99a，相对于选自SEQ ID NO:47、48、50、52和54的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-100-5p，相对于选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7a-5p，相对于选自SEQID NO:37、39和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7c-5p，相对于选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。

在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂包括至少一种miR拮抗剂，相对于本发明所公开的一种或多种miR拮抗剂的核苷酸序列，其核苷酸序列包含或约包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或任意两个值之间的一个范围的错配核碱基。例如，在某些实施例中，所述miR拮抗剂包含或全部包含一个核苷酸序列，相对于本发明所公开的一种或多种miR拮抗剂的核苷酸序列，此核苷酸序列包含至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个或更多错配核碱基。在某些实施例中，所述miR拮抗剂包含或全部包含一个核苷酸序列，相对于本发明所公开的一种或多种miR拮抗剂的核苷酸序列，此核苷酸序列包含至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个或更多错配核碱基。

因此，在某些实施例中，所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种包括抗miR-99a，相对于选自SEQ ID NO:47、48、50、52和54的一个核苷酸序列，其核苷酸序列包含或约包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或任意两个值之间的一个范围的错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-100-5p，相对于选自SEQID NO:46、49、51、53和55的一个核苷酸序列，其核苷酸序列包含或约包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或任意两个值之间的一个范围的错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7a-5p，相对于选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个核苷酸序列，其核苷酸序列包含或约包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或任意两个值之间的一个范围的错配核碱基。在某些实施例中，所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7c-5p，相对于选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个核苷酸序列，其核苷酸序列包含或约包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或任意两个值之间的一个范围的错配核碱基。

在本发明所公开合成物的各个实施例中，至少一种所述抗miR包含本发明所述的一种或多种化学修饰。适当的化学修饰包括但不限于核碱基、糖和/或核苷间键修饰。由于具有期望特性，例如，细胞摄取增强、对其他寡核苷酸或核酸靶点的亲和力增强、在存在核酸酶时稳定性提高，可在未修饰的形式中选择修饰核碱基、糖和/或核苷间键。因此，在本发明所公开合成物的某些实施例中，至少一种所述抗miR包含选自修饰核苷间键、修饰核苷酸和修饰糖部分及其组合的一种或多种化学修饰。

在某些实施例中，所述一种或多种化学修饰包括修饰核苷间键。一般而言，修饰核苷间键可为本领域已知的任何核苷间键。适当修饰核苷间键的非限制性示例包括硫代磷酸酯、2'-O-甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。在某些实施例中，所述修饰核苷间键包含磷原子。在某些实施例中，所述修饰核苷间键不包含磷原子在某些此类实施例中，核苷间键由一个短链烷基核苷间键形成。在某些此类实施例中，核苷间键由一个环烷基核苷间键形成。在某些此类实施例中，核苷间键由一个混合杂原子和烷基核苷间键形成。在某些此类实施例中，核苷间键由一个混合杂原子和环烷基核苷间键形成。在某些此类实施例中，核苷间键由一个或多个短链杂原子核苷间键形成。在某些此类实施例中，核苷间键由一个或多个杂环核苷间键形成。在某些此类实施例中，核苷间键包含一个酰胺骨架。在某些此类实施例中，核苷间键包含混合N、O、S和CH₂组成部分。在某些实施例中，至少一种所述抗miR包含一个修饰核苷间键，即硫代磷酸酯核苷间键。

在某些实施例中，所述一种或多种化学修饰中的至少一种包括修饰核苷酸。修饰核苷酸通常可为任何修饰核苷酸，例如，锁核酸(LNA)化学修饰、肽核酸(PNA)、阿糖核酸(FANA)、类似物、衍生物或其组合。在某些实施例中，所述修饰核苷酸包括5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，修饰核苷酸选自5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤。在某些实施例中，所述修饰核苷酸选自7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在某些实施例中，所述修饰核苷酸选自5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。在某些实施例中，修饰核苷酸包含一个多环杂环。在某些实施例中，修饰核苷酸包含一个三环杂环。在某些实施例中，修饰核苷酸包含一种吩恶嗪衍生物。在某些实施例中，所述吩恶嗪可进行进一步的修饰，形成本领域已知的核碱基“G-钳”。

在某些实施例中，所述修饰核苷酸包括锁核酸(LNA)。在某些实施例中，所述一种或多种化学修饰包括至少一种锁核酸(LNA)化学修饰，用于增强效力、特异性和作用持续时间并拓宽寡核苷酸给药途径。用LNA核碱基取代碱基核苷酸序列中的某些核碱基，即可实现这一点。所述LNA修饰核苷酸序列的大小与亲本核碱基类似，也可能更大，优选更小。在某些实施例中，所述LNA修饰核苷酸序列包含小于约70％、小于约65％，更优选小于约60％、小于约55％，最优选小于约50％、小于约45％的LNA核碱基，其大小约为5-25个核苷酸，更优选约为12-20个核苷酸。在某些实施例中，所述锁核酸(LNA)包含在修饰抗miR的一端或两端。

在某些实施例中，所述一种或多种化学修饰包括至少一个修饰糖部分。在某些实施例中，糖修饰核苷为2'-修饰核苷，其中，在天然核糖或2'-脱氧-核糖中的2'碳处对所述糖环进行修饰。在某些实施例中，2'-修饰核苷包含一个双环糖部分。在某些此类实施例中，所述双环糖部分为采用α构型的D糖。在某些此类实施例中，所述双环糖部分为采用β构型的D糖。在某些此类实施例中，所述双环糖部分为采用α构型的L糖。在某些此类实施例中，所述双环糖部分为采用β构型的L糖。

在某些实施例中，所述双环糖部分在2'和4'碳原子之间包含一个桥基。在某些实施例中，所述桥基包含1-8个连接双自由基。在某些实施例中，所述双环糖部分包含1-4个连接双自由基。在某些实施例中，所述双环糖部分包含2个或3个连接双自由基。在某些实施例中，所述双环糖部分包含2个连接双自由基。在某些实施例中，连接双自由基选自-O-、-S-、-N(R₁)-、-C(R₁)(R₂)-、-C(R₁)＝C(R₁)-、-C(R₁)＝N-、-C(＝NR₁)-、-Si(R₁)(R₂)-、-S(＝O)₂-、-S(＝O)-、-C(＝O)-和-C(＝S)-；式中，每个R₁和R₂独立为H、羟基、C₁-C₁₂烷基、取代C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代C₅-C₂₀芳基、杂环自由基、取代杂环自由基、杂芳基、取代杂芳基、C₅-C₇脂环族自由基、取代C₅-C₇脂环族自由基、卤素、取代氧基(-O-)、氨基、取代氨基、叠氮基、羧基、取代羧基、酰基、取代酰基、CN、硫醇、取代硫醇、磺酰基(S(＝O)₂-H)、取代磺酰基、增效砜(S(＝O)-H)或取代增效砜；每个取代基独立为卤素、C₁-C₁₂烷基、取代C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代C₂-C₁₂炔基、氨基、取代氨基、酰基、取代酰基、C₁-C₁₂氨烷基、C₁-C₁₂氨基烷氧基、取代C₁-C₁₂氨烷基、取代C₁-C₁₂氨基烷氧基或保护基团。

在某些实施例中，所述双环糖部分在2'和4'碳原子之间通过一个双自由基进行桥接，所述双自由基选自-O-(CH₂)_P-、-O-CH₂-、-O-CH₂CH₂-、-O-CH(烷基)-、-NH-(CH₂)_P-、-N(烷基)-(CH₂)_P-、-O-CH(烷基)-、-(CH(烷基))-(CH₂)_P-、-NH-O-(CH₂)_P-、-N(烷基)-O-(CH₂)_P-或-O-N(烷基)-(CH₂)_P-，式中，p为1、2、3、4或5，每个烷基可进行进一步的取代。在某些实施例中，p为1、2或3。

在某些实施例中，2'-修饰核苷包含一个选自卤代、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF₃、OCF₃、O-、S-或N(R_m)-烷基；O-、S-或N(R_m)-烯基；O-、S-或N(R_m)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)或O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)的2'-取代基，式中，每个R_m和R_n独立为H、氨基保护基团或取代或未取代C₁-C₁₀烷基。可以用独立选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO₂)、硫醇、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基的一个或多个取代基进一步取代这些2'-取代基。

在某些实施例中，2'-修饰核苷包含一个选自F、NH₂、N₃、OCF₃、O-CH₃、O(CH₂)₃NH₂、CH₂-CH＝CH₂、O-CH₂-CH＝CH₂、OCH₂CH₂OCH₃、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(Rn)、-O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂和N-取代乙酰胺(O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)的2'-取代基，式中，每个R_m和R_n独立为H、氨基保护基团或取代或未取代C₁-C₁₀烷基。

在某些实施例中，2'-修饰核苷包含一个选自F、OCF₃、O-CH₃、OCH₂CH₂OCH₃、2'-O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(CH₃)₂、O(CH₂)₂O(CH₂)₂N-CH₃)₂和O-CH₂-C(＝O)-N(H)CH₃的2'-取代基。

在某些实施例中，2'-修饰核苷包含一个选自F、O-CH₃和OCH₂CH₂OCH₃的2'-取代基。

在某些实施例中，糖修饰核苷为4'-硫代修饰核苷。在某些实施例中，糖修饰核苷为4'-硫代-2'-修饰核苷。4'-硫代修饰核苷包含β-D-核糖核苷，其中，4'-O被4'-S取代。4'-硫代-2'-修饰核苷是一种4'-硫代修饰核苷，其2'-OH被2'-取代基取代。适当的2'-取代基包括2'-OCH₃、2'-O-(CH₂)₂-OCH₃和2'-F。

因此，在本发明的某些实施例中，所述修饰糖部分为2'-O-甲氧基乙基修饰糖部分、2'-甲氧基修饰糖部分、2'-O-烷基修饰糖部分、双环糖部分或其组合。在某些实施例中，所述修饰糖部分包括2'-O-甲基糖部分。

表达盒

在某些实施例中，本发明所述的一种或多种miR拮抗剂由表达盒编码并从其中表达。因此，一方面，本发明的某些实施例涉及表达盒，所述表达盒包含一个对本发明所述的一种或多种miR拮抗剂进行编码的核苷酸序列。在本发明中，“表达”是指通过转录将多核苷酸的遗传信息转化为RNA(通常由酶(RNA聚合酶)催化)以及在RNA对多肽进行编码的情况下通过翻译核糖体上的mRNA(产生编码蛋白)将其转化为蛋白的过程。在本发明中，术语“表达盒”是指对基因、蛋白或可操作连接至表达控制元件(如启动子)的功能RNA进行编码的核酸构建体以及影响基因转录或翻译的任何其他核酸序列或其组合(可选)，包括但不限于转录终止子、核糖体结合位点、剪接位点或剪接识别序列、内含子、增强子、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点等。

克隆载体和表达载体

在相关方面，本发明所述的一种或多种miR拮抗剂可由克隆载体或表达载体编码并从其中表达。因此，本申请的某些实施例涉及一种克隆抗体或表达抗体，包括本发明所公开的表达盒。在本发明中，术语“载体”是指一种核酸构建体，通常为质粒或病毒，用于将遗传物质输送到宿主细胞。例如，载体可为病毒、质粒、粘粒或噬菌体。在本发明中，载体可由DNA或RNA组成。在某些实施例中，载体由DNA组成。在某些实施例中，载体由RNA组成。术语“载体”包括克隆载体和表达载体以及病毒载体和整合载体。“表达盒”是一种载体，在适当的环境中，能够指导基因或蛋白(由载体所携带的一个或多个基因编码)的表达。载体优选能够自主复制。表达载体通常包含一个转录因子、一个基因和一个转录终止子。基因表达通常在启动子的控制下，据说基因“可操作连接至”启动子。

因此，在某些实施例中，本发明所公开的克隆载体或表达载体包括表达盒，所述表达盒包含一个对本发明所述的一种或多种miR拮抗剂进行编码的核苷酸序列。在某些实施例中，本发明所公开的克隆载体或表达载体包括表达盒，所述表达盒包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列。

在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体为病毒载体。在本发明中，“病毒载体”是一种病毒衍生核酸分子，能够将另一种核酸运输到细胞中。在适当的环境中，病毒载体能够指导基因或蛋白(由载体所携带的一个或多个基因编码)的表达。病毒载体的示例包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。

因此，在某些实施例中，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体或任何血清型。在本发明中，术语“血清型”或“血清变型”是一种细菌或病毒内或不同个体免疫细胞中的明显变异。根据其细胞表面抗原，将这些微生物、病毒或细胞分类在一起，使生物体的流行病学分类达到亚种水平。一般而言，AAV载体可为任何现有AAV载体，例如，可为选自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的AAV载体或其衍生嵌合AAV，甚至更适用于在目标组织中进行高效转导。在转染后，AAV只在宿主内引起轻微的免疫反应(如有)。因此，AAV载体非常适用于基因疗法。据报告，对于小鼠体内转导，AAV血清型6和AAV血清型9尤其适用。将基因转移到人体内时，通常优选AAV血清型1、6、8和9。还假设AAV的治疗基因包装能力仅限于约4.9kb，而较长的序列会导致AAV粒子截断。在某些实施例中，所述AAV载体为AAV2/9载体，例如，交叉包装成AAV衣壳的AAV2反向末端重复(ITR)序列。

在某些实施例中，本发明公开了克隆载体或表达载体，其核苷酸序列与本发明所公开的一种或多种载体的序列一致性为或约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。例如，在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含或全部包含一个核苷酸序列，此核苷酸序列与JBT-miRl全序列(SEQ ID NO:85)的序列一致性为至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或以上。在某些实施例中，所述载体包含或全部包含一个核苷酸序列，此核苷酸序列与JBT-miR2核苷酸序列的序列一致性为至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或以上。在某些实施例中，所述载体包含或全部包含一个核苷酸序列，此核苷酸序列与JBT-miRl全序列(SEQ IDNO:85)或JBT-miR2的序列一致性约为85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。

在某些实施例中，本发明所公开的克隆载体或表达载体包括一个核苷酸序列，此核苷酸序列与SEQ ID NO:59-64中每个核苷酸序列的序列一致性为或约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。在某些实施例中，本发明所公开的克隆载体或表达载体包括一个核苷酸序列，此核苷酸序列与SEQ ID NO:86-89中每个核苷酸序列的序列一致性为或约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。在某些实施例中，本发明所公开的克隆载体或表达载体包括一个核苷酸序列，此核苷酸序列与SEQ IDNO:59-64和SEQ ID NO:86-89中每个核苷酸序列的序列一致性为或约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。在某些实施例中，本发明所公开的克隆载体或表达载体包括一个核苷酸序列，此核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:8的序列一致性为或约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或任意两个值之间的一个范围。

治疗合成物和药物制剂

另一方面，本发明公开了治疗合成物的实施例，所述治疗合成物包含有效量的至少一种治疗剂以及以下一项或多项的：a)一种包含本发明所公开多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物；b)一个本发明所公开的表达盒；以及一个本发明所公开的克隆载体或表达载体。

虽然可以未加工物质的形式施用所述药剂，但是，考虑到其效力，优选以药物制剂的形式提供它们。因此，在本发明所公开合成物的某些实施例中，将所述合成物进一步配制成药物制剂。术语“药物制剂”是指适用于向个体施用、包含一种药剂的合成物。例如，本发明某些方面和实施例所述的药物制剂可包含本发明所公开的一种抗miR拮抗剂和一种无菌水溶液。例如，本发明所述供人类使用的药物制剂包含所述药剂及其一个或多个可接受载体和其他治疗成分(可选)。在与制剂的其他成分相容的意义上，所述载体必须“可接受”，并且不得对其受体有害或对活性剂的抑制功能有害。理想情况下，所述药物制剂不得包含氧化剂以及已知与所述药剂不相容的其他物质。

因此，本发明所公开的某些实施例涉及包含本发明所述治疗合成物和可药用载体的药物制剂。所述制剂还可包含稀释剂、稳定剂、赋形剂和佐剂等附加成分。在本发明中，“可药用”载体、赋形剂、稀释剂、佐剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对其接触到的细胞或受试者无毒(优选惰性)，或具有由技术熟练的从业人员确定的可接受毒性水平。

所述药物制剂还可包含缓冲剂，以使制剂具有适当的pH值。适当的此类材料包括磷酸钠和乙酸。氯化钠或甘油可用于使制剂与血液保持等渗。如需要，可在惰性气氛(如氮气)下将所述制剂灌装到容器中，或所述制剂可包含抗氧化剂，并以单位剂量或多剂量的形式方便提供，例如，在密封的安瓿瓶中。

所述载体、稀释剂和佐剂可包括抗氧化剂(如抗坏血酸)、低分子量多肽(例如，少于10个残基)；蛋白(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如明胶、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(如EDTA)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；成盐平衡离子(如钠)；和/或非离子表面活性剂(如吐温^TM、普朗尼克^TM或聚乙二醇(PEG))。在某些实施例中，所述生理上可接受的载体是一种水性pH缓冲溶液。

一般而言，可通过本领域已知的任何一种方法和技术来制备本发明所述的药物制剂。例如，可通过湿法制粒、干法制粒、直接压缩等制备固体剂型。在某些实施例中，本发明所述的固体剂型可包覆包衣或以其他方式复合，从而提供具有长效优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂量组分和外剂量组分，后者将包裹前者。在某些实施例中，所述两种组分可由肠溶层隔开，以防胃内崩解，并使内组分完整进入十二指肠或迟释。在这些情况下，各种材料均可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种聚合酸或聚合酸与此类材料(如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素)的混合物。

根据特定表达载体、给药方式、治疗目标、个体以及靶向的细胞类型，所述表达载体和/或所施用的一种或多种miRNA拮抗剂的滴度将有所不同，可通过本领域的标准方法进行确定。

对于本领域的普通技术人员，显而易见的是，根据年龄、体重、痛苦的严重程度、所治疗的动物物种、使用的特定表达载体以及所述表达载体和/或一种或多种miRNA拮抗剂的特定用途，所述表达载体和/或所施用的一种或多种miRNA拮抗剂的有用体内剂量以及特定给药方式将有所不同。可由本领域的普通技术人员使用常规药理学方法确定有效剂量水平，所述有效剂量水平是实现预期结果所必需的剂量水平。通常从较低剂量水平开始产品的人体临床应用，然后剂量水平逐渐增加，直至达到预期作用。可替代地，可接受的体外研究可用于使用既定的药理学方法确定本方法所确定的合成物有用剂量和给药途径。

例如，可调整给药方案，以提供最佳预期反应。例如，可给药一次，或可在一段时间内分几次给药，或根据治疗情况的紧急状态，可按比例减少或增加剂量。以单位剂型配制胃肠外合成物和制剂以易于给药及确保剂量均匀特别有利。在本发明中，“单位剂型”是指用作待治疗哺乳动物受试者单位剂量的物理离散单位；每单位含有预定量的活性化合物，经计算，与所需药物载体结合时可产生预期治疗作用。本发明的单位剂型规格决定于并直接取决于：(a)治疗剂的特性和需达到的特定治疗或预防作用，以及(b)合成此类活性化合物以进行个体敏感性治疗在领域的固有局限性。

因此，根据本发明所公开的内容，本领域的技术人员将理解，根据治疗领域众所周知的方法来调整剂量和给药方案。也就是说，很容易确定最大耐受剂量，还可确定向患者提供可检测疗效的有效剂量以及向患者提供可检测疗效的每种药剂的给药时间要求。因此，虽然本发明举例说明了某些剂量和给药方案，但这些示例不得以任何方式限制在本发明的实践中可向患者提供的剂量和给药方案。

应注意，剂量值可能因需减轻的病症类型和严重程度而有所不同，可包括单剂量或多剂量。应进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需求以及合成物施用或施用监督人员的专业判断，随时间调整具体给药方案，本发明所列的剂量范围仅用作示例，并不旨在限制权利要求所述合成物的范围或实践。例如，可根据药代动力学或药效动力学参数来调整剂量，所述参数可包括临床作用(如毒性作用)和/或实验室值。因此，本发明包括本领域技术人员所确定的患者内剂量递增。确定治疗剂的适当给药剂量和方案在相关领域众所周知，在提供本发明所公开的指导后，将理解为由本领域的技术人员完成。

可向有需要的受试者(例如，人类)施用本发明所公开的表达载体和/或miRNA拮抗剂。给药途径无特定限制。例如，可通过本领域的标准途径向受试者施用治疗有效量的重组病毒。所述途径的非限制性示例包括肌肉内、阴道内、静脉内、腹膜内、皮下、表皮、皮内、直肠、眼内、肺部、颅内、骨内、口腔、颊或鼻腔。在某些实施例中，通过肌肉内注射，向受试者施用所述重组病毒。在某些实施例中，通过阴道内注射，向受试者施用所述重组病毒。在某些实施例中，通过胃肠外途径(例如，通过静脉内、肌肉内或皮下注射)、通过表面划破或通过接种到受试者的体腔中，向受试者施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。在某些实施例中，向肌肉细胞(如心肌细胞)施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。

在通过注射来施用这些小miR寡核苷酸拮抗剂时，可通过连续输注、单次或多次团注进行所述给药。根据患者的年龄、体重、性别、一般医疗状况和既往病史等此类因素，所施用miR拮抗剂的剂量将有所不同。通常需要为受体提供在约1pg/kg-10mg/kg(药剂量/患者体重)范围内的分子剂量，但是，也可施用较低或较高剂量。

在某些实施例中，可能需要将治疗剂靶向递送至心脏，同时限制将所述治疗剂递送至其他器官。这可通过本领域已知的任何一种方法来实现。在某些实施例中，本发明所述治疗合成物或药物制剂的心脏递送包括冠状动脉输注。在某些实施例中，冠状动脉输注包括通过股动脉插入导管，并使导管穿过主动脉到达冠状动脉的起点。在某些其他实施例中，将治疗剂靶向递送至心脏包括使用抗体-鱼精蛋白融合蛋白(如之前所述的蛋白)(Song E等人，《自然生物技术》，2005年)递送本发明所公开的小miR寡核苷酸拮抗剂。

可通过任何物理方法完成所述表达载体和/或miRNA拮抗剂的实际给药，此类物理方法将所述表达载体和/或miRNA拮抗剂运输到受试者的靶组织中。例如，可将所述表达载体和/或miRNA拮抗剂注射到肌肉、血流中和/或直接注射到肝脏中。可将药物制剂配制为注射制剂或局部制剂，通过经皮运输递送至肌肉。

为进行肌肉内注射，可使用芝麻油或花生油等佐剂溶液或丙二醇水溶液以及无菌水溶液。如需要，可对此类水溶液进行缓冲，首先使液体稀释剂与生理盐水或葡萄糖等渗。可在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备所述表达载体和/或miRNA拮抗剂的游离酸(DNA包含酸性磷酸基)或在药理学上可接受的盐溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及油中制备所述表达载体和/或miRNA拮抗剂的分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以防止微生物生长。

可以液体或冻干形式(结合一种或多种适当的防腐剂和/或保护剂，从而在冻干过程中保护病毒)使用待使用的所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。对于基因疗法(例如，可通过特定基因产品得到改善的神经障碍的基因疗法)，向需要此类治疗的宿主施用治疗有效量的重组病毒(表达治疗蛋白)。在生产诱导宿主免疫或向宿主提供基因疗法的药物时使用本发明所公开的表达载体和/或miRNA拮抗剂在本申请的范围内。

如果已针对至少某些病症确定所述表达载体和/或miRNA拮抗剂的人体剂量，则可使用这些相同剂量或约0.1％-500％，更优选约25％-250％既定人体剂量的剂量。如果未确定人体剂量(新发现的药物制剂正是如此)，则可根据ED₅₀或ID₅₀值或源自体外或体内研究的其他适当值推断出适当的人体剂量(通过动物毒性研究和疗效研究确定合格)。

可在各个时间点向受试者施用治疗有效量的所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。例如，可在病毒感染之前、期间或之后向受试者施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。可在疾病(例如，癌症)发生之前、期间或之后向受试者施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。在某些实施例中，在癌症缓解期间，向受试者施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。在某些实施例中，在病毒感染前施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂，以进行免疫预防。

可替代地或此外，所述表达载体和/或miRNA拮抗剂的给药频率可能有所不同。例如，可以约每周一次、约每两周一次、约每月一次、约每六个月一次、约每一年一次、约每两年一次、约每三年一次、约每四年一次、约每五年一次、约每六年一次、约每七年一次、约每八年一次、约每九年一次、约每十年一次或约每十五年一次的频率向受试者施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。在某些实施例中，以至多约每周一次、至多约每两周一次、至多约每月一次、至多约每六个月一次、至多约每一年一次、至多约每两年一次、至多约每三年一次、至多约每四年一次、至多约每五年一次、至多约每六年一次、至多约每七年一次、至多约每八年一次、至多约每九年一次、至多约每十年一次或至多约每十五年一次的频率向受试者施用所述表达载体和/或miRNA拮抗剂。

在某些实施例中，提供了一种药物试剂盒，其中，所述试剂盒包含：任何上述治疗合成物和药物制剂以及(a)表明所述制剂适用于在心肌细胞(例如，心肌样细胞)中抑制心脏病相关基因的功能和/或(b)提供药物制剂给药指南的书面信息。

III.发明方法

在本发明中，术语“缺血再灌注损伤”(IRI)应具有普通含义，还应指由缺血、再灌注或缺血再灌注引起的组织损伤。因此，术语“缺血再灌注损伤”包括由缺血引起的损伤、再灌注损伤以及由缺血再灌注引起的损伤。心肌梗死(MI)是一种心脏缺血事件，可导致心脏组织IR损伤。在本发明中，“由缺血导致的损伤”、“由缺血引起的损伤”和“缺血损伤”可指由缺血或供血不足(例如，由于动脉阻塞)以及由此导致的供氧不足引起的细胞、组织或器官损伤，进而导致组织或器官损伤或功能障碍。在某些实施例中，术语“缺血再灌注损伤”是指由之前因缺血事件而血流量不足的组织或器官的血流恢复而导致的损伤。与再灌注相关的氧化应激可能导致受影响的组织或器官损伤。缺血再灌注损伤的生化特征在于，在缺氧事件期间氧气耗尽，然后是在再灌注时进行再氧合，同时产生活性氧类。在某些实施例中，在再灌注时施用本发明所提供的合成物。在某些实施例中，“在再灌注时”可从再灌注前2小时到再灌注后2小时以及在再灌注的同时。这意味着，可在施用溶栓剂的同时或在进行手术干预以消除阻塞血流的血块时，施用本发明所提供的合成物。

所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-99a，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:47、48、50、52和54的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-100-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。。所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-Let-7a-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-Let-7c-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-99a，相对于选自SEQID NO:47、48、50、52和54的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-100-5p，相对于选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-Let-7a-5p，相对于选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种可包括抗miR-Let-7c-5p，相对于选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。

至少一种所述抗miR可包含选自修饰核苷间键、修饰核苷酸和修饰糖部分及其组合的一种或多种化学修饰。所述一种或多种化学修饰可包括修饰核苷间键。所述修饰核苷间键可选自硫代磷酸酯、2'-O-甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。所述修饰核苷间键可包括硫代磷酸酯核苷间键。所述一种或多种化学修饰中的至少一种可包括修饰核苷酸。所述修饰核苷酸可包括锁核酸(LNA)。所述锁核酸(LNA)可包含在修饰抗miR的一端或两端。所述修饰核苷酸可包括锁核酸(LNA)化学修饰、肽核酸(PNA)、阿糖核酸(FANA)、类似物、衍生物或其组合。所述一种或多种化学修饰中的至少一种可包括修饰糖部分。所述修饰糖部分可为2'-O-甲氧基乙基修饰糖部分、2'-甲氧基修饰糖部分、2'-O-烷基修饰糖部分、双环糖部分或其组合。所述修饰糖部分可包括2'-O-甲基糖部分。

本发明所公开的克隆载体或表达载体可为病毒载体。所述病毒载体可为慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。所述克隆载体或表达载体可包含：(a)一个与SEQ ID NO:59-64中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列；(b)一个与SEQ ID NO:86-89中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列；或(c)一个与(a)和(b)所示SEQID NO中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。所述克隆载体或表达载体可包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:85的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂由相同表达盒或载体进行编码。在某些实施例中，所述多种miR拮抗剂由不同表达盒或载体进行编码。

所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:101的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述表达盒包括一个强诱饵(TuD)盒，其包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂进行编码的核苷酸序列。在某些实施例中，所述TuD盒包含与核苷酸序列(对一种或多种miR-99a拮抗剂进行编码)可操作连接的一个或多个启动子序列，可选地，所述一个或多个启动子序列包含H1启动子和/或U6启动子。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含两个或多个TuD盒。在某些实施例中，所含克隆载体或表达载体包含两个或多个TuD盒的治疗合成物的有效剂量比所含克隆载体或表达载体包含一个TuD盒的治疗合成物的有效剂量至少约少1.1倍。在某些实施例中，所述TuD盒包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:98的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:99的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。在某些实施例中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:100的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

在某些实施例中，在心脏缺血事件发生前施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在心脏缺血事件期间施用所述治疗合成物。可在缺血心脏组织再灌注前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时或约96小时施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在缺血心脏组织再灌注时施用所述治疗合成物。在某些实施例中，在缺血心脏组织再灌注后施用所述治疗合成物。可在缺血心脏组织再灌注后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20天施用所述治疗合成物。

所述治疗合成物可包含多种微小RNA(miR)拮抗剂，所述给药可包括皮下给药、全身给药和/或冠脉内给药，所述治疗合成物的施用剂量可以为约0.0001mg/kg-100mg/kg(例如，约0.08mg/kg、约0.24mg/kg、约0.81mg/kg、约1.22mg/kg、约2.44mg/kg、约3.25mg/kg、约4.06mg/kg、约4.89mg/kg、约5.69mg/kg、约6.50mg/kg、约7.32mg/kg或约8.13mg/kg)。所述治疗合成物可包含多种微小RNA(miR)拮抗剂，所述给药可包括脑室内给药和/或心肌内给药，所述治疗合成物的施用剂量可以为约0.0001mg/kg-100mg/kg(例如，约0.004mg/kg、约0.012mg/kg、约0.0405mg/kg、约0.061mg/kg、约0.122mg/kg、约0.1625mg/kg、约0.203mg/kg、约0.2445mg/kg、约0.2845mg/kg、约0.325mg/kg、约0.366mg/kg或约0.4065mg/kg)。在某些实施例中，与所述治疗合成物的静脉内给药相比，所述治疗合成物的皮下给药可提高生存率，并降低心脏血栓的发生率。

所述治疗合成物可包含一个病毒载体，所述给药可包括采用约1.0×10⁵vg/kg-1.0×10¹⁹vg/kg(例如，约2.5×10¹²vg(病毒基因组)/kg、约2.5×10¹³vg/kg、约2.5×10¹⁴vg/kg或约2.5×10¹⁵vg/kg)剂量的静脉内全身给药和/或冠脉内给药。所述治疗合成物可包含一个病毒载体，所述给药可包括脑室内给药和/或心肌内给药，所述治疗合成物的施用剂量可以为约1.0×10⁵vg/kg-l.0×10¹⁹vg/kg(例如，约0.125×10¹²vg/kg、约0.125×10¹³vg/kg、约0.125×10¹⁴vg/kg或约0.125×10¹⁵vg/kg)。

所述治疗合成物可为药物合成物。所述受试者可为哺乳动物(例如，人类)。可通过单次给药来施用所述剂量。可通过多次给药来施用所述剂量。所述方法可包括：向受试者重复施用所述治疗合成物。所述重复施用可包括向受试者施用一个或多个附加剂量的所述治疗合成物。附加剂量的数量可能有所不同，可为1个附加剂量到100个附加剂量。所述一个或多个附加剂量可与初始给药相同，或大于或小于初始给药。可采用与初始给药相同的方式施用所述一个或多个附加剂量。所述重复施用可包括在缺血心脏组织再灌注后约1分钟至约1000天(例如，约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天和/或约20天)向受试者施用一个或多个附加剂量的所述治疗合成物。

本发明所公开的方法可包括向受试者施用有效量的至少一种附加治疗剂或至少一种附加疗法，实现联合疗法。可在单独制剂中施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法的每一种，或可在单一制剂中同时施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法。在某些实施例中，按顺序施用、同时施用和/或交替施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法。所述至少一种附加治疗剂或疗法可选自：艾地苯醌、依普利酮、VECTTOR、AVI-4658、阿塔鲁伦/PTC124/Translarna、BMN044/PRO044、CAT-1004、微型肌营养不良蛋白AAV基因疗法(SGT-001)、半乳糖蛋白-1疗法(SB-002)、LTBB4(SB-001)、rAAV2.5-CMV-微小肌营养不良蛋白、谷氨酰胺、NFKB抑制剂、肌聚糖蛋白、δ(35kDa肌营养不良蛋白相关糖蛋白)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达、通过CRISPR/Cas9系统进行的基因组编辑、旨在重新引入肌营养不良蛋白基因功能重组版本的任何基因递送疗法、外显子跳跃疗法、无义突变的通读策略、细胞疗法、肌营养相关蛋白上调、肌肉生长抑制素抑制、抗炎药/抗氧化剂、机械支持装置、生物药物、基因疗法或治疗性基因调节剂、肌营养不良症的任何标准疗法及其组合。所述至少一种附加治疗剂或疗法可选自：经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术、溶栓疗法、抗血小板疗法、肝素、华法林、纤维蛋白溶解剂、氧疗、血管舒张剂、止痛药、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、糖蛋白拮抗剂、他汀类药物、醛固酮拮抗剂、植入式心脏除颤器(ICD)或其任何组合。

缺血心脏组织再灌注可包括经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术、溶栓疗法、抗血小板疗法、肝素、华法林、纤维蛋白溶解剂、氧疗、血管舒张剂、止痛药、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、糖蛋白拮抗剂、他汀类药物、醛固酮拮抗剂、植入式心脏除颤器(ICD)或其任何组合。

在某些实施例中，所述受试者患有或疑似患有心脏病。所述心脏病可为心肌梗死、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心力衰竭(例如，充血性心力衰竭)、缺血性心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、酒精性心肌病、病毒性心肌病、心动过速性心肌病、应激性心肌病、淀粉样变心肌病、致心律失常性右心室发育不良、左心室致密化不全、心内膜弹力纤维增生症、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣狭窄、二尖瓣反流、二尖瓣脱垂、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣反流、三尖瓣狭窄、三尖瓣反流、先天性疾病、遗传性疾病或其任何组合。所述受试者可能受选自以下几项的一种病症影响：酒精性心肌病、冠状动脉疾病、先天性心脏病、影响心脏的营养性疾病、缺血性心肌病、高血压性心肌病、瓣膜性心肌病、炎症性心肌病、继发于全身代谢性疾病的心肌病、扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、限制型心肌病(RCM)、致密化不全心肌病、主动脉瓣上狭窄(SVAS)、血管瘢痕形成、动脉粥样硬化、慢性进行性肾小球疾病、肾小球硬化症、进行性肾衰竭、血管闭塞、高血压、狭窄、糖尿病性视网膜病变或其任何组合。

所述心脏缺血再灌注损伤可包括心脏缺血损伤、心脏再灌注损伤或其组合。在某些实施例中，与对照受试者相比，所述给药减轻了心脏缺血损伤、心脏再灌注损伤或其组合。在某些实施例中，与对照受试者相比，所述给药降低了肌酸激酶水平。所述心脏缺血再灌注损伤可包括由心脏缺血事件、再灌注损伤或其组合引起的损伤。

所述心脏缺血事件可包括以下一项或多项：心肌梗死、冠状动脉旁路移植术(CABG)、心脏搭桥手术、心脏移植术和血管成形术。所述心脏缺血事件可包括使用以下器械的血管介入手术：支架、激光导管、动脉粥样硬化切除术导管、血管镜检查器械、β或γ辐射导管、冠状动脉旋磨术器械、涂层支架、放射性球囊、可加热线、可加热球囊、可生物降解支架撑杆、可生物降解套管或其任何组合。

本发明所提供的合成物还可用于在治疗性干预前离体抑制细胞、组织或器官(例如，在移植手术中使用的组织、在器官移植手术中使用的器官)的缺血或缺血再灌注损伤。例如，在将器官移植到宿主个体的体内前(例如，在无菌环境中储存或运输器官时)，器官可与本发明所提供的合成物接触(例如，浸泡在含有本发明所提供合成物的溶液中)，从而抑制缺血或缺血再灌注损伤。

本发明所提供的方法可治疗与一个或多个FHL1突变和/或一个或多个TNNT2突变相关的疾病或病症。在某些实施例中，所述治疗合成物增加FHL1和/或TNNT2的mRNA水平和/或蛋白水平。所述疾病或病症可为肌营养不良症或肌营养不良症样肌肉疾病。所述肌营养不良症可能与肌萎缩侧索硬化症(ALS)、腓骨肌萎缩症(CMT)、先天性肌营养不良症(CMD)、杜氏肌营养不良症(DMD)、Emery-Dreifuss肌营养不良症(EDMD)、遗传性和内分泌肌病、肌肉代谢性疾病、线粒体肌病(MM)、强直性肌营养不良症(MMD)、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)或其组合相关。所述疾病或病症可为肢带型肌营养不良症、X连锁肌病伴姿势性肌萎缩(XMPMA)、还原体肌病(RBM)、肩胛腓骨(SP)综合征或其任何组合。所述疾病或病症可为肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、扩张型心肌病(DCM)或其任何组合。所述肥厚型心肌病可为家族性肥厚型心肌病。

在某些实施例中，本发明所公开的合成物具有肾治疗作用。在某些实施例中，所述肾治疗作用包括肾保护作用或肾预防作用。本发明所提供的方法可治疗与受试者肾功能相关的肾脏病症。所述肾脏病症可选自：急性肾病(AKD)、急性肾损伤、急性和快速进行性肾小球肾炎、肾病综合征的急性表现、急性肾盂肾炎、急性肾衰竭、特发性慢性肾小球肾炎、继发性慢性肾小球肾炎、慢性心力衰竭、慢性间质性肾炎、慢性肾病(CKD)、慢性肝病、慢性肾盂肾炎、糖尿病、糖尿病性肾病、纤维化、局灶性节段性肾小球硬化症、古德帕斯彻病、糖尿病性肾病、遗传性肾病、间质性肾病、高血压性肾硬化症、IgG4相关性肾病、间质性炎症、狼疮性肾炎、肾炎综合征、尿路部分梗阻、多囊性肾病、进行性肾病、肾细胞癌、肾纤维化、肾移植后的移植物抗宿主病和血管炎。本发明所提供的方法可保护受试者肾脏免受与以下一项或多项相关的损伤：手术、放射性造影剂成像、放射性造影剂肾病、心血管手术、心肺转流术、体外膜肺氧合(ECMO)、球囊血管成形术、诱导性心脏或脑缺血再灌注损伤、器官移植、肾移植、败血症、休克、低血压、高血压、肾灌注不足、化疗、给药、肾毒性药物给药、钝力外伤、穿刺、毒药或吸烟。所述治疗合成物可与选自以下几项的肾治疗剂联合施用：地塞米松、类固醇、布地奈德、曲安奈德、抗炎剂、抗氧化剂、去铁胺、铁胺、锡络合物、锡卟啉络合物、金属螯合剂、乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA-Fe络合物、二巯基琥珀酸(DMSA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、青霉胺、米诺环素、强的松、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、霉酚酸、西罗莫司、环孢菌素或他克莫司抗生素、铁螯合剂、卟啉、血红素、维生素B12、Nrf2通路激活剂、巴多索龙、ACE抑制剂、依那普利、甘氨酸聚合物、抗氧化剂、谷胱甘肽、N乙酰半胱氨酸、化疗剂、QPI-1002、QM56、SVT016426(QM31)、16/86(第三代铁他汀类药物)、BASP siRNA、CCX140、BIIB023、CXA-10、碱性磷酸酶、Dnmtl抑制剂、THR-184、锂、福莫特罗、IL-22、EPO、EPO衍生物、促红细胞生成素刺激剂、阿法依泊汀、阿法达依泊汀、PDGF抑制剂、CRMD-001、阿曲生坦、托伐普坦、RWJ-676070、阿巴西普、Sotatercept、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷类、非甾体抗炎药(NSAID)、利尿剂、他汀类药物、抗衰老药物、皮质类固醇、糖皮质激素、脂质体、肾素、血管紧张素、ACE抑制剂、凋亡介质、纤维化介质、靶向p53的药物、Apaf-1抑制剂、RIPK1抑制剂、RIPK3抑制剂、IL17抑制剂、IL6抑制剂、IL23抑制剂、CCR2抑制剂、硝化脂肪酸、血管紧张素阻滞剂、ALK3受体激动剂和视黄酸。所述治疗合成物可与肾保护剂或肾预防剂联合施用，包括但并不限于：噻嗪类、布美他尼、依他尼酸、呋塞米、托拉塞米、葡萄糖、甘露糖醇、阿米洛利、螺内酯、依普利酮、氨苯蝶啶、坎利酸钾、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪、加压素、两性霉素B、乙酰唑胺、托伐普坦、考尼伐坦、多巴胺、多佐胺、咖啡因、茶碱、可可碱、他汀类药物、抗衰老药物、纳维克拉、奥巴克拉、皮质类固醇、强的松、倍他米松、氟氢可的松、脱氧皮质酮、醛固酮、可的松、氢化可的松、倍氯米松、莫米松、氟替卡松、泼尼松龙、甲基强的松龙、曲安奈德、糖皮质激素、地塞米松、类固醇、布地奈德、曲安奈德、抗炎剂、抗氧化剂、非甾体抗炎药(NSAID)、去铁胺、铁、锡、金属、金属螯合物、乙二胺四乙酸(EDTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、青霉胺、抗生素、氨基糖苷类、铁螯合剂、卟啉、Nrf2通路激活剂、巴多索龙、ACE抑制剂、依那普利、甘氨酸聚合物、抗氧化剂、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、PDGF抑制剂、锂、铁死亡抑制剂、维生素B12QPI-1002、QM56、SVT016426(QM31)、16/86(第三代铁他汀类药物)、BASP siRNA、CCX140、BIIB023、CXA-10、碱性磷酸酶、Dnmtl抑制剂、THR-184、锂、福莫特罗、IL-22、EPO、EPO衍生物、促红细胞生成素刺激剂、阿法依泊汀、阿法达依泊汀、PDGF抑制剂、CRMD-001、阿曲生坦、托伐普坦、RWJ-676070、阿巴西普、Sotatercept、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷类、非甾体抗炎药(NSAID)、利尿剂、他汀类药物、抗衰老药物、皮质类固醇、糖皮质激素、脂质体、肾素、血管紧张素、ACE抑制剂、凋亡介质、纤维化介质、靶向p53的药物、Apaf-1抑制剂、RIPK1抑制剂、RIPK3抑制剂、IL17抑制剂、IL6抑制剂、IL23抑制剂、CCR2抑制剂、硝化脂肪酸、血管紧张素阻滞剂、ALK3受体激动剂、SGLT2调节剂和视黄酸。所述治疗合成物可改善选自以下几项的一个或多个受试者肾功能标志物：受试者体内的血尿素氮(BUN)减少、受试者血液中的肌酐减少、受试者的肌酐清除率提高、受试者体内的蛋白尿减少、受试者的白蛋白:肌酐比降低、受试者的肾小球滤过率提高、受试者尿液中的NAG减少、受试者尿液中的NGAL减少、受试者尿液中的KIM-1减少、受试者尿液中的IL-18减少、受试者尿液中的MCP1减少、受试者尿液中的CTGF减少、受试者尿液中的胶原蛋白IV片段减少、受试者尿液中的胶原蛋白III片段减少、受试者尿液中的足细胞蛋白水平降低(其中，所述足细胞蛋白选自肾病蛋白和足突蛋白)、受试者血液中的胱抑素C蛋白减少、受试者血液中的β-微量蛋白(BTP)减少以及受试者血液中的2-微球蛋白(B2M)减少。

IV.联合疗法

在某些实施例中，所述治疗合成物和药物制剂包含本发明所公开的微小RNA拮抗剂(如序列表中提供的或包含本发明所公开的微小RNA拮抗剂组合的治疗合成物和药物制剂)、一个表达盒(包含一个对本发明所公开的一种或多种微小RNA拮抗剂进行编码的核苷酸序列)或一个包含一种或多种此类表达盒的载体，可与一种或多种附加治疗剂联合使用。在某些实施例中，包含本发明所公开微小RNA拮抗剂的所述治疗合成物和药物制剂(如序列表中提供的治疗合成物和药物制剂或包含本发明所公开的微小RNA拮抗剂、一个表达盒(包含一个对本发明所公开的一种或多种微小RNA拮抗剂进行编码的核苷酸序列)或一个包含一个或多个此类表达盒的载体组合的治疗合成物和药物制剂)可与一种或多种疗法联合使用。

一般而言，肌营养不良症的任何药理学或非药理学治疗方法可在本发明所公开的方法中适当用作附加治疗剂和疗法。可与本发明所公开的微小RNA拮抗剂或包含本发明所公开的微小RNA拮抗剂、一个表达盒(包含一个对本发明所公开的一种或多种微小RNA拮抗剂进行编码的核苷酸序列)或一个包含一个或多个此类表达盒的载体组合的合成物或制剂联合使用的附加治疗剂和疗法示例包括但不限于艾地苯醌、依普利酮、VECTTOR、AVI-4658、阿塔鲁伦/PTC124/Translarna、BMN044/PRO044、CAT-1004、任何MD基因疗法(包括微型肌营养不良蛋白AAV基因疗法(SGT-001)、半乳糖蛋白-1疗法(SB-002)、LTBB4(SB-001))、rAAV2.5-CMV-微小肌营养不良蛋白、谷氨酰胺、NFKB抑制剂、肌聚糖蛋白、δ(35kDa肌营养不良蛋白相关糖蛋白)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达、通过CRISPR/Cas9系统进行的基因组编辑、旨在重新引入肌营养不良蛋白基因功能重组版本的任何基因递送疗法、外显子跳跃疗法、无义突变的通读策略、细胞疗法、肌营养相关蛋白上调、肌肉生长抑制素抑制、抗炎药/抗氧化剂、机械支持装置、肌营养不良症的任何标准疗法及其组合。

适用于本发明所述方法的附加治疗剂还包括但不限于抗血小板疗法、溶栓疗法、血管成形术、肝素、硫酸镁、胰岛素、阿司匹林、降胆固醇药物、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂。特别是，当用于治疗慢性心力衰竭和高风险急性心肌梗死患者时，ACE抑制剂具有明显的好处；这可能是因为它们抑制血管紧张素II产生炎性细胞因子。附加治疗剂和疗法的非限制性列表包括ACE抑制剂(如卡托普利、依那普利、赖诺普利或喹那普利)；血管紧张素受体阻滞剂(如缬沙坦)；β受体阻滞剂(如卡维地洛、美托洛尔和比索洛尔)；血管舒张剂(通过NO)(如肼苯哒嗪、硝酸异山梨酯和单硝酸异山梨酯)；他汀类药物(如辛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、瑞舒伐他汀或普伐他汀)；抗凝药物(如阿司匹林、华法林或肝素)；或肌力药(如多巴酚丁胺、多巴胺、米力农、氨力农、硝普钠、硝酸甘油或奈西立肽)；强心苷(如地高辛)；抗心律失常药(如钙通道阻滞剂，例如，维拉帕米和地尔硫卓)或III类抗心律失常药(例如，胺碘酮、索他洛尔或多非利特)；利尿剂(如袢利尿剂，例如，呋塞米、布美他尼或托塞米；噻嗪类利尿剂，例如，氢氯噻嗪)；醛固酮拮抗剂(例如，螺内酯或依普利酮)。可替代地或此外，心脏病的其他治疗方法也适用，如起搏器、除颤器、机械循环支持装置(如反搏装置(主动脉内球囊泵或无创反搏))、心肺辅助装置或左心室辅助装置；手术(如心脏移植、心肺移植或心肾移植；或免疫抑制剂(如吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤、环孢素、西罗莫司、他克莫司、皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白(例如，胸腺球蛋白或ATGAM)、OKT3、IL-2受体抗体(例如，巴利昔单抗或达克珠单抗))也适用。

在某些实施例中，至少一种附加治疗剂或疗法包括生物药物。在某些实施例中，所述至少一种附加治疗剂或疗法包括基因疗法或治疗基因调节剂。在本发明中，治疗基因调节是指为减轻某种形式的病痛而在各个阶段中的一个阶段改变基因表达的实践。与基因疗法的不同之处在于，基因调节旨在通过诱导对新调节蛋白进行编码的基因来改变内源基因的表达，而基因疗法则涉及诱导其产物直接辅助受体的基因。可在转录水平上使用DNA结合剂介导基因表达的调节，所述DNA结合剂可为人工转录因子、小分子或合成寡核苷酸。可替代地或此外，还可通过RNA干扰在转录后进行介导。

可将本发明所公开的治疗合成物、药物制剂以及附加治疗剂或疗法进一步配制为适用于特定用途的最终药物制剂。在某些实施例中，在单一制剂中施用所述治疗合成物和附加治疗剂或疗法。在某些实施例中，在单独制剂中施用每种所述治疗合成物和附加治疗剂或疗法。在本发明所公开方法的某些实施例中，以单剂量向受试者施用所述治疗合成物和/或附加治疗剂或疗法。在某些实施例中，以多剂量向受试者施用所述治疗合成物和/或附加治疗剂或疗法。在某些实施例中，所述剂量相等。在某些实施例中，所述剂量不同。在某些实施例中，随时间以渐增剂量向受试者施用所述治疗合成物和/或附加治疗剂或疗法。在某些实施例中，随时间以渐减剂量向受试者施用所述治疗合成物和/或附加治疗剂或疗法。

所述治疗合成物和药物制剂与一种或多种治疗剂或疗法的施用顺序可能有所不同。在某些实施例中，可在施用所有附加治疗剂或疗法之前施用本发明所公开的治疗合成物或药物制剂。在某些实施例中，可在至少一种附加治疗剂或疗法之前施用本发明所公开的治疗合成物或药物制剂。在某些实施例中，本发明所公开的治疗合成物或药物制剂可与一种或多种附加治疗剂或疗法同时施用。在其他实施例中，可在施用至少一种附加治疗剂或疗法之后施用本发明所公开的治疗合成物或药物制剂。在某些实施例中，可在施用所有附加治疗剂或疗法之后施用本发明所公开的治疗合成物或药物制剂。在某些实施例中，交替施用本发明所公开的治疗合成物或药物制剂以及至少一种附加治疗剂或疗法(例如，周期疗法)。例如，在某些实施例中，向受试者周期性施用本发明所公开的治疗合成物或药物制剂以及至少一种附加治疗剂或疗法。周期疗法包括在一段时间内施用第一活性剂或疗法，然后在一段时间内施用第二活性剂或疗法，并重复进行序贯给药。周期疗法可减缓对一种或多种疗法产生抵抗性的进程，避免或减少一种或多种疗法的副作用，和/或提高疗效。

在某些实施例中，间歇疗法是连续疗法的一种替代方法。例如，间歇疗法可持续使用6个月，然后停用6个月。在某些实施例中，一种或多种治疗剂或疗法可持续使用一个月，然后停用一个月。在某些实施例中，一种或多种治疗剂或疗法可持续使用三个月，然后停用三个月。因此，可在根据上述说明施用一种或多种附加治疗剂或疗法之前、期间和/或之后提供本发明所公开的一种或多种治疗合成物或药物制剂。

示例

在以下示例中进一步详细公开了上述实施例的某些方面，这些实施例不以任何方式限制本发明公开的范围。

示例1

特异性微小RNA的抑制性寡核苷酸的设计

本示例说明了可用作miR-99a-5p、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p拮抗剂的合成寡核苷酸的设计和构成。先前已经公开了用微小RNA拮抗剂改善心脏病和/或肌营养不良症的方法和合成物，例如，第2019/0249178号美国专利出版物，所述专利通过本发明的整体引用，明确成为本发明的一部分。

分析了以下人微小RNA的核苷酸顺序：miR-99a-5p、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p。这些微小RNA的序列和互补拮抗剂的序列如下表1所示。以粗体突出显示的碱基与let-7a-5p和let-7c-5p之间或miR-99a-5p和miR-100-5p之间的碱基差异相对应。所有微小RNA的种子序列一般认为是从5'端开始的2-8个碱基。不受任何特定理论的约束，微小RNA种子序列中的核碱基是决定微小RNA靶向哪些mRNA的碱基。在下表1所列的序列中，种子序列标有下划线。

表1：人miR-99-5p、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p的核苷酸序列以及包含在任何合适载体(例如心肌生成病毒)中的互补抑制序列。

为了进一步评估相应微小RNA的序列保守性，还对不同哺乳动物物种的同系物进行了检查。如下表2所示，观察不同哺乳动物物种的miR-99a-5p、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p核苷酸序列表现出高度序列同源性。Let-7a-5p的核苷酸序列在所有分析物种中100％同源。Let-7c-5p的核苷酸序列在所有分析物种中也是100％同源。狗的miR-99a-5p序列缺少核碱基#，否则所有其他序列均同源。狗缺少miR-100miRNA，否则所有其他序列均同源。

表2：miR-99a-5p、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p同系物的序列同源性。Dre：斑纹鱼(斑马鱼)，Hsa：智人(人类)，Ptr：黑猩猩属(黑猩猩)，Cfa：犬科(狗)，Ssc：野猪(小型猪)，Rno：褐家鼠(大鼠)，Mmu：小家鼠(小鼠)。

共设计了二十(20)种抗miR寡核苷酸化合物，其中十种用于let-7a-5p/let-7c-5p家族，十种用于miR-99a-5p/miR-100-5p家族。靶向Let-7c-5p的两种抗miR设计为JRX0100和JRX0102，可用于抑制Let-7a-5p。靶向Let-7a-5p的两种抗miR设计为JRX0101和JRX0103，可用于抑制Let-7a-5p。靶向let-7a-5p和Let-7c-5p的六种抗miR设计为JRX0104、JRX0105、JRX0106、JRX0107、JRX0108和JRX0109。靶向miR-100a的五种抗miR设计为JRX0110、JRX0113、JRX0115、JRX0117和JRX0119。靶向miR-99a的五种抗miR设计为JRX0111、JRX0112、JRX0114、JRX0116和JRX0118。在本实验中，设计使用了锁定核酸(LNA)化学修饰(+)，其中2'-O-氧通过亚甲基连接子桥接到4'位置形成刚性双环，并锁定在C3'-内(RNA)糖构象中，可抵抗核酸酶降解并对其互补RNA碱基具有极高的亲和力。为实现稳定性，在表3序列中由(+)指定的分子的每一端具体包含这些修饰，例如，通过增强对核酸外切酶的抗性，并在与种子互补的区域增加对其靶向miR的亲和力，从而增加作为microRNA抑制剂的效力。抗miR的骨架为硫代磷酸酯(在下表3中用*表示)，以便在动物中广泛分布。这种类型的骨架通过对RISC复合物中特定微小RNA的空间阻断而发挥作用。小心将抗miR寡核苷酸化合物保持相对较短的时间，避免形成异源双链体的可能性，但保存时间足够长，有效结合血浆蛋白并从肾脏循环中滤出，从而改善其生物分布特性。20种抗miR设计及其各自靶向微小RNA的汇总如下表3所示。

如表3所示，一些miR-7家族抗miR与let-7c-5p和目标c异构体100％同源，并且会抑制这两种成员。相比之下，因为这些miR中一个碱基的位置不同，miR-99a-5p和miR-100家族抗miR各自与其中一个家族成员100％同源。然而，实际上，为这两个家族中的每一个家族设计的所有抗miR都可抑制目标家族的两个成员，因为与目标识别类似，种子区域(碱基2-8)是确定抗miR活性的最重要区域。

表3.本发明公开的二十种抗miR设计汇总

如下文进一步详细描述，随后可通过由Applied

(件号：AM5795，Applied Biosystems公司)提供的商用报告基因载体系统pMIR-REPORT^TM miRNA表达报告基因载体系统评估这些合成抗miR的抑制活性。在此系统中，将目标微小RNA结合位点插入位于报告基因荧光素酶编码序列下游的多个克隆位点。

示例2

腺病毒载体JBT-miRl的设计

本示例汇总的实验结果说明了使用RNAi技术设计微小RNA miR-99a、miR-100-5p、miR-Let-7a-5p和miR-Let-7c-5p的修饰发夹拉链构建体和载体表达抑制序列。在本实验中，以碱基对短发夹(sh)RNA(shRNA)的形式在靶细胞内实施RNAi技术，通过内源性miR途径加工成大约20个碱基对的小干扰RNA。小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)通常定义为具有紧密发夹弯的人工RNA分子，可用于通过RNA干扰(RNAi)沉默靶基因表达。为评价抗miR-99/100和抗Let-7a/c在小鼠心脏中再生心肌的潜在治疗用途，通过AAV2反向末端重复(ITR)序列交叉包装成AAV9衣壳(AAV2/9)制备了两种对Let-7a/c和miR-99/100的重组病毒表达互补抑制序列。AAV2/9血清型具有明显的心肌靶向性。一种常见的方法是将互补序列通过病毒载体递送到miR。在本实验中，AAV载体被选为心血管基因治疗的最佳载体，因为其a)不含病毒蛋白编码序列，从而不会刺激免疫反应，b)不需要活跃的细胞分裂来进行表达，c)与腺病毒载体相比具有显著优势，因为在体内心肌样细胞中稳定、长期表达重组基因。

在本实验中，修饰发夹拉链构建体(1)在H1启动子和U6启动子下分别表达Let-7a-5p和miR-99a-5p抑制序列，以及(2)在H1启动子和U6启动子的调节下分别表达Let-7c-5p和miR-100-5p抑制序列。下表4中提供了插入pAV-4inl shRNA-GFP载体产生病毒载体JBT-miR1的抗miR拮抗剂的核苷酸序列和环序列的汇总。在本实验中，将编码前述拮抗剂的核苷酸序列克隆到pAV-4inlshRNA-GFP载体中。将与四个miR抑制序列相对应的核苷酸序列插入到载体ITR位点之间的pAV-4inlshRNA-GFP载体中，特别是在BamH1和HindIII克隆位点内，并通过环序列TGTGCTT(SEQ ID NO:56)分离。在所得载体中，每个抑制序列的表达由交替的人U6启动子或H1启动子调节，这些启动子驱动短发夹RNA(shRNA)对miR-99a-5p、100、Let-7a-5p和Let-7c的表达。

同样插入载体的是驱动绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达的CMV启动子，这进而可在各种组织中进行检测以进行临床前研究，然后是猿猴病毒40(SV40)序列，这是一种多瘤病毒结合位点，在复制起点处启动DNA复制，可在表达SV40大T的哺乳动物细胞中复制。然而，预计也可从设计用于人类药物的载体中适当去除这些序列。

将具有AAV2 ITR序列的载体基因组通过AAV-293细胞(J.Fraser Wright，人类基因治疗，20:698-706，2009年7月)的三重转染交叉包装成AAV9衣壳，然后通过碘克沙醇梯度离心纯化。然后，通过qPCR检测来确定定义为病毒基因组(vg)/ml的AAV载体的滴度。在本实验中，使用以下引物扩增小鼠U6启动子：5'-TCGCACAGACTTGTGGGAGAA-3'(SEQ ID NO:57)(正向)和5'CGCACATTAAGCCTCTATAGTTACTAGG-3'(SEQ ID NO:58)(反向)。

使用已知拷贝数的携带相应表达盒的质粒来构建定量的标准曲线。病毒由VigeneBiosciences有限公司(马里兰州罗克维尔市)使用制造商建议的安全预防措施和程序进行生产和测序。

表4：插入pAV-4inlshRNA-GFP载体的BamH1和HindIII克隆位点产生病毒载体JBT-miR1的抗-miR拮抗剂的核苷酸序列和环序列汇总。

在序列表的SEQ ID NO:85中列出了JBT-miRl病毒载体设计的核苷酸序列。

如以上示例1所述，共设计了二十(20)种抗miR寡核苷酸化合物。这些抗miR寡核苷酸化合物的序列如下表5所示。下表5中公开的抗miR寡核苷酸化合物序列的任何组合可插入pAV-4inlshRNA-GFP载体的BamH1和HindIII克隆位点，产生用于miR-99a、miR-100-5p、Let-7a-5p和Let-7c-5p抑制的其他病毒递送系统。

表5

示例3

病毒载体JBT-miR2的设计

本示例汇总的实验结果说明了另一种病毒载体JBT-miR2的设计，该载体表达了可优于拉链(JBT-miRl)的强诱饵(也称为TuD)(Takeshi等人，2009)。简而言之，将四个基于120的寡核苷酸序列插入载体的ITR位点之间以及BamH1和HindIII克隆位点中，以便在插入病毒递送系统时产生可抑制let-7和miR-99a-5p家族的TuD。在以下所示的前述寡核苷酸的核苷酸序列中，粗体字符与各个miR结合位点相对应。

let-7a-5p

GACGGCGCTAGGATCATCAACAACTATACAACCAATGTACTACCTCACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACAACTATACAACCAATGTACTACCTCACAAGATGATCCTAGCGCCGTC(SEQ ID NO:86)。

let-7a-5p反向补体

GACGGCGCTAGGATCATCTTGTGAGGTAGTACATTGGTTGTATAGTTGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTGAGGTAGTACATTGGTTGTATAGTTGTTGATGATCCTAGCGCCGTC(SEQ ID NO:87)

miR-99a-5p

GACGGCGCTAGGATCATCAACCACAAGATCGGAAATGTCTACGGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCACAAGATCGGAAATGTCTACGGGTACAAGATGATCCTAGCGCCGTC(SEQ ID NO:88)

miR-99a-5p反向补体

GACGGCGCTAGGATCATCTTGTACCCGTAGACATTTCCGATCTTGTGGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCCGTAGACATTTCCGATCTTGTGGTTGATGATCCTAGCGCCGTC(SEQ ID NO:89)。

在某些实验中，在寡核苷酸中添加限制位点，进而有助于其亚克隆到合适的载体中。将这些序列的5'端克隆到启动子序列(例如U6启动子)的相邻位置，将3'端克隆到PolII终止序列(例如TTTTT)。

示例4

使用MiRNA抑制剂减轻心脏缺血再灌注损伤

本示例汇总的实验结果说明了使用本发明所述合成物减轻心脏缺血再灌注损伤的方法。

在发达国家，缺血性心脏病(IHD)是男性和女性死亡的主要原因。IHD可由急性心肌梗塞(MI)引起，这会限制足够的血液流向心脏，导致心肌样细胞发生不可逆转的死亡。永久性心肌样细胞死亡后的瘢痕形成与大多数患者的进行性心脏功能恶化有关，同时随后心血管事件和死亡的可能性显著增加。尽管治疗MI的治疗资源很广泛，最重要的是及时的冠状动脉介入治疗以及恢复动脉灌注的溶栓治疗和抗血小板治疗，但许多患者无法恢复完全的心脏功能，因为目前的治疗不能促进心肌的再生并无法防止转变为心力衰竭(HF)。外源性干细胞治疗方法等研究性治疗已经过广泛探索，但由于多种原因而无法进行临床转化，包括外源性干细胞无法与受损心肌整合、细胞排斥反应、干细胞生产不一致、临床研究设计和执行、并发症以及临床转化前不充分、无偏差的临床前无偏差测试。因此，正在研究诱导内源性心肌再生的替代策略作为新的MI损伤治疗方法。

这些新方法包括靶向miRNA的治疗方法，miRNA是几乎所有生物过程中的关键调节因子。微小RNA(miRNA)包括非编码RNA分子，这些分子长度为21-24个核苷酸，在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用，并通过与mRNA分子内的互补序列的碱基配对、沉默mRNA以及调节靶蛋白表达和下游信号通路发挥作用。

研究表明，成年小鼠可通过成熟心肌样细胞的去分化过程再生心肌，然后通过靶向特异性miRNA进行增殖和再分化。此过程说明了两个重要事实：1)哺乳动物心脏内的内源性细胞代表比外源性干细胞更大、更有效的再生前体库，2)再生是哺乳动物心脏的先天属性，可使功能恢复，尽管在成人中效率较低。已证明许多miRNA可调节心肌样细胞的内源性再生。已证明miRNA hsa-miR-199a-3p和hsa-miR-590-3p可刺激心肌样细胞增殖并改善对MI的心肌功能。在另一项研究中，miRNA在调节心肌样细胞增殖和心脏再生方面的功能与Hippo/Yap通路有关，其中miR302-367簇的成员直接靶向Hippo/Yap通路的关键成分。已证明miRNA的miR-34a和miR-17-92簇可在发生MI后在小鼠中再生心肌样细胞。其他研究已证明，miR-128的丢失可促进小鼠的心肌再生，而miR-15的丢失可防止小鼠和猪的MI损伤。需要注意的是，miR-15不再作为心肌再生的治疗方法进行开发，并表明靶向单个miRNA可能对心脏没有治疗效果，并且由超过60个miRNA在下部脊椎动物心脏再生中具有显著的表达变化这一事实支持。

Aitor等人的一项详细研究发现，聚集在两个明确定义的基因组位置的四种miR(即miR-99、miR-100、let-7a和let-7c)在斑马鱼心脏再生过程中表达明显下调。与其他研究不同，这篇论文强调，抑制四种miRNA组合有助于MI后的哺乳动物心肌再生。这一发现得到了miR-99a/let-7c簇在调节脊椎动物心肌生成方面共同作用的支持，表观遗传学重塑和细胞周期控制是控制这一再生过程的两个关键步骤。基于MIRANDA的miR-UTR结合预测显示miR-99/100与斑马鱼FNTβ(法尼基转移酶的β亚基)和SMARCA5(与染色质亚科a成员5肌动蛋白依赖调控因子相关的SWI/SNF相关基质)具有较强的相互作用，将miR-let-7a/c、miR-99/100家族与心肌样细胞中的细胞周期和外遗传控制联系起来。值得注意的是，miR-99/100和let-7a/c水平在哺乳动物心脏发育早期较低，促进心脏质量快速生长，但在发育后期呈指数级增长，FNTβ和SMARCA5蛋白水平相应降低，阻止心肌样细胞的进一步增殖。对受损的人类心脏组织进行了事后分析，结果表明，这些miR是成年人心脏再生的保守障碍。将miR-99/100和let-7a/c的修饰拉链构建抑制剂克隆成两种腺相关病毒(AAV2/9)，并以1×10¹¹病毒基因组(vg)的剂量经心肌内向具有永久性MI的成年小鼠注射。病毒递送抑制剂允许心肌样细胞的去分化、增殖以及再分化循环，导致MI后90天缩短分数(FS)、射血分数(EF)和左心室前壁(LVAW)厚度增加，瘢痕减少。

作为一种转化治疗方法，通过心肌样细胞的再生能力开发了一种优化的单一病毒(JBT-miR2)，该病毒向心脏递送let-7a/c和miR-99/100(称为强诱饵(TuD))的两个转录miR结合RNA，从而使心肌样细胞再生。TuD包括具有一个反义miR结合域的人造单链RNA(诱饵)或具有两个miR结构域的稳定茎环，这些结构域通过互补碱基配对将miRNA隔离到稳定的复合物中。这会关闭特定的RNA干扰途径，通过募集加尾和修剪途径来靶向miR进行破坏，以降低目标miR的稳态丰度，从而部分起作用。除病毒递送治疗策略外，本示例还描述了miR-99/100和let-7a/c两种合成寡核苷酸antagomiR(称为JN-101)的设计和测试。JN-101寡核苷酸具有锁核酸(LNA)构型，在血流中稳定，耐降解并通过RISC复合物抑制miRNA。JN-101改善了IR损伤小鼠的室壁运动和心脏功能。在患有短暂性IR损伤的小鼠中，本示例通过全面的功能性整体和局部心脏影像以及组织学和生物标志物数据证明了miR-99/miR-100和let-7a/c的结合抑制可减轻IR损伤小鼠的心肌损伤，从而增强心脏功能。因此，本发明提供的方法和合成物可以是转化疗法，可在MI后以标准护理给药。

在本发明所述合成物的一些实施例中，pAV-U6-GFP载体用作基本克隆载体。在一些实施例中，在BamH1和HindIII克隆位点中插入的pAV-U6-GFP载体是由环序列TGTGCTT分隔的两个TuD抑制剂序列。每个抑制剂均可由交替的人U6或H1启动子调节，这些启动子驱动在两个AAV2 ITR之间克隆的miR-99/100和Let-7ac TuD的表达。通过AAV-293细胞的三重转染将具有AAV2 ITR序列的载体基因组交叉包装成AAV9衣壳，然后通过硫酸铵分离和碘克沙醇梯度离心纯化。两个ITR序列的AAV载体[病毒基因组(vg)/ml]滴度通过qPCR确定。使用携带相应表达盒的质粒的已知拷贝数来构建定量的标准曲线。图31A-31F为有关本发明所提供的合成物设计的非限制性示例性示意图。图31A显示了在本发明所提供的某些合成物(例如，JBT-miR2)中使用的pAV-U6-GFP载体和插入片段。图31B显示了在本发明所提供的TuD设计中使用的非限制性示例性序列(SEQ ID NO:86和89)。图31C显示了插入pAV-U6 GFP的非限制性示例性TuD盒(SEQ ID NO:98)。可将本发明所述的一个或多个TUD盒插入一个克隆或表达载体中(例如，在两个ITR序列之间克隆)。可以在ITR之间插入多个TuD盒，并且在某些实施例中，可以减少需要向本发明所述受试者施用的病毒量。在本发明所述合成物的某些实施例中(例如，临床前和临床转化)，将移除驱动GFP的CMV启动子和SV40终止序列并插入“填充片段DNA”(例如，图31D-31E所示的序列)。图31D显示了白蛋白填充片段设计1(SEQ IDNO:99)，图31E显示了ADD填充片段设计2(SEQ ID NO:100)。图31F显示了JBT-miR2核苷酸序列(SEQ ID NO:101)的一部分。

方法

病毒和抑制剂设计以及体外感染实验

TuD可包含具有一个反义miR结合域的人造单链RNA(诱饵)或具有两个miR结构域的稳定茎环，这些结构域通过互补碱基配对将miR隔离到稳定的复合物中。这可以关闭特定的RNA干扰途径，在某些实施例中，通过募集加尾和修剪途径来靶向miR进行破坏，以降低目标miR的稳态丰度，从而部分起作用。RNAi技术是开发新疗法的热门研究领域，一些研究表明AAV在体内用于递送小信号寡核苷酸。TuD的病毒递送在本领域被视为具有单一病毒递送的强miR抑制剂，解决了生产多种药物递送系统时可预见的问题。插入pAV-U6-GFP载体中的是在驱动其表达的人U6或H1启动子旁边克隆的5'端上的两个TuD(图1A)。Jaan Biotherapeutics设计的病毒由Vigene Biosciences有限公司(地址：9430Key West Ave，Suite 105，Rockville，MD 20850)生产，质量为体内级，本研究使用了多批病毒。为所有生产的病毒批次提供了分析证书。在-80℉储存病毒，使用时解冻。在24孔组织培养板中接种293T细胞，密度为8×10^4个细胞/孔。对于10^10vg/mL，病毒浓度约为10^5/细胞。还测试了相同数量细胞的增加浓度10^11vg/mL和10^12vg/mL。根据制造商指南(https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines)，聚凝胺用于感染细胞，这可以增强病毒-细胞的接触。细胞在无血清培养基中感染6h。随后，在无血清培养基中添加胎牛血清(FBS)，使最终浓度达为5％(v/v)。培养基没有改变，细胞在感染后第7天成像(图1B)。

JN-101 AntagomiR的选择与设计

使用pMIR-REPORT^TM miRNA表达报告基因载体系统(件号：AM5795，AppliedBiosystems公司)筛查了二十种miR-99/100和let-7a/c antagomiR的生物活性。antagomiR可通过RNA诱导的沉默复合物或RISC复合物中特异性miRNA的空间阻断而发挥作用。antagomiR的骨架为硫代磷酸酯，它们的长度小于19个核苷酸且没有较大的DNA缺口。pMIR-REPORT^TM miRNA表达报告基因载体系统包含一个实验萤火虫荧光素酶报告基因载体，其中荧光素酶基因的3'UTR包含用于插入预测miRNA结合靶点的多个克隆位点。将特异性miRNA靶序列克隆到pMIR-REPORT的多个克隆位点中，并且荧光素酶报告基因受到模拟miRNA靶点的调节，当用报告基因构建体转染的细胞与浓度增加的相关antagomiR一起培养时，miRNA靶点应诱导荧光素酶活性的剂量依赖性增加。

使用两种细胞类型来测试antagomiR、海拉细胞和原发性新生大鼠心室心肌样细胞的效率。用添加Earle平衡盐溶液(Hyclone)(包含2mM L谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1nM非必需胺基酸、10％FBS(PAA)和青霉素链霉素)的最低基本培养基中培养海拉细胞。在转染前24小时将细胞接种在96孔板(1×10⁴个细胞/孔)中不含抗生素的血清培养基中，转染时的细胞的融合率为30-70％。根据制造商的说明，使用Opti-

培养基和最终体积为200μl/孔的正常生长培养基，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies公司，货号：11668-019)以0.1、1、10或50nmol/L(nM)的浓度，用50ng/孔的LUC报告基因质粒和10ng/孔的P-gal报告基因质粒转染细胞2小时。报告基因质粒(pMIR-REPORT^TM或LUC质粒)单独转染。由于细胞活性和转染效率的差异，此对照质粒的β-gal表达用于对变异性进行归一化。分离新生大鼠心肌样细胞，并以80,000个细胞/孔的密度接种在Primara预涂板上(24孔)。接种后24小时，根据制造商的说明，使用Opti-

培养基和最终体积为600μl/孔的正常生长培养基，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies公司，货号：11668-019)以0.1、1、3、10或50nmol/L(nM)的浓度，用500ng/孔的LUC报告基因质粒和100ng/孔的P-gal报告基因质粒转染细胞5小时。报告基因质粒(pMIR-REPORT^TM或LUC质粒)单独转染。数据表明，大多数antagomiR可以有效抑制特异性miRNA，这通过在海拉细胞和新生大鼠心室心肌细胞中以剂量依赖性方式增加相应萤光素酶报告基因的活性来确定，表明antagomiR与相应的内源性miRNA特异性结合并抑制其活性。重要的是，使用不同的细胞类型测试antagomiR，并在实验之间观察到可重复、一致的数据。这些实验为体内实验选择了两种antagomiR，JRX0104、let-7a/c antagomiR 5'-ATACAACCTACTACCTC-3'和JRX0116 miR-99/100antagomiR 5'-GATCGGATCTACGGGT-3'，它们将一起用于实验，统称为JN-101。图1C-1H显示了JRX0116、JRX0104on miRNA-99/100和Let-7a/c pMIR-REPORT^TM构建体在两种细胞类型中的疗效。

体内研究设计汇总

JBT-miR2或对照病毒：

在这项双盲随机和安慰剂对照研究中，六十六只(N＝66)雄性CD1小鼠接受了60分钟的左冠状动脉(LCA)结扎。在再灌注时以1×10¹¹vg/小鼠(在100μl注射用无菌生理盐水中稀释)的剂量，经眶后静脉IV施用JBT-miR2(17只小鼠)或加扰对照病毒(对照组，N＝19只小鼠)(第1组，图2A)。在第2-7天之间对小鼠进行2D超声心动图筛查(ECHO)，确认手术损伤一致。在IR后的第2周和第8周，进行随访ECHO和MRI成像，然后在第8周进行末端血液动力学(HEMO)以及组织和血液收集。第二组小鼠(第2组，图2B)在IR 2周后，在第2周基线ECHO和MRI后施用JBT-miR2(N＝14只小鼠)或对照品(N＝16只小鼠)。小鼠接受与第1组相同的手术，从再灌注时开始8周随访。

JN-101或运载体：

二十四(24)只小鼠接受了60分钟IR手术，并在再灌注后几分钟施用400μl(200μlJRX0104、200μl JRX0116)稀释的10mg/kg JN-101(作为无菌SC注射剂)(N＝12)，或施用包括无菌注射生理盐水的运载体(N＝12)(图2C)。在第2-7天对小鼠进行2D-ECHO筛查，在第2周和第4周进行2D-ECHO随访，然后进行末端血流动力学以及组织和血液收集。在第4周对小鼠进行MRI。

缺血再灌注(IR)手术

根据既定指南并经加州大学圣地亚哥分校(UCSD)机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准进行体内手术。体重30-40克的雄性CD1小鼠(8-12周龄)购自查尔斯河实验室(MA 01867)。通过i.p.注射氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉CD1小鼠进行初始诱导，然后维持异氟醚(0.75-1.5％)以便在整个手术过程中完成麻醉诱导。给小鼠插上压力呼吸机(Kent Scientific公司，PhysioSuite。峰值吸气压力约13cm H2O，吸气率100-110/min)。待小鼠稳定并确认麻醉后，从胸骨中线向左腋窝切开皮肤，沿胸骨左侧横向切开1cm打开胸壁，切开第3和第4根肋骨暴露心脏的左心室(LV)。识别升主动脉和主肺动脉；然后定位左冠状动脉前降支(LCA)，因为它穿过心脏前壁，在左心室和右心室之间。把8-0丙烯缝合线系在2-0丝线上进行LCA闭塞。通过LCA灌注区域的变白以及肢体导联心电图导联上的急性ST段抬高来评估动脉的闭塞情况。当小鼠稳定至少5分钟后，可将小鼠移动到没有异氟醚的第二个呼吸机上，并且在剩余的缺血期用水循环加热垫维持小鼠的体温。此时根据小鼠的体重(单位：克)施用氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)(i.p.)以及200-300μl生理盐水(i.p.)的额外混合物。在整个手术和恢复过程中，手术者对小鼠进行密切监测。根据研究要求，小鼠心脏缺血60分钟。60分钟后，拆下2-0缝合线，再灌注心脏。

通过观察心外膜冠状动脉中的血流返回来确认再灌注。在再灌注时使用27G针(305109，27G-常规斜面1/2英寸-灰色)通过眶后静脉以1×10¹¹vg/小鼠(在100μl生理盐水中稀释)的剂量施用JBT-miR2或加扰对照病毒(对照组)。或者，将200μlJRX0104(在注射用无菌生理盐水中稀释10mg/kg)和200μl JRX0116(在注射用无菌生理盐水中稀释10mg/kg)(400μl JN-101)或400μl无菌生理盐水皮下推注到颈部后松弛的皮肤中。

然后从LCA周围拆下缝合线；一旦小鼠血流动力学稳定，就缝合胸部。根据小鼠的体重施用额外100-200μl生理盐水(i.p.)。然后用一层穿过胸壁的5-0编织黑丝缝合线缝合胸部，并用

液体局部组织粘合剂封闭皮肤。在切口闭合时，从胸部排出空气。术后，密切观察动物的不适或气短迹象。在预期恢复前15-30分钟施用丁丙诺啡(0.1mg/kg)(100μl)，或在动物预期恢复时间前15-30分钟经皮下施用盐酸丁丙诺啡缓释混悬注射液(3.25mg/kg)。没有动物因手术后或后期护理中的急性应激而接受安乐死。手术后5天每天观察动物，并在任何研究程序之前和之后称重。

心脏MRI

随着心脏再生疗法对心脏功能的改善，应设法减少体积和瘢痕面积。ECHO通常用于实验动物和人类，因为它使用方便，能准确定义心脏尺寸，但受到平面视图的限制，不能全面反映心肌的损伤程度。相比之下，三维(3D)心脏MRI(3D-MRI)重建与心内膜区域的有限元分析提供病毒处理小鼠IR后第2周和第8周或JN-101处理小鼠第4周的LV和MI面积、整体LV功能、局部心内膜壁运动异常(节点位移、表面元变化％)的预测定量测量值。

对随机的N＝6-7只小鼠/Grp进行称重，并用异氟醚1.5-2.5％和100％O₂麻醉。对小动物使用水平Bruker Biospec 7T/20MRI系统进行MRI(Bruker公司，德国)。对于FLASH电影图像采集，将EKG和呼吸信号发送到门控系统(SA仪器)。使用以下参数获取图像：FOV：1.5×2.0cm，矩阵尺寸：128×128，切片厚度：1mm，切片间距离：0mm，回声时间：2.1msec，重复时间：6msec，平均为6，翻转角：40°，每心搏周期20帧。单片采集时间为110秒，并与QRS复杂峰同步。根据晚期钆增强(LGE)MRI识别的心肌灰度区(正常和梗死组织的混合物)的面积是梗死后不良心脏事件的独立预测因子。对于LGE成像，在MR扫描前20-50分钟，经i.p.施用30μL的0.5mmol/kg Gd-DTPA(

英国Schering Healthcare公司)。短轴平面设置为垂直于冠状动脉平面和长轴。需要九个连续的短轴切片来覆盖整个LV。

LV面积、整体功能和EF：

对于ED和ES图像，由区室面积和切片厚度(1mm)的乘积确定体积数据。根据所有切片和导出的EF的总和计算EDV和ESV。

MI面积：

选择每个切片的ED图像进行瘢痕描绘。

3D重建和室壁运动分析：

将从图像导出的边框导入到Continuity软件(6.4b修订版6734，国家生物医学计算资源)。

定量和归一化：

心室面积的最简单归一化是计算每个节点的位移与计算的舒张末期心内膜表面积(EDSA)之比。另一种归一化方法是计算每个参数的“Z”分数，其依据是在相同年龄和物种的小鼠对照组(N＝8)中测量的每个节点分布的SD。对于3D心内膜室壁运动，将从对照心脏的平均值移动≤2.0SD的节点归类为运动功能减退/运动异常节点。如果表面元在其心内膜表面有>3个异常节点，则将该元件归类为异常元件。通过将Z分数≤2.0SD的节点数相加来计算异常心肌的数量。采用

(MathWorks公司，马萨诸塞州)和Continuity软件进行所有分析。

2D超声心动图

对所有小鼠进行2D-ECHO。在IR后第2-7天之间进行了ECHO筛查，确认可比较的危险区(AOR)损伤，对JBT-miR2或加扰对照病毒处理的动物在第2周和第8周进行随访，对JN-101或对照品处理小鼠在IR手术后第2周和第4周进行随访。在进行任何病毒处理之前，第2周ECHO是第2组中随机分配到JBT-miR2或对照病毒组的小鼠的基线。用1.5-2.5％和100％O₂的异氟醚麻醉小鼠，并使用Visual Sonics 2100机器和30-MHz换能器成像。

血液动力学

在IR后第8周(JBT-miR2或对照病毒)或IR后4周(JN-101或注射控制用无菌生理盐水)存活的小鼠经i.p.注射KX进行麻醉，插管、通气并暴露右颈动脉。将1.4法国高保真导管尖端微压计(Millar Instruments公司，德克萨斯州)通过左颈动脉逆向插入主动脉并进入左心室。双侧迷走神经切断术后，记录基线压力直至稳定，并通过股静脉以0.75、2、4、6和8μg/kg/min依次增加的剂量施用多巴酚丁胺。使用图表采集系统(AD仪器)记录压力数据，并通过定制程序进行分析。参数包括(mmHg)：主动脉平均压、右心房压、最大压力、舒张末期压、心输出量(ml/min)、全身血管阻力(mmHg/ml)。还测量了最大和最小峰值(-/+)dP/dt(mmHg/s)。

尸检、组织学和末端手术

对于JBT-miR2或对照病毒处理的心脏，在血液动力学之后，取出心脏并通过主动脉插管，在重力作用下灌注松弛缓冲液；77mM Nacl、4.3mM Na2HPO4.7H2O、1.47mM KHPO4、62.7nM KCL。将心脏固定在10％中性缓冲福尔马林中。取出其他组织(肺、脾脏、肝脏、肾脏、皮肤、骨骼肌、大脑)并储存在10％中性缓冲福尔马林中。将组织灌封在石蜡块中进行组织学检查。保留组织样本(包括心肌)进行下一代测序(NGS)、RNAseq和定量PCR。

定量组织学第1组病毒

为了量化瘢痕面积，在结扎上方修剪八颗心脏(N＝3个对照品和N＝5个JBT-miR2，第1组)确定横截面方向，在其自身的盒中加工并将切面朝下包埋。将每个FFPP块在4μm处切割，放在带正电荷的载玻片上，并在三个不同的水平上收集六个连续切片。使用具有先前验证条件的Leica Bond自动免疫染色仪对FFPE小鼠心脏进行IF染色。使用Leica Bond表位检索缓冲液2(EDTA溶液，pH 9.0)进行热诱导抗原检索20分钟(ER2(20))。使用Novolink蛋白阻断剂(Leica，货号：RE7280-CE，批号：6064062)阻断非特异性抗体结合20分钟。使用Novolink过氧化氢阻断剂(Leica，货号：RE7280-CE，批号：6056766)阻断内源性过氧化物酶10分钟。使用Novolink蛋白阻断剂(Leica，货号：RE7280-CE，批号：6064062)阻断非特异性抗体结合20分钟。隔夜培养后手动应用抗MHC抗体。第二天，应用山羊抗小鼠Alexa Fluor

488 60分钟。载玻片与DAPI一起封装在Fluor封片胶II中以实现核可视化。

免疫组织化学优化染色条件

使用Pannoramic SCAN(30Histech)在明视场和荧光中生成整个载玻片图像，并存储在带有图像查看软件(Case Viewer)的USB数据驱动器上。质量控制：图像专家对图像质量进行评估，并重新扫描任何不符合质量标准的图像。本示例包括代表性快照图像。比例尺表示50μm。使用集成的完整载玻片图像管理和自动图像分析工作流ImageDx^TM对完整载玻片图像进行自动分析生成图像分析数据。首先使用精确焦点测量来评估每张图像的质量，然后进行准确性检查。所有组织和染色伪影均以数字方式排除在报告的定量之外。分析过程包括自动识别组织，分割目标区域，然后对特异性标志物免疫反应阳性的细胞进行分类。然后对这些识别的区域进行量化以获得精确的阳性结果。对于Masson三色染色样本，从所有组织图像数据中分离出胶原蛋白阳性的图像数据。算法根据载玻片上的位置识别组织，然后识别与胶原蛋白相对应的黄色区域，以进行Masson三色染色。然后对这些识别的区域进行量化以获得阳性结果。生成定量数据点以测量每个组织区域的阳性细胞。

细胞大小分析

通过基于核复染(荧光中的DAPI)的核分割创建细胞大小测定。给定细胞核的大小源自复染面积并转换为微米。密度图显示心肌细胞核大小的分布，以及近似细胞质，共同构成细胞大小的测量。

定性组织学第1组和第2组心脏和组织

对来自第1组(N＝3个JBT-miR2，N＝4个对照品)和第2组(N＝4个JBT-miR2和对照品)的心脏以及在福尔马林中的组织进行大体检查，并进行解剖放在盒中，并包埋在石蜡中。组织学切片用H&E染色，并按以下方式进行定性评估：正常＝0，1(+)至3(+++)最小至最大纤维化和变薄。用H&E对非心脏组织(脑、肺、肝脏、脾脏、肾脏、皮肤和骨骼肌)进行毒性染色。使用组织病理学评价的一般方法确定毒理学变化的病理学评估。肝脏、肾脏和脾脏的编码H&E染色组织学切片以一次通过的盲法方式进行评价。然后在破解密码后对结果进行审查和评价，以纳入器官重量和相关的功能和生化结果。评价的特异性组织学特征如下：肝脏：微观和宏观脂肪变性、空泡或水性细胞质变性、细胞凋亡、坏死病灶、出血、炎性细胞浸润和双核细胞。肾脏：肾小球缩小和变形、急性肾小管坏死、肾小管扩张、肾小管上皮细胞空泡化、玻璃样小滴、血栓性微血管病、肾小球膜溶解、水肿、坏死、炎症细胞浸润。脾脏：变形的淋巴结构、最小化淋巴滤泡、存在粒性白细胞和巨噬细胞。心脏：细胞质空泡化、肌细胞坏死、收缩带坏死、巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润、心肌纤维化。如果存在组织切片异常，则从0(正常结构)到3(严重病理变化)进行半定量分级。

代谢血液功能检测(MFT)

在KX的致命性注射后，血液通过腹部收集到BD SST Microtainer REF 365967管中，并在4℃下以5000×g离心10分钟。将血清样本在-80℃下冷冻，直到测试实验室将代谢血液测试结果指定为正常或异常，并且每种分析物的相对浓度表示为每单位(由兔子和啮齿动物诊断服务(RADA)分析，圣地亚哥，92121)

组织中JBT-miR2的PCR检测

根据制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒(ThermoFisher，货号：AM1560)从JBT-miR2或对照病毒处理的两只小鼠的约20mg总湿组织(肝脏、骨骼肌、脑、肺、脾脏、心脏、肾脏)中分离出总RNA。将RNA样本稀释为2ng/μl。根据制造商的说明，使用高容量RNA-转换-cDNA试剂盒(ThermoFisher，货号：4387406)将总RNA逆转录为cDNA，总体积为20μl，使用热循环仪ABI9700在37℃下反应60分钟，在95℃下反应5分钟，然后保持在4℃。使用96孔板根据下述制造商的说明使用以下Taqman引物进行表6所示的以下qPCR程序。

表6：Qpcr分析

下一代测序技术

从JBT-miR2(小鼠309和310的心脏)和对照病毒(心脏315和316)处理的2只小鼠的心脏(包括LV顶端的2mm组织)中均匀切下样本。将组织在液氮下快速冷冻，并在-80℃下储存直至分析。组织样本来自在IR后第8周经病毒处理的第2组小鼠。根据制造商的说明使用Trizol试剂分离RNA。在1％琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染。使用

分光光度计(IMPLEN公司，美国加利福尼亚州)检查RNA纯度。使用

2.0中的

RNA监测试剂盒测量RNA浓度。荧光计(Life Technologies公司，美国加利福尼亚州)。使用生物分析仪2100系统(Agilent Technologies公司，美国加利福尼亚州)的RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性。

IncRNA测序的文库构建

每个样本共使用3μg RNA作为RNA样本制备的输入材料。首先，通过EpicentreRibo-zero^TM rRNA去除试剂盒(Epicentre公司，美国)去除核醣体RNA，并通过乙醇沉淀清除rRNA游离残基。然后，根据制造商的建议，通过针对

(NEB公司，美国)的

Ultra^TM定向RNA文库构建试剂盒，使用rRNA耗尽的RNA生成测序文库。简而言之，在NEBNext第一链合成反应缓冲液(5×)中，在高温下使用二价阳离子进行片段化。使用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶(RNaseH-)合成第一链cDNA。随后，使用DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成。在反应缓冲液中，用dUTP取代具有dTTP的dNTP。剩余的突出端通过核酸外切酶/聚合酶活性转化为钝端。在DNA片段3'端腺苷酸化后，对具有发夹环结构的NEB下一代接头结扎以准备杂交。为了选择长度优选150-200bp的cDNA片段，用AMPure XP系统纯化文库片段(Beckman Coulter公司，美国比佛利)。然后将3μl USER酶(NEB公司，美国)与大小已选、接头结扎的cDNA在37℃下使用15分钟，然后在进行PCR之前在95℃下使用5分钟。然后用Phusion高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和索引(X)引物进行PCR。最后，对产品进行纯化(AMPure XP系统)，并在Agilent Bio分析仪2100系统上评估文库质量。

数据分析

质量控制：

首先通过内部perl脚本处理fastq格式的原始数据(原始读段)。在此步骤中，通过从原始数据中删除包含接合体的读段、包含聚N的读段和低质量读段来获得干净数据(干净读段)。同时，计算韩静数据中的Q20、Q30和GC含量。所有下游分析均基于高质量的干净数据。

映射到参考基因组：

参考基因组和基因模型注释文件可以直接从基因组网站下载。使用bowtie2v2.2.8构建参考基因组的索引，并使用HISAT2 v2.0.4将双端干净读段与参考基因组进行比对。HISAT2使用‘-rna-strandness RF’运行，其他参数设置为默认值。

转录组组装：

由StringTie(vl.3.1)以基于参考的方法组装每个样本的映射读段。StringTie使用新颖的网络流算法以及可选的从头组装步骤来组装和定量代表每个基因位点的多个剪接变体的全长转录本。

编码潜能分析：

使用Picard工具vl.41和samtools v0.1.18对每个样本的bam比对结果进行排序、删除重复读段并合并。使用GATK3软件进行SNP调用。使用GATK标准过滤方法和其他参数过滤原始vcf文件(簇：3；WindowSize：35；QD<2.0或FS>60.0或MQ<40.0或SOR>4.0或MQRankSum<-12.5或ReadPosRankSumΦ-8.0或DP<10)。CNCI(编码-非编码-索引)(v2)显示了毗邻的核苷酸三联体，以有效区分独立于已知注释的蛋白编码和非编码序列(Sun等人，2013)。CPC(编码潜能计算器)(0.9-r2)主要通过评估转录本中ORF的范围和质量，并用已知的蛋白序列数据库搜索序列，明确编码和非编码转录本。使用NCBI真核细胞的蛋白数据库，并在分析中将e值设置为“le-10”。

Pfam-scan：

将每个转录本翻译为所有三个可能的框架，并使用Pfam Scan(vl.3)识别Pfam数据库中记录的任何已知蛋白家族结构域的出现(版本27；同时使用Pfam A和Pfam B)。以下步骤排除任何具有Pfam命中的转录本。Pfam搜索使用默认参数-E 0.001--domE 0.001。

phyloCSF：

PhyloCSF(系统发育密码子替换频率)(v20121028)检查保守编码区比对的进化特征，例如同义密码子取代和保守氨基酸取代的高频，以及其他错义和无义替换的低频，以区分蛋白编码和非编码转录本。构建多物种基因组序列比对，并使用默认参数运行phyloCSF。过滤通过上述四种工具中的任何一种/所有工具预测的具有编码潜能的转录本，而没有编码潜能的转录本为IncRNA的候选集。

保守性分析：

Phast(vl.3)是包含统计程序的软件包，最常用于系统发育分析，phastCons是保守元件的保守分数和识别程序。使用phyloFit程序计算物种间保守和非保守区的系统发育模型，然后将模型和HMM转换参数提供给phastCons，以计算IncRNA和编码基因的一组保守分数。

靶基因预测：

靶基因预测的顺式作用

顺式作用为IncRNA作用于邻近的靶基因。在IncRNA的上游和下游以10k/100k搜索编码基因，然后分析其功能。

靶基因预测的反式作用

反式作用是IncRNA通过表达水平相互识别。计算IncRNA与具有自定义脚本的编码基因之间的表达相关性；否则，将来自不同样本的基因与WGCNA57聚类以搜索公用表达模块，然后通过功能富集分析分析其功能。

基因表达水平的定量：

使用Cuffdiff(v2.1.1)计算每个样本中IncRNA和编码基因的FPKM。通过对每个基因组中转录本的FPKM求和来计算基因FPKM。FPKM是指根据片段长度和映射到此片段映射的读段计数映射、计算的每百万个片段中每千碱基外显子的片段。

差异表达分析：

Ball gown套件包括以下功能：转录组组装的交互式探索、每个基因座的转录本结构和特征特定丰度的可视化以及组装特征到注释特征的事后注释。将P调整<0.05的转录本指定为差异表达。

Cuffdiff提供的统计程序使用基于负二项分布的模型确定数字转录本或基因表达数据中的差异表达。将P调整<0.05的转录本指定为差异表达。

GO和KEGG富集分析：

通过GOseq R包进行差异表达基因或IncRNA靶基因的基因本体(GO)富集分析，其中校正了基因长度偏差。校正后P值小于0.05的GO项通过差异表达基因得到显著富集。KEGG是一种数据库资源，用于从分子水平信息中了解生物系统(例如，细胞、生物体和生态系统)的高级功能和实用性，特别是通过基因组测序和其他高通量实验技术生成的大规模分子数据集(http://www.genome.jp/kegg/)。使用KOBAS软件测试KEGG通路中差异表达基因或IncRNA靶基因的统计富集。

PPI(蛋白-蛋白相互作用)：

差异表达基因的PPI分析基于STRING数据库，该数据库已知并预测蛋白-蛋白相互作用。对于数据库中存在的物种，通过从数据库中提取靶基因列表来构建网络；否则，使用Blaxx(v2.2.28)比对靶基因序列与选定的参考蛋白序列，然后根据所选参考物种的已知相互作用构建网络。

可变剪接分析：

通过软件Asprofile vl.0将可变剪接事件分为12种基本类型。分别估计每个样本中的AS事件数量。

SNP分析：

使用Picard工具v 1.96和samtools v0.1.18对每个样本的bam比对结果进行排序、标记重复读段和重新排序。使用GATK2软件进行SNP调用。

统计分析

统计分析由不了解处理分配的个体进行。所有定量数据均以平均值±SD表示。在适当情况下，在IR后第2周和第8周，将JBT-miR2的疗效(ECHO、MRI、HEMO参数和瘢痕面积)和安全性(MFT、病理学和存活期)与对照组进行比较。在适当情况下，在IR后第2周和第4周比较JN-101参数。对于串行数据，使用双因子ANOVA测试处理的主要效果以进行重复测量，并通过学生-纽曼-科伊尔斯检验对特定时间点和剂量之间的处理差异进行事后比较。P<0.05具有统计学意义。Systat 13.0用于MRI线性建模，嵌套参数之间的室壁运动一致性。使用Kaplan-Meier分析每天感染的剩余小鼠数量来确定存活率。组织学：使用Image^DX对瘢痕面积和MHC染色CM的增加数量/区域确认CM增殖进行定量。

脱靶组织正常小鼠的病理学

第1批正式病理报告

概述：本研究是抗miR与注射生理盐水的对照组。对福尔马林中接收到的湿组织进行大体检查，并进行解剖放在盒中，并包埋在石蜡中。准备组织切片并用H&E染色。组织的石蜡块仍可用于可能需要的任何进一步分析，例如免疫组织化学研究。

分析：每个标本ID(5-7；29；34-40；45-48；77-80)可用的组织。所有标本均有肝脏和肾脏组织，除了两个例外(29；34)均有肺和心脏组织。

在肺、心脏和肾脏中未见特异性组织异常。同样，骨骼肌和皮肤没有表现出组织异常。肝细胞中存在真空变化，如所附电子表格C列所示。这些变化与实验变量无关，并归因于固定伪影和/或验尸间隔。

结论：没有与实验变量相关的组织变化。

第2批正式病理报告

概述：对福尔马林中接收到的湿组织进行大体检查，并进行解剖放在盒中，并包埋在石蜡中。准备组织切片并用H&E染色。组织的石蜡块仍可用于可能需要的任何进一步分析，例如免疫组织化学研究。

分析：每个标本ID(85-88；113-116；125-128；152-155)可用的组织。所有标本均有肝脏和肾脏组织。

一份肺标本显示充血(858)。在肺、心脏和肾脏中未见其他特异性组织异常。同样，骨骼肌和皮肤没有表现出组织异常。

结论：四组中没有表明毒理学变化的组织变化。

结果

体外表达

Hek-293细胞用浓度增加的对照品或JBT-miR2病毒转染。在所有浓度下均检测到绿色荧光蛋白表达，但在最高浓度10^12vg/mL的培养基中观察到约70％的感染(图1B)。图1C-1H显示了JRX0116和JRX0104对海拉细胞和新生大鼠心室心肌样细胞中miRNA-99和Let-7a/c pMIR-REPORT^TM构建体的疗效。

缺血再灌注实验

JBT-miR2存活率：

虽然本研究不适用于存活研究，再加上手术诱发IR损伤的致死性，在第1组和第2组中，与对照品相比，JBT-miR2将存活率提高了约20％。第1组：JBT-miR2处理小鼠的存活率为53％(9/17只小鼠)，而对照组(8/19只小鼠)在IR后第8周的存活率为42％。第2组：IR后第8周，JBT-miR2处理小鼠的存活率为78％(11/14只小鼠，包括在第8周ECHO时死亡的一只小鼠)，而对照(9/16)病毒处理的小鼠的存活率为56％(表7)。

表7：缺血再灌注后第8周小鼠的最终沉积

*包括一只在第8周超声心动图检查死亡的小鼠

JN-101存活率：

缺血后再灌注时经SC施用10mg/kg JN-101，显示了83％的小鼠存活率(n＝10/n＝12)，与再灌注时施用运载体相比，67％的小鼠存活到IR后第4周(n＝8/n＝12)(表8)。

表8：每组存活的小鼠

向正常小鼠施用的JN-101剂量

对152只未受伤的小鼠(表9)以增加剂量施用N-101。当研究药物通过皮下注射给药时，在高达15mg/kg的剂量下没有观察到不良病理影响。这些数据表明，以单剂量15mg/kg对小鼠进行SC给药在单次注射后长达15天是安全的。以单剂量10mg/kg对小鼠进行SC给药在单次注射后长达25天是安全的。在JN-101处理的小鼠中观察到舒张期左心室舒张内径(LVIDd)和收缩期左心室舒张内径(LVID)的减小。在JN-101处理的小鼠中观察到左心室后壁直径(LVPWd)的增加。未受伤小鼠的心率(HR)、射血分数(EF)没有变化。在JN-101处理的所有小鼠中观察到心脏重量(HW)与体重(BW)比值的剂量依赖性增加，但没有观察到BW变化。在25天期间没有研究药物相关的死亡。正常小鼠的所有代谢血液功能检测均在正常范围内。在脱靶组织(包括肝脏、皮肤、骨骼肌、肾脏和肺)中没有发现异常。选择10mg/kg JN-101的最佳剂量，以继续在本示例中对具有短暂性IR损伤的小鼠进行测试。

所有小鼠在处死当天均进行2D-Echo。收集所有小鼠的心脏，并使用RT-PCR分析miR基因沉默(n＝4)。对生理盐水处理小鼠和施用15mg/kg抗miR(高剂量)的小鼠的组织进行组织学分析(n＝4/组)。收集并储存所有小鼠的血液。在不同的时间点，对生理盐水处理小鼠和施用15mg/kg抗miR(高剂量)的小鼠的血浆进行全面的代谢组分析(n＝4/组)。(表9)。

表9：JN-101皮下给药对正常小鼠的影响

JN-101的最佳给药途径是SC

对四十一(41)只动物的初始队列进行60分钟的LCA结扎，并通过股静脉经IV施用JN-101，体积200μl。本研究在通过2D超声心动图检测到JN-101处理的九只存活小鼠出现心脏血栓(9/17，52.9％)后暂停。经运载体处理的动物没有出现血栓。在其他高粘度研究药物中观察到心脏血栓，包括由测试实验室与牛血清白蛋白一起施用的药物。在通过IV输注用JN-101处理的小鼠中观察到死亡率增加。由于这些初步发现，研究药物施用改为SC途径(表10A-10D；图21A-21D)。

表10A：JN-101的最佳给药途径-IR后存活率统计数据

表10B：JN-101的最佳给药途径-IR后存活率统计数据

表10C：JN-101的最佳给药途径-IR后血栓的统计数据

表10D：JN-101的最佳给药途径-IR后血栓的统计数据

JBT-miR2整体心脏功能

在第1组小鼠中，MRI和ECHO均显示出LV整体指数一致的值变化，提高对JBT-miR2疗效的置信度(表11A-11C)。施用病毒后2周，与对照组相比，JBT-miR2处理小鼠的EF增加约23％(P＝0.093，ECHO)。同样，舒张末期容积(EDV)和收缩末期容积(ESV)分别减少了23％(P＝0.05，ECHO)和32-34％(P＝0.03，ECHO)。第8周的断奶效应可能是由于全身性IV给药途径，该途径稀释了以有效浓度到达心脏的病毒水平(图3A)。对于第2组小鼠，在处理前从第2周基线值中减去第8周的ECHO值。与对照病毒处理的小鼠相比，在IR后第8周、处理后第6周，ECHO显示EDV和ESV减少了8μl。此外，与对照病毒处理的小鼠相比，JBT-miR2处理小鼠的EF增加了3％。此数据表明，在某些实施例中，在已确定心力衰竭的情况下，更高或心脏局部注射JBT-miR2可能有益。

表11A：整体ECHO和MRI LV指数JBT-miR2或对照病毒处理的小鼠

*在2D超声心动图筛查(JBT-miR2处理小鼠281和对照品处理小鼠272)之后，从分析中移除“正常”小鼠。JBT＝JBT-miR2，加扰对照病毒＝对照品。EDV＝舒张末期容积(μl)。ESV＝收缩末期容积(μl)

表11B：整体ECHO和MRI LV指数JBT-miR2或对照病毒处理的小鼠

表11C：整体ECHO和MRI LV指数JBT-miR2或对照病毒处理的小鼠

JN-101整体心脏功能

在再灌注时施用JN-101(10mg/kg)或运载体时，观察到与JBt-miR2处理相似的心脏容积减少(表12A-12B)。与运载体相比，在IR后2周和再灌注时施用JN-101时，舒张末期容积(EDV)和收缩末期容积(ESV)分别减少了32.4％(P＝0.027，ECHO)和36.8％(P＝0.097，ECHO)。在JN-101施用后4周，与运载体相比，通过ECHO确定的EDV降低了19.1％，通过MRI测量的EDV降低了17.8％。在JN-101给药后4周，与运载体相比，通过ECHO确定的ESV降低了21.36％，通过MRI测量的ESV降低了26.36％，表明这两种疗法的相对心脏体积变化一致。在IR后4周，EF相对于运载体增加了8.6％(ECHO)和13.14％(MRI)。

表12A：JN-101或再灌注时运载体处理小鼠的整体ECHO和MRI LV指数

表12B：JN-101或再灌注时运载体处理小鼠的整体ECHO和MRI LV指数

治疗前随机组间缺血再灌注损伤的一致性

由第2组小鼠LV指数的可比2周基线ECHO测量值反映JBT-miR2和对照组之间手术损伤和风险区(AOR)一致性的置信度(表11A-11C)，并且在第2周时，未处理组的节点位移/EDSA没有从标识线转移(蓝点)(图4C)。

JBT-miR2局部心脏功能

对于第1组小鼠，ECHO和MRI疗法均证明了局部室壁运动的改善。与对照组相比，在施用JBT-miR2后第2周和第8周梗死区域(节点23-37)(左心室(LV)的50个节点周围ECHO分析)的劳损增加了10％(图3B)。

使用MRI，从基底到心尖，根据9个独立的堆叠切片重建LV心内膜形状，空间分辨率为0.5mm(图4A)。通过最小二乘法程序，舒张末期(ED)和收缩末期(ES)的形状均拟合为扁长球体，其表面有300个等距节点。然后，计算ED和ES之间每个节点的空间位移，并根据舒张末期表面积(EDSA)对总体LV面积进行归一化，从而提供心肌缩短(收缩)的有限元测度。通过由扁长球体拟合定义的每个相应节点处的平均数据，获得复合图像。从形貌结构上，LV ES形状采用颜色编码，反映了较低到较高程度的节点位移情况。注意到单次施用JBT-miR2后2周小鼠前心尖部梗死区域的位移值较低(较浅蓝色)(图4B)。此数据在图4C中以图形方式表示，将红色节点位移归一化到移至JBT-miR2处理一致性线以上的ED表面积(EDSA)。第2组的效果并不突出(数据未显示)。

JN-101局部心脏功能

与施用JN-101后2周心脏容积减少一致，在节点30-36处左心室梗死区域的劳损百分比显著增加(节点30、31、34、36的p<0.05以及节点32和33的P<0.01)(图5A和B)。JN-101处理的小鼠的LV的合成3D图像显示出强烈且具有统计学意义的迹象，表明与处理后施用运载体4周相比，JN-101在IR损伤后的几周内明显增强了基础心肌缩短(图5C和D)。

JBT-miR2末端血液动力学

第1组：

当缺血后再灌注时将JBT-miR2施用于小鼠，没有发现JBT-miR2处理组和对照组之间存在最大压力差，表明药物不会阻碍心脏的扩张能力。处理组之间基线和多巴酚丁胺刺激时的心率没有差异。当用6μg多巴酚丁胺(5.1mmHg JBT-miR2与8.0mmHg对照品P＝0.056)刺激时，JBT-miR2处理的心脏出现了几乎显著的到显著降低的舒张末压(EDP)。用8μg多巴酚丁胺刺激，JBT-miR2处理小鼠的EDP为6.1mmHg，而对照病毒处理小鼠为10.4mmHg，P＝0.029，表明易于扩张。与经对照病毒处理的小鼠相比，当用8μg多巴酚丁胺(15820.7mmHg/sJBT-miR2与14428.6mmHg/s对照品P＝0.262)刺激时，施用JBT-miR2的小鼠的最大压力变化率(最大dP/dt)高出1392.1mmHg/s，表明JBT-miR2处理的收缩性增加。与施用对照病毒的小鼠相比，用8μg多巴酚丁胺(-10050.7mmHg/s JBT-miR2与-9121.2mmHg/s对照品P＝0.128)刺激时，JBT-miR2处理小鼠的最小压力变化率(最小dP/dt)的绝对值几乎显著更高，表明施用JBT-miR2后舒张功能增加。与施用对照病毒的小鼠相比，在JBT-miR2处理的心脏中，施用6μg多巴酚丁胺(10ms JBT-miR2与12.3ms对照品P＝0.027)后指数τ显著降低，进一步表明药物对舒张功能增加的与影响(图9A-9L)。

第2组：

当缺血后再灌注后两周向小鼠施用JBT-miR2时，JBT-miR2处理组与对照组在基线或多巴酚丁胺刺激下的最大压力没有差异。处理组之间基线或多巴酚丁胺刺激时的心率没有差异。JBT-miR2处理的心脏与对照病毒处理的心脏之间的EDP、最小dP/dt和最大dP/dt无显著差异。需要注意的是，对于最小dP/dt和最大dP/dt，两次测量中JBT-miR2和对照品之间的平均差异对于最大dP/dt高出约1000mmHg/s，对于最小dP/dt降低约1000mmHg/s。与对照病毒相比，在用8μg(8.1ms JBTmiR2与9.3ms对照品P＝0.092)刺激时，JBT-miR2处理的心脏的指数τ几乎显著降低(1.2ms差异)，表明放松能力增加，与第1组小鼠在再灌注时施用JBT-miR2时一致(图9A-9L)。

JN-101末端血液动力学

通过末端血液动力学测量，N-101处理的小鼠在给药4周后具有显著增加的基础dP/dt最大(6182.68+/-1415mmHg/s JN-101与5139.45+/-668.8mmHg/s运载体P＝0.049)，表明在心脏缺血后用JN-101处理形成了功能活跃的成熟心肌细胞(图10A-10F)。在另一组小鼠中，其中在IR损伤后2周施用JN-101，末端血液动力学显示，与运载体处理小鼠相比，在JN-101处理的小鼠中施用8μg多巴酚丁胺(P＝0.0024)测量的最大压力mmHg的刺激具有显著差异。同样，在JN-101处理的小鼠使用施用8μg多巴酚丁胺(P＝0.0185)增加了最大dP/dt(mmHg/s)，施用6μg和8μg多巴酚丁胺增加了松弛最小dP/dt mmHg/s(P＝0.036和P＝0.0275)。最小和最大dP/dt的斜率存在显著差异。这些数据表明，在损伤后2周可向具有IR损伤的小鼠施用JN-101，表明功能活跃的心肌细胞的形成可在缺血性损伤后的显著时间间隔后对多巴酚丁胺刺激作出反应(图11A-11G)。

组织学

JBT-miR2瘢痕面积：

将选定存活小鼠的心脏从LCA结扎上方1mm处连续切割至心尖，在三个水平上以4μM的间隔用马松三色(TM)染色(图6A)。使用ImageDx软件对每个水平两个连续切片的总组织mm^{^2}的瘢痕进行量化，取平均值并表示为总组织面积的百分比。在第1组中，与对照品处理的心脏相比(10.96％，N＝3)(P＝0.039)，JBT-miR2处理的心脏纤维化组织显著降低了47.7％(5.73％，N＝5)(图6C)。对照品和JBT-miR2处理小鼠的代表性切片如图6B所示。

由委员会认证的病理学家进行的定性病理学分析了第1组(N＝3JBT个JBT-miR2，N＝4对照品)的剩余小鼠心脏。对福尔马林中的组织进行大体检查，并进行解剖放在盒中，并包埋在石蜡中。组织学切片用H&E染色，并按以下方式进行定性评估：正常＝0，1(+)至3(+++)最小至最大纤维化和变薄。官方病理学发现：‘在再灌注时施用JBT-miR2可缓和缺血性损伤(第1组，如图12)。对于选定的第2组小鼠样本，“当在再灌注后2周施用JBT-miR2时，3只缺血小鼠的心脏在组织学上正常化”。病理报告的结论是，在再灌注时和缺血后2周施用JBT-miR2可缓和缺血性损伤。在缺血后2周施用JBT-miR2时，C组中3只缺血小鼠的心脏在组织学上正常化。在第1组和第2组小鼠中检查的任何组织(包括肝脏)中均未观察到任何表示毒性的组织学变化。

JBT-miR2组织学：

在JBT-miR2处理小鼠中，每切片面积的肌球蛋白重链(MHC)阳性绿色心肌样细胞数量增加14％，表明增殖后再分化[10,595+1036对照品N＝3与12,092+790JBT-miR2 N＝5，P＝0.06，平均6个切片/心脏/小鼠](图6D)。为了支持CM特异性，miR下调不影响人成纤维细胞或血管细胞的增殖。

JBT-miR2分布：

使用人U6启动子的引物在给药后6周，通过qPCR测定在组织中未检测到病毒和miR基因沉默，这与AAV2/9的非整合性质一致(图13)。

JBT-miR2脱靶组织病理学和多效性效果：

代谢血液功能测试(MFT)：兔子和啮齿动物诊断服务(RADA)分析(圣地亚哥，92121)分析了第8周收集的末端血液的MFT。第1组：在JBT-miR2与对照品处理小鼠之间没有测量到钠、钾、氯化物、二氧化碳、钙、葡萄糖、血尿素氮、肌酸、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶、胆红素、蛋白、白蛋白、球蛋白、胆固醇或肌酸激酶(CK)的差异。然而，在JBT-miR2处理小鼠中，CK水平降低约40％(JBT-miR2(N＝5)302±269.7与对照品(N＝6)501±228IUL，P＝0.22)。第2组：JBT-miR2处理小鼠的BUN水平明显低于对照组，这可能表明该药物可以帮助肾脏更有效地去除血液中的尿素(P＝0.001)。JBT-miR2处理小鼠的CK水平也降低了50％(P＝0.04)(图7、图22A-22B)。病理学：毒性组织病理学评价的一般方法显示心脏、脾脏、肺、肾脏、肝脏、皮肤、骨骼肌和脑中没有毒理学变化的迹象(Troyer)。各组间体重和心率相似(图12)。

JBT-miR2 NGS：

在仅对心脏的亚分析中，JBT-miR2增加了64个mRNA的表达，降低了86个mRNA的表达。KEGG分析显示，参与蛋白合成、细胞内信号传导、心肌结构和功能以及肌膈组织的通路均上调。4.5LIM结构域蛋白1是一种在人类中由FHL1基因编码的蛋白，mRNA上调>log2(倍数变化)为11.34。研究表明，FHL1A与其他蛋白之间的相互作用在肌节的组装中起关键作用，肌节是肌肉细胞内肌肉紧张(收缩)所必需的结构。这些相互作用似乎也参与肌肉细胞内的化学信号传导，维持这些细胞的结构，并影响肌肉生长和大小。对JN-101处理作出反应的心脏中第二高表达的mRNA是肌钙蛋白T2(log 2倍数变化为10.35，P＝1.28E-09)，它是心肌细胞收缩的关键调控因子。参与癌症、肥厚型心肌病的通路被下调(图8A-8D、图23A-23B)。在JBT-miR2治疗后，心脏中的长链非编码RNA(IncRNA)水平增加(9)和降低(9)(图8E-8H)，并列于图23C-23D。JBT-miR2处理的心脏组织中未知编码蛋白(TUCP)的转录本增加(23)和减少(24)(图8I-8L)，并列于图23E-23F。JBT-miR2处理可调节多个途径，正在进行的分析将帮助我们破译那些参与心肌细胞再生的关键途径。

体重和心律失常：

JBT-miR2(图14A-14F)或JN-101(数据未显示)对体重或心脏重量没有影响。在任何小鼠中均未发现心率失常。从衰竭的人心脏移植器官中分离出的原发性人心室心肌样细胞与JBT-miR2在1×10¹¹vg/mL下培养30分钟。培养10分钟后没有发现后收缩(AC)或收缩失败(CF)(图15)。

BW和HW的分析

与运载体相比，在单次给药后第15天测量时(剂量为15mg/kg)和在单次给药后第25天测量时(剂量为10mg/kg)，JN-101对无损伤小鼠BW没有影响。在第15天观察到HW的剂量依赖性增加，在第7天观察到影响，但在第25天时不显著。值得注意的是，在第15天，JN-101处理的小鼠的湿HW低于运载体处理小鼠的湿HW。在研究后给药第25天测量到HW与BW比值的显著剂量依赖性增加(P值：0.01，F值＝4.43，T检测P值：P＝0.05运载体与10mg/kg JN-101)。施用10mg/kg JN-101处理在第25天使HW与BW比值增加可能与心肌细胞的再生有关。

代谢血液功能检测

与运载体相比，SC注射JN-101(400μl)导致第2天的钠、钾、氯离子和磷轻微升高(50％生理盐水：50％10mM Tris-HCL，0.1mM EDTA，pH 8.0)，然而，在注射后第7天、第15天或第25天，水平恢复正常并且与运载体没有差异。由于抗miR在10mM Tris-HCL，0.1mMEDTA，pH 8.0中溶解，这可能是第2天这些离子水平较高的原因。与运载体相比，JN-101处理的小鼠的CK、BUN和胆固醇水平在第7天升高，但在任何其他时间点均没有差异。在JN-101处理的动物中，ALK水平在第15天较高，但在所有其他时间点均正常。所有值均在雄性CD-1小鼠的正常范围内。未观察到毒性(Stanley Roberts DABT)。

心肌细胞增殖和细胞面积

进行一项额外实验，确认1)细胞分裂和2)肥大是否是SC注射10mg/kg JN-101后第25天湿HW:BW比值增加的原因。对在SC注射(小鼠编号113、114、115、116)或运载体(小鼠编号85、86、87、88)后15天施用15mg/kg JN-101处理的4只小鼠的心脏进行切片，用ARK-2、MHC和H3P抗体进行三重染色并使用Image^DX进行量化。2-Plex细胞计数显示H3P/ARK-2阳性细胞增加，表明胞质分裂。

对用10mg/kg JN-101处理并在第25天处死(小鼠编号152、153、154和155)或用运载体处理(小鼠编号125、126、127、128)的4只小鼠的心脏进行切片，并用马松三色染色。使用Image^DX量化细胞大小。细胞大小或心肌细胞肥大的迹象无差异(图26)。

讨论

miRNA作为多种疾病(包括心脏病)的治疗靶点正得到深入研究。通过利用成年心肌样细胞的再生能力，作为一种转化的治疗方法，我们证明了一种优化的病毒JBT-miR2，该病毒为let-7a/c和miR-99/100递送两个转录的miR结合RNA，在短暂性IR损伤小鼠再灌注时单次给药可以显著减少心肌瘢痕形成、减少心脏容积并增加心脏功能。

同样，四个miR的antagomiR在体内具有相似的效果，在缺血后再灌注时施用可以改善整体和局部室壁运动。本发明公开的方法与Aguirre等人的发现不同，Aguirre等人证明了两种病毒对miR表达修饰的拉链构建体抑制剂减轻了永久性LCA结扎小鼠的缺血性损伤。本发明使用的具有短暂性LCA结扎的小鼠IR模型是与人类临床使用更相关的模型，在某些实施例中，在灌注已恢复心肌后，在心脏病发作后不久在心导管插入术实验室中施用病毒。

有效性的时机

JBT-miR2在尽可能接近缺血后再灌注时施用可以更有效，如第1组小鼠所示，由本发明提供的整体ECHO和MRI数据支持(表7)。心脏容积的减少在给药后2周时明显，但在IR后8周时不显著。在其他实施例中，在第1组和第2组小鼠中，较高剂量的病毒和/或局部心脏给药可能对增加心脏功能和减少心脏容积具有更显著的长期积极效果。

与ECHO确定的对照病毒相比，IR后2周用JBT-miR2处理的第2组小鼠在IR后8周确实显示心脏容积的减少，但JBT-miR2和对照病毒组之间的效果没有差异。在某些实施例中，在已确定心力衰竭的小鼠中，较高剂量的病毒和/或局部心脏给药可能对增加心脏功能和减少心脏容积具有更显著的长期积极效果。

局部室壁运动

本研究的独特之处在于应用心脏MRI 3D区域室壁运动测量收缩，并能够将这种成像方法转化为大型动物和人类研究(图4)。2D-ECHO受平面视图的限制，仅提供左心室的单一平面视图。与对照病毒(第1组)相比，JBT-miR2在IR给药后2周显著增加心壁运动。在IR损伤后2周施用JBT-miR2(第2组)时，对室壁运动的效果并不明显，这表明，在某些实施例中，在已确定心力衰竭的小鼠中，较高剂量(1×10^12-14vg/小鼠)的病毒和/或局部心脏给药可能对增加心脏功能和减少心脏容积具有更显著的长期积极效果。

瘢痕面积减少

两个独立的盲组使用马松三色染色或苏木精和伊红染色在IR后8周评估瘢痕面积的减少。两组的发现显示，当在再灌注(第1组)和再灌注后2周(第2组)时施用JBT-miR2可显著减少纤维化组织(图6)。CK水平(肌肉损伤的标志物)在第2组小鼠中显著降低(P＝0.048)(图7)。由于CK循环水平升高表示肌肉损伤并且在IHD患者中长期升高，这表明JBT-miR2减少肌肉损伤，这与心脏组织学一致。高血尿素氮(BUN)水平也可能是由于心力衰竭导致肾脏血流不足的结果。与心脏功能的增加、纤维化和瘢痕组织的减少以及CK水平一致，第2组小鼠的BUN水平显著降低(P<0.001)。在JBT-miR2处理的第1组小鼠中，CK水平降低40％，但BUN水平没有变化。这可能是由于在第1组处理后8周与第2组处理后6周测量的CK和BUN的循环水平，在本发明提供的某些实施例中，病毒的有效期可能是在施用JBT-miR2后2至6周。

作用机制

斑马鱼和新生小鼠的心脏再生的作用机制是一种心肌样细胞介导的过程，即成熟心肌样细胞去分化，然后增殖和进一步再分化。目前的研究设计无法证实FNTβ和SMARCA5参与小鼠心肌再生，因为在8周的末端血液动力学后，在尸检时收集心脏组织进行转录RNA分析，预测FNTβ和SMARCA5的水平将显著降低。在用15mg/kg JN-101处理的正常小鼠中，与运载体相比，观察到心脏中ARK2阳性细胞的增加(p＝0.03)。然而，在缺血性损伤小鼠中，IR后8周的mRNA、TUCP和IncRNA水平存在显著差异，特别是与心肌结构和功能相关的mRNA(图23A-23F)。重要的是心肌肌钙蛋白T(cTnT)水平的升高，它由JBT-miR2处理心脏中的基因TNNT2编码，是肌钙蛋白复合物的一个组分，允许肌动球蛋白相互作用和收缩以响应FHL1A的Ca 2+和mRNA水平。结合增加的MHC阳性细胞(图14A-14F)，这表明JBT-miR2增加了IR损伤后分化的心肌样细胞的数量。

安全性

在小鼠中单次IV施用JBT-miR2或SC施用JN-101中没有发现明显的安全问题。部分是因为病毒和JN-101短暂存在于心肌细胞中并且是非整合病毒。此外，在脱靶组织中没有异常病理变化或与Tud或JN-101表达相关的死亡增加。相反，与对照病毒处理的小鼠相比，JBT-miR2处理小鼠的存活益处不显著。MFT没有显示出肝毒性的迹象，这一直是病毒递送疗法的一个问题。毒性组织病理学评价的一般方法显示心脏、脾脏、肺、肾脏、肝脏、皮肤、骨骼肌和脑中没有毒理学变化的迹象(Troyer)。各组间体重和心率相似。从衰竭的人心脏移植器官中分离出的原发性人心室心肌样细胞与JBT-miR2在1×10¹¹vg/mL下培养30分钟。培养10分钟后没有发现后收缩(AC)或收缩失败(CF)。

病毒和AntagomiR的设计与翻译

我们的单一病毒表达Tud到miR-99/100具有高度创新性。首先，目前没有可再生心肌的商业治疗方法。JBT-miR2代表了一种一流的、新颖的(并且在一些实施方案中是辅助的)心脏IR损伤疗法，通过靶向经验证的miR靶点来增强内源性CM再生。JBT-miR2不仅通过促进内源性CM的增殖消除了外源性细胞排斥的可能性，而且与自体策略相比，它可以简化药物生产，因为心脏祖细胞的产生不需要收集、培养和移植干细胞。这种情况从未获得实现，代表着概念上的重大进步。其次，JBT-miR2是一种精确的单一亲心性AAV2/9构建体，是向心肌有效、安全地递送特异性多RNAi再生疗法的下一个“垫脚石”。本发明提供的合成物和方法的优点包括：(a)AAV载体在CV基因治疗中可能是递送TuD的最佳选择，因为它们不含病毒蛋白编码序列来刺激免疫反应，不需要活性细胞分裂即可发生表达，并且与腺病毒载体相比具有显著优势，因为它们在体内心肌样细胞中具有稳定、长期的基因表达；(b)在广泛的研究中，在再灌注以单次低测试剂量经IV施用时，JBT-miR2在IR损伤的小鼠中表现出疗效，并且没有瘤形成或器官毒性的证据；(c)AAV2/9病毒是非整合病毒，这降低了脱靶效应和长期毒性的可能性；(d)JBT-miR2可通过新肌内或冠状动脉内注射施用，从而减少安全问题；(e)与目前其他靶向单个miR的合成物和方法不同，已知多个miR(>60)参与斑马鱼心脏再生，这表明靶向单个miR不能有效再生人类心脏；以及(f)TuD在设计、效力、特异性和疗效方面优于先前描述的作为miR抑制剂的修饰拉链构建体。

JN-101寡核苷酸通过抑制RISC复合物中的内源性微小RNA起作用，并通过与病毒中表达的Tud完全不同的机制起作用。

人类等效剂量和给药策略

根据我们生成的数据，我们可以使用食品和药物行业指南在成人健康志愿者治疗的初步临床试验中估计的最大安全起始剂量预测在再灌注和已确定心脏衰竭时JBT-miR2和JN-101在人类中的药理活性剂量范围。

在小鼠中，无毒性的JN-101治疗剂量范围为10mg/kg/小鼠，施用体积为400μl。由此我们可以估计，在测试剂量高达15mg/kg的小鼠中，有效和安全的剂量在1-100mg/kg，在正常小鼠中没有观察到毒性。因此，人类等效剂量如下所示，根据体表面积在患者的心脏内经皮下或局部给药。对于小鼠，有效剂量除以12.3。小鼠JBT-miR2的有效剂量为1×10¹¹vg/小鼠。在一些实施例中，根据本发明提供的临床前数据和可能限制脱靶副作用的局部心脏给药，可以施用更高的剂量。表13和14提供了基于鼠类研究的本发明所述的合成物的人类等效剂量的估计值。

表13：JN-101的动物剂量转换为人类剂量

表14：JBT-miR2的动物剂量转换为人类剂量

JBT-miR2和JN-101在其他疾病治疗和护理标准基础上的适用性

本发明所述的合成物可在心肌梗塞后再灌注时在标准护理的基础上施用，或在已确定心力衰竭药物的基础上施用。IHD的一个主要原因是心脏病发作。尽管有许多用于疏通血栓和恢复受损组织血流的治疗方法，例如可恢复动脉灌注的经皮冠状动脉介入治疗(PCI，例如球囊扩张、支架植入)，并与溶栓和抗血小板治疗或手术血运重建(冠状动脉旁路移植术，CABG)相结合，这些治疗方法改善了IHD患者的治疗(表15)，但在大多数患者中，心脏功能的恢复和预防向HF发展的结果并不令人满意，因为目前的治疗在MI后不会再生心肌，也不会预防向HF发展。本发明所述的合成物和方法在与一个或多个护理标准结合使用时，可为患者预后提供附加或协同的改善。

表15：IHD的当前护理标准

根据退化的RNA测序数据，存在一些选择性潜在mRNA靶蛋白在表达中上调，其中let-7a/c、miR-99/100抑制和治疗其他疾病如下表16所示，以增加补偿蛋白的表达。

表16：靶蛋白

结论

缺血性心脏病是发达国家最大的死亡原因，可由心肌梗死(MI)引起。一个主要的病理问题是成人心肌样细胞在MI后无法内源性再生，导致瘢痕形成、心脏功能下降和心力衰竭的发展。有效促进缺血性心脏内源性心肌样细胞再生可能为MI提供新的治疗方法，并可能预防不良的病理生理后果。

如本发明所述，抑制四种miRNA(miR-99、miR-100、let-7a和let-7c)的特定组合是哺乳动物心肌样细胞去分化和增殖的关键调控因子。作为一种转化治疗方法，本示例描述了合成寡核苷酸antagomiR(JN-101)和腺伴随病毒(AAV2/9、JBT-miR2)的效果的设计和测试，它们都可以暂时抑制心脏缺血再灌注(IR)损伤小鼠心脏中的miR-99、miR-100，let-7a和let-7c。

在本示例中公开的大量双盲研究中，再灌注时经静脉注射单剂量1×10¹¹vg/小鼠的JBT-miR2可能是必须的并且足以重新激活IR损伤小鼠的潜在心脏再生过程，如第2周心脏容积的减少(舒张末期容积，EDV＝63.7±15.5μl JBT-miR2与82.9+16.3μl对照品，p＝0.051，减少23.2％，收缩末期容积，ESV＝39.2±12.9μl JBT-miR2与57.4±14.9μl对照品，p＝0.037，减少31.8％；N＝7证实JBT-miR2，N＝7对照品)和射血分数(EF)的增加(38±8％JBT-miR2与31±6％对照品，p＝0.09，增加22.7％)所示。与对照品相比，MRI显示EDV(-23.1％)、ESV(-34％)出现相似减少，EF增加(23.5％)，单次施用JBT-miR2后2周，小鼠前心尖梗死的室壁运动显著增加。JBT-miR2减少了瘢痕形成(47.7％，p＝0.039)并增加了心肌样细胞的数量，没有明显的安全性问题。当在IR后2周施用时，与对照病毒相比，JBT-miR2减少了纤维化以及血尿素氮(p<0.001)和肌酸激酶(p＝0.04)的水平。RNAseq数据显示FHL1A(11倍)_log2和TNNT2(10倍)_log2的mRNA水平显著增加。ECHO和MRI均显示，当单次皮下施用10mg/kg JN-101治疗时，IR损伤小鼠出现相似的整体改善，进一步验证了靶miRNA。

整体和局部心脏成像以及组织学和生物标志物数据表明，miRNAs-99/miR-100和let-7a/c与两种不同的治疗策略的结合抑制可减轻心脏IR损伤小鼠的心肌损伤，并强调miRNA作为治疗心脏病的新型治疗靶点的重要性。

在本示例中，向RI损伤的小鼠经静脉施用单次低剂量的JBT-miR2。CV病毒递送治疗成功的障碍是获得足够高的心脏摄取以提供有益的生物学效应。IV技术是一种有效、简单的AAV递送模式，因为它避免了侵入性手术的风险。在人类中，IV可通过使用外周或中心静脉导管来实施。然而，在某些实施例中，可通过将病毒隔离在肺、肝脏、脾脏、脑或其他器官中来降低功效。此外，在某些实施例中，这种途径不适用于动脉闭塞的患者。在某些实施例中，对于出现MI的患者，导管介入后重建冠状动脉血流易于递送，可使冠状动脉内递送具有吸引力，因为它可以选择性将治疗剂递送到目标心肌区域并且限制全身毒性的风险。

本示例提供的数据证实：(1)向miR-99、miR-100、let-7a和let-7c递送抑制剂的单次低IV剂量的JBT-miR2或经SC施用JN-101可能是必要的并且足以重新激活IR损伤小鼠的潜在心脏再生过程，如区域室壁运动改善所示；(2)在小鼠短暂性缺血后再灌注时施用JBT-miR2，心脏功能增加，心脏容积减少，疗效更明显；以及(3)JBT-miR2减少瘢痕形成并增加心肌样细胞数量，与施用后数周CK和BUN水平的降低相关。两种治疗策略的小鼠均没有明显的安全性问题。在某些实施例中，局部心脏给药和/或更高剂量的本发明所述的合成物(例如病毒)可能更有效。

本发明包括JBT-miR2，一种包含let-7a/c和miR-99/100(在本发明中称为强诱饵(TuD))的两个转录miR结合RNA的单一病毒载体。作为单一病毒载体，JBT-miR2可用于多种药物递送。在某些实施例中，TuD是具有一个反义miR结合域的人造单链RNA(诱饵)或具有两个miR结构域的稳定茎环，这些结构域通过互补碱基配对将miR隔离到稳定的复合物中。本示例性配置会关闭一个或多个RNAi途径，例如，通过募集加尾和修剪途径来靶向miR进行破坏，以降低目标miR的稳态丰度，从而部分起作用。插入pAV-U6-GFP载体中的是在驱动其表达的人U6或H1启动子旁边克隆的5'端上的两个TuD。

在某些实施例中，JBT-miR2病毒载体在受试者(例如，哺乳动物(如人类或小鼠))中以治疗有效量经静脉施用。例如，当再灌注给药时，受试者可以是患有心脏缺血再灌注损伤的受试者。与目前已知的使用两个单独的AAV2/9或慢病毒载体向四个microRNA表达修饰拉链构建抑制剂的技术相比，本发明公开的病毒载体(例如，JBT-miR2病毒载体)允许在单个病毒载体中递送多个microRNA。在目前已知的技术中，永久性缺血性损伤(非缺血性再灌注)的小鼠模型和两种病毒载体通过直接心内肌(直接进入心肌)施用。在某些实施例中，与心脏缺血再灌注损伤后2周相比，本发明所述病毒载体(例如，JBT-miR2或JN-101)在再灌注时尽可能接近短暂性心脏缺血再灌注损伤时施用有效。这种结果是优越的且出乎意料。JN-101包括等量的JRX0104和JRX0116(向每只小鼠施用10mg/kg)。

JBT-miR2 TuD序列如图1A所示。在本发明中，包含两种寡核苷酸的病毒载体JN-101可通过皮下注射向受试者(例如哺乳动物，包括人类)施用。在某些实施例中，静脉注射导致心脏血栓。经IV施用抗miR将死亡率提高到87％，而SC施用的死亡率为50％。在本发明中，一种或多种病毒载体JBT-miR2和JN-101可在治疗后2周出现心脏病发作的患者中显著降低心脏容积(舒张末期容积和收缩末期容积)并增加射血分数。治疗可在4-8周后生效。可给予重复注射或更高剂量。在本发明中，本发明所述的病毒载体可降低肌酸激酶水平，从而减少心肌损伤并改善肾脏功能，如心脏病发作小鼠中血尿素氮水平的降低所示。在某些实施例中，本发明所述的一种或多种病毒载体可用于改善哺乳动物和人类的肾脏功能。例如，如本示例所示，JBT-miR2可将左心室的瘢痕形成减少47％。两种治疗可改善左心室的局部室壁运动。可在心脏病发作后两周给予两种治疗，并且需要更高的剂量。本示例还提供了人类等效剂量。在某些实施例中，本发明所述的一种或多种病毒载体可增加心肌样细胞和参与分化心肌样细胞肌肉结构和功能的mRNA编码蛋白的数量，并且可应用于其他疾病。在某些实施例中，本发明所述的一种或多种病毒载体(例如JBT-miR2和JN-101中的每一种)，在缺血后再灌注时立即以单一测试剂量施用时，可将存活率提高20％。

在某些实施例中，本发明所述病毒载体包含两个强诱饵(TuD)，其中一个TuD为let-7a/c的转录miR结合RNA，另一个TuD为miR-99/100的转录miR结合RNA。病毒载体可用于多种药物递送。两个TuD中的一个可包含具有一个反义miR结合域的人造单链RNA(诱饵)或具有两个miR结构域的稳定茎环，这些结构域通过互补碱基配对将miR隔离到稳定的复合物中。TuD构型可禁用RNAi途径。这种RNAi途径的关闭包含通过募集加尾和修剪途径来靶向miR进行破坏，以降低目标miR的稳态丰度。两个TuD可位于病毒载体的5'端和/或与驱动其表达的人U6或H1启动子相邻。病毒载体可包含以下一种或多种：(a)TuD(Let-7a/c TuD 1)，(b)Let-7a反向补体，(c)miR-99a/100TuD 2，以及(d)miR-99a反向补体，如图1A所示。

在至少某些上述实施例中，一个实施例中使用的一个或多个元件可在另一个实施例中互换使用，除非这种互换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离要求标的物的范围的情况下，可对上述方法和结构进行各种省略、补充和修改。所有此类修改和变更均均在所附权利要求定义的标的物范围内。

关于本发明中使用的基本上任何复数和/或单数术语，本领域技术人员可根据上下文和/或应用从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为清楚起见，本发明明确规定了各种单数/复数的排列。在本说明书和所附权利要求中，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数引用。除非另有说明，否则本发明对“或”的任何引用包括“和/或”。

本领域技术人员将理解，一般而言，本发明使用的术语，特别是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常是“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(includes but isnot limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果打算介绍特定数量的权利要求叙述，则这种意图将在权利要求中明确叙述，在没有这种叙述的情况下不存在这种意图。例如，作为理解的辅助手段，以下所附权利要求可包括使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来介绍权利要求叙述。然而，此类短语的使用不应解释为暗示由不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”介绍的权利要求叙述将包括此类介绍的权利要求叙述的任何特定权利要求限制为仅包括一种此类叙述的实施例，即使同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词，如“一个(a)”或“一个(an)”(例如，“一个(a)”和/或“一个(an)”应解释为“至少一个”或“一个或多个”)；这同样适用于使用用于介绍权利要求叙述的定冠词。此外，即使明确叙述了具体数量的介绍的权利要求叙述，本领域技术人员将认识到，这种叙述应解释至少是指叙述数量(例如，“两次叙述”的简单叙述，没有其他修饰词，意味着至少两次叙述，或两次或两次以上的叙述)。此外，在使用类似于“A、B和C等至少一个”的习惯用语的情况下，一般而言，这种结构是指本领域技术人员理解的习惯用语的意义(例如，“具有A、B和C等至少一个系统”包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C等的系统)。在使用类似于“A、B或C等至少一个”的习惯用语的示例中，一般而言，这种结构是指本领域技术人员理解的习惯用语的意义(例如，“具有A、B或C等至少一个系统”包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上任何表示两个或多个替代术语的转折词和/或短语，无论是在实施方式、权利要求或附图中，均应理解为包括其中一个术语、术语之一或两个术语的可能性。

此外，当根据马库什组来描述本发明的特征或方面时，本领域的技术人员将认识到，还可根据马库什组要素的任何单独要素或子组来描述本发明。

本领域的技术人员理解，出于任何及所有目的，如在提供书面描述方面，本发明所公开的所有范围也包括任何及所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围均可轻松视为足以描述并将相同范围分为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本发明所讨论的每个范围很容易分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域的技术人员也理解，“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言均包括所列举的数字，并且指可随后分为上述子范围的范围。最后，本领域的技术人员理解，一个范围包括每个单独成员。因此，例如，包括1-3个物品的一组是指包括1个、2个或3个物品的多组。同样，包括1-5个物品的一组是指包括1个、2个、3个、4个或5个物品的多组。

虽然本发明已公开了各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域的技术人员显而易见。本发明公开的各个方面和实施例仅作说明之用，而非加以限制，本发明的真实范围和精神如以下权利要求所述。

序列表

<110> Jaan药业有限公司

Brar, Bhawanjit Kaur

<120> 减轻缺血再灌注损伤的合成物和方法

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<220>

<221> misc_feature

<222> (0)...(0)

<223> mmu-miR-100-5p

<400> 31

aacccguaga uccgaacuug ug 22

<210> 32

<211> 22

<212> RNA

<213> 褐家鼠

<220>

<221> misc_feature

<222> (0)...(0)

<223> rno-miR-100-5p

<400> 32

aacccguaga uccgaacuug ug 22

<210> 33

<211> 22

<212> RNA

<213> 野猪

<220>

<221> misc_feature

<222> (0)...(0)

<223> ssc-miR-100

<400> 33

aacccguaga uccgaacuug ug 22

<210> 34

<211> 22

<212> RNA

<213> 黑猩猩

<220>

<221> misc_feature

<222> (0)...(0)

<223> ptr-miR-100

<400> 34

aacccguaga uccgaacuug ug 22

<210> 35

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (0)...(0)

<223> hsa-miR-100-5p

<400> 35

aacccguaga uccgaacuug ug 22

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0100

<400> 36

ccatacaacc tactacctc 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0101

<400> 37

ctatacaacc tactacctc 19

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0102

<400> 38

catacaacct actacctc 18

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0103

<400> 39

tatacaacct actacctc 18

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0104

<400> 40

atacaaccta ctacctc 17

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0105

<400> 41

atacaaccta ctacctc 17

<210> 42

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0106

<400> 42

tacaacctac tacctc 16

<210> 43

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0107

<400> 43

tacaacctac tacctc 16

<210> 44

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0108

<400> 44

acaacctact acctc 15

<210> 45

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0109

<400> 45

acaacctact acctc 15

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0110

<400> 46

caagttcgga tctacgggt 19

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0111

<400> 47

caagatcgga tctacgggt 19

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0112

<400> 48

aagatcggat ctacgggt 18

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0113

<400> 49

aagttcggat ctacgggt 18

<210> 50

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0114

<400> 50

agatcggatc tacgggt 17

<210> 51

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0115

<400> 51

agttcggatc tacgggt 17

<210> 52

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0116

<400> 52

gatcggatct acgggt 16

<210> 53

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0117

<400> 53

gttcggatct acgggt 16

<210> 54

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0118

<400> 54

atcggatcta cgggt 15

<210> 55

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JRX0119

<400> 55

ttcggatcta cgggt 15

<210> 56

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 环序列

<400> 56

tgtgctt 7

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠U6启动子正向引物

<400> 57

tcgcacagac ttgtgggaga a 21

<210> 58

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠U6启动子反向引物

<400> 58

cgcacattaa gcctctatag ttactagg 28

<210> 59

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR1的let-7a-5p序列

<400> 59

gtgaggtagt aggttgtata gtttcaagag aactatacaa cctactacct cattttt 57

<210> 60

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR1的miR-99a-5p序列

<400> 60

gaacccgtag atccgatctt gtgtcaagag cacaagatcg gatctacggg ttttttt 57

<210> 61

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR1的(H1-)let-7a-5p和(U6)-miR-99a-5p

<400> 61

gtgaggtagt aggttgtata gtttcaagag aactatacaa cctactacct catttttgag 60

ctcaaaaaaa cccgtagatc cgatcttgtg ctcttgacac aagatcggat ctacgggttc 120

<210> 62

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR1的let-7c-5p序列

<400> 62

gtgaggtagt aggttgtatg gtttcaagag aaccatacaa cctactacct cattttt 57

<210> 63

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR1的miR-100-5p序列

<400> 63

gaacccgtag atccgaactt gtgtcaagag cacaagttcg gatctacggg ttttttt 57

<210> 64

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR1的(H1-)let-7C-5p和(U6)-miR-100-5p

<400> 64

gtgaggtagt aggttgtatg gtttcaagag aaccatacaa cctactacct catttttgag 60

ctcaaaaaaa cccgtagatc cgaacttgtg ctcttgacac aagttcggat ctacgggttc 120

<210> 65

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7c抑制剂序列

<400> 65

ccatacaacc tactacctc 19

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a抑制剂序列

<400> 66

ctatacaacc tactacctc 19

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7c抑制剂序列

<400> 67

catacaacct actacctc 18

<210> 68

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a抑制剂序列

<400> 68

tatacaacct actacctc 18

<210> 69

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a/c抑制剂序列

<400> 69

atacaaccta ctacctc 17

<210> 70

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a/c抑制剂序列

<400> 70

atacaaccta ctacctc 17

<210> 71

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a/c抑制剂序列

<400> 71

tacaacctac tacctc 16

<210> 72

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a/c抑制剂序列

<400> 72

tacaacctac tacctc 16

<210> 73

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a/c抑制剂序列

<400> 73

acaacctact acctc 15

<210> 74

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let-7a/c抑制剂序列

<400> 74

acaacctact acctc 15

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-100抑制剂序列

<400> 75

caagttcgga tctacgggt 19

<210> 76

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-99抑制剂序列

<400> 76

caagatcgga tctacgggt 19

<210> 77

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-99抑制剂序列

<400> 77

aagatcggat ctacgggt 18

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-100抑制剂序列

<400> 78

aagttcggat ctacgggt 18

<210> 79

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-99抑制剂序列

<400> 79

agatcggatc tacgggt 17

<210> 80

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-100抑制剂序列

<400> 80

agttcggatc tacgggt 17

<210> 81

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-99抑制剂序列

<400> 81

gatcggatct acgggt 16

<210> 82

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-100抑制剂序列

<400> 82

gttcggatct acgggt 16

<210> 83

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-99抑制剂序列

<400> 83

atcggatcta cgggt 15

<210> 84

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-100抑制剂序列

<400> 84

ttcggatcta cgggt 15

<210> 85

<211> 6558

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 病毒载体JBT-miR1

<400> 85

cggcctcagt gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg 60

cggccgcacg cgtctagtta ttaatagtaa tcgaattcgt gttactcata gcagatcacc 120

gctgctcgtc aactgaggcg cccaggcagt caggggactt cgtcgcccgg cctcagtgag 180

cgagcgcgca gcgagggagt ggcccacttc atcactaggc gttcctgcgg ccgcacgcgt 240

ctagttcact catagtaatc gaacttcgcg ttactcataa cagtgaacgc tgacgtcatc 300

aacccgctcc aaggaatcgc gggcccagtg tcactaggcg gggaacaccc agcgcgcgtg 360

cgccctggca ggaagatggc tgcgagggac aggggagtgg cgccccgcaa tattttccat 420

gtcggctatg tgttcttggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 480

ttataagttt ctgtatgaga ccactcggat ccgtgaggta gtaggttgta tagtttcaag 540

agaactatac aacctactac ctcatttttg agctcaaaaa aaacccgtag atccgatctt 600

gtgctcttga cacaagatcg gatctacggg tttcggtgtt cgcgtccttt ccacaagata 660

tataaaccca agaaatcgaa atactttcaa gttacggtaa gcatatgata gtccatttta 720

aaacataatt ttaaaactgc aaactaccca agaaattatt actttctacg tcacgtattt 780

tgtactaata tctttgtgtt tacagtcaaa ttaattctaa ttatctctct aacagccttg 840

tatcgtatat gcaaatatga aggaatcatg ggaaataggc cctcttcctg cccgaccttc 900

tgtcccctcc accccacgtc gacattaatg aagcttggcg actagtaata ctgtaatagt 960

aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1020

cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cctatatgca tggccccagg 1080

aaatcggaaa tagttcaagt tacggtaagc atatgatagt ccattttaaa acattatttt 1140

aaactgcaaa ctacccaaga aaattatact ttctacgtca cgtattttgt actaatatct 1200

ttgtgtttac agtcaaatta ttctaattat ctctcctaac agccttgtat cgtatatgca 1260

aatatgaacg gaatcatggg aaataggccc tcttcctgcc cgaccttctg tcccctccac 1320

cccacgtcga cgacaggatt ggtgacagag aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga 1380

atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga 1440

tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg 1500

gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga 1560

ccactcggat ccggtgaggt agtaggttgt atggtttcaa gagaaccata caacctacta 1620

cctcattttt gagctcaaaa aaaaacccgt agatccgaac ttgtgctctt gacacaagtt 1680

cggatctacg ggttcggtgt tcgcgtcctt tccacaagat atataaaccc aagaaatcga 1740

aatactttca agttacggta agcatatgat agtccatttt aaaacataat tttaaaactg 1800

caaactaccc aagaaattat tactttctac gtcacgtatt ttgtactaat atctttgtgt 1860

ttacagtcaa attaattcta attatctctc taacagcctt gtatcgtata tgcaaatatg 1920

aaggaatcat gggaaatagg ccctcttcct gcccgacctt aagcttggcg actagtaata 1980

ctgtaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 2040

acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg ccccatgatg 2100

ccctagtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 2160

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 2220

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 2280

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 2340

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 2400

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 2460

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttgcaccaa aatcaacggg actttccaaa 2520

atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 2580

ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccgc tagagatccg gtaccgagga 2640

gatctgccgc cgcgatcgcc ggcgcgccag atctcacgct taactagcta gcggaccgac 2700

gcgtacgcgg ccgctcgaga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc 2760

catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg 2820

cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct 2880

gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg 2940

ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt 3000

ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa 3060

gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga 3120

cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat 3180

ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga 3240

cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt 3300

gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga 3360

gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat 3420

ggacgagctg tacaagtaag tcgaggatta taaggatgac gacgataaat tcgtcgagca 3480

ccaccaccac caccactaat aaggtttatc cgatccaccg gatctagata agatatccga 3540

tccaccggat ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt 3600

gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 3660

gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 3720

ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 3780

gtatcttaac gcggtaacca cgtgcggacc gagcggccgc aggaacccct agtgatggag 3840

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 3900

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag 3960

gggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatacgt 4020

caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 4080

cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 4140

cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 4200

tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg 4260

gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 4320

cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcgggct 4380

attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 4440

tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt ttatggtgca 4500

ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4560

ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4620

ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4680

gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4740

agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4800

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4860

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4920

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 4980

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5040

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5100

gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5160

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5220

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5280

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5340

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5400

agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5460

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5520

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5580

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5640

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5700

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5760

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5820

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5880

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 5940

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6000

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 6060

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6120

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6180

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6240

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6300

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6360

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6420

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6480

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6540

ggccttttgc tcacatgt 6558

<210> 86

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR2的let-7a-5p序列

<400> 86

gacggcgcta ggatcatcaa caactataca accaatgtac tacctcacaa gtattctggt 60

cacagaatac aacaactata caaccaatgt actacctcac aagatgatcc tagcgccgtc 120

<210> 87

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR2的let-7a-5p反向补体

<400> 87

gacggcgcta ggatcatctt gtgaggtagt acattggttg tatagttgtt gtattctgtg 60

accagaatac ttgtgaggta gtacattggt tgtatagttg ttgatgatcc tagcgccgtc 120

<210> 88

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR2的miR-99a-5p序列

<400> 88

gacggcgcta ggatcatcaa ccacaagatc ggaaatgtct acgggtacaa gtattctggt 60

cacagaatac aaccacaaga tcggaaatgt ctacgggtac aagatgatcc tagcgccgtc 120

<210> 89

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体JBT-miR2的miR-99a-5p反向补体

<400> 89

gacggcgcta ggatcatctt gtacccgtag acatttccga tcttgtggtt gtattctgtg 60

accagaatac ttgtacccgt agacatttcc gatcttgtgg ttgatgatcc tagcgccgtc 120

<210> 90

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-let-7a

<400> 90

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 91

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-let-7c

<400> 91

ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 92

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-100

<400> 92

aacccguaga uccgaacuug ug 22

<210> 93

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-99a

<400> 93

aacccguaga uccgaucuug ug 22

<210> 94

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsU6R

<400> 94

gctaatcttc tctgtatcgt tcca 24

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsU6F

<400> 95

ggatcagcgt ttgagtaaga g 21

<210> 96

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-U6-52

<400> 96

gcctatttcc catgattcct tc 22

<210> 97

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-U6-32

<400> 97

ggtgtttcgt cctttccac 19

<210> 98

<211> 1096

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TUD盒插入pAV-U6-GFP

<220>

<221> U6启动子

<222> (1)..(241)

<220>

<221> miR-99a TuD

<222> (412)..(531)

<220>

<221> let-7a/c TuD

<222> (550)..(669)

<220>

<221> H1启动子

<222> (678)..(892)

<220>

<221> ITR

<222> (950)..(1036)

<400> 98

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt tatatatctt gtggaaagga 240

ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt 300

agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa 360

agtatttcga tttcttgggt ttatatatct tgtggaaagg acgcgaacac cgacggcgct 420

aggatcatct tgtacccgta gacatttccg atcttgtggt tgtattctgt gaccagaata 480

cttgtacccg tagacatttc cgatcttgtg gttgatgatc ctagcgccgt cttttttgag 540

ctcaaaaaag acggcgctag gatcatcaac aactatacaa ccaatgtact acctcacaag 600

tattctggtc acagaataca acaactatac aaccaatgta ctacctcaca agatgatcct 660

agcgccgtcg gatccgagtg gtctcataca gaacttataa gattcccaaa tccaaagaca 720

tttcacgttt atggtgattt cccagaacac atagcgacat gcaaatattg cagggcgcca 780

ctcccctgtc cctcacagcc atcttcctgc cagggcgcac gcgcgctggg tgttcccgcc 840

tagtgacact gggcccgcga ttccttggag cgggttgatg acgtcagcgt tcactagtta 900

tgagtaacac gaattcgatt actattaata actagacgcg tgcggccgca ggaaccccta 960

gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 1020

tcgcccgacg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggacatg 1080

tgagcaaaag gccagc 1096

<210> 99

<211> 2308

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 白蛋白填充片段设计1

<220>

<221> ITR

<222> (154)..(180)

<220>

<221> U6启动子

<222> (340)..(580)

<220>

<221> miR-99a

<222> (751)..(870)

<220>

<221> let-7a/c

<222> (889)..(1008)

<220>

<221> H1启动子

<222> (1017)..(1231)

<220>

<221> ITR

<222> (2168)..(2308)

<400> 99

ccactccctc tatgcgcgct cgctcactca ctcggccctg gagaccaaag gtctccagac 60

tgccggcctc tggccggcag ggccgagtga gtgagcgagc gcgcatagag ggagtgggta 120

cctccatcat ctaggtttgc ccctgcaggc agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 180

cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgcgc agagagggag 240

tggccaactc catcactagg ggttcctgcg gccgcacgcg tctagttatt aatagtaatc 300

gaattcgtgt tactcataac tagtaaggtc gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt 360

ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat taatttgact 420

gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag 480

tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag 540

tatttcgatt tcttgggttt atatatcttg tggaaaggac tgtaaacaca aagatattag 600

tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 660

gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt 720

tatatatctt gtggaaagga cgcgaacacc gacggcgcta ggatcatctt gtacccgtag 780

acatttccga tcttgtggtt gtattctgtg accagaatac ttgtacccgt agacatttcc 840

gatcttgtgg ttgatgatcc tagcgccgtc ttttttgagc tcaaaaaaga cggcgctagg 900

atcatcaaca actatacaac caatgtacta cctcacaagt attctggtca cagaatacaa 960

caactataca accaatgtac tacctcacaa gatgatccta gcgccgtcgg atccgagtgg 1020

tctcatacag aacttataag attcccaaat ccaaagacat ttcacgttta tggtgatttc 1080

ccagaacaca tagcgacatg caaatattgc agggcgccac tcccctgtcc ctcacagcca 1140

tcttcctgcc agggcgcacg cgcgctgggt gttcccgcct agtgacactg ggcccgcgat 1200

tccttggagc gggttgatga cgtcagcgtt cactagttat gagtaacacg aattcgatta 1260

ctattaataa ctagacgcgt gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 1320

tctctgcgcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggcggcc 1380

tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg caggacatgt gagcaaaagg ccagccaaca 1440

aaatcagcag ctaatgaagg caagtcagca ggtcactcat cattttccac ttcggcaatg 1500

cagtgggatt attccaacag aggtttttca cagcattcct tcagttaact ggagatcgaa 1560

tcttgatttt cacagatata cttggcaagg tccgccctgt catcagcaca ttcaagcaga 1620

tctccatggc agcattccgt gtggacttag gtaagatctg tcactaactt ggaaacttct 1680

gcaaactcag cttagggaaa tctctggctc aggcgagcta ctgcctcagc ttagaaagct 1740

ctttctccaa attattggag actggcacac ttaagtccct gttaggcaga cgaagccttc 1800

ccttcatccc gaagttcatc gagctttggc aacaggcagg cagctttatc agcagcttgg 1860

caacattctg taaaagcagc tttatacctt taagcaaaga aaaggagttc cggggcataa 1920

aagtaaggat gtcttctggc aatttataat aagtattttt tcaaaaatgt ctcttcattg 1980

tcatgaaaag cagtgcatca cacatcaacc tctggtctca ccaatcgggg gaggtttggg 2040

ttgtttactt agtgttgcaa gaattatttt attctctcag gttcttgttt tgcacagcag 2100

tcagctcatt caccataggt ttcacgaaga gttgcacgcg gtaaccacgt gcggaccgag 2160

cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 2220

actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 2280

agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 2308

<210> 100

<211> 3593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADD填充片段设计2

<220>

<221> ITR

<222> (154)..(180)

<220>

<221> U6启动子

<222> (340)..(580)

<220>

<221> miR-99a

<222> (751)..(870)

<220>

<221> let-7a/c

<222> (889)..(1008)

<220>

<221> H1启动子

<222> (1017)..(1231)

<220>

<221> ITR

<222> (3453)..(3593)

<400> 100

ccactccctc tatgcgcgct cgctcactca ctcggccctg gagaccaaag gtctccagac 60

tgccggcctc tggccggcag ggccgagtga gtgagcgagc gcgcatagag ggagtgggta 120

cctccatcat ctaggtttgc ccctgcaggc agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 180

cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgcgc agagagggag 240

tggccaactc catcactagg ggttcctgcg gccgcacgcg tctagttatt aatagtaatc 300

gaattcgtgt tactcataac tagtaaggtc gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt 360

ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat taatttgact 420

gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag 480

tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag 540

tatttcgatt tcttgggttt atatatcttg tggaaaggac tgtaaacaca aagatattag 600

tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 660

gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt 720

tatatatctt gtggaaagga cgcgaacacc gacggcgcta ggatcatctt gtacccgtag 780

acatttccga tcttgtggtt gtattctgtg accagaatac ttgtacccgt agacatttcc 840

gatcttgtgg ttgatgatcc tagcgccgtc ttttttgagc tcaaaaaaga cggcgctagg 900

atcatcaaca actatacaac caatgtacta cctcacaagt attctggtca cagaatacaa 960

caactataca accaatgtac tacctcacaa gatgatccta gcgccgtcgg atccgagtgg 1020

tctcatacag aacttataag attcccaaat ccaaagacat ttcacgttta tggtgatttc 1080

ccagaacaca tagcgacatg caaatattgc agggcgccac tcccctgtcc ctcacagcca 1140

tcttcctgcc agggcgcacg cgcgctgggt gttcccgcct agtgacactg ggcccgcgat 1200

tccttggagc gggttgatga cgtcagcgtt cactagttat gagtaacacg aattcgatta 1260

ctattaataa ctagacgcgt gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 1320

tctctgcgcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggcggcc 1380

tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg caggacatgt gagcaaaagg ccagccgttt 1440

agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 1500

ccgggaccga tccagcctcc ggactctaga gagacgtaca aaaaagagca agaagctaaa 1560

aaagatttaa aaattatttt tagcgcagtt aatggaacag gaactaaatt taccccaaaa 1620

atattacgtg aatcaggata taacgttatt gaggttgaag agcatgcatt tgaagatgaa 1680

acatttaaaa atgttgtaaa tccaaatcca gaatttgatc ctgcatgaaa aataccgctt 1740

gaatatggta ttaaacatga tgcagatatt attattatga atgacccaga tgctgacaga 1800

tttggaatgg caataaaaca tgatggtcat tttgtaagat tagatggaaa tcaaacagga 1860

ccaattttaa ttgattgaaa attatcaaat ctaaaacgct taaatagcat tccaaaaaat 1920

ccggctctat attcaagttt tgtaacaagt gatttgggtg atagaatcgc tcatgaaaaa 1980

tatggagtta atattgtaaa aactttaact ggatttaaat gaatgggtag agaaattgct 2040

aaagaagaag ataacggatt aaattttgtt tttgcttatg aagaaagtta tggatatgta 2100

attgatgact cagctagaga taaagatgga atacaagctt ctatattaat agcagaggct 2160

gcttgatttt ataaaaaaca aaataaaaca ttagtagact atttagaaga tttatttaaa 2220

gaaatgggtg catattacac tttcacttta aacttgaatt ttaaaccaga agaaaagaaa 2280

ttaaaaattg aaccattaat gaaatcattg agagcaacac ccttaactca aattgctgga 2340

cttaaagttg ttaatgttga agactacatc gatggaatgt ataatatgcc aggacaagac 2400

ttactaaaat tttatttaga agataagtca tgatttgctg ttcgcccaag tggaactgaa 2460

cctaaactaa aaatttattt tataggtgtt ggtgaatctg ttcaaaacgc taaagttaaa 2520

gtagacgaaa ttattaaaga attaaaatta aaaatgaata tataggagaa aaaatgaaac 2580

taaacaaata tatagatcac acattattaa aacaagatgc tacgaaagct gaaattaaac 2640

aattatgtga tgaagcaatt gaatttgatt ttgcaacagt ttgtgttaat tcatattgaa 2700

caagctattg taaagaatta ttaaaaggca caaatgtagg aataacaaat gttgtaggtt 2760

ttcctctagg tgcatgcaca acagctacaa aagcattcga agtttctgaa gcaattaaag 2820

atggtgcaac agaaattgat atggtattaa atattggtgc attaaaagac aaaaattatg 2880

aattagtttt agaagacatg aaagctgtaa aaaaagcagc tggatcacat gttgttaaat 2940

gtattatgga aaattgttta ttaacaaaag aagaaatcat gaaagcttgt gaaatagctg 3000

ttgaagctgg attagaattt gttaaaacat caacaggatt ttcaaaatca ggtgcaacat 3060

ttgaagatgt taaactaatg aagtcagttg ttaaagacaa tgctttagtt aaagcagctg 3120

gtggagttag aacatttgaa gatgctcaaa aaatgattga agcaggagct gaccgcttag 3180

gaacaagtgg tggagtagct attattaaag gtgaagaaaa caacgcgagt tactaaaact 3240

agcgtttttt tattttgctc atttttatta aaagtttgca aaaaggaaca taaaaattct 3300

aattattgat actaaagtta ttaaaaagaa gattttggtt gattttataa aggtcataga 3360

atataatatt ttagcatgtg tattttgtgt gctcatttac aaccgtctcg cggccgcggg 3420

acgcggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 3480

tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 3540

gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 3593

<210> 101

<211> 1604

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 部分JBT-miR2病毒序列

<220>

<221> U6启动子

<222> (251)..(491)

<220>

<221> miR-99a

<222> (501)..(620)

<220>

<221> let-7a/c

<222> (639)..(758)

<220>

<221> H1启动子

<222> (767)..(981)

<400> 101

agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 60

ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt 120

atgtaacgcg gaactccata tatgggctat gaactaatga ccccgtaatt gattactatt 180

acagtattac tagtcgccaa gcttcattaa tgtcgacgtg gggtggaggg gacagaaggt 240

cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 300

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 360

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 420

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt tatatatctt 480

gtggaaagga cgcgaacacc gacggcgcta ggatcatctt gtacccgtag acatttccga 540

tcttgtggtt gtattctgtg accagaatac ttgtacccgt agacatttcc gatcttgtgg 600

ttgatgatcc tagcgccgtc ttttttgagc tcaaaaaaga cggcgctagg atcatcaaca 660

actatacaac caatgtacta cctcacaagt attctggtca cagaatacaa caactataca 720

accaatgtac tacctcacaa gatgatccta gcgccgtcgg atccgagtgg tctcatacag 780

aacttataag attcccaaat ccaaagacat ttcacgttta tggtgatttc ccagaacaca 840

tagcgacatg caaatattgc agggcgccac tcccctgtcc ctcacagcca tcttcctgcc 900

agggcgcacg cgcgctgggt gttcccgcct agtgacactg ggcccgcgat tccttggagc 960

gggttgatga cgtcagcgtt cactagttat gagtaacacg aattcgatta ctattaataa 1020

ctagacgcgt gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 1080

ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggcggcc tcagtgagcg 1140

agcgagcgcg cagctgcctg caggacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 1200

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 1260

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1320

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 1380

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 1440

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 1500

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 1560

tatcgccact ggcagcagcc actggtaact gagggcctat ttcc 1604

Claims

1.一种预防、抑制、减轻或治疗心脏缺血再灌注损伤的方法，包括在心脏缺血事件之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

2.根据权利要求1所述的方法，包括缺血心脏组织再灌注。

3.一种增强心脏功能、降低死亡率、减少心脏容积和/或减少缺血再灌注损伤后瘢痕大小的方法，包括在心脏缺血事件之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

4.根据权利要求3所述的方法，包括缺血心脏组织再灌注。

5.一种治疗心肌梗死的方法，包括在缺血心脏组织再灌注之前、期间和/或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述心肌梗死是一种心脏缺血事件。

7.一种在心脏缺血事件后诱导心肌样细胞再生、心脏修复、血管发生和/或心肌样细胞分化的方法，包括在缺血心脏组织再灌注之前、期间或之后向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

8.一种治疗与FHL1和/或TNNT2调节异常相关的疾病或病症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

9.一种治疗受试者肾脏病症和/或防止受试者肾脏受损的方法，包括向受试者施用治疗合成物，其中，所述治疗合成物包含以下一项或多项：(a)一种包含多种微小RNA(miR)拮抗剂的合成物，其中，所述多种miR拮抗剂包括一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂；(b)一个表达盒，包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂、一种或多种miR-100-5p拮抗剂、一种或多种miR-Let-7a-5p拮抗剂以及一种或多种miR-Let-7c-5p拮抗剂进行编码的核苷酸序列；以及(c)一个克隆载体或表达载体，包含(b)所述表达盒。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，以下一项或多项适用：

(a)所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种包括抗miR-99a，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:47、48、50、52和54的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；

(b)所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-100-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；

(c)所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7a-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；以及

(d)所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7c-5p，其核苷酸序列与选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，以下一项或多项适用：

(a)所述一种或多种miR-99a拮抗剂中的至少一种包括抗miR-99a，相对于选自SEQ IDNO:47、48、50、52和54的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基；

(b)所述一种或多种miR-100-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-100-5p，相对于选自SEQ ID NO:46、49、51、53和55的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基；

(c)所述一种或多种Let-7a-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7a-5p，相对于选自SEQ ID NO:37、39和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基；以及

(d)所述一种或多种Let-7c-5p拮抗剂中的至少一种包括抗miR-Let-7c-5p，相对于选自SEQ ID NO:36、38和40-45的一个序列，其核苷酸序列包含一个或多个错配核碱基。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，至少一种所述抗miR包含选自修饰核苷间键、修饰核苷酸和修饰糖部分及其组合的一种或多种化学修饰。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述一种或多种化学修饰包括修饰核苷间键。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述修饰核苷间键选自硫代磷酸酯、2'-O-甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。

15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中，所述修饰核苷间键包括硫代磷酸酯核苷间键。

16.根据权利要求12-15所述的方法，其中，所述一种或多种化学修饰中的至少一种包括修饰核苷酸，可选地，所述修饰核苷酸包括锁核酸(LNA)，进一步可选地，所述锁核酸(LNA)包含在修饰抗miR的一端或两端。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述修饰核苷酸包括锁核酸(LNA)化学修饰、肽核酸(PNA)、阿糖核酸(FANA)、类似物、衍生物或其组合。

18.根据权利要求12-17所述的方法，其中，所述一种或多种化学修饰中的至少一种包括修饰糖部分。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述修饰糖部分为2'-O-甲氧基乙基修饰糖部分、2'-甲氧基修饰糖部分、2'-O-烷基修饰糖部分、双环糖部分或其组合。

20.根据权利要求18-19中任一项所述的方法，其中，所述修饰糖部分包括2'-O-甲基糖部分。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述克隆载体或表达载体为病毒载体。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述病毒载体为慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述克隆载体或表达载体包含：

(a)一个与SEQ ID NO:59-64中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列；

(b)一个与SEQ ID NO:86-89中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列；或

(c)一个与(a)和(b)所示SEQ ID NO中每个核苷酸序列的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:85的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:101的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述多种miR拮抗剂由相同表达盒或载体进行编码。

27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述多种miR拮抗剂由不同表达盒或载体进行编码。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述表达盒包括一个强诱饵(TuD)盒，其包含一个对一种或多种miR-99a拮抗剂进行编码的核苷酸序列。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述TuD盒包含与核苷酸序列(对一种或多种miR-99a拮抗剂进行编码)可操作连接的一个或多个启动子序列，可选地，所述一个或多个启动子序列包含H1启动子和/或U6启动子。

30.根据权利要求28-29所述的方法，其中，所述克隆载体或表达载体包含两个或多个TuD盒。

31.根据权利要求28-30所述的方法，其中，所含克隆载体或表达载体包含两个或多个TuD盒的治疗合成物的有效剂量比所含克隆载体或表达载体包含一个TuD盒的治疗合成物的有效剂量至少约少1.1倍。

32.根据权利要求28-31所述的方法，其中，所述TuD盒包含一个与核苷酸序列SEQ IDNO:98的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:99的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，所述克隆载体或表达载体包含一个与核苷酸序列SEQ ID NO:100的一致性至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，所述治疗合成物是一种药物合成物。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中，在心脏缺血事件发生前施用所述治疗合成物。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，在心脏缺血事件期间施用所述治疗合成物。

38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，在缺血心脏组织再灌注前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时或约96小时施用所述治疗合成物。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中，在缺血心脏组织再灌注时施用所述治疗合成物。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，在缺血心脏组织再灌注后施用所述治疗合成物。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，在缺血心脏组织再灌注后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20天施用所述治疗合成物。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中，所述治疗合成物包含多种微小RNA(miR)拮抗剂，其中，所述给药包括皮下给药、全身给药和/或冠脉内给药。

43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述治疗合成物的施用剂量为约0.08mg/kg、约0.24mg/kg、约0.81mg/kg、约1.22mg/kg、约2.44mg/kg、约3.25mg/kg、约4.06mg/kg、约4.89mg/kg、约5.69mg/kg、约6.50mg/kg、约7.32mg/kg或约8.13mg/kg。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，所述治疗合成物包含多种微小RNA(miR)拮抗剂，其中，所述给药包括脑室内给药和/或心肌内给药。

45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述治疗合成物的施用剂量为约0.004mg/kg、约0.012mg/kg、约0.0405mg/kg、约0.061mg/kg、约0.122mg/kg、约0.1625mg/kg、约0.203mg/kg、约0.2445mg/kg、约0.2845mg/kg、约0.325mg/kg、约0.366mg/kg或约0.4065mg/kg。

46.根据权利要求42-45所述的方法，其中，与所述治疗合成物的静脉内给药相比，所述治疗合成物的皮下给药可提高生存率，并降低心脏血栓的发生率。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中，所述治疗合成物包含一个病毒载体，其中，所述给药包括静脉内全身给药和/或冠脉内给药，可选地，所述治疗合成物的施用剂量为约2.5×10¹²vg(病毒基因组)/kg、约2.5×10¹³vg/kg、约2.5×10¹⁴vg/kg或约2.5×10¹⁵vg/kg。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中，所述治疗合成物包含一个病毒载体，其中，所述给药包括脑室内给药和/或心肌内给药。

49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述治疗合成物的施用剂量为约1.0×10⁵vg/kg-1.0×10¹⁹vg/kg，可选地，所述治疗合成物的施用剂量为约0.125×10¹²vg/kg、约0.125×10¹³vg/kg、约0.125×10¹⁴vg/kg或约0.125×10¹⁵vg/kg。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中，通过单次给药来施用所述剂量。

51.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中，通过多次给药来施用所述剂量。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，包括向受试者重复施用所述治疗合成物，可选地，所述重复施用包括向受试者施用一个或多个附加剂量的所述治疗合成物。

53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述重复施用包括在缺血心脏组织再灌注后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天和/或约20天向受试者施用一个或多个附加剂量的所述治疗合成物。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，进一步包括向受试者施用有效量的至少一种附加治疗剂或至少一种附加疗法，实现联合疗法。

55.根据权利要求54所述的方法，其中，在单独制剂中施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法的每一种，或在单一制剂中同时施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法。

56.根据权利要求54-55所述的方法，其中，按顺序施用、同时施用和/或交替施用所述治疗合成物和所述至少一种附加治疗剂或疗法。

57.根据权利要求54-56所述的方法，其中，所述至少一种附加治疗剂或疗法选自：艾地苯醌、依普利酮、VECTTOR、AVI-4658、阿塔鲁伦/PTC124/Translarna、BMN044/PRO044、CAT-1004、微型肌营养不良蛋白AAV基因疗法(SGT-001)、半乳糖蛋白-1疗法(SB-002)、LTBB4(SB-001)、rAAV2.5-CMV-微小肌营养不良蛋白、谷氨酰胺、NFKB抑制剂、肌聚糖蛋白、δ(35kDa肌营养不良蛋白相关糖蛋白)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达、通过CRISPR/Cas9系统进行的基因组编辑、旨在重新引入肌营养不良蛋白基因功能重组版本的任何基因递送疗法、外显子跳跃疗法、无义突变的通读策略、细胞疗法、肌营养相关蛋白上调、肌肉生长抑制素抑制、抗炎药/抗氧化剂、机械支持装置、生物药物、基因疗法或治疗性基因调节剂、肌营养不良症的任何标准疗法及其组合。

58.根据权利要求54-57所述的方法，其中，所述至少一种附加治疗剂或疗法选自：经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术、溶栓疗法、抗血小板疗法、肝素、华法林、纤维蛋白溶解剂、氧疗、血管舒张剂、止痛药、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、糖蛋白拮抗剂、他汀类药物、醛固酮拮抗剂、植入式心脏除颤器(ICD)或其任何组合。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中，缺血心脏组织再灌注包括经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术、溶栓疗法、抗血小板疗法、肝素、华法林、纤维蛋白溶解剂、氧疗、血管舒张剂、止痛药、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、糖蛋白拮抗剂、他汀类药物、醛固酮拮抗剂、植入式心脏除颤器(ICD)或其任何组合。

60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物，可选为人类。

61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，所述受试者患有或疑似患有心脏病，其中，所述心脏病为心肌梗死、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心力衰竭(例如，充血性心力衰竭)、缺血性心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、酒精性心肌病、病毒性心肌病、心动过速性心肌病、应激性心肌病、淀粉样变心肌病、致心律失常性右心室发育不良、左心室致密化不全、心内膜弹力纤维增生症、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣狭窄、二尖瓣反流、二尖瓣脱垂、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣反流、三尖瓣狭窄、三尖瓣反流、先天性疾病、遗传性疾病或其任何组合。

62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中，所述受试者受选自以下几项的一种病症影响：酒精性心肌病、冠状动脉疾病、先天性心脏病、影响心脏的营养性疾病、缺血性心肌病、高血压性心肌病、瓣膜性心肌病、炎症性心肌病、继发于全身代谢性疾病的心肌病、扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、限制型心肌病(RCM)、致密化不全心肌病、主动脉瓣上狭窄(SVAS)、血管瘢痕形成、动脉粥样硬化、慢性进行性肾小球疾病、肾小球硬化症、进行性肾衰竭、血管闭塞、高血压、狭窄、糖尿病性视网膜病变或其任何组合。

63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中，所述心脏缺血再灌注损伤包括心脏缺血损伤、心脏再灌注损伤或其组合。

64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中，与对照受试者相比，所述给药减轻了心脏缺血损伤、心脏再灌注损伤或其组合。

65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中，与对照受试者相比，所述给药降低了肌酸激酶水平。

66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中，所述心脏缺血再灌注损伤包括由心脏缺血事件、再灌注损伤或其组合引起的损伤。

67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中，所述心脏缺血事件包括以下一项或多项：心肌梗死、冠状动脉旁路移植术(CABG)、心脏搭桥手术、心脏移植术和血管成形术。

68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中，所述心脏缺血事件包括使用以下器械的血管介入手术：支架、激光导管、动脉粥样硬化切除术导管、血管镜检查器械、β或γ辐射导管、冠状动脉旋磨术器械、涂层支架、放射性球囊、可加热线、可加热球囊、可生物降解支架撑杆、可生物降解套管或其任何组合。

69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中，所述给药引起以下一种或多种情况：(1)与对照受试者相比，生存率提高；(2)与对照受试者相比，受试者的肾功能得到改善；(3)与对照受试者相比，血尿素氮(BUN)水平降低；(4)与对照受试者相比，受试者左心室的瘢痕减少和/或受试者左心室的局部室壁运动得到改善；(5)与对照受试者相比，舒张末期容积和/或收缩末期容积减少；(6)与对照受试者相比，射血分数增加；(7)与对照受试者相比，心肌样细胞和/或mRNA(对分化心肌样细胞肌肉结构和功能中所涉及的蛋白进行编码)的数量增加；(8)与对照受试者相比，Ank2、Kdm6a、Grk6、Klhl15、Adam22、Pfkp、Gorasp2、Ralgps1、Inppl1、Kdm3a、Kit、Sort1、Dvl2、Sema6d、Tead1、B4galnt2、Ltbp4、Osbpl9、Nfe2I1、Tnnt2和Fhl1中一项或多项的mRNA水平和/或蛋白水平增加；(9)与对照受试者相比，Asph、Map6、Zfp120、Ctnnd1、Eya3、Tnnt2、Kdm3a、Myo18a、Ncoa6、Slc25a13、Rpe、Ralgps1、Gimap1、Myo5a、Zeb2、Arap1、Nt5c2、Phldb1、Ttn、Camta2、Mef2c、Slk、Uimc1、Mthfd1I、Mtus1、Ythdc1和Eif2ak4中一项或多项的mRNA水平和/或蛋白水平降低；以及(10)与对照受试者相比，心肌样细胞形成、心肌样细胞增殖、心肌样细胞周期活化、心肌样细胞有丝分裂指数、肌丝密度、边界区壁厚或其任何组合中的一项或多项增加。

70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中，所述给药诱导内源性心肌样细胞再生。

71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中，与对照受试者相比，所述给药增强了受试者的心脏功能，其中，增强心脏功能包括以下一项或多项：(i)改善左心室功能；(ii)改善短轴缩短率；(iii)改善射血分数；(iv)减少舒张末期容积；(v)减少左心室质量；以及(vi)使心脏几何结构正常化；或(vii)其组合。

72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中，所述给药对体重和/或心脏重量无显著影响。

73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中，所述给药不会导致以下一项或多项：心律失常、后收缩(AC)以及收缩失败(CF)。

74.根据权利要求8-73中任一项所述的方法，其中，所述治疗合成物增加FHL1和/或TNNT2的mRNA水平和/或蛋白水平。

75.根据权利要求8-74中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症与一个或多个FHL1突变和/或一个或多个TNNT2突变相关。

76.根据权利要求8-75中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症为肌营养不良症或肌营养不良症样肌肉疾病，可选地，所述肌营养不良症与肌萎缩侧索硬化症(ALS)、腓骨肌萎缩症(CMT)、先天性肌营养不良症(CMD)、杜氏肌营养不良症(DMD)、Emery-Dreifuss肌营养不良症(EDMD)、遗传性和内分泌肌病、肌肉代谢性疾病、线粒体肌病(MM)、强直性肌营养不良症(MMD)、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)或其组合相关。

77.根据权利要求8-76中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症为肢带型肌营养不良症、X连锁肌病伴姿势性肌萎缩(XMPMA)、还原体肌病(RBM)、肩胛腓骨(SP)综合征或其任何组合。

78.根据权利要求8-77中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症为肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、扩张型心肌病(DCM)或其任何组合，可选地，所述肥厚型心肌病为家族性肥厚型心肌病。

79.根据权利要求9-78所述的方法，其中，所述肾脏病症与受试者肾功能相关。

80.根据权利要求9-79所述的方法，其中，所述肾脏病症选自：急性肾病(AKD)、急性肾损伤、急性和快速进行性肾小球肾炎、肾病综合征的急性表现、急性肾盂肾炎、急性肾衰竭、特发性慢性肾小球肾炎、继发性慢性肾小球肾炎、慢性心力衰竭、慢性间质性肾炎、慢性肾病(CKD)、慢性肝病、慢性肾盂肾炎、糖尿病、糖尿病性肾病、纤维化、局灶性节段性肾小球硬化症、古德帕斯彻病、糖尿病性肾病、遗传性肾病、间质性肾病、高血压性肾硬化症、IgG4相关性肾病、间质性炎症、狼疮性肾炎、肾炎综合征、尿路部分梗阻、多囊性肾病、进行性肾病、肾细胞癌、肾纤维化、肾移植后的移植物抗宿主病和血管炎。

81.根据权利要求9-80所述的方法，其中，所述损伤与以下一项或多项相关：手术、放射性造影剂成像、放射性造影剂肾病、心血管手术、心肺转流术、体外膜肺氧合(ECMO)、球囊血管成形术、诱导性心脏或脑缺血再灌注损伤、器官移植、肾移植、败血症、休克、低血压、高血压、肾灌注不足、化疗、给药、肾毒性药物给药、钝力外伤、穿刺、毒药或吸烟。

82.根据权利要求9-81所述的方法，其中，所述治疗合成物与选自以下几项的肾治疗剂联合施用：地塞米松、类固醇、布地奈德、曲安奈德、抗炎剂、抗氧化剂、去铁胺、铁胺、锡络合物、锡卟啉络合物、金属螯合剂、乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA-Fe络合物、二巯基琥珀酸(DMSA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、青霉胺、米诺环素、强的松、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、霉酚酸、西罗莫司、环孢菌素或他克莫司抗生素、铁螯合剂、卟啉、血红素、维生素B12、Nrf2通路激活剂、巴多索龙、ACE抑制剂、依那普利、甘氨酸聚合物、抗氧化剂、谷胱甘肽、N乙酰半胱氨酸、化疗剂、QPI-1002、QM56、SVT016426(QM31)、16/86(第三代铁他汀类药物)、BASP siRNA、CCX140、BIIB023、CXA-10、碱性磷酸酶、Dnmtl抑制剂、THR-184、锂、福莫特罗、IL-22、EPO、EPO衍生物、促红细胞生成素刺激剂、阿法依泊汀、阿法达依泊汀、PDGF抑制剂、CRMD-001、阿曲生坦、托伐普坦、RWJ-676070、阿巴西普、Sotatercept、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷类、非甾体抗炎药(NSAID)、利尿剂、他汀类药物、抗衰老药物、皮质类固醇、糖皮质激素、脂质体、肾素、血管紧张素、ACE抑制剂、凋亡介质、纤维化介质、靶向p53的药物、Apaf-1抑制剂、RIPK1抑制剂、RIPK3抑制剂、IL17抑制剂、IL6抑制剂、IL23抑制剂、CCR2抑制剂、硝化脂肪酸、血管紧张素阻滞剂、ALK3受体激动剂和视黄酸。

83.根据权利要求9-82所述的方法，其中，所述治疗合成物与选自以下几项的肾保护剂或肾预防剂联合施用：噻嗪类、布美他尼、依他尼酸、呋塞米、托拉塞米、葡萄糖、甘露糖醇、阿米洛利、螺内酯、依普利酮、氨苯蝶啶、坎利酸钾、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪、加压素、两性霉素B、乙酰唑胺、托伐普坦、考尼伐坦、多巴胺、多佐胺、咖啡因、茶碱、可可碱、他汀类药物、抗衰老药物、纳维克拉、奥巴克拉、皮质类固醇、强的松、倍他米松、氟氢可的松、脱氧皮质酮、醛固酮、可的松、氢化可的松、倍氯米松、莫米松、氟替卡松、泼尼松龙、甲基强的松龙、曲安奈德、糖皮质激素、地塞米松、类固醇、布地奈德、曲安奈德、抗炎剂、抗氧化剂、非甾体抗炎药(NSAID)、去铁胺、铁、锡、金属、金属螯合物、乙二胺四乙酸(EDTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、青霉胺、抗生素、氨基糖苷类、铁螯合剂、卟啉、Nrf2通路激活剂、巴多索龙、ACE抑制剂、依那普利、甘氨酸聚合物、抗氧化剂、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、PDGF抑制剂、锂、铁死亡抑制剂、维生素B12QPI-1002、QM56、SVT016426(QM31)、16/86(第三代铁他汀类药物)、BASP siRNA、CCX140、BIIB023、CXA-10、碱性磷酸酶、Dnmtl抑制剂、THR-184、锂、福莫特罗、IL-22、EPO、EPO衍生物、促红细胞生成素刺激剂、阿法依泊汀、阿法达依泊汀、PDGF抑制剂、CRMD-001、阿曲生坦、托伐普坦、RWJ-676070、阿巴西普、Sotatercept、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷类、非甾体抗炎药(NSAID)、利尿剂、他汀类药物、抗衰老药物、皮质类固醇、糖皮质激素、脂质体、肾素、血管紧张素、ACE抑制剂、凋亡介质、纤维化介质、靶向p53的药物、Apaf-1抑制剂、RIPK1抑制剂、RIPK3抑制剂、IL17抑制剂、IL6抑制剂、IL23抑制剂、CCR2抑制剂、硝化脂肪酸、血管紧张素阻滞剂、ALK3受体激动剂、SGLT2调节剂和视黄酸。

84.根据权利要求9-83所述的方法，其中，所述治疗合成物可改善选自以下几项的一个或多个受试者肾功能标志物：受试者体内的血尿素氮(BUN)减少、受试者血液中的肌酐减少、受试者的肌酐清除率提高、受试者体内的蛋白尿减少、受试者的白蛋白:肌酐比降低、受试者的肾小球滤过率提高、受试者尿液中的NAG减少、受试者尿液中的NGAL减少、受试者尿液中的KIM-1减少、受试者尿液中的IL-18减少、受试者尿液中的MCP1减少、受试者尿液中的CTGF减少、受试者尿液中的胶原蛋白IV片段减少、受试者尿液中的胶原蛋白III片段减少、受试者尿液中的足细胞蛋白水平降低(其中，所述足细胞蛋白选自肾病蛋白和足突蛋白)、受试者血液中的胱抑素C蛋白减少、受试者血液中的β-微量蛋白(BTP)减少以及受试者血液中的2-微球蛋白(B2M)减少。