JP7362097B2 - 細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法 - Google Patents
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Description
[1] ヌクレアーゼをコードするmiRNA応答性mRNAを、細胞に導入する工程を含む、細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記:
(i) miRNAによって特異的に認識される核酸配列、および
(ii) 前記ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列を含む、方法。
[2] 前記miRNAによって特異的に認識される核酸配列が、miR-302a標的配列またはmiR-21標的配列のいずれかである、[1]に記載の方法。
[3] 前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質またはその変異体であり、
さらに、前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAを前記細胞群に導入する工程を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 未分化細胞特異的にヌクレアーゼを制御する、[3]に記載の方法。
[5] 前記未分化細胞が、miR-302aを発現する細胞である、[4]に記載の方法。
[6] 前記miRNA応答性mRNAが、(i)および(ii)が5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含む、[1]から[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7] (i) miRNAによって特異的に認識される核酸配列、および
(ii) ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列を含む、miRNA応答性mRNA。
[8] 前記miRNAによって特異的に認識される核酸配列が、miR-302a標的配列またはmiR-21標的配列のいずれかである、[7]に記載のmiRNA応答性mRNA。
[9] 前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質またはその変異体である、[7]または[8]に記載のmiRNA応答性mRNA。
[10] [9]に記載のmiRNA応答性mRNAと、
前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAと
を含む、細胞特異的にヌクレアーゼを制御するためのキット。
[11] a)ヌクレアーゼをコードするトリガータンパク質応答性mRNAと、
b)前記トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAと
を、細胞に導入する工程を含む、細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法であって、
前記a)ヌクレアーゼをコードするタンパク質応答性mRNAが下記:
(ia) 前記タンパク質に特異的に結合する核酸配列と、
(iia) 前記ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列と
を含み
前記b)トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAが下記:
(ib) miRNAによって特異的に認識される核酸配列と、
(iib) 前記トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列を含む、方法。
[12] 前記トリガータンパク質が、L7Aeタンパク質もしくはその誘導体を含み、前記タンパク質に特異的に結合する核酸配列が、K-turn配列もしくはその誘導体を含む、[11]に記載の方法。
[13] 前記miRNAによって特異的に認識される核酸配列が、miR-302a標的配列またはmiR-21標的配列のいずれかである、[11]または[12]に記載の方法。
[14] 前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質またはその変異体であり、
さらに、前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAを前記細胞に導入する工程を含む、[11]~[13]のいずれか1項に記載の方法。
[15] 未分化細胞特異的にヌクレアーゼを制御する、[14]に記載の方法。
[16] 前記未分化細胞が、miR-302aを発現する細胞である、[15]に記載の方法。
[17] 前記a)トリガータンパク質をコードするタンパク質応答性mRNAが、(ia) および(iia) が5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含み、
前記b)ヌクレアーゼをコードするmiRNA応答性mRNAが、(ib)および(iib)が5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含む、[11]~[16]のいずれか1項に記載の方法。
[18] a)下記を含むヌクレアーゼをコードするトリガータンパク質応答性mRNA:
(ia) 前記タンパク質に特異的に結合する核酸配列、及び
(iia) 前記ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列と、
b)下記を含むトリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNA:
(ib) miRNAによって特異的に認識される核酸配列、及び
(iib) 前記トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列と
を含むヌクレアーゼ制御剤。
[19] 前記トリガータンパク質が、L7Aeタンパク質もしくはその誘導体を含み、前記タンパク質に特異的に結合する核酸配列が、K-turn配列もしくはその誘導体を含む、[18]に記載のヌクレアーゼ制御剤。
[20] 前記トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAにおいて、前記miRNAによって特異的に認識される核酸配列が、miR-302a標的配列またはmiR-21標的配列のいずれかである、[18]または[19]に記載のヌクレアーゼ制御剤。
[21] 前記トリガータンパク質応答性mRNAにおいて、前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質またはその変異体である、[18]~[20]のいずれか1項に記載のヌクレアーゼ制御剤。
[22] [18]~[21]のいずれか1項に記載のヌクレアーゼ制御剤と、
前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAと
を含む、細胞特異的にヌクレアーゼを制御するためのキット。
本発明は、一実施形態によれば、細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法であって、ヌクレアーゼをコードするmiRNA応答性mRNAを細胞に導入する工程を含む。本発明において、細胞特異的にヌクレアーゼを制御するとは、細胞内在性のmiRNAの発現状態に基づいて、ヌクレアーゼの活性を制御することをいう。
細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における細胞として用いることができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本発明において、ヌクレアーゼをコードするmiRNA応答性mRNAは、miRNA-responsive mRNA、あるいはmiRNAスイッチとも言い、以下の(i)および(ii)の核酸配列を含むmRNAを意味する:(i) miRNAによって特異的に認識される核酸配列、および(ii) ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列。
当該(i)miRNAによって特異的に認識される核酸配列と(ii) ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列は、機能的に連結されている。図1(a)は、本発明に係る方法において使用しうるmiRNA-responsive mRNAの一例を模式的に示す図である。当該miRNA-responsive mRNAにおいては、5'UTRにmiRNAに応答する配列が組みこまれ、蛋白質コーディングリージョンにヌクレアーゼをコードする遺伝子が挿入されている。
本発明において、miRNA-responsive mRNAを細胞に導入する方法としてはmRNAの形態で導入することができる。例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い(Warren L, (2010) Cell Stem Cell.7:618-630)。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。あるいは、miRNA-responsive mRNAは、ベクターなどのDNAの形態で導入することもでき、導入法は、上記と同様のものを用いることができる。
本発明は、第2実施形態によれば、細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法であって、a)ヌクレアーゼをコードするトリガータンパク質応答性mRNAと、b)前記トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAとを細胞に導入する工程を含む。本発明において、細胞特異的にヌクレアーゼを制御するとは、細胞内在性のmiRNAの発現状態に基づいて、ヌクレアーゼの活性を制御することをいう。
本実施形態において、ヌクレアーゼをコードする、トリガータンパク質応答性mRNAは、以下の(ia)および(iia)の核酸配列を含むmRNAを意味する:(ia) トリガータンパク質に特異的に結合する核酸配列、および(iia)ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列。
当該(ia) トリガータンパク質に特異的に結合する核酸配列と(iia)ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列は、機能的に連結されている。図8(a)のmRNA1は、本発明に係る方法において使用しうるトリガータンパク質応答性mRNAの一例を模式的に示す図である。当該トリガータンパク質応答性mRNAにおいては、5'UTRにトリガータンパク質に応答する配列が組みこまれ、蛋白質コーディングリージョンにヌクレアーゼをコードする遺伝子が挿入されている。
本実施形態において、トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAは、miRNA-responsive mRNA、あるいはmiRNAスイッチとも言い、以下の(ib)および(iib)の核酸配列を含むmRNAを意味する:(ib) miRNAによって特異的に認識される核酸配列、及び(iib) 前記トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列を含む。
当該(ib)miRNAによって特異的に認識される核酸配列と(iib) トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列は、機能的に連結されている。図8(a)のmRNA2は、本実施形態に係る方法において使用しうるmiRNA-responsive mRNAの一例を模式的に示す図である。当該miRNA-responsive mRNAにおいては、5'UTRにmiRNAに応答する配列が組みこまれ、蛋白質コーディングリージョンにトリガータンパク質をコードする遺伝子が挿入されている。
次に、このようなa)、b)のmRNAのセットによる、ヌクレアーゼの制御について説明する。細胞内に導入された当該miRNA-responsive mRNAは、細胞内に、標的配列を特異的に認識するmiRNAが存在すると、翻訳抑制されてトリガータンパク質の発現量が低下する。トリガータンパク質が存在すると、トリガータンパク質応答性mRNAに結合して翻訳抑制されるところ、トリガータンパク質の発現量が低下すると逆にトリガータンパク質応答性mRNAの翻訳量が増加し、ヌクレアーゼの翻訳を促進して、ヌクレアーゼ活性を向上させることができる。これにより、ヌクレアーゼの標的となる標的遺伝子の切断活性も向上し、標的遺伝子が切断されその機能消失を引き起こす。一方、細胞内に、標的配列を特異的に認識するmiRNAが存在しないと、miRNA-responsive mRNAは翻訳抑制されることがなく、細胞内でトリガータンパク質が発現する。すると、トリガータンパク質がトリガータンパク質応答性mRNAの翻訳を抑制して、ヌクレアーゼの発現量が低下する。その結果、ヌクレアーゼが標的遺伝子を切断する確率は減少し、標的遺伝子の機能は維持される。
5'UTRの鋳型(miRNA標的配列なし)と3'UTRの鋳型は対応するプライマーとKOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)を用いて、以下のサイクルで(94°C 2min後、98°C 10 sec、68°C 10 secを13サイクル行い、4°Cで保存)PCR増幅を行った。Cas9蛋白をコードする遺伝子は、鋳型プラスミド(pHL-EF1a-SphcCas9-iC-A) から対応するプライマーとKOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)を用いて、以下のサイクルで(94°C 2 min後、98°C 10 sec、68°C 140 secを20サイクル行い、4°Cで保存)PCR増幅を行った。
Cas9 mRNAはMegaScript kit (Ambion)により作製した。この時、免疫反応を抑えるため修飾塩基pseudouridine-5'-triphosphateと5-methylcytidine-5'-triphosphate (TriLink Bio Technologies)をUTPとCTPの代わりにそれぞれ加えた。またGTPは、Anti Reverse Cap Analog (TriLink Bio Technologies)で5倍希釈した。sgRNAは天然の塩基(ATP, GTP, CTP, UTP)を用いMEGAshortscript kit (Ambion)により作製した。反応混合液を37°Cで6時間インキュベートして、TURBO DNase (Amibion)を加えた後、37°Cでさらに30分インキュベートした。得られたmRNAは、FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech)で精製し、Antarctic phosphatase (New England Biolabs)を用いて37C°で30分インキュベートした。その後、RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。sgRNAは精製後さらにウレアページ(10%)による切り出し精製を行った。Cas9 mRNAのcoding region、並びに5'UTR、3'UTRの配列を下記表10A、10Bに示す。
培養細胞
iPS_GFP (AAVS1-CAG::GFP iPS cells) はWoltjen Lab (CiRA, Kyoto University, Japan)より供与されたものである。iPS_GFPは、StemFit (Ajinomoto)培地を用いてラミニンコート{laminin-511 E8 (iMatrix-511, nippi)}したプレートで培養した。HeLa_GFPはDMEM High Glucose (nakarai tesque)にFBS (JBS、終濃度10%)とHygromycin B (50 mg / mL)を加えた培地で培養した。Normal HeLa cellsはDMEM High Glucose (nakarai tesque)にFBS (JBS、終濃度10%)を加えた培地で培養した。全ての細胞は37°C、5% CO2の条件で培養した。
Day0にiPS_GFP細胞を、分化誘導培地を用いてラミニンコートした6-wellプレートに再播種(5x106 cells/well)し、Morizana et al., Neural Development: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol.1018,DOI 10.1007/978-1-62703-444-9_2 を改変したプロトコールにより培養した。以後、毎日培地交換を行った。14日後にそれぞれの実験に用いた。分化誘導培地の組成を下記の表11に示した。
normal HeLaとHeLa_GFP は24-wellプレートに播種した。iPS_GFPとmDA_GFPはラミニンコートした24-wellプレートに播種した(細胞数:5x104cells/well)。 トランスフェクションはStemfect RNA transfection kit (Stemgent)を用いプロトコールに従い行った(導入遺伝子量はそれぞれの実験項を参照)。トランスフェクション後4時間で培地を交換した(但し、mDA_GFPを除く)。Cell killingはトランスフェクション48時間後に、T7E1 assay、EGFP activity assay、co-cultureはトランスフェクション72時間後に解析を行った。それぞれの解析に入る前に、IX81 microscope (Olympus)で細胞を撮影した(図2)。
100 ngのCas9 mRNAと300 ng (iPS_GFP)もしくは100 ng (mDA_GFP)のsgRNAを使用した。トランスフェクション後の細胞をPBSで洗浄後、200 μL Accumax (Funakoshi) で37°C、5% CO2 の条件で10分間処理した。1.5 mL Tubeに細胞を回収し遠心した(室温、1000 rpmで5分)。上精を廃棄後、沈殿した細胞をPBSで洗浄し、先ほどと同じ条件で遠心した。Lysis buffer (1 M Tris-HCl (pH.7.6)[final 0.05 M], 0.5 M EDTA [final 0.02 M], 5 M NaCl [0.1 M], 10% SDS[final 1%], D2W)にproteinase K (x100; final 1x)を500mL加えて55度で3時間以上処理した。その後、PCIを用いてゲノムDNAの抽出を行った。Nested PCRにより、抽出したゲノムDNAから標的配列を増幅した。First PCRは、(94°C 2 min後、98°C 10 sec, 60°C 30 sec, 68°C 30 secを20サイクル行い、72°C 3 min反応後、4°C で保存)、Second PCRは、(94°C 2 min後、98°C 10 sec, 60°C 30 sec,68°C 15 secを35サイクル行い、72°C 3 min反応後、4°C で保存)の条件で行った。PCR産物は、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)により精製した。精製後、PCR産物の変性と再会合を、(95°C 5 min後、 95°C から85°Cまで毎秒2度で冷却し、85°Cから25°Cまでは毎秒0.1°Cで冷却し、その後4°Cで保存)の条件で行った。反応後、制限酵素T7 Endonuclease Iによる処理を施した(37℃で 15 min)。15分後、0.5 M EDTAを加え反応を停止させ、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、SYBER GREEN mixture (I+II =1:1)で染色し撮影した。PCRで使用したプライマーを表9に示した。
Indels (Cas9 activity)を以下の公式により算出した。
Indels = 100 × (1 - sqrt(1 - (b + c)/(a + b + c)))
a : 制限酵素で切断されなかったPCR産物のバンド強度
b,c : 制限酵素で切断されたPCR産物のバンド強度
100 ngのCas9 mRNAと300 ng (iPS_GFP, HeLa_GFP)もしくは100 ng (mDA_GFP)のsgRNAと5 pmolの miRNA inhibitor(mirVana)もしくはnegative control (miRNA inhibitorとnegative controlは任意)を使用した。細胞をPBSで洗浄した。その後、HeLa_GFPは100 μL 0.25% trypsin-EDTAで37°C、5% CO2 の条件で5分間処理した後、100 μLの培地を加えた。iPS_GFPとmDA_GFPは200 μL Accumax (Funakoshi) で37°C、5% CO2 の条件で10分間処理した。1.5 mLチューブに細胞を回収し、CYTOX Red dead-cell stain (ThermoFisher)で処理した(15分間、遮光して室温放置)。Aria-II (BD)、Accuri(BD)、LSR(BD)により測定した。 EGFP negative cells (%)をCas9 activity (%)と定義した。
10 ngのCas9 mRNAと300 ngのsgRNAを使用した。PBSで洗浄する前に、培地を1.5 mLチューブに回収した。PBSでの洗浄後、normal HeLaを100 μL 0.25% trypsin-EDTAで37°C、5% CO2 の条件で5分間処理した。その後、100 μLの培地を加えて細胞を先ほどの1.5 mLチューブに回収し遠心した(室温、1000 rpmで5分)。上精を廃棄後、沈殿した細胞をPBSで洗浄し、先ほどと同じ条件で遠心した。上精を廃棄後、53 μLの染色試薬の混合物{annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate (Life Technologies)、 Annexin-binding buffer 5x (Life Technologies)、 SYTOX Red dead-cell stain}で染色した。 Accuri (BD)により測定した。
50 ngのCas9 mRNAと150 ngのsgRNAを使用した。iPS_GFP細胞とHeLa_GFP細胞を3対2の比率で播種したCas9 activity assayと同様の方法で細胞を1.5 mLチューブに回収したのち、遠心を行った(室温、1000 rpmで5分)。上精を除去したのち、Alexa FluorR 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen をプロトコールに従い染色(プロトコールの2倍量の抗体を使用)し、LSRで測定した。
HeLa細胞におけるmiRNA-responsive CRISPR/Cas9 Systemの挙動を図2に示す。HeLa細胞では、内在性miR-21の活性が高いことが知られている。図2(a)は、miRNA-responsive mRNAを導入したHeLa細胞の蛍光顕微鏡画像である。miRNA に応答しないControlと、miRNA-302aに応答するCas9 mRNAでは、GFPの蛍光がUntreatedや、標的配列に対するネガティブコントロールに比べ弱くなっている。なお、ネガティブコントロールとしては、DMD遺伝子を標的としたものを用いた。一方、miRNA-21に応答するCas9 mRNAでは蛍光に変化が見られなかった。なお、図2(a)は、3回行った実験のうちの1回を代表として記載した。また、図2(b)から、上記蛍光画像と、Aria-II解析による蛍光強度の定量結果が一致していることが明らかになった。2(b)も、3回行った実験のうちの1回を代表として記載した。図2(c)は、上記図2(b)のGFP negative populationをCas9 activityと定義しグラフ化した図である。なお、以降のCas9 activityは特別な記述がない限り、この方法で算出したものとする。以上より、HeLa細胞に各種miRNA-responsive mRNA及びコントロールmRNAを導入した場合に、miR-21に応答するCas9 mRNAのみがCas9 activityが低いことがわかり、miR-21に応答するCas9 mRNA がmiR-21によって制御されている可能性が示された。
Cas9 activity (%) = Q4/(Q1+Q4) x 100: HeLa
Cas9 activity (%) = Q3/(Q2+Q3) x 100: iPS
normal HeLaとHeLa_GFP は24-wellプレートに播種した。iPS_GFPとmDA_GFPはラミニンコートした24-wellプレートに播種した(細胞数:5x104 cells/well)。 トランスフェクションはStemfect RNA transfection kit (Stemgent)を用いプロトコールに従い行った(導入遺伝子量はそれぞれの実験項を参照)。トランスフェクション後4時間で培地を交換した(但し、mDA_GFPを除く)。Evaluation of gene expression level, Evaluation of Cas9 protein expression level, Evaluation of transfection efficiencyはトランスフェクション24時間後に、Cell killingはトランスフェクション48時間後に、T7E1 assay、 EGFP activity assay、co-culture、On-systemはトランスフェクション72時間後に解析を行った。それぞれの解析に入る前に、IX81 microscope (Olympus)で細胞を撮影した。
図11Aに概要を示すようにmRNAを設計した。miRNAの標的部位としては、miR-21に相補的な配列を用いた。miRNAに応答して発現抑制されるトリガータンパク質としては、L7Aeタンパク質を用い、L7Aeタンパク質に特異的に結合する配列としては、キンクターンモチーフを用い、先の方法と同様にして、mRNAを作製した。作製したmRNA(Kt-Cas9 mRNA)の配列は以下の表12A、Bの通りであり、表中、L7Ae 結合モチーフは二重下線で、Cas9コード領域はイタリック体で示す。また、mRNA(L7Ae mRNA、miR-21-responsive L7Ae、Tag BFP mRNA)の配列は以下の表13の通りであり、表中、miR-21-5pの標的配列は二重下線で、L7AeまたはTag BFPのコード領域はイタリック体で示す。
OFF 状態の条件:Control L7Ae mRNA 15 ng + kt-Cas9 mRNA (kt motifを5’UTRに持つ)5 ng + sgRNA 150 ng
ON 状態の条件:miR-21-responsive L7Ae mRNA 15 ng + kt-Cas9 mRNA 5 ng + sgRNA 150 ng
stemfect transfection reagent をプロトコールに従い使用しトランスフェクションを行った。トランスフェクションから 3 日後、Accuri により測定した。
HeLa-EGFP, iPS-EGFP, mDA-EGFPの3種類の細胞を用いた。TaqMan(登録商標) MicroRNA Cells-to-CT(商標) Kit (Ambion)を用いて測定を行なった。細胞溶解液を has-miR-21-5p (Assay ID: 000397), 302a-5p (Assay ID: 002381) そして RNU6B (Assay ID: 001093) Taqman probes (Applied Biosystems)のそれぞれを用いて逆転写反応を行なった。qPCRはTaqman probeを用いて行い、StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を用いて行なった。標的miRNAをRNU6Bによりノーマライズした。さらに、mDA-EGFPを1となるようにノーマライズした。
100 ngのCas9 mRNAと300 ngの sgRNAを使用した。トランスフェクションから24時間後、PBS washを行い、50 μLの M-PER cocktail (M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent [ThermoFisher], protease inhibitor, PMSFを混合したもの) により細胞を溶解し回収した。5分間振盪した後、1.5 mLチューブに溶液を回収した。遠心(12400 rpm, 4°C, 5 min)後、上清を新しい1.5 mL チューブに回収してタンパク質濃度をBCA法により測定した。0.5 mg/mLにタンパク質溶液を希釈後、Wes (ProteinSimple) のプロトコールに従いタンパク質の検出を行なった。GAPDHはローディングコントロールとして使用した。一次抗体:Cas9 antibody (50倍希釈、Active Motif), GAPDH antibody (100倍希釈、Santa Cruz)。二次抗体:anti-mouse, anti-rabbit (ProteinSimple)
T7E1 assayで得られた 2回目のPCR産物(iPS-EGFP)をpUC19ベクターに挿入後、シーケンサーにより配列を読んだ。まず2回目のPCRで用いたプライマーをT4PNKによりリン酸化をし、2回目のPCR産物に対して再度、PCRをかけた。その後pUC19ベクターに挿入し、M13 FwdNew primer, T7E1 Fwd primer, T7E1 Rev primerを用いて配列を決定した。シーケンサーはApplies Biosystems 3500xL Genetic analyzerを使用した。
HeLa-EGFPもしくはiPS-EGFPを用いた。また、100 ng Cas9 mRNA, 300 ng sgRNAを用いた。Trizol (ThermoFisher)をプロトコールに従い用いることで、total RNAを細胞より抽出した。また、TURBO DNase Inactivation Kit (Ambion)を用い、ゲノムDNAを除去した。ReverTra Acr(登録商標)qPCR RT Master Mix (TOYOBO)を用いて、上記処理を施したサンプル (250もしくは300 ng) を逆転写した。qPCRをTHUNDERBIRD(登録商標) SYBR(登録商標) qPCR Mix (TOYOBO)を用いて行なった。反応は、StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を使用した。 標的mRNAはGAPDHでノーマライズした。さらに、Control Cas9 mRNAでの遺伝子発現が1となるようにノーマライズした。
HeLa-EGFPとiPS-EGFPを用いた。100 ngのBFP mRNAと300 ngのCy5でラベル化したsgRNAを用いた。トランスフェクションから24時間後、細胞をPBSで3回ウォッシュした。その後、細胞を1.5mLチューブに回収(細胞の剥がし方は、Cas9 activity assayの項参照)して、LSRにより測定した。
Cas9 activity assayと同様にして実施した。
図9(a)はmiR-21、図9(b)はmiR-302aの発現レベルを HeLa-EGFP, iPS-EGFP, mDA-EGFPでそれぞれ測定した結果である。HeLa-EGFP細胞ではmiR-21のiPS-EGFP細胞ではmiR-302aの発現が高いことを示している。
Control Cas9 mRNAとmiR-21-responsive Cas9 mRNAとmiR-302a-responsive Cas9 mRNAをHeLa細胞に導入(sgRNAも一緒に導入)し、Cas9タンパク質の発現に影響があるのかをSimple Western (Wes) により検討した。結果を図10に示す。ControlやmiR-302a-responsive Cas9 mRNAではCas9タンパク質が検出されたが、miR-21-responsive Cas9 mRNAでは検出されなかった。つまり、HeLa細胞においてmiRNA-21-responsive Cas9 mRNAではmiR-21による翻訳抑制が起こるためCas9タンパク質の発現がほぼみられなくなることを示している。また、GAPDHをローディングコントロールとして用いた。
図4の(b)、(c)に示すT7E1より得られたPCR産物の配列を読んだ。図11(a)はスキームズであり、標的配列周辺の配列を示している。図11(b)は、EGFP遺伝子の標的領域に変異が入っていることを示している。つまり、EGFPの蛍光強度の減少はCRISPR/Cas9 systemによるEGFP遺伝子のノックアウトであることを示している。
図中にある「Δ」は塩基の欠失を「+」は塩基の挿入を示している。また、一番右側にある数字は、 得られた配列のコロニー数/総コロニー数、を示している。
緑文字は「標的配列」、青文字(図11(a)のTGG、ACC)は「PAM (Protospacer Adjascent motif)」、紫文字(図11(b)のCCA)は「PAMに対して相補な配列」、赤字(Control Cas9 mRNA 2行目の、5’側から9、10塩基、12~18塩基の-、3行目の、5’側から19塩基から41塩基、4行目の、5’側から19塩基から35塩基、miR-302a-responsive Cas9 mRNA+miR-302inhibitor 2行目の5’側から20塩基、3行目の5’側から17塩基の右側の-)は「変異」を示している。また、図中の塩基または「-」表示の間の縦線は、青字、赤字などの字色の変わる境界を示している。
miR-21、miR-302aのそれぞれにより機能が制御されていることが知られている遺伝子の発現変動をqPCRにより検証した結果を図12(a)、図12(b)に示す。Control Cas9 mRNAとmiRNA-responsive Cas9 mRNAを細胞に導入した時の遺伝子発現レベルをそれぞれ比べると、その発現レベルの差はほぼ見られなかった。つまり、miRNA-responsive CRISPR/Cas9 systemが内在性のmiR-21, miR-302aの機能にほとんど影響を与えていないことを示している。
図13(a)はHeLa-EGFPの図13(b)はiPS-EGFPのトランスフェクション効率を示す。BFP mRNAとsgRNA(Cy5でラベリング)のそれぞれでトランスフェクション効率を測定してある。トランスフェクション効率は約90%以上であった。
図14(a)はEGFPを標的としたsgRNAの5’末端から「GG」を除いた時のCas9活性を示している。図4(a)では約30%であったCas9活性が70%近くまで上昇していることより、ガイド鎖を改変することによりCas9活性が改善しているのがわかる。しかしながら、インヒビターのネガティブコントロールでもCas9活性が30%近くある。図14(b)は図14(a)で見られたCas9活性のリークを減らすために、miR-302 responsive Cas9 mRNAを改変し、4x miR-302 responsive Cas9 mRNAにしてある。Cas9 mRNAを50 ng、sgRNAを300 ngにすることで、リークをさらに減らしつつ、高い活性を保っていることがわかった。
100 ngのCas9 mRNAと300 ngのsgRNAを用いた。EGFP activity assay (iPS-EGFPでsgRNAを改変: 1)の図14(a)で見られたCas9活性のリークをなくすため、miR-302 responsive Cas9 mRNAを改変し、4x miR-302 responsive Cas9 mRNA(miR-302に応答する配列を5’UTRに4個タンデムに挿入してある)にした時の結果である。図15(a)は細胞の写真、図15(b)はその時のヒストグラム、図15(c)は定量結果である。miRNAに応答する配列を増やすことで、Cas9活性のリークを抑えていることがわかった。
Claims (17)
- ヌクレアーゼをコードするmiRNA応答性mRNAを、細胞に導入する工程を含む、未分化細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記:
(i) miR-302a標的配列、および
(ii) 前記ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列
を含み、(i)の核酸配列が前記miRNA応答性mRNAの5'UTRに含まれる、方法。 - 前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質であり、
さらに、前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAを前記細胞に導入する工程を含む、請求項1に記載の方法。 - (i) miR-302a標的配列、および
(ii) ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列
を含む、miRNA応答性mRNAであって、(i)の核酸配列が前記miRNA応答性mRNAの5'UTRに含まれる、miRNA応答性mRNA。 - 前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質である、請求項3に記載のmiRNA応答性mRNA。
- 請求項4に記載のmiRNA応答性mRNAと、
前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAと
を含む、細胞特異的にヌクレアーゼを制御するためのキット。 - a)ヌクレアーゼをコードするトリガータンパク質応答性mRNAと、
b)前記トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAと
を、細胞に導入する工程を含む、細胞特異的にヌクレアーゼを制御する方法であって、
前記a)ヌクレアーゼをコードするタンパク質応答性mRNAが下記:
(ia) 前記タンパク質に特異的に結合する核酸配列と、
(iia) 前記ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列と
を含み
前記b)トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAが下記:
(ib) miRNAによって特異的に認識される核酸配列と、
(iib) 前記トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列を含む、方法。 - 前記トリガータンパク質が、L7Aeタンパク質もしくは前記(ia)の核酸配列との解離定数Kdが、0.1nM~1μMの範囲内にあるその変異体を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記miRNAによって特異的に認識される核酸配列が、miR-302a標的配列またはmiR-21標的配列のいずれかである、請求項6または7に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質であり、
さらに、前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAを前記細胞に導入する工程を含む、請求項6~8のいずれか1項に記載の方法。 - 未分化細胞特異的にヌクレアーゼを制御する、請求項9に記載の方法。
- 前記未分化細胞が、miR-302aを発現する細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記a)トリガータンパク質をコードするタンパク質応答性mRNAが、(ia) および(iia) が5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含み、
前記b)ヌクレアーゼをコードするmiRNA応答性mRNAが、(ib)および(iib)が5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含む、請求項6~11のいずれか1項に記載の方法。 - a)下記を含むヌクレアーゼをコードするトリガータンパク質応答性mRNA:
(ia) 前記タンパク質に特異的に結合する核酸配列、及び
(iia) 前記ヌクレアーゼのコード領域に対応する核酸配列と、
b)下記を含むトリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNA:
(ib) miRNAによって特異的に認識される核酸配列、及び
(iib) 前記トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列と
を含むヌクレアーゼ制御剤。 - 前記トリガータンパク質が、L7Aeタンパク質もしくは(ia)の核酸配列との解離定数Kdが、0.1nM~1μMの範囲内にあるその変異体を含む、請求項13に記載のヌクレアーゼ制御剤。
- 前記トリガータンパク質をコードするmiRNA応答性mRNAにおいて、前記miRNAによって特異的に認識される核酸配列が、miR-302a標的配列またはmiR-21標的配列のいずれかである、請求項13または14に記載のヌクレアーゼ制御剤。
- 前記トリガータンパク質応答性mRNAにおいて、前記ヌクレアーゼが、Cas9タンパク質である、請求項13~15のいずれか1項に記載のヌクレアーゼ制御剤。
- 請求項13~16のいずれか1項に記載のヌクレアーゼ制御剤と、
前記ヌクレアーゼの標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるsgRNAと
を含む、細胞特異的にヌクレアーゼを制御するためのキット。
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