ES2962434T3 - Procedimientos y composiciones para editar ARN - Google Patents

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Zhuo Zhou
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Abstract

Se proporcionan métodos para editar ARN mediante la introducción de un ARN reclutador de desaminasas en una célula huésped para la desaminación de una adenosina en un ARN diana, y ARN reclutadores de desaminasas usados en los métodos de edición de ARN y composiciones que los comprenden. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos y composiciones para editar ARN
REFERENCIA CRUZADA DE SOLICITUDES CORRESPONDIENTES
[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de una solicitud internacional con la Solicitud Internacional Número PCT/CN2018/110105 presentada el 12 de octubre de 2018 y una solicitud internacional con la Solicitud Internacional Número CN2019/082713 presentada el 15 de abril de 2019.
PRESENTACIÓN DE LISTADO DE SECUENCIAS EN DOCUMENTO DE TEXTO ASCII
[0002] El contenido de la siguiente presentación del archivo de texto ASCII es un formato legible por ordenador (CRF) del Listado de Secuencias (nombre del fichero: FC00158PCT New-sequence listing-YZG-zhc.TXT, datos grabados: 11 de octubre de 2019, tamaño: 104 KB).
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0003] La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para editar ARN utilizando un ARN diseñado capaz de reclutar una adenosina desaminasa para desaminar una o más adenosinas en ARN diana.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0004] La edición del genoma es una herramienta poderosa para la investigación biomédica y el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades. Hasta la fecha, la tecnología de edición de genes más popular es el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-Cas, que fue desarrollado a partir del sistema inmune adaptable de bacterias y arqueas. CRISPR-Cas puede reconocer y escindir con precisión ADN genómico, generando roturas de ADN bicatenario (DSB). Se pueden reparar las DSB a través de mecanismos de unión de extremos no homólogos (NHEJ,non-homologous end joining),generando una inserción o eliminación (Indel), que en la mayoría de los casos inactiva el gen. Alternativamente, el mecanismo de reparación dirigida por homología (HDR,homology-directed repair)puede reparar las DSB utilizando los plantillas homólogas de ADNbc o ADNmc y, por consiguiente, lograr edición precisa del genoma.
[0005] Recientemente, beneficiándose de las proteínas desaminasas, tales como adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR), se desarrollaron nuevas herramientas para la edición de ARN. En células de mamíferos, existen tres tipos de proteínas ADAR, Adar1 (dos isoformas, p110 y p150), Adar2 y Adar3 (catalíticamente inactivo). El sustrato catalítico de proteína ADAR es ARN bicatenario y puede eliminar el grupo -NH2 de una nucleobase de adenosina (A), cambiando A por inosina (I), que se reconoce como guanosina (G) y se empareja con citidina (C) durante los posteriores procedimientos de transcripción y traducción celulares. Los investigadores fusionaron el péptido AN con el dominio de desaminasa Adar1 o Adar2 humana para construir el sistema de AN-ADARDD, que se puede guiar para unirse a dianas de ARN específicas mediante un ARN de fusión que consiste en tallo bucle BoxB y ARN antisentido. Este procedimiento puede editar la A diana a I introduciendo un desemparejamiento (“mismatch”) de A-C en la base de A diana, generando la edición de bases de ARN de A a G. Otros procedimientos de edición de ARN incluyen la fusión de ARN antisentido con el motivo R/G (estructura de ARN que recluta ADAR) para editar ARN diana mediante la sobreexpresión proteínas Adar1 o Adar2 en células de mamífero y utilizando dCas13-ADAR para reconocer y modificar ARN con precisión.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0006] La edición de ácidos nucleicos posee gran potencial para investigación biológica y el desarrollo de agentes terapéuticos. Las herramientas actuales de edición de ADN o ARN se basan en la introducción de proteínas exógenas en organismos vivos, que se exponen a riesgos potenciales o barreras técnicas debido a la posible actividad efectora anormal, límites de suministro e inmunogenicidad. En algunos aspectos, la presente solicitud da a conocer un enfoque programable que utiliza un ARN corto para aprovechar proteínas de ADAR endógenas (adenosina desaminasa que actúa sobre ARN) para editar el ARN diana. En algunos aspectos, la presente solicitud da a conocer un ARN modificado que es parcialmente complementario al transcrito diana para reclutar ADAR1 o ADAR2 nativas para cambiar adenosina a inosina en un sitio específico en un ARN diana. Los procedimientos descritos en el presente documento se denominan en conjunto «LEAPER» (Aprovechamiento de ADAR endógena para edición programable de ARN) y los ARN reclutadores de ADAR se denominan de manera intercambiable «ARNd» o «ARNar».
[0007] En un aspecto, la presente solicitud da a conocer un procedimiento de edición de un ARN diana en una célula huésped, que comprende introducir un ARN reclutador de desaminasa (ARNd) o una construcción que codifica el ARN reclutador de desaminasa en la célula huésped, en el que el ARNd comprende una secuencia de<a>R<n>complementaria que se hibrida con el ARN diana y un desemparejamiento de citidina directamente opuesta a la adenosina diana en el ARN diana, en el que el desemparejamiento de citidina se ubica a como mínimo 20 nucleótidos del extremo 3' de la secuencia complementaria y a como mínimo 5 nucleótidos del extremo 5' de la secuencia complementaria en el ARNd, en el que el ARNd tiene entre 50 y 260 nucleótidos en longitud y no comprende un nucleótido químicamente modificado, y en el que el ARNd es capaz de reclutar una adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN 1 o 2 (ADAR1 o ADAR2) para desaminar una adenosina (A) diana en el ARN diana, en el que el ARNd no comprende un dominio reclutador de ADA. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de ratón. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota.
[0008] En determinadas realizaciones, la ADAR está presente de manera natural o endógena en la célula huésped, por ejemplo, está presente de manera natural o endógena en la célula eucariota. En algunas realizaciones, la ADAR se expresa de manera endógena por la célula huésped. En determinadas realizaciones, la ADAR es exógena a la célula huésped. En algunas realizaciones, la ADAR es codificada por un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN). En algunas realizaciones, el procedimiento comprende introducir la ADAR o una construcción que codifica la ADAR en la célula huésped. En algunas realizaciones, el procedimiento no comprende introducir cualquier proteína en la célula huésped. La ADAR es ADAR1 y/o ADAR 2. En algunas realizaciones, la ADAR es una o más ADARs seleccionadas entre el grupo que consiste en hADAR1, hADAR2, ADAR1 murino y ADAR2 murino.
[0009] En determinadas realizaciones, el ARNd no es reconocido por una Cas. En algunas realizaciones, el ARNd no comprende ARNcr, ARNtracr o ARNg utilizados en un sistema CRISPR/Cas. En algunas realizaciones, el procedimiento no comprende la introducción de una Cas o una proteína de fusión Cas en la célula huésped.
[0010] En determinadas realizaciones, la desaminación de la A diana en el ARN diana da como resultado una mutación con cambio de sentido, un cordón de terminación temprano, un empalme anormal o empalme alternativo en el ARN diana. En algunas realizaciones, el ARN diana codifica una proteína, y la desaminación de la A diana en el ARN diana da como resultado una mutación puntual, truncamiento, alargamiento y/o mal plegamiento de la proteína. En determinadas realizaciones, la desaminación de la A diana en el ARN diana da como resultado la inversión de una mutación con cambio de sentido, un cordón de terminación temprano, empalme anormal o empalme alternativo en el ARN diana. En algunas realizaciones, en las que el ARN diana codifica una proteína truncada, alargada, mutada o mal plegada, la desaminación de la A diana en el ARN diana da como resultado una proteína funcional, de longitud completa, correctamente plegada y/o de tipo salvaje mediante la inversión de una mutación con cambio de sentido, un cordón de terminación temprano, empalme anormal o empalme alternativo en el ARN diana. En algunas realizaciones, el ARN diana es un ARN regulador y la desaminación de la A diana da como resultado un cambio de la expresión de una molécula en dirección 3' regulado mediante el ARN diana. En determinadas realizaciones, el procedimiento sirve para aprovechar una adenosina desaminasa endógena para editar un ARN diana para generar una mutación puntual y/o mal plegamiento de la proteína codificada por el ARN diana y/o generar un codón de terminación temprano, un sitio de empalme anormal y/o un sitio de empalme alternativo en el ARN diana.
[0011] En determinadas realizaciones, el procedimiento comprende introducir una pluralidad de ARNd o construcciones que codifican una pluralidad de ARNd en las células huésped, en el que cada una de las pluralidades de ARN reclutadores de desaminasa comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con un ARN diana correspondiente en la pluralidad de ARN dianas y en el que cada ARNd es capaz de reclutar una adenosina desaminasa que actúa sobre ARN (ADAR) para desaminar una adenosina (A) diana en el ARN diana correspondiente.
[0012] En algunas realizaciones, se da a conocer un ARN editado o una célula huésped que tiene un ARN editado producido mediante cualquiera de los procedimientos de edición de ARN, tal como se han descrito anteriormente.
[0013] Un aspecto de la presente solicitud da a conocer un ARNd para desaminación de una adenosina diana en un ARN diana reclutando una adenosina desaminasa que actúa sobre ARN (ADAR), que comprende una secuencia de ARN complementaria que hibrida con el ARN diana, en el que el ARNd comprende una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de SEQ ID NOs: 25-44, 142-205, 341-342.
[0014] En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos o ARNd descritos en el presente documento, el ARNd comprende una secuencia de ARN que comprende una citidina (C), preferiblemente adicionalmente adenosina (A) o uridina (U), directamente opuesta a la adenosina diana a editar en el ARN diana. En determinadas realizaciones, la secuencia de ARN comprende adicionalmente una o más guanosinas cada una directamente opuesta a una adenosina o adenosinas no diana en el ARN diana. En determinadas realizaciones, el vecino más cercano al al extremo 5' terminal de la A diana en la secuencia de ARN diana es un nucleótido seleccionado entre U, C, A y G con la preferencia de U>C“ A>G y el vecino más cercano al extremo 3' terminal de la A diana en la secuencia de ARN diana es un nucleótido seleccionado entre G, C, A y U con la preferencia de G>C>A“ U. En determinadas realizaciones, la A diana se encuentra en un motivo de tres bases seleccionado entre el grupo que consiste en UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA y GAU en el ARN diana. En determinadas realizaciones, cuando el motivo de tres bases es UAG, el ARNd comprende una A directamente opuesta a U en el motivo de tres bases, una C directamente opuesta a la A diana y una C, G o U directamente opuesta a la G en un motivo de tres bases. En determinadas realizaciones, cuando el motivo de tres bases es UAG en el ARN diana, el ARNd comprende ACC, ACG o ACU opuesto al UAG del ARN diana.
[0015] En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos o ARNd descritos en el presente documento, el ARN reclutador de desaminasa comprende más de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 nucleótidos. En determinadas realizaciones, el ARN reclutador de desaminasa tiene 50-240, 60-230, 65-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75-200, 80-190, 85-180, 90 170, 95-160, 100-150 o 105-140 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, el ARN diana es un ARN seleccionado entre el grupo que consiste en un ARN premensajero, un ARN mensajero, un ARN ribosómico, un ARN de transferencia, un ARN no codificante largo y un<a>R<n>pequeño (por ejemplo, ARNmi).
[0016] En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos o ARNd descritos en el presente documento, el ARNd es un ARN de cadena única. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementario es de cadena única, y en donde el ARNd comprende adicionalmente una o más regiones de doble cadena. En algunas realizaciones, el ARNd comprende una o más modificaciones, tales como modificación de 2'-O-metilo y/o modificación de fosforotioato.
[0017] En algunas realizaciones, se da a conocer una construcción (por ejemplo, vector viral o plásmido) que codifica cualquiera de los ARNd descritos anteriormente. En algunas realizaciones, la construcción comprende un promotor unido de manera operativa a una secuencia que codifica el ARNd. En algunas realizaciones, la construcción es una construcción de ADN. En algunas realizaciones, la construcción es un vector viral, tal como AAV, tal como AAV8.
[0018] En algunas realizaciones, se da a conocer una biblioteca que comprende una pluralidad de los ARNd de acuerdo con cualquiera de los ARNd descritos anteriormente o una pluralidad de construcciones de acuerdo con cualquiera de las construcciones descritas anteriormente.
[0019] También se dan a conocer las composiciones y las células huésped que comprenden cualquiera de los ARNd descritos en el presente documento, cualquiera de las construcciones descritas en el presente documento o cualquiera de las bibliotecas descritas en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0020]
Las figuras 1A-1H muestran la edición de ARN con ARNd único que utiliza proteína Adar1 endógena. La figura 1A y 1B muestran representaciones esquemáticas de la edición de ARN con proteína Adar1 endógena. La figura 1C muestra la edición de ARNm reportero con ARNd utilizando la proteína Adar1 endógena. La figura 1D muestra el análisis estadístico de los resultados de la Figura 1B. La figura 1E muestra los resultados deknockoutde Adar1 y de rescate de Adar1(p110), Adar1(p150) y Adar2. La figura 1F muestra el análisis estadístico de los resultados de la Figura 1D. La figura 1G muestra el efecto de sobreexpresión de Adar1(p110), Adar1(p150) o Adar2 en la edición de ARN mediada por ARNd en células 293T-WT. La figura 1H muestra que los resultados de la secuenciación profunda (es decir, Secuenciación de Nueva Generación, NGS) confirmaron la edición de A a G en el lugar de reconocimiento. Las figuras 2A-2H muestran la optimización de ARNd. La figura 2A muestra la representación esquemática de cuatro tipos de identificación de bases (A, U, C y G) opuestas a la adenosina de reconocimiento. La figura 2B muestra los efectos de identificación de bases opuestas a la adenosina de reconocimiento sobre la eficacia de edición de ARN por ARNd. La figura 2C muestra la representación esquemática de ARNd con una, dos o tres bases no emparejadas con el sitio de reconocimiento de UAG. La figura 2D muestra los efectos de una, dos o tres bases no emparejadas con el sitio de reconocimiento de UAG en la edición de ARN reportero por ARNd. ARNd prefería el desemparejamiento de A-C en la adenosina de reconocimiento. La figura 2E muestra la representación esquemática de ARNd con longitud variable. La figura 2F muestra el efecto de longitud de ARNd sobre la eficacia de edición de ARN basada en reportero 2 de fluorescencia dual. La figura 2G muestra la representación esquemática de la diferente posición del desemparejamiento de A-C. La figura 2H muestra el efecto de la posición de desemparejamiento de A-C sobre la eficacia de edición de ARN.
Las figuras 3A-3B muestran la flexibilidad de edición de ARN endógeno mediante la edición del procedimiento de edición de ARN de ejemplo de la presente solicitud. La figura 3A muestra la cuantificación en porcentaje de eficacia de edición de ARN endógeno en todos los 16 motivos de 3 bases diferentes. La figura 3B muestra el mapa de calor de preferencias de bases 5' y 3' de la edición de ARN endógeno para los 16 motivos de 3 bases diferentes.
Las figuras 4A-4H muestran la edición del ARNm de genes endógenos con ARNd en células 293T. La figura 4A muestra la representación esquemática de diana de ARNm de KRAS y ARNd con longitud variable. La figura 4B muestra la edición del ARNm de gen KRAS endógeno con ARNd en células 293T. Vector vacío, plásmidos de ARNd-91nt se transfectaron en células 293T-WT, respectivamente. 60 horas más tarde, se aisló el ARN para RT-PCR, y, a continuación, se amplificó el ADNc y se secuenció en Illumina NextSeq. La figura 4C muestra la representación esquemática de diana de ARNm de PPIB (sitio1, sitio2 y sitio3) el diseño de ARNd correspondiente. Las figuras 4D, 4E y 4F muestran la edición del ARNm de gen de PPIB endógeno con ARNd en células 293T. La figura 4G muestra la representación esquemática de diana de ARNm de p-Actina y ARNd (71 nucleótidos y 131 nucleótidos). La figura 4H muestra la edición de ARNm de gen de p-Actina endógeno con ARNd en células 293T.
Las figuras 5A-5G muestran el análisis de dianas no deseadas. La figura 5A muestra la representación esquemática de la ventana de secuencia en la que se analizaron las ediciones de A a I para diana de ARNm de PPIB (sito 1 de PPIB). La flecha negra indica la adenosina reconocida. La figura 5B muestra la cuantificación de secuenciación profunda de la edición de ARN de A a I por diana de ARNm de PPIB que reconoce un ARNd de 151 nucleótidos (sitio 1 de PPIB). La figura 5C muestra la representación esquemática de la ventana de secuencia en la que se analizaron las ediciones de A a I para la diana de ARNm de KRAS. La flecha negra indica la adenosina reconocida. La figura 5D muestra la cuantificación de secuenciación profunda de la edición de ARN de A a I por la diana de ARNm de KRAS que reconoce un ARNd de 91 nucleótidos y 111 nucleótidos. La figura 5E muestra la representación esquemática de cuatro tipos diseñados de variantes de ARNd de 91 nucleótidos o 111 nucleótidos que contienen combinaciones de desemparejamiento de A-G. El desemparejamiento de A-G se diseñó basándose en los resultados estadísticos de la Figura 5D y conocimientos existentes de códigos genéticos para aminoácidos diferentes. La figura 5F muestra los resultados de la edición de A56 reconocida por ARNd y diferentes tipos de variantes de ARNd en la Figura 5E. La figura 5G muestra la cuantificación de secuenciación profunda de edición de ARN de A a I por ARNd de 111 nucleótidos y cuatro tipos de variantes de ARNd de 111 nucleótidos con reconocimiento de diana de ARNm de KRAS.
Las figuras 6A-6H muestran la edición de ARN con ARN único utilizando proteína Adar1 endógena. La figura 6A muestra la representación esquemática de edición de ARN por proteínas de fusión dLbuCas13-ADARDD. La dLbuCas13 catalíticamente inactiva se fusionó con los dominios de desaminasa de ARN de ADAR1 o ADAR2. La figura 6B muestra la representación esquemática de diana de ARNm reportero de fluorescencia dual y diseño de ARN guía. La figura 6C muestra el análisis estadístico de los resultados de las Figuras 6A y 6B. La figura 6D muestra el nivel de ARNm de Adar1 y Adar2 en células 293T-WT. La figura 6E muestra los resultados de denominación del genotipo de gen de ADAR1 en líneas celulares 293T-ADAR1-KO mediante PCR genómica. La figura 6F muestra el nivel de expresión de Adar1(p110) y Adar1(p150) en líneas celulares 293T-WT y 293T-ADAR1-KO a través de transferencia western. La figura 6G muestra los efectos de sobreexpresión de Adar1(p110), Adar1(p150) o Adar2 en la edición de ARN mediada por ARNd en células 293T-WT a través de FACS. La figura 6H muestra los resultados de secuenciación de Sanger que mostraron la edición de A a G en el sitio de adenosina reconocida.
Las figuras 7A-7C muestran la optimización de ARNd. La figura 7A muestra la representación esquemática de ARNd con longitud variable y los resultados de edción de ARNm reconocido por ARNd con longitud variable basados en reportero-1 de fluorescencia dual. La figura 7B muestra la representación esquemática de diferente posición de desemparejamiento de A-C y el efecto de la posición de desemparejamiento de A-C sobre la eficacia de edición de ARN basada en el reportero-1 de fluorescencia dual. La figura 7C muestra la representación esquemática de la diferente posición de desemparejamiento de A-C y el efecto de la posición de desemparejamiento de A-C sobre la eficacia de edición de ARN basada en el reportero-3 de fluorescencia dual.
Las figuras 8A-8B muestran la edición del ARNm de genes endógenos con ARNd en células 293T. La figura 8A muestra la edición de ARNm de gen p-Actina endógeno (sitio 2) con ARNd en células 293T. La figura 8B muestra que la edición del ARNm de gen de GAPDH endógeno con ARNd en células 293T.
La figura 9 muestra la edición de ARN por ARNd en líneas celulares diferentes. La figura 9A muestra que los plásmidos reporteros y los plásmidos de ARNd se transfectaron conjuntamente en diferentes líneas celulares, y los resultados muestran que el ARNd podía funcionar bien en múltiples líneas celulares, lo que indica la universalidad del uso de ARNd.
Las figuras 10A-10D muestran la exploración de una plataforma de edición de ARN eficiente de ejemplo. La figura 10A, esquema de la proteína de fusión dLbuCas13a-ADAR1DD (E1008Q) y el ARNcr correspondiente. La LbuCas13a inactiva catalítica se fusionó con el dominio de desaminasa de ADAR1 (variante E1008Q hiperactiva) utilizando 3x enlazador GGGGS. El ARNcr (ARNcrCas13a) consistió en la estructura Lbu-ARNcr y un espaciador, que era complementario al ARN de reconocimiento con un desemparejamiento de A-C, tal como se indicó. La figura 10B, esquema del sistema de reportero de fluorescencia dual y el Lbu-ARNcr con longitudes diferentes de espaciadores, tal como se indica. La figura 10C, cuantificación de las células positivas de EGFP (EGFP+). Las células HEK293T que expresan de manera estable el Reportero-1 se transfectaron con las longitudes indicadas de ARNcrCas13a, con o sin la co-expresión de dLbuCas13a-ADAR1DD (E1008Q), seguido de análisis de FACS. Los datos se presentan como la media ± EEM (error estándar de la media) (n = 3). La figura 10D, resultado de FACS representativo del experimento realizado con el control (ARN Ctrlcr7o) o el espaciador de reconocimiento (ARNcr7o).
Las figuras 11A-11G muestran los procedimientos de ejemplo para aprovechar la proteína ADAR1 endógena para la edición de ARN reconocido. La figura 11A, esquema del Reportero-1 y el ARNar de 70 nucleótidos. La figura 11B, análisis de FACS representativo de la expresión EGFP inducida por ARNar en células de tipo salvaje (HEK293T, parte superior) o conknock-outde ADAR1 (HEK293TADAR1~-~,parte inferior) que expresan de manera estable el Reportero-1. La figura 11C, análisis de transferencia Western que muestra los niveles de expresión de proteínas ADAR1 en células de tipo salvaje y HEK293TADAR1--,así como también aquellos en células HEK293Ta Da R1-/-transfectadas con isoformas de<a>D<a>R1 (p110 y p150). La figura 11D, análisis de transferencia Western que muestra los niveles de expresión de proteínas ADAR2 en células de tipo salvaje y HEK293TADAR1-/-,así como aquellos en células HEK293Ta Da R1-'~transfectadas con ADAR2. La figura 11E, cuantificación de las células positivas de EGFP (EGFP+). El Reportero-1 y las construcciones que expresan ADAR indicadas se transfectaron conjuntamente en células HEK293TADAR1-/-,junto con el ARN Ctrlzo o con el ARNarzo de reconocimiento, seguido de análisis de FACS. Los porcentajes de EGFP+ se normalizaron mediante la eficacia de transfección, la cual se determinó mediante mCherry+. Los datos son los valores medios ± EEM (n = 4). La figura 11F, los electroferogramas que muestran los resultados de secuenciación de Sanger en el ARN Ctrl7o (parte superior) o la región reconocida de ARNar7o (parte inferior). La figura 11G, cuantificación de la tasa de conversión de A a I en el sitio reconocido mediante secuenciación profunda.
Las figuras 12A-12B muestran el nivel de expresión de ARNm de ADAR1/ADAR2 y edición de ARN mediada por ARNar. La figura 12A, PCR cuantitativa que muestra los niveles de ARNm deADAR1yADAR2en células HEK293T. Los datos se presentan como la media ± EEM (error estándar de la media) (n = 3). La figura 12B, resultados de FACS representativos de la Figura 1E.
La figura13 muestra los resultados de PCR que demuestran los efectos de un procedimiento LEAPER de ejemplo sobre los niveles de expresión de transcritos del Reportero-1 reconocidos por ARNar de 111 nucleótidos o ARN de control en células HEK293T. Los datos se presentan como la media ± EEM (error estándar de la media) (n = 3); prueba t de Student de dos colas no pareadas, ns, no significativo.
Las figuras 14A-14D muestran la edición de ARN reconocido con un procedimiento LEAPER de ejemplo en múltiples líneas celulares. La figura 14A, resultados de la transferencia Western que muestran los niveles de expresión de ADAR1, ADAR2 y ADAR3 en líneas celulares humanas indicadas. p-tubulina se utilizó como un control de carga. Los datos mostrados es la representación de tres experimentos independientes.ADAR1-/-/ADAR2representa las células HEK293T conknock-outde ADAR1 que sobreexpresan ADAR2. La figura 14B, niveles de expresión de proteína ADAR relativos normalizados por la expresión de p-tubulina. La figura 14C, células humanas indicadas se transfectaron con el Reportero-1, junto con el ARNar de control de 71 nucleótidos (ARN Ctrlyi) o con el ARNar de reconocimiento de 71 nucleótidos (ARNaryi), seguido del análisis FACS. La figura 14D, líneas celulares de ratón indicadas se analizaron, tal como se describe en la Figura 14C. Los porcentajes de EGFP+ se normalizaron mediante la eficacia de transfección, que se determinó mediante mCherry+. Barras de errores en las Figuras 14 B, 14c y 14d todas indican la media ± EEM (n = 3); prueba t de Student de dos colas no pareadas, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****p < 0,0001; ns, no significativo.
Las figuras 15A-15C muestran esquemas de Reportero 1 (a), 2 (b) y 3 (c), así como sus ARNar correspondientes. Las figuras 16A-16G muestran la caracterización y la optimización de los procedimientos LEAPER de ejemplo. La figura 16A, parte superior, esquema del diseño de ARNar con triplete cambiado (5'-CNA, N indica A, U, C o G) opuesto a UAG diana. Parte inferior, porcentaje de EGFP+ que muestra los efectos de bases variables opuestas a la adenosina reconocida sobre la eficacia de edición de ARN.
Figura 16B, parte superior, el diseño de ARNar con bases vecinas cambiadas que flanquean la citidina en el desemparejamiento de A-C (5'-N1CN2). Parte inferior, los efectos de 16 combinaciones diferentes de N1CN2 sobre la eficacia de edición de ARN. La figura 16C, resumen de la preferencia de sitios vecinos más cercanos al extremo 5' y 3' de la citidina en el desemparejamiento de A-C. La figura 16D, parte superior, el diseño de ARNar con longitud variable. Parte inferior, el efecto de la longitud de ARNar sobre la eficacia de edición de ARN basado en el Reportero-1 y el Reportero-2. La figura 16E, parte superior, el diseño de ARNar con posición de desemparejamiento de A-C variable. Parte inferior, el efecto de la posición de desemparejamiento de A-C sobre la eficacia de edición de ARN basado en el Reportero-1 y el Reportero-2. La figura 16F, parte superior, el diseño de los motivos de triplete en el reportero-3 con bases vecinas más cercanas variables que rodean la adenosina de reconocimiento (5'-N1AN2) y el motivo opuesto (5'-N2CN1) en el ARNar de 111 nucleótidos (ARNar-m). Parte inferior, los resultados de secuenciación profunda que muestran la tasa de edición en adenosina reconocida en el motivo 5'-N1AN2. La figura 16G, resumen de las preferencias de base en 5' y 3' de la edición mediada por LEAPER en el Reportero-3. Barras de errores en las Figuras 16A, 16B, 16D, 16E y 16F todas indican valores medios ± EEM (n = 3).
Figuras 17A-17I muestra la edición de transcritos endógenos con procedimientos LEAPER de ejemplo. La figura 17A, esquema del reconocimiento de transcritos endógenos de cuatro genes relacionados con enfermedades(PPIB, KRAS, SMAD4yFANCC)y los ARNar correspondientes. La figura 17B, los resultados de secuenciación profunda que muestran la tasa de edición sobre adenosina diana en los transcritos dePPIB, KRAS, SMAD4yFANCCmediante la introducción de las longitudes indicadas de ARNar. La figura 17C, resultados de secuenciación profunda que muestran la tasa de edición de sitios no UAN de transcritos de PPIB, FANCC e IDUA endógenos. La figura 17D, tasa de edición múltiple por dos ARNar de 111 nucleótidos. Los ARNar indicados se transfectaron por sí solos o se transfectaron conjuntamente en las células HEK293T. La edición dirigida en los dos sitios se midió de las células transfectadas conjuntamente. La figura 17E, esquema de la secuencia de transcrito dePPIBcubierta con el ARNar de 151 nucleótidos. La flecha negra indica la adenosina reconocida. Todas las adenosinas se marcaron en rojo. La figura 17F, mapa de calor de tasa de edición de adenosinas cubiertas con longitudes indicadas de ARNar que reconocen el genPPIB(marcadas en azul en el recuadro en negrita). Para la región cubierta con PPIB de ARNar de 111 nucleótidos o ARNar-151-PPIB, se determinaron las tasas de edición de A22, A30, A33 y A34 mediante secuenciación de ARN debido a la carencia de cebadores de PCR eficaces para la amplificación de esta región. En otros casos, la tasa de edición se determinó mediante el análisis de secuenciación profunda dirigida. La figura 17G, parte superior, el diseño de los motivos de triplete en el reportero-3 con bases vecinas más cercanas variables que rodean la adenosina de reconocimiento (5'-N1AN2) y el motivo opuesto (5'-N2'GN1) en el ARNar de 111 nucleótidos (ARNar-m). Parte inferior, los resultados de la secuenciación profunda que muestran la tasa de edición. La figura 17H, parte superior, el diseño de ARNar con dos desemparejamientos consecutivos en el motivo 5'-N1GN2 opuesto a los motivos 5'-UAG o 5'-AAG. Resultados de secuenciación profunda que muestran la tase de edición por un ARNar111 con dos desemparejamientos consecutivos en el motivo 5'-N1GN2 opuesto al motivo 5'-UAG (parte inferior izquierda) o el motivo 5'-AAG (parte inferior derecha). La figura 17I, mapa de calor de la tasa de edición en adenosinas cubiertas con variantes de ARNar111 modificados que reconocen el genKRAS.Datos en las Figuras 17B, 17C, 17D, 17G y 17H se representan como la media ± EEM (n = 3); prueba t de Student de dos colas no pareadas, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS, no significativo. Datos en (f e i) se representan como la media (n = 3).
Figuras 18A-18B muestran los efectos de procedimientos LEAPER de ejemplo sobre los niveles de expresión de transcritos reconocidos y productos de proteínas. La figura 18A, PCR cuantitativa que muestra los niveles de expresión de transcritos reconocidos de PPIB, KRAS, SMAD4 y FANCC por el ARNar de 151 nucleótidos o ARN de Control correspondiente en células HEK293T. Los datos se presentan como la media ± EEM (n = 3); prueba t de Student de dos colas no pareadas, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns, no significativo. La figura 18B, resultados de transferencia Western que muestran los efectos sobre productos de proteínas de genl KRAS reconocido por ARNar de 151 nucleótidos en células HEK293T. p-tubulina se utilizó como un control de carga.
Las figuras 19A-19F muestran la edición de transcritos endógenos con procedimientos LEAPER de ejemplo. La figura 19A, esquema de la secuencia de transcrito deKARScubierta con el ARNar de 151 nucleótidos. La flecha indica la adenosina de reconocimiento. Todas las adenosinas se marcaron en rojo. La figura 19B, mapa de calor de tasa de edición de adenosinas cubiertas con los ARNar indicados en el transcrito deKARS(marcados en el recuadro en negrita en azul). La figura 19C, esquema del transcrito deSMAD4cubierto con el ARNar de 151 nucleótidos. La figura 19D, mapa de calor de la tasa de edición de adenosinas cubiertas con ARNar indicados en el transcrito deSMAD4.La figura 19E, esquema del transcrito deFANCCcubierto con el ARNar de 151 nucleótidos. La figura 19F, mapa de calor de tasa de edición de adenosinas cubiertas con los ARNar indicados en el transcrito deFANCC.Para cada ARNar, la región de ARN dúplex se marca con recuadro en negrita en azul. Datos (Figuras 19B, 19D y 19F) se representan como la media (n = 3).
Figuras 20A-20D muestran la especificidad amplia de transcriptoma de edición de ARN mediante LEAPER. Las figuras 20A y 20B, análisis de reconocimiento no deseado amplio de transcriptomas de ARN Ctrlm y ARNarm-PPIB. El lugar de reconocimiento (PPIB) está marcado en rojo. Los sitios de diana no deseada potenciales identificados en los dos grupos de ARN Ctrl y ARN con reconocimiento de PPIB están marcados en azul. La figura 20C, la afinidad de hibridación predicha entre sitios de diana no deseada y los correspondientes ARN Ctrlm o ARNarm- PPIB. Se pronosticó la energía libre mínima (AG) de ARN de doble cadena formado por sitios de diana no deseada (dirección 5' y dirección 3' de 150 nucleótidos de los sitios de edición) y los correspondientes ARN CtrÍ151 o ARNarm-PPIB con híbrido de ARN, una herramienta de página web en línea. La figura 20D, parte superior, esquema de la región altamente complementaria entre ARNarm-PPIB y los sitios de diana no deseada potenciales indicados, que se predijeron mediante la búsqueda de secuencias homólogas con NCBI--BLAST. Parte inferior, secuenciación profunda que muestra la tasa de edición del sitio de diana deseada y todos los sitios de dianas no deseadas previstos de ARNar151-PPIB. Los datos se presentan como la media ± EEM (n = 3).
Figuras 21A-21B muestran la evaluación de dianas no deseadas potenciales. La figura 21A, esquema de la región altamente complementaria de ARNarm-FANCC y la secuencia de diana no deseada potencial indicada, que se predijeron mediante la búsqueda de secuencias homólogas con NCBI-BLAST. La figura 21<b>, secuenciación profunda que muestra la tasa de edición del sitio de diana deseada y todos los sitios de dianas no deseadas predichos de ARNarm-FANCC. Todos los datos se presentan como la media ± EEM (n = 3).
Figuras 22A-22F muestran la evaluación de seguridad de aplicación de procedimientos LEAPER de ejemplo en células de mamíferos. Las figuras 22A y 22B, análisis variado de transcriptomas de los efectos de ARN Ctrlm (a) ARNarm-PPIB (b) en sitios de edición originarios mediante la secuenciación de ARN variada de transcriptomas. Se utilizó el análisis de coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la tasa de edición de ARN diferencial en sitios de edición originarios. Las figuras 22C y 22D, análisis de expresión diferencial de genes de los efectos de ARN Ctrlm (c) ARNar151-PPIB (d) con datos de secuenciación de ARN al nivel de transcriptomas. Se utilizó el análisis de coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la expresión diferencial de genes. Las figuras 22E y 22F, efecto de transfección de ARNar sobre la respuesta inmune innata. Los ARNar indicados o los poli(I:C) se transfectaron en células HEK293T. A continuación, se analizó el ARN total utilizando PCR cuantitativa para determinar los niveles de expresión de IFN-p (e) e IL-6 (f). Los datos (e y f) se presentan como la media ± EEM (n = 3).
Las figuras 23A-23D muestran la recuperación de actividad reguladora transcripcional de TP53W53X mutante mediante LEAPER. La figura 23A, parte superior, esquema de la secuencia de transcrito deTP53cubierta con el ARNar de 111 nucleótidos que contiene mutación antisentido clínicamente relevante de c.158G>A (Trp53Ter). La flecha negra indica la adenosina reconocida. Todas las adenosinas se marcaron en rojo. Parte inferior, el diseño de dos ARNar optimizados que reconocen los transcritos de TP53W53X con desemparejamiento de A-G en A46' para ARNarm-AG1 y en A16', A46', A91' y A94' en conjunto para ARNarm-AG4 para minimizar las dianas no deseadas potenciales en motivos «propensos a edición». La figura 23B, resultados de secuenciación profunda que muestra la edición dirigida en transcritos de TP53W53X por ARNarm, ARNarm-AG1 y ARNarm-AG4. La figura 23C, transferencia Western que muestra la producción recuperada de proteína p53 de longitud completa a partir de los transcritos de TP53W53X en las células HEK293TTP53-/-.La figura 23D, detección de la actividad reguladora transcripcional de proteína p53 restaurada utilizando un sistema reportero de p53-luciferasa de luciérnaga, normalizada mediante el vector de luciferasa de Renilla cotransfectado. Los datos (b, c y d) se presentan como la media ± EEM (n = 3); prueba t de Student de dos colas no pareadas, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****p < 0,0001; ns, no significativo. La figura 24 muestra la edición de transcritos de TP53W53X mutantes con un procedimiento LEAPER de ejemplo. Parte superior de la secuencia de transcrito deTP53cubierta con los ARNar de 111 nucleótidos. La flecha indica la adenosina reconocida. Todas las adenosinas se marcaron en rojo. Parte inferior, un mapa de calor de tasa de edición de adenosinas cubiertas con ARNar indicados en el transcrito deTP53.
Figura 25 muestra una representación esquemática del ADNc relevante para la enfermedad seleccionada que contiene la mutación de G a A a partir de datos ClinVar y el ARNar de 111 nucleótidos correspondiente.
Figura 26 muestra la correlación de las mutaciones patógenas mediante un procedimiento LEAPER de ejemplo. La correlación de A con I de la mutación de G>A que es relevante con enfermedad a partir de datos ClinVar mediante el ARNar de 111 nucleótidos correspondiente, el reconocimiento de mutaciones clínicamente relacionadas de seis genes patógenos tal como se indica (Figura 25 y las tablas de las secuencias de ARNar y ARNar de control y ADNc relacionados con enfermedad a continuación). Los datos se presentan como la media ± EEM (n = 3); prueba t de Student de dos colas no pareadas, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****p < 0,0001; ns, no significativo.
Figuras 27A-27C muestran la edición de ARN en múltiples células primarias humanas mediante procedimientos LEAPER de ejemplo. La figura 27A, cuantificación de las células EGFP positivas (EGFP+) inducidas por la edición de ARN mediada por LEAPER. Fibroblastos pulmonares primarios humanos y células epiteliales bronquiales primarias humanas se transfectaron con el Reportero-1, junto con el ARN de control de 151 nucleótidos (ARN Ctrlm) o el ARNar diana de 151 nucleótidos (ARNarm) seguido del análisis de FACS. Las figuras 27B y 27C, resultados de secuenciación profunda que muestran la tasa de edición de transcritos dePPIBen fibroblastos pulmonares primarios humanos, células epiteliales bronquiales primarias humanas (b) y células T primarias humanas (c). Los datos en a, b y el grupo no tratado (c) se presentan como la media ± EEM (n = 3); los datos de ARN Ctrl-151 y ARNar151 (c) se presentan como la media ±<e>E<m>(n = 2).
Figuras 28A-28D muestran la edición dirigida mediante la transducción lentiviral de ARNar y la electroporación de oligonucleótidos de ARNar sintetizados. La figura 28A, cuantificación de las células EGFP+. Las células HEK293T que expresan el Reportero-1 de manera estable se infectaron con lentivirus que expresa ARN Ctrl de 151 nucleótidos o el ARNar de reconocimiento. Se realizaron los análisis FACS 2 días y 8 días después de la infección. Se normalizaron las proporciones de células EGFP+ mediante la eficacia de transducción lentiviral (proporciones de BFP+). La figura 28B, resultados de secuenciación profunda que muestran la tasa de edición de los transcritos dePPIBtras la transducción lentiviral de ARNar de 151 nucleótidos en células HEK293T. La figura 28C, esquema de la secuencia dePPIBy el ARNar de reconocimeinto de 111 nucleótidos correspondiente. *(en rojo) representa nucleótido con modificaciones de 2'-O-metilo y enlace fosforotioato. La figura 28D, resultados de secuenciación profunda que muestran la tasa de edición de los transcritos dePPIBdespués de la electroporación de oligonucleótidos de ARNar sintético de 111 nucleótidos en células T primarias humanas.
Figuras 29A-29E muestran la recuperación de la actividad de a-L-iduronidasa en fibroblasto primario derivado de paciente con síndrome de Hurler mediante un procedimiento LEAPER de ejemplo. La figura 29A, parte superior, información genética de la mutación patógena en fibroblasto GM06214 derivado de paciente; parte central, esquema de la secuencia de ARNm maduro deIDUAde células GM06214 (negro) que contienen una mutación TGG>TAG homocigota en el exón 9 del genIDUA(Trp402Ter), y el ARN111-IDUA-V1 de reconocimiento de 111 nucleótidos correspondiente (azul); parte inferior, esquema de la secuencia de pre-ARNm deIDUAde células GM06214 (negro) y el ARNar-i11-IDUA-V2 de reconocimiento de 111 nucleótidos correspondiente (azul). *(en rojo) representa nucleótidos con modificaciones de 2'-O-metilo y enlace fosforotioato. La figura 29B, medición de la actividad catalítica de a-L-iduronidasa con sustrato de 4-metilumbeliferil a-L-iduronidasa en diferentes puntos de tiempo. Los datos se presentan como la media ± EEM (n = 2). La figura 29C, resultados de secuenciación profunda que muestran la tasa de edición dirigida en transcritos deIDUAen células GM06214, 48 horas después de electroporación. La figura 29D, parte superior, esquema de la secuencia de transcrito deIDUAcubierta con el ARNar de 111 nucleótidos. La flecha indica la adenosina reconocida. Todas las adenosinas se marcaron en rojo. Parte inferior, mapa de calor de tasa de edición en adenosinas cubiertas con ARNar indicados en el transcrito deIDUA(marcados en el recuadro en negrita en azul). e, PCR cuantitativa que muestra las expresiones de interferón de tipo I, genes estimulados por interferón y genes pro inflamatorios tras la electroporación de ARNar o poli(I:C). Datos se representan como la media (n = 3).
Figuras 30A-30C muestran tres versiones de reporteros de fluorescencia dual (Reportero-1, -2 y -3), mCherry y EGFP. La figura 30A, estructura del Reportero-1, Figura 30B, estructura del Reportero-2 y Figura 30C, estructura del Reportero-3.
Figura 31 muestra la información de plásmidos de AAV8-IDUA-ARNad151-KD2 y AAV8-Aleatorio151-KD2.
Figuras 32A-B muestran la actividad enzimática relativa a a-L-iduronidasa de ratones MPSI inyectados con AAV8-IDUA-ARNad151- KD2 y AAV8-Aleatorio151-KD2. Células GM01323 a modo de control.
Figuras 33A-B muestran la eficacia de edición de ARN de ratones MPSI inyectados con AAV8-IDUA-ARNad151- KD2 y AAV8-Aleatorio151-KD2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0021] La presente solicitud da a conocer procedimientos de edición de ARN (denominados en el presente documento como procedimientos «LEAPER») y ARNs diseñados de manera especial, denominados en el presente documento como ARNs reclutadores de desaminasa («ARNd») o ARNs que reclutan ADAR («ARNar») para editar ARNs diana en una célula huésped. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría o hipótesis, el ARNd actúa a través de la hibridación de su<a>R<n>diana de un modo específico de secuencia para formar un ARN de doble cadena, que recluta una adenosina desaminasa que actúa sobre ARN (ADAR) para desaminar una adenosina diana en el ARN diana. Por tanto, se puede lograr la edición eficiente de ARN en algunas realizaciones sin expresión ectópica o sobreexpresión de las proteínas ADAR en la célula huésped.
[0022] Los procedimientos de edición de ARN descritos en el presente documento no utilizan proteínas de fusión que comprenden una ADAR y una proteína que se une de manera específica a un ácido nucleico guía, tal como Cas. Los ARNs reclutadores de desaminasa («ARNd») descritos en el presente documento no comprenden ARNcr, ARNtracr o ARNg utilizados en el sistema CRISPR/Cas. El ARNd no comprende un dominio reclutador de ADAR. En algunas realizaciones, el ARNd no comprende una modificación o modificaciones químicas. En algunas realizaciones, el ARNd puede sobreexpresarse a partir de un plásmido o un vector viral o sintetizarse como un oligonucleótido, que podría lograr la eficacia de edición deseable.
[0023] Los procedimientos LEAPER descritos en el presente documento tienen tasas de diana no deseada controlables en los transcritos diana y dianas no deseadas globales raras. Los inventores de la presente invención han utilizado el procedimiento LEAPER para recuperar la función de p53 reparando una mutación puntual relevante para el cáncer. Los procedimientos LEAPER descritos en el presente documento pueden utilizarse en un amplio espectro de tipos de células que incluyen múltiples células primarias humanas y pueden utilizarse para recuperar la actividad catalítica de a-L-iduronidasa en fibroblastos primarios derivados de pacientes con síndrome de Hurler sin provocar respuestas inmunes innatas. En algunas realizaciones, el procedimiento LEAPER implica un sistema de molécula única (es decir, ARNd). Los procedimientos LEAPER descritos en el presente documento facilitan edición de ARN precisa y eficiente, que ofrece potencial transformador para investigación básica y agentes terapéuticos.
Definiciones
[0024] La presente invención se describirá con relación a las realizaciones particulares y con referencia a determinadas figuras. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no deberá interpretarse como limitante del alcance. Cuando se utiliza el término «que comprende» en la presente descripción y las reivindicaciones, no excluye otros elementos o etapas. Cuando se utiliza un artículo indefinido o definido con referencia a un sustantivo, por ejemplo, «uno» o «una», «el/la», incluye una forma plural de aquel sustantivo a menos que se indique cualquier otra cosa de manera específica. Para la enumeración de intervalos numéricos de nucleótidos en el presente documento, se contempla cada número intermedio entre ellos. Por ejemplo, para el intervalo de 40-260 nucleótidos, se contempla cualquier número entero de nucleótidos entre 40 y 260 nucleótidos además de los números de 40 nucleótidos y 260 nucleótidos.
[0025] Los siguientes términos y definiciones se proporcionan solamente para ayudar a entender la presente invención. A menos que se defina de manera específica en el presente documento, todos los términos utilizados en el presente documento poseen el mismo significado tal como los entendería un experto en la técnica de la presente invención. Los médicos se dirigen particularmente a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Plainsview, Nueva York (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York (1999), para las definiciones y los términos de la técnica. Las definiciones que se dan a conocer en el presente documento no deberían interpretarse que tienen un alcance inferior al que entendería un experto en la técnica.
[0026] Los términos «ARN reclutador de desaminasa», «ARNd», «ARN que recluta ADAR» y «ARNar» se utilizan en el presente documento de manera intercambiable para hacer referencia a un ARN diseñado capaz de reclutar una ADAR para desaminar una adenosina diana en un ARN.
[0027] Los términos «polinucleótido», «secuencia de nucleótidos» y «ácido nucleico» se utilizan de manera intercambiable. Hacen referencia a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos.
[0028] Los términos «adenina», «guanina», «citosina», «timina», «uracilo» e «hipoxantina», tal como se utilizan en el presente documento, hacen referencia a las nucleobases como tales. Los términos «adenosina», «guanosina», «citidina», «timidina», «uridina» e «inosina» hacen referencia a las nucleobases enlazadas al resto de azúcar de ribosa o desoxirribosa. El término «nucleósido» hace referencia a la nucleobase enlazada a la ribosa o desoxirribosa. El término «nucleótido» hace referencia a nucleobase-ribosil-fosfato o nucleobase-desoxirribosil-fosfato correspondiente. A veces los términos adenosina y adenina (con la abreviatura «A»), guanosina y guanina (con la abreviatura «G»), citosina y citidina (con la abreviatura «C»), uracilo y uridina (con la abreviatura «U»), timina y timidina (con la abreviatura «T»), inosina e hipoxantina (con la abreviatura «I») se utilizan de manera intercambiable para hacer referencia a la nucleobase, nucleósido o nucleótido correspondiente. A veces los términos nucleobase, nucleósido y nucleótido se utilizan de manera intercambiable, a menos que el contexto lo requiera claramente de manera distinta.
[0029] En el contexto de la presente solicitud, «ARN diana» hace referencia a una secuencia de ARN para la que se diseña una secuencia de ARN reclutador de desaminasa para tener complementariedad perfecta o complementariedad sustancial e hibridación entre la secuencia diana y el ARNd forma una región de ARN de doble cadena (ARNbc) que contiene una adenosina diana, que recluta una adenosina desaminasa que actúa sobre ARN (ADAR) que desamina la adenosina diana. En algunas realizaciones, la ADAR está presente de forma natural en una célula huésped, tal como una célula eucariota (preferiblemente, una célula de mamífero, más preferiblemente, una célula humana). En algunas realizaciones, la ADAR se introduce en la célula huésped.
[0030] Tal como se utiliza en el presente documento, «complementariedad» hace referencia a la capacidad de un ácido nucleico de formar un enlace o enlaces de hidrógeno con otro ácido nucleico mediante emparejamiento de bases de Watson-Crick tradicional. Una complementariedad en porcentaje indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (es decir, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con un segundo ácido nucleico (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10, siendo aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % complementarios respectivamente). «Perfectamente complementario» significa que todos los residuos continuos de una secuencia de ácido nucleico forman enlaces de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. «Sustancialmente complementario», tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un grado de complementariedad que es como mínimo aproximadamente cualquiera de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % sobre una región de aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones rigurosas.
[0031] Tal como se utiliza en el presente documento, «condiciones rigurosas» de hibridación hacen referencia condiciones bajo cuales un ácido nucleico que tiene complementariedad en relación con una secuencia diana se híbrida de manera predominante con la secuencia diana y no se híbrida de manera sustancial con secuencias no diana. Las condiciones rigurosas generalmente dependen de la secuencia y varían dependiendo de un número de factores. De manera general, cuanto más larga es la secuencia, más alta es la temperatura a la que la secuencia hibrida de manera específica con su secuencia diana. Los ejemplos no limitativos de condiciones rigurosas se describen de manera detallada en Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Segundo Capítulo «Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay», Elsevier, N,Y.
[0032] «Hibridación» hace referencia a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza a través del enlace de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El emparejamiento de hidrógeno se puede realizar mediante el emparejamiento de bases de Watson Crick, enlace de Hoogstein o de cualquier otra manera específica de secuencia. Una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia determinada se denomina el «complemento» de la secuencia determinada.
[0033] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «célula», «línea celular» y «cultivo celular» se utilizan de manera intercambiable y todas de dichas denominaciones incluyen progenie. Se entiende que toda la progenie no puede ser exactamente idéntica en el contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie diferente que tiene la misma función o actividad biológica que las células originales.
Procedimientos de edición de ARN
[0034] Se da a conocer un procedimiento de edición de un ARN diana en una célula huésped (por ejemplo, célula eucariota), que comprende introducir un ARN reclutador de desaminasa (ARNd) o una construcción que codifica el ARNd en la célula huésped, en el que el ARN comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con el ARN diana y un desemparejamiento de citidina directamente opuesto a la adenosina diana en el ARN diana, en el que el desemparejamiento de citidina está ubicado al menos a 20 nucleótidos de distancia del extremo 3' de la secuencia complementaria, y al menos a 5 nucleótidos de distancia del extremo 5' de la secuencia complementaria en el ARNd, en el que el ARNd tiene una longitud de 50 a 260 nucleótidos y no comprende un nucleótido químicamente modificado, y en el que el ARNd es capaz de reclutar una adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN 1 o 2 (ADAR1 o ADAR2) para desaminar una adenosina (A) diana en el ARN diana, y el ARNd no comprende un dominio de reclutamiento de ADAR.
[0035] En algunas realizaciones, el procedimiento sirve para editar un ARN diana en una célula huésped (por ejemplo, célula eucariota) que comprende introducir un ARNd o una construcción que codifica el ARNd en la célula huésped, en el que el ARNd comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con el ARN diana, y en el que el ARNd recluta una ADAR que se expresa de manera endógena de la célula huésped para desaminar una A diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, el procedimiento no comprende la introducción de cualquier proteína o construcción que codifica una proteína (por ejemplo, Cas, ADAR o una proteína de fusión de ADAR y Cas) en la célula huésped.
[0036] En algunas realizaciones, el procedimiento de edición de un ARN diana en una célula huésped (por ejemplo, célula eucariota) comprende introducir: (a) un ARNd o una construcción que codifica el ARNd y (b) una ADAR o una construcción que codifica la ADAR en la célula huésped, en el que el ARNd comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con el ARN diana y en el que el ARNd recluta la ADA<r>para desaminar una A diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, la ADAR es una ADAR codificada de manera endógena de la célula huésped, en el que la introducción de la ADAR comprende la sobreexpresión de la ADAR en la célula huésped. En algunas realizaciones, la ADAR es exógena para la célula huésped. En algunas realizaciones, la construcción que codifica la ADAR es un vector, tal como un plásmido o un vector viral (por ejemplo, un vector lentiviral).
[0037] En algunas realizaciones, el procedimiento sirve para editar una pluralidad (por ejemplo, como mínimo aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100 o más) de ARNs diana en una célula huésped (por ejemplo, una célula eucariota), que comprende introducir una pluralidad de ARNs o construcciones que codifican la pluralidad de ARNd en la célula huésped, en el que cada ARNd comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con un ARN diana correspondiente en la pluralidad de ARNs diana, y en el que cada ARNd es capaz de reclutar una ADAR para desaminar una A diana en el ARN diana correspondiente.
[0038] En algunas realizaciones, el procedimiento sirve para editar una pluralidad (por ejemplo, como mínimo aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100 o más) de ARNs diana en una célula huésped (por ejemplo, una célula eucariota), que comprende introducir una pluralidad de ARNs o construcciones que codifican la pluralidad de ARNd en la célula huésped, en el que cada ARNd comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con un ARN diana correspondiente en la pluralidad de ARNs diana, y en el que cada ARNd recluta una ADAR expresada de manera endógena para desaminar una A diana en el ARN diana correspondiente.
[0039] En algunas realizaciones, el procedimiento sirve para editar una pluralidad (por ejemplo, como mínimo aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000 o más) de ARNs diana en una célula huésped (por ejemplo, una célula eucariota), que comprende introducir: (a) una pluralidad de ARNd o construcciones que codifican la pluralidad de ARNd y (b) una ADAR o una construcción que codifica ADAR en la célula huésped, en el que cada ARNd comprende una secuencia de ARN complementaria que se híbrida con un ARN diana correspondiente en la pluralidad de ARN diana, y en el que el ARNd recluta la ADAR para desaminar una A diana en el ARN diana correspondiente.
[0040] En un aspecto, la presente solicitud da a conocer un procedimiento de edición de una pluralidad de ARNs en células huésped introduciendo una pluralidad de los ARNs reclutadores de desaminasa, una o más construcciones que codifican los ARNs reclutadores de desaminasa o una biblioteca descrita en el presente documento, en las células huésped.
[0041] En determinadas realizaciones, el procedimiento de edición de un ARN diana comprende introducir múltiples ARN reclutadores de desaminasa o una o más construcciones que comprenden los múltiples ARNs reclutadores de desaminasa en células huésped para reclutar adenosina desaminasa que actúa sobre ARN (ADAR) para llevar a cabo la reacción de desaminación sobre una o más adenosinas diana en uno o más ARNs diana, en el que cada ARN reclutador de desaminasa comprende una secuencia de ARN complementaria a un ARN diana correspondiente.
[0042] En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el ARNd comprende más de aproximadamente cualquiera de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 nucleótidos. En determinadas realizaciones, el ARNd es aproximadamente cualquiera de 50-240, 60-230, 65-220, 70-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75-200, 80-190, 85-180, 90-170, 95-160, 100-200, 100-150, 100-175, 110-200, 110-175, 110-150 o 105-140 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el ARNd tiene aproximadamente 71 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el ARNd tiene aproximadamente 111 nucleótidos de longitud.
[0043] En los procedimientos descritos en el presente documento, el ARNd no comprende un dominio reclutador de ADAR. «Dominio reclutador de ADAR» puede ser una secuencia de nucleótidos o estructura que se une con alta afinidad a ADAR, o una secuencia de nucleótidos que se une a un miembro de unión fusionado con ADAR en una construcción de ADAR diseñada. Los dominios reclutadores de ADAR de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, dominios GluR-2, GluR-B (R/G), GluR-B (Q/R), GluR-6 (R/G), 5HT2C y FlnA (Q/R); véanse, por ejemplo, Wahlstedt, Helene y Marie, «Site-selective versus promiscuous A-to-I editing». Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 2.6 (2011): 761-771. En algunas realizaciones, el ARNd no comprende una parte de doble cadena. En algunas realizaciones, el ARNd no comprende una horquilla, tal como un tallo bucle de MS2. En algunas realizaciones, el ARNd es de cadena única. En algunas realizaciones, la ADAR no comprende un dominio de unión a DSB. En algunas realizaciones, el ARNd consiste en (o consiste esencialmente en) la secuencia de ARN complementaria.
[0044] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el ARNd no comprende modificaciones químicas. En algunas realizaciones, el ARNd no comprende un nucleótidos modificado químicamente, tal como un nucleótido con 2'-O-metilo o un nucleótido que tiene un enlace de fosforotioato. En algunas realizaciones, el ARNd comprende las modificaciones de 2'-O-metilo y el enlace de fosforotioato solamente en los tres primeros y los tres últimos residuos. En algunas realizaciones, el ARNd no es un oligonucleótido antisentido (ASO).
[0045] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la célula huésped es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula murina. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula vegetal o una célula fúngica.
[0046] En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la célula huésped es una línea celular, tal como célula HEK293T, Ht 29, A549, HepG2, RD, SF268, SW13 y HeLa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula primaria, tal como fibroblasto, célula epitelial o inmune. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula T. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula postmitótica. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula del sistema nervioso central (SNC), tal como una célula cerebral, por ejemplo, una célula de cerebelo.
[0047] En algunas realizaciones, el procedimiento de edición de un ARN diana en una célula huésped primaria (por ejemplo, célula T o una célula del<s>N<c>) comprende la introducción de un ARNd o una construcción que codifica el ARNd en la célula huésped, en el que el ARNd comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con el ARN diana, y en el que el ARNd recluta una ADAR que se expresa de manera endógena de la célula huésped para desaminar una A diana en el ARN diana.
[0048] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la ADAR es endógena para la célula huésped. En algunas realizaciones, la adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR) está presente de manera natural o de forma endógena en la célula huésped, por ejemplo, está presente de manera natural o endógena en la célula eucariota. En algunas realizaciones, la ADAR es expresada de manera endógena por la célula huésped. En determinadas realizaciones, la ADAR se introduce de manera exógena en la célula huésped. La ADAR es ADAR1 y/o ADAR2. En determinadas realizaciones, la ADAR es una o más ADARs seleccionadas entre el grupo que consiste en hADAR1, hADAR2, ADAR1 y ADAR2 de ratón. En algunas realizaciones, la ADAR es ADAR1, tal como isoterma p110 de ADAR1 («ADAR1p110») y/o isoterma p150 de ADAR1 («ADAR1p150»). En algunas realizaciones, la ADAR es ADAR2. En algunas realizaciones, la ADAR es una ADAR2 expresada por la célula huésped, por ejemplo, ADAR2 expresada por células de cerebelo.
[0049] En algunas realizaciones, la ADAR es una ADAR exógena para la célula huésped. En algunas realizaciones, la ADAr es un mutante hiperactivo de una ADAR de origen natural. En algunas realizaciones, la ADAR es ADAR1 que comprende una mutación E1008Q. En algunas realizaciones, la ADAR no es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión. En algunas realizaciones, la ADAR no comprende un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena modificado. En algunas realizaciones, la ADAR no comprende un dominio de MCP que se une a horquilla MS2 que se fusiona con la secuencia de ARN complementaria en el ARNd. En algunas realizaciones, la ADAR no comprende un dominio de unión a DSB.
[0050] En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la célula huésped tiene un alto nivel de expresión de ADAR1 (tal como ADAR1p110 y/o ADAR1p150), por ejemplo, como mínimo, aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 50 %, 100 %, 2x, 3x, 5x, o superior en relación con el nivel de expresión de proteína de p-tubulina. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene un alto nivel de expresión de ADAR2, por ejemplo, como mínimo, aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 50 %, 100 %, 2x, 3x, 5x, o superior en relación con el nivel de expresión de proteína de p-tubulina. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene bajo nivel de expresión de ADAR3, por ejemplo, no superior a aproximadamente cualquiera de 5x, 3x, 2x, 100 %, 50 %, 20 % o inferior en relación con el nivel de expresión de proteína de p-tubulina.
[0051] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la secuencia de ARN complementaria comprende una citidina, preferiblemente adicionalmente adenosina o uridina, directamente opuesta a la A diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria comprende un desemparejamiento de citidina directamente opuesta a la A diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, el desemparejamiento de citidina se ubica a como mínimo 10, 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos del extremo 5' terminal de la secuencia de ARN complementaria. En algunas realizaciones, el desemparejamiento de citidina se ubica a como mínimo 25, 30, 35 o más nucleótidos del extremo 3' terminal de la secuencia de ARN complementaria. El desemparejamiento de citidina se ubica a como mínimo 20 nucleótidos (por ejemplo, como mínimo 25, 30, 35 o más nucleótidos) del extremo 3' terminal y a como mínimo 5 nucleótidos (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30 0 más nucleótidos) del extremo 5' terminal de la secuencia de ARN complementaria. En algunas realizaciones, el desemparejamiento de citidina se ubica en el centro de la secuencia de ARN complementaria. En algunas realizaciones, el desemparejamiento de citidina se ubica a 20 nucleótidos(porejemplo, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido) del centro de la secuencia complementaria en el ARNd.
[0052] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la secuencia de ARN complementaria comprende adicionalmente una o más guanosinas, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6 o más G, que se ubican cada una directamente opuesta a una adenosina no diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria comprende dos o más nucleótidos de desemparejamiento consecutivos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos de desemparejamiento) opuestos a una adenosina no diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, el ARN diana comprende no más de aproximadamente 20 A no diana, tal como no más de aproximadamente cualquiera de 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 de A no diana. Las G y nucleótidos de desemparejamiento consecutivos opuestos a A no diana pueden reducir los efectos de edición de dianas no deseadas por ADAR.
[0053] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el vecino más cercano al extremo 5' terminal de la A diana es un nucleótido seleccionado entre U, C, A y G con la preferencia de U>C“ A>G y el vecino más cercano al extremo 3' terminal de la A diana es un nucleótido seleccionado entre G, C, A y U con la preferencia de G>C>A“ U. En determinadas realizaciones, la A diana se encuentra en un motivo de tres bases seleccionado entre el grupo que consiste en UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA y GAU en el ARN diana. En determinadas realizaciones, el motivo de tres bases es UAG y el ARNd comprende una A directamente opuesta a U en el motivo de tres bases, una C directamente opuesta a la A diana y una C, G o U directamente opuesta a la G en un motivo de tres bases. En determinadas realizaciones, el motivo de tres bases es UAG en el ARN diana y el ARNd comprende ACC, ACG o ACU que se encuentra opuesto al UAG del ARN diana. En determinadas realizaciones, el motivo de tres bases es UAG en el ARN diana y el ARNd comprende ACG que se encuentra opuesto a UAG del ARN diana.
[0054] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el ARN diana es cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en un ARN premensajero, un ARN mensajero, un ARN ribosómico, un ARN de transferencia, un ARN no codificante largo y un ARN pequeño (por ejemplo, ARNmi). En algunas realizaciones, el ARN diana es un ARN premensajero. En algunas realizaciones, el ARN diana es un ARN mensajero.
[0055] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el procedimiento comprende adicionalmente introducir un inhibidor de ADAR3 en la célula huésped. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADAR3 es un ARNi contra ADAR3, tal como un ARNsh contra ADAR3 o un ARNpi contra ADAR3. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente introducir un estimulador de interferón en la célula huésped. En algunas realizaciones, la ADAR es inducible por un interferón, por ejemplo, la ADAR es ADARp150 En algunas realizaciones, el estimulador de interferón es IFNa. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADAR3 y/o el estimulador de interferón son codificados por la misma construcción (por ejemplo, vector) que codifica el ARNd.
[0056] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la eficacia de edición del ARN diana es como mínimo aproximadamente del 5 %, tal como, como mínimo, aproximadamente cualquiera de 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 % o superior. En algunas realizaciones, la eficacia de edición del ARN diana es, como mínimo, aproximadamente del 5 % (por ejemplo, como mínimo aproximadamente del 7 %)in vivo,por ejemplo, en un animal. En algunas realizaciones, la eficacia de edición del ARN diana es, como mínimo, aproximadamente del 10% (por ejemplo, como mínimo, aproximadamente del 15%) en una célulain vivooex vivo.En algunas realizaciones, la eficacia de edición se determina por la secuenciación de Sanger. En algunas realizaciones, la eficacia de edición se determina por la secuenciación de siguiente generación.
[0057] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el procedimiento tiene baja tasa de edición de diana no deseada. En algunas realizaciones, el procedimiento tiene menos de aproximadamente el 1 % (por ejemplo, no superior a aproximadamente cualquiera de 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 %, 0,001 % o inferior) de eficacia de edición de A no diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, el procedimiento no edita A no diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, el procedimiento tiene menos de aproximadamente el 0,1 % (por ejemplo, no superior a aproximadamente cualquiera de 0,05 %, 0,01 %, 0,005 %, 0,001 %, 0,0001 % o inferior) de eficacia de edición de A en el ARN no diana.
[0058] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el procedimiento no induce respuesta inmune, tal como respuesta inmune innata. En algunas realizaciones, el procedimiento no induce la expresión de interferones y/o interleucinas en la célula huésped. En algunas realizaciones, el procedimiento no induce la expresión de IFN-p y/o IL-6 en la célula huésped.
[0059] Se dan a conocer también ARN editado o células huésped que tienen un ARN editado producidos mediante cualquiera de los procedimiento descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el ARN editado comprende una inosina. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende un ARN que tiene una mutación con cambio de sentido, un codón de terminación temprano, un sitio de empalme alternativo o un sitio de empalme anormal. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una proteína mutante, truncada o mal plegada.
[0060] «Célula huésped», tal como se describe en el presente documento, hace referencia a cualquier tipo de célula que se puede utilizar como una célula huésped, siempre y cuando se pueda modificar, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula huésped con adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR) expresada de manera endógena, o puede ser una célula huésped en la que se introduce una adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR) mediante un procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula procariota, una célula eucariota o una célula vegetal. En algunas realizaciones, la célula huésped se deriva de una línea celular preestablecida, tal como líneas celulares de mamíferos que incluyen líneas celulares humanas o líneas celulares no humanas. En algunas realizaciones, la célula huésped se deriva de un individuo, tal como un individuo humano.
[0061] «Introducir» o «introducción» utilizados en el presente documento significa suministrar uno o más polinucleótidos, tales como ARNd o una o más construcciones que incluyen vectores, tal como se describe en el presente documento, una o más transcritos de los mismos, en una célula huésped. La presente invención sirve como una plataforma básica para facilitar la edición dirigida de ARN, por ejemplo, ARN premensajero, un ARN mensajero, un ARN ribosómico, un ARN de transferencia, un ARN no codificante largo y un<a>R<n>pequeño (tal como ARNmi). Los procedimientos de la presente solicitud pueden utilizar muchos sistemas de suministro, que incluyen, pero no se limitan a, viral, liposomal, por electroporación, microinyección y conjugación, para lograr la introducción del ARNd o construcción, tal como se describe en el presente documento, en una célula huésped. Pueden utilizarse los procedimientos de transferencia de genes basados en procesos virales y no virales convencionales para introducir ácidos nucleicos en células de mamíferos o tejidos diana. Tales procedimientos pueden utilizarse para administrar ácidos nucleicos que codifican ARNd de la presente solicitud a células en cultivo o en un organismo huésped. Los sistemas de suministro de vector no viral incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ejemplo, un transcrito de una construcción descrita en el presente documento), ácido nucleico desnudo y un ácido nucleico formando complejo con un vehículo de suministro, tal como un liposoma. Los sistemas de suministro con vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados para el suministro a la célula huésped.
[0062] Los procedimientos de suministro no viral de ácidos nucleicos incluyen lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípido:ácido nucleico, electroporación, nanopartículas, exosomas, microvesículas o biolística, ADN desnudo y viriones artificiales.
[0063] El uso de sistemas basados en virales de ARN o ADN para el suministro de ácidos nucleicos tiene alta eficacia en el reconocimiento de un virus en células específicas y el tráfico de la carga viral hasta los núcleos de las células.
[0064] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el procedimiento comprende introducir un vector viral (tal como, un vector lentiviral) que codifica el ARNd en la célula huésped. En algunas realizaciones, el vector viral es un AAV, por ejemplo, AAV8. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende introducir un plásmido que codifica el ARNd en la célula huésped. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende introducir (por ejemplo, mediante electroporación) el ARNd (por ejemplo, ARNd sintético) en la célula huésped. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la transfección del ARNd en la célula huésped.
[0065] Después de la desaminación, se puede determinar la modificación del ARN diana y/o la proteína codificada por el ARN diana utilizando diferentes procedimientos dependiendo de las posiciones de las adenosinas reconocidas en el ARN diana. Por ejemplo, para determinar si «A» ha sido editada a «I» en el ARN diana, se pueden utilizar procedimientos de secuenciación de ARN conocidos en la técnica para detectar la modificación de la secuencia de ARN. Cuando la adenosina diana se ubica en la región codificante de un ARNm, la edición de ARN puede causar cambios en la secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones puntuales en el ARNm o una mutación puntual innata o adquirida en el ARNm, pueden invertirse para generar un producto productos génicos de tipo salvaje debido a la conversión de «A» en «I». Se puede utilizar la secuenciación de aminoácidos mediante los procedimientos conocidos en la técnica para encontrar cualquier cambio de residuos de aminoácidos en la proteína codificada. Se pueden determinar las modificaciones de un codón de terminación evaluando la presencia de una proteína funcional, alargada, truncada, de longitud completa y/o de tipo salvaje. Por ejemplo, cuando la adenosina diana se ubica en un codón de terminación de UGA, UAG o UAA, una modificación de la A (UGA o UAG) o As (UAA) diana puede crear una mutación de lectura y/o se puede invertir una proteína alargada o una proteína truncada codificada por el ARN diana para crear una proteína funcional, de longitud completa y/o de tipo salvaje. La edición de un ARN diana puede generar también un sitio de empalme anormal y/o un sitio de empalme alternativo en el ARN diana, conduciendo así a una proteína alargada, truncada o mal plegada, o un empalme anormal o un sitio de empalme alternativo codificado en el ARN diana se puede invertir para crear una proteína funcional, con plegado correcto, de longitud completa y/o de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la presente solicitud contempla la edición de cambios genéticos tanto innatos como adquiridos, por ejemplo, mutación con cambio de sentido, codón de terminación temprano, empalme anormal o sitio de empalme alternativo codificados por un ARN diana. Utilizando los procedimientos conocidos para evaluar la función de la proteína codificada por el<a>R<n>diana se puede averiguar si la edición de ARN logra los efectos deseados. Dado que la desaminación de la adenosina (A) a una inosina (I) puede corregir una A mutada en la posición diana en un ARN mutante que codifica una proteína, la identificación de la desaminación a inosina puede proporcionar la evaluación de si una proteína funcional está presente o si una enfermedad o un ARN asociado a resistencia a fármacos causados por la presencia de una adenosina mutada se invierte o se invierte parcialmente. De manera similar, dado que la desaminación de la adenosina (A) a una inosina (I) puede introducir una mutación puntual en la proteína resultante, la identificación de la desaminación a inosina puede proporcionar una indicación funcional para identificar una causa de enfermedad o un factor relevante de una enfermedad.
[0066] Cuando la presencia de una adenosina diana causa corte y empalme anormal, la lectura puede ser la evaluación de la aparición y la frecuencia de corte y empalme anormal. Por el otro lado, cuando la desaminación de una adenosina diana es deseable para introducir un sitio de empalme, entonces se pueden utilizar enfoques similares para verificar si tiene lugar el tipo de corte y empalme necesario. Un procedimiento adecuado de ejemplo para identificar la presencia de una inosina después de la desaminación de la adenosina diana es RT-PCR y la secuenciación, utilizando los procedimientos que se conocen bien por el experto en la técnica.
[0067] Los efectos de desaminación de adenosina o adenosinas diana incluyen, por ejemplo, mutación puntual, codón de terminación temprano, sitio de empalme anormal, sitio de empalme alternativo y mal plegado de la proteína resultante. Estos efectos pueden inducir cambios estructurales y funcionales de ARNs y/o proteínas asociados a enfermedades, tanto si se heredan genéticamente como si están causados por mutaciones genéticas adquiridas o pueden inducir cambios estructurales y funcionales de ARNs y/o proteínas asociados a la aparición de resistencia a fármacos. Por lo tanto, los ARNs, las construcciones que codifican los ARNs y los procedimientos de edición de ARN de la presente solicitud se pueden utilizar para prevenir o tratar enfermedades o afecciones genéticas hereditarias o enfermedades o afecciones asociadas a mutaciones genéticas adquiridas cambiando la estructura y/o la función de los ARNs y/o proteínas asociados a la enfermedad.
[0068] En algunas realizaciones, el ARN diana es un ARN regulador. En algunas realizaciones, el ARN diana a editar es un ARN ribosómico, un ARN de transferencia, un ARN no codificante largo o un ARN pequeño (por ejemplo, ARNmi, pri-ARNmi, pre-ARNmi, ARNpi, ARNsi, ARN pequeño no codificante (ARNsno), ARNpn, ARN extracelular (ARNex) o ARN específico de cuerpo de Cajal (ARNsca)). Los efectos de desaminación de adenosinas diana incluyen, por ejemplo, cambios estructurales y funcionales del ARN ribosómico, ARN de transferencia, ARN no codificante largo o ARN pequeño (por ejemplo, ARNmi), que incluyen cambios de estructura tridimensional y/o pérdida de función o aumento de función del ARN diana. En algunas realizaciones, la desaminación de las A diana en el ARN diana cambia el nivel de expresión de una o más moléculas en dirección 3' (por ejemplo, proteína, ARN y/o metabolitos) del ARN diana. Los cambios del nivel de expresión de las moléculas en dirección 3' pueden ser el aumento o la disminución del nivel de expresión.
[0069] Algunas realizaciones de la presente solicitud implican la edición múltiple de ARNs diana en células huésped, que son útiles para el cribado de diferentes variantes de un gen diana o genes diferentes en las células huésped. En algunas realizaciones, en las que el procedimiento comprende introducir una pluralidad de ARNd en las células huésped, como mínimo, dos de los ARNd de la pluralidad de ARNd tienen secuencias diferentes y/o tiene ARNs diana diferentes. En algunas realizaciones, cada ARNd tiene una secuencia diferente y/o ARN diana diferente. En algunas realizaciones, el procedimiento genera una pluralidad (por ejemplo, como mínimo, 2, 3, 5, 10, 50, 100, 1000 o más) de modificaciones en un ARN diana único en las células huésped. En algunas realizaciones, el procedimiento genera una modificación en una pluralidad (por ejemplo, como mínimo, 2, 3, 5, 10, 50, 100, 1000 o más) de ARNs diana en las células huésped. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la edición de una pluralidad de ARNs diana en una pluralidad de poblaciones de células huésped. En algunas realizaciones, cada población de células huésped recibe un ARNd diferente o un ARNd que tiene un ARN diana diferente de otras poblaciones de células huésped.
ARN reclutador de desaminasa, construcción y biblioteca
[0070] En un aspecto, la presente solicitud da a conocer un ARN reclutador de desaminasa útil para cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Cualquiera de los ARNd descritos en este apartado se puede utilizar en los procedimientos de edición y tratamiento de ARN descritos en el presente documento. Se pretende que cualquiera de las características y los parámetros de ARNd descritos en el presente documento se puede combinar uno con el otro, como si cada una de las combinaciones se describiese de manera individual. El ARNd descrito en el presente documento no comprende un ARNtracr, ARNcr o ARNg utilizados en el sistema CRISPR/Cas.
[0071] En algunas realizaciones, se da a conocer un ARN reclutador de desaminasa (ARNd) para la desaminación de una adenosina diana en un ARN diana mediante el reclutamiento de una ADAR, que comprende una secuencia de ARN complementaria que hibrida con el ARN diana.
[0072] En un aspecto, la presente solicitud da a conocer una construcción que comprende cualquiera de los ARNs reclutadores de desaminasa descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, la construcción es un vector viral, (tal como un vector de lentivirus) o un plásmido. En algunas realizaciones, el vector viral es un AAV, tal como AAV8. En algunas realizaciones, la construcción codifica un único ARNd. En algunas realizaciones, la construcción codifica una pluralidad (por ejemplo, aproximadamente uno de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 o más) de ARNd.
[0073] En un aspecto, la presente solicitud da a conocer una biblioteca que comprende una pluralidad de los ARNs reclutadores de desaminasa o una pluralidad de las construcciones descritas en el presente documento.
[0074] En un aspecto, la presente solicitud da a conocer una composición o una célula huésped que comprende el ARN reclutador de desaminasa o la construcción descrita en el presente documento. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota. Preferiblemente, la célula huésped es una célula de mamífero. Más preferiblemente, la célula huésped es una célula humana.
[0075] En los ARNd, construcciones, bibliotecas o composiciones descritos en el presente documento, la secuencia de ARN complementaria comprende una citidina, preferiblemente adicionalmente adenosina o uridina, directamente opuestas a la adenosina diana a ser editada en el ARN diana. En determinadas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria comprende adicionalmente una o más guanosinas que se encuentran cada una directamente opuestas a una adenosina no diana en el ARN diana. En determinadas realizaciones, el vecino más cercano al extremo 5' terminal de la A diana es un nucleótido seleccionado entre U, C, A y G con la preferencia de U>C“ A>G y el vecino más cercano al extremo 3' terminal de la A diana es un nucleótido seleccionado entre G, C, A y U con la preferencia de G>C>A“ U. En algunas realizaciones, el vecino más cercano al extremo 5' terminal de la A diana es U. En algunas realizaciones, el vecino más cercano al extremo 5' terminal de la A diana es C o A. En algunas realizaciones, el vecino más cercano al extremo 3' terminal de la A diana es G. En algunas realizaciones, el vecino más cercano al extremo 3' terminal de la A diana es C.
[0076] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los ARNd, construcciones, librerías o composiciones descritos en el presente documento, la A diana se encuentra está en un motivo de tres bases seleccionado entre el grupo que consiste en UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA y GAU en el ARN diana. En determinadas realizaciones, el motivo de tres bases es UAG y el ARNd comprende una A directamente opuesta a la U en el motivo de tres bases, una C directamente opuesta a la A diana y una C, G o U directamente opuestas a la G en un motivo de tres bases. En determinadas realizaciones, el motivo de tres bases es UAG en el ARN diana y el ARNd comprende ACC, ACG o ACU que se encuentran opuestos a la UAG del ARN diana.
[0077] El ARNd comprende un desemparejamiento de citidina directamente opuesto a la A diana en el ARN diana. En algunas realizaciones, el desemparejamiento de citidina se encuentra cerca del centro de la secuencia de ARN complementaria, tal como en 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos de distancia del centro de la secuencia de ARN complementaria. En algunas realizaciones, el desemparejamiento de citidina se encuentra a como mínimo 5 nucleótidos de distancia del extremo 5' terminal de la secuencia de ARN complementaria. En algunas realizaciones, el desemparejamiento de citidina se encuentra a como mínimo 20 nucleótidos de distancia del extremo 3' terminal de la secuencia de ARN complementaria.
[0078] En determinadas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los ARNd, construcciones, bibliotecas o composiciones descritos en el presente documento, el ARNd comprende más de aproximadamente cualquiera de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 nucleótidos. En determinadas realizaciones, el ARNd tiene aproximadamente cualquiera de 50-240, 60-230, 65-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75 200, 80-190, 85-180, 90-170, 95-160, 100-150 o 105-140 nucleótidos de longitud.
[0079] El ARNd comprende la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las SEQ ID NOs: 25-44, 142-205, 341 342.
[0080] El ARNd de la presente solicitud comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con el ARN diana. La secuencia de ARN complementaria es perfectamente complementaria o sustancialmente complementaria al ARN diana para facilitar la hibridación de la secuencia de ARN complementaria con el ARN diana. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria tiene un 100 % de complementariedad de secuencia como el ARN diana. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria tiene, como mínimo, aproximadamente cualquiera de 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de complementariedad sobre un tramo continuo de, como mínimo, aproximadamente cualquiera de 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 o más nucleótidos en el ARN diana. En algunas realizaciones, los ARNbc formados mediante la hibridación entre la secuencia de ARN complementaria y el ARN diana tiene uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) pares de base que no son de Watson-Crick (es decir, desemparejamientos).
[0081] La ADAR, por ejemplo, enzimas ADAR humanas, editan estructuras de ARN de doble cadena (ARNbc) con especificidad variable, dependiendo de un número de factores. Un factor importante es el grado de complementariedad de las dos cadenas que constituyen la secuencia de ARNbc. La complementariedad perfecta entre el ARNd y el ARN diana provoca normalmente la desaminación de adenosinas por el dominio catalítico de ADAR de un modo no discriminatorio. La especificidad y la eficacia de ADAR se puede modificar mediante la introducción de desemparejamientos en la región de ARNbc. Por ejemplo, un desemparejamiento de A-C es perfectamente recomendable para aumentar la especificidad y la eficacia de desaminación de la adenosina a ser editada. Por otro lado, en otras posiciones de A (adenosina) diferentes a la A diana (es decir, «A no diana»), el desemparejamiento de G-A puede reducir la edición de diana no deseada. La complementariedad perfecta no es necesariamente requerida para una formación de ARNbc entre el ARNd y su ARN diana, siempre que exista complementariedad sustancial de hibridación y formación del ARNbc entre el ARNd y el ARN diana. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNd o la región de ARN de cadena única del mismo tiene, como mínimo, aproximadamente cualquiera de 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de complementariedad de secuencia en relación con el ARN diana cuando se alinean de manera óptima. La alineación óptima se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para la alineación de secuencias, entre los ejemplos no limitativos de los cuales se incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wimsch, algoritmos basados en la transformación de Burrows-Wheeler (por ejemplo, el alineador de Burrows Wheeler).
[0082] Los nucleótidos vecinos a la adenosina diana también afectan a la especificidad y la eficacia de la desaminación. Por ejemplo, el vecino más cercano al extremo 5' terminal de la adenosina diana para ser editada en la secuencia de ARN diana tiene la preferencia de U>C=A>G el vecino más cercano al extremo 3' terminal de la adenosina diana para ser editada en la secuencia de ARN diana tiene la preferencia de G>C>A“ U en términos de especificidad y eficacia de desaminación de adenosina. En algunas realizaciones, cuando la adenosina diana puede estar presente en un motivo de tres bases seleccionado entre el grupo que consiste en UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA y GAU en el ARN diana, la especificidad y la eficacia de desaminación de adenosina son superiores a adenosinas en otros motivos de tres bases. En algunas realizaciones, cuando la adenosina diana para ser editada se encuentra en el motivo de tres bases de UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, AAG, AAC o AAA, la eficacia de desaminación de adenosina es muy superior que adenosinas en otros motivos. En lo que se refiere al mismo motivo de tres bases, diferentes diseños de ARNd pueden conducir también a diferente eficacia de desaminación. Tomando como un ejemplo el motivo de tres bases de UAG, en algunas realizaciones, cuando el ARNd comprende citidina (C) directamente opuesta a la adenosina diana para ser editada, la adenosina (A) directamente opuesta a la uridina, y la citidina (C), guanosina (G) o uridina (U) directamente opuestas a la guanosina, la eficacia de la desaminación de la adenosina diana es superior a aquella utilizando otras secuencias de ARNd. En algunas realizaciones, cuando el ARNd comprende ACC, ACG o ACU opuestos a UAG del ARN diana, la eficacia de edición de la A en la UAG del ARN diana puede alcanzar aproximadamente 25 %-30 %.
[0083] Además de las adenosinas diana, puede haber una o más adenosinas en el ARN diana, que no son deseables para ser editadas. En lo que respecta a estas adenosinas, se prefiere reducir su eficacia de edición tanto como sea posible. Se descubrió mediante esta invención que cuando la guanosina se encuentra directamente opuesta a una adenosina en el ARN diana, la eficacia de desaminación se disminuye de manera significativa. Por consiguiente, para disminuir la desaminación de diana no deseada, los ARNd pueden diseñarse para comprender una o más guanosinas opuestas directamente a una o más adenosinas distintas de la adenosina diana para ser editada en el ARN diana.
[0084] El nivel deseado de especificidad y eficacia de edición de la secuencia de ARN diana puede depender de aplicaciones diferentes. Siguiendo las instrucciones de la presente solicitud de patente, los expertos en la técnica serán capaces de diseñar un ARNd que tiene secuencia complementaria o sustancialmente complementaria con relación a la secuencia de ARN diana de acuerdo con sus necesidades, y con un poco de prueba y error, obtener sus resultados deseados. Tal como se describe en el presente documento, el término «desemparejamiento»(missmatch,en inglés) hace referencia a nucleótidos opuestos en un ARN de doble cadena (ARNbc) que no forman pares de base perfectas de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Los pares de bases de desemparejamiento incluyen, por ejemplo, pares de bases de G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U. Tomando como ejemplo la pareja de A-C, donde una A diana tiene que ser editada en el ARN diana, se diseña un ARNd para comprender una C opuesta a la A a ser editada, generando un desemparejamiento de A-C en el ARNbc formado mediante la hibridación entre el ARN diana y el ARNd.
[0085] En algunas realizaciones, el ARNbc formado mediante la hibridación entre el ARNd y el ARN diana no comprende un desemparejamiento. En algunas realizaciones, el ARNbc formado mediante la hibridación entre el ARNd y el ARN diana comprende uno o más, tal como cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o más desemparejamientos (por ejemplo, el mismo tipo de diferentes tipos de desemparejamientos). En algunas realizaciones, el ARNbc formado mediante la hibridación entre el ARNd y el ARN diana comprende uno o más tipos de desemparejamientos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 tipos de desemparejamientos seleccionados entre el grupo que consiste en G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C y U-U.
[0086] Los nucleótidos de desemparejamiento en el ARNbc formado mediante la hibridación entre el ARNd y el ARN diana pueden formar protuberancias, que pueden promover la eficacia de edición del ARN diana. Puede existir una (que solamente se forma en la adenosina diana) o más protuberancias formadas mediante los desemparejamientos. Los desemparejamientos que inducen protuberancias adicionales pueden ubicarse en dirección 5' y/o en dirección 3' de la adenosina diana. Las protuberancias pueden ser protuberancias de desemparejamiento único (causados por un par de bases desemparejadas) o protuberancias de desemparejamientos múltiples (causados por más de un par de bases desemparejadas consecutivas, preferiblemente dos o tres pares de bases desemparejadas consecutivas).
[0087] La secuencia de ARN complementaria en el ARNd es de cadena única. El ARNd puede ser en su totalidad de cadena única o tener una o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o más) regiones de doble cadena y/o una o más regiones de tallo bucle. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria es como mínimo aproximadamente cualquiera de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o más nucleótidos. En determinadas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria es aproximadamente cualquiera de 50-240, 60-230, 65-220, 70-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75-200, 80-190, 85-180, 90-170, 95-160, 100-200, 100-150, 100-175, 110-200, 110 175, 110-150 o 105-140 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria tiene aproximadamente 71 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN complementaria tiene aproximadamente 111 nucleótidos de longitud.
[0088] En algunas realizaciones, el ARNd, además de la secuencia de ARN complementaria, comprende adicionalmente regiones de estabilización de ARNd, por ejemplo, una o más regiones de doble cadena y/o regiones de tallo bucle. En algunas realizaciones, la región de doble cadena o región de tallo bucle del ARNd comprende no más de aproximadamente cualquiera de 200,55150, 100, 50, 40, 30, 20, 10 o menos pares de bases. En algunas realizaciones, el ARNd no comprende una región de tallo bucle o de doble cadena. El ARNd no comprende un dominio reclutados de ADAR.
[0089] El ARNd pueden comprender una o más modificaciones. En algunas realizaciones, el ARNd contiene uno o más nucleótidos modificados, que incluyen modificación de nucleobase y/o modificación de esqueleto. Las modificaciones de ejemplo del ARN incluyen, pero no se limitan a, modificación de esqueleto con fosforotioato, sustituciones en 2' en la ribosa (tal como sustituciones de 2'-O-metilo y 2'-fluoro), LNA y L-ARN. En algunas realizaciones, el ARNd no tiene modificaciones de nucleobase o del esqueleto.
[0090] La presente solicitud contempla también una construcción que comprende el ARNd descrito en el presente documento. El término «construcción», tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a moléculas de ADN o ARN que comprenden una secuencia de nucleótidos codificante que puede transcribirse en ARNs o expresarse en proteínas. En algunas realizaciones, la construcción contiene uno o más elementos reguladores unidos de manera operativa con la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN o proteína. Cuando la construcción se introduce en una célula huésped, bajo condiciones adecuadas, la secuencia de nucleótidos codificante en la construcción puede transcribirse o expresarse.
[0091] En algunas realizaciones, la construcción comprende un promotor que se une de manera operativa o se conecta espacialmente con la secuencia de nucleótidos codificante, de tal modo que el promotor controla la transcripción o la expresión de la secuencia de nucleótidos codificante. Un promotor puede posicionarse en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos codificante bajo su control. La distancia entre el promotor y la secuencia codificante puede ser aproximadamente la misma que la distancia entre el promotor y el gen que la controla en el gen del que proviene el promotor. Tal como se conoce en la técnica, la variación en esta distancia puede adaptarse sin la pérdida de la función promotora. En algunas realizaciones, la composición comprende un 5' UTR y/o un 3' UTR que regula la transcripción o la expresión de la secuencia de nucleótidos codificante.
[0092] En algunas realizaciones, la construcción es un vector que codifica cualquiera de los ARNd divulgados en la presente solicitud. El término «vector» hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son de cadena única, doble cadena o doble cadena parcialmente; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (por ejemplo, circular); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un «plásmido», que hace referencia a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que pueden insertarse los segmentos de ADN adicionales, tal como mediante técnicas de clonación molecular estándar. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tiene origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la transcripción o la expresión de secuencias de nucleótidos codificantes a las que se unen de manera operativa. Tales vectores se denominan en el presente documento «vectores de expresión».
[0093] Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la presente invención en una forma adecuada para la transcripción o la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. En algunas realizaciones, el vector de expresión recombinante incluye uno o más elementos reguladores, que pueden seleccionarse basándose en las células huésped a utilizar para la transcripción o la expresión, que está unido de manera operativa a la secuencia de ácido nucleico a transcribir o expresar. En un vector de expresión recombinante, «unido de manera operativa» pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés se une al elemento o elementos reguladores de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped).
[0094] En algunas realizaciones, se da a conocer una construcción (por ejemplo, un vector, tal como vector viral) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNd. En algunas realizaciones, se da a conocer una construcción (por ejemplo, un vector, tal como vector viral) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la ADAR. En algunas realizaciones, se da a conocer una construcción que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica el ARNd y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la ADAR. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están unidas de manera operativa al mismo promotor. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están unidas de manera operativa a promotores diferentes. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, la construcción no codifica la ADAR. En algunas realizaciones, el vector comprende adicionalmente una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un inhibidor de ADAR3 (por ejemplo, shARN o siARN de ADAR3) y/o un estimulador de interferón (e.g., IFN-a). En algunas realizaciones, la construcción es un AAV, tal como AAV8.
Composiciones
[0095] También se dan a conocer en el presente documento composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de los ARNd, construcciones, bibliotecas o células huésped que tienen un ARN editado tal como se describe en el presente documento.
[0096] En algunas realizaciones, se da a conocer una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ARNd o construcciones que codifican el ARNd descritos en el presente documento, y un portador, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. Los portadores, excipientes y estabilizadores farmacéuticamente aceptables de ejemplo se han descrito, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores, excipientes o estabilizadores adecuados son no tóxicos para los receptores con las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; parabenos de alquilo, tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones se dan a conocer formulaciones liofilizadas. Las composiciones farmacéuticas para ser utilizadas en la administraciónin vivodeben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estéril.
Realizaciones de ejemplo
EJEMPLO
[0097] Los ejemplos a continuación pretenden servir de ejemplo de la presente solicitud. Los siguientes ejemplos y la descripción detallada se ofrecen a modo de ilustración.
Materiales y métodos
Construcción de plásmidos
[0098] El reportero de fluorescencia dual se clonó mediante amplificación por PCR de ADN codificante de mCherry y EGFP (se eliminó el primer codón ATG de EGFP), se añadieron el enlazador 3xGS y la secuencia de ADN de reconocimiento mediante los cebadores durante la PCR. A continuación, los productos de PCR se escindieron y se enlazaron mediante enzima de restricción BsmB1 de tipo IIs (Thermo) y T4 ADN ligasa (NEB), que se insertaron a continuación en el esqueleto de pLenti (pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd, Stanley Cohen Lab, Stanford University).
[0099] El ADN de dLbuCas13 se amplificó mediante PCR a partir de los plásmidos Lbu (Addgene #83485). Las ADAR1DD y ADAR2DD se amplificaron a partir de ADNc de Adar1(p150) y ADNc de Adar2, ambos fueron obsequios de laboratorio Han de la Universidad de Xiamen. La ADAR1DD o ADAR2DD se fusionaron con dLbuCas13 ADN mediante la PCR de solapamiento y se insertaron los productos de PCR fusionados en el esqueleto de pLenti.
[0100] Para la expresión de ARNd en células de mamíferos, las secuencias de ARNd se sintetizaron directamente (para ARNd cortos) y se hibridaron o amplificaron por PCR mediante la síntesis de ADNss solapante, y los productos se clonaron en los vectores correspondientes bajo la expresión de U6 mediante la clonación Golden-gate.
[0101] Las Adar1(p110) y Adar1(p150) de longitud completa se amplificaron con PCR a partir de ADNc de Adar1(p150), y las Adar2 de longitud completa se amplificaron por PCR a partir de ADNc de Adar2, que a continuación se clonaron en el esqueleto do pLenti, respectivamente.
[0102] Para las tres versiones de reporteros de fluorescencia dual (Reportero-1, -2 y -3), se amplificaron por PCR las secuencias que codificabanmCherryyEGFP(se eliminó la ATG de codón inicial de EGFP), se digirieron utilizando BsmBI (Thermo Fisher Scientific, ER0452), seguido de ligadura mediada por T4 ADN ligasa (NEB, M0202L) con enlazadores GGGGS. Posteriormente, el producto de ligadura se insertó en el esqueleto de pLenti-CMV-MCS-PURO.
[0103] Para la construcción que expresa dLbuCas13-ADARoü (E1008Q), se amplificó el gen de ADAR1DD a partir de la construcción de ADAR1p150 (obsequio del Laboratorio Jiahuai Han, Universidad de Xiamen). El gen de dLbuCas13 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido Lbu C2c2 R472A H477A R1048A_ H1053A (Addgene #83485). La ADAR1<dd>(variante de E1008Q hiperactiva) se generó mediante la PCR de superposición y, a continuación, se fusionó con dLbuCas13. Los productos de ligadura se insertaron en el esqueleto de pLenti-CMV-MCS-BSD.
[0104] Para la construcción que expresa ARNar, se sintetizaron las secuencias de ARNar y se clonaron mediante golden-gate en el esqueleto de pLenti-sgRNA-lib 2.0 (Addgene #89638), y la transcripción de ARNar se impulsó mediante el promotor hU6. Para las construcciones que expresan ADAR, las ADAR1p110 y ADAR1p150 de longitud completa se amplificaron por PCR a partir de la construcción de ADAR1p150, y la ADAR2 de longitud completa se amplificó mediante PCR a partir de la construcción de ADAR2 (un obsequio de Laboratorio Jiahuai Han, Universidad de Xiamen). A continuación, los productos amplificados se clonaron en el esqueleto de pLenti-CMV-MCS-BSD. Para las construcciones que expresan genes con mutaciones patógenas, las secuencias codificantes de longitud completa deTP53(pedidos de Vigenebio) y otros 6 genes relevantes de enfermedades(COL3A1, BMPR2, AHI1, FANCC, MYBPC3yIL2RG,obsequios de Laboratorio Jianwei Wang, Instituto de biología patógena, Academia China de Ciencias Médicas) se amplificaron a partir de las construcciones que codifican los genes correspondientes con la introducción de mutaciones de G>A a través de la PCR de mutagénesis. Los productos amplificados se clonaron en el esqueleto de pLenti-CMV-MCS-mCherry mediante el procedimiento59 de clonación de Gibson.
Líneas celulares de mamíferos y Cultivo celular
[0105] Las líneas celulares de mamíferos se cultivaron en el medio Eagle modificado Dulbecco (10-013-CV, Corning, Tewksbury, MA, EE. UU.), añadiendo suero bovino fetal al 10 % (Lanzhou Bailing Biotechnology Co., Ltd., Lanzhou, China), suplementado con penicilina-estreptomicina al 1 % bajo 5% de CO2 a 37°C. La línea celular Adar1-KO se adquirió en EdiGene China, y los resultados de genotipificación también fueron proporcionados por EdiGene China.
[0106] Las líneas celulares HeLa y B16 eran del laboratorio Z. Jiang (Universidad de Beijing). Y la línea celular HEK293T era de laboratorio C. Zhang (Universidad de Beijing). La línea celular RD era de laboratorio J Wang (Instituto de Biología Patógena, Colegio Médico de la Unión de Beijing & Academia China de Ciencias Médicas). Las líneas celulares SF268 procedían de Centro de Células, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas. Las líneas celulares A549 y SW13 procedían de EdiGene Inc. Las líneas celulares HepG2, HT29, NIH3T3 y MEF se mantuvieron en nuestro laboratorio en la Universidad de Beijing. Estas líneas celulares de mamíferos se cultivaron en el medio Eagle modificado de Dulbecco (Corning, 10-013-CV) con suero bovino fetal al 10 % (CellMax, SA201.02), suplementadas adicionalmente con penicilina-estreptomicina al 1 % bajo 5 % de CO2 a 37°C. A menos que se describa lo contrario, las células se transfectaron con el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (Roche, 06366546001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
[0107] Los fibroblastos pulmonares primarios humanos (#3300) y las células epiteliales bronquiales primarias humanas (#3210) se adquirieron en ScienCell Research Laboratories, Inc. y se cultivaron en el medio de fibroblastos (ScienCell, #2301) y el medio de células epiteliales bronquiales (ScienCell, #3211), respectivamente. Ambos medios se suplementaron con suero bovino fetal al 15 % (BI) y penicilina-estreptomicina al 1 %. Las células GM06214 y GM01323 primarias se solicitaron el Instituto Coriell de Investigación Médica y se cultivaron en el medio Eagle modificado de Dulbecco (Corning, 10-013-CV) con suero bovino fetal (BI) y penicilina-estreptomicina al 1 %. Todas las células se cultivaron bajo 5 % de CO2 a 37°C.
Transfección de sistema reportero, análisis porFACS y secuenciación de Sanger
[0108] Para los experimentos de edición de reportero de fluorescencia dual, las células 293T-WT o las células 293T-Adar1-KO se sembraron en placas de 6 pocillos (6 x 105 células/pocillo), 24 horas después, 1,5 |jg de plásmidos reporteros y 1,5 jg de plásmidos de ARNd se transfectaron conjuntamente utilizando el reactivo de transfección de<a>D<n>X-tremeGENE HP (06366546001; Roche, Mannheim, Alemania), de acuerdo con los protocolos del proveedor. De 48 a 72 horas después, las células se recogieron y se les realizó un análisis mediante FACS. Para confirmar adicionalmente la edición de ARNm de reportero, se clasificaron las células EGFP-positivas y las células 293T-WT transfectadas con el reportero y los plásmidos de ARNd utilizando una citometría de flujo FACS Aria (BD Biosciences), seguido de aislamiento total de ARN (TIANGEN, DP430). A continuación, el ARN se transcribió de forma inversa en ADNc a través de RT-PCR (TIANGEN, KR103-04), y los locus reconocidos se amplificaron con PCR con los pares de cebadores correspondientes (23 ciclos de PCR) y los productos de PCR se purificaron mediante la secuenciación de Sanger.
[0109] Para los experimentos de rescate y sobreexpresión de Adar1(p110), Adar1(p150) o Adar2, las células 293T-WT o las células 293T-Adar1-KO se sembraron en placas de 12 pocillos (2,5 x 105 células/pocillo), 24 horas después, 0,5 jg de plásmidos de reportero, 0,5 jg de plásmidos de ARNd y 0,5 jg de plásmidos de Adar1/2 (esqueleto de pLenti como control) se transfectaron conjuntamente utilizando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (06366546001, Roche, Mannheim, Alemania). De 48 a 72 horas después, las células se recogieron y se les realizó un análisis mediante FACS.
[0110] Para los experimentos de ARNm endógeno, las células 293T-WT se sembraron en placas de 6 pocillos (6 x 105 células/pocillo). Cuando se llegó a aproximadamente el 70% de confluencia, 3 jg de plásmidos de ARNd se transfectaron utilizando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (06366546001, Roche, Mannheim, Alemania). 72 horas más tarde, las células recogidas se almacenaron y se clasificaron las células GFP-positivas o BFP-positivas (de acuerdo con el marcador fluorescente correspondiente) mediante FACS para el posterior aislamiento de ARN.
Aislamiento y cultivo de células T primarias humanas
[0111] Se aislaron células T humanas primarias de productos de leucoféresis de donante humano sano. De forma resumida, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la centrifugación de Ficoll (Dakewei, AS1114546), y las células T se aislaron mediante la selección negativa magnética utilizando un equipo de aislamiento de células T humanas EasySep (STEMCELL, 17951) de PBMCs. Después del aislamiento, las células T se cultivaron en un medio X-vivo15, 10 % de FBS e IL2 (1000 U/ml) y se estimularon con DynaBeads CD3/CD28 (ThermoFisher, 11131D) durante 2 días. Los productos de leucoféresis de donantes sanos se adquirieron en AllCells LLC China. Todos los donantes sanos firmaron el consentimiento informado.
Paquete de lentivirus y construcción de líneas celulares de reporteros
[0112] Los plásmidos de expresión se transfectaron conjuntamente en células HEK293T-WT, junto con dos plásmidos de empaquetamiento vírico, pR8.74 y pVSVG (Addgene) a través del reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP. 72 horas más tarde, se recogió el virus sobrenadante y se almacenó a -80°C. Las células HEK293T-WT se infectaron con lentivirus, 72 horas después, se clasificaron las células mCherry-positivas mediante FACS y se cultivaron para seleccionar líneas celulares de un solo clon que expresaban de manera estable el sistema reportero de fluorescencia dual con el entorno de EGFP mucho más bajo limitando el procedimiento de dilución.
[0113] Para las líneas celulares de reportero estables, las construcciones de reportero (esqueleto de pLenti-CMV-MCS-PURO) se transfectaron conjuntamente en células HEK293T, junto con dos plásmidos de empaquetamiento vírico, pR8.74 y pVSVG. 72 horas más tarde, se recogió el virus sobrenadante y se almacenó a -80°C. Las células HEK293T se infectaron con lentivirus, a continuación, se clasificaron las células mCherry-positivas mediante FACS y se cultivaron para seleccionar líneas celulares de un solo clon que expresaban de manera estable el sistema de reportero de fluorescencia dual sin el entorno de EGFP detectable. Se generaron las líneas celularesADAR1-/-yTP53-/- de HEK293T de acuerdo con el procedimiento60 descrito anteriormente. El ARNsg con reconocimiento de ADAR1 y el ADN donante amplificado por PCR que contiene gen resistente a puromicina inducida por CMV se transfectaron conjuntamente en células HEK293T. A continuación, las células se trataron con puromicina durante 7 días después de la transfección. Se aislaron las clones únicos de células resistentes a puromicina seguido de verificación mediante la secuenciación y transferencia Western.
Edición de ARN de transcritos expresados de manera endógena o exógena
[0114] Para la evaluación de la edición de ARN en el reportero de fluorescencia dual, células HEK293T o células HEK293T ADAR1'/_ se sembraron en placas de 6 pocillos (6x105 células/pocillo). 24 horas después, las células se transfectaron conjuntamente con 1,5 |jg de plásmidos reportero y 1,5 |jg de plásmidos de ARNar. Para examinar el efecto de la expresión de proteínas ADAR1p110, ADAR1p150 o ADAR2, la eficacia de edición se evaluó mediante la proporción de EGFP positiva y secuenciación profunda.
[0115] Se sembraron células HEK293TADAR1-/-en placas de 12 pocillos (2,5x105 células/pocillo). 24 horas después, las células se transfectaron conjuntamente con 0,5 jg de plásmidos de reportero, 0,5 jg de plásmidos de ARNar y 0,5 jg de plásmidos de ADAR1/2 (esqueleto de pLenti como control). La eficacia de edición se evaluó mediante la proporción de EGFP positiva y secuenciación profunda.
[0116] Para evaluar la edición de ARN en transcritos de ARNm endógeno, se sembraron células HEK293T en placas de 6 pocillos (6x105 células/pocillo). Veinticuatro horas más tarde, las células se transfectaron con 3 jg de plásmidos de ARNar. La eficacia de edición se analizó mediante la secuenciación profunda.
[0117] Para evaluar la eficacia de edición de ARN en múltiples líneas celulares, 8-9x104 células (RD, SF268, HeLa) o 1,5x105 células (HEK293T) se sembraron en placas de 12 pocillos. Para las células difíciles de transfectar, tales como HT29, A549, HepG2, SW13, NIH3T3, MEF y B16, 2-2,5x105 de células se sembraron en placas de 6 pocillos. Veinticuatro horas después, los reporteros y plásmidos de ARNar se transfectaron conjuntamente en estas células. La eficacia de edición se evaluó mediante la proporción de EGFP positiva.
[0118] Para evaluar la proporción de EGFP positiva, en un periodo de 48 a 72 horas después de la transfección, las células se clasificaron y se recogieron mediante el análisis de clasificación de células activado por fluorescencia (FACS). La señal de mCherry sirvió como un marcador de selección fluorescente para las células que expresan reportero/ARNar y los porcentajes de células de EGFP+/mCherry+ se calcularon como la lectura de eficacia de edición.
[0119] Para la cuantificación de NGS de la tasa de edición de A a I, en un periodo de 48 a 72 horas después de la transfección, las células se clasificaron y se recogieron mediante el ensayo de FACS y, a continuación, se sometieron a aislamiento de ARN (TIANGEN, DP420). A continuación, los ARNs totales se transcribieron de forma la inversa en ADNc mediante RT-PCR (TIANGEN, KR103-04), y el locus reconocido se amplificó mediante PCR con los cebadores correspondientes enumerados en la siguiente tabla.
[0120] Los productos de PCR se purificaron para la secuenciación de Sanger o NGS (IMumina HiSeq X Ten).
Secuenciación profunda
[0121] Para los experimentos de edición de ARNm endógeno, las células 293T-WT se sembraron en placas de 6 pocillos (6x105 células/pocillo). Cuando aproximadamente hubo un 70% de confluencia, las células HEK293 se transfectaron con 3 |jg de ARNd utilizando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (Roche). 72 horas más tarde, se clasificaron las células GFP-positivas o BFP-positivas (de acuerdo con el marcador fluorescente correspondiente) mediante FACS seguido de aislamiento de ARN. A continuación, el ARN aislado se transcribió de manera inversa en ADNc mediante RT-PCR, y el locus de gen reconocido específico se amplificó con el par de cebadores correspondiente (23 ciclos de PCR) y se secuenció en Illumina NextSeq.
Pruebas con múltiples líneas celulares
[0122] Aparte de las células HEK293T (control positivo) y HEK293T ADAR1_/_ (control negativo), se seleccionaron una línea celular de ratón (NIH3T3), así como siete líneas celulares humanas (RD, HeLa, SF268, A549, HepG2, HT-29, SW13) originarias de diferentes tejidos y órganos para realizar el experimento. Para las líneas celulares con eficacia de transfección más alta, aproximadamente 8-9 x 104 de células (RD, HeLa, SF268) o 1,5 x 105 células (HEK293T) se colocaron en cada pocillo o placas de 12 pocillos, en lo que se refiere a las células (A549, HepG2, HT-29, SW13, NIH3T3) que son difíciles de transfectar, 2-2,5 x 105 células se colocaron en placas de 6 pocillos. Y todas estas células se mantuvieron en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Corning) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, CellMax) con 5 % de CO2 a 37°C. 24 horas después, el reportero C<g>2 y el plásmido de ARNd de 71nt (35-C-35) se transfectaron conjuntamente en diferentes tipos de células con el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (Roche). 48 horas después de la transfección, las células se tripsinizaron y se analizaron mediante FACS (BD). Debido a que las células con eficacia de transfección baja tenían bastante menos células positivas de mCherry y BFP, se incrementó el número total de células para el análisis de FACS hasta 1 x 105 para aquellas células que se colocaron en placas de 6 pocillos.
Análisis de edición de ARN para sitios reconocidos
[0123] Para el análisis de secuenciación profunda, se generó un índice utilizando la secuencia de sitio reconocida (20 nt en dirección 5' y en dirección 3') de secuencias que recubren ARNar. Las lecturas se alinearon y se cuantificaron utilizando BWA de la versión 0.7.10-r789. A continuación, los BAMs de alineación se clasificaron mediante Samtools, y los sitios de edición de ARN se analizaron utilizando REDitools versión 1.0.4. Los parámetros son los siguientes: -U [AG o TC] -t 8 -n 0,0 -T 6-6 -e -d -u. Todas las conversiones de A>G significativas en una región reconocida de ARNar calculadas mediante la prueba exacta de Fisher (valor p < 0,05) se consideraron ediciones por ARNar. Las conversiones a excepción de adenosina diana eran ediciones de diana no deseadas. Las mutaciones que aparecieron en grupos de control y experimentales de manera simultánea se consideraron SNPs.
Análisis de secuenciación de ARN variado de transcriptomas
[0124] Los plásmidos que expresan ARN Ctrl-i51 o ARNar-isi-PPIB con casete de expresión de BFP se transfectaron en las células HEK293T. Las células BFP+ se enriquecieron mediante FACS 48 horas después de la transfección y los ARNs se purificaron con el equipo ARNprep Pure Micro (TIANGEN, DP420). A continuación, se purificó el ARNm utilizando el módulo de aislamiento magnético de ARNm de poli(A) NEBNext (New England Biolabs, E7490), se procesó con el equipo de preparación de biblioteca de ARN NEBNext Ultra II para Illumina (New England Biolabs, E7770), seguido del análisis de secuenciación profunda utilizando la plataforma Illumina HiSeq X Ten (2 x 150 pb por extremo emparejado; 30G para cada muestra). Para excluir un efecto no específico causado por la transfección, se incluyó el grupo de simulación en el que solamente se trataron las células con reactivo de transfección. Cada grupo contenía cuatro réplicas.
[0125] El proceso de análisis bioinformático hizo referencia al trabajo de Vogelet ai22.El control de calidad de análisis se llevó a cabo utilizando FastQC, y el ajuste de calidad se basó en Cutadapt (las primeras 6 pb para cada lectura se cortaron y hasta 20 pb se sometieron al ajuste de calidad). Se utilizaron las secuencias de comandos de AWK para filtrar los ARNar introducidos. Después del ajuste, las lecturas con longitudes inferiores a 90 nt se filtraron. Posteriormente, las lecturas filtradas se mapearon al genoma de referencia (GRCh38-hg38) mediante software61 de STAR. Utilizamos los GATK Haplotypcaller62 para llamar a las variantes. Los archivos VCF sin procesar generados por GATK se filtraron y anotaron mediante filtración de GATKVariant Filtration, bcftools y ANNOVAR63. Las variantes en dbSNP, 1000 Genome64, EVS se filtraron. A continuación, las variantes compartidas en cuatro réplicas de cada grupo se seleccionaron como los sitios de edición de ARN. El nivel de edición de ARN de grupo de simulación se observó como la base, y las dianas generales de ARN Ctrl-151 y ARNar151-PPIB se obtuvieron sustrayendo las variantes del grupo de simulación.
[0126] Para evaluar si LEAPER perturba la homeostasis de edición natural, se analizaron los sitios de edición global compartidos por el grupo de simulación y el grupo de ARNar151-PPIB (o grupo de ARN Ctrl-^-i). Se evaluaron las diferentes tasas de edición de ARN diferencial en sitios de edición de A a I originales mediante el análisis de coeficientes de correlación de Pearson. Las correlaciones de Pearson de tasa de edición entre el grupo de simulación y el grupo de ARNar-isi-PPIB (o grupo de ARN Ctrhs-i) se calcularon y se anotaron en la Figura 6.
X significa la tasa de edición de cada sitio en el grupo de simulación;Ysignifica la tasa de edición de cada sitio en el grupo de ARN Ctrli5i (Figura 6A) o el grupo de ARNari5i-PPIB (Figura 6B);Oxes la desviación estándar de X;oyes la desviación estándar deY; j xes la media de X;j yes la media deY; Ees la expectativa.
[0127] Los datos de ARN-Seq se analizaron para el interrogatorio de posibles cambios transcripcionales inducidos por los eventos de edición de ARN. El análisis de expresión genética variado de transcriptomas se llevó a cabo utilizando software65 de HISAT2 y STRINGTIE. Se utilizaron Cutadapt y FastQC para el control de calidad de los datos de secuenciación. A continuación, las lecturas de secuenciación se mapearon al genoma de referencia (GRCh38-hg38) utilizando HISAT2, seguido del análisis de coeficientes de correlación de Pearson tal como se menciona anteriormente.
Transferencia Western
[0128] Se utilizaron, respectivamente, anticuerpos primarios monoclonales de ratón contra ADAR1 (Santa Cruz, sc-271854), ADAR2 (Santa Cruz, sc-390995), ADAR3 (Santa Cruz, sc-73410), p53 (Santa Cruz, sc-99), KRAS (Sigma, SAB1404011); GAPDH (Santa Cruz, sc-47724) y p-tubulina (CWBiotech, CW0098). El anticuerpo secundario de IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP (H+L, 115-035-003) se adquirió en Jackson ImmunoResearch. 2x106 células se clasificaron para el lisado y se cargó una cantidad igual de cada lisado en SDS-PAGE. A continuación, las proteínas de muestra se transfirieron en membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories) y se inmunotransfirieron con anticuerpos primarios contra una de las enzimas de ADAR (anti-ADAR1, 1:500; anti-ADAR2, 1:100; anti-ADAR3, 1:800), seguido de incubación con anticuerpos secundarios (1:10,000) y exposición. La p-tubulina se volvió a sondar en la misma membrana de PVDF después de la extracción de las proteínas de ADAR con el tampón de extracción (CWBiotech, CW0056). Los experimentos se repitieron tres veces. El análisis semicuantitativo se realizó con el software de Image Lab.
Ensayo de expresión de atocinas
[0129] Se sembraron células HEK293T en placas de 12 pocillos (2,5 x105 células/pocillo). Cuando la confluencia llegó a aproximadamente el 70 %, las células se transfectaron con 1,5 |jg de ARNar. Como control positivo, se transfectó 1 |jg de poli(I:C) (Invitrogen, tlrl-picw). Cuarenta y ocho horas después, las células se recogieron y se sometieron al aislamiento de ARN (TIANGEN, DP430). A continuación, los ARNs totales se transcribieron de forma inversa en ADNc mediante RT-PCR (TIANGEN, KR103-04), y se midió la expresión de IFN-p e IL-6 mediante PCR cuantitativa (TAKARA, RR820A). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla anterior.
Ensayo de actividad reguladora transcripcional de p53
[0130] Los plásmidos que expresan ADNc de TP53W53X y los plásmidos que expresan ARNar se transfectaron conjuntamente en las células HEK293TTP53-/-,junto con los plásmidos reporteros en cis de p53-luciferasa de luciérnaga (YRGene, VXS0446) y los plásmidos de luciferasa de Renilla (una donación del laboratorio Z. Jiang, Universidad de Beijing) para detectar la actividad reguladora transcripcional de p53. 48 horas más tarde, las células se recogieron y se sometieron al ensayo con el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo de Promega (Promega, E4030) de acuerdo con el protocolo del fabricante. De forma resumida, se añadieron 150 j l del reactivo de luciferasa Dual-Glo a los sedimentos celulares recogidos, y 30 minutos después, la luminiscencia de luciérnaga se midió mediante la adición de 100 j l del reactivo de luciferasa Dual-Glo (lisado celular) a la placa blanca de 96 pocillos mediante el lector Infinite M200 (TECAN). 30 minutos más tarde, se añadieron de manera secuencial 100 j l de terminación de Dual-Glo y reactivo Glo a cada pocillo para medir la luminiscencia de Renilla y calcular la proporción de luminiscencia de luciérnaga con relación a la luminiscencia de Renilla.
Electroporación en células primarias
[0131] Para la electroporación de plásmidos que expresan ARNar en los fibroblastos pulmonares primarios humanos o células epiteliales bronquiales primarias humanas, se electroporaron 20 jg de plásmidos con el dispositivo Nucleofector™ 2b (Lonza) y equipo de Basic Nucleofector™ (Lonza, VPI-1002), y se utilizó el programa de electroporación U-023. Para la electroporación de plásmidos que expresan ARNar en células T primarias humanas, se sometieron a electroporación 20 jg de plásmidos en células T primarias humanas con el dispositivo de Nucleofector™ 2b (Lonza) y equipo Nucleofector™ de células T humanas (Lonza, VPA-1002), y se utilizó el programa de electroporación T-024. Cuarenta y ocho horas después de la electroporación, las células se clasificaron y se recogieron mediante el ensayo de FACS y, a continuación, se sometieron a la posterior secuenciación profunda para el ensayo de edición de ARN reconocido. La eficacia de electroporación se normalizó de acuerdo con el marcador de fluorescencia.
[0132] Para la electroporación de ARNar quimiosintético o ARN de control en células T primarias humanas o células GM06214 primarias, el oligonucleótido de ARN se disolvió en 100 j l del medio opti-MEM (Gbico, 31985070) con la concentración final de 2 jM . A continuación, 1x10E6 de células GM06214 o 3x10E6 de células T se volvieron a suspender con la mezcla de electroporación anterior y se sometieron a electroporación con el dispositivo Agile Pulse In Vivo (BTX) a 450 V durante 1 ms. A continuación, las células se transfirieron al medio de cultivo caliente para los ensayos posteriores.
Ensayo de actividad catalítica de a-L-iduronidasa (IDUA)
[0133] El sedimento celular recogido se volvió a suspender y se lisó con 28 j l de Triton X-100 al 0,5 % en 1x tampón de PBS sobre hielo durante un periodo de 30 minutos. Y, a continuación, se añadieron 25 j l de lisis celular a 25 j l de sustrato de 4-metilumbeliferil-a-L-iduronidasa 190 jM (Cayman, 2A-19543-500), que se disolvió en tampón de formiato de sodio 0,4 M que contenía Triton X-100 al 0,2 %, pH 3,5, y se incubó durante un periodo de 90 minutos a 37°C en oscuridad. La reacción catalítica se detuvo mediante la adición de 200 j l de tampón 0,5M de NaOH/Glicina, pH 10,3, y, a continuación, se centrifugó durante 2 minutos a 4°C. El sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocillos, y se midió la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm con el lector Infinite M200 (TECAN).
Ejemplo 1. Prueba del procedimiento de edición de ARN de la invención en un reportero
[0134] Se ha descrito que las proteínas de la familia Cas13 (C2c2) pueden editar el ARN en células de mamíferos. Se analizó adicionalmente este sistema bajo diferentes condiciones. En primer lugar, se construyó un sistema de reportero de fluorescencia dual basado en fluorescencia mCherry y EGFP introduciendo 3 x enlazador GS que reconoce la secuencia que contenía un codón de terminación entre el gen de mCherry y EGFP. Asimismo, eliminamos el codón de inicio ATG de EGFP para reducir la pérdida de la traducción de EGFP.
[0135] El reportero-1 de fluorescencia dual comprende la secuencia de mCherry (SEQ ID NO:1), la secuencia que comprende 3 x enlazador GS y la A reconocida (S<e>Q ID NO:2) y la secuencia de eGFP (SEQ ID N<o>:3).
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCAT
GCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGA
TC'G A GG GCG AG GG CG A GG GCC GCCCCTA CG A GG GC A CCC AG ACCGCC A A
G CTG A AGGTG ACCA AGGGTGC CCCCCTGCCCTTCGCC J GG C<j>A C ATCCTGTC
CCCTC A GTTG ATGTACG GC TCC A A GG C CTACGTG A A G C A C CCCGCCG A C AT
CCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGT
GATGAAaTCGAGGACGGCGCCGTGCTGACCGTGACCCACGAC]'CCTCCC
T GC A GG ACG GCG A GTT C ATCTAC A AGG TG A AG CT G CGC G GC ACC A AC TT C
CCCT C CG A O GGCCCCGTA ATGC AG A AG A AG ACC ATG G GCTGG G A GGCCT C
c t c c g a g c g g a t g t a c c c c g a g g a c g g c g c c c t g a a g g g c g a g a t c a a g c
A G A GGC TG A AG CT G A A GG ACG GCGG C C A CTA CG ACGCTG A GGTC A AG AC
CACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCA
ACATCAAG TIGG ACATCACCTCCCACAACGAGC<j>ACTACACCATCGTGGAAC
a g t a c g a a c g c g c c g a g g g c c g c c a c t c c a c c g g c g g c a t g g a c g a g c t g
TACAAG<(secuencia de>mCherry) (SEQ<JD N O : l )>
CTGCAGGGCGGA GGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCA
<g c a g a a g g t a t a c a c g c c g g a a g a a t c t g t>A<g a g a t c c c c g g t c g c c a c c>(secuencia que comprende 3x enlazador GS (que se representa con caracteres en cursiva y negrita) y la A reconocida (que se representa como A más grande y en negrita)) (SEQ ID NO:2)
GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGA
GCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCG
AGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACC
GGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGG
CGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTT
CAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAA
GGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGAC
ACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGG
CAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCT
ATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATC
CGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCA
GAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACC
TG AGCACCCAGTOCGCCCTG AG C AAAG ACCCCAACG AG AAGCGCG ATC AC
ATGGTCCTGCTGG AG TTCGTG ACCGCCGCCG GG ATC ACTCTCGGC ATGG AC
G AG C TG TAC AAG TA A(secuencia decGFP) (SEQ ID NO:3)
[0136] El reportero-2 de fluorescencia dual comprende la secuencia de mCherry (SEQ ID NO:1), secuencia que comprende 3x enlazador GS (se muestra con caracteres en cursiva y negrita) y la A reconocida (se muestra como A más grande y en negrita) (Se Q ID NO:4) y la secuencia de eGFP (s Eq ID n O:3).
CTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTA-GAGGGCTCTGCCA (secuencia que comprende 3x enlazador GS (se muestra con caracteres en cursiva y negrita) y la A reconocida (se muestra con caracteres más grandes y en negrita)) (SEQ ID NO:4)).
[0137] El reportero-3 de fluorescencia dual comprende la secuencia de mCherry (SEQ ID NO:1), secuencia que comprende 1x enlazador GS (se muestra con caracteres en cursiva y negrita) y la A reconocida (SEQ ID NO:5) y la secuencia de eGFP (SEQ ID NO:3).
CTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAGAGGGCTCTGCC A (secuencia que comprende 1x enlazador GS (se muestra con caracteres en cursiva y negrita) y la A reconocida (se muestra como A más grande y en negrita)) (SEQ ID NO:5).
[0138] Se clonó mCherry-3x enlazador GS-TAG-EGFP en el esqueleto de pLenti, y el plásmido reportero se empaquetó en lentivirus, que infectó células 293T que construían una línea celular estable que expresaba el reportero de fluorescencia dual. A continuación, se seleccionó una copia única con base de fluorescencia de EGFP como el sistema reportero. Se montaron guías de ARNcr de LbucC2c2 con espaciadores de 28 a 78 nucleótidos de longitud a lo largo de la adenosina de reconocimiento para probar el diseño óptimo de ARNcr. Se encontró que las guías de ARNcr más largas conferían eficacia de EGFP positiva más alta. De manera sorprendente, cuando se transfectaron plásmidos de ARNcr de reconocimiento sin transfección conjunta de cualquiera de los plásmidos que expresan dC2c2ADARDD, la proteína EGFP se expresa de manera sustancial. Por ejemplo, la guía de ARNcr con la secuencia: GGACCACCCCAAAAAUGAAUAUAACCAAAACU-GAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGCAUCGCGAGCAGGCGCUGCCUCCUCC GCC
(SEQ ID NO: 6) confirió más de 25 % de eficacia de EGFP positiva. Esto indica que la adenina en el codón de terminación UAG se edita en gran parte. En cambio, el ARNcr aleatorio no podría hacer que las células EGFP negativas en positivas (Figuras 6A, 6B y 6C). Basándose en estos resultados, se dedujo que la sobreexpresión de un transcrito de ARN solo podía aprovechar la enzima de ADAR endógena para editar el ARN.
[0139] Adicionalmente, se eliminó la secuencia de ARN de la estructura en las guías de ARN creando un ARN guía lineal. Se encontró que un ARN con una longitud de 70 nucleótidos (AAACCGAGGGAUCAUAGGGGACUGAAUCCACCAUUCUUCUCCCAAUCC CUGCAACUCCUUCUUCCCCUGC (SEQ ID NO: 7)) complementario para el ARN de reconocimiento con un desemparejamiento de A-C podía convertir de manera eficiente las células EGFP negativas en células EGFP positivas, mientras que el ARN aleatorio de 70 nt (UGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGCAUCGCGA GCAGGCGCUGCCUCCUCCGCC (SEQ ID NO: 8)) no podía (Figuras 1A, 1B, 1C y 1D). De este modo, se designa este ARN como ARNd (ARN que recluta desaminasa). Para verificar que la ADAR endógena celular podía reclutarse para llevar a cabo la desaminación de adenina por ARNd, se realizaron experimentos en las líneas celulares 293T de doble knockout de Adar1 p110 y Adar1 p150 (Figuras 6E y 6F). Debido a que Adar1 se expresa de manera generalizada, mientras que Adar2 se expresa principalmente en cerebro a alto nivel, se propuso que la desaminación de adenina de reconocimiento por ARNd estaba mediaba principalmente por Adar1, pero no por Adar2. Tal como se esperaba el ARNd de reconocimiento no podía desencadenar la expresión de EGFP en células 293T-Adar1-/-, pero la sobreexpresión tanto de Adar1 p110, p150 o Adar2 exógena podía rescatar la expresión de EGFP en células 293T-Adar1-/- (Figuras 1E y 1F), lo que sugiere que en las células 293T, el ARNd podía reclutar Adar1 o Adar2 para mediar la desaminación de adenina en un ARN diana. Además, se descubrió que Adar1-p110 y Adar2 poseen actividad de edición más alta que Adar1-p150 (Figura 1G y Figura 6G), posiblemente debido a la localización celular diferente de Adar1-p110 y Adar1-p150.
[0140] Para determinar que la restauración de fluorescencia de EGFP era debida a los eventos de edición de ARN de reconocimiento, se midió directamente la edición mediada por ARNd de transcritos de Reportero-2 a través de RT-PCR, seguido de secuenciación de Sanger y secuenciación de siguiente generación dirigidas. Los resultados de secuenciación mostraron la conversión de base A a G en la adenina reconocida (sitio de desemparejamiento de A-C) y la tasa de edición podían alcanzar el 13 % (Figura 6H y Figura 1H). Además, observamos también escasamente la edición de A a G en las ventanas de secuenciación cerca de la adenina reconocida, más probablemente debido a las regiones de ARN dúplex aumentadas, más tarde, intentaríamos eliminar la edición inesperada con varias estrategias.
Ejemplo 2. Optimización de los factores para el diseño de ARNd
[0141] A continuación, se estableció optimizar el ARNd para lograr una eficacia de edición más alta. En primer lugar, pusimos como objetivo determinar qué base en el sitio opuesto de la adenina reconocida favorece la edición. Los estudios anteriores mostraron que la base opuesta de la adenosina reconocida afectaría la edición de manera eficiente. De este modo, se diseñó ARNd de 71nt con un desemparejamiento N (A, U, C y G) en la posición central opuesta a A reconocida. Basándose en los resultados de FACS, se encontró que la edición de los cuatro ARNd diferentes de manera eficiente fue tal como sigue: C> A> U> G (Figuras 2A y 2B). Recientemente, se ha informado de que una pequeña burbuja en el sitio UAG diana puede beneficiar la eficacia de edición. Por lo tanto, se diseñaron ARNd que contenían dos o tres bases de desemparejamiento con el sitio UAG diana para ensayar nuestra hipótesis. Se diseñaron 16 ARNd de 71 nt diferentes y se construyeron sobre el vector de ARNd con el marcador de BFP utilizando el procedimiento de clonación Golden Gate. Se descubrió que los ARNd con secuencia de CCA y GCA poseen la eficacia más alta, lo que significa que la pequeña burbuja contribuye a la edición de A-I, como mínimo en el caso del sitio diana de UAG. Además, cuatro ARNd de secuencia de NCA tienen el porcentaje más alto de células positivas de GFP, llevando a la conclusión que el par de bases U-A complementario puede ser importante para la edición de ADAR (Figuras 2C y 2D). Posteriormente, se analizó la eficacia de diferentes longitudes de ARNd basados en reportero. Los ARNd se diseñaron con un desemparejamiento C en la posición central con diferentes longitudes que oscilaban entre 31 nt y 221 nt. Se encontró que la eficacia de edición aumenta con ARNd más largo. El pico de edición del sistema reportero se ubica en el ARNd de 171nt. El ARNd de 51 nt podía iluminar el sistema reportero con una buena eficacia (18 %) (Figuras 2E y 2F). Finalmente, se examinó si la posición de desemparejamiento C de ARNd afecta la eficacia de edición. Los ARNd se conservaron con la misma longitud de 71 nt, se diseñó un desemparejamiento C en posición diferente a la del inicio de transcripción. Basándose en los resultados de FACS, se encontró que la localización del desemparejamiento C opuesto podía afectar la eficacia de edición, y el desemparejamiento C ubicado en el extremo 5' o 3' terminal del ARNd tiene una eficacia más baja (Figuras 2G y 2H). 16 reporteros diferentes que comprenden secuencias diana que contienen todos los motivos de 3 bases posibles se construyeron mediante clonación de Gibson y, a continuación, se clonaron en el esqueleto de pLenti (pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd, Stanley Cohen Lab, Universidad de Stanford). Las secuencias diana se muestran tal como se indica a continuación.
[0142] Las secuencias diana que contienen todos los motivos de 3 bases posibles:
TAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCTATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 9)
TAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCTAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 10)
TAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCTACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 11)
TAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCTAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 12)
AAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCAATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 13)
AAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCAAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 14)
AAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG ATGCAACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 15)
AAG:
A T G G A C G A G C T G T A C A A G C T G C A G G G C G G A G G A G G C A G C G C C T G C T C G C G
A T G C A A G A G G G C T C T G C C A G T G A G C A A G G G C G A G G A G C T G T T C A C C G G G G
T G G T G C C C A T C (S E Q ID N O : 16)
CAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG ATGCCATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 17)
CAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG ATGCCAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 18)
CAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCCACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 19)
CAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG ATGCCAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 20)
GAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCGATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG
TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 21)
GAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCGAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 22)
GAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG
ATGCGACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 23)
GAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCG ATGCGAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG TGGTGCCCATC (SEQ ID NO: 24)
[0143] Los ARNd se conservaron con la misma longitud de 111 pb y se diseñó un desemparejamiento C en la parte central en dirección a la A diana.
[0144] En el grupo de cultivo celular de 12 pocillos, se colocaron en placas 2x105 células HEK293T en cada pocillo y cada experimento se llevó a cabo con tres réplicas. 24 horas más tarde, se transfirieron en conjunto 0,5 |jg de plásmido de ARNd y 0,5 jg de plásmido diana de reportero a las células utilizando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (Roche). 48 horas después, las células se tripsinizaron y se seleccionaron células mCherry-positivas mediante FACS (BD). Se recogió un total de 4x105 células y se extrajo el ARN total utilizando el equipo de ARNprep pure Cell/Bacteria (TIANGEN DP430). Los ADNc se sintetizaron a partir de 2 jg de ARN total utilizando el equipo Quantscript RT (TIANGEN KR103-04). Y las 111 regiones diana se amplificaron mediante PCR y se enviaron para secuenciación profunda.
[0145] Se descubrió que todos los 16 motivos diferentes de 3 bases pueden editarse mediante un procedimiento de edición de ARN de ejemplo de la presente solicitud, aunque con una eficacia variable. En resumen, los resultados indican que el vecino más cercano al extremo 5' terminal de A a editar tiene la preferencia de U>C“ A>G y el vecino más cercano al extremo 3' terminal de A a editar tiene la preferencia de G >C> A U. Los datos se representan como un gráfico de barras en la Figura 3A o mapa de calor de la Figura 3B.
Ejemplo 3. Edición de ARN transcrito a partir de los genes endógenos
[0146] A continuación, se probó si ARNd podía mediar ARNm transcrito a partir de genes endógenos. Se diseñó ARNd que reconoce cuatro genes de KRAS, P<p>IB, p-Actina y GAPDH. Para ARNm de KRAS, se diseñaron ARNd con longitudes de 91, 111, 131, 151, 171 y 191 nucleótidos (Figura 4A) con secuencias tal como se muestran a continuación.
KRAS-ARNd de 91 nt
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACC
ACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (SEQ ID
NO: 25)
KRAS-ARNd de 111 nt
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGC
UCCAACUACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCC
CGCACCUGGGAGC (SEQ ID NO: 26)
KRAS-ARNd de 131 nt
UCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCU
ACGCCACCAGCUCCAACUACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCA
GGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCU (SEQ ID NO: 27)
KRAS-ARNd de 151 nt
AUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGC
ACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUC AUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGC CCCGC (SEQ ID NO: 28)
KRAS-ARNd de 171 nt
CUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUA
UCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUU
AUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUG AGCCUCUGGCCCCGCCGCCGCCUUC (SEQ ID NO: 29)
KRAS-ARNd de 191 nt
UAGGAAUCCUCUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGA
AUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCA
CCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUG
GGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCGCCGCCGCCUUCAGUGCCUGCG (SEQ ID NO: 30)
[0147] Los resultados de secuenciación de siguiente generación mostraron que los ARNd podían editar el ARNm de KRAS reconocido con una eficacia de edición de hasta 11,7 % (Figura 4B). Para ARNm de PPIB endógeno, los tres sitios reconocidos: sitio1, sitio2 y sitio3. Se diseñaron ARNd con una longitud de 151 nucleótidos para cada sitio (Figura 4C) con secuencias tal como se muestra a continuación.
PPIB-ARNd de 151 nt (sitio 1)
GAGGCGCAGCAUCCACAGGCGGAGGCGAAAGCAGCCCGGACAGCUGAGG
CCGGAAGAGGGUGGGGCCGCGGUGGCCAGGGAGCCGGCGCCGCCACGCG
CGGGUGGGGGGGACUGGGGUUGCUCGCGGGCUCCGGGCGGGCGGCGGG
CGCCG (SEQ ID NO: 31)
PPIB-ARNd de 151 nt (sitio 2)
UCCUGUAGCUAAGGCCACAAAAUUAUCCACUGUUUUUGGAACAGUCUU
UCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCCACAUCUUCAUCUCCAAUUCGU
AGGUCAAAAUACACCUUGACGGUGACUUUGGGCCCCUUCUUCUUCUCAU
CGGCC (SEQ ID NO: 32)
PPIB-ARNd de 151 nt (sitio 3)
GCCCU GGAUCAU GAAGUCCUUGAUUACACGAUGGAAUUUGCUGUUUUU
GUAGCCAAAUCCUUUCUCUCCUGUAGCCAAGGCCACAAAAUUAUCCACU
GUUUUUGGAACAGUCUUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCUACA
UCUUCA (SEQ ID NO: 33)
[0148] Los resultados de secuenciación de siguiente generación mostraron que el ARNd podría editar el sitiol de ARNm de PPIB de manera eficiente con una tasa de edición de hasta el 14 % (Figura 4D). Para el sitio 2 y el sitio3 de ARNm de PPIB, la eficacia de edición era del 1,5 % y 0,6 % (Figura 4E y 4F). Para ARNm de p-actina endógeno, se seleccionaron dos sitios reconocidos y se diseñaron ARNd para cada sitio (Figura 4G) con secuencias tal como se muestra a continuación.
p-actina-ARNd de 72 nt (sitio 1)
p-actina-ARNd de 131 nt (sitio 1)
GCCAUGCCAAUCUCAUCUUGUUUUCUGCGCAAGUUAGGUUUUGUCAAG
AAAGGGUGUAACGCAACCAAGUCAUAGUCCGCCUAGAAGCAUUUGCGG
UGGACGAUGGAGGGGCCGGACUCGUCAUACUCCUG (SEQ ID NO: 35)
P-actina-ARN de 70 nt (sitio 2) GGACUUCCUGUAACAACGCAUCUCAUAUUUGGAAUGACCAUUAAAAAA ACAACAAUGUGCAAUCAAAGUC (SEQ ID NO: 36)
[0149] Se descubrió que el ARNd podría editar el ARNm de p-actina de los dos sitio 1 y sitio 2, con hasta 1,4 % de eficacia de edición para cada sitio (Figura 4H y Figura 8A). También se observó que ARNd más largo confería una eficacia de edición más alta, con 0,6% para ARNd-71nt y 1,4% para ARNd-131nt (Figura 3H). Para otro gen constitutivo de GAPDH, utilizamos ARNd de 71nt (CAAGGUGCGGCUCCGGCCCCUCCCCUCUUCAAGGGGUCCACAUGGCAAC UGUGAGGAGGGGAGAUUCAGUG (SEQ ID NO: 37)), y la eficacia de edición es del 0,3 %, quizás debido a la longitud de ARNd corto (Figura 8B).
Ejemplo 4 Análisis de mutaciones no deseadas mediante el procedimiento de LEAPER de ejemplo
[0150] Para la aplicación terapéutica, la precisión de edición es fundamental. A continuación, se intentó caracterizar la especificidad de un sistema de edición de ARN de ejemplo de la presente solicitud. Se seleccionaron el sitio1 de PPIB endógeno y sitio de KRAS para el análisis. Para el sitio1 de PPIB, pudimos observar en las regiones cubiertas de ARNd, que existían varias bases A que flanqueaban la A76 reconocida, tales como A22, A30, A33, A34, A39, A49, A80, A91, A107 y A140. Se reveló que las bases A flanqueantes apenas se editaban, mientras que la base A76 reconocida (desemparejamiento A-C) mostraba hasta el 14 % de eficacia de edición (Figuras 5A y 5B).
[0151] En lo que se refiere al sitio de KRAS, se pudo observar en la región cubierta de ARNd la existencia de muchas adeninas que flanqueaban la base A56 reconocida, hasta 29 bases A flanqueantes. A partir de los resultados de edición de ARNm de KRAS, se descubrió que mientras la base A56 reconocida (desemparejamiento de A-C) mostraba hasta 11,7 % de eficacia de edición, se podía editar la adenina flanqueante (Figuras 5C y 5D). Se editó una serie de adeninas diana no deseadas, mientras que las adeninas, tales como A41, A43, A45, A46, A74, A79, mostraron más edición. Se descubrió que el vecino más cercano al extremo 5' terminal de las bases A no editadas era G o C, mientras que el vecino más cercano al extremo 5' terminal de las adeninas editadas de manera eficaz era T o A. Basándose en esta observación, se determinó diseñar ARNd para minimizar la edición de diana no deseada de aquellas adeninas que son propensas a la edición. Durante nuestro estudio, se descubrió que ADAR tenía preferencia por el desemparejamiento de A-C con relación a los emparejamientos A-A, A-U, y tenían menor preferencia del desemparejamiento de A-G. Por tanto, se sugirió que para las bases A de diana no deseadas que tenían U o A como el vecino más cercano al extremo 5' terminal, el desemparejamiento de A-G podría reducir o disminuir los efectos de dianas no deseadas. El estudio anterior ha indicado que el desemparejamiento de A-G podría bloquear la edición de desaminación por ADAR.
[0152] Por tanto, a continuación, se diseñaron tres tipos de variantes de ARNd de 91 nt y cuatro tipos de variantes de ARNd de 111 nt (con secuencias tal como se muestra a continuación) que contenían diferentes combinaciones de desemparejamientos de A-G basadas en los resultados estadísticos en la Figura 5D y conocimiento existente: ARNd-AG1 (A41, A46, A74); ARNd-AG2 (A41, A43, A45, A46, A74, A79); ARNd-AG3 (A31, A32, A33, A41, A43, A45, A46, A47, A74, A79); ARNd-AG4 (A7, A31, A32, A33, A40, A41, A43, A45, A46, A47, A74, A79, A95) (Figura 4E).
KRAS-ARNd-91 -AG2
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCA CAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (SEQ ID NO: 38)
KRAS-ARN-91-AG3
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCA CAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (SEQ ID NO: 39)
KRAS-ARNd-91 -AG4
UAGCUGGAUCGUCAAGGCACUCGUGCCGACGCCACCAGCUCCAACCACC ACAAGGGGAGAGGCAGUCAGGGUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (SEQ ID
NO: 40)
KRAS-ARNd-111-AG 1
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGC UCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCC
GCACCUGGGAGC (SEQ ID NO:41)
KRAS-ARNd-111-AG2 GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGC UCCAACcACCACAAGUggAgAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCC GCACCUGGGAGC (SEQ ID NO:42)
KRAS-ARNd-111-AG3
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGC UCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC ACCUGGGAGC (SEQ ID NO:43)
KRAS-ARNd-111-AG4 GCUCCCCGGUGCGGGAGAGAGGCCUGCUGACCCUGACUGCCUCUCCCCU
UGUGGUGGUUGGAGCUGGUGGCGUCGGCACGAGUGCCUUGACGAUCCA
GCUAAUUCAGAAUC (SEQ ID NO: 44)
[0153] A continuación, estos ARNd se transfectaron en las células HEK293T, se utilizaron un vector vacío y control de ARNd diana no deseada de 71 nt: (TCTCAGTCCAATGTATGGTCCGAGCACAAGCTCTAATCAAAGTCCGCGGGT GTAGACCGGTTGCCATAGGA (SEQ ID NO: 45)) como controles negativos. Para ARNd de 91 nt, los resultados de secuenciación profunda mostraron que la edición de diana deseada (A56) se redujo hasta 2,8 % para ARNd-91-AG2, 2,3 % para ARNd-91-AG3 y 0,7 % para ARNd-91-AG4, en comparación con la eficacia de edición de diana deseada (A56) del 7,9 % para ARNd-91 sin el desemparejamiento de A-G (Figura 4F). Para ARNd de 91 nt, la edición de diana deseada (A56) se redujo hasta el 5,1 % para ARNd-111-AG2 y 4,9 % para ARNd-111-AG3 en comparación con la eficacia de edición de diana deseada (A56) del 15,1 % para ARNd-111 sin el desemparejamiento de A-G (Figura 4F), lo que indica que el ARNd más largo podría soportar un mayor desemparejamiento de A-G. Entonces, a continuación, se seleccionó ARNd de 111 nt para el análisis detallado de dianas no deseadas. La edición de las bases A flanqueantes se eliminaron de manera drástica a excepción de A7 y A79 (Figura 4G). Para la base A7, el efecto de diana no deseada podía prevenirse mediante un diseño de desemparejamiento de A-G adicional en este sitio, que está ausente en el diseño de ARNd actual. Para la base A79, la introducción adyacente de dos desemparejamientos de A-G de A78/A79 podría ayudar en la eliminación de efectos de diana no deseada. Basándose en tales resultados, la aplicación de los sistemas de edición de ARN de la presente solicitud en la cura de enfermedades genéticas es muy prometedora y esperanzadora.
Ejemplo 5. Ensayos de un procedimiento de LEAPER de ejemplo en múltiples líneas celulares
[0154] Basándose en los resultados de las células HEK293T, se supuso que el ARN de doble cadena formado por el ARNd lineal y su ARN diana podía reclutar la proteína ADAR endógena para la edición de A-I. Para confirmar esta hipótesis, se escogieron más líneas celulares para ensayar nuestro procedimiento de edición de ARN. Los resultados se muestran en la Figura 9. Estos resultados en múltiples líneas celulares demostraron la universalidad de nuestro procedimiento de edición de ARN. En primer lugar, a pesar de la diferente eficacia de edición, la utilización del ARNd para reclutar ADAR endógena era adecuada para múltiples líneas celulares, que se originó a partir de 7 tejidos y órganos diferentes. Además, este procedimiento podría no solamente funcionar en células humanas, sino también en células de ratón, proporcionando la posibilidad de llevar a cabo experimentos en un ratón.
Ejemplo 6. Aprovechamiento de ADAR endógena para la edición de ARN
[0155] En un intento de explorar una plataforma de edición de ARN eficiente, se fusionó el dominio de desaminasa de<la ADAR1 con mutación E1008Q hiperactiva (ADAR1dd)>40<con LbuCas13 inactivo catalíticamente (dCas13a), un>efector41 de CRISP con reconocimiento de ARN guiado por ARN (Figura 10A). Para evaluar la eficacia de edición de ARN, se construyó un reportero sustituto que albergaba genesmCherryyEGFPunidos mediante una secuencia que comprendía 3x región que codifica GGGGS y un codón de terminación UAG en marco (Reportero-1, Figura 10B). Las células transfectadas con reportero expresaron únicamente la proteína mCherry, mientras que la edición reconocida en la UAG del transcrito de reportero pudo convertir el codón de terminación en UIG y, por consiguiente, pudo permitir la expresión de EGFP en dirección 3'. Dicho reportero permite la medición de la eficacia de edición de A a I a través de la monitorización del nivel de EGFP. A continuación, se diseñaron ARNcr impulsados por el promotor hU6 (ARN de CRISPR) que contenían estructuras 5' sometidas a reconocimiento de Cas13a y longitudes variables de secuencias espaciadoras para el reconocimiento (ARNcrCas13a, después de las secuencias de ARNcr de LbuCas13). Secuencias de ARNcr de LbuCas13
[0156] Las secuencias complementarias a los transcritos diana contienen todas CCA opuesta al codón de UAG para introducir un desemparejamiento de citidina (C) con la adenosina (A) (Figura 10B) debido a que la desaminación de adenosina tiene lugar preferentemente en el sitio1314 de desemparejamiento de A-C. Para ensayar la longitud óptima del ARNcr, se expresaron de manera conjunta los ARNcr de reconocimiento y no reconocimiento de diferentes longitudes con las proteínas dCas13a-ADAR1DD en células HEK293T que expresaban de manera estable el reportero-1. Los efectos evidentes de edición de ARN indicados por la aparición de la expresión de EGFP se observaron con ARNcr que contenían secuencias emparejables de como mínimo 40 nt de longitud, y cuanto más larga eran los ARNcr, más alto era el porcentaje de EGFP positiva (Figura 10C). De manera sorprendente, la expresión de ARNcrCas13a largo solo pareció ser suficiente para activar la expresión de EGFP y la expresión conjunta de dCas13a-ADAR1oü más que la actividad disminuida de ARNcr (Figuras 10C, 10d). La expresión de EGFP era claramente dependiente de la secuencia debido a que el ARN de control de 70 nt (exclusivo de la estructura 5' en el cálculo de longitud) no podía activar la expresión de EGFP (Figuras 10C, 10D).
[0157] Con el sorprendente descubrimiento de que determinados ARNcrCas13a modificados largos permitían la edición de ARN independiente de dCas13a-ADAR1oü, se decidió eliminar la secuencia de estructura que recluta Cas13a del ARNcr. Debido a que ARNcr70 poseía la actividad más alta para desencadenar la expresión de EGFP (Figuras 10C, 10D), se escogió el mismo ARN guía de 70 nt de longitud sin la estructura que recluta Cas13a para pruebas adicionales (Figura 11A y las siguientes secuencias de aRNar y ARN de control utilizados en los ejemplos).
[0158] Resultó que este ARN guía lineal inducía una fuerte expresión de EGFP en cerca de 40%de células totales que albergaban el reportero-1 (Figura 11B, parte superior). Debido a que las proteínas ADAR endógenas podían editar sustratos12 de ARN de doble cadena (ARNbc), se consideró que los ARNs guía largos podrían hibridarse con los transcritos diana para formar sustratos de ARNbc que a su vez reclutaban las proteínas ADAR endógenas para la edición dirigida. De este modo, se designaron tales ARN guía como ARNar (ARN que recluta ADAR). Para verificar si las proteínas ADAR endógenas son, en efecto, responsables para la observación anterior, se estableció examinar la edición de ARN mediada por ARNar en células deficientes de ADAR. Debido a que ARNm deADAR2era escasamente detectable en células HEK293T (Figura 12A), se generaron células HEK293TADARV'-,haciendo esta línea celular fuera deficiente en tanto ADAR1 como ADAR2 (Figuras 11C, D). De hecho, el agotamiento de ADAR1 abrogó las señales de EGFP inducidas por ARNar70 (Figura 11B, parte inferior). Además, la expresión exógena de ADAR1p110, ADAR1p150 o ADAR2 en células HEK293TADAR1-1-(Figuras 11C, D) rescató con éxito la pérdida de inducción de EGFP mediante ARNar70 (Figura 11E, Figura 12B), demostrando que la expresión de reportero de EGFP inducida por ARNar dependía únicamente de ADAR1 original, cuya actividad podría reconstruirse mediante cualquiera de sus dos isoformas (p110 y p150) o ADAR2. El análisis de secuenciación de Sanger en la región de reconocimiento de ARNar70 mostró un pico se superposición de A/G en el sitio de adenosina pronosticado en UAG, indicando una conversión importante de A a I (G) (Figura 11F). La secuenciación de la siguiente generación (NGS) confirmó adicionalmente que la tasa de conversión de A a I era aproximadamente el 13 % de los transcritos reportero totales (Figura 11G). El análisis de PCR cuantitativa mostró que ARNar70 no reducía la expresión de transcritos reconocidos (Figura 13), descartando el posible efecto de ARNi del ARNar. De manera conjunta, los datos demostraron que el ARNar es capaz de generar un nivel importante de edición en los transcritos diana mediante el desemparejamiento de A-C modificado.
Ejemplo 7. LEAPER permite la edición de ARN en múltiples líneas celulares
[0159] Dado que la expresión de proteínas ADAR endógenas es un prerrequisito para la edición de ARN mediada por LEAPER, se analizó el rendimiento de LEAPER en un panel de líneas celulares con origen en tejidos distintos, que incluyen HT29, A549, HepG2, RD, SF268, SW13 y HeLa. En primer lugar, se examinó la expresión endógena de los tres tipos de proteínas ADAR utilizando el análisis de transferencia Western. ADAR1 se expresó altamente en todas las líneas celulares y se confirmó su identidad en las transferencias Western mediante el control negativo, línea HEK293TA D A R 1(Figuras 14A, B). ADAR3 se detectó solamente en las células HepG2 y HeLa (Figuras 14a , B). ADAR2 no se detectó en ninguna célula, un resultado que no se debió al fallo de la transferencia Western porque la proteína ADAR2 podía detectarse a partir de las células HEK293T que sobreexpresan ADAR2 (Figuras 14A, B). Estos descubrimientos son coherentes con los informes anteriores que ADAR1 se expresa de manera universal, mientras que las expresiones de ADAR2 y ADAR3 se limitan a determinados tejidos11.
[0160] A continuación, los inventores se dispusieron a ensayar las eficacias de edición de un ARNar de 71 nt (ARNar71) rediseñado con reconocimiento del Reportero-1 (Figura 15A y las Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizados en este estudio se enumeran anteriormente) en estas líneas celulares.
[0161] LEAPER funcionó en todas las células analizadas para este ARNar71, aunque con eficacias variables (Figura 14C). Estos resultados coincidían con el informe anterior que los niveles de proteínas ADAR1/2 tienen correlación con el rendimiento42 de edición de ARN, con la excepción de las células HepG2 y HeLa. Las correlaciones subóptimas de eficacias de edición con niveles de ADAR1 probablemente se debían a las expresiones abundantes de ADAR3 en estas dos líneas (Figuras 14A, B) debido a que se ha informado de que ADAR3 juega un papel de inhibición en la edición de ARN. De manera importante, LEAPER funcionó también en las tres líneas celulares diferentes con origen de ratón (NIH3T3, fibroblasto embrionario de ratón (MEF) y B16) (Figura 14D), preparando el camino para ensayar su potencial terapéutico en modelos de animales y enfermedades. De manera general, se concluye que LEAPER es una herramienta versátil para un amplio espectro de tipos de células y para organismos diferentes.
Ejemplo 8. Caracterización y optim ización de LEAPER
[0162] Para caracterizar y optimizar mejor LEAPER, se investigaron las opciones de nucleótido opuesto a la adenosina en el triplete UAG del transcrito reconocido. En células HEK293T, el ARNar71 con reconocimiento de Reportero-1 mostró las eficacias de edición variables con un triplete cambiado (5'-CNA, N representa uno de A/U/C/G) opuesto a la UAG reconocida (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). El desemparejamiento de A-C dio como resultado la eficacia de edición más alta y el desemparejamiento de A-G generó la mínima, pero ediciones evidentes (Figura 16A). A continuación, se investigó la preferencia de nucleótidos que flanqueaban el desemparejamiento de A-C en ARNar. Se analizaron las 16 combinaciones de sitios vecinos del extremo 5' y 3' terminal alrededor de la citidina (5'-N1CN2) (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente), y se encontró que la adenosina vecina del extremo 3' terminal era necesaria para la edición eficiente, mientras que la adenosina es el nucleótido menos favorable en el extremo 5' terminal (Figuras 16B, C). Por consiguiente, concluimos que el motivo de CCA en el ARNar otorga la eficacia de edición más alta para el reconocimiento del sitio UAG. Merece la pena mencionar que la guanosina vecina del extremo 3' terminal (5'-N1CG) en ARNar mostró un efecto inhibidor impresionante (Figuras 16B, C).
[0163] La longitud de ARN pareció ser relevante en la eficacia de ARNar en el control de la edición de los transcritos reconocidos (Figura 10C), acorde a el informe42 previo. Para entender completamente este efecto, se analizaron los ARNs con longitudes variables con reconocimiento de dos diferentes transcritos de reportero: Reportero-1 y Reportero-2 (Figuras 15A, B). Para cualquiera de los reconocimientos de los dos reporteros, se diseñaron y se analizaron los ARNs de 10 diferentes tamaños, que oscilaban entre 31 nt y 211 nt, con el triplete de CCA (para el reconocimiento de UAG) justo en la parte central (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). Basándose en las actividades de EGFP de reportero, la longitud de ARNar tenía correlación positiva con la eficacia de edición, para ambos reporteros, con picos desde 111 hasta 191 nt (Figura 16D). Aunque pareció que uno de ARNar51 funcionaba, la longitud mínima para que el ARNar funcionase para ambos reporteros era de 71 nt (Figura 16D).
[0164] A continuación, se investigó el efecto de la posición de desemparejamiento de A-C en un ARNar sobre la eficacia de edición. Se fijaron las longitudes para todos los ARNar para la prueba a 71 nt, y se deslizó un triplete de ACC con reconocimiento de UAG desde el extremo 5' hasta 3' terminal en los ARNar (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). Resultó que colocando el desemparejamiento de A-C en la región central se generaba un rendimiento de edición elevado, y los ARNar con los sitios de desemparejamiento cercanos al extremo 3' terminal sobrepasaron aquellos cercanos al extremo 5' terminal en ambos reporteros (Figura 16E). Por conveniencia, se colocó el desemparejamiento de A-C en la parte central de ARNar para todos los estudios posteriores.
[0165] También se analizó la flexibilidad de reconocimiento de LEAPER y se intentó determinar si UAG en diana es el único motivo sometido a la edición de ARN. Para todas las 16 combinaciones de tripletes (5'-N1AN2) en Reportero-3 (Figura 15C), se utilizaron los ARNar correspondientes con las longitudes fijas (111 nt) y se aseguró la correspondencia de secuencia perfecta para ARNar y el reportero a excepción del sitio de edición (desemparejamiento de A-C) (Figura 16F y las Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). Los resultados de NGS mostraron que todos los motivos de N1AN2 podían editarse. Los UAN2 y GAN2 son los motivos más y menos preferidos, respectivamente (Figuras 16F, G). En conjunto, la preferencia del vecino más cercano a la adenosina diana es 5' U>C“ A>G y 3' G>C>A=U (Figura 16G).
Ejemplo 9. Edición de transcritos endógenos utilizando LEAPER
[0166] A continuación, se examinó si LEAPER podía permitir la edición eficaz de transcritos endógenos. Utilizando ARNar de diferentes longitudes, reconocimos los motivos de UAG en las transcritos de los genesPPIB, KRASySMAD4,y un motivo de UAC en el transcrito del genFANCC(Figura 17A, Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). De manera alentadora, los sitios de adenosina reconocidos en los cuatro transcritos se editaron mediante sus ARNar correspondientes con los cuatro tamaños, no obstante, con eficacias variables de acuerdo con los resultados de NGS (Figura 17B). En coherencia con la observación anterior, los ARNar más largos tendían a generar tasas de edición más altas. Digno de mención, el ARNarPPIB de 151 nt editó ~50 % de transcritos totales del genPPIB(Figura 17B). Ningún ARNar mostró efectos de ARNi en sus transcritos reconocidos (Figura 18A) o mayor nivel de proteínas (por ejemplo, KRAS, Figura 18B). Además, LEAPER es capaz de alcanzar la tasa de edición deseable en sitios no-UAN (Figura 17C y Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente), mostrando la flexibilidad de LEAPER en edición de transcritos endógenos. Para explorar adicionalmente el poder de LEAPER, se analizó si se podían reconocer de manera simultánea múltiples sitios. Se observó la edición múltiplex de ambos transcritos deTARDBPyFANCCmediante la expresión conjunta de dos ARNar (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente), con la eficacia incluso más alta que las de ARNar individuales (Figura 17D), lo que indica que LEAPER es muy adecuado para la edición de dianas múltiples de forma paralela.
[0167] Cabe destacar que ADAR1/2 tiende a desaminar de manera promiscua múltiples adenosinas en un dúplex44 de a Rn y el desemparejamiento de A-C no es el único motivo para guiar el cambio de A a I (Figura 16A). Por consiguiente, es razonable suponer que todas las adenosinas en transcritos diana en las coberturas de ARNar se someten a diferentes niveles de edición, fuentes principales de modificaciones no deseadas. Cuanto más largo es el ARNar, más alta es la posibilidad de tales dianas no deseadas. Por lo tanto, se examinaron todos los sitios de adenosinas en las regiones de recubrimiento de ARNar en estos transcritos reconocidos. Para los transcritos dePPIB,se observó muy poca edición de diana no deseada a lo largo de la ventana de secuenciación para tamaños variables de ARNar (Figuras 17E, F). Sin embargo, en los casos de reconocimiento de los genesKRAS, SMAD4yFANCC, sedetectaron múltiples ediciones de dianas no deseadas (Figuras 19A-F). ParaKRASen particular, 11 de las 30 adenosinas experimentaron conversiones sustanciales de A a I en la ventana de secuenciación de ARNarm (Figuras 19A, B).
[0168] A continuación, se intentó desarrollar las estrategias para minimizar tales efectos no deseados de dianas no deseadas. Debido a que un desemparejamiento de A-G eliminaba la edición de reconocimiento de UAG (Figura 16A), se postuló que el emparejamiento de una guanosina con una adenosina no diana podría reducir la edición no deseada. A continuación, se analizó el efecto del desemparejamiento de A-G en adenosina en todas posibles combinaciones de tripletes (5'-N1AN2) como en Reportero-3 (Figura 15C y Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). En efecto, el desemparejamiento de A-G disminuyó la edición de adenosina en todas las dianas analizadas, a excepción de reconocimiento de UAG o AAG (~2 %) (Figura 17G), en comparación con el desemparejamiento de A-C (Figura 16F). Para reducir adicionalmente las tasas de edición en sitios no deseados, seguimos con los ensayos del efecto de dos desemparejamientos consecutivos. Resultó que el desemparejamiento adicional en el nucleótido del extremo 3' terminal del triplete opuesto a cualquiera de los dos UAG o AAG, eliminaba su edición de adenosina correspondiente (Figura 17H y Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). En vista de estos descubrimientos, se intentó aplicar esta regla para reducir las dianas no deseadas en transcritos deKRAS(Figura 19A). En primer lugar, se diseñó un ARNar (ARNarm-AG6) que creó los desemparejamientos de A-G en todos los motivos «susceptibles a ediciones» cubiertos por ARNar-m (Figura 17I, Figura 19A y Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente), que incluyen AAU (el 61°), UAU (el 63°), UAA (el 65°), AAA (el 66°), UAG (el 94°) y AAG (el 99°). Este ARNar-m-AG6 eliminó la mayoría de las ediciones de dianas no deseada, mientras mantuvo una tasa de edición de diana deseada de ~ 5 %. En consistencia con los descubrimientos en la Figura 17G, el desemparejamiento de A-G único no podía minimizar de manera completa la edición del motivo de AAG (99°) (Figura 17I y Figura 19A). A continuación, se añadieron más desemparejamientos en ARNar-m-AG6, incluyendo un desemparejamiento dual (5'-CGG opuesto al motivo de 5'-AAG reconocido), más tres desemparejamientos de A-G adicionales para mitigar la edición de las adenosinas 27a, 98a y 115a (ARNar-m-AG9) (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). Por consiguiente, conseguimos una especificidad de edición mucho más mejorada, sin pérdida adicional de tasa de edición en el sitio reconocido (A76) (Figura 17I). En resumen, LEAPER modificado que incorpora condiciones adicionales permite la edición de ARN eficiente y más precisa en transcritos endógenos.
Ejemplo 10. Especificidad de edición de ARN de LEAPER
[0169] Además de los posibles efectos de en dianas no deseadas en la región de ARNbc cubierta con ARNar, existía también la preocupación de los potenciales efectos en dianas no deseadas en otros transcritos a través del emparejamiento parcial de bases de ARNar. A continuación, se llevó a cabo un análisis de secuenciación de ARN variado de transcriptomas para evaluar los efectos en dianas no deseadas globales de LEAPER. Las células se transfectaron con un ARN Ctrl-i51 o un ARNar específico dePPIB(ARNarisi-PPIB) que expresa plásmidos antes de someterse al análisis de secuenciación de ARN. Se identificaron seis dianas no deseadas potenciales en el grupo de ARN Ctrl-151 (Figura 20A) y cinco en el grupo de ARNarisi-PPIB (Figura 20B), y la tasa de diana deseada dePPIBbasada en el análisis de NGS fue del ~37 % (Figura 20B). El análisis adicional reveló que todos los sitios, a excepción de los dos sitos de transcritos deEIF2AK2,se ubicaban en cualquiera de las dos regiones de SINE (Alu) o LINE (Figuras 20A, B), ambas susceptibles de la edición45 mediada por ADAR, lo que sugiere que estas dianas no deseadas pueden no derivarse del emparejamiento entre las transcritos diana y el ARNar o ARN de control. Cabe señalar, dos transcritos de dianas no deseadas,WDR73ySMYD4,aparecieron en ambos grupos, sugiriendo que es improbable la edición de ARN dependiente de secuencia. De hecho, el análisis de energía libre mínima sugirió que todos estos transcritos de dianas no deseadas posibles no eran capaces de formar un dúplex estable con ninguno de los dos ARN Ctrl-151 o ARNarisi-PPIB (Figura 20C). Para analizar adicionalmente si ARNar genera dianas no deseadas dependientes de secuencia, se seleccionaron potenciales sitios de dianas no deseadas mediante la comparación de la similitud de secuencias utilizando NCBI BlAsT para ARNar151-PPIB y ARNarm-FANCC. Las transcritosdeTRAPPC12para ARNar151-PPIB y tres sitios en las transcritos deST3GAL1, 0STM1-AS1yEHD2para ARNarm-FANCC eran los candidatos principales (Figura 20D y Figura 21A). El análisis de NGS reveló que no se podía detectar ninguna edición en ninguno de estos sitios de diana no deseada previstos (Figura 20D y Figura 21B). Estos resultados indican que LEAPER fortalece la edición eficiente en el sitio reconocido, mientras se mantiene la especificidad variada de transcriptoma sin ediciones de diana no deseada dependiente de secuencia detectables.
Ejemplo 11. Evaluación de seguridad de LEAPER en células de mamíferos
[0170] Dado que ARNar se basan en proteínas ADAR endógenas para la edición de transcritos diana, nos preguntamos si la adición de ARNar exógeno influye en eventos de edición de ARN original ocupando demasiadas proteínas ADAR1 o ADAR2. Por consiguiente, se analizaron los sitios de edición de ARN de A a I compartidos por el grupo de simulación y el grupo de ARNar151-PPIB a partir de los resultados de secuencia de ARN variado de transcriptoma, y se analizó la comparación entre el grupo de simulación y el grupo de ARN Ctrl151. Ni el grupo ARN Ctrl151 ni el grupo ARNarisi-PPIB mostraron una diferencia importante en comparación con el grupo de simulación (Figuras 22A, B), lo que indica que LEAPER tenía poco impacto sobre la función normal de ADAR1 endógeno para catalizar los eventos de edición de A a I originales.
[0171] Mientras tanto, se realizó el análisis de expresión de genes diferencial utilizando los datos de secuenciación de ARN para verificar si el ARNar afecta la expresión de genes global. Se descubrió que ni ARN Ctrlm ni ARNarisi-PPIB afectaban la expresión de genes global en comparación con el grupo de simulación (Figuras 22C, D). En concordancia con nuestra observación anterior (Figura 18A), los ARNar no mostraron ningún efecto de ARNi sobre la expresión dePPIB(Figuras 22C, D).
[0172] Considerando que el ARNar forma un dúplex de ARN con el transcrito diana y que el dúplex de ARN podría provocar la respuesta inmune innata, se investigó si la introducción de ARNar tenía tal efecto. Para este ensayo, se seleccionaron ARNar con reconocimiento de cuatro transcritos de genes que han sido demostrados como eficaces. No se observó ninguna inducción de ARNm de interferón-p (IFN-p) (Figura 22E) o interleucina-6 (IL-6) (Figura 22F), que son dos características de activación inmune innata. Como control positivo, un análogo sintético de ARN de doble cadena - poli(I:C) indujo una expresión fuerte de IFN-p e IL-6 (Figuras 22E, F). No parece que LEAPER induzca inmunogenicidad en células diana, una característica importante para agentes terapéuticos seguros.
Ejemplo 12. Recuperación de actividad reguladora transcripcional de p53 mediante LEAPER
[0173] Ahora que se ha establecido un procedimiento novedoso de edición de ARN sin la necesidad de introducir proteínas exógenas, se intentó demostrar su utilidad terapéutica. En primer lugar, se reconoció el gen supresor de tumorTP53,que se conoce por tener un papel vital en el mantenimiento de homeostasis celular, pero que experimenta mutaciones frecuentes en más del 50 % de cánceres46 humanos. La mutación c.158G>A enTP53es una mutación antisentido clínicamente relevante (Trp53Ter), que genera una proteína46 truncada no funcional. Se diseñaron un ARNarm y dos ARNar alternativos (ARNarm-AG1 y ARNarm-AG4) (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente), todos con reconocimiento de los transcritos de TP53W53X (Figura 23A), siendo los últimos dos diseñados para minimizar las potenciales dianas no deseadas. Se generó una línea celular HEK293TTP53-/-para eliminar los efectos de la proteína p53 nativa. Las tres formas de ARNar con reconocimiento de TP53W53X convirtieron ~25-35 % de transcritos de TP53W53X en el sitio de adenosina mutada (Figura 23B), con reducciones variables de ediciones no deseadas para ARNarm-AG1 y ARNarm-AG4 (Figura 24). El análisis de transferencia Western mostró que ARNarm, ARNarm-AG1 y ARNarm-AG4 podían rescatar la producción de proteína p53 de longitud completa basada en las transcritos de TP53W53X en células HEK293TTP53-/-,mientras que el ARN Ctrlm no podía (Figura 23C).
[0174] Para verificar si las proteínas p53 reparadas son completamente funcionales, se analizó la actividad reguladora transcripcional de p53 con un sistema4748 reportero encisde p53-luciferasa. Las tres versiones de ARNar podían restaurar la actividad de p53 y la versión optimizada de ARNarm-AG1 funcionó de la mejor manera (Figura 23D). En conclusión, se demostró que LEAPER es capaz de reparar el codón de terminación prematuro relevante para el cáncer deTP53y restaurar su función.
Ejemplo 13. Correcciones de mutaciones patógenas mediante LEAPER
[0175] A continuación, se investigó si LEAPER se podría utilizar para corregir más mutaciones patógenas. Dirigido a mutaciones clínicamente relevantes de seis genes patógenos,COL3A1del síndrome de Ehlers-Danlos,BMPR2de hipertensión pulmonar primaria,AHI1del síndrome de Joubert,FANCCde anemia de Fanconi,MYBPC3de cardiomiopatía hipertrófica hereditaria yIL2RGde inmunodeficacia combinada severa unida por X, se diseñaron ARNar de 111 nt para cada uno de estos genes que llevan mutaciones de G>A patógenas correspondientes (Figura 25 y Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente y los siguientes ADNc relevantes para enfermedades utilizados en este estudio).
ADNc relacionados con enfermedad utilizados en este estudio
[0176]
[0177] Mediante la expresión conjunta de pares de ARNar/ADNc en células HEK293T, se identificaron cantidades importantes de transcritos diana con correlaciones de A>G en todos los ensayos (Figura 24). Debido a que las mutaciones de G>A representan casi la mitad de las mutaciones genéticas que causan enfermedades conocidas en seres humanos1049, la transformación de A>G mediante LEAPER puede ofrecer oportunidades inmensas para agentes terapéuticos.
Ejemplo 14. Edición de ARN en múltiples células primarias humanas mediante LEAPER
[0178] Para explorar adicionalmente la utilidad clínica de LEAPER, se estableció el ensayo del procedimiento en múltiples células primarias humanas. En primer lugar, se analizó LEAPER en fibroblastos pulmonares primarios humanos y células epiteliales bronquiales primarias con ARNar de 151 nt (Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente) para editar el reportero-1 (Figura 15A). El 35-45 % de células positivas de EGFP podían obtenerse mediante LEAPER en las dos células primarias humanas (Figura 27A). A continuación, se analizó LEAPER en la edición del gen endógenoPPIBen estas dos células primarias y células T primarias humanas y se descubrió que ARNar151-PPIB podía alcanzar >40 %, >80 % y >30 % de tasas de edición en fibroblastos pulmonares primarios humanos, células epiteliales bronquiales primarias (Figura 27B) y células T primarias (Figura 27C), respectivamente. La alta eficacia de edición de LEAPER en células primarias humanas es particularmente prometedora por su uso potencial en agentes terapéuticos.
Ejemplo 15. Edición eficiente mediante la expresión de lentivirus y síntesis química de ARNar
[0179] A continuación, se investigó si se podía suministrar LEAPER mediante más procedimientos clínicamente relevantes. En primer lugar, se analizó el efecto de ARNar a través de la expresión basada en lentivirus. Los ARNarisi con reconocimiento de reportero-1 indujeron una expresión fuerte de EGFP en más de 40 % de células totales que albergaban el reportero-1 en las células HEK293T 2 días después de la infección (dpi). 8 días después de la infección, la proporción de EGFP se mantuvo a un nivel comparable de ~38 % (Figura 28A y Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente), lo que sugiere que LEAPER podría ajustarse a agentes terapéuticos que necesitan administración continua. Para la edición de genes originales, se suministró ARNar151 con reconocimiento dePPIBa través de transducción lentiviral en las células HEK293T y se observó más de 6 % de edición diana 6 días después de la infección (Figura 28B).
[0180] A continuación, se pusieron a prueba oligonucleótidos de ARNar sintetizados y el procedimiento de suministro mediante electroporación de LEAPER. Los transcritos dePPIBcon reconocimiento de ARNar de 111 nt así como el ARN de control se sintetizaron químicamente con modificaciones de 2'-O-metilo y de enlace de fosforotioato en los primeros tres y los últimos tres residuos de ARNar (Figura 28C). Después de la introducción en las células T mediante la electroporación, los oligonucleótidos de ARNar-m-PPIB alcanzaron ~20 % de edición de transcritos dePPIB(Figura 28D), indicando que LEAPER es prometedor en el desarrollo de fármacos con fármacos de oligonucleótidos.
Ejemplo 16. Restauración de la actividad de a-L-iduronidasa en fibroblasto primario derivado de paciente con síndrome de Hurler mediante LEAPER
[0181] Finalmente, se examinó el potencial de LEAPER en el tratamiento de unacnfermedad monogénica, síndrome de Hurler, el subtipo más grave de mucopolisacaridosis del tipo I (MPS I) debido a la deficacia de a-L-iduronidasa (IDUA), una enzima metabólica lisosomal responsable de la degradación de mucopolisacáridos50 Se escogió un fibroblasto primario GM06214 que fue aislado originalmente de un paciente con síndrome de Hurler. Las células GM06214 contienen una mutación de TGG>TAG homocigota en el exón 9 del genIDUA,generando una mutación Trp402Ter en la proteína. Se diseñaron dos versiones de ARNar por los oligonucleótidos de ARN sintetizados con modificaciones químicas, ARNar-m-IDUA-V1 y ARNar-m-IDUA-V2, con reconocimiento del ARNm maduro y el pre-ARNm deIDUA,respectivamente (Figura 29A y Secuencias de ARNar y ARNs de control utilizadas en este estudio se enumeran anteriormente). Después de la introducción de ARNar-m-IDUA-V1 o ARNar-m-IDUA-V2 en las células GM06214 mediante la electroporación, se midieron las tasas de edición de ARN reconocido mediante el análisis de NGS y la actividad catalítica de a-L-iduronidasa con sustrato de 4-MU-a-L-iduronidasa en diferentes puntos de tiempo. Tanto ARNar-m-IDUA-V1 como ARNar-m-IDUA-V2 restauraron de manera significativa la actividad catalítica de IDUA en las células GM06214 con deficacia deIDUAde manera progresiva con el tiempo después de la electroporación, y ARNar-m-IDUA-V2 se comportó mucho mejor que ARNar-m-IDUA-V1, mientras que no se pudo detectar ninguna actividad de a-L-iduronidasa en los tres grupos de control (Figura 29B).
[0182] Para evaluar adicionalmente hasta qué grado la actividad de IDUA restaurada en GM06214 mediante LEAPER reduce el síndrome de Hurler, se examinó la actividad de IDUA en las células GM01323, otros fibroblastos primarios del paciente con síndrome de Scheie, un subtipo mucho más leve de MPS I que el síndrome de Hurler debido a la actividad residual de IDUA generada a partir del genotipo heterocigoto del genIDUA.Se descubrió que la actividad catalítica de IDUA en células GM06214 que albergaban ARNar-m-IDUA-V2 era superior a la de las células GM01323 48 horas después de la electroporación (Figura 29B). Acorde con estos resultados, el análisis de NGS indicó que ARNar-m-IDUA-V2 convirtió casi el 30 % de edición de A a I, una tasa mucho más alta que la de ARNar-m-IDUA-V1 (Figura 29C). Los análisis adicionales revelaron que se detectaron ediciones no deseadas mínimas en las regiones cubiertas con ARNar de transcritos deIDUA(Figura 29D). De manera destacada, LEAPER no desencadenó ninguna respuesta inmune en células primarias, tal como se demostró, a diferencia del poli(I:C) de dúplex de ARN que sirve como control positivo, ni ARNarm-IDUA-V1 ni tampoco ARNariii-IDUA-V2 indujeron expresiones de un panel de genes involucrados en las respuestas de interferón del tipo I y proinflamatorias (Figura 29E). Estos resultados mostraron el potencial terapéutico de LEAPER en el reconocimiento de determinadas enfermedades monogenéticas.
Ejemplo 17. Restauración de la actividad de a-L-iduronidasa en ratones con el síndrome de Hurler mediante LEAPER
[0183] Debido a que LEAPER facilita la posibilidad de llevar a cabo experimentos en un ratón, se examinó el potencial de LEAPER en el tratamiento de una enfermedad monogénica - síndrome de Hurlerin vivo.Se selecciona un virus adenoasociado (AAV) como el sistema de suministro. Se insertaron las dos secuencias (Seq ID NO. 341 y Seq ID NO.
342) en el vector plásmido AAV-U6-CMV-GFP y el plásmido se empaquetó en el virus AAV8 mediante PackGene Biotech (véanse, Figura 31). El título del virus fue el siguiente:
nombre título volumen Cantidad total secuencia de ARNar 5'-3
Seq ID NO. 341:
gggtgatgggtgctggccaggacacccactgtatg
AAV8-ID UA- attgctgtccaacacagccccagcctttgagacctct ARNad151-KD29,61E+1 2GC/ml 590ul 5,67 E+12GC gcccagagttgttctccatccaacagggccatgag
ccccatgactgtgagtactggctttcgcagcaactg
cacatggg
Seq ID NO. 342:
actacagttgctccgatatttaggctacgtcaataggcact AAV8-Aleatorio151- 9,91E+12GC/ml 600ul 5.95E+12GC aacttattggcgctggtgaacggacttcctctcgagtacc KD2 agaagatgactacaaaactcctttccattgcgagtatcgg
agtctggctcagtttggccagggaggcact
Se seleccionaron seis ratones macho MPSI (ratones W392X idua, B6.129S-Iduatm11Kmke/J) (4-10 semanas de edad) y se dividieron en dos grupos, y cada uno de los tres ratones del primer grupo fue inyectado con 1E12 GC del virus AAV8 empaquetado con plásmido AAV8-IDUA-ARNad151-KD2 a través de la vena caudal, cada uno de otros tres ratones del segundo grupo fue inyectado con 1E12 GC del virus AAV8 empaquetado con plásmido AAV8-Aleatorio151-KD2 a través de la vena caudal también como un control. Veintiocho días después de la inyección, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical y se recogieron los hígados. Se midió la actividad enzimática de a-L-iduronidasa en células hepática de ratón con el sustrato de 4-MU-a-L-iduronidasa de cada ratón en los dos grupos. El hígado se divide en piezas pequeñas, se utiliza una parte después de la trituración para la medición de la actividad enzimática (inmediatamente). La actividad enzimática relativa promedio del primer grupo es más alta que la del segundo grupo (véase Figura 32A). La actividad enzimática relativa de cada ratón del primer grupo es más alta que la del segundo grupo (véase Figura 32B, GM01323 como control y tiene 0,3 % de actividad enzimática de a-L-iduronidasa en comparación con las células de tipo salvaje). A partir del resultado de la actividad enzimática se puede observar que la actividad de a-L-iduronidasa del primer grupo de ratones se restaura. Para confirmar que la mutación de TGG> TAG se restaura y que LEAPER proporciona una edición eficaz de ARN, a continuación, se midieron las tasas de edición de ARN reconocido en células hepática de ratones a través del análisis de secuenciación de la última generación para cada ratón en los dos grupos utilizando la otra parte del hígado triturado. La otra parte se añade con trizol para NGS. La eficacia de edición de ARN promedio del primer grupo es casi más alta que la del segundo grupo (véase la Figura 33A). La eficacia de edición de ARN de cada ratón del primer grupo es casi más alta que la del segundo grupo (véase la Figura 33B). A partir del resultado de eficacia de edición de ARN se puede observar que el procedimiento LEAPER proporciona la edición eficaz de ARN hasta 7 %.
ADNc de ADAR1(p110)
5-ATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATT TGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGG GGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGAT GCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGA AACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATGGTAACCACAGAAAA AGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGACGCCAGACCAGAACCAGC AAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCC AGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCC ATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGA GTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGT TCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCC GAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCAT GACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCC ACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTT CTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGT CTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAAC TTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAG GCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTC ACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGA ACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTG GTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGT
t c c c a g c c g t c t g c g c a c a c a g c a a g a a g c a a g g c a a g c a g g a a g c a g c a g a t g c g g c t c t c c g t g TCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGC CAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCA CTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGC TTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACAT GGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGA GAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGA GTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGC TCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCT TTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAAT CCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGT GACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAA AATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATC TCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGA CAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGC AGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCT GGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAAT TGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGG ATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTA CTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAAC TTTTATCTCTGCCCAGTA GATTACAAGGATGACGACGATAAG(Flai¿ lag') TAG-3' (SEQ ID NO:332)
ADNc de ADAR1(p150)
5ATGAATCCGCGGCAGGGGTATTCCCTCAGCGGATACTACACCCATCCATTTCAAGGCTATGAGCACA GACAGCTCAGATACCAGCAGCCTGGGCCAGGATCTTCCCCCAGTAGTTTCCTGCTTAAGCAAATAGAA TTTCTCAAGGGGCAGCTCCCAGAAGCACCGGTGATTGGAAAGCAGACACCGTCACTGCCACCTTCCC TCCCAGGACTCCGGCCAAGGTTTCCAGTACTACTTGCCTCCAGTACCAGAGGCAGGCAAGTGGACATC AGGGGTGTCCCCAGGGGCGTGCATCTCGGAAGTCAGGGGCTCCAGAGAGGGTTCCAGCATCCTTCAC CACGTGGCAGGAGTCTGCCACAGAGAGGTGTTGATTGCCTTTCCTCACATTTCCAGGAACTGAGTATC TACCAAGATCAGGAACAAAGGATCTTAAAGTTCCTGGAAGAGCTTGGGGAAGGGAAGGCCACCACAG CACATGATCTGTCTGGGAAACTTGGGACTCCGAAGAAAGAAATCAATCGAGTTTTATACTCCCTGGCA AAGAAGGGCAAGCTACAGAAAGAGGCAGGAACACCCCCTTTGTGGAAAATCGCGGTCTCCACTCAG GCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACGGTCATAGCCAAGGAGCCCCAAACTCAGAC CCGAGTTTGGAACCGGAAGACAGAAACTCCACATCTGTCTCAGAAGATCTTCTTGAGCCTTTTATTGC AGTCTCAGCTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACAGTCATAGCCAAGGATCC CCAAACTCAGACCCAGGTTTGGAACCTGAAGACAGCAACTCCACATCTGCCTTGGAAGATCCTCTTGA GTTTTTAGACATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGC CCTGAATTTGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGA AAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGA GAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGA CCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATCiGTAACC ACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCA GAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGA AAATGGCCAGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGT TTCGAGCCATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAAC TGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACC TGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATC AATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGA AAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCA CTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCC TTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGA ATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAG CCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAG CCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATC TCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAG ATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATT CAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGT CGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCT CTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGA CAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACT CCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGA CTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTG AGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTA AAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTA CAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAG AAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGC GCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTT CGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGA ATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTA GTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCC CATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGT CGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAA GGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAAC TGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACG GAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTA CCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCC AAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGG AAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA GATTACAAGGATGACGACGATAAGíF1;i¡*Ui r )TAG-3’ (SEQ ID NO:333)
ADNc de ADAR2
5-ATGGATATAGAAGATGAAGAAAACATGAGTTCCAGCAGCACTGATGTGAAGGAAAACCGCAATCTG G AC A AC GTGTCCCCC A AGG ATGGC AGC AC ACCTGGGCCTGGCGAGGGCTCTC AGCTCTCC A ATGGGG GTGGTGGTGGCCCCGGCAGAAAGCGGCCCCTGGAGGAGGGCAGCAATGGCCACTCCAAGTACCGCCT GAAGAAAAGGAGGAAAACACCAGGGCCCGTCCTCCCCAAGAACGCCCTGATGCAGCTGAATGAGAT CAAGCCTGGTTTGCAGTACACACTCCTGTCCCAGACTGGGCCCGTGCACGCGCCTTTGTTTGTCATGT CTGTGGAGGTGAATGGCCAGGTTTTTGAGGGCTCTGGTCCCACAAAGAAAAAGGCAAAACTCCATGC TGGTGAGAAGGCCTTGAGGTCTTTCGTTCAGTTTCCTAATGCCTCTGAGGCCCACCTGGCCATGGGGA
GGACCCTGTCTGTCAACACGGACTTCACATCTGACCAGGCCGACTTCCCTGACACGCTCTTCAATGGT TTTGAAACTCCTGACAAGGCGGAGCCTCCCTTTTACGTGGGCTCCAATGGGGATGACTCCTTCAGTTC CAGCGGGGACCTCAGCTTGTCTGCTTCCCCGGTGCCTGCCAGCCTAGCCCAGCCTCCTCTCCCTGCCTT ACCACCATTCCCACCCCCGAGTGGGAAGAATCCCGTGATGATCTTGAACGAACTGCGCCCAGGACTCA AGTATGACTTCCTCTCCGAGAGCGGGGAGAGCCATGCCAAGAGCTTCGTCATGTCTGTGGTCGTGGAT GGTCAGTTCTTTGAAGGCTCGGGGAGAAACAAGAAGCTTGCCAAGGCCCGGGCTGCGCAGTCTGCCC TGGCCGCCATTTTTAACTTGCACTTGGATCAGACGCCATCTCGCCAGCCTATTCCCAGTGAGGGTCTTC AGCTGCATTTACCGCAGGTTTTAGCTGACGCTGTCTCACGCCTGGTCCTGGGTAAGTTTGGTGACCTG ACCGACAACTTCTCCTCCCCTCACGCTCGCAGAAAAGTGCTGGCTGGAGTCGTCATGACAACAGGCA CAGATGTTAAAGATGCCAAGGTGATAAGTGTTTCTACAGGAACAAAATGTATTAATGGTGAATACATGA GTGATCGTGGCCTTGCATTAAATGACTGCCATGCAGAAATAATATCTCGGAGATCCTTGCTCAGATTTCT TTATACACAACTTGAGCTTTACTTAAATAACAAAGATGATCAAAAAAGATCCATCTTTCAGAAATCAGA GCGAGGGGGGTTTAGGCTGAAGGAGAATGTCCAGTTTCATCTGTACATCAGCACCTCTCCCTGTGGAG ATGCCAGAATCTTCTCACCACATGAGCCAATCCTGGAAGAACCAGCAGATAGACACCCAAATCGTAAA GCAAGAGGACAGCTACGGACCAAAATAGAGTCTGGTGAGGGGACGATTCCAGTGCGCTCCAATGCGA GCATCCAAACGTGGGACGGGGTGCTGCAAGGGGAGCGGCTGCTCACCATGTCCTGCAGTGACAAGAT TGCACGCTGGAACGTGGTGGGCATCCAGGGATCCCTGCTCAGCATTTTCGTGGAGCCCATTTACTTCTC GAGCATCATCCTGGGCAGCCTTTACCACGGGGACCACCTTTCCAGGGCCATGTACCAGCGGATCTCCA ACATAGAGGACCTGCCACCTCTCTACACCCTCAACAAGCCTTTGCTCAGTGGCATCAGCAATGCAGAA GCACGGCAGCCAGGGAAGGCCCCCAACTTCAGTGTCAACTGGACGGTAGGCGACTCCGCTATTGAGG TCATCAACGCCACGACTGGGAAGGATGAGCTGGGCCGCGCGTCCCGCCTGTGTAAGCACGCGTTGTA CTGTCGCTGGATGCGTGTGCACGGCAAGGTTCCCTCCCACTTACTACGCTCCAAGATTACCAAACCCA ACGTGTACCATGAGTCCAAGCTGGCGGCAAAGGAGTACCAGGCCGCCAAGGCGCGTCTGTTCACAGC CTTCATCAAGGCGGGGCTGGGGGCCTGGGTGGAGAAGCCCACCGAGCAGGACCAGTTCTCACTCACG CCC G ATTAC A AGG AT G AC G ACG ATA AG( Flag tag) TAG-3’ (SEQ ID NO:334)
Secuencia codificante (CDS) de los genes relevantes para enfermedades
[0184]
COL3A1
5’-atgatgagctttgtgcaaaaggggagctggctacttctcgctctgcttcatcccactattattttggcacaacaggaagctgttgaaggaggatgttcccatcttggtca gtcctatgcggatagagatgtctggaagccagaaccatgccaaatatgtgtctgtgactcaggatccgttctctgcgatgacataatatgtgacgaicaagaattagactg ccccaacccagaaattccatttggagaatgttgtgcagtttgcccacagcctccaactgctcctactcgccctcctaatggtcaaggacctcaaggccccaagggagat ccaggccctcctggtattcctgggagaaatggtgaccctggtattccaggacaaccagggtcccctggttctcctggcccccctggaatctgtgaatcatgccctactgg tcctcagaactattctccccagtatgattcatatgatgtcaagtctggagtagcagtaggaggactcgcaggctatcctggaccagctggccccccaggccctcccggt ccccctggtacatctggtcatcctggttcccctggatctccaggataccaaggaccccctggtgaacctgggcaagctggtccttcaggccctccaggacctcctggtg ctataggtccatctggtcctgctggaaaagatggagaatcaggtagacccggacgacctggagagcgaggattgcctggacctccaggtatcaaaggtccagctggg atacctggattccctggtatgaaaggacacagaggcttcgatggacgaaalggagaaaagggtgaaacaggtgctcctggattaaagggtgaaaatggtcttccagg cgaaaatggagctcctggacccatgggtccaagaggggctcctggtgagcgaggacggccaggacttcctggggctgcaggtgctcggggtaatgacggtgctcg aggcagtgatggtcaaccaggccctcctggtcctcctggaactgccggattccctggatcccctggtgctaagggtgaagttggacctgcagggtctcctggttcaaat ggtgcccctggacaaagaggagaacctggacctcagggacacgctggtgctcaaggtcctcctggccctcctgggattaatggtagtcctggtggtaaaggcgaaat gggtcccgctggcattcctggagctcctggactgatgggagcccggggtcctccaggaccagccggtgctaatggtgctcctggactgcgaggtggtgcaggtgag cctggtaagaatggtgccaaaggagagcccggaccacgtggtgaacgcggtgaggctggtattccaggtgttccaggagctaaaggcgaagatggcaaggatgga tcacctggagaacctggtgcaaatgggcttccaggagctgcaggagaaaggggtgcccctgggttccgaggacctgctggaccaaatggcatcccaggagaaaag ggtcctgctggagagcgtggtgctccaggccctgcagggcccagaggagctgctggagaacctggcagagatggcgtccctggaggtccaggaatgaggggcat gcccggaagtccaggaggaccaggaagtgatgggaaaccagggcctcccggaagtcaaggagaaagtggtcgaccaggtcctcctgggccatctggtccccgag gtcagcctggtgtcatgggcttccccggtcctaaaggaaatgatggtgctcctggtaagaatggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcct
ggaaagaatggtgaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaaggattacaaggcttg cctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccggtgcacctggagetccaggaggcaagggtgatgctggt gcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggccccaggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctg ggccacctggtgctgctggtactcctggtctgcaaggaatgcctggagaaagaggaggtcttggaagtcctggtccaaagggtgacaagggtgaaccaggcggtcc aggtgctgatggtgtcccagggaaagatggcccaaggggtcctactggtcctattggtcctcctggcccagctggccagcctggagataagggtgaaggtggtgccc ccggacttccaggtatagctggacctcgtggtagccctggtgagagaggtgaaactggccctccaggacctgctggtttccctggtgctcctggacagaatggtgaac ctggtggtaaaggagaaagaggggctccgggtgagaaaggtgaaggaggccctcctggagttgcaggaccccctggaggttctggacctgctggtcctcctggtcc ccaaggtgtcaaaggtgaacgtggcagtcctggtggacctggtgctgctggcttccctggtgctcgtggtcttcctggtcctcctggtagtaatggtaacccaggacccc caggtcccagcggttctccaggcaaggatgggcccccaggtcctgcgggtaacactggtgctcctggcagccctggagtgtctggaccaaaaggtgatgctggcca accaggagagaagggatcgcctggtgcccagggcccaccaggagctccaggcccacttgggattgctgggatcactggagcacggggtcttgcaggaccaccag gcatgccaggtcctaggggaagccctggccctcagggtgtcaagggtgaaagtgggaaaccaggagctaacggtctcagtggagaacgtggtccccctggacccc agggtcltcctggtctggctggtacagctggtgaacctggaagagatggaaaccctggatcagatggtctlccaggccgagatggatctcctggtggcaagggtgatc gtggtgaaaatggctctcctggtgcccctggcgctcctggtcatccaggcccacctggtcctgtcggtccagctggaaagagtggtgacagaggagaaagtggccct gclggccctgctggtgctcccggtcctgctggttcccgaggtgctcctggtcctcaaggcccacgtggtgacaaaggtgaaacaggtgaacgtggagctgctggcat caaaggacatcgaggattccctggtaatccaggtgccccaggttctccaggccctgctggtcagcagggtgcaatcggcagtccaggacctgcaggccccagagga cctgttggacccagtggacctcctggcaaagatggaaccagtggacatccaggtcccattggaccaccagggcctcgaggtaacagaggtgaaagaggatctgagg gclccccaggccacccagggcaaccaggccctcctggacctcctggtgcccctggtccttgctgtggtgglgttggagccgctgccattgctgggattggaggtgaaa aagctggcggttttgccccgtattatggagatgaaccaatggatttcaaaatcaacaccgatgagattatgacttcactcaagtctgttaatggacaaatagaaagcctcat tagtcctgatggttctcgtaaaaaccc'cgctagaaactgcagagacctgaaattctgccatcctgaactcaagagtggagaatactgggttgaccctaaccaaggatgc aaattggatgctatcaaggtattctgtaatatggaaactggggaaacatgcataagtgccaatcctttgaatgttccacggaaacactggtggacagattctagtgctgag aagaaacacgtttggtttggagagtccatggatggtggttttcagtttagctacggcaatcctgaacttcctgaagatgtccttgatgtgcagctggcattccttcgacttctc tccagccgagcttcccagaacatcacatatcactgcaaaaatagcattgcatacatggatcaggccagtggaaatgtaaagaaggccctgaagctgatggggtcaaat gaaggtgaattcaaggctgaaggaaatagcaaattcacctacacagttctggaggatggttgcacgaaacacactggggaatggagcaaaacagtctttgaatatcga acacgcaaggctgtgagactacctattgtagatattgcaccctatgacattggtggtcctgatcaagaatttggtgtggacgttggccctgtttgctttttataa-3’ (SEQBMPR2
5 ’-atgacttcctcgctgcagcggccctggcgggtgccctggctaccatggaccatcctgctggtcagcgctgcggctgcttcgcagaatcaagaacggctatgtgcg tttaaagatccgtatcagcaagaccttgggataggtgagagtagaatctctcatgaaaatgggacaatattatgctcgaaaggtagcacctgctatggcctttgggagaa atcaaaaggggacataaatcttgtaaaacaaggatgttggtctcacattggagatccccaagagtgtcactatgaagaatgtgtagtaactaccactcctccctcaattca gaatggaacataccgtttctgctgttgtagcacagatttatgtaatgtcaactttactgagaattttccacctcctgacacaacaccactcagtccacctcattcatttaaccga gatgagacaataalcattgctttggcatcagtctctgtattagctgttttgatagttgccttatgctttggatacagaatgttgacaggagaccgtaaacaaggtcttcacagt atgaacatgatggaggcagcagcatccgaaccctctcttgatctagataatctgaaactgttggagctgattggccgaggtcgatatggagcagtatataaaggctcctt ggatgagcgtccagttgctgtaaaagtgttttcctttgcaaaccgtcagaattttatcaacgaaaagaacatttacagagtgcctttgatggaacatgacaacattgcccgc tttatagttggagatgagagagtcactgcagatggacgcatggaatatttgcttgtgatggagtactatcccaatggatctttatgcaagtatttaagtctccacacaagtga ctgggtaagctcttgccgtcttgctcattctgttactagaggactggcttatcttcacacagaattaccacgaggagatcattataaacctgcaatttcccatcgagatttaaa cagcagaaatgtcctagtgaaaaatgatggaacctgtgttattagtgactttggactgtccatgaggctgactggaaatagactggtgcgcccaggggaggaagataat gcagccataagcgaggttggcactatcagatatatggcaccagaagtgctagaaggagctgtgaacttgagggactgtgaatcagctttgaaacaagtagacatgtat gctcttggactaatctattgggagatatttatgagatgtacagacctcttcccaggggaatccgtaccagagtaccagatggcttttcagacagaggttggaaaccatccc acttttgaggatatgcaggttctcgtgtctagggaaaaacagagacccaagttcccagaagcctggaaagaaaatagcctggcagtgaggtcactcaaggagacaatc gaagactgttgggaccaggatgcagaggctcggcttactgcacagtgtgctgaggaaaggatggctgaacttatgatgatttgggaaagaaacaaatctgtgagccca acagtcaatccaatgtctactgctatgcagaatgaacgcaacctgtcacalaataggcgtgtgccaaaaattggtccttatccagattattcttcctcctcatacattgaaga ctctatccateatactgacagcatcgtgaagaatatttcctctgagcattctatgtccagcacacctttgactataggggaaaaaaaccgaaattcaattaaetatgaacgac agcaagcacaagctcgaatccccagccctgaaacaagtgtcaccagcctctccaccaacacaacaaccacaaacaccacaggactcacgccaagtactggcatgac tactatatctgagatgccatacccagatgaaacaaatctgcataccacaaatgttgcacagtcaattgggccaacccctgtctgcttacagctgacagaagaagacttgg
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AHI1
5'-atgcctacagctgagagtgaagcaaaagtaaaaaccaaagttcgctttgaagaattgcttaagacccacagtgatctaatgcgtgaaaagaaaaaactgaagaaaa aacttgtcaggtctgaagaaaacatctcacctgacactattagaagcaatcttcactatatgaaagaaactacaagtgatgatcccgacactattagaagcaatcttcccca tattaaagaaactacaagtgatgatgtaagtgctgctaacactaacaacctgaagaagagcacgagagtcactaaaaacaaattgaggaacacacagttagcaactga aaatcctaatggtgatgctagtgtagaggaagacaaacaaggaaagccaaataaaaaggtgataaagacggtgccccagttgactacacaagacctgaaaccggaa actcctgagaataaggttgattctacacaccagaaaacacatacaaagccacagccaggcgttgatcatcagaaaagtgagaaggcaaatgagggaagagaagaga ctgatttagaagaggatgaagaattgatgcaagcatatcagtgccatgtaactgaagaaatggcaaaggagattaagaggaaaataagaaagaaactgaaagaacag ttgacttactttccctcagatactttattccatgatgacaaactaagcagtgaaaaaaggaaaaagaaaaaggaagttccagtcttctctaaagctgaaacaagtacattga ccatctctggtgacacagttgaaggtgaacaaaagaaagaatcttcagttagatcagtttcttcagattctcatcaagatgatgaaataagctcaatggaacaaagcacag aagacagcatgcaagatgatacaaaacctaaaccaaaaaaaacaaaaaagaagactaaagcagttgcagataataatgaagatgttgatggtgatggtgttcatgaaat aacaagccgagatagcccggtttatcccaaatgtttgcttgatgatgaccttgtcttgggagtttacattcaccgaactgatagacttaagtcagattttatgatttctcaccca atggtaaaaattcatgtggttgatgagcatactggtcaatatgtcaagaaagatgatagtggacggcctgtttcatcttactatgaaaaagagaatgtggattatattcttcct attatgacccagccatatgattttaaacagttaaaatcaagacttccagagtgggaagaacaaattgtatttaatgaaaattttccctatttgcttcgaggctctgatgagagt cctaaagtcatcctgttctttgagattcttgatttcttaagcgtggatgaaattaagaataattctgaggttcaaaaccaagaatgtggctttcggaaaattgcctgggcatttc ttaagcttctgggagccaatggaaatgcaaacatcaactcaaaacttcgcttgcagctatattacccacctactaagcctcgatccccattaagtgttgttgaggcatttgaa tggtggtcaaaatgtccaagaaatcattacccatcaacactgtacgtaactgtaagaggactgaaagttccagactgtataaagccatcttaccgctctatgatggctcttc aggaggaaaaaggtaaaccagtgcattgtgaacgtcaccatgagtcaagctcagtagacacagaacctggattagaagagtcaaaggaagtaataaagtggaaacg actccctgggcaggcttgccgtatcccaaacaaacacctcttctcactaaatgcaggagaacgaggatgtttttgtcttgatttctcccacaatggaagaatattagcagca gcttgtgccagccgggatggatatccaattattttatatgaaattccttctggacgtttcalgagagaattgtgtggccacctcaatatcatttatgatctttcctggtcaaaag atgatcactacatccttacttcatcatctgatggcactgccaggatatggaaaaatgaaataaacaatacaaatactttcagagttttacctcatccttcttttgtttacacggct aaattccatccagctgtaagagagctagtagttacaggatgctatgattccatgatacggatatggaaagttgagatgagagaagattctgccatattggtccgacagttt gacgttcacaaaagttttatcaactcactttgttttgatactgaaggtcatcatatgtattcaggagattgtacaggggtgattgttgtttggaatacctatgtcaagattaatga tttggaacattcagtgcaccactggactataaataaggaaattaaagaaactgagtttaagggaattccaataagttatttggagattcatcccaatggaaaacgtttgttaa tccataccaaagacagtactttgagaattatggatctccggatattagtagcaaggaagtttgtaggagcagcaaattatcgggagaagattcatagtactttgactccatg tgggacltttctgtttgctggaagtgaggatggtatagtgtatgtttggaacccagaaacaggagaacaagtagccatgtattctgacttgccattcaagtcacccattcga gacatttcttatcatccatttgaaaatatggttgcattctgtgcatttgggcaaaatgagccaattcttctgtatatttacgatttccatgttgcccagcaggaggctgaaatgtt caaacgctacaatggaacatttccattacctggaatacaccaaagtcaagatgccctatgtacctgtccaaaactaccccatcaaggctcttttcagattgatgaatttgtcc acactgaaagttcttcaacgaagatgcagctagtaaaacagaggcttgaaactgtcacagaggtgatacgttcctgtgctgcaaaagtcaacaaaaatctctcatttactt caccaccagcagtttcctcacaacagtctaagttaaagcagtcaaacatgctgaccgctcaagagattctacatcagtttggtttcactcagaccgggattatcagcatag aaagaaagccttgtaaccatcaggtagatacagcaccaacggtagtggctctttatgactacacagcgaatcgatcagatgaactaaccatccatcgcggagacattat ccgagtgtttttcaaagataatgaagactggtggtatggcagcataggaaagggacaggaaggttattttccagctaatcatgtggctagtgaaacactgtatcaagaact gcctcctgagataaaggagcgatcccctcctttaagccctgaggaaaaaactaaaatagaaaaatctccagctcctcaaaagcaatcaatcaataagaacaagtccca ggacttcagactaggctcagaatctatgacacattctgaaatgagaaaagaacagagccatgaggaccaaggacacataatggatacacggatgaggaagaacaag
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FANCC
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ctgaaacctga-3' (SEQ ID NO:340)
Discusión
[0185] Las tecnologías de edición del genoma están revolucionando la investigación biomédica. Se han diseñado con éxito nucleasas altamente activas, tales como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN)1, las nucleasas efectoras de tipo activadores de la transcripción (TALEN)2-4 y las proteínas Cas del sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas)5-7 para manipular el genoma en una miríada de organismos. Recientemente, se han aprovechado las desaminasas para cambiar con precisión el código genético sin romper la doble cadena del ADN. Al acoplar una citidina o una adenosina desaminasa con el sistema CRISPR-Cas9, los investigadores crearon editores de base programables que permiten la conversión de C^G en T^A o de A^T en G^C en ADN genómico 8-10, que ofrece nuevas oportunidades para corregir mutaciones que causan enfermedades.
[0186] Aparte del ADN, el ARN es una diana atractiva para la corrección genética porque la modificación del ARN podría alterar la función de la proteína sin generar ningún cambio permanente en el genoma. Las adenosina desaminasas ADAR se explotan actualmente para lograr una edición de bases precisa en los ARN. Se han identificado tres tipos de proteínas ADAR en mamíferos, ADAR1 (isoformas p110 y p150), ADAR2 y ADAR3 (catalítica inactiva)1112, cuyos sustratos son ARN bicatenarios, en los que una adenosina (A) no emparejada con una citosina (C) se desamina preferentemente a inosina (I). Se cree que la inosina imita la guanosina (G) durante la traducción 1314. Para lograr la edición de ARN reconocido, la proteína ADAR o su dominio catalítico se fusionó con un péptido AN 15-17, una etiqueta SNAP18-22 o una proteína Cas (dCas13b)23, y se diseñó un ARN guía para reclutar la proteína quimérica ADAR al sitio específico. De manera alternativa, también se describió que la sobreexpresión de proteínas ADAR1 o ADAR2 junto con un ARN guía con motivo R/G permite la edición de ARN reconocido 24-27
[0187] Todos estos procedimientos de edición de ácidos nucleicos descritos en sistemas de mamíferos se basan en la expresión ectópica de dos componentes: una enzima y un ARN guía. Aunque estos sistemas binarios funcionan de manera eficiente en la mayoría de los estudios, algunos obstáculos inherentes limitan sus amplias aplicaciones, especialmente en terapias. Debido a que el suministroin vivomás eficaz para la terapia génica es a través de vectores virales 28, y los vectores de virus adenoasociados (AAV) altamente deseables tienen un tamaño de carga limitado (~4,5 kb), lo que dificulta el acomodamiento tanto de la proteína como de ARN guía2930. Recientemente se ha descrito que la sobreexpresión de ADAR1 confiere oncogenicidad en mielomas múltiples debido a una hiperedición aberrante en los ARN 31 y genera ediciones globales sustanciales de dianas no deseadas 32 Además, la expresión ectópica de proteínas o sus dominios de origen no humano tiene un riesgo potencial de provocar inmunogenicidad 3033. Además, la inmunidad adaptativa preexistente y la respuesta al daño del ADN mediada por p53 pueden comprometer la eficacia de la proteína terapéutica, tal como Cas934-38 Aunque se ha intentado utilizar un mecanismo endógeno para la edición de a Rn , esto se intentó únicamente inyectando transcrito:dúplex de ARN diana preensamblado en embriones deXenopus39.Son muy necesarias tecnologías alternativas para una edición robusta de ácidos nucleicos que no dependan de la expresión ectópica de proteínas. Aquí, se desarrolló un enfoque novedoso que aprovecha las ADAR endógenas para la edición de ARN. Se demostró que expresar un ARN guía diseñado deliberadamente permite una edición eficiente y precisa de ARN endógenos y corrige mutaciones patógenas. Esta plataforma unaria de edición de ácidos nucleicos puede abrir nuevas vías para agentes terapéuticos y la investigación.
[0188] En particular, se demostró que la expresión de un ARNr lineal con longitud adecuada es capaz de guiar a las proteínas ADAR endógenas para editar adenosina a inosina en los transcritos reconocidos. Este sistema, denominado LEAPER, utiliza proteínas ADAR endógenas para lograr la edición programable de ácidos nucleicos, lo que presenta ventajas sobre los enfoques existentes.
[0189] La rara cualidad de LEAPER es su simplicidad porque solo se basa en un tamaño pequeño de molécula de ARN para dirigir las proteínas endógenas para la edición de ARN. Esto recuerda al ARNi, en el que un pequeño ARNbc podría invocar un mecanismo nativo para la degradación del ARN reconocido 51. Debido a su pequeño tamaño, el ARNr podría suministrarse fácilmente mediante una variedad de vehículos virales y no virales. A diferencia de RNAi, LEAPEr cataliza el cambio preciso de A a I sin generar corte o degradación de transcritos reconocidos (Fig. 18A). Aunque el requisito de longitud para el ARNr es mayor que el del ARNi, no induce efectos inmunoestimulantes a nivel celular (Fig. 22E, f y Fig. 29E) ni afecta la función de las proteínas ADAR endógenas (Fig. 22A, B), lo que hace que sea una estrategia segura para el reconocimiento ARN. De manera destacable, se ha descrito que la expresión ectópica de las proteínas ADAR o sus dominios catalíticos induce ediciones globales sustanciales de dianas no deseadas32 y posiblemente desencadene el cáncer31.
[0190] Recientemente, varios grupos informaron que el editor de bases de citosina podría generar variantes sustanciales de un solo nucleótido de dianas no deseadas en embriones de ratón, arroz o líneas celulares humanas debido a la expresión de una proteína efectora, lo que ilustra la ventaja de LEAPER para una posible aplicación terapéutica 52-54 Es gratificante que LEAPER potencie la edición eficiente al mismo tiempo que provoca una rara edición global de dianas no deseadas (Fig. 20 y Fig. 21). Además, LEAPER podría minimizar la inmunogenicidad potencial o superar los obstáculos de suministro comúnmente compartidos por otros procedimientos que requieren la introducción de proteínas exógenas.
[0191] Para LEAPER, recomendaríamos usar ARNr con un tamaño mínimo superior a 70 nt para lograr la actividad deseable. En el contexto nativo, las proteínas ADAR editan de forma no específica repeticiones de Alu que tienen un dúplex de más de 300 n t55 Cabe destacar que las repeticiones de Alu forman un dúplex intramolecular estable, mientras que LEAPER da como resultado un dúplex intermolecular entre ARNr y ARNm o pre-ARNm, que se supone que es menos estable y más difícil de formar. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que un dúplex de ARN de más de 70 nt es estequiométricamente importante para reclutar o acoplar proteínas ADAR para una edición efectiva. De hecho, un ARNr más largo dio como resultado un mayor rendimiento de edición tanto en reporteros expresadosde manera ectópica como en transcritos endógenas (Fig. 16D y Fig. 17B). Sin embargo, debido a que las proteínas ADAR desaminan promiscuamente la base de adenosina en el dúplex de ARN, un ARNr más largo puede provocar más dianas nos deseadas fuera de la ventana de reconocimiento.
[0192] Si bien LEAPER podía reconocer de manera eficaz transcritos originales, su eficiencia de edición y sus tasas de en dianas no deseadas variaban. Para el reconocimiento de transcritos dePPIB,podríamos convertir el 50 % de la adenosina reconocida en inosina sin dianas no deseadas evidentes dentro de las ventanas de cobertura (Fig. 17B, F). Las dianas no deseadas se volvieron más graves para otros transcritos. Se ha logrado reducir las dianas no deseadas, tales como la introducción de desemparejamientos A-G o desemparejamientos consecutivos para reprimir la edición no deseada. Sin embargo, demasiados desemparejamientos podrían disminuir la eficiencia en la eficacia de las dianas deseadas. Al sopesar la eficiencia y las posibles dianas no deseadas, se recomendaría ARNr con una longitud que oscilara entre 100 y 150 nt para editar en transcritos endógenos. Si existe la opción, es mejor seleccionar regiones con menos adenosina para minimizar la posibilidad de ediciones no deseadas. De manera alentadora, no se han detectado ninguna diana no deseada fuera de los dúplex de transcritos con reconocimiento de ARNar (figura 20).
[0193] Se ha optimizado el diseño del ARNr para lograr una eficiencia de edición mejorada y se ha demostrado que LEAPER podría aprovecharse para manipular la función genética o corregir la mutación patógena. También se ha demostrado que LEAPER no se limita a trabajar únicamente con UAG, sino que funciona posiblemente con cualquier adenosina independientemente de sus nucleótidos flanqueantes (Fig. 16F, G y Fig. 17C). Esta flexibilidad es ventajosa para una posible corrección terapéutica de enfermedades genéticas causadas por determinadas mutaciones puntuales. De manera interesante, al editar los transcritos deIDUA,el ARNr que reconoce pre-ARNm es más efectivo que el que reconoce el ARN maduro, lo que indica que los núcleos son los principales sitios de acción para las proteínas ADAR y LEAPER podría aprovecharse para manipular el empalme modificando los sitios de empalme dentro del pre-ARN. Y lo que es más, LEAPER ha demostrado una alta eficacia para reconocer de manera simultánea múltiples transcritos de genes (Fig. 17D). Esta capacidad de multiplexación de LEAPER podría desarrollarse para curar determinadas enfermedades poligenéticas en el futuro.
[0194] Es beneficioso realizar la corrección genética a nivel de ARN. En primer lugar, la edición de transcritos reconocidos no cambiaría permanentemente el genoma o el repertorio del transcriptoma, lo que hace que los enfoques de edición de ARN sean más seguros para agentes terapéuticos que los medios de edición del genoma. Además, la edición transitoria es muy adecuada para el control temporal del tratamiento de enfermedades causadas por cambios ocasionales en un estado específico. En segundo lugar, LEAPER y otros procedimientos de edición de ARN no introducirían DSB en el genoma, evitando el riesgo de generar eliminaciones no deseadas de grandes fragmentos de ADN 37 Los procedimientos de edición de bases de ADN que adoptan la nickasa Cas9 aún podrían generar indeles en el genoma8. Además, independientemente de la maquinaria de reparación del ADN nativo, LEAPER también debería funcionar en células posmitóticas, tales como las células del cerebelo, con alta expresión de ADAR2 11.
[0195] Se ha demostrado que LEAPER podría aplicarse a un amplio espectro de tipos de células, tales como líneas celulares humanas (Fig. 14C), líneas celulares de ratón (Fig. 14D) y células primarias humanas, incluidas células T primarias (Fig. 27 y Fig. 28D). La edición eficiente mediante suministro lentiviral u oligonucleótidos sintetizados proporciona un mayor potencial para el desarrollo terapéutico (Fig. 28). Además, LEAPER podría producir cambios fenotípicos o fisiológicos en diversas aplicaciones, incluida la recuperación de la actividad reguladora transcripcional de p53 (Fig. 7), la corrección de mutaciones patógenas (Fig. 26) y la restauración de la actividad de a-L-iduronidasa en fibroblastos primarios derivados de pacientes con síndrome de Hurler (Fig. 29). Por tanto, se puede prever que LEAPER tiene un enorme potencial en el tratamiento de enfermedades.
[0196] Stafforst y colegas describieron un procedimiento de edición de ARN nuevo y aparentemente similar, denominado RESTORE, que funciona mediante el reclutamiento de ADAR endógenas utilizando oligonucleótidos antisentido sintéticos 56 La diferencia fundamental entre RESTORE y LEAPER radica en la naturaleza distinta del ARN guía para reclutar ADAR endógena. El ARN guía de RESTORE se limita a oligonucleótidos antisentido quimiosintéticos (ASO) que dependen de una modificación química compleja, mientras que el ARNr de LEAPER se puede generar de diversas formas, síntesis química y expresión a partir de vectores virales o no virales (Fig. 28 y Fig. 29). Es importante destacar que, al estar fuertemente modificado químicamente, el ASO está restringido a actuar de forma transitoria en el tratamiento de enfermedades. Por el contrario, el ARNr podría producirse mediante expresión, una característica particularmente importante a efectos de la edición constante.
[0197] Todavía hay margen de mejora con respecto a la eficiencia y especificidad de LEAPER. Debido a que LEAPER depende de ADAR endógena, el nivel de expresión de las proteínas ADAR en las células diana es uno de los determinantes para una edición exitosa. Según el informe anterior57 y nuestras observaciones (Fig. 14A, B), la ADAR1 p110 se expresa de manera ubicua en todos los tejidos, lo que garantiza la amplia aplicabilidad de LEAPER. La ADAR1 p150 es una isoforma 58 inducible por interferón, y ha demostrado ser funcional en LEAPER (Fig. 11E, Fig. 12B). Por lo tanto, la transfección en conjunto de los ARN estimuladores de interferón con el ARNr podría mejorar aún más la eficacia de la edición en determinadas circunstancias. Alternativamente, como ADAR3 desempeña funciones inhibidoras, la inhibición de ADAR3 podría mejorar la eficacia de edición en células que expresan ADAR3. Además, una modificación adicional del ARNr podría aumentar su eficacia de edición. Por ejemplo, el ARNr fusionado con cierta estructura de reclutamiento de ADAR puede aumentar la concentración de proteína ADAR local y, en consecuencia, reforzar el rendimiento de la edición. Hasta ahora, sólo se pudo aprovechar las proteínas ADAR1/2 endógenas para la conversión de bases A a I. Es apasionante explorar si se podrían aprovechar de manera similar más mecanismos nativos para la modificación de elementos genéticos, especialmente para realizar una potente edición de ácidos nucleicos.
[0198] En conjunto, se proporcionó una prueba de concepto de que la maquinaria endógena en las células podría ser coseleccionada para editar transcritos de ARN. Se demostró que LEAPER es un sistema simple, eficiente y seguro, que arroja luz sobre un camino novedoso para agentes terapéuticos e investigación basados en la edición de genes.
Referencias
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Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para editar un ARN diana en una célula huésped, que comprende introducir un ARN reclutador de desaminasa (ARNd) o una construcción que codifica el ARNd en la célula huésped,
en el que el ARNd comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con el ARN diana y un desemparejamiento de citidina directamente opuesto a la adenosina diana en el ARN diana,
en el que el desemparejamiento de citidina está ubicado al menos a 20 nucleótidos de distancia del extremo 3' de la secuencia complementaria, y al menos a 5 nucleótidos de distancia del extremo 5' de la secuencia complementaria en el ARNd,
en el que el ARNd tiene una longitud de 50 a 260 nucleótidos y no comprende un nucleótido químicamente modificado, y
en el que el ARNd es capaz de reclutar una adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN 1 o 2 (ADAR1 o ADAR2) para desaminar una adenosina diana en el ARN diana, y el ARNd no comprende un dominio de reclutamiento de ADAR.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ARNd tiene una longitud de 70 a 260 nucleótidos.
3. Procedimiento de la reivindicación 2, en el que el ARNd tiene una longitud de 100 a 150 nucleótidos.
4. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la ADAR1 o ADAR2 es una ADAR expresada endógenamente por la célula huésped, o ADAR1 o ADAR2 es una ADAR exógena introducida en la célula huésped.
5. Procedimiento de la reivindicación 4, que comprende introducir una construcción que codifica el ARNd en la célula huésped, en el que la construcción es un vector viral o un plásmido.
6. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el desemparejamiento de citidina está ubicado dentro de 10 nucleótidos del centro de la secuencia complementaria en el ARNd.
7. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia complementaria comprende además una o más guanosinas, cada una de ellas opuesta a una adenosina no diana en el<a>R<n>diana.
8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el que la secuencia complementaria comprende dos o más nucleótidos no emparejables consecutivos opuestos a una adenosina no diana en el ARN diana.
9. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la adenosina diana está en un motivo de tres bases seleccionado del grupo que consiste en UAG, UAC, UAA,<u>A<u>, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA y GAU en el ARN diana.
10. Procedimiento de la reivindicación 9, en el que el motivo de tres bases es UAG, y en el que el ARNd comprende una A directamente opuesta a la uridina en el motivo de tres bases, una citidina directamente opuesta a la adenosina diana y una citidina, guanosina o uridina directamente opuestas a la guanosina en el motivo de tres bases.
11. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el ARN diana es un ARN seleccionado del grupo que consiste en un ARN premensajero, un ARN mensajero, un ARN ribosómico, un ARN de transferencia, un ARN largo no codificante y un ARN pequeño.
12. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende introducir una pluralidad de ARNd, cada uno de los cuales se dirige a un ARN diana diferente.
13. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la célula huésped es una célula eucariota.
14. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la célula huésped es una célula de mamífero.
15. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la célula huésped es una célula humana o de ratón.
16. ARN reclutador de desaminasa (ARNd) para la desaminación de una adenosina diana en un ARN diana mediante el reclutamiento de una adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR), que comprende una secuencia de ARN complementaria que se hibrida con el ARN diana, en el que el ARNd comprende la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las SEQ ID NO: 25-44, 142-205, 341-342.
17. Construcción que codifica el ARNd de la reivindicación 16.
18. Biblioteca que comprende una pluralidad de los ARNd de la reivindicación 16 o la construcción de la reivindicación 17.
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