JP2023507181A - ポリヌクレオチドをエクソソームに送達するための核酸コンストラクト - Google Patents

Abstract

本発明は、ｍｉＲＮＡ分子ＭＩＲ２１、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１、およびｐｒｅ－ｍｉＲ－２１において特定された構造的および調節的特性を使用して、外因性ヌクレオチド配列をエクソソーム内へと送達する。特に、本発明は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡに関し、ここで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、外因性ヌクレオチド配列およびステム－ループ構造を含み、当該ステムは、少なくとも１つのゆらぎ対を含む。本発明は、操作されたｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む核酸カセット、ベクター、および細胞、エクソソームに搭載する方法、ならびに結果として得られる搭載されたエクソソームも提供する。当該搭載されたエクソソームを使用して、例えば、療法において、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達することができる。

Description

本発明は、ヌクレオチド配列をエクソソームに送達することができる核酸コンストラクト、および目的のヌクレオチド配列を含むエクソソームを産生するためにこれらのコンストラクトを使用する方法に関する。

エクソソームは、エンドソームコンパートメントに由来する膜結合小胞であり、多胞小体（ＭＶＢ）が細胞膜と融合する時に細胞から分泌される。エクソソームは、典型的には、３０ｎｍから１２０ｎｍの間の直径を有する。エクソソームは、タンパク質、炭水化物、脂質、および核酸などの多くのタイプの生体分子を含有することができる。エクソソーム生合成は、細胞の界面活性剤不溶性膜画分において典型的に見出される、コレステロール、セラミド、および他の脂質によるそれらの膜の富化を伴う。例えば、テトラスパニンおよび他の膜貫通タンパク質および受容体などの、それらのソーティングおよび生物活性においてある役割を果たし得るタンパク質も、エクソソーム膜に埋め込まれている（Colombo et al. 2014）。

エクソソームの内腔は、標的細胞において転写および翻訳をモジュレートする能力を当該エクソソームに付与する特定のタンパク質および核酸、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などを含む。エクソソーム内のｍｉＲＮＡのレパートリーは、プロデューサー細胞の生理的状態を反映するようであり、その場合、選択されたｍｉＲＮＡは、当該エクソソーム内へとシャトリングされる。エクソソーム内包ｍｉＲＮＡまたはエクソソーム会合ｍｉＲＮＡの分泌は、それらを産生する細胞のパラクリン活性を生じさせることにおいてある役割を果たすことも観察されている。このメカニズムは、正常な状態においてと、局所刺激、例えば、感染症、栄養飢餓、または低酸素血症などに応答してとの両方において、細胞が局所的かつ遠隔の制御を発揮することを可能にし得る。

エクソソームに目的のｍｉＲＮＡなどの外因性カーゴ分子を搭載することは、細胞間においてシグナルを送達するそれらの能力を利用する有用な方法として提案されている。１つの方法は、目的の生物学的分子を回収されるエクソソーム内に直接導入することである。しかしながら、これは、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの技術を使用する小さいスケールにおいて可能であるにもかかわらず、これらの技術は、大きなスケールにおいて反復可能、規模拡大縮小可能、または信頼できるとは証明されていない。その上、これらの技術は、エクソソームの構造を損なうことさえあり得る（Janas, et al. 2015）。

ｍｉＲＮＡは、細胞によってエクソソーム内へと選択的にシャトリングされることが分かっている。ｍｉＲＮＡコード配列の約６０％は、遺伝子内領域または遺伝子間領域に位置し、したがって、発現は、一次遺伝子の発現を調節する、調節配列および転写因子に依存する。しかしながら、より少ない割合のｍｉＲＮＡコード領域は、遺伝子間領域に位置し、それら自身のプロモーター配列、エンハンサー、およびリプレッサーを含む。したがって、これらｍｉＲＮＡの発現は、他の遺伝子によって統制されるプロモーター媒介活性化を頼りにする細胞依存かつ刺激依存の方式においてそれらの正常な発現を特異的に制御するための規則の追加のレベルに依存する。両方の場合において、ｍｉＲＮＡは、最初に転写され、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（「一次ｍｉＲＮＡ」）と呼ばれる長い前駆体内に埋め込まれ、この場合、機能的ｍｉＲＮＡは、酵素Ｄｒｏｓｈａを含むタンパク質複合体によるその効率的で正しいプロセシングおよび切断にとって必要な配列によって囲まれる。Ｄｒｏｓｈａによる核での正しいプロセシングは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして知られるより短い前駆体を形成する。このｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、典型的には、ステム－ループ構造を形成し、それは、次いで、ＲＮａｓｅ ＤＩＣＥＲおよびアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質を含むタンパク質複合体ＲＩＳＣによって認識される場合に、核から細胞質へと輸送される。Ｄｉｃｅｒは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ構造のループ部分を切断して、成熟二本鎖ｍｉＲＮＡを形成し、鎖の１つ（パッセンジャー鎖として知られる）は、おそらくＡｇｏによって、分解されるかまたは破棄され、ＲＩＳＣ内に一本鎖ガイド鎖を残す。ＲＩＳＣ複合体は、次いで、一本鎖ｍｉＲＮＡガイド鎖に対して相補的な配列を含むメッセンジャーＲＮＡの遺伝子発現をサイレンシングすることができる。ヘアピンの長さおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにおけるループのサイズの両方は、ＤＩＣＥＲによる正確な切断のために、およびガイドｍｉＲＮＡ鎖の局在化のために、不可欠であることが示唆されている（Tsutsumi, et al. 2011）。

現在、エクソソーム内へとシャトリングされるｍｉＲＮＡが、どのようにしてエクソソームを産生する細胞においてＲＩＳＣによる細胞質プロセシングを回避するかは不明である。Ａｇｏタンパク質は、一般的に、エクソソームに位置せず、このことは、エクソソーム内へのｍｉＲＮＡのソーティングための特異的メカニズムを示唆している。エクソソーム内へのｍｉＲＮＡのアップシャトリングは、ＭＶＢ形成の際にエンドソーム膜に位置するセラミドに対して高い親和性を有するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の様々なセットとｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡとの相互作用を必要とすることが分かっている（Villarroya-Beltrei, et al. 2013）。しかしながら、異なる細胞とｍｉｃｒｏＲＮＡとの組み合わせは、シャペロンとして異なるＲＢＰを報告している。ＲＢＰのどれがエクソソームへのｍｉＲＮＡｓの選択的シャトリングを担っているかに関する統一見解は存在しないようであり、細胞毎に異なるＲＢＰが採用されるようである。

エクソソーム内へのｍｉＲＮＡのソーティングに関与するＲＢＰ相互作用モチーフの特定は、目的の外因性ヌクレオチドを運搬するエクソソームを産生するための細胞の遺伝子改変の可能性を開いた。しかしながら、ＲＮＡ結合タンパク質および配列タグのいくつかの細胞／ｍｉｃｒｏＲＮＡ特異的シャトリングは特定されているが、エクソソーム内へのｍｉＲＮＡパッケージングの普遍的に適用可能でかつ許容されるモードは、まだ特定されていない。いくつかのグループは、ＥＸＯモチーフ（ＧＣＣＧ、ＵＧＡＣ、ＵＣＣＧ、ＧＧＡＣ、ＧＧＣＧおよびＵＧＣＣ）と称される小さい配列が、エクソソーム内へのｍｉＲＮＡのソーティングを担い得ることを示唆している。多くの天然に存在するｍｉＲＮＡにおけるその存在にもかかわらず、改変されたｍｉＲＮＡをＥＸＯモチーフによってエクソソームに搭載する効率は、可変であり、細胞および搭載される標的配列に依存し、場合によって、恩恵を示さない（Villarroya-Beltrei, et al. 2013）。他のものは、ｍｉＲＮＡによって標的化される多くのｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に見出される２５ヌクレオチド配列を使用しており、それは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、したがって、多形膠芽腫細胞株から分泌される微細小胞内の可能性のあるｍｉＲＮＡを、アップシャトリングするのを助けることが観察された。これら２５ヌクレオチド配列は、「ジップコード」と称され、全てが、ステム－ループ構造上に存在するＣＵＧＣＣコア配列を利用する（Bolukbasi, et al. 2012）。

国際公開第２０１８／２０９１８２号パンフレットには、エクソソームへと選択的にソートし、カーゴをエクソソームへと送達することができる、「ＥＸＯコード」と呼ばれる特定のＲＮＡ配列について記載されている。Sutaria et al (2017)には、細胞外小胞へのＴＡＲ ＲＮＡループの搭載を増強するための、ＴＡＴペプチド／ＨＩＶ－Ｉトランス活性化反応（ＴＡＲ）ＲＮＡ相互作用ペプチドの使用について記載されている。国際公開第２０１９／２２６６０３号パンフレット、国際公開第２０１９／２０４７３３号パンフレット、および国際公開第２０１５／１８３６６７号パンフレットには、ハイブリッドｔＲＮＡ－ｍｉＲＮＡステム－ループ構造について記載されている。これらの操作されたキメラ核酸は、細胞または患者への送達のために合成リポソーム内またはナノ粒子内にパッケージングすることができる。

まとめると、細胞タイプにわたる全般的有用性のために十分に効率的に機能する、エクソソーム生合成の際にエクソソームに外因性ヌクレオチド配列を搭載するための明確な統一的な配列または決定因子は存在しない（Yoo, et al. 2018）。

国際公開第２０１７／０５４０８５号パンフレットには、改変されたｐｒｅ－ｍｉＲ－４５１構造的ミミックを含む発現ベクターを使用してｍｉＲＮＡをエクソソームに搭載する方法について記載されている。米国特許第８，２７３，８７１号明細書およびYang, et al. 2010にも、ｐｒｅ－ｍｉＲ－４５１の特異な特性について記載されている。この技術は、Ａｇｏの低発現レベルを有するかまたは好ましくはＡｇｏを発現しない細胞株、ならびに、好ましくは天然において高レベルのｍｉＲ－４５１を産生するもの、および／またはＤＩＣＥＲによる切断を必要としないｍｉＲＮＡを必要とする。国際公開第２０１７／０５４０８５号パンフレットによって説明されるベクターにおいて、ステムｍｉＲＮＡおよびループは、配列にかかわらず、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの長さを維持する、設計されたヌクレオチド配列によって置き換えられる。著者らは、ループの配列にかかわらず、ｍｉＲＮＡの正しい長さを維持することが、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをプロセシングするための切断部位を維持するはずであると主張している。これとは逆に、Ｇｕら（Cell 151. 900-911 November 9 2012）は、ループの配列は、ｍｉＲＮＡの正しいプロセシングにとって重要ではないが、ループとｍｉＲＮＡの配列との間の距離は、ｍｉＲＮＡを放出させるためにｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの正しい切断を生じるためだけではなく、生成されたｍｉＲＮＡの不適切な形態の非特異的認識に起因する任意のオフターゲット効果を避けるためにも、重要であると報告した。したがって、ｍｉＲＮＡの正しいプロセシングは、正しい長さだけではなく、正しい機能も有する分子を得るための基本的ステップである。

その上、安定したＲＮＡ－タンパク質複合体を形成するためのＲＢＰによるＲＮＡヘリックス（Ａ形態またはＢ形態）の正確な認識は、天然に存在するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにおいて観察される非ワトソン－クリックゆらぎＧ－Ｕ対（non-Watson-Crick wobble G-U pair）に依存し得る。大きなＲＮＡ－タンパク質複合体の三次元構造に関する研究は、ゆらぎＧ－Ｕ対は、重要な構造エレメントであり、ＲＮＡの天然の折り畳みおよびＲＢＰによるその認識を可能にするように、ＲＮＡの深い溝を歪ませることを調査した。これらの三次元研究は、特定のＲＢＰによって認識されるべきにｍｉＲＮＡに異なる空間的コンフォメーションを与える他の塩基対も特定した（Arachchilage et al. 2015）。これにもかかわらず、先に説明したアプローチのいずれも、ループ構造またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列などｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの一部における非標準Ｇ－Ｕゆらぎ対の機能的重要性を考慮していない。

予測可能で効率的で制御可能な方式において目的のヌクレオチド配列をエクソソームに搭載できることが依然として必要とされている。

本発明は、ＭＩＲ２１、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１、およびｐｒｅ－ｍｉＲ－２１のそれぞれが、外因性ヌクレオチド配列をエクソソーム内へと送達するために利用することができる特性を有するという驚くべき発見に基づいている。

一部において、本発明は、遺伝子ＭＩＲ２１が、ｍｉＲＮＡ発現を制御するために利用することができ、外因性ヌクレオチド配列をエクソソーム内へと送達するためにも利用することができる、ｍｉＲ－２１の５’および３’フランキング領域における調節配列を含むという驚くべき発見に基づいている。特に、本発明者らは、ＭＩＲ２１プロモーターは、例えば、転写活性化、他のｍｉｃｒｏＲＮＡの使用、抗ｍｉＲ、または組換え遺伝子操作において現在採用されている任意の他の技術によって、細胞特異的および／または刺激特異的方式において調節することができることを見出した。この調節は、実施例において実証されるように、転写因子ｃ－Ｍｙｃの発現を伴うメカニズム（または複数のメカニズム）によって行われ得る。本発明者らは、ｍｉＲ２１の発現のリプレッサーとして機能するｍｉＲ２１までの５’上流配列における領域も特定した。したがって、特定された調節配列の機能の制御（例えば、存在または不在）を使用することにより、エクソソーム内への外因性ヌクレオチド配列の送達を制御することができる。

したがって、ＭＩＲ２１遺伝子の上流領域および下流領域に位置する調節エレメントの１つまたは複数を使用することにより、エクソソームへのｍｉＲＮＡの搭載を制御することができる。任意のｍｉＲＮＡ（または他の目的の核酸）は、所望の調節領域を操作することによって、搭載および制御することができる。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、ｍｉＲ－２１ヘアピンに対して－３，７７０塩基対から－３，３３７塩基対上流におけるｐｒｉ－ｍｉＲ－２１に見出されるｍｉＰＰＲ－２１プロモーター領域の全てまたは一部を含む。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１由来のリプレッサーを含む。いくつかの実施形態において、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１由来のリプレッサーは、削除されるかまたは不活性化される。これらのｍｉＲＮＡ搭載調節エレメントの特定は、さらに、いくつかの実施形態において、これらのエレメントを含むプロデューサー細胞を、調節エレメントに結合する転写因子または他の因子と接触させることによって、エクソソームへのｍｉＲＮＡの搭載を駆動することを可能にする。ある特定の実施形態において、部位特異的ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を使用することにより、所望の外因性ＲＮＡ配列、例えば、成熟ｍｉＲＮＡ配列をＭＩＲ２１遺伝子座に追加または挿入することができ、したがって、任意の所望のｍｉＲＮＡ配列（または他の核酸カーゴ）に対してＭＩＲ２１制御およびエクソソーム搭載メカニズムを利用することができる。これは、エクスビボまたはインビボにて、細胞において発現させることができる。さらなる実施形態において、ＲＮＡカーゴと共にｐｒｉ－および／またはｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐ調節エレメントを含むコンストラクトは、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含むように操作され得、エクスビボにおいて合成することができ、細胞内へとトランスフェクトすることができるか、またはインビボにおいて治療用または遺伝子送達ビヒクルとして使用することができるる。

その上、本発明者らは、外因性ＲＮＡカーゴを含む操作されたＲＮＡの発現は、いくつかの特定された転写因子によって調節することができ、それにより、ある程度の細胞特異的発現を付与することができ、それにより、そのような識別された転写因子を発現する細胞は、そのような転写因子を発現しない細胞より多くのカーゴＲＮＡを転写するであろうと考慮する。このことは、ある特定の疾患状態、例えば、これらの転写因子を上方調節し得るがんなどにおいて興味深くあり得る。

その上、本発明者らは、エクソソームパッケージングにとって重要であり、エクソソーム内へ外因性ヌクレオチド配列を送達するために利用することができる、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１ステムおよびループ配列内に含まれるいくつかのゆらぎ対、ミスマッチ、および欠失が存在することを特定した。これらのエクソソームは、その後に治療利用され得るか、またはレシピエントまたは標的細胞への組換えＲＮＡまたは外因性ＲＮＡのための送達システムとして、インビトロにおいて使用され得る。本発明者らは、さらに、ＭＩＲ２１の正しい発現のための安定化配列として機能するｍｉＲ２１の３’下流配列における領域も特定している。理論に束縛されるわけではないが、ｍｉＲ－２１－５ｐのこれらの構造的特徴は、正しいプロセシング、空間的折り畳み、およびエクソソーム内へのこれらの小さな非コードヌクレオチドのソーティングにとって重要であると考えられる。

したがって、目的のヌクレオチド配列は、天然の成熟ｍｉＲ－２１ ｍｉＲＮＡ配列の代わりに、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ－２１またはｐｒｅ－ｍｉＲ－２１配列内に挿入することができ、エクソソーム内へ送達されると予想することができる。

したがって、本発明は、外因性ヌクレオチド配列を含むように改変された、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１またはｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の一次、二次、および／または三次構造に基づいて、核酸コンストラクトを提供する。このコンストラクトは、エクソソームに選択的に搭載するために有用である。このコンストラクトは、リボ核酸カーゴ、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、抗ｍｉＲ、モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）、および小さいｍＲＮＡなどをエクソソームに搭載するために特に有用である。そのような遺伝子操作は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｚｎフィンガーエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、および当技術分野で一般的に知られているプライム編集などを使用する遺伝子編集技術によって達成することができる。

ある特定の実施形態において、改変されたｐｒｉ－またはｐｒｅ－ｍｉＲ－２１は、典型的には、外因性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）の正しいプロセシングを駆動するための制御されたメカニズムによって任意の細胞における外因性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）の発現を可能にするために、ｍｉＲ２１－５ｐのためのＲＮＡの発現のプロモーター領域；リプレッサー；エンハンサー；および／または安定化剤；のうちの１つまたは複数を含む。

いくつかの実施形態において、改変された配列は、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）によるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの認識を可能にするようにＲＮＡの深い溝を歪めると考えられる、ゆらぎ対も含む。これらのＲＢＰは、典型的には、エクソソーム膜に位置するセラミドに対して高い親和性を有する。したがって、天然のｐｒｉおよび／またはｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の構造的および機能的特徴を維持することによって、目的のヌクレオチド配列は、制御された発現メカニズムによってエクソソームへと標的化することができる。

本発明の第１の態様は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを提供し、その場合、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ステムループ構造を含み、当該ステムは、少なくとも１つのゆらぎ対を含む。

本発明の別の態様は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの発現のためのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを提供する。当該ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの発現は、典型的には、プロモーター領域によって駆動され、調節配列および安定化配列を含み、この場合、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ステムループ構造を含み、当該ステムは、少なくとも１つのゆらぎ対を含む。典型的には、当該発現は、制御可能であり、および／または高レベルである。

本発明の別の態様は、エクソソームに対して外因性配列を標的化するために、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の天然配列を外因性ヌクレオチド配列によって置き換えるように遺伝子改変することができる遺伝子座としてＭＩＲ２１を提供する。そのような遺伝子操作は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｚｎフィンガーエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、および当技術分野で一般的に知られているプライム編集などを使用する遺伝子編集技術によって達成することができる。

改変されたｐｒｉ－および／またはｐｒｅ－ｍｉＲ－２１は、ミスマッチおよび欠失も含み得、それらは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの三次元構の判別を支援し、結果として、ＲＢＰによる認識を促進するとも考えられる。ある特定の実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ゆらぎ対を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端；および／または１つまたは複数の欠失および／またはミスマッチを含む外因性ヌクレオチド配列；および／またはループおよびゆらぎ対を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端をさらに含む。

いくつかの実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ステムに１つまたは複数のゆらぎ対を有するステム－ループ二次構造を含み得る。本発明の実施形態において、当該ゆらぎ対は、１から５ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長であり得る。

別の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ステムに１つまたは複数の塩基対ミスマッチを含むステム－ループ二次構造を含み得る。これらのミスマッチ塩基対は、ステム内に不対領域を生じさせる。いくつかの実施形態において、ミスマッチ領域は、１から５ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長であり得る。ミスマッチは、図５Ｂにおいてハッシュ（♯）でマークされた位置に示される。

別の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ステムに１つまたは複数の塩基欠失を含むステム－ループ二次構造を含み得る。いくつかの実施形態において、当該欠失は、１から５ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長であり得る。典型的には、欠失は、ステムにおけるその反対側に、対応する塩基が存在しない１つまたは複数のヌクレオチドをステム領域に残す（すなわち、ステム二重鎖の真半分は、異なる長さである）。これは、例えば、二重鎖の片方は２０ヌクレオチドを有し、他方は２２ヌクレオチドを有するといったように、非対称ステム二重鎖として見ることができる。欠失は、図５Ｂにおいてアスタリスク（＊）によってマークされた位置に示される。

本発明に従って、任意の好適な外因性ヌクレオチド配列を用いることができる。この配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１における天然の成熟ｍｉＲ－２１の全てまたは一部が置き換えられるため、外因性である。典型的には、当該外因性配列は、ＲＮＡである。それは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド上に存し得る。それは、典型的には、一本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、遺伝子編集での使用のためのＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにおける外因性ヌクレオチド配列は、１９～２５ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列の長さは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。本発明のさらなる実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのためのヌクレオチド配列、または任意の他の外因性ヌクレオチド配列である。例示的実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、成熟ｍｉＲ－２１ではなく、場合により、２１、２２、または２３ヌクレオチドからなる少なくとも１つの鎖を含む二重鎖を含む、成熟ｍｉＲである。一実施形態において、当該外因性配列は、図５Ｂに示されるように、ｍｉＲ－２１の２０／２２非対称ヌクレオチド構造を有する。

ある実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、１から５ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長のゆらぎ対；および／または１から５ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長のミスマッチ；および／または１から５ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の欠失；および／または１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長の外因性ヌクレオチドを含む。

ある特定の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、４、５、６、７、８、または９ヌクレオチドのループ長全体を含むステム－ループ二次構造を含む。一実施形態において、当該ループは、７ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、当該ループ構造は、配列５’－ＣＵＣＵＡＡＧ－３’を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、２５から３５ヌクレオチド、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチドのステム長全体を含むステム－ループ二次構造を含み得る。

ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの構造は、そのエクソソームパッケージングにとって重要であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、当該改変されたｐｒｅ－ｍｉＲ－２１は、天然ｍｉＲ２１－５ｐの一次、二次、および／または三次構造と構造的に類似する。

本発明のある特定の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで、Ａは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であり、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の５’末端に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％配列同一性を含み；Ｂは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１において天然には見出されない外因性ヌクレオチド配列であり；Ｃは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であり、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の３’末端に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％配列同一性を含み、場合により、全ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の全配列に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上の全配列同一性を含む。

「５’末端」によって、成熟ｍｉＲＮＡ／外因性配列に隣接する、非ループ（開放）末端におけるステム二重鎖の両方の鎖上の配列が意味される。これは、図５Ｂに示される。典型的には、当該５’末端配列は、二重鎖の各鎖上の７から９ヌクレオチドを含む。典型的には、当該５’末端配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ二重鎖の各側における８ヌクレオチド長である。

「３’末端」によって、ループと成熟ｍｉＲＮＡ／外因性配列に隣接する部位とを含む二重鎖の末端が意味される。３’末端は、ループ構造と少なくとも１つまたは２つのゆらぎ対を含む。３’末端は、図５Ｂに３’－ループとして標識される。

本発明の特定の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックは、下記を含み：

ここで、
Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし；
Ｎ_Ｘは、ｎとハイブリダイズするヌクレオチド配列の任意の長さであり、場合により、Ｎ_ｘ１、Ｎ_ｘ２、およびＮ_ｘ３は、異なる長さを有し；
Ｍは、ヌクレオチドであり、ミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
Ｄは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し；
Ｗは、ヌクレオチドであり、ｗとゆらぎ対を形成し；
Ｌは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、ｌとハイブリダイズし得；
Ｌ_ｘは、１～５ヌクレオチドであり得、
［…］は、ｍｉＲ－２１ ５’末端構造的ミミックであるＡであり；
｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
（…）は、ｍｉＲ－２１ ３’末端構造的ミミックであるＣである。

いくつかの実施形態において、Ｌ_ｘは、４、５、６、７、８、または９ヌクレオチドを含む。一実施形態において、ループは、７ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、ループ構造は、配列５’－ＣＵＣＵＡＡＧ－３’を含むかまたはそれからなる。

本発明のある特定の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、下記の構造を有し：

ここで、
Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし、
Ｎ_Ｘは、ｎとハイブリダイズするヌクレオチド配列の任意の長さであり、場合により、Ｎ_ｘ１、Ｎ_ｘ２、およびＮ_ｘ３は、異なる長さを有し；
Ｍは、ヌクレオチドであり、ｍとミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
Ｄは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し；
Ｗは、ヌクレオチドであり、ｗとゆらぎ対を形成し；
Ｌは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、ｌとハイブリダイズし得；
当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：
［…］は、ｍｉＲ－２１ ５’末端構造的ミミックであるＡであり；
｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
（…）は、ｍｉＲ－２１ ３’末端構造的ミミックであるＣである。

任意の好適な外因性ヌクレオチド配列（Ｎ_ｘ）は、本発明に従って用いることができる。いくつかの実施形態において、Ｎ_ｘは、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態において、Ｎ_ｘ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド長であり；および／またはＮ_ｘ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド長であり；および／またはＮ_ｘ３は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド長であり；またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、Ｎ_ｘ１は、４から１２ヌクレオチドを含み；および／またはＮ_ｘ２は、２から８ヌクレオチドを含み；および／またはＮ_ｘ３は、２から８ヌクレオチドを含み；またはそれらの任意の組み合わせである。典型的には、Ｎ_ｘ１は、７、８、または９ヌクレオチド長であり、および／またはＮ_ｘ２は、４、５、または６ヌクレオチド長であり、および／またはＮ_ｘ３は、４、５、または６ヌクレオチド長であり、あるいはそれらの任意の組合せである。一実施形態において、Ｎ_ｘ１は、８ヌクレオチド長であり、Ｎ_ｘ２は、５ヌクレオチド長であり、Ｎ_ｘ１は、５ヌクレオチド長である。

本発明の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、全体の長さが約６０から８０ヌクレオチド長を有するステムループ二次構造を含み、場合により、当該外因性ヌクレオチド配列は、１９～２５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、当該ステム－ループ二次構造は、全体の長さが約６０、６５、７０、７５、または８０ヌクレオチド長を含み得る。典型的には、成熟ｍｉＲＮＡ内へのプロセシングのために必要な切断部位は、保持される。

ある特定の実施形態において、ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、下記の構造を含み：

ここで：
Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし；
Ｍは、ヌクレオチドであり、ｍとミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
Ｄは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し；
Ｗは、ヌクレオチドであり、ｗとゆらぎ対を形成し；
Ｌは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、ｌとハイブリダイズし得；
当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：
［…］は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であるＡであり；
｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
（…）は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であるＣである。

いくつかの実施形態において、本発明は、成熟ｍｉＲＮＡではないｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと、成熟ｍｉＲＮＡの代わりの外因性核酸とを提供する。

いくつかの実施形態において、ゆらぎ対（Ｗ－ｗ）は、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）、ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－ＵまたはＵ－Ｉ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－ＡまたはＡ－Ｉ）、および／またはヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－ＣまたはＣ－Ｉ）を含む。いくつかの実施形態において、当該ゆらぎ対は異なる。例えば、１つまたは複数のゆらぎ対は、任意の順序および任意の組み合わせにおいて、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）、ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－ＵまたはＵ－Ｉ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－ＡまたはＡ－Ｉ）、および／またはヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－ＣまたはＣ－Ｉ）を含み得る。他の実施形態において、当該ゆらぎ対は、同じであり、例えば、すべて、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）、ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－ＵまたはＵ－Ｉ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－ＡまたはＡ－Ｉ）、あるいはヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－ＣまたはＣ－Ｉ）である。典型的には、当該ゆらぎ対は、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）を含む。

ある特定の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、下記の構造を含み：

ここで：
Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし；
Ｍは、ヌクレオチドであり、ｍとミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
Ｄは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し；
当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：
［…］は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であるＡであり；
｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
（…）は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であるＣである。

疑義を避けるため、この実施形態における５’末端、外因性配列、および３’末端は、以下の通りである：

別の実施形態において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、下記の構造を含み：

ここで：
Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし；
Ｍは、ヌクレオチドであり、ｍとミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
Ｄは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し；
当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：
［…］は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であるＡであり；
｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
（…）は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であるＣである。

任意の好適な外因性ヌクレオチド配列を、本発明に従って用いることができる。本発明のさらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのためのヌクレオチド配列、または任意の他の外因性ヌクレオチド配列である。本発明のさらなる実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１４６－ｂまたはｍｉＲ－１２４６、あるいは任意の選択されたｓｉＲＮＡのｓｈＲＮＡ同等物である。典型的には、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡである。

いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトは、エクソソーム生合成の際に、エクソソームに対して標的化される。

いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の下方調節を生じる。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少させる。典型的には、遺伝子発現は、６０％から１００％減少する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上増加させる。典型的には、遺伝子発現は、６０％から１００％増加する。遺伝子活性のモジュレーションは、ウェスタンブロット、ｑＰＣＲ、蛍光レポーターアッセイ、またはルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して評価することができる。あるいは、遺伝子活性のモジュレーションは、治療成果を測定することによって、典型的には、目的の疾患の症状を改善することによって、評価することができる。

ある実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、時にはｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックと称され、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の生物学的機能を保持する。「ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミック」は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１と実質的に構造的および／または機能的に類似するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡである。ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックは、配列は異なり得るが、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の１つまたは複数の生物学的機能を維持する。「１つまたは複数の生物学的機能を維持する」によって、当該ミミックが、問題の生物学的機能の少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％を保持することが意味される。特定の実施形態において、問題の生物学的機能は、エクソソームへのｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックのソーティングであり得る。この実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、配列は異なり得るが、天然のｍｉＲ２１－５ｐと構造的および／または機能的に類似する一次、二次、および／または三次構造を共有し、それにより、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１のレベルの少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％でエクソソームにパッケージングされる、ｍｉＲＮＡである。精製されたエクソソームに存在する外因性ヌクレオチド配列の量は、ｑＰＣＲを使用して定量化することができる。

別の実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の結合親和性の少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％の結合親和性でＲＢＰに結合することができるような構造的および／または機能的に類似する一次、二次、および／または三次構造を共有する。別の実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の結合親和性の少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％の結合親和性でｍｉＲＮＡプロセシング酵素に結合することができるような構造的および／または機能的に類似する一次、二次、および／または三次構造を共有する。ｍｉＲＮＡプロセシング酵素の例としては、Ｒａｎ－ＧＴＰ、エクスポーチン－５、およびＤｉｃｅｒが挙げられる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの結合親和性は、例えば、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、および表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定することができる。他の好適な技術としては、ＲＢＰへのｍｉＲＮＡの結合を特異的に検出するため、またはＲＮＡ－免疫沈降アッセイ（ＲＩＰ－ＣｈＩＰアッセイ）を実施するための、場合により古典的ＩＨＣ／ＩＣＣを伴う、ＦＩＳＨ／ＳＣＯＰＥが挙げられる。

エクソソーム中にまさにＲＮＡが存在することを検出するためには、ＦＩＳＨ／ＳＣＯＰＥおよび／またはｑＰＣＲは好適である。

いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐの配列に対して少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、またはそれ以上の配列同一性を含む。操作されたｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の三次元構造を模倣し、それにより、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１のようにエクソソーム生合成の際に、エクソソーム中へと標的化されることが意図される。これは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックと称される。

ある特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐの長さ、ゆらぎ対、ミスマッチ、および欠失に関して、成熟ｍｉＲ２１－５ｐのステムの天然の一次、二次、および／または三次構造を保持し得る。別の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、成熟ｍｉＲ－２１－５ｐのステムの天然構造に存在する下記の特徴：ｍｉＲ－２１－５ｐの長さ全体；および／またはゆらぎ対；および／またはミスマッチ；および／または欠失を含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲ－２１－５ｐより長いかまたは短く、および／または外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲ－２１－５ｐと比較して、増加または減少した数のゆらぎ対を含み、および／または外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲ－２１－５ｐと比較して、増加または減少した数のミスマッチ塩基対を含み、および／または外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲ－２１－５ｐと比較して、増加または減少した数の欠失を含む。

本発明の第２の態様において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含むカセットが提供される。いくつかの実施形態において、当該カセットは、以下：５’ｐｒｉ＿ｍｉＲ－２１配列；前記請求項のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ；および３’ｐｒｉ＿ｍｉＲ－２１配列を（その順番で）含む。

ある特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ発現カセットは、ｐｒｉ－およびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの元の配列および長さ、例えば、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１内のループ、ミス対、ゆらぎ対、および塩基対合の欠如などを保存する。

例示的実施形態において、カセットは、遍在するプロモーター領域；細胞特異的プロモーターあるいは特定のおよび／または選択された転写因子結合部位を有するプロモーター；ｍｉＲＮＡの５’上流配列中のエンハンサーまたはリプレッサー；ならびに／あるいはｍｉＲＮＡの３’下流配列中の３’エンハンサー、リプレッサー、または安定化配列を含む。

いくつかの実施形態において、天然のｍｉＲ－２１リプレッサー配列は、存在しないかまたは機能的ではない。

本発明の一実施形態において、本発明者らは、ｐｒｉ－およびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの元の配列および長さ、例えば、元の天然に存在するｍｉＲＮＡ内のループ、ミスマッチ対、ゆらぎ対、および塩基対合の欠如などを保存するｍｉＲＮＡ発現カセットを設計および生成した。これは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１エクソソームのシャトリング配列および機能を利用するミミックによって生成された当該構造を維持することが意図される。

本発明の第３の態様は、本発明のカセットまたは本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドベクターのｐＥＦ１－α、ｐＴＫ、ｐＣＡＧ、ｐＳＶ、およびｐＣＭＶシリーズ、ワクシニア、およびレトロウイルスベクター、ならびにバキュロウイルスを包含する。特定の実施形態において、本発明のベクターは、レンチウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、当該ベクターは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ＣＡＧ、ＥＦ１－α、ＴＫ、およびＳＶ４０のためのプロモーターを含む。

本開示の第４の態様は、本開示のベクター、カセット、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、あるいは遺伝子改変された遺伝子座を含む細胞を提供する。使用することができる細胞は、特に制限されておらず、ならびに技術者は、広範な細胞を使用することができることに気付くであろう。いくつかの実施形態において、当該細胞は、幹細胞または樹状細胞である。いくつかの実施形態において、当該細胞は、幹細胞、場合により神経幹細胞または間葉細胞である。特定の実施形態において、当該細胞は、神経幹細胞である。さらなる実施形態において、当該細胞は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞である（アクセッション番号０４０９１６０１において出願人によってＥＣＡＣＣに寄託された）。別の実施形態において、当該細胞は、場合により一部が分化した幹細胞である。当該ベクターは、ベクターまたは核酸を細胞内に導入する任意の公知の方法によって、細胞内に導入することができる。そのような方法としては、これらに限定されるわけではないが、カチオン性脂質試薬を使用するトランスフェクション、エレクトロポレーション法、およびウイルス性形質導入が挙げられ得る。

第５の態様は、外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載する方法であって、本発明のコンストラクトを含む細胞からエクソソームを産生するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、特定のｓｉＲＮＡの細胞内産物をコードするｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または遺伝子編集のためのモルホリノ、ｓｇＲＮＡ、またはガイドＲＮＡを含む、オリゴヌクレオチドをサイレンシングまたは改変する任意の遺伝子の搭載を可能にする。さらなる実施形態において、本発明は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド鎖、および任意の他の一本鎖ＲＮＡ分子などの任意の遺伝子編集ツールの搭載を可能にする。特定の実施形態において、当該ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。「搭載される」によって、エクソソーム内に、エクソソームの表面に、およびエクソソームの膜に、「搭載される」ことが意味される。エクソソーム内に搭載する、は、エクソソーム内部に、すなわち、内腔に搭載することであり得る。

本発明のさらなる態様において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡを含むエクソソームを調製する方法が提供される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡを含むエクソソームを調製する方法は、細胞を培養するステップおよび馴化培地の回収ステップを含む。ある実施形態において、当該方法は、エクソソームの精製およびエクソソームの検証の随意的なステップをさらに含む。さらなる実施形態において、当該方法は、細胞を培養するステップ、馴化培地の回収ステップ、ならびに、場合により精製ステップ、ならびに、場合によりエクソソームの検証ステップを含む。いくつかの実施形態において、当該方法から得られるまたは得ることができるエクソソームが提供される。理解されるように、エクソソームまたはエクソソーム様小胞は、当技術分野において公知の任意の方法によって精製され得る。

本発明の第７の態様は、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含むエクソソームを提供する。本発明のさらなる実施形態において、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのためのヌクレオチド配列を含む外因性ヌクレオチド配列、あるいは他の外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１４６－ｂまたはｍｉＲ－１２４６、あるいは特定のｓｉＲＮＡの細胞内産物をコードするｓｈＲＮＡであり得る。典型的には、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡである。

本発明のさらなる態様は、本発明に従って産生された成熟ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームを使用して、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達する方法を提供する。ある実施形態において、当該方法は、標的細胞をｍｉＲＮＡ搭載エクソソームに接触させるステップを含む。さらなる実施形態において、当該方法は、場合により、第１に、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを介するｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームを単離することを含むステップ、および第２に、標的細胞をｍｉＲＮＡ搭載エクソソームに接触させることを含むステップを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞とｍｉＲＮＡ搭載エクソソームとの接触ステップは、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、２４時間、またはそれ以上の間である。別の実施形態において、当該接触ステップは、３７℃において行われる。

本発明の第９の態様は、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする方法であって、本発明に従って生成された、ＲＮＡを含むエクソソームを投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の下方調節を生じる。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現の下方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少させる。典型的には、遺伝子発現は、６０％から１００％減少する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上増加させる。典型的には、遺伝子発現は、６０％から１００％増加する。遺伝子活性のモジュレーションは、ウェスタンブロット、ｑＰＣＲ、蛍光レポーターアッセイ、またはルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して評価することができる。あるいは、遺伝子活性のモジュレーションは、治療成果を測定することによって、典型的には、目的の疾患の症状を改善することによって、評価することができる。

本発明のさらなる態様は、本発明の搭載済みエクソソームを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される組成物は、典型的には、本発明のエクソソームに加えて、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル、および／または賦形剤を含む。

本発明の別の態様は、治療法における使用のために本発明の方法に従って生成されたＲＮＡカーゴを含むエクソソームを提供する。当該治療法は、細胞遊走の阻害を必要とする疾患、例えば、がん、線維症、アテローム性動脈硬化症、または関節リウマチなどの療法であり得る。当該治療法は、神経系疾患、眼疾患、難聴、炎症、がん、またはウイルス感染の療法であり得る。当該治療法は、脈管形成の阻害を必要とする疾患の治療法、例えば、血管新生を阻害することによる固形腫瘍の治療でもあり得る。いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子療法における使用のためのｍｉＲＮＡ搭載エクソソームを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、疾患を引き起こす点突然変異を編集すること、不適切に機能している突然変異遺伝子を不活性化（「ノックアウト」）すること、および／または疾患との戦いを支援するために新規の遺伝子を身体に導入することによる遺伝子療法を提供する。遺伝子療法によって治療することができる疾患の例としては、これらに限定されるわけではないが、嚢胞性繊維症、重症複合型免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫性障害（ＣＧＤ）、血友病、レーバーの先天性黒内障（ＬＣＡ）、がん、パーキンソン病、およびハンチントン病が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該遺伝子療法は、ガイドＲＮＡを含む本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲゲノム編集によって媒介される。

遺伝子ＭＩＲ２１を含む新規のプラスミド。この図は、遺伝子ＭＩＲ２１を含む新規のプラスミド（図１Ａに示される）が、ＨＥＫ細胞において、基底発現レベルは非常に低いにもかかわらず、２つの異なる細胞（ＨＥＫおよびＣＴＸ、図１Ｂ～１Ｄを参照されたい）において活性であることを示している。 遺伝子ＭＩＲ２１を含む新規のプラスミド。この図は、遺伝子ＭＩＲ２１を含む新規のプラスミド（図１Ａに示される）が、ＨＥＫ細胞において、基底発現レベルは非常に低いにもかかわらず、２つの異なる細胞（ＨＥＫおよびＣＴＸ、図１Ｂ～１Ｄを参照されたい）において活性であることを示している。 ＭＩＲ２１プラスミドは、異なる調節配列を含む。この図は、ＭＩＲ２１プラスミドが、ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート）およびｃ－ｍｙｃによって活性化することができるプロモーター領域に、異なる調節配列を含むことを示している。それは、少なくともリプレッサー配列を含む５’領域に他の配列が存在すること、ならびにｍＲＮＡのレベルをｍｉＲＮＡに対して制御も行う３’領域に安定化配列が存在することも示している。 ＭＩＲ２１プラスミドは、異なる調節配列を含む。この図は、ＭＩＲ２１プラスミドが、ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート）およびｃ－ｍｙｃによって活性化することができるプロモーター領域に、異なる調節配列を含むことを示している。それは、少なくともリプレッサー配列を含む５’領域に他の配列が存在すること、ならびにｍＲＮＡのレベルをｍｉＲＮＡに対して制御も行う３’領域に安定化配列が存在することも示している。 ハイブリッドカセットの構築の実施例。本発明者らは、搭載されたｍｉＲＮＡの３Ｄ構造に依拠する認識を有することが重要であり得ることを示している。３Ｄ構造は、ｍｉＲＮＡに存在する内部ループに依存する。 ｍｉＲＮＡのためのビヒクルとしてのエクソソーム：ｍｉＲ－２１－５ｐカセットおよび構造をベースとするｍｉＲＮＡ。エクソソームは、ｍｉＲＮＡのための天然のビヒクルである。本発明者らは、蛍光タンパク質Ｒｕｂｙ２に対抗する設計されたｍｉＲＮＡを運ぶために、ｍｉＲ２１－５ｐのための配列を改変した。これは、任意のｍｉＲＮＡをエクソソーム内に導入するために使用することができる。Ａ）ｍｉＲ－２１－５ｐカセットおよび構造、Ｂ）エクソソームに搭載されたｍｉＲ－２１構造的ミミック。 エクソソームにおける治療用ＲＮＡの発現および搭載のためのｍｉＲ－２１ベースのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡカセットの設計。（Ａ）ゆらぎ対は、ＲＮＡヘリックスに異なる三次元構造を付与する（出典Varani and McClain, EMBO Reports, 2000）。（Ｂ）ＲＢＰによるその認識およびプロセシングを保存するために、設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２の配列において維持されるいくつかのゆらぎＧ－Ｕ対（有色のボックス）、欠失（＊）、およびミスマッチ（♯）を含むｐｒｅ－ｍｉＲ２１－５ｐの天然構造。（Ｃ）ｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２カセットの構造、および（Ｄ）プロモーターＥＦ－１αおよびＣＡＧ、ブラストサイジン（ＢＳＤ）のための選択遺伝子、およびリポーター遺伝子Ｃｌｏｖｅｒを含む改変されたレンチウイルスベクター上のその位置。ｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２カセットは、コード配列の３’ＵＴＲ配列としてベクターにクローニングした。 機能的ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２がプロデューサー細胞株のエクソソームに搭載される。（Ａ）ｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２カセットを含むベクターによってエレクトロポレーションされた細胞上でのｑＰＣＲによる成熟ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２の発現レベル。（Ｂ）Ｃｌｏｖｅｒ（＊）を発現する制御プラスミドまたはｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２カセットおよび蛍光タンパク質Ｃｌｏｖｅｒ（矢尻）を含むプラスミドによってエレクトロポレーションされたＨＥＫ２９３－Ｒｕｂｙ２細胞。（Ｃ）ｑＰＣＲによって特定された対照細胞株と比較した、ＨＥＫ２９３－ｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２細胞由来のエクソソームに搭載されたｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２のレベル。（Ｄ）タンパク質の発現レベル、および（Ｅ）ＨＥＫ２９３－Ｒｕｂｙ２および対照細胞の共培養アッセイ、またはｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２を発現するＨＥＫ２９３を用いた共培養アッセイにおけるＲｕｂｙ２のためのｍＲＮＡ。

本発明者らは、エクソソーム搭載において特定の機能を有する特定のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡに注目した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、ＭＩＲ２１遺伝子の配列内に、成熟ｍｉＲ２１－５ｐの発現にとって重要であるいくつかの調節配列が存在することを特定した。調節配列は、ｐｒｅ－およびｐｒｉ－ＭＩＲ２１領域の両方において特定される。さらに、ｍｉＲ－２１－５ｐの周辺配列内にも、いくつかのゆらぎ対、ミスマッチ、および欠失が存在する。これらの特徴は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステムおよびループ配列内に含まれ、エクソソームパッケージングにとって重要であるとして特定されている。ｍｉＲ－２１－５ｐの構造的特徴は、正しいプロセシング、空間的折り畳み、およびエクソソームへのこれらの小さな非コードヌクレオチドのソーティングにとって重要であることが分かっている。さらに、正しいプロセシング、空間的折り畳み、およびエクソソームへのこれらの小さな非コードヌクレオチドのソーティングは全て、ＡｇｏおよびＤｉｃｅｒの存在下または不在下において生じ得ることも特定されている。

したがって、本発明は、エクソソームへの搭載、例えば、ｓｓＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡの搭載を制御するための、ＭＩＲ２１遺伝子の上流および下流領域に位置する１つまたは複数の調節エレメントの使用を提供する。

したがって、本発明は、エクソソーム内への外因性ヌクレオチド配列の標的化のためのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ足場も提供する。目的の外因性オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを特定された足場に加えることにより、本発明の足場は、エクソソームプロデューサー細胞を遺伝子改変することによって、任意の目的の外因性ヌクレオチド配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、ＡＳＯ、またはＣＲＩＳＰＲガイド鎖）をエクソソームに搭載する可能性を有する。本発明は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡカセットも提供し、これは、先行技術において説明されるような、エクソソーム搭載のためのエクソソーム標的化モチーフによるｍｉＲＮＡの直接的なタグ付けを必要としないという利点を有する。このカセットは、細胞株に応じて外因性ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ）の発現を調節するように、あるいはその発現を一時的に制御するために、改変することができる。さらに、本発明は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１またはその一部を、その発現を維持しエクソソーム内に搭載する他の核配列によって置き換えるために、例えば、遺伝子編集を使用して、ＭＩＲ２１の内因性染色体座を改変する能力も提供する。

その上、本発明は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの標準的なプロセシングに関与する任意のタンパク質マシナリーを欠く細胞株の使用を必ずしも必要としない。理論に束縛されるわけではないが、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の三次元構造を維持することにより、ＲＢＰによる認識にとって有利であり、結果として、プロセシング、産生、およびエクソソームへの外因性ヌクレオチド配列の搭載を生じることは理解されよう。

本発明は、任意の目的のヌクレオチド配列を搭載したエクソソームを生成するために、任意のプロデューサー細胞を改変するための方法を提供する。次いで、本発明の精製されたエクソソームは、治療法での使用のためにインビボにおいて全身的にまたは局所的に使用することができる。目的のヌクレオチド配列を含むエクソソームは、裸の外因性ヌクレオチド配列と比較して、改善された体内分布、全身的安定性、および改善された標的組織取り込みを提供する。

予め精製され単離されたエクソソームに外因性ヌクレオチド配列を直接搭載する方法は、当該分野において既知である。しかしながら、これらの方法は、非常に効率が悪く、さらに非修飾ｓｉＲＮＡでは再現可能ではなく、搭載のための現在の方法（例えば、エレクトロポレーションまたはリポフェクション）を使用してスケールアップするのが困難であることがわかっている。本発明者らは、エクソソームへと目的の外因性ヌクレオチド配列を標的化するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターによってプロデューサー細胞株を改変することによって、この問題に対処している。本発明者らは、その後の回収されたエクソソームが、所望の外因性ヌクレオチド配列を含有することを示している（実施例１）。

実施例（例えば、図１）は、本発明に従って産生されたコンストラクトが様々な細胞種において活性であることを示している。したがって、本発明は、複数の細胞株にわたって広く適用可能であることが予想される。

ＭＩＲ２１に存在する異なる調節配列が、図２に見ることができる。この図は、ＭＩＲ２１プラスミドが、ＰＭＡ（ホルボル１２－ミリステート１３－アセテート）およびｃ－ｍｙｃによって活性化することができるプロモーター領域に、異なる調節配列を含む。それは、少なくともリプレッサー配列を含む５’領域に他の配列が、ならびにｍｉＲＮＡのためにｍＲＮＡのレベルも制御する３’領域に安定化配列が存在することも示している。特に、ｍｉＲＮＡレベルは、ＭＩＲ２１がＨｐａＩ制限部位において切断される場合に著しく増加し、ＰａｃＩ制限部位において切断される場合に減少することが図２において見ることができる。

本発明者らは、成熟ｍｉＲＮＡ配列を囲むｐｒｉ－およびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ内の配列は、外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載するために使用することができることを特定した。本発明者らは、機能的三次ループ構造における関連配列を評価することにより、任意の所望の外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載するために使用することができる、ハイブリッド「カセット」ベクターを生成した。このハイブリッドカセットベクターは、典型的には、その発現およびエクソソームにその核酸を搭載するためのプロセシングを可能にする、目的のｍｉＲＮＡまたはヌクレオチドまでの５’上流および３’下流配列を含む。そのようなエクソソームは、その後、回収することができ、所望の外因性ヌクレオチド配列を含む送達ビヒクルとして使用することができる。異なる組織に対して搭載済みエクソソームを標的化するために、プロデューサー細胞株を変更することができ、および／または当該エクソソーム上の表面マーカーを操作することができる。

いくつかの実施形態において、改変された非天然ヌクレオチドを含むＲＮＡカーゴを、エクソソームに搭載する。本発明のコンストラクトは、カーゴＲＮＡ内の非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドと取り替えられた）によって合成され得、ならびに結果として得られる模倣物は、標的細胞に直接的にトランスフェクトされ得る。次いで、標的細胞は培養され得、ならびにそれが産生するエクソソームは、治療用途または診断用途のために、または研究における使用のために、例えば、疾患のモデリングまたは薬物スクリーニングのためにノックインおよびノックダウン細胞株を操作するために、回収され得る。

ｍｉＲ－２１およびエクソソーム搭載
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における部位を標的化するためにアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質をガイドすることによって遺伝子サイレンシングを媒介する、約２２ヌクレオチドの短いノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡ搭載Ａｇｏは、翻訳抑制および標的化されたｍＲＮＡの分解を促進する、ｍｉＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）の一部を形成する。ｍｉＲＮＡとそれらの標的との相互作用は、主に、それらのシード配列に基づいており、ｍｉＲＮＡ生合成は、ＲＢＰとの相互作用を媒介するＲＮＡ二次構造によって影響を受ける。エクソソームＲＢＰはｍｉＲＮＡをエクソソーム内へと向かわせることができることが示唆されている（Gebert, and MacRae. 2019）。

ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａによる切断の後にｐｒｉ－ｍｉＲＮＡから始まる核において生成される、約７０塩基長のＲＮＡヘアピンである。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、エクスポーチン５によって細胞質中へ移出され、その場合、それらは、さらに、ヌクレアーゼＤｉｃｅｒによってプロセッシングされて、成熟ｍｉＲＮＡを形成する（Cullen. 2004）。

本発明者らは、ｍｉＲ－２１－５ｐ配列は、その特別な特性およびハイブリッド転写因子ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴａｍの過剰発現による遺伝子改変により神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３によって産生される豊富に発現されたエクソソームｍｉＲＮＡであることを報告している。ｈｓａ－ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２１－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐとしても知られるｍｉＲ－２１は、ＭＩＲ２１遺伝子によってコードされる哺乳動物ｍｉＲＮＡである。ＭＩＲ２１は、遺伝子ＶＭＰ１のイントロン配列の内に位置するが、発現は、この遺伝子の発現または調節配列に依存しない。ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１配列内に、ｍｉＲ－２１－５ｐの発現の制御および調節を可能にする、プロモーター領域、エンハンサー、リプレッサー、および安定化配列を含むいくつかの調節エレメントが存在する。ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐ配列内には、そのエクソソームパッケージングに必須であるいくつかの主要なＧ－Ｕ対およびループ配列が存在する。一貫して、ＣＴＸ０Ｅ０３に由来する回収されたエクソソーム内において、ｍｉＲ２１－５ｐは豊富に発現されたｍｉＲＮＡであることが観察された。多数のバッチにわたって、ｍｉＲ－２１－５ｐの存在量は、次に最も豊富なｍｉＲＮＡよりも、およそ少なくとも１桁多かった。このことは、この特定のｍｉＲＮＡに関連する強力なエクソソームパッケージング機能が存在することを示している。

ｈｓａ－ｍｉｒ－２１（ｐｒｅ－ｍｉＲ）は、ｍｉＲＢａｓｅアクセッション番号ＭＩ０００００７７を有する：

ｍｉＲＢａｓｅ上に示されるようなステム－ループ構造は、下記である：

成熟－５ｐ配列は、ヌクレオチド８～２９、すなわち、下記である：

成熟－３ｐ配列は、ヌクレオチド４６～６６、すなわち、下記である：

したがって、本発明は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の構造に基づく、エクソソームへの搭載のために外因性ヌクレオチド配列を含むように改変された、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを提供する。外因性ヌクレオチド配列を含むこの改変されたｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックまたはミメティックとして説明することができる。いくつかの実施形態において、改変されたｐｒｅ－ｍｉＲ－２１は、天然ｐｒｅ－ｍｉＲ２１－５ｐの一次、二次、および／または三次構造と構造的に類似する。したがって、本発明は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチドカーゴを標的化するためのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを提供し、この場合、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ステムループ構造を含み、当該ステムは、ゆらぎ対を含む。

「外因性ヌクレオチド配列」は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐにおいて天然には見出されないヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡに組み入れられる外因性ヌクレオチド配列は、二重鎖である。さらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ゆらぎ対、欠失、および／またはミスマッチを含むように改変される。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐ配列と同じ位置にミスマッチおよび欠失を含み、それにより、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐと実質的に同じ三次元構造を維持する。理論に束縛されるわけではないが、ｐｒｅ－ｍｉ－２１の三次元構造は、エクソソーム生合成の際のエクソソームに対するその標的化のために重要であると考えられる。したがって、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の実質的に同じ三次元構造全体を有する、外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、生合成の際にエクソソームに外因性ヌクレオチド配列を標的化し得る。

ヘアピンループとしても知られる「ステムループ」は、通常、反対方向に読まれる場合にヌクレオチド配列において相補的である、同じ鎖の２つの領域が、不対ループに終わる二重螺旋を形成する塩基対である場合に生じる。ステムループは、ＲＮＡ分子における二次構造の一般的なタイプである。ステムループは、ＲＮＡ折り畳み、ｍＲＮＡに対するタンパク質構造安定性を指示することができ、ＲＮＡ結合タンパク質のための認識部位を提供することができ、酵素反応のための基質として機能することができる。

「核酸ハイブリダイゼーション」は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対してアニールされる場合に生じる。ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列の基本的特性である。「ワトソン－クリック対合」により、塩基対と呼ばれる水素結合によって接続される相補的ＲＮＡ鎖上の２つのヌクレオチドが意味される。ワトソン－クリック塩基対合において、アデニン（Ａ）は、２つの水素結合を使用してチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）は、３つの水素結合を使用してシトシン（Ｃ）と塩基対を形成する。ＲＮＡにおける標準的なワトソン－クリック塩基対合において、チミジンは、ウラシル（Ｕ）によって置き換えられる。

「ゆらぎ対」により、ワトソン－クリック塩基対ルールに従わないｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックにおける２つのヌクレオチドの間の対合が意味される。いくつかの実施形態において、ゆらぎ対（Ｗ－ｗ）は、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－ＵまたはＵ－Ｉ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－ＡまたはＡ－Ｉ）、および／またはヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－ＣまたはＣ－Ｉ）を含む。いくつかの実施形態において、当該ゆらぎ対は異なる。例えば、１つまたは複数のゆらぎ対は、任意の順序および任意の組み合わせにおいて、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－ＵまたはＵ－Ｉ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－ＡまたはＡ－Ｉ）、および／またはヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－ＣまたはＣ－Ｉ）を含み得る。他の実施形態において、当該ゆらぎ対は同じであり、例えば、すべて、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－ＵまたはＵ－Ｉ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－ＡまたはＡ－Ｉ）、またはヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－ＣまたはＣ－Ｉ）である。典型的には、当該ゆらぎ対は、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）を含む。ゆらぎ対は、ＲＮＡ二次構造において基本的であり、遺伝子コードの正しい翻訳のために重要である。ワトソン－クリック塩基対との幾何学的相違点は、生物学的機能にとって決定的な構造変動を付与する。いくつかの実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１と機能的に類似する。理論に束縛されることを望むわけではないが、ゆらぎ対は、ＲＮＡの天然折り畳みおよびＲＢＰによるその認識を可能にするように、ＲＮＡの深い溝を歪ませ、それにより、プロセシング、産生、およびエクソソームへの当該ｍｉＲＮＡの搭載を可能にすると理解される（図５Ａ）。

「ミスマッチ」は、２つの非相補的塩基がＲＮＡの二重鎖の同じ塩基対の段に整列される場合に生じる。理論に束縛されるわけではないが、ミスマッチの塩基対は、特定のＲＢＰによっても認識される異なる空間的コンフォメーションをｍｉＲＮＡに与え、それにより、プロセシング、産生、およびエクソソームへの当該ｍｉＲＮＡの搭載を可能にする。

「欠失」により、ヌクレオチドはステムループ構造の片側のみに存在し、ステムの反対側の対応する位置に欠失が存在することが意味される。

ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックとも称される本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１ ５’末端構造的ミミック；外因性ヌクレオチド配列；およびｐｒｅ－ｍｉＲ－２１ ３’ループ構造的ミミックを提供する。「５’末端」によって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ二重鎖の各側における７から９ヌクレオチドの５’末端配列が意味される。典型的には、当該５’末端配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ二重鎖の各側における８ヌクレオチド長である。「３’末端」によって、ループ構造を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ二重鎖の末端が意味される。

本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：Ａは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であり、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の５’末端に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を含み；Ｂは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１において天然には見出されない外因性ヌクレオチド配列であり；Ｃは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であり、当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の３’末端に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を含む。当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の三次元構造を模倣し、それにより、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１のようにエクソソーム生合成の際に、エクソソームへと標的化されることが意図される。

いくつかの実施形態において、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、以下のように定義される：
（Ａ）ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の５’末端と実質的に構造的および／または機能的に類似する。当該ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の５’末端は、ゆらぎ対を含む特異的な構造を含む。当該存在するゆらぎ対は、ＲＮＡの深い溝を歪め、折り畳まれたｐｒｅ－ｍｉＲ－２１全体の二次構造を変える。本発明において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端の５’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１ ５’末端の二次構造を保持する。
（Ｂ）外因性ヌクレオチド配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックのステム－ループのステム構造の一部を形成する。当該外因性ヌクレオチド配列は、１９～２５ヌクレオチド長であり得る。当該外因性ヌクレオチド配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐの長さ、ゆらぎ対、ミスマッチ、欠失に関して、成熟ｍｉＲ２１－５ｐのステムの天然構造を保持し得る。
（Ｃ）ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの３’末端においてループ構造を形成する。当該ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の３’末端は、ゆらぎ対を含む特異的な構造を含む。当該存在するゆらぎ対は、ＲＮＡの深い溝を歪め、折り畳まれたｐｒｅ－ｍｉＲ－２１全体の二次構造を変える。当該ループ構造は、４、５、６、７、８、または９ヌクレオチドのループ長さ全体を有する。好ましくは、７ヌクレオチド長である。本発明において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端の３’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１ ３’末端の二次構造を保持する。

本発明のある特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ－２１－５ｐに対する配列を除いた天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐの配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を含む。当該ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の三次元構造全体を模倣し、それにより、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１のようにエクソソーム生合成の際に、エクソソームへと標的化されることが意図される。

例えば、％同一性の値は、パーセント同一性が報告されている配列長さで割った、一致する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数によって特定され得る。パーセンテージ（％）アミノ酸配列相同性は、％アミノ酸配列同一性を特定するために使用されたのと同じ計算によって特定され得るが、例えば、計算において、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含んでもよい。配列同一性％を算出するために、例えば、ＢＬＡＳＴ（ジェンバンク；デフォルトパラメータを使用）などのオリゴヌクレオチドアラインメントアルゴリズムが使用され得る。２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であり得ることの代替の指標は、当該２つの配列が中程度のストリンジェントな、好ましくはストリンジェントな条件下においてお互いにハイブリダイズすることである。

ある実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックとも呼ばれ得る）は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の生物学的機能を保持する。「ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミック」は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１と実質的に構造的および／または機能的に類似するｍｉＲＮＡである。ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックは、配列は異なり得るが、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の１つまたは複数の生物学的機能を維持する。「１つまたは複数の生物学的機能を維持する」によって、当該ミミックが、問題の生物学的機能の少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％を保持することが意味される。特定の実施形態において、問題の生物学的機能は、エクソソームへのｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックのソーティングであり得る。この実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、配列は異なり得るが、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１のレベルの少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％においてエクソソームにパッケージングされるように、天然のｍｉＲ２１－５ｐと構造的および／または機能的に類似する一次、二次、および／または三次構造を共有する、ｍｉＲＮＡである。

別の実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の結合親和性の少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％の結合親和性によってＲＢＰに結合することができるような構造的および／または機能的に類似する一次、二次、および／または三次構造を共有する。別の実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の結合親和性の少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％の結合親和性によってｍｉＲＮＡプロセシング酵素に結合することができるような構造的および／または機能的に類似する一次、二次、および／または三次構造を共有する。ｍｉＲＮＡプロセシング酵素の例としては、Ｒａｎ－ＧＴＰ、エクスポーチン－５，およびＤｉｃｅｒが挙げられる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの結合親和性は、例えば、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、および表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定することができる。

精製されたエクソソームに存在する外因性ヌクレオチド配列の量は、ｑＰＣＲ、またはｄｄＰＲＣなどの他の定量方法を使用して定量化することができる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの構造は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル分析、低温電子顕微鏡法（ｃｙｒｏ－ＥＭ）、化学的／酵素的プロービング、熱変性、および質量分光分析などの方法によって特定することができる。

ｍｉＲ－２１発現カセット
本発明は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックと称される、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の構造に基づく外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む発現カセットを提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、ｍｉＲＮＡの転写を制御するために、天然に存在する配列もしくは設計された調節配列、転写開始点を含むｍｉＲＮＡに対して上流の５’配列、下流の３’配列、安定化配列、エンハンサー、および／またはリプレッサー配列であり得るプロモーター領域の１つまたは複数またはその全てと、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミックと称される、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の構造に基づく外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとを含む発現カセットを提供する。本発明のある態様において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含むカセットが提供される。特定の実施形態において、当該カセットは、５’ｐｒｉ＿５ｍｉＲ２１配列；ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１構造的ミミック；および３’ｐｒｉ＿ｍｉＲ２１配列を含む（その順番で）。ある特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ発現カセットは、元の天然に存在するｍｉＲＮＡ内のループ、ミス対、ゆらぎ対、および塩基対合の欠如を含む、ｐｒｉ－およびｐｒｅ－ｍｉ－２１の元の配列および長さを保存する。これは、エクソソームへの外因性ヌクレオチド配列のシャトリングを促進するために、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の構造を維持することが意図される。

典型的には、このカセットは、細胞内転写機構を使用して本明細書において説明されるＲＮＡ部分を転写する、遺伝子改変された細胞株を生成する目的による選抜のプロデューサー細胞株内へとトランスフェクトされた、ＤＮＡベクター内のクローニングされたＤＮＡ配列によって導入することができる。当該カセットまたはその一部も、目的の核酸の発現のために一部を置き換えるために、この遺伝子座の遺伝子操作を可能にする任意の技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲなどを使用することによって、遺伝子ＭＩＲ２１の内因性遺伝子座に導入することができる。「ベクター」は、ウイルス、プラスミド、または高等生物の細胞から取られた、ＤＮＡの小片であり、それは、生物体中において安定して維持することができ、クローニング目的のためにその中に外来ＤＮＡ断片を挿入することができる。そのような発現ベクターの設計は、実施例３において概説される。

ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子組換えを可能にする任意の遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーまたはプライム編集などを使用することによって天然に存在するｍｉＲ－２１配列を置き換えるために、ＭＩＲ２１のための遺伝子座に導入され得る。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子組換えを可能にする任意の技術を使用することによって、天然に存在するｍｉＲ－２１配列を置き換えるために、ＭＩＲ２１のための遺伝子座に導入してもよい。

あるいは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ステム－ループ構造の形態において直接トランスフェクトすることができ、またはエクスビボにおいて生成することができる。これは、任意の許容可能なインビトロ方法論を使用して転写ミックスと共にＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＤＮＡガイド鎖を使用するインビトロにおいて生成されたＲＮＡコンストラクトを使用することによって、あるいは任意の数の既知のオリゴ合成方法論を使用して所望のコンストラクトを化学的に合成することによって、達成することができる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを合成することにより、当該コンストラクトにおいて天然のヌクレオチドおよび／または非天然のヌクレオチドの化学的に改変された形態を生成させることも可能であろう。これは、改善された全身的安定性、および／または減少した免疫原性、および／またはシード配列における配列の変更を伴うより選択的な標的結合を有する、改変されたｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および他のＲＮＡコンストラクト、例えば抗ｍｉＲなどの使用を可能にするであろう。次いで、そのようなエクスビボＲＮＡコンストラクトは、利用可能な任意の数のトランスフェクション方法（例えば、リポフェクタミン、エレクトロポレーション、またはトランスフェクションもしくは核酸送達の任意の他の手段）により、プロデューサー細胞株に導入されるであろう。

本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ発現カセットを使用することにより、本発明者らは、細胞内の生合成の際にエクソソーム内へ輸送されることがわかっている外因性ヌクレオチド配列を含む機能的ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをインサイチュにおいて生成した。その上、えり抜きのこのエクソソームカプセル化外因性ヌクレオチド配列は、レシピエント細胞株においても機能的であり、標的遺伝子活性をモジュレートするために、例えば、標的細胞における下方調節のために、レシピエント細胞に送達することができる。

したがって、本発明を使用して、
ｉ）外因性ヌクレオチド配列（例えば、標的遺伝子サイレンシングまたは遺伝子編集／置き換えオリゴマー性一本鎖ＲＮＡ配列）は、エクソソーム搭載カセット内にパッケージングすることができ；
ｉｉ）外因性ヌクレオチド配列を有するそのようなカセットは、哺乳動物発現ベクター内において具現化することができ、または完全なステムループ構造としてエクスビボにおいて合成することができ；
ｉｉｉ）上記において説明される発現ベクターまたはステムループのどちらかは、任意の選択された標的細胞にトランスフェクトすることができ（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクタミンを使用して、または別のエクソソームによって）、そのような細胞の選択は、使用者が標的への最終的なエクソソーム送達ビヒクルを必要とする所望の組織によって、および／または治療標的が脳血液関門を越えなければならないか否か（神経性プロデューサー細胞が選択され得る場合）によって、決定づけられ得；
ｉｖ）当該外因性ヌクレオチド配列は、細胞がアルゴノートタンパク質を発現するか否かに関係なく、ならびにＤＩＣＥＲがそのような細胞内において機能的であるか否かに関係なく、プロデューサー細胞天然エクソソームシャトリングメカニズムを使用することによって、プロセシングのためにエクソソームへと標的化することができ；
ｖ）所望の外因性ヌクレオチド配列を搭載されたエクソソームは、様々な既知のエクソソーム回収方法、例えば、これらに限定されるわけではないが、超遠心分離、ＰＥＧ沈殿、ＴＦＦ、親和性クロマトグラフィーなどを使用して、プロデューサー細胞からの馴化培地から回収することができ；
ｖｉ）エクソソームは、パッケージングされた外因性ヌクレオチド配列をインビトロおよびインビボにおいてヒト細胞に送達することができ、起源のプロデューサー細胞に依存するある特定の場合において、当該エクソソームは、全身的に送達される場合、特定の組織を標的化することができ；
ｖｉｉ）標的細胞を当該エクソソームに接触させることにより、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞に送達し、遺伝子活性をモジュレートする。

本発明は、任意の遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの搭載、および任意の遺伝子編集ツール、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド鎖など、ならびに任意の他の一本鎖ＲＮＡ分子を搭載するのを可能にする。これらのヌクレオチド配列は、選りすぐりのエクソソームに搭載されること、ならびに、細胞培養およびエクソソーム精製技術を使用するスケールにおいて産生されることが意図される。

本発明の方法は、発現ベクターによってプロデューサー細胞を操作することによる外因性ヌクレオチド配列のエクソソームの搭載を開示する。当該方法は、プロデューサー細胞への実際のｍｉＲ－２１ ｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡとＲＮＡカーゴとを含む天然または合成コンストラクトの直接的な導入による改変にも適用可能である。当該コンストラクトは、任意の手段によってプロデューサー細胞にトランスフェクトすることができる。

本発明は、エクソソームに搭載された外因性ヌクレオチド配列の大量の産生を可能にするという点において利点を有する。本発明の特定の利点は、エクソソームに搭載されたそのような外因性ヌクレオチド配列、例えば、治療用ｍｉＲＮＡの産生の方法は、馴化培地の回収、精製、および検証のために減らされる。したがって、ｍｉＲＮＡなどの外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載する他の方法に関連する時間およびコストを減少させる。

本明細書において開示されるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ発現カセットおよび方法は、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子編集／置換のために、任意の外因性または内因性一本鎖ヌクレオチド配列を送達するために使用することができる。したがって、インビボ送達のためにエクソソームによってカプセル化されるかまたはそれらを伴う治療部分を生成させるための手段を提供する（図４）。このシステムの有益性としては、改善された組織標的化、より低い免疫原性、ならびにＲＮＡｓｅおよびそれ以外の「裸の」治療部位のインビボにおける分解を加速させ得る他の因子からの保護が挙げられる。回収された搭載済みのエクソソームは、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの移植技術において使用することができる細胞を操作するために、外因性ヌクレオチド配列をインビトロにおいて細胞に送達するためにも使用することができる。

外因性ヌクレオチド配列
「外因性ヌクレオチド配列」は、天然のｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐにおいて天然には見出されないヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする。

本発明の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、ＡＳＯ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのための配列、あるいは他の外因性ヌクレオチド配列である。本発明のさらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１４６－ｂまたはｍｉＲ－１２４６、あるいはｓｉＲＮＡである。

ある特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、治療用であり得る。ヌクレオチド配列を用いる療法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを含み得る。ＤＮＡ治療は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡアプタマー、および遺伝子療法を含む。ＲＮＡ治療は、ＲＮＡｉ、およびＣＲＩＳＰＲのためのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、治療用ＲＮＡである。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、８～５０塩基対長さの一本鎖配列であり、標準的ワトソン－クリック塩基対合によって標的ｍＲＮＡに結合する。ＡＳＯがｍＲＮＡに結合した後、標的複合体は、内因性細胞ＲＮａｓｅＨによって分解されるか、または立体障害によりｍＲＮＡの機能的遮断が生じる。「化学抗体」とも呼ばれるＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーは、５６～１２０ヌクレオチド長の一本鎖合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、高い親和性によりタンパク質をコードするヌクレオチドと結合することができ、結果としてデコイとして機能する。ＤＮＡアプタマーは、構造認識により標的核酸に対して非常に高い親和性を有する、ＡＳＯと類似する短い一本鎖オリゴヌクレオチド配列である（Sridharan and Gogtay. 2016）。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子発現を調節するために小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を使用する、真核細胞における調節メカニズムである。ＲＮＡｉは、およそ２１ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子が、相補的ｍＲＮＡ配列を有する特定の遺伝子の発現を強力にサイレンシングまたは抑制することができるようなメカニズムである。ＲＮＡｉに対して、２つのタイプの小型ＲＮＡ分子が主要である。これらは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ヒトにおいて、遺伝子発現は、遺伝子サイレンシング核酸（すなわち、ｓｉＲＮＡガイド鎖）に対して完全に相補的なＲＮＡを切断および分解することによって、または不完全に相補的なｍＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子サイレンシング核酸の場合など）の翻訳を抑制することによって、減じられる。ヒトにおいて、小さなＲＮＡ遺伝子サイレンサーの主要なクラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、部分的に相補的な結合部位を有するｍＲＮＡの翻訳を抑制することによって、大きな遺伝子ネットワークを調節する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、標的化されたＤＮＡの編集を可能にする。当該システムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子との会合によって、当該ＤＮＡに対して標的化され、塩基相補性によって、標的化されたＤＮＡに結合し、両方の鎖における正確なＤＮＡ切断を可能にする。Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断の結末は、標的ＤＮＡ内での二本鎖切断（double-strand break:DSB）であり、これは、効率的だが修復ミスの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、またはあまり効率的ではないが修復ミスの少ない相同組換え修復（ＨＤＲ）経路による、細胞の細胞内修復メカニズムによって修復される。置換遺伝子配列は、常染色体によって支配的な遺伝性遺伝病に対して増大された遺伝子療法を実施する場合、ＷＴ置換配列をコードするために例えばＡＡＶを使用して同時トランスフェクトすることもできる。両方の修復メカニズムは、異なる成果のために利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの成功は、結果として、最適な標的部位の正しい識別とその後の相補的ｇＲＮＡの設計とによって決まる（Wilson, et al. 2018）。

ＲＮＡ干渉ベースの治療薬の送達は、重要な課題を提示している。例えば、脂質粒子、ｓｉＲＮＡ－改変、ナノ粒子、およびアプタマーなど、ＲＮＡｉ治療薬を送達するための多くの戦略が試された（Whitehead, et al. 2009; Kanasty, et al. 2013）。しかしながら、多くの場合、送達は成功せず、ＲＮＡｉベースの治療薬の送達に対する障害が依然として残っている（Kanasty, et al. 2013; Tatiparti, et al. 2017）。エクソソームは、ＲＮＡｉベースの治療薬の送達におけるこの障害に対する解決策を提供する。しかしながら、遺伝子サイレンシングヌクレオチド配列などの治療用ヌクレオチド配列のための薬物送達ビヒクルとしてエクソソームまたはエクソソーム用小胞を使用することの主要な障害は、ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ／ｍｉＲＮＡ、または目的の他のヌクレオチド配列をエクソソーム内にパッケージングする能力である。タンパク質およびＲＮＡを産生する細胞と比較して、エクソソームは、タンパク質およびＲＮＡの両方の非常に選択的な含有量を有する。本発明は、エクソソームに外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載する改善された方法を提供することによって、あるいはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを発現させるために遺伝子座ＭＩＲ２１の遺伝子編集によって、この問題を克服する。

エクソソーム
本発明は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の構造および／または機能を有しかつ外因性ヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを搭載したエクソソームを提供する。

エクソソームは、エンドソームコンパートメントに由来し、多胞小体（ＭＶＢ）が細胞膜と融合する時に分泌される。

エクソソームは、微粒子の一種である。「微粒子」は、細胞から放出される３０ｎｍから１０００ｎｍの直径の細胞外小胞である。それは、生物学的分子を内包する脂質二重層によって制限される。用語「微粒子」は、当該分野において既知であり、膜粒子、膜小胞、微細小胞、エクソソーム様小胞、エクソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソーム、またはエキソベジクルなど、いくつかの異なる種類の微粒子を包含する。異なるタイプの微粒子は、直径、細胞内起源、スクロース中のそれらの密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー、および分泌の様式（すなわち、シグナル（誘導性）に従って、または自発的に（構成型））に基づいて区別される。４つの一般的な微粒子およびそれらの区別的特徴を、下記の表１に記載する。

エクソソームは、典型的には、３０～１００ｎｍの直径を有するとして定義されるが、より最近の研究は、エクソソームは、１００ｎｍから２００ｎｍの間の直径も有することができることを確認している（例えば、Katsuda, et al. Proteomics 2013, and Katsuda, et al. Scientific Reports 2013）。したがって、エクソソームは、典型的には、３０ｎｍから１５０ｎｍの間の直径を有する。直径は、任意の好適な技術、例えば、電子顕微鏡法または動的光散乱法などによって判定することができる。

エクソソームは、直接的および間接的メカニズムによってドナー細胞とレシピエント細胞の間においてビヒクルとして機能することによって、細胞間情報伝達においてある役割を果たすと考えられる。直接的メカニズムとしては、レシピエント細胞によるエクソソームおよびそのドナー細胞由来の成分（例えば、タンパク質、脂質、または核酸）の取り込みが挙げられ、当該成分は、レシピエント細胞において生物活性を有する。間接的メカニズムとしては、エクソソーム－レシピエント細胞表面相互作用が挙げられ、それは、レシピエント細胞の細胞内シグナル伝達のモジュレーションを引き起こす。したがって、エクソソームは、レシピエント細胞による１つまたは複数のドナー細胞由来特性の獲得を媒介し得る。

本発明のいくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームが単離される。用語「単離される」は、それが言及するエクソソームまたはエクソソーム集団がその自然環境内にないことを示している。当該エクソソームまたはエクソソーム集団は、実質的に周囲組織から分離されている。いくつかの実施形態において、当該試料が、少なくとも約７５％、いくつかの実施形態では少なくとも約８５％、いくつかの実施形態では少なくとも約９０％、ならびにいくつかの実施形態では少なくとも約９５％のエクソソームを含む場合、当該エクソソームまたはエクソソーム集団は、実質的に周囲組織から分離される。換言すれば、試料が、約２５％未満、いくつかの実施形態では約１５％未満、いくつかの実施形態では約５％未満の、エクソソーム以外の物質を含有する場合、当該試料は、周囲組織から実質的に分離される。そのようなパーセンテージ値は、重量パーセンテージを意味する。当該用語は、エクソソームが由来する生物体から取り出されて培養物中に存在するエクソソームを包含する。当該用語は、エクソソームが由来する有機体から取り出されてその後に生物体中に再挿入されたエクソソームも包含する。

エクソソームは、実質的に任意の細胞タイプから分泌され得る。いくつかの実施形態において、エクソソームは、幹細胞、ｈＩＰＳＣ、組織幹細胞、それらのいずれかに由来する分化細胞、または樹枝状細胞から分泌される。ある特定の実施形態において、エクソソームは、幹細胞から分泌される。幹細胞は、天然において、細胞内多胞小体（微粒子を含む）と細胞膜との融合、ならびに細胞外コンパートメントへの当該エクソソームの放出によって、エクソソームを産生する。

別の実施形態において、当該幹細胞は、神経幹細胞である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、神経細胞、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトを産生する、自己再生性の多能性幹細胞である（Kornblum, 2007）。いくつかの実施形態において、神経幹細胞株は、「ＣＴＸ０Ｅ０３」細胞株、「ＳＴＲ０Ｃ０５」細胞株、「ＨＰＣ０Ａ０７」細胞株、またはMiljan et al. 2009において開示される神経幹細胞株であり得る。神経幹細胞は、例えばＣＴＸ０Ｅ０３条件付き不死化された細胞株など、本明細書において説明される神経幹細胞のいずれであってもよく、クローン性であり、標準化され、インビトロおよびインビボにおける明確な安全性を示し、安定なエクソソーム産生のための特有の供給源を提供するスケールにおいて製造することができるものである。あるいは、神経幹細胞は、場合により米国特許第７５１４２５９号明細書（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるような、神経網膜幹細胞株であり得る。

神経幹細胞エクソソームは、神経幹細胞によって産生されるエクソソームである。典型的には、当該エクソソームは、神経幹細胞によって分泌される。間葉系幹細胞など、他の細胞由来のエクソソームは、当該分野において既知である。

本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームを産生する神経幹細胞は、胎児の、胚の、または成体の神経幹細胞、例えば、米国特許第５８５１８３２号明細書、米国特許第６７７７２３３号明細書、米国特許第６４６８７９４号明細書、米国特許第５７５３５０６号明細書、および国際公開第２００５１２１３１８号パンフレット（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるものなど、であり得る。胎児組織は、ヒト胎生皮質組織であり得る。当該細胞は、Yuan, et al. (2011)に記載されているような、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の分化からの神経幹細胞として、または線維芽細胞などの体細胞から作り出される、直接誘導された神経幹細胞として、選択することができる（例えば、Their, et al. 2012によって最近報告されたように、再プログラミングの初期相にＯｃｔ４活性を厳密に制限しつつ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを構成的に誘導することによって）。ヒト胚性幹細胞は、当該分野において既知であるような、ドナー胎児の生存力を保持する方法によって得られ得る（例えば、Klimanskaya et al. 2006およびChung, et al. 2008）。ヒト胚性幹細胞を得るそのような非破壊方法は、本発明の微粒子を得ることができる胎児幹細胞を提供するために使用され得る。あるいは、本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、成体幹細胞、ｉＰＳ細胞、または直接誘導された神経幹細胞から得ることができる。したがって、本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、基礎材料としてのヒト胎児の破壊またはヒト胎児の使用を必要としない複数の方法によって作り出すことができる。

典型的には、エクソソームを産生する神経幹細胞集団は、実質的に純粋である。用語「実質的に純粋」は、本明細書に使用される場合、総細胞集団を構成する他の細胞に対して、少なくとも約７５％、いくつかの実施形態では少なくとも約８５％、いくつかの実施形態では少なくとも約９０％、いくつかの実施形態では少なくとも約９５％純粋である幹細胞の集団を指す。例えば、神経幹細胞集団に関して、この用語は、総細胞集団を構成する他の細胞と比較して、少なくとも約７５％、いくつかの実施形態では少なくとも約８５％、いくつかの実施形態では少なくとも約９０％、いくつかの実施形態では少なくとも約９５％純粋な、神経幹細胞が存在することを意味する。換言すれば、用語「実質的に純粋」は、後続の培養および増幅前の元の非増幅集団および単離された集団における系列拘束細胞の、約２５％未満、いくつかの実施形態では約１５％未満、いくつかの実施形態では約５％未満を含む本発明の幹細胞の集団を指す。

エクソソームは、典型的には、脂質、タンパク質、および核酸を含む環境を包囲する、少なくとも１つの脂質二重層を含む。当該核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または任意のｍｉＲＮＡ前駆体、例えば、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、および／または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）などであり得る。

幹細胞由来のエクソソームは、それが由来する幹細胞の少なくとも１つの生物学的機能を保持する。保持され得る生物学的機能としては、血管新生および／または神経発生を促進する能力、脳卒中を患う患者の脳で認識向上に作用する能力、または末梢動脈障害における血流量回復を促進する能力が挙げられる。例えば、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、ＰＢＭＣアッセイにおけるＴ細胞活性化を阻害することが知られており、一実施形態において、本発明の微粒子は、ＰＢＭＣアッセイにおけるＴ細胞活性化を阻害するこの能力を保持する。ＰＢＭＣアッセイは、当業者に周知であり、当該アッセイを実施するためのキットは、市販されている。

本発明のいくつかのエクソソームは、ＣＤ１３３表面マーカーを発現する。本発明の他のエクソソームは、ＣＤ１３３表面マーカーを発現しない。「マーカー」は、その存在、濃度、活性、またはリン酸化状態が、検出され得て、細胞の表現型を特定するために使用され得る、生物学的分子を意味する。

エクソソームは、エクソサイトーシスにより細胞から放出される、典型的には３０～１００ｎｍ直径の、時々は１００ｎｍから２００ｎｍの間の直径の、エンドソーム誘導脂質微粒子である。エクソソームの放出は、制御された方式または機能的に関連する方式において、構成的にまたは誘導の際に生じる。エクソソームは、それらの生合成の際に、様々な細胞質タンパク質（シャペロンタンパク質、インテグリン、細胞骨格タンパク質、およびテトラスパニンなど）および遺伝的物質を組み入れる。その結果、エクソソームは、親細胞微環境およびかなりの距離にわたる、細胞間でのタンパク質、脂質、および遺伝物質の移送のための細胞間情報伝達デバイスであると考えられる。本発明はこの理論に束縛されないが、エクソソームが神経幹細胞の効力を担うことは可能である。したがって、神経幹細胞由来のエクソソームは、それ自体治療的に効き目があると予想される。

一実施形態において、単離または精製された外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、標的細胞において所望の機能を実施することが意図される１つまたは複数の外因性の核酸、脂質、タンパク質、薬物、またはプロドラッグも搭載される。これは、幹細胞の操作を必要とせず、ならびに当該外因性物質は、場合により、エクソソームに直接加えることもできる。例えば、外因性のペプチドまたはタンパク質は、エレクトロポレーションによってエクソソーム内に導入することができる。この微粒子は、次いで、外因性物質ためのビヒクルまたは担体として使用することができる。この方法において、微粒子は、１つまたは複数の薬剤、典型的には治療薬または診断薬を標的細胞に送達するためのビヒクルとして使用することができる。

神経幹細胞
エクソソームを産生する神経幹細胞は、幹細胞株、すなわち、安定して分裂する幹細胞の培養物であり得る。幹細胞株は、単一の定義された供給源を使用して、大量に増殖させることができる。細胞不死化は、突発性事象から生じ得、あるいは細胞不死化因子をコードする幹細胞に外因性の遺伝的情報を導入することによって、達成され得、結果として、好適な培養条件下での幹細胞の無限な細胞増殖を生じる。そのような外因性の遺伝因子は、転写因子Ｍｙｃをコードする遺伝子「ｍｙｃ」を含み得る。外因性の遺伝的情報は、様々な好適な手段、例えば、トランスフェクションまたは形質導入などによって、幹細胞内に導入され得る。形質導入の場合、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、から誘導されるものなど、遺伝子操作されたウイルス性ビヒクルが使用され得る。

追加の利点は、条件付き不死化された幹細胞株を使用することによって獲得することができ、そこでは、治療的に有効な微粒子の産生に悪影響を与えることなく、不死化因子の発現を調節することができる。これは、細胞に活性化剤を供給しない限り不活性である細胞不死化因子を導入することによって達成され得る。そのような細胞不死化因子は、ｃ－ｍｙｃＥＲなどの遺伝子であり得る。ｃ－ＭｙｃＥＲ遺伝子産物は、変異体エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに融合したｃ－Ｍｙｃバリアントを含む融合タンパク質である。ｃ－ＭｙｃＥＲのみが、合成ステロイド４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の存在下において細胞増植を駆動する（Littlewood, et al.1995）。このアプローチは、神経幹細胞株に由来する微粒子中のｃ－Ｍｙｃまたはそれをコードする遺伝子の存在に起因する宿主細胞増殖に対する望まないインビボ効果（例えば、腫瘍形成）を避けつつ、インビトロでの神経幹細胞の制御された拡大を可能にする。好適なｃ－ｍｙｃＥＲの条件付き不死化された神経幹細胞は、米国特許第７４１６８８８号明細書に記載される。したがって、条件付き不死化された神経幹細胞株の使用は、既存の幹細胞微粒子の単離および産生に対する改良を提供する。

好ましい条件付き不死化された細胞株としては、ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株、ＳＴＲ０Ｃ０５神経幹細胞株、およびＨＰＣ０Ａ０７神経幹細胞株が挙げられ、これらは、アクセッション番号０４０９１６０１（ＣＴＸ０Ｅ０３）；アクセッション番号０４１１０３０１（ＳＴＲ０Ｃ０５）；およびアクセッション番号０４０９２３０２（ＨＰＣ０Ａ０７）にて、出願人によってヨーロピアンコレクションオブアニマルカルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ）、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ０ＪＧに寄託されている。これらの細胞の誘導および起源は、欧州特許第１６４５６２６号明細書に記載される。これらの細胞の利点は、これらの細胞により産生されるエクソソームによって保持される。

ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞は、以下の培養条件下において培養され得る：
・ヒト血清アルブミン ０．０３％
・ヒトトランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
・プトレシン 二塩酸塩 １６．２μｇ／ｍｌ
・ヒト組換えインスリン ５μ／ｍｌ
・プロゲステロン ６０ｎｇ／ｍｌ
・Ｌ－グルタミン ２ｍＭ
・亜セレン酸ナトリウム（セレン） ４０ｎｇ／ｍｌ

細胞の増大のために、塩基性線維芽細胞増殖因子（１０ ｎｇ／ｍｌ）、上皮細胞増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、および４－ヒドロキシタモキシフェン１００ｎＭを加える。細胞は、４－ヒドロキシタモキシフェンを除去することによって、分化され得る。典型的には、ら細胞は、５％ＣＯ_２／３７℃において、または５％、４％、３％、２％、または１％のＯ_２の低酸素条件下において、培養され得る。これらの細胞株は、良好に培養するために血清を必要としない。血清は、多くの細胞株の良好な培養に必要であるが、それ自体のエクソソームなどの多くの汚染物質を含む。ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株、ＳＴＲ０Ｃ０５神経幹細胞株、またはＨＰＣ０Ａ０７神経幹細胞株、あるいは血清を必要としない任意の他の細胞株のさらなる利点は、血清による汚染物混入が避けられることである。

ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞（およびこれらの細胞に由来する微粒子）は、元は１２週齢のヒト胎生皮質に由来する多分化能細胞である。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の単離、製造、およびプロトコルは、Ｓｉｎｄｅｎらによって詳細に説明される（米国特許第７，４１６，８８８号明細書および欧州特許第１６４５６２６号明細書）。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は「胚性幹細胞」ではなく、すなわち、それらは、胚盤胞の内細胞塊から由来する多能性細胞ではなく；原細胞の単離は、胚の破壊を生じなかった。

ＣＴＸ０Ｅ０３は、レトロウイルス感染により送達された単一コピーのｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子を含有するクローン細胞株であり、４－ＯＨＴ（４－ヒドロキシタモキシフェン）により条件的に調節される。ｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子は、４－ＯＨＴの存在下において細胞増殖を刺激する融合タンパク質を発現し、結果として、４－ＯＨＴの存在下において培養される場合に制御された増大を可能にする。この細胞株はクローン性であり、培養下において急速に増殖し（倍増時間は５０～６０時間）、正常なヒト核型（４６ＸＹ）を有する。それは、遺伝的に安定であり、大量に増殖させることができる。当該細胞は、安全で、非腫瘍形成性である。当該細胞は、増殖因子および４－ＯＨＴの不存在下において増殖を停止し、ニューロンおよび星状細胞へと分化する。

ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の開発は、臨床用途のための一貫した製品のスケールアップを可能にした。バンクに保存される材料からの細胞の産生は、商業利用のための多量の細胞の生成を可能にする（Hodges, et al. 2007）。

用語「培養培地」または「培地」は、当該分野において認識されており、一般的に、生きている細胞の培養のために使用される任意の物質または調製物を示す。用語「培地」は、細胞培養に関して使用される場合、細胞を囲む環境の構成要素を包含する。培地は、固体、液体、気体、あるいは相および材料の混合物であり得る。培地としては、液体増殖培地、ならびに細胞増殖を維持しない液体培地が挙げられる。培地としては、ゼラチン状培地、例えば、寒天、アガロース、ゼラチン、コラーゲンマトリックス、および／または任意の細胞外マトリックスを形成する他のタンパク質も挙げられる。例示的な気体培地としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で増殖している細胞が曝露される気相が挙げられる。用語「培地」は、たとえ細胞といまだ接触していなくても細胞培養での使用を対象とする材料も意味する。換言すれば、細菌培養のために調製された、栄養素の豊富な液体は、培地である。同様に、水または他の液体と混合されたときに、細胞培養にとって好適になる粉末混合物は、「粉末化培地」と称され得る。「合成培地(defined medium)」は、化学的に定義された（通常は精製された）成分で構成される培地を意味する。「合成培地」は、酵母抽出物およびビーフブロスなどの特徴が明らかでない生物学的抽出物を含有しない。「富栄養培地」は、ほとんどまたは全ての生存可能な形態の特定種の増殖を支持するように設計されている培地を含む。富栄養培地は、多くの場合、複雑な生物学的抽出物を含む。「高密度培養の増殖にとって好適な培地」は、他の条件（例えば、温度および酸素移動速度など）が増殖を許容する場合に、細胞培養物が３以上のＯＤ６００に達するのを可能にする任意の培地である。用語「基礎培地」は、任意の特別な栄養素補給を必要としない多くのタイプの微生物の増殖を促進する培地を意味する。ほとんどの基礎培地は、一般的に、４つの基礎化学群：アミノ酸、炭水化物、無機塩、およびビタミン、で構成される。基礎培地は、一般的に、血清、緩衝液、増殖因子、脂質などの栄養補助剤が加えられた、より複雑な培地のための基礎として機能する。一態様において、増殖培地は、本発明の細胞の自己複製能力を維持しつつ当該細胞の増殖および増大を支持するために必要な増殖因子を有する複雑な培地であり得る。基礎培地の例としては、これらに限定されるわけではないが、イーグル基礎培地、最小必須培地、ダルベッコ変法イーグル培地、１９９培地、栄養混合物(Nutrient Mixtures)ハムＦ－１０およびハムＦ－１２、マッコイ５Ａ、ダルベッコＭＥＭ／Ｆ－１２、ＲＰＭＩ １６４０、ならびにイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられる。

エクソソームを産生するための細胞のトランスフェクション
本発明の核酸コンストラクトによるエクソソーム－プロデューサー細胞のトランスフェクションは、複数の方法を使用して実施することができる。そのような方法としては、これらに限定されるわけではないが、カチオン脂質移入、エレクトロポレーション法、ウイルス性トランスフェクション、およびリン酸カルシウムトランスフェクションが挙げられる。

本発明の核酸コンストラクトは、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、または本発明のカセット、または本発明のベクターを含む。

いくつかの実施形態において、エクソソームプロデューサー細胞に核酸コンストラクトをトランスフェクトするために、カチオン脂質トランスフェクションが使用される。さらなる実施形態において、カチオン脂質トランスフェクションは、試薬、例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３，－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル塩化アンモニウム）、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）トランスフェクション試薬リポフェクチン（登録商標）リポフェクトアミン（登録商標）、およびオリゴフェクタミン（oligofectamine）（登録商標）などを使用して実施される。

いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトをエクソソームプロデューサー細胞にトランスフェクトするために、エレクトロポレーションが使用される。エレクトロポレーションは、細胞を高透過性にする一時的不安定化を生じさせ、それにより、外因性分子の侵入を可能にする、高密度電気パルスへの細胞膜の曝露を伴う。エレクトロポレーションは、様々な細胞タイプにおいて高い形質転換効率をもたらし得る、容易で非化学の技術である。

いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトをエクソソームプロデューサー細胞にトランスフェクトするために、ウイルス性トランスフェクションが使用される。この方法は、核酸を細胞に送達するためのウイルスベクターの使用を伴う。ウイルス性送達システム、例えば、レンチウイルスシステム、アデノウイルスシステム、アデノ随伴ウイルスシステム、およびオンコレトロウイルスベクターなどは、トランスフェクトしにくい細胞においてさえヌクレオチド配列を移送するために、使用することができる。

いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトをエクソソームプロデューサー細胞にトランスフェクトするために、リン酸カルシウムが使用される。リン酸カルシウムトランスフェクション技術は、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムの沈殿を伴う。当該沈殿は、リン酸ナトリウムを含むＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水を、塩化カルシウム溶液およびＤＮＡ２と混合することによって促進される。

精製されたエクソソーム中に存在するトランスフェクトされた核酸コンストラクトの量は、ｑＰＣＲ（実施例１）またはＲＮＡ定量化を可能にする他の技術、例えば、ＦＩＳＨ／Ｓｃｏｐｅ、小滴－デジタルＰＣＲまたはＲＮＡｓｅｑなどを使用して定量化することができる。

エクソソーム精製
本発明のエクソソームは、既知のエクソソーム精製技術を使用して精製され得る。例えば、エクソソームは、接線流ろ過（ＴＦＦ）、または例えば１０００００ｘｇにおいて１～２時間の超遠心分離によって精製することができる。精製のために代替のまたは追加の方法、例えば、抗体ベースの方法、例えば、特異抗体を使用した、免疫沈降、磁性ビーズ精製、樹脂ベースの精製などを使用してもよい。

エクソソームは、続いて、国際公開第２０１３／１５０３０３号パンフレットおよび国際公開第２０１４／０１３２５８号パンフレット（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるように、定量化およびキャラクタリゼーションすることができる。

標的細胞への送達のためのエクソソーム内への外因性ヌクレオチド配列のパッケージング
エクソソームは、標的細胞への外因性ヌクレオチド配列の送達に対して、特に興味深い送達オプションを示す。本発明は、細胞間情報伝達のために内因性システムを十分に利用し、それにより、標的細胞への外因性ヌクレオチド配列の送達のためのシステムを提供する。エクソソームは、様々な特定の細胞タイプおよび組織を標的化するように改変することができる。異なる細胞タイプから分泌されたエクソソームは、それらの表面上において異なるタンパク質を発現し、それらは、当該エクソソームを異なる標的細胞に対して標的化し得る。

したがって、本発明は、外因性核酸カーゴを搭載したエクソソーム、例えば、外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームを提供する。本発明は、例えば、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームを使用して、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達する方法も提供し、この場合当該方法は、標的細胞を当該搭載エクソソームに接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、特定の細胞に対して、外因性ヌクレオチド配列を含むエクソソームを標的化するために、エクソソームの表面において発現されるか、または当該表面にコンジュゲートされる。

標的細胞は、外因性ヌクレオチド配列が遺伝子活性をモジュレートすることが意図される細胞である。標的細胞は、インビトロまたはインビボにおける細胞であり得る。いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞、幹細胞、免疫細胞である。他の実施形態において、標的細胞は、神経細胞、間質性細胞、または筋細胞である。

標的細胞での遺伝子モジュレーションの評価
標的細胞での遺伝子活性のモジュレーションを評価するために使用することができる多くの方法が存在する。以下の方法は、方法の例として機能するものであり、限定ではない。いくつかの実施形態において、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、結果として、標的細胞における標的遺伝子の発現の減少を生じる。

ウェスタンブロットは、タンパク質の混合物から特定のタンパク質分子を検出するために分子生物学において使用される、広く使用される分析技術である。ウェスタンブロットは、タンパク質発現の量を測定するために使用することができる。当該方法は、ＳＤＳなどの界面活性と混合することによってタンパク質試料を調製するステップと、ゲル電気泳動を使用してタンパク質を分離するステップと、当該ゲルからブロッティング膜へとタンパク質を移すステップと、膜をブロックするステップと、一次抗体を用いてインキュベートするステップと、色または光を生成するレポーター酵素に結合した二次抗体を用いてインキュベートするステップと、この色または光を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態において、定量的ウェスタンブロットを実施することによって、遺伝子活性のモジュレーションを評価することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質量の減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、タンパク質量の増加は、遺伝子の上方調節の指標である。

細胞における遺伝子発現の変化は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して測定することができる。いくつかの実施形態において、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施することによって、遺伝子活性のモジュレーションを評価することができる。そのような方法は、標的細胞から全ＲＮＡを単離するステップと、ｃＤＮＡ合成を実施するステップと、ｑＰＣＲ反応を行わせるステップと、相対的定量化を使用してｑＰＣＲによる結果を解析するステップとを含み得る（Fleige and Pfaffl. 2006）。いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲ－グリーンまたはＴａｑＭａｎ／ＴａｑＰａｔｈプローブを使用して実施される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、ＲＮＡの増加は、遺伝子の上方調節の指標である。

いくつかの実施形態において、遺伝子モジュレーションを評価するために、レポーターアッセイが使用される。さらなる実施形態において、レポーターアッセイは、蛍光タンパク質、例えば、ｔａｇＢＦＰ、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ｍｃｈｅｒｒｙ、Ｒｕｂｙ２、ｍＯｒａｎｇｅ、シトリン、Ｃｌｏｖｅｒ、およびｍターコイズなどを使用する蛍光レポーターアッセイである。蛍光タンパク質レポーターシステムは、実施例１ならびに図５および６において説明される。蛍光タンパク質または融合タンパク質の発現の変化は、フローサイトメトリー、顕微鏡法、または高処理量定量的顕微鏡法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、蛍光シグナルの増加は、遺伝子の上方調節の指標である。

別の実施形態において、レポーターアッセイは、ルシフェラーゼベースのシステムを使用する。いくつかの実施形態において、使用することができるルシフェラーゼレポーターは、ウミホタルルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａ－Ｄｕｒａルシフェラーゼ、緑色ウミシイタケルシフェラーゼ、赤色ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、Ｎａｎｏ－Ｌｕｃルシフェラーゼ、またはＴｕｒｂｏＬｕｃルシフェラーゼである。ルシフェラーゼベースのシステムにおいて、遺伝子発現の変化は、ルミノメーターまたは修正光学顕微鏡を使用して測定されるが（McClure, et al. 2011）、他の手段、例えば、ｑＰＣＲ、ウェスタンブロット、免疫化学、またはフローサイトメトリーなどによって測定することもできる。いくつかの実施形態において、シグナルの減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、シグナルの増加は、遺伝子の上方調節の指標である。

本発明のいくつかの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、結果として、遺伝子発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少させる。典型的には、遺伝子発現は、６０％から１００％減少する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、結果として、遺伝子発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上増加させる。典型的には、遺伝子発現は、６０％から１００％増加する。

治療用途
外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームは、疾患の治療または予防において有用であり得る。したがって、本発明は、外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームを使用して患者の疾患または障害を治療または予防する方法を含む。用語「患者」は、予防処置または治療処置を受けるヒト対象および他の哺乳動物対象を包含する。

いくつかの実施形態において、外因性核酸は、ＲＮＡ治療のための治療的ＲＮＡ配列である。現在臨床試験中であるＲＮＡ治療の例としては、がん、肝線維症、緑内障、嚢胞性繊維症、潰瘍性大腸炎、Ｂ型肝炎感染症、ＩＩ型糖尿病、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型進行性筋ジストロフィー症、喘息、およびＨＩＶ感染症のためのＲＮＡ治療が挙げられる（Kaczmarek, et al. 2017）。そのようなＲＮＡ治療は、そのような治療的ＲＮＡをエクソソームにパッケージングすることによって標的細胞に対して送達システムを提供することにより、本発明から恩恵を受け得る。

本発明は、疾患または状態を治療または予防する方法であって、有効量の本発明のエクソソームを投与し、それにより、当該疾患を治療または予防するステップを含む方法も提供する。本発明のエクソソームは、当該エクソソームが得られる幹細胞と同じ疾患を治療するために使用することができる。

予防用途では、特定の疾患を発症するリスクを排除または減少するのに十分な、または疾患の発症を遅延させるのに十分な量において、当該疾患になりやすい患者、またはそうでなければそのリスクにある患者に、医薬組成物または医薬品が投与される。治療用途では、疾患および併発症の症状を回復させるのに十分な、または少なくとも部分的に抑制するのに十分な量において、そのような疾患が疑われる患者、または既に患っている患者に、組成物または医薬品が投与される。これを達成するのに適した量は、治療的または薬学的に有効な用量として定義される。予防的および治療的レジームでの両方において、薬剤は、十分な反応が達成されるまで、典型的には複数回投薬量において投与される。典型的には、当該反応はモニターされ、反応が弱まり始めた場合、反復投薬量が与えられる。

上記において説明した状態の治療のための本発明の組成物の有効用量は、多くの異なる要因、例えば、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物のどちらであるか、投与された他の医薬品、および治療が予防的かまたは治療的のどちらであるかなどに応じて変わる。

本明細書において使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「治療すること」、および「治療法」は、患者または対象に直接関連して使用される場合、障害に関連する１つまたは複数の症状の改善、あるいは障害または障害に関連する１つまたは複数の症状の防止または予防を意味するために用いられる。治療すべき障害としては、これらに限定されるわけではないが、変性障害、組織破壊に関わる障害、新生物障害、炎症性障害、自己免疫疾患、または移植された器官および組織の拒絶反応を含む免疫学的媒介疾患が挙げられる。症状の改善または防止は、治療を必要とする対象への、本発明の微粒子の投与、またはこれらの微粒子を含む医薬組成物の投与の結果として生じる。

本発明の外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームおよび方法は、増殖性疾患の治療において使用され得る。用語「増殖性疾患」は、本明細書に使用される場合、がんおよび非がん性疾患の両方を意味する。そのため、当該方法は、結果として、最終的に、異常に増殖する細胞、例えば、がん細胞、例えば、腫瘍細胞および他の（非悪性）腫瘍細胞などの殺傷を生じ得る。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、がん治療のために、治療的外因性ヌクレオチド配列をエクソソームへと送達する。本発明は、エクソソーム内への治療的ヌクレオチド配列のパッケージングを促進し、次いで、患者の細胞へと送達される。

ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡｓ／ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡは、がん遺伝子、例えば、がんにおけるＥＧＦＲ変異バリアントなどを標的化するために使用することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲまたは抗ｍｉＲＮＡのためのガイド鎖は、本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを使用して、エクソソームに搭載することができる。

したがって、本発明は、本発明の組成物を使用して患者においてがんを治療または予防する方法も含む。

用語「患者」は、予防処置または治療処置を受けるヒト対象および他の哺乳動物対象を包含する。

本発明の外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを搭載したエクソソームは、場合により、併用療法を提供するために別の治療薬と組み合わせてもよい。

医薬組成物
外因性ヌクレオチド配列を含むｐｒｅ－ｍｉＲ－２１を搭載したエクソソームは、治療法において有用であり、したがって、医薬組成物として製剤化することができる。薬学的に許容される組成物は、典型的には、本発明のエクソソームに加えて、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル、および／または賦形剤を含む。好適な担体の例は、乳酸リンゲル液である。そのような成分の十分な説明は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472において提供される。

語句「薬学的に許容される」は、本明細書において用いられる場合、十分に医学的な判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは併発症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用に対して好適である、合理的な恩恵／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を意味する。

本発明の組成物は、所望の場合、少量のｐＨ緩衝剤も含むことができる。担体は，貯蔵媒体、例えば、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡから市販されているＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）などを含み得る。好適な医薬担体の例は、E.W.Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するような好適な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態において、予防用または治療用エクソソームの予防的または治療的に有効な量を含有する。当該製剤は、投与の様式に適合させる必要がある。好ましい実施形態において、当該医薬組成物は無菌であり、対象、好ましくは動物対象、より好ましくは哺乳動物対象、最も好ましくはヒト対象への投与にとって好適な形態である。

本発明の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらは、例えば、半固体および液体投与形態、例えば、凍結乾燥調製物、液体溶液もしくは懸濁液、注射可能な不融性溶液などを含む。医薬組成物は、好ましくは注射可能である。

一般的に、医薬組成物は水性形態である。組成物は、保存料および／または酸化防止剤を含み得る。

医薬組成物は、浸透圧を制御するために、生理的な塩、例えば、ナトリウム塩などを含むことができる。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は好ましく、それは、１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの間において存在し得る。存在していてもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムが挙げられる。

組成物は、１つまたは複数の緩衝剤を含み得る。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には、５～２０ｍＭの範囲の濃度において含まれる。組成物のｐＨは、一般的に、５から８の間、より典型的には６から８の間、例えば、６．５および７．５、または７．０から７．８の間である。

組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくはグルテンフリーである。組成物は、好ましくは発熱性物質を含まない。

典型的な実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標））、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃｌ^－、Ｈ_２Ｐ０_４ ^－、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオネート、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストロン－４０、アデノシン、およびグルタチオンを含む組成物に懸濁される。典型的には、当該組成物は、双極性非プロトン溶媒、例えば、ＤＭＳＯなどを含まない。好適な組成物は、市販されており、例えば、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍａｓｏｌ（登録商標）－ＦＲＳである。そのような組成物は、エクソソームを４℃から２５℃において、長期間（数時間から数日間）貯蔵することを、または凍結温度、すなわち、－２０℃未満の温度において保存することを可能にする場合に有利である。次いで、エクソソームは、解凍後にこの組成物において投与され得る。

当該医薬組成物は、任意の適切な経路によって投与することができ、そのような経路は、治療すべき疾患または状態に応じて、当業者には明らかである。典型的な投与経路としては、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、脳内、鼻腔内、または腹腔内経路が挙げられる。

本発明のエクソソームは、治療的または予防的に有効な用量において投与され、そのような量は、当業者には明らかであろう。当該エクソソームの低い免疫原性または免疫原性が存在しないことにより、有害な免疫反応を引き起こすことなく、反復用量を投与することが可能である。

本発明は、下記の非限定的な実施例を参照しながらより詳細に説明される。

実施例の概要
本発明は、ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｐｒｉ－ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡの直鎖状配列および三次（３Ｄ）構造の両方、ＣＴＸ神経幹細胞から生じるエクソソーム中の特定のバリアントの相対的存在量についての分析の組み合わせから生じたものである。さらに、本発明は、回収されたエクソソームにおける高レベルのマイクロＲＮＡの発現およびアップシャトリングにつながる構造および配列を識別することから生じたものである。この知識は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１コンストラクトを設計するために使用され、この場合、選択する任意の外因性ヌクレオチド配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）の配列を、エクソソーム生合成の際にエクソソームに挿入し、標的化することができる。

本発明の発現ベクターは、合成により生産した本発明のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを用いるトランスフェクションのために、エレクトロポレーション、リポフェクション、または任意の他の同等な技術を使用したトランスフェクションと交換することができる。発現ベクターは、ｃ－ｍｙｃ発現、ホルボル１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、またはベクターまたは改変ベクターの発現を調節することができるＭＩＲ２１の外因性配列または人工配列に対する結合能力を有する他の転写因子に応じて、種々の転写因子を使用することによって、モジュレートすることができる。

[実施例１]細胞および転写因子依存性の方式においてｍｉＲの発現を調節するためにＭＩＲ２１ベクターを使用することができる
ＭＩＲ２１は、ＶＭＰ１遺伝子のイントロン配列に組み込まれることは理解されよう。しかしながら、Fujita et. al., 2008によって説明されるように、その発現は、プロモーター領域ｍｉＰＰＲ２１に含まれるそれ自体の調節エレメントに依存する（図１Ａ）。このプロモーター領域は、ｍｉＲ－２１ヘアピンに対して－３，７７０から－３，３３７上流に見出される。

図１Ａに表されるｍｉＰＰＲ－２１プロモーターにおいて強調表示されたエンハンサーエレメントは以下の通りである：

本発明者らは、ｍｉＲ２１エクソンに位置する任意のｍｉＲＮＡを発現する能力を調べるために、ＭＩＲ２１遺伝子の全長を含むベクターを設計した（図１Ａ）。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ－５ｐを発現しないかまたは非常に低いレベルでしか発現しない細胞において、ならびにｍｉＲ２１－５ｐが、発現されている最も高いｍｉＲＮＡであることを本発明者らが見出した本発明のＣＴＸ０Ｅ０３細胞において、発現ベクターが機能的であることを見出した（図１Ｂ、１Ｃ）。このことは、当該ベクターが細胞内容物に関係なく機能することを示している。

その上、本発明者らは、Fujita et. al., 2008によって説明されるように、おそらく、そのプロモーター上の調節配列に起因して、ベクターがＰＭＡによって調節することができることを見出した。

本発明者らは、転写因子ｃ－ｍｙｃの過剰発現は、ｍｉＲ２１の発現を効果的に増加させることができることも見出した（図１Ｄ）。したがって、ｍｉＲ２１に対するｍＲＮＡまたはｍｉＲ２１エクソンに位置する任意の他のｍｉＲＮＡの発現は、ｃ－ｍｙｃに依存するメカニズムによって細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３において調節することができる。

ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの転写、安定性、および正しいプロセシングを制御することができる他の調節配列を探すことによって、本発明者らは、異なる制限部位を含ませることによってベクターのいくつかの欠失コンストラクトを設計した。本発明者らは、その発現を制御しそのプロセシングに影響を及ぼし得るｍｉＲ２１エクソンの上流領域および下流領域に位置する調節エレメントの存在－したがって、エクソソームへの搭載を観察した（図２）。

[実施例２]ｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２を使用した設計および機能研究
理論に束縛されるわけではないが、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１の配列に存在するゆらぎ対および構造は、その折り畳み、プロセシング、およびＲＢＰとの相互作用において、したがって、エクソソームへの当該生成されたｍｉＲＮＡのソーティングにおいて、重要な役割を有することは理解されよう（図３）。この仮説を調べるために、正しくプロセッシングされた場合、蛍光タンパク質Ｒｕｂｙ２に対する機能的ｍｉＲＮＡを生成することになる、カセットｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２を含む発現ベクターを生成した（図３）。このカセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによってその転写を促進するために、遺伝子コード配列（ＣＤＳ）の３’ＵＴＲ領域に配置した。

ｐｒｉ－ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２の設計において、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐの天然構造、長さ、Ｇ－Ｕ対、ミスマッチ、欠失、およびループは維持されたが、天然の成熟ｍｉＲ２１－５ｐの配列に存在する２つのゆらぎ対は維持されなかった（図５Ｂ）。最終的に、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１－５上に見出される５’および３’末端配列に両側が挟まれ（図５Ｃ）、カセット全体をレンチウイルス発現ベクターにクローニングした（図５Ｄ）。

ＨＥＫ２９３細胞へのこのベクターのエレクトロポレーション後、細胞質における成熟ｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２の発現を、ｑＰＣＲによって検出し、それは、プロデューサー細胞株におけるｍｉＲＮＡの正しい生成およびプロセシングを示していた（図６Ａ）。このｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２は、プロデューサー細胞株においても機能的であり、このタンパク質を構成的に発現するＨＥＫ２９３において、Ｒｕｂｙ２に関するｍＲＮＡレベルに対するかなりの下方調節が観察された（図６Ｂ）。その上、プロデューサー細胞の培養培地由来の精製されたエクソソームにおけるｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２の存在が、共培養アッセイにおいてｑＰＣＲによって検出された（図６Ｃ）。精製されたエクソソーム中のｍｉＲ－Ｒｕｂｙ２による、タンパク質発現の下方調節に対する効果（図６Ｄ）およびｍＲＮＡ発現の下方調節に対する効果（図６Ｄ）も、共培養アッセイにおいて分析した。

[実施例３]発現ベクターｐＬＶＸ－Ｅｘｏ－ｍｉＲＮＡにクローニングされるｍｉＲＮＡの設計
設計されたベクターｐＬＶＸ－Ｅｘｏ－ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐの構造に基づいたエクソソームに搭載されるｍｉＲＮＡの発現を可能にするレンチウイルスベクターである。このベクターは、所望のｍｉＲＮＡカセットの発現のための安定した細胞株を生成するために、蛍光タンパク質Ｃｌｏｖｅｒおよびブラストサイジンに対する抗生物質選択タンパク質の発現も可能にする。

ｍｉＲ２１カセットは、発現およびエクソソームへのｍｉＲＮＡの搭載のために必要な全てのエレメントを含む。

ｐＬＶＸベクターへクローニングされるｍｉＲＮＡを生成させるために、当業者は、ｐＬＶＸベクターにクローニングされるべきｐｒｉ－ｍｉＲ２１の構造に基づいてｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを設計する必要がある。

ｐＬＶＸベクターにクローニングされるべきｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、下記の特徴を含むべきである：
１．制限酵素ＡｖｒＩＩに対応する６ヌクレオチド：ＣＣＴＡＧＧ；
２．ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ２１の５’配列に対応する１３０ヌクレオチド：

３．ｈｓａ－ｍｉＲ２１－５ｐの５’配列に対応する８ヌクレオチド：ＴＧＴＣＧＧＧＴ；
４．２１ヌクレオチド標的配列の逆相補体（成熟ｍｉＲＮＡ配列）。これは、一度転写されるとｍｉＲＮＡのステムになる。これは、利用可能な複数のオンラインツールのいずれかによって設計することができる。
５．ｈｓａ－ｍｉｒ－２１の末端ループに対応する１６ヌクレオチド：ＣＴＧＴＴＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧ；
６．標的センス配列のヌクレオチド２～６：
７．ワトソン－クリック塩基対相補性による標的アンチセンス配列に一致せず、ゆらぎ塩基対を形成する、１ヌクレオチド；
８．標的センス配列のヌクレオチド８～１２および１４～２１；
９．ｈｓａ－ｍｉＲ２１－５ｐの３’配列に一致する８ヌクレオチド：ＧＴＣＴＧＡＣＡ；
１０．ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１の３’配列に一致する１１２ヌクレオチド：

および
１１．制限酵素ＮｏｔＩに対応する８ヌクレオチド：ＧＣＧＧＣＣＧＣ。

設計した後、当該配列は、制限部位ＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩを使用して本発明の発現ベクターに直接クローニングするために、二本鎖ＤＮＡ配列としてオーダーすることができる。

[実施例４]
ｍｉＲＮＡのプロセシングおよびエクソソームへの搭載に対するさらなる調査は、設計されたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡカセットを含むベクターを、以下のように改変する：
・ｍｉＲ－２１－５ｐの５’および３’末端配列：異なるｍｉＲＮＡ由来の他の配列の代わりにこれらの配列で代用する；
・ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１－５ｐ構造：ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列におけるゆらぎ塩基対で代用し、標準的なワトソン－クリック対を使用する；
・内部ループ：他のループ配列でそれを置換する；
・ミスマッチおよび置換：これらを除去し、元のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列およびループを維持する設計されたｍｉＲＮＡの完全に相補的な鎖を生成する。

本願明細書に記載した実施例と実施形態は説明だけを目的としたものであり、本願明細書を参照するとさまざまな修正や変更が当業者に示唆され、そうした修正や変更は、本出願の本質内、範囲内に含まれるものであり、添付の請求項の範囲に含まれるものである。本願明細書で引用したあらゆる刊行物、配列アクセッション番号、特許、特許出願は、参考としてその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれているものとする。

選択された参考文献

Claims (26)

1. エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡであって、外因性ヌクレオチド配列およびステム－ループ構造を含み、前記ステムが少なくとも１つのゆらぎ対を含む、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
2. ａ．少なくとも１つのゆらぎ対を含む５’末端；ならびに／または
   ｂ．１つもしくは複数の欠失および／もしくはミスマッチを含む外因性ヌクレオチド配列；ならびに／または
   ｃ．ループおよび少なくとも１つのゆらぎ対を含む３’末端
   を含む、請求項１に記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
3. 構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、
   ここで：
   ａ．Ａは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であり、前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の５’末端に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の配列同一性を含み；
   ｂ．Ｂは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１において天然には見出されない外因性ヌクレオチド配列であり；
   ｃ．Ｃは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であり、前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端は、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の３’末端に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の配列同一性を含み、
   場合により、前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の配列に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、またはそれ以上の全配列同一性を含む、請求項１または２のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
4. 構造：
   

   

   を含み、
   ここで：
   Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし；
   Ｎ_Ｘは、ｎとハイブリダイズするヌクレオチド配列の任意の長さであり、場合により、Ｎ_ｘ１，Ｎ_ｘ２，およびＮ_ｘ３は、異なる長さを有し；
   Ｍは、ヌクレオチドであり、ｍとミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
   Ｄは、ヌクレオチドであり、前記ステムループ構造の片側にのみ存在し；
   Ｗは、ヌクレオチドであり、ｗとゆらぎ対を形成し；
   Ｌは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、ｌとハイブリダイズし得；
   前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：
   ［…］は、ｍｉＲ－２１ ５’末端構造的ミミックであるＡであり；
   ｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
   （…）は、ｍｉＲ－２１ ３’末端構造的ミミックであるＣである、
   請求項１～３のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
5. Ｎ_ｘ１は、４から１２ヌクレオチドを含み；Ｎ_ｘ２は、２から８ヌクレオチドを含み；Ｎ_ｘ３は、２から８ヌクレオチドを含む、請求項４に記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
6. 前記ステムループ構造が、６０から８０ヌクレオチドの全長を含み、場合により、前記外因性ヌクレオチド配列は、１９～２５ヌクレオチド長であり；および／または
   前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが、前記外因性ヌクレオチド配列の上流の転写因子調節プロモーターを含み、場合により、前記プロモーターが、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アクティベータータンパク質１（ＡＰ－１）、ＣＣＡＡＴ－エンハンサー－結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、血清応答因子（ＳＲＦ）、シグナル伝達および転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、ＧＣ－ｂｏｘ結合タンパク質、Ｅ２６形質転換特異的（ＥＴＳ）ファミリー転写因子、場合により、ＰＵ．１、核因子Ｉ（ＮＦＩ）転写因子、またはｐ５３の１つまたは複数によって調節される、請求項１～５のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
7. 構造：
   

   

   を含み、
   ここで：
   Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし；
   Ｍは、ヌクレオチドであり、ｍとミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
   Ｄは、ヌクレオチドであり、前記ステムループ構造の片側にのみ存在し；
   Ｗは、ヌクレオチドであり、ｗとゆらぎ対を形成し；
   Ｌは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、ｌとハイブリダイズし得；
   前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：
   ［…］は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であるＡであり；
   ｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
   （…）は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であるＣである、
   請求項１～６のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
8. 成熟ｍｉＲ－２１配列の代わりにｐｒｅ－ｍｉＲ－２１の配列および外因性ヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
9. 前記ゆらぎ対（Ｗ－ｗ）が、グアニン－ウラシル（Ｇ－ＵまたはＵ－Ｇ）、ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－ＵまたはＵ－Ｉ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－ＡまたはＡ－Ｉ）、および／またはヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－ＣまたはＣ－Ｉ）を含む、請求項１～８のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
10. 構造：
    

    

    を含み、
    ここで：
    Ｎは、任意のヌクレオチドでありｎとハイブリダイズし、場合によりワトソン－クリック対合によってｎとハイブリダイズし；
    Ｍは、ヌクレオチドであり、ｍとミスマッチであるかまたはｍとハイブリダイズせず；
    Ｄは、ヌクレオチドであり、前記ステムループ構造の片側にのみ存在し；
    前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、前記構造Ａ－Ｂ－Ｃを含み、ここで：
    ［…］は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ５’末端であるＡであり；
    ｛…｝は、外因性ヌクレオチド配列であるＢであり；
    （…）は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ３’末端であるＣである、
    請求項１～９のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
11. 前記外因性ヌクレオチド配列が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、またはＣＲＩＳＰＲガイド鎖配列である、請求項１～１０のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
12. 前記外因性ヌクレオチド配列が、エクソソーム生合成の際に、前記エクソソームに対して標的化される、請求項１～１１のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
13. 前記外因性ヌクレオチド配列が、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする、請求項１～１２のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ。
14. ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含むカセットであって、以下の順番で：
    ａ．５’ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１配列であって、場合により調節エレメントを含む配列；
    ｂ．請求項１～１３のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡミミック；および
    ｃ．３’ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１配列であって、場合により調節エレメントを含む配列
    を含む、カセット。
15. 請求項１４に記載のカセットまたは請求項１～１３のいずれか一項に記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む、ベクター。
16. 請求項１５に記載のベクター、請求項１４に記載のカセット、または請求項１～１３のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む、細胞。
17. 幹細胞であり、場合により神経幹細胞であり、場合によりＣＴＸ０Ｅ０３細胞であり、場合により部分的に分化した幹細胞である、請求項１６に記載の細胞。
18. 前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが、前記細胞におけるエクソソーム内に存在する、請求項１６または請求項１７に記載の細胞。
19. 外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載する方法であって、請求項１６、１７、または１８に記載の細胞からエクソソームを産生するステップを含む、方法。
20. エクソソーム、場合により請求項１～１３のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含むエクソソームを調製する方法であって、
    ａ．請求項１６、１７、または１８に記載の細胞を培養するステップ；
    ｂ．馴化培地を回収するステップ；場合により、
    ｃ．前記エクソソームの精製ステップ；および／または
    ｄ．前記エクソソームの検証ステップ
    を含む方法。
21. 請求項１９または請求項２０の方法によって得ることができるまたは得られるエクソソームであって、場合により、請求項１～１３のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む、エクソソーム。
22. 外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達する方法であって、
    請求項２１のエクソソームを使用するステップであって、前記標的細胞を前記搭載したエクソソームと接触させることを含むステップ；または
    細胞にトランスフェクトされる場合に前記外因性ヌクレオチド配列を送達する、請求項１～１３のいずれかに記載のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、請求項１４のカセット、または請求項１５のベクターを使用するステップであって、場合により前記外因性ヌクレオチド配列は前記標的細胞において選択的に発現され、場合により前記標的細胞は調節不全の遺伝子発現を有する病的細胞、例えばがん細胞または自己免疫疾患の細胞である、ステップ
    である、方法。
23. 標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする方法であって、請求項２１に記載のエクソソームを投与するステップを含む方法。
24. 請求項２１のエクソソームを含む医薬組成物。
25. 治療法での使用のための、請求項２１または２４に記載のエクソソーム。
26. エクソソームへのｍｉＲＮＡ搭載を制御するための、ｍｉｒ２１エクソンの上流領域または下流領域に位置する調節エレメントの１つまたは複数の使用であって、
    場合により、前記１つまたは複数の調節エレメントが、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アクティベータータンパク質１（ＡＰ－１）、ＣＣＡＡＴ－エンハンサー－結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、血清応答因子（ＳＲＦ）、シグナル伝達および転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、ＧＣ－ｂｏｘ結合タンパク質、Ｅ２６形質転換特異的（ＥＴＳ）ファミリー転写因子、場合によりＰＵ．１、核因子Ｉ（ＮＦＩ）転写因子、またはｐ５３の１つまたは複数によって調節される、使用。

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