JP2023507181A - ポリヌクレオチドをエクソソームに送達するための核酸コンストラクト - Google Patents

ポリヌクレオチドをエクソソームに送達するための核酸コンストラクト Download PDF

Info

Publication number
JP2023507181A
JP2023507181A JP2022537277A JP2022537277A JP2023507181A JP 2023507181 A JP2023507181 A JP 2023507181A JP 2022537277 A JP2022537277 A JP 2022537277A JP 2022537277 A JP2022537277 A JP 2022537277A JP 2023507181 A JP2023507181 A JP 2023507181A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mirna
exosomes
mir
sequence
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022537277A
Other languages
English (en)
Inventor
コルテリング,ランドルフ
デオグラシャス,ルーベン
Original Assignee
リニューロン リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by リニューロン リミテッド filed Critical リニューロン リミテッド
Publication of JP2023507181A publication Critical patent/JP2023507181A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141MicroRNAs, miRNAs
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50Physical structure
    • C12N2310/53Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531Stem-loop; Hairpin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50Physical structure
    • C12N2310/53Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/533Physical structure partially self-complementary or closed having a mismatch or nick in at least one of the strands
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/32Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/15011Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、miRNA分子MIR21、pri-miR-21、およびpre-miR-21において特定された構造的および調節的特性を使用して、外因性ヌクレオチド配列をエクソソーム内へと送達する。特に、本発明は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのpre-miRNAに関し、ここで、pre-miRNAは、外因性ヌクレオチド配列およびステム-ループ構造を含み、当該ステムは、少なくとも1つのゆらぎ対を含む。本発明は、操作されたpre-miRNAを含む核酸カセット、ベクター、および細胞、エクソソームに搭載する方法、ならびに結果として得られる搭載されたエクソソームも提供する。当該搭載されたエクソソームを使用して、例えば、療法において、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達することができる。

Description

本発明は、ヌクレオチド配列をエクソソームに送達することができる核酸コンストラクト、および目的のヌクレオチド配列を含むエクソソームを産生するためにこれらのコンストラクトを使用する方法に関する。
エクソソームは、エンドソームコンパートメントに由来する膜結合小胞であり、多胞小体(MVB)が細胞膜と融合する時に細胞から分泌される。エクソソームは、典型的には、30nmから120nmの間の直径を有する。エクソソームは、タンパク質、炭水化物、脂質、および核酸などの多くのタイプの生体分子を含有することができる。エクソソーム生合成は、細胞の界面活性剤不溶性膜画分において典型的に見出される、コレステロール、セラミド、および他の脂質によるそれらの膜の富化を伴う。例えば、テトラスパニンおよび他の膜貫通タンパク質および受容体などの、それらのソーティングおよび生物活性においてある役割を果たし得るタンパク質も、エクソソーム膜に埋め込まれている(Colombo et al. 2014)。
エクソソームの内腔は、標的細胞において転写および翻訳をモジュレートする能力を当該エクソソームに付与する特定のタンパク質および核酸、例えば、microRNA(miRNA)などを含む。エクソソーム内のmiRNAのレパートリーは、プロデューサー細胞の生理的状態を反映するようであり、その場合、選択されたmiRNAは、当該エクソソーム内へとシャトリングされる。エクソソーム内包miRNAまたはエクソソーム会合miRNAの分泌は、それらを産生する細胞のパラクリン活性を生じさせることにおいてある役割を果たすことも観察されている。このメカニズムは、正常な状態においてと、局所刺激、例えば、感染症、栄養飢餓、または低酸素血症などに応答してとの両方において、細胞が局所的かつ遠隔の制御を発揮することを可能にし得る。
エクソソームに目的のmiRNAなどの外因性カーゴ分子を搭載することは、細胞間においてシグナルを送達するそれらの能力を利用する有用な方法として提案されている。1つの方法は、目的の生物学的分子を回収されるエクソソーム内に直接導入することである。しかしながら、これは、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの技術を使用する小さいスケールにおいて可能であるにもかかわらず、これらの技術は、大きなスケールにおいて反復可能、規模拡大縮小可能、または信頼できるとは証明されていない。その上、これらの技術は、エクソソームの構造を損なうことさえあり得る(Janas, et al. 2015)。
miRNAは、細胞によってエクソソーム内へと選択的にシャトリングされることが分かっている。miRNAコード配列の約60%は、遺伝子内領域または遺伝子間領域に位置し、したがって、発現は、一次遺伝子の発現を調節する、調節配列および転写因子に依存する。しかしながら、より少ない割合のmiRNAコード領域は、遺伝子間領域に位置し、それら自身のプロモーター配列、エンハンサー、およびリプレッサーを含む。したがって、これらmiRNAの発現は、他の遺伝子によって統制されるプロモーター媒介活性化を頼りにする細胞依存かつ刺激依存の方式においてそれらの正常な発現を特異的に制御するための規則の追加のレベルに依存する。両方の場合において、miRNAは、最初に転写され、pri-miRNA(「一次miRNA」)と呼ばれる長い前駆体内に埋め込まれ、この場合、機能的miRNAは、酵素Droshaを含むタンパク質複合体によるその効率的で正しいプロセシングおよび切断にとって必要な配列によって囲まれる。Droshaによる核での正しいプロセシングは、pre-miRNAとして知られるより短い前駆体を形成する。このpre-miRNAは、典型的には、ステム-ループ構造を形成し、それは、次いで、RNase DICERおよびアルゴノート(Ago)タンパク質を含むタンパク質複合体RISCによって認識される場合に、核から細胞質へと輸送される。Dicerは、pre-miRNA構造のループ部分を切断して、成熟二本鎖miRNAを形成し、鎖の1つ(パッセンジャー鎖として知られる)は、おそらくAgoによって、分解されるかまたは破棄され、RISC内に一本鎖ガイド鎖を残す。RISC複合体は、次いで、一本鎖miRNAガイド鎖に対して相補的な配列を含むメッセンジャーRNAの遺伝子発現をサイレンシングすることができる。ヘアピンの長さおよびpre-miRNAにおけるループのサイズの両方は、DICERによる正確な切断のために、およびガイドmiRNA鎖の局在化のために、不可欠であることが示唆されている(Tsutsumi, et al. 2011)。
現在、エクソソーム内へとシャトリングされるmiRNAが、どのようにしてエクソソームを産生する細胞においてRISCによる細胞質プロセシングを回避するかは不明である。Agoタンパク質は、一般的に、エクソソームに位置せず、このことは、エクソソーム内へのmiRNAのソーティングための特異的メカニズムを示唆している。エクソソーム内へのmiRNAのアップシャトリングは、MVB形成の際にエンドソーム膜に位置するセラミドに対して高い親和性を有するRNA結合タンパク質(RBP)の様々なセットとpre-miRNAまたは成熟miRNAとの相互作用を必要とすることが分かっている(Villarroya-Beltrei, et al. 2013)。しかしながら、異なる細胞とmicroRNAとの組み合わせは、シャペロンとして異なるRBPを報告している。RBPのどれがエクソソームへのmiRNAsの選択的シャトリングを担っているかに関する統一見解は存在しないようであり、細胞毎に異なるRBPが採用されるようである。
エクソソーム内へのmiRNAのソーティングに関与するRBP相互作用モチーフの特定は、目的の外因性ヌクレオチドを運搬するエクソソームを産生するための細胞の遺伝子改変の可能性を開いた。しかしながら、RNA結合タンパク質および配列タグのいくつかの細胞/microRNA特異的シャトリングは特定されているが、エクソソーム内へのmiRNAパッケージングの普遍的に適用可能でかつ許容されるモードは、まだ特定されていない。いくつかのグループは、EXOモチーフ(GCCG、UGAC、UCCG、GGAC、GGCGおよびUGCC)と称される小さい配列が、エクソソーム内へのmiRNAのソーティングを担い得ることを示唆している。多くの天然に存在するmiRNAにおけるその存在にもかかわらず、改変されたmiRNAをEXOモチーフによってエクソソームに搭載する効率は、可変であり、細胞および搭載される標的配列に依存し、場合によって、恩恵を示さない(Villarroya-Beltrei, et al. 2013)。他のものは、miRNAによって標的化される多くのmRNAの3’非翻訳領域(3’UTR)に見出される25ヌクレオチド配列を使用しており、それは、メッセンジャーRNA(mRNA)を、したがって、多形膠芽腫細胞株から分泌される微細小胞内の可能性のあるmiRNAを、アップシャトリングするのを助けることが観察された。これら25ヌクレオチド配列は、「ジップコード」と称され、全てが、ステム-ループ構造上に存在するCUGCCコア配列を利用する(Bolukbasi, et al. 2012)。
国際公開第2018/209182号パンフレットには、エクソソームへと選択的にソートし、カーゴをエクソソームへと送達することができる、「EXOコード」と呼ばれる特定のRNA配列について記載されている。Sutaria et al (2017)には、細胞外小胞へのTAR RNAループの搭載を増強するための、TATペプチド/HIV-Iトランス活性化反応(TAR)RNA相互作用ペプチドの使用について記載されている。国際公開第2019/226603号パンフレット、国際公開第2019/204733号パンフレット、および国際公開第2015/183667号パンフレットには、ハイブリッドtRNA-miRNAステム-ループ構造について記載されている。これらの操作されたキメラ核酸は、細胞または患者への送達のために合成リポソーム内またはナノ粒子内にパッケージングすることができる。
まとめると、細胞タイプにわたる全般的有用性のために十分に効率的に機能する、エクソソーム生合成の際にエクソソームに外因性ヌクレオチド配列を搭載するための明確な統一的な配列または決定因子は存在しない(Yoo, et al. 2018)。
国際公開第2017/054085号パンフレットには、改変されたpre-miR-451構造的ミミックを含む発現ベクターを使用してmiRNAをエクソソームに搭載する方法について記載されている。米国特許第8,273,871号明細書およびYang, et al. 2010にも、pre-miR-451の特異な特性について記載されている。この技術は、Agoの低発現レベルを有するかまたは好ましくはAgoを発現しない細胞株、ならびに、好ましくは天然において高レベルのmiR-451を産生するもの、および/またはDICERによる切断を必要としないmiRNAを必要とする。国際公開第2017/054085号パンフレットによって説明されるベクターにおいて、ステムmiRNAおよびループは、配列にかかわらず、pre-miRNAの長さを維持する、設計されたヌクレオチド配列によって置き換えられる。著者らは、ループの配列にかかわらず、miRNAの正しい長さを維持することが、pre-miRNAをプロセシングするための切断部位を維持するはずであると主張している。これとは逆に、Guら(Cell 151. 900-911 November 9 2012)は、ループの配列は、miRNAの正しいプロセシングにとって重要ではないが、ループとmiRNAの配列との間の距離は、miRNAを放出させるためにpre-miRNAの正しい切断を生じるためだけではなく、生成されたmiRNAの不適切な形態の非特異的認識に起因する任意のオフターゲット効果を避けるためにも、重要であると報告した。したがって、miRNAの正しいプロセシングは、正しい長さだけではなく、正しい機能も有する分子を得るための基本的ステップである。
その上、安定したRNA-タンパク質複合体を形成するためのRBPによるRNAヘリックス(A形態またはB形態)の正確な認識は、天然に存在するpre-miRNAにおいて観察される非ワトソン-クリックゆらぎG-U対(non-Watson-Crick wobble G-U pair)に依存し得る。大きなRNA-タンパク質複合体の三次元構造に関する研究は、ゆらぎG-U対は、重要な構造エレメントであり、RNAの天然の折り畳みおよびRBPによるその認識を可能にするように、RNAの深い溝を歪ませることを調査した。これらの三次元研究は、特定のRBPによって認識されるべきにmiRNAに異なる空間的コンフォメーションを与える他の塩基対も特定した(Arachchilage et al. 2015)。これにもかかわらず、先に説明したアプローチのいずれも、ループ構造またはpre-miRNA配列などpre-miRNAの一部における非標準G-Uゆらぎ対の機能的重要性を考慮していない。
予測可能で効率的で制御可能な方式において目的のヌクレオチド配列をエクソソームに搭載できることが依然として必要とされている。
本発明は、MIR21、pri-miR-21、およびpre-miR-21のそれぞれが、外因性ヌクレオチド配列をエクソソーム内へと送達するために利用することができる特性を有するという驚くべき発見に基づいている。
一部において、本発明は、遺伝子MIR21が、miRNA発現を制御するために利用することができ、外因性ヌクレオチド配列をエクソソーム内へと送達するためにも利用することができる、miR-21の5’および3’フランキング領域における調節配列を含むという驚くべき発見に基づいている。特に、本発明者らは、MIR21プロモーターは、例えば、転写活性化、他のmicroRNAの使用、抗miR、または組換え遺伝子操作において現在採用されている任意の他の技術によって、細胞特異的および/または刺激特異的方式において調節することができることを見出した。この調節は、実施例において実証されるように、転写因子c-Mycの発現を伴うメカニズム(または複数のメカニズム)によって行われ得る。本発明者らは、miR21の発現のリプレッサーとして機能するmiR21までの5’上流配列における領域も特定した。したがって、特定された調節配列の機能の制御(例えば、存在または不在)を使用することにより、エクソソーム内への外因性ヌクレオチド配列の送達を制御することができる。
したがって、MIR21遺伝子の上流領域および下流領域に位置する調節エレメントの1つまたは複数を使用することにより、エクソソームへのmiRNAの搭載を制御することができる。任意のmiRNA(または他の目的の核酸)は、所望の調節領域を操作することによって、搭載および制御することができる。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、miR-21ヘアピンに対して-3,770塩基対から-3,337塩基対上流におけるpri-miR-21に見出されるmiPPR-21プロモーター領域の全てまたは一部を含む。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、pri-miR-21由来のリプレッサーを含む。いくつかの実施形態において、pri-miR-21由来のリプレッサーは、削除されるかまたは不活性化される。これらのmiRNA搭載調節エレメントの特定は、さらに、いくつかの実施形態において、これらのエレメントを含むプロデューサー細胞を、調節エレメントに結合する転写因子または他の因子と接触させることによって、エクソソームへのmiRNAの搭載を駆動することを可能にする。ある特定の実施形態において、部位特異的ゲノム編集(例えば、CRISPR)を使用することにより、所望の外因性RNA配列、例えば、成熟miRNA配列をMIR21遺伝子座に追加または挿入することができ、したがって、任意の所望のmiRNA配列(または他の核酸カーゴ)に対してMIR21制御およびエクソソーム搭載メカニズムを利用することができる。これは、エクスビボまたはインビボにて、細胞において発現させることができる。さらなる実施形態において、RNAカーゴと共にpri-および/またはpre-miR-21-5p調節エレメントを含むコンストラクトは、1つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含むように操作され得、エクスビボにおいて合成することができ、細胞内へとトランスフェクトすることができるか、またはインビボにおいて治療用または遺伝子送達ビヒクルとして使用することができるる。
その上、本発明者らは、外因性RNAカーゴを含む操作されたRNAの発現は、いくつかの特定された転写因子によって調節することができ、それにより、ある程度の細胞特異的発現を付与することができ、それにより、そのような識別された転写因子を発現する細胞は、そのような転写因子を発現しない細胞より多くのカーゴRNAを転写するであろうと考慮する。このことは、ある特定の疾患状態、例えば、これらの転写因子を上方調節し得るがんなどにおいて興味深くあり得る。
その上、本発明者らは、エクソソームパッケージングにとって重要であり、エクソソーム内へ外因性ヌクレオチド配列を送達するために利用することができる、pre-miR-21ステムおよびループ配列内に含まれるいくつかのゆらぎ対、ミスマッチ、および欠失が存在することを特定した。これらのエクソソームは、その後に治療利用され得るか、またはレシピエントまたは標的細胞への組換えRNAまたは外因性RNAのための送達システムとして、インビトロにおいて使用され得る。本発明者らは、さらに、MIR21の正しい発現のための安定化配列として機能するmiR21の3’下流配列における領域も特定している。理論に束縛されるわけではないが、miR-21-5pのこれらの構造的特徴は、正しいプロセシング、空間的折り畳み、およびエクソソーム内へのこれらの小さな非コードヌクレオチドのソーティングにとって重要であると考えられる。
したがって、目的のヌクレオチド配列は、天然の成熟miR-21 miRNA配列の代わりに、pri-miRNA-21またはpre-miR-21配列内に挿入することができ、エクソソーム内へ送達されると予想することができる。
したがって、本発明は、外因性ヌクレオチド配列を含むように改変された、pri-miR-21またはpre-miR-21の一次、二次、および/または三次構造に基づいて、核酸コンストラクトを提供する。このコンストラクトは、エクソソームに選択的に搭載するために有用である。このコンストラクトは、リボ核酸カーゴ、例えば、microRNA、抗miR、モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNA(ショートヘアピンRNA)、および小さいmRNAなどをエクソソームに搭載するために特に有用である。そのような遺伝子操作は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、Znフィンガーエンドヌクレアーゼ、CRISPR/Cas、TALEN、および当技術分野で一般的に知られているプライム編集などを使用する遺伝子編集技術によって達成することができる。
ある特定の実施形態において、改変されたpri-またはpre-miR-21は、典型的には、外因性核酸(例えば、miRNA)の正しいプロセシングを駆動するための制御されたメカニズムによって任意の細胞における外因性核酸(例えば、miRNA)の発現を可能にするために、miR21-5pのためのRNAの発現のプロモーター領域;リプレッサー;エンハンサー;および/または安定化剤;のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態において、改変された配列は、RNA結合タンパク質(RBP)によるpre-miRNAの認識を可能にするようにRNAの深い溝を歪めると考えられる、ゆらぎ対も含む。これらのRBPは、典型的には、エクソソーム膜に位置するセラミドに対して高い親和性を有する。したがって、天然のpriおよび/またはpre-miR-21の構造的および機能的特徴を維持することによって、目的のヌクレオチド配列は、制御された発現メカニズムによってエクソソームへと標的化することができる。
本発明の第1の態様は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのpre-miRNAを提供し、その場合、当該pre-miRNAは、ステムループ構造を含み、当該ステムは、少なくとも1つのゆらぎ対を含む。
本発明の別の態様は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのpre-miRNAの発現のためのpri-miRNAを提供する。当該pri-miRNAの発現は、典型的には、プロモーター領域によって駆動され、調節配列および安定化配列を含み、この場合、当該pre-miRNAは、ステムループ構造を含み、当該ステムは、少なくとも1つのゆらぎ対を含む。典型的には、当該発現は、制御可能であり、および/または高レベルである。
本発明の別の態様は、エクソソームに対して外因性配列を標的化するために、pre-miR-21の天然配列を外因性ヌクレオチド配列によって置き換えるように遺伝子改変することができる遺伝子座としてMIR21を提供する。そのような遺伝子操作は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、Znフィンガーエンドヌクレアーゼ、CRISPR/Cas、TALEN、および当技術分野で一般的に知られているプライム編集などを使用する遺伝子編集技術によって達成することができる。
改変されたpri-および/またはpre-miR-21は、ミスマッチおよび欠失も含み得、それらは、pre-miRNAの三次元構の判別を支援し、結果として、RBPによる認識を促進するとも考えられる。ある特定の実施形態において、本発明のpre-miRNAは、ゆらぎ対を含むpre-miRNA 5’末端;および/または1つまたは複数の欠失および/またはミスマッチを含む外因性ヌクレオチド配列;および/またはループおよびゆらぎ対を含むpre-miRNA 3’末端をさらに含む。
いくつかの実施形態において、pre-miRNAは、ステムに1つまたは複数のゆらぎ対を有するステム-ループ二次構造を含み得る。本発明の実施形態において、当該ゆらぎ対は、1から5ヌクレオチド長、例えば、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長であり得る。
別の実施形態において、pre-miRNAは、ステムに1つまたは複数の塩基対ミスマッチを含むステム-ループ二次構造を含み得る。これらのミスマッチ塩基対は、ステム内に不対領域を生じさせる。いくつかの実施形態において、ミスマッチ領域は、1から5ヌクレオチド長、例えば、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長であり得る。ミスマッチは、図5Bにおいてハッシュ(♯)でマークされた位置に示される。
別の実施形態において、pre-miRNAは、ステムに1つまたは複数の塩基欠失を含むステム-ループ二次構造を含み得る。いくつかの実施形態において、当該欠失は、1から5ヌクレオチド長、例えば、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長であり得る。典型的には、欠失は、ステムにおけるその反対側に、対応する塩基が存在しない1つまたは複数のヌクレオチドをステム領域に残す(すなわち、ステム二重鎖の真半分は、異なる長さである)。これは、例えば、二重鎖の片方は20ヌクレオチドを有し、他方は22ヌクレオチドを有するといったように、非対称ステム二重鎖として見ることができる。欠失は、図5Bにおいてアスタリスク(*)によってマークされた位置に示される。
本発明に従って、任意の好適な外因性ヌクレオチド配列を用いることができる。この配列は、pre-miR-21における天然の成熟miR-21の全てまたは一部が置き換えられるため、外因性である。典型的には、当該外因性配列は、RNAである。それは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド上に存し得る。それは、典型的には、一本鎖RNAである。いくつかの実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、遺伝子編集での使用のためのRNA、miRNA、shRNA、sgRNA、またはガイドRNAである。いくつかの実施形態において、本発明のpre-miRNAにおける外因性ヌクレオチド配列は、19~25ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列の長さは、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長である。本発明のさらなる実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、shRNA、siRNA、miRNA、抗miR、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、CRISPRガイドRNAのためのヌクレオチド配列、または任意の他の外因性ヌクレオチド配列である。例示的実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、成熟miR-21ではなく、場合により、21、22、または23ヌクレオチドからなる少なくとも1つの鎖を含む二重鎖を含む、成熟miRである。一実施形態において、当該外因性配列は、図5Bに示されるように、miR-21の20/22非対称ヌクレオチド構造を有する。
ある実施形態において、pre-miRNAは、1から5ヌクレオチド長、例えば、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長のゆらぎ対;および/または1から5ヌクレオチド長、例えば、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長のミスマッチ;および/または1から5ヌクレオチド長、例えば、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長の欠失;および/または19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長の外因性ヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、pre-miRNAは、4、5、6、7、8、または9ヌクレオチドのループ長全体を含むステム-ループ二次構造を含む。一実施形態において、当該ループは、7ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、当該ループ構造は、配列5’-CUCUAAG-3’を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、当該pre-miRNAは、25から35ヌクレオチド、例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35ヌクレオチドのステム長全体を含むステム-ループ二次構造を含み得る。
pre-miRNAの構造は、そのエクソソームパッケージングにとって重要であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、当該改変されたpre-miR-21は、天然miR21-5pの一次、二次、および/または三次構造と構造的に類似する。
本発明のある特定の実施形態において、pre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで、Aは、pre-miRNA 5’末端であり、当該pre-miRNA 5’末端は、pre-miR-21の5’末端に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%配列同一性を含み;Bは、pre-miR-21において天然には見出されない外因性ヌクレオチド配列であり;Cは、pre-miRNA 3’末端であり、当該pre-miRNA 3’末端は、pre-miR-21の3’末端に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%配列同一性を含み、場合により、全pre-miRNAは、pre-miR-21の全配列に対して少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%またはそれ以上の全配列同一性を含む。
「5’末端」によって、成熟miRNA/外因性配列に隣接する、非ループ(開放)末端におけるステム二重鎖の両方の鎖上の配列が意味される。これは、図5Bに示される。典型的には、当該5’末端配列は、二重鎖の各鎖上の7から9ヌクレオチドを含む。典型的には、当該5’末端配列は、pre-miRNA二重鎖の各側における8ヌクレオチド長である。
「3’末端」によって、ループと成熟miRNA/外因性配列に隣接する部位とを含む二重鎖の末端が意味される。3’末端は、ループ構造と少なくとも1つまたは2つのゆらぎ対を含む。3’末端は、図5Bに3’-ループとして標識される。
本発明の特定の実施形態において、pre-miR-21構造的ミミックは、下記を含み:
Figure 2023507181000001
ここで、
Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし;
は、nとハイブリダイズするヌクレオチド配列の任意の長さであり、場合により、Nx1、Nx2、およびNx3は、異なる長さを有し;
Mは、ヌクレオチドであり、ミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
Dは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し;
Wは、ヌクレオチドであり、wとゆらぎ対を形成し;
Lは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、lとハイブリダイズし得;
は、1~5ヌクレオチドであり得、
[…]は、miR-21 5’末端構造的ミミックであるAであり;
{…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
(…)は、miR-21 3’末端構造的ミミックであるCである。
いくつかの実施形態において、Lは、4、5、6、7、8、または9ヌクレオチドを含む。一実施形態において、ループは、7ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、ループ構造は、配列5’-CUCUAAG-3’を含むかまたはそれからなる。
本発明のある特定の実施形態において、pre-miRNAは、下記の構造を有し:
Figure 2023507181000002
ここで、
Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし、
は、nとハイブリダイズするヌクレオチド配列の任意の長さであり、場合により、Nx1、Nx2、およびNx3は、異なる長さを有し;
Mは、ヌクレオチドであり、mとミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
Dは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し;
Wは、ヌクレオチドであり、wとゆらぎ対を形成し;
Lは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、lとハイブリダイズし得;
当該pre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで:
[…]は、miR-21 5’末端構造的ミミックであるAであり;
{…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
(…)は、miR-21 3’末端構造的ミミックであるCである。
任意の好適な外因性ヌクレオチド配列(N)は、本発明に従って用いることができる。いくつかの実施形態において、Nは、1、2、3、4、5、または6ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態において、Nx1は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18ヌクレオチド長であり;および/またはNx2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18ヌクレオチド長であり;および/またはNx3は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18ヌクレオチド長であり;またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、Nx1は、4から12ヌクレオチドを含み;および/またはNx2は、2から8ヌクレオチドを含み;および/またはNx3は、2から8ヌクレオチドを含み;またはそれらの任意の組み合わせである。典型的には、Nx1は、7、8、または9ヌクレオチド長であり、および/またはNx2は、4、5、または6ヌクレオチド長であり、および/またはNx3は、4、5、または6ヌクレオチド長であり、あるいはそれらの任意の組合せである。一実施形態において、Nx1は、8ヌクレオチド長であり、Nx2は、5ヌクレオチド長であり、Nx1は、5ヌクレオチド長である。
本発明の実施形態において、pre-miRNAは、全体の長さが約60から80ヌクレオチド長を有するステムループ二次構造を含み、場合により、当該外因性ヌクレオチド配列は、19~25ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、当該ステム-ループ二次構造は、全体の長さが約60、65、70、75、または80ヌクレオチド長を含み得る。典型的には、成熟miRNA内へのプロセシングのために必要な切断部位は、保持される。
ある特定の実施形態において、pre-mRNAは、下記の構造を含み:
Figure 2023507181000003
ここで:
Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし;
Mは、ヌクレオチドであり、mとミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
Dは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し;
Wは、ヌクレオチドであり、wとゆらぎ対を形成し;
Lは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、lとハイブリダイズし得;
当該pre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで:
[…]は、pre-miRNA 5’末端であるAであり;
{…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
(…)は、pre-miRNA 3’末端であるCである。
いくつかの実施形態において、本発明は、成熟miRNAではないpre-miR-21の配列を含むpre-miRNAと、成熟miRNAの代わりの外因性核酸とを提供する。
いくつかの実施形態において、ゆらぎ対(W-w)は、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)、ヒポキサンチン-ウラシル(I-UまたはU-I)、ヒポキサンチン-アデニン(I-AまたはA-I)、および/またはヒポキサンチン-シトシン(I-CまたはC-I)を含む。いくつかの実施形態において、当該ゆらぎ対は異なる。例えば、1つまたは複数のゆらぎ対は、任意の順序および任意の組み合わせにおいて、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)、ヒポキサンチン-ウラシル(I-UまたはU-I)、ヒポキサンチン-アデニン(I-AまたはA-I)、および/またはヒポキサンチン-シトシン(I-CまたはC-I)を含み得る。他の実施形態において、当該ゆらぎ対は、同じであり、例えば、すべて、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)、ヒポキサンチン-ウラシル(I-UまたはU-I)、ヒポキサンチン-アデニン(I-AまたはA-I)、あるいはヒポキサンチン-シトシン(I-CまたはC-I)である。典型的には、当該ゆらぎ対は、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)を含む。
ある特定の実施形態において、pre-miRNAは、下記の構造を含み:
Figure 2023507181000004
ここで:
Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし;
Mは、ヌクレオチドであり、mとミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
Dは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し;
当該pre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで:
[…]は、pre-miRNA 5’末端であるAであり;
{…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
(…)は、pre-miRNA 3’末端であるCである。
疑義を避けるため、この実施形態における5’末端、外因性配列、および3’末端は、以下の通りである:
Figure 2023507181000005
別の実施形態において、pre-miRNAは、下記の構造を含み:
Figure 2023507181000006
ここで:
Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし;
Mは、ヌクレオチドであり、mとミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
Dは、ヌクレオチドであり、ステムループ構造の片側にのみ存在し;
当該pre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで:
[…]は、pre-miRNA 5’末端であるAであり;
{…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
(…)は、pre-miRNA 3’末端であるCである。
任意の好適な外因性ヌクレオチド配列を、本発明に従って用いることができる。本発明のさらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、siRNA、miRNA、抗miR、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、CRISPRガイドRNAのためのヌクレオチド配列、または任意の他の外因性ヌクレオチド配列である。本発明のさらなる実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、miRNA、例えば、miR-146-bまたはmiR-1246、あるいは任意の選択されたsiRNAのshRNA同等物である。典型的には、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、miRNAである。
いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトは、エクソソーム生合成の際に、エクソソームに対して標的化される。
いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の下方調節を生じる。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上減少させる。典型的には、遺伝子発現は、60%から100%減少する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上増加させる。典型的には、遺伝子発現は、60%から100%増加する。遺伝子活性のモジュレーションは、ウェスタンブロット、qPCR、蛍光レポーターアッセイ、またはルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して評価することができる。あるいは、遺伝子活性のモジュレーションは、治療成果を測定することによって、典型的には、目的の疾患の症状を改善することによって、評価することができる。
ある実施形態において、本発明のpre-miRNAは、時にはpre-miR-21構造的ミミックと称され、pre-miR-21の生物学的機能を保持する。「pre-miR-21構造的ミミック」は、pre-miR-21と実質的に構造的および/または機能的に類似するpre-miRNAである。pre-miR-21構造的ミミックは、配列は異なり得るが、pre-miR-21の1つまたは複数の生物学的機能を維持する。「1つまたは複数の生物学的機能を維持する」によって、当該ミミックが、問題の生物学的機能の少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%を保持することが意味される。特定の実施形態において、問題の生物学的機能は、エクソソームへのpre-miR-21構造的ミミックのソーティングであり得る。この実施形態において、本発明のpre-miRNAは、配列は異なり得るが、天然のmiR21-5pと構造的および/または機能的に類似する一次、二次、および/または三次構造を共有し、それにより、天然のpre-miR-21のレベルの少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%でエクソソームにパッケージングされる、miRNAである。精製されたエクソソームに存在する外因性ヌクレオチド配列の量は、qPCRを使用して定量化することができる。
別の実施形態において、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21の結合親和性の少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%の結合親和性でRBPに結合することができるような構造的および/または機能的に類似する一次、二次、および/または三次構造を共有する。別の実施形態において、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21の結合親和性の少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%の結合親和性でmiRNAプロセシング酵素に結合することができるような構造的および/または機能的に類似する一次、二次、および/または三次構造を共有する。miRNAプロセシング酵素の例としては、Ran-GTP、エクスポーチン-5、およびDicerが挙げられる。pre-miRNAの結合親和性は、例えば、蛍光偏光(FP)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、および表面プラズモン共鳴法(SPR)によって測定することができる。他の好適な技術としては、RBPへのmiRNAの結合を特異的に検出するため、またはRNA-免疫沈降アッセイ(RIP-ChIPアッセイ)を実施するための、場合により古典的IHC/ICCを伴う、FISH/SCOPEが挙げられる。
エクソソーム中にまさにRNAが存在することを検出するためには、FISH/SCOPEおよび/またはqPCRは好適である。
いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAは、天然のpre-miR-21-5pの配列に対して少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、またはそれ以上の配列同一性を含む。操作されたpre-miRNAは、天然のpre-miR-21の三次元構造を模倣し、それにより、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21のようにエクソソーム生合成の際に、エクソソーム中へと標的化されることが意図される。これは、pre-miR-21構造的ミミックと称される。
ある特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、pre-miR-21-5pの長さ、ゆらぎ対、ミスマッチ、および欠失に関して、成熟miR21-5pのステムの天然の一次、二次、および/または三次構造を保持し得る。別の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、成熟miR-21-5pのステムの天然構造に存在する下記の特徴:miR-21-5pの長さ全体;および/またはゆらぎ対;および/またはミスマッチ;および/または欠失を含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、miR-21-5pより長いかまたは短く、および/または外因性ヌクレオチド配列は、miR-21-5pと比較して、増加または減少した数のゆらぎ対を含み、および/または外因性ヌクレオチド配列は、miR-21-5pと比較して、増加または減少した数のミスマッチ塩基対を含み、および/または外因性ヌクレオチド配列は、miR-21-5pと比較して、増加または減少した数の欠失を含む。
本発明の第2の態様において、本発明のpre-miRNAを含むカセットが提供される。いくつかの実施形態において、当該カセットは、以下:5’pri_miR-21配列;前記請求項のいずれかに記載のpre-miRNA;および3’pri_miR-21配列を(その順番で)含む。
ある特定の実施形態において、miRNA発現カセットは、pri-およびpre-miRNAの元の配列および長さ、例えば、天然のpre-miR-21内のループ、ミス対、ゆらぎ対、および塩基対合の欠如などを保存する。
例示的実施形態において、カセットは、遍在するプロモーター領域;細胞特異的プロモーターあるいは特定のおよび/または選択された転写因子結合部位を有するプロモーター;miRNAの5’上流配列中のエンハンサーまたはリプレッサー;ならびに/あるいはmiRNAの3’下流配列中の3’エンハンサー、リプレッサー、または安定化配列を含む。
いくつかの実施形態において、天然のmiR-21リプレッサー配列は、存在しないかまたは機能的ではない。
本発明の一実施形態において、本発明者らは、pri-およびpre-miRNAの元の配列および長さ、例えば、元の天然に存在するmiRNA内のループ、ミスマッチ対、ゆらぎ対、および塩基対合の欠如などを保存するmiRNA発現カセットを設計および生成した。これは、pre-miR-21エクソソームのシャトリング配列および機能を利用するミミックによって生成された当該構造を維持することが意図される。
本発明の第3の態様は、本発明のカセットまたは本発明のpre-miRNAを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドベクターのpEF1-α、pTK、pCAG、pSV、およびpCMVシリーズ、ワクシニア、およびレトロウイルスベクター、ならびにバキュロウイルスを包含する。特定の実施形態において、本発明のベクターは、レンチウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、当該ベクターは、サイトメガロウィルス(CMV)、CAG、EF1-α、TK、およびSV40のためのプロモーターを含む。
本開示の第4の態様は、本開示のベクター、カセット、pre-miRNA、またはCRISPR/Cas9、あるいは遺伝子改変された遺伝子座を含む細胞を提供する。使用することができる細胞は、特に制限されておらず、ならびに技術者は、広範な細胞を使用することができることに気付くであろう。いくつかの実施形態において、当該細胞は、幹細胞または樹状細胞である。いくつかの実施形態において、当該細胞は、幹細胞、場合により神経幹細胞または間葉細胞である。特定の実施形態において、当該細胞は、神経幹細胞である。さらなる実施形態において、当該細胞は、CTX0E03細胞である(アクセッション番号04091601において出願人によってECACCに寄託された)。別の実施形態において、当該細胞は、場合により一部が分化した幹細胞である。当該ベクターは、ベクターまたは核酸を細胞内に導入する任意の公知の方法によって、細胞内に導入することができる。そのような方法としては、これらに限定されるわけではないが、カチオン性脂質試薬を使用するトランスフェクション、エレクトロポレーション法、およびウイルス性形質導入が挙げられ得る。
第5の態様は、外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載する方法であって、本発明のコンストラクトを含む細胞からエクソソームを産生するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、特定のsiRNAの細胞内産物をコードするshRNA、またはsiRNA、miRNA、もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)または遺伝子編集のためのモルホリノ、sgRNA、またはガイドRNAを含む、オリゴヌクレオチドをサイレンシングまたは改変する任意の遺伝子の搭載を可能にする。さらなる実施形態において、本発明は、例えば、CRISPR RNAガイド鎖、および任意の他の一本鎖RNA分子などの任意の遺伝子編集ツールの搭載を可能にする。特定の実施形態において、当該ヌクレオチド配列は、miRNAヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。「搭載される」によって、エクソソーム内に、エクソソームの表面に、およびエクソソームの膜に、「搭載される」ことが意味される。エクソソーム内に搭載する、は、エクソソーム内部に、すなわち、内腔に搭載することであり得る。
本発明のさらなる態様において、本発明のpre-miRNAまたは成熟miRNAを含むエクソソームを調製する方法が提供される。pre-miRNAまたは成熟miRNAを含むエクソソームを調製する方法は、細胞を培養するステップおよび馴化培地の回収ステップを含む。ある実施形態において、当該方法は、エクソソームの精製およびエクソソームの検証の随意的なステップをさらに含む。さらなる実施形態において、当該方法は、細胞を培養するステップ、馴化培地の回収ステップ、ならびに、場合により精製ステップ、ならびに、場合によりエクソソームの検証ステップを含む。いくつかの実施形態において、当該方法から得られるまたは得ることができるエクソソームが提供される。理解されるように、エクソソームまたはエクソソーム様小胞は、当技術分野において公知の任意の方法によって精製され得る。
本発明の第7の態様は、本発明のpre-miRNAを含むエクソソームを提供する。本発明のさらなる実施形態において、当該pre-miRNAは、shRNA、siRNA、miRNA、抗miR、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、CRISPRガイドRNAのためのヌクレオチド配列を含む外因性ヌクレオチド配列、あるいは他の外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、当該外因性ヌクレオチド配列は、miRNA、例えば、miR-146-bまたはmiR-1246、あるいは特定のsiRNAの細胞内産物をコードするshRNAであり得る。典型的には、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、miRNAである。
本発明のさらなる態様は、本発明に従って産生された成熟miRNAを搭載したエクソソームを使用して、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達する方法を提供する。ある実施形態において、当該方法は、標的細胞をmiRNA搭載エクソソームに接触させるステップを含む。さらなる実施形態において、当該方法は、場合により、第1に、pre-miRNAを介するmiRNAを搭載したエクソソームを単離することを含むステップ、および第2に、標的細胞をmiRNA搭載エクソソームに接触させることを含むステップを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞とmiRNA搭載エクソソームとの接触ステップは、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、24時間、またはそれ以上の間である。別の実施形態において、当該接触ステップは、37℃において行われる。
本発明の第9の態様は、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする方法であって、本発明に従って生成された、RNAを含むエクソソームを投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の下方調節を生じる。いくつかの実施形態において、遺伝子活性をモジュレートすることは、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現の下方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上減少させる。典型的には、遺伝子発現は、60%から100%減少する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現の上方調節を生じる。さらなる実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列は、結果として、遺伝子発現を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上増加させる。典型的には、遺伝子発現は、60%から100%増加する。遺伝子活性のモジュレーションは、ウェスタンブロット、qPCR、蛍光レポーターアッセイ、またはルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して評価することができる。あるいは、遺伝子活性のモジュレーションは、治療成果を測定することによって、典型的には、目的の疾患の症状を改善することによって、評価することができる。
本発明のさらなる態様は、本発明の搭載済みエクソソームを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される組成物は、典型的には、本発明のエクソソームに加えて、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル、および/または賦形剤を含む。
本発明の別の態様は、治療法における使用のために本発明の方法に従って生成されたRNAカーゴを含むエクソソームを提供する。当該治療法は、細胞遊走の阻害を必要とする疾患、例えば、がん、線維症、アテローム性動脈硬化症、または関節リウマチなどの療法であり得る。当該治療法は、神経系疾患、眼疾患、難聴、炎症、がん、またはウイルス感染の療法であり得る。当該治療法は、脈管形成の阻害を必要とする疾患の治療法、例えば、血管新生を阻害することによる固形腫瘍の治療でもあり得る。いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子療法における使用のためのmiRNA搭載エクソソームを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、疾患を引き起こす点突然変異を編集すること、不適切に機能している突然変異遺伝子を不活性化(「ノックアウト」)すること、および/または疾患との戦いを支援するために新規の遺伝子を身体に導入することによる遺伝子療法を提供する。遺伝子療法によって治療することができる疾患の例としては、これらに限定されるわけではないが、嚢胞性繊維症、重症複合型免疫不全症(ADA-SCID)、慢性肉芽腫性障害(CGD)、血友病、レーバーの先天性黒内障(LCA)、がん、パーキンソン病、およびハンチントン病が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該遺伝子療法は、ガイドRNAを含む本発明のpre-miRNA、およびCRISPRゲノム編集によって媒介される。
遺伝子MIR21を含む新規のプラスミド。この図は、遺伝子MIR21を含む新規のプラスミド(図1Aに示される)が、HEK細胞において、基底発現レベルは非常に低いにもかかわらず、2つの異なる細胞(HEKおよびCTX、図1B~1Dを参照されたい)において活性であることを示している。 遺伝子MIR21を含む新規のプラスミド。この図は、遺伝子MIR21を含む新規のプラスミド(図1Aに示される)が、HEK細胞において、基底発現レベルは非常に低いにもかかわらず、2つの異なる細胞(HEKおよびCTX、図1B~1Dを参照されたい)において活性であることを示している。 MIR21プラスミドは、異なる調節配列を含む。この図は、MIR21プラスミドが、PMA(ホルボール12-ミリステート13-アセテート)およびc-mycによって活性化することができるプロモーター領域に、異なる調節配列を含むことを示している。それは、少なくともリプレッサー配列を含む5’領域に他の配列が存在すること、ならびにmRNAのレベルをmiRNAに対して制御も行う3’領域に安定化配列が存在することも示している。 MIR21プラスミドは、異なる調節配列を含む。この図は、MIR21プラスミドが、PMA(ホルボール12-ミリステート13-アセテート)およびc-mycによって活性化することができるプロモーター領域に、異なる調節配列を含むことを示している。それは、少なくともリプレッサー配列を含む5’領域に他の配列が存在すること、ならびにmRNAのレベルをmiRNAに対して制御も行う3’領域に安定化配列が存在することも示している。 ハイブリッドカセットの構築の実施例。本発明者らは、搭載されたmiRNAの3D構造に依拠する認識を有することが重要であり得ることを示している。3D構造は、miRNAに存在する内部ループに依存する。 miRNAのためのビヒクルとしてのエクソソーム:miR-21-5pカセットおよび構造をベースとするmiRNA。エクソソームは、miRNAのための天然のビヒクルである。本発明者らは、蛍光タンパク質Ruby2に対抗する設計されたmiRNAを運ぶために、miR21-5pのための配列を改変した。これは、任意のmiRNAをエクソソーム内に導入するために使用することができる。A)miR-21-5pカセットおよび構造、B)エクソソームに搭載されたmiR-21構造的ミミック。 エクソソームにおける治療用RNAの発現および搭載のためのmiR-21ベースのpri-miRNAカセットの設計。(A)ゆらぎ対は、RNAヘリックスに異なる三次元構造を付与する(出典Varani and McClain, EMBO Reports, 2000)。(B)RBPによるその認識およびプロセシングを保存するために、設計されたpre-miR-Ruby2の配列において維持されるいくつかのゆらぎG-U対(有色のボックス)、欠失(*)、およびミスマッチ(♯)を含むpre-miR21-5pの天然構造。(C)pri-miR-Ruby2カセットの構造、および(D)プロモーターEF-1αおよびCAG、ブラストサイジン(BSD)のための選択遺伝子、およびリポーター遺伝子Cloverを含む改変されたレンチウイルスベクター上のその位置。pri-miR-Ruby2カセットは、コード配列の3’UTR配列としてベクターにクローニングした。 機能的miR-Ruby2がプロデューサー細胞株のエクソソームに搭載される。(A)pri-miR-Ruby2カセットを含むベクターによってエレクトロポレーションされた細胞上でのqPCRによる成熟miR-Ruby2の発現レベル。(B)Clover(*)を発現する制御プラスミドまたはpri-miR-Ruby2カセットおよび蛍光タンパク質Clover(矢尻)を含むプラスミドによってエレクトロポレーションされたHEK293-Ruby2細胞。(C)qPCRによって特定された対照細胞株と比較した、HEK293-pri-miR-Ruby2細胞由来のエクソソームに搭載されたmiR-Ruby2のレベル。(D)タンパク質の発現レベル、および(E)HEK293-Ruby2および対照細胞の共培養アッセイ、またはmiR-Ruby2を発現するHEK293を用いた共培養アッセイにおけるRuby2のためのmRNA。
本発明者らは、エクソソーム搭載において特定の機能を有する特定のpre-miRNAに注目した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、MIR21遺伝子の配列内に、成熟miR21-5pの発現にとって重要であるいくつかの調節配列が存在することを特定した。調節配列は、pre-およびpri-MIR21領域の両方において特定される。さらに、miR-21-5pの周辺配列内にも、いくつかのゆらぎ対、ミスマッチ、および欠失が存在する。これらの特徴は、pre-miRNAステムおよびループ配列内に含まれ、エクソソームパッケージングにとって重要であるとして特定されている。miR-21-5pの構造的特徴は、正しいプロセシング、空間的折り畳み、およびエクソソームへのこれらの小さな非コードヌクレオチドのソーティングにとって重要であることが分かっている。さらに、正しいプロセシング、空間的折り畳み、およびエクソソームへのこれらの小さな非コードヌクレオチドのソーティングは全て、AgoおよびDicerの存在下または不在下において生じ得ることも特定されている。
したがって、本発明は、エクソソームへの搭載、例えば、ssRNA、特にmiRNAの搭載を制御するための、MIR21遺伝子の上流および下流領域に位置する1つまたは複数の調節エレメントの使用を提供する。
したがって、本発明は、エクソソーム内への外因性ヌクレオチド配列の標的化のためのpre-miRNA足場も提供する。目的の外因性オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを特定された足場に加えることにより、本発明の足場は、エクソソームプロデューサー細胞を遺伝子改変することによって、任意の目的の外因性ヌクレオチド配列(例えば、miRNA、shRNA、siRNA、抗miR、ASO、またはCRISPRガイド鎖)をエクソソームに搭載する可能性を有する。本発明は、pri-miRNAカセットも提供し、これは、先行技術において説明されるような、エクソソーム搭載のためのエクソソーム標的化モチーフによるmiRNAの直接的なタグ付けを必要としないという利点を有する。このカセットは、細胞株に応じて外因性ヌクレオチド配列(例えば、RNA)の発現を調節するように、あるいはその発現を一時的に制御するために、改変することができる。さらに、本発明は、pre-miR-21またはその一部を、その発現を維持しエクソソーム内に搭載する他の核配列によって置き換えるために、例えば、遺伝子編集を使用して、MIR21の内因性染色体座を改変する能力も提供する。
その上、本発明は、pre-miRNAの標準的なプロセシングに関与する任意のタンパク質マシナリーを欠く細胞株の使用を必ずしも必要としない。理論に束縛されるわけではないが、本発明のpre-miRNAは、pre-miR-21の三次元構造を維持することにより、RBPによる認識にとって有利であり、結果として、プロセシング、産生、およびエクソソームへの外因性ヌクレオチド配列の搭載を生じることは理解されよう。
本発明は、任意の目的のヌクレオチド配列を搭載したエクソソームを生成するために、任意のプロデューサー細胞を改変するための方法を提供する。次いで、本発明の精製されたエクソソームは、治療法での使用のためにインビボにおいて全身的にまたは局所的に使用することができる。目的のヌクレオチド配列を含むエクソソームは、裸の外因性ヌクレオチド配列と比較して、改善された体内分布、全身的安定性、および改善された標的組織取り込みを提供する。
予め精製され単離されたエクソソームに外因性ヌクレオチド配列を直接搭載する方法は、当該分野において既知である。しかしながら、これらの方法は、非常に効率が悪く、さらに非修飾siRNAでは再現可能ではなく、搭載のための現在の方法(例えば、エレクトロポレーションまたはリポフェクション)を使用してスケールアップするのが困難であることがわかっている。本発明者らは、エクソソームへと目的の外因性ヌクレオチド配列を標的化するpre-miRNAをコードする発現ベクターによってプロデューサー細胞株を改変することによって、この問題に対処している。本発明者らは、その後の回収されたエクソソームが、所望の外因性ヌクレオチド配列を含有することを示している(実施例1)。
実施例(例えば、図1)は、本発明に従って産生されたコンストラクトが様々な細胞種において活性であることを示している。したがって、本発明は、複数の細胞株にわたって広く適用可能であることが予想される。
MIR21に存在する異なる調節配列が、図2に見ることができる。この図は、MIR21プラスミドが、PMA(ホルボル12-ミリステート13-アセテート)およびc-mycによって活性化することができるプロモーター領域に、異なる調節配列を含む。それは、少なくともリプレッサー配列を含む5’領域に他の配列が、ならびにmiRNAのためにmRNAのレベルも制御する3’領域に安定化配列が存在することも示している。特に、miRNAレベルは、MIR21がHpaI制限部位において切断される場合に著しく増加し、PacI制限部位において切断される場合に減少することが図2において見ることができる。
本発明者らは、成熟miRNA配列を囲むpri-およびpre-miRNA内の配列は、外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載するために使用することができることを特定した。本発明者らは、機能的三次ループ構造における関連配列を評価することにより、任意の所望の外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載するために使用することができる、ハイブリッド「カセット」ベクターを生成した。このハイブリッドカセットベクターは、典型的には、その発現およびエクソソームにその核酸を搭載するためのプロセシングを可能にする、目的のmiRNAまたはヌクレオチドまでの5’上流および3’下流配列を含む。そのようなエクソソームは、その後、回収することができ、所望の外因性ヌクレオチド配列を含む送達ビヒクルとして使用することができる。異なる組織に対して搭載済みエクソソームを標的化するために、プロデューサー細胞株を変更することができ、および/または当該エクソソーム上の表面マーカーを操作することができる。
いくつかの実施形態において、改変された非天然ヌクレオチドを含むRNAカーゴを、エクソソームに搭載する。本発明のコンストラクトは、カーゴRNA内の非天然ヌクレオチド(天然ヌクレオチドと取り替えられた)によって合成され得、ならびに結果として得られる模倣物は、標的細胞に直接的にトランスフェクトされ得る。次いで、標的細胞は培養され得、ならびにそれが産生するエクソソームは、治療用途または診断用途のために、または研究における使用のために、例えば、疾患のモデリングまたは薬物スクリーニングのためにノックインおよびノックダウン細胞株を操作するために、回収され得る。
miR-21およびエクソソーム搭載
miRNAは、mRNAの3’非翻訳領域(UTR)における部位を標的化するためにアルゴノート(Ago)タンパク質をガイドすることによって遺伝子サイレンシングを媒介する、約22ヌクレオチドの短いノンコーディングRNA(ncRNA)である。miRNA搭載Agoは、翻訳抑制および標的化されたmRNAの分解を促進する、miRNA誘導サイレンシング複合体(miRISC)の一部を形成する。miRNAとそれらの標的との相互作用は、主に、それらのシード配列に基づいており、miRNA生合成は、RBPとの相互作用を媒介するRNA二次構造によって影響を受ける。エクソソームRBPはmiRNAをエクソソーム内へと向かわせることができることが示唆されている(Gebert, and MacRae. 2019)。
pre-miRNAは、Droshaによる切断の後にpri-miRNAから始まる核において生成される、約70塩基長のRNAヘアピンである。pre-miRNAは、エクスポーチン5によって細胞質中へ移出され、その場合、それらは、さらに、ヌクレアーゼDicerによってプロセッシングされて、成熟miRNAを形成する(Cullen. 2004)。
本発明者らは、miR-21-5p配列は、その特別な特性およびハイブリッド転写因子c-myc-ERTamの過剰発現による遺伝子改変により神経幹細胞株CTX0E03によって産生される豊富に発現されたエクソソームmiRNAであることを報告している。hsa-miR-21、miR-21-5pおよびhsa-miR-21-5pとしても知られるmiR-21は、MIR21遺伝子によってコードされる哺乳動物miRNAである。MIR21は、遺伝子VMP1のイントロン配列の内に位置するが、発現は、この遺伝子の発現または調節配列に依存しない。pri-miR-21配列内に、miR-21-5pの発現の制御および調節を可能にする、プロモーター領域、エンハンサー、リプレッサー、および安定化配列を含むいくつかの調節エレメントが存在する。pre-miR-21-5p配列内には、そのエクソソームパッケージングに必須であるいくつかの主要なG-U対およびループ配列が存在する。一貫して、CTX0E03に由来する回収されたエクソソーム内において、miR21-5pは豊富に発現されたmiRNAであることが観察された。多数のバッチにわたって、miR-21-5pの存在量は、次に最も豊富なmiRNAよりも、およそ少なくとも1桁多かった。このことは、この特定のmiRNAに関連する強力なエクソソームパッケージング機能が存在することを示している。
hsa-mir-21(pre-miR)は、miRBaseアクセッション番号MI0000077を有する:
Figure 2023507181000007
miRBase上に示されるようなステム-ループ構造は、下記である:
Figure 2023507181000008
成熟-5p配列は、ヌクレオチド8~29、すなわち、下記である:
Figure 2023507181000009
成熟-3p配列は、ヌクレオチド46~66、すなわち、下記である:
Figure 2023507181000010
したがって、本発明は、pre-miR-21の構造に基づく、エクソソームへの搭載のために外因性ヌクレオチド配列を含むように改変された、pre-miRNAを提供する。外因性ヌクレオチド配列を含むこの改変されたpre-miRNAは、pre-miR-21構造的ミミックまたはミメティックとして説明することができる。いくつかの実施形態において、改変されたpre-miR-21は、天然pre-miR21-5pの一次、二次、および/または三次構造と構造的に類似する。したがって、本発明は、エクソソームに対して外因性ヌクレオチドカーゴを標的化するためのpre-miRNAを提供し、この場合、pre-miRNAは、ステムループ構造を含み、当該ステムは、ゆらぎ対を含む。
「外因性ヌクレオチド配列」は、pre-miR-21-5pにおいて天然には見出されないヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、本発明のpre-miRNAに組み入れられる外因性ヌクレオチド配列は、二重鎖である。さらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ゆらぎ対、欠失、および/またはミスマッチを含むように改変される。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、天然のpre-miR-21-5p配列と同じ位置にミスマッチおよび欠失を含み、それにより、天然のpre-miR-21-5pと実質的に同じ三次元構造を維持する。理論に束縛されるわけではないが、pre-mi-21の三次元構造は、エクソソーム生合成の際のエクソソームに対するその標的化のために重要であると考えられる。したがって、pre-miR-21の実質的に同じ三次元構造全体を有する、外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAは、生合成の際にエクソソームに外因性ヌクレオチド配列を標的化し得る。
ヘアピンループとしても知られる「ステムループ」は、通常、反対方向に読まれる場合にヌクレオチド配列において相補的である、同じ鎖の2つの領域が、不対ループに終わる二重螺旋を形成する塩基対である場合に生じる。ステムループは、RNA分子における二次構造の一般的なタイプである。ステムループは、RNA折り畳み、mRNAに対するタンパク質構造安定性を指示することができ、RNA結合タンパク質のための認識部位を提供することができ、酵素反応のための基質として機能することができる。
「核酸ハイブリダイゼーション」は、一本鎖DNAまたはRNA分子が、相補的DNAまたはRNAに対してアニールされる場合に生じる。ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列の基本的特性である。「ワトソン-クリック対合」により、塩基対と呼ばれる水素結合によって接続される相補的RNA鎖上の2つのヌクレオチドが意味される。ワトソン-クリック塩基対合において、アデニン(A)は、2つの水素結合を使用してチミン(T)と塩基対を形成し、グアニン(G)は、3つの水素結合を使用してシトシン(C)と塩基対を形成する。RNAにおける標準的なワトソン-クリック塩基対合において、チミジンは、ウラシル(U)によって置き換えられる。
「ゆらぎ対」により、ワトソン-クリック塩基対ルールに従わないpre-miR-21構造的ミミックにおける2つのヌクレオチドの間の対合が意味される。いくつかの実施形態において、ゆらぎ対(W-w)は、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)ヒポキサンチン-ウラシル(I-UまたはU-I)、ヒポキサンチン-アデニン(I-AまたはA-I)、および/またはヒポキサンチン-シトシン(I-CまたはC-I)を含む。いくつかの実施形態において、当該ゆらぎ対は異なる。例えば、1つまたは複数のゆらぎ対は、任意の順序および任意の組み合わせにおいて、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)ヒポキサンチン-ウラシル(I-UまたはU-I)、ヒポキサンチン-アデニン(I-AまたはA-I)、および/またはヒポキサンチン-シトシン(I-CまたはC-I)を含み得る。他の実施形態において、当該ゆらぎ対は同じであり、例えば、すべて、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)ヒポキサンチン-ウラシル(I-UまたはU-I)、ヒポキサンチン-アデニン(I-AまたはA-I)、またはヒポキサンチン-シトシン(I-CまたはC-I)である。典型的には、当該ゆらぎ対は、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)を含む。ゆらぎ対は、RNA二次構造において基本的であり、遺伝子コードの正しい翻訳のために重要である。ワトソン-クリック塩基対との幾何学的相違点は、生物学的機能にとって決定的な構造変動を付与する。いくつかの実施形態において、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21と機能的に類似する。理論に束縛されることを望むわけではないが、ゆらぎ対は、RNAの天然折り畳みおよびRBPによるその認識を可能にするように、RNAの深い溝を歪ませ、それにより、プロセシング、産生、およびエクソソームへの当該miRNAの搭載を可能にすると理解される(図5A)。
「ミスマッチ」は、2つの非相補的塩基がRNAの二重鎖の同じ塩基対の段に整列される場合に生じる。理論に束縛されるわけではないが、ミスマッチの塩基対は、特定のRBPによっても認識される異なる空間的コンフォメーションをmiRNAに与え、それにより、プロセシング、産生、およびエクソソームへの当該miRNAの搭載を可能にする。
「欠失」により、ヌクレオチドはステムループ構造の片側のみに存在し、ステムの反対側の対応する位置に欠失が存在することが意味される。
pre-miR-21構造的ミミックとも称される本発明のpre-miRNAは、pre-miR-21 5’末端構造的ミミック;外因性ヌクレオチド配列;およびpre-miR-21 3’ループ構造的ミミックを提供する。「5’末端」によって、pre-miRNA二重鎖の各側における7から9ヌクレオチドの5’末端配列が意味される。典型的には、当該5’末端配列は、pre-miRNA二重鎖の各側における8ヌクレオチド長である。「3’末端」によって、ループ構造を含むpre-miRNA二重鎖の末端が意味される。
本発明のpre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで:Aは、pre-miRNA 5’末端であり、当該pre-miRNA 5’末端は、pre-miR-21の5’末端に対して少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の配列同一性を含み;Bは、pre-miR-21において天然には見出されない外因性ヌクレオチド配列であり;Cは、pre-miRNA 3’末端であり、当該pre-miRNA 3’末端は、pre-miR-21の3’末端に対して少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の配列同一性を含む。当該pre-miRNAは、天然のpre-miR-21の三次元構造を模倣し、それにより、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21のようにエクソソーム生合成の際に、エクソソームへと標的化されることが意図される。
いくつかの実施形態において、構造A-B-Cを含むpre-miRNAは、以下のように定義される:
(A)pre-miRNA 5’末端は、pre-miR-21の5’末端と実質的に構造的および/または機能的に類似する。当該pre-miR-21の5’末端は、ゆらぎ対を含む特異的な構造を含む。当該存在するゆらぎ対は、RNAの深い溝を歪め、折り畳まれたpre-miR-21全体の二次構造を変える。本発明において、pre-miRNA 5’末端の5’末端は、pre-miR-21 5’末端の二次構造を保持する。
(B)外因性ヌクレオチド配列は、pre-miR-21構造的ミミックのステム-ループのステム構造の一部を形成する。当該外因性ヌクレオチド配列は、19~25ヌクレオチド長であり得る。当該外因性ヌクレオチド配列は、pre-miR-21-5pの長さ、ゆらぎ対、ミスマッチ、欠失に関して、成熟miR21-5pのステムの天然構造を保持し得る。
(C)pre-miRNA 3’末端は、pre-miRNAの3’末端においてループ構造を形成する。当該pre-miR-21の3’末端は、ゆらぎ対を含む特異的な構造を含む。当該存在するゆらぎ対は、RNAの深い溝を歪め、折り畳まれたpre-miR-21全体の二次構造を変える。当該ループ構造は、4、5、6、7、8、または9ヌクレオチドのループ長さ全体を有する。好ましくは、7ヌクレオチド長である。本発明において、pre-miRNA 3’末端の3’末端は、pre-miR-21 3’末端の二次構造を保持する。
本発明のある特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAは、成熟miR-21-5pに対する配列を除いた天然のpre-miR-21-5pの配列に対して少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の配列同一性を含む。当該pre-miRNAは、天然のpre-miR-21の三次元構造全体を模倣し、それにより、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21のようにエクソソーム生合成の際に、エクソソームへと標的化されることが意図される。
例えば、%同一性の値は、パーセント同一性が報告されている配列長さで割った、一致する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数によって特定され得る。パーセンテージ(%)アミノ酸配列相同性は、%アミノ酸配列同一性を特定するために使用されたのと同じ計算によって特定され得るが、例えば、計算において、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含んでもよい。配列同一性%を算出するために、例えば、BLAST(ジェンバンク;デフォルトパラメータを使用)などのオリゴヌクレオチドアラインメントアルゴリズムが使用され得る。2つのヌクレオチド配列が実質的に同一であり得ることの代替の指標は、当該2つの配列が中程度のストリンジェントな、好ましくはストリンジェントな条件下においてお互いにハイブリダイズすることである。
ある実施形態において、本発明のpre-miRNA(pre-miR-21構造的ミミックとも呼ばれ得る)は、pre-miR-21の生物学的機能を保持する。「pre-miR-21構造的ミミック」は、pre-miR-21と実質的に構造的および/または機能的に類似するmiRNAである。pre-miR-21構造的ミミックは、配列は異なり得るが、pre-miR-21の1つまたは複数の生物学的機能を維持する。「1つまたは複数の生物学的機能を維持する」によって、当該ミミックが、問題の生物学的機能の少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%を保持することが意味される。特定の実施形態において、問題の生物学的機能は、エクソソームへのpre-miR-21構造的ミミックのソーティングであり得る。この実施形態において、本発明のpre-miRNAは、配列は異なり得るが、天然のpre-miR-21のレベルの少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%においてエクソソームにパッケージングされるように、天然のmiR21-5pと構造的および/または機能的に類似する一次、二次、および/または三次構造を共有する、miRNAである。
別の実施形態において、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21の結合親和性の少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%の結合親和性によってRBPに結合することができるような構造的および/または機能的に類似する一次、二次、および/または三次構造を共有する。別の実施形態において、本発明のpre-miRNAは、天然のpre-miR-21の結合親和性の少なくとも95%、90%、80%、70%、60%、50%の結合親和性によってmiRNAプロセシング酵素に結合することができるような構造的および/または機能的に類似する一次、二次、および/または三次構造を共有する。miRNAプロセシング酵素の例としては、Ran-GTP、エクスポーチン-5,およびDicerが挙げられる。pre-miRNAの結合親和性は、例えば、蛍光偏光(FP)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、および表面プラズモン共鳴法(SPR)によって測定することができる。
精製されたエクソソームに存在する外因性ヌクレオチド配列の量は、qPCR、またはddPRCなどの他の定量方法を使用して定量化することができる。pre-miRNAの構造は、X線結晶構造解析、核磁気共鳴(NMR)スペクトル分析、低温電子顕微鏡法(cyro-EM)、化学的/酵素的プロービング、熱変性、および質量分光分析などの方法によって特定することができる。
miR-21発現カセット
本発明は、pre-miR-21構造的ミミックと称される、pre-miR-21の構造に基づく外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを含む発現カセットを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、miRNAの転写を制御するために、天然に存在する配列もしくは設計された調節配列、転写開始点を含むmiRNAに対して上流の5’配列、下流の3’配列、安定化配列、エンハンサー、および/またはリプレッサー配列であり得るプロモーター領域の1つまたは複数またはその全てと、pre-miR-21構造的ミミックと称される、pre-miR-21の構造に基づく外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAとを含む発現カセットを提供する。本発明のある態様において、本発明のpre-miRNAを含むカセットが提供される。特定の実施形態において、当該カセットは、5’pri_5miR21配列;pre-miR-21構造的ミミック;および3’pri_miR21配列を含む(その順番で)。ある特定の実施形態において、miRNA発現カセットは、元の天然に存在するmiRNA内のループ、ミス対、ゆらぎ対、および塩基対合の欠如を含む、pri-およびpre-mi-21の元の配列および長さを保存する。これは、エクソソームへの外因性ヌクレオチド配列のシャトリングを促進するために、pre-miR-21の構造を維持することが意図される。
典型的には、このカセットは、細胞内転写機構を使用して本明細書において説明されるRNA部分を転写する、遺伝子改変された細胞株を生成する目的による選抜のプロデューサー細胞株内へとトランスフェクトされた、DNAベクター内のクローニングされたDNA配列によって導入することができる。当該カセットまたはその一部も、目的の核酸の発現のために一部を置き換えるために、この遺伝子座の遺伝子操作を可能にする任意の技術、例えば、CRISPRなどを使用することによって、遺伝子MIR21の内因性遺伝子座に導入することができる。「ベクター」は、ウイルス、プラスミド、または高等生物の細胞から取られた、DNAの小片であり、それは、生物体中において安定して維持することができ、クローニング目的のためにその中に外来DNA断片を挿入することができる。そのような発現ベクターの設計は、実施例3において概説される。
pre-miRNAは、特定の遺伝子組換えを可能にする任意の遺伝子編集技術、例えば、CRISPR/Cas、TALEN、またはジンクフィンガーまたはプライム編集などを使用することによって天然に存在するmiR-21配列を置き換えるために、MIR21のための遺伝子座に導入され得る。pre-miRNAは、特定の遺伝子組換えを可能にする任意の技術を使用することによって、天然に存在するmiR-21配列を置き換えるために、MIR21のための遺伝子座に導入してもよい。
あるいは、pre-miRNAは、ステム-ループ構造の形態において直接トランスフェクトすることができ、またはエクスビボにおいて生成することができる。これは、任意の許容可能なインビトロ方法論を使用して転写ミックスと共にRNAポリメラーゼプロモーターおよびDNAガイド鎖を使用するインビトロにおいて生成されたRNAコンストラクトを使用することによって、あるいは任意の数の既知のオリゴ合成方法論を使用して所望のコンストラクトを化学的に合成することによって、達成することができる。pre-miRNAを合成することにより、当該コンストラクトにおいて天然のヌクレオチドおよび/または非天然のヌクレオチドの化学的に改変された形態を生成させることも可能であろう。これは、改善された全身的安定性、および/または減少した免疫原性、および/またはシード配列における配列の変更を伴うより選択的な標的結合を有する、改変されたsiRNA、miRNA、および他のRNAコンストラクト、例えば抗miRなどの使用を可能にするであろう。次いで、そのようなエクスビボRNAコンストラクトは、利用可能な任意の数のトランスフェクション方法(例えば、リポフェクタミン、エレクトロポレーション、またはトランスフェクションもしくは核酸送達の任意の他の手段)により、プロデューサー細胞株に導入されるであろう。
本発明のpre-miRNA発現カセットを使用することにより、本発明者らは、細胞内の生合成の際にエクソソーム内へ輸送されることがわかっている外因性ヌクレオチド配列を含む機能的pre-miRNAをインサイチュにおいて生成した。その上、えり抜きのこのエクソソームカプセル化外因性ヌクレオチド配列は、レシピエント細胞株においても機能的であり、標的遺伝子活性をモジュレートするために、例えば、標的細胞における下方調節のために、レシピエント細胞に送達することができる。
したがって、本発明を使用して、
i)外因性ヌクレオチド配列(例えば、標的遺伝子サイレンシングまたは遺伝子編集/置き換えオリゴマー性一本鎖RNA配列)は、エクソソーム搭載カセット内にパッケージングすることができ;
ii)外因性ヌクレオチド配列を有するそのようなカセットは、哺乳動物発現ベクター内において具現化することができ、または完全なステムループ構造としてエクスビボにおいて合成することができ;
iii)上記において説明される発現ベクターまたはステムループのどちらかは、任意の選択された標的細胞にトランスフェクトすることができ(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクタミンを使用して、または別のエクソソームによって)、そのような細胞の選択は、使用者が標的への最終的なエクソソーム送達ビヒクルを必要とする所望の組織によって、および/または治療標的が脳血液関門を越えなければならないか否か(神経性プロデューサー細胞が選択され得る場合)によって、決定づけられ得;
iv)当該外因性ヌクレオチド配列は、細胞がアルゴノートタンパク質を発現するか否かに関係なく、ならびにDICERがそのような細胞内において機能的であるか否かに関係なく、プロデューサー細胞天然エクソソームシャトリングメカニズムを使用することによって、プロセシングのためにエクソソームへと標的化することができ;
v)所望の外因性ヌクレオチド配列を搭載されたエクソソームは、様々な既知のエクソソーム回収方法、例えば、これらに限定されるわけではないが、超遠心分離、PEG沈殿、TFF、親和性クロマトグラフィーなどを使用して、プロデューサー細胞からの馴化培地から回収することができ;
vi)エクソソームは、パッケージングされた外因性ヌクレオチド配列をインビトロおよびインビボにおいてヒト細胞に送達することができ、起源のプロデューサー細胞に依存するある特定の場合において、当該エクソソームは、全身的に送達される場合、特定の組織を標的化することができ;
vii)標的細胞を当該エクソソームに接触させることにより、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞に送達し、遺伝子活性をモジュレートする。
本発明は、任意の遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド、例えば、siRNA、miRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの搭載、および任意の遺伝子編集ツール、例えば、CRISPR RNAガイド鎖など、ならびに任意の他の一本鎖RNA分子を搭載するのを可能にする。これらのヌクレオチド配列は、選りすぐりのエクソソームに搭載されること、ならびに、細胞培養およびエクソソーム精製技術を使用するスケールにおいて産生されることが意図される。
本発明の方法は、発現ベクターによってプロデューサー細胞を操作することによる外因性ヌクレオチド配列のエクソソームの搭載を開示する。当該方法は、プロデューサー細胞への実際のmiR-21 pri-microRNAとRNAカーゴとを含む天然または合成コンストラクトの直接的な導入による改変にも適用可能である。当該コンストラクトは、任意の手段によってプロデューサー細胞にトランスフェクトすることができる。
本発明は、エクソソームに搭載された外因性ヌクレオチド配列の大量の産生を可能にするという点において利点を有する。本発明の特定の利点は、エクソソームに搭載されたそのような外因性ヌクレオチド配列、例えば、治療用miRNAの産生の方法は、馴化培地の回収、精製、および検証のために減らされる。したがって、miRNAなどの外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載する他の方法に関連する時間およびコストを減少させる。
本明細書において開示されるpre-miRNA発現カセットおよび方法は、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子編集/置換のために、任意の外因性または内因性一本鎖ヌクレオチド配列を送達するために使用することができる。したがって、インビボ送達のためにエクソソームによってカプセル化されるかまたはそれらを伴う治療部分を生成させるための手段を提供する(図4)。このシステムの有益性としては、改善された組織標的化、より低い免疫原性、ならびにRNAseおよびそれ以外の「裸の」治療部位のインビボにおける分解を加速させ得る他の因子からの保護が挙げられる。回収された搭載済みのエクソソームは、CAR-T細胞療法などの移植技術において使用することができる細胞を操作するために、外因性ヌクレオチド配列をインビトロにおいて細胞に送達するためにも使用することができる。
外因性ヌクレオチド配列
「外因性ヌクレオチド配列」は、天然のpre-miR-21-5pにおいて天然には見出されないヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする。
本発明の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、shRNA、siRNA、miRNA、抗miR、ASO、CRISPRガイドRNAのための配列、あるいは他の外因性ヌクレオチド配列である。本発明のさらなる実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、miRNA、例えば、miR-146-bまたはmiR-1246、あるいはsiRNAである。
ある特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、治療用であり得る。ヌクレオチド配列を用いる療法は、DNAまたはRNA、あるいはRNA-DNAハイブリッドを含み得る。DNA治療は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAアプタマー、および遺伝子療法を含む。RNA治療は、RNAi、およびCRISPRのためのガイドRNAを含む。いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、治療用RNAである。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、8~50塩基対長さの一本鎖配列であり、標準的ワトソン-クリック塩基対合によって標的mRNAに結合する。ASOがmRNAに結合した後、標的複合体は、内因性細胞RNaseHによって分解されるか、または立体障害によりmRNAの機能的遮断が生じる。「化学抗体」とも呼ばれるDNAまたはRNAアプタマーは、56~120ヌクレオチド長の一本鎖合成DNAまたはRNA分子であり、高い親和性によりタンパク質をコードするヌクレオチドと結合することができ、結果としてデコイとして機能する。DNAアプタマーは、構造認識により標的核酸に対して非常に高い親和性を有する、ASOと類似する短い一本鎖オリゴヌクレオチド配列である(Sridharan and Gogtay. 2016)。
RNA干渉(RNAi)は、遺伝子発現を調節するために小さな二本鎖RNA(dsRNA)分子を使用する、真核細胞における調節メカニズムである。RNAiは、およそ21ヌクレオチド長の二本鎖RNA分子が、相補的mRNA配列を有する特定の遺伝子の発現を強力にサイレンシングまたは抑制することができるようなメカニズムである。RNAiに対して、2つのタイプの小型RNA分子が主要である。これらは、マイクロRNA(miRNA)および低分子干渉RNA(siRNA)である。ヒトにおいて、遺伝子発現は、遺伝子サイレンシング核酸(すなわち、siRNAガイド鎖)に対して完全に相補的なRNAを切断および分解することによって、または不完全に相補的なmRNA(例えば、miRNA遺伝子サイレンシング核酸の場合など)の翻訳を抑制することによって、減じられる。ヒトにおいて、小さなRNA遺伝子サイレンサーの主要なクラスは、マイクロRNA(miRNA)と呼ばれ、部分的に相補的な結合部位を有するmRNAの翻訳を抑制することによって、大きな遺伝子ネットワークを調節する。
CRISPR-Cas9システムは、標的化されたDNAの編集を可能にする。当該システムは、ガイドRNA(gRNA)分子との会合によって、当該DNAに対して標的化され、塩基相補性によって、標的化されたDNAに結合し、両方の鎖における正確なDNA切断を可能にする。Cas9媒介性DNA切断の結末は、標的DNA内での二本鎖切断(double-strand break:DSB)であり、これは、効率的だが修復ミスの多い非相同末端結合(NHEJ)経路、またはあまり効率的ではないが修復ミスの少ない相同組換え修復(HDR)経路による、細胞の細胞内修復メカニズムによって修復される。置換遺伝子配列は、常染色体によって支配的な遺伝性遺伝病に対して増大された遺伝子療法を実施する場合、WT置換配列をコードするために例えばAAVを使用して同時トランスフェクトすることもできる。両方の修復メカニズムは、異なる成果のために利用することができる。CRISPR-Cas9システムの成功は、結果として、最適な標的部位の正しい識別とその後の相補的gRNAの設計とによって決まる(Wilson, et al. 2018)。
RNA干渉ベースの治療薬の送達は、重要な課題を提示している。例えば、脂質粒子、siRNA-改変、ナノ粒子、およびアプタマーなど、RNAi治療薬を送達するための多くの戦略が試された(Whitehead, et al. 2009; Kanasty, et al. 2013)。しかしながら、多くの場合、送達は成功せず、RNAiベースの治療薬の送達に対する障害が依然として残っている(Kanasty, et al. 2013; Tatiparti, et al. 2017)。エクソソームは、RNAiベースの治療薬の送達におけるこの障害に対する解決策を提供する。しかしながら、遺伝子サイレンシングヌクレオチド配列などの治療用ヌクレオチド配列のための薬物送達ビヒクルとしてエクソソームまたはエクソソーム用小胞を使用することの主要な障害は、siRNA/RNAi/miRNA、または目的の他のヌクレオチド配列をエクソソーム内にパッケージングする能力である。タンパク質およびRNAを産生する細胞と比較して、エクソソームは、タンパク質およびRNAの両方の非常に選択的な含有量を有する。本発明は、エクソソームに外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを搭載する改善された方法を提供することによって、あるいはpre-miRNAを発現させるために遺伝子座MIR21の遺伝子編集によって、この問題を克服する。
エクソソーム
本発明は、pre-miR-21の構造および/または機能を有しかつ外因性ヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを搭載したエクソソームを提供する。
エクソソームは、エンドソームコンパートメントに由来し、多胞小体(MVB)が細胞膜と融合する時に分泌される。
エクソソームは、微粒子の一種である。「微粒子」は、細胞から放出される30nmから1000nmの直径の細胞外小胞である。それは、生物学的分子を内包する脂質二重層によって制限される。用語「微粒子」は、当該分野において既知であり、膜粒子、膜小胞、微細小胞、エクソソーム様小胞、エクソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソーム、またはエキソベジクルなど、いくつかの異なる種類の微粒子を包含する。異なるタイプの微粒子は、直径、細胞内起源、スクロース中のそれらの密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー、および分泌の様式(すなわち、シグナル(誘導性)に従って、または自発的に(構成型))に基づいて区別される。4つの一般的な微粒子およびそれらの区別的特徴を、下記の表1に記載する。
Figure 2023507181000011
エクソソームは、典型的には、30~100nmの直径を有するとして定義されるが、より最近の研究は、エクソソームは、100nmから200nmの間の直径も有することができることを確認している(例えば、Katsuda, et al. Proteomics 2013, and Katsuda, et al. Scientific Reports 2013)。したがって、エクソソームは、典型的には、30nmから150nmの間の直径を有する。直径は、任意の好適な技術、例えば、電子顕微鏡法または動的光散乱法などによって判定することができる。
エクソソームは、直接的および間接的メカニズムによってドナー細胞とレシピエント細胞の間においてビヒクルとして機能することによって、細胞間情報伝達においてある役割を果たすと考えられる。直接的メカニズムとしては、レシピエント細胞によるエクソソームおよびそのドナー細胞由来の成分(例えば、タンパク質、脂質、または核酸)の取り込みが挙げられ、当該成分は、レシピエント細胞において生物活性を有する。間接的メカニズムとしては、エクソソーム-レシピエント細胞表面相互作用が挙げられ、それは、レシピエント細胞の細胞内シグナル伝達のモジュレーションを引き起こす。したがって、エクソソームは、レシピエント細胞による1つまたは複数のドナー細胞由来特性の獲得を媒介し得る。
本発明のいくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを搭載したエクソソームが単離される。用語「単離される」は、それが言及するエクソソームまたはエクソソーム集団がその自然環境内にないことを示している。当該エクソソームまたはエクソソーム集団は、実質的に周囲組織から分離されている。いくつかの実施形態において、当該試料が、少なくとも約75%、いくつかの実施形態では少なくとも約85%、いくつかの実施形態では少なくとも約90%、ならびにいくつかの実施形態では少なくとも約95%のエクソソームを含む場合、当該エクソソームまたはエクソソーム集団は、実質的に周囲組織から分離される。換言すれば、試料が、約25%未満、いくつかの実施形態では約15%未満、いくつかの実施形態では約5%未満の、エクソソーム以外の物質を含有する場合、当該試料は、周囲組織から実質的に分離される。そのようなパーセンテージ値は、重量パーセンテージを意味する。当該用語は、エクソソームが由来する生物体から取り出されて培養物中に存在するエクソソームを包含する。当該用語は、エクソソームが由来する有機体から取り出されてその後に生物体中に再挿入されたエクソソームも包含する。
エクソソームは、実質的に任意の細胞タイプから分泌され得る。いくつかの実施形態において、エクソソームは、幹細胞、hIPSC、組織幹細胞、それらのいずれかに由来する分化細胞、または樹枝状細胞から分泌される。ある特定の実施形態において、エクソソームは、幹細胞から分泌される。幹細胞は、天然において、細胞内多胞小体(微粒子を含む)と細胞膜との融合、ならびに細胞外コンパートメントへの当該エクソソームの放出によって、エクソソームを産生する。
別の実施形態において、当該幹細胞は、神経幹細胞である。神経幹細胞(NSC)は、神経細胞、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトを産生する、自己再生性の多能性幹細胞である(Kornblum, 2007)。いくつかの実施形態において、神経幹細胞株は、「CTX0E03」細胞株、「STR0C05」細胞株、「HPC0A07」細胞株、またはMiljan et al. 2009において開示される神経幹細胞株であり得る。神経幹細胞は、例えばCTX0E03条件付き不死化された細胞株など、本明細書において説明される神経幹細胞のいずれであってもよく、クローン性であり、標準化され、インビトロおよびインビボにおける明確な安全性を示し、安定なエクソソーム産生のための特有の供給源を提供するスケールにおいて製造することができるものである。あるいは、神経幹細胞は、場合により米国特許第7514259号明細書(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるような、神経網膜幹細胞株であり得る。
神経幹細胞エクソソームは、神経幹細胞によって産生されるエクソソームである。典型的には、当該エクソソームは、神経幹細胞によって分泌される。間葉系幹細胞など、他の細胞由来のエクソソームは、当該分野において既知である。
本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームを産生する神経幹細胞は、胎児の、胚の、または成体の神経幹細胞、例えば、米国特許第5851832号明細書、米国特許第6777233号明細書、米国特許第6468794号明細書、米国特許第5753506号明細書、および国際公開第2005121318号パンフレット(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるものなど、であり得る。胎児組織は、ヒト胎生皮質組織であり得る。当該細胞は、Yuan, et al. (2011)に記載されているような、人工多能性幹(iPS)細胞の分化からの神経幹細胞として、または線維芽細胞などの体細胞から作り出される、直接誘導された神経幹細胞として、選択することができる(例えば、Their, et al. 2012によって最近報告されたように、再プログラミングの初期相にOct4活性を厳密に制限しつつ、Sox2、Klf4、およびc-Mycを構成的に誘導することによって)。ヒト胚性幹細胞は、当該分野において既知であるような、ドナー胎児の生存力を保持する方法によって得られ得る(例えば、Klimanskaya et al. 2006およびChung, et al. 2008)。ヒト胚性幹細胞を得るそのような非破壊方法は、本発明の微粒子を得ることができる胎児幹細胞を提供するために使用され得る。あるいは、本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、成体幹細胞、iPS細胞、または直接誘導された神経幹細胞から得ることができる。したがって、本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、基礎材料としてのヒト胎児の破壊またはヒト胎児の使用を必要としない複数の方法によって作り出すことができる。
典型的には、エクソソームを産生する神経幹細胞集団は、実質的に純粋である。用語「実質的に純粋」は、本明細書に使用される場合、総細胞集団を構成する他の細胞に対して、少なくとも約75%、いくつかの実施形態では少なくとも約85%、いくつかの実施形態では少なくとも約90%、いくつかの実施形態では少なくとも約95%純粋である幹細胞の集団を指す。例えば、神経幹細胞集団に関して、この用語は、総細胞集団を構成する他の細胞と比較して、少なくとも約75%、いくつかの実施形態では少なくとも約85%、いくつかの実施形態では少なくとも約90%、いくつかの実施形態では少なくとも約95%純粋な、神経幹細胞が存在することを意味する。換言すれば、用語「実質的に純粋」は、後続の培養および増幅前の元の非増幅集団および単離された集団における系列拘束細胞の、約25%未満、いくつかの実施形態では約15%未満、いくつかの実施形態では約5%未満を含む本発明の幹細胞の集団を指す。
エクソソームは、典型的には、脂質、タンパク質、および核酸を含む環境を包囲する、少なくとも1つの脂質二重層を含む。当該核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)および/またはリボ核酸(RNA)であり得る。RNAは、メッセンジャーRNA(mRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または任意のmiRNA前駆体、例えば、pri-miRNA、pre-miRNA、および/または核内低分子RNA(snRNA)などであり得る。
幹細胞由来のエクソソームは、それが由来する幹細胞の少なくとも1つの生物学的機能を保持する。保持され得る生物学的機能としては、血管新生および/または神経発生を促進する能力、脳卒中を患う患者の脳で認識向上に作用する能力、または末梢動脈障害における血流量回復を促進する能力が挙げられる。例えば、CTX0E03細胞は、PBMCアッセイにおけるT細胞活性化を阻害することが知られており、一実施形態において、本発明の微粒子は、PBMCアッセイにおけるT細胞活性化を阻害するこの能力を保持する。PBMCアッセイは、当業者に周知であり、当該アッセイを実施するためのキットは、市販されている。
本発明のいくつかのエクソソームは、CD133表面マーカーを発現する。本発明の他のエクソソームは、CD133表面マーカーを発現しない。「マーカー」は、その存在、濃度、活性、またはリン酸化状態が、検出され得て、細胞の表現型を特定するために使用され得る、生物学的分子を意味する。
エクソソームは、エクソサイトーシスにより細胞から放出される、典型的には30~100nm直径の、時々は100nmから200nmの間の直径の、エンドソーム誘導脂質微粒子である。エクソソームの放出は、制御された方式または機能的に関連する方式において、構成的にまたは誘導の際に生じる。エクソソームは、それらの生合成の際に、様々な細胞質タンパク質(シャペロンタンパク質、インテグリン、細胞骨格タンパク質、およびテトラスパニンなど)および遺伝的物質を組み入れる。その結果、エクソソームは、親細胞微環境およびかなりの距離にわたる、細胞間でのタンパク質、脂質、および遺伝物質の移送のための細胞間情報伝達デバイスであると考えられる。本発明はこの理論に束縛されないが、エクソソームが神経幹細胞の効力を担うことは可能である。したがって、神経幹細胞由来のエクソソームは、それ自体治療的に効き目があると予想される。
一実施形態において、単離または精製された外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、標的細胞において所望の機能を実施することが意図される1つまたは複数の外因性の核酸、脂質、タンパク質、薬物、またはプロドラッグも搭載される。これは、幹細胞の操作を必要とせず、ならびに当該外因性物質は、場合により、エクソソームに直接加えることもできる。例えば、外因性のペプチドまたはタンパク質は、エレクトロポレーションによってエクソソーム内に導入することができる。この微粒子は、次いで、外因性物質ためのビヒクルまたは担体として使用することができる。この方法において、微粒子は、1つまたは複数の薬剤、典型的には治療薬または診断薬を標的細胞に送達するためのビヒクルとして使用することができる。
神経幹細胞
エクソソームを産生する神経幹細胞は、幹細胞株、すなわち、安定して分裂する幹細胞の培養物であり得る。幹細胞株は、単一の定義された供給源を使用して、大量に増殖させることができる。細胞不死化は、突発性事象から生じ得、あるいは細胞不死化因子をコードする幹細胞に外因性の遺伝的情報を導入することによって、達成され得、結果として、好適な培養条件下での幹細胞の無限な細胞増殖を生じる。そのような外因性の遺伝因子は、転写因子Mycをコードする遺伝子「myc」を含み得る。外因性の遺伝的情報は、様々な好適な手段、例えば、トランスフェクションまたは形質導入などによって、幹細胞内に導入され得る。形質導入の場合、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、から誘導されるものなど、遺伝子操作されたウイルス性ビヒクルが使用され得る。
追加の利点は、条件付き不死化された幹細胞株を使用することによって獲得することができ、そこでは、治療的に有効な微粒子の産生に悪影響を与えることなく、不死化因子の発現を調節することができる。これは、細胞に活性化剤を供給しない限り不活性である細胞不死化因子を導入することによって達成され得る。そのような細胞不死化因子は、c-mycERなどの遺伝子であり得る。c-MycER遺伝子産物は、変異体エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに融合したc-Mycバリアントを含む融合タンパク質である。c-MycERのみが、合成ステロイド4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)の存在下において細胞増植を駆動する(Littlewood, et al.1995)。このアプローチは、神経幹細胞株に由来する微粒子中のc-Mycまたはそれをコードする遺伝子の存在に起因する宿主細胞増殖に対する望まないインビボ効果(例えば、腫瘍形成)を避けつつ、インビトロでの神経幹細胞の制御された拡大を可能にする。好適なc-mycERの条件付き不死化された神経幹細胞は、米国特許第7416888号明細書に記載される。したがって、条件付き不死化された神経幹細胞株の使用は、既存の幹細胞微粒子の単離および産生に対する改良を提供する。
好ましい条件付き不死化された細胞株としては、CTX0E03神経幹細胞株、STR0C05神経幹細胞株、およびHPC0A07神経幹細胞株が挙げられ、これらは、アクセッション番号04091601(CTX0E03);アクセッション番号04110301(STR0C05);およびアクセッション番号04092302(HPC0A07)にて、出願人によってヨーロピアンコレクションオブアニマルカルチャーズ(European Collection of Animal Cultures)(ECACC)、Vaccine Research and Production laboratories、Public Health Laboratory Services、Porton Down、Salisbury、Wiltshire、SP4 0JGに寄託されている。これらの細胞の誘導および起源は、欧州特許第1645626号明細書に記載される。これらの細胞の利点は、これらの細胞により産生されるエクソソームによって保持される。
CTX0E03細胞株の細胞は、以下の培養条件下において培養され得る:
・ヒト血清アルブミン 0.03%
・ヒトトランスフェリン 5μg/ml
・プトレシン 二塩酸塩 16.2μg/ml
・ヒト組換えインスリン 5μ/ml
・プロゲステロン 60ng/ml
・L-グルタミン 2mM
・亜セレン酸ナトリウム(セレン) 40ng/ml
細胞の増大のために、塩基性線維芽細胞増殖因子(10 ng/ml)、上皮細胞増殖因子(20ng/ml)、および4-ヒドロキシタモキシフェン100nMを加える。細胞は、4-ヒドロキシタモキシフェンを除去することによって、分化され得る。典型的には、ら細胞は、5%CO/37℃において、または5%、4%、3%、2%、または1%のOの低酸素条件下において、培養され得る。これらの細胞株は、良好に培養するために血清を必要としない。血清は、多くの細胞株の良好な培養に必要であるが、それ自体のエクソソームなどの多くの汚染物質を含む。CTX0E03神経幹細胞株、STR0C05神経幹細胞株、またはHPC0A07神経幹細胞株、あるいは血清を必要としない任意の他の細胞株のさらなる利点は、血清による汚染物混入が避けられることである。
CTX0E03細胞株の細胞(およびこれらの細胞に由来する微粒子)は、元は12週齢のヒト胎生皮質に由来する多分化能細胞である。CTX0E03細胞株の単離、製造、およびプロトコルは、Sindenらによって詳細に説明される(米国特許第7,416,888号明細書および欧州特許第1645626号明細書)。CTX0E03細胞は「胚性幹細胞」ではなく、すなわち、それらは、胚盤胞の内細胞塊から由来する多能性細胞ではなく;原細胞の単離は、胚の破壊を生じなかった。
CTX0E03は、レトロウイルス感染により送達された単一コピーのc-mycER導入遺伝子を含有するクローン細胞株であり、4-OHT(4-ヒドロキシタモキシフェン)により条件的に調節される。c-mycER導入遺伝子は、4-OHTの存在下において細胞増殖を刺激する融合タンパク質を発現し、結果として、4-OHTの存在下において培養される場合に制御された増大を可能にする。この細胞株はクローン性であり、培養下において急速に増殖し(倍増時間は50~60時間)、正常なヒト核型(46XY)を有する。それは、遺伝的に安定であり、大量に増殖させることができる。当該細胞は、安全で、非腫瘍形成性である。当該細胞は、増殖因子および4-OHTの不存在下において増殖を停止し、ニューロンおよび星状細胞へと分化する。
CTX0E03細胞株の開発は、臨床用途のための一貫した製品のスケールアップを可能にした。バンクに保存される材料からの細胞の産生は、商業利用のための多量の細胞の生成を可能にする(Hodges, et al. 2007)。
用語「培養培地」または「培地」は、当該分野において認識されており、一般的に、生きている細胞の培養のために使用される任意の物質または調製物を示す。用語「培地」は、細胞培養に関して使用される場合、細胞を囲む環境の構成要素を包含する。培地は、固体、液体、気体、あるいは相および材料の混合物であり得る。培地としては、液体増殖培地、ならびに細胞増殖を維持しない液体培地が挙げられる。培地としては、ゼラチン状培地、例えば、寒天、アガロース、ゼラチン、コラーゲンマトリックス、および/または任意の細胞外マトリックスを形成する他のタンパク質も挙げられる。例示的な気体培地としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で増殖している細胞が曝露される気相が挙げられる。用語「培地」は、たとえ細胞といまだ接触していなくても細胞培養での使用を対象とする材料も意味する。換言すれば、細菌培養のために調製された、栄養素の豊富な液体は、培地である。同様に、水または他の液体と混合されたときに、細胞培養にとって好適になる粉末混合物は、「粉末化培地」と称され得る。「合成培地(defined medium)」は、化学的に定義された(通常は精製された)成分で構成される培地を意味する。「合成培地」は、酵母抽出物およびビーフブロスなどの特徴が明らかでない生物学的抽出物を含有しない。「富栄養培地」は、ほとんどまたは全ての生存可能な形態の特定種の増殖を支持するように設計されている培地を含む。富栄養培地は、多くの場合、複雑な生物学的抽出物を含む。「高密度培養の増殖にとって好適な培地」は、他の条件(例えば、温度および酸素移動速度など)が増殖を許容する場合に、細胞培養物が3以上のOD600に達するのを可能にする任意の培地である。用語「基礎培地」は、任意の特別な栄養素補給を必要としない多くのタイプの微生物の増殖を促進する培地を意味する。ほとんどの基礎培地は、一般的に、4つの基礎化学群:アミノ酸、炭水化物、無機塩、およびビタミン、で構成される。基礎培地は、一般的に、血清、緩衝液、増殖因子、脂質などの栄養補助剤が加えられた、より複雑な培地のための基礎として機能する。一態様において、増殖培地は、本発明の細胞の自己複製能力を維持しつつ当該細胞の増殖および増大を支持するために必要な増殖因子を有する複雑な培地であり得る。基礎培地の例としては、これらに限定されるわけではないが、イーグル基礎培地、最小必須培地、ダルベッコ変法イーグル培地、199培地、栄養混合物(Nutrient Mixtures)ハムF-10およびハムF-12、マッコイ5A、ダルベッコMEM/F-12、RPMI 1640、ならびにイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)が挙げられる。
エクソソームを産生するための細胞のトランスフェクション
本発明の核酸コンストラクトによるエクソソーム-プロデューサー細胞のトランスフェクションは、複数の方法を使用して実施することができる。そのような方法としては、これらに限定されるわけではないが、カチオン脂質移入、エレクトロポレーション法、ウイルス性トランスフェクション、およびリン酸カルシウムトランスフェクションが挙げられる。
本発明の核酸コンストラクトは、本発明のpre-miRNA、または本発明のカセット、または本発明のベクターを含む。
いくつかの実施形態において、エクソソームプロデューサー細胞に核酸コンストラクトをトランスフェクトするために、カチオン脂質トランスフェクションが使用される。さらなる実施形態において、カチオン脂質トランスフェクションは、試薬、例えば、DOTMA(N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム)、TransIT(登録商標)、X-tremeGENE(商標)トランスフェクション試薬リポフェクチン(登録商標)リポフェクトアミン(登録商標)、およびオリゴフェクタミン(oligofectamine)(登録商標)などを使用して実施される。
いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトをエクソソームプロデューサー細胞にトランスフェクトするために、エレクトロポレーションが使用される。エレクトロポレーションは、細胞を高透過性にする一時的不安定化を生じさせ、それにより、外因性分子の侵入を可能にする、高密度電気パルスへの細胞膜の曝露を伴う。エレクトロポレーションは、様々な細胞タイプにおいて高い形質転換効率をもたらし得る、容易で非化学の技術である。
いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトをエクソソームプロデューサー細胞にトランスフェクトするために、ウイルス性トランスフェクションが使用される。この方法は、核酸を細胞に送達するためのウイルスベクターの使用を伴う。ウイルス性送達システム、例えば、レンチウイルスシステム、アデノウイルスシステム、アデノ随伴ウイルスシステム、およびオンコレトロウイルスベクターなどは、トランスフェクトしにくい細胞においてさえヌクレオチド配列を移送するために、使用することができる。
いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトをエクソソームプロデューサー細胞にトランスフェクトするために、リン酸カルシウムが使用される。リン酸カルシウムトランスフェクション技術は、DNAおよびリン酸カルシウムの沈殿を伴う。当該沈殿は、リン酸ナトリウムを含むHEPES緩衝化生理食塩水を、塩化カルシウム溶液およびDNA2と混合することによって促進される。
精製されたエクソソーム中に存在するトランスフェクトされた核酸コンストラクトの量は、qPCR(実施例1)またはRNA定量化を可能にする他の技術、例えば、FISH/Scope、小滴-デジタルPCRまたはRNAseqなどを使用して定量化することができる。
エクソソーム精製
本発明のエクソソームは、既知のエクソソーム精製技術を使用して精製され得る。例えば、エクソソームは、接線流ろ過(TFF)、または例えば100000xgにおいて1~2時間の超遠心分離によって精製することができる。精製のために代替のまたは追加の方法、例えば、抗体ベースの方法、例えば、特異抗体を使用した、免疫沈降、磁性ビーズ精製、樹脂ベースの精製などを使用してもよい。
エクソソームは、続いて、国際公開第2013/150303号パンフレットおよび国際公開第2014/013258号パンフレット(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるように、定量化およびキャラクタリゼーションすることができる。
標的細胞への送達のためのエクソソーム内への外因性ヌクレオチド配列のパッケージング
エクソソームは、標的細胞への外因性ヌクレオチド配列の送達に対して、特に興味深い送達オプションを示す。本発明は、細胞間情報伝達のために内因性システムを十分に利用し、それにより、標的細胞への外因性ヌクレオチド配列の送達のためのシステムを提供する。エクソソームは、様々な特定の細胞タイプおよび組織を標的化するように改変することができる。異なる細胞タイプから分泌されたエクソソームは、それらの表面上において異なるタンパク質を発現し、それらは、当該エクソソームを異なる標的細胞に対して標的化し得る。
したがって、本発明は、外因性核酸カーゴを搭載したエクソソーム、例えば、外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを搭載したエクソソームを提供する。本発明は、例えば、pre-miRNAを搭載したエクソソームを使用して、外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達する方法も提供し、この場合当該方法は、標的細胞を当該搭載エクソソームに接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、特定の細胞に対して、外因性ヌクレオチド配列を含むエクソソームを標的化するために、エクソソームの表面において発現されるか、または当該表面にコンジュゲートされる。
標的細胞は、外因性ヌクレオチド配列が遺伝子活性をモジュレートすることが意図される細胞である。標的細胞は、インビトロまたはインビボにおける細胞であり得る。いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞、幹細胞、免疫細胞である。他の実施形態において、標的細胞は、神経細胞、間質性細胞、または筋細胞である。
標的細胞での遺伝子モジュレーションの評価
標的細胞での遺伝子活性のモジュレーションを評価するために使用することができる多くの方法が存在する。以下の方法は、方法の例として機能するものであり、限定ではない。いくつかの実施形態において、本発明のpre-miRNAは、結果として、標的細胞における標的遺伝子の発現の減少を生じる。
ウェスタンブロットは、タンパク質の混合物から特定のタンパク質分子を検出するために分子生物学において使用される、広く使用される分析技術である。ウェスタンブロットは、タンパク質発現の量を測定するために使用することができる。当該方法は、SDSなどの界面活性と混合することによってタンパク質試料を調製するステップと、ゲル電気泳動を使用してタンパク質を分離するステップと、当該ゲルからブロッティング膜へとタンパク質を移すステップと、膜をブロックするステップと、一次抗体を用いてインキュベートするステップと、色または光を生成するレポーター酵素に結合した二次抗体を用いてインキュベートするステップと、この色または光を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態において、定量的ウェスタンブロットを実施することによって、遺伝子活性のモジュレーションを評価することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質量の減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、タンパク質量の増加は、遺伝子の上方調節の指標である。
細胞における遺伝子発現の変化は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して測定することができる。いくつかの実施形態において、定量的PCR(qPCR)を実施することによって、遺伝子活性のモジュレーションを評価することができる。そのような方法は、標的細胞から全RNAを単離するステップと、cDNA合成を実施するステップと、qPCR反応を行わせるステップと、相対的定量化を使用してqPCRによる結果を解析するステップとを含み得る(Fleige and Pfaffl. 2006)。いくつかの実施形態において、qPCRは、SYBR-グリーンまたはTaqMan/TaqPathプローブを使用して実施される。いくつかの実施形態において、RNAの減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、RNAの増加は、遺伝子の上方調節の指標である。
いくつかの実施形態において、遺伝子モジュレーションを評価するために、レポーターアッセイが使用される。さらなる実施形態において、レポーターアッセイは、蛍光タンパク質、例えば、tagBFP、GFP、eGFP、YFP、mcherry、Ruby2、mOrange、シトリン、Clover、およびmターコイズなどを使用する蛍光レポーターアッセイである。蛍光タンパク質レポーターシステムは、実施例1ならびに図5および6において説明される。蛍光タンパク質または融合タンパク質の発現の変化は、フローサイトメトリー、顕微鏡法、または高処理量定量的顕微鏡法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、蛍光シグナルの増加は、遺伝子の上方調節の指標である。
別の実施形態において、レポーターアッセイは、ルシフェラーゼベースのシステムを使用する。いくつかの実施形態において、使用することができるルシフェラーゼレポーターは、ウミホタルルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼ、Gaussia-Duraルシフェラーゼ、緑色ウミシイタケルシフェラーゼ、赤色ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、Nano-Lucルシフェラーゼ、またはTurboLucルシフェラーゼである。ルシフェラーゼベースのシステムにおいて、遺伝子発現の変化は、ルミノメーターまたは修正光学顕微鏡を使用して測定されるが(McClure, et al. 2011)、他の手段、例えば、qPCR、ウェスタンブロット、免疫化学、またはフローサイトメトリーなどによって測定することもできる。いくつかの実施形態において、シグナルの減少は、遺伝子の下方調節の指標である。別の実施形態において、シグナルの増加は、遺伝子の上方調節の指標である。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、結果として、遺伝子発現を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上減少させる。典型的には、遺伝子発現は、60%から100%減少する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、結果として、遺伝子発現を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上増加させる。典型的には、遺伝子発現は、60%から100%増加する。
治療用途
外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを搭載したエクソソームは、疾患の治療または予防において有用であり得る。したがって、本発明は、外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを搭載したエクソソームを使用して患者の疾患または障害を治療または予防する方法を含む。用語「患者」は、予防処置または治療処置を受けるヒト対象および他の哺乳動物対象を包含する。
いくつかの実施形態において、外因性核酸は、RNA治療のための治療的RNA配列である。現在臨床試験中であるRNA治療の例としては、がん、肝線維症、緑内障、嚢胞性繊維症、潰瘍性大腸炎、B型肝炎感染症、II型糖尿病、Duchenne型進行性筋ジストロフィー症、喘息、およびHIV感染症のためのRNA治療が挙げられる(Kaczmarek, et al. 2017)。そのようなRNA治療は、そのような治療的RNAをエクソソームにパッケージングすることによって標的細胞に対して送達システムを提供することにより、本発明から恩恵を受け得る。
本発明は、疾患または状態を治療または予防する方法であって、有効量の本発明のエクソソームを投与し、それにより、当該疾患を治療または予防するステップを含む方法も提供する。本発明のエクソソームは、当該エクソソームが得られる幹細胞と同じ疾患を治療するために使用することができる。
予防用途では、特定の疾患を発症するリスクを排除または減少するのに十分な、または疾患の発症を遅延させるのに十分な量において、当該疾患になりやすい患者、またはそうでなければそのリスクにある患者に、医薬組成物または医薬品が投与される。治療用途では、疾患および併発症の症状を回復させるのに十分な、または少なくとも部分的に抑制するのに十分な量において、そのような疾患が疑われる患者、または既に患っている患者に、組成物または医薬品が投与される。これを達成するのに適した量は、治療的または薬学的に有効な用量として定義される。予防的および治療的レジームでの両方において、薬剤は、十分な反応が達成されるまで、典型的には複数回投薬量において投与される。典型的には、当該反応はモニターされ、反応が弱まり始めた場合、反復投薬量が与えられる。
上記において説明した状態の治療のための本発明の組成物の有効用量は、多くの異なる要因、例えば、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物のどちらであるか、投与された他の医薬品、および治療が予防的かまたは治療的のどちらであるかなどに応じて変わる。
本明細書において使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「治療すること」、および「治療法」は、患者または対象に直接関連して使用される場合、障害に関連する1つまたは複数の症状の改善、あるいは障害または障害に関連する1つまたは複数の症状の防止または予防を意味するために用いられる。治療すべき障害としては、これらに限定されるわけではないが、変性障害、組織破壊に関わる障害、新生物障害、炎症性障害、自己免疫疾患、または移植された器官および組織の拒絶反応を含む免疫学的媒介疾患が挙げられる。症状の改善または防止は、治療を必要とする対象への、本発明の微粒子の投与、またはこれらの微粒子を含む医薬組成物の投与の結果として生じる。
本発明の外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを搭載したエクソソームおよび方法は、増殖性疾患の治療において使用され得る。用語「増殖性疾患」は、本明細書に使用される場合、がんおよび非がん性疾患の両方を意味する。そのため、当該方法は、結果として、最終的に、異常に増殖する細胞、例えば、がん細胞、例えば、腫瘍細胞および他の(非悪性)腫瘍細胞などの殺傷を生じ得る。pre-miRNAは、がん治療のために、治療的外因性ヌクレオチド配列をエクソソームへと送達する。本発明は、エクソソーム内への治療的ヌクレオチド配列のパッケージングを促進し、次いで、患者の細胞へと送達される。
miRNAおよびshRNAs/siRNAなどのRNAは、がん遺伝子、例えば、がんにおけるEGFR変異バリアントなどを標的化するために使用することができる。あるいは、CRISPRまたは抗miRNAのためのガイド鎖は、本発明のpre-miRNAを使用して、エクソソームに搭載することができる。
したがって、本発明は、本発明の組成物を使用して患者においてがんを治療または予防する方法も含む。
用語「患者」は、予防処置または治療処置を受けるヒト対象および他の哺乳動物対象を包含する。
本発明の外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miRNAを搭載したエクソソームは、場合により、併用療法を提供するために別の治療薬と組み合わせてもよい。
医薬組成物
外因性ヌクレオチド配列を含むpre-miR-21を搭載したエクソソームは、治療法において有用であり、したがって、医薬組成物として製剤化することができる。薬学的に許容される組成物は、典型的には、本発明のエクソソームに加えて、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル、および/または賦形剤を含む。好適な担体の例は、乳酸リンゲル液である。そのような成分の十分な説明は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472において提供される。
語句「薬学的に許容される」は、本明細書において用いられる場合、十分に医学的な判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは併発症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用に対して好適である、合理的な恩恵/リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および/または投薬形態を意味する。
本発明の組成物は、所望の場合、少量のpH緩衝剤も含むことができる。担体は,貯蔵媒体、例えば、BioLife Solutions Inc., USAから市販されているHypothermosol(登録商標)などを含み得る。好適な医薬担体の例は、E.W.Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するような好適な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態において、予防用または治療用エクソソームの予防的または治療的に有効な量を含有する。当該製剤は、投与の様式に適合させる必要がある。好ましい実施形態において、当該医薬組成物は無菌であり、対象、好ましくは動物対象、より好ましくは哺乳動物対象、最も好ましくはヒト対象への投与にとって好適な形態である。
本発明の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらは、例えば、半固体および液体投与形態、例えば、凍結乾燥調製物、液体溶液もしくは懸濁液、注射可能な不融性溶液などを含む。医薬組成物は、好ましくは注射可能である。
一般的に、医薬組成物は水性形態である。組成物は、保存料および/または酸化防止剤を含み得る。
医薬組成物は、浸透圧を制御するために、生理的な塩、例えば、ナトリウム塩などを含むことができる。塩化ナトリウム(NaCl)は好ましく、それは、1mg/mlから20mg/mlの間において存在し得る。存在していてもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムが挙げられる。
組成物は、1つまたは複数の緩衝剤を含み得る。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には、5~20mMの範囲の濃度において含まれる。組成物のpHは、一般的に、5から8の間、より典型的には6から8の間、例えば、6.5および7.5、または7.0から7.8の間である。
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくはグルテンフリーである。組成物は、好ましくは発熱性物質を含まない。
典型的な実施形態において、本発明の外因性ヌクレオチド配列搭載エクソソームは、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸(Trolox(登録商標))、Na、K、Ca2+、Mg2+、Cl、HP0 、HEPES、ラクトビオネート、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストロン-40、アデノシン、およびグルタチオンを含む組成物に懸濁される。典型的には、当該組成物は、双極性非プロトン溶媒、例えば、DMSOなどを含まない。好適な組成物は、市販されており、例えば、HypoThermasol(登録商標)-FRSである。そのような組成物は、エクソソームを4℃から25℃において、長期間(数時間から数日間)貯蔵することを、または凍結温度、すなわち、-20℃未満の温度において保存することを可能にする場合に有利である。次いで、エクソソームは、解凍後にこの組成物において投与され得る。
当該医薬組成物は、任意の適切な経路によって投与することができ、そのような経路は、治療すべき疾患または状態に応じて、当業者には明らかである。典型的な投与経路としては、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、脳内、鼻腔内、または腹腔内経路が挙げられる。
本発明のエクソソームは、治療的または予防的に有効な用量において投与され、そのような量は、当業者には明らかであろう。当該エクソソームの低い免疫原性または免疫原性が存在しないことにより、有害な免疫反応を引き起こすことなく、反復用量を投与することが可能である。
本発明は、下記の非限定的な実施例を参照しながらより詳細に説明される。
実施例の概要
本発明は、pre-microRNAおよびpri-micro-RNAの直鎖状配列および三次(3D)構造の両方、CTX神経幹細胞から生じるエクソソーム中の特定のバリアントの相対的存在量についての分析の組み合わせから生じたものである。さらに、本発明は、回収されたエクソソームにおける高レベルのマイクロRNAの発現およびアップシャトリングにつながる構造および配列を識別することから生じたものである。この知識は、pre-miR-21コンストラクトを設計するために使用され、この場合、選択する任意の外因性ヌクレオチド配列(例えば、miRNA、siRNA、またはshRNA)の配列を、エクソソーム生合成の際にエクソソームに挿入し、標的化することができる。
本発明の発現ベクターは、合成により生産した本発明のpre-miRNAを用いるトランスフェクションのために、エレクトロポレーション、リポフェクション、または任意の他の同等な技術を使用したトランスフェクションと交換することができる。発現ベクターは、c-myc発現、ホルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA)、またはベクターまたは改変ベクターの発現を調節することができるMIR21の外因性配列または人工配列に対する結合能力を有する他の転写因子に応じて、種々の転写因子を使用することによって、モジュレートすることができる。
[実施例1]細胞および転写因子依存性の方式においてmiRの発現を調節するためにMIR21ベクターを使用することができる
MIR21は、VMP1遺伝子のイントロン配列に組み込まれることは理解されよう。しかしながら、Fujita et. al., 2008によって説明されるように、その発現は、プロモーター領域miPPR21に含まれるそれ自体の調節エレメントに依存する(図1A)。このプロモーター領域は、miR-21ヘアピンに対して-3,770から-3,337上流に見出される。
図1Aに表されるmiPPR-21プロモーターにおいて強調表示されたエンハンサーエレメントは以下の通りである:
Figure 2023507181000012
本発明者らは、miR21エクソンに位置する任意のmiRNAを発現する能力を調べるために、MIR21遺伝子の全長を含むベクターを設計した(図1A)。本発明者らは、miRNA-5pを発現しないかまたは非常に低いレベルでしか発現しない細胞において、ならびにmiR21-5pが、発現されている最も高いmiRNAであることを本発明者らが見出した本発明のCTX0E03細胞において、発現ベクターが機能的であることを見出した(図1B、1C)。このことは、当該ベクターが細胞内容物に関係なく機能することを示している。
その上、本発明者らは、Fujita et. al., 2008によって説明されるように、おそらく、そのプロモーター上の調節配列に起因して、ベクターがPMAによって調節することができることを見出した。
本発明者らは、転写因子c-mycの過剰発現は、miR21の発現を効果的に増加させることができることも見出した(図1D)。したがって、miR21に対するmRNAまたはmiR21エクソンに位置する任意の他のmiRNAの発現は、c-mycに依存するメカニズムによって細胞株CTX0E03において調節することができる。
mRNAおよびmiRNAの転写、安定性、および正しいプロセシングを制御することができる他の調節配列を探すことによって、本発明者らは、異なる制限部位を含ませることによってベクターのいくつかの欠失コンストラクトを設計した。本発明者らは、その発現を制御しそのプロセシングに影響を及ぼし得るmiR21エクソンの上流領域および下流領域に位置する調節エレメントの存在-したがって、エクソソームへの搭載を観察した(図2)。
[実施例2]pri-miR-Ruby2を使用した設計および機能研究
理論に束縛されるわけではないが、pri-miR-21の配列に存在するゆらぎ対および構造は、その折り畳み、プロセシング、およびRBPとの相互作用において、したがって、エクソソームへの当該生成されたmiRNAのソーティングにおいて、重要な役割を有することは理解されよう(図3)。この仮説を調べるために、正しくプロセッシングされた場合、蛍光タンパク質Ruby2に対する機能的miRNAを生成することになる、カセットpri-miR-Ruby2を含む発現ベクターを生成した(図3)。このカセットは、RNAポリメラーゼIIプロモーターによってその転写を促進するために、遺伝子コード配列(CDS)の3’UTR領域に配置した。
pri-miR-Ruby2の設計において、pre-miR-21-5pの天然構造、長さ、G-U対、ミスマッチ、欠失、およびループは維持されたが、天然の成熟miR21-5pの配列に存在する2つのゆらぎ対は維持されなかった(図5B)。最終的に、pre-miRNAは、pri-miR-21-5上に見出される5’および3’末端配列に両側が挟まれ(図5C)、カセット全体をレンチウイルス発現ベクターにクローニングした(図5D)。
HEK293細胞へのこのベクターのエレクトロポレーション後、細胞質における成熟miR-Ruby2の発現を、qPCRによって検出し、それは、プロデューサー細胞株におけるmiRNAの正しい生成およびプロセシングを示していた(図6A)。このmiR-Ruby2は、プロデューサー細胞株においても機能的であり、このタンパク質を構成的に発現するHEK293において、Ruby2に関するmRNAレベルに対するかなりの下方調節が観察された(図6B)。その上、プロデューサー細胞の培養培地由来の精製されたエクソソームにおけるmiR-Ruby2の存在が、共培養アッセイにおいてqPCRによって検出された(図6C)。精製されたエクソソーム中のmiR-Ruby2による、タンパク質発現の下方調節に対する効果(図6D)およびmRNA発現の下方調節に対する効果(図6D)も、共培養アッセイにおいて分析した。
[実施例3]発現ベクターpLVX-Exo-miRNAにクローニングされるmiRNAの設計
設計されたベクターpLVX-Exo-miRNAは、hsa-miR-21-5pの構造に基づいたエクソソームに搭載されるmiRNAの発現を可能にするレンチウイルスベクターである。このベクターは、所望のmiRNAカセットの発現のための安定した細胞株を生成するために、蛍光タンパク質Cloverおよびブラストサイジンに対する抗生物質選択タンパク質の発現も可能にする。
miR21カセットは、発現およびエクソソームへのmiRNAの搭載のために必要な全てのエレメントを含む。
pLVXベクターへクローニングされるmiRNAを生成させるために、当業者は、pLVXベクターにクローニングされるべきpri-miR21の構造に基づいてpri-miRNAを設計する必要がある。
pLVXベクターにクローニングされるべきpri-miRNAは、下記の特徴を含むべきである:
1.制限酵素AvrIIに対応する6ヌクレオチド:CCTAGG;
2.hsa-pri-miR21の5’配列に対応する130ヌクレオチド:
Figure 2023507181000013
3.hsa-miR21-5pの5’配列に対応する8ヌクレオチド:TGTCGGGT;
4.21ヌクレオチド標的配列の逆相補体(成熟miRNA配列)。これは、一度転写されるとmiRNAのステムになる。これは、利用可能な複数のオンラインツールのいずれかによって設計することができる。
5.hsa-mir-21の末端ループに対応する16ヌクレオチド:CTGTTGAATCTCATGG;
6.標的センス配列のヌクレオチド2~6:
7.ワトソン-クリック塩基対相補性による標的アンチセンス配列に一致せず、ゆらぎ塩基対を形成する、1ヌクレオチド;
8.標的センス配列のヌクレオチド8~12および14~21;
9.hsa-miR21-5pの3’配列に一致する8ヌクレオチド:GTCTGACA;
10.hsa-pri-miR-21の3’配列に一致する112ヌクレオチド:
Figure 2023507181000014
および
11.制限酵素NotIに対応する8ヌクレオチド:GCGGCCGC。
設計した後、当該配列は、制限部位AvrIIおよびNotIを使用して本発明の発現ベクターに直接クローニングするために、二本鎖DNA配列としてオーダーすることができる。
[実施例4]
miRNAのプロセシングおよびエクソソームへの搭載に対するさらなる調査は、設計されたpri-miRNAカセットを含むベクターを、以下のように改変する:
・miR-21-5pの5’および3’末端配列:異なるmiRNA由来の他の配列の代わりにこれらの配列で代用する;
・pre-miR-21-5p構造:pre-miRNA配列におけるゆらぎ塩基対で代用し、標準的なワトソン-クリック対を使用する;
・内部ループ:他のループ配列でそれを置換する;
・ミスマッチおよび置換:これらを除去し、元のpre-miRNA配列およびループを維持する設計されたmiRNAの完全に相補的な鎖を生成する。
本願明細書に記載した実施例と実施形態は説明だけを目的としたものであり、本願明細書を参照するとさまざまな修正や変更が当業者に示唆され、そうした修正や変更は、本出願の本質内、範囲内に含まれるものであり、添付の請求項の範囲に含まれるものである。本願明細書で引用したあらゆる刊行物、配列アクセッション番号、特許、特許出願は、参考としてその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれているものとする。
選択された参考文献
Figure 2023507181000015
Figure 2023507181000016
Figure 2023507181000017

Claims (26)

  1. エクソソームに対して外因性ヌクレオチド配列を標的化するためのpre-miRNAであって、外因性ヌクレオチド配列およびステム-ループ構造を含み、前記ステムが少なくとも1つのゆらぎ対を含む、pre-miRNA。
  2. a.少なくとも1つのゆらぎ対を含む5’末端;ならびに/または
    b.1つもしくは複数の欠失および/もしくはミスマッチを含む外因性ヌクレオチド配列;ならびに/または
    c.ループおよび少なくとも1つのゆらぎ対を含む3’末端
    を含む、請求項1に記載のpre-miRNA。
  3. 構造A-B-Cを含み、
    ここで:
    a.Aは、pre-miRNA 5’末端であり、前記pre-miRNA 5’末端は、pre-miR-21の5’末端に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の配列同一性を含み;
    b.Bは、pre-miR-21において天然には見出されない外因性ヌクレオチド配列であり;
    c.Cは、pre-miRNA 3’末端であり、前記pre-miRNA 3’末端は、pre-miR-21の3’末端に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の配列同一性を含み、
    場合により、前記pre-miRNAは、pre-miR-21の配列に対して少なくとも20%、30%、40%、またはそれ以上の全配列同一性を含む、請求項1または2のいずれかに記載のpre-miRNA。
  4. 構造:
    Figure 2023507181000018
    を含み、
    ここで:
    Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし;
    は、nとハイブリダイズするヌクレオチド配列の任意の長さであり、場合により、Nx1,Nx2,およびNx3は、異なる長さを有し;
    Mは、ヌクレオチドであり、mとミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
    Dは、ヌクレオチドであり、前記ステムループ構造の片側にのみ存在し;
    Wは、ヌクレオチドであり、wとゆらぎ対を形成し;
    Lは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、lとハイブリダイズし得;
    前記pre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで:
    […]は、miR-21 5’末端構造的ミミックであるAであり;
    {…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
    (…)は、miR-21 3’末端構造的ミミックであるCである、
    請求項1~3のいずれかに記載のpre-miRNA。
  5. x1は、4から12ヌクレオチドを含み;Nx2は、2から8ヌクレオチドを含み;Nx3は、2から8ヌクレオチドを含む、請求項4に記載のpre-miRNA。
  6. 前記ステムループ構造が、60から80ヌクレオチドの全長を含み、場合により、前記外因性ヌクレオチド配列は、19~25ヌクレオチド長であり;および/または
    前記pre-miRNAが、前記外因性ヌクレオチド配列の上流の転写因子調節プロモーターを含み、場合により、前記プロモーターが、TATA結合タンパク質、アクティベータータンパク質1(AP-1)、CCAAT-エンハンサー-結合タンパク質(C/EBP)、血清応答因子(SRF)、シグナル伝達および転写活性化因子3(STAT3)、GC-box結合タンパク質、E26形質転換特異的(ETS)ファミリー転写因子、場合により、PU.1、核因子I(NFI)転写因子、またはp53の1つまたは複数によって調節される、請求項1~5のいずれかに記載のpre-miRNA。
  7. 構造:
    Figure 2023507181000019
    を含み、
    ここで:
    Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし;
    Mは、ヌクレオチドであり、mとミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
    Dは、ヌクレオチドであり、前記ステムループ構造の片側にのみ存在し;
    Wは、ヌクレオチドであり、wとゆらぎ対を形成し;
    Lは、ループ構造を形成するヌクレオチドであり、lとハイブリダイズし得;
    前記pre-miRNAは、構造A-B-Cを含み、ここで:
    […]は、pre-miRNA 5’末端であるAであり;
    {…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
    (…)は、pre-miRNA 3’末端であるCである、
    請求項1~6のいずれかに記載のpre-miRNA。
  8. 成熟miR-21配列の代わりにpre-miR-21の配列および外因性ヌクレオチド配列を含む、請求項1~7のいずれかに記載のpre-miRNA。
  9. 前記ゆらぎ対(W-w)が、グアニン-ウラシル(G-UまたはU-G)、ヒポキサンチン-ウラシル(I-UまたはU-I)、ヒポキサンチン-アデニン(I-AまたはA-I)、および/またはヒポキサンチン-シトシン(I-CまたはC-I)を含む、請求項1~8のいずれかに記載のpre-miRNA。
  10. 構造:
    Figure 2023507181000020
    を含み、
    ここで:
    Nは、任意のヌクレオチドでありnとハイブリダイズし、場合によりワトソン-クリック対合によってnとハイブリダイズし;
    Mは、ヌクレオチドであり、mとミスマッチであるかまたはmとハイブリダイズせず;
    Dは、ヌクレオチドであり、前記ステムループ構造の片側にのみ存在し;
    前記pre-miRNAは、前記構造A-B-Cを含み、ここで:
    […]は、pre-miRNA 5’末端であるAであり;
    {…}は、外因性ヌクレオチド配列であるBであり;
    (…)は、pre-miRNA 3’末端であるCである、
    請求項1~9のいずれかに記載のpre-miRNA。
  11. 前記外因性ヌクレオチド配列が、siRNA、miRNA、抗miR、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、またはCRISPRガイド鎖配列である、請求項1~10のいずれかに記載のpre-miRNA。
  12. 前記外因性ヌクレオチド配列が、エクソソーム生合成の際に、前記エクソソームに対して標的化される、請求項1~11のいずれかに記載のpre-miRNA。
  13. 前記外因性ヌクレオチド配列が、標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする、請求項1~12のいずれかに記載のpre-miRNA。
  14. pre-miRNAを含むカセットであって、以下の順番で:
    a.5’pri-miR-21配列であって、場合により調節エレメントを含む配列;
    b.請求項1~13のいずれかに記載のpre-miRNAミミック;および
    c.3’pri-miR-21配列であって、場合により調節エレメントを含む配列
    を含む、カセット。
  15. 請求項14に記載のカセットまたは請求項1~13のいずれか一項に記載のpre-miRNAを含む、ベクター。
  16. 請求項15に記載のベクター、請求項14に記載のカセット、または請求項1~13のいずれかに記載のpre-miRNAを含む、細胞。
  17. 幹細胞であり、場合により神経幹細胞であり、場合によりCTX0E03細胞であり、場合により部分的に分化した幹細胞である、請求項16に記載の細胞。
  18. 前記pre-miRNAが、前記細胞におけるエクソソーム内に存在する、請求項16または請求項17に記載の細胞。
  19. 外因性ヌクレオチド配列をエクソソームに搭載する方法であって、請求項16、17、または18に記載の細胞からエクソソームを産生するステップを含む、方法。
  20. エクソソーム、場合により請求項1~13のいずれかに記載のpre-miRNAを含むエクソソームを調製する方法であって、
    a.請求項16、17、または18に記載の細胞を培養するステップ;
    b.馴化培地を回収するステップ;場合により、
    c.前記エクソソームの精製ステップ;および/または
    d.前記エクソソームの検証ステップ
    を含む方法。
  21. 請求項19または請求項20の方法によって得ることができるまたは得られるエクソソームであって、場合により、請求項1~13のいずれかに記載のpre-miRNAを含む、エクソソーム。
  22. 外因性ヌクレオチド配列を標的細胞へ送達する方法であって、
    請求項21のエクソソームを使用するステップであって、前記標的細胞を前記搭載したエクソソームと接触させることを含むステップ;または
    細胞にトランスフェクトされる場合に前記外因性ヌクレオチド配列を送達する、請求項1~13のいずれかに記載のpre-miRNA、請求項14のカセット、または請求項15のベクターを使用するステップであって、場合により前記外因性ヌクレオチド配列は前記標的細胞において選択的に発現され、場合により前記標的細胞は調節不全の遺伝子発現を有する病的細胞、例えばがん細胞または自己免疫疾患の細胞である、ステップ
    である、方法。
  23. 標的細胞における遺伝子活性をモジュレートする方法であって、請求項21に記載のエクソソームを投与するステップを含む方法。
  24. 請求項21のエクソソームを含む医薬組成物。
  25. 治療法での使用のための、請求項21または24に記載のエクソソーム。
  26. エクソソームへのmiRNA搭載を制御するための、mir21エクソンの上流領域または下流領域に位置する調節エレメントの1つまたは複数の使用であって、
    場合により、前記1つまたは複数の調節エレメントが、TATA結合タンパク質、アクティベータータンパク質1(AP-1)、CCAAT-エンハンサー-結合タンパク質(C/EBP)、血清応答因子(SRF)、シグナル伝達および転写活性化因子3(STAT3)、GC-box結合タンパク質、E26形質転換特異的(ETS)ファミリー転写因子、場合によりPU.1、核因子I(NFI)転写因子、またはp53の1つまたは複数によって調節される、使用。
JP2022537277A 2019-12-20 2020-12-18 ポリヌクレオチドをエクソソームに送達するための核酸コンストラクト Pending JP2023507181A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1919021.4 2019-12-20
GBGB1919021.4A GB201919021D0 (en) 2019-12-20 2019-12-20 Nucleic acid constructs for delivering polynucleotides into exosomes
PCT/GB2020/053284 WO2021123805A1 (en) 2019-12-20 2020-12-18 Nucleic acid constructs for delivering polynucleotides into exosomes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023507181A true JP2023507181A (ja) 2023-02-21

Family

ID=69322611

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022537277A Pending JP2023507181A (ja) 2019-12-20 2020-12-18 ポリヌクレオチドをエクソソームに送達するための核酸コンストラクト

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230287408A1 (ja)
EP (1) EP4077665A1 (ja)
JP (1) JP2023507181A (ja)
KR (1) KR20220119084A (ja)
CN (1) CN114867855A (ja)
AU (1) AU2020410187A1 (ja)
CA (1) CA3162118A1 (ja)
GB (1) GB201919021D0 (ja)
IL (1) IL294039A (ja)
WO (1) WO2021123805A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110358827A (zh) * 2019-07-09 2019-10-22 中国人民解放军第四军医大学 Vmp1基因在病理诊断胶质母细胞瘤中的应用及其试剂盒的制备
WO2024131946A1 (zh) * 2022-12-22 2024-06-27 南京科捷基因技术有限公司 核酸分子及其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851832A (en) 1991-07-08 1998-12-22 Neurospheres, Ltd. In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny
US5753506A (en) 1996-05-23 1998-05-19 Cns Stem Cell Technology, Inc. Isolation propagation and directed differentiation of stem cells from embryonic and adult central nervous system of mammals
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6468794B1 (en) 1999-02-12 2002-10-22 Stemcells, Inc. Enriched central nervous system stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations
US7514259B2 (en) 2000-02-11 2009-04-07 Schepens Eye Research Institute Isolation and transplantation of retinal stem cells
PL1758986T3 (pl) 2004-06-09 2016-03-31 Univ Court Univ Of Edinburgh Nerwowe komórki macierzyste
ATE373081T1 (de) 2004-09-30 2007-09-15 Reneuron Ltd Zelllinie
EP3502254A1 (en) 2010-04-23 2019-06-26 Cold Spring Harbor Laboratory Novel structurally designed shrnas
WO2013150303A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles
US20150164955A1 (en) 2012-07-19 2015-06-18 Reneuron Limited Stem cell microparticles
EP3160980B1 (en) 2014-05-28 2020-05-20 The Regents of the University of California HYBRID tRNA/pre-miRNA MOLECULES AND METHODS OF USE
CA3021949C (en) * 2015-04-24 2023-10-17 University Of Massachusetts Modified aav constructs and uses thereof
EP3356519B1 (en) * 2015-10-01 2021-06-30 University Of Ottawa Exosome packaging of nucleic acids
AU2017322522B2 (en) * 2016-09-09 2024-01-04 Cornell University Delivery of nucleic acids, proteins and small molecules in vitreous vesicular bodies
CA3073705A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for loading extracellular vesicles with chemical and biological agents/molecules
EP3781684A4 (en) 2018-04-20 2022-04-20 The Regents Of The University Of California TRNA/PRE-MIRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF LIVER CELL CARCINOMA
JP7545726B2 (ja) 2018-05-22 2024-09-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア tRNA/プレmiRNA組成物およびがん治療における使用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3162118A1 (en) 2021-06-24
US20230287408A1 (en) 2023-09-14
IL294039A (en) 2022-08-01
GB201919021D0 (en) 2020-02-05
WO2021123805A1 (en) 2021-06-24
EP4077665A1 (en) 2022-10-26
KR20220119084A (ko) 2022-08-26
CN114867855A (zh) 2022-08-05
AU2020410187A1 (en) 2022-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108368487B (zh) 核酸的外泌体包装
CA3036926C (en) Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
EP3320092B1 (en) Engineered crispr-cas9 compositions and methods of use
KR20220119129A (ko) Leaper 기술에 기반한 mps ih 치료 방법 및 조성물
CN110959039A (zh) 新型cas13b直向同源物crispr酶和系统
US10519443B2 (en) Microrna inhibitor system and methods of use thereof
US9879254B2 (en) Targeting RNAs to microvesicles
CN114007655A (zh) 用于细胞疗法的环状rna
JP2021529518A (ja) ドナーポリヌクレオチドの挿入によるゲノム編集のための組成物および方法
US7972816B2 (en) Efficient process for producing dumbbell DNA
CN113227152A (zh) 用于大分子递送和基因组修饰的可编程设计因子治疗性促融合分泌性g型核外颗粒体囊泡
JP2023507181A (ja) ポリヌクレオチドをエクソソームに送達するための核酸コンストラクト
EP3813522A1 (en) Models of tauopathy
CN109219659B (zh) 用于治疗眼咽型肌营养不良(opmd)的试剂及其用途
WO2012046065A2 (en) Culture method
EP3912629A1 (en) Method for delivering gene in cells
KR102620197B1 (ko) 약물전달물질로서의 대장암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도
Sawai et al. A novel method of cell-specific mRNA transfection
WO2023074873A1 (ja) 細胞純化方法
Lesizza et al. Noncoding RNAs in cardiovascular disease
JP7362097B2 (ja) 細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法
WO2011001965A1 (ja) small RNA二本鎖およびヘアピン型RNAの設計方法
KR20230071602A (ko) 대장암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도
WO2023213983A2 (en) Expression construct
Wang Validation of shRNA clones for gene silencing in 293FT cells

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231208