WO2020241748A1 - 標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法 - Google Patents

標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法 Download PDF

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WO2020241748A1
WO2020241748A1 PCT/JP2020/021106 JP2020021106W WO2020241748A1 WO 2020241748 A1 WO2020241748 A1 WO 2020241748A1 JP 2020021106 W JP2020021106 W JP 2020021106W WO 2020241748 A1 WO2020241748 A1 WO 2020241748A1
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mirna
protein
acllla4
cells
mrna
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PCT/JP2020/021106
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English (en)
French (fr)
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博英 齊藤
萌 弘澤
Original Assignee
国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for cell-specifically controlling a protein that edits a target gene, and a kit that can be used for the method.
  • CRISPR / Cas9 System cleaves the target gene with a single guide RNA (sgRNA) that incorporates the nuclease Cas9 protein (Cas9) and 20 bases complementary to the target sequence.
  • sgRNA single guide RNA
  • Cas9 protein Cas9 protein
  • MicroRNA (hereinafter referred to as miRNA) has been attracting attention as an index for identifying cells (see, for example, Patent Document 1).
  • Methods for controlling nucleases such as Cas9 in a cell-specific manner have been devised using this miRNA (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1).
  • the present inventors have also attempted to edit the genome when the activity of the target miRNA is high by using an RNA-binding protein (see, for example, Non-Patent Document 2 and Patent Document 2).
  • the nuclease control method disclosed in Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 2 is a system in which the genome is not edited when the activity of the target miRNA is high. Such a system is also referred to as an OFF system in the present specification.
  • OFF system In order to edit the genome specifically to a target cell using the OFF system, it is necessary to search for a miRNA having a specific low activity in a specific target cell, which is complicated.
  • a leak of Cas9 expression was observed when Cas9 expression was desired to be suppressed. In order to increase the specificity, it is necessary to suppress this leak.
  • Non-Patent Document 3 it is unclear whether the method disclosed in Non-Patent Document 3 can actually activate an endogenous gene, that is, a gene on the genome of a target cell. Furthermore, this method requires the use of a viral vector, and there is concern about its safety in clinical use of cells.
  • the present inventors have found that the genome can be edited specifically for a target cell by controlling the expression of a protein that inactivates a protein that edits a target gene using the activity of miRNA as an index. It was discovered and the present invention was completed.
  • a method for controlling the editing of a target gene in a cell-specific manner comprises the step of introducing into a cell an sgRNA having a guide sequence specifically recognized by the target gene. It contains (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the second protein.
  • a method, wherein the miRNA is a miRNA that is specifically active in the cell.
  • the first protein is Cas9 protein or an analog thereof.
  • the method according to [1], wherein the second protein is AclllA4 or an analog thereof.
  • the first protein is dCas9-VPR protein or an analog thereof.
  • the method according to [1], wherein the second protein is AclllA4 or an analog thereof.
  • the method according to [1], wherein the (a), (b) and / or (c) are introduced into a cell in the form of a synthetic RNA molecule without using a DNA vector or a viral vector.
  • the miRNA-responsive mRNA which comprises an sgRNA having a guide sequence specifically recognized by the target gene, is described below: It contains (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the second protein.
  • a kit in which the miRNA is a miRNA that is specifically active in the cell.
  • the first protein is Cas9 protein or an analog thereof.
  • the kit according to [7], wherein the second protein is AclllA4 or an analog thereof.
  • the first protein is dCas9-VPR protein or an analog thereof.
  • a miRNA-responsive mRNA switch such as miR-AclllA4, i.e. a target expressed in a particular cell type by using an mRNA molecule that expresses a particular protein in response to miRNA.
  • the present invention can realize a system in which the genome is edited when the activity of the target miRNA is high, that is, an ON system.
  • miRNA-responsive mRNA such as miR-AclllA4 switch can control the expression of a protein that inactivates a protein that edits a gene, and for the following reasons, for designing the genome of a target cell. It can be a useful tool.
  • the ON system can easily and selectively activate proteins (nucleases and the like) that edit genes in target cells.
  • miRNA-responsive mRNA switches undergo cell-specific genome editing, tissue-specific genome editing, that is, loss of function due to genome knockout or acquisition of function by CRISPRa. to enable.
  • a miRNA-responsive mRNA switch such as the miR-AclllA4 switch, can be performed by an RNA delivery method. This avoids genomic integration and off-target effects of concern in DNA delivery methods.
  • miRNA-responsive mRNA switches such as the miR-AclllA4 switch, can minimize genome editing in non-target cells. This is important in clinical applications, for example, in cancer treatment, it is possible to avoid genome editing in normal cells and reduce side effects.
  • miRNA-responsive mRNA switches such as the miR-AclllA4 switch respond not only to endogenous miRNAs but also to synthetic oligonucleotides such as miR-mimics, they are also used for inducible or transient genome editing. be able to.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing a scheme of a miRNA-responsive CRISPR-Cas9 ON switch.
  • AclllA4 is a key player that inhibits the activity of Cas9, and the expression of AclllA4 is regulated by the endogenous miRNA by inserting the target site of miRNA into the 5'-UTR of AclllA4 mRNA. That is, when the activity of the target miRNA is high, the expression of AclllA4 is suppressed, so that Cas9 edits the gene and dCas9-VPR activates the gene.
  • FIG. 2A is a photograph of typical cells when the inhibition of Cas9 activity by AclllA4 was evaluated by knockout of the EGFP gene.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing a scheme of a miRNA-responsive CRISPR-Cas9 ON switch.
  • AclllA4 is a key player that inhibits the activity of Cas9, and the expression of AclllA4 is regulated by
  • FIG. 2B is a representative histogram when the inhibition of Cas9 activity by AclllA4 is evaluated by knockout of the EGFP gene.
  • FIG. 2C is a bar graph of the results of three experiments in which the inhibition of Cas9 activity by AclllA4 was evaluated by knockout of the EGFP gene. The results are shown in mean ⁇ SD.
  • FIG. 3A is a conceptual diagram of a miRNA-responsive CRISPR-Cas9 ON system that senses miRNA with a miR-AclllA4 switch and controls genome editing. Cas9 mRNA, sgRNA, and miRNA-responsive AcrllA4 switch are introduced into cells.
  • FIG. 3B is a photograph of typical cells when the activity of Cas9 is evaluated by knockout of the EGFP gene.
  • FIG. 3C is a representative histogram when the activity of Cas9 is evaluated by knockout of the EGFP gene.
  • FIG. 3D shows a bar graph of the results of three experiments in which Cas9 activity was evaluated by knockout of the EGFP gene.
  • FIG. 4A is a conceptual diagram of a miRNA-responsive CRISPRa ON system in which the miR-AclllA4 switch controls CRISPRa via endogenous miRNA.
  • dCas9-VPR plasmid (a), sgRNA plasmid (c), and miR-AclllA4 plasmid (b) are introduced into HeLa cells in which TRE-P miniCMV- hmAG1 is genome- encapsulated .
  • AclllA4 inhibits DNA binding of the dCas9-VPR-sgRNA complex and suppresses HMAG1 expression.
  • FIG. 4B is a photograph of typical cells when the activity of dCas9-VPR was evaluated by hmAG1 expression.
  • FIG. 4C is a typical dot plot when the activity of dCas9-VPR is evaluated by hmAG1 expression.
  • FIG. 4D shows a bar graph of the results of three experiments in which the activity of dCas9-VPR was evaluated by hmAG1 expression.
  • FIG. 5 shows Cas9 mRNA and 5 ng miRNA-responsive AclllA4 mRNA introduced into iPS-EGFP cells, which are iPS cells in which the EGFP gene is integrated into the genome, senses miRNA, controls genome editing, and activates Cas9. The results of the experiment in which the EGFP gene was knocked out are shown.
  • FIG. 5A is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment using miRNA-responsive AclllA4 mRNA (the left panel did not add AclllA4, and the right panel did not add sgRNA EGFP recognized as a target gene). is there.
  • FIG. 5A is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment using miRNA-responsive AclllA4 mRNA (the left panel did not add AclllA4, and the right panel did not add sgRNA EGFP recognized as a target gene). is there.
  • FIG. 5A is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment
  • 5B is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment using miRNA-responsive AclllA4 mRNA (left panel added AclllA4, middle panel added inactivated AclllA4 mutant, right panel untreated). Is.
  • miRNA was sensed using miR-302a-responsive AclllA4 mRNA using one sequence specifically recognized by miR-302a at the target site, and Cas9 activity was evaluated by knockout of the EGFP gene. It is a photograph which shows the result of an experiment.
  • FIG. 5C miRNA was sensed using miR-302a-responsive AclllA4 mRNA using one sequence specifically recognized by miR-302a at the target site, and Cas9 activity was evaluated by knockout of the EGFP gene.
  • FIG. 5D miRNA is sensed using 4 ⁇ miR-302a-responsive AclllA4 mRNA using four sequences specifically recognized by miR-302a at the target site, and Cas9 activity is detected by knockout of the EGFP gene. It is a photograph showing the result of the evaluated experiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing the experimental results shown in FIG. 5 by a dot plot.
  • FIG. 7 is a graph showing the proportion (%) of the EGFP-negative cell population in the cells subjected to each operation as a result of the experiment shown in FIG.
  • FIG. 8A-D show Cas9 mRNA and 10 ng miRNA-responsive AcrllA4 mRNA introduced into iPS-EGFP cells, which are iPS cells incorporating the EGFP gene on the genome, sensing miRNA and controlling genome editing. The results of an experiment in which the activity of Cas9 was evaluated by knocking out the mRNA gene are shown.
  • FIG. 8A is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment using miRNA-responsive AclllA4 mRNA (the left panel did not add AclllA4, and the right panel did not add sgRNA EGFP recognized as a target gene). is there.
  • FIG. 8A is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment using miRNA-responsive AclllA4 mRNA (the left panel did not add AclllA4, and the right panel did not add sgRNA EGFP recognized as a target gene). is there.
  • FIG. 8A is a photograph of cells obtained as a result of a
  • FIG. 8B is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment using miRNA-responsive AclllA4 mRNA (left panel added AclllA4, middle panel added inactivated AclllA4 mutant, right panel untreated). Is.
  • FIG. 8C miRNA was sensed using miR-302a-responsive AclllA4 mRNA using one sequence specifically recognized by miR-302a at the target site, and Cas9 activity was evaluated by knockout of the EGFP gene. It is a photograph which shows the result of an experiment.
  • FIG. 8C miRNA was sensed using miR-302a-responsive AclllA4 mRNA using one sequence specifically recognized by miR-302a at the target site, and Cas9 activity was evaluated by knockout of the EGFP gene.
  • FIG. 8D miRNA is sensed using 4 ⁇ miR-302a-responsive AclllA4 mRNA using four sequences specifically recognized by miR-302a at the target site, and Cas9 activity is detected by knockout of the EGFP gene. It is a photograph showing the result of the evaluated experiment.
  • FIG. 9 is a diagram showing the experimental results shown in FIG. 8 by a dot plot.
  • FIG. 10 is a graph showing the proportion (%) of the EGFP-negative cell population in the cells subjected to each operation as a result of the experiment shown in FIG.
  • FIG. 11 shows a schematic diagram of the construct.
  • FIG. 12 shows a structural conceptual diagram of miRNA-responsive mRNA having a miRNA target site in 5'-UTR and encoding Anti-CRISPR that functions as the second protein of the present invention.
  • B is a conceptual diagram showing an example of a miRNA target sequence of miRNA-responsive mRNA, and shows that a miRNA target site can be incorporated in 1 repeat or 4 repeats.
  • C shows a conceptual diagram of the second protein of miRNA-responsive mRNA, the upper figure shows the sequence encoding the wild-type AclllA4 protein, and the lower figure shows the N-terminal fused with M9, which is a nuclear localization signal. The sequence encoding M9_AclllA4 is conceptually shown.
  • FIG. 12 represents a representative Western blot image 24 hours after transfection of AclllA4_3xFlag mRNA and miR-21 responsive AclllA4_3xFlag mRNA.
  • the present invention is a method for controlling the editing of a target gene in a cell-specific manner.
  • A mRNA encoding the first protein that edits the target gene
  • B A miRNA-responsive mRNA encoding a second protein that inactivates the first protein
  • C The miRNA-responsive mRNA comprises the step of introducing into a cell an sgRNA having a guide sequence specifically recognized by the target gene. It contains (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the second protein. It relates to a method in which the miRNA is a miRNA that is specifically active in the cell.
  • the "cell” in the present invention is not particularly limited and may be any cell.
  • it may be a cell collected from a multicellular organism species, or it may be a cell obtained by culturing an isolated cell.
  • the cells are, in particular, cells collected from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs, rats, etc.), cells isolated from mammals, or cells obtained by culturing a mammalian cell line. is there.
  • somatic cells examples include keratinizing epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells on the surface of the tongue), exocrine gland epithelial cells (eg, mammary cells), hormone-secreting cells (eg, mammary cells).
  • keratinizing epithelial cells eg, keratinized epidermal cells
  • mucosal epithelial cells eg, epithelial cells on the surface of the tongue
  • exocrine gland epithelial cells eg, mammary cells
  • hormone-secreting cells eg, mammary cells
  • Adrenal medulla cells Adrenal medulla cells
  • cells for metabolism and storage eg, hepatocytes
  • lumen epithelial cells that make up the interface eg, type I alveolar cells
  • lumen epithelial cells of the inner chain canal eg, blood vessels
  • Endophilic cells cell with ciliary capacity (eg, airway epithelial cells)
  • cells for extracellular matrix secretion eg, fibroblasts
  • contractile cells eg, smooth muscle cells
  • blood and immune system Cells eg, T lymphocytes
  • sensory cells eg, rod cells
  • autonomic nervous system neurons eg, cholinergic neurons
  • sensory and peripheral neuronal support cells eg, companion cells
  • central nervous system Nerve cells and glial cells eg, stellate glial cells
  • pigment cells eg, retinal pigment epithelial cells
  • their precursor cells tissue precursor cells
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the cell in the present invention may be a cell that has been artificially manipulated after collecting the early somatic cells.
  • the pluripotent stem cell that can be used in the present invention is a stem cell that has pluripotency capable of differentiating into all cells existing in a living body and also has proliferative ability.
  • pluripotent stem cells are not limited to the following, but are limited to: embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation, and sperm stem cells (“GS cells”). ”), Embryonic stem cells (“EG cells”), induced pluripotent stem (iPS) cells and the like.
  • ES embryonic stem
  • ntES embryonic stem
  • GS cells sperm stem cells
  • EG cells Embryonic stem cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • Preferred pluripotent stem cells are ES cells, ntES cells, and iPS cells. More preferred pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells, particularly preferably human ES cells and human iPS cells.
  • the cells that can be used in the present invention are not only pluripotent stem cells, but also cell groups induced by so-called "direct reprogramming" in which differentiation is directly induced into desired cells without passing through pluripotent stem cells.
  • the cells in the present invention may be a cell group in which gene editing is desired, such as a cell group in which cancer cells and normal cells can be contained, and a cell group in which gene editing is not desired. ..
  • the cells in the present invention are particularly preferably in a viable state.
  • a cell in a viable state means a cell in a state in which the metabolic ability is maintained.
  • the cells remain alive, particularly maintaining their ability to divide, without losing their innate properties. , Can be cells that can be used for subsequent uses.
  • the "target gene” in the present invention is a gene on the genome of a specific target cell.
  • the type of gene is not particularly limited, and any desired gene can be used as a target gene by designing an sgRNA described later.
  • editing of a target gene means acting on the target gene to change the function of the gene, for example, including reducing, losing, acquiring, or enhancing the function of the gene. Is done. More specifically, “editing” means cleaving genes, activating and suppressing gene expression, base editing, labeling (genome labeling), DNA methylation / demethylation and histone acetylation. It shall include performing epigenome editing such as.
  • regulating means a state in which the translation of miRNA-responsive mRNA encoding the second protein is suppressed, whereby the first protein that edits the target gene does not function ( It means to change from the OFF state) to the functionable state (ON state).
  • cell-specific regulation means controlling the editing of a target gene in a specific cell by using miRNA having a specifically high activity as an index. Editing control using miRNA as an index can be performed using the miRNA-responsive mRNA described in (b) above.
  • miRNA-responsive mRNA described in (b) above.
  • the mRNA of (a) is an mRNA that encodes a first protein that edits a target gene and is translated intracellularly to express the first protein.
  • the first protein that edits the target gene is generally a protein having an enzymatic activity capable of editing the target gene.
  • the first protein includes, but is not limited to, a nuclease capable of cleaving the target gene and an inactivated nuclease capable of activating the target gene.
  • the nuclease includes, but is not limited to, Crusted Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Associated Proteins 9 (Cas9) transcriptional activator-like effector nuclease (TALEN), homing endonuclease, and zinc finger nuclease.
  • Cas9 protein analogs include Cas9 family proteins, and specific Cas9 family proteins include Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9), and Francisel.
  • CjCas9 Neisseria meningitidis Cas9 (NmCas9 or NmeCas9), Geobacillus thermophilus Cas9 (GeoCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (NmCas9), Streptococcus thermophilus 9 (NmCas9), CRISPR1-Cas Fusion proteins in which Cas9 proteins, analogs or derivatives are fused with other proteins are also included in the nuclease.
  • inactivating nuclease examples include an inactivating nuclease fused to a transcriptional activator, which are inactivated Cas9 (dCas9) nucleases fused to the transcriptional activator VP64, dCas9-VP64, dCas9-.
  • VPR, dCas9-SunTag, dCas9-VP16, dCas9-VP160, dCas9-P300 can be used, but are not limited thereto.
  • a SAM system using an MS2-P65-HSF1 fusion protein and an sgRNA having an MS2-binding sequence in the guide strand (c) and a Tree system using VPR together with dCas9-SunTag are also used.
  • the proteins used in these systems can be encoded by mRNA other than the mRNA encoding the first protein, or can be encoded on the mRNA encoding the first protein.
  • analogs and derivatives having the same functions as these inactivated nucleases can also be used.
  • the mRNA of (a) is preferably a Cap structure (7 methylguanosine 5'phosphate) or an Ampi-Reverse Cap Analog (ARCA) manufactured by Ambion in the direction from the 5'end to the 5'to 3'. It has a 5'-UTR containing an analog, a start codon, an open reading frame encoding the first protein, and a 3'-UTR containing a poly A tail. The design of the 5'-UTR and 3'-UTR may be arbitrary.
  • the mRNA of (a) does not contain a nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA in any of the 5'-UTR, open reading frame, and 3'-UTR. As a result, the mRNA encoding the first protein of (a) can be introduced into the cell, translated without being affected by miRNA activity, and the first protein can be expressed.
  • the miRNA-responsive mRNA of (b) is an mRNA that encodes a second protein and is capable of expressing the second protein intracellularly under translation control by miRNA.
  • the second protein is a protein that can inactivate the first protein.
  • the second protein can be determined in relation to the first protein described for mRNA in (a).
  • the second protein may be a fusion of proteins that inactivates the first protein.
  • anti-CRISPR capable of inactivating these nucleases is used as the second protein.
  • anti-CRISPR capable of inactivating Cas9 (spCas9) of Streptococcus pyogenes includes AclllA2, AclllA4, AclllA5, AclllA7, AclllA8, AclllA9, and Acl.
  • the second protein may be an analog of anti-CRISPR that has the same function as the exemplified anti-CRISPR, i.e., can inactivate the nuclease.
  • Examples of the anti-CRISPR that inactivates NmCas9 which is a Cas9 family protein exemplified above, include AclllC1, AclllC2, AclllC3, AclllC4, and AclllA5.
  • Examples of anti-CRISPR that inactivates CjCas9 include AclllC1, AclllC2, AclllC3, AclllC4, and AclllA5.
  • Examples of the anti-CRISPR that inactivates GeoCas9 include AclllC1
  • examples of the anti-CRISPR that inactivates St1Cas9 include AclllA5 and AclllA6
  • examples of the anti-CRISPR that inactivates SaCas9 include AcllC1. Can be mentioned.
  • the second protein may be a protein fusion containing anti-CRISPR or an analog thereof, for example, a fusion protein in which a nuclear localization signal M9 is fused to the N-terminal side of anti-CRISPR such as AclllA4. May be good.
  • a fusion protein in which AclllA4 is fused with the nuclear localization signal M9 can enhance cleavage or activation in the target gene edited by the first protein.
  • Preferred combinations of the first protein and the second protein include, but are not limited to, AsCas12a and AcrVA1, LbCas12a and AcrVA4 or AcrVA5 (AcrVA1), NmeCas9 and AcrllC1 or AclllC3.
  • the miRNA-responsive mRNA is a messenger RNA whose translation of the encoded protein is controlled in response to the activity of the miRNA, and is also referred to herein as a miRNA switch.
  • the general structure of miRNA-responsive mRNA is detailed in Patent Document 1 (WO2015 / 105172), which is made part of this specification by reference.
  • the miRNA-responsive mRNA of (b) used in the present invention contains (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the second protein, and (i) miRNA.
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by (ii) and the nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the second protein are functionally linked.
  • a miRNA having a specific activity specifically in a specific cell can be appropriately selected for the purpose of editing a specific target gene by the first protein in a specific cell.
  • the miRNA of (i) may be referred to as the "target sequence" of the miRNA, and such miRNA may be referred to as the target miRNA.
  • a miRNA that is specifically active in a particular cell is a miRNA that is expressed more in that cell than in other cells. "Expression" of a miRNA means that there is a miRNA in a state in which the mature miRNA interacts with a plurality of predetermined proteins to form RNA-induced silencing complex (RISC).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • a “mature miRNA” is a single-stranded RNA (20-25 bases) that results from pre-miRNA by cleavage by a Dicer outside the nucleus, and "pre-miRNA” by partial cleavage by a nuclear enzyme called Drosha. It results from tri-mRNA, a single-stranded RNA transcribed from DNA.
  • the miRNA in the present invention is appropriately selected from at least 10,000 types of miRNA. Specifically, miRNA registered in the information of the database (for example, http: //www.mirbase.org/ or http: //www.microrna.org/), and / or the literature information described in the database. Is appropriately selected from the miRNAs described in.
  • the miRNA of (i) is not limited to the miRNA composed of a specific sequence.
  • Such miRNA of (i) is not limited to the miRNA specified at the time of the present application, and includes any miRNA whose existence and function are specified in the future.
  • MiRNAs that are highly expressed in specific cells are 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80, as compared with the expression in other cells. Examples of miRNAs are highly expressed at a rate of% or more, 90% or more, or more. MiRNAs that are highly expressed in such specific cells can also be appropriately selected based on the information in the above database.
  • the target sequence of miRNA is preferably, for example, a sequence completely complementary to the miRNA.
  • it may have a mismatch with a completely complementary sequence as long as it can be recognized in the miRNA.
  • the discrepancy from a sequence that is completely complementary to the miRNA may be a discrepancy that can be normally recognized by the miRNA in a desired cell, and the discrepancy in the original function of the cell in vivo is about 40 to 50%. There may be.
  • discrepancies are not particularly limited, but are 1 base, 2 bases, 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, or 10 bases, or 1% of the entire recognition sequence, 5 %, 10%, 20%, 30%, or 40% discrepancies are exemplified.
  • 5'in the target sequence corresponding to a portion other than the seed region that is, about 16 bases on the 3'side of the miRNA.
  • the side region may contain a large number of discrepancies, and the seed region portion may contain no discrepancies or may contain 1 base, 2 bases, or 3 bases of discrepancies.
  • Such a sequence may have a base length including the number of bases to which RISC specifically binds, and the length is not particularly limited, but a sequence of 18 bases or more and less than 24 bases is preferable, and 20 is more preferable. It is a sequence of more than a base and less than 22 bases.
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA has the target sequence, and a miRNA-responsive mRNA encoding a marker protein such as a visible fluorescent protein is introduced into a desired cell and other cells. However, by confirming that the expression of the corresponding marker protein is suppressed only in the desired cells, it can be appropriately determined and used.
  • the functional linkage between the nucleic acid sequence (i) specifically recognized by miRNA and the nucleic acid sequence (ii) corresponding to the coding region of the second protein is an open reading encoding the second protein. It means that the target sequence of at least one miRNA is provided in the 5'-UTR of the frame (including the start codon), and / or in the open reading frame.
  • the miRNA-responsive mRNA is preferably an open reading encoding a cap structure (7 methylguanosine 5'phosphate) or a Cap analog such as ARCA, a second protein, from the 5'end to the 5'to 3'direction.
  • the Cap analog comprises a frame as well as a poly A tail and at least one miRNA target sequence within a 5'-UTR, within a 3'-UTR, and / or within an open reading frame.
  • the Cap analog is also included.
  • the location of the miRNA target sequence in the mRNA may be in the untranslated region and may be 5'-UTR or 3'-UTR.
  • the position of the target sequence of miRNA may be within the open reading frame (3'side of the start codon).
  • the untranslated region and all within the open reading frame may include miRNA target sequences.
  • the number of miRNA target sequences may be one or plural, eg, 2, 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8 or more. There may be.
  • FIG. 11 is a diagram conceptually showing a design example of the miRNA-responsive mRNA of (b).
  • FIG. 11 (A) conceptually shows an example of the overall structure of miRNA-responsive mRNA.
  • miRNA target site shows the nucleic acid sequence of (i) above
  • Anti-CRISPR shows the nucleic acid sequence of (ii).
  • the white circle on the left side represents the Cap structure at the 5'end
  • the Poly (A) on the right side represents the polyA tail at the 3'end.
  • the binding mode of the nucleic acid sequence of (i) in FIG. 11 and the nucleic acid sequence of (ii) is an example, and does not limit the present invention.
  • FIG. 11 (A) conceptually shows an example of the overall structure of miRNA-responsive mRNA.
  • miRNA target site shows the nucleic acid sequence of (i) above
  • Anti-CRISPR shows the nucleic acid sequence of (ii).
  • the white circle on the left side represents the Cap structure at the 5'
  • FIG. 11B shows the nucleic acid sequence of (i) above, the upper figure shows the nucleic acid sequence of (i) having one repeat of the miRNA target sequence, and the lower figure shows the nucleic acid sequence of (i) having four repeats of the miRNA target sequence.
  • FIG. 11C is a conceptual diagram showing an example of the nucleic acid sequence of (ii). The upper figure shows the case where the second protein is AclllA4, and the lower figure shows the fusion protein of the nuclear localization signals M9 and AclllA4. It is a conceptual diagram in the case of.
  • the nucleic acid sequences of (i) and (ii) are linked in this order in the direction of 5'to 3'.
  • the number of bases and the type of bases between the Cap structure and the target sequence of miRNA may be arbitrary as long as they do not constitute a stem structure or a three-dimensional structure.
  • the number of bases between the Cap structure and the miRNA target sequence can be designed to be 0 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
  • the number of bases and the type of base between the miRNA target sequence and the start codon do not affect the interaction between the miRNA and the miRNA-responsive mRNA, such as inhibiting the binding.
  • the number of bases between the miRNA target sequence and the start codon can be designed to be 0 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
  • AUG serving as a start codon does not exist in the miRNA target sequence of (i).
  • the target sequence of miRNA exists in 5'-UTR and the target sequence contains AUG, it is designed to be in-frame in relation to the marker gene linked to the 3'side. It is preferable to be done.
  • AUG is contained in the target sequence, it is also possible to convert AUG in the target sequence into GUG and use it.
  • the location of the target sequence in the 5'-UTR can be appropriately changed in order to minimize the influence of AUG in the target sequence.
  • the number of bases between the Cap structure and the AUG sequence in the target sequence is 0 to 60 bases, for example, 0 to 15 bases, 10 to 20 bases, 20 to 30 bases, 30 to 40 bases, 40 to 50 bases.
  • 50-60 bases can be designed.
  • the number of bases of 5'-UTR and 3'-UTR of the miRNA-responsive mRNA of (b) is approximately the same as the number of bases of 5'-UTR and 3'-UTR of the mRNA of (a), respectively. Can be designed to be.
  • the miRNA-responsive mRNA of (b) preferably contains a modified base such as pseudouridine or 5-methylcytidine instead of normal uridine or cytidine. This is to reduce cytotoxicity.
  • the positions of the modified bases can be independently all or part of both uridine and cytidine, and if they are a part, they can be random positions at any ratio.
  • the miRNA-responsive mRNA of (b) is introduced into the cell, and the translation of the second protein is regulated in response to the miRNA.
  • the introduced cells when the activity of a specific miRNA that specifically binds to the above target sequence is high, the translation of the second protein is suppressed.
  • the activity of the specific miRNA that specifically binds to the target sequence is low in the introduced cells, the second protein is translated and the second protein is expressed in the cells.
  • the sgRNA of (c) is an RNA having a guide sequence specifically recognized by the target gene edited by the first protein.
  • the sgRNA (c) can be designed to incorporate a base sequence of about 20, for example, about 18 to 22, which specifically recognizes the target gene, in the vicinity of the 5'end.
  • the base sequence that specifically recognizes the target gene is preferably a sequence that is completely complementary to the target gene. Alternatively, it may have a mismatch with a completely complementary sequence as long as it can be recognized in the target gene.
  • Mismatches from sequences that are completely complementary to the target gene may be similar to those defined for miRNAs and their target sequences in the design of miRNA-responsive mRNAs in (b). Further, there may be a sequence of about 1 to 5 bases on the 5'side of the base sequence that specifically recognizes the gene targeted for editing by this first protein, or even if there is a sequence of about 80 bases. Good. By providing such a sequence, it may be possible to bind to the target sequence and control the editing of the genome. Furthermore, the sequence after the 3'side of the base sequence that specifically recognizes the target gene may be a sequence of sgRNA known to function as an sgRNA of a gene editing system such as CRISPR / Cas9 System, and is a Terra.
  • modified loop, system loop2, 3'ends and chemical modifications to RNA constituting sgRNA.
  • the sgRNA tetraloop and / or stemloop can also be added with a binding sequence to the relevant protein.
  • the sequence is not limited to a specific sequence as long as it is a sequence that forms a complex with the first protein and enables editing, for example, cleavage or activation of the target gene at the target site.
  • the sgRNA of (c) forms a complex with the first protein and edits the target gene, for example, the target gene is cleaved at a desired site, or the target gene is used. Can activate the desired site of.
  • the mRNA of (a), miRNA-responsive mRNA of (b), and sgRNA of (c) are designed and sequenced according to the above, and can be synthesized by those skilled in the art by any method known genetically engineered. Can be done. In particular, it can be obtained by an in vitro transcription synthesis method using a template DNA containing a promoter sequence as a template, but the synthesis method is not particularly limited.
  • RNA molecules in the form of synthetic RNA molecules
  • introduction into cells in the form of synthetic RNA molecules can be mentioned. Be done. For example, it may be introduced into a body cell by a method such as lipofection or microinjection.
  • the RNAs (a), (b) and (c) can be introduced in the form of DNA such as a viral vector, a plasmid vector, an episomal vector, etc., and the same introduction method as above is used. be able to. It is preferable to introduce the three types of RNA (a), (b) and (c) by the same method.
  • the miRNA-responsive mRNA of (b) to be introduced into cells may be 1 type, 2 types, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, or 8 types. It may be more than one kind.
  • miRNA-responsive mRNA for example, mRNA having a different sequence of the miRNA target site in (i) and responding to different miRNA can be used.
  • the activity of the second protein is controlled with respect to a plurality of types of cells that can be included in the cell group into which the miRNA-responsive mRNA is introduced. Will be possible.
  • RNAs of (a), (b) and (c) When introducing the RNAs of (a), (b) and (c) into cells, it is preferable to co-introduce the mRNAs of (a) and (b) into the cell group. This is because the intracellular proportions of the two or more co-introduced mRNAs are maintained in individual cells, and the activity ratio of the proteins expressed from these mRNAs is constant in the cell population.
  • the amount to be introduced at this time varies depending on the cell group to be introduced, the mRNA to be introduced, the method of introduction and the type of the reagent to be introduced, and those skilled in the art will appropriately obtain the desired translation amount of the first protein and the second protein. These can be selected.
  • the sgRNA of (c) is preferably co-introduced with the mRNAs of (a) and (b), but it is not always necessary to co-introduce it, but it can be introduced independently at an appropriate timing.
  • the present invention includes a step of introducing an mRNA encoding the Cas9 protein of (a), a miRNA-responsive mRNA encoding AcrllA4 of (b), and an sgRNA of (c) into cells. ..
  • the mRNA encoding the Cas9 protein of (a) is also referred to as Cas9 mRNA
  • the miRNA-responsive mRNA encoding AclllA4 of (b) is also referred to as miRNA-reponsive AclllA4 mRNA.
  • FIG. 1 schematically shows the intracellular action when the Cas9 mRNA of (a), the miRNA-reponsive AclllA4 mRNA of (b), and the sgRNA of (c) are introduced into cells (from the bottom). 2nd panel left side, lower left panel).
  • the activity of miRNA recognized in the target sequence of miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is high, the translation of AclllA4 protein from miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is suppressed, or the translation of AclllA4 protein from miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is suppressed, or miRNA-responsive AcllA4 mRNA is generated. Not expressed.
  • Cas9 mRNA expresses Cas9 protein regardless of miRNA activity. Since the Cas9 protein is not inactivated by the AclllA4 protein, the sgRNA and the Cas9 protein form a complex, and genome editing, specifically, cleavage of the target gene is performed.
  • the AclllA4 protein from the miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is translated and the AclllA4 protein is expressed.
  • the AclllA4 protein inactivates the Cas9 protein expressed from Cas9 mRNA.
  • the present invention is a step of introducing into a cell an mRNA encoding the dCas9-VPR protein of (a), a miRNA-responsive mRNA encoding AcrllA4 of (b), and sgRNA of (c). including.
  • the mRNA (a) encoding the dCas9-VPR protein is also referred to as dCas9-VPR mRNA (a).
  • FIG. 1 schematically shows the intracellular action when dCas9-VPR mRNA, miRNA-reponsive AclllA4 mRNA, and sgRNA are introduced into cells (the right and lower right panels in the second row from the bottom). ).
  • the activity of miRNA recognized in the target sequence of miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is high, the translation of AclllA4 protein from miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is suppressed, or the translation of AclllA4 protein from miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is suppressed, or miRNA-reponsive AcllA4 mRNA is generated. Not expressed.
  • dCas9-VPR mRNA expresses the dCas9-VPR protein regardless of miRNA activity. Since the dCas9-VPR protein is not inactivated by the AclllA4 protein, the sgRNA and the dCas9-VPR protein form a complex, and genome editing, specifically activation of the target gene, is performed.
  • the AclllA4 protein When the activity of miRNA recognized in the target sequence of miRNA-reponsive AclllA4 mRNA is low, the AclllA4 protein is translated from the miRNA-reponsive AclllA4 mRNA and the AclllA4 protein is expressed. The AclllA4 protein inactivates the Cas9 protein expressed from dCas9-VPR mRNA.
  • the method according to the present invention it is possible to control the activity of a protein that enables editing of a target gene in a cell-specific manner using the activity of miRNA as an index. Therefore, it has become possible to construct an ON system that executes editing of a target gene in response to miRNA having high activity in a specific cell.
  • the activity of Cas9 mRNA was evaluated with and without transfection of AclllA4 mRNA. The results are shown in FIGS. 2A, 2B, and 2C. In the absence of AcrllA4 mRNA, approximately 70% of cells were EGFP negative, indicating that Cas9 mRNA and sgRNA EGFP efficiently edited the EGFP gene. On the other hand, when AcrllA4 mRNA was added, the number of EGFP-negative cells decreased. This result shows that AclllA4 mRNA (10-50 ng) efficiently suppressed Cas9 activity to the same extent as untargeted and untreated cells. Defective AclllA4 mutant (E70R) without Cas9 binding activity (Dong D, et al.
  • miRNA-AclllA4 switch 5'of miRNA-responsive AclllA4 mRNA also referred to as miR-AclllA4 switch, FIG. 3A
  • miRNA target site miRNA antisense sequence
  • the AclllA4 mRNA does not express AclllA4 and forms a Cas9-sgRNA-dsDNA complex to promote genome editing (Fig. 3A, right panel).
  • a MiRNA-driven Cas9-ON system was obtained.
  • the miR-21 inhibitor reduced the size of the EGFP-negative cell population to the same extent as cells not treated with Cas9 (Cas9-OFF). Negative controls that do not interfere with miRNA (inhibitor NC) had no effect on the EGFP-negative cell population (Cas9-ON). From these results, it was shown that the T21_AclllA4 switch regulates Cas9 activity by the endogenous miR-21, and the background level of Cas9 activity in the OFF state in the presence of miR-21 inhibitor was clarified. That is, in the OFF state, Cas9 activity was efficiently suppressed, and Cas9 was activated by detecting the target miRNA.
  • the EGFP-negative cell population when transfected with 4xT21_AclllA4 mRNA was 15.6%
  • the EGFP-negative cell population when transfected with T21_AclllA4 mRNA was 15.9%, which were about the same. It was a numerical value. This indicates that the sensitivity to the target miRNA was improved while avoiding the off-target effect on non-target cells.
  • miR-302a-5p miR-302a-5p
  • miR-302a is known as a marker for human pluripotent stem cells (hPSCs). Since the activity of miR-302a is low in HeLa cells, Cas9 activation was induced using miR-302a mimic. Cas9 mRNA, sgRNA EGFP , and T302a-AclllA4 mRNA were cotransfected with miR-302a mimic or miR-302a negative control (mimic NC). As expected, the EGFP-negative cell population increased in the presence of miR-302a mimic, but miR-302a mimic N. et al.
  • the expression level of the hmAG1 gene triggered by miR-21 could be optimized (FIG. 4B, 4C, 4D, T21-M9_AclllA4 (SEQ ID NO: 55). Furthermore, it was experimentally confirmed that the same result could be obtained by changing the switch to a switch targeting miR-302a, and the generality of this strategy was confirmed (details are not shown). ). From these results, it is considered that the optimum ON / OFF state of the CRISPR-Cas9 ON system using miRNA as an input signal can be achieved by changing the expression level of AclllA4.
  • iPS-EGFP cells which are iPS cells in which the EGFP gene was integrated into the genome.
  • the activity of Cas9 was evaluated by knockout of.
  • iPS-EGFP cells were seeded on a 24-well plate at 5x10 4 cells / well 17-24 hours prior to transfection.
  • StemFect RNA Transfection Reagent was used according to the protocol to transfect iPS-EGFP cells with AclllA4-mRNA (5 ng), Cas9-encoding mRNA (Cas9 mRNA), and sgRNA EGFP targeting the EGFP gene.
  • FIG. 5A is a photograph of cells obtained as a result of a control experiment using miRNA-responsive AclllA4 mRNA. The left panel shows the result without the addition of AclllA4, and the right panel shows the result without the addition of sgRNA EGFP recognized by the target gene.
  • FIG. 5B is also a photograph of the cells obtained as a result of the control experiment, and the left panel is the result of adding AclllA4, the middle panel is the result of adding the inactivated AclllA4 mutant, and the right panel is untreated).
  • FIG. 6 shows the dot plot results
  • FIG. 7 shows the percentage (%) of the EGFP-negative cell population in the cells subjected to each operation. The results of FIGS. 5A and 5A and 6 and 7 showed a tendency substantially similar to the results obtained by FIG.
  • T302a-AclllA4 switch or a 4xT302a-AclllA4 switch (both 5 ng) having 1 repeat or 4 repeats with the complementary sequence of miR-302a as the target sequence was used.
  • Cell seeding and transfection were performed in the same manner as transfection of AcrllA4 mRNA into iPS-EGFP cells.
  • FIG. 5C is a photograph of the cells obtained as a result of transfection with the T302a-AclllA4 switch
  • FIG. 5D is a photograph of the cells obtained as a result of transfection with the 4xT302a-AclllA4 switch
  • FIG. 6 shows the dot plot results
  • FIG. 7 shows the percentage (%) of the EGFP-negative cell population in the cells subjected to each operation. The results of FIGS. 5C and 5D and FIGS. 6 and 7 showed substantially the same tendency as the results obtained by FIG.
  • MiRNA sensing and genome editing control by miR-AclllA4 switch (10 ng) Transfer to iPS-EGFP cells in the same manner as in (4) except that the amount of AclllA4 mRNA or miR-AclllA4 switch added was 10 ng. I did an ejection. The results are shown in FIGS. 8A to D, 9 and 10. Even if the amount of the miR-AclllA4 switch to be introduced was changed, the same result as in the experiment (4) was shown.
  • M-PER cocktail M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher), Protease inhibitor, PMSF). After centrifuging at 14000 xg at 4 ° C. for 10 minutes, the supernatant was collected and a BCA assay was performed using the Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) according to the protocol. The protein was diluted to 0.5 mg / mL and then analyzed by Wes (Protein Simple). The Flag antibody (Sigma Aldrich) was diluted 1:10 and the GAPDH antibody (Santa Cruz) was diluted 1: 500. Anti-mouse and anti-rabbit antibody (Protein Simple) were used for the detection of the primary antibody.
  • FIG. 12 is a representative Western blot image (image of the virtual western blot obtained by Wes) 24 hours after RNA transfection, showing the results of detecting AclllA4 expression by Wes.
  • 3xFlag was fused to AclllA4 to detect AclllA4.
  • GAPDH was used as a control, and the experiment was performed three times.
  • miR-AclllA4 switch as a Cas9 regulator and cleaved or activated the target gene in response to the highly active miRNA. Since AclllA4 delivered as mRNA efficiently suppressed Cas9 activity (FIGS. 2A-C), regulation of AclllA4 by miRNA can be an attractive means for genome editing and activation depending on the cellular state. In the absence of the input miRNA, the miR-AclllA4 switch expressed AclllA4 and efficiently suppressed the activity of Cas9 or dCas9-VPR, turning it off.
  • Non-Patent Document 2 uses two types of mRNA, Cas9 mRNA and L7Ae mRNA that suppresses the translation of Cas9. Compared with this conventional system, the miR-AclllA4 switch of the present invention reduced Cas9 leak expression in the OFF state. It is believed that the interaction between AclllA4 and Cas9 effectively blocked Cas9 activity.
  • DNA fragments containing AclllA4 can be found in pUC19-AclllA4 from forward primer No. 1 and reverse primer No. Amplified by PCR using 2. The fragment was inserted between the EcoRI site of pHL-EF1 ⁇ -SphcCas9-iP-A (provided by Dr. Akitsu Hotta) and the SalI site to generate pHL-EF ⁇ -AclllA4-iP-A.
  • pHL-EF1 ⁇ -AclllA4_E70R-iP-A pHL-EF1 ⁇ -AclllA4_E70R-iP-A was constructed from pHL-EF1 ⁇ -AclllA4-iP-A using KOD-Plus-Mutagenesis Kit according to the protocol of the manufacturer (TOYOBO). To introduce the mutation, iPCR forward primer No. 3 and iPCR reverse primer No. 4 was used.
  • DNA fragments containing M9 are available from pAptamerCassette-tagBFP-M9 (unpublished) in forward primer No. 12 and reverse primer No. Amplified by PCR using 13. pHL-EF1 ⁇ -AclllA4-iP-A and pHL-EF1 ⁇ -T21_AclllA4-iP-A are described in forward primer No. 14, and reverse primer No. Using 15, it was linearized by inverse PCR. The M9 fragment and linearized vector were fused using the In-Fusion® HD Cloning Kit according to the manufacturer's (Clontech) protocol.
  • PHL-gRNA [EGFP] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH The DNA fragment containing the target gene EGFP is described in the forward primer No. 16 and reverse primer No. Amplified by PCR using 18. The DNA fragment is inserted between the BamHI site and the EcoRI site of pHL-gRNA [DMD] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH (provided by Dr. Akitsu Hotta), and the DNA fragment is inserted between the BamHI site and the EcoRI site, and the pHL-gRNA [EGFP] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH Was generated.
  • PLL-gRNA [TRE] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH The DNA fragment containing the target gene TRE is described in the forward primer No. 17 and reverse primer No. Amplified by PCR using 18. The DNA fragment was inserted between the BamHI and EcoRI sites of pHL-gRNA [EGFP] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH to generate pHL-gRNA [TRE] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH.
  • PLL-gRNA [Target] -mEF1 ⁇ -iRFP670-RiH: Target TRE and EGFP]
  • the DNA fragment containing iRFP670 is piRFP670-N1 (Addgene, plasmid # 45457, Shcherbakova DM, Verkusher VV. (2013) Near-infrared fluorosector in vivo. .. 19 and reverse primer No. Amplified by PCR using 20.
  • the DNA fragment was inserted between the EcoRV and AvrII sites of pHL-gRNA [TRE] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH and pHL-gRNA [EGFP] -mEF1 ⁇ -mRFP-RiH to replace iRFP670 with mRFP.
  • PB-TRE_hmAG1 The DNA fragment containing TRE-AG1 is described from pTRE-Tight-hmAG1 in the forward primer No. 23 and reverse primer No. Amplified by PCR using 24.
  • PB-TRE-IRES-AG (Nakanishi H, et al. (2017) Dynamics and visualizing microRNA dynamics daring live cell deferentiation using microRNA-responsive web.
  • 25 and reverse primer No. 26 was linearized by inverse PCR.
  • the resulting DNA fragment and linearized vector were fused using the In-Fusion® HD Cloning Kit according to the manufacturer's (Clontech) protocol.
  • the plasmid DNA was removed by DpnI.
  • the 5'-UTR, protein coding region, and 3'-UTR were fused to construct templates for Cas9 mRNA and AcrllA4 mRNA for IVT by further PCR reaction.
  • the sgRNA template is described in Hirosawa M, et al. It was constructed by the method described in (Non-Patent Document 2). All PCR reactions were performed using KOD-Plus-Neo (TOYOBO) and all PCR products were purified using the Min Elute PCR purification kit (QIAGEN). The combinations of primers and templates for the PCR reaction are shown in Tables 2 and 3 below.
  • a natural base such as rNTP was used for the preparation of sgRNA.
  • samples were treated with TURBO DNase (Ambion) at 37 ° C. for 30 minutes. Then, it was generated using FaborPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction colon (Favorgen Biotech), and again in an Antarctic Phosphatase (New England Biolabs) and incubated with New England Biolabs 37 incubate (New England Biolabs). ..
  • the sgRNA was electrophoresed for further purification, extracted from a 10% polyacrylamide gel containing 8.3M urea and ethanol precipitated.
  • [MRNA and sgRNA sequences] The sequences of the mRNA and sgRNA used are shown in Table 4 below. In Table 4, the open reading frame is represented by bold, and the start codon and stop codon are circled. The miRNA target sequence on the mRNA and the sequence recognized by the target gene on the sgRNA are underlined.
  • HeLa CCL2 cells (ATCC) were seeded in 24-well plates (2.5x10 4 cells / well). 250 ng of PB-TRE_hmAG1 (SEQ ID NO: 56) and 250 ng of pCAG-PBase were cotransfected into cells using Lipofectamine TM 3000 transfection reagent and according to the ThermoFisher protocol. Cells were passaged in 6-well plates, cultured and selected by puromycin (Invivogen).
  • HeLa-EGFP cells were cultured in DMEM High glucose (nacalai tesque) supplemented with 10% FBS (JBS).
  • HeLa-TRehmAG1 cells were supplemented with 10% FBS (JBS), 0.1 mM MEM-non-essential amino acids (Life technologies), 2 mM L-glutamine (Life technologies), and 1 mM sodium pyruvate (DM). It was cultured in Nakalai tesque).
  • iPS_EGFP (AAVS1-CAG :: GFP iPS cells, Waltjen Lab (CiRA, Kyoto University, Japan) was cultivated in Laminin coat ⁇ laminin-511 E8 (iMix) limin-511 E8 (iMix) using StemFit (Ajinomoto) medium. All cell lines were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • [Cas9 activity assay (EGFP knockout assay) HeLa-EGFP cells were seeded in 24-well plates (5x10 4 cells / well). Cas9 mRNA, sgRNA, CellllA4 mRNA, human miRNA-21-5p inhibitor / negative control (ThermoFisher, optional), and human miRNA-302a-5p mimic / negative control (ThermoFisher, Opti) (TermoFisher, Optimal) Cells were transfected using transfection reagents according to the manufacturer's (ThermoFiser) protocol. Cells were captured by an IX 81 microscope (Olympus) equipped with a CCD camera prior to flow cytometric analysis.
  • the hmAG1-positive cell population corresponds to the successful hmAG1 gene activation by dCas9-VPR
  • the hmAG1-negative cell population corresponds to the failed hmAG1 gene activation by dCas9-VPR.

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Abstract

標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、　（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、　（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＡ応答性ｍＲＮＡと、　（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡとを、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：　（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および　（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列 を含み、　前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法を提供する。

Description

標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法
　本発明は、標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法、並びに当該方法に用いることができるキットに関する。
　近年、ゲノム編集において、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ　ａｎｄ　ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）Ｓｙｓｔｅｍが広く用いられている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍは、ヌクレアーゼであるＣａｓ９蛋白質（Ｃａｓ９）と標的配列に相補的な２０塩基を組み込んだシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）により、目的遺伝子を切断するものである。しかし、ゲノム編集において、意図しない配列を切断してしまうことや、標的でない細胞のゲノムを編集してしまうことは思わぬ結果をもたらす危険性がある。そのため、ゲノム編集を行うツールを制御することは重要である。
　細胞を識別するための指標となる対象として、マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡと指称する）が、着目されている（例えば、特許文献１を参照）。このｍｉＲＮＡを利用して、細胞特異的にＣａｓ９などのヌクレアーゼを制御する方法が考案されてきた（例えば、非特許文献１、２、及び特許文献１を参照）。また、本発明者らにより、ＲＮＡ結合蛋白質を利用し、標的ｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムを編集する試みもなされてきた（例えば、非特許文献２及び特許文献２を参照）。
　近年、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の活性を阻害するＡｃｒｌｌＡ４が発見された。このＡｃｒｌｌＡ４をｍｉＲＮＡで制御することで、標的ｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムを編集することが試みられた（非特許文献３を参照）。この方法は、ＤＮＡデリバリーであり、導入遺伝子がゲノムに組み込まれる危険性がある。また、プラスミドＤＮＡを用いたレポーター（ルシフェラーゼ）により遺伝子活性化を評価している。
国際公開ＷＯ２０１５／１０５１７２ 国際公開ＷＯ２０１８／００３３３９
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ．　２０１４　Ｎｏｖ；９（１１）：１４０２－１４１２ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（２０１７）　４５：ｅ１１８ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（２０１９）　１，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｚ２７１
　非特許文献１、２、及び特許文献２に開示されたヌクレアーゼの制御方法は、標的となるｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムが編集されなくなるシステムである。このようなシステムを、本明細書において、ＯＦＦシステムともいう。ＯＦＦシステムを用いて標的細胞特異的にゲノムを編集するためには、特定の標的細胞で特異的に活性の低いｍｉＲＮＡを探す必要があり、煩雑である。一方、非特許文献２及び特許文献２に開示されたＲＮＡ結合蛋白質を使用する方法では、Ｃａｓ９発現を抑えたい場合において、Ｃａｓ９発現のリークがみられた。より特異性を上げるためには、このリークを抑える必要性がある。
　また、非特許文献３に開示された方法では、内在性の遺伝子、すなわち標的細胞のゲノム上にある遺伝子を実際に活性化できるかは不明である。さらにこの方法はウイルスベクターの使用を必須とする方法であり、細胞の臨床使用における安全性が懸念される。
　ｍｉＲＮＡの活性を指標として、意図しない遺伝子や細胞に作用することなく、細胞特異的に、かつより精密に、標的遺伝子を編集することができる、安全な方法が求められている。
　本発明者らは鋭意検討の結果、標的遺伝子を編集する蛋白質を不活性化する蛋白質の発現を、ｍｉＲＮＡの活性を指標として制御することにより、標的細胞特異的にゲノムを編集することができることを発見し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］　標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、
　（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
　（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
　（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡとを、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
　（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
　（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
　前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
［２］　前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［１］に記載の方法。
［３］　前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［１］に記載の方法。
［４］　前記（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）が、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターを使用することなく、合成ＲＮＡ分子の形態で細胞に導入される、［１］に記載の方法。
［５］　前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの非翻訳領域に複数含まれる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］　前記第２蛋白質が、Ｎ末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、［２］または［３］に記載の方法。
［７］　標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御するキットであって、
　（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
　（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
　（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を含み、当該ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
　（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
　（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
　前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、キット。
［８］　前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［７］に記載のキット。
［９］　前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［７］に記載のキット。
［１０］　前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、５’－ＵＴＲに複数含まれる、［７］～［９］のいずれか１項に記載のキット。
［１１］　前記第２蛋白質が、N末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、［８］または［９］に記載のキット。
　本発明に係る方法によれば、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４のようなｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチ、すなわち、ｍｉＲＮＡに応答して特定の蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子を用いることにより、特定の細胞種において発現される標的ｍｉＲＮＡを検出し、細胞特異的にゲノム編集を実現することができた。この方法をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムなどの遺伝子編集システムと組み合わせることにより、細胞工学や臨床治療を含む種々の研究分野への応用が可能となる。
　本発明は、標的となるｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムが編集されるシステム、すなわち、ＯＮシステムを実現することができる。かかる方法では、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡにより、遺伝子を編集する蛋白質を不活性化する蛋白質の発現を制御することができ、以下の理由により、標的細胞のゲノムを設計するための有用なツールとなりうる。
［１］　ＯＦＦシステムと比較して、ＯＮシステムは容易にかつ選択的に標的細胞において遺伝子を編集する蛋白質（ヌクレアーゼなど）を活性化することができる。
［２］　モデル生命体における遺伝子機能を同定するために、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは細胞特異的なゲノム編集や、組織特異的なゲノム編集、すなわちゲノムノックアウトによる機能の喪失またはＣＲＩＳＰＲａによる機能の獲得を可能にする。
［３］　ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは、ＲＮＡ送達方法により実施することができる。これにより、ＤＮＡ送達方法において懸念されるゲノム組み込みやオフターゲット効果を避けることができる。
［４］　ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは、非標的細胞におけるゲノム編集を最低限にすることができる。これは、臨床応用において重要であり、例えば、がん治療において、正常細胞におけるゲノム編集を回避し、副作用を低減することができる。
［５］　ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは内在性ｍｉＲＮＡのみならず、合成オリゴヌクレオチド、例えばｍｉＲ－ｍｉｍｉｃにも応答するため、誘導可能なゲノム編集または一時的なゲノム編集にも用いることができる。
図１は、ｍｉＲＮＡ応答性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９　ＯＮスイッチのスキームを表す概念図である。ＡｃｒｌｌＡ４は、Ｃａｓ９の活性を阻害するキープレイヤーであり、このＡｃｒｌｌＡ４の発現は、ｍｉＲＮＡの標的部位をＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに挿入することで内在性のｍｉＲＮＡにより制御される。つまり、標的ｍｉＲＮＡの活性が高い時はＡｃｒｌｌＡ４の発現が抑制されるため、Ｃａｓ９により遺伝子の編集が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲにより遺伝子の活性化が行われる。 図２Ａは、ＡｃｒｌｌＡ４によるＣａｓ９活性阻害を、ＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した場合の代表的な細胞の写真である。 図２Ｂは、ＡｃｒｌｌＡ４によるＣａｓ９活性阻害を、ＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した場合の代表的なヒストグラムである。 図２Ｃは、ＡｃｒｌｌＡ４によるＣａｓ９活性阻害を、ＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験を３回実施した結果の棒グラフである。結果は、ｍｅａｎ±ＳＤで表示した。 図３Ａは、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチによりｍｉＲＮＡをセンシングしゲノム編集を制御する、ｍｉＲＮＡ応答性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９　ＯＮシステムの概念図である。Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４　ｓｗｉｔｃｈを細胞に導入する。標的ｍｉＲＮＡの活性が低い場合は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現しＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体に結合し、Ｃａｓ９のＤＮＡ結合を阻害するためゲノムが編集されない（左）。標的ｍｉＲＮＡの活性が高い場合は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現しない。そのため、Ｃａｓ９がＤＮＡに結合しゲノムが編集される（右）。 図３Ｂは、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した場合の代表的な細胞の写真である。 図３Ｃは、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した場合の代表的なヒストグラムである。 図３Ｄは、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験を３回実施した結果の棒グラフを示す。結果は、ｍｅａｎ±ＳＤで表示し、＊＊＊Ｐ　＜　０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔ）を示す。 図４Ａは、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチが内在性ｍｉＲＮＡを介しＣＲＩＳＰＲａを制御する、ｍｉＲＮＡ応答性ＣＲＩＳＰＲａ　ＯＮシステムの概念図である。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ　ｐｌａｓｍｉｄ（ａ）、ｓｇＲＮＡ　ｐｌａｓｍｉｄ（ｃ）、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４　ｐｌａｓｍｉｄ（ｂ）をＴＲＥ－ＰｍｉｎｉＣＭＶ－ｈｍＡＧ１がゲノムに組まれたＨｅＬａ細胞に導入する。ＡｃｒｌｌＡ４はｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ｓｇＲＮＡ複合体のＤＮＡ結合を阻害し、ｈｍＡＧ１発現を抑制する。標的ｍｉＲＮＡ活性が高い場合、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ｓｇＲＮＡ複合体が標的サイトに結合するので、ｈｍＡＧ１が発現する。下図の下線部は標的配列、四角で囲んだ配列はｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）を示す。 図４Ｂは、ｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性をｈｍＡＧ１発現により評価した場合の代表的な細胞の写真である。 図４Ｃは、ｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性をｈｍＡＧ１発現により評価した場合の代表的なドットプロットである。 図４Ｄは、ｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性をｈｍＡＧ１発現により評価した実験を３回実施した結果の棒グラフを示す。結果は、ｍｅａｎ±ＳＤで表示し、＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔ）を示す。 図５は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び５ｎｇのｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを、ＥＧＦＰ遺伝子をゲノム上に組み込んであるｉＰＳ細胞であるｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞に導入し、ｍｉＲＮＡをセンシングしゲノム編集を制御し、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す。図５Ａは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加せず、右パネルは標的遺伝子に認識されるｓｇＲＮＡＥＧＦＰを添加せず）の結果、得られた細胞の写真である。 図５Ｂは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加、中パネルは不活性化したＡｃｒｌｌＡ４変異体を添加、右パネルは未処理）の結果、得られた細胞の写真である。 図５Ｃは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を１つ用いた、ｍｉＲ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である。 図５Ｄは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を４つ用いた、４×ｍｉＲ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である 図６は、図５に示す実験結果をドットプロットにより表した図である。 図７は、図５に示す実験の結果、各操作を行った細胞におけるＥＧＦＰ陰性細胞集団の割合（％）を示すグラフである。 図８Ａ～Ｄは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び１０ ｎｇのｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを、ＥＧＦＰ遺伝子をゲノム上に組み込んであるｉＰＳ細胞であるｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞に導入し、ｍｉＲＮＡをセンシングしゲノム編集を制御し、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す。図８Ａは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加せず、右パネルは標的遺伝子に認識されるｓｇＲＮＡＥＧＦＰを添加せず）の結果、得られた細胞の写真である。 図８Ｂは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加、中パネルは不活性化したＡｃｒｌｌＡ４変異体を添加、右パネルは未処理）の結果、得られた細胞の写真である。 図８Ｃは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を１つ用いた、ｍｉＲ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である。 図８Ｄは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を４つ用いた、４×ｍｉＲ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である 図９は、図８に示す実験結果をドットプロットにより表した図である。 図１０は、図８に示す実験の結果、各操作を行った細胞におけるＥＧＦＰ陰性細胞集団の割合（％）を示すグラフである。 図１１は、コンストラクトの概略図を示す。（Ａ）は５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ標的部位を有し、本発明の第２蛋白質として機能するＡｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲをコードする、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの構造概念図を示す。（Ｂ）は、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ標的配列の一例を示す概念図であり、ｍｉＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｉｔｅを１リピートまたは４リピート組み込むことができることを示す。（Ｃ）は、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの第２蛋白質の概念図を示しており、上図は野生型のＡｃｒｌｌＡ４蛋白質をコードする配列を、下図はＮ末端に核移行シグナルであるＭ９を融合させたＭ９＿ＡｃｒｌｌＡ４をコードする配列を概念的に示す。 図１２は、ＡｃｒｌｌＡ４＿３ｘＦｌａｇ　ｍＲＮＡとｍｉＲ－２１応答性ＡｃｒｌｌＡ４＿３×Ｆｌａｇ　ｍＲＮＡのトランスフェクション２４時間後の代表的なウェスタンブロットの画像を表す。
　以下に、本発明の実施の形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
　本発明は、一実施形態によれば、標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、
　（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
　（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
　（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡとを、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
　（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
　（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列を含み、
　前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法に関する。
　本発明における、「細胞」とは、特に限定されるものではなく任意の細胞であってよい。例えば、多細胞生物種から採取した細胞であってもよく、単離された細胞を培養することによって得られる細胞であってもよい。当該細胞は、特には、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）採取した細胞、若しくは哺乳動物より単離された細胞又は哺乳動物細胞株を培養することによって得られる細胞である。体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における細胞として用いることができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　本発明における細胞は、前期体細胞を採取後に人為的な操作を加えた細胞であってよい。例えば、前記体細胞から調製した多能性幹細胞を含んでなる細胞群であり、あるいは多能性幹細胞を分化させた後に得られる細胞群であって、所望する細胞以外に分化された細胞を含み得る細胞群であってもよい。本発明で使用可能な多能性幹細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。それらの多能性幹細胞の具体例は、以下のものに限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞である。より好ましい多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、特に好ましくはヒトＥＳ細胞、およびヒトｉＰＳ細胞である。さらに、本発明で使用可能な細胞は、多能性幹細胞だけでなく、多能性幹細胞を経ることなく直接所望の細胞に分化誘導させた、いわゆる「ダイレクトリプログラミング」により誘導された細胞群であってもよい。その他には、本発明における細胞は、がん細胞と正常細胞を含み得る細胞群など、遺伝子の編集が所望される細胞と、遺伝子の編集が所望されない細胞を含み得る細胞群であってもよい。
　本発明における細胞は、特には生存状態にあることが好ましい。本発明において、細胞が生存状態にあるとは、代謝能を維持した状態の細胞を意味する。本発明においては、細胞に、先の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のＲＮＡを導入した後にも、その生来の特性を失うことなく、生存状態のまま、特に分裂能を維持したまま、続く用途に用いることができる細胞であってよい。
　本発明における「標的遺伝子」とは、標的となる特定の細胞のゲノム上にある遺伝子である。遺伝子の種類は特には限定されず、後述するｓｇＲＮＡの設計により、任意の所望の遺伝子を標的遺伝子とすることができる。
　本発明において、標的遺伝子の「編集」とは、標的遺伝子に作用して、遺伝子の機能を変更することをいい、例えば遺伝子の機能を低下させ、損失させ、獲得し、または増強することが含まれる。さらに具体的には、「編集」とは、遺伝子を切断し、遺伝子の発現を活性化し、抑制化し、塩基編集し、ラベリング（ゲノム標識）し、ＤＮＡメチル化・脱メチル化やヒストンのアセチル化などのエピゲノム編集を行うことを含むものとする。
　また、本発明において、本発明において、「制御する」とは、第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、これにより、標的遺伝子の編集を行う第１蛋白質が機能しない状態（ＯＦＦ状態）から、機能することができる状態（ＯＮ状態）とすることをいう。
　また、「細胞特異的に制御する」とは、特定の細胞において、特異的に活性が高いｍｉＲＮＡを指標として、当該細胞において標的遺伝子の編集を制御することをいう。ｍｉＲＮＡを指標とした編集制御は、上記（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを用いて実施することができる。以下、各ＲＮＡの構造及び機能について説明する。
　（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡ
　（ａ）のｍＲＮＡは、標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードし、細胞内で翻訳されて第１蛋白質を発現するｍＲＮＡである。標的遺伝子を編集する第１蛋白質とは、一般的には、標的遺伝子を編集することができる酵素活性を有する蛋白質である。第１蛋白質としては、標的遺伝子を切断することができるヌクレアーゼや、標的遺伝子を活性化することができる不活性化型ヌクレアーゼが含まれるが、これらには限定されない。
　ヌクレアーゼとしては、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　９（Ｃａｓ９）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。なお、いずれのヌクレアーゼについても、同様の機能、すなわち標的遺伝子の切断活性を備える類似体や、同等の活性を有するその誘導体を用いることもできる。例えば、Ｃａｓ９蛋白質の類似体には、Ｃａｓ９ファミリー蛋白質が含まれ、具体的なＣａｓ９ファミリー蛋白質としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｃａｓ９　（ＳａＣａｓ９）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ　Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９，もしくは　ＮｍｅＣａｓ９）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＣＲＩＳＰＲ１－Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）が挙げられるが、これらには限定されない。Ｃａｓ９蛋白質、類似体もしくは誘導体に他の蛋白質が融合した融合蛋白質もヌクレアーゼに含まれる。
　不活性化型ヌクレアーゼとしては、転写活性因子に融合した不活性化型ヌクレアーゼを挙げることができ、転写活性化因子ＶＰ６４に融合した不活性化型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ヌクレアーゼであるｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ、ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ、ｄＣａｓ９－ＶＰ１６、ｄＣａｓ９－ＶＰ１６０、ｄＣａｓ９－Ｐ３００を用いることができるが、これらには限定されない。なお、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４とともに、ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１融合蛋白質と、ガイド鎖にＭＳ２結合配列を有する（ｃ）のｓｇＲＮＡとを用いたＳＡＭシステムや、ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇとともにＶＰＲを用いるＴｒｅｅシステムもまた、用いることができる。これらのシステムに用いるタンパク質は、第１蛋白質をコードするｍＲＮＡとは別のｍＲＮＡによりコードすることもでき、第１蛋白質をコードするｍＲＮＡ上にコードすることもできる。また、これらの不活性化型ヌクレアーゼと同様の機能を備える類似体や誘導体を用いることもできる。
　（ａ）のｍＲＮＡは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン５’リン酸）またはＡｍｂｉｏｎ製のＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）などのＣａｐ類似体を含む５’－ＵＴＲ、開始コドン、第１蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを含む３’－ＵＴＲを備えている。５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの設計は任意であってよい。（ａ）のｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、及び３’－ＵＴＲのいずれにも、ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含まない。これにより、（ａ）の第１蛋白質をコードするｍＲＮＡは、細胞内に導入されて、ｍｉＲＮＡ活性の影響を受けることなく翻訳され、第１蛋白質を発現することができる。
　（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡ
　（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、第２蛋白質をコードし、細胞内でｍｉＲＮＡによる翻訳制御下で第２蛋白質を発現することができるｍＲＮＡである。第２蛋白質は、第１蛋白質を不活性化することができる蛋白質である。第２蛋白質は、（ａ）のｍＲＮＡについて説明した第１蛋白質との関係で決定することができる。第２蛋白質は、第１蛋白質を不活性化する蛋白質の融合体であってもよい。
　例えば、第１蛋白質が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼや、不活性化型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはこれらの類似体の場合には、第２蛋白質としては、これらのヌクレアーゼを不活性化することができるａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲを用いることができる。特には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）を不活性化することができるａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲは、ＡｃｒｌｌＡ２、ＡｃｒｌｌＡ４、ＡｃｒｌｌＡ５、ＡｃｒｌｌＡ７、ＡｃｒｌｌＡ８、ＡｃｒｌｌＡ９、ＡｃｒｌｌＡ１０が挙げられるが、これらには限定されない。第２蛋白質は、例示したａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲと同様の機能を有する、すなわちヌクレアーゼを不活性化することができるａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲの類似体であってもよい。なお、先に例示したＣａｓ９ファミリー蛋白質のＮｍＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＣ１、ＡｃｒｌｌＣ２、ＡｃｒｌｌＣ３、ＡｃｒｌｌＣ４、ＡｃｒｌｌＡ５が挙げられ、ＣｊＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＣ１が挙げられ、ＧｅｏＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＣ１が挙げられ、Ｓｔ１Ｃａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしてはＡｃｒｌｌＡ５、ＡｃｒｌｌＡ６が挙げられ、ＳａＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＡ５が挙げられる。第２蛋白質は、ａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲまたはその類似体を含む蛋白質融合体であってもよく、例えば、ＡｃｒｌｌＡ４などのａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲの好ましくはＮ末端側に核移行シグナルＭ９を融合した融合蛋白質であってもよい。ＡｃｒｌｌＡ４に核移行シグナルＭ９を融合した融合蛋白質を用いると、第１蛋白質が編集する標的遺伝子における切断もしくは活性化を増強することができる。
　好ましい第１蛋白質と第２蛋白質の組み合わせとしては、例えば、ＡｓＣａｓ１２ａとＡｃｒＶＡ１、ＬｂＣａｓ１２ａとＡｃｒＶＡ４もしくはＡｃｒＶＡ５（ＡｃｒＶＡ１）、ＮｍｅＣａｓ９とＡｃｒｌｌＣ１もしくはＡｃｒｌｌＣ３等が挙げられるが、これらには限定されない。
　ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡとは、ｍｉＲＮＡの活性に応答してコードする蛋白質の翻訳が制御されるメッセンジャーＲＮＡであり、本明細書において、ｍｉＲＮＡスイッチとも指称する。ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの一般的な構造は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする特許文献１（ＷＯ２０１５／１０５１７２）に詳述されている。本発明に用いる（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および（ｉｉ）第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列を含み、（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列と（ｉｉ）第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列が機能的に連結されている。
　（ｉ）のｍｉＲＮＡは、ある特定の細胞において、第１蛋白質により特定の標的遺伝子を編集することを目的として、その細胞で特異的に活性が高いｍｉＲＮＡを適宜選択することができる。本明細書において、（ｉ）のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの「標的配列」と指称する場合があり、このようなｍｉＲＮＡを、標的ｍｉＲＮＡと指称する場合がある。特定の細胞で特異的に活性が高いｍｉＲＮＡとは、当該細胞における発現が、他の細胞における発現よりも多いｍｉＲＮＡをいうものとする。ｍｉＲＮＡの「発現」とは、成熟ｍｉＲＮＡが、所定の複数の蛋白質と相互作用して、ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）を形成した状態にあるｍｉＲＮＡが存在していることをいうものとする。「成熟ｍｉＲＮＡ」は、一本鎖ＲＮＡ（２０～２５塩基）であり、核外でＤｉｃｅｒによる切断によってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡから生じ、「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」は、Ｄｒｏｓｈａと呼ばれる核内酵素による部分切断によって、ＤＮＡから転写された一本鎖ＲＮＡであるｐｒｉ－ｍＲＮＡから生じる。本発明におけるｍｉＲＮＡとは、少なくとも１０，０００種類以上のｍｉＲＮＡから適宜選択される。詳細には、データベースの情報（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／）に登録されたｍｉＲＮＡ、及び／または当該データベースに記載されている文献情報に記載されたｍｉＲＮＡより適宜選択される。すなわち、本発明においては、（ｉ）のｍｉＲＮＡは特定の配列から構成されるｍｉＲＮＡに限定されるものではない。このような、（ｉ）のｍｉＲＮＡは、本出願時において特定されているｍｉＲＮＡには限定されず、今後、その存在及び機能が特定されるあらゆるｍｉＲＮＡを含むものとする。特定の細胞において発現が多いｍｉＲＮＡとは、他の細胞における発現と比較して、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上あるいはそれ以上の割合で高く発現しているｍｉＲＮＡが例示される。このような特定の細胞において発現が多いｍｉＲＮＡも、上記データベースの情報に基づき適宜選択することができる。
　本発明において、ｍｉＲＮＡの標的配列は、例えば、当該ｍｉＲＮＡに完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該ｍｉＲＮＡにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該ｍｉＲＮＡに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にｍｉＲＮＡが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０～５０％程度の不一致があっても良い。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわち、ｍｉＲＮＡの３’側の１６塩基程度に対応する、標的配列内の５’側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。このような配列は、ＲＩＳＣが特異的に結合する塩基数を含む塩基長であればよく、長さは別段限定されないが、好ましくは、１８塩基以上、２４塩基未満の配列、より好ましくは、２０塩基以上、２２塩基未満の配列である。本発明において、ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列は、当該標的配列を有し、視認可能な蛍光蛋白質などのマーカー蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを、所望の細胞および他の細胞へ導入し、所望の細胞においてのみ対応するマーカー蛋白質の発現が抑制されることを確認することによって、適宜決定して用いることができる。
　本発明において、ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列（ｉ）と第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列（ｉｉ）が機能的に連結されるとは、第２蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の５’－ＵＴＲ内、３’－ＵＴＲ内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的配列を備えることを意味する。ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン５’リン酸）またはＡＲＣＡなどのＣａｐ類似体、第２蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを備え、５’－ＵＴＲ内、３’－ＵＴＲ内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的配列を備える。以下、Ｃａｐ構造と指称する場合は、Ｃａｐアナログも含むものとする。ｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡの標的配列の位置は、非翻訳領域にあってよく、５’－ＵＴＲであっても、３’－ＵＴＲであってもよい。あるいはｍｉＲＮＡの標的配列の位置は、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの３’側）であってもよい。非翻訳領域並びにオープンリーディングフレーム内のすべてにｍｉＲＮＡの標的配列を備えていてもよい。したがって、ｍｉＲＮＡ標的配列の数は、１つであってもよく、複数であってもよく、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つあるいはそれ以上であっても良い。例えば、５’－ＵＴＲに、４つあるいはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を組み込むことが好ましい。
　図１１は、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの設計例を概念的に示す図である。図１１（Ａ）は、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの全体の構造の一例を概念的に示す。図中、ｍｉＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｉｔｅは上記（ｉ）の核酸配列を示し、Ａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲは（ｉｉ）の核酸配列を示す。左側の白丸は、５’末端のＣａｐ構造を表し、右側のＰｏｌｙ（Ａ）は３’末端のポリＡテイルを表す。なお、図１１における（ｉ）の核酸配列と、（ｉｉ）の核酸配列との結合態様は一例であり、本発明を限定するものではない。図１１（Ｂ）は、上記（ｉ）の核酸配列を示し、上図はｍｉＲＮＡ標的配列を１リピート有する（ｉ）の核酸配列、下図はｍｉＲＮＡ標的配列を４リピート有する（ｉ）の核酸配列を例示する。図１１（Ｃ）は、（ｉｉ）の核酸配列の一例を示す概念図であり、上図は第２蛋白質がＡｃｒｌｌＡ４である場合、下図は第２蛋白質が、核移行シグナルＭ９とＡｃｒｌｌＡ４の融合蛋白質である場合の概念図である。
　好ましくは、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が、５’から３’の方向にこの順序で連結されている。このとき、Ｃａｐ構造とｍｉＲＮＡの標的配列との間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、Ｃａｐ構造とｍｉＲＮＡ標的配列との間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。また、ｍｉＲＮＡ標的配列と開始コドンとの間の塩基数及び塩基の種類は、ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡとの結合を阻害するなど、これらの相互作用に影響を与えないことが好ましい。一例としては、ｍｉＲＮＡ標的配列と開始コドンと間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるような配置にて設計することができる。
　本発明において、（ｉ）のｍｉＲＮＡ標的配列内には、開始コドンとなるＡＵＧが存在しないことが好ましい。例えば、ｍｉＲＮＡの標的配列が５’－ＵＴＲに存在し、かつ、当該標的配列内にＡＵＧを含む場合には、３’側に連結されるマーカー遺伝子との関係上でインフレームとなるように設計されることが好ましい。あるいは、標的配列内にＡＵＧを含む場合、標的配列内のＡＵＧをＧＵＧに変換して使用することも可能である。また、標的配列内のＡＵＧの影響を最小限に留めるために、５’－ＵＴＲ内における標的配列の配置場所を適宜変更することができる。例えば、Ｃａｐ構造と標的配列内のＡＵＧ配列との間の塩基数が、０～６０塩基、例えば、０～１５塩基、１０～２０塩基、２０～３０塩基、３０～４０塩基、４０～５０塩基、５０～６０塩基となるような配置にて設計され得る。なお、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの塩基数は、（ａ）のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの塩基数とそれぞれ、概ね同程度になるように設計することができる。
　（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５－メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。細胞毒性を低減させるためである。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
　（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、細胞内に導入され、ｍｉＲＮＡに応答して第２蛋白質の翻訳が制御される。導入された細胞において、上記の標的配列に特異的に結合する特定のｍｉＲＮＡの活性が高い場合は、第２蛋白質の翻訳が抑制される。一方、導入された細胞において、上記の標的配列に特異的に結合する特定のｍｉＲＮＡの活性が低い場合には、第２蛋白質が翻訳され、当該細胞内で第２蛋白質が発現される。
　（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡ
　（ｃ）のｓｇＲＮＡは、第１蛋白質が編集する標的となる遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるＲＮＡである。ｓｇＲＮＡ（ｃ）は、標的遺伝子を特異的に認識する、２０程度、例えば、１８～２２の程度の塩基配列を５’末端近傍に組み込むように設計することができる。標的遺伝子を特異的に認識する塩基配列は、標的となる遺伝子に完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該標的となる遺伝子において認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該標的となる遺伝子に完全に相補的な配列からの不一致については、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの設計において、ｍｉＲＮＡとその標的配列について定義したのと同様であってよい。また、この第１蛋白質による編集の標的となる遺伝子を特異的に認識する塩基配列の５’側に、１～５塩基程度の配列があってもよく、約８０塩基程度の配列があってもよい。このような配列を設けることにより、標的配列に結合しゲノムの編集を制御することができる可能性がある。さらに、標的遺伝子を特異的に認識する塩基配列の３’側以降の配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍ等の遺伝子編集システムのｓｇＲＮＡとして機能することが知られているｓｇＲＮＡの配列であってよく、Ｔｅｔｒａ　ｌｏｏｐ、ｓｔｅｍ　ｌｏｏｐ２、３’末端を改変した例やｓｇＲＮＡを構成するＲＮＡに化学修飾を加えた例が知られている。使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍによっては、ｓｇＲＮＡのｔｅｔｒａｌｏｏｐ及び／またはｓｔｅｍ　ｌｏｏｐに、関連する蛋白質との結合配列を付加することもできる。しかしながら、第１蛋白質と複合体を形成して、標的遺伝子の目的の部位での編集、例えば切断や活性化を可能とする配列であれば、特定の配列には限定されない。
　（ｃ）のｓｇＲＮＡは、第１蛋白質が活性な状態で存在する場合、第１蛋白質と複合体を形成して、標的遺伝子を編集する、例えば標的遺伝子を所望の部位で切断し、あるいは標的遺伝子の所望の部位を活性化することができる。
　（ａ）のｍＲＮＡ、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡ、（ｃ）のｓｇＲＮＡは、上記に従って設計され、配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートＤＮＡを鋳型として用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写合成法により、得ることができるが、合成方法は特には限定されない。
　本発明の一実施態様において、（ａ）のｍＲＮＡ、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡ、（ｃ）のｓｇＲＮＡを細胞に導入する方法としては、合成ＲＮＡ分子の形態で細胞に導入することが挙げられる。例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。あるいは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のＲＮＡは、ウイルスベクターやプラスミドベクター、エピソーマルベクター等などのＤＮＡの形態で導入することもでき、導入法は、上記と同様のものを用いることができる。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の三種のＲＮＡは同じ方法で導入することが好ましい。
　なお、本発明の方法において、細胞に導入する（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、１種類であってもよく、２種、３種、４種、５種、６種、７種、あるいは８種類以上であってもよい。２種以上のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを導入する場合には、例えば、（ｉ）のｍｉＲＮＡ標的部位の配列が異なり、異なるｍｉＲＮＡに応答するｍＲＮＡを用いることができる。（ｉ）の配列が異なる複数のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを用いることにより、例えば、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが導入される細胞群に含まれうる複数種の細胞に対して、第２蛋白質の活性を制御することが可能になる。
　（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のＲＮＡを細胞に導入する場合、（ａ）及び（ｂ）のｍＲＮＡを細胞群に共導入することが好ましい。共導入した２種以上のｍＲＮＡの細胞内での割合は個々の細胞で維持されるため、これらのｍＲＮＡから発現する蛋白質の活性比は、細胞集団内において一定となるためである。この時の導入量は、導入される細胞群、導入するｍＲＮＡ、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量の第１の蛋白質、及び第２の蛋白質を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。（ｃ）のｓｇＲＮＡは、（ａ）及び（ｂ）のｍＲＮＡと共導入することが好ましいが、必ずしも共導入しなくとも適切なタイミングで、独立に導入することもできる。
　より具体的な例として、第１蛋白質としてＣａｓ９蛋白質を用い、第２蛋白質としてＡｃｒｌｌＡ４を用いる場合の本発明の第１態様による方法を説明する。本発明は、一実施態様によれば、（ａ）のＣａｓ９蛋白質をコードするｍＲＮＡと、（ｂ）のＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、（ｃ）のｓｇＲＮＡを細胞に導入する工程を含む。以下の説明において、（ａ）のＣａｓ９蛋白質をコードするｍＲＮＡを、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡとも指称し、（ｂ）のＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡとも指称する。
　図１に、（ａ）のＣａｓ９　ｍＲＮＡと、（ｂ）のｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡと、（ｃ）のｓｇＲＮＡとを細胞に導入した場合の、細胞内での作用を模式的に示す（下から２段目のパネル左側、左下段パネル）。ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が高い場合、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が抑制され、あるいは、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ分子の分解が生じ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現されない。一方、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ活性に関わらずＣａｓ９蛋白質を発現する。Ｃａｓ９蛋白質は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質により不活性化されることがないため、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９蛋白質が複合体を形成し、ゲノム編集、具体的には標的遺伝子の切断が行われる。
　次に、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が低い場合は、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が行われ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現する。ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質は、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡから発現されるＣａｓ９蛋白質を不活性化する。
　別の具体的な例として、第１蛋白質としてｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質を用い、第２蛋白質としてＡｃｒｌｌＡ４を用いる場合の本発明の第１態様による方法を説明する。本発明は、一実施態様によれば、（ａ）のｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質をコードするｍＲＮＡと、（ｂ）のＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、（ｃ）のｓｇＲＮＡを細胞に導入する工程を含む。以下の説明において、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質をコードするｍＲＮＡ（ａ）を、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ　ｍＲＮＡ（ａ）とも指称する。
　図１に、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ　ｍＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡと、ｓｇＲＮＡとを細胞に導入した場合の、細胞内での作用を模式的に示す（下から２段目のパネル右側、右下段パネル）。ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が高い場合、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が抑制され、あるいは、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ分子の分解が生じ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現されない。一方、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ　ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ活性に関わらずｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質を発現する。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質により不活性化されることがないため、ｓｇＲＮＡとｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質が複合体を形成し、ゲノム編集、具体的には標的遺伝子の活性化が行われる。
　ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が低い場合は、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が行われ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現する。ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ　ｍＲＮＡから発現されるＣａｓ９蛋白質を不活性化する。
　本発明に係る方法によれば、標的遺伝子の編集を可能とする蛋白質の活性を、ｍｉＲＮＡの活性を指標として細胞特異的に制御することが可能となる。このため、特定の細胞において活性の高いｍｉＲＮＡに応答して、標的遺伝子の編集を実行するＯＮシステムを構築することが可能となった。
　以下に、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
（１）ＡｃｒｌｌＡ４によるＣａｓ９活性の阻害
　はじめに、ＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍＲＮＡ（ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ）から作製されたＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が、Ｃａｓ９活性を抑制することができるかを検証した。本発明者らは、ＥＧＦＰ遺伝子がゲノムに組み込まれたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ）を用いてＣａｓ９活性を評価した結果を報告している（Ｈｉｒｏｓａｗａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２０１７）、非特許文献２）。本実験では、ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ）、及びＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡＥＧＦＰを、ＨｅＬａ－ＥＧＦＰにトランスフェクトした。Ｃａｓ９活性は、ＥＧＦＰ陰性細胞集団をフローサイトメトリーにより定量することで評価した。詳細は、方法の欄に示す。
　Ｃａｓ９　ｍＲＮＡの活性は、ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡをトランスフェクションした場合と、しない場合について評価した。結果を図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃに示す。ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡが存在しなかった場合、およそ７０％の細胞がＥＧＦＰ陰性であり、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡＥＧＦＰにより、ＥＧＦＰ遺伝子の編集が効率的に行われたことを示す。これに対し、ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡを添加した場合は、ＥＧＦＰ陰性細胞の数が減少した。この結果は、ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ（１０～５０ｎｇ）が、標的化していない細胞および未処理の細胞と同程度にまで、Ｃａｓ９活性を効率的に抑制したことを示す。Ｃａｓ９結合活性のないｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍｕｔａｎｔ（Ｅ７０Ｒ）（Ｄｏｎｇ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ．（２０１７）　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ－ＳｐｙＣａｓ９　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｎａｔｕｒｅ　５４６：４３６-４３９．）は、ＥＧＦＰ陰性細胞集団に影響を与えなかった。このことは、Ｃａｓ９活性の効率的な抑制が、Ｃａｓ９とＡｃｒｌｌＡ４の相互作用によるものであることを示唆している。このように、ＡｃｒｌｌＡ４は、ゲノム編集を確実に制御する。すなわち、ＯＦＦ状態におけるオフターゲットを最低限にする。以下の実験（図３）においては、１０ｎｇのＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡを用いた。
（２）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチによるｍｉＲＮＡのセンシングとゲノム編集制御
　任意のｍｉＲＮＡに応答してＣａｓ９活性を誘導するために、ｍｉＲＮＡ　応答性ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ（ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチとも指称する、図３Ａ）の５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ標的部位（ｍｉＲＮＡのアンチセンス配列）を挿入した。特定のｍｉＲＮＡ活性が低い場合に、ＡｃｒｌｌＡ４がＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡから発現されてＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体に結合し、Ｃａｓ９が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合するのを抑制して、ゲノム編集を中断する（図３Ａ、左パネル）。一方、特定のｍｉＲＮＡ活性が高い場合には、ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡはＡｃｒｌｌＡ４を発現せず、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ－ｄｓＤＮＡ複合体を形成しゲノム編集が促進される（図３Ａ、右パネル）。このように、ｍｉＲＮＡにより駆動されるＣａｓ９－ＯＮシステムが得られた。
　ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチが、ｍｉＲＮＡ活性を感知してＣａｓ９を活性化できるか否かを調べた。ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓではｍｉＲ－２１活性が高いため、我々は、ｍｉＲ－２１応答性ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ（Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４）を構築し、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡＥＧＦＰをＨｅＬａ－ＥＧＦＰにトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ＥＧＦＰ陰性細胞集団はＣａｓ９活性に基づいて増加した。結果を、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄに示す。このことは、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の発現がｍｉＲ－２１により抑制されたことを示す。
　内在性のｍｉＲ－２１がゲノム編集を引き起こすことができるか確認した。ｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、ＥＧＦＰ陰性細胞集団のサイズを、Ｃａｓ９で処理していない細胞と同程度まで減少させた（Ｃａｓ９－ＯＦＦ）。ｍｉＲＮＡに干渉しないネガティブコントロール（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｎ．Ｃ．）は、ＥＧＦＰ陰性細胞集団に何の効果も及ぼさなかった（Ｃａｓ９－ＯＮ）。これらの結果から、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４スイッチは内在性のｍｉＲ－２１によりＣａｓ９活性を制御することを示しており、ｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下でのＯＦＦ状態でのＣａｓ９活性のバックグラウンドレベルを明らかにした。すなわち、ＯＦＦ状態ではＣａｓ９活性を効率的に抑制し、標的ｍｉＲＮＡ　を検知することによりＣａｓ９を活性化した。また、ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに複数のｍｉＲＮＡ標的配列を直列に挿入することで、ＯＦＦ状態に影響を与えることなくＯＮ状態を改善した（図３Ｄ、４ｘＴ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ｖｓ．Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４）。ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｎ．Ｃ．を用いた場合に、４ｘＴ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団は、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団と比較して高く、前者が４１．１％、後者が３１．７％であった。しかし、ｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを用いると、４ｘＴ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団は１５．６％、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団は１５．９％で、同程度の数値であった。このことは、標的としない細胞に対するオフターゲット効果を避けながら、標的ｍｉＲＮＡに対する感度を改善したことを示す。
　このストラテジーの一般性を確認するために、上記とは異なるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ（ｍｉＲ－３０２ａ）を標的とした。ｍｉＲ－３０２ａは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）のマーカーとして知られている。ＨｅＬａ細胞では、ｍｉＲ－３０２ａの活性が低いため、ｍｉＲ－３０２ａ　ｍｉｍｉｃを用いてＣａｓ９活性化を引き起こした。Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡＥＧＦＰ、及びＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡを、ｍｉＲ－３０２ａ　ｍｉｍｉｃまたはｍｉＲ－３０２ａネガティブコントロール（ｍｉｍｉｃ　Ｎ．Ｃ．）とともに、コトランスフェクションした。予測どおり、ＥＧＦＰ陰性細胞集団は、ｍｉＲ－３０２ａ　ｍｉｍｉｃの存在下では増加したが、ｍｉＲ－３０２ａ　ｍｉｍｉｃ　Ｎ．Ｃの存在下では増加せず、Ｃａｓ９活性のバックグラウンドレベルをＯＦＦ状態に保持した（図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ）。これは、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチがモジュラーであることを示す。このように、ＡｃｒｌｌＡ４を制御することで、合成ＲＮＡにより送達され、ｍｉＲＮＡに応答するＣａｓ９－ＯＮシステムを設計することに成功した。
（３）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチによるｍｉＲＮＡのセンシングとＣＲＩＳＰＲａの制御
　次に、このようなｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチと、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システムを組み合わせて標的遺伝子の発現を上方制御することができるかどうかを探った。そのために、レポーター細胞として、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）により制御可能なｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ１（ｈｍＡＧ１）遺伝子をゲノムに組み込んだＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１）（図４Ａ）を構築した。ｈｍＡＧ１の活性化には、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ　ｓｙｓｔｅｍを用いた（Ｃｈａｖｅｚ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．（２０１５）Ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２：３２６-３２８．）。はじめに、ＡｃｒｌｌＡ４を用いない場合、ｈｍＡＧ１の効率的な発現がなされることを観察した（図４Ｄ、Ｗｉｔｈｏｕｔ　ＡｃｒｌｌＡ４）。ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチを用いたＣＲＩＳＰＲａシステムの制御を調べるために、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ、　ｓｇＲＮＡＴＲＥ、　Ｔ２１－ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡのそれぞれをコードするプラスミドを、ｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒまたはｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｎ．Ｃ．とともに、ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１にコトランスフェクションした。その結果、ｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加は、選択的かつ顕著にｈｍＡＧ１陽性細胞集団を減少させたが、ｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｎ．Ｃ．を添加してもｈｍＡＧ１陽性細胞集団を減少させず、ｈｍＡＧ１の発現はｍｉＲ－２１の活性に依存することがわかった（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４）。この結果から、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチは、ｍｉＲＮＡ活性に応答してゲノムにコードされる遺伝子を活性化できることがわかった。また、ＡｃｒｌｌＡ４のＮ末端を核移行シグナル（ＮＳＬ）であるＭ９に融合することにより、Ｃａｓ９抑制効率を犠牲にすることなく、ｈｍＡＧ１発現レベルを向上させることができた。（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、Ｔ２１－Ｍ９＿ＡｃｒｌｌＡ４（配列番号５５）。さらに、ＡｃｒｌｌＡ４のレベルを変えることにより、ｍｉＲ－２１によりトリガーされるｈｍＡＧ１遺伝子の発現レベルを最適化することができた（図示せず）。さらに、スイッチを、ｍｉＲ－３０２ａを標的とするスイッチに変えても同様の結果が得られることを実験的に確認し、このストラテジーの一般性を確認した（詳細は図示せず）。これらの結果から、ＡｃｒｌｌＡ４の発現レベルを変化させることで、ｍｉＲＮＡを入力信号として用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９　ＯＮシステムの最適なＯＮ／ＯＦＦ状態を達成することができると考えられる。
　（４）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ（５ｎｇ）によるｍｉＲＮＡのセンシングとゲノム編集制御
　先の（１）と同様の実験を、ＥＧＦＰ遺伝子がゲノムに組み込まれたｉＰＳ細胞であるｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞において行い、ＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトによりＣａｓ９の活性を評価した。ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞は、トランスフェクションの１７－２４時間前に、２４　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに　５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。ＳｔｅｍＦｅｃｔ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔをプロトコルに従って使用し、ＡｃｒｌｌＡ４－ｍＲＮＡ（５ｎｇ）、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ）、及びＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡＥＧＦＰを、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから３日後、フローサイトメトリー分析の前に細胞をＣｙｔｅｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりキャプチャーした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、Ａｃｃｕｍａｘで、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下にて１０分間処理した。次いで、２００μＬのＰＢＳを添加し、剥離した細胞を懸濁した。細胞をフローサイトメーターにより測定した。フローサイトメーターの測定条件は、実験方法、ＥＧＦＰノックアウトアッセイに記載した。図５Ａは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡを用いないコントロール実験の結果、得られた細胞の写真であり、左パネルはＡｃｒｌｌＡ４の添加なし、右パネルは標的遺伝子に認識されるｓｇＲＮＡＥＧＦＰの添加なしの結果を示す。図５Ｂもコントロール実験の結果、得られた細胞の写真であり、左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加、中パネルは不活性化したＡｃｒｌｌＡ４変異体を添加、右パネルは未処理）の結果である。図６はドットプロット結果を示し、図７は、各操作を行った細胞におけるＥＧＦＰ陰性細胞集団の割合（％）を示す。図５Ａ、Ｂ、図６、７の結果は、図２により得られた結果と概ね同様の傾向を示した。
　次いで、（２）と同様の実験を、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞において行った。スイッチには、ｍｉＲ－３０２ａの相補配列を標的配列として１リピート、または４リピート有するＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチまたは４ｘＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ（いずれも５ｎｇ）を用いた。細胞の播種並びにトランスフェクションは、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞へのＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡのトランスフェクションと同様にして行った。Ｔ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ、４ｘＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチのトランスフェクションでは、いずれもスイッチに加え、Ｈ２Ｏ、ｍｉＲ－３０２　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｍｉＲ－３０２　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｎ．Ｃ．を添加した。Ｃａｓ９の活性はＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した。図５Ｃは、Ｔ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチをトランスフェクションした結果、得られた細胞の写真であり、図５Ｄは、４ｘＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチをトランスフェクションした結果、得られた細胞の写真である。図６はドットプロット結果を示し、図７は、各操作を行った細胞におけるEGFP陰性細胞集団の割合（％）を示す。図５Ｃ、Ｄ、図６、７の結果は、図３により得られた結果と概ね同様の傾向を示した。
　（５）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ（１０ｎｇ）によるｍｉＲＮＡのセンシングとゲノム編集制御
　ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡまたはｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチの添加量を１０ｎｇとした以外は、（４）と同様にして、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞へのトランスフェクションを行った。結果を図８Ａ～Ｄ、図９、及び図１０に示す。導入するｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチの量を変化させても、（４）の実験と同様の結果を示した。
　（６）ＡｃｒｌｌＡ４タンパク質の発現確認
　ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞を２４－ｗｅｌｌプレートに５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。（Ｔ２１）＿ＡｃｒｌｌＡ４＿３ｘＦｌａｇ　ｍＲＮＡとｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒもしくはｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をプロトコルに従い細胞に導入した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬの０．２５％　ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡで３７℃、５分処理した。その後、１００μＬの培地を加え懸濁することで細胞を剥離した。細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブに回収後、２００ｘｇ、４℃で５分遠心して上清を除去した。ＰＢＳで洗浄後、再度遠心と上清の除去を行った。５０μＬのＭ－ＰＥＲカクテル（Ｍ－ＰＥＲ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＰＭＳＦ）を加えて、細胞を溶解した。１４０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心した後、上清を回収、ＢＣＡアッセイをＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてプロトコルに従い行なった。タンパク質を０．５ｍｇ／ｍＬに希釈後、Ｗｅｓ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）により解析を行なった。Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）は１：１０に、ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）は１：５００で希釈した。一次抗体の検出には、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅとａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いた。
　図１２は、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後の代表的なウェスタンブロットの画像（Ｗｅｓにより得られたｖｉｒｔｕａｌ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔの画像）であり、ＡｃｒｌｌＡ４発現をＷｅｓにより検出した結果を示す。本実施例では、ＡｃｒｌｌＡ４を検出するため、３ｘＦｌａｇをＡｃｒｌｌＡ４に融合した。また、ＧＡＰＤＨをコントロールとして使用し、実験は３回行った。
レーン：Ｍ，分子量マーカー；１，ＡｃｒｌｌＡ４＿３ｘＦｌａｇ　ｍＲＮＡ；２，Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４＿３ｘＦｌａｇ　ｍＲＮＡ＋Ｈ２Ｏ；３，Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４＿３ｘＦｌａｇ　ｍＲＮＡ＋ｍｉＲ－２１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；４，Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４＿３ｘＦｌａｇ　ｍＲＮＡ＋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；５，Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ
　この研究では、Ｃａｓ９レギュレータとしてのｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチを構築し、活性が高いｍｉＲＮＡに応答して標的遺伝子を切断し、または活性化した。ｍＲＮＡとして送達されるＡｃｒｌｌＡ４はＣａｓ９活性を効率的に抑制したため（図２Ａ～Ｃ）、ｍｉＲＮＡによるＡｃｒｌｌＡ４の制御は細胞状態に応じたゲノムの編集及び活性化のための魅力的な手段となりうる。入力ｍｉＲＮＡが存在しない場合、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチはＡｃｒｌｌＡ４を発現してＣａｓ９またはｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性を効率的に抑制し、ＯＦＦ状態とした。一方、標的ｍｉＲＮＡが存在すると、ＡｃｒｌｌＡ４の発現を抑制し、Ｃａｓ９または　ｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性を上方制御するＯＮ状態を形成した。Ｈｉｒｏｓａｗａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．（非特許文献２）に開示された従来のＣａｓ９－ＯＮスイッチシステムは、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡと、Ｃａｓ９の翻訳を抑制するＬ７Ａｅ　ｍＲＮＡの二種類のｍＲＮＡを用いるものであった。この従来のシステムと比較して、本発明のｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチは、ＯＦＦ状態におけるＣａｓ９のリーク発現を減少させた。ＡｃｒｌｌＡ４とＣａｓ９の相互作用がＣａｓ９活性を効率的にブロックしたと考えられる。一方、従来のＬ７Ａｅを用いた制御システムでは、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡとＬ７Ａｅ　ｍＲＮＡの二種類のｍＲＮＡをコトランスフェクションしたため、Ｃａｓ９の翻訳を完全にはシャットダウンすることができなかったと考えられる。さらに、入力ＡｃｒｌｌＡ４の量及び安定性を変化させることによるＡｃｒｌｌＡ４の制御は、ＯＮ状態のパフォーマンスを向上させることができた。
　［実験方法］
　［プラスミドの構築］
　全ての　ＰＣＲ　反応は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて実施し、全てのＰＣＲ産物は、Ｍｉｎ　Ｅｌｕｔｅ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ライゲーションには、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。全てのプラスミド　ＤＮＡはＥ．　ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＤＨ５α中で増殖し、Ｊｅｔｓｔａｒ　ｐｌａｓｍｉｄｅ　Ｍｉｄｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）またはＱＩＡＧＥＮ　ｐｌａｓｍｉｄｅ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造者の指示に従い精製した。プライマーとオリゴヌクレオチドの番号は、以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［ｐＵＣ１９－ＡｃｒｌｌＡ４］
　ＡｃｒｌｌＡ４の合成は、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＩＤＴ）に委託した。このフラグメントは、制限酵素ＳｍａＩで消化することによりｐＵＣ１９ベクターに直接ライゲートした。
　［ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ］
　ＡｃｒｌｌＡ４　を含むＤＮＡフラグメントは、ｐＵＣ１９－ＡｃｒｌｌＡ４から、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２を用いてＰＣＲにより増幅した。フラグメントは、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＳｐｈｃＣａｓ９－ｉＰ－Ａ（堀田秋津博士より提供を受けた）のＥｃｏＲＩサイトと、ＳａｌＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ＥＦα－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａを生成した。
　［ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａ］
　ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａは、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａから、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔを用い、製造者（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコルに従って構築した。変異を導入するために、ｉＰＣＲ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．３及びｉＰＣＲ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．４を用いた。
　［ｐＨＬ－ＥＦ１α－ｍｉＲ＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ：ｍｉＲ＝Ｔ２１、Ｔ３０２ａ、４ｘＴ２１］
　ｍｉＲＮＡ標的部位を含むそれぞれのＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．５、　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．６、及びｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｎｏｓ．７、８、９を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｎｏ．７はＴ２１、ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｎｏ．８はＴ３０２ａ、ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｎｏ．９は、４ｘＴ２１に対応する。
　ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａは、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１０、及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１１を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。得られたインサートおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
　［ｐＨＬ－ＥＦ１α－Ｍ９＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ　及び　ｐＨＬ－ＥＦ１α－Ｔ２１＿Ｍ９＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ］
　Ｍ９を含むＤＮＡフラグメントは、ｐＡｐｔａｍｅｒＣａｓｓｅｔｔｅ－ｔａｇＢＦＰ－Ｍ９（ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）から、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１２及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１３を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ及びｐＨＬ－ＥＦ１α－Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａは、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１４、及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１５を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。Ｍ９　ｆｒａｇｍｅｎｔおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
　［ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ］
　標的遺伝子であるＥＧＦＰを含むＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１６及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＤＭＤ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ（堀田秋津博士より提供を受けた）のＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨを生成した。
　［ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ］
　標的遺伝子であるＴＲＥを含むＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１７及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨのＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨを生成した。
　［ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［Ｔａｒｇｅｔ］－ｍＥＦ１α－ｉＲＦＰ６７０－ＲｉＨ：Ｔａｒｇｅｔ＝ＴＲＥ及びＥＧＦＰ］
　ｉＲＦＰ６７０を含むＤＮＡフラグメントは、ｐｉＲＦＰ６７０－Ｎ１（Ａｄｄｇｅｎｅ，　ｐｌａｓｍｉｄ　＃４５４５７，Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ　ＤＭ，Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ　ＶＶ．（２０１３）Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｍａｇｉｎｇ．　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０：７５１－７５４）から、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．１９及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２０を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ　及び　ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨのＥｃｏＲＶサイトとＡｖｒＩＩサイトの間に挿入し、ｉＲＦＰ６７０をｍＲＦＰに置き換えた。
　［ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１］
　ｈｍＡＧ１を含むＤＮＡフラグメントは、ｐ５’ＲＴＭ－ｈｍＡＧ１（ｄｅｌｔａｐＡ）－ＡＢＨＤ１２Ｂｅｘｏｎ１３（ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）から、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２
１及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２２を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩサイトとＥｃｏＲＶサイトの間に挿入し、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１を生成した。
　［ＰＢ－ＴＲＥ＿ｈｍＡＧ１］
　ＴＲＥ－ＡＧ１含むＤＮＡフラグメントは、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１から、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２３及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２４を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＢ－ＴＲＥ－ＩＲＥＳ－ＡＧ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．（２０１７）　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｌｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１２８：１２１－１３５．）は、ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２５及びｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２６を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。得られたＤＮＡフラグメントおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
　［インヴィトロトランスフェクション（ＩＶＴ）のためのＤＮＡテンプレート］
　ｍｉＲＮＡ標的部位を持たない５’－ＵＴＲ（コントロール５’－ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲは、合成オリゴＤＮＡをハイブリダイズすることにより伸長した。Ｃａｓ９蛋白質及びＡｃｒｌｌＡ４蛋白質コード領域は、それぞれ、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＳｐｈｃＣａｓ９－ｉＰ－Ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ，　ｐｌａｓｍｉｄ　＃６０５９９）及びｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａから、適切なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ蛋白質コード領域は、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａから増幅した。プラスミドＤＮＡは、ＤｐｎＩにより除去した。５’－ＵＴＲ、蛋白質コード領域、及び３’－ＵＴＲを融合して、ＩＶＴのためのＣａｓ９　ｍＲＮＡ及びＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡのテンプレートをさらなるＰＣＲ反応により構築した。ｓｇＲＮＡテンプレートは、Ｈｉｒｏｓａｗａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．（非特許文献２）に記載の方法により構築した。全てのＰＣＲ反応は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて実施し、全てのＰＣＲ産物は、Ｍｉｎ　Ｅｌｕｔｅ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応のためのプライマーとテンプレートの組み合わせは、以下の表２、３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
 
　［Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ、ＡｃｒｌｌＡ４－ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの合成及び精製］
　全てのｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて生成した。長いＲＮＡにより引き起こされるインターフェロン応答を減少するために、天然のウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に代えて、それぞれ、ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ－５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ－５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。グアノシン５’三リン酸は、ＩＶＴ反応の前に、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＴｒｉＬｉｎｋ　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５倍希釈した。ｓｇＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて構築した。ｓｇＲＮＡの調整には天然の塩基、例えば、ｒＮＴＰ等を使用した。ＤＮＡテンプレートを除去するために、サンプルをＴＵＲＢＯ　ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、３７℃で３０分処理した。次いで、ＦａｖｏｒＰｒｅｐ　Ｂｌｏｏｄ／Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて生成し、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で３７℃で３０分インキュベートし、ＲＮｅａｓｙ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて再び精製した。ｓｇＲＮＡは、さらに精製するために電気泳動し、８．３Ｍのウレアを含む１０％ポリアクリルアミドゲルから抽出し、エタノール沈殿した。
　［ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの配列］
　使用したｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの配列の配列は以下表４のとおりである。表４中、オープンリーディングフレームはボールド体で表し、開始コドン及び終始コドンは四角で囲った。ｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的配列並びにｓｇＲＮＡ上の標的遺伝子に認識される配列は、下線を付した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　［ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞株の生成］
　ＨｅＬａ　ＣＣＬ２　細胞（ＡＴＣＣ）は、２４ウェルプレートに播種した（２．５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。２５０ｎｇの　ＰＢ－ＴＲＥ＿ｈｍＡＧ１（配列番号５６）及び２５０ｎｇのｐＣＡＧ－ＰＢａｓｅは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００トランスフェクション試薬を用い、製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のプロトコルに従って、細胞にコトランスフェクションした。細胞は６ウェルプレートで継代し、培養し、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）により選択した。
　［細胞培養］
　ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞は、１０％　ＦＢＳ（ＪＢＳ）を添加したＤＭＥＭ　Ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｋａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）で培養した。ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞は、１０％　ＦＢＳ（ＪＢＳ）、０．１ｍＭ　ＭＥＭ－ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ　Ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｋａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）で培養した。ｉＰＳ＿ＥＧＦＰ（ＡＡＶＳ１－ＣＡＧ：：ＧＦＰ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ，Ｗｏｌｔｊｅｎ　Ｌａｂ（ＣｉＲＡ，　Ｋｙｏｔｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）はＳｔｅｍＦｉｔ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）培地を用いてラミニンコート｛ｌａｍｉｎｉｎ－５１１　Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ，ｎｉｐｐｉ）｝したプレートで培養した。全ての細胞株は、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で培養した。
　［Ｃａｓ９活性アッセイ（ＥＧＦＰノックアウトアッセイ）］
　ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞は、２４ウェルプレートに播種した（５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＡｃｒｌｌＡ４　ｍＲＮＡ、ヒト　ｍｉＲＮＡ－２１－５ｐ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ネガティブコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，　ｏｐｔｉｏｎａｌ）、及びヒトｍｉＲＮＡ－３０２ａ－５ｐ　ｍｉｍｉｃ／ネガティブコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｏｐｔｉｏｎａｌ）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬を用い、　製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のプロトコルに従って、細胞にトランスフェクションした。フローサイトメトリー分析の前に細胞を、ＣＣＤカメラを備えたＩＸ　８１　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によりキャプチャーした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下にて５分間処理した。次いで、１００μＬの培地を添加し、剥離した細胞を懸濁した。サンプルはＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターで、ＦＬ－１（５３０／３０ｎｍ）フィルターを用いて分析した。ヒストグラム（ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ）またはドットプロット（ｉＰＳ－ＥＧＦＰ）から、ＥＧＦＰ陰性及び陽性細胞集団をゲーティングした。ＥＧＦＰ陰性細胞集団は、Ｃａｓ９によるＥＧＦ遺伝子ノックアウトが成功したものに対応し、ＥＧＦＰ陽性細胞集団は、Ｃａｓ９によるＥＧＦ遺伝子ノックアウトが失敗したものに対応する。
　［ｄＣａｓ９－ＶＰＲ活性化アッセイ（ｈｍＡＧ１活性化アッセイ）］
　ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞は、２４ウェルプレートに播種した（５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ　プラスミド、ｓｇＲＮＡ　プラスミド、ＡｃｒｌｌＡ４プラスミド、ヒトｍｉＲ－２１－５ｐ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ネガティブコントロール（ｏｐｔｉｏｎａｌ）、及びヒトｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ　ｍｉｍｉｃ／ネガティブコントロール（ｏｐｔｉｏｎａｌ）はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００　トランスフェクション試薬を用い、製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の指示に従って、細胞にトランスフェクションした。フローサイトメトリー分析の前に細胞をＣｙｔｅｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりキャプチャーした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下にて５分間処理した。次いで、１００μＬの培地を添加し、剥離した細胞を懸濁した。サンプルはＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメーターで、９９％　ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎのＦＬ－１（５３０／３０ｎｍ）及びＦＬ－４（６７５／２５　ｎｍ）フィルターを用いて分析した。トランスフェクトされた細胞を決定するために、ｉＲＦＰ６７０陽性細胞集団をゲーティングした。次いで、ｈｍＡＧ１陽性及び陰性細胞集団をゲーティングした。ｈｍＡＧ１陽性細胞集団は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲによるｈｍＡＧ１遺伝子活性化が成功したものに対応し、ｈｍＡＧ１陰性細胞集団は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲによるｈｍＡＧ１遺伝子活性化が失敗したものに対応する。
　［統計分析］
　統計分析には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ検定及びＷｅｌｃｈ’ｓ　ｔ検定を用いた。有意性のレベルは、以下のように示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ検定及びＷｅｌｃｈ’ｓ　ｔ検定は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて実施した。

Claims (11)

  1. 　標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、
    　（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
    　（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
    　（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡとを、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
    　（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
    　（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
    を含み、
    　前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
  2. 　前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
    　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
    　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）が、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターを使用することなく、合成ＲＮＡ分子の形態で細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの非翻訳領域に複数含まれる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記第２蛋白質が、Ｎ末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、請求項２または３に記載の方法。
  7. 　標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御するキットであって、
    　（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
    　（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
    　（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
    を含み、当該ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
    　（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
    　（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
    を含み、
    　前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、キット。
  8. 　前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
    　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項７に記載のキット。
  9. 　前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
    　前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項７に記載のキット。
  10. 　前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、５’－ＵＴＲに複数含まれる、請求項７～９のいずれか１項に記載のキット。
  11. 　前記第２蛋白質が、N末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、請求項８または９に記載のキット。 
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019034784A1 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 Universität Heidelberg USE OF ANTI-CRISPRANT POLYPEPTIDES FOR THE SPECIFIC ACTIVATION OF NUCLEASES CASES

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019034784A1 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 Universität Heidelberg USE OF ANTI-CRISPRANT POLYPEPTIDES FOR THE SPECIFIC ACTIVATION OF NUCLEASES CASES

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAVEZ A. ET AL.: "Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming", NATURE METHODS, vol. 12, no. 4, 2015, pages 326 - 328, XP055694813, DOI: 10.1038NMETH.3312 *
HIROSAWA M. ET AL.: "Cell-type-specific genome editing with a microRNA- responsive CRISPR-Cas9 switch", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 45, no. 13, 2017, pages e118, XP055534718, DOI: 10.1093/nar/gkx309 *
JOOYOUNG LEE, MOU HAIWEI, IBRAHEIM RAED, SHUN-QING LIANG , PENGPENG LIU, WEN XUE, SONTHEIMER ERIK J: "Tissue-restricted genome editing in vivo specified by microRNA-repressible anti-CRISPR proteins", RNA, vol. 25, no. 11, 22 August 2019 (2019-08-22), pages 1421 - 1431, XP055766674 *
MAREIKE D HOFFMANN; SABINE ASCHENBRENNER; STEFANIE GROSSE; KLEOPATRA RAPTI; CLAIRE DOMENGER; JULIA FAKHIRI; MANUEL MASTEL; KATHLEE: "Cell -specific CRISPR-Cas9 activation by microRNA- dependent expression of anti-CRISPR proteins", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 47, no. 13, 15 April 2019 (2019-04-15), pages e75, XP055646332, DOI: 10.1093/nar/gkz271 *
MOE HIROSAWA, YOSHIHIKO FUJITA, HIROHIDE SAITO: "Cell-type-specific CRISPR activation with microRNA- responsive AcrIIA4 switch", ACS SYNTH. BIOL., vol. 8, 3 July 2019 (2019-07-03), pages 1575 - 1582, XP055766664, DOI: 10.1021/acssynbio.9b00073 *

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