KR20220119129A - Leaper 기술에 기반한 mps ih 치료 방법 및 조성물 - Google Patents

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넝인 류
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에디진 테라퓨틱스 (베이징) 인크.
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Abstract

본 출원은 생체 내에서 LEAPER에 의해 아데노신-이노신 RNA 편집(A-to-I RNA 편집)을 안전하고 효과적으로 수행하는 단계를 포함하는 LEAPER에 기반한 RNA의 표적 편집 방법에 관한 것으로, 이에 의해 병원성 돌연변이 부위가 정확하게 복구될 수 있어서, MPS IH와 같은 G>A 돌연변이에 의해 야기된 모든 질환이 치료될 수 있다.

Description

LEAPER 기술에 기반한 MPS IH 치료 방법 및 조성물
본 출원은 유전자 편집 치료 분야에 관한 것으로, 구체적으로 MPS IH와 같은 G>A 돌연변이로 인한 질환을 치료하기 위해 생체 내에서 LEAPER에 의해 부위 지정 A-to-I RNA 편집을 행하는 단계를 포함하는, LEAPER(RNA에 대한 프로그래머블 편집을 위한 내인성 ADAR의 활용)에 기반한 RNA의 표적 편집에 의한 MPS IH 치료 방법에 관한 것이다.
뮤코다당질축적증 IH(MPS IH) 또는 글리코사미노글리칸 장애 IH로도 알려진 헐러 증후군은 MPSI의 세 가지 하위 유형, 즉 IH, IH/S 및 IS 중 가장 중증이다. 이 질환을 가진 환자에 있어서 α-L-이두로니다아제(IDUA)의 결핍으로 인해 발생하는 장애를 초래하는 치명적인 유전성 대사 질환이며, 또한 상염색체 열성(AR) 장애이다. 헐러 증후군의 근본적인 기전은 4번 염색체의 4p16.3에 위치한 IDUA 단백질을 인코딩하는 IDUA 유전자의 돌연변이이다. 지금까지, 200개를 초과하는 병원성 IDUA 돌연변이가 알려져 있으며, 가장 흔한 유형은 cDNA 1205 부위의 G-to-A 돌연변이이다. 이 돌연변이로 인해, 원래의 트립토판은 종결코돈으로 변환되므로써, 번역에 의해 얻은 단백질은 이 부위 다음의 모든 아미노산(NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter))이 결핍되어 IDUA 효소 활성을 상실한다. 이 돌연변이 유형은 전체 발병률의 63%를 유발할 수 있다(Worldwide distribution of common IDUA pathogenic variants, Poletto, Edina(2018). Clinical Genetics. 94. 10.1111/cge.13224.). α-L-이두로니다아제는 세포의 리소좀에서 글리코사미노글리칸(GAG)의 분해를 담당한다. 증상은 헐러 증후군을 가진 환자마다 다르며, 출생 시에는 나타나지 않을 수 있다. 생후 3∼6개월에 시작되는 가장 초기의 증상은 얼굴 특징부의 두꺼워짐, 툭 튀어나온 전두골, 골격 이상, 성장 멈춤, 언어 능력 제한 등의 다른 증상이 나타나며, 보통 10세에 사망한다.
헐러 증후군에 대한 치료법은 없다. 현재 승인된 두 가지 치료법은 효소 보충 요법(ERT)과 조혈모세포 이식(HSCT)이다. ERT는 간 크기 감소, 호흡 기능 개선, 및 환자 이동성의 전반적인 개선을 포함한 내장 표현형의 측면에서 양호한 효과를 보였다. 단점은 이것은 중추신경계에 도달할 수 없으므로, 인지 장애를 예방할 수 없다. 성공적인 HSCT는 신경학적 증상을 포함한 대부분의 임상 증상을 예방할 수 있다. 그러나, 이것은 임상증상이 나타나기 전에(생후 8개월 이전이 바람직함) 치료를 위해 적용되어야 하며, 사망률이 높기 때문에 중증 질환을 가진 환자에게만 적용 가능하다(헐러 증후군에 대한 치료법으로서의 효소 보충과 조혈모세포 이식의 조합. Tolar, J(2008). Bone marrow transplantation. 41. 531-5. 10.1038/sj.bmt.1705934).
현재, 헐러 증후군 치료를 위한 유전자 편집 기술의 원리는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)와 아데노 연관 바이러스(AAV)를 이용하여, 정상 IDUA 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열을 간 세포의 게놈에 삽입하는 것이지만, 이 방법은 여전히 헐러 증후군의 뇌 및 골격계 증상을 제거할 수 없으며, 또한 DNA 편집에 의해 초래된 표적이탈(off-target)은 높은 우려 사항이다.
이론적으로, 최근에 빠르게 발전하고 있는 CRISPR(규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복구조, Clustered regular interspaced short palindromic repeats)도 헐러 증후군 치료에 사용할 수 있다. 많은 연구자와 생명공학회사도 이 기술을 진료에 적용하기 위해 전념하고 있다. 예를 들면, 2019년 9월에는 AIDS와 백혈병을 치료하기 위해 CRISPR에 의해 줄기세포를 편집하고 이를 다시 환자에게 주입한 임상 시험의 결과가 처음 보고되었고, 이는 유전자 치료에 CRISPR을 적용하는 데 크게 기여했다. CRISPR은 응용 잠재성이 크지만, 연구 단계부터 임상 치료까지 적용하기 어렵게 하는 다수의 문제점도 갖고 있다. 문제 중 하나는 CRISPR에 사용되는 핵심 효소인 Cas9이다. CRISPR 기반 DNA 편집은 외인성으로 발현된 Cas9 또는 유사한 기능을 가진 다른 뉴클레아제에 의존하여, 여러 문제를 야기한다. 첫째로, 외인성으로 발현되는 뉴클레아제는 일반적으로 분자량이 커서 바이러스 벡터를 통해 신체로 전달하는 효율이 크게 감소한다. 둘째로, 뉴클레아제의 외인성 발현은 뉴클레아제 표적이탈을 가질 가능성을 가질 수 있게 하여, 적용 시 잠재적으로 암을 유발할 것이다. 마지막으로, 외인성으로 발현된 뉴클레아제는 인간 또는 포유류에서는 발견되지 않지만, 박테리아에서 발견되어, 환자에게서 면역 반응을 유도할 수 있으며, 이는 한편으로는 환자에게 데미지를 줄 수 있고, 또한 다른 한편으로는 외인성으로 발현된 뉴클레아제의 중화를 야기하므로, 적절한 활성을 잃거나 추가 치료 개입을 방해할 수 있다.
2017년에 장 펑(Feng Zhang)의 그룹은 REPAIR(RNA Editing for Programmable A to I Replacement)(CRISPR-Cas13을 사용한 RNA 편집, Cox et al., 2017)이라고 칭해지는 RNA 편집 기술을 보고했다. 또한, 이 기술은 외인성으로 발현된 Cas13-ADAR 융합 단백질과 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 표적화된 A-to-I RNA 편집을 달성할 수 있다. 그러나, 이 기술은 CRISPR과 마찬가지로, 여전히 외인성 단백질의 발현에 의존하고 있어, 외인성 단백질의 발현에 의해 야기된 문제를 해결할 수 없다.
2019년 1월에, 스태포스트 토르스텐(Thorsten Stafforst)의 그룹은 RESTORE(올리고뉴클레오티드 매개 RNA 편집을 위한 특정 트랜스에 대한 내인성 ADAR 모집, Merkle et al., 2019)라고 칭해지는 핵산 편집 기술을 보고했다. 이 기술은 외인성 단백질에 의존하지 않는다. 그러나, 한편으로 RESTORE는 자가면역의 발달과 중증도를 결정하는 주요 요인인 IFN-γ의 존재시에만 높은 편집 효율을 달성할 수 있으며(Interferon-γ and systemic autoimmunity, Pollard et al., 2013), 따라서 의료 분야에서 이 기술의 적용을 방해한다. 반면에, RESTORE는 또한 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드인 가이드 RNA를 사용하며, 안정성을 확보하기 위해 다수의 화학적 변형으로 인위적으로 도입해야 한다.
2019년에, 특허출원 PCT/CN2019/110782 및 PCT/CN2020/084922는 조작 변형된 RNA를 제공했다. RNA는 표적 전사체에 부분적으로 상보적이어서 표적 RNA의 특정 부위에서 아데노신을 이노신으로 변환하도록, 천연 ADAR1 또는 ADAR2를 모집한다. 이 기술을 "LEAPER(Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)"라고 하며, ADAR 모집을 위한 RNA는 "dRNA" 또는 "arRNA"라고 칭해질 수 있다. dRNA는 표적 RNA에 혼성화하는 상보적 RNA 서열을 포함하고, 표적 RNA에서 표적 아데노신(A)을 탈아미노화하기 위해 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나아제(ADAR)를 모집할 수 있다.
헐러 증후군을 유발하는 IDUA 병원성 유전자의 G-to-A 돌연변이, 특히 가장 높은 비율을 차지하는 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이의 관점에서, 본 출원은 표적 RNA의 돌연변이 부위를 정확하게 편집하기 위한 새로운 기술 솔루션을 제공한다.
구체적으로, 본 출원은 적어도 다음과 같은 기술 솔루션을 제공한다.
1. LEAPER에 기반한 표적 세포에서의 표적 RNA의 표적 편집 방법으로서, 여기서 표적 RNA는 IDUA 유전자 전사체에 G-to-A 돌연변이를 포함하는 RNA이고, 상기 방법은:
표적 RNA를 편집하는데 사용되는 아데노신 데아미나아제-모집 RNA(arRNA)를 포함하는 구축물 또는 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 표적 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 arRNA는 표적 RNA와 혼성화하고, 또한 표적 RNA에서 표적 아데노신(A)을 탈아미노화하기 위해 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나아제(ADAR)를 모집할 수 있는 상보적 RNA 서열을 포함하는 단계를 포함하는 방법.
2. 항목 1에 기재된 방법에 있어서, arRNA는 표적 A와 페어링하는 염기 C, A, U 또는 G를 도입하는 방법.
일부 실시형태에 있어서, arRNA는 표적 A와 페어링하는 염기 C를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 표적 A와 페어링하는 염기 A를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 표적 A와 페어링하는 염기 U를 포함하는 방법.
3. 항목 1 또는 2에 기재된 방법에 있어서, arRNA의 길이는 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt 또는 81-66nt이다. 본 출원은 수치 범위 내의 임의의 자연수를 개시하고 포함하는 방법.
4. 항목 3에 기재된 방법에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 45-5nt, 40-5nt, 35-10nt, 25-15nt 또는 24-11nt이다. 본 출원은 수치 범위 내의 임의의 자연수를 개시하고 포함하는 방법.
5. 항목 3 또는 4에 기재된 방법에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt이다. 본 출원은 수치 범위 내의 임의의 자연수를 개시하고 포함하는 방법.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, 표적 세포는 인간 세포인 방법.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, 표적 RNA는 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 방법.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, arRNA는 하기 서열: 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 30, 서열번호 31, 및 서열번호 34 중 어느 하나를 포함하는 방법.
9. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, arRNA는 하기 서열: 서열번호 44 및 서열번호 52 중 어느 하나를 포함하는 방법.
10. 항목 1 내지 항목 9 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, arRNA는 화학적으로 변형되는 방법.
11. 항목 10에 기재된 방법에 있어서, 화학적 변형은 2-O'-메틸화(2'-OMe) 또는 티오포스페이트 변형을 포함하는 방법.
12. 항목 11에 기재된 방법에 있어서, 화학적 변형은:
arRNA 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드 각각에 대한 2'-OMe 변형;
처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합 연결;
arRNA 서열의 모든 염기 U에 대한 2'-OMe 변형;
표적으로 하는 염기에 최인접한 3' 염기인 염기 A에 대한 2'-OMe 변형;
표적으로 하는 염기에 최인접한 5' 염기인 염기 C에 대한 2'-OMe 변형;
표적으로 하는 염기와 그것의 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기 사이의 티오포스페이트 결합 연결;
처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드 각각에 대한 2'-OMe 변형; 및
처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합 연결로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 방법.
일부 특정 실시형태에 있어서, 화학적 변형은:
arRNA 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 개별적으로 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합을 통해 연결되고, 한편 arRNA 서열의 염기 U가 2'-OM 변형되는 것을 지칭하는 CM1;
arRNA 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 개별적으로 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합을 통해 연결되고, 한편 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기가 2'-OMe 변형된 염기 A인 것을 지칭하는 CM2;
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 개별적으로 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합을 통해 연결되고, 한편 표적으로 하는 염기의 5' 최인접 염기가 2'-OMe 변형된 염기 C인 것을 지칭하는 CM3;
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 개별적으로 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합을 통해 연결되고, 한편 표적으로 하는 염기는 티오포스페이트 결합을 통해 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기에 각각 연결되는 것을 지칭하는 CM4; 및
서열의 처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드가 개별적으로 2'-OMe 변형되고, 또한 처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합을 통해 연결되는 것을 지칭하는 CM6로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 하나 이상에서 선틱되는 방법.
13. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, arRNA를 인코딩하기 위한 구축물은 선형 핵산쇄, 바이러스 벡터 또는 플라스미드인 방법.
14. 항목 13에 기재된 방법에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 발현 벡터인 방법.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, 전달 방법은 일렉트로트랜스펙션(electrotransfecton), 리포펙션(lipofection), 또는 지질 나노입자(LNP) 전달 또는 감염인 방법.
16. 항목 15에 기재된 방법에 있어서, 표적 RNA의 편집에 사용되는 아데노신 데아미나아제-모집 RNA(arRNA)를 포함하는 구축물 또는 arRNA를 인코딩하는 구축물은 LNP를 통해 표적 세포에 전달되는 방법.
17. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, arRNA의 전달 농도가 2.5nM, 5nM, 10nM, 15nM 또는 20nM 이상인 방법.
상기 실시형태에 있어서, 표적 세포는 간 세포 또는 섬유아세포를 포함한다.
18. LEAPER에 기반한 표적 세포에서의 표적 RNA의 표적 편집에 사용되는 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열로서, 여기서 arRNA는 하기 서열: 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 44, 및 서열번호 52 중 어느 하나를 포함하거나 또는 구성되는 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열.
19. 항목 18에 기재된 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 또는 지질 나노입자.
20. 항목 18에 기재된 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열을 포함하거나, 또는 항목 19에 기재된 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 또는 지질 나노입자를 포함하는 조성물, 제제, 키트 또는 생물학적 생성물.
21. 항목 1 내지 17 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 개체의 표적 세포에서 MPS IH와 연관된 G-to-A 돌연변이를 교정하는 단계를 포함하는,\ 개체에서 MPS IH를 치료하는 방법.
22. 항목 20에 기재된 방법에 있어서, 돌연변이는 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이인 방법.
23. 항목 20 또는 21에 기재된 방법에 있어서, arRNA는 ≥21 마다, ≥17 마다, ≥14일 마다 또는 ≥10 마다의 빈도로 투여되는 방법.
일부 실시형태에 있어서, 본 출원은 또한 MPS IH를 치료하기 위한 약제의 제조에서 하기 서열: 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 9, 서열번호 : 13, 서열번호 17, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 44, 및 서열번호 52 중 어느 하나의 사용에 관한 것이다.
본 출원의 기술 솔루션은 생체 내에서 표적 세포(예를 들면 간 세포 및 섬유아세포)에서의 A-to-I RNA 편집을 안전하고 효과적으로 수행하기 위해 사용될 수 있음으로써, NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이와 같은 병원성 돌연변이 부위를 정확하게 복구하고, 또한 MSP IH 치료의 목적을 달성하기 위해 생체 내 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 정상 발현을 회복시킬 수 있다.
도 1은 GM06214 세포의 IDUA 유전자형의 검출을 도시한다.
도 2는 세포 일렉트로트랜스펙션에 대한 시험을 도시한다.
도 3a는 IDUA pre-mRNA 및 mRNA에 특이적인 arRNA의 설계 및 편집 후 세포 기능의 검출을 도시하고; 도 3b는 IDUA pre-mRNA 및 mRNA에 특이적인 arRNA의 설계 및 세포 편집 효율의 검출을 도시한다.
도 4a는 IDUA-리포터 세포주의 설계를 도시하고; 도 4b는 293T-IDUA-리포터에서 상이한 길이(대칭적으로 절단)를 갖는 arRNA의 편집 효율의 검출을 도시한다.
도 5a 및 도 5b는 상이한 시점에서 상이한 길이(대칭적으로 절단됨)를 갖는 arRNA로 트랜스펙트된 GM06214 세포에서의 효소 활성 및 편집 효율의 검출을 도시한다.
도 6은 리포펙타민 RNAiMAX에 의해 arRNA(대칭으로 절단, 3'-말단으로부터 절단, 5'-말단으로부터 절단)로 트랜스펙트되는 GM06214 세포에서의 IDUA 효소 활성 및 편집 효율의 검출을 도시한다.
도 7a는 인간 IDUA 돌연변이 부위를 표적으로 하는 arRNA로 트랜스펙트되는 GM06214 세포에서의 효소 활성의 검출에 의한 최적의 길이의 선택을 도시하고, 여기서 arRNA의 길이는 바람직하게는 55nt-c-25nt∼55nt-c-10nt이고, 즉 3'-말단의 염기가 하나씩 감소되고; 도 7b는 마우스 IDUA 돌연변이 부위를 표적으로 하는 arRNA로 트랜스펙트되는 MSPI 마우스 MEF(MSPI 마우스 배아 섬유아세포) 세포에서의 효소 활성의 검출에 의한 최적 길이의 선택을 도시하며, 여기서 arRNA의 길이는 55nt-c-55nt∼55nt-c-10nt이고, 즉 3'-말단의 염기가 5 염기마다 감소한다.
도 8a는 3'-말단의 2개의 바람직한 길이의 조건에서 5'-말단의 길이를 점진적으로 절단함으로써 최적의 길이를 갖는 arRNA의 선택을 도시하고; 도 8b는 3'-말단의 길이가 14nt로 고정되고, 5'-말단의 길이가 염기 마다 점진적으로 절단되는 arRNA가 효소 활성에 미치는 영향을 도시하고, 여기서 최적의 길이를 갖는 arRNA는 도 8a 및 도 8b에 따라 선별된다.
도 9는 2개의 바람직한 길이를 갖는 arRNA의 편집 효율(효소 활성에 반영됨)에 대한 상이한 화학적 변형의 영향의 비교를 도시한다.
도 10a∼도 10d는 인간 및 마우스 IDUA mRNA를 표적으로 하는 arRNA의 편집 효율과, 바람직한 길이, 바람직한 화학적 변형 조합 및 상이한 농도의 arRNA의 조건하에서 편집 후에 기능성 IDUA 단백질을 생성하는 능력을 도시한다.
도 11a∼도 11d는 바람직한 길이 및 바람직한 화학적 변형 조합의 조건하에서 1회 트랜스펙션 후 상이한 시점에서의 인간 또는 마우스 세포에서의 IDUA 효소 활성을 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 상이한 방법으로 arRNA가 1차 인간 및 마우스 간 세포에 전달된 후 부위를 표적으로 하는 arRNA의 편집 효율을 도시한다.
도 13은 LNP를 통한 1차 세포 배양에 의해 얻은 인간 및 마우스 간 세포에 arRNA가 전달된 후 IDUA를 표적으로 하는 arRNA의 편집 효율을 도시한다.
도 14는 상이한 농도로 꼬리 정맥 주사에 의해 마우스에, LNP로 제조된 마우스 IDUA 돌연변이를 표적으로 하는 선택된 arRNA(서열번호 52)를 투여한 후 24시간 후에 마우스 간 세포에서의 IDUA 편집 효율을 나타낸다.
정의
RNA 편집은 진핵 세포에서 일어나는 자연적인 과정이다. RNA 편집은 단백질 번역 전 및 DNA 전사 후에 발생하는 RNA에서의 염기 A(아데노신)가 염기 I(이노신)으로의 변환을 포함하고, 번역 중 이노신은 G로 표시되고, A-to-I RNA 편집은 전사체를 다양화한다. RNA 분자를 정확하게 변환함으로써 RNA의 총 수는 몇 배로 증가할 것이다. 이러한 편집은 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나아제(ADAR)에 의해 촉매되므로, 부위 지정 RNA 편집이라고 칭해진다. 편집은 인트론 및 엑손 서열을 포함하는 코딩 영역에서 일어날 수 있고, 또는 비코딩 영역에서 일어날 수 있으며, 또한 코딩 영역에서의 편집은 단백질 코딩 서열을 재정의할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "LEAPER"는 RNA 편집에 사용되는 내인성 ADAR을 모집하기 위해 조작된 RNA를 사용하는 기술이며, 이는 WO2020074001A1에 개시되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 조작된 RNA는 표적 RNA에서 표적 아데노신을 탈아미노화하기 위해 ADAR 또는 ADAR 도메인을 포함하는 일부 화합물을 모집할 수 있는 아데노신 데아미나아제-모집 RNA(arRNA)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "RNA에 작용하는 아데노신 데아미나아제(ADAR)"라는 용어는 진핵생물(인간과 같은 포유동물 포함)의 조직에서 널리 발현되는 아데노신 데아미나아제의 부류를 지칭하며, 이는 RNA 분자에서 아데노신(A)에서 이노신(A)으로의 변환을 촉매할 수 있다. 그러나, 진핵생물에서의 단백질 합성과정에서 I는 보통 G로 번역된다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산의 "상보성"은 통상적인 왓슨-크릭 염기 페어링(Watson-Crick base pairing)에 의해 다른 핵산과 수소 결합을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성의 백분율은 다른 핵산 분자의 잔기와 수소 결합을 형성(즉, 왓슨-크릭 염기 페어링)할 수 있는 핵산 분자의 잔기의 백분율을 지칭한다. 예를 들면, 핵산 분자의 10개의 잔기 중 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 잔기가 다른 핵산 분자의 잔기와 수소 결합을 형성할 수 있으며, 이는 2개의 핵산 분자의 상보성의 백분율이 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%인 것을 의미한다. "완전한 상보성"은 뉴클레오티드 서열의 모든 연속 잔기가 다른 뉴클레오티드 서열의 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은, 약 40, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250개 이상의 뉴클레오티드 영역에서, 상보성의 백분율이 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%인 것을 지칭하거나, 또는 엄격한 조건하에서 2개의 핵산이 혼성화하는 것을 지칭한다. 단일 염기 또는 단일 뉴클레오티드의 경우, 왓슨-크릭 염기 페어링 원리에서 A와 T 또는 U의 페어링 및 C와 G 또는 I의 페어링을 상보성 또는 매칭이라고 칭해질 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 그렇지 않으면, 염기의 페어링을 비상보성 또는 비매칭이라고 칭해야 한다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 화합물을 형성하고, 화합물이 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합에 의해 안정화되는 과정을 지칭한다. 또한, 수소 결합은 왓슨-크릭 염기 페어링, 후그스테인 페어링, 또는 기타 서열 특이적 방법에 의해 형성될 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보적 서열"이라고 칭해진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "일렉트로트랜스펙션(electrotransfection)"은 세포가 마이크로초∼밀리초 동안 전기장에 노출되고, 세포막에 구멍 또는 개구가 일시적으로 형성되고, DNA와 같은 거대분자가 세포에 전달되는 전기천공 트랜스펙션을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리포펙션(Lipo)"은 생체 내 또는 시험관내 전달 벡터로서 리포솜을 사용하는 트랜스펙션 기술을 지칭한다. 리포솜은 중성 리포솜과 양이온성 리포솜을 포함한다. 중성 리포솜의 경우, 핵산과 같은 거대분자가 지질막으로 래핑된 다음, 지질막을 통해 세포막으로 전달되고, 또한 양으로 하전된 양이온성 리포솜의 경우, 전달할 거대분자가 미리 양이온성 리포솜에 매립되지 않고, 음으로 하전된 거대분자는 양으로 하전된 리포솜에 자동으로 결합하여, 음으로 하전된 세포막의 표면에 흡착되고, 엔도시토시스에 의해 세포로 전달될 수 있는 거대분자-양이온성 리포솜 화합물을 형성한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지질 나노입자(LNP) 전달"은 지질 나노입자를 통한 핵산 및 단백질과 같은 거대분자의 막관통 전달을 지칭한다. 지질 나노입자는 이온화 지질, 보조 인지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함하는 에탄올상과, 핵산 및 단백질과 같은 거대분자를 포함하는 산성 수상을 포함하는 2개의 상을 혼합함으로써 합성된 입자를 지칭한다. 예를 들면, LNP로 래핑된 RNA는 엔도시토시스에 의해 세포질로 전달될 수 있다.
여기서, NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이는 IDUA 유전자의 No. 000203.4 전사체 상의 1205 부위에서의 G-to-A 돌연변이를 지칭하며, 이는 전사체에 의해 번역된 펩티드쇄의 402 부위 상의 트립토판(Trp)의 코딩 서열이 종결 코돈(Ter)으로 변환할 것이고, 이것에 의해 최종적으로 번역된 펩티드쇄는 402 부위 이후의 모든 아미노산이 결핍되어 IDUA 효소 활성을 상실한다. 이러한 돌연변이는 활성 α-L-이두로니다아제의 결핍으로 이어져서, 세포의 리소좀에서의 글리코사미노글리칸의 분해에 영향을 미치고, 결국에는 기형을 유발하고 환자를 사망에 이르게 한다. 그러나, 본 출원의 기술적 해결책은 IDUA 효소 활성을 회복하기 위해 전사 동안 돌연변이를 역전시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 RNA"는 편집될 아데노신(A)을 포함하는 편집될 표적 RNA를 지칭한다. 표적 RNA는 성숙 mRNA일 수 있거나, 또는 전구체 mRNA일 수 있다. 본 출원에 있어서, 표적 RNA는 전구체 mRNA인 것이 보다 바람직하다. 본원에서, "표적 RNA"를 포함하는 세포를 표적 세포라고 칭한다. 편집할 아데노신을 "표적 염기", "표적 아데노신" 또는 "표적 A"라고 칭한다. 본 출원에 있어서, "표적 염기", "표적 아데노신" 및 "표적 A"는 호환적으로 사용될 수 있다. 표적 RNA의 5'-말단에서 표적 아데노신에 인접한 염기를 "5' 인접 염기"라고 칭하고; 표적 RNA의 3'-말단에서 표적 아데노신에 인접한 염기를 "3' 인접 염기"라고 칭하고; 및 표적 염기, 3' 인접 염기 및 5' 인접 염기로 구성된 염기 삼중항을 본원에서 "표적 염기 삼중항"이라고 칭한다. arRNA가 표적 RNA와 혼성화할 때, arRNA 상의 표적 염기에 상응하는 염기를 "표적으로 하는 염기"라고 칭하며; arRNA의 5'-말단에서 표적으로 하는 염기에 인접한 염기를 "5' 최인접 염기"라고 칭하고; arRNA의 3'-말단에서 표적으로 하는 염기에 인접한 염기를 "3' 최인접 염기"라고 칭하고; 또한 표적으로 하는 염기, 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기로 구성된 염기 삼중항을 본원에서는 "타겟으로 하는 염기 삼중항"이라고 칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "구축물"은 선형 핵산 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있는 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 벡터를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 분자일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 전사, 번역 또는 발현을 거치지 않고 작용할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열이고, 뉴클레오티드 서열을 전사함으로써 생성되는 RNA 분자의 형태로 작용한다. 일부 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 RNA 서열이고, 뉴클레오티드 서열을 번역함으로써 생성되는 폴리펩티드 또는 단백질의 형태로 작용한다. 일부 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열이고, 뉴클레오티드 서열을 전사 및 번역함으로써 생성된 단백질의 형태로 작용한다. 구축물은 바이러스, 지질 나노입자 또는 엑소좀의 형태로 제조된 다음, 표적 세포에 전달될 수 있고, 또는 전기형질전환(electrotransformation), 미세주입 또는 화학적 변환에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전달"은 소정 방식에 의해 세포막에의 핵산 및 단백질과 같은 생체거대분자의 도입을 지칭한다. "전달" 방법에는 일렉트로트랜스펙션, 리포펙션, 지질 나노입자 전달, 바이러스 전달 및 엑소좀 전달이 포함된다.
본 출원에서 사용된 용어 "변형"은 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 핵산 또는 단백질의 하나 이상의 특성 또는 기능이 변경되는 것을 지칭한다. 예를 들면, 핵산 또는 단백질의 구성 또는 구조는 유전자 조작에 의해 변경된다.
달리 정의하지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
RNA 편집 방법
본 출원은 표적 세포에서의 IDUA 유전자의 G-to-A 돌연변이를 포함하는 LEAPER에 기반한 표적 RNA의 표적 편집 방법을 제공하고, 이는 표적 RNA를 편집하는데 사용되는 아데노신 데아미나아제-모집 RNA(arRNA)를 포함하는 구축물 또는 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물이 표적 세포에 전달되는 단계를 포함하고, 여기서 arRNA는 표적 RNA와 혼성화하는 상보적 RNA 서열을 포함하고, 또한 표적 RNA에서 표적 아데노신(A)을 탈아미노화하도록 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나아제(ADAR)를 모집할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 RNA는 전구체 mRNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 RNA는 성숙 mRNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 RNA는 IDUA 유전자에 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 전사된 RNA이다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA는 표적 A와 페어링하는 염기 C, A, U 또는 G를 포함한다. 표적 A와 페어링하는 염기는 우선순위에 따라 C ＞ A ＞ U ＞ G로 분류된다. 즉, 동일한 길이의 arRNA, 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 동일한 거리, 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 동일한 거리, 및 표적으로 하는 염기를 제외하고는 완전히 동일한 arRNA 서열의 조건 하에서, 표적으로 하는 염기는 우선순위에 따라 C ＞ A ＞ U ＞ G로 분류된다. 표적으로 하는 염기가 C인 경우, arRNA는 Xnt-c-Ynt로 표현될 수 있고, 여기서 X는 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리가 Xnt인 것을 나타내고, Y는 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리가 Ynt인 것을 나타내고, X와 Y는 임의의 자연수일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 간 세포 또는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 인간 또는 마우스 세포이다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt 또는 81-66nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 45-5nt, 40-5nt, 35-10nt, 25-15nt 또는 24-11nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt이다. 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기에서 3'-말단의 마지막 염기까지의 염기의 수를 나타내고; 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 표적으로 하는 염기의 5' 최인접 염기에서 5'-말단의 마지막 염기까지의 염기의 수를 나타낸다.
일부 실시형태에 있어서, 표적 세포가 인간 세포이고, 표적 RNA가 IDUA 유전자에 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 전사된 RNA일 경우, arRNA의 전체 길이는 66nt 이상, 예를 들면 약 121-66nt, 111-66nt, 101-66nt, 91-66nt, 및 81-66nt이고, 즉 arRNA의 전체 길이는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 67nt, 68nt, 69nt, 70nt, 71nt, 72nt, 73nt, 74nt, 75nt, 76nt, 77nt, 78nt, 79nt, 80nt, 81nt, 82nt, 83nt, 84nt, 85nt, 86nt, 87nt, 88nt, 89nt, 90nt, 91nt, 95nt, 100nt, 110nt, 115nt 및 120nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 45-5nt, 40-5nt, 35-10nt, 25-15nt 또는 24-11nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 상기 거리 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 12nt, 13nt, 14nt, 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt 및 23nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 상기 거리 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 46nt, 47nt, 48nt, 49nt, 50nt, 51nt, 52nt, 53nt, 및 54nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 하기 서열: 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 30, 서열번호 31, 및 서열번호 34 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 마우스 세포(예를 들면, W392X 마우스 세포)이고, 표적 RNA는 IDUA 유전자에서 인간 W402X 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함하는 전사된 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 W392X 마우스 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 약 121-53nt, 111-61nt, 101-61nt, 91-61nt, 81-61nt, 111-66nt 또는 105-66nt이고, 즉 arRNA의 전체 길이는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 67nt, 68nt, 69nt, 70nt, 71nt, 72nt, 73nt, 74nt, 75nt, 76nt, 77nt, 78nt, 79nt, 80nt, 81nt, 82nt, 83nt, 84nt, 85nt, 86nt, 87nt, 88nt, 89nt, 90nt, 91nt, 95nt, 100nt, 110nt, 115nt 및 120nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 55-10nt 또는 50-10nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 11nt, 12nt, 13nt, 14nt, 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt, 23nt, 24nt, 25nt, 26nt, 27nt, 28nt, 29nt, 30nt, 31nt, 32nt, 33nt, 34nt, 35nt, 35nt, 37nt, 38nt, 39nt, 41nt, 42nt, 43nt, 44nt, 45nt, 46nt, 47nt, 48nt, 49nt 및 50nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 33nt, 36nt, 47nt, 46nt, 47nt, 48nt, 49nt, 50nt, 51nt, 52nt, 53nt, 54nt, 60nt, 65nt 및 75nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 하기 서열: 서열번호 44 및 서열번호 52 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 2-O'-메틸화 및/또는 티오포스페이트 변형을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 화학적 변형은:
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 각각 2'-OMe 변형되고,
처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 각각 티오포스페이트 결합을 통해 연결되고,
서열의 모든 염기 U는 2'-OMe 변형되고;
표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기는 2'-OMe 변형된 A이고,
표적으로 하는 염기의 5' 최인접 염기는 2'-OMe 변형된 C이고,
표적으로 하는 염기는 티오포스페이트 결합을 통해 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기에 각각 연결되고,
처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드는 각각 2'-OMe 변형되고, 또한
처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드는 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결되는 것 중 임의의 하나 이상에서 선택된다.
본원에 기재된 바와 같이, arRNA를 인코딩하기 위한 구축물은 arRNA의 코딩 서열을 포함하는 구축물이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물이 표적 세포에 전달된 후, arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 전사함으로써 생성된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA를 인코딩하기 위한 구축물은 선형 핵산쇄, 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포에 전달된 후, arRNA를 인코딩하는 구축물은 전사에 의해 arRNA를 연속적으로 생성하도록, 상동 재조합 또는 비상동 재조합에 의해 arRNA의 코딩 서열을 표적 세포의 게놈에 삽입한다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포에 전달된 후, arRNA를 인코딩하기 위한 구축물은 arRNA의 코딩 서열이 표적 세포에 유리 핵산의 일부로서 존재할 수 있어서, arRNA의 코딩 서열이 소정 기간 내에 전사에 의해 arRNA를 생성할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 전달 방법은 일렉트로트랜스펙션, 리포펙션, 또는 지질 나노입자(LNP) 전달 또는 감염이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포가 간 세포인 경우, 전달 방법은 LNP 전달이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포가 섬유아세포인 경우, 전달 방법은 리포펙션이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA의 전달 농도는 2.5-5nM 이상, 바람직하게는 10-20nM 이상, 예를 들면 15nM 이상이다. 본 출원에 있어서, 전달 농도는 arRNA 구축물이 표적 세포에 전달된 후 arRNA의 1 부피 단위 및 표적 세포가 위치하는 전달 시스템의 1 부피 단위 내의 arRNA 함량을 지칭한다. 전달 시스템은 arRNA 또는 그의 구축물, 표적 세포, 및 arRNA 및 표적 세포 주위의 유체 매트릭스를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 유체 매트릭스는 세포질의 삼투압과 동일한 삼투압을 갖고, 또한 세포의 안정적인 생존 조건을 유지할 수 있는 세포 배양 배지, PBS 또는 기타 용액일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 전달 시스템은 전달을 촉진하기 위한 시약을 추가로 포함한다.
arRNA
또한, 본 출원은 표적 RNA의 표적 A를 이노신(I)으로 탈아미노화하기 위해,표적 세포에서 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 LEAPER에 기반한 전사된 RNA와 같은 표적 RNA의 표적 편집에 사용될 수 있는 arRNA를 제공한다. 후속하는 표적 세포의 번역 과정에 있어서, G>A 돌연변이가 G로 회복될 수 있고, 또한 arRNA에 의해 편집된 후 표적 RNA가 교정 단백질로 번역될 수 있도록, I는 G로 식별될 것이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 RNA는 전구체 mRNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 RNA는 성숙 mRNA이다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA는 표적 A와 페어링하는 염기(표적으로 하는 염기) C, A, U 또는 G를 갖고, 염기는 편집 효율에 의해 C ＞ A ＞ U ＞ G로 분류된다. 일부 실시형태에 있어서, 표적으로 하는 염기 이외에, arRNA에서의 다른 염기는 상보적인 방식으로 표적 RNA와 페어링될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 표적으로 하는 염기를 제외하고, arRNA에서의 하나 이상의 염기는 표적 RNA와 미스페어링(mispairing)된다.
일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 간 세포 또는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 세포는 인간 또는 마우스 세포(예를 들면, W392X 마우스 세포)이다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt 또는 81-66nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 45-5nt, 40-5nt, 35-10nt, 25-15nt 또는 24-11nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt이다. 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기에서 3'-말단의 마지막 염기까지의 염기의 수를 지칭하고; 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 표적으로 하는 염기의 5' 최인접 염기에서 5'-말단의 마지막 염기까지의 염기의 수를 지칭한다.
일부 실시형태에 있어서, 표적 세포가 인간 세포이고, 또한 표적 RNA가 IDUA 유전자에 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 전사된 RNA인 경우, arRNA의 전체 길이는 66nt 이상, 예를 들면 약 121-66nt, 111-66nt, 101-66nt, 91-66nt, 및 81-66nt이고, 즉 arRNA의 전체 길이는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 67nt, 68nt, 69nt, 70nt, 71nt, 72nt, 73nt, 74nt, 75nt, 76nt, 77nt, 78nt, 79nt, 80nt, 81nt, 82nt, 83nt, 84nt, 85nt, 86nt, 87nt, 88nt, 89nt, 90nt, 91nt, 95nt, 100nt, 110nt, 115nt, 및 120nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 45-5nt, 40-5nt, 35-10nt, 25-15nt 또는 24-11nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 상기 거리 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 12nt, 13nt, 14nt, 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt 및 23nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 상기 거리 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 46nt, 47nt, 48nt, 49nt, 50nt, 51nt, 52nt, 53nt, 및 54nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 하기 서열: 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 30, 서열번호 31, 및 서열번호 34 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 표적 세포가 마우스 세포(예를 들면 W392X 마우스 세포)이고, 또한 표적 RNA가 IDUA 유전자에서 인간 W402X 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함하는 전사된 RNA인 경우, arRNA의 길이는 약 121-53nt, 111-61nt, 101-61nt, 91-61nt, 81-61nt, 111-66nt 또는 105-66nt이고, 즉 arRNA의 전체 길이는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 67nt, 68nt, 69nt, 70nt, 71nt, 72nt, 73nt, 74nt, 75nt, 76nt, 77nt, 78nt, 79nt, 80nt, 81nt, 82nt, 83nt, 84nt, 85nt, 86nt, 87nt, 88nt, 89nt, 90nt, 91nt, 95nt, 100nt, 110nt, 115nt 및 120nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 55-10nt 또는 50-10nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 11nt, 12nt, 13nt, 14nt, 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt, 23nt, 24nt, 25nt, 26nt, 27nt, 28nt, 29nt, 30nt, 31nt, 32nt, 33nt, 34nt, 35nt, 35nt, 37nt, 38nt, 39nt, 40nt, 41nt, 42nt, 43nt, 44nt, 45nt, 46nt, 47nt, 48nt, 49nt 및 50nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt이고, 즉 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 상기 길이 범위에서 선택된 임의의 자연수, 예를 들면 33nt, 36nt, 47nt, 46nt, 47nt, 48nt, 49nt, 50nt, 51nt, 52nt, 53nt, 54nt, 60nt, 65nt 및 75nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 하기 서열: 서열번호 44 및 서열번호 52 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA는 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 전사 및 발현함으로써 생성된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 시험관 내에서 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 전사 및 발현시키고 정제함으로써 얻어진다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 생체 내에서 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 직접 발현함으로써 얻어지고, 편집에 사용된다. 일부 실시형태에 있어서, 구축물은 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 선형 핵산이다. 일부 실시형태에 있어서, 바이러스는 AAV 또는 렌티바이러스이다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA는 화학적으로 합성된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 2-O'-메틸화 및/또는 티오포스페이트 변형을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 화학적 변형은:
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 각각 2'-OMe 변형되고;
처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 각각 티오포스페이트 결합을 통해 연결되고;
서열의 모든 염기 U는 2'-OMe 변형되고;
표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기는 2'-OMe 변형된 A이고;
표적 염기의 5' 최인접 염기는 2'-OMe 변형된 C이고;
표적으로 하는 염기는 티오포스페이트 결합을 통해 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기에 각각 연결되고;
처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드는 각각 2'-OMe 변형되고; 또한
처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드는 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결되는 것 중 어느 하나 이상에서 선택된다.
일부 실시형태에 있어서, 화학적 변형은:
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 각각 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결되고, 한편 서열의 모든 염기 U가 2'-OMe 변형되는 것을 지칭하는 CM1;
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 각각 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결되고, 한편 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기는 2'-OMe 변형된 A인 것을 지칭하는 CM2;
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 각각 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결되고, 한편 표적으로 하는 염기의 5' 최인접 염기가 2'-OMe 변형된 염기 C인 것을 지칭하는 CM3;
서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 각각 2'-OMe 변형되고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결되고, 한편 표적으로 하는 염기가 티오포스페이트 결합을 통해 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기에 각각 연결되는 것을 지칭하는 CM4; 및
서열의 처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드가 각각 2'-OMe 변형되고, 또한 처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결되는 것을 지칭하는 CM6 중 임의의 하나 이상에서 선택된다.
구축물
또한, 본 출원은 상기 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 구축물은 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 선형 핵산이다. 일부 실시형태에 있어서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터 또는 렌티바이러스 발현 벡터이다.
본 출원은 상기 구축물을 포함하는 바이러스, 지질 나노입자, 리포솜, 엑소좀 또는 세포를 추가로 제공한다.
조제품 및 생물학적 생성물
또한, 본 출원은 IDUA 유전자의 정상적인 기능을 회복시키기 위해, 상술한 설명에 있어서의 임의의 arRNA 또는 구축물을 포함하고, 또한 표적 세포에서의 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 전사된 표적 RNA의 편집에 사용될 수 있는 조성물, 조제품 또는 생물학적 생성물을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA 또는 구축물은 리포솜 내에 래핑된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA 또는 구축물은 지질 나노입자로 제조된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA 또는 구축물은 바이러스(예를 들면, 아데노 연관 바이러스 또는 렌티바이러스) 전달에 의해 피험체의 신체 내에 도입된다.
일부 실시형태에 있어서, arRNA를 포함하는 조제품은 질환을 치료하기 위해 환자의 신체에 주입될 수 있는 치료제이다. 일부 실시형태에 있어서, 주입 방법은 국소 주사, 국소 관류 또는 정맥내 주입, 또는 국소 관류 또는 국소 주사이다. 일부 실시형태에 있어서, 치료제는 간으로의 동맥 관류와 같은 간으로의 국소 주사에 적용 가능한 형태이다. 일부 실시형태에 있어서, 치료제는 근육내 주사에 적용 가능한 형태이다. 일부 실시형태에 있어서, 치료제는 정맥내 주사에 적용 가능한 형태이다.
키트
또한, 본 출원은 상기 arRNA, arRNA를 인코딩하기 위한 구축물 또는 조제품을 포함하는, 표적 세포에서의 표적 RNA의 편집에 사용되는 키트를 제공한다. 이 키트는 표적 세포에서의 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 전사된 표적 RNA의 편집에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 키트는 상이한 용기에 패키징되는 상기 arRNA 또는 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물, 및 염색 보조제를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 염색 보조제는 지질 용액이다. 예를 들면, 염색 보조제는 Invitrogen에서 구입한 Lipo(리포펙타민 RNAiMAX, 카탈로그 번호 13778150) 또는 동일한 기능성 성분을 포함하는 시약이다.
일부 실시형태에 있어서, 키트는 키트 내의 다양한 성분 및 내용물을 사용자에게 도입하기 위한 설명서 및/또는 키트의 사용 방법을 추가로 포함한다.
치료 방법
본 출원은 상기 방법에 의해 개체의 세포에서 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter)와 같은 IDUA 유전자의 G-to-A 돌연변이를 교정하는 단계를 포함하는, 개체에서 뮤코다당질축적증 IH를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 질병은 헐러 증후군을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 개체가 인간인 경우, arRNA는 ≥21일 마다, ≥17일 마다, ≥14일 마다 또는 ≥10일 마다의 빈도로 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 개체가 마우스인 경우, arRNA는 ≥8일마다의 빈도로 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 치료 방법은 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 사용하고, 구축물은 arRNA의 코딩 서열을 표적 세포에 통합할 수 있고, arRNA는 1회 투여된다.
본 출원에서 제공하는 LEAPER에 기반한 RNA의 표적 편집 방법은 다음과 같은 장점이 있다.
1. 이 방법은 외인성 단백질의 발현에 의존하지 않으므로, 단백질의 큰 분자량으로 인해 바이러스 벡터를 통한 로딩 및 생체 내 전달에서의 어려움을 회피하고, 외인성 단백질의 과발현으로 야기된 표적이탈 효과를 회피하고, 외인성 단백질의 발현으로 야기된 유기체의 면역 반응 및 손상을 회피하고, 또한 유기체에 이미 존재하는 항체를 갖는 이펙터 단백질 또는 편집에 사용되는 외인성 효소의 중화에 의해 야기된 유전자 편집의 실패를 회피한다.
2. 본 출원에서 제공하는 효소 유도 부위 특이적 RNA 편집 방법은 DNA 편집과 다르고, RNA 편집은 가역적이고 제어 가능하다. 아미노산 코돈을 기록함으로써 질환을 치료하고, 단백질과 RNA의 기능을 연구할 수 있다. RNA 편집의 잠재적인 부작용은 되돌릴 수 있으므로, RNA 편집이 더 안전하다.
3. 종래 기술과 비교하여, 상기 방법은 arRNA를 화학적으로 합성할 수 있고, 일렉트로트랜스펙션 또는 리포펙션에 의해, 또는 아데노 연관 바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 벡터를 통해 환자에게 arRNA를 전달할 수 있으며, 전달 방법은 유연하고 변경 가능하며, 편집 효율이 더 높다.
상기에 본 출원의 바람직한 실시형태가 기재되어 있지만, 본 출원은 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 적절한 방식으로 다양한 기술적 특징의 조합을 포함한 많은 단순한 변경이 본 출원의 기술적 사상의 범위 내에서 이루어질 수 있으며, 이들 단순한 변형 및 조합도 본 출원에 개시된 내용으로 간주되고 본 출원의 보호 범위 내에 포함된다.
이하에, 본 출원의 기술적 솔류션에 대해 구체적인 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 기재하지만, 본 출원은 하기 실시예에 제한되지 않는다. 달리 정의되지 않는 한, 이하의 설명에 포함된 시약은 상업적으로 입수가능한 제품이다. 간결성을 위해, 일부 실험은 사용된 파라미터, 단계 및 도구를 명기하지 않고 기재되고, 이들 실험은 잘 알려져 있고 당업자에 의해 재현 가능함을 이해해야 한다. 본원에 사용된 세포(GM06214)는 Coriell(미국)에서 구입한 것이고, 헐러 증후군을 가진 환자의 섬유아세포이다. 편집에 사용되는 arRNA는 Synthego(미국) 또는 Biosyntech(중국 쑤저우)에 의해 합성되고, 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)은 RuiBioTech(중국 베이징)에 의해 행해지고, 차세대 시퀀싱은 Novogene 또는 중국 쌀 연구소의 시퀀싱 플랫폼에 의해 행해진다.
실시예
실시예 1: GM06214 세포의 돌연변이 유전자형의 검출
GM06214 세포(헐러 증후군 환자의 섬유아세포)를 15% 혈청(ScienCell, FM, 카탈로그 번호 2301)을 포함하는 섬유아세포 배양 용액에 넣고, 1% 섬유아세포 성장 보조제(ScienCell, FGS, 카탈로그 번호 2301)를 첨가하고, 세포를 2-3일 동안 37℃에서 5% CO2가 있는 인큐베이터에서 배양했다. 90% 컨플루언스까지 성장한 후, 0.25% 췌장 효소로 세포를 소화시킨 후, 15% 혈청을 포함하는 섬유아세포 배양액으로 소화를 종료했다. 지침에 따라 TianGene®(TIANGEN Biotech(Beijing) Co., Ltd.) DNA 추출 키트(카탈로그 번호 DP304-03)를 사용하여 DNA를 추출했다.
IDUA 유전자의 돌연변이 부위의 상류 및 하류 서열에 대한 프라이머는 NCBI-Primer blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)에서 설계되었다. 서열번호 1 CGCTTCCAGGTCAACAACAC(정방향 프라이머 hIDUA-F1); 서열번호 2 CTCGCGTAGATCAGCACCG(역방향 프라이머 hIDUA-R1). PCR 반응을 수행한 후, PCR 산물을 생어 시퀀싱을 했다. 세포의 돌연변이 유전자형은, 도 1에 도시된 바와 같이, IDUA 게놈의 15704 부위에서 병원성 G-to-A 돌연변이인 것을 확인했다.
실시예 2: GM06214 세포 일렉트로트랜스펙션 조건의 스크리닝
약 90% 컨플루언스까지 성장한 후, GM06214 세포를 소화시키고, 소화가 종료된 후 세포를 카운팅했다. 일렉트로트랜스펙션 동안, 6백만 세포를 400μL의 미리 혼합된 일렉트로트랜스펙션 용액(Lonza, 카탈로그 번호 V4XP-3024)으로 재현탁하고, 20㎍의 GFP 플라스미드(Lonza, 카탈로그 번호 V4XP-3024)를 세포에 첨가하고 균일하게 혼합하고, 20μL의 일렉트로트랜스펙션 시스템을 샘플로서 취하고, 7개의 일렉트로트랜스펙션 조건(도 2 참조)과 1개의 음성 대조군 조건을 포함한 8개의 조건하에서 론자(Lonza) 핵 일렉트로트랜스펙션 기기에서 검출하고, 각 조건하에서 이중 측정을 수행했다. 일렉트로트랜스펙션 후, 세포를 즉시 15% 혈청을 포함하는 2mL의 섬유아세포 배양액(ScienCell, FM, 카탈로그 번호 2301)로 옮기고, 각 조건의 세포를 6웰 플레이트의 2개의 웰에 접종하고, 세포를 37℃의 5% CO2를 갖는 인큐베이터에서 배양했다. 일렉트로트랜스펙션 24시간 후, 각 일렉트로트랜스펙션 조건의 2개의 웰 중 1개의 웰의 세포를 소화시키고, 유세포분석기를 이용하여 GFP 양성 세포의 비율을 검출했다. 일렉트로트랜스펙션 48시간 후, 각 일렉트로트랜스펙션 조건의 2개의 웰 중 다른 웰의 세포를 소화시키고, 유세포분석기를 사용하여 GFP-양성 세포의 비율을 검출했다. 얻어진 최적의 세포 일렉트로트랜스펙션 조건은, 도 2에 도시된 바와 같이, CA-137 군의 일렉트로트랜스펙션 조건이었다.
실시예 3: arRNA로 일렉트로트랜스펙션 후 GM06214 세포에서의 IDUA 효소 활성 및 편집 효율
다음의 arRNA 서열은 IDUA 유전자의 전사 후 pre-mRNA(전구체 mRNA) 및 성숙한 mRNA(성숙 mRNA)의 돌연변이 부위의 상류 및 하류 서열에 대해 설계 및 합성했다: 서열번호 3 GACGCCCACCGUGUGG UUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCCAGCAGCGCCAGCAGCCCCAUGGCCGUGAGCACCGGCUU(pre-55nt-c-55nt); 서열번호 4 GACGCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCC AGAGCUGCUCCUCAUCUGCGGGGCGGGGGGGGGCCGUCGCCGCGUGGGGUCGUUG(m-55nt-c-55nt); 및 서열번호 5 UACCGCUACAGCCACGCUGAUUUCAGCUAUACCUGC CCGGUAUAAAGGGACGUUCACACCGCGAUGUUCUCUGCUGGGGAAUUGCGCGAUAUUCAGGAUUAAAAGAAGUGC (랜덤-111nt). 합성된 arRNA에서 돌연변이 부위에 상당하는 염기가 T에서 C로 변환되어, A-C 미스페어링이 형성되었다. 합성된 arRNA의 길이는 111nt인 것이 바람직하다. 실시예 2에서 얻은 최적의 일렉트로트랜스펙션 조건하에서 세포를 일렉트로트랜스펙션하고, 일렉트로트랜스펙션 48시간 후, 세포를 수집하고 효소 활성 어세이 및 편집 효율 검출을 수행했다.
편집 효율의 검출:
설계 및 합성된 arRNA를 RNase-프리 워터(TransGen, 카탈로그 번호 GI201-01)에 필요한 농도로 용해하여 -80℃에서 보관했다. 약 90% 컨플루언스까지 성장한 후, GM06214 세포를 소화시키고, 소화가 종료된 후 세포를 카운팅했다. 혼합물의 부피가 100uL가 될 때까지 100만 세포에 200pmol의 arRNA를 첨가하고, 세포를 CA-137 조건하에 일렉트로트랜스펙션시켰다. 일렉트로트랜스펙션 48시간 후, 세포를 카운팅하고, 세포 생존력 어세이를 실시했다. 세포를 RNA 효소-프리 원심분리관에 옮기고 원심분리하고, 상층액을 제거하고, QIAGEN RNA 추출 키트(QIAGEN, 카탈로그 번호 74134)를 이용하여 RNA를 추출했다. 작동 매뉴얼에 따라, 버퍼 RLT 플러스 0.35mL에 5×105개의 세포를 균등하게 피펫팅하여 첨가하고, 균일하게 혼합했다(냉동보존 세포의 경우, RNA를 직접 추출하고, PBS로 1회 세척하는 것을 권장함). 용해된 세포 용액을 gDNA 제거기 스핀 컬럼(Eliminator spin column)에 첨가하고, ≥8000g에서 30초 동안 원심분리하고, 컬럼을 제거하고, 유체를 수집했다. 유체와 동일한 체적의 70% 에탄올을 피펫팅하여 유체에 첨가하고, 유체와 균일하게 혼합하고, 다음 단계를 수행했다. 액체를 RNeasyMinElute 스핀 컬럼에 첨가하고, ≥8000g에서 15초 동안 원심분리하고, 액체 폐기물을 제거했다. 700μL의 버퍼 RW1을 RNeasyMinElute 스핀 컬럼에 첨가하고, ≥8000g에서 15초 동안 원심분리하고, 액체 폐기물을 제거했다. 500μL의 버퍼 RPE를 RNeasyMinElute 스핀 컬럼에 첨가하고, ≥8000g에서 15초 동안 원심분리하고, 액체 폐기물을 제거했다. 500μL의 80% 에탄올을 RNeasyMinElute 스핀 컬럼에 첨가하고, ≥8000g에서 2분간 원심분리하고, 액체 폐기물을 제거했다. RNeasyMinElute 스핀 컬럼을 새로운 2mL 수집 컬럼에 배치하고, 가장 높은 상대 원심력으로 5분 동안 덮지 않고 원심분리하여 건조했다. RNeasyMinElute 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 수집 컬럼에 배치하고, 컬럼 멤브레인 중앙에 RNase-프리 워터 14μL를 적하하고, 컬럼을 최고 속도로 1분간 원심분리하여 RNA를 희석했다.
추출된 RNA의 농도를 Nanodrop(Thermo, 카탈로그 No. Nanodrop2000)을 이용하여 검출하고, RNA 1㎍을 역전사(Thermo, 역전사효소 카탈로그 No. 28025013)했다. 역전사 시스템은 표 1에 따라 제조하고, 65℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 즉시 아이스 배스에서 냉각했다. 역전사 시스템을 다시 37℃에서 50분간 인큐베이션했다. 역전사효소는 70℃에서 15분 동안 비활성화했다. PCR은 표 3에 나타낸 조건하에서 수행했다. PCR이 완료된 후, 2μL의 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동하고, PCR 산물의 농도와 밴드의 크기의 정확도를 전기영동 결과에 따라 사전에 결정했다. 정제 후, PCR 산물로 라이브러리를 구축하고, 이들 산물을 차세대 시퀀싱을 행했다.
Figure pct00001
반응 시스템을 65℃에서 5분 동안 실행한 다음, 즉시 아이스 상에 옮겼다.
Figure pct00002
Figure pct00003
효소 활성 어세이
GM06214 세포를 소화시키고, 원심분리하고, 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 28μL의 1×PBS로 재현탁하고, 30분 동안 아이스 상에서 용해시켰다. 25μL의 용해된 세포 용액을 190μm의 4-메틸움벨리페릴-α-L-이두로니다아제를 포함하는 기질(Cayman, 2A-19543-500, 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 0.4M 포름산나트륨 용액에 용해됨, pH=3.5) 25μL에 첨가했다. 세포를 암실에서 37℃에서 90분 동안 인큐베이션했다. 200μL의 0.5M NaOH/글리신 용액(Beijing Chemical Technology, NAOH, 카탈로그 번호 AR500G; Solarbio, Glycine, 카탈로그 번호 G8200)(pH=10.3)을 첨가하여 촉매 반응을 비활성화했다. 세포를 4℃에서 2분 동안 원심분리했다. 상층액을 96웰 플레이트에 옮기고, Infinite M200 기구(TECAN)를 사용하여 여기 파장 365nm 및 450nm에서 형광 측정했다.
본 출원에서, 효소 활성 어세이의 모든 결과 데이터는 GM01323 세포에서의 효소 활성의 배수로 표현된다. GM01323 세포는 샤이에 증후군을 가진 환자의 섬유아세포이다. 샤이에 증후군은 뮤코다당질축적증의 가장 경증의 아형이며, 헐러 증후군보다 훨씬 더 경증이다. 샤이에 증후군을 가진 환자는 일반적으로 더 우수한 예후와 정상적인 수명을 가지며, 성인까지 생존할 수 있다. 샤이에 증후군을 가진 환자의 섬유아세포에서의 IDUA 효소 활성은 건강한 사람의 야생형 섬유아세포의 0.3%이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 전구체 mRNA(pre-mRNA)를 표적으로 하는 arRNA는 높은 효소 활성 및 편집 효율을 야기할 수 있고, 성숙한 mRNA(성숙-mRNA)를 표적으로 하는 arRNA는 현저히 낮은 효소 활성 및 편집 효율을 야기한다. 따라서, 하기 실시예에 포함된 arRNA는 전구체 mRNA(pre-mRNA)를 표적으로 하는 arRNA이다.
실시예 4: arRNA로 IDUA 리포터 세포주의 일렉트로트랜스펙션 후의 IDUA 표적 부위에서의 편집 효율의 검출
도 4a에 도시된 바와 같이, 렌티바이러스 플라스미드 상에 mCherry 및 GFP 단백질을 발현하는 서열 사이에 IDUA 돌연변이 부위를 갖고 약 100bp 상류 및 100bp 하류를 갖는 서열을 삽입함으로써 플라스미드를 구축했다. 상기 구축한 플라스미드를 바이러스 내에서 제조하고, 293T 세포를 감염시키는 데 사용하고, 서열을 게놈에 통합시킨 후, IDUA-리포터 단일클론 세포를 선별했다. 단클론성 세포는 삽입된 서열에서 IDUA 돌연변이 부위의 종결 코돈 TAG의 영향때문에, mCherry 단백질만 발현할 수 있으며, arRNA에 의해 세포가 편집된 후, TAG->TGG가 발생하고, 돌연변이 부위 뒤에 위치한 GFP 단백질은 정상적으로 발현될 수 있으며, GFP 단백질의 발현은 세포 내 arRNA의 편집 효율로 간주될 수 있다. 실시예 2의 일렉트로트랜스펙션 조건하에서 길이가 상이한 arRNA로 세포를 일렉트로트랜스펙션한 후, 실시예 4에 도시된 바와 같이, 51-111nt의 상이한 길이를 갖는 4개의 arRNA를 설계하는 것이 바람직하고, 세포에서의 GFP의 비율을 1일부터 7일까지 검출하고, 편집 효율을 사전에 검출했다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 서열 91nt: 45nt-c-45nt의 편집 효율이 가장 높고, 편집의 피크는 2일(48h)에 나타난다. 이는 arRNA의 길이의 측면에서 서열이 길지 않을수록 편집 효율이 높다는 것을 나타낸다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 5: 상이한 길이의 arRNA로 일렉트로트랜스펙션 후 상이한 시점에서 GM06214 세포에서의 IDUA 효소 활성 어세이 및 RNA 편집 효율의 검출
상이한 길이의 arRNA로의 GM06214 세포의 일렉트로트랜스펙션(표 4 참조)을 실시예 2의 일렉트로트랜스펙션 조건하에 행하고, 실시예 3의 방법으로 일렉트로트랜스펙션 후, 세포에서의 효소 활성을 2일째, 4일째, 6일째, 8일째, 10일째, 12일째, 및 14일째에 각각 어세이하고, 세포에서의 RNA 편집 효율을 2일째 및 4일째에 검출했다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 서열 91nt: 45nt-c-45nt에 의해 야기된 효소 활성이 가장 높고, IDUA 효소 활성은 일렉트로트랜스펙션 후 6일째에도 여전히 높은 수준으로 유지한다. 편집 효율에 관해서, 91nt와 111nt의 서열은 거의 동일한 편집 효율을 나타낸다.
실시예 6: arRNA 상의 상이한 부위에의서 표적으로 하는 염기의 편집 효율의 검출
111nt의 길이의 arRNA를 예로 들며, arRNA 상의 상이한 부위에서의 표적으로 하는 염기의 편집 효율은 돌연변이 부위의 양측으로부터 동시에 잘라내고, 5'-말단 또는 3'-말단을 잘라냄으로써 검출했다.
본 실시예에 있어서, arRNA는 리포펙타민 RNAiMAX에 의해 세포 내에 도입했다. 먼저, 양 말단으로부터 동시에 arRNA 서열을 절단한 후, 한 말단을 고정하고, 다른 말단을 절단하여, 표 5에 나타낸 바와 같이, 14개의 arRNA와 4개의 동일한 길이의 랜덤 서열을 얻었다. 트랜스펙션 48시간 후, IDUA 효소 활성을 어세이하고, RNA 편집 효율을 검출했다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 서열 81nt: 55nt-c-25nt(서열번호 14), 71nt: 55nt-c-15nt(서열번호 15), 91nt: 45nt-c-45nt(서열번호 9), 91nt: 55nt-c-35nt(서열번호 13), 및 101nt: 45nt-c-55nt(서열번호 17)에 의해 야기된 IDUA 효소 활성 및 RNA 편집 효율이 다른 서열에 의한 것보다 더 높다.
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 7: 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리가 편집 효율에 미치는 영향
실시예 6에 의해, 서열 81nt: 55nt-c-25nt 및 71nt: 55nt-c-15nt에 의해 야기된 IDUA 효소 활성 및 편집 효율이 더 높은 것을 확인했다. 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 최단 거리와 최적 거리를 선별하기 위해, 표 6에 나타낸 바와 같이, 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리를 25nt(81nt: 55nt-c-25nt)로부터 10nt(66nt: 55nt-c-10nt)까지 점차적으로 절단했다. 도 7a에 도시된 바와 같이, IDUA 효소 활성 어세이에 의해, 서열 24nt-c-11nt가 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 최적의 거리를 갖는 것을 발견했다. 또한, 비교에 의해 서열 80nt: 55nt-c-24nt(서열번호 22), 79nt: 55nt-c-23nt(서열번호 23), 72nt: 55nt-c-16nt(서열번호 30), 70nt: 55nt-c-14nt(서열번호 31), 및 67nt: 55nt-c-11nt(서열번호 34)에 의해 야기된 효소 활성이 서열번호 14 및 서열번호 15에 의해 야기된 것과 동일하거나 더 높은 것을 알 수 있다.
더욱이, 마우스 IDUA 돌연변이 부위(인간에 있어서 인간 IDUA-W402X 돌연변이에 상응)를 표적으로 하는 arRNA에 대해 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 최적 거리의 선별을 수행하고, arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리를 표 7에 나타낸 바와 같이 55nt로부터 5염기마다 절단했다. 도 7b에 도시된 바와 같이, IDUA 효소 활성 어세이에 의해, 서열 55nt-c-10nt은 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 최적 거리를 갖는 것을 발견했다. 또한, 서열 111nt: 55nt-c-50nt(서열번호 44) 및 66nt: 55nt-c-10nt(서열번호 52)는 높은 편집 효율을 나타낸다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 8: 5'-말단의 길이가 편집 효율에 미치는 영향
길이가 상이한 2개의 arRNA, 즉 76nt: 55nt-c-20nt 및 71nt: 55nt-c-15nt를 선택하고, 3'-말단의 길이는 변경되지 않고 유지되고, 표 8에 나타낸 바와 같이, 5'-말단의 길이를 점진적으로 절단했다. 도 8a에 도시된 바와 같이, IDUA 효소 활성 어세이에 의해, 5'-말단의 길이가 55-45nt인 경우, arRNA에 의해 편집된 세포에서의 IDUA 효소 활성이 높고, 또한 arRNA의 전체 길이가 65-61nt이면, IDUA 효소 활성이 현저히 감소된 것을 알았다. 3'-말단의 길이를 14nt로 고정하고, 5'-말단을 51nt(전체 길이는 66nt)로부터 염기마다 점차적으로 절단하고, 또한 5'-말단이 51nt로부터 50nt(전체 길이는 65nt)까지 절단했을 경우, IDUA 효소 활성이 현저히 감소했다. 따라서, 5'-말단의 절단은, 도 8b에 도시된 바와 같이, arRNA의 전체 길이가 66nt 이상인 것일 필요가 있다.
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 9: RNA에 대한 화학적 변형이 편집 효율에 미치는 영향
RNA 합성 동안 RNA에 대한 상이한 화학적 변형은 RNA의 안정성을 증가시키고 표적이탈의 가능성을 감소시킬 수 있다. RNA에 대한 일반적인 화학적 변형은 2'-OMe 및 티오포스페이트 변형을 포함한다. 본 실시예에 있어서, 표 8에 나타낸 바와 같이, 상이한 길이의 2개의 arRNA, 즉 71nt 및 76nt를 선택하고, 2개의 화학적 변형 방법의 상이한 조합을 행했다. 구체적인 변형 방법은 다음과 같다.
CM1: 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 각각 2'-OMe 변형했고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결했고, 한편 서열의 모든 염기 U는 2'-OMe 변형했다.
CM2: 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 각각 2'-OMe 변형했고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 각각 티오포스페이트 결합을 통해 연결했고, 한편 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기는 2'-OMe 변형된 A였다.
CM3: 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 각각 2'-OMe 변형했고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 각각 티오포스페이트 결합을 통해 연결했고, 한편 표적으로 하는 염기의 5' 최인접 염기는 2'-OMe 변형된 C였다.
CM4: 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 각각 2'-OMe 변형했고, 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결했고, 한편 표적으로 하는 염기는 티오포스페이트 결합을 통해 각각 표적으로 하는 염기의 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기에 연결했다.
CM5: 표적으로 하는 염기를 제외하고, 5'-말단의 표적으로 하는 염기에 인접한 5개의 염기, 및 3'-말단의 표적으로 하는 염기에 인접한 5개의 염기, 다른 모든 뉴클레오티드를 2'-OMe 변형했고, 한편 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드를 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결했다.
CM6: 서열의 처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드를 각각 2'-OMe 변형했고, 또한 처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드를 티오포스페이트 결합을 통해 각각 연결했다.
GM06214 세포를 상이한 arRNA로 트랜스펙션시켜 세포의 IDUA를 편집하고, 트랜스펙션 48시간 후에 세포를 수집하고, IDUA 효소 활성 어세이를 실시했다. 도 9에 도시된 바와 같이, 화학적 변형 방법 CM5(5번째 변형: 표적으로 하는 염기 근처에서 11nt를 제외한 모든 뉴클레오티드를 2'-OMe 변형함)를 제외한 다른 변형 방법에 의해 야기된 효소 활성은 높다.
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Figure pct00015
Figure pct00016
주: ro는 뉴클레오티드가 변형되지 않고, 뉴클레오티드 사이의 에스테르 결합이 변형되지 않은 것을 나타내고; r*은 뉴클레오티드가 변형되지 않고, 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 연결되어 있는 것을 나타내고; mo는 뉴클레오티드가 2'-OMe 변형되고, 뉴클레오티드 사이의 에스테르 결합이 변형되지 않은 것을 나타내고; m*은 뉴클레오티드가 2'-OMe 변형되고, 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 연결되어 있는 것을 나타낸다.
실시예 10: 화학적 변형이 편집 효율에 미치는 영향
본 실시예에 있어서는, 인간 IDUA 돌연변이 부위를 표적으로 하는 3개의 바람직한 arRNA와, 마우스 IDUA 돌연변이 부위를 표적으로 하는 1개의 바람직한 arRNA를 사용하고, 방법 CM1에 의해 화학적으로 변형시켰다. 농도 구배 실험을 동형접합성 IDUA 돌연변이(Wang D, Shukla C, Liu X et al. Characterization of an MPS I-H knock-in mouse that carries a nonsense mutation analogous to the human IDUA-W402X mutation[공개된 수정 사항은 Mol Genet Metab. 2010 Apr;99(4):439에 나타낸다]. Mol Genet Metab.2010;99(1):62-71. doi:10.1016/j.ymgme.2009.08.002)를 가진 태아 마우스(IDUA W392X 마우스, B6.129S-Iduatm1.1Kmke/J)로부터 분리된 GM06214 세포 및 MSPI MEF(MSPI 마우스 배아 섬유아세포(MEF)) 세포에 대해 행했다.
실시예 7의 실험 결과에 근거하여, 인간 IDUA를 표적으로 하는 3개의 arRNA, 즉 서열 55nt-c-16nt, 55nt-c-14nt 및 55nt-c-11nt와, 마우스 IDUA를 표적으로 하는 하나의 arRNA, 즉 서열 55nt-c-10nt를 선택했다. 또한, 랜덤 arRNA 서열 RM-67CM1을 대조군으로 선택했다. 실시예 9의 실험 결과에 근거하여, 상기 IDUA를 표적으로 하는 arRNA를 표 9에 나타낸 바와 같이, 화학적 변형 방법 CM1(모든 염기 U는 2'-OMe 변형됨)에 의해 합성했다. 상이한 농도의 arRNA로의 인간 GM06214 세포 및 MSPI 마우스 MEF의 트랜스펙션에 대한 비교 실험을 수행했다. 9개의 농도의 arRNA를 설정했다: 160nM, 80nM, 40nM, 20nM, 10nM, 5nM, 2.5nM, 1.25nM 및 0.625nM. 세포를 6웰 플레이트에 코팅하고, 코팅 후 24시간 동안 트랜스펙션하고, 트랜스펙션 48시간 후에 소화시키고, 세포의 절반을 IDUA 효소 활성 어세이를 위해 취하고, 세포의 절반을 RNA 추출 및 편집 효율 검출을 위해 취했다. 도 10a 및 도 10c에 도시된 바와 같이, arRNA의 트랜스펙션 농도가 2.5-5nM 이상이면, 높은 효소 활성이 달성될 수 있고, 트랜스펙션 농도가 10-20nM 이상이면, 효소 활성이 안정 상태에 도달한다. 도 10b 및 도 10d에 도시된 바와 같이, arRNA의 동일한 트랜스펙션 농도의 조건하에서, 인간 세포(GM06214)에서의 IDUA 효소 활성 및 편집 효율은 마우스 세포(MSPI MEF)에서의 것과 상이하다.
Figure pct00017
Figure pct00018
주: ro는 뉴클레오티드가 변형되지 않고, 뉴클레오티드 사이의 에스테르 결합이 변형되지 않은 것을 나타내고; r*은 뉴클레오티드가 변형되지 않고, 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 연결되어 있는 것을 나타내고; mo는 뉴클레오티드가 2'-OMe 변형되고, 뉴클레오티드 사이의 에스테르 결합이 변형되지 않은 것을 나타내고; m*은 뉴클레오티드가 2'-OMe 변형되고, 뉴클레오티드가 티오포스페이트 결합을 통해 연결되어 있는 것을 나타낸다.
실시예 11: arRNA에 의해 편집된 후 지속된 IDUA의 프로테이나제 활성
본 실시예에서는, 인간 IDUA 돌연변이 부위를 표적으로 하는 3개의 바람직한 arRNA와, 마우스 IDUA 돌연변이 부위를 표적으로 하는 1개의 바람직한 arRNA를 사용하고, 방법 CM1에 의해 화학적으로 변형시켰다. GM06214 세포와 MSPI MEF(마우스 배아 섬유아세포) 세포에서의 IDUA 효소 활성이 현저히 개선되었으며, 약 3주 동안 지속되었다.
실시예 10에 있어서, 상이한 농도의 IDUA를 표적으로 하는 바람직한 arRNA로 인간 및 마우스 세포의 트랜스펙션 48시간 후, IDUA 효소 활성을 비교했다. 본 실시예에서는, 농도 20nM의 arRNA를 사용했으며, IDUA 효소 활성과 편집 효율을 다른 시점에서 비교했다. GM06214 세포를 arRNA로 트랜스펙션한 후, IDUA 효소 활성을 연속 14일 동안 어세이했다. 도 11a에 도시된 바와 같이, IDUA 효소 활성의 피크는 트랜스펙션 후 4일째 및 9일째에 나타나며, 14일째의 IDUA 효소 활성은 2일째보다 더욱 높다. 그 다음, IDUA 효소 활성을 트랜스펙션 후 17일째 및 21일째에 어세이했다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 트랜스펙션 후 21일째의 효소 활성은 1일째의 효소 활성보다 더욱 높고, 효소 활성은 GM01323의 약 6∼10배이다. (편집 효율이 추가된 것이고, 도 11b 참조). MSPI MEF 세포를 arRNA로 트랜스펙션한 후, IDUA 효소 활성을 연속 8일 동안 어세이했다. 도 11c에 도시된 바와 같이, arRNA로 트랜스펙션 후 24시간부터 8일째까지, 효소 활성은 GM1323 세포의 약 2배이다. 도 11d에 도시된 바와 같이, IDUA 편집 효율의 피크는 트랜스펙션 24시간 후에 나타나며, 그후 IDUA 편집 효율은 연속적으로 감소한다.
인간과 마우스 세포의 데이터를 비교함으로써, 마우스 세포에서의 arRNA의 편집 효율의 피크는 트랜스펙션 24시간 후에 나타나는 반면, 인간 세포에서의 arRNA의 편집 효율의 피크는 트랜스펙션 48시간 후에 나타나는 것을 발견했다. 편집 후, 인간 세포에서의 IDUA 효소 활성은 21일을 초과하여 지속되는 반면, 마우스 세포의 IDUA 효소 활성은 8일을 초과하여 지속된다.
실시예 12: arRNA 전달 방법이 편집 효율에 미치는 영향
본 실시예에서는, 1차 세포 배양에 의해 얻어진 인간 및 마우스 간 세포에서 PPIB 유전자의 야생형 부위를 LEAPER에 의해 편집하고, 최적의 전달 방법을 선별하기 위해 arRNA를 상이한 방법으로 전달했다.
"PPIB"는 인간 NM_000942(PPIB Genomic chr15(-): 64163082) UTR 영역에서의 야생형 부위 또는 마우스 NM_011149(PPIB Genomic chr9(+): 66066490) UTR 영역에서의 야생형 부위를 지칭한다. PPIB는 성숙 mRNA 또는 전구체 mRNA일 수 있다. PPIB의 UTR 영역은 하나의 TAG를 포함한다. 본 실시예에서는, 간 세포에서 본 출원의 arRNA의 편집 효율을 검출하기 위해 표적인 TAG에서의 A를 편집했다.
PPIB UTR 영역을 표적으로 하는 arRNA(55nt-c-15nt)를 표 11에 나타낸 바와 같이 설계 및 합성했다. 합성된 arRNA의 일부를 용해하고, 서브패키징하고, -80℃에서 보관하고, Lipo(리포펙타민 RNAiMAX)에 의한 세포의 트랜스펙션에 사용했고, arRNA의 나머지 부분은 LNP로 제조했다. LNP는 Witzigmann D, Kulkarni J A, Leung J et al. Lipid nanoparticle technology for therapeutic gene regulation in the liver[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2020.; Kauffman K J, Dorkin J R, Yang J H, et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs[J]. Nano Letters, 2015, 15(11): 7300-7306.; 및 Reis J, Kanagaraj S, Fonseca A, et al. In vitro studies of multiwalled carbon nanotube/ultrahigh molecular weight polyethylene nanocomposites with osteoblast-like MG63 cells[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2010, 43(5): 476-482을 참조하여 제조했다.
1차 인간 간 세포는 LONZA(catalog No. HUCPI)에서 구입하고, 사용 매뉴얼(회복 배지 카탈로그 번호: MCHT50, 플랭킹 배지 카탈로그 번호: MP100)에 따라 회복 및 배양했다. 세포가 벽에 부착된 후, 배지를 간 세포 유지 배지 5C로 교체했다(참조: Xiang C, Du Y, Meng G, et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro[J]. Science, 2019 , 364(6438): 399-402).
1차 마우스 간 세포를 C57BJ 마우스로부터 분리하고(Charni-Natan M, Goldstein I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation[J]. STAR protocols, 2020, 1(2): 100086 참조), 분리된 간 세포를 벽에 부착한 후, 배지를 유지 배지 5C로 교체했다.
인간 간 세포의 회복 24시간 후, arRNA를 전달하고, LNP와 Lipo에 의해 전달된 arRNA의 농도는 모두 20nM이었다. 마우스 간 세포의 분리 배양 24시간 후, arRNA를 전달하고, LNP와 Lipo에 의해 전달된 arRNA의 농도는 모두 20nM이었다. 인간 간 세포의 RNA는 arRNA 전달 24시간 후 추출하고, 마우스 간 세포의 RNA는 arRNA 전달 48시간 후 추출하여, 차세대 시퀀싱에 의해 편집 효율을 검출했다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 인간 간 세포에서 두 방법에 의한 arRNA 전달 48시간 후의 편집 효율은 arRNA 전달 24시간 후의 편집 효율보다 높으며, 한편 arRNA 전달 24시간 후, LNP 전달로 인한 편집 효율이 Lipo 전달로 인한 편집 효율보다 높고, 전달 48시간 후에는 두 전달 방법으로 인한 편집 효율은 거의 동일한다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 마우스 간 세포에서 두 방법에 의한 arRNA 전달 24시간 후의 편집 효율은 arRNA 전달 48시간 후의 편집 효율보다 높고, 한편 arRNA 전달 24시간 및 48시간 후, Lipo 전달로 인한 편집 효율은 LNP 전달로 인한 편집 효율보다 높다.
따라서, 1차 간 세포에서 PPIB 부위의 편집 효율을 비교하면, arRNA 전달 24시간 후에 마우스 간 세포에서 편집 피크가 나타나고, arRNA 전달 48시간 후에 인간 간 세포에서 편집 피크가 나타나는 것으로 판단되고, 이들 데이터는 인간 GM06214 세포 및 마우스 MSPI MEF 세포의 데이터와 일치한다. arRNA를 인간 간 세포로 전달하기 위해서는, LNP가 Lipo보다 우수하거나 동일하다. arRNA를 마우스 간 세포로 전달하기 위해서는 Lipo가 LNP보다 훨씬 우수하다.
Figure pct00019
실시예 13: LNP 전달로 인한 편집 효율
본 실시예는 LNP를 통한 1차 세포 배양에 의해 얻어진 인간 및 마우스 간 세포에 arRNA를 전달한 후, IDUA에서의 arRNA의 편집 효율에 대한 연구를 포함한다.
본 실시예에서는, 인간 IDUA CDS 영역의 야생형 부위를 표적으로 하는 arRNA를 표 12에 나타낸 바와 같이 설계 및 합성했다. 인간 및 마우스 IDUA를 표적으로 하는 arRNA(20nM)를 LNP에 의해 1차 인간 간 세포 및 1차 마우스 간 세포에 각각 전달하고, 전달 24시간 및 48시간 후에 편집 효율을 검출했다. 도 13에 도시된 바와 같이, 시험관내 1차 세포 배양에 의해 얻은 간 세포에서, 인간 IDUA에서의 arRNA의 편집 효율은 전달 48시간 후에 약 30%의 피크에 도달하고, 마우스 IDUA에서의 arRNA의 편집 효율은 전달 24시간 후에 약 15%의 피크에 도달한다. 또한, LNP가 인간 세포, 특히 1차 인간 간 세포에서 더 높은 전달 효율을 실현할 수 있다는 것을 추가로 나타낸다.
Figure pct00020
실시예 14: MSPI 마우스 모델에서의 IDUA에 대한 arRNA의 치료 효과
본 실시예에 있어서, MPSI 마우스 모델(IDUA W392X 마우스, B6.129S-Iduatm1.1Kmke/J)(Wang D, Shukla C, Liu X, et al. Characterization of a MPS I-H knock-in mouse that carry a nonsense mutation analogous to the human IDUA-W402X mutation[공개된 수정은 Mol Genet Metab. 2010 Apr;99(4):439에 나타남]. Mol Genet Metab. 2010; 99(1): 62-71. Doi:10.1016/j. ymgme.2009.08.002)를 사용했다. 돌연변이는 인간 IDUA-W402X 돌연변이에 상응하며, 이는 단백질의 합성을 조기에 종료할 수 있으며 헐러 뮤코다당질축적증(MPS I-H) 환자에서 만연한다. 이러한 리소좀 축적 장애는 α-L-이두로니다아제의 결핍으로 인해 야기되었다. α-L-이두로니다아제 활성은 5주령, 10주령 및 30주령의 동형 접합성 마우스의 뇌 및 간 조직에서는 검출되지 않았다. 돌연변이를 가진 이들 동형 접합성 마우스는 생존 가능하고 생식력이 있었지만, 평균 수명은 69주였다. 동형 접합체는 글리코사미노글리칸(GAG)의 뇨중 배설의 점진적인 증가 및 조직 내 GAG의 점진적인 축적을 나타냈다. 안정된 IDUA mRNA 수준이 30-50% 감소했다. 조직학적 분석은 푸르키니에 세포와 수질 뉴런의 세포질에서의 리소좀 축적 함유물의 점진적인 축적, 및 나이가 들어감에 따라 거품성 대식세포의 침윤 증가가 보였다. 방사선 사진에서는 15주령 마우스에서 관골궁과 대퇴골이 눈에 띄게 비후되어 있었고, 35주령 마우스에서는 상당한 비후가 보였다. 35주령에서는, 대퇴골의 무기질 밀도가 증가하고 체지방 비율이 감소했다. 마우스 IDUA 돌연변이, 즉 55nt-c-10nt CM1(서열번호 52)을 표적으로 하는 선택된 arRNA를 LNP로 제조했다. 상이한 농도의 arRNA를 꼬리 정맥을 통해 주입하고, 상이한 농도는 각각 0.1mg/kg, 0.5mg/kg, 2mg/kg, 10mg/kg이었다. 투여 24시간 후, IDUA에서의 편집 효율을 검출하기 위해 마우스 간 세포를 채취했다. 도 14에 도시된 바와 같이, 투여 24시간 후, 10mg/kg 농도의 arRNA를 주입한 마우스에서의 편집 효율은 약 2%이다. 본 실시예의 결과는 MSPI 마우스 모델에서 IDUA를 표적으로 하는 arRNA가 생체 내 간 세포에서 IDUA 돌연변이 유전자의 정확한 편집을 달성할 수 있고, 또한 IDUA 돌연변이를 교정하여 MPSI 치료 목적을 달성할 수 있다는 것을 입증한다.
Sequence Listing <110> Edigene (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. <120> LEAPER TECHNOLOGY BASED METHOD FOR TREATING MPS IH AND COMPOSITION <130> FD00306EP <150> PCT/CN2019/129952 <151> 2019-12-30 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 1 cgcttccagg tcaacaacac 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctcgcgtaga tcagcaccg 19 <210> 3 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 3 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca uccagcagcg ccagcagccc cauggccgug agcaccggcu u 111 <210> 4 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 4 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucugcggggc gggggggggc cgucgccgcg uggggucguu g 111 <210> 5 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 5 uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga 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cugcuccuca ucugcggggc 80 <210> 23 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 23 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucugcgggg 79 <210> 24 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 24 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucugcggg 78 <210> 25 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 25 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucugcgg 77 <210> 26 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 26 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucugcg 76 <210> 27 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 27 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucugc 75 <210> 28 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 28 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucug 74 <210> 29 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 29 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca ucu 73 <210> 30 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 30 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca uc 72 <210> 31 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 31 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuca 70 <210> 32 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 32 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccuc 69 <210> 33 <211> 68 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 33 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuccu 68 <210> 34 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 34 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcucc 67 <210> 35 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 35 gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60 cugcuc 66 <210> 36 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 36 ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60 ccucaucugc g 71 <210> 37 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 37 gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca 60 ucugcg 66 <210> 38 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 38 guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu ccucaucugc 60 g 61 <210> 39 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 39 uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca ucugcg 56 <210> 40 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 40 ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60 ccucau 66 <210> 41 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 41 gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca 60 u 61 <210> 42 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 42 guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu ccucau 56 <210> 43 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 43 uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca u 51 <210> 44 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 44 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuauaagcc aagcagaggg cugaggcugu uggcuc 106 <210> 45 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 45 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuauaagcc aagcagaggg cugaggcugu u 101 <210> 46 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 46 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuauaagcc aagcagaggg cugagg 96 <210> 47 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 47 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuauaagcc aagcagaggg c 91 <210> 48 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 48 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuauaagcc aagcag 86 <210> 49 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 49 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuauaagcc a 81 <210> 50 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 50 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuaua 76 <210> 51 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 51 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca u 71 <210> 52 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 52 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguuc 66 <210> 53 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 53 uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc 60 gcgaug 66 <210> 54 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 54 caccccauca gauggaagca cuagggccag gguggcacag aaccuuguga cuggccaccu 60 ucgucugugu g 71 <210> 55 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 55 ggaggcgaaa gcagcccgga cagcugaggc cggaagaggg uggggccgcg guggccaggg 60 agccggcgcc g 71 <210> 56 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 56 cccaccgugu gguugcuguc caggacgguc ccggccugcg acacuucggc ccagagcugc 60 uccuca 66 <210> 57 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 57 ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60 ccuca 65 <210> 58 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 58 caccgugugg uugcugucca ggacgguccc ggccugcgac acuucggccc agagcugcuc 60 cuca 64 <210> 59 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 59 accguguggu ugcuguccag gacggucccg gccugcgaca cuucggccca gagcugcucc 60 uca 63 <210> 60 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 60 ccgugugguu gcuguccagg acggucccgg ccugcgacac uucggcccag agcugcuccu 60 ca 62 <210> 61 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 61 cgugugguug cuguccagga cggucccggc cugcgacacu ucggcccaga gcugcuccuc 60 a 61 <210> 62 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 62 gacacccacu guaugauugc uguccaacac agccccagcc uuugagaccu cugcccagag 60 uuguucucca ucuauaagcc aagcagaggg cugaggcugu uggcucucuc a 111

Claims (23)

  1. LEAPER에 기반한 표적 세포에서의 표적 RNA의 표적 편집 방법으로서, 상기 표적 RNA는 IDUA 유전자 전사체에 G-to-A 돌연변이를 포함하는 RNA이고, 상기 방법은:
    상기 표적 RNA를 편집하기 위한 아데노신 데아미나아제-모집 RNA(arRNA)를 포함하는 구축물 또는 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물을 표적 세포에 전달하는 단계로서, 상기 arRNA는 표적 RNA와 혼성화하고, 또한 상기 표적 RNA에서 표적 아데노신(A)을 탈아미노화하기 위해 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나아제(ADAR)를 모집할 수 있는 상보적 RNA 서열을 포함하는 단계를 포함하는 LEAPER에 기반한 표적 세포에서의 표적 RNA의 표적 편집 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 arRNA는 표적 A와 페어링하는 염기 C, A, U 또는 G를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 arRNA의 길이는 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt 또는 81-66nt인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 3'-말단 사이의 거리는 45-5nt, 40-5nt, 35-10nt, 25-15nt 또는 24-11nt인 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 arRNA에서의 표적으로 하는 염기와 5'-말단 사이의 거리는 80-30nt, 70-35nt, 60-40nt, 55-35nt 또는 55-45nt인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 세포는 인간 세포인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 RNA는 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 RNA인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 arRNA는 하기 서열: 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 30, 서열번호 31, 및 서열번호 34 중 어느 하나를 포함하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 arRNA는 하기 서열: 서열번호 44 및 서열번호 52 중 어느 하나를 포함하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 arRNA는 화학적으로 변형되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 2-O'-메틸화(2'-OMe) 또는 티오포스페이트 변형을 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 화학적 변형은:
    arRNA 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 마지막 3개의 뉴클레오티드 각각에 대한 2'-OMe 변형;
    처음 3개의 뉴클레오티드와 마지막 3개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합 연결;
    arRNA 서열의 모든 U 염기에 대한 2'-OMe 변형;
    표적으로 하는 염기에 최인접한 3' 염기인 염기 A에 대한 2'-OMe 변형;
    표적으로 하는 염기에 최인접한 5' 염기인 염기 C에 대한 2'-OMe 변형;
    표적으로 하는 염기와 그것의 3' 최인접 염기 및 5' 최인접 염기 각각 사이의 티오포스페이트 결합 연결;
    처음 5개의 뉴클레오티드 및 마지막 5개의 뉴클레오티드 각각에 대한 2'-OMe 변형; 및
    처음 5개의 뉴클레오티드와 마지막 5개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이의 티오포스페이트 결합 연결로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    arRNA를 인코딩하기 위한 구축물은 선형 핵산쇄, 바이러스 벡터 또는 플라스미드인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 발현 벡터인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전달 방법은 일렉트로트랜스펙션, 리포펙션, 또는 지질 나노입자(LNP) 전달 또는 감염인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    표적 RNA를 편집하기 위한 아데노신 데아미나아제-모집 RNA를 포함하는 구축물 또는 arRNA를 인코딩하기 위한 구축물은 LNP를 통해 표적 세포에 전달되는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    arRNA의 전달 농도는 2.5nM, 5nM, 10nM, 15nM 또는 20nM 이상인 방법.
  18. LEAPER에 기반한 표적 세포에서의 표적 RNA의 표적 편집을 위한 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열로서, 상기 arRNA는 하기 서열: 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 44, 및 서열번호 52 중 어느 하나를 포함하거나 또는 구성되는 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열.
  19. 제 18 항에 기재된 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 또는 지질 나노입자.
  20. 제 18 항에 기재된 arRNA 또는 arRNA의 코딩 서열을 포함하거나, 또는 제 19항에 기재된 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 또는 지질 나노입자를 포함하는 조성물 또는 생물학적 생성물.
  21. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 개체의 표적 세포에서, MPS IH와 연관된 G-to-A 돌연변이를 교정하는 단계를 포함하는 개체에서 MPS IH를 치료하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    상기 돌연변이는 NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter) 돌연변이인 방법.
  23. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 arRNA는 ≥21일 마다, ≥17일 마다, ≥14일 마다 또는 ≥10일 마다의 빈도로 투여되는 방법.
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