TW202128193A - 一種基於ｌｅａｐｅｒ技術治療ｍｐｓ ｉｈ的方法和組合物 - Google Patents

一種基於ｌｅａｐｅｒ技術治療ｍｐｓ ｉｈ的方法和組合物 Download PDF

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Abstract

本申請涉及一種基於LEAPER技術靶向編輯RNA的方法，其包括利用LEAPER技術安全有效地進行RNA上由腺苷到次黃嘌呤鹼基的體內編輯，精准地修復致病的突變位點，實現治療所有由於G＞A突變導致的疾病，例如MPS IH的目的。

Description

一種基於LEAPER技術治療MPS　IH的方法和組合物
本申請屬於基因編輯治療領域，具體地，涉及一種基於LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)技術靶向編輯RNA治療MPS IH的方法，其包括利用LEAPER技術進行RNA上由A到I鹼基的體內位點定向編輯，來治療由於G＞A突變導致的疾病，例如MPS IH。
赫勒氏綜合征(Hurler syndrome)，又稱粘多糖貯積症IH型(Mucopolysaccharidoses IH，MPS IH)，或稱粘多糖病 IH，是MPSI型三種亞型IH、IH/S、IS中最嚴重的一種，它是由於該病患者體內α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase，IDUA)缺乏而引起的一種致殘、致死性的遺傳性代謝病，為常染色體隱性遺傳病(autosomal recessive，AR)。導致赫勒氏綜合征的根本原因，是位於人4號染色體上4p16.3編碼IDUA蛋白的IDUA 基因突變導致的，到目前為止它的致病突變有200多種，其中最為常見的一種類型是位於α-L-艾杜糖醛酸苷酶cDNA上1205位G到A的突變，該突變導致原本的色氨酸變為終止密碼子，進而使最終翻譯出來的蛋白上缺乏該位元點之後的全部氨基酸(NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter))而喪失IDUA全部酶活性。該突變類型可占到總發病人群的63%（Worldwide distribution of common IDUA pathogenic variants，Poletto, Edina  (2018). Clinical Genetics. 94. 10.1111/cge.13224.）。α-L-艾杜糖醛酸酶是負責細胞溶酶體(lysosomes)內葡糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)降解的。Hurler綜合征的病人個體間差異較大，出生時可為正常，3-6個月時最早出現的徵兆為面部輪廓粗糙，隨後出現額骨突出、骨骼畸形、生長停滯、語言障礙等症狀，病人通常活不過10歲。
赫勒氏綜合征沒有治癒方法，已知目前批准了兩種治療方法：酶替代療法(ERT)和造血幹細胞移植(HSCT)。ERT在內臟表型方面取得了良好的效果，包括減少肝臟大小，呼吸功能改善，患者活動性全面改善。不利的是，它不能到達中樞神經系統，因此不能阻止認知障礙。另一方面，成功的HSCT可預防大多數臨床症狀，包括神經系統症狀，但必須在出現臨床症狀前進行治療(最好在8個月大之前)，但是由於這種治療方法的死亡率高所以只適用於病情嚴重的患者(Combination of enzyme replacement and hematopoietic stem cell transplantation as therapy for Hurler Syndrome. Tolar, J  (2008). Bone marrow transplantation. 41. 531-5. 10.1038/sj.bmt.1705934)。
目前，在研究的基因編輯技術治療赫勒氏綜合征的原理是利用鋅指核糖核酸酶 (zinc finger nuclease，ZFN)和腺相關病毒 (Adeno-associated virus，AAV)將編碼正常IDUA蛋白的cDNA序列定點插入到肝細胞的基因組中，但這種方法仍舊無法解決赫勒氏綜合征中大腦骨骼等系統的症狀，另外DNA編輯所產生的脫靶(off-target)是需要高度關注的問題。
理論上，近年來正在飛速發展的基因組編輯技術CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)也可以用來治療赫勒氏綜合征。許多科研工作者和生物技術公司也在致力於將該技術推上臨床。例如，2019年9月，首次報導了利用CRISPR技術編輯幹細胞並將其回輸至患者，以治療其愛滋病和白血病的臨床實驗結果，為CRISPR技術在基因治療方向的轉化做出了巨大的貢獻。儘管CRISPR技術存在極大的潛在應用前景，但該技術也存在一系列缺陷，導致該技術從科研階段向臨床治療應用中的轉化步履維艱。問題之一便是CRISPR技術用到的核心作用酶：Cas9。基於CRISPR的DNA編輯技術，必須通過外源表達Cas9或擁有相似功能的其它核酸酶，從而造成了以下幾個問題。首先，通常需要外源表達的核酸酶通常具有較大分子量，這使得通過病毒載劑將其遞送至體內的效率急劇下降。其次，由於核酸酶的外源表達，使得其存在潛在的核酸酶脫靶可能，這將使得其應用中具有潛在的致癌風險。最後，外源表達的核酸酶是從細菌中發現的，而非人類或哺乳動物天然存在的，這使得其可能引起患者體內的免疫反應，這一方面可能會對患者自身造成損傷，另一方面也可能會使外源表達的核酸酶被中和，從而失去應有的活性，或者阻礙進一步的干預治療。
2017年，張鋒課題組曾報導一種名為REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement )的RNA編輯技術(RNA editing with CRISPR-Cas13，Cox et al., 2017)，該技術通過外源表達Cas13-ADAR融合蛋白及單獨嚮導RNA (single guide RNA, sgRNA)同樣可以實現靶向目標RNA的A到I的編輯，但是該方法同CRISPR技術一樣，仍需要外源蛋白的表達。無法解決外源蛋白表達造成的問題。
2019年1月，Thorsten Stafforst課題組曾報導一種名為RESTORE核酸編輯技術(recruiting endogenous ADAR to specific trans for oligonucleotide-mediated RNA editing, Merkle et al., 2019)。該技術能夠擺脫對外源蛋白的依賴。但首先RESTORE技術需要在IFN-γ存在的前提下才能有較高的編輯效率，而IFN-γ是決定自體免疫發展和嚴重程度的關鍵因數(Interferon-γ and systemic autoimmunity, Pollard et al., 2013，這使得該技術在醫學領域的應用大打折扣。另一方面，RESTORE技術中同樣也用到一段嚮導RNA，而其使用的嚮導RNA是化學合成的寡核苷酸，並且其合成的寡核苷酸需要人為引入大量的化學修飾以保證其穩定性。
2019年，PCT/CN2019/110782和PCT/CN2020/084922申請提供了一種工程改造的RNA，其與靶轉錄物部分互補以募集天然ADAR1或ADAR2以在靶標RNA中的特定位點將腺苷變為肌苷，該方法稱為“LEAPER(Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)”(利用內源性ADAR進行RNA的可程式設計編輯)，而募集ADAR的RNA可稱為“dRNA”或“arRNA”。該dRNA包含與靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述dRNA能夠募集作用於RNA的腺苷脫氨酶(ADAR)以使靶標RNA中的靶標腺苷(A)脫氨基。
本申請針對Hurler綜合征IDUA致病基因中的G到A的突變，尤其是占比最高的突變型(NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter))提供了一種全新的技術方案使其能夠精准地在靶標RNA上編輯突變位點。
具體地，本申請提供了至少以下技術方案：
1. 一種基於LEAPER技術靶向編輯靶標細胞中靶標RNA的方法，其中所述靶標RNA為IDUA基因轉錄本中含有G到A突變的RNA，該方法包括： 將包含用於編輯靶標RNA的腺苷脫氨酶募集RNA(arRNA)或編碼所述arRNA的構建體遞送至所述靶標細胞，其中所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠募集作用於RNA的腺苷脫氨酶（ADAR）以使靶標RNA中的靶標腺苷(A)脫氨基。
2. 如項1中所述的方法，其中所述arRNA引入與靶標A配對的鹼基C、A、U或G。
在一些實施方案中，所述arRNA引入與靶標A配對的鹼基C。在一些實施方案中，所述arRNA引入與靶標A配對的鹼基A。在一些實施方案中，所述arRNA引入與靶標A配對的鹼基U。
3. 如項1-2中任一項所述的方法，其中所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。本申請公開和涵蓋所述數字範圍內的任何自然數。
4. 如項3中所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15n或24nt-11nt。本申請公開和涵蓋所述數字範圍內的任何自然數。
5. 如項3或4中所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt。本申請公開和涵蓋所述數字範圍內的任何自然數。
6. 如項1-5中所述的方法，其中所述靶標細胞是人的細胞。
7. 項1-6中任一項的方法，其中所述靶標RNA為包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的RNA。
8. 項1-7中任一項的方法，其中所述arRNA包含以下的序列：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：34。
9. 如項1-5中任一項所述的方法，其中所述arRNA包含選自由下列序列組成之群組：：SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：52。
10. 如項1-9中任一項所述的方法，其中所述arRNA是經化學修飾的。
11. 如項10中所述的方法，其中所述化學修飾包含2-O’-甲基化（2`-OMe）或硫代磷酸酯修飾。
12. 如項11中所述的方法，其中所述化學修飾選自由下列組成之群組中的一項或多項： 序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾， 前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接， 序列中全部U均被2`-OMe修飾， 靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A， 靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C， 靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接， 前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，和 前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。
在一些具體實施方案中，所述化學修飾選自由下列組成之群組中的一項或多項： CM1：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時序列中全部U均被2`-OMe修飾； CM2：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A； CM3：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C； CM4：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接；以及 CM6：序列前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，並且前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。
13. 如項1-9中任一項所述的方法，其中所述編碼所述arRNA的構建體為線性核酸鏈、病毒載劑或質粒。
14. 如項13中所述的方法，其中所述病毒載劑為腺相關病毒(AAV)載劑或慢病毒表達載劑。
15. 如項1-14中任一項所述的方法，其中所述遞送方式為電轉染、脂質體轉染、脂質-奈米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)遞送或感染。
16. 如項15中所述的方法，通過LNP將包含用於編輯靶標RNA的腺苷脫氨酶募集RNA(arRNA)或編碼所述arRNA的構建體遞送至所述靶標細胞。
17. 如項1-16中任一項所述的方法，其中所述arRNA的遞送濃度≥2.5，≥5nM，≥10nM，≥15nM，或≥20nM。
在上述實施方案中，所述靶標細胞包括肝細胞或成纖維細胞。
18. 一種用於通過LEAPER技術靶向編輯靶標細胞中靶標RNA的arRNA或其編碼序列，所述arRNA包含如下任一序列或由如下任一序列組成：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：52。
19. 包含項18所述arRNA或其編碼序列的質粒、病毒載劑、脂質體或脂質奈米顆粒。
20. 包含項18所述arRNA或其編碼序列、或項19所述質粒、病毒載劑、脂質體或脂質奈米顆粒的組合物、製劑、套組或生物製品。
21. 一種治療個體中MPS IH的方法，包括用項1-17中任一項所述的方法校正所述個體的靶標細胞中與MPS IH疾病相關的G到A的突變。
22. 項20的方法，其中所述突變為NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變。
23. 如項20或21所述的方法，其中所述arRNA的使用頻次為≥21天/次、≥17天/次、≥14天/次或≥10天/次。
在一些實施方案中，本申請還涉及選自由下列組成之群組中的序列在製備治療MPS IH疾病的藥物中的用途：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：52。
利用本申請的技術方案，可以安全有效地進行靶細胞（例如肝細胞或成纖維細胞）內RNA上由A到I鹼基的體內編輯，精准地修復致病的突變位點，例如NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變，恢復由RNA編碼的蛋白在體內的正常表達，實現治療MSP IH的目的。
定義
RNA編輯是指存在於真核細胞中的一種天然過程，RNA編輯是在DNA轉錄之後，蛋白質翻譯之前在RNA水準上發生的由鹼基A(腺嘌呤)到I(次黃嘌呤)的編輯，次黃嘌呤在翻譯的過程中被識別為G，RNA中A到I的編輯使轉錄組多樣化。通過位元點特異和精確改變RNA分子的方式將RNA的全部數量增加幾倍。這種編輯是被ADAR(Adenosine Deaminase Acting on RNA)蛋白酶催化產生的，被稱為位點定向RNA編輯。編輯可以發生的編碼區包括內含子和外顯子序列，也可以發生在非編碼區序列，編碼區的編輯可以重新定義蛋白質編碼序列。
如本文所用，“LEAPER技術”即通過使用工程化RNA募集內源性ADAR進行RNA編輯的技術，是指如WO2020074001A1中所報導的RNA編輯技術。所述工程化RNA即腺苷脫氨酶募集RNA（arRNA），如本文所用，是指能通過招募ADAR或某些包含ADAR結構域的複合物在RNA中使靶標腺苷脫脫氨基的RNA。
如本文所用，術語“腺苷脫氨酶（ADAR）”是指是一類在真核生物（包括人等哺乳動物）各組織中廣泛表達的腺苷脫氨酶，能夠催化RNA分子中腺苷A到肌苷I的轉換。而I在真核生物蛋白質合成過程中，通常被當做G進行翻譯。
如本文所用，核酸的“互補”是指一條核酸通過傳統的Watson-Crick鹼基配對與另一條核酸形成氫鍵的能力。百分比互補性表示核酸分子中可與另一核酸分子形成氫鍵(即，Watson-Crick鹼基配對)的殘基的百分比(例如，10個中的約5、6、7、8、9、10 個分別為約50%，60%，70%，80%，90%和100%互補)。“完全互補”是指核酸序列的所有連續殘基與第二核酸序列中相同數量的連續殘基形成氫鍵。如本文所用，“基本上互補”是指在約40、50、60、70、80、100、150、200、250或更多個核苷酸的區域內，至少約70%，75%，80%，85%，90%，95%，97%，98%，或99%中的任何一個的互補程度，或指在嚴格條件下雜交的兩條核酸。對於單個鹼基或單個核苷酸，按照Watson-Crick鹼基配對原則，A與T或U、C與G或I配對時，被稱為互補或匹配，反之亦然；而除此以外的鹼基配對都稱為不互補或不匹配。
“雜交”是指其中一種或多種多核苷酸反應形成複合物的反應，所述複合物通過核苷酸殘基的鹼基之間的氫鍵穩定。所述氫鍵可以通過Watson Crick鹼基配對，Hoogstein結合或以任何其他序列特異性的方式發生。能夠與給定序列雜交的序列稱為給定序列的“互補序列”。
如本文所用，術語“電轉染”即電穿孔轉染技術，其通過電場作用於細胞幾微秒到幾毫秒之後，在細胞膜上暫時形成小孔或開口，把大分子如DNA等遞送至細胞的技術。
如本文所用，術語“脂質體轉染（Lipo）”是指以脂質體作為體內和體外輸送載劑的轉染技術。脂質體包括中性脂質體和陽離子脂質體，其中中性脂質體是利用脂質膜包裹大分子，例如核酸，借助脂質膜將所述大分子遞送至細胞膜內；陽離子脂質體帶正電荷，其轉載的大分子並沒有預先包埋其中，而是由於所述大分子本身帶負電荷而自動結合到帶正電的脂質體上，形成大分子-陽離子脂質體複合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被遞送入細胞。
如本文所用，術語“脂質-奈米顆粒（LNP）遞送”是指將大分子，例如核酸、蛋白質等物質通過脂質奈米顆粒向細胞內進行跨膜遞送。其中，脂質奈米顆粒是指由兩相混合合成的顆粒包括含有可電離脂質、輔助磷脂、膽固醇和PEG脂的乙醇相和含有核酸、蛋白質等大分子的酸性水相。例如，包裹有RNA的LNP可通過內吞進入細胞質內。
在本文中，NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變是指IDUA基因編號000203.4的轉錄本中，1205位的G至A的突變，所述突變導致所述轉錄本翻譯的肽鏈的402位色氨酸（Trp）編碼序列轉變為終止密碼子（Ter），使得最終翻譯的氨基酸缺失了402位元之後的全部氨基酸，從而喪失IDUA的酶活性。發生這一突變的患者會因為缺乏具有活性的α-L-艾杜糖醛酸酶而影響細胞溶酶體內葡糖胺聚糖的降解，最終對患者致畸甚至致死。而本申請中的方案可通過在轉錄水準逆轉這一突變，恢復IDUA酶的活性。
如本文所用，術語“靶標RNA”是指待編輯的目標RNA，其包含待編輯的腺苷（A）。所述靶標RNA可以是成熟的mRNA，也可以是mRNA前體。在本申請中更佳mRNA前體。在本文中，包含所述“靶標RNA”的細胞稱為靶標細胞。所述待編輯的腺苷稱為“靶標鹼基”，“靶標腺苷”或“靶標A”。在本申請中，“靶標鹼基”，“靶標腺苷”或“靶標A”可以互換使用。在靶標RNA的5’端與靶標腺苷相鄰的鹼基稱為“5’相鄰鹼基”；在靶標RNA的3’端與靶標腺苷相鄰的鹼基稱為“3’相鄰鹼基”；靶標鹼基及其3’和5’ 相鄰鹼基組成的鹼基三聯體在本文中被稱為“靶標鹼基三聯體”。當arRNA與靶標RNA雜交時，在arRNA上與所述靶標鹼基相對的鹼基稱為“靶向鹼基”，在arRNA的5’端與靶向鹼基相鄰的鹼基稱為“5’最近鄰鹼基”；在arRNA的3’端與靶向鹼基相鄰的鹼基稱為“3’最近鄰鹼基”；靶向鹼基及其3’和5’最近鄰鹼基組成的鹼基三聯體在本文中被稱為“靶向鹼基三聯體”。
如本文所用，術語“構建體”是指包含某一核酸序列的核酸載劑，所述核酸載劑可以是線性核酸分子、質粒或病毒載劑等。所述核酸分子可以是單鏈也可以是雙鏈分子。所述核酸序列可以是DNA序列也可以是RNA序列。在一些實施方案中，所述核酸序列不經過轉錄、翻譯或表達而直接發揮其功能。在一些實施方案中，所述核酸序列為DNA序列，其經過轉錄形成RNA後以RNA分子形式發揮功能。在一些實施方案中，所述核酸序列為RNA，其經過翻譯後以多肽或蛋白質的形式發揮作用。在一些實施方案中，所述核酸序列為DNA，其經過轉錄和翻譯步驟形成蛋白質後以蛋白質的形式發揮功能。所述構建體可以通過包裝為病毒、脂質奈米顆粒或外泌體等形式進入靶標細胞，亦可以通過電轉化、顯微注射、化學轉化等方式進入靶標細胞。
如本文所用，術語“遞送”是指將核酸、蛋白等生物大分子通過某些途徑從細胞膜外引入細胞膜內。所述“遞送”例如電轉染、脂質體轉染、脂質-奈米顆粒遞送、病毒遞送、外泌體遞送等方式。
本申請所用術語“修飾”是指通過化學或生物學方法，例如基因工程方法改變核酸或蛋白的組成或結構，從而使所述核酸或蛋白的一項或多項特性或功能發生改變。
除非本文另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。
RNA 編輯方法
本申請提供了一種基於LEAPER技術靶向編輯靶標細胞中含有G到A突變的IDUA靶標RNA的方法，其包括：將包含用於編輯靶標RNA的腺苷脫氨酶募集RNA(arRNA)或編碼所述arRNA的構建體遞送至所述靶標細胞，其中所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠募集作用於RNA的腺苷脫氨酶（ADAR）以使靶標RNA中的靶標腺苷(A)脫氨基。在一些實施方案中，所述靶標RNA是mRNA前體。在一些實施方案中，所述靶標RNA是成熟mRNA。在一些實施方案中，所述靶標RNA為轉錄有包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的IDUA靶標RNA。
在一些實施方案中，所述arRNA包含與靶標A配對的鹼基C、A、U或G。所述與靶標A配對的鹼基較佳順序為C、A、U、G。即在arRNA長度一致、靶向鹼基距離5’端的距離一致、靶向鹼基距離3’端的距離一致、並且除靶向鹼基以外的arRNA序列完全一致的情況下，靶向鹼基的較佳順序為C＞A＞U＞G。當所述靶向鹼基為C時，所述arRNA可以表示為X nt-c-Y nt，其中X表示所述靶向鹼基距離arRNA的5’端的距離為X nt，Y表示所述靶向鹼基距離arRNA的3’端的距離為Y nt，其中X和Y可以表示任何自然數。
在一些實施方案中，所述靶標細胞是真核細胞。在一些實施方案中，所述靶標細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述靶標細胞是肝細胞或成纖維細胞。在一些實施方案中，所述靶標細胞是人或小鼠細胞。
在一些實施方案中，所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15n或24nt-11nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt。其中，所述靶向鹼基距離3’端的長度是指將靶向鹼基的3’最近鄰鹼基至3’最末端鹼基的所有鹼基個數；所述靶向鹼基距離5’端的長度是指靶向鹼基的5’最近鄰鹼基至5’最末端鹼基的所有鹼基個數。
在一些實施方案中，所述靶標細胞是人的細胞，且其中所述靶標RNA為轉錄有包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的IDUA靶標RNA，則所述arRNA的全長≥66nt，例如長約121-66 nt、111-66 nt、101-66 nt、91-66 nt或81-66 nt，即所述arRNA的全長選自上述長度範圍的任意自然數，例如：67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、91nt、95nt、100nt、110nt、115nt、120nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt或24nt-11nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離3’端的距離選自上述靶向鹼基距離3’端的長度範圍的任意自然數，例如：12nt、13nt、14nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離5’端的距離選自上述靶向鹼基距離5’端的長度範圍的任意自然數，例如：46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt。在一些實施方案中，所述arRNA包含選自由下列序列組成之群組：：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34。
在一些實施方案中，所述靶標細胞是小鼠細胞（例如W392X小鼠細胞），且其中所述靶標RNA為轉錄有包含與人W402X突變相應的 IDUA突變的靶標RNA。在一些實施方案中，所述靶標細胞為W392X小鼠細胞。在一些實施方案中，所述arRNA長約121-53nt、111-61nt、101-61nt、91-61nt、81-61nt、111-66nt、或105-66nt，即所述arRNA的全長選自上述長度範圍的任意自然數，例如：67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、91nt、95nt、100nt、110nt、115nt、120nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為55nt-10nt或50nt-10nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離3’端的距離選自上述靶向鹼基距離3’端的長度範圍的任意自然數，例如：11nt、12nt、13nt、14nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、35nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離5’端的距離選自上述靶向鹼基距離5’端的長度範圍的任意自然數，例如：33nt、36nt、47nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、60nt、65nt、75nt。在一些實施方案中，所述arRNA包含選自由下列序列組成之群組：：SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：52。
在一些實施方案中，所述arRNA是經化學修飾的。在一些實施方案中，所述化學修飾為2-O’-甲基化和/或硫代磷酸酯修飾。在一些實施方案中，所述化學修飾選自由下列組成之群組中的一項或多項： 序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾， 前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接， 序列中全部U均被2`-OMe修飾， 靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A， 靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C， 靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接， 前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，和 前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。
如本文所述，編碼所述arRNA的構建體即包含所述arRNA編碼序列的構建體。在一些實施方案中，所述arRNA在所述編碼所述arRNA的構建體被遞送入靶標細胞後，由編碼所述arRNA的構建體轉錄而成。在一些實施方案中，所述編碼所述arRNA的構建體為線性核酸鏈、病毒載劑或質粒。在一些實施方案中，所述病毒載劑為腺相關病毒(AAV)或慢病毒。在一些實施方案中，當所述編碼所述arRNA的構建體被遞送入靶標細胞時，其通過同源重組或非同源重組等方式將編碼所述編碼arRNA的序列插入靶標細胞基因組，從而持續轉錄生成所述arRNA。在一些實施方案中，所述編碼所述arRNA的構建體被遞送入靶標細胞時，其使編碼所述arRNA的序列作為游離核酸的一部分存在於靶標細胞中，從而所述編碼所述arRNA的序列可以在一定的時間內轉錄生成所述arRNA。
在一些實施方案中，所述遞送為電轉染、脂質體轉染或脂質-奈米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)遞送或感染。在一些實施方案中，當所述靶標細胞為肝臟細胞時，所述遞送為LNP遞送。在一些實施方案中，當所述靶標細胞為成纖維細胞時，所述遞送為脂質體轉染。在一些實施方案中，所述arRNA的遞送濃度≥2.5-5nM，較佳地≥10-20nM，例如≥15nM。在本申請中，所述遞送濃度是指在將所述arRNA構建體遞送至所述靶標細胞時，一體積單位arRNA與所述靶標細胞所在的遞送體系中所含有的arRNA的量。所述遞送體系包含arRNA或其構建體、靶標細胞及所述arRNA及靶標細胞周圍的液體基質。在一些實施方案中，所述液體基質可以是細胞培養基、PBS或其他可在一定時間內維持細胞穩定生存狀態的，與胞漿等滲的溶液。在一些實施方案中，所述遞送體系還包含可促進遞送的試劑。
arRNA
本申請還提供了一種arRNA，其可用於基於LEAPER技術靶向編輯靶標細胞中的靶標RNA，例如轉錄有包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的靶標RNA，以使靶標RNA中的靶A脫氨基稱為次黃嘌呤I。而在靶標細胞後續的翻譯過程中，I會被識別為G，從而將G＞A的突變恢復為G，使得經arRNA編輯後，靶標RNA可翻譯為正確的蛋白。在一些實施方案中，所述靶標RNA是mRNA前體。在一些實施方案中，所述靶標RNA是成熟mRNA。
在一些實施方案中，所述arRNA引入與靶標A配對的鹼基（靶向鹼基）編輯效率從大到小為C、A、U、G。在一些實施方案中，所述arRNA中除靶向鹼基外，其他鹼基均可與靶標RNA互補配對。在一些實施方案中，所述arRNA中除靶向鹼基外，還有一個或多個鹼基與靶標RNA形成錯配。
在一些實施方案中，所述靶標細胞是真核細胞。在一些實施方案中，所述靶標細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述靶標細胞是肝細胞或成纖維細胞。在一些實施方案中，所述靶標細胞是人或小鼠細胞（例如W392X小鼠細胞）。
在一些實施方案中，所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15n或24nt-11nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt。其中，所述靶向鹼基距離3’端的長度是指將靶向鹼基的3’最近鄰鹼基至3’最末端鹼基的所有鹼基個數；所述靶向鹼基距離5’端的長度是指靶向鹼基的5’最近鄰鹼基至5’最末端鹼基的所有鹼基個數。
在一些實施方案中，所述靶標細胞是人的細胞，且其中所述靶標RNA為轉錄有包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的IDUA靶標RNA，則所述arRNA的全長≥66nt，例如長約121-66 nt、111-66 nt、101-66 nt、91-66 nt或81-66 nt，即所述arRNA的全長選自上述長度範圍的任意自然數，例如：67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、91nt、95nt、100nt、110nt、115nt、120nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt或24nt-11nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離3’端的距離選自上述靶向鹼基距離3’端的長度範圍的任意自然數，例如：12nt、13nt、14nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離5’端的距離選自上述靶向鹼基距離5’端的長度範圍的任意自然數，例如：46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt。在一些實施方案中，所述arRNA包含選自由下列序列組成之群組：：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34。
在一些實施方案中，所述靶標細胞是小鼠細胞（例如W392X小鼠細胞），且其中所述靶標RNA為轉錄有包含與人W402X突變相應的IDUA突變的靶標RNA，則所述arRNA長約121-53nt、111-61nt、101-61nt、91-61nt、81-61nt、111-66nt、或105-66nt，即所述arRNA的全長選自上述長度範圍的任意自然數，例如：67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、91nt、95nt、100nt、110nt、115nt、120nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為55nt-10nt或50nt-10nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離3’端的距離選自上述靶向鹼基距離3’端的長度範圍的任意自然數，例如：11nt、12nt、13nt、14nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、35nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt，即所述arRNA的靶向鹼基距離5’端的距離選自上述靶向鹼基距離5’端的長度範圍的任意自然數，例如：33nt、36nt、47nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、60nt、65nt、75nt。在一些實施方案中，所述arRNA包含選自由下列序列組成之群組：：SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：52。
在一些實施方案中，所述arRNA由編碼所述arRNA的構建體轉錄表達而成。在一些實施方案中，所述arRNA由編碼所述arRNA的構建體在體外轉錄表達，並經純化獲得。在一些實施方案中，所述arRNA由編碼所述arRNA的構建體在體內直接表達並發揮編輯作用。在一些實施方案中，所述構建體選自由下列組成之群組：病毒載劑、質粒和線性核酸。在一些實施方案中，所述病毒為AAV或慢病毒。
在一些實施方案中，所述arRNA由化學合成。在一些實施方案中，所述arRNA是經化學修飾的。在一些實施方案中，所述化學修飾為2-O’-甲基化和/或硫代磷酸酯修飾。在一些實施方案中，所述化學修飾選自由下列組成之群組中的一項或多項： 序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾， 前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接， 序列中全部U均被2`-OMe修飾， 靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A， 靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C， 靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接， 前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，和 前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。
在一些實施方案中，所述化學修飾選自由下列組成之群組中的一項或多項： CM1：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時序列中全部U均被2`-OMe修飾； CM2：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A； CM3：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C； CM4：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接；以及 CM6：序列前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，並且前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。
構建體
本申請還提供了一種編碼前述arRNA的構建體。在一些實施方案中，所述構建體選自由下列組成之群組：病毒載劑、質粒和線性核酸。在一些實施方案中，所述病毒載劑為AAV載劑或慢病毒表達載劑。
本申請還進一步提供了包含所述構建體的病毒、直至奈米顆粒、脂質體、外泌體或細胞。
製劑和生物製品
本申請還提供了包含前述任一種arRNA或前述任一種構建體的組合物、製劑和生物製品，其可用于編輯靶標細胞中轉錄有包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的靶標RNA，以恢復IDUA基因的正常功能。在一些實施方案中，所述arRNA或構建體包裹在脂質體中。在一些實施方案中，所述arRNA或所述構建體經製備形成脂質奈米顆粒。在一些實施方案中，所述arRNA或所述構建體通過病毒遞送方式（例如腺相關病毒或慢病毒）導入受試者體內。
在一些實施方案中，所述包含arRNA的製劑為一種治療藥劑，可輸入患者體內用於疾病的治療。在一些實施方案中，所述輸入為局部注射、局部灌注或靜脈輸注、局部灌注或局部注射。在一些實施方案中，所述藥劑為適於肝臟局部注射的劑型，例如肝臟動脈灌注。在一些實施方案中，所述藥劑為適於肌肉注射的劑型。在一些實施方案中，所述藥劑為適於靜脈注射的劑型。
套組
本申請同時還提供了一種用於編輯靶標細胞中的靶標RNA的套組，其包含如前所述的arRNA、如前所述的編碼所述arRNA的構建體或如前所述的製劑。所述套組可用于靶向編輯靶標細胞中轉錄有包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的靶標RNA。
在一些實施方案中，所述套組包含如前所述的arRNA或如前所述的編碼所述arRNA的構建體，以及助染試劑，所述arRNA或構建體以及助染試劑分裝於不同的容器。在一些實施方案中，所述助染試劑為脂質溶液。例如：英濰捷基的Lipo (lipofectmine RNAiMAX貨號：13778150）或與其具有相同功能成分的試劑。
在一些實施方案中，所述套組還包含使用說明，以告知使用者所述套組中包含的各種成分及其含量，和/或所述套組的使用方法。
療法
本申請還進一步提供了一種治療個體中粘多糖貯積症IH型的方法，包括使用如前所述的方法校正個體細胞中與IDUA 基因的G到A的突變，例如NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變。在一些實施方案中，所述疾病包括赫勒氏綜合征。在一些實施方案中，當所述個體為人時，其中arRNA的使用頻次為≥21天/次、≥17天/次、≥14天/次或≥10天/次。在一些實施方案中，當所述個體為小鼠時，其中arRNA的使用頻次為≥8天/次。在一些實施方案中，所述療法使用編碼所述arRNA的構建體，並且所述構建體可將編碼所述arRNA的序列整合入靶標細胞，則所述arRNA的使用頻次為單次。
本申請提供的利用LEAPER技術對RNA進行靶向編輯的方法，具有以下優點：
1. 該方法不依賴於外源蛋白的表達，因此，不會由於蛋白分子量過大使得通過病毒載劑進行裝載及人體內遞送十分困難；不會由於外源蛋白過表達引起的脫靶效應；不會導致由外源蛋白表達引起的機體免疫反應及損傷；也不會由於機體內的預存抗體使外源編輯酶或效應蛋白被中和從而導致基因編輯失敗。
2. 本申請提供的這種酶導向特定位元點RNA編輯方法與DNA編輯不同，RNA編輯是可逆和可調控的。通過重新編碼氨基酸密碼子可以對疾病進行治療，對蛋白質和RNA功能進行研究。由於RNA編輯潛在的副作用是可逆的，因此更安全。
3. 與現有技術相比，該方法不僅可以通過化學合成arRNA後，經電轉染或脂質體轉染完成，也可以通過腺相關病毒(AAV)、慢病毒等載劑遞送至患者發揮功能，這使得其遞送手段的選擇上更加靈活多變，編輯效率更高。
以上詳細描述了本發明的較佳實施方式，但是，本發明並不限於此。在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，包括各個技術特徵以任何其它的合適方式進行組合，此等簡單變型和組合同樣應當視為本發明所公開的內容，均屬於本發明的保護範圍。
下面結合具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的詳述，但本發明並不限於以下實施例。如未特別指出，以下所涉及的試劑均可通過商業途徑購得。為簡便起見，部分操作未詳述操作的參數、步驟及所使用的儀器，應當理解，此等都是所屬技術領域中具有通常知識者所熟知並可重複再現的。本文中所使用的細胞（GM06214）夠買於美國Coriell公司，是一株來源於Hurler綜合征病人的成纖維細胞。編輯用arRNA是由美國Synthego公司或蘇州貝信生物技術有限公司合成，Sanger定序由北京睿博生物技術有限公司完成，二代定序由諾禾致源生物資訊科技有限公司或中科院水稻所定序平臺完成。
實施例
[實施例1：偵測GM06214突變基因型]
將GM06214細胞（赫爾勒氏綜合症（Hurler syndrome）患者來源的成纖維母細胞）放入含有15%血清的成纖維細胞培養液(ScienCell，FM培養基，貨號：2301)中，添加1%成纖維細胞生長添加物(ScienCell，GFS，貨號：2301 )，在37℃、5%CO2 培養箱裡培養2-3天。待細胞融合度達到90%時，用0.25%的胰酶消化後，含有15%血清的成纖維細胞培養液終止消化。用TianGene® (TIANGEN Biotech(Beijing)Co.,Ltd.)細胞DNA提取套組（貨號：DP304-03）根據操作說明進行DNA提取。
利用NCBI-Primer blast（網址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）進行IDUA突變位點上下游序列的引物設計。SEQ ID NO 1： CGCTTCCAGGTCAACAACAC （正向引物hIDUA-F1）; SEQ ID NO 2： CTCGCGTAGATCAGCACCG （反向引物hIDUA-R1）。進行PCR反應， PCR產物進行Sanger定序。確定細胞的突變型是IDUA基因組上第15704位點G變為A的致病型，如圖1所示。
[實施例2：GM06214細胞電轉染條件篩選]
待GM06214細胞生長至約90%匯合度時消化細胞，終止消化後計數。電轉染時，用預混合電轉染液（Lonza，貨號：V4XP-3024）400ul重懸600萬個細胞，再加20ug的GFP質粒（Lonza，貨號：V4XP-3024，混勻後，取每20ul為一個電轉染體系，用Lonza核電轉染儀測試7個電轉染條件（參見圖2）加一個陰性對照共8個，每個條件做2個重複。電轉染後，將細胞迅速轉入2ml含有15%血清的成纖維細胞培養液（ScienCell，FM培養基，貨號：2301）中，每個條件的細胞分2個孔(6孔板)接種在培養板中，將細胞放入37℃、5%CO2培養箱培養。電轉染後24小時，消化每個電轉染條件2孔細胞中的一孔細胞，利用流式細胞儀測GFP陽性細胞的比例。電轉染後48小時，消化每個電轉染條件2孔細胞中的另一孔細胞，利用流式細胞儀測GFP陽性細胞的比例。得到細胞的最佳電轉染條件為CA-137組的電轉染條件，如圖2所示。
[實施例3：GM06214細胞電轉染arRNA後IDUA酶活性和編輯效率研究]
針對IDUA基因轉錄後pre-mRNA(mRNA前體)和mature-mRNA（成熟mRNA）突變位點上下游序列，設計合成以下arRNA序列：SEQ ID NO 3： GACGCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCCAGCAGCGCCAGCAGCCCCAUGGCCGUGAGCACCGGCUU （Pre-55nt-c-55nt）；SEQ ID NO 4： GACGCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCUGCGGGGCGGGGGGGGGCCGUCGCCGCGUGGGGUCGUUG （m-55nt-c-55nt）；SEQ ID NO 5：UACCGCUACAGCCACGCUGAUUUCAGCUAUACCUGCCCGGUAUAAAGGGACGUUCACACCGCGAUGUUCUCUGCUGGGGAAUUGCGCGAUAUUCAGGAUUAAAAGAAGUGC （Random-111nt），其中，合成的arRNA中突變位點對應的鹼基由T變成C，形成一個A-C錯配。合成arRNA的長度較佳在111nt。利用實施例2得到的最佳電轉染條件對細胞進行電轉染，電轉染後48小時，收集細胞，進行酶活測定和編輯效率偵測。
編輯效率偵測：
用無RNase的水（全式金，貨號：GI201-01，）將設計合成的arRNA溶解至需要的濃度，-80℃保存。待GM06214細胞生長至約90%匯合度時消化細胞，終止消化後計數。取100萬個細胞，添加200pmol的arRNA，至100ul體積，CA-137條件下電轉染。電轉染後48小時，對細胞計數，並測活率。將細胞移入無RNA酶的離心管中離心後棄上清，用QIAGEN RNA提取套組提RNA(QIAGEN，貨號：74134)。根據說明書，按5×105 個細胞加入0.35ml的Buffer RLT Plus吹打混勻（若是凍存細胞直接提RNA，建議用PBS洗一次）。將裂解後的細胞液加入gDNA Eliminator旋轉離心柱(spin column)，在≥8000 g離心30s，扔掉柱子留下液體。加入一倍體積的70%的乙醇，吹打混勻，立即進行下一步。將液體加入RNeasyMinElute 旋轉離心柱中，在≥8000 g離心15 s，棄廢液。向RNeasyMinElute旋轉離心柱中添加700 μl的Buffer RW1，在≥8000 g離心15 s，棄廢液。向RNeasyMinElute旋轉離心柱中添加500 μl的Buffer RPE，在≥8000 g離心15 s，棄廢液。向RNeasyMinElute旋轉離心柱中添加500 μl 80%的乙醇，在≥8000 g離心2分鐘，棄廢液。將RNeasyMinElute 旋轉離心柱放到一個新的2 ml的收集柱中，開蓋最高速度離心5分鐘以便柱子乾燥。將RNeasyMinElute旋轉離心柱放到一個新的1.5 ml的收集柱中，在柱膜中心位置滴加14 μl 無RNase水，最大速度離心1分鐘溶離RNA。
將提取的RNA用Nanodrop（Thermo，貨號：Nanodrop2000）測濃度，用1ug RNA做反轉錄（Thermo，逆轉錄酶貨號：28025013）。如表1配置反轉錄體系，65℃溫育5分鐘後，立即冰浴冷卻。37℃繼續溫育50分鐘。70℃，15分鐘滅活反轉錄酶。在表3所示條件下，進行PCR。PCR結束後，取2ul PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果初步判定PCR產物的濃度以及條帶大小是否正確等。純化後，PCR產物建庫，送二代定序。
表1. 反轉錄體系配置-1
  體積（ul）
總RNA(1ug) X
Oligo dT 1
10nM dNTP 1
RNase-Free Water 10-X
總體積 12
65℃，5分鐘，立即轉移到冰上。
表2. 反轉錄體系配置-2
  體積（ul）
表1體系 12ul
5X First-Strand Buffer 4
0.1 M DTT 2
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor 1
M-MLV 1
總體積 20
表3. PCR條件
步驟 時間 迴圈
98℃ 2min 1 cycle
98℃ 15s 28-35 cycle
63℃ 30s
72℃ 15s
72℃ 2min 1 cycle
酶活性偵測：
將GM06214細胞消化後離心，用28ul含0.1% Triton X-100的1×PBS重新懸浮在冰上裂解30分鐘。然後將25ul的細胞裂解液添加到25ul含190μm 4-甲基傘形酮-α-L-異丁烯酸酶（4-methylumbelliferyl-α-L-iduronidase）的底物中 (Cayman, 2A-19543-500，溶解於0.4 M甲酸鈉緩衝液中，含有0.2% Triton X-100，PH3.5)。在暗處，37°C孵育90分鐘。加入200ul 0.5M NaOH/Glycine溶液（北京化工，NAOH，貨號：AR500G；索萊寶，Glycine貨號：G8200，），PH 10.3，滅活催化反應。在4°C離心2分鐘。上清液被轉移到96孔板上，螢光值量測用365nm激勵波長和450nm激勵射波長，使用Infinite M200儀器(TECAN)。
在本申請中，所有酶活性偵測結果資料均以GM01323細胞中酶活性的倍數來表示。其中，GM01323細胞是來源於Scheie綜合征患者的成纖維細胞。Scheie綜合征是黏多糖貯積症中較為輕微的一種，症狀比Hurler綜合征輕得多。Scheie綜合征患者往往預後較好，壽命一般為正常，可活至成年。Scheie綜合征患者的成纖維細胞中IDUA酶活性是健康人野生型成纖維細胞的0.3%。
如圖3所示，結果顯示，當arRNA靶向mRNA前體（pre-mRNA）時能夠表現出較高的酶活性和編輯效率，而靶向成熟mRNA(mature-mRNA)的arRNA表現出明顯低的酶活性和編輯效率。因此在後面的實施例中所涉及到的arRNA均是靶向mRNA前體（pre-mRNA）的。
[實施例4：在IDUA-報告子細胞株上電轉染arRNA後IDUA靶位點編輯效率的偵測]
如圖4A所示，在慢病毒質粒上表達mCherry和GFP蛋白的序列之間插入了一段攜帶IDUA突變位點及上下游有各100bp左右的序列，構建質粒。將上述構建後的質粒包裝成病毒，感染293T細胞，待其整合進基因組後，篩選出IDUA-報告子（reporter）單克隆細胞。這個單克隆細胞因為受到插入序列中IDUA突變位元點TAG終止密碼子的影響，只表達mCherry蛋白，而當細胞被arRNA編輯後，發生TAG-＞TGG，其後面的GFP蛋白才能夠正常表達，GFP蛋白的表達可以看作是arRNA編輯細胞的編輯效率。我們優選設計了4條從51nt-111nt不同長度的arRNA，如下表4所示，細胞以實施例2中的電轉染條件電轉染不同長度的arRNA後，分別在第1-第7天偵測細胞中GFP的比率，對編輯效率進行初步偵測。從圖4B中可以看編輯效率最高的序列是91nt：45-c-45，編輯的最高峰出現在第2天（48h）。由此可見，在arRNA的長度方面，並不是序列越長編輯效率越高。
表4：
111nt-隨機(random) SEQ ID NO 5：uaccgcuacagccacgcugauuucagcuauaccugcccgguauaaagggacguucacaccgcgauguucucugcuggggaauugcgcgauauucaggauuaaaagaagugc
91nt-隨機 SEQ ID NO 6：uaauccugaauaucgcgcaauuccccagcagagaacaucgcggugugaacgucccuuuauaccgggcagguauagcugaaaucagcguggc
71nt-隨機 SEQ ID NO 7：uuucagcuauaccugcccgguauaaagggacguucacaccgcgauguucucugcuggggaauugcgcgaua
51nt-隨機 SEQ ID NO 8：uuccccagcagagaacaucgcggugugaacgucccuuuauaccgggcaggu
55nt-c-55nt SEQ ID NO 4：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug
45nt-c-45nt SEQ ID NO 9：gugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcgu
35nt-c-35nt SEQ ID NO 10：uguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggcc
25nt-c-25nt SEQ ID NO 11：ggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcg
[實施例5：不同長度的arRNA電轉染GM06214細胞後，偵測不同時間點的細胞內IDUA酶活性和細胞內RNA編輯效率]
利用實施例2的電轉染條件在GM06214細胞上電轉染不同長度的arRNA（參見表4），以實施例3中的方法，分別在電轉染後第2，4，6，8，10，12，14天偵測了細胞內的酶活性，在第2和4天偵測了細胞內RNA被編輯的效率。從結果上看，如圖5所示，91nt：45-c-45酶活性最高，在電轉染後第6天IDUA酶活性仍然維持在高水準。從編輯效率上看，91nt和111nt呈現了大致相同的編輯效率。
[實施例6：編輯位點A對應於arRNA的不同位置的編輯效率]
以111nt長度的arRNA為例，從突變位點兩端同時截斷和從5’端或3’端二端分別截斷，研究靶向鹼基對應於arRNA不同位置的編輯效率。
本實驗研究以lipofectmine RNAiMAX方式將arRNA導入細胞。首先我們將arRNA序列從兩端同時截短，之後擴展到固定一端從另一端截短，得到14條arRNA和4個等長的隨機序列，如下表5所示。通過轉染後48小時IDUA酶活性和RNA編輯效率的偵測發現， 81nt：55nt-c-25nt （SEQ ID NO：14），71nt：55nt-c-15nt（SEQ ID NO：15），91nt：45nt-c-45nt（SEQ ID NO：9），91nt：55nt-c-35nt（SEQ ID NO：13），101nt：45nt-c-55nt（SEQ ID NO：17）在所偵測的序列中IDUA酶活性和RNA編輯效率優於其它序列，如圖6所示。
表5：
111nt-random SEQ ID NO 5：uaccgcuacagccacgcugauuucagcuauaccugcccgguauaaagggacguucacaccgcgauguucucugcuggggaauugcgcgauauucaggauuaaaagaagugc
91nt-random SEQ ID NO 6：uaauccugaauaucgcgcaauuccccagcagagaacaucgcggugugaacgucccuuuauaccgggcagguauagcugaaaucagcguggc
71nt-random SEQ ID NO 7：uuucagcuauaccugcccgguauaaagggacguucacaccgcgauguucucugcuggggaauugcgcgaua
51nt-random SEQ ID NO 8：uuccccagcagagaacaucgcggugugaacgucccuuuauaccgggcaggu
55nt-c-55nt SEQ ID NO 4：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug
45nt-c-45nt SEQ ID NO 9：gugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcgu
35nt-c-35nt SEQ ID NO 10：uguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggcc
25nt-c-25nt SEQ ID NO 11：ggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcg
55nt-c-45nt SEQ ID NO 12：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcgu
55nt-c-35nt SEQ ID NO 13：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggcc
55nt-c-25nt SEQ ID NO 14：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcg
55nt-c-15nt SEQ ID NO：15 gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucau
55nt-c-5nt SEQ ID NO：16 gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagc
45nt-c-55nt SEQ ID NO：17 gugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug
35nt-c-55nt SEQ ID NO：18 uguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug
25nt-c-55nt SEQ ID NO：19 ggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug
15nt-c-55nt SEQ ID NO：20 ugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug
5nt-c-55nt SEQ ID NO：21 cggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug
[實施例7：距離靶向鹼基3’端的長度對編輯效率的影響]
在實施例6中，在81nt：55-c-25、71nt：55-c-15序列上偵測到了較高的IDUA酶活性和編輯效率。為找到最短且最優的3’端的長度，對3’端從距離靶向鹼基的25nt開始（81nt：55-c-25）到10nt（66nt：55nt-c-10nt）之間的序列進行逐個截短，如表6所示。最終通過IDUA酶活測定篩選出靶向鹼基距離3’端的最優長度為24nt-11nt，如圖7A所示。此外，通過比較可見80nt：55nt-c-24nt（SEQ ID NO：22）、79nt：55nt-c-23nt（SEQ ID NO：23）、72nt：55nt-c-16nt（SEQ ID NO：30）、70nt：55nt-c-14nt（SEQ ID NO：31）、67nt：55nt-c-11nt（SEQ ID NO：34）可導致與SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15類似或更高的IDUA酶活性。
除此之外我們還在靶向鼠的IDUA突變位點（與人IDUA- W402X突變相對應的突變位點）的arRNA進行了靶向鹼基距離3`端最優長度的篩選，arRNA的3`距離靶向鹼基的長度從55nt開始，每5個鹼基截短一次，如表7所示。通過IDUA 酶活性的測定篩選出小鼠中靶向鹼基距離3`端的長度為55nt-10nt，最優長度為55nt-10nt，如圖7B所示。其中，111nt：55nt-c-50nt（SEQ ID NO：44）和66nt：55nt-c-10nt（SEQ ID NO：52）表現出較為優異的編輯效率。
表6：
55nt-c-25nt SEQ ID NO 14：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcg
55nt-c-24nt SEQ ID NO 22：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggc
55nt-c-23nt SEQ ID NO 23：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcgggg
55nt-c-22nt SEQ ID NO 24：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggg
55nt-c-21nt SEQ ID NO 25：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcgg
55nt-c-20nt SEQ ID NO 26：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcg
55nt-c-19nt SEQ ID NO 27：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugc
55nt-c-18nt SEQ ID NO 28：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucug
55nt-c-17nt SEQ ID NO 29：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucu
55nt-c-16nt SEQ ID NO 30：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucauc
55nt-c-15nt SEQ ID NO：15：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucau
55nt-c-14nt SEQ ID NO 31：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuca
55nt-c-13nt SEQ ID NO 32：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuc
55nt-c-12nt SEQ ID NO 33：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccu
55nt-c-11nt SEQ ID NO 34：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcucc
55nt-c-10nt SEQ ID NO 35：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuc
表7：
小鼠 arRNA 55nt-c-55nt GacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUaagccaagcagagggcUgaggcUgUUggcUcUcUca （SEQ ID NO：62）
55nt-c-50nt GacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUaagccaagcagagggcUgaggcUgUUggcUc （SEQ ID NO：44）
55nt-c-45nt GacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUaagccaagcagagggcUgaggcUgUU （SEQ ID NO：45）
55nt-c-40nt GacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUaagccaagcagagggcUgagg （SEQ ID NO：46）
55nt-c-35nt gacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUaagccaagcagagggc （SEQ ID NO：47）
55nt-c-30nt gacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUaagccaagcag （SEQ ID NO：48）
55nt-c-25nt gacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUaagcca （SEQ ID NO：49）
55nt-c-20nt gacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaUcUaUa （SEQ ID NO：50）
55nt-c-15nt gacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUcUccaU （SEQ ID NO：51）
55nt-c-10nt gacacccacUgUaUgaUUgcUgUccaacacagccccagccUUUgagaccUcUgcccagagUUgUUc （SEQ ID NO：52）
[實施例8： 5’端長度對編輯效率的影響]
我們選取了2個不同長度的arRNA：76nt：55-c-20、71nt：55-c-15，在3’ 端長度固定不變的基礎上，5’ 端逐漸截短，如表8所示。通過IDUA酶活性實驗測定當5’ 端長度在55nt—45nt之間時，利用arRNA編輯後的細胞的IDUA酶活性較高，同時arRNA總長度在65nt—61nt之間IDUA酶活性有一個顯著下降，如圖8A所示。當3`端的長度固定在14nt時，5`端長度從51nt(即總長度66nt)開始逐個鹼基截短，當5`端長度從51nt截短到50nt(即總長度為65nt)時，IDUA 酶活性出現了顯著下降，因此5`端的arRNA的截短要求總arRNA長度不能低於66nt,如圖8B所示。
表8：
55nt-c-20nt SEQ ID NO 26：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcg
50nt-c-20nt SEQ ID NO 36：ccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcg
45nt-c-20nt SEQ ID NO 37：gugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcg
40nt-c-20nt SEQ ID NO 38：guugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcg
35nt-c-20nt SEQ ID NO 39：uguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcg
55nt-c-15nt SEQ ID NO：15：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucau
50nt-c-15nt SEQ ID NO 40：ccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucau
45nt-c-15nt SEQ ID NO 41：gugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucau
40nt-c-15nt SEQ ID NO 42：guugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucau
35nt-c-15nt SEQ ID NO 43：uguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucau
51nt-c-14nt SEQ ID NO：56： cccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuca
50nt-c-14nt SEQ ID NO：57：ccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuca
49nt-c-14nt SEQ ID NO：58：caccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuca
48nt-c-14nt SEQ ID NO：59：accgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuca
47nt-c-14nt SEQ ID NO：60：ccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuca
46nt-c-14nt SEQ ID NO：61：cgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccuca
[實施例9：RNA化學修飾對編輯效率的影響]
RNA合成時對RNA進行不同類型的化學修飾，可以增加RNA的穩定性和減少脫靶的可能性。比較常見的對RNA進行的化學修飾有2`-OMe和硫代，我們實驗選取了2個不同長度的arRNA：71nt、76nt，進行了2種化學修飾方式的不同組合，如表8所示。具體修飾方式所表示的意義如下所示： CM1：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時序列中全部U均被2`-OMe修飾。 CM2：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A。 CM3：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C。 CM4：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接；同時靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接。 CM5：除靶向鹼基及與5’端與其鄰近的5個鹼基以及3’端與其最鄰近的5個鹼基之外，所有核苷酸均被2`-OMe修飾；同時序列前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接。 CM6：序列前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，並且前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。
在GM06214細胞中轉染不同的arRNA對細胞內IDUA進行編輯，收集轉染後48小時的細胞進行IDUA酶活性測定，從實驗結果上看，除CM5(第5種修飾：全部2`-OMe，除靶向鹼基附近11nt)其餘幾種修飾組合均具體較好的酶活性，如圖9所示。
表9
名稱 長度 修飾方式 序列
HIV2-76-CM1 55nt-c-20nt CM1   Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Umo-Cro-Aro-Umo-Cro-Um*Gm*Cm*Gm （SEQ ID NO 26）
HIV2-76-CM2 55nt-c-20nt CM2：   Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Amo-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Umo-Cro-Aro-Umo-Cro-Um*Gm*Cm*Gm （SEQ ID NO 26）
HIV2-76-CM3 55nt-c-20nt CM3：   Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cmo-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Umo-Cro-Aro-Umo-Cro-Um*Gm*Cm*Gm （SEQ ID NO 26）
HIV2-76-CM4 55nt-c-20nt CM4： Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cr*Cr*Ar-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Umo-Cro-Aro-Umo-Cro-Um*Gm*Cm*Gm （SEQ ID NO 26）
HIV2-76-CM5 55nt-c-20nt CM5：   Gm*Am*Cm*Gmo-Cmo-Cmo-Cmo-Amo-Cmo-Cmo-Gmo-Umo-Gmo-Umo-Gmo-Gmo-Umo-Umo-Gmo-Cmo-Umo-Gmo-Umo-Cmo-Cmo-Amo-Gmo-Gmo-Amo-Cmo-Gmo-Gmo-Umo-Cmo-Cmo-Cmo-Gmo-Gmo-Cmo-Cmo-Umo-Gmo-Cmo-Gmo-Amo-Cmo-Amo-Cmo-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gmo-Cmo-Umo-Cmo-Cmo-Umo-Cmo-Amo-Umo-Cmo-Um*Gm*Cm*Gm （SEQ ID NO 26）
HIV2-76-CM6 55nt-c-20nt CM6：   Gm*Am*Cm*Gm*Cm*Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Uro-Gro-Uro-Gro-Gro-Uro-Uro-Gro-Cro-Uro-Gro-Uro-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Uro-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Uro-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Uro-Uro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Uro-Gro-Cro-Uro-Cro-Cro-Uro-Cro-Aro-Ur*Cm*Um*Gm*Cm*Gm （SEQ ID NO 26）
HIV2-71-CM1 55nt-c-15nt CM1：   Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Um*Cm*Am*Um （SEQ ID NO：15）
HIV2-71-CM2 55nt-c-15nt CM2 ： Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Amo-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Um*Cm*Am*Um
HIV2-71-CM3 55nt-c-15nt CM3： Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cmo-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Um*Cm*Am*Um （SEQ ID NO：15）
HIV2-71-CM4 55nt-c-15nt CM4：   Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cr*Cr*Ar-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Um*Cm*Am*Um （SEQ ID NO：15）
HIV2-71-CM5 55nt-c-15nt CM5：   Gm*Am*Cm*Gmo-Cmo-Cmo-Cmo-Amo-Cmo-Cmo-Gmo-Umo-Gmo-Umo-Gmo-Gmo-Umo-Umo-Gmo-Cmo-Umo-Gmo-Umo-Cmo-Cmo-Amo-Gmo-Gmo-Amo-Cmo-Gmo-Gmo-Umo-Cmo-Cmo-Cmo-Gmo-Gmo-Cmo-Cmo-Umo-Gmo-Cmo-Gmo-Amo-Cmo-Amo-Cmo-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gmo-Cmo-Umo-Cmo-Cmo-Um*Cm*Am*Um （SEQ ID NO：15）
HIV2-71-CM6 55nt-c-15nt CM6：   Gm*Am*Cm*Gm*Cm*Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Uro-Gro-Uro-Gro-Gro-Uro-Uro-Gro-Cro-Uro-Gro-Uro-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Uro-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Uro-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Uro-Uro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Uro-Gro-Cro-Uro-Cro*Cm*Um*Cm*Am*Um （SEQ ID NO：15）
注：ro代表核苷酸上不做修飾核和核苷酸之間連接酯鍵不修飾；r*代表核苷酸上不做修飾核和核苷酸之間用硫代磷酸酯鍵連接;mo代表核苷酸做2`-OMe修飾核苷酸之間連接酯鍵不修飾；m*代表核苷酸做2`-OMe修飾核苷酸之間用硫代磷酸酯鍵連接。
[實施例10：化學修飾對編輯效率的影響]
本實施例涉及靶向人IDUA的突變位點的3個較佳arRNA和靶向小鼠IDUA突變位點1個較佳arRNA，應用CM1方式的化學修飾方法，在GM06214細胞和MSPI MEF(MSPI小鼠胚胎成纖維細胞(MSPI mouse embryo fibroblast, MEF），分離自IDUA 純合突變的胎鼠(idua W392X小鼠，B6.129S-Iduatm1.1Kmke /J)( Wang D, Shukla C, Liu X, et al. Characterization of an MPS I-H knock-in mouse that carries a nonsense mutation analogous to the human IDUA-W402X mutation [published correction appears in Mol Genet Metab. 2010 Apr;99(4):439]. Mol Genet Metab. 2010;99(1):62-71. doi:10.1016/j.ymgme.2009.08.002))細胞上進行濃度梯度實驗。
從實施例7的實驗結果中，我們選取了3個靶向人IDUA的arRNA，長度分別是：55nt-c-16nt, 55nt-c-14nt, 55nt-c-11nt，1個靶向小鼠IDUA的arRNA：55nt-c-10nt。此外，我們還選取了隨機arRNA序列RM-67CM1作為對照。從實施例9中我們選取了CM1（全部u：2`-OMe）的化學修飾方式合成了上述靶向IDUA的arRNA，如表9所示。我們在人GM06214細胞和MSPI小鼠MEF相比上進行了arRNA 濃度梯度的轉染。arRNA 濃度為：160nM，80nM，40nM，20nM，10nM，5nM，2.5nM，1.25nM，0.625nM共9個濃度。細胞鋪在6孔板中，鋪板後24hrs 進行轉染，轉染後48hrs消化細胞，取一半細胞進行IDUA酶活性偵測，一半細胞提RNA進行編輯效率偵測。酶活性偵測的結果顯示arRNA的轉染濃度在大於等於2.5-5nM時，便能達到一個較高的酶活，而在大於等於10-20nM時其酶活達到平臺期，如圖10A和10C所示，同時相同濃度的arRNA轉染在人細胞（GM06214）和小鼠細胞（MSPI MEF）中所產生的IDUA酶活性和編輯效率不同，如圖10B和10D所示。
表10：
名稱和長度 修飾方式 序列
55nt-c-11nt  CM1 CM1 `-Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cr*Um*Cm*Cm （SEQ ID NO：34）
55nt-c-16ntCM1 CM1 `-Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cr*Um*Cm*Am （SEQ ID NO：30）
55nt-c-14ntCM1 CM1 `-Gm*Am*Cm*Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Umo-Gro-Umo-Gro-Gro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Gro-Umo-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Gro-Aro-Cro-Aro-Cro-Umo-Umo-Cro-Gro-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Cro-Umo-Gro-Cro-Umo-Cro-Cro-Umo-Cr*Am*Um*Cm （SEQ ID NO：31）
隨機RNA--67ntCM1 CM1 `-Um*Am*Cm*Cro-Gro-Cro-Umo-Aro-Cro-Aro-Gro-Cro-Cro-Aro-Cro-Gro-Cro-Umo-Gro-Aro-Umo-Umo-Umo-Cro-Aro-Gro-Cro-Umo-Aro-Umo-Aro-Cro-Cro-Umo-Gro-Cro-Cro-Cro-Gro-Gro-Umo-Aro-Umo-Aro-Aro-Aro-Gro-Gro-Gro-Aro-Cro-Gro-Umo-Umo-Cro-Aro-Cro-Aro-Cro-Cro-Gro-Cro-Gr*Am*Um*Gm （SEQ ID NO：53）
小鼠： 55nt-c-10ntCM1 CM1 Gm*Am*Cm*Aro-Cro-Cro-Cro-Aro-Cro-Umo-Gro-Umo-Aro-Umo-Gro-Aro-Umo-Umo-Gro-Cro-Umo-Gro-Umo-Cro-Cro-Aro-Aro-Cro-Aro-Cro-Aro-Gro-Cro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Cro-Cro-Umo-Umo-Umo-Gro-Aro-Gro-Aro-Cro-Cro-Umo-Cro-Umo-Gro-Cro-Cro-Cro-Aro-Gro-Aro-Gro-Umo-Umo-Gr*Um*Um*Cmo （SEQ ID NO：52）  
注： ro代表核苷酸上不做修飾和核苷酸之間連接酯鍵不修飾；r*代表核苷酸上不做修飾和核苷酸之間用硫代磷酸酯鍵連接;mo代表核苷酸做2`-OMe修飾核苷酸之間連接不修飾；m*代表核苷酸做2`-OMe修飾核苷酸之間用硫代磷酸酯鍵連接。
[實施例11：通過arRNA編輯後IDUA可持續保持蛋白酶活性]
本實驗通過使用靶向人IDUA的突變位點的3個較佳arRNA和靶向小鼠IDUA突變位點1個較佳arRNA，並對其進行CM1方式的化學修飾，在GM06214細胞和MSPI MEF(mouse embryo fibroblast)細胞上獲得顯著提高的IDUA酶活性，並且可持續約3周以上。
在實施例10中我們進行了人和小鼠中優選出的靶向IDUA的arRNA轉染後48hrs在不同濃度下的比較，此實施例中我們選取20nM的濃度在不同時間通過IDUA酶活性和編輯效率進行比較。 如圖11A所示，arRNA轉染GM06214細胞後我們連續偵測了14天的IDUA酶活，轉染後酶活的高峰為第4天到第9天，第14天酶活性仍高於第2天，隨後我們又在更長的時間點上偵測了2天分別是轉染後第17天和21天，從10A圖上可以看到第21天的酶活仍高於轉染後第1天，酶活約為GM01323的6到10倍。（編輯效率待補充，圖11B）。在MSPI MEF細胞中arRNA 轉染後我們連續偵測了8天IDUA酶活性，由圖11C中可以看到，arRNA轉染後24hrs開始酶活性約為GM1323細胞的2倍直至第8天，從圖11D的編輯效率偵測中可以看到，IDUA的編輯效率高峰為24hrs，而後持續下降。
通過人和小鼠資料的比較我們發現，arRNA在小鼠中的編輯高峰是轉染後24hrs，而人中是48hrs，編輯後IDUA蛋白酶活性的持續時間在人的細胞中大於21天，在小鼠中大於8天。
[實施例12：arRNA遞送方式對編輯效率的影響]
本實驗涉及在初級培養的人和小鼠的肝臟細胞上利用LEAPER技術對野生型的PPIB基因位點進行編輯，通過不同的方式進行arRNA遞送，篩選出最優的遞送方式。
“PPIB”是指人NM_000942（PPIB Genomic chr15 (-)：64163082）UTR區域野生位元點或小鼠NM_011149 (PPIB Genomic chr9 (+)：66066490) UTR區域野生位元點。其可以是成熟的mRNA也可以是mRNA前體。PPIB的UTR區段存在一個TAG，本實施例中將所述TAG中的A作為靶標進行編輯，以測試本申請中的arRNA在肝臟細胞中的編輯效率。
我們設計並合成了靶向PPIB UTR區域的arRNA（55nt-c-15nt），如表11所示。合成的arRNA部分溶解分裝後存於-80度用於Lipo (lipofectmine RNAiMAX)的轉染，其餘包裝成LNP。LNP的包裝參考文獻中方法（參考文獻：Witzigmann D, Kulkarni J A, Leung J, et al. Lipid nanoparticle technology for therapeutic gene regulation in the liver[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2020.；Kauffman K J, Dorkin J R, Yang J H, et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs[J]. Nano letters, 2015, 15(11)：7300-7306.；Reis J, Kanagaraj S, Fonseca A, et al. In vitro studies of multiwalled carbon nanotube/ultrahigh molecular weight polyethylene nanocomposites with osteoblast-like MG63 cells[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2010, 43(5)：476-482.）。
人肝臟初級細胞購買於LONZA(貨號：HUCPI)，細胞按照廠家說明書復蘇培養（復蘇培養基貨號：MCHT50 ；鋪板培養基貨號 ：MP100）。細胞貼壁後更換為肝細胞維持培養基5C(參考文獻：Xiang C, Du Y, Meng G, et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro[J]. Science, 2019, 364(6438)：399-402)。
小鼠肝臟初級細胞分離於C57BJ小鼠（參考文獻：Charni-Natan M, Goldstein I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation[J]. STAR protocols, 2020, 1(2)：100086.）分離肝臟細胞貼壁後更換為維持培養基5C。
人的肝臟細胞復蘇後24hrs進行arRNA遞送，LNP和Lipo的遞送濃度均為20nM。小鼠肝臟細胞分離培養24hrs後進行arRNA遞送，LNP和Lipo的遞送濃度均為20nM。人和小鼠的肝臟細胞分別於arRNA遞送後24hrs 和 48hrs 收取RNA，通過二代定序偵測編輯效率。從圖 12A中可以看到，在人的肝臟細胞中，2種方式的arRNA遞送後48hrs編輯效率均高於24hrs，同時LNP遞送的arRNA產生的編輯效率在24hrs優於Lipo的遞送，48hrs兩種遞送方式編輯效率近似。從圖12B中可以看到，在小鼠的肝臟細胞中，2種方式的arRNA遞送後24hrs編輯效率均高於48hrs，同時Lipo遞送arRNA產生的編輯效率在24hrs和48hrs均高於同時間LNP的遞送。
因此，通過肝臟初級細胞中PPIB 位點編輯效率的比較，我們可以得出小鼠肝臟細胞中編輯的高峰位於arRNA遞送後24hrs，而人的肝細胞中編輯高峰位於48hrs，這與在人的GM06214細胞和小鼠的MSPI MEF細胞中的資料一致。人肝臟細胞中arRNA的遞送，LNP優於或等於Lipo的遞送。小鼠的肝臟細胞中arRNA的遞送，Lipo遠優於LNP的遞送。
表11：
小鼠55nt-c-15nt CACCCCAUCAGAUGGAAGCACUAGGGCCAGGGUGGCACAGAACCUUGUGACUGGCCACCUUCGUCUGUGUG （SEQ ID NO：54）
人55nt-c-15nt GGAGGCGAAAGCAGCCCGGACAGCUGAGGCCGGAAGAGGGUGGGGCCGCGGUGGCCAGGGAGCCGGCGCCG （SEQ ID NO：55）
[實施例13：LNP遞送的編輯效率]
本實驗涉及在初級培養的人和小鼠的肝臟細胞上利用LNP遞送IDUA的arRNA對IDUA的編輯效率的研究。
我們設計並合成了靶向人IDUA CDS區域野生位元點的arRNA,如表12所示。將人和小鼠的arRNA（20nM）分別通過LNP遞送至人初級肝臟細胞和小鼠初級肝臟細胞，遞送後分別於24小時和48小時偵測編輯效率，如圖13所示。從圖中我們可以看到在體外初級培養的肝臟細胞中IDUA 的編輯效率中，人的IDUA在48小時編輯效率可以達到約30%，小鼠中最高編輯效率出現在24小時約為15%。進一步表明LNP可以在人的細胞中，尤其是人的肝臟初級細胞中，達到更高的遞送效率。
表12
人IDUA 55nt-c-15nt         GGAGGCGAAAGCAGCCCGGACAGCUGAGGCCGGAAGAGGGUGGGG CCGCGGUGGCCAGGGAGCCGGCGCCG（SEQ ID NO：55）
[實施例14：針對MSPI模型小鼠IDUA的arRNA的治療作用]
本實驗使用的是MPSI模型小鼠（idua W392X小鼠，B6.129S-Iduatm1.1Kmke /J）（Wang D, Shukla C, Liu X, et al. Characterization of an MPS I-H knock-in mouse that carries a nonsense mutation analogous to the human IDUA-W402X mutation [published correction appears in Mol Genet Metab. 2010 Apr;99(4):439]. Mol Genet Metab. 2010;99(1):62-71. doi:10.1016/j.ymgme.2009.08.002），該突變與人IDUA- W402X突變相對應，該突變可提前終止蛋白質合成，在Hurler黏多多糖症(MPS I-H)綜合征患者中普遍存在。α- l -iduronidase酶的缺乏導致這種溶酶體儲存疾病。5周齡、10周齡和30周齡純合子小鼠的大腦和肝臟組織中均未偵測到α- l -iduronidase活性。儘管這種突變純合子的小鼠是有活力和可育的，但它們的平均壽命是69周。純合子表現出尿中糖胺聚糖(GAGs)排泄量的進行性增加，以及組織中GAGs的進行性積累。穩態Idua mRNA水準降低30-50%。組織學分析顯示浦肯野細胞、髓質神經元的胞質中溶酶體儲存內含物的累進積累，以及隨年齡增長而增加的泡沫狀巨噬細胞浸潤。x線片顯示顴骨弓和股骨增厚在15周齡時可見，35周齡時增厚。35周齡時，股骨骨密度增加，體脂百分比減少。我們將篩選出的靶向小鼠突變IDUA的arRNA：55nt-c-10ntCM1（SEQ ID NO：52）,包裝成LNP。將不同濃度的arRNA通過尾靜脈進行注射，所述不同濃度分別為0.1mg/kg；0.5mg/kg；2mg/kg；10mg/kg。給藥後24hrs取小鼠肝臟細胞進行IDUA編輯效率偵測，如圖14所示。給藥後24小時可以在10mg/kg組偵測到約2%的編輯效率。該實施例結果證明了針對MSPI模型小鼠IDUA的arRNA在體內可實現對肝臟細胞中突變IDUA基因的精准編輯，糾正IDUA突變，達到治療MPSI的目的。
無
圖1顯示了在GM06214細胞上偵測IDUA基因型。 圖2顯示了細胞電轉染條件測試。 圖3A-B顯示了針對IDUA pre-mRNA和mRNA設計arRNA，對編輯後細胞功能進行偵測；和針對IDUA pre-mRNA和mRNA設計arRNA，對細胞編輯效率進行偵測。 圖4A顯示了IDUA-reporter細胞株的設計；和圖4B顯示了在293T-IDUA-Reporter上偵測不同長度arRNA（對稱截短）的編輯效率。 圖5A-B顯示了在GM06214細胞上轉染不同長度（對稱截短）arRNA後，不同時間點的酶活和編輯效率偵測。 圖6顯示了在GM06214細胞用lipofectmine RNAiMAX轉染arRNA（對稱截短、3`截短和5`截短）後，IDUA酶活性和編輯效率偵測。 圖7A顯示了靶向人IDUA突變位點的arRNA在較佳的55-c-25到55-c-10之間，在3`端逐個減少鹼基，使用GM06214細胞通過酶活性偵測選出最佳長度。7B顯示了靶向小鼠的IDUA突變位點的arRNA在55-c-55到55-c-10之間，在3`端每5個鹼基逐漸減少，使用MPSI小鼠MEF細胞（MSPI MEF (MSPI mouse embryo fibroblast)）通過酶活性偵測選出最佳arRNA長度序列。 圖8A顯示了在較佳的2個3`端長度下，逐漸截短5`端長度以篩選出最優長度範圍，圖8B顯示了3`端長度固定為14nt後，5`端逐個鹼基截短後形成的arRNA對酶活性的影響，綜合圖8A和8B篩選出最優的的arRNA長度。 圖9顯示了在較佳的2個arRNA長度下，比較不同種化學修飾對arRNA編輯效率（以酶活性體現）的影響。 圖10A-D 顯示了在較佳的長度和較佳的化學修飾方式組合下，在不同的arRNA濃度下，人和小鼠arRNA編輯IDUA mRNA所產生的編輯效率和編輯後產生有功能IDUA蛋白的能力。 圖11A-D 顯示了在較佳的長度和較佳化學修飾方式組合下，一次轉染後，在不同時間在人或鼠的細胞中測得的IDUA酶活性。 圖12A-B 顯示在人和小鼠的初級肝臟細胞中，用不同的方式進行arRNA的遞送，所實現的靶向位點的編輯效率。 圖13 顯示在初級培養的人和小鼠肝臟細胞上利用LNP遞送的靶向IDUA的arRNA的編輯效率。 圖14 顯示經篩選的靶向小鼠IDUA突變的arRNA（SEQ ID NO：52）在包裝成LNP後，以不同濃度通過尾靜脈向小鼠給藥24hrs後，小鼠肝臟細胞中的IDUA編輯效率。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (23)

  1. 一種基於LEAPER技術靶向編輯靶標細胞中靶標RNA的方法，其中所述靶標RNA為IDUA基因轉錄本中含有G到A突變的RNA，該方法包括： 將包含用於編輯靶標RNA的腺苷脫氨酶募集RNA(arRNA)或編碼所述arRNA的構建體遞送至所述靶標細胞，其中所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠募集作用於RNA的腺苷脫氨酶（ADAR）以使靶標RNA中的靶標腺苷(A)脫氨基。
  2. 如請求項1中所述的方法，其中所述arRNA包含與靶標A配對的鹼基C、A、U或G。
  3. 如請求項1-2中任一項所述的方法，其中所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。
  4. 如請求項3中所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15n或24nt-11nt。
  5. 如請求項3或4中所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt或55nt-45nt。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的方法，其中所述靶標細胞是人的細胞。
  7. 請求項1-6中任一項所述的方法，其中所述靶標RNA為包含NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變位點的RNA。
  8. 請求項1-7中任一項所述的方法，其中所述arRNA包含以下的序列：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：34。
  9. 如請求項1-5中任一項所述的方法，其中所述arRNA包含選自由下列序列組成之群組：：SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：52。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的方法，其中所述arRNA是經化學修飾的。
  11. 如請求項10中所述的方法，其中所述化學修飾包含2-O’-甲基化（2`-OMe）或硫代磷酸酯修飾。
  12. 如請求項11中所述的方法，其中所述化學修飾選自由下列組成之群組中的一項或多項： 序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾， 前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接， 序列中全部U均被2`-OMe修飾， 靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A， 靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C， 靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接， 前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，和 前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。
  13. 如請求項1-9中任一項所述的方法，其中所述編碼所述arRNA的構建體為線性核酸鏈、病毒載劑或質粒。
  14. 如請求項13中所述的方法，其中所述病毒載劑為腺相關病毒(AAV)載劑或慢病毒表達載劑。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其中所述遞送方式為電轉染、脂質體轉染、脂質-奈米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)遞送或感染。
  16. 如請求項15中所述的方法，通過LNP將包含用於編輯靶標RNA的腺苷脫氨酶募集RNA(arRNA)或編碼所述arRNA的構建體遞送至所述靶標細胞。
  17. 如請求項1-16中任一項所述的方法，其中所述arRNA的遞送濃度≥2.5，≥5nM，≥10nM，≥15nM，或≥20nM。
  18. 一種用於通過LEAPER技術靶向編輯靶標細胞中靶標RNA的arRNA或其編碼序列，所述arRNA包含如下任一序列或由如下任一序列組成：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：52。
  19. 一種包含請求項18所述arRNA或其編碼序列的質粒、病毒載劑、脂質體或脂質奈米顆粒。
  20. 一種包含請求項18所述arRNA或其編碼序列、或請求項19所述質粒、病毒載劑、脂質體或脂質奈米顆粒的組合物或生物製品。
  21. 一種治療個體中MPS IH的方法，包括用請求項1-17中任一項所述的方法校正所述個體的靶標細胞中與MPS IH疾病相關的G到A的突變。
  22. 如請求項20的方法，其中所述突變為NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A (p.Trp402Ter)突變。
  23. 如請求項20或21所述的方法，其中所述arRNA的使用頻次為≥21天/次、≥17天/次、≥14天/次或≥10天/次。
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