JP2023078373A - Rnaを編集する方法および組成物 - Google Patents
Rnaを編集する方法および組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023078373A JP2023078373A JP2023045897A JP2023045897A JP2023078373A JP 2023078373 A JP2023078373 A JP 2023078373A JP 2023045897 A JP2023045897 A JP 2023045897A JP 2023045897 A JP2023045897 A JP 2023045897A JP 2023078373 A JP2023078373 A JP 2023078373A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- drna
- target
- editing
- adenosine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 279
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 589
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 583
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 489
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims abstract description 244
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims abstract description 244
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 123
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 121
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims abstract description 80
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 101000865408 Homo sapiens Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102100029791 Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase Human genes 0.000 claims abstract description 70
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 62
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims abstract description 62
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 claims abstract description 62
- 102100038191 Double-stranded RNA-specific editase 1 Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 101000742223 Homo sapiens Double-stranded RNA-specific editase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 113
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 51
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 49
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 claims description 47
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 41
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 36
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 24
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 18
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims description 18
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 17
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 claims description 16
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 224
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 224
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 168
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 134
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 128
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 123
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 112
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 108
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 105
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 100
- 101000611202 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Proteins 0.000 description 98
- 102100040283 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Human genes 0.000 description 98
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 94
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 83
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 83
- 238000013461 design Methods 0.000 description 74
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 69
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 68
- 102100035028 Alpha-L-iduronidase Human genes 0.000 description 64
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 56
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 56
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 description 55
- 101710098624 Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 description 55
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 52
- 101001024630 Drosophila melanogaster RNA cytidine acetyltransferase Proteins 0.000 description 50
- 101000652705 Drosophila melanogaster Transcription initiation factor TFIID subunit 4 Proteins 0.000 description 50
- 101000873927 Homo sapiens Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Proteins 0.000 description 50
- 101000996915 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Nucleoporin NSP1 Proteins 0.000 description 50
- 102100035748 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Human genes 0.000 description 50
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 49
- 108010027673 Fanconi Anemia Complementation Group C protein Proteins 0.000 description 46
- 102000018825 Fanconi Anemia Complementation Group C protein Human genes 0.000 description 46
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 46
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 46
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 46
- 101001019502 Homo sapiens Alpha-L-iduronidase Proteins 0.000 description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 37
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 36
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 34
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 33
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 33
- 102100025725 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Human genes 0.000 description 32
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 32
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 32
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 31
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 31
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 30
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 30
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 29
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 28
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 24
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 24
- 230000017156 mRNA modification Effects 0.000 description 23
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 22
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 22
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 22
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 21
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 21
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 21
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 20
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 20
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 19
- 108010003381 Iduronidase Proteins 0.000 description 19
- 101150105104 Kras gene Proteins 0.000 description 19
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 19
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 19
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 101150105899 ppiB gene Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 17
- 102100024692 Double-stranded RNA-specific editase B2 Human genes 0.000 description 16
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 16
- 101000686486 Homo sapiens Double-stranded RNA-specific editase B2 Proteins 0.000 description 16
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 16
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 16
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 14
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 13
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 13
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 13
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 13
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 12
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 12
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 12
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 11
- 206010056886 Mucopolysaccharidosis I Diseases 0.000 description 11
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 11
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 11
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 10
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 10
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 10
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 10
- 102100028089 RING finger protein 112 Human genes 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 10
- 102220097788 rs876658483 Human genes 0.000 description 10
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 10
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 9
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 9
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 9
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 8
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 8
- 208000015178 Hurler syndrome Diseases 0.000 description 7
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 7
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 7
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 208000028781 Mucopolysaccharidosis type 1 Diseases 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 6
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 5
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102100026234 Cytokine receptor common subunit gamma Human genes 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 101000929495 Homo sapiens Adenosine deaminase Proteins 0.000 description 5
- 101001055227 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit gamma Proteins 0.000 description 5
- 101000982032 Homo sapiens Myosin-binding protein C, cardiac-type Proteins 0.000 description 5
- 101150022680 IDUA gene Proteins 0.000 description 5
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 5
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 5
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102100026771 Myosin-binding protein C, cardiac-type Human genes 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 5
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 102220004234 rs121965019 Human genes 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 4
- 102100025422 Bone morphogenetic protein receptor type-2 Human genes 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102100031611 Collagen alpha-1(III) chain Human genes 0.000 description 4
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000934635 Homo sapiens Bone morphogenetic protein receptor type-2 Proteins 0.000 description 4
- 101000993285 Homo sapiens Collagen alpha-1(III) chain Proteins 0.000 description 4
- 208000031309 Hypertrophic Familial Cardiomyopathy Diseases 0.000 description 4
- 201000008645 Joubert syndrome Diseases 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- 208000012827 T-B+ severe combined immunodeficiency due to gamma chain deficiency Diseases 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000023940 X-Linked Combined Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 4
- 201000007146 X-linked severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 201000006692 familial hypertrophic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 4
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 208000002197 Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 3
- 208000004248 Familial Primary Pulmonary Hypertension Diseases 0.000 description 3
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 3
- 102100030651 Glutamate receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 206010064911 Pulmonary arterial hypertension Diseases 0.000 description 3
- 230000009948 RNA mutation Effects 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 201000008312 primary pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004135 Bone phosphate Substances 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108020004460 Fungal RNA Proteins 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 2
- 101100468236 Mus musculus Adarb1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008228 bacteriostatic water for injection Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- -1 crRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009459 flexible packaging Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 108010089305 glutamate receptor type B Proteins 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 108700007502 mouse ADAR1 Proteins 0.000 description 2
- 108700007949 mouse ADAR2 Proteins 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 208000030683 polygenic disease Diseases 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150102859 ADARB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108700040115 Adenosine deaminases Proteins 0.000 description 1
- 101100132920 Arabidopsis thaliana ATR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100025473 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010264 Condition aggravated Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 101150034590 DAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010442 DNA editing Methods 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710086766 FP protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101710087631 Glutamate receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100022758 Glutamate receptor ionotropic, kainate 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710112360 Glutamate receptor ionotropic, kainate 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 208000015204 Hurler-Scheie syndrome Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100066898 Mus musculus Flna gene Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 108010020062 Peptidylprolyl Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100393304 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GPD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007415 Small Cajal body-specific RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UDEWPOVQBGFNGE-UHFFFAOYSA-N benzoic acid n-propyl ester Natural products CCCOC(=O)C1=CC=CC=C1 UDEWPOVQBGFNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H bis[(2-oxo-1,3,2$l^{5},4$l^{2}-dioxaphosphaplumbetan-2-yl)oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150073223 hisat gene Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000043770 human ADAR Human genes 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001660 hyperkinetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- OLXYLDUSSBULGU-UHFFFAOYSA-N methyl pyridine-4-carboxylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=NC=C1 OLXYLDUSSBULGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920006267 polyester film Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
Abstract
【課題】工学操作されたRNAを使用してRNAを編集するための方法を提供する。【解決手段】インビトロで宿主細胞における標的RNAを編集する方法であって、標的RNAとハイブリダイズさせた複合体ではないdRNA、または前記dRNAをコードする構築体を前記宿主細胞に導入することを含み、前記dRNAは、前記宿主細胞内で前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列と、前記標的RNA中の標的アデノシンの真向かいのシチジンまたはアデノシンのミスマッチを含み、前記dRNAは50~260ヌクレオチド長であり、前記dRNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、前記宿主細胞によって内因的に発現されたADAR1またはADAR2を動員することができ、前記dRNAがADAR動員ドメインを含まず、前記宿主細胞は真核細胞である、方法とする。【選択図】なし
Description
(相互参照)
本出願は、2018年10月12日に提出された国際出願番号PCT/CN2018/
110105である国際出願、及び2019年4月15日に提出された国際出願番号CN
2019/082713である国際出願の優先権を享有することを主張する。それらの内
容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる。
本出願は、2018年10月12日に提出された国際出願番号PCT/CN2018/
110105である国際出願、及び2019年4月15日に提出された国際出願番号CN
2019/082713である国際出願の優先権を享有することを主張する。それらの内
容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる。
ASCIIテキストファイルで提出された内容は、その全体が参照により本出願に取り
込まれる:配列表のコンピュータ可読形態(CRF)(ファイル名:FC00158PC
T-New-sequence listing-YZG-zhc.TXT、記録日付:
2019年10月11日、サイズ:104KB)。
込まれる:配列表のコンピュータ可読形態(CRF)(ファイル名:FC00158PC
T-New-sequence listing-YZG-zhc.TXT、記録日付:
2019年10月11日、サイズ:104KB)。
本発明は、アデノシンデアミナーゼを動員して標的RNA中の1つ以上のアデノシンを
脱アミノ化することができる工学操作されたRNAを使用してRNAを編集するための方
法および組成物に関する。
脱アミノ化することができる工学操作されたRNAを使用してRNAを編集するための方
法および組成物に関する。
ゲノム編集は、生物医学研究および疾患治療法の開発のための強力なツールである。今
まで、最もはやっている遺伝子編集技術は、細菌と古細菌の適応免疫システムから開発さ
れたクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(Clust
ered Regularly Interspaced Short Palindr
omic Repeats,CRISPR)-Casシステムである。CRISPR-C
asは、ゲノムDNAを正確に標的にして切断し、二本鎖DNA切断(DSB)を生成す
ることができる。DSBは、非相同末端結合(NHEJ)経路を介して修復でき、挿入ま
たは削除(Indel)を引き起こし、後者はほとんどの場合、遺伝子を不活性化させる
。あるいは、相同性指向修復(HDR)経路は、相同テンプレートdsDNAまたはss
DNAを使用して前記DSBを修復し、正確なゲノム編集を実現できる。
まで、最もはやっている遺伝子編集技術は、細菌と古細菌の適応免疫システムから開発さ
れたクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(Clust
ered Regularly Interspaced Short Palindr
omic Repeats,CRISPR)-Casシステムである。CRISPR-C
asは、ゲノムDNAを正確に標的にして切断し、二本鎖DNA切断(DSB)を生成す
ることができる。DSBは、非相同末端結合(NHEJ)経路を介して修復でき、挿入ま
たは削除(Indel)を引き起こし、後者はほとんどの場合、遺伝子を不活性化させる
。あるいは、相同性指向修復(HDR)経路は、相同テンプレートdsDNAまたはss
DNAを使用して前記DSBを修復し、正確なゲノム編集を実現できる。
最近、デアミナーゼタンパク質(RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR
)など)を利用して、RNA編集用の新しいツールが開発された。哺乳類細胞には、Ad
ar1(2つのアイソフォーム、p110とp150)、Adar2とAdar3(触媒
的に不活性)の3種類のADARタンパク質がある。ADARタンパク質の触媒基質は二
本鎖RNAであり、アデノシン(A)ヌクレオシド塩基から-NH2基を除去し、Aをイ
ノシン(I)に変更することができる。これは、グアノシン(G)として認識され、その
後の細胞の転写および翻訳プロセス中にシチジン(C)とペアリングする。研究者らは、
λNペプチドをヒトAdar1またはAdar2デアミナーゼドメインに融合させてλN
-ADARDDシステムを構築した。このシステムは、BoxBステムループとアンチセ
ンスRNAからなる融合RNAによって誘導されて特定のRNA標的に結合することがで
きる。この方法では、標的Aの塩基に(A-Cミスマッチを導入することで)標的Aから
Iに編集することができる。その結果、AからGのRNA塩基が編集される。RNA編集
の他の方法には、アンチセンスRNAをR/Gモチーフ(ADAR-動員RNAスキャフ
ォールド)に融合して、哺乳類細胞でAdar1またはAdar2タンパク質を過剰発現
させることにより、標的RNAを編集する方法や、dCas13-ADARを使用してR
NAを正確に標的にして編集する方法が含まれる。
)など)を利用して、RNA編集用の新しいツールが開発された。哺乳類細胞には、Ad
ar1(2つのアイソフォーム、p110とp150)、Adar2とAdar3(触媒
的に不活性)の3種類のADARタンパク質がある。ADARタンパク質の触媒基質は二
本鎖RNAであり、アデノシン(A)ヌクレオシド塩基から-NH2基を除去し、Aをイ
ノシン(I)に変更することができる。これは、グアノシン(G)として認識され、その
後の細胞の転写および翻訳プロセス中にシチジン(C)とペアリングする。研究者らは、
λNペプチドをヒトAdar1またはAdar2デアミナーゼドメインに融合させてλN
-ADARDDシステムを構築した。このシステムは、BoxBステムループとアンチセ
ンスRNAからなる融合RNAによって誘導されて特定のRNA標的に結合することがで
きる。この方法では、標的Aの塩基に(A-Cミスマッチを導入することで)標的Aから
Iに編集することができる。その結果、AからGのRNA塩基が編集される。RNA編集
の他の方法には、アンチセンスRNAをR/Gモチーフ(ADAR-動員RNAスキャフ
ォールド)に融合して、哺乳類細胞でAdar1またはAdar2タンパク質を過剰発現
させることにより、標的RNAを編集する方法や、dCas13-ADARを使用してR
NAを正確に標的にして編集する方法が含まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開
示内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
示内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
Porteus, M. H. & Carroll, D. Gene targeting using zinc finger nucleases. Nat Biotechnol 23, 967-973 (2005).
Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326, 1509-1512 (2009).
Moscou, M. J. & Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326, 1501 (2009).
Miller, J. C. et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011).
Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).
Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013).
Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013).
Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
Ma, Y. et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nat Methods 13, 1029-1035 (2016).
Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).
Tan, M. H. et al. Dynamic landscape and regulation of RNA editing in mammals. Nature 550, 249-254 (2017).
Nishikura, K. Functions and regulation of RNA editing by ADAR deaminases. Annu Rev Biochem 79, 321-349 (2010).
Bass, B. L. & Weintraub, H. An unwinding activity that covalently modifies its double-stranded RNA substrate. Cell 55, 1089-1098 (1988).
Wong, S. K., Sato, S. & Lazinski, D. W. Substrate recognition by ADAR1 and ADAR2. RNA 7, 846-858 (2001).
Montiel-Gonzalez, M. F., Vallecillo-Viejo, I., Yudowski, G. A. & Rosenthal, J. J. Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by site-directed RNA editing. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 18285-18290 (2013).
Sinnamon, J. R. et al. Site-directed RNA repair of endogenous Mecp2 RNA in neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 114, E9395-E9402 (2017).
Montiel-Gonzalez, M. F., Vallecillo-Viejo, I. C. & Rosenthal, J. J. An efficient system for selectively altering genetic information within mRNAs. Nucleic Acids Res 44, e157 (2016).
Hanswillemenke, A., Kuzdere, T., Vogel, P., Jekely, G. & Stafforst, T. Site-Directed RNA Editing in Vivo Can Be Triggered by the Light-Driven Assembly of an Artificial Riboprotein. J Am Chem Soc 137, 15875-15881 (2015).
Schneider, M. F., Wettengel, J., Hoffmann, P. C. & Stafforst, T. Optimal guideRNAs for re-directing deaminase activity of hADAR1 and hADAR2 in trans. Nucleic Acids Res 42, e87 (2014).
Vogel, P., Hanswillemenke, A. & Stafforst, T. Switching Protein Localization by Site-Directed RNA Editing under Control of Light. ACS synthetic biology 6, 1642-1649 (2017).
Vogel, P., Schneider, M. F., Wettengel, J. & Stafforst, T. Improving site-directed RNA editing in vitro and in cell culture by chemical modification of the guideRNA. Angewandte Chemie 53, 6267-6271 (2014).
Vogel, P. et al. Efficient and precise editing of endogenous transcripts with SNAP-tagged ADARs. Nat Methods 15, 535-538 (2018).
Cox, D. B. T. et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027 (2017).
Fukuda, M. et al. Construction of a guide-RNA for site-directed RNA mutagenesis utilising intracellular A-to-I RNA editing. Scientific reports 7, 41478 (2017).
Wettengel, J., Reautschnig, P., Geisler, S., Kahle, P. J. & Stafforst, T. Harnessing human ADAR2 for RNA repair - Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy. Nucleic Acids Res 45, 2797-2808 (2017).
Heep, M., Mach, P., Reautschnig, P., Wettengel, J. & Stafforst, T. Applying Human ADAR1p110 and ADAR1p150 for Site-Directed RNA Editing-G/C Substitution Stabilizes GuideRNAs against Editing. Genes (Basel) 8 (2017).
Katrekar, D. et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nat Methods 16, 239-242 (2019).
Yin, H., Kauffman, K. J. & Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov 16, 387-399 (2017).
Platt, R. J. et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell 159, 440-455 (2014).
Chew, W. L. et al. A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response. Nat Methods 13, 868-874 (2016).
Teoh, P. J. et al. Aberrant hyperediting of the myeloma transcriptome by ADAR1 confers oncogenicity and is a marker of poor prognosis. Blood 132, 1304-1317 (2018).
Vallecillo-Viejo, I. C., Liscovitch-Brauer, N., Montiel-Gonzalez, M. F., Eisenberg, E. & Rosenthal, J. J. C. Abundant off-target edits from site-directed RNA editing can be reduced by nuclear localization of the editing enzyme. RNA biology 15, 104-114 (2018).
Mays, L. E. & Wilson, J. M. The complex and evolving story of T cell activation to AAV vector-encoded transgene products. Mol Ther 19, 16-27 (2011).
Wagner, D. L. et al. High prevalence of Streptococcus pyogenes Cas9-reactive T cells within the adult human population. Nat Med 25, 242-248 (2019).
Simhadri, V. L. et al. Prevalence of Pre-existing Antibodies to CRISPR-Associated Nuclease Cas9 in the USA Population. Mol Ther Methods Clin Dev 10, 105-112 (2018).
Charlesworth, C. T. et al. Identification of preexisting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans. Nat Med 25, 249-254 (2019).
Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B. & Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med 24, 927-930 (2018).
Ihry, R. J. et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med 24, 939-946 (2018).
Woolf, T. M., Chase, J. M. & Stinchcomb, D. T. Toward the therapeutic editing of mutated RNA sequences. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 8298-8302 (1995).
Zheng, Y., Lorenzo, C. & Beal, P. A. DNA editing in DNA/RNA hybrids by adenosine deaminases that act on RNA. Nucleic Acids Res 45, 3369-3377 (2017).
Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573 (2016).
Daniel, C., Widmark, A., Rigardt, D. & Ohman, M. Editing inducer elements increases A-to-I editing efficiency in the mammalian transcriptome. Genome Biol 18, 195 (2017).
Chen, C. X. et al. A third member of the RNA-specific adenosine deaminase gene family, ADAR3, contains both single- and double-stranded RNA binding domains. RNA 6, 755-767 (2000).
Savva, Y. A., Rieder, L. E. & Reenan, R. A. The ADAR protein family. Genome Biol 13, 252 (2012).
Nishikura, K. A-to-I editing of coding and non-coding RNAs by ADARs. Nat Rev Mol Cell Biol 17, 83-96 (2016).
Floquet, C., Deforges, J., Rousset, J. P. & Bidou, L. Rescue of non-sense mutated p53 tumor suppressor gene by aminoglycosides. Nucleic Acids Res 39, 3350-3362 (2011).
Kern, S. E. et al. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science 252, 1708-1711 (1991).
Doubrovin, M. et al. Imaging transcriptional regulation of p53-dependent genes with positron emission tomography in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9300-9305 (2001).
Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res 44, D862-868 (2016).
Ou, L. et al. ZFN-Mediated In Vivo Genome Editing Corrects Murine Hurler Syndrome. Mol Ther 27, 178-187 (2019).
Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811 (1998).
Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science (2019).
Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science (2019).
Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I. & Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nat Biotechnol 37, 430-435 (2019).
Levanon, E. Y. et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nat Biotechnol 22, 1001-1005 (2004).
Merkle, T. et al. Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides. Nat Biotechnol 37, 133-138 (2019).
Wagner, R. W. et al. Double-stranded RNA unwinding and modifying activity is detected ubiquitously in primary tissues and cell lines. Mol Cell Biol 10, 5586-5590 (1990).
Patterson, J. B. & Samuel, C. E. Expression and regulation by interferon of a double-stranded-RNA-specific adenosine deaminase from human cells: evidence for two forms of the deaminase. Mol Cell Biol 15, 5376-5388 (1995).
Gibson, D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods 6, 343-345 (2009).
Zhou, Y., Zhang, H. & Wei, W. Simultaneous generation of multi-gene knockouts in human cells. FEBS Lett 590, 4343-4353 (2016).
Dobin, A. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15-21 (2013).
Van der Auwera, G. A. et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics 43, 11 10 11-33 (2013).
Wang, K., Li, M. & Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res 38, e164 (2010).
Genomes Project, C. et al. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature 491, 56-65 (2012).
Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T. & Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nat Protoc 11, 1650-1667 (2016).
核酸編集は、生物学的研究と治療法の開発に大きな可能性を秘めている。DNAまたは
RNA編集のための現在のツールは、外因性タンパク質を生物に導入することに依存して
いる。これは、可能な異常なエフェクター活性、送達制限、および免疫原性により、潜在
的なリスクまたは技術的障壁の影響を受ける可能性がある。いくつかの局面において、本
出願は、標的RNA編集のため内因性ADAR(RNAに作用するアデノシンデアミナー
ゼ)タンパク質を活用するために短いRNAを使用するプログラム可能な方法を提供する
。いくつかの局面において、本出願は、標的転写物に部分的に相補的であり、天然のAD
AR1またはADAR2を動員して、標的RNAの特定の部位でアデノシンをイノシンに
変化させる工学操作されたRNAを提供する。本明細書に記載の方法は、まとめて「LE
APER」(内因性ADARを利用したRNAのプログラム可能な編集)と呼ばれ、AD
AR動員RNAは、「dRNA」または「arRNA」とも呼ばれる。
RNA編集のための現在のツールは、外因性タンパク質を生物に導入することに依存して
いる。これは、可能な異常なエフェクター活性、送達制限、および免疫原性により、潜在
的なリスクまたは技術的障壁の影響を受ける可能性がある。いくつかの局面において、本
出願は、標的RNA編集のため内因性ADAR(RNAに作用するアデノシンデアミナー
ゼ)タンパク質を活用するために短いRNAを使用するプログラム可能な方法を提供する
。いくつかの局面において、本出願は、標的転写物に部分的に相補的であり、天然のAD
AR1またはADAR2を動員して、標的RNAの特定の部位でアデノシンをイノシンに
変化させる工学操作されたRNAを提供する。本明細書に記載の方法は、まとめて「LE
APER」(内因性ADARを利用したRNAのプログラム可能な編集)と呼ばれ、AD
AR動員RNAは、「dRNA」または「arRNA」とも呼ばれる。
一局面では、本出願は、デアミナーゼ動員RNA(dRNA)またはデアミナーゼ動員
RNAをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における標的RN
Aを編集する方法を提供し、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的R
NA配列を含み、前記dRNAは、標的RNA中の標的アデノシン(A)を脱アミノ化す
るようにRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる
。特定の実施形態では、前記宿主細胞が真核細胞である。一部の実施形態では、前記宿主
細胞が哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞がヒト細胞である。一部
の実施形態では、前記宿主細胞がマウス細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞
が原核細胞である。
RNAをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における標的RN
Aを編集する方法を提供し、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的R
NA配列を含み、前記dRNAは、標的RNA中の標的アデノシン(A)を脱アミノ化す
るようにRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる
。特定の実施形態では、前記宿主細胞が真核細胞である。一部の実施形態では、前記宿主
細胞が哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞がヒト細胞である。一部
の実施形態では、前記宿主細胞がマウス細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞
が原核細胞である。
特定の実施形態では、ADARは、宿主細胞に自然にまたは内因的に存在し、例えば、
真核細胞に自然にまたは内因的に存在する。一部の実施形態では、ADARは、宿主細胞
によって内因的に発現される。特定の実施形態では、ADARは、宿主細胞に対して外因
的である。一部の実施形態では、ADARは、核酸(例えば、DNAまたはRNA)によ
ってコードされる。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADARをコード
する構築体を宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、この方法は、宿主細
胞にタンパク質を導入することを含まない。特定の実施形態では、前記ADARは、AD
AR1および/またはADAR2である。一部の実施形態では、ADARは、hADAR
1、hADAR2、マウスADAR1およびマウスADAR2からなる群から選ばれる1
つ以上のADARである。
真核細胞に自然にまたは内因的に存在する。一部の実施形態では、ADARは、宿主細胞
によって内因的に発現される。特定の実施形態では、ADARは、宿主細胞に対して外因
的である。一部の実施形態では、ADARは、核酸(例えば、DNAまたはRNA)によ
ってコードされる。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADARをコード
する構築体を宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、この方法は、宿主細
胞にタンパク質を導入することを含まない。特定の実施形態では、前記ADARは、AD
AR1および/またはADAR2である。一部の実施形態では、ADARは、hADAR
1、hADAR2、マウスADAR1およびマウスADAR2からなる群から選ばれる1
つ以上のADARである。
特定の実施形態では、Casは前記dRNAを認識しない。一部の実施形態では、前記
dRNAは、CRISPR/Casシステムに使用されるcrRNA、tracrRNA
またはgRNAを含まない。一部の実施形態では、この方法は、CasまたはCas融合
タンパク質を宿主細胞に導入することを含まない。
dRNAは、CRISPR/Casシステムに使用されるcrRNA、tracrRNA
またはgRNAを含まない。一部の実施形態では、この方法は、CasまたはCas融合
タンパク質を宿主細胞に導入することを含まない。
特定の実施形態では、前記標的RNA中の標的Aの脱アミノ化作用は、前記標的RNA
中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的スプライシ
ングを引き起こす。一部の実施形態では、標的RNAはタンパク質をコードし、前記標的
RNA中の標的Aの脱アミノ化作用は、前記タンパク質の点突然変異、切断、伸長および
/またはミスフォールディングを引き起こす。一部の実施形態では、前記標的RNA中の
標的Aの脱アミノ化作用は、標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なス
プライシングまたは可変的スプライシングの回復を引き起こす。一部の実施形態では、前
記標的RNAが、切断された、伸長した、突然変異した、またはミスフォールディングさ
れたタンパク質をコードし、標的RNA中の標的A(アデノシン)の脱アミノ化作用は、
標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的ス
プライシングの回復によって、機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及
び/または野生型タンパク質を引き起こす。一部の実施形態では、標的RNAは調節性R
NAであり、標的Aの脱アミノ化作用により、標的RNAによって調節される下流分子の
発現が変化する。特定の実施形態では、この方法は、内因性アデノシンデアミナーゼを利
用して標的RNA上で編集し、標的RNAによってコードされるタンパク質の点突然変異
及び/またはミスフォールディング、及び/または標的RNAにおいて早期終止コドン、
異常なスプライシング部位または可変的スプライシング部位を生成する。
中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的スプライシ
ングを引き起こす。一部の実施形態では、標的RNAはタンパク質をコードし、前記標的
RNA中の標的Aの脱アミノ化作用は、前記タンパク質の点突然変異、切断、伸長および
/またはミスフォールディングを引き起こす。一部の実施形態では、前記標的RNA中の
標的Aの脱アミノ化作用は、標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なス
プライシングまたは可変的スプライシングの回復を引き起こす。一部の実施形態では、前
記標的RNAが、切断された、伸長した、突然変異した、またはミスフォールディングさ
れたタンパク質をコードし、標的RNA中の標的A(アデノシン)の脱アミノ化作用は、
標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的ス
プライシングの回復によって、機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及
び/または野生型タンパク質を引き起こす。一部の実施形態では、標的RNAは調節性R
NAであり、標的Aの脱アミノ化作用により、標的RNAによって調節される下流分子の
発現が変化する。特定の実施形態では、この方法は、内因性アデノシンデアミナーゼを利
用して標的RNA上で編集し、標的RNAによってコードされるタンパク質の点突然変異
及び/またはミスフォールディング、及び/または標的RNAにおいて早期終止コドン、
異常なスプライシング部位または可変的スプライシング部位を生成する。
特定の実施形態では、複数のdRNAまたは前記複数のdRNAをコードする構築体を
宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における複数の標的RNAを編集するための方
法が提供され、前記複数のデアミナーゼ動員RNAのそれぞれが、複数の標的RNA中の
対応する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAが、対応
する標的RNA中の標的アデノシン(A)を脱アミノ化するようにRNAに作用するアデ
ノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる。
宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における複数の標的RNAを編集するための方
法が提供され、前記複数のデアミナーゼ動員RNAのそれぞれが、複数の標的RNA中の
対応する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAが、対応
する標的RNA中の標的アデノシン(A)を脱アミノ化するようにRNAに作用するアデ
ノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる。
一部の実施形態では、上記のRNA編集方法のいずれか1つによって生成された編集さ
れたRNAを有する、編集されたRNAまたは宿主細胞が提供される。
れたRNAを有する、編集されたRNAまたは宿主細胞が提供される。
一局面において、本願は、上記のRNA編集方法のいずれか1つに従って、個体の細胞
内の疾患または病症に関連する標的RNAを編集することを含む、個体の疾患または病症
を治療または予防するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、エクス
ビボ(Ex vivo)で細胞内の標的RNAを編集することを含む。一部の実施形態では、こ
の方法は、編集された細胞を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、この方法
は、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体に投与することを含む。
一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体(例えば
、ウイルスベクター)を細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態では、この方
法は、ADARまたはADARをコードする構築体(例えば、ウイルスベクター)を個体
に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾
患である。一部の実施形態において、前記疾患または病症は、1つ以上の後天性遺伝子突
然変異(例えば、薬剤耐性)に関連する。
内の疾患または病症に関連する標的RNAを編集することを含む、個体の疾患または病症
を治療または予防するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、エクス
ビボ(Ex vivo)で細胞内の標的RNAを編集することを含む。一部の実施形態では、こ
の方法は、編集された細胞を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、この方法
は、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体に投与することを含む。
一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体(例えば
、ウイルスベクター)を細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態では、この方
法は、ADARまたはADARをコードする構築体(例えば、ウイルスベクター)を個体
に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾
患である。一部の実施形態において、前記疾患または病症は、1つ以上の後天性遺伝子突
然変異(例えば、薬剤耐性)に関連する。
本願の一局面は、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含む、RNAに
作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することによって標的RNA中の標
的アデノシンを脱アミノ化するためのdRNAを提供する。一部の実施形態では、dRN
Aは、配列番号25~44、142~205、341~342のいずれか1つの核酸配列
を含む。
作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することによって標的RNA中の標
的アデノシンを脱アミノ化するためのdRNAを提供する。一部の実施形態では、dRN
Aは、配列番号25~44、142~205、341~342のいずれか1つの核酸配列
を含む。
本明細書に記載の方法またはdRNAのいずれか1つによる一部の実施形態では、前記
dRNAは、標的RNAで編集される標的アデノシンと真向かいのシチジン(C)、アデ
ノシン(A)、またはウリジン(U)を含むRNA配列を含む。特定の実施形態では、前
記RNA配列は、標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグア
ノシンをさらに含む。特定の実施形態では、標的RNA中の標的Aの5’に最も近い隣接
物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gで
あり、標的RNAにおける標的Aの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選
ばれるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである。特定の実施形態では、標的
RNAにおける標的Aは、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、
CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからな
る群より選ばれる3塩基モチーフに位置する。特定の実施形態では、前記3塩基モチーフ
がUAGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのUと真向かいのA、前記標的A
と真向かいのC、及び3塩基モチーフのGと真向かいのC、G、またはUを含む。特定の
実施形態では、前記3塩基モチーフは、標的RNA中のUAGであり、前記dRNAは、
標的RNAのUAGに対向するACC、ACG、またはACUを含む。
dRNAは、標的RNAで編集される標的アデノシンと真向かいのシチジン(C)、アデ
ノシン(A)、またはウリジン(U)を含むRNA配列を含む。特定の実施形態では、前
記RNA配列は、標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグア
ノシンをさらに含む。特定の実施形態では、標的RNA中の標的Aの5’に最も近い隣接
物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gで
あり、標的RNAにおける標的Aの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選
ばれるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである。特定の実施形態では、標的
RNAにおける標的Aは、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、
CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからな
る群より選ばれる3塩基モチーフに位置する。特定の実施形態では、前記3塩基モチーフ
がUAGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのUと真向かいのA、前記標的A
と真向かいのC、及び3塩基モチーフのGと真向かいのC、G、またはUを含む。特定の
実施形態では、前記3塩基モチーフは、標的RNA中のUAGであり、前記dRNAは、
標的RNAのUAGに対向するACC、ACG、またはACUを含む。
本明細書に記載の方法またはdRNAのいずれか1つによる一部の実施形態では、前記
デアミナーゼ動員RNAは、40、45、50、55、60、65、70、75または8
0を超えるヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、デアミナーゼ動員RNAは、40
~260、45~250、50~240、60~230、65~220、70~210、
70~200、70~190、70~180、70~170、70~160、70~15
0、70~140、70~130、70~120、70~110、70~100、70~
90、70~80、75~200、80~190、85~180、90~170、95~
160、100~150または105~140ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施
形態では、標的RNAは、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャーRNA、リボソー
ムRNA、転移RNA、長い非コードRNA、および小さいRNA(例えば、miRNA
)からなる群から選択されるRNAである。
デアミナーゼ動員RNAは、40、45、50、55、60、65、70、75または8
0を超えるヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、デアミナーゼ動員RNAは、40
~260、45~250、50~240、60~230、65~220、70~210、
70~200、70~190、70~180、70~170、70~160、70~15
0、70~140、70~130、70~120、70~110、70~100、70~
90、70~80、75~200、80~190、85~180、90~170、95~
160、100~150または105~140ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施
形態では、標的RNAは、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャーRNA、リボソー
ムRNA、転移RNA、長い非コードRNA、および小さいRNA(例えば、miRNA
)からなる群から選択されるRNAである。
本明細書に記載の方法またはdRNAのいずれか1つによる一部の実施形態では、前記
dRNAは一本鎖RNAである。一部の実施形態では、前記相補的RNA配列は一本鎖で
あり、ここで、前記dRNAは、1つ以上の二本鎖領域をさらに含む。一部の実施形態で
は、前記dRNAは、2'-O-メチル修飾および/またはホスホロチオエート修飾など
の1つ以上の修飾を含む。
dRNAは一本鎖RNAである。一部の実施形態では、前記相補的RNA配列は一本鎖で
あり、ここで、前記dRNAは、1つ以上の二本鎖領域をさらに含む。一部の実施形態で
は、前記dRNAは、2'-O-メチル修飾および/またはホスホロチオエート修飾など
の1つ以上の修飾を含む。
一部の実施形態において、上記のdRNAのいずれか1つをコードする構築体(例えば
、ウイルスベクターまたはプラスミド)が提供される。一部の実施形態において、前記構
築体は、dRNAをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一部の
実施形態では、前記構築体はDNA構築体である。一部の実施形態において、前記構築体
は、AAV8などのAAVなどのウイルスベクターである。
、ウイルスベクターまたはプラスミド)が提供される。一部の実施形態において、前記構
築体は、dRNAをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一部の
実施形態では、前記構築体はDNA構築体である。一部の実施形態において、前記構築体
は、AAV8などのAAVなどのウイルスベクターである。
一部の実施形態において、上記のdRNAのいずれか1つによる複数のdRNA、また
は上記の構築体のいずれか1つによる複数の構築体を含むライブラリーが提供される。
は上記の構築体のいずれか1つによる複数の構築体を含むライブラリーが提供される。
また、本明細書に記載のdRNAのいずれか1つ、本明細書に記載の構築体のいずれか
1つ、または本明細書に記載のライブラリーのいずれか1つを含む、組成物、宿主細胞、
キット、及び製品が提供される。
1つ、または本明細書に記載のライブラリーのいずれか1つを含む、組成物、宿主細胞、
キット、及び製品が提供される。
本出願は、宿主細胞における標的RNAを編集するために、RNA編集法(本明細書で
は「LEAPER」法と呼ばれる)および特別に設計されたRNA(本明細書ではデアミ
ナーゼ動員RNA(「dRNA」)またはADAR-動員RNA(「arRNA」)と呼
ばれる)を提供する。理論や仮説に縛られることなく、前記dRNAはその標的RNAに
配列特異的にハイブリダイズして二本鎖RNAを形成し、RNAに作用するアデノシンデ
アミナーゼ(Adenosine Deaminase Acting on RNA、
ADAR)を動員して、標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化する。したがって、
一部の実施形態では、宿主細胞におけるADARタンパク質の異所性発現または過剰発現
なしに、効率的なRNA編集を達成することができる。本発明はさらに、前記RNA編集
法を使用して個体の疾患または病症を治療または予防するための方法および組成物を提供
する。
は「LEAPER」法と呼ばれる)および特別に設計されたRNA(本明細書ではデアミ
ナーゼ動員RNA(「dRNA」)またはADAR-動員RNA(「arRNA」)と呼
ばれる)を提供する。理論や仮説に縛られることなく、前記dRNAはその標的RNAに
配列特異的にハイブリダイズして二本鎖RNAを形成し、RNAに作用するアデノシンデ
アミナーゼ(Adenosine Deaminase Acting on RNA、
ADAR)を動員して、標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化する。したがって、
一部の実施形態では、宿主細胞におけるADARタンパク質の異所性発現または過剰発現
なしに、効率的なRNA編集を達成することができる。本発明はさらに、前記RNA編集
法を使用して個体の疾患または病症を治療または予防するための方法および組成物を提供
する。
本明細書に記載のRNA編集方法は、ADARと、ガイド核酸に特異的に結合するタン
パク質(Casなど)とを含む融合タンパク質を使用しない。本明細書に記載のデアミナ
ーゼ動員RNA(deaminase-recruiting RNA(dRNA))は
、CRISPR/Casシステムで使用されるcrRNA、tracrRNAまたはgR
NAを含まない。一部の実施形態では、dRNAは、ADAR動員ドメイン、または化学
修飾を含まない。一部の実施形態において、dRNAは、プラスミドまたはウイルスベク
ターから発現され得るか、またはオリゴヌクレオチドとして合成され得、これは、望まし
い編集効率を達成し得る。
パク質(Casなど)とを含む融合タンパク質を使用しない。本明細書に記載のデアミナ
ーゼ動員RNA(deaminase-recruiting RNA(dRNA))は
、CRISPR/Casシステムで使用されるcrRNA、tracrRNAまたはgR
NAを含まない。一部の実施形態では、dRNAは、ADAR動員ドメイン、または化学
修飾を含まない。一部の実施形態において、dRNAは、プラスミドまたはウイルスベク
ターから発現され得るか、またはオリゴヌクレオチドとして合成され得、これは、望まし
い編集効率を達成し得る。
ここで説明するLEAPER法は、標的となる転写物とまれなグローバルオフターゲッ
トに対して管理可能なオフターゲット率を持っている。発明者らは、LEAPER法を使
用して、特定の癌関連の点突然変異を修復することにより、p53機能を回復させた。本
明細書に記載のLEAPER法は、複数のヒト初代細胞を含む広範囲の細胞型にも適用で
き、自然免疫応答を誘発することなく、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけ
るα-L-イズロニダーゼ触媒活性を回復するために使用できる。一部の実施形態では、
LEAPER法は、単一分子(すなわち、dRNA)システムを含む。本明細書でいうL
EAPER法は、正確で効率的なRNA編集を可能にし、基礎研究と治療法に変革の可能
性をもたらす。
トに対して管理可能なオフターゲット率を持っている。発明者らは、LEAPER法を使
用して、特定の癌関連の点突然変異を修復することにより、p53機能を回復させた。本
明細書に記載のLEAPER法は、複数のヒト初代細胞を含む広範囲の細胞型にも適用で
き、自然免疫応答を誘発することなく、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけ
るα-L-イズロニダーゼ触媒活性を回復するために使用できる。一部の実施形態では、
LEAPER法は、単一分子(すなわち、dRNA)システムを含む。本明細書でいうL
EAPER法は、正確で効率的なRNA編集を可能にし、基礎研究と治療法に変革の可能
性をもたらす。
定義
本発明を、特定の実施形態を用いて特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それ
に限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項内の参照記号は、範囲を
制限するものと解釈されるべきではない。「含む」という用語が本明細書および請求の範
囲で使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。単数名詞に言及する
時に、例えば、「一つ」または「一種」、「当該」など、不定冠詞または定冠詞が使用さ
れる場合、特に明記されていない限り、その名詞の複数形も含まれる。本明細書における
ヌクレオチドの数値範囲に対する説明については、その間に介在する各数値が明確に考慮
されている。例えば、40~260ヌクレオチドの範囲については、40ヌクレオチドお
よび260ヌクレオチドの数の他に、40~260ヌクレオチドの間の任意の整数のヌク
レオチドも考慮される。
本発明を、特定の実施形態を用いて特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それ
に限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項内の参照記号は、範囲を
制限するものと解釈されるべきではない。「含む」という用語が本明細書および請求の範
囲で使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。単数名詞に言及する
時に、例えば、「一つ」または「一種」、「当該」など、不定冠詞または定冠詞が使用さ
れる場合、特に明記されていない限り、その名詞の複数形も含まれる。本明細書における
ヌクレオチドの数値範囲に対する説明については、その間に介在する各数値が明確に考慮
されている。例えば、40~260ヌクレオチドの範囲については、40ヌクレオチドお
よび260ヌクレオチドの数の他に、40~260ヌクレオチドの間の任意の整数のヌク
レオチドも考慮される。
以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためにのみ提供されている。本明細書
で具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者に
とっての意味と同じ意味を有する。本分野の定義及び用語について、当業者は、特に、S
ambrook et al.,Molecular Cloning:A Labor
atory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbour
Press,Plainsview,New York(1989)、Ausubel
et al.,Current Protocols in Molecular B
iology(Supplement 47),John Wiley&Sons,Ne
w York(1999)を参照できる。本明細書で提供される定義は、当業者によって
理解される範囲よりも狭い範囲と解釈されるべきではない。
で具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者に
とっての意味と同じ意味を有する。本分野の定義及び用語について、当業者は、特に、S
ambrook et al.,Molecular Cloning:A Labor
atory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbour
Press,Plainsview,New York(1989)、Ausubel
et al.,Current Protocols in Molecular B
iology(Supplement 47),John Wiley&Sons,Ne
w York(1999)を参照できる。本明細書で提供される定義は、当業者によって
理解される範囲よりも狭い範囲と解釈されるべきではない。
「デアミナーゼ動員RNA」、「dRNA」、「ADAR動員RNA」および「arR
NA」という用語は、本明細書では置き換えて使用でき、RNA中の標的アデノシンを脱
アミノ化するためにADARを動員することができる工学操作されたRNAを指す。
NA」という用語は、本明細書では置き換えて使用でき、RNA中の標的アデノシンを脱
アミノ化するためにADARを動員することができる工学操作されたRNAを指す。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」という用語は置き換えて
使用できる。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、
またはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。
使用できる。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、
またはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。
本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウ
ラシル」および「ヒポキサンチン」という用語は、核酸塩基それ自体を指す。「アデノシ
ン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」
という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖部分に連結された核酸塩基を指す。「
ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボースに結合した核酸塩基を指
す。「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基-リボシル-リン酸または核酸塩
基-デオキシリボシル-リン酸を指す。アデノシンとアデニン(略して「A」)、グアノシ
ンとグアニン(略して「G」)、シトシンとシチジン(略して「C」)、ウラシルとウリ
ジン(略して、「U」)、チミンおよびチミジン(略して「T」)、イノシンおよびヒポ
キサンチン(略して「I」)は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを
指し、置き換えて使用されることができる。文脈が明らかに異なって要求しない限り、核
酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は交換可能に使用されることがある
。
ラシル」および「ヒポキサンチン」という用語は、核酸塩基それ自体を指す。「アデノシ
ン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」
という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖部分に連結された核酸塩基を指す。「
ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボースに結合した核酸塩基を指
す。「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基-リボシル-リン酸または核酸塩
基-デオキシリボシル-リン酸を指す。アデノシンとアデニン(略して「A」)、グアノシ
ンとグアニン(略して「G」)、シトシンとシチジン(略して「C」)、ウラシルとウリ
ジン(略して、「U」)、チミンおよびチミジン(略して「T」)、イノシンおよびヒポ
キサンチン(略して「I」)は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを
指し、置き換えて使用されることができる。文脈が明らかに異なって要求しない限り、核
酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は交換可能に使用されることがある
。
本出願の文脈において、「標的RNA」は、デアミナーゼ動員RNA配列が完全な相補
性または実質的な相補性を有するように設計され、標的配列とdRNAとの間のハイブリ
ダイゼーションが、標的アデノシンを含む二本鎖RNA(dsRNA)領域を形成するR
NA配列を指し、それはRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員し
、この酵素は標的アデノシンを脱アミノ化する。一部の実施形態において、ADARは、
真核細胞(好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞)などの宿主細胞に自
然に存在する。一部の実施形態において、前記ADARは、宿主細胞に導入される。
性または実質的な相補性を有するように設計され、標的配列とdRNAとの間のハイブリ
ダイゼーションが、標的アデノシンを含む二本鎖RNA(dsRNA)領域を形成するR
NA配列を指し、それはRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員し
、この酵素は標的アデノシンを脱アミノ化する。一部の実施形態において、ADARは、
真核細胞(好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞)などの宿主細胞に自
然に存在する。一部の実施形態において、前記ADARは、宿主細胞に導入される。
本明細書で使用される場合、「相補性」は、従来のワトソン-クリック(Watson
-Crick)塩基対形成によって別の核酸と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パ
ーセント相補性は、第2の核酸と水素結合(すなわち、ワトソン-クリック(Watso
n-Crick)塩基対形成)を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテー
ジを示す(例えば、10のうち約5、6、7、8、9、10がそれぞれ約50%、60%
、70%、80%、90%、及び100%相補的である)。「完全に相補的」とは、核酸
配列のすべての連続する残基が、第2の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結
合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、約40、
50、60、70、80、100、150、200、250またはそれ以上のヌクレオチ
ドの領域にわたって、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、
97%、98%、99%、または100%のいずれか1つである相補性の程度、またはス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする2つの核酸を指す。
-Crick)塩基対形成によって別の核酸と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パ
ーセント相補性は、第2の核酸と水素結合(すなわち、ワトソン-クリック(Watso
n-Crick)塩基対形成)を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテー
ジを示す(例えば、10のうち約5、6、7、8、9、10がそれぞれ約50%、60%
、70%、80%、90%、及び100%相補的である)。「完全に相補的」とは、核酸
配列のすべての連続する残基が、第2の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結
合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、約40、
50、60、70、80、100、150、200、250またはそれ以上のヌクレオチ
ドの領域にわたって、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、
97%、98%、99%、または100%のいずれか1つである相補性の程度、またはス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする2つの核酸を指す。
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」と
は、標的配列に対して相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、実質的に
非標的配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に配列に
依存し、多くの要因によって異なる。一般に、配列が長いほど、その配列がその標的配列
に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例
は、Tijssen(1993),Laboratory Techniques In
Biochemistry And Molecular Biology- Hyb
ridization With Nucleic Acid Probes Part
I,Second Chapter “Principles of princip
les of hybridization and the strategy of
nucleic acid probe assay”,Elsevier,N,Yに
詳細に記載されている。
は、標的配列に対して相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、実質的に
非標的配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に配列に
依存し、多くの要因によって異なる。一般に、配列が長いほど、その配列がその標的配列
に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例
は、Tijssen(1993),Laboratory Techniques In
Biochemistry And Molecular Biology- Hyb
ridization With Nucleic Acid Probes Part
I,Second Chapter “Principles of princip
les of hybridization and the strategy of
nucleic acid probe assay”,Elsevier,N,Yに
詳細に記載されている。
「ハイブリダイゼーション」とは、1つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオ
チド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。前記水
素結合は、ワトソンクリック(Watson-Crick)塩基対形成、フーグスティー
ン(Hoogstein)結合、またはその他の配列特異的な方法で発生できる。所定の
配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補配列」と呼ばれる。
チド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。前記水
素結合は、ワトソンクリック(Watson-Crick)塩基対形成、フーグスティー
ン(Hoogstein)結合、またはその他の配列特異的な方法で発生できる。所定の
配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補配列」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語
は置き換えて使用され、これらすべての呼称には後代が含まれる。意図的または意図しな
い突然変異のため、すべての後代のDNA内容が完全に同じであるとは限らないことを理
解されたい。本発明は、元の細胞と同じ機能または生物学的活性を有する変異体の後代を
含む。
は置き換えて使用され、これらすべての呼称には後代が含まれる。意図的または意図しな
い突然変異のため、すべての後代のDNA内容が完全に同じであるとは限らないことを理
解されたい。本発明は、元の細胞と同じ機能または生物学的活性を有する変異体の後代を
含む。
RNA編集の方法
一部の実施形態において、本出願は、デアミナーゼ動員RNA(dRNA)またはdR
NAをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞
)における標的RNAを編集する方法を提供し、前記dRNAは、標的RNAにハイブリ
ダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAは、標的RNA中の標的アデノシン(
A)を脱アミノ化するようにRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動
員することができる。
一部の実施形態において、本出願は、デアミナーゼ動員RNA(dRNA)またはdR
NAをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞
)における標的RNAを編集する方法を提供し、前記dRNAは、標的RNAにハイブリ
ダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAは、標的RNA中の標的アデノシン(
A)を脱アミノ化するようにRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動
員することができる。
一部の実施形態において、本出願は、dRNAまたはdRNAをコードする構築体を宿
主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における標的RNAを編集
する方法を提供し、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列
を含み、前記dRNAは、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化するように宿主細胞の内因
的に発現されたADARを動員する。一部の実施形態では、この方法は、任意のタンパク
質またはタンパク質をコードする構築体(例えば、Cas、ADARまたはADARとC
asの融合タンパク質)を宿主細胞に導入することを含まない。
主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における標的RNAを編集
する方法を提供し、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列
を含み、前記dRNAは、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化するように宿主細胞の内因
的に発現されたADARを動員する。一部の実施形態では、この方法は、任意のタンパク
質またはタンパク質をコードする構築体(例えば、Cas、ADARまたはADARとC
asの融合タンパク質)を宿主細胞に導入することを含まない。
一部の実施形態において、(a)dRNAまたはdRNAをコードする構築体、および
(b)ADARまたはADARをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿
主細胞(例えば、真核細胞)における標的RNAを編集するための方法が提供され、ここ
で、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記d
RNAは、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化するようにADARを動員する。一部の実
施形態において、前記ADARは、宿主細胞の内因的にコードされたADARであり、前
記ADARの導入は、宿主細胞においてADARを過剰発現することを含む。一部の実施
形態において、前記ADARは、宿主細胞に対して外因性である。一部の実施形態におい
て、前記ADARをコードする構築体は、プラスミドなどのベクター、またはウイルスベ
クター(例えば、レンチウイルスベクター)である。
(b)ADARまたはADARをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿
主細胞(例えば、真核細胞)における標的RNAを編集するための方法が提供され、ここ
で、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記d
RNAは、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化するようにADARを動員する。一部の実
施形態において、前記ADARは、宿主細胞の内因的にコードされたADARであり、前
記ADARの導入は、宿主細胞においてADARを過剰発現することを含む。一部の実施
形態において、前記ADARは、宿主細胞に対して外因性である。一部の実施形態におい
て、前記ADARをコードする構築体は、プラスミドなどのベクター、またはウイルスベ
クター(例えば、レンチウイルスベクター)である。
一部の実施形態において、複数のdRNAまたは複数のdRNAをコードする構築体を
宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における複数(例えば、
少なくとも約2、3、4、5、10、20、50、100以上)の標的RNAを編集する
ための方法が提供され、ここで、各dRNAは、前記複数の標的RNA中の対応する標的
RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAは、対応する標的RN
Aの標的Aを脱アミノ化するようにADARを動員することができる。
宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における複数(例えば、
少なくとも約2、3、4、5、10、20、50、100以上)の標的RNAを編集する
ための方法が提供され、ここで、各dRNAは、前記複数の標的RNA中の対応する標的
RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAは、対応する標的RN
Aの標的Aを脱アミノ化するようにADARを動員することができる。
一部の実施形態において、複数のdRNAまたは複数のdRNAをコードする構築体を
宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における複数(例えば、
少なくとも約2、3、4、5、10、20、50、100以上)の標的RNAを編集する
ための方法が提供され、ここで、各dRNAは、前記複数の標的RNA中の対応する標的
RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAは、対応する標的RN
Aの標的Aを脱アミノ化するように内因的に発現されるADARを動員する。
宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における複数(例えば、
少なくとも約2、3、4、5、10、20、50、100以上)の標的RNAを編集する
ための方法が提供され、ここで、各dRNAは、前記複数の標的RNA中の対応する標的
RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAは、対応する標的RN
Aの標的Aを脱アミノ化するように内因的に発現されるADARを動員する。
一部の実施形態において、(a)複数のdRNAまたは複数のdRNAをコードする構
築体、および(b)ADARまたはADARをコードする構築体を宿主細胞に導入するこ
とを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における複数(例えば、少なくとも約2、3、
4、5、10、20、50、100、1000以上)の標的RNAを編集するための方法
が提供され、ここで、各dRNAは、前記複数の標的RNA中の対応する標的RNAにハ
イブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAは、対応する標的RNA中の標的
Aを脱アミノ化するようにADARを動員する。
築体、および(b)ADARまたはADARをコードする構築体を宿主細胞に導入するこ
とを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)における複数(例えば、少なくとも約2、3、
4、5、10、20、50、100、1000以上)の標的RNAを編集するための方法
が提供され、ここで、各dRNAは、前記複数の標的RNA中の対応する標的RNAにハ
イブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRNAは、対応する標的RNA中の標的
Aを脱アミノ化するようにADARを動員する。
一態様では、本出願は、複数のデアミナーゼ動員RNA、デアミナーゼ動員RNAをコ
ードする1つ以上の構築体、または本明細書に記載のライブラリーを宿主細胞に導入する
ことにより、宿主細胞内の複数のRNAを編集する方法を提供する。
ードする1つ以上の構築体、または本明細書に記載のライブラリーを宿主細胞に導入する
ことにより、宿主細胞内の複数のRNAを編集する方法を提供する。
特定の実施形態において、標的RNAを編集するための方法は、複数のデアミナーゼ動
員RNAまたは複数のデアミナーゼ動員RNAを含む1つ以上の構築体を宿主細胞に導入
して、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員して(1つ以上の標
的RNA中の1つ以上の標的アデノシンに対する)脱アミノ化する反応を行うことを含み
、各デアミナーゼ動員RNAは、対応する標的RNAに相補的なRNA配列を含む。
員RNAまたは複数のデアミナーゼ動員RNAを含む1つ以上の構築体を宿主細胞に導入
して、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員して(1つ以上の標
的RNA中の1つ以上の標的アデノシンに対する)脱アミノ化する反応を行うことを含み
、各デアミナーゼ動員RNAは、対応する標的RNAに相補的なRNA配列を含む。
一態様では、本出願は、dRNAまたはdRNAをコードする構築体を宿主細胞に導入
することを含む、標的RNAおよび/または標的RNAによってコードされるタンパク質
の1つ以上の修飾を宿主細胞(例えば、真核細胞)において生成するための方法を提供し
、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記1つ以上
の修飾は、標的RNAによってコードされるタンパク質の点突然変異、標的RNAによっ
てコードされるタンパク質のミスフォールディング、標的RNA中の早期終止コドン、標
的RNA中の異常なスプライシング部位、及び標的RNA中の可変的スプライシング部位
からなる群より選ばれる。
することを含む、標的RNAおよび/または標的RNAによってコードされるタンパク質
の1つ以上の修飾を宿主細胞(例えば、真核細胞)において生成するための方法を提供し
、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記1つ以上
の修飾は、標的RNAによってコードされるタンパク質の点突然変異、標的RNAによっ
てコードされるタンパク質のミスフォールディング、標的RNA中の早期終止コドン、標
的RNA中の異常なスプライシング部位、及び標的RNA中の可変的スプライシング部位
からなる群より選ばれる。
一部の実施形態において、本出願は、dRNAまたはdRNAをコードする構築体を宿
主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)において、標的RNAまた
は標的RNAによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復するための方法を
提供し、ここで、dRNAが標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、
標的RNAが、標的RNA中の早期終止コドン、異常なスプライス部位または可変的スプ
ライス部位、若しくはタンパク質のミスフォールディングをもたらすGからAへの突然変
異を有し、dRNAがADARを動員してA変異を編集し、それによって標的RNAまた
は標的RNAによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復させる。
主細胞に導入することを含む、宿主細胞(例えば、真核細胞)において、標的RNAまた
は標的RNAによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復するための方法を
提供し、ここで、dRNAが標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、
標的RNAが、標的RNA中の早期終止コドン、異常なスプライス部位または可変的スプ
ライス部位、若しくはタンパク質のミスフォールディングをもたらすGからAへの突然変
異を有し、dRNAがADARを動員してA変異を編集し、それによって標的RNAまた
は標的RNAによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復させる。
特定の実施形態において、複数の標的RNAおよび/または標的RNAによってコード
されるタンパク質の1つ以上の修飾を宿主細胞(例えば、真核細胞)において生成するた
めの方法は、複数のデアミナーゼ動員RNAまたは複数のデアミナーゼ動員RNAをコー
ドする構築体を宿主細胞に導入することを含む。ここで、各dRNAは、前記複数の標的
RNA中の対応する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRN
Aは、ADARを動員して対応する標的RNAの標的Aを脱アミノ化することができる。
一態様では、本出願は、宿主細胞内の標的RNAを編集するための、本明細書に記載のd
RNAのいずれか1つによるデアミナーゼ動員RNAの使用を提供する。特定の実施形態
において、デアミナーゼ動員RNAは、編集される標的RNAにハイブリダイズする相補
的RNA配列を含む。
されるタンパク質の1つ以上の修飾を宿主細胞(例えば、真核細胞)において生成するた
めの方法は、複数のデアミナーゼ動員RNAまたは複数のデアミナーゼ動員RNAをコー
ドする構築体を宿主細胞に導入することを含む。ここで、各dRNAは、前記複数の標的
RNA中の対応する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、各dRN
Aは、ADARを動員して対応する標的RNAの標的Aを脱アミノ化することができる。
一態様では、本出願は、宿主細胞内の標的RNAを編集するための、本明細書に記載のd
RNAのいずれか1つによるデアミナーゼ動員RNAの使用を提供する。特定の実施形態
において、デアミナーゼ動員RNAは、編集される標的RNAにハイブリダイズする相補
的RNA配列を含む。
一態様では、本出願は、標的RNAおよび/または標的RNAによってコードされるタ
ンパク質に1つ以上の修飾を生成するための、本明細書に記載のdRNAのいずれか1つ
によるデアミナーゼ動員RNAの使用を提供する。前記一つ以上の修飾は、標的RNAに
よってコードされるタンパク質の点突然変異、標的RNAによってコードされるタンパク
質のミスフォールディング、標的RNA中の早期終止コドン、標的RNA中の異常なスプ
ライシング部位、及び標的RNA中の可変的スプライシング部位からなる群より選ばれる
。特定の実施形態において、前記デアミナーゼ動員RNAは、編集される標的RNAにハ
イブリダイズする相補的RNA配列を含む。
ンパク質に1つ以上の修飾を生成するための、本明細書に記載のdRNAのいずれか1つ
によるデアミナーゼ動員RNAの使用を提供する。前記一つ以上の修飾は、標的RNAに
よってコードされるタンパク質の点突然変異、標的RNAによってコードされるタンパク
質のミスフォールディング、標的RNA中の早期終止コドン、標的RNA中の異常なスプ
ライシング部位、及び標的RNA中の可変的スプライシング部位からなる群より選ばれる
。特定の実施形態において、前記デアミナーゼ動員RNAは、編集される標的RNAにハ
イブリダイズする相補的RNA配列を含む。
本発明はまた、本明細書に記載のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を真核細
胞に導入して天然の内因性アデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員し、ADARが標
的RNA配列中の標的アデノシンに対して脱アミノ化反応を行うようにRNAに作用する
ことを含む、内因性アデノシンデアミナーゼを利用して真核細胞中の標的RNAを編集す
るための方法に関する。
胞に導入して天然の内因性アデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員し、ADARが標
的RNA配列中の標的アデノシンに対して脱アミノ化反応を行うようにRNAに作用する
ことを含む、内因性アデノシンデアミナーゼを利用して真核細胞中の標的RNAを編集す
るための方法に関する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態において、dR
NAは、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、1
10、120、130、140、150、160、170、180、190、200、2
10、220、230、240、または250を上回るヌクレオチドのいずれか1つを含
む。特定の実施形態において、dRNAは、約40~260、45~250、50~24
0、60~230、65~220、70~220、70~210、70~200、70~
190、70~180、70~170、70~160、70~150、70~140、7
0~130、70~120、70~110、70~100、70~90、70~80、7
5~200、80~190、85~180、90~170、95~160、100~20
0、100~150、100~175、110~200、110~175、110~15
0、または105~140ヌクレオチドのいずれか1つである。一部の実施形態では、d
RNAは約71ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、dRNAは、約111
ヌクレオチド長である。
NAは、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、1
10、120、130、140、150、160、170、180、190、200、2
10、220、230、240、または250を上回るヌクレオチドのいずれか1つを含
む。特定の実施形態において、dRNAは、約40~260、45~250、50~24
0、60~230、65~220、70~220、70~210、70~200、70~
190、70~180、70~170、70~160、70~150、70~140、7
0~130、70~120、70~110、70~100、70~90、70~80、7
5~200、80~190、85~180、90~170、95~160、100~20
0、100~150、100~175、110~200、110~175、110~15
0、または105~140ヌクレオチドのいずれか1つである。一部の実施形態では、d
RNAは約71ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、dRNAは、約111
ヌクレオチド長である。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、dRNA
は、ADAR動員ドメインを含まない。「ADAR動員ドメイン」は、ADARに高い親
和性で結合するヌクレオチド配列または構造、あるいは工学操作されたADAR構築体に
おいてADARに融合された結合パートナーに結合するヌクレオチド配列であり得る。例
示的なADAR動員領域には、GluR-2、GluR-B(R/G)、GluR-B(
Q/R)、GluR-6(R/G)、5HT2C、およびFlnA(Q/R)ドメインが
含まれるが、これらに限定されない;たとえば、Wahlstedt、Helene、a
nd Marie,“Site-selective versus promiscu
ous A-to-I editing”、Wiley Interdisciplin
ary Reviews:RNA 2.6(2011):761-771は、参照により
その全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、dRNAは二本鎖部分を含ま
ない。一部の実施形態では、dRNAは、MS2ステムループなどのヘアピンを含まない
。一部の実施形態では、dRNAは一本鎖である。一部の実施形態において、ADARは
、DSB結合ドメインを含まない。一部の実施形態において、dRNAは、相補的RNA
配列からなる(または本質的に相補的RNA配列からなる)。
は、ADAR動員ドメインを含まない。「ADAR動員ドメイン」は、ADARに高い親
和性で結合するヌクレオチド配列または構造、あるいは工学操作されたADAR構築体に
おいてADARに融合された結合パートナーに結合するヌクレオチド配列であり得る。例
示的なADAR動員領域には、GluR-2、GluR-B(R/G)、GluR-B(
Q/R)、GluR-6(R/G)、5HT2C、およびFlnA(Q/R)ドメインが
含まれるが、これらに限定されない;たとえば、Wahlstedt、Helene、a
nd Marie,“Site-selective versus promiscu
ous A-to-I editing”、Wiley Interdisciplin
ary Reviews:RNA 2.6(2011):761-771は、参照により
その全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、dRNAは二本鎖部分を含ま
ない。一部の実施形態では、dRNAは、MS2ステムループなどのヘアピンを含まない
。一部の実施形態では、dRNAは一本鎖である。一部の実施形態において、ADARは
、DSB結合ドメインを含まない。一部の実施形態において、dRNAは、相補的RNA
配列からなる(または本質的に相補的RNA配列からなる)。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、dRNA
は化学修飾を含まない。一部の実施形態において、dRNAは、2'-O-メチルヌクレ
オチドまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドなどの化学的に修飾されたヌ
クレオチドを含まない。一部の実施形態において、dRNAは、最初の3つおよび最後の
3つの残基にのみ2'-O-メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を含む。一部の実
施形態において、dRNAは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)ではない。
は化学修飾を含まない。一部の実施形態において、dRNAは、2'-O-メチルヌクレ
オチドまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドなどの化学的に修飾されたヌ
クレオチドを含まない。一部の実施形態において、dRNAは、最初の3つおよび最後の
3つの残基にのみ2'-O-メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を含む。一部の実
施形態において、dRNAは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)ではない。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、前記宿主
細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は真核細胞である。一部
の実施形態では、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細
胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、宿前記主細胞はマウス細胞である。一部
の実施形態において、前記宿主細胞は、植物細胞または真菌細胞である。
細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は真核細胞である。一部
の実施形態では、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細
胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、宿前記主細胞はマウス細胞である。一部
の実施形態において、前記宿主細胞は、植物細胞または真菌細胞である。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる一部の実施形態では、宿主細胞
は、HEK293T、HT29、A549、HepG2、RD、SF268、SW13お
よびHeLa細胞などの細胞株である。一部の実施形態において、宿主細胞は、線維芽細
胞、上皮細胞、または免疫細胞などの初代細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は
T細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、有糸分裂後の細胞である。一部の
実施形態において、宿主細胞は、脳細胞、例えば、小脳細胞などの中枢神経系(CNS)
の細胞である。
は、HEK293T、HT29、A549、HepG2、RD、SF268、SW13お
よびHeLa細胞などの細胞株である。一部の実施形態において、宿主細胞は、線維芽細
胞、上皮細胞、または免疫細胞などの初代細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は
T細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、有糸分裂後の細胞である。一部の
実施形態において、宿主細胞は、脳細胞、例えば、小脳細胞などの中枢神経系(CNS)
の細胞である。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体を宿主細胞に導
入することを含む、初代宿主細胞(例えば、T細胞またはCNS細胞)において標的RN
Aを編集する方法が提供され、ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相
補的RNA配列を含み、dRNAは、宿主細胞の内因的に発現されたADARを動員して
、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化する。
入することを含む、初代宿主細胞(例えば、T細胞またはCNS細胞)において標的RN
Aを編集する方法が提供され、ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相
補的RNA配列を含み、dRNAは、宿主細胞の内因的に発現されたADARを動員して
、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、前記AD
ARは宿主細胞に対して内因性である。一部の実施形態において、RNAに作用するアデ
ノシンデアミナーゼ(ADAR)は、宿主細胞に自然にまたは内因的に存在し、例えば、
真核細胞に自然にまたは内因的に存在する。一部の実施形態において、前記ADARは、
宿主細胞によって内因的に発現される。特定の実施形態において、前記ADARは、宿主
細胞に外因的に導入される。一部の実施形態では、前記ADARは、ADAR1および/
またはADAR2である。特定の実施形態では、前記ADARは、hADAR1、hAD
AR2、マウスADAR1およびADAR2からなる群から選択される1つ以上のADA
Rである。一部の実施形態では、ADARは、ADAR1のp110アイソフォーム(「
ADAR1p110」)および/またはADAR1のp150アイソフォーム(「ADA
R1p150」)などのADAR1である。一部の実施形態では、ADARはADAR2
である。一部の実施形態において、ADARは、宿主細胞によって発現されるADAR2
、例えば、小脳細胞によって発現されるADAR2である。
ARは宿主細胞に対して内因性である。一部の実施形態において、RNAに作用するアデ
ノシンデアミナーゼ(ADAR)は、宿主細胞に自然にまたは内因的に存在し、例えば、
真核細胞に自然にまたは内因的に存在する。一部の実施形態において、前記ADARは、
宿主細胞によって内因的に発現される。特定の実施形態において、前記ADARは、宿主
細胞に外因的に導入される。一部の実施形態では、前記ADARは、ADAR1および/
またはADAR2である。特定の実施形態では、前記ADARは、hADAR1、hAD
AR2、マウスADAR1およびADAR2からなる群から選択される1つ以上のADA
Rである。一部の実施形態では、ADARは、ADAR1のp110アイソフォーム(「
ADAR1p110」)および/またはADAR1のp150アイソフォーム(「ADA
R1p150」)などのADAR1である。一部の実施形態では、ADARはADAR2
である。一部の実施形態において、ADARは、宿主細胞によって発現されるADAR2
、例えば、小脳細胞によって発現されるADAR2である。
一部の実施形態において、ADARは、宿主細胞に対して外因性のADARである。一
部の実施形態において、ADARは、天然に存在するADARの多動変異体である。一部
の実施形態では、ADARは、E1008Q突然変異を含むADAR1である。一部の実
施形態において、ADARは、結合ドメインを含む融合タンパク質ではない。一部の実施
形態において、ADARは、工学操作された二本鎖核酸結合ドメインを含まない。一部の
実施形態では、ADARは、dRNAの相補的RNA配列に融合されたMS2ヘアピンに
結合するMCPドメインを含まない。一部の実施形態では、ADARは、DSB結合ドメ
インを含まない。
部の実施形態において、ADARは、天然に存在するADARの多動変異体である。一部
の実施形態では、ADARは、E1008Q突然変異を含むADAR1である。一部の実
施形態において、ADARは、結合ドメインを含む融合タンパク質ではない。一部の実施
形態において、ADARは、工学操作された二本鎖核酸結合ドメインを含まない。一部の
実施形態では、ADARは、dRNAの相補的RNA配列に融合されたMS2ヘアピンに
結合するMCPドメインを含まない。一部の実施形態では、ADARは、DSB結合ドメ
インを含まない。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる一部の実施形態では、宿主細胞
は、高い発現レベル、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、少な
くとも約10%、20%、50%、100%、2x、3x、5xまたそれ以上のいずれか
1つのADAR1(ADAR1p110および/またはADAR1p150など)を有す
る。一部の実施形態において、宿主細胞は、高い発現レベル、例えば、β-チューブリン
のタンパク質発現レベルに対して、少なくとも約10%、20%、50%、100%、2
x、3x、5xまたはそれ以上のいずれか1つのADAR2を有する。一部の実施形態に
おいて、宿主細胞は、低い発現レベル、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベ
ルに対して、約5x、3x、2x、100%、50%、20%またはそれ以下のいずれか
1つを超えないADAR3を有する。
は、高い発現レベル、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、少な
くとも約10%、20%、50%、100%、2x、3x、5xまたそれ以上のいずれか
1つのADAR1(ADAR1p110および/またはADAR1p150など)を有す
る。一部の実施形態において、宿主細胞は、高い発現レベル、例えば、β-チューブリン
のタンパク質発現レベルに対して、少なくとも約10%、20%、50%、100%、2
x、3x、5xまたはそれ以上のいずれか1つのADAR2を有する。一部の実施形態に
おいて、宿主細胞は、低い発現レベル、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベ
ルに対して、約5x、3x、2x、100%、50%、20%またはそれ以下のいずれか
1つを超えないADAR3を有する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、前記相補
的RNA配列は、標的RNAの標的Aの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウ
リジンを含む。一部の実施形態では、相補的RNA配列は、標的RNAの標的Aの真向か
いにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、
相補的RNA配列の5'末端から少なくとも5ヌクレオチド、例えば、少なくとも10、
15、20、25、30、またはそれ以上のヌクレオチド離れに位置している。一部の実
施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列の3'末端から少なくとも2
0ヌクレオチド、例えば、少なくとも25、30、35、またはそれ以上のヌクレオチド
離れに位置している。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配
列の3'末端から20(例えば、15、10、5以下)ヌクレオチド内に位置していない
。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列の3'末端から少
なくとも20ヌクレオチド(例えば、少なくとも25、30、35、またはそれ以上のヌ
クレオチド)および5'末端から少なくとも5ヌクレオチド(例えば、少なくとも10、
15、20)離れて位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的
RNA配列の中心に位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、dRN
Aの相補的配列の中心から20ヌクレオチド(例えば、15、10、9、8、7、6、5
、4、3、2、または1ヌクレオチド)内に位置する。
的RNA配列は、標的RNAの標的Aの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウ
リジンを含む。一部の実施形態では、相補的RNA配列は、標的RNAの標的Aの真向か
いにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、
相補的RNA配列の5'末端から少なくとも5ヌクレオチド、例えば、少なくとも10、
15、20、25、30、またはそれ以上のヌクレオチド離れに位置している。一部の実
施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列の3'末端から少なくとも2
0ヌクレオチド、例えば、少なくとも25、30、35、またはそれ以上のヌクレオチド
離れに位置している。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配
列の3'末端から20(例えば、15、10、5以下)ヌクレオチド内に位置していない
。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列の3'末端から少
なくとも20ヌクレオチド(例えば、少なくとも25、30、35、またはそれ以上のヌ
クレオチド)および5'末端から少なくとも5ヌクレオチド(例えば、少なくとも10、
15、20)離れて位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的
RNA配列の中心に位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、dRN
Aの相補的配列の中心から20ヌクレオチド(例えば、15、10、9、8、7、6、5
、4、3、2、または1ヌクレオチド)内に位置する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、相補的R
NA配列は、1つまたは2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上のGなどの1つ
以上のグアノシンをさらに含み、それらはそれぞれ標的RNAの非標的アデノシンの真向
かいにある。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、標的RNAの非標的アデノ
シンに対向する2つまたはそれ以上の連続するミスマッチヌクレオチド(例えば、2、3
、4、5、またはそれ以上のミスマッチヌクレオチド)を含む。一部の実施形態において
、標的RNAは、約15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下の非標
的Aのいずれか1つなど、約20以下の非標的Aを含む。非標的Aに対向するGおよび連
続するミスマッチヌクレオチドは、ADARによるオフターゲット編集効果を低減するこ
とができる。
NA配列は、1つまたは2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上のGなどの1つ
以上のグアノシンをさらに含み、それらはそれぞれ標的RNAの非標的アデノシンの真向
かいにある。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、標的RNAの非標的アデノ
シンに対向する2つまたはそれ以上の連続するミスマッチヌクレオチド(例えば、2、3
、4、5、またはそれ以上のミスマッチヌクレオチド)を含む。一部の実施形態において
、標的RNAは、約15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下の非標
的Aのいずれか1つなど、約20以下の非標的Aを含む。非標的Aに対向するGおよび連
続するミスマッチヌクレオチドは、ADARによるオフターゲット編集効果を低減するこ
とができる。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、標的Aの
5'に最も近い隣接物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度
がU>C≒A>Gであり、標的Aの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選
ばれるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである。特定の実施形態では、標的
RNAにおける標的Aが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、
CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからな
る群より選ばれる3塩基モチーフである。特定の実施形態では、前記3塩基モチーフがU
AGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのUの真向かいのA、前記標的Aの真
向かいのC、及び3塩基モチーフのGの真向かいのC、G、またはUを含む。特定の実施
形態では、前記3塩基モチーフが標的RNA中のUAGであり、前記dRNAが、標的R
NAのUAGに対向するACC、ACGまたはACUを含む。特定の実施形態では、3塩
基モチーフは標的RNA中のUAGであり、dRNAは、標的RNAのUAGに対向する
ACCを含む。
5'に最も近い隣接物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度
がU>C≒A>Gであり、標的Aの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選
ばれるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである。特定の実施形態では、標的
RNAにおける標的Aが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、
CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからな
る群より選ばれる3塩基モチーフである。特定の実施形態では、前記3塩基モチーフがU
AGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのUの真向かいのA、前記標的Aの真
向かいのC、及び3塩基モチーフのGの真向かいのC、G、またはUを含む。特定の実施
形態では、前記3塩基モチーフが標的RNA中のUAGであり、前記dRNAが、標的R
NAのUAGに対向するACC、ACGまたはACUを含む。特定の実施形態では、3塩
基モチーフは標的RNA中のUAGであり、dRNAは、標的RNAのUAGに対向する
ACCを含む。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、前記標的
RNAは、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、トラ
ンスファーRNA、長い非コードRNA、及び小さいRNA(例えば、miRNA)から
なる群から選択されるいずれか1つである。一部の実施形態において、標的RNAは、プ
レメッセンジャーRNAである。一部の実施形態では、標的RNAはメッセンジャーRN
Aである。
RNAは、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、トラ
ンスファーRNA、長い非コードRNA、及び小さいRNA(例えば、miRNA)から
なる群から選択されるいずれか1つである。一部の実施形態において、標的RNAは、プ
レメッセンジャーRNAである。一部の実施形態では、標的RNAはメッセンジャーRN
Aである。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、この方法
は、ADAR3の阻害剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態におい
て、ADAR3の阻害剤は、ADAR3に対するRNAiであり、例えば、ADAR3に
対するshRNAまたはADAR3に対するsiRNAなどである。一部の実施形態では
、この方法は、インターフェロンのスティミュレーター(stimulator)を宿主
細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ADARは、インターフェ
ロンによって誘導可能であり、例えば、ADARは、ADARp150である。一部の実
施形態において、インターフェロンのスティミュレーターは、IFNαである。一部の実
施形態において、ADAR3の阻害剤および/またはインターフェロンのスティミュレー
ターは、dRNAをコードする同じ構築体(例えば、ベクター)によってコードされる。
は、ADAR3の阻害剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態におい
て、ADAR3の阻害剤は、ADAR3に対するRNAiであり、例えば、ADAR3に
対するshRNAまたはADAR3に対するsiRNAなどである。一部の実施形態では
、この方法は、インターフェロンのスティミュレーター(stimulator)を宿主
細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ADARは、インターフェ
ロンによって誘導可能であり、例えば、ADARは、ADARp150である。一部の実
施形態において、インターフェロンのスティミュレーターは、IFNαである。一部の実
施形態において、ADAR3の阻害剤および/またはインターフェロンのスティミュレー
ターは、dRNAをコードする同じ構築体(例えば、ベクター)によってコードされる。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、標的RN
Aの編集効率は、少なくとも約5%、例えば、少なくとも約6%、7%、8%、9%、1
0%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、6
0%、65%、またはそれ以上のいずれか1つである。一部の実施形態において、インビ
ボ(例えば、動物において)での標的RNAの編集効率は、少なくとも約5%(例えば、
少なくとも約7%)である。一部の実施形態において、標的RNAの編集の効率は、イン
ビトロまたはエクスビボの細胞において少なくとも約10%(例えば、少なくとも約15
%)である。一部の実施形態では、編集の効率は、サンガー(Sanger)シーケンシ
ングによって決定される。一部の実施形態では、編集の効率は、次世代シーケンシングに
よって決定される。
Aの編集効率は、少なくとも約5%、例えば、少なくとも約6%、7%、8%、9%、1
0%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、6
0%、65%、またはそれ以上のいずれか1つである。一部の実施形態において、インビ
ボ(例えば、動物において)での標的RNAの編集効率は、少なくとも約5%(例えば、
少なくとも約7%)である。一部の実施形態において、標的RNAの編集の効率は、イン
ビトロまたはエクスビボの細胞において少なくとも約10%(例えば、少なくとも約15
%)である。一部の実施形態では、編集の効率は、サンガー(Sanger)シーケンシ
ングによって決定される。一部の実施形態では、編集の効率は、次世代シーケンシングに
よって決定される。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、この方法
は、オフターゲット編集率が低い。一部の実施形態では、この方法は、標的RNA中の非
標的Aに対して約1%未満(例えば、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0
.001%またはそれ以下のいずれか1つ以下)の編集効率を有する。一部の実施形態で
は、この方法は、標的RNA中の非標的Aを編集しない。一部の実施形態において、この
方法は、非標的RNAにおけるAに対する編集効率が約0.1%未満(例えば、0.05
%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0001%以下あるいはそれ以下の
いずれか1つ)である。
は、オフターゲット編集率が低い。一部の実施形態では、この方法は、標的RNA中の非
標的Aに対して約1%未満(例えば、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0
.001%またはそれ以下のいずれか1つ以下)の編集効率を有する。一部の実施形態で
は、この方法は、標的RNA中の非標的Aを編集しない。一部の実施形態において、この
方法は、非標的RNAにおけるAに対する編集効率が約0.1%未満(例えば、0.05
%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0001%以下あるいはそれ以下の
いずれか1つ)である。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、この方法
は、自然免疫応答などの免疫応答を誘導しない。一部の実施形態において、この方法は、
宿主細胞においてインターフェロンおよび/またはインターロイキンの発現を誘導しない
。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞においてIFN-βおよび/またはI
L-6発現を誘導しない。
は、自然免疫応答などの免疫応答を誘導しない。一部の実施形態において、この方法は、
宿主細胞においてインターフェロンおよび/またはインターロイキンの発現を誘導しない
。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞においてIFN-βおよび/またはI
L-6発現を誘導しない。
本発明さらに、本明細書に記載の方法のいずれか1つによって生成された編集されたR
NAを有する、編集されたRNAまたは宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、編集
されたRNAはイノシンを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ミスセンス
突然変異、早期終止コドン、可変的スプライシング部位、または異常なスプライシング部
位を有するRNAを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、突然変異された、
切断された、またはミスフォールディングされたタンパク質を含む。
NAを有する、編集されたRNAまたは宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、編集
されたRNAはイノシンを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ミスセンス
突然変異、早期終止コドン、可変的スプライシング部位、または異常なスプライシング部
位を有するRNAを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、突然変異された、
切断された、またはミスフォールディングされたタンパク質を含む。
本明細書に記載の「宿主細胞」とは、本明細書に記載のように修飾されることができる
という条件で、宿主細胞として使用することができる任意の細胞型を指す。例えば、前記
宿主細胞は、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を内因的に発現する
宿主細胞であり得るか、またはRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)が
本分野で既知の方法によって導入される宿主細胞であり得る。例えば、前記宿主細胞は、
原核細胞、真核細胞、または植物細胞であってもよい。一部の実施形態において、前記宿
主細胞は、ヒト細胞株または非ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞株などの予め確立された細
胞株に由来する。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト個体などの個体に由来
する。
という条件で、宿主細胞として使用することができる任意の細胞型を指す。例えば、前記
宿主細胞は、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を内因的に発現する
宿主細胞であり得るか、またはRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)が
本分野で既知の方法によって導入される宿主細胞であり得る。例えば、前記宿主細胞は、
原核細胞、真核細胞、または植物細胞であってもよい。一部の実施形態において、前記宿
主細胞は、ヒト細胞株または非ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞株などの予め確立された細
胞株に由来する。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト個体などの個体に由来
する。
本明細書で使用される「導入(introducing)」または「導入(intro
duction)」は、dRNAなどの1つ以上のポリヌクレオチド、または本明細書に
記載のベクターを含む1つまたは複数の構築体、その1つ以上の転写物を前記宿主細胞に
送達することを意味する。本発明は、例えば、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャ
ーRNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、長い非コードRNAおよび小さい
RNA(miRNAなど)の標的化された編集を可能にするためのRNAの基本的なプラ
ットフォームとして使用される。本出願の方法は、ウイルス、リポソーム、エレクトロポ
レーション、マイクロインジェクションおよび接合を含むがこれらに限定されない多くの
送達システムを使用して、本明細書に記載のdRNAまたは構築体の宿主細胞への導入を
達成することができる。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用し
て、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入することができる。そのような方法を使用
して、本出願のdRNAをコードする核酸を、培養中の細胞または宿主生物内に投与する
ことができる。非ウイルスベクター送達システムには、DNAプラスミド、RNA(例え
ば、本明細書に記載の構築体の転写物)、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒク
ルと複合体を形成した核酸が含まれる。前記ウイルスベクター送達システムには、前記宿
主細胞に送達するためのエピソームまたは統合ゲノムのいずれかを有するDNAおよびR
NAウイルスが含まれる。
duction)」は、dRNAなどの1つ以上のポリヌクレオチド、または本明細書に
記載のベクターを含む1つまたは複数の構築体、その1つ以上の転写物を前記宿主細胞に
送達することを意味する。本発明は、例えば、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャ
ーRNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、長い非コードRNAおよび小さい
RNA(miRNAなど)の標的化された編集を可能にするためのRNAの基本的なプラ
ットフォームとして使用される。本出願の方法は、ウイルス、リポソーム、エレクトロポ
レーション、マイクロインジェクションおよび接合を含むがこれらに限定されない多くの
送達システムを使用して、本明細書に記載のdRNAまたは構築体の宿主細胞への導入を
達成することができる。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用し
て、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入することができる。そのような方法を使用
して、本出願のdRNAをコードする核酸を、培養中の細胞または宿主生物内に投与する
ことができる。非ウイルスベクター送達システムには、DNAプラスミド、RNA(例え
ば、本明細書に記載の構築体の転写物)、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒク
ルと複合体を形成した核酸が含まれる。前記ウイルスベクター送達システムには、前記宿
主細胞に送達するためのエピソームまたは統合ゲノムのいずれかを有するDNAおよびR
NAウイルスが含まれる。
核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイク
ロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、
ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ナノ粒子、エ
キソソーム、微小胞、または遺伝子銃、裸のDNAおよび人工ビリオンが含まれる。
ロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、
ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ナノ粒子、エ
キソソーム、微小胞、または遺伝子銃、裸のDNAおよび人工ビリオンが含まれる。
核酸の送達のためのRNAまたはDNAウイルスベースのシステムの使用は、ウイルス
を特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを細胞核に輸送するのに高い効率を有する
。
を特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを細胞核に輸送するのに高い効率を有する
。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか1つによる特定の実施形態では、この方法
は、dRNAをコードするウイルスベクター(レンチウイルスベクターなど)を宿主細胞
に導入することを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、AAV、例えば
、AAV8である。一部の実施形態において、この方法は、dRNAをコードするプラス
ミドを宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、この方法は、dRNA
(例えば、合成dRNA)を宿主細胞に(例えば、エレクトロポレーションによって)導
入することを含む。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞へのdRNAのトラ
ンスフェクションを含む。
は、dRNAをコードするウイルスベクター(レンチウイルスベクターなど)を宿主細胞
に導入することを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、AAV、例えば
、AAV8である。一部の実施形態において、この方法は、dRNAをコードするプラス
ミドを宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、この方法は、dRNA
(例えば、合成dRNA)を宿主細胞に(例えば、エレクトロポレーションによって)導
入することを含む。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞へのdRNAのトラ
ンスフェクションを含む。
脱アミノ化後、標的RNAおよび/または標的RNAによってコードされるタンパク質
の修飾は、標的RNA中の標的アデノシンの位置に応じて異なる方法を使用して確定する
ことができる。例えば、標的RNAにおいて「A」が「I」に編集されているかどうかを
確認するために、本分野で知られているRNA配列決定法を使用して、RNA配列の修飾
を検出することができる。標的アデノシンがmRNAのコード領域にある場合、RNA編
集によりmRNAによってコードされるアミノ酸配列が変化することができる。例えば、
点突然変異をmRNAに導入することができ、または、mRNA中の先天のまたは後天的
な点突然変異を元に戻って野生型遺伝子産物を生じることができる。これは、「A」から
「I」へ変換されたからである。本分野で知られている方法によるアミノ酸配列決定を使
用して、コードされたタンパク質中のアミノ酸残基の変化を見つけることができる。終止
コドンの修飾は、機能的、伸長、切断された、完全長および/または野生型タンパク質の
存在を評価することによって決定することができる。例えば、標的アデノシンがUGA、
UAG、またはUAA終止コドンに位置する場合、標的A(UGAまたはUAG)または
複数のA(UAA)の修飾は、リードスルー変異および/または伸長タンパク質を作製す
ることができる。あるいは、標的RNAによってコードされる切断されたタンパク質を回
復して、機能的な完全長および/または野生型タンパク質を作製することができる。標的
RNAの編集はまた、標的RNAに異常なスプライシング部位および/または可変的スプ
ライシング部位を生成することができ、したがって、伸長、切断、またはミスフォールデ
ィングされたタンパク質、または標的RNAにコードされた異常なスプライシングまたは
可変的スプライシング部位の回復によって、機能的で正しくフォールディングされた完全
長および/または野生型タンパク質を作製する。一部の実施形態において、本出願は、先
天性および後天性の両方の遺伝的変化、例えば、ミスセンス突然変異、早期終止コドン、
異常なスプライシングまたは標的RNAによってコードされる可変的スプライシング部位
の編集を考慮する。既知の方法を使用して、標的RNAによってコードされるタンパク質
の機能を評価することで、RNA編集が所望の効果を達成したかどうかを確認できる。ア
デノシン(A)のイノシン(I)への脱アミノ化は、タンパク質をコードする変異RNA
の標的位置で変異したAを修正することができるため、イノシンへの脱アミノ化の同定は
、機能性タンパク質が存在するかどうか、または変異したアデノシンの存在によって引き
起こされる疾患または薬剤耐性関連RNAは、回復または部分的に回復されたかという評
価を提供することができる。同様に、アデノシン(A)からイノシン(I)への脱アミノ
化は、得られたタンパク質に点突然変異を導入する可能性があるため、イノシンへの脱ア
ミノ化の同定は、疾患の原因または疾患の関連因子を特定するための機能的指標を見つけ
ることができる。
の修飾は、標的RNA中の標的アデノシンの位置に応じて異なる方法を使用して確定する
ことができる。例えば、標的RNAにおいて「A」が「I」に編集されているかどうかを
確認するために、本分野で知られているRNA配列決定法を使用して、RNA配列の修飾
を検出することができる。標的アデノシンがmRNAのコード領域にある場合、RNA編
集によりmRNAによってコードされるアミノ酸配列が変化することができる。例えば、
点突然変異をmRNAに導入することができ、または、mRNA中の先天のまたは後天的
な点突然変異を元に戻って野生型遺伝子産物を生じることができる。これは、「A」から
「I」へ変換されたからである。本分野で知られている方法によるアミノ酸配列決定を使
用して、コードされたタンパク質中のアミノ酸残基の変化を見つけることができる。終止
コドンの修飾は、機能的、伸長、切断された、完全長および/または野生型タンパク質の
存在を評価することによって決定することができる。例えば、標的アデノシンがUGA、
UAG、またはUAA終止コドンに位置する場合、標的A(UGAまたはUAG)または
複数のA(UAA)の修飾は、リードスルー変異および/または伸長タンパク質を作製す
ることができる。あるいは、標的RNAによってコードされる切断されたタンパク質を回
復して、機能的な完全長および/または野生型タンパク質を作製することができる。標的
RNAの編集はまた、標的RNAに異常なスプライシング部位および/または可変的スプ
ライシング部位を生成することができ、したがって、伸長、切断、またはミスフォールデ
ィングされたタンパク質、または標的RNAにコードされた異常なスプライシングまたは
可変的スプライシング部位の回復によって、機能的で正しくフォールディングされた完全
長および/または野生型タンパク質を作製する。一部の実施形態において、本出願は、先
天性および後天性の両方の遺伝的変化、例えば、ミスセンス突然変異、早期終止コドン、
異常なスプライシングまたは標的RNAによってコードされる可変的スプライシング部位
の編集を考慮する。既知の方法を使用して、標的RNAによってコードされるタンパク質
の機能を評価することで、RNA編集が所望の効果を達成したかどうかを確認できる。ア
デノシン(A)のイノシン(I)への脱アミノ化は、タンパク質をコードする変異RNA
の標的位置で変異したAを修正することができるため、イノシンへの脱アミノ化の同定は
、機能性タンパク質が存在するかどうか、または変異したアデノシンの存在によって引き
起こされる疾患または薬剤耐性関連RNAは、回復または部分的に回復されたかという評
価を提供することができる。同様に、アデノシン(A)からイノシン(I)への脱アミノ
化は、得られたタンパク質に点突然変異を導入する可能性があるため、イノシンへの脱ア
ミノ化の同定は、疾患の原因または疾患の関連因子を特定するための機能的指標を見つけ
ることができる。
標的アデノシンの存在が異常なスプライシングを引き起こす場合、読み出しは異常なス
プライシングの発生と頻度の評価であってもよい。一方、望ましいターゲットアデノシン
の脱アミノ化がスプライシング部位に導入される場合、類似した方法を使用して、必要な
タイプのスプライシングが起こるかどうかをチェックすることができる。当業者に周知の
方法を使用して標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を同定するための例示的
な適切な方法は、RT-PCRおよび配列決定である。
プライシングの発生と頻度の評価であってもよい。一方、望ましいターゲットアデノシン
の脱アミノ化がスプライシング部位に導入される場合、類似した方法を使用して、必要な
タイプのスプライシングが起こるかどうかをチェックすることができる。当業者に周知の
方法を使用して標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を同定するための例示的
な適切な方法は、RT-PCRおよび配列決定である。
標的アデノシンの脱アミノ化の効果には、例えば、点突然変異、早期終止コドン、異常
なスプライシング部位、可変的なスプライシング部位、および得られたタンパク質のミス
フォールディングが含まれる。これらの効果は、遺伝的に受け継がれているか、後天的な
遺伝子変異によって引き起こされているかにかかわらず、疾患に関連するRNAおよび/
またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発するか、薬剤耐性の発生に関連するR
NAおよび/またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発することができる。した
がって、疾患に関連するRNA及び/またはタンパク質の構造及び/または機能を変える
ことによって、dRNA、dRNAをコードする構築体、および本願のRNA編集方法を
、遺伝性の疾患または病症、または後天性遺伝子突然変異に関連する疾患または病症の予
防または治療に使用することができる。
なスプライシング部位、可変的なスプライシング部位、および得られたタンパク質のミス
フォールディングが含まれる。これらの効果は、遺伝的に受け継がれているか、後天的な
遺伝子変異によって引き起こされているかにかかわらず、疾患に関連するRNAおよび/
またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発するか、薬剤耐性の発生に関連するR
NAおよび/またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発することができる。した
がって、疾患に関連するRNA及び/またはタンパク質の構造及び/または機能を変える
ことによって、dRNA、dRNAをコードする構築体、および本願のRNA編集方法を
、遺伝性の疾患または病症、または後天性遺伝子突然変異に関連する疾患または病症の予
防または治療に使用することができる。
一部の実施形態では、標的RNAは調節RNAである。一部の実施形態において、編集
される標的RNAは、リボソームRNA、転移RNA、長い非コードRNAまたは小さい
RNA(例えば、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、piRNA、
siRNA、snoRNA、snRNA、exRNAまたはscaRNA)である。標的
アデノシンの脱アミノ化の効果には、例えば、リボソームRNA、転移RNA、長い非コ
ードRNAまたは小さいRNA(例えば、miRNA)の三次元構造及び/または機能喪
失もしくは機能の獲得が含まれる。一部の実施形態において、標的RNAにおける標的A
の脱アミノ化は、標的RNAの1つ以上の下流分子(例えば、タンパク質、RNAおよび
/または代謝産物)の発現レベルを変化させる。下流分子の発現レベルの変化は、発現レ
ベルの増加または減少であってもよい。
される標的RNAは、リボソームRNA、転移RNA、長い非コードRNAまたは小さい
RNA(例えば、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、piRNA、
siRNA、snoRNA、snRNA、exRNAまたはscaRNA)である。標的
アデノシンの脱アミノ化の効果には、例えば、リボソームRNA、転移RNA、長い非コ
ードRNAまたは小さいRNA(例えば、miRNA)の三次元構造及び/または機能喪
失もしくは機能の獲得が含まれる。一部の実施形態において、標的RNAにおける標的A
の脱アミノ化は、標的RNAの1つ以上の下流分子(例えば、タンパク質、RNAおよび
/または代謝産物)の発現レベルを変化させる。下流分子の発現レベルの変化は、発現レ
ベルの増加または減少であってもよい。
本出願の一部の実施形態は、宿主細胞における標的RNAのマルチプレックス編集に係
り、これは、標的遺伝子の異なる変異体または宿主細胞における異なる遺伝子をスクリー
ニングするために使用できる。一部の実施形態では、この方法が複数のdRNAを宿主細
胞に導入することを含み、前記複数のdRNAの少なくとも2つのdRNAは、異なる配
列を有し、および/または異なる標的RNAを有する。一部の実施形態において、各dR
NAは、異なる配列および/または異なる標的RNAを有する。一部の実施形態では、こ
の方法は、宿主細胞内の単一の標的RNAに複数(例えば、少なくとも2、3、5、10
、50、100、1000またはそれ以上)の修飾を生成する。一部の実施形態では、こ
の方法は、宿主細胞内の複数(例えば、少なくとも2、3、5、10、50、100、1
000またはそれ以上)の標的RNAに修飾を生成する。一部の実施形態では、この方法
は、複数の宿主細胞群における複数の標的RNAを編集することを含む。一部の実施形態
において、各宿主細胞群は、異なるdRNA、または他の宿主細胞群とは異なる標的RN
Aを有するdRNAを受ける。
り、これは、標的遺伝子の異なる変異体または宿主細胞における異なる遺伝子をスクリー
ニングするために使用できる。一部の実施形態では、この方法が複数のdRNAを宿主細
胞に導入することを含み、前記複数のdRNAの少なくとも2つのdRNAは、異なる配
列を有し、および/または異なる標的RNAを有する。一部の実施形態において、各dR
NAは、異なる配列および/または異なる標的RNAを有する。一部の実施形態では、こ
の方法は、宿主細胞内の単一の標的RNAに複数(例えば、少なくとも2、3、5、10
、50、100、1000またはそれ以上)の修飾を生成する。一部の実施形態では、こ
の方法は、宿主細胞内の複数(例えば、少なくとも2、3、5、10、50、100、1
000またはそれ以上)の標的RNAに修飾を生成する。一部の実施形態では、この方法
は、複数の宿主細胞群における複数の標的RNAを編集することを含む。一部の実施形態
において、各宿主細胞群は、異なるdRNA、または他の宿主細胞群とは異なる標的RN
Aを有するdRNAを受ける。
デアミナーゼ動員RNA、構築体、およびライブラリー
一態様では、本出願は、本明細書に記載の方法のいずれか1つに使用できるデアミナー
ゼ動員RNAを提供する。このセクションで説明されているdRNAのいずれか1つを、
ここで説明されているRNA編集および治療法で使用することができる。dRNAについ
て本明細書に記載されている特徴およびパラメータのいずれかを、あたかもすべての組み
合わせが個別に記載されているかのように、互いに組み合わせることができることが意図
されている。本明細書に記載のdRNAは、CRISPR/Casシステムで使用される
tracrRNA、crRNA、またはgRNAを含まない。
一態様では、本出願は、本明細書に記載の方法のいずれか1つに使用できるデアミナー
ゼ動員RNAを提供する。このセクションで説明されているdRNAのいずれか1つを、
ここで説明されているRNA編集および治療法で使用することができる。dRNAについ
て本明細書に記載されている特徴およびパラメータのいずれかを、あたかもすべての組み
合わせが個別に記載されているかのように、互いに組み合わせることができることが意図
されている。本明細書に記載のdRNAは、CRISPR/Casシステムで使用される
tracrRNA、crRNA、またはgRNAを含まない。
一部の実施形態において、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含むA
DARを動員することによって標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するためのデ
アミナーゼ動員RNA(dRNA)が提供される。
DARを動員することによって標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するためのデ
アミナーゼ動員RNA(dRNA)が提供される。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のデアミナーゼ動員RNAのいずれか1つを含
む構築体を提供する。特定の実施形態において、前記構築体は、ウイルスベクター(レン
チウイルスベクターなど)またはプラスミドである。一部の実施形態において、ウイルス
ベクターは、AAV8などのAAVである。一部の実施形態では、前記構築体は単一のd
RNAをコードする。一部の実施形態では、前記構築体は、複数の(例えば、約1、2、
3、4、5、10、20またはそれ以上の何れか一つの)dRNAをコードする。
む構築体を提供する。特定の実施形態において、前記構築体は、ウイルスベクター(レン
チウイルスベクターなど)またはプラスミドである。一部の実施形態において、ウイルス
ベクターは、AAV8などのAAVである。一部の実施形態では、前記構築体は単一のd
RNAをコードする。一部の実施形態では、前記構築体は、複数の(例えば、約1、2、
3、4、5、10、20またはそれ以上の何れか一つの)dRNAをコードする。
一態様では、本出願は、複数のデアミナーゼ動員RNAまたは本明細書に記載の複数の
構築体を含むライブラリーを提供する。
構築体を含むライブラリーを提供する。
一態様では、本出願は、デアミナーゼ動員RNAまたは本明細書に記載の構築体を含む
組成物または宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、前記宿主細胞は、原核細胞
または真核細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。最も好ましく
は、前記宿主細胞はヒト細胞である。
組成物または宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、前記宿主細胞は、原核細胞
または真核細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。最も好ましく
は、前記宿主細胞はヒト細胞である。
本明細書に記載のdRNA、構築体、ライブラリーまたは組成物のいずれか1つによる
特定の実施形態では、前記相補的RNA配列は、(標的RNAで編集される)標的アデノ
シンの真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む。特定の実施形態にお
いて、前記相補的RNA配列は、それぞれが標的RNA中の非標的アデノシンの真向かい
にある1つ以上のグアノシンをさらに含む。特定の実施形態において、標的Aの5'に最
も近い隣接物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C
≒A>Gであり、標的Aの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選ばれるヌ
クレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである。一部の実施形態では、標的Aの5'
に最も近い隣接物がCまたはAである。一部の実施形態では、標的Aの3’に最も近い隣
接物がGである。一部の実施形態では、標的Aの3’に最も近い隣接物がCである。
特定の実施形態では、前記相補的RNA配列は、(標的RNAで編集される)標的アデノ
シンの真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む。特定の実施形態にお
いて、前記相補的RNA配列は、それぞれが標的RNA中の非標的アデノシンの真向かい
にある1つ以上のグアノシンをさらに含む。特定の実施形態において、標的Aの5'に最
も近い隣接物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C
≒A>Gであり、標的Aの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選ばれるヌ
クレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである。一部の実施形態では、標的Aの5'
に最も近い隣接物がCまたはAである。一部の実施形態では、標的Aの3’に最も近い隣
接物がGである。一部の実施形態では、標的Aの3’に最も近い隣接物がCである。
本明細書に記載のdRNA、構築体、ライブラリーまたは組成物のいずれか1つによる
特定の実施形態では、標的RNA中の標的Aは、UAG、UAC、UAA、UAU、CA
G、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GA
A、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフである。特定の実施形態では、前
記3塩基モチーフはUAGであり、dRNAは、3塩基モチーフのUの真向かいにあるA
、標的Aの真向かいにあるC、および3塩基モチーフのGの真向かいにあるC、G、また
はUを含む。特定の実施形態では、前記3塩基モチーフは、標的RNAのUAGであり、
前記dRNAは、標的RNAのUAGに対向するACC、ACG、またはACUを含む。
特定の実施形態では、標的RNA中の標的Aは、UAG、UAC、UAA、UAU、CA
G、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GA
A、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフである。特定の実施形態では、前
記3塩基モチーフはUAGであり、dRNAは、3塩基モチーフのUの真向かいにあるA
、標的Aの真向かいにあるC、および3塩基モチーフのGの真向かいにあるC、G、また
はUを含む。特定の実施形態では、前記3塩基モチーフは、標的RNAのUAGであり、
前記dRNAは、標的RNAのUAGに対向するACC、ACG、またはACUを含む。
一部の実施形態では、dRNAは、標的RNA中の標的Aの真向かいにあるシチジンミ
スマッチを含む。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列の
中心から20、15、10、5、4、3、2、または1ヌクレオチド以内など、相補的R
NA配列の中心に近い。一部の実施形態では、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列
の5'末端から少なくとも5ヌクレオチド離れている。一部の実施形態において、シチジ
ンミスマッチは、相補的RNA配列の3'末端から少なくとも20ヌクレオチド離れてい
る。
スマッチを含む。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列の
中心から20、15、10、5、4、3、2、または1ヌクレオチド以内など、相補的R
NA配列の中心に近い。一部の実施形態では、シチジンミスマッチは、相補的RNA配列
の5'末端から少なくとも5ヌクレオチド離れている。一部の実施形態において、シチジ
ンミスマッチは、相補的RNA配列の3'末端から少なくとも20ヌクレオチド離れてい
る。
本明細書に記載のdRNA、構築体、ライブラリー、または組成物のいずれか1つによ
る特定の実施形態において、前記dRNAは、約40、45、50、55、60、65、
70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、
170、180、190、200、210、220、230、240、または250を上
回るヌクレオチドのいずれか1つを含む。特定の実施形態において、前記dRNAの長さ
は、約40~260、45~250、50~240、60~230、65~220、70
~220、70~210、70~200、70~190、70~180、70~170、
70~160、70~150、70~140、70~130、70~120、70~11
0、70~100、70~90、70~80、75~200、80~190、85~18
0、90~170、95~160、100~150、または105~140ヌクレオチド
のいずれか1つである。
る特定の実施形態において、前記dRNAは、約40、45、50、55、60、65、
70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、
170、180、190、200、210、220、230、240、または250を上
回るヌクレオチドのいずれか1つを含む。特定の実施形態において、前記dRNAの長さ
は、約40~260、45~250、50~240、60~230、65~220、70
~220、70~210、70~200、70~190、70~180、70~170、
70~160、70~150、70~140、70~130、70~120、70~11
0、70~100、70~90、70~80、75~200、80~190、85~18
0、90~170、95~160、100~150、または105~140ヌクレオチド
のいずれか1つである。
一部の実施形態では、dRNAは、配列番号25~44、142~205、341~3
42のいずれか1つの核酸配列を含む。
42のいずれか1つの核酸配列を含む。
本出願のdRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含む。前記
相補的RNA配列は、標的RNAと完全に相補的または実質的に相補的であり、標的RN
Aへの相補的RNA配列のハイブリダイゼーションを可能にする。一部の実施形態におい
て、前記相補的RNA配列は、標的RNAと100%の配列相補性を有する。一部の実施
形態において、前記相補的RNA配列は、(少なくとも標的RNA中の約20、40、6
0、80、100、150、200、またはそれ以上のヌクレオチドの連続ストレッチ(
stretch)にわたって)少なくとも約70%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、または99%以上のいずれか1つの相補性を有する。一部の実
施形態において、相補的RNA配列と標的RNAとの間のハイブリダイゼーションによっ
て形成されたdsRNAは、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10以上)の非ワトソン-クリック(Watson-Crick)塩基対(すなわち、ミ
スマッチ)を有する。
相補的RNA配列は、標的RNAと完全に相補的または実質的に相補的であり、標的RN
Aへの相補的RNA配列のハイブリダイゼーションを可能にする。一部の実施形態におい
て、前記相補的RNA配列は、標的RNAと100%の配列相補性を有する。一部の実施
形態において、前記相補的RNA配列は、(少なくとも標的RNA中の約20、40、6
0、80、100、150、200、またはそれ以上のヌクレオチドの連続ストレッチ(
stretch)にわたって)少なくとも約70%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、または99%以上のいずれか1つの相補性を有する。一部の実
施形態において、相補的RNA配列と標的RNAとの間のハイブリダイゼーションによっ
て形成されたdsRNAは、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10以上)の非ワトソン-クリック(Watson-Crick)塩基対(すなわち、ミ
スマッチ)を有する。
ADAR、例えば、ヒトADAR酵素は、多くの要因に応じて、異なる特異性を有する
二本鎖RNA(dsRNA)構造を編集する。重要な要素の1つは、dsRNA配列を構
成する2本の鎖の相補性の程度である。前記dRNAと標的RNAの間の完全な相補性に
より、通常、ADARの触媒ドメインが無差別にアデノシンを脱アミ化する。ADARの
特異性と効率は、dsRNA領域にミスマッチを導入することで修飾できる。例えば、編
集されるアデノシンの脱アミノ化の特異性および効率を高めるために、A-Cミスマッチ
が好ましく推奨される。逆に、標的A以外のA(アデノシン)位置(つまり、「非標的A
」)では、G-Aミスマッチによりオフターゲット編集を減らすことができる。前記dR
NAと標的RNAとの間のdsRNAのハイブリダイゼーションおよびdsRNAの生成
に実質的な相補性があれば、dRNAとその標的RNAとの間のdsRNA形成には必ず
しも完全な相補性は必要とされない。一部の実施形態において、dRNA配列またはその
一本鎖RNA領域は、標的RNAとの相補性(最適なアラインメント時)が、配列の少な
くとも約70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または9
9%のうちのいずれか1つである。最適なアラインメントは、配列をアラインメントする
ための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例には
、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wimschアル
ゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム(例えば、Bur
rows Wheeler Aligner)が含まれる。
二本鎖RNA(dsRNA)構造を編集する。重要な要素の1つは、dsRNA配列を構
成する2本の鎖の相補性の程度である。前記dRNAと標的RNAの間の完全な相補性に
より、通常、ADARの触媒ドメインが無差別にアデノシンを脱アミ化する。ADARの
特異性と効率は、dsRNA領域にミスマッチを導入することで修飾できる。例えば、編
集されるアデノシンの脱アミノ化の特異性および効率を高めるために、A-Cミスマッチ
が好ましく推奨される。逆に、標的A以外のA(アデノシン)位置(つまり、「非標的A
」)では、G-Aミスマッチによりオフターゲット編集を減らすことができる。前記dR
NAと標的RNAとの間のdsRNAのハイブリダイゼーションおよびdsRNAの生成
に実質的な相補性があれば、dRNAとその標的RNAとの間のdsRNA形成には必ず
しも完全な相補性は必要とされない。一部の実施形態において、dRNA配列またはその
一本鎖RNA領域は、標的RNAとの相補性(最適なアラインメント時)が、配列の少な
くとも約70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または9
9%のうちのいずれか1つである。最適なアラインメントは、配列をアラインメントする
ための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例には
、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wimschアル
ゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム(例えば、Bur
rows Wheeler Aligner)が含まれる。
標的アデノシンに隣接するヌクレオチドもまた、脱アミノ化の特異性および効率に影響
を及ぼす。例えば、標的RNA配列で編集される標的アデノシンの5'最近傍は、優先度
U>C≒A>Gを有し、標的RNA配列で編集される標的アデノシンの3'最近傍は、ア
デノシンの脱アミノ化の特異性と効率の観点から、優先度G>C>A≒Uを有する。一部
の実施形態において、標的RNA中の標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UA
U、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GA
C、GAA及びGAUからなる群から選択される3塩基モチーフであり得る場合、前記ア
デノシンの脱アミノ化の特異性と効率は、他の3塩基モチーフのアデノシンよりも高い。
一部の実施形態では、編集される標的アデノシンが3塩基モチーフUAG、UAC、UA
A、UAU、CAG、CAC、AAG、AACまたはAAAにある場合、前記アデノシン
の脱アミノ化の効率は、他のモチーフのアデノシンよりも高い。同じ3塩基モチーフに関
して、dRNAの異なるデザインも異なる脱アミノ化効率につながる可能性がある。3塩
基モチーフUAGを例として取り上げると、一部の実施形態において、dRNAが、編集
される標的アデノシンの真向かいのシチジン(C)を含む場合、前記アデノシン(A)は
ウリジンの真向かいにあり、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)
はグアノシンの真向かいにあり、標的アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のdRNA配
列を使用した脱アミノ化の効率よりも高い。一部の実施形態では、dRNAが標的RNA
のUAGに対向するACC、ACGまたはACUを含む場合、前記標的RNAのUAGに
おけるAの編集効率は、約25%~30%に達することができる。
を及ぼす。例えば、標的RNA配列で編集される標的アデノシンの5'最近傍は、優先度
U>C≒A>Gを有し、標的RNA配列で編集される標的アデノシンの3'最近傍は、ア
デノシンの脱アミノ化の特異性と効率の観点から、優先度G>C>A≒Uを有する。一部
の実施形態において、標的RNA中の標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UA
U、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GA
C、GAA及びGAUからなる群から選択される3塩基モチーフであり得る場合、前記ア
デノシンの脱アミノ化の特異性と効率は、他の3塩基モチーフのアデノシンよりも高い。
一部の実施形態では、編集される標的アデノシンが3塩基モチーフUAG、UAC、UA
A、UAU、CAG、CAC、AAG、AACまたはAAAにある場合、前記アデノシン
の脱アミノ化の効率は、他のモチーフのアデノシンよりも高い。同じ3塩基モチーフに関
して、dRNAの異なるデザインも異なる脱アミノ化効率につながる可能性がある。3塩
基モチーフUAGを例として取り上げると、一部の実施形態において、dRNAが、編集
される標的アデノシンの真向かいのシチジン(C)を含む場合、前記アデノシン(A)は
ウリジンの真向かいにあり、シチジン(C)、グアノシン(G)、またはウリジン(U)
はグアノシンの真向かいにあり、標的アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のdRNA配
列を使用した脱アミノ化の効率よりも高い。一部の実施形態では、dRNAが標的RNA
のUAGに対向するACC、ACGまたはACUを含む場合、前記標的RNAのUAGに
おけるAの編集効率は、約25%~30%に達することができる。
標的アデノシンに加えて、標的RNAには1つ以上の編集するのが望ましくないアデノ
シンが存在する可能性がある。これらのアデノシンに関しては、それらの編集効率を可能
な限り低下させることが好ましい。本発明により、グアノシンが標的RNAのアデノシン
の真向かいにある場合、脱アミノ化効率が有意に低下することが見出された。したがって
、オフターゲット脱アミノ化を減少させるために、dRNAは、標的RNAで編集される
標的アデノシン以外の1つ以上のアデノシンの真向かいにある1つ以上のグアノシンを含
むように設計することができる。
シンが存在する可能性がある。これらのアデノシンに関しては、それらの編集効率を可能
な限り低下させることが好ましい。本発明により、グアノシンが標的RNAのアデノシン
の真向かいにある場合、脱アミノ化効率が有意に低下することが見出された。したがって
、オフターゲット脱アミノ化を減少させるために、dRNAは、標的RNAで編集される
標的アデノシン以外の1つ以上のアデノシンの真向かいにある1つ以上のグアノシンを含
むように設計することができる。
標的RNA配列を編集する際の特異性と効率の望ましいレベルは、さまざまなアプリケ
ーションによって異なる。本特許出願の説明に従って、当業者は、必要に応じて標的RN
A配列に相補的または実質的に相補的な配列を有するdRNAを設計することができ、ま
た、試行錯誤を繰り返しながら、所望の結果を取得できる。本明細書で使用されるように
、「ミスマッチ」という用語は、ワトソン-クリック(Watson-Crick)の塩
基対形成規則に従って完全な塩基対を形成しない二本鎖RNA(dsRNA)中の対向す
るヌクレオチドを指す。ミスマッチの塩基対には、例えば、G-A、C-A、U-C、A
-A、G-G、C-C、U-U塩基対が含まれる。A-Cマッチを例にとると、標的Aが
標的RNAで編集される場合、dRNAは、編集されるAに対向するCを含むように設計
され、標的RNAとdRNAの間のハイブリダイゼーションによって形成されたdsRN
AにおいてA-Cミスマッチを生成する。
ーションによって異なる。本特許出願の説明に従って、当業者は、必要に応じて標的RN
A配列に相補的または実質的に相補的な配列を有するdRNAを設計することができ、ま
た、試行錯誤を繰り返しながら、所望の結果を取得できる。本明細書で使用されるように
、「ミスマッチ」という用語は、ワトソン-クリック(Watson-Crick)の塩
基対形成規則に従って完全な塩基対を形成しない二本鎖RNA(dsRNA)中の対向す
るヌクレオチドを指す。ミスマッチの塩基対には、例えば、G-A、C-A、U-C、A
-A、G-G、C-C、U-U塩基対が含まれる。A-Cマッチを例にとると、標的Aが
標的RNAで編集される場合、dRNAは、編集されるAに対向するCを含むように設計
され、標的RNAとdRNAの間のハイブリダイゼーションによって形成されたdsRN
AにおいてA-Cミスマッチを生成する。
一部の実施形態において、dRNAと標的RNAとの間のハイブリダイゼーションによ
って形成されたdsRNAは、ミスマッチを含まない。一部の実施形態において、dRN
Aと標的RNAとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるdsRNAは、1つ
以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7またはそれ以上のミスマッチ(例えば、異な
るタイプのミスマッチにおける同じタイプのミスマッチ)を含む。一部の実施形態におい
て、dRNAと標的RNAとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるdsRN
Aは、1つ以上の種類のミスマッチ、例えば、G-A、C-A、U-C、A-A、G-G
、C-C、及びU-Uからなる群から選択される1、2、3、4、5、6、7種類のミス
マッチを含む。
って形成されたdsRNAは、ミスマッチを含まない。一部の実施形態において、dRN
Aと標的RNAとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるdsRNAは、1つ
以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7またはそれ以上のミスマッチ(例えば、異な
るタイプのミスマッチにおける同じタイプのミスマッチ)を含む。一部の実施形態におい
て、dRNAと標的RNAとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるdsRN
Aは、1つ以上の種類のミスマッチ、例えば、G-A、C-A、U-C、A-A、G-G
、C-C、及びU-Uからなる群から選択される1、2、3、4、5、6、7種類のミス
マッチを含む。
dRNAと標的RNAの間のハイブリダイゼーションによって形成されたdsRNAの
ミスマッチヌクレオチドはバルジを形成することができ、これは標的RNAの編集の効率
を促進することができる。ミスマッチによって形成される1つ以上のバルジ(標的アデノ
シンでのみ形成される)が存在する可能性がある。追加のバルジを誘発するミスマッチは
、標的アデノシンの上流および/または下流にあり得る。前記バルジは、単一のミスマッ
チのバルジ(1つのミスマッチの塩基対によって引き起こされる)または複数のミスマッ
チのバルジ(複数の連続するミスマッチの塩基対、好ましくは2つまたは3つの連続する
ミスマッチの塩基対によって引き起こされる)であってもよい。
ミスマッチヌクレオチドはバルジを形成することができ、これは標的RNAの編集の効率
を促進することができる。ミスマッチによって形成される1つ以上のバルジ(標的アデノ
シンでのみ形成される)が存在する可能性がある。追加のバルジを誘発するミスマッチは
、標的アデノシンの上流および/または下流にあり得る。前記バルジは、単一のミスマッ
チのバルジ(1つのミスマッチの塩基対によって引き起こされる)または複数のミスマッ
チのバルジ(複数の連続するミスマッチの塩基対、好ましくは2つまたは3つの連続する
ミスマッチの塩基対によって引き起こされる)であってもよい。
dRNA中の相補的RNA配列は一本鎖である。前記dRNAは、完全に一本鎖である
か、1つ以上(例えば、1、2、3、またはそれ以上)の二本鎖領域および/または1つ
以上のステムループ領域を有し得る。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、少
なくとも約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、1
10、120、130、140、150、160、170、180、190、200また
はそれ以上のヌクレオチドのうちのいずれか1つである。特定の実施形態において、相補
的RNA配列は、40~260、45~250、50~240、60~230、65~2
20、70~220、70~210、70~200、70~190、70~180、70
~170、70~160、70~150、70~140、70~130、70~120、
70~110、70~100、70~90、70~80、75~200、80~190、
85~180、90~170、95~160、100~200、100~150、100
~175、110~200、110~175、110~150、または105~140ヌ
クレオチドの長さを有する。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、約71ヌク
レオチド長である。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、約111ヌクレオチ
ド長である。
か、1つ以上(例えば、1、2、3、またはそれ以上)の二本鎖領域および/または1つ
以上のステムループ領域を有し得る。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、少
なくとも約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、1
10、120、130、140、150、160、170、180、190、200また
はそれ以上のヌクレオチドのうちのいずれか1つである。特定の実施形態において、相補
的RNA配列は、40~260、45~250、50~240、60~230、65~2
20、70~220、70~210、70~200、70~190、70~180、70
~170、70~160、70~150、70~140、70~130、70~120、
70~110、70~100、70~90、70~80、75~200、80~190、
85~180、90~170、95~160、100~200、100~150、100
~175、110~200、110~175、110~150、または105~140ヌ
クレオチドの長さを有する。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、約71ヌク
レオチド長である。一部の実施形態において、相補的RNA配列は、約111ヌクレオチ
ド長である。
一部の実施形態において、dRNAは、相補的RNA配列の他に、dRNAを安定化す
るための領域、例えば、1つ以上の二本鎖領域および/またはステムループ領域をさらに
含むことができる。一部の実施形態において、dRNAの二本鎖領域またはステムループ
領域は、約200、150、100、50、40、30、20、10またはそれ以下の塩
基対のうちの1つを含むことができる。一部の実施形態において、dRNAは、ステムル
ープまたは二本鎖領域を含まない。一部の実施形態では、dRNAは、ADAR動員ドメ
インを含む。一部の実施形態では、dRNAは、ADAR動員ドメインを含まない。
るための領域、例えば、1つ以上の二本鎖領域および/またはステムループ領域をさらに
含むことができる。一部の実施形態において、dRNAの二本鎖領域またはステムループ
領域は、約200、150、100、50、40、30、20、10またはそれ以下の塩
基対のうちの1つを含むことができる。一部の実施形態において、dRNAは、ステムル
ープまたは二本鎖領域を含まない。一部の実施形態では、dRNAは、ADAR動員ドメ
インを含む。一部の実施形態では、dRNAは、ADAR動員ドメインを含まない。
dRNAは、1つ以上の修飾を含み得る。一部の実施形態において、dRNAは、核酸
塩基修飾および/または骨格修飾を含む、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを有する。
RNAへの例示的な修飾には、ホスホロチオエート骨格修飾、リボース中の2'-置換(
2'-O-メチルおよび2'-フルオロ置換など)、LNA、およびL-RNAが含まれる
が、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記dRNAは、核酸塩基または
骨格に対する修飾を有さない。
塩基修飾および/または骨格修飾を含む、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを有する。
RNAへの例示的な修飾には、ホスホロチオエート骨格修飾、リボース中の2'-置換(
2'-O-メチルおよび2'-フルオロ置換など)、LNA、およびL-RNAが含まれる
が、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記dRNAは、核酸塩基または
骨格に対する修飾を有さない。
本出願はまた、本明細書に記載のdRNAを含む構築体を考慮する。本明細書で使用さ
れる「構築体」という用語は、RNAに転写されるかまたはタンパク質に発現され得るコ
ードヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子を指す。一部の実施形態において、
前記構築体は、RNAまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結
された1つ以上の調節エレメントを含む。前記構築体が宿主細胞に導入されると、適切な
条件下で、前記構築体中のコードヌクレオチド配列が転写または発現され得る。
れる「構築体」という用語は、RNAに転写されるかまたはタンパク質に発現され得るコ
ードヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子を指す。一部の実施形態において、
前記構築体は、RNAまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結
された1つ以上の調節エレメントを含む。前記構築体が宿主細胞に導入されると、適切な
条件下で、前記構築体中のコードヌクレオチド配列が転写または発現され得る。
一部の実施形態において、前記構築体は、プロモーターがコードヌクレオチド配列の転
写または発現を制御するように、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結されているか
、または空間的に連結されているプロモーターを含む。前記プロモーターは、その制御下
にあるコードヌクレオチド配列の5'(上流)に位置することができる。前記プロモータ
ーとコード配列との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターに由来する遺伝子に
おいてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであってもよい。本分野で知られて
いるように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。一部の
実施形態において、前記構築体は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する
5'UTRおよび/または3'UTRを含む。
写または発現を制御するように、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結されているか
、または空間的に連結されているプロモーターを含む。前記プロモーターは、その制御下
にあるコードヌクレオチド配列の5'(上流)に位置することができる。前記プロモータ
ーとコード配列との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターに由来する遺伝子に
おいてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであってもよい。本分野で知られて
いるように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。一部の
実施形態において、前記構築体は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する
5'UTRおよび/または3'UTRを含む。
一部の実施形態において、前記構築体は、本出願において開示されるdRNAのいずれ
か1つをコードするベクターである。「ベクター」という用語は、それが連結されている
別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。前記ベクターには、一本鎖、二本鎖、
または部分的に二本鎖である核酸分子;1つ以上の自由端を含み、自由端を含まない(例
えば、環状)核酸分子;DNA、RNA、またはその両方を含む核酸分子;および本分野
で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベク
ターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術な
どによって、追加のDNAセグメントを挿入できる環状の二本鎖DNAループを指す。特
定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる(例え
ば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベ
クター(例えば、非エピソマル哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入後に宿主細胞の
ゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクタ
ーは、それらが作動可能に連結されているコードヌクレオチド配列の転写または発現を指
導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる
。
か1つをコードするベクターである。「ベクター」という用語は、それが連結されている
別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。前記ベクターには、一本鎖、二本鎖、
または部分的に二本鎖である核酸分子;1つ以上の自由端を含み、自由端を含まない(例
えば、環状)核酸分子;DNA、RNA、またはその両方を含む核酸分子;および本分野
で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベク
ターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術な
どによって、追加のDNAセグメントを挿入できる環状の二本鎖DNAループを指す。特
定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる(例え
ば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベ
クター(例えば、非エピソマル哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入後に宿主細胞の
ゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクタ
ーは、それらが作動可能に連結されているコードヌクレオチド配列の転写または発現を指
導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる
。
前記組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の転写または発現に適した形態の本
発明の核酸を含むことができる。一部の実施形態において、前記組換え発現ベクターは、
転写または発現される核酸配列に作動可能に連結される、転写または発現に使用される宿
主細胞に基づいて選択され得る1つ以上の調節エレメントを含む。前記組換え発現ベクタ
ー内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列
の発現を可能にする方法で調節エレメントに連結されていることを意味することを意図す
る(例えば、インビトロ、またはベクターが宿主細胞に導入された場合の宿主細胞内の転
写/翻訳システムにおいて)。
発明の核酸を含むことができる。一部の実施形態において、前記組換え発現ベクターは、
転写または発現される核酸配列に作動可能に連結される、転写または発現に使用される宿
主細胞に基づいて選択され得る1つ以上の調節エレメントを含む。前記組換え発現ベクタ
ー内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列
の発現を可能にする方法で調節エレメントに連結されていることを意味することを意図す
る(例えば、インビトロ、またはベクターが宿主細胞に導入された場合の宿主細胞内の転
写/翻訳システムにおいて)。
一部の実施形態において、dRNAをコードするヌクレオチド配列を含む構築体(例え
ば、ウイルスベクターなどのベクター)が提供される。一部の実施形態において、前記A
DARをコードするヌクレオチド配列を含む構築体(例えば、ウイルスベクターなどのベ
クター)が提供される。一部の実施形態において、前記dRNAをコードする第1のヌク
レオチド配列および前記ADARをコードする第2のヌクレオチド配列を含む構築体が提
供される。一部の実施形態において、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド
配列は、同じプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、第1
のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに作動可能に
連結されている。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実
施形態では、前記構築体は、ADARをコードしない。一部の実施形態において、ベクタ
ーは、ADAR3の阻害剤(例えば、ADAR3 shRNAまたはsiRNA)および
/またはインターフェロンのスティミュレーター(例えば、IFN-α)をコードする核
酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、構築体は、AAV8などのAAVである。
ば、ウイルスベクターなどのベクター)が提供される。一部の実施形態において、前記A
DARをコードするヌクレオチド配列を含む構築体(例えば、ウイルスベクターなどのベ
クター)が提供される。一部の実施形態において、前記dRNAをコードする第1のヌク
レオチド配列および前記ADARをコードする第2のヌクレオチド配列を含む構築体が提
供される。一部の実施形態において、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド
配列は、同じプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、第1
のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに作動可能に
連結されている。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実
施形態では、前記構築体は、ADARをコードしない。一部の実施形態において、ベクタ
ーは、ADAR3の阻害剤(例えば、ADAR3 shRNAまたはsiRNA)および
/またはインターフェロンのスティミュレーター(例えば、IFN-α)をコードする核
酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、構築体は、AAV8などのAAVである。
治療方法
本明細書に記載のRNA編集方法および組成物は、遺伝性遺伝子疾患および薬剤耐性を
含むがこれらに限定されない、個体の疾患または病症を治療または予防するために使用す
ることができる。
本明細書に記載のRNA編集方法および組成物は、遺伝性遺伝子疾患および薬剤耐性を
含むがこれらに限定されない、個体の疾患または病症を治療または予防するために使用す
ることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のRNA編集方法のいずれか1つを使用して標的
RNAを編集することを含む、エクスビボで個体(例えば、ヒト個体)の細胞内の標的R
NAを編集する方法が提供される。
RNAを編集することを含む、エクスビボで個体(例えば、ヒト個体)の細胞内の標的R
NAを編集する方法が提供される。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体の細胞に
導入することを含み、エクスビボで個体(例えば、ヒト個体)の細胞において標的RNA
を編集する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする
相補的RNA配列を含み、前記dRNAはADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱
アミノ化することができる。一部の実施形態において、前記標的RNAは、個体の疾患ま
たは病症に関連している。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾
患、または1つ以上の後天性遺伝子突然変異(例えば、薬剤耐性)に関連する疾患または
病症である。一部の実施形態では、この方法は、個体から細胞を取得することをさらに含
む。
導入することを含み、エクスビボで個体(例えば、ヒト個体)の細胞において標的RNA
を編集する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする
相補的RNA配列を含み、前記dRNAはADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱
アミノ化することができる。一部の実施形態において、前記標的RNAは、個体の疾患ま
たは病症に関連している。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾
患、または1つ以上の後天性遺伝子突然変異(例えば、薬剤耐性)に関連する疾患または
病症である。一部の実施形態では、この方法は、個体から細胞を取得することをさらに含
む。
一部の実施形態において、本明細書に記載のRNA編集方法のいずれか1つを使用して
標的RNAを編集することを含む、疾患または病症を有する個体の細胞において標的RN
Aまたは標的RNAによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復する方法が
提供され、ここで、標的RNAは、疾患または病症に関連するGからAへの突然変異を有
する。一部の実施形態では、この方法は、エクスビボで個体から単離された細胞に対して
実施される。一部の実施形態では、この方法はインビボで実施される。
標的RNAを編集することを含む、疾患または病症を有する個体の細胞において標的RN
Aまたは標的RNAによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復する方法が
提供され、ここで、標的RNAは、疾患または病症に関連するGからAへの突然変異を有
する。一部の実施形態では、この方法は、エクスビボで個体から単離された細胞に対して
実施される。一部の実施形態では、この方法はインビボで実施される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のRNA編集方法のいずれか1つを使用して個体
の細胞内の疾患または病症に関連する標的RNAを編集することを含む、個体(例えば、
ヒト個体)の疾患または病症を治療または予防する方法が提供される。
の細胞内の疾患または病症に関連する標的RNAを編集することを含む、個体(例えば、
ヒト個体)の疾患または病症を治療または予防する方法が提供される。
一部の実施形態において、エクスビボで個体の単離された細胞にdRNAまたはdRN
Aをコードする構築体を導入することを含む、個体(例えば、ヒト個体)における疾患ま
たは病症を治療または予防する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、疾患または病
症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAは
、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化することができる。一部の実施
形態において、前記ADARは、単離された細胞において内因的に発現されるADARで
ある。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を
単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたR
NAを有する細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、編集
されたRNAを有する細胞を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前
記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または1つ以上の後天性遺伝子突然変異(例え
ば、薬剤耐性)に関連する疾患または病症である。
Aをコードする構築体を導入することを含む、個体(例えば、ヒト個体)における疾患ま
たは病症を治療または予防する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、疾患または病
症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAは
、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化することができる。一部の実施
形態において、前記ADARは、単離された細胞において内因的に発現されるADARで
ある。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を
単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたR
NAを有する細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、編集
されたRNAを有する細胞を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前
記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または1つ以上の後天性遺伝子突然変異(例え
ば、薬剤耐性)に関連する疾患または病症である。
一部の実施形態において、エクスビボで個体の単離された細胞にdRNAまたはdRN
Aをコードする構築体を導入することを含む、個体(例えば、ヒト個体)における疾患ま
たは病症を治療または予防する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、疾患または病
症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAは
、宿主細胞の内因的に発現されたADARを動員して、前記標的RNA中の標的Aを脱ア
ミノ化することができる。一部の実施形態では、この方法は、編集されたRNAを有する
細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたRNA
を有する細胞を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前記疾患または
病症は、遺伝性遺伝子疾患、または1つ以上の後天性遺伝子突然変異(例えば、薬剤耐性
)に関連する疾患または病症である。
Aをコードする構築体を導入することを含む、個体(例えば、ヒト個体)における疾患ま
たは病症を治療または予防する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、疾患または病
症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAは
、宿主細胞の内因的に発現されたADARを動員して、前記標的RNA中の標的Aを脱ア
ミノ化することができる。一部の実施形態では、この方法は、編集されたRNAを有する
細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたRNA
を有する細胞を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前記疾患または
病症は、遺伝性遺伝子疾患、または1つ以上の後天性遺伝子突然変異(例えば、薬剤耐性
)に関連する疾患または病症である。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体(例えば、ヒト個体)における疾患または病症を治療または
予防する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、疾患または病症に関連する標的RN
Aにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAがADARを動員して標
的RNA中の標的Aを脱アミノ化することができる。一部の実施形態において、前記AD
ARは、個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、
この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。
一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または1つ以上の後天
性遺伝子突然変異(例えば、薬剤耐性)に関連する疾患または病症である。
に投与することを含む、個体(例えば、ヒト個体)における疾患または病症を治療または
予防する方法が提供され、ここで、前記dRNAは、疾患または病症に関連する標的RN
Aにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記dRNAがADARを動員して標
的RNA中の標的Aを脱アミノ化することができる。一部の実施形態において、前記AD
ARは、個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、
この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。
一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または1つ以上の後天
性遺伝子突然変異(例えば、薬剤耐性)に関連する疾患または病症である。
本願の方法を使用した治療に適した疾患及び病症は、RNA転写物におけるミスセンス
変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的なスプライシングを引き起
こすGからAへの突然変異のような変異に関連する疾患を含む。本出願の方法によって回
復され得る疾患関連突然変異の例には、癌に関連するTP53W53X(例えば、158
G>A)、I型ムコ多糖症(MPS I)に関連するIDUAW402X(例えば、エク
ソン9におけるTGG>TAG突然変異)、エーラース・ダンロス症候群に関連するCO
L3A1W1278X(例、3833G>A突然変異)、原発性肺高血圧症に関連するB
MPR2W298X(例、893G>A)、ジュベール症候群に関連するAHI1W72
5X(例、2174G>A)症候群、ファンコニ貧血に関連するFANCCW506X(
例、1517G>A)、原発性家族性肥大性心筋症に関連するMYBPC3W1098X
(例、3293G>A)、およびX連鎖重症複合免疫不全症に関連するIL2RGW23
7X(例、710G>A)が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、
疾患または病症は癌である。一部の実施形態では、疾患または病症は単一遺伝子疾患であ
る。一部の実施形態では、疾患または病症は多遺伝子性疾患である。
変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的なスプライシングを引き起
こすGからAへの突然変異のような変異に関連する疾患を含む。本出願の方法によって回
復され得る疾患関連突然変異の例には、癌に関連するTP53W53X(例えば、158
G>A)、I型ムコ多糖症(MPS I)に関連するIDUAW402X(例えば、エク
ソン9におけるTGG>TAG突然変異)、エーラース・ダンロス症候群に関連するCO
L3A1W1278X(例、3833G>A突然変異)、原発性肺高血圧症に関連するB
MPR2W298X(例、893G>A)、ジュベール症候群に関連するAHI1W72
5X(例、2174G>A)症候群、ファンコニ貧血に関連するFANCCW506X(
例、1517G>A)、原発性家族性肥大性心筋症に関連するMYBPC3W1098X
(例、3293G>A)、およびX連鎖重症複合免疫不全症に関連するIL2RGW23
7X(例、710G>A)が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、
疾患または病症は癌である。一部の実施形態では、疾患または病症は単一遺伝子疾患であ
る。一部の実施形態では、疾患または病症は多遺伝子性疾患である。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体の単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A突
然変異)を有する標的RNAに関連する癌を治療する方法が提供され、ここで、dRNA
は標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、dRNAはADARを動員
して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによって標的RNA中の突然変異を救う
ことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離された細胞において内因的に
発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADAR
をコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、
標的RNAは、TP53W53X(例えば、158G>A)である。一部の実施形態にお
いて、dRNAは、配列番号195、196または197の核酸配列を含む。
個体の単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A突
然変異)を有する標的RNAに関連する癌を治療する方法が提供され、ここで、dRNA
は標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、dRNAはADARを動員
して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによって標的RNA中の突然変異を救う
ことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離された細胞において内因的に
発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADAR
をコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、
標的RNAは、TP53W53X(例えば、158G>A)である。一部の実施形態にお
いて、dRNAは、配列番号195、196または197の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNAを使
用して癌を治療または予防する方法が提供される。ここで、dRNAは、疾患または病症
に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、dRNAは、AD
ARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより標的RNAの突然変異
を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の細胞において内因的
に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADA
Rをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的RN
Aは、TP53W53X(例えば、158G>A)である。一部の実施形態において、d
RNAは、配列番号195、196または197の核酸配列を含む。
に投与することを含む、個体に変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNAを使
用して癌を治療または予防する方法が提供される。ここで、dRNAは、疾患または病症
に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、dRNAは、AD
ARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより標的RNAの突然変異
を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の細胞において内因的
に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、ADARまたはADA
Rをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的RN
Aは、TP53W53X(例えば、158G>A)である。一部の実施形態において、d
RNAは、配列番号195、196または197の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体の単離された細胞に導入することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異
)を有する標的RNAに関連するMPS I(例えば、ハーラー(Hurler)症候群
またはシャイエ(Scheie)症候群)を治療する方法が提供され、ここで、dRNA
は、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そしてdRNAは、AD
ARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによって、標的RNAの突
然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離された細胞にお
いて内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、ADARま
たはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形
態において、標的RNAは、IDUAW402X(例えば、エクソン9におけるTGG>
TAG突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号204または
205の核酸配列を含む。
個体の単離された細胞に導入することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異
)を有する標的RNAに関連するMPS I(例えば、ハーラー(Hurler)症候群
またはシャイエ(Scheie)症候群)を治療する方法が提供され、ここで、dRNA
は、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そしてdRNAは、AD
ARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによって、標的RNAの突
然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離された細胞にお
いて内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、ADARま
たはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形
態において、標的RNAは、IDUAW402X(例えば、エクソン9におけるTGG>
TAG突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号204または
205の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を使用してMPS I(例えば、ハーラー(Hurler)症候群またはシャイエ(Sc
heie)症候群)を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、疾患ま
たは病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そしてd
RNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによって標
的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の
細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、A
DARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態
において、標的RNAは、IDUAW402X(例えば、エクソン9におけるTGG>T
AG突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号204または2
05の核酸配列を含む。
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を使用してMPS I(例えば、ハーラー(Hurler)症候群またはシャイエ(Sc
heie)症候群)を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、疾患ま
たは病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そしてd
RNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによって標
的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の
細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、A
DARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態
において、標的RNAは、IDUAW402X(例えば、エクソン9におけるTGG>T
AG突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号204または2
05の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体の単離された細胞に導入することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異
)を有する標的RNAに関連するエーラース-ダンロス症候群を治療または予防する方法
が提供され、ここで、dRNAが標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含
み、dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによ
り、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは
、単離された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、こ
の方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入すること
を含む。一部の実施形態において、標的RNAは、COL3A1W1278X(例えば、
3833G>A突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号19
8の核酸配列を含む。
個体の単離された細胞に導入することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異
)を有する標的RNAに関連するエーラース-ダンロス症候群を治療または予防する方法
が提供され、ここで、dRNAが標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含
み、dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによ
り、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは
、単離された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、こ
の方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入すること
を含む。一部の実施形態において、標的RNAは、COL3A1W1278X(例えば、
3833G>A突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号19
8の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてエーラース・ダンロス症候群を治療または予防する方法が提供され、ここで、d
RNAは、疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列
を含み、dRNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それに
より、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADAR
は、個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この
方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部
の実施形態において、標的RNAは、COL3A1W1278X(例えば、3833G>
A突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号198の核酸配列
を含む。
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてエーラース・ダンロス症候群を治療または予防する方法が提供され、ここで、d
RNAは、疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列
を含み、dRNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それに
より、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADAR
は、個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この
方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部
の実施形態において、標的RNAは、COL3A1W1278X(例えば、3833G>
A突然変異)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号198の核酸配列
を含む。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連する原発性肺高血圧症を治療する方法が提供され、
ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そして
dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、
標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離
された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法
は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む
。一部の実施形態において、標的RNAは、BMPR2W298X(例えば、893G>
A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号199の核酸配列を含む。
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連する原発性肺高血圧症を治療する方法が提供され、
ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そして
dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、
標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離
された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法
は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む
。一部の実施形態において、標的RNAは、BMPR2W298X(例えば、893G>
A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号199の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いて原発性肺高血圧症を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、
疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、d
RNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標的
RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の
細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、A
DARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態
において、標的RNAは、BMPR2W298X(例えば、893G>A)である。一部
の実施形態において、dRNAは、配列番号199の核酸配列を含む。
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いて原発性肺高血圧症を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、
疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、d
RNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標的
RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の
細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、A
DARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態
において、標的RNAは、BMPR2W298X(例えば、893G>A)である。一部
の実施形態において、dRNAは、配列番号199の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連するジュベール症候群を治療する方法が提供され、
ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そして
dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、
標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離
された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法
は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む
。一部の実施形態において、標的RNAは、AH11W725X(例えば、2174G>
A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号200の核酸配列を含む。
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連するジュベール症候群を治療する方法が提供され、
ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そして
dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、
標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離
された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法
は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む
。一部の実施形態において、標的RNAは、AH11W725X(例えば、2174G>
A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号200の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてジュベール症候群を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、
疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、d
RNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標的
RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の
細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、A
DARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態
において、標的RNAは、AH11W725X(例えば、2174G>A)である。一部
の実施形態において、dRNAは、配列番号200の核酸配列を含む。
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてジュベール症候群を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、
疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、d
RNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標的
RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の
細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、A
DARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態
において、標的RNAは、AH11W725X(例えば、2174G>A)である。一部
の実施形態において、dRNAは、配列番号200の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連するファンコニ貧血を治療する方法が提供され、こ
こで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そしてd
RNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標
的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離さ
れた細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は
、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。
一部の実施形態において、標的RNAは、FANCCW506X(例えば、1517G>
A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号201の核酸配列を含む。
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連するファンコニ貧血を治療する方法が提供され、こ
こで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、そしてd
RNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標
的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、単離さ
れた細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は
、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。
一部の実施形態において、標的RNAは、FANCCW506X(例えば、1517G>
A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号201の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてファンコニ貧血を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、疾
患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、dR
NAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標的R
NA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の細
胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、AD
ARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態に
おいて、標的RNAは、FANCCW506X(例えば、1517G>A)である。一部
の実施形態において、dRNAは、配列番号201の核酸配列を含む。
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてファンコニ貧血を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRNAは、疾
患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、dR
NAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより、標的R
NA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、個体の細
胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法は、AD
ARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態に
おいて、標的RNAは、FANCCW506X(例えば、1517G>A)である。一部
の実施形態において、dRNAは、配列番号201の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法が提
供され、ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み
、そしてdRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それ
により、標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADAR
は、単離された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、
この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入するこ
とを含む。一部の実施形態において、標的RNAは、MYBPC3W1098X(例えば
、3293G>A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号202の核
酸配列を含む。
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法が提
供され、ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み
、そしてdRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それ
により、標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADAR
は、単離された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、
この方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入するこ
とを含む。一部の実施形態において、標的RNAは、MYBPC3W1098X(例えば
、3293G>A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号202の核
酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いて原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防する方法が提供され、ここで、dR
NAは、疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を
含み、dRNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによ
り、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは
、個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方
法は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の
実施形態において、標的RNAは、MYBPC3W1098X(例えば、3293G>A
)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号202の核酸配列を含む。
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いて原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防する方法が提供され、ここで、dR
NAは、疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を
含み、dRNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それによ
り、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは
、個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方
法は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の
実施形態において、標的RNAは、MYBPC3W1098X(例えば、3293G>A
)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号202の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、dRNAまたはdRNAをコードする構築体をエクスビボで
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連するX連鎖重症複合免疫不全を治療する方法が提供
され、ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、
そしてdRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それに
より、標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは
、単離された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、こ
の方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入すること
を含む。一部の実施形態において、標的RNAは、IL2RGW237X(例えば、71
0G>A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号203の核酸配列を
含む。
個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異(例えば、G>A
突然変異)を有する標的RNAに関連するX連鎖重症複合免疫不全を治療する方法が提供
され、ここで、dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、
そしてdRNAは、ADARを動員して、標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それに
より、標的RNAの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは
、単離された細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、こ
の方法は、ADARまたはADARをコードする構築体を単離された細胞に導入すること
を含む。一部の実施形態において、標的RNAは、IL2RGW237X(例えば、71
0G>A)である。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号203の核酸配列を
含む。
一部の実施形態において、有効量のdRNAまたはdRNAをコードする構築体を個体
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてX連鎖重症複合免疫不全を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRN
Aは、疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含
み、dRNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより
、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、
個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法
は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実
施形態において、標的RNAは、IL2RGW237X(例えば、710G>A)である
。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号203の核酸配列を含む。
に投与することを含む、個体に突然変異(例えば、G>A突然変異)を有する標的RNA
を用いてX連鎖重症複合免疫不全を治療または予防する方法が提供され、ここで、dRN
Aは、疾患または病症に関連する標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含
み、dRNAは、ADARを動員して標的RNA中の標的Aを脱アミノ化し、それにより
、標的RNA中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ADARは、
個体の細胞において内因的に発現されるADARである。一部の実施形態では、この方法
は、ADARまたはADARをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実
施形態において、標的RNAは、IL2RGW237X(例えば、710G>A)である
。一部の実施形態において、dRNAは、配列番号203の核酸配列を含む。
本明細書で使用されるように、「治療(treatment)」または「治療(tre
ating)」は、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチで
ある。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、疾患に起因するもう1
つの症状の減少、疾患の程度の減少、疾患の安定化(例えば、疾患の悪化の予防または疾
患の悪化の遅延)、疾患の広がり(例えば、転移)の予防または遅延、疾患の発生または
再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または緩慢、病状の改善、疾患の寛解の提供(
部分的であろうと全体的であろうと)、病気を治療するために必要な1つ以上の他の薬剤
の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上および/または生存期間の延長からな
る群より選ばれる1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。「治療」には、疾患ま
たは病症の病理学的結果の軽減も含まれる。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいず
れか1つ以上を考慮している。
ating)」は、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチで
ある。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、疾患に起因するもう1
つの症状の減少、疾患の程度の減少、疾患の安定化(例えば、疾患の悪化の予防または疾
患の悪化の遅延)、疾患の広がり(例えば、転移)の予防または遅延、疾患の発生または
再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または緩慢、病状の改善、疾患の寛解の提供(
部分的であろうと全体的であろうと)、病気を治療するために必要な1つ以上の他の薬剤
の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上および/または生存期間の延長からな
る群より選ばれる1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。「治療」には、疾患ま
たは病症の病理学的結果の軽減も含まれる。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいず
れか1つ以上を考慮している。
「個体」、「被験者」および「患者」という用語は、本明細書では、ヒトを含む哺乳動
物を説明するために置き換えて使用されるができる。個体には、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ
、イヌ、げっ歯類動物、または霊長類動物が含まれるが、これらに限定されない。一部の
実施形態では、前記個体はヒトである。一部の実施形態では、前記個体は、薬剤耐性など
の疾患または病症を有する。一部の実施形態では、前記個体は治療を必要としている。
物を説明するために置き換えて使用されるができる。個体には、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ
、イヌ、げっ歯類動物、または霊長類動物が含まれるが、これらに限定されない。一部の
実施形態では、前記個体はヒトである。一部の実施形態では、前記個体は、薬剤耐性など
の疾患または病症を有する。一部の実施形態では、前記個体は治療を必要としている。
本分野で理解されるように、「有効量」とは、所望の治療結果(例えば、疾患または病
症の1つ以上の症状の重症度の低減または期間の短縮、疾患または病症の1つ以上の症状
の重症度の安定化、または疾患または病症の1つ以上の症状の排除)を生み出すのに十分
な組成物(例えば、dRNAまたはこのdRNAをコードする構築体)の量を指す。治療
的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、例えば、疾患の発症中に現れるその合併症
および中間の病理学的表現型を含む、疾患に起因する1つ以上の症状(生化学的、組織学
的および/または行動学的)の減少が含まれ、これは、そのような疾患または病症を有す
る人の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の薬剤の投与量の低減、別の薬剤
の効果の増強、疾患の進行の遅延、及び/または患者の生存の延長を含む。
症の1つ以上の症状の重症度の低減または期間の短縮、疾患または病症の1つ以上の症状
の重症度の安定化、または疾患または病症の1つ以上の症状の排除)を生み出すのに十分
な組成物(例えば、dRNAまたはこのdRNAをコードする構築体)の量を指す。治療
的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、例えば、疾患の発症中に現れるその合併症
および中間の病理学的表現型を含む、疾患に起因する1つ以上の症状(生化学的、組織学
的および/または行動学的)の減少が含まれ、これは、そのような疾患または病症を有す
る人の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の薬剤の投与量の低減、別の薬剤
の効果の増強、疾患の進行の遅延、及び/または患者の生存の延長を含む。
一般に、組成物(例えば、dRNAまたはこのdRNAをコードする構築体)の投与量
、スケジュール、および投与経路は、個体のサイズおよび状態に従って、そして標準的な
製薬実践に従って決定されることができる。例示的な投与経路には、静脈内、動脈内、腹
腔内、肺内、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、または経皮が含まれる。
、スケジュール、および投与経路は、個体のサイズおよび状態に従って、そして標準的な
製薬実践に従って決定されることができる。例示的な投与経路には、静脈内、動脈内、腹
腔内、肺内、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、または経皮が含まれる。
本出願のRNA編集方法は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞で使用できるだけでなく、
植物または真菌のRNA、例えば、内因的にADARを発現する植物または真菌のRNA
の修飾にも使用することができる。本明細書に記載の方法は、改善された特性を有する遺
伝子操作された植物および真菌を生成するために使用することができる。
植物または真菌のRNA、例えば、内因的にADARを発現する植物または真菌のRNA
の修飾にも使用することができる。本明細書に記載の方法は、改善された特性を有する遺
伝子操作された植物および真菌を生成するために使用することができる。
組成物、キットおよび製品
本明細書はさらに、dRNA、構築体、ライブラリー、または本明細書に記載のように
編集されたRNAを有するまたは宿主細胞のいずれか1つを含む組成物(医薬組成物など
)を提供する。
本明細書はさらに、dRNA、構築体、ライブラリー、または本明細書に記載のように
編集されたRNAを有するまたは宿主細胞のいずれか1つを含む組成物(医薬組成物など
)を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のdRNAまたは該dRNAをコードする構築体
のいずれか1つ、および薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む医薬組成物
が提供される。例示的な薬学的に許容される担体、賦形剤および安定剤は、例えば、Re
mington’s Pharmaceutical Sciences第16版、Os
ol,A.Ed.(1980)に記載されている。許容される担体、賦形剤、または安定
剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエ
ン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止
剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニ
ウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチル
またはベンジルアルコール;p-ヒドロキシ安息香酸メチルまたはp-ヒドロキシ安息香
酸プロピルなどのp-ヒドロキシ安息香酸アルキル;カテコール;レゾルシノール;シクロ
ヘキサノール;3-ペンタノール;およびm3-クレゾールなど);低分子量(約10残基
未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパ
ク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン
酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸;単糖、二糖、およびグルコー
ス、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;シ
ョ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形
成対イオン;金属錯体(例:Zn-タンパク質錯体);および/またはTWEEN(登録商
標)、PLURONICS(登録商標)またはポリエチレングリコール(PEG)などの
非イオン性界面活性剤を含む。一部の実施形態では、凍結乾燥製剤が提供される。インビ
ボ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過
膜による濾過によって容易に達成され得る。本明細書に記載のdRNA、構築体、組成物
、ライブラリー、または編集された宿主細胞のいずれか1つを含む、本明細書に記載のR
NA編集方法または治療方法のいずれか1つに使用できるキットまたは製品がさらに提供
される。
のいずれか1つ、および薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む医薬組成物
が提供される。例示的な薬学的に許容される担体、賦形剤および安定剤は、例えば、Re
mington’s Pharmaceutical Sciences第16版、Os
ol,A.Ed.(1980)に記載されている。許容される担体、賦形剤、または安定
剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエ
ン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止
剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニ
ウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチル
またはベンジルアルコール;p-ヒドロキシ安息香酸メチルまたはp-ヒドロキシ安息香
酸プロピルなどのp-ヒドロキシ安息香酸アルキル;カテコール;レゾルシノール;シクロ
ヘキサノール;3-ペンタノール;およびm3-クレゾールなど);低分子量(約10残基
未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパ
ク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン
酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸;単糖、二糖、およびグルコー
ス、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;シ
ョ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形
成対イオン;金属錯体(例:Zn-タンパク質錯体);および/またはTWEEN(登録商
標)、PLURONICS(登録商標)またはポリエチレングリコール(PEG)などの
非イオン性界面活性剤を含む。一部の実施形態では、凍結乾燥製剤が提供される。インビ
ボ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過
膜による濾過によって容易に達成され得る。本明細書に記載のdRNA、構築体、組成物
、ライブラリー、または編集された宿主細胞のいずれか1つを含む、本明細書に記載のR
NA編集方法または治療方法のいずれか1つに使用できるキットまたは製品がさらに提供
される。
一部の実施形態において、dRNAを含む、宿主細胞内の標的RNAを編集するための
キットが提供され、ここで、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的R
NA配列を含み、ここで、前記dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中のAを脱
アミノ化させることができる。一部の実施形態では、前記キットは、ADARまたはAD
ARをコードする構築体をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、ADAR3
の阻害剤またはその構築体をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、インター
フェロンのスティミュレーターまたはその構築体をさらに含む。一部の実施形態では、前
記キットは、本明細書に記載のRNA編集方法のいずれか1つを実行するための説明書を
さらに含む。
キットが提供され、ここで、前記dRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的R
NA配列を含み、ここで、前記dRNAは、ADARを動員して、標的RNA中のAを脱
アミノ化させることができる。一部の実施形態では、前記キットは、ADARまたはAD
ARをコードする構築体をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、ADAR3
の阻害剤またはその構築体をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、インター
フェロンのスティミュレーターまたはその構築体をさらに含む。一部の実施形態では、前
記キットは、本明細書に記載のRNA編集方法のいずれか1つを実行するための説明書を
さらに含む。
本出願のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジ
ャー、軟包装(例えば、密封されたポリエステルフィルムまたはビニール袋)などが含ま
れるが、これらに限定されない。キットは、トランスフェクションまたは形質導入試薬、
細胞培養培地、緩衝液、および解釈情報などの追加コンポーネントを選択可能に提供する
場合がある。
ャー、軟包装(例えば、密封されたポリエステルフィルムまたはビニール袋)などが含ま
れるが、これらに限定されない。キットは、トランスフェクションまたは形質導入試薬、
細胞培養培地、緩衝液、および解釈情報などの追加コンポーネントを選択可能に提供する
場合がある。
したがって、本出願はまた、製品を提供する。前記製品は、容器と、容器上または容器
に関連付けられたラベルまたはプロトコルを含むことができる。適切な容器には、バイア
ル(密封されたバイアルなど)、ボトル、ジャー、軟包装などが含まれる。一部の実施形
態では、前記容器は医薬組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、
前記容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する
バイアルであってもよい)。医薬組成物を収容する容器は、再構成された製剤の反復投与
(例えば、2~6回の投与)を可能にする複数回使用可能なバイアルであってもよい。プ
ロトコルとは、治療用製品の市販パッケージに通常含まれている説明書を指し、そのよう
な製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、禁忌、および/または警告などの
情報が含まれている。また、前記製品は、注射用静菌性水(BWFI)、リン酸緩衝生理
食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第
2の容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および
注射器を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい
。
に関連付けられたラベルまたはプロトコルを含むことができる。適切な容器には、バイア
ル(密封されたバイアルなど)、ボトル、ジャー、軟包装などが含まれる。一部の実施形
態では、前記容器は医薬組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、
前記容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する
バイアルであってもよい)。医薬組成物を収容する容器は、再構成された製剤の反復投与
(例えば、2~6回の投与)を可能にする複数回使用可能なバイアルであってもよい。プ
ロトコルとは、治療用製品の市販パッケージに通常含まれている説明書を指し、そのよう
な製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、禁忌、および/または警告などの
情報が含まれている。また、前記製品は、注射用静菌性水(BWFI)、リン酸緩衝生理
食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第
2の容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および
注射器を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい
。
前記キットまたは製品は、薬局(例えば、病院薬局および調剤薬局)での保管および使
用に十分な量で包装された、複数の単位用量の医薬組成物のおよび使用説明書を含んでも
よい。
用に十分な量で包装された、複数の単位用量の医薬組成物のおよび使用説明書を含んでも
よい。
例示的な実施形態
本明細書に提供された実施形態は下記通りである。
1.デアミナーゼ動員RNA(dRNA)または前記dRNAをコードする構築体を宿
主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的RNAを編集するための方法であっ
て、前記dRNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前
記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するよう
にRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる、方法
。
2.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチ
ジン、アデノシン、またはウリジンを含む、実施形態1に記載の方法。
3.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチ
ジンミスマッチを含む、実施形態2に記載の方法。
4.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の3’末端から少
なくとも20ヌクレオチド離れ、前記相補配列の5’末端から少なくとも5ヌクレオチド
離れて位置する、実施形態3に記載の方法。
5.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の中心(例えば、
中心にある)から10ヌクレオチド以内に位置する、実施形態4に記載の方法。
6.前記RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1
つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態1~5のいずれか一項に記載の方法。
7.前記相補配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続
するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態1~6のいずれか一項に記載の方法。
8.前記標的RNA中の前記標的アデノシンの5’に最も近い隣接物が、U、C、A、
及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gであり、前記標的RN
Aにおける前記標的アデノシンの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選ば
れるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである、実施形態1~7のいずれか一
項に記載の方法。
9.前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU
、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC
、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、実施形態1~
8のいずれか一項に記載の方法。
10.前記3塩基モチーフがUAGであり、前記デアミナーゼ動員RNAが、前記3塩
基モチーフのウリジンの真向かいのA、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び
前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを
含む、実施形態9に記載の方法。
11.前記デアミナーゼ動員RNAが約40~260ヌクレオチド長である、実施形態
1~10のいずれか一項に記載の方法。
12.前記デアミナーゼ動員RNAが約60~230ヌクレオチド長である、実施形態
11に記載の方法。
13.前記dRNAが約70ヌクレオチドを超える長さを有する、実施形態11または
12に記載の方法。
14.前記dRNAが約100から約150(例えば、約110~150)ヌクレオチ
ド長である、実施形態11~13のいずれか一項に記載の方法。
15.前記標的RNAが、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャーRNA、リボソ
ームRNA、トランスファーRNA、長い非コードRNA、及び小さいRNAからなる群
より選ばれるRNAである、実施形態1~14のいずれか一項に記載の方法。
16.前記標的RNAがプレメッセンジャーRNAである、実施形態15に記載の方法
。
17.前記ADARが前記宿主細胞によって内因的に発現される、実施形態1~16の
いずれか一項に記載の方法。
18.前記ADARが前記宿主細胞対して外因的である、実施形態1~16のいずれか
一項に記載の方法。
19.前記ADARを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態18に記載
の方法。
20.前記ADARがE1008突然変異を含む、実施形態18または19に記載の方
法。
21.前記デアミナーゼ動員RNAが一本鎖RNAである、実施形態1~20のいずれ
か一項に記載の方法。
22.前記相補的RNA配列が一本鎖であり、前記デアミナーゼ動員RNAが1つ以上
の二本鎖領域をさらに含む、実施形態1~20のいずれか一項に記載の方法。
23.前記dRNAがADAR-動員ドメイン(例えば、DSB結合ドメイン、Glu
R2ドメインまたはMS2ドメイン)を含まない、実施形態1~22のいずれか一項に記
載の方法。
24.前記dRNAが、化学的に修飾されたヌクレオチド(例えば、2'-O-メチル
修飾またはホスホロチオエート修飾)を含まない、実施形態1~23のいずれか一項に記
載の方法。
25.前記dRNAをコードする、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクタ
ー)またはプラスミドである構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、実施形態24
に記載の方法。
26.標的RNA中の標的アデノシンの脱アミノ化作用が、前記標的RNA中のミスセ
ンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的スプライシング、若し
くは前記標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは
可変的スプライシングの回復を引き起こす、実施形態1~25のいずれか一項に記載の方
法。
27.前記標的RNA中の標的アデノシンの脱アミノ化作用が、前記標的RNAによっ
てコードされるタンパク質の点突然変異、切断、伸長および/またはミスフォールディン
グを引き起こすか、または、前記標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常
なスプライシングまたは可変的スプライシングの回復によって、機能的で、完全長の、正
しくフォールディングされた、及び/または野生型タンパク質を引き起こす、実施形態2
6に記載の方法。
28.前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態1~27のいずれか一項に記載の方法
。
29.前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態28に記載の方法。
30.前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、実施形態29に記載の方法。
31.前記ADARがADAR1および/またはADAR2である、実施形態29また
は30に記載の方法。
32.前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態1~31のいずれか一項に記載の方法
。
33.前記宿主細胞がT細胞である、実施形態32に記載の方法。
34.前記宿主細胞が有糸分裂後の細胞である、実施形態32に記載の方法。
35.ADAR3の阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態1~
34のいずれか一項に記載の方法。
36.インターフェロンのスティミュレーターを前記宿主細胞に導入することをさらに
含む、実施形態1~35のいずれか一項に記載の方法。
37.それぞれ異なる標的RNAを標的とする複数のdRNAを導入することを含む、
実施形態1~36のいずれか一項に記載の方法。
38.前記標的RNAを編集する効率が少なくとも約5%(例えば、少なくとも約10
%、20%、または30%)である、実施形態1~37のいずれか一項に記載の方法。
39.前記dRNAが免疫応答を誘導しない、実施形態1~38のいずれか一項に記載
の方法。
40.実施形態1~39のいずれか一項に記載の方法によって生成された編集されたR
NAまたは編集されたRNAを有する宿主細胞。
41.実施形態1~39のいずれか一項に記載の方法に従って、個体の細胞内の疾患ま
たは病症に関連する標的RNAを編集することを含む、個体の疾患または病症を治療また
は予防するための方法。
42.前記疾患または病症が、遺伝性遺伝子疾患または1つ以上の後天性遺伝子突然変
異に関連する疾患または病症である、実施形態41に記載の方法。
43.前記標的RNAがGからAへの突然変異を有する、実施形態41または42に記
載の方法。
44.前記疾患または病症が単一遺伝子の疾患または病症である、実施形態41~43
のいずれか一項に記載の方法。
45.前記疾患または病症が多遺伝子の疾患または病症である、実施形態41~44の
いずれか一項に記載の方法。
46.(i)前記標的RNAがTP53であり、前記疾患または病症が癌である;
(ii)前記標的RNAがIDUAであり、前記疾患または病症がI型ムコ多糖症(M
PS I)である;
(iii)前記標的RNAがCOL3A1であり、前記疾患または病症がエーラース・
ダンロス症候群である;
(iv)前記標的RNAがBMPR2であり、前記疾患または病症がジュベール症候群
である;
(v)前記標的RNAがFANCCであり、前記疾患または病症がファンコニ貧血であ
る;
(vi)前記標的RNAがMYBPC3であり、前記疾患または病症が原発性家族性肥
大型心筋症である;または
(vii)前記標的RNAがIL2RGであり、前記疾患または病症がX連鎖重症複合
免疫不全である、
実施形態41~45のいずれか一項に記載の方法。
47.標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含む、RNAに作用するア
デノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することによって前記標的RNA中の標的アデ
ノシンを脱アミノ化するためのデアミナーゼ動員RNA(dRNA)。
48.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシ
チジン、アデノシン、またはUを含む、実施形態47に記載のデアミナーゼ動員RNA。
49.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシ
チジンミスマッチを含む、実施形態48に記載のdRNA。
50.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の3’末端から
少なくとも20ヌクレオチド離れ、前記相補配列の5’末端から少なくとも5ヌクレオチ
ド離れて位置する、実施形態49に記載のdRNA。
51.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の中心(例えば
、中心にある)から10ヌクレオチド以内に位置する、実施形態50に記載のdRNA。
52.前記RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する
1つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態47~51のいずれか一項に記載のデアミ
ナーゼ動員RNA。
53.前記相補配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連
続するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態47~51のいずれか一項に記載のdR
NA。
54.前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UA
U、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GA
C、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、実施形態4
7~53のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA。
55.前記3塩基モチーフがUAGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのウ
リジンの真向かいのアデノシン、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3
塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、
実施形態54に記載のデアミナーゼ動員RNA。
56.前記3塩基モチーフが、前記標的RNA中のUAGであり、前記デアミナーゼ動
員RNAが、前記標的RNAのUAGに対向するACC、ACG、またはACUを含む、
実施形態55に記載のデアミナーゼ動員RNA。
57.前記デアミナーゼ動員RNAが約40~260ヌクレオチド長である、実施形態
47~56のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA。
58.前記dRNAが約70ヌクレオチドを超える長さを有する、実施形態57に記載
のdRNA。
59.前記dRNAが約100から約150(例えば、約110~150)ヌクレオチ
ド長である、実施形態57または58に記載のdRNA。
60.前記dRNAがADAR動員ドメイン(例えば、DSB結合ドメイン、GluR
2ドメインまたはMS2ドメイン)を含まない、実施形態47~59のいずれか一項に記
載のdRNA。
61.前記dRNAが、化学的に修飾されたヌクレオチド(例えば、2'-O-メチル
修飾またはホスホロチオエート修飾)を含まない、実施形態47~60のいずれか一項に
記載のdRNA。
62.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNAをコードす
る構築体。
63.前記構築体がウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)またはプラ
スミドである、実施形態62に記載の構築体。
64.実施形態47~61のいずれか一項に記載の複数のデアミナーゼ動員RNAまた
は実施形態62または63に記載の構築体を含むライブラリー。
65.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA、実施形態
62または63に記載の構築体、または実施形態64に記載のライブラリーを含む、組成
物。
66.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNAまたは実施
形態62または63に記載の構築体を含む、宿主細胞。
67.前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態66に記載の宿主細胞。
68.前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態66または67に記載の宿主細胞。
69.デアミナーゼ動員RNAを含む、宿主細胞における標的RNAを編集するための
キットであって、前記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする
相補的RNA配列を含み、前記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNA中の標的アデ
ノシンを脱アミノ化するようにADARを動員することができる、キット。
本明細書に提供された実施形態は下記通りである。
1.デアミナーゼ動員RNA(dRNA)または前記dRNAをコードする構築体を宿
主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的RNAを編集するための方法であっ
て、前記dRNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前
記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するよう
にRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる、方法
。
2.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチ
ジン、アデノシン、またはウリジンを含む、実施形態1に記載の方法。
3.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチ
ジンミスマッチを含む、実施形態2に記載の方法。
4.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の3’末端から少
なくとも20ヌクレオチド離れ、前記相補配列の5’末端から少なくとも5ヌクレオチド
離れて位置する、実施形態3に記載の方法。
5.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の中心(例えば、
中心にある)から10ヌクレオチド以内に位置する、実施形態4に記載の方法。
6.前記RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1
つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態1~5のいずれか一項に記載の方法。
7.前記相補配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続
するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態1~6のいずれか一項に記載の方法。
8.前記標的RNA中の前記標的アデノシンの5’に最も近い隣接物が、U、C、A、
及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gであり、前記標的RN
Aにおける前記標的アデノシンの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選ば
れるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである、実施形態1~7のいずれか一
項に記載の方法。
9.前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU
、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC
、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、実施形態1~
8のいずれか一項に記載の方法。
10.前記3塩基モチーフがUAGであり、前記デアミナーゼ動員RNAが、前記3塩
基モチーフのウリジンの真向かいのA、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び
前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを
含む、実施形態9に記載の方法。
11.前記デアミナーゼ動員RNAが約40~260ヌクレオチド長である、実施形態
1~10のいずれか一項に記載の方法。
12.前記デアミナーゼ動員RNAが約60~230ヌクレオチド長である、実施形態
11に記載の方法。
13.前記dRNAが約70ヌクレオチドを超える長さを有する、実施形態11または
12に記載の方法。
14.前記dRNAが約100から約150(例えば、約110~150)ヌクレオチ
ド長である、実施形態11~13のいずれか一項に記載の方法。
15.前記標的RNAが、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャーRNA、リボソ
ームRNA、トランスファーRNA、長い非コードRNA、及び小さいRNAからなる群
より選ばれるRNAである、実施形態1~14のいずれか一項に記載の方法。
16.前記標的RNAがプレメッセンジャーRNAである、実施形態15に記載の方法
。
17.前記ADARが前記宿主細胞によって内因的に発現される、実施形態1~16の
いずれか一項に記載の方法。
18.前記ADARが前記宿主細胞対して外因的である、実施形態1~16のいずれか
一項に記載の方法。
19.前記ADARを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態18に記載
の方法。
20.前記ADARがE1008突然変異を含む、実施形態18または19に記載の方
法。
21.前記デアミナーゼ動員RNAが一本鎖RNAである、実施形態1~20のいずれ
か一項に記載の方法。
22.前記相補的RNA配列が一本鎖であり、前記デアミナーゼ動員RNAが1つ以上
の二本鎖領域をさらに含む、実施形態1~20のいずれか一項に記載の方法。
23.前記dRNAがADAR-動員ドメイン(例えば、DSB結合ドメイン、Glu
R2ドメインまたはMS2ドメイン)を含まない、実施形態1~22のいずれか一項に記
載の方法。
24.前記dRNAが、化学的に修飾されたヌクレオチド(例えば、2'-O-メチル
修飾またはホスホロチオエート修飾)を含まない、実施形態1~23のいずれか一項に記
載の方法。
25.前記dRNAをコードする、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクタ
ー)またはプラスミドである構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、実施形態24
に記載の方法。
26.標的RNA中の標的アデノシンの脱アミノ化作用が、前記標的RNA中のミスセ
ンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的スプライシング、若し
くは前記標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは
可変的スプライシングの回復を引き起こす、実施形態1~25のいずれか一項に記載の方
法。
27.前記標的RNA中の標的アデノシンの脱アミノ化作用が、前記標的RNAによっ
てコードされるタンパク質の点突然変異、切断、伸長および/またはミスフォールディン
グを引き起こすか、または、前記標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常
なスプライシングまたは可変的スプライシングの回復によって、機能的で、完全長の、正
しくフォールディングされた、及び/または野生型タンパク質を引き起こす、実施形態2
6に記載の方法。
28.前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態1~27のいずれか一項に記載の方法
。
29.前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態28に記載の方法。
30.前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、実施形態29に記載の方法。
31.前記ADARがADAR1および/またはADAR2である、実施形態29また
は30に記載の方法。
32.前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態1~31のいずれか一項に記載の方法
。
33.前記宿主細胞がT細胞である、実施形態32に記載の方法。
34.前記宿主細胞が有糸分裂後の細胞である、実施形態32に記載の方法。
35.ADAR3の阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態1~
34のいずれか一項に記載の方法。
36.インターフェロンのスティミュレーターを前記宿主細胞に導入することをさらに
含む、実施形態1~35のいずれか一項に記載の方法。
37.それぞれ異なる標的RNAを標的とする複数のdRNAを導入することを含む、
実施形態1~36のいずれか一項に記載の方法。
38.前記標的RNAを編集する効率が少なくとも約5%(例えば、少なくとも約10
%、20%、または30%)である、実施形態1~37のいずれか一項に記載の方法。
39.前記dRNAが免疫応答を誘導しない、実施形態1~38のいずれか一項に記載
の方法。
40.実施形態1~39のいずれか一項に記載の方法によって生成された編集されたR
NAまたは編集されたRNAを有する宿主細胞。
41.実施形態1~39のいずれか一項に記載の方法に従って、個体の細胞内の疾患ま
たは病症に関連する標的RNAを編集することを含む、個体の疾患または病症を治療また
は予防するための方法。
42.前記疾患または病症が、遺伝性遺伝子疾患または1つ以上の後天性遺伝子突然変
異に関連する疾患または病症である、実施形態41に記載の方法。
43.前記標的RNAがGからAへの突然変異を有する、実施形態41または42に記
載の方法。
44.前記疾患または病症が単一遺伝子の疾患または病症である、実施形態41~43
のいずれか一項に記載の方法。
45.前記疾患または病症が多遺伝子の疾患または病症である、実施形態41~44の
いずれか一項に記載の方法。
46.(i)前記標的RNAがTP53であり、前記疾患または病症が癌である;
(ii)前記標的RNAがIDUAであり、前記疾患または病症がI型ムコ多糖症(M
PS I)である;
(iii)前記標的RNAがCOL3A1であり、前記疾患または病症がエーラース・
ダンロス症候群である;
(iv)前記標的RNAがBMPR2であり、前記疾患または病症がジュベール症候群
である;
(v)前記標的RNAがFANCCであり、前記疾患または病症がファンコニ貧血であ
る;
(vi)前記標的RNAがMYBPC3であり、前記疾患または病症が原発性家族性肥
大型心筋症である;または
(vii)前記標的RNAがIL2RGであり、前記疾患または病症がX連鎖重症複合
免疫不全である、
実施形態41~45のいずれか一項に記載の方法。
47.標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含む、RNAに作用するア
デノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することによって前記標的RNA中の標的アデ
ノシンを脱アミノ化するためのデアミナーゼ動員RNA(dRNA)。
48.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシ
チジン、アデノシン、またはUを含む、実施形態47に記載のデアミナーゼ動員RNA。
49.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシ
チジンミスマッチを含む、実施形態48に記載のdRNA。
50.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の3’末端から
少なくとも20ヌクレオチド離れ、前記相補配列の5’末端から少なくとも5ヌクレオチ
ド離れて位置する、実施形態49に記載のdRNA。
51.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の中心(例えば
、中心にある)から10ヌクレオチド以内に位置する、実施形態50に記載のdRNA。
52.前記RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する
1つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態47~51のいずれか一項に記載のデアミ
ナーゼ動員RNA。
53.前記相補配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連
続するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態47~51のいずれか一項に記載のdR
NA。
54.前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UA
U、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GA
C、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、実施形態4
7~53のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA。
55.前記3塩基モチーフがUAGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのウ
リジンの真向かいのアデノシン、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3
塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、
実施形態54に記載のデアミナーゼ動員RNA。
56.前記3塩基モチーフが、前記標的RNA中のUAGであり、前記デアミナーゼ動
員RNAが、前記標的RNAのUAGに対向するACC、ACG、またはACUを含む、
実施形態55に記載のデアミナーゼ動員RNA。
57.前記デアミナーゼ動員RNAが約40~260ヌクレオチド長である、実施形態
47~56のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA。
58.前記dRNAが約70ヌクレオチドを超える長さを有する、実施形態57に記載
のdRNA。
59.前記dRNAが約100から約150(例えば、約110~150)ヌクレオチ
ド長である、実施形態57または58に記載のdRNA。
60.前記dRNAがADAR動員ドメイン(例えば、DSB結合ドメイン、GluR
2ドメインまたはMS2ドメイン)を含まない、実施形態47~59のいずれか一項に記
載のdRNA。
61.前記dRNAが、化学的に修飾されたヌクレオチド(例えば、2'-O-メチル
修飾またはホスホロチオエート修飾)を含まない、実施形態47~60のいずれか一項に
記載のdRNA。
62.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNAをコードす
る構築体。
63.前記構築体がウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)またはプラ
スミドである、実施形態62に記載の構築体。
64.実施形態47~61のいずれか一項に記載の複数のデアミナーゼ動員RNAまた
は実施形態62または63に記載の構築体を含むライブラリー。
65.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA、実施形態
62または63に記載の構築体、または実施形態64に記載のライブラリーを含む、組成
物。
66.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNAまたは実施
形態62または63に記載の構築体を含む、宿主細胞。
67.前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態66に記載の宿主細胞。
68.前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態66または67に記載の宿主細胞。
69.デアミナーゼ動員RNAを含む、宿主細胞における標的RNAを編集するための
キットであって、前記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする
相補的RNA配列を含み、前記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNA中の標的アデ
ノシンを脱アミノ化するようにADARを動員することができる、キット。
以下の実施例は、本出願の例示的なもののみであるため、いかなる方法でも本発明を限
定すると見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、限定としてではな
く、例示として提供されている。
定すると見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、限定としてではな
く、例示として提供されている。
材料及び方法
プラスミドの構築
二重蛍光レポーターは、mCherryおよびEGFP(EGFPの第1のコドンAT
Gが削除された)をコードするDNAをPCRにより増幅することによってクローン化さ
れ、3×GSリンカーおよびターゲティングDNA配列がPCR中にプライマーを介して
追加された。次に、PCR産物をタイプIIの制限酵素BsmB1(Thermo)とT
4 DNAリガーゼ(NEB)で切断して連結し、pLentiバックボーン(pLen
ti-CMV-MCS-SV-Bsd、Stanley Cohen Lab, Sta
nford University)に挿入した。
プラスミドの構築
二重蛍光レポーターは、mCherryおよびEGFP(EGFPの第1のコドンAT
Gが削除された)をコードするDNAをPCRにより増幅することによってクローン化さ
れ、3×GSリンカーおよびターゲティングDNA配列がPCR中にプライマーを介して
追加された。次に、PCR産物をタイプIIの制限酵素BsmB1(Thermo)とT
4 DNAリガーゼ(NEB)で切断して連結し、pLentiバックボーン(pLen
ti-CMV-MCS-SV-Bsd、Stanley Cohen Lab, Sta
nford University)に挿入した。
dLbuCas13 DNAは、Lbuプラスミド(Addgene#83485)か
らPCRにより増幅された。ADAR1DDとADAR2DDは、厦門大学の漢の研究室
からのAdar1(p150)cDNAとAdar2 cDNAから増幅された。ADA
R1DDまたはADAR2DDをオーバーラップPCRによってdLbuCas13DN
Aに融合し、融合したPCR産物をpLentiバックボーンに挿入した。
らPCRにより増幅された。ADAR1DDとADAR2DDは、厦門大学の漢の研究室
からのAdar1(p150)cDNAとAdar2 cDNAから増幅された。ADA
R1DDまたはADAR2DDをオーバーラップPCRによってdLbuCas13DN
Aに融合し、融合したPCR産物をpLentiバックボーンに挿入した。
哺乳動物細胞でのdRNAの発現のために、dRNA配列(短いdRNAの場合)を直
接に合成し、オーバーラップssDNAを合成することによってアニーリングするか、ま
たはPCR増幅し、Golden-gateクローニングによりU6発現下で対応するベ
クターにクローニングした。
接に合成し、オーバーラップssDNAを合成することによってアニーリングするか、ま
たはPCR増幅し、Golden-gateクローニングによりU6発現下で対応するベ
クターにクローニングした。
完全長Adar1(p110)およびAdar1(p150)はAdar1(p150
)cDNAからPCRにより増幅され、完全長Adar2はAdar2 cDNAからP
CRにより増幅され、それぞれpLentiバックボーンにクローニングされた。
)cDNAからPCRにより増幅され、完全長Adar2はAdar2 cDNAからP
CRにより増幅され、それぞれpLentiバックボーンにクローニングされた。
二重蛍光レポーターの3つのバージョン(レポーター-1、-2、および-3)につい
て、mCherryおよびEGFP(EGFPの開始コドンATGが削除された)コード
配列をPCRにより増幅し、BsmBI(Thermo Fisher Scienti
fic、ER0452)を使用して消化し、続いて、T4 DNAリガーゼ(NEB、M
0202L)を介したGGGGSリンカーとのライゲーションが行われた。そして、ライ
ゲーション産物をpLenti-CMV-MCS-PURO主鎖に挿入した。
て、mCherryおよびEGFP(EGFPの開始コドンATGが削除された)コード
配列をPCRにより増幅し、BsmBI(Thermo Fisher Scienti
fic、ER0452)を使用して消化し、続いて、T4 DNAリガーゼ(NEB、M
0202L)を介したGGGGSリンカーとのライゲーションが行われた。そして、ライ
ゲーション産物をpLenti-CMV-MCS-PURO主鎖に挿入した。
dLbuCas13-ADARDD(E1008Q)を発現する構築体の場合、ADA
R1DD遺伝子はADAR1p150構築体(厦門大学のJiahuai Han研究室
からの贈り物)から増幅された。dLbuCas13遺伝子は、Lbu_C2c2_R4
72A_H477A_R1048A_H1053Aプラスミド(Addgene#834
85)からPCRによって増幅された。ADAR1DD(高活性E1008Q変異体)は
オーバーラップPCRによって生成され、dLbuCas13に融合された。ライゲーシ
ョン産物はpLenti-CMV-MCS-BSD主鎖に挿入された。
R1DD遺伝子はADAR1p150構築体(厦門大学のJiahuai Han研究室
からの贈り物)から増幅された。dLbuCas13遺伝子は、Lbu_C2c2_R4
72A_H477A_R1048A_H1053Aプラスミド(Addgene#834
85)からPCRによって増幅された。ADAR1DD(高活性E1008Q変異体)は
オーバーラップPCRによって生成され、dLbuCas13に融合された。ライゲーシ
ョン産物はpLenti-CMV-MCS-BSD主鎖に挿入された。
arRNAを発現する構築体の場合、arRNAの配列を合成し、ゴールデンゲート(
golden-gate)をpLenti-sgRNA-lib 2.0(Addgen
e#89638)主鎖にクローニングし、arRNAの転写をhU6プロモーターによっ
て駆動した。ADARを発現する構築体の場合、完全長ADAR1p110およびADA
R1p150はADAR1p150構築体から増幅され、完全長ADAR2はADAR2
構築体(厦門大学のJiahuai Han研究室からの贈り物)から増幅された。次に
、増幅された産物をpLenti-CMV-MCS-BSD主鎖にクローニングした。病
原性変異を有する遺伝子を発現する構築体については、TP53の全長コード配列(Vi
genebioから注文)および他の6つの疾患関連遺伝子(COL3A1、BMPR2
、AHI1、FANCC、MYBPC3およびIL2RG、中国医学科学院病原体生物学
研究所のJianwei Wangの研究室からの贈り物)は、G>A突然変異が導入さ
れた対応する遺伝子をコードする構築体から、誘発PCRにより増幅された。増幅産物は
、ギブソン(Gibson)クローニング法(非特許文献59)によりpLenti-C
MV-MCS-mCherry主鎖にクローニングされた。
golden-gate)をpLenti-sgRNA-lib 2.0(Addgen
e#89638)主鎖にクローニングし、arRNAの転写をhU6プロモーターによっ
て駆動した。ADARを発現する構築体の場合、完全長ADAR1p110およびADA
R1p150はADAR1p150構築体から増幅され、完全長ADAR2はADAR2
構築体(厦門大学のJiahuai Han研究室からの贈り物)から増幅された。次に
、増幅された産物をpLenti-CMV-MCS-BSD主鎖にクローニングした。病
原性変異を有する遺伝子を発現する構築体については、TP53の全長コード配列(Vi
genebioから注文)および他の6つの疾患関連遺伝子(COL3A1、BMPR2
、AHI1、FANCC、MYBPC3およびIL2RG、中国医学科学院病原体生物学
研究所のJianwei Wangの研究室からの贈り物)は、G>A突然変異が導入さ
れた対応する遺伝子をコードする構築体から、誘発PCRにより増幅された。増幅産物は
、ギブソン(Gibson)クローニング法(非特許文献59)によりpLenti-C
MV-MCS-mCherry主鎖にクローニングされた。
哺乳類の細胞株と細胞培養
哺乳類細胞株は、ダルベッコ改良イーグル培地(Dulbecco’s Modifi
ed Eagle Medium,10-013-CV,Corning,Tewksb
ury,MA,USA))で培養し、10%ウシ胎児血清(蘭州百霊生物技術有限公司、
蘭州、中国)を添加し、37℃、5%CO2で1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添
加した。前記Adar1-KO細胞株はEdiGene Chinaから購入し、ジェノ
タイピングの結果もEdiGene Chinaから提供された。
哺乳類細胞株は、ダルベッコ改良イーグル培地(Dulbecco’s Modifi
ed Eagle Medium,10-013-CV,Corning,Tewksb
ury,MA,USA))で培養し、10%ウシ胎児血清(蘭州百霊生物技術有限公司、
蘭州、中国)を添加し、37℃、5%CO2で1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添
加した。前記Adar1-KO細胞株はEdiGene Chinaから購入し、ジェノ
タイピングの結果もEdiGene Chinaから提供された。
HeLaおよびB16細胞株は、Z.Jiangの研究室(北京大学)からのものであ
った。また、HEK293T細胞株は、C.Zhangの研究室(北京大学)からのもの
であった。RD細胞株は、J Wangの研究室(北京協和医学院および中国医学科学院
の病原体生物学研究所)からのものであった。SF268細胞株は、中国医学科学院、基
礎医学研究所、セルセンターから入手した。A549およびSW13細胞株は、EdiG
ene Inc.から入手した。HepG2、HT29、NIH3T3、およびMEF細
胞株は、北京大学の我らの研究室で維持されていた。これらの哺乳動物細胞株は、10%
ウシ胎児血清(CellMax、SA201.02)を含むダルベッコ改良イーグル培地
(Corning、10-013-CV)で培養し、さらに1%ペニシリン-ストレプト
マイシンを5%CO2下で37℃で補充した。特に明記されていない限り、細胞はX-t
remeGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Roche、063665
46001)で製造元の説明に従ってトランスフェクトされた。
った。また、HEK293T細胞株は、C.Zhangの研究室(北京大学)からのもの
であった。RD細胞株は、J Wangの研究室(北京協和医学院および中国医学科学院
の病原体生物学研究所)からのものであった。SF268細胞株は、中国医学科学院、基
礎医学研究所、セルセンターから入手した。A549およびSW13細胞株は、EdiG
ene Inc.から入手した。HepG2、HT29、NIH3T3、およびMEF細
胞株は、北京大学の我らの研究室で維持されていた。これらの哺乳動物細胞株は、10%
ウシ胎児血清(CellMax、SA201.02)を含むダルベッコ改良イーグル培地
(Corning、10-013-CV)で培養し、さらに1%ペニシリン-ストレプト
マイシンを5%CO2下で37℃で補充した。特に明記されていない限り、細胞はX-t
remeGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Roche、063665
46001)で製造元の説明に従ってトランスフェクトされた。
ヒト初代肺線維芽細胞(#3300)およびヒト初代気管支上皮細胞(#3210)は
、ScienCell Research Laboratories、Inc.から購入
し、線維芽細胞培地(ScienCell、#2301)および気管支上皮細胞培地(S
cienCell、#3211)でそれぞれ培養した。両方の培地にそれぞれ15%ウシ
胎児血清(BI)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。初代GM0621
4およびGM01323細胞は、Coriell Institute for Med
ical Researchに注文し、15%ウシ胎児血清(BI)および1%ペニシリ
ン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ改良イーグル培地(Corning、10-0
13-CV)で培養した。すべての細胞は37℃で5%CO2下で培養された。
、ScienCell Research Laboratories、Inc.から購入
し、線維芽細胞培地(ScienCell、#2301)および気管支上皮細胞培地(S
cienCell、#3211)でそれぞれ培養した。両方の培地にそれぞれ15%ウシ
胎児血清(BI)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。初代GM0621
4およびGM01323細胞は、Coriell Institute for Med
ical Researchに注文し、15%ウシ胎児血清(BI)および1%ペニシリ
ン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ改良イーグル培地(Corning、10-0
13-CV)で培養した。すべての細胞は37℃で5%CO2下で培養された。
レポーターシステムのトランスフェクション、FACS解析およびサンガー(Sang
er)シーケンシング
二重蛍光レポーター編集実験では、293T-WT細胞または293T-Adar1-
KO細胞を6ウェルプレートに播種し(6×105細胞/ウェル)、24時間後、1.5
μgのレポータープラスミドと1.5μgのdRNAプラスミドを播種した。X-tre
meGENE HP DNAトランスフェクション試薬(06366546001;Ro
che、Mannheim、ドイツ)を、サプライヤーのプロトコルに従って使用して同
時トランスフェクトした。48~72時間後、細胞を収集し、FACS解析を実行した。
レポーターmRNA編集をさらに確認するために、FACS Ariaフローサイトメー
ター(BD Biosciences)を使用して、レポーターおよびdRNAプラスミ
ドをトランスフェクトした293T-WT細胞からのEGFP陽性細胞を選別し、続いて
トータルRNAを単離した(TIANGEN、DP430)。次に、RNAをRT-PC
R(TIANGEN、KR103-04)を介してcDNAに逆転写し、標的遺伝子座を
対応するプライマーペア(23PCRサイクル)でPCR増幅し、PCR産物を精製して
サンガーシーケンシングに供した。
er)シーケンシング
二重蛍光レポーター編集実験では、293T-WT細胞または293T-Adar1-
KO細胞を6ウェルプレートに播種し(6×105細胞/ウェル)、24時間後、1.5
μgのレポータープラスミドと1.5μgのdRNAプラスミドを播種した。X-tre
meGENE HP DNAトランスフェクション試薬(06366546001;Ro
che、Mannheim、ドイツ)を、サプライヤーのプロトコルに従って使用して同
時トランスフェクトした。48~72時間後、細胞を収集し、FACS解析を実行した。
レポーターmRNA編集をさらに確認するために、FACS Ariaフローサイトメー
ター(BD Biosciences)を使用して、レポーターおよびdRNAプラスミ
ドをトランスフェクトした293T-WT細胞からのEGFP陽性細胞を選別し、続いて
トータルRNAを単離した(TIANGEN、DP430)。次に、RNAをRT-PC
R(TIANGEN、KR103-04)を介してcDNAに逆転写し、標的遺伝子座を
対応するプライマーペア(23PCRサイクル)でPCR増幅し、PCR産物を精製して
サンガーシーケンシングに供した。
Adar1(p110)、Adar1(p150)、またはAdar2のレスキューお
よび過剰発現実験では、293T-WT細胞または293T-Adar1-KO細胞を1
2ウェルプレート(2.5×105細胞/ウェル)に播種し、24時間後、X-trem
eGENE HP DNAトランスフェクション試薬(06366546001、Roc
he、Mannheim、ドイツ)を使用して、0.5μgのレポータープラスミド、0
.5μgのdRNAプラスミドおよび0.5μgのAdar1/2プラスミド(pLen
tiバックボーンを対照として)を同時トランスフェクトした。48~72時間後、細胞
を収集し、FACS解析を実行した。
よび過剰発現実験では、293T-WT細胞または293T-Adar1-KO細胞を1
2ウェルプレート(2.5×105細胞/ウェル)に播種し、24時間後、X-trem
eGENE HP DNAトランスフェクション試薬(06366546001、Roc
he、Mannheim、ドイツ)を使用して、0.5μgのレポータープラスミド、0
.5μgのdRNAプラスミドおよび0.5μgのAdar1/2プラスミド(pLen
tiバックボーンを対照として)を同時トランスフェクトした。48~72時間後、細胞
を収集し、FACS解析を実行した。
内因性mRNA実験では、293T-WT細胞を6ウェルプレートに播種した(6×1
05細胞/ウェル)。約70%コンフルエントになったときに、X-tremeGENE
HP DNAトランスフェクション試薬(06366546001、Roche、Ma
nnheim、ドイツ)を使用して3μgのdRNAプラスミドをトランスフェクトした
。72時間後、次のRNA分離のために、FACSを介して細胞を収集し、GFP陽性ま
たはBFP陽性細胞(対応する蛍光マーカーによる)を選別した。
05細胞/ウェル)。約70%コンフルエントになったときに、X-tremeGENE
HP DNAトランスフェクション試薬(06366546001、Roche、Ma
nnheim、ドイツ)を使用して3μgのdRNAプラスミドをトランスフェクトした
。72時間後、次のRNA分離のために、FACSを介して細胞を収集し、GFP陽性ま
たはBFP陽性細胞(対応する蛍光マーカーによる)を選別した。
ヒト初代T細胞の分離と培養
初代ヒトT細胞は、健康なヒトドナーからの白血球アフェレーシス産物から単離された
。簡単に説明すると、末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll遠心分離(Dakew
ei、AS1114546)で分離し、EasySep人T細胞分離キット(STEMC
ELL、17951)を使用してT細胞をPBMCから磁気ネガティブセレクションで分
離した。分離後、T細胞をX-vivo15培地、10%FBSおよびIL2(1000
U/ml)で培養し、CD3/CD28 DynaBeads(ThermoFish
er、11131D)で2日間刺激した。健康なドナーからの白血球アフェレーシス製品
は、AllCells LLC Chinaから購入した。すべての健康なドナーはイン
フォームドコンセントを提供した。
初代ヒトT細胞は、健康なヒトドナーからの白血球アフェレーシス産物から単離された
。簡単に説明すると、末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll遠心分離(Dakew
ei、AS1114546)で分離し、EasySep人T細胞分離キット(STEMC
ELL、17951)を使用してT細胞をPBMCから磁気ネガティブセレクションで分
離した。分離後、T細胞をX-vivo15培地、10%FBSおよびIL2(1000
U/ml)で培養し、CD3/CD28 DynaBeads(ThermoFish
er、11131D)で2日間刺激した。健康なドナーからの白血球アフェレーシス製品
は、AllCells LLC Chinaから購入した。すべての健康なドナーはイン
フォームドコンセントを提供した。
レンチウイルスパッケージとレポーター細胞株の構築
発現プラスミドは、X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬
を介して、2つのウイルスパッケージングプラスミドpR8.74およびpVSVG(A
ddgene)とともにHEK293T-WT細胞に同時トランスフェクトされた。72
時間後、上清ウイルスを回収し、-80℃で保存した。HEK293T-WT細胞をレン
チウイルスに感染させ、72時間後、mCherry陽性細胞をFACSで選別して培養
し、限界希釈法により、EGFPバックグラウンドが非常に低い二重蛍光レポーターシス
テムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。
発現プラスミドは、X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬
を介して、2つのウイルスパッケージングプラスミドpR8.74およびpVSVG(A
ddgene)とともにHEK293T-WT細胞に同時トランスフェクトされた。72
時間後、上清ウイルスを回収し、-80℃で保存した。HEK293T-WT細胞をレン
チウイルスに感染させ、72時間後、mCherry陽性細胞をFACSで選別して培養
し、限界希釈法により、EGFPバックグラウンドが非常に低い二重蛍光レポーターシス
テムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。
安定したレポーター細胞株の場合、レポーター構築体(pLenti-CMV-MCS
-PUROバックボーン)を、2つのウイルスパッケージングプラスミドpR8.74お
よびpVSVGとともにHEK293T細胞に同時トランスフェクトした。72時間後、
上清ウイルスを回収し、-80℃で保存した。HEK293T細胞をレンチウイルスに感
染させた後、mCherry陽性細胞をFACSで選別して培養し、検出可能なEGFP
バックグラウンドのない二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細
胞株を選択した。HEK293T ADAR1-/-およびTP53-/-細胞株は、以
前に報告された方法(非特許文献60)に従って生成された。ADAR1を標的とするs
gRNAとCMV駆動のピューロマイシン耐性遺伝子を含むPCR増幅ドナーDNAをH
EK293T細胞に同時トランスフェクトした。次に、トランスフェクションの7日後に
細胞をピューロマイシンで処理した。ピューロマイシン耐性細胞から単一クローンを単離
した後、シーケンシングとウエスタンブロットによる検証を行った。
-PUROバックボーン)を、2つのウイルスパッケージングプラスミドpR8.74お
よびpVSVGとともにHEK293T細胞に同時トランスフェクトした。72時間後、
上清ウイルスを回収し、-80℃で保存した。HEK293T細胞をレンチウイルスに感
染させた後、mCherry陽性細胞をFACSで選別して培養し、検出可能なEGFP
バックグラウンドのない二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細
胞株を選択した。HEK293T ADAR1-/-およびTP53-/-細胞株は、以
前に報告された方法(非特許文献60)に従って生成された。ADAR1を標的とするs
gRNAとCMV駆動のピューロマイシン耐性遺伝子を含むPCR増幅ドナーDNAをH
EK293T細胞に同時トランスフェクトした。次に、トランスフェクションの7日後に
細胞をピューロマイシンで処理した。ピューロマイシン耐性細胞から単一クローンを単離
した後、シーケンシングとウエスタンブロットによる検証を行った。
内因性または外因性で発現した転写産物のRNA編集
二重蛍光レポーターでのRNA編集を評価するために、HEK293T細胞またはHE
K293T ADAR1-/-細胞を6ウェルプレート(6×105細胞/ウェル)に播
種した。24時間後、細胞に1.5μgのレポータープラスミドと1.5μgのarRN
Aプラスミドを同時トランスフェクトした。ADAR1p110、ADAR1p150、
またはADAR2タンパク質発現の影響を調べるために、編集効率をEGFP陽性率とデ
ィープシーケンシングによってアッセイした。
二重蛍光レポーターでのRNA編集を評価するために、HEK293T細胞またはHE
K293T ADAR1-/-細胞を6ウェルプレート(6×105細胞/ウェル)に播
種した。24時間後、細胞に1.5μgのレポータープラスミドと1.5μgのarRN
Aプラスミドを同時トランスフェクトした。ADAR1p110、ADAR1p150、
またはADAR2タンパク質発現の影響を調べるために、編集効率をEGFP陽性率とデ
ィープシーケンシングによってアッセイした。
HEK293T ADAR1-/-細胞を12ウェルプレートに播種した(2.5×1
05細胞/ウェル)。24時間後、細胞に0.5μgのレポータープラスミド、0.5μ
gのarRNAプラスミドおよび0.5μgのADAR1/2プラスミド(対照としての
pLentiバックボーン)を同時トランスフェクトした。編集効率は、EGFP陽性率
とディープシーケンシングによって測定された。
05細胞/ウェル)。24時間後、細胞に0.5μgのレポータープラスミド、0.5μ
gのarRNAプラスミドおよび0.5μgのADAR1/2プラスミド(対照としての
pLentiバックボーン)を同時トランスフェクトした。編集効率は、EGFP陽性率
とディープシーケンシングによって測定された。
内因性mRNA転写産物のRNA編集を評価するために、HEK293T細胞を6ウェ
ルプレートに播種した(6×105細胞/ウェル)。24時間後、細胞に3μgのarR
NAプラスミドをトランスフェクトした。編集効率は、ディープシーケンシングによって
解析された。
ルプレートに播種した(6×105細胞/ウェル)。24時間後、細胞に3μgのarR
NAプラスミドをトランスフェクトした。編集効率は、ディープシーケンシングによって
解析された。
複数の細胞株でのRNA編集効率を評価するために、8~9×104(RD、SF26
8、HeLa)または1.5×105(HEK293T)細胞を12ウェルプレートに播
種した。HT29、A549、HepG2、SW13、NIH3T3、MEF、B16な
どのトランスフェクションが困難な細胞の場合、2~2.5×105個の細胞を6ウェル
プレートに播種した。24時間後、レポーターとarRNAプラスミドをこれらの細胞に
同時トランスフェクトした。編集効率は、EGFP陽性率によって測定された。
8、HeLa)または1.5×105(HEK293T)細胞を12ウェルプレートに播
種した。HT29、A549、HepG2、SW13、NIH3T3、MEF、B16な
どのトランスフェクションが困難な細胞の場合、2~2.5×105個の細胞を6ウェル
プレートに播種した。24時間後、レポーターとarRNAプラスミドをこれらの細胞に
同時トランスフェクトした。編集効率は、EGFP陽性率によって測定された。
EGFP陽性率を評価するために、トランスフェクションの48~72時間後に、蛍光
活性化細胞選別(FACS)解析によって細胞を選別して収集した。mCherryシグ
ナルは、レポーター/arRNA発現細胞の蛍光選択マーカーとして機能し、EGFP+
/mCherry+細胞のパーセンテージは編集効率の読み取り値として計算された。
活性化細胞選別(FACS)解析によって細胞を選別して収集した。mCherryシグ
ナルは、レポーター/arRNA発現細胞の蛍光選択マーカーとして機能し、EGFP+
/mCherry+細胞のパーセンテージは編集効率の読み取り値として計算された。
AからIへの編集率のNGS定量化のために、トランスフェクションの48~72時間
後に、細胞をFACSアッセイによって選別および収集してRNA単離(TIANGEN
、DP420)をした。次に、RT-PCR(TIANGEN、KR103-04)を介
して全RNAをcDNAに逆転写し、次の表に記載されている対応するプライマーを使用
して、標的遺伝子座をPCR増幅した。
後に、細胞をFACSアッセイによって選別および収集してRNA単離(TIANGEN
、DP420)をした。次に、RT-PCR(TIANGEN、KR103-04)を介
して全RNAをcDNAに逆転写し、次の表に記載されている対応するプライマーを使用
して、標的遺伝子座をPCR増幅した。
PCR産物は、精製されてサンガーシーケンシングまたはNGS(Illumina
HiSeq X Ten)に供した。
HiSeq X Ten)に供した。
ディープシーケンシング
内因性mRNA編集実験では、293T-WT細胞を6ウェルプレートに播種した(6
×105細胞/ウェル)。約70%コンフルエントになったら、X-tremeGENE
HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)を使用してHEK293細胞に
3μgのdRNAをトランスフェクトした。72時間後、FACSを介してGFP陽性ま
たはBFP陽性細胞を(対応する蛍光マーカーに従って)選別し、続いてRNAを単離し
た。次に、単離されたRNAをRT-PCRを介してcDNAに逆転写し、対応するプラ
イマーペアで特異的標的遺伝子座を増幅し(23PCRサイクル)、Illumina
NextSeqでシーケンシングした。
内因性mRNA編集実験では、293T-WT細胞を6ウェルプレートに播種した(6
×105細胞/ウェル)。約70%コンフルエントになったら、X-tremeGENE
HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)を使用してHEK293細胞に
3μgのdRNAをトランスフェクトした。72時間後、FACSを介してGFP陽性ま
たはBFP陽性細胞を(対応する蛍光マーカーに従って)選別し、続いてRNAを単離し
た。次に、単離されたRNAをRT-PCRを介してcDNAに逆転写し、対応するプラ
イマーペアで特異的標的遺伝子座を増幅し(23PCRサイクル)、Illumina
NextSeqでシーケンシングした。
複数の細胞株でのテスト
HEK293T(陽性対照)およびHEK293T ADAR1-/-(陰性対照)細
胞に加えて、1つのマウス細胞株(NIH3T3)およびさまざまな組織や器官に由来す
る7つのヒト細胞株(RD、HeLa、SF268、A549、HepG2、HT-29
、SW13)を選択して実験を行った。トランスフェクション効率の高い細胞株では、約
8~9×104細胞(RD、HeLa、SF268)または1.5×105(HEK29
3T)を12ウェルプレートの各ウェルに播種し、トランスフェクションが困難なもの(
A549、HepG2、HT-29、SW13、NIH3T3)について、2~2.5x
105細胞を6ウェルプレートに播種した。そして、これらの細胞はすべて、37℃でダ
ルベッコ改良イーグル培地(DMEM、Corning)で維持され、この培地には、1
0%ウシ胎児血清(FBS、CellMax)及び5%CO2が補充された。24時間後
、CG2レポーターと71nt dRNA(35-C-35)プラスミドをX-trem
eGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)で異なるタイプの細
胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞をトリプシン
で処理し、FACS(BD)で解析した。トランスフェクション効率の低い細胞ではmC
herryおよびBFP陽性細胞が非常に少なかったため、6ウェルプレートに播種した
細胞は、FACS解析のために、総細胞数を1×105に増やした。
HEK293T(陽性対照)およびHEK293T ADAR1-/-(陰性対照)細
胞に加えて、1つのマウス細胞株(NIH3T3)およびさまざまな組織や器官に由来す
る7つのヒト細胞株(RD、HeLa、SF268、A549、HepG2、HT-29
、SW13)を選択して実験を行った。トランスフェクション効率の高い細胞株では、約
8~9×104細胞(RD、HeLa、SF268)または1.5×105(HEK29
3T)を12ウェルプレートの各ウェルに播種し、トランスフェクションが困難なもの(
A549、HepG2、HT-29、SW13、NIH3T3)について、2~2.5x
105細胞を6ウェルプレートに播種した。そして、これらの細胞はすべて、37℃でダ
ルベッコ改良イーグル培地(DMEM、Corning)で維持され、この培地には、1
0%ウシ胎児血清(FBS、CellMax)及び5%CO2が補充された。24時間後
、CG2レポーターと71nt dRNA(35-C-35)プラスミドをX-trem
eGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)で異なるタイプの細
胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞をトリプシン
で処理し、FACS(BD)で解析した。トランスフェクション効率の低い細胞ではmC
herryおよびBFP陽性細胞が非常に少なかったため、6ウェルプレートに播種した
細胞は、FACS解析のために、総細胞数を1×105に増やした。
標的部位のRNA編集解析
ディープシーケンシング解析では、arRNAカバー配列の標的部位配列(上流および
下流20-nt)を使用してインデックスが生成された。読み取りは、BWAバージョン
0.7.10-r789を使用してアライメントおよび定量化された。次に、BAMをS
amtoolsアライメントで選別し、REDitools 1.0.4バージョンを使
用してRNA編集部位を解析した。パラメータは、-U[AGまたはTC]-t8-n0
.0-T6-6-e-d-uであった。フィッシャーの直接確率検定(Fisher’s
exact test)(p値<0.05)によって計算されたarRNA標的領域内
のすべての有意なA>G変換(p値<0.05)は、arRNAによる編集と見なされた
。標的アデノシン以外の変換は、オフターゲット編集であった。対照群と実験群に同時に
現れた突然変異はSNPと見なされた。
ディープシーケンシング解析では、arRNAカバー配列の標的部位配列(上流および
下流20-nt)を使用してインデックスが生成された。読み取りは、BWAバージョン
0.7.10-r789を使用してアライメントおよび定量化された。次に、BAMをS
amtoolsアライメントで選別し、REDitools 1.0.4バージョンを使
用してRNA編集部位を解析した。パラメータは、-U[AGまたはTC]-t8-n0
.0-T6-6-e-d-uであった。フィッシャーの直接確率検定(Fisher’s
exact test)(p値<0.05)によって計算されたarRNA標的領域内
のすべての有意なA>G変換(p値<0.05)は、arRNAによる編集と見なされた
。標的アデノシン以外の変換は、オフターゲット編集であった。対照群と実験群に同時に
現れた突然変異はSNPと見なされた。
トランスクリプトーム全体のRNAシーケンシング解析
BFP発現カセットを有する対照RNA151またはarRNA151-PPIB発現
プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48
時間後にFACSによってBFP+細胞が濃縮され、RNAはRNAprep Pure
Microキット(TIANGEN、DP420)で精製された。次に、NEBNex
t ポリ(A)mRNA磁性分離モジュール(New England Biolabs
、E7490)を使用してmRNAを精製し、IlluminaのNEBNext Ul
tra II RNAライブラリープレプキット(New England Biola
bs、E7770)で処理した後、Illumina HiSeq X Tenプラット
フォーム(2×150-bpペアエンド;各サンプル30G)を使用してディープシーケ
ンス解析を行った。トランスフェクションによる非特異的影響を排除するために、トラン
スフェクション試薬でのみ細胞を処理した模擬グループを含めた。各グループには4つの
複製が含まれていた。
BFP発現カセットを有する対照RNA151またはarRNA151-PPIB発現
プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48
時間後にFACSによってBFP+細胞が濃縮され、RNAはRNAprep Pure
Microキット(TIANGEN、DP420)で精製された。次に、NEBNex
t ポリ(A)mRNA磁性分離モジュール(New England Biolabs
、E7490)を使用してmRNAを精製し、IlluminaのNEBNext Ul
tra II RNAライブラリープレプキット(New England Biola
bs、E7770)で処理した後、Illumina HiSeq X Tenプラット
フォーム(2×150-bpペアエンド;各サンプル30G)を使用してディープシーケ
ンス解析を行った。トランスフェクションによる非特異的影響を排除するために、トラン
スフェクション試薬でのみ細胞を処理した模擬グループを含めた。各グループには4つの
複製が含まれていた。
バイオインフォマティクス解析パイプラインは、Vogelら(非特許文献22)が参
照された。解析の品質管理はFastQCを使用して行われ、品質トリムはCutada
ptに基づいた(各読み取りの最初の6-bpがトリムされ、最大20-bpが品質トリ
ムされた)。AWKスクリプトを使用して、導入されたarRNAをフィルタリングした
。トリミング後、90-nt未満の長さのリードはフィルタリングされた。続いて、フィ
ルタリングされたリードは、STARソフトウェア(非特許文献61)によってリファレ
ンスゲノム(GRCh38-hg38)にマッピングされた。GATK Haploty
pcaller(非特許文献62)を使用してバリアントを徴用(call)した。GATK
によって生成された原始VCFファイルは、GATK VariantFiltrati
on、bcftools、およびANNOVAR(非特許文献63)によってフィルタリ
ングされ、注釈が付けられた。dbSNP、1000 Genome(非特許文献64)
のバリアントからEVSはろ過された。次に、各グループの4つの複製の共有バリアント
がRNA編集部位として選択された。模擬グループのRNA編集レベルをバックグラウン
ドとして表示し、模擬グループのバリアントを差し引くことにより、対照RNA151お
よびarRNA151-PPIBの全体標的を取得した。
照された。解析の品質管理はFastQCを使用して行われ、品質トリムはCutada
ptに基づいた(各読み取りの最初の6-bpがトリムされ、最大20-bpが品質トリ
ムされた)。AWKスクリプトを使用して、導入されたarRNAをフィルタリングした
。トリミング後、90-nt未満の長さのリードはフィルタリングされた。続いて、フィ
ルタリングされたリードは、STARソフトウェア(非特許文献61)によってリファレ
ンスゲノム(GRCh38-hg38)にマッピングされた。GATK Haploty
pcaller(非特許文献62)を使用してバリアントを徴用(call)した。GATK
によって生成された原始VCFファイルは、GATK VariantFiltrati
on、bcftools、およびANNOVAR(非特許文献63)によってフィルタリ
ングされ、注釈が付けられた。dbSNP、1000 Genome(非特許文献64)
のバリアントからEVSはろ過された。次に、各グループの4つの複製の共有バリアント
がRNA編集部位として選択された。模擬グループのRNA編集レベルをバックグラウン
ドとして表示し、模擬グループのバリアントを差し引くことにより、対照RNA151お
よびarRNA151-PPIBの全体標的を取得した。
LEAPERが自然な編集ホメオスタシスを混乱させるかどうかを評価するために、模
擬グループとarRNA151-PPIBグループ(または対照RNA151グループ)
が共有するグローバル編集部位を解析した。ネイティブのAからIへの編集部位でのRN
A編集率の差は、ピアソン(Pearson)の相関係数解析で評価された。模擬グルー
プとarRNA151-PPIBグループ(または対照RNA151グループ)の間の編
集率のピアソン相関を計算し、図6に注釈を付けた。
擬グループとarRNA151-PPIBグループ(または対照RNA151グループ)
が共有するグローバル編集部位を解析した。ネイティブのAからIへの編集部位でのRN
A編集率の差は、ピアソン(Pearson)の相関係数解析で評価された。模擬グルー
プとarRNA151-PPIBグループ(または対照RNA151グループ)の間の編
集率のピアソン相関を計算し、図6に注釈を付けた。
Xは、模擬グループの各部位の編集率を表し、Yは、対照RNA151グループ(図6
A)またはarRNA151-PPIBグループ(図6B)の各部位の編集率を表す。σ
xはXの標準偏差であり、σyはYの標準偏差であり、μxはXの平均であり、μyはY
の平均であり、Eは期待値である。
A)またはarRNA151-PPIBグループ(図6B)の各部位の編集率を表す。σ
xはXの標準偏差であり、σyはYの標準偏差であり、μxはXの平均であり、μyはY
の平均であり、Eは期待値である。
RNA-Seqデータは、RNA編集イベントによって誘発される可能性のある転写変
化の調査のために解析された。トランスクリプトーム全体の遺伝子発現の解析は、HIS
AT2およびSTRINGTIEソフトウェアを使用して実行された(非特許文献65)
。シーケンスデータの品質管理には、CutadaptとFastQCを使用した。次に
、HISAT2を使用してシーケンスリードをリファレンスゲノム(GRCh38-hg
38)にマッピングし、前述のようにピアソン(Pearson)の相関係数解析を行っ
た。
化の調査のために解析された。トランスクリプトーム全体の遺伝子発現の解析は、HIS
AT2およびSTRINGTIEソフトウェアを使用して実行された(非特許文献65)
。シーケンスデータの品質管理には、CutadaptとFastQCを使用した。次に
、HISAT2を使用してシーケンスリードをリファレンスゲノム(GRCh38-hg
38)にマッピングし、前述のようにピアソン(Pearson)の相関係数解析を行っ
た。
ウエスタンブロット
ADAR1(Santa Cruz、sc-271854)、ADAR2(Santa
Cruz、sc-390995)、ADAR3(Santa Cruz、sc-734
10)、P53(Santa Cruz、sc-99)、KRAS(Sigma、SAB
1404011); GAPDH(Santa Cruz、sc-47724)およびβ-
チューブリン(CWBiotech、CW0098)に対するマウスモノクローナル一次
抗体をそれぞれ使用した。HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG(H+L、
115-035-003)二次抗体は、Jackson ImmunoResearch
から購入した。2×106個の細胞を選別して溶解し、等量の各溶解物をSDS-PAG
E用にロードした。次に、サンプルタンパク質をPVDFメンブレン(Bio-Rad
Laboratories)に転写し、ADAR酵素の1つに対する一次抗体(抗ADA
R1、1:500、抗ADAR2、1:100、抗ADAR3、1:800)でイムノブ
ロットした。続いて、二次抗体のインキュベーション(1:10,000)および曝露を
行った。ADARタンパク質を剥離緩衝液(CWBiotech、CW0056)で剥離
した後、β-チューブリンを同じPVDFメンブレンで再プローブした。実験は3回繰り
返された。半定量解析は、Image Labソフトウェアを使用して行われた。
ADAR1(Santa Cruz、sc-271854)、ADAR2(Santa
Cruz、sc-390995)、ADAR3(Santa Cruz、sc-734
10)、P53(Santa Cruz、sc-99)、KRAS(Sigma、SAB
1404011); GAPDH(Santa Cruz、sc-47724)およびβ-
チューブリン(CWBiotech、CW0098)に対するマウスモノクローナル一次
抗体をそれぞれ使用した。HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG(H+L、
115-035-003)二次抗体は、Jackson ImmunoResearch
から購入した。2×106個の細胞を選別して溶解し、等量の各溶解物をSDS-PAG
E用にロードした。次に、サンプルタンパク質をPVDFメンブレン(Bio-Rad
Laboratories)に転写し、ADAR酵素の1つに対する一次抗体(抗ADA
R1、1:500、抗ADAR2、1:100、抗ADAR3、1:800)でイムノブ
ロットした。続いて、二次抗体のインキュベーション(1:10,000)および曝露を
行った。ADARタンパク質を剥離緩衝液(CWBiotech、CW0056)で剥離
した後、β-チューブリンを同じPVDFメンブレンで再プローブした。実験は3回繰り
返された。半定量解析は、Image Labソフトウェアを使用して行われた。
サイトカイン発現アッセイ
HEK293T細胞を12ウェルプレートに播種した(2×105細胞/ウェル)。約
70%がコンフルエンシーになったら、細胞に1.5μgのarRNAをトランスフェク
トした。陽性対照として、1μgのポリ(I:C)(Invitrogen、tlrl-
picw)をトランスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、RNA分離(TIAN
GEN、DP430)を行った。次に、RT-PCR(TIANGEN、KR103-0
4)を介して全RNAをcDNAに逆転写し、定量PCR(TAKARA、RR820A
)によりIFN-βとIL-6の発現を測定した。プライマーの配列は上の表に記載され
ている。
HEK293T細胞を12ウェルプレートに播種した(2×105細胞/ウェル)。約
70%がコンフルエンシーになったら、細胞に1.5μgのarRNAをトランスフェク
トした。陽性対照として、1μgのポリ(I:C)(Invitrogen、tlrl-
picw)をトランスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、RNA分離(TIAN
GEN、DP430)を行った。次に、RT-PCR(TIANGEN、KR103-0
4)を介して全RNAをcDNAに逆転写し、定量PCR(TAKARA、RR820A
)によりIFN-βとIL-6の発現を測定した。プライマーの配列は上の表に記載され
ている。
p53の転写調節活性アッセイ
TP53W53X cDNA発現プラスミドとarRNA発現プラスミドを、p53の
転写調節活性を検出するために、p53-ホタルルシフェラーゼシス報告プラスミド(Y
RGene、VXS0446)およびレニラルシフェラーゼプラスミド(北京大学Z.J
iang研究室からの贈り物)とともにHEK293T TP53-/-細胞に同時トラ
ンスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、製造元のプロトコルに従ってProme
ga Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、E4030
)でアッセイした。簡単に説明すると、150μLのデュアルグロルシフェラーゼ試薬を
採取した細胞ペレットに添加し、30分後、100μLのデュアルグロルシフェラーゼ試
薬(細胞溶解)をInfinite M200リーダー(TECAN)で96ウェルホワ
イトプレートに添加してホタルの発光を測定した。30分後、100μLのデュアルグロ
ストップとグロ試薬を各ウェルに順次添加して、レニラ発光を測定し、ホタル発光とレニ
ラ発光の比率を計算した。
TP53W53X cDNA発現プラスミドとarRNA発現プラスミドを、p53の
転写調節活性を検出するために、p53-ホタルルシフェラーゼシス報告プラスミド(Y
RGene、VXS0446)およびレニラルシフェラーゼプラスミド(北京大学Z.J
iang研究室からの贈り物)とともにHEK293T TP53-/-細胞に同時トラ
ンスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、製造元のプロトコルに従ってProme
ga Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、E4030
)でアッセイした。簡単に説明すると、150μLのデュアルグロルシフェラーゼ試薬を
採取した細胞ペレットに添加し、30分後、100μLのデュアルグロルシフェラーゼ試
薬(細胞溶解)をInfinite M200リーダー(TECAN)で96ウェルホワ
イトプレートに添加してホタルの発光を測定した。30分後、100μLのデュアルグロ
ストップとグロ試薬を各ウェルに順次添加して、レニラ発光を測定し、ホタル発光とレニ
ラ発光の比率を計算した。
初代細胞でのエレクトロポレーション
ヒト初代肺線維芽細胞またはヒト初代気管支上皮細胞におけるarRNA発現プラスミ
ドのエレクトロポレーションでは、20μgのプラスミドをNucleofector(
登録商標) 2b装置(Lonza)およびBasic Nucleofector(登
録商標)キット(Lonza、VPI-1002)でエレクトロポレーションし、エレク
トロポレーションプログラムはU-023であった。ヒト初代T細胞におけるarRNA
発現プラスミドのエレクトロポレーションでは、20μgのプラスミドをNucleof
ector(登録商標) 2b Device(Lonza)およびHuman T細胞
Nucleofector(登録商標) Kit(Lonza、VPA-1002)を使
用してヒト初代Tにエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションプログラムはT
-024であった。エレクトロポレーションの48時間後、細胞をFACSアッセイで選
別および収集し、標的RNA編集アッセイのために以下のディープシーケンシングを行っ
た。エレクトロポレーション効率は、蛍光マーカーに従って正規化された。
ヒト初代肺線維芽細胞またはヒト初代気管支上皮細胞におけるarRNA発現プラスミ
ドのエレクトロポレーションでは、20μgのプラスミドをNucleofector(
登録商標) 2b装置(Lonza)およびBasic Nucleofector(登
録商標)キット(Lonza、VPI-1002)でエレクトロポレーションし、エレク
トロポレーションプログラムはU-023であった。ヒト初代T細胞におけるarRNA
発現プラスミドのエレクトロポレーションでは、20μgのプラスミドをNucleof
ector(登録商標) 2b Device(Lonza)およびHuman T細胞
Nucleofector(登録商標) Kit(Lonza、VPA-1002)を使
用してヒト初代Tにエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションプログラムはT
-024であった。エレクトロポレーションの48時間後、細胞をFACSアッセイで選
別および収集し、標的RNA編集アッセイのために以下のディープシーケンシングを行っ
た。エレクトロポレーション効率は、蛍光マーカーに従って正規化された。
ヒト初代T細胞または初代GM06214細胞における化学合成arRNAまたは対照
RNAエレクトロポレーションでは、RNAオリゴを最終濃度2μMの100μLоpt
i-MEM培地(Gbico、31985070)に溶解した。次に、1×10E6 G
M06214細胞または3×10E6 T細胞を上記のエレクトロポレーション混合物で
再懸濁し、450Vで1msの間Agile Pulse In Vivoデバイス(B
TX)でエレクトロポレーションした。そして、以下のアッセイのために、細胞を温かい
培地に移した。
RNAエレクトロポレーションでは、RNAオリゴを最終濃度2μMの100μLоpt
i-MEM培地(Gbico、31985070)に溶解した。次に、1×10E6 G
M06214細胞または3×10E6 T細胞を上記のエレクトロポレーション混合物で
再懸濁し、450Vで1msの間Agile Pulse In Vivoデバイス(B
TX)でエレクトロポレーションした。そして、以下のアッセイのために、細胞を温かい
培地に移した。
α-L-イズロニダーゼ(IDUA)触媒活性アッセイ
採取した細胞ペレットを再懸濁し、氷上で1×PBS緩衝液中の0.5%Triton
X-100 28μLで30分間溶解した。次に、25μLの細胞溶解液を25μLの
190μM 4-メチルウンベリフェリル-α-L-イデュロニダーゼ基質(Cayma
n、2A-19543-500)に添加し、0.2%Triton X-100を含む0
.4Mギ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、pH 3.5、暗所で37℃で90分間インキュ
ベートした。触媒反応は、200μLの0.5M NaOH/グリシン緩衝液、pH10
.3を添加してクエンチし、4℃で2分間遠心分離した。上清を96ウェルプレートに移
し、Infinite M200リーダー(TECAN)を使用して365nmの励起波
長と450nmの発光波長で蛍光を測定した。
採取した細胞ペレットを再懸濁し、氷上で1×PBS緩衝液中の0.5%Triton
X-100 28μLで30分間溶解した。次に、25μLの細胞溶解液を25μLの
190μM 4-メチルウンベリフェリル-α-L-イデュロニダーゼ基質(Cayma
n、2A-19543-500)に添加し、0.2%Triton X-100を含む0
.4Mギ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、pH 3.5、暗所で37℃で90分間インキュ
ベートした。触媒反応は、200μLの0.5M NaOH/グリシン緩衝液、pH10
.3を添加してクエンチし、4℃で2分間遠心分離した。上清を96ウェルプレートに移
し、Infinite M200リーダー(TECAN)を使用して365nmの励起波
長と450nmの発光波長で蛍光を測定した。
実施例1
レポーターに基づいた本発明のRNA編集法の試験
Cas13ファミリータンパク質(C2c2)が哺乳類細胞のRNAを編集できること
が報告されている。さらに、このシステムをさまざまな条件下でテストした。まず、mC
herryとEGFP遺伝子の間に終止コドンを含む3×GSリンカーターゲティング配
列を導入することにより、mCherryとEGFPの蛍光に基づく二重蛍光レポーター
システムを構築した。また、EGFP翻訳の漏れを減らすために、EGFPの開始コドン
ATGを削除した。
レポーターに基づいた本発明のRNA編集法の試験
Cas13ファミリータンパク質(C2c2)が哺乳類細胞のRNAを編集できること
が報告されている。さらに、このシステムをさまざまな条件下でテストした。まず、mC
herryとEGFP遺伝子の間に終止コドンを含む3×GSリンカーターゲティング配
列を導入することにより、mCherryとEGFPの蛍光に基づく二重蛍光レポーター
システムを構築した。また、EGFP翻訳の漏れを減らすために、EGFPの開始コドン
ATGを削除した。
二重蛍光レポーター-1は、mCherryの配列(配列番号1)、3×GSリンカー
および標的Aを含む配列(配列番号2)、およびeGFPの配列(配列番号3)を含む。
および標的Aを含む配列(配列番号2)、およびeGFPの配列(配列番号3)を含む。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGT
GAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGA
CCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCAC
CCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGG
CGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACT
TCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGC
GCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAA
GGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACA
CCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG (mChe
rryの配列)(配列番号1)
GAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGA
CCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCAC
CCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGG
CGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACT
TCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGC
GCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAA
GGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACA
CCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG (mChe
rryの配列)(配列番号1)
GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTT
CAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGC
CCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAG
CACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAA
GACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACG
GCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC
ATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC
CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGA
AGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
(eGFPの配列)(配列番号3)
CAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGC
CCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAG
CACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAA
GACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACG
GCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC
ATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC
CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGA
AGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
(eGFPの配列)(配列番号3)
二重蛍光レポーター-2は、mCherryの配列(配列番号1)、3×GSリンカー
(斜体及び太字で示されている)及び標的A(大きい太字Aで示されている)を含む配列
(配列番号4)、及びeGFPの配列(配列番号3)を含む。
(斜体及び太字で示されている)及び標的A(大きい太字Aで示されている)を含む配列
(配列番号4)、及びeGFPの配列(配列番号3)を含む。
二重蛍光レポーター-3は、mCherryの配列(配列番号1)、1×GSリンカー
(斜体及び太字で示されている)及び標的Aを含む配列(配列番号5)、及びeGFPの
配列(配列番号3)を含む。
(斜体及び太字で示されている)及び標的Aを含む配列(配列番号5)、及びeGFPの
配列(配列番号3)を含む。
mCherry-3xGSリンカー-TAG-EGFPをpLenti-バックボーン
にクローニングし、レポータープラスミドをレンチウイルスにパックした。レンチウイル
スは293T細胞に感染し、二重蛍光レポーターを発現する安定した細胞株を構築した。
次に、レポーターシステムとしてEGFP蛍光バックグラウンドが低い単一のクローンを
選択した。最適なcrRNA設計をテストするために、ターゲティングアデノシンをわた
って28~78ヌクレオチド長のスペーサーを使用してLbucC2c2 crRNAガ
イドを並べた。より長いcrRNAガイドがより高いEGFP陽性効率を与えることを発
見した。驚くべきことに、dC2c2-ADARDDを発現するプラスミドを同時トラン
スフェクションせずにターゲットcrRNAプラスミドをトランスフェクトすると、EG
FPタンパク質が実質的に発現された。たとえば、次の配列を含むcrRNAガイド:GG
ACCACCCCAAAAAUGAAUAUAACCAAAACUGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGCAUCGCGAGC
AGGCGCUGCCUCCUCCGCC(配列番号6)には、25%を超えるEGFP陽性効率が与えられ
た。これは、終止コドンUAGのアデニンが大幅に編集されていることを示している。対
照的に、ランダムcrRNAはEGFP陰性細胞を陽性にすることができなかった(図6
A、6Bおよび6C)。これらの結果に基づいて、単一のRNA転写産物の過剰発現のみ
では内因性ADAR酵素を利用してRNAを編集できると推測した。
にクローニングし、レポータープラスミドをレンチウイルスにパックした。レンチウイル
スは293T細胞に感染し、二重蛍光レポーターを発現する安定した細胞株を構築した。
次に、レポーターシステムとしてEGFP蛍光バックグラウンドが低い単一のクローンを
選択した。最適なcrRNA設計をテストするために、ターゲティングアデノシンをわた
って28~78ヌクレオチド長のスペーサーを使用してLbucC2c2 crRNAガ
イドを並べた。より長いcrRNAガイドがより高いEGFP陽性効率を与えることを発
見した。驚くべきことに、dC2c2-ADARDDを発現するプラスミドを同時トラン
スフェクションせずにターゲットcrRNAプラスミドをトランスフェクトすると、EG
FPタンパク質が実質的に発現された。たとえば、次の配列を含むcrRNAガイド:GG
ACCACCCCAAAAAUGAAUAUAACCAAAACUGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGCAUCGCGAGC
AGGCGCUGCCUCCUCCGCC(配列番号6)には、25%を超えるEGFP陽性効率が与えられ
た。これは、終止コドンUAGのアデニンが大幅に編集されていることを示している。対
照的に、ランダムcrRNAはEGFP陰性細胞を陽性にすることができなかった(図6
A、6Bおよび6C)。これらの結果に基づいて、単一のRNA転写産物の過剰発現のみ
では内因性ADAR酵素を利用してRNAを編集できると推測した。
また、RNAガイドのスキャフォールドRNA配列を削除し、リニアガイドRNAを作
製した。70ヌクレオチド長の、ACミスマッチを有するターゲティングRNAに相補的
なRNA(AAACCGAGGGAUCAUAGGGGACUGAAUCCACCAUUCUUCUCCCAAUCCCUGCAACUCCUUCUUCCCCUGC
)(配列番号7)が、EGFP陰性細胞を効果的にEGFP陽性細胞に転化させることが
できるが、70-ntのランダムRNA(UGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGC
AUCGCGAGCAGGCGCUGCCUCCUCCGCC)(配列番号8)がそうすることができないことを発見し
た(図1A、1B、1C、及び1D)。したがって、このRNAをdRNA(デアミナー
ゼ動員RNA)と指定した。細胞内因性ADARを動員してdRNAによるアデニン脱ア
ミノ化を実施できることを確認するために、Adar1 p110およびAdar1 p
150ダブルノックアウト293T細胞株で実験を行った(図6E及び6F)。Adar
1は遍在的に発現しているのに対し、Adar2は主に脳で高レベルに発現しているため
である。そこで、dRNAによるアデニン脱アミノ化のターゲティングは主にAdar1
によって媒介され、Adar2によっては媒介されていないことを提案した。予想通り、
ターゲティングdRNAは293T-Adar1-/-細胞でEGFP発現をトリガーで
きなかったが、外因性Adar1 p110、p150、またはAdar2のいずれかを
過剰発現させると、293T-Adar1-/-細胞でEGFP発現をレスキューするこ
とができた(図1E及び1F)。293T細胞では、dRNAがAdar1またはAda
r2を動員して、標的RNAのアデニン脱アミノ化を媒介できることを示唆している。さ
らに、Adar1-p110およびAdar1-p150の異なる細胞局在化のためかも
しれないが、Adar1-p110およびAdar2は、Adar1-p150よりも高
い編集活性を有することが見出された(図1Gおよび図6G)。
製した。70ヌクレオチド長の、ACミスマッチを有するターゲティングRNAに相補的
なRNA(AAACCGAGGGAUCAUAGGGGACUGAAUCCACCAUUCUUCUCCCAAUCCCUGCAACUCCUUCUUCCCCUGC
)(配列番号7)が、EGFP陰性細胞を効果的にEGFP陽性細胞に転化させることが
できるが、70-ntのランダムRNA(UGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGC
AUCGCGAGCAGGCGCUGCCUCCUCCGCC)(配列番号8)がそうすることができないことを発見し
た(図1A、1B、1C、及び1D)。したがって、このRNAをdRNA(デアミナー
ゼ動員RNA)と指定した。細胞内因性ADARを動員してdRNAによるアデニン脱ア
ミノ化を実施できることを確認するために、Adar1 p110およびAdar1 p
150ダブルノックアウト293T細胞株で実験を行った(図6E及び6F)。Adar
1は遍在的に発現しているのに対し、Adar2は主に脳で高レベルに発現しているため
である。そこで、dRNAによるアデニン脱アミノ化のターゲティングは主にAdar1
によって媒介され、Adar2によっては媒介されていないことを提案した。予想通り、
ターゲティングdRNAは293T-Adar1-/-細胞でEGFP発現をトリガーで
きなかったが、外因性Adar1 p110、p150、またはAdar2のいずれかを
過剰発現させると、293T-Adar1-/-細胞でEGFP発現をレスキューするこ
とができた(図1E及び1F)。293T細胞では、dRNAがAdar1またはAda
r2を動員して、標的RNAのアデニン脱アミノ化を媒介できることを示唆している。さ
らに、Adar1-p110およびAdar1-p150の異なる細胞局在化のためかも
しれないが、Adar1-p110およびAdar2は、Adar1-p150よりも高
い編集活性を有することが見出された(図1Gおよび図6G)。
EGFP蛍光の回復がターゲティングRNA編集イベントによるものであると確認する
ために、RT-PCRを通して、dRNAを介したレポーター2転写産物の編集を直接測
定し、そして、ターゲティングサンガーシーケンシングおよび次世代シーケンシングをし
た。シーケンシングの結果は、標的アデニン(A-Cミスマッチ部位)におけるAからG
への塩基変換を示し、編集率は13%に達する可能性があることを示した(図6Hおよび
図1H)。さらに、標的アデニンの近くのシーケンスウィンドウでAからGへの編集がわ
ずかに観察されたが、これはおそらく二本鎖RNA領域の増加が原因であり、後でいくつ
かのストラテジーで予期しない編集を取り除こうとした。
ために、RT-PCRを通して、dRNAを介したレポーター2転写産物の編集を直接測
定し、そして、ターゲティングサンガーシーケンシングおよび次世代シーケンシングをし
た。シーケンシングの結果は、標的アデニン(A-Cミスマッチ部位)におけるAからG
への塩基変換を示し、編集率は13%に達する可能性があることを示した(図6Hおよび
図1H)。さらに、標的アデニンの近くのシーケンスウィンドウでAからGへの編集がわ
ずかに観察されたが、これはおそらく二本鎖RNA領域の増加が原因であり、後でいくつ
かのストラテジーで予期しない編集を取り除こうとした。
実施例2
dRNAを設計するための要因の最適化
次に、dRNAを最適化して、より高い編集効率を実現することに着手した。まず、標
的アデニンの反対側のサイトのどの塩基が編集により有利であるかを決定することを目的
とした。以前の研究では、標的アデノシンの反対側の塩基が編集に効率的に影響すること
が示されていた。したがって、標的Aの反対側の中央位置にミスマッチN(A、U、C、
及びG)を持つ71nt dRNAを設計した。FACSの結果に基づいて、4つの異な
るdRNAが次のように効率的に編集されることがわかった:C>A>U>G(図2A及
び2B)。最近、標的UAGサイトの小さなバブルが編集効率に役立つ可能性があること
が報告された。したがって、仮説をテストするために、標的UAG部位を持つ2つまたは
3つのミスマッチ塩基を含むdRNAを設計した。ゴールデンゲート(Golden G
ate)クローニング法を使用して、BFPマーカーを含むdRNAベクター上に16種
類の異なる71 ntdRNAを設計および構築した。CCAおよびGCA配列を持つd
RNAが最も効率が高いことがわかった。これは、少なくともUAG標的部位の場合、小
さなバブルがA-I編集にほとんど寄与しないことを意味する。さらに、NCA配列の4
つのdRNAはGFP陽性細胞の割合が高く、相補的なU-A塩基対がADAR編集に重
要である可能性があるという結論に至る(図2Cおよび2D)。続いて、レポーターに基
づいてさまざまな長さのdRNAの効率をテストした。dRNAは、31ntから221
ntの範囲の異なる長さで、中央の位置にミスマッチCが設計された。dRNAが長いほ
ど編集効率が上がることがわかった。レポーターシステムの編集のピークは171nt
dRNAにある。51 nt dRNAは、レポーターシステムを良好な効率(18%)
で活性化させることができる(図2E及び2F)。最後に、dRNAのミスマッチCの位
置が編集効率に影響を与えるかどうかを調べた。dRNAは同じ71ntの長さに保たれ
、転写開始とは異なる位置にミスマッチCが設計された。FACSの結果に基づいて、反
対側のミスマッチCの位置が編集効率に影響を与える可能性があり、dRNAの5’また
は3’にあるミスマッチCの効率が低いことがわかった(図2Gおよび2H)。可能な3
つの塩基モチーフすべてを含む標的配列を含む16の異なるレポーターが、ギブソン(G
ibson)クローニングによって構築され、pLentiバックボーン(pLenti
-CMV-MCS-SV-Bsd,Stanley Cohen Lab,Stanfo
rd University)にクローニングされた。前記標的配列を以下に示す。
dRNAを設計するための要因の最適化
次に、dRNAを最適化して、より高い編集効率を実現することに着手した。まず、標
的アデニンの反対側のサイトのどの塩基が編集により有利であるかを決定することを目的
とした。以前の研究では、標的アデノシンの反対側の塩基が編集に効率的に影響すること
が示されていた。したがって、標的Aの反対側の中央位置にミスマッチN(A、U、C、
及びG)を持つ71nt dRNAを設計した。FACSの結果に基づいて、4つの異な
るdRNAが次のように効率的に編集されることがわかった:C>A>U>G(図2A及
び2B)。最近、標的UAGサイトの小さなバブルが編集効率に役立つ可能性があること
が報告された。したがって、仮説をテストするために、標的UAG部位を持つ2つまたは
3つのミスマッチ塩基を含むdRNAを設計した。ゴールデンゲート(Golden G
ate)クローニング法を使用して、BFPマーカーを含むdRNAベクター上に16種
類の異なる71 ntdRNAを設計および構築した。CCAおよびGCA配列を持つd
RNAが最も効率が高いことがわかった。これは、少なくともUAG標的部位の場合、小
さなバブルがA-I編集にほとんど寄与しないことを意味する。さらに、NCA配列の4
つのdRNAはGFP陽性細胞の割合が高く、相補的なU-A塩基対がADAR編集に重
要である可能性があるという結論に至る(図2Cおよび2D)。続いて、レポーターに基
づいてさまざまな長さのdRNAの効率をテストした。dRNAは、31ntから221
ntの範囲の異なる長さで、中央の位置にミスマッチCが設計された。dRNAが長いほ
ど編集効率が上がることがわかった。レポーターシステムの編集のピークは171nt
dRNAにある。51 nt dRNAは、レポーターシステムを良好な効率(18%)
で活性化させることができる(図2E及び2F)。最後に、dRNAのミスマッチCの位
置が編集効率に影響を与えるかどうかを調べた。dRNAは同じ71ntの長さに保たれ
、転写開始とは異なる位置にミスマッチCが設計された。FACSの結果に基づいて、反
対側のミスマッチCの位置が編集効率に影響を与える可能性があり、dRNAの5’また
は3’にあるミスマッチCの効率が低いことがわかった(図2Gおよび2H)。可能な3
つの塩基モチーフすべてを含む標的配列を含む16の異なるレポーターが、ギブソン(G
ibson)クローニングによって構築され、pLentiバックボーン(pLenti
-CMV-MCS-SV-Bsd,Stanley Cohen Lab,Stanfo
rd University)にクローニングされた。前記標的配列を以下に示す。
可能な3塩基モチーフすべてを含む標的配列:
TAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号9)
TAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号10)
TAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号11)
TAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号12)
AAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号13)
AAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号14)
AAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号15)
AAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号16)
CAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号17)
CAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号18)
CAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号19)
CAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号20)
GAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号21)
GAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号22)
GAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号23)
GAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号24)
TAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号9)
TAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号10)
TAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号11)
TAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号12)
AAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号13)
AAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号14)
AAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号15)
AAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号16)
CAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号17)
CAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号18)
CAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号19)
CAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号20)
GAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号21)
GAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号22)
GAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号23)
GAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGG
CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号24)
dRNAは同じ111bpの長さに保たれ、標的Aに向かって中央にミスマッチCを設
計した。
12ウェル細胞培養クラスターでは、2×105細胞HEK293Tを各ウェルにプレ
ーティングし、各実験を3回繰り返して実施した。24時間後、X-tremeGENE
HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)を使用して、0.5μgのdR
NAプラスミドと0.5μgのレポーターターゲットプラスミドを細胞に同時トランスフ
ェクトした。48時間後、細胞をトリプシン処理し、FACS(BD)を介してmChe
rry陽性細胞を選択した。合計4×105個の細胞を回収し、RNAprep純細胞/
バクテリアキット(TIANGEN DP430)を使用してトータルRNAを抽出した
。Quantscript RT Kit(TIANGEN KR103-04)を使用
して、2μgのトータルRNAからcDNAを合成した。そして、111の標的領域がP
CRによって増幅され、ディープシーケンシングを行った。
16の異なる3塩基モチーフすべてが、可変効率ではあるが、本出願の例示的なRNA
編集方法によって編集できることを見出した。要約すると、結果は、編集されるAの5’
最近傍が優先度U>C≒A>Gを持ち、編集されるAの3’最近傍が優先度G>C>A≒
Uを持っていることを示している。データは図3Aに棒グラフ、図3Bにヒートマップと
して示された。
計した。
12ウェル細胞培養クラスターでは、2×105細胞HEK293Tを各ウェルにプレ
ーティングし、各実験を3回繰り返して実施した。24時間後、X-tremeGENE
HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)を使用して、0.5μgのdR
NAプラスミドと0.5μgのレポーターターゲットプラスミドを細胞に同時トランスフ
ェクトした。48時間後、細胞をトリプシン処理し、FACS(BD)を介してmChe
rry陽性細胞を選択した。合計4×105個の細胞を回収し、RNAprep純細胞/
バクテリアキット(TIANGEN DP430)を使用してトータルRNAを抽出した
。Quantscript RT Kit(TIANGEN KR103-04)を使用
して、2μgのトータルRNAからcDNAを合成した。そして、111の標的領域がP
CRによって増幅され、ディープシーケンシングを行った。
16の異なる3塩基モチーフすべてが、可変効率ではあるが、本出願の例示的なRNA
編集方法によって編集できることを見出した。要約すると、結果は、編集されるAの5’
最近傍が優先度U>C≒A>Gを持ち、編集されるAの3’最近傍が優先度G>C>A≒
Uを持っていることを示している。データは図3Aに棒グラフ、図3Bにヒートマップと
して示された。
実施例3
内因性遺伝子から転写されたRNAの編集
次に、dRNAが内因性遺伝子から転写されたmRNAを媒介できるかどうかをテスト
した。KRAS、PPIB、β-アクチン、及びGAPDHの4つの遺伝子を標的とした
dRNAを設計した。KRAS mRNAについては、以下に示す配列を有する、91、
111、131、151、171、および191ヌクレオチド長のdRNA(図4A)を
設計した。
内因性遺伝子から転写されたRNAの編集
次に、dRNAが内因性遺伝子から転写されたmRNAを媒介できるかどうかをテスト
した。KRAS、PPIB、β-アクチン、及びGAPDHの4つの遺伝子を標的とした
dRNAを設計した。KRAS mRNAについては、以下に示す配列を有する、91、
111、131、151、171、および191ヌクレオチド長のdRNA(図4A)を
設計した。
91-nt KRAS-dRNA
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号25)
111-nt KRAS-dRNA
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACUACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUU
UUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号26)
131-nt KRAS-dRNA
UCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACUACCACAAGUUUAUA
UUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCU (配列番号27)
151-nt KRAS-dRNA
AUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCA
CAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCGC (配列番
号28)
171-nt KRAS-dRNA
CUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCU
CCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCG
CCGCCGCCUUC (配列番号29)
191-nt KRAS-dRNA
UAGGAAUCCUCUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUAC
GCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCC
UCUGGCCCCGCCGCCGCCUUCAGUGCCUGCG (配列番号30)
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号25)
111-nt KRAS-dRNA
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACUACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUU
UUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号26)
131-nt KRAS-dRNA
UCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACUACCACAAGUUUAUA
UUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCU (配列番号27)
151-nt KRAS-dRNA
AUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCA
CAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCGC (配列番
号28)
171-nt KRAS-dRNA
CUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCU
CCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCG
CCGCCGCCUUC (配列番号29)
191-nt KRAS-dRNA
UAGGAAUCCUCUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUAC
GCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCC
UCUGGCCCCGCCGCCGCCUUCAGUGCCUGCG (配列番号30)
次世代シーケンシングの結果、dRNAが最大11.7%の編集効率で標的KRAS
mRNAを編集できることを示した(図4B)。内因性PPIB mRNAの場合、標的
となる3つの部位:部位1、部位2、および部位3がある。以下に示す配列で、各部位に
対して151ヌクレオチド長のdRNAを設計した(図4C)。
mRNAを編集できることを示した(図4B)。内因性PPIB mRNAの場合、標的
となる3つの部位:部位1、部位2、および部位3がある。以下に示す配列で、各部位に
対して151ヌクレオチド長のdRNAを設計した(図4C)。
151-nt PPIB-dRNA (部位1)
GAGGCGCAGCAUCCACAGGCGGAGGCGAAAGCAGCCCGGACAGCUGAGGCCGGAAGAGGGUGGGGCCGCGGUGGCCAGGG
AGCCGGCGCCGCCACGCGCGGGUGGGGGGGACUGGGGUUGCUCGCGGGCUCCGGGCGGGCGGCGGGCGCCG (配列番
号31)
151-nt PPIB-dRNA (部位2)
UCCUGUAGCUAAGGCCACAAAAUUAUCCACUGUUUUUGGAACAGUCUUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCCACAU
CUUCAUCUCCAAUUCGUAGGUCAAAAUACACCUUGACGGUGACUUUGGGCCCCUUCUUCUUCUCAUCGGCC (配列番
号32)
151-nt PPIB-dRNA (部位3)
GCCCUGGAUCAUGAAGUCCUUGAUUACACGAUGGAAUUUGCUGUUUUUGUAGCCAAAUCCUUUCUCUCCUGUAGCCAAGG
CCACAAAAUUAUCCACUGUUUUUGGAACAGUCUUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCUACAUCUUCA (配列番
号33)
GAGGCGCAGCAUCCACAGGCGGAGGCGAAAGCAGCCCGGACAGCUGAGGCCGGAAGAGGGUGGGGCCGCGGUGGCCAGGG
AGCCGGCGCCGCCACGCGCGGGUGGGGGGGACUGGGGUUGCUCGCGGGCUCCGGGCGGGCGGCGGGCGCCG (配列番
号31)
151-nt PPIB-dRNA (部位2)
UCCUGUAGCUAAGGCCACAAAAUUAUCCACUGUUUUUGGAACAGUCUUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCCACAU
CUUCAUCUCCAAUUCGUAGGUCAAAAUACACCUUGACGGUGACUUUGGGCCCCUUCUUCUUCUCAUCGGCC (配列番
号32)
151-nt PPIB-dRNA (部位3)
GCCCUGGAUCAUGAAGUCCUUGAUUACACGAUGGAAUUUGCUGUUUUUGUAGCCAAAUCCUUUCUCUCCUGUAGCCAAGG
CCACAAAAUUAUCCACUGUUUUUGGAACAGUCUUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCUACAUCUUCA (配列番
号33)
次世代シーケンシングの結果、dRNAが最大14%の編集効率でPPIB mRNA
部位1を効果的に編集できることを示した(図4D)。PPIB mRNA部位2および
部位3の場合、編集効率は1.5%及び0.6%である(図4E及び4F)。内因性β-
アクチンmRNAについて、以下に示す配列で、各部位に対して2つの標的部位及び設計
されたdRNAを選択した(図4G)。
部位1を効果的に編集できることを示した(図4D)。PPIB mRNA部位2および
部位3の場合、編集効率は1.5%及び0.6%である(図4E及び4F)。内因性β-
アクチンmRNAについて、以下に示す配列で、各部位に対して2つの標的部位及び設計
されたdRNAを選択した(図4G)。
72-nt β-アクチン-dRNA (部位1)
GCGCAAGUUAGGUUUUGUCAAGAAAGGGUGUAACGCAACCAAGUCAUAGUCCGCCUAGAAGCAUUUGCGGUG (配列番
号34)
131-nt β-アクチン-dRNA (部位1)
GCCAUGCCAAUCUCAUCUUGUUUUCUGCGCAAGUUAGGUUUUGUCAAGAAAGGGUGUAACGCAACCAAGUCAUAGUCCGC
CUAGAAGCAUUUGCGGUGGACGAUGGAGGGGCCGGACUCGUCAUACUCCUG (配列番号35)
70-nt β-アクチン-dRNA (部位2)
GGACUUCCUGUAACAACGCAUCUCAUAUUUGGAAUGACCAUUAAAAAAACAACAAUGUGCAAUCAAAGUC (配列番号
36)
GCGCAAGUUAGGUUUUGUCAAGAAAGGGUGUAACGCAACCAAGUCAUAGUCCGCCUAGAAGCAUUUGCGGUG (配列番
号34)
131-nt β-アクチン-dRNA (部位1)
GCCAUGCCAAUCUCAUCUUGUUUUCUGCGCAAGUUAGGUUUUGUCAAGAAAGGGUGUAACGCAACCAAGUCAUAGUCCGC
CUAGAAGCAUUUGCGGUGGACGAUGGAGGGGCCGGACUCGUCAUACUCCUG (配列番号35)
70-nt β-アクチン-dRNA (部位2)
GGACUUCCUGUAACAACGCAUCUCAUAUUUGGAAUGACCAUUAAAAAAACAACAAUGUGCAAUCAAAGUC (配列番号
36)
dRNAが部位1と部位2の両方でβ-アクチンmRNAを編集でき、各部位で最大1
.4%の編集効率が得られることを発見した(図4Hおよび図8A)。また、dRNAが
長いほど編集効率が高く、dRNA-71ntで0.6%、dRNA-131ntで1.
4%であることが観察された(図3H)。別のハウスキーピング遺伝子GAPDHには、
71nt dRNA(CAAGGUGCGGCUCCGGCCCCUCCCCUCUUCAAGGGGUCCACAUGGCAACUGUGAGGAGGGGAGAUUCAG
UG(配列番号37))を使用し、編集効率が0.3%であり、dRNAの長さが短いからかも
しれない(図8B)。
.4%の編集効率が得られることを発見した(図4Hおよび図8A)。また、dRNAが
長いほど編集効率が高く、dRNA-71ntで0.6%、dRNA-131ntで1.
4%であることが観察された(図3H)。別のハウスキーピング遺伝子GAPDHには、
71nt dRNA(CAAGGUGCGGCUCCGGCCCCUCCCCUCUUCAAGGGGUCCACAUGGCAACUGUGAGGAGGGGAGAUUCAG
UG(配列番号37))を使用し、編集効率が0.3%であり、dRNAの長さが短いからかも
しれない(図8B)。
実施例4
例示的なLEAPERメソッドのオフターゲット解析
治療用途では、編集の精度が極めて重要である。次に、本出願の例示的なRNA編集シ
ステムの特異性をキャラクタリゼーションすることを試みた。解析のために内因性PPI
B部位1とKRAS部位を選択した。PPIB部位1の場合、dRNAでカバーされた領
域の間に、A22、A30、A33、A34、A39、A49、A80、A91、A10
7、A140など、標的A76に隣接するいくつかのA塩基があることが見えた。隣接す
るA塩基がほとんど編集されていないが、標的のA76塩基(A-Cミスマッチ)が最大
14%の編集効率を示したことが明らかになった(図5A及び5B)。
KRAS部位に関しては、dRNAでカバーされた領域で、標的A56塩基に隣接する
多くのアデニンがあり、最大29の隣接するA塩基があることが見えた。KRAS mR
NA編集の結果から、標的A56塩基(A-Cミスマッチ)が最大11.7%の編集効率
を示したが、隣接するアデニンを編集できることがわかった(図5Cおよび5D)。複数
のオフターゲットアデニンが編集されたが、A41、A43、A45、A46、A74、
A79などのアデニンはより多くの編集を示した。編集されていないA塩基の5’最近傍
はGまたはCであるのに対し、効率的に編集されたアデニンの5’最近傍はTまたはAで
あることがわかった。この観察に基づいて、編集されやすいそれらのアデニンのオフター
ゲット編集を最小限に抑えるようにdRNAの設計に着手した。私たちの研究では、AD
ARが、A-CとA-A、A-Uミスマッチが好ましく、A-Gミスマッチが最も好まし
くないことが分かった。したがって、5’最近傍がUまたはAであるオフターゲットA塩
基の場合、A-Gミスマッチがオフターゲット効果を低減または減少させる可能性がある
ことを提案した。以前の研究では、A-GミスマッチがADARによる脱アミノ化の編集
をブロックする可能性があることが報告されていた。
例示的なLEAPERメソッドのオフターゲット解析
治療用途では、編集の精度が極めて重要である。次に、本出願の例示的なRNA編集シ
ステムの特異性をキャラクタリゼーションすることを試みた。解析のために内因性PPI
B部位1とKRAS部位を選択した。PPIB部位1の場合、dRNAでカバーされた領
域の間に、A22、A30、A33、A34、A39、A49、A80、A91、A10
7、A140など、標的A76に隣接するいくつかのA塩基があることが見えた。隣接す
るA塩基がほとんど編集されていないが、標的のA76塩基(A-Cミスマッチ)が最大
14%の編集効率を示したことが明らかになった(図5A及び5B)。
KRAS部位に関しては、dRNAでカバーされた領域で、標的A56塩基に隣接する
多くのアデニンがあり、最大29の隣接するA塩基があることが見えた。KRAS mR
NA編集の結果から、標的A56塩基(A-Cミスマッチ)が最大11.7%の編集効率
を示したが、隣接するアデニンを編集できることがわかった(図5Cおよび5D)。複数
のオフターゲットアデニンが編集されたが、A41、A43、A45、A46、A74、
A79などのアデニンはより多くの編集を示した。編集されていないA塩基の5’最近傍
はGまたはCであるのに対し、効率的に編集されたアデニンの5’最近傍はTまたはAで
あることがわかった。この観察に基づいて、編集されやすいそれらのアデニンのオフター
ゲット編集を最小限に抑えるようにdRNAの設計に着手した。私たちの研究では、AD
ARが、A-CとA-A、A-Uミスマッチが好ましく、A-Gミスマッチが最も好まし
くないことが分かった。したがって、5’最近傍がUまたはAであるオフターゲットA塩
基の場合、A-Gミスマッチがオフターゲット効果を低減または減少させる可能性がある
ことを提案した。以前の研究では、A-GミスマッチがADARによる脱アミノ化の編集
をブロックする可能性があることが報告されていた。
次に、図5Dの統計結果及び既存知識に基づいて、異なるA-Gミスマッチの組み合わ
せを含む3種類の91nt dRNA変異体および4種類の111nt dRNA変異体
(以下に示す配列を有する)を設計した:dRNA-AG1(A41,A46,A74); dRNA-AG2(A41,A43
,A45,A46,A74,A79); dRNA-AG3(A31,A32,A33,A41,A43,A45,A46,A47,A74,A79
); dRNA-AG4(A7,A31,A32,A33,A40,A41,A43,A45,A46,A47,A74,A79,A95)(図
4E)。
せを含む3種類の91nt dRNA変異体および4種類の111nt dRNA変異体
(以下に示す配列を有する)を設計した:dRNA-AG1(A41,A46,A74); dRNA-AG2(A41,A43
,A45,A46,A74,A79); dRNA-AG3(A31,A32,A33,A41,A43,A45,A46,A47,A74,A79
); dRNA-AG4(A7,A31,A32,A33,A40,A41,A43,A45,A46,A47,A74,A79,A95)(図
4E)。
KRAS-dRNA-91-AG2
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号38)
KRAS-dRNA-91-AG3
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号39)
KRAS-dRNA-91-AG4
UAGCUGGAUCGUCAAGGCACUCGUGCCGACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGGGGAGAGGCAGUCAGGGUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号40)
KRAS-dRNA-111-AG1
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUU
UUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号41)
KRAS-dRNA-111-AG2
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUggAgAgUCAGUCAUU
UUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号42)
KRAS-dRNA-111-AG3
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgg
gUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号43)
KRAS-dRNA-111-AG4
GCUCCCCGGUGCGGGAGAGAGGCCUGCUGACCCUGACUGCCUCUCCCCUUGUGGUGGUUGGAGCUGGUGGCGUCGGCACG
AGUGCCUUGACGAUCCAGCUAAUUCAGAAUC (配列番号44)
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号38)
KRAS-dRNA-91-AG3
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号39)
KRAS-dRNA-91-AG4
UAGCUGGAUCGUCAAGGCACUCGUGCCGACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGGGGAGAGGCAGUCAGGGUCAGCAGGC
CUCUCUCCCGC (配列番号40)
KRAS-dRNA-111-AG1
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUU
UUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号41)
KRAS-dRNA-111-AG2
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUggAgAgUCAGUCAUU
UUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号42)
KRAS-dRNA-111-AG3
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgg
gUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号43)
KRAS-dRNA-111-AG4
GCUCCCCGGUGCGGGAGAGAGGCCUGCUGACCCUGACUGCCUCUCCCCUUGUGGUGGUUGGAGCUGGUGGCGUCGGCACG
AGUGCCUUGACGAUCCAGCUAAUUCAGAAUC (配列番号44)
次に、これらのdRNAをHEK293T細胞にトランスフェクトし、空のベクターと
71-ntの非標的dRNA対照:(TCTCAGTCCAATGTATGGTCCGAGCACAAGCTCTAATCAAAGTCCG
CGGGTGTAGACCGGTTGCCATAGGA(配列番号45))を陰性対照として使用した。91-nt
dRNAの場合、ディープシーケンシングの結果は、A-GミスマッチのないdRNA-
91のオンターゲット編集(A56)効率7.9%と比較して、オンターゲット(оn-
target)編集(A56)がdRNA-91-AG2で2.8%、dRNA-91-
AG3で2.3%、dRNA-91-AG4で0.7%に減少したことを示している(図
4F)。91-nt dRNAの場合、オンターゲット編集(A56)は、A-Gミスマ
ッチのないdRNA-111のオンターゲット編集(A56)効率15.1%と比較して
、dRNA-111-AG2では5.1%、dRNA-111-AG3では4.9%に減
少した(図4F)。これは、より長いdRNAがより多くのA-Gミスマッチを有する可
能性があることを示している。次に、詳細なオフターゲット解析のために111-nt
dRNAを選択した。A7およびA79以外に、隣接するA塩基編集は、有意に解消され
た(図4G)。A7塩基の場合、オフターゲット効果は、現在のdRNA設計にはない、
この部位でのA-Gミスマッチ設計によって防ぐことができる。A79塩基の場合、隣接
する2つのA-GミスマッチA78/A79を導入すると、オフターゲット効果を解消す
るのに役立つ場合がある。そのような結果に基づいて、遺伝病を治療するために本出願の
RNA編集システムを適用することは非常に有望である。
71-ntの非標的dRNA対照:(TCTCAGTCCAATGTATGGTCCGAGCACAAGCTCTAATCAAAGTCCG
CGGGTGTAGACCGGTTGCCATAGGA(配列番号45))を陰性対照として使用した。91-nt
dRNAの場合、ディープシーケンシングの結果は、A-GミスマッチのないdRNA-
91のオンターゲット編集(A56)効率7.9%と比較して、オンターゲット(оn-
target)編集(A56)がdRNA-91-AG2で2.8%、dRNA-91-
AG3で2.3%、dRNA-91-AG4で0.7%に減少したことを示している(図
4F)。91-nt dRNAの場合、オンターゲット編集(A56)は、A-Gミスマ
ッチのないdRNA-111のオンターゲット編集(A56)効率15.1%と比較して
、dRNA-111-AG2では5.1%、dRNA-111-AG3では4.9%に減
少した(図4F)。これは、より長いdRNAがより多くのA-Gミスマッチを有する可
能性があることを示している。次に、詳細なオフターゲット解析のために111-nt
dRNAを選択した。A7およびA79以外に、隣接するA塩基編集は、有意に解消され
た(図4G)。A7塩基の場合、オフターゲット効果は、現在のdRNA設計にはない、
この部位でのA-Gミスマッチ設計によって防ぐことができる。A79塩基の場合、隣接
する2つのA-GミスマッチA78/A79を導入すると、オフターゲット効果を解消す
るのに役立つ場合がある。そのような結果に基づいて、遺伝病を治療するために本出願の
RNA編集システムを適用することは非常に有望である。
実施例5
複数の細胞株で例示的なLEAPERメソッドをテストすること
HEK293T細胞での結果から、線形dRNAとその標的RNAによって形成された
二本鎖RNAは、A-I編集のために内因性ADARタンパク質を動員できると考えられ
た。この仮説を確認するために、RNA編集法をテストするためにさらに多くの細胞株を
選択した。結果を図9に示す。複数の細胞株でのこれらの結果は、RNA編集法の普遍性
を証明した。まず、複数の編集効率にもかかわらず、dRNAを使用して内因性ADAR
を動員することは、(7つの異なる組織および器官に由来する)複数のヒト細胞株に適し
た。さらに、この方法はヒト細胞だけでなくマウス細胞でも機能し、マウスで実験を行う
可能性を提供する。
複数の細胞株で例示的なLEAPERメソッドをテストすること
HEK293T細胞での結果から、線形dRNAとその標的RNAによって形成された
二本鎖RNAは、A-I編集のために内因性ADARタンパク質を動員できると考えられ
た。この仮説を確認するために、RNA編集法をテストするためにさらに多くの細胞株を
選択した。結果を図9に示す。複数の細胞株でのこれらの結果は、RNA編集法の普遍性
を証明した。まず、複数の編集効率にもかかわらず、dRNAを使用して内因性ADAR
を動員することは、(7つの異なる組織および器官に由来する)複数のヒト細胞株に適し
た。さらに、この方法はヒト細胞だけでなくマウス細胞でも機能し、マウスで実験を行う
可能性を提供する。
実施例6
RNA編集のための内因性ADARの活用
効率的なRNA編集プラットフォームを探索するために、高活性E1008Q変異体A
DAR1(ADAR1DD)(非特許文献40)のデアミナーゼドメインを、RNA誘導
RNAターゲティングCRISPRエフェクター(非特許文献41)である触媒不活性L
buCas13(dCas13a)に融合した(図10A)。RNA編集効率を評価する
ために、3×GGGGSコード領域とインフレームUAG終止コドンを含む配列によって
リンクされたmCherryおよびEGFP遺伝子を含む代替レポーターを構築した(レ
ポーター-1、図10B)。レポーターをトランスフェクトした細胞はmCherryタ
ンパク質のみを発現したが、レポーター転写産物のUAGを標的として編集すると、終止
コドンがUIGに変換され、その結果、下流のEGFP発現が可能になる。このようなレ
ポーターを使用すると、EGFPレベルを監視することでAからIへの編集効率を測定で
きる。次に、ターゲティング用のCas13a認識の対象となる5’スキャフォールドと
可変長のスペーサー配列(crRNACas13a、LbuCas13 crRNA配列
に続く)を含むhU6プロモーター駆動型crRNA(CRISPR RNA)を設計し
た。
RNA編集のための内因性ADARの活用
効率的なRNA編集プラットフォームを探索するために、高活性E1008Q変異体A
DAR1(ADAR1DD)(非特許文献40)のデアミナーゼドメインを、RNA誘導
RNAターゲティングCRISPRエフェクター(非特許文献41)である触媒不活性L
buCas13(dCas13a)に融合した(図10A)。RNA編集効率を評価する
ために、3×GGGGSコード領域とインフレームUAG終止コドンを含む配列によって
リンクされたmCherryおよびEGFP遺伝子を含む代替レポーターを構築した(レ
ポーター-1、図10B)。レポーターをトランスフェクトした細胞はmCherryタ
ンパク質のみを発現したが、レポーター転写産物のUAGを標的として編集すると、終止
コドンがUIGに変換され、その結果、下流のEGFP発現が可能になる。このようなレ
ポーターを使用すると、EGFPレベルを監視することでAからIへの編集効率を測定で
きる。次に、ターゲティング用のCas13a認識の対象となる5’スキャフォールドと
可変長のスペーサー配列(crRNACas13a、LbuCas13 crRNA配列
に続く)を含むhU6プロモーター駆動型crRNA(CRISPR RNA)を設計し
た。
LbuCas13 crRNA配列
アデノシン脱アミノ化はA-Cミスマッチ部位で優先的に起こるため、標的転写物に相
補的な配列はすべて、UAGコドンと対向するCCAを含み、アデノシン(A)とのシチ
ジン(C)ミスマッチを引き起こす(非特許文献13、14)。crRNAの最適な長さ
をテストするために、異なる長さの非標的または標的crRNAを、レポーター-1を安
定して発現するHEK293T細胞でdCas13a-ADAR1DDタンパク質と共発
現させた。EGFP発現の出現によって示される明らかなRNA編集効果は、少なくとも
40 ntの長さのマッチングする配列を含むcrRNAで観察され、crRNAが長い
ほど、EGFP陽性率が高くなる(図10C)。驚くべきことに、長いcrRNACas
13aの発現だけでEGFP発現を活性化するのに十分であるように見え、dCas13
a-ADAR1DDの共発現はむしろcrRNA活性を低下させた(図10C、10d)
。70-nt(長さ計算用の5’スキャフォールドを除く)対照RNAはEGFP発現を
活性化できなかったため、EGFP発現は明らかに配列依存的であった(図10C、10
D)。
特定の長く操作されたcrRNACas13aがdCas13a-ADAR1DDとは
独立してRNA編集を可能にするという驚くべき発見により、crRNAからCas13
a動員スキャフォールド配列を削除することにした。crRNA70はEGFP発現をト
リガーする最も高い活性を持っていたため(図10C、10D)、Cas13a動員スキ
ャフォールのない同じ70-ntの長さのガイドRNAを選択して、さらなるテストを行
った(図11Aおよび以下の実施例で使用されたarRNAと対照RNA配列)。
補的な配列はすべて、UAGコドンと対向するCCAを含み、アデノシン(A)とのシチ
ジン(C)ミスマッチを引き起こす(非特許文献13、14)。crRNAの最適な長さ
をテストするために、異なる長さの非標的または標的crRNAを、レポーター-1を安
定して発現するHEK293T細胞でdCas13a-ADAR1DDタンパク質と共発
現させた。EGFP発現の出現によって示される明らかなRNA編集効果は、少なくとも
40 ntの長さのマッチングする配列を含むcrRNAで観察され、crRNAが長い
ほど、EGFP陽性率が高くなる(図10C)。驚くべきことに、長いcrRNACas
13aの発現だけでEGFP発現を活性化するのに十分であるように見え、dCas13
a-ADAR1DDの共発現はむしろcrRNA活性を低下させた(図10C、10d)
。70-nt(長さ計算用の5’スキャフォールドを除く)対照RNAはEGFP発現を
活性化できなかったため、EGFP発現は明らかに配列依存的であった(図10C、10
D)。
特定の長く操作されたcrRNACas13aがdCas13a-ADAR1DDとは
独立してRNA編集を可能にするという驚くべき発見により、crRNAからCas13
a動員スキャフォールド配列を削除することにした。crRNA70はEGFP発現をト
リガーする最も高い活性を持っていたため(図10C、10D)、Cas13a動員スキ
ャフォールのない同じ70-ntの長さのガイドRNAを選択して、さらなるテストを行
った(図11Aおよび以下の実施例で使用されたarRNAと対照RNA配列)。
この線形ガイドRNAは、レポーター-1を含む全細胞の40%近くで強力なEGFP
発現を誘導することが証明された(図11B、上図)。内因性ADARタンパク質は二本
鎖RNA(dsRNA)基質を編集できるため(非特許文献12)、長いガイドRNAが
標的転写物とアニーリングしてdsRNA基質を形成し、それが内因性ADARタンパク
質を標的編集のために動員できると考えた。そこで、このようなガイドRNAをarRN
A(ADAR動員RNA)と名付けた。内因性ADARタンパク質が実際に上記の観察に
関与しているかどうかを検証するために、ADAR欠損細胞におけるarRNAを介した
RNA編集の調査に着手した。ADAR2 mRNAはHEK293T細胞ではほとんど
検出されなかったため(図12A)、HEK293T ADAR1-/-細胞を生成し、
この細胞株をADAR1とADAR2の両方で欠損させた(図11C、D)。実際、AD
AR1の枯渇は、arRNA70によって誘導されるEGFPシグナルを解消した(図1
1B、下図)。さらに、HEK293T ADAR1-/-細胞におけるADAR1p1
10、ADAR1p150、またはADAR2の外因性発現(図11C、D)は、arR
NA70によるEGFP誘導の喪失をうまく救い(図11E、図12B)、arRNA誘
導EGFPレポーターの発現はネイティブADAR1にのみ依存し、その活性がアイソフ
ォーム(p110およびp150)またはADAR2のいずれかによって再構築されるこ
とができることを証明した。arRNA70ターゲティング領域のサンガーシーケンシン
グ解析は、UAG内の予測されたアデノシン部位にA/Gオーバーラップピークを示し、
有意なAからI(G)への変換を示している(図11F)。次世代シーケンシング(NG
S)により、AからIへの変換率がレポーター転写産物全体の約13%であることがさら
に確認された(図11G)。定量的PCR解析は、arRNA70が標的転写物の発現を
低下させないことを示し(図13)、arRNAのRNAi効果の可能性を排除した。ま
とめると、私たちのデータは、arRNAが工学操作されたA-Cミスマッチを介して標
的転写物に対してかなりのレベルの編集を生成できることを示した。
発現を誘導することが証明された(図11B、上図)。内因性ADARタンパク質は二本
鎖RNA(dsRNA)基質を編集できるため(非特許文献12)、長いガイドRNAが
標的転写物とアニーリングしてdsRNA基質を形成し、それが内因性ADARタンパク
質を標的編集のために動員できると考えた。そこで、このようなガイドRNAをarRN
A(ADAR動員RNA)と名付けた。内因性ADARタンパク質が実際に上記の観察に
関与しているかどうかを検証するために、ADAR欠損細胞におけるarRNAを介した
RNA編集の調査に着手した。ADAR2 mRNAはHEK293T細胞ではほとんど
検出されなかったため(図12A)、HEK293T ADAR1-/-細胞を生成し、
この細胞株をADAR1とADAR2の両方で欠損させた(図11C、D)。実際、AD
AR1の枯渇は、arRNA70によって誘導されるEGFPシグナルを解消した(図1
1B、下図)。さらに、HEK293T ADAR1-/-細胞におけるADAR1p1
10、ADAR1p150、またはADAR2の外因性発現(図11C、D)は、arR
NA70によるEGFP誘導の喪失をうまく救い(図11E、図12B)、arRNA誘
導EGFPレポーターの発現はネイティブADAR1にのみ依存し、その活性がアイソフ
ォーム(p110およびp150)またはADAR2のいずれかによって再構築されるこ
とができることを証明した。arRNA70ターゲティング領域のサンガーシーケンシン
グ解析は、UAG内の予測されたアデノシン部位にA/Gオーバーラップピークを示し、
有意なAからI(G)への変換を示している(図11F)。次世代シーケンシング(NG
S)により、AからIへの変換率がレポーター転写産物全体の約13%であることがさら
に確認された(図11G)。定量的PCR解析は、arRNA70が標的転写物の発現を
低下させないことを示し(図13)、arRNAのRNAi効果の可能性を排除した。ま
とめると、私たちのデータは、arRNAが工学操作されたA-Cミスマッチを介して標
的転写物に対してかなりのレベルの編集を生成できることを示した。
実施例7
LEAPERは複数の細胞株でのRNA編集を可能にする
内因性ADARタンパク質の発現は、LEAPERを介したRNA編集の前提条件であ
るため、HT29、A549、HepG2、RD、SF268、SW13、HeLaなど
の異なる組織に由来する細胞株におけるLEAPERのパフォーマンスをテストした。最
初に、ウエスタンブロッティング解析を使用して、3種類すべてのADARタンパク質の
内因性発現を調べた。ADAR1は、テストしたすべての細胞株で高度に発現し、ウエス
タンブロットでの身分は陰性対照であるHEK293T ADAR1-/-株によって確
認された(図14A、B)。ADAR3はHepG2およびHeLa細胞でのみ検出され
た(図14A、B)。ADAR2はどの細胞でも検出できなかった。これは、ADAR2
を過剰発現するHEK293T細胞からADAR2タンパク質を検出できたため、ウエス
タンブロッティングの失敗によるものではなかった(図14A、B)。これらの発見は、
ADAR1が遍在的に発現している一方、ADAR2およびADAR3の発現が特定の組
織に限定されているという以前の報告と一致している(非特許文献11)。
次に、これらの細胞株でレポーター-1を標的とする再設計された71-nt arR
NA(arRNA71)の編集効率のテストに着手した(図15Aおよび上記列した、こ
の研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)。
LEAPERは、効率が異なるが、このarRNA71についてテストされたすべての
細胞で機能した(図14C)。これらの結果は、HepG2およびHeLa細胞を除いて
、ADAR1/2タンパク質レベルがRNA編集収量(非特許文献42)と相関するとい
う以前の報告と一致している。編集効率とADAR1レベルの次善の相関関係は、ADA
R3がRNA編集において阻害的役割を果たすことが報告されているため、これら2つの
ラインに大量なADAR3発現があるからかもしれない(図14A、B)。重要なことに
、LEAPERはマウス由来の3つの異なる細胞株(NIH3T3、マウス胚性線維芽細
胞(MEF)およびB16)でも機能し(図14D)、動物および疾患モデルを通じてそ
の治療の可能性をテストする道を開いた。まとめると、LEAPERは、幅広い種類の細
胞やさまざまな生物に使用する多機能ツールであると結論付けた。
LEAPERは複数の細胞株でのRNA編集を可能にする
内因性ADARタンパク質の発現は、LEAPERを介したRNA編集の前提条件であ
るため、HT29、A549、HepG2、RD、SF268、SW13、HeLaなど
の異なる組織に由来する細胞株におけるLEAPERのパフォーマンスをテストした。最
初に、ウエスタンブロッティング解析を使用して、3種類すべてのADARタンパク質の
内因性発現を調べた。ADAR1は、テストしたすべての細胞株で高度に発現し、ウエス
タンブロットでの身分は陰性対照であるHEK293T ADAR1-/-株によって確
認された(図14A、B)。ADAR3はHepG2およびHeLa細胞でのみ検出され
た(図14A、B)。ADAR2はどの細胞でも検出できなかった。これは、ADAR2
を過剰発現するHEK293T細胞からADAR2タンパク質を検出できたため、ウエス
タンブロッティングの失敗によるものではなかった(図14A、B)。これらの発見は、
ADAR1が遍在的に発現している一方、ADAR2およびADAR3の発現が特定の組
織に限定されているという以前の報告と一致している(非特許文献11)。
次に、これらの細胞株でレポーター-1を標的とする再設計された71-nt arR
NA(arRNA71)の編集効率のテストに着手した(図15Aおよび上記列した、こ
の研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)。
LEAPERは、効率が異なるが、このarRNA71についてテストされたすべての
細胞で機能した(図14C)。これらの結果は、HepG2およびHeLa細胞を除いて
、ADAR1/2タンパク質レベルがRNA編集収量(非特許文献42)と相関するとい
う以前の報告と一致している。編集効率とADAR1レベルの次善の相関関係は、ADA
R3がRNA編集において阻害的役割を果たすことが報告されているため、これら2つの
ラインに大量なADAR3発現があるからかもしれない(図14A、B)。重要なことに
、LEAPERはマウス由来の3つの異なる細胞株(NIH3T3、マウス胚性線維芽細
胞(MEF)およびB16)でも機能し(図14D)、動物および疾患モデルを通じてそ
の治療の可能性をテストする道を開いた。まとめると、LEAPERは、幅広い種類の細
胞やさまざまな生物に使用する多機能ツールであると結論付けた。
実施例8
LEAPERの特性と最適化
LEAPERをよりよくキャラクタリゼーションして最適化するために、標的転写物の
UAGトリプレット内のアデノシンと対向するヌクレオチドの選択を調査した。HEK2
93T細胞では、レポーター1を標的とするarRNA71は、可変的な編集効率を示し
、標的となるUAGに対向する変化したトリプレット(5’-CNA、NはA/U/C/
Gの一つを表す)を有する(上記のこの研究で使用されたarRNA及び対照RNAの配
列)。A-Cミスマッチは最高の編集効率をもたらし、A-Gミスマッチは最小であるが
明白な編集をもたらした(図16A)。次に、arRNAのA-Cミスマッチに隣接する
ヌクレオチドの優先度を調査した。シチジン(5’-N1CN2)の周りの5’および3
’隣接部位の16の組み合わせすべてをテストし(上記のこの研究で使用したarRNA
および対照RNAの配列)、3’隣接アデノシンが効率的な編集に必要なものであり、ア
デノシンが5’部位で最も好ましくないヌクレオチドであることを発見した(図16B、
C)。したがって、arRNAのCCAモチーフは、UAG部位を対象とした最高の編集
効率をもたらすと結論付けた。arRNAの3’隣接グアノシン(5’-N1CG)が有
意な阻害効果を示したことに注意すべきである(図16B、C)。
RNAの長さは、以前の報告と一致して、標的転写物の編集をガイドする際のarRN
A効率に関連しているように見えた(図10C)(非特許文献42)。この効果を完全に
理解するために、2つの異なるレポーター転写産物であるレポーター-1とレポーター-
2を標的にした可変長のarRNAをテストした(図15A、B)。どちらのレポーター
ターゲティングでも、31-ntから211-ntの範囲の10種類のサイズの異なるa
rRNAが設計およびテストされ、CCAトリプレット(UAGターゲティング用)がち
ょうど中間にある(上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)。レポ
ーターのEGFP活性に基づくと、arRNAの長さは、両方のレポーターで編集効率と
正の相関があり、111~191-ntでピークに達した(図16D)。1つのarRN
A51が機能しているように見えたが、71-ntは、arRNAが両方のレポーターで
機能するための最小の長さであった(図16D)。
LEAPERの特性と最適化
LEAPERをよりよくキャラクタリゼーションして最適化するために、標的転写物の
UAGトリプレット内のアデノシンと対向するヌクレオチドの選択を調査した。HEK2
93T細胞では、レポーター1を標的とするarRNA71は、可変的な編集効率を示し
、標的となるUAGに対向する変化したトリプレット(5’-CNA、NはA/U/C/
Gの一つを表す)を有する(上記のこの研究で使用されたarRNA及び対照RNAの配
列)。A-Cミスマッチは最高の編集効率をもたらし、A-Gミスマッチは最小であるが
明白な編集をもたらした(図16A)。次に、arRNAのA-Cミスマッチに隣接する
ヌクレオチドの優先度を調査した。シチジン(5’-N1CN2)の周りの5’および3
’隣接部位の16の組み合わせすべてをテストし(上記のこの研究で使用したarRNA
および対照RNAの配列)、3’隣接アデノシンが効率的な編集に必要なものであり、ア
デノシンが5’部位で最も好ましくないヌクレオチドであることを発見した(図16B、
C)。したがって、arRNAのCCAモチーフは、UAG部位を対象とした最高の編集
効率をもたらすと結論付けた。arRNAの3’隣接グアノシン(5’-N1CG)が有
意な阻害効果を示したことに注意すべきである(図16B、C)。
RNAの長さは、以前の報告と一致して、標的転写物の編集をガイドする際のarRN
A効率に関連しているように見えた(図10C)(非特許文献42)。この効果を完全に
理解するために、2つの異なるレポーター転写産物であるレポーター-1とレポーター-
2を標的にした可変長のarRNAをテストした(図15A、B)。どちらのレポーター
ターゲティングでも、31-ntから211-ntの範囲の10種類のサイズの異なるa
rRNAが設計およびテストされ、CCAトリプレット(UAGターゲティング用)がち
ょうど中間にある(上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)。レポ
ーターのEGFP活性に基づくと、arRNAの長さは、両方のレポーターで編集効率と
正の相関があり、111~191-ntでピークに達した(図16D)。1つのarRN
A51が機能しているように見えたが、71-ntは、arRNAが両方のレポーターで
機能するための最小の長さであった(図16D)。
次に、編集効率に対するarRNA内のA-Cミスマッチ位置の影響を調査した。テス
ト用のすべてのarRNAの長さを71ntに固定し、UAGを標的とするACCトリプ
レットをarRNA内で5’から3’にスライドさせた(上記のこの研究で使用したar
RNAと対照RNAの配列)。両方のレポーターでは、A-Cミスマッチを中央領域に配
置すると編集率が高くなり、ミスマッチ部位が3’末端に近いarRNAは、5’末端に
近いarRNAよりも優れていることが事実によって証明された(図16E)。便宜上、
後続のすべての研究では、A-CミスマッチをarRNAの中心に配置した。
また、LEAPERのターゲティングの柔軟性をテストし、標的上のUAGがRNA編
集の対象となる唯一のモチーフであるかどうかを判断しようとした。レポーター-3の1
6のトリプレットの組み合わせ(5’-N1AN2)すべてについて(図15C)、固定
長(111-nt)の対応するarRNAを使用し、編集部位(ACミスマッチ)を除き
、arRNAとレポーターの完全な配列マッチングを保証した(図16Fおよび上記のこ
の研究で使用されたarRNAおよび対照RNAの配列)。NGSの結果は、すべてのN
1AN2モチーフを編集できることを示した。UAN2とGAN2は、それぞれ最も好ま
しいモチーフと最も好ましくないモチーフである(図16F、G)。まとめると、標的ア
デノシンの最近傍優先度は5’U>C≒A>Gおよび3’G>C>A≒Uである(図16
G)。
ト用のすべてのarRNAの長さを71ntに固定し、UAGを標的とするACCトリプ
レットをarRNA内で5’から3’にスライドさせた(上記のこの研究で使用したar
RNAと対照RNAの配列)。両方のレポーターでは、A-Cミスマッチを中央領域に配
置すると編集率が高くなり、ミスマッチ部位が3’末端に近いarRNAは、5’末端に
近いarRNAよりも優れていることが事実によって証明された(図16E)。便宜上、
後続のすべての研究では、A-CミスマッチをarRNAの中心に配置した。
また、LEAPERのターゲティングの柔軟性をテストし、標的上のUAGがRNA編
集の対象となる唯一のモチーフであるかどうかを判断しようとした。レポーター-3の1
6のトリプレットの組み合わせ(5’-N1AN2)すべてについて(図15C)、固定
長(111-nt)の対応するarRNAを使用し、編集部位(ACミスマッチ)を除き
、arRNAとレポーターの完全な配列マッチングを保証した(図16Fおよび上記のこ
の研究で使用されたarRNAおよび対照RNAの配列)。NGSの結果は、すべてのN
1AN2モチーフを編集できることを示した。UAN2とGAN2は、それぞれ最も好ま
しいモチーフと最も好ましくないモチーフである(図16F、G)。まとめると、標的ア
デノシンの最近傍優先度は5’U>C≒A>Gおよび3’G>C>A≒Uである(図16
G)。
実施例9
LEAPERを使用した内因性転写産物の編集
次に、LEAPERが内因性転写物の効果的な編集を可能にするかどうかを調べた。異
なる長さのarRNAを使用して、PPIB、KRAS、SMAD4遺伝子の転写産物の
UAGモチーフ、およびFANCC遺伝子転写産物のUACモチーフを標的にした(図1
7A、上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)。心強いことに、4つ
の転写物すべての標的アデノシン部位は、NGSの結果によると効率が異なるが、4つの
サイズすべての対応するarRNAによって編集された(図17B)。以前の観察と一致
して、arRNAが長いほど編集率が高くなる傾向があった。注目すべきことに、151
ntのarRNAPPIBはPPIB遺伝子の全転写産物の約50%を編集した(図17
B)。それらの標的転写物(図18A)または最終的なタンパク質レベル(例えば、KR
AS、図18B)に対してRNAi効果を示すarRNAはなかった。さらに、LEAP
ERは非UAN部位で望ましい編集率を達成することができ(図17Cおよび上記のこの
研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)、内因性転写物の編集におけるLEA
PERの柔軟性を示している。LEAPERの機能をさらに探求するために、複数の部位
を同時に標的とすることができるかどうかをテストした。2つのarRNA(上記のこの
研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)の共発現によるTARDBPとFANC
Cの両方の転写産物の多重編集を観察し、単一のarRNAよりも効率が高いことを示し
ている(図17D)。これは、LEAPERが、複数の標的を並行して編集するのに適し
ていることを示した。
LEAPERを使用した内因性転写産物の編集
次に、LEAPERが内因性転写物の効果的な編集を可能にするかどうかを調べた。異
なる長さのarRNAを使用して、PPIB、KRAS、SMAD4遺伝子の転写産物の
UAGモチーフ、およびFANCC遺伝子転写産物のUACモチーフを標的にした(図1
7A、上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)。心強いことに、4つ
の転写物すべての標的アデノシン部位は、NGSの結果によると効率が異なるが、4つの
サイズすべての対応するarRNAによって編集された(図17B)。以前の観察と一致
して、arRNAが長いほど編集率が高くなる傾向があった。注目すべきことに、151
ntのarRNAPPIBはPPIB遺伝子の全転写産物の約50%を編集した(図17
B)。それらの標的転写物(図18A)または最終的なタンパク質レベル(例えば、KR
AS、図18B)に対してRNAi効果を示すarRNAはなかった。さらに、LEAP
ERは非UAN部位で望ましい編集率を達成することができ(図17Cおよび上記のこの
研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)、内因性転写物の編集におけるLEA
PERの柔軟性を示している。LEAPERの機能をさらに探求するために、複数の部位
を同時に標的とすることができるかどうかをテストした。2つのarRNA(上記のこの
研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)の共発現によるTARDBPとFANC
Cの両方の転写産物の多重編集を観察し、単一のarRNAよりも効率が高いことを示し
ている(図17D)。これは、LEAPERが、複数の標的を並行して編集するのに適し
ていることを示した。
ADAR1/2はRNA二重鎖の複数のアデノシンを乱雑に脱アミ化する傾向があり(
非特許文献44)、A-CミスマッチがAからIへの変換を導く唯一のモチーフではない
ことは注目に値す(図16A)。したがって、arRNAカバレッジ内の標的転写産物上
のすべてのアデノシンは、可変的なレベルの編集を受け、不要な修飾の主な由来であると
合理的に想定できる。arRNAが長いほど、そのようなオフターゲットの可能性が高く
なる。そのため、これらの標的転写物中のarRNAカバレッジ内のすべてのアデノシン
部位を調べた。PPIB転写産物の場合、さまざまなサイズのarRNAのシーケンスウ
ィンドウ全体でオフターゲット編集はほとんど観察されなかった(図17E、F)。ただ
し、KRAS、SMAD4、およびFANCC遺伝子を標的とする場合、複数のオフター
ゲット編集が検出された(図19A-F)。特にKRASの場合、30個のアデノシンの
うち11個が、arRNA111のシーケンスウィンドウで大量なAからIへの変換を受
けた(図19A、B)。
非特許文献44)、A-CミスマッチがAからIへの変換を導く唯一のモチーフではない
ことは注目に値す(図16A)。したがって、arRNAカバレッジ内の標的転写産物上
のすべてのアデノシンは、可変的なレベルの編集を受け、不要な修飾の主な由来であると
合理的に想定できる。arRNAが長いほど、そのようなオフターゲットの可能性が高く
なる。そのため、これらの標的転写物中のarRNAカバレッジ内のすべてのアデノシン
部位を調べた。PPIB転写産物の場合、さまざまなサイズのarRNAのシーケンスウ
ィンドウ全体でオフターゲット編集はほとんど観察されなかった(図17E、F)。ただ
し、KRAS、SMAD4、およびFANCC遺伝子を標的とする場合、複数のオフター
ゲット編集が検出された(図19A-F)。特にKRASの場合、30個のアデノシンの
うち11個が、arRNA111のシーケンスウィンドウで大量なAからIへの変換を受
けた(図19A、B)。
次に、このような望ましくないオフターゲット効果を最小限に抑えるための戦略の開発
を試みた。A-GミスマッチがUAGターゲティングの編集を抑制したため(図16A)
、グアノシンを非標的アデノシンとペアリングすると、望ましくない編集が減少する可能
性があると仮定した。次に、レポーター-3において、あらゆる可能なトリプレットの組
み合わせ(5’-N1AN2)でアデノシンに対するA-Gミスマッチの影響をテストし
た(図15Cおよび上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)。A-G
ミスマッチは、A-Cミスマッチ(図16F)と比較して、UAGまたはAAGターゲテ
ィング(~2%)(図17G)を除いて、テストしたすべてのターゲットでアデノシンの
編集を確実に減少させた。不要な部位での編集率をさらに下げるために、2つの連続した
ミスマッチの影響をテストした。UAGまたはAAGのいずれかに対向するトリプレット
の3’末端ヌクレオチドでの追加のミスマッチにより、対応するアデノシン編集が解消さ
れたことが分かった(図17Hおよび上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNA
の配列)。これらの発見によって、KRAS転写産物のオフターゲットを減らすためにこ
のルールを適用しようとした(図19A)。まず、arRNA111でカバーされるすべ
ての「編集しやすい」モチーフにAGミスマッチを生成するarRNA(arRNA11
1-AG6)を設計し(図17I、図19A、および上記のこの研究で使用されたarR
NAと対照RNAの配列)、このarRNA111-AG6は、AAU(61番目)、U
AU(63番目)、UAA(65番目)、AAA(66番目)、UAG(94番目)、及
びAAG(99番目)を含む。このarRNA111-AG6は、オフターゲット編集率
を約5%に維持しながら、オフターゲット編集のほとんどを排除した。図17Gの発見と
一致して、単一のA-Gミスマッチは、AAGモチーフ(99番目)の編集を完全に最小
化することができなかった(図17Iおよび図19A)。次に、arRNA111-AG
6により多くのミスマッチを追加した。これには、デュアルミスマッチ(標的モチーフ5
’-AAGの反対側の5’-CGG)に加えて、27、98、および115番目のアデノ
シンでの編集(arRNA111-AG9)を軽減する3つの別のA-Gミスマッチが追
加された(上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)。その結果、標
的部位(A76)での編集率をさらに損なうことなく、編集の特異性を大幅に向上させる
ことができた(図17I)。要約すると、他のルールを組み込んだ工学操作されたLEA
PERは、内因性転写産物の効率的でより正確なRNA編集を可能にする。
を試みた。A-GミスマッチがUAGターゲティングの編集を抑制したため(図16A)
、グアノシンを非標的アデノシンとペアリングすると、望ましくない編集が減少する可能
性があると仮定した。次に、レポーター-3において、あらゆる可能なトリプレットの組
み合わせ(5’-N1AN2)でアデノシンに対するA-Gミスマッチの影響をテストし
た(図15Cおよび上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)。A-G
ミスマッチは、A-Cミスマッチ(図16F)と比較して、UAGまたはAAGターゲテ
ィング(~2%)(図17G)を除いて、テストしたすべてのターゲットでアデノシンの
編集を確実に減少させた。不要な部位での編集率をさらに下げるために、2つの連続した
ミスマッチの影響をテストした。UAGまたはAAGのいずれかに対向するトリプレット
の3’末端ヌクレオチドでの追加のミスマッチにより、対応するアデノシン編集が解消さ
れたことが分かった(図17Hおよび上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNA
の配列)。これらの発見によって、KRAS転写産物のオフターゲットを減らすためにこ
のルールを適用しようとした(図19A)。まず、arRNA111でカバーされるすべ
ての「編集しやすい」モチーフにAGミスマッチを生成するarRNA(arRNA11
1-AG6)を設計し(図17I、図19A、および上記のこの研究で使用されたarR
NAと対照RNAの配列)、このarRNA111-AG6は、AAU(61番目)、U
AU(63番目)、UAA(65番目)、AAA(66番目)、UAG(94番目)、及
びAAG(99番目)を含む。このarRNA111-AG6は、オフターゲット編集率
を約5%に維持しながら、オフターゲット編集のほとんどを排除した。図17Gの発見と
一致して、単一のA-Gミスマッチは、AAGモチーフ(99番目)の編集を完全に最小
化することができなかった(図17Iおよび図19A)。次に、arRNA111-AG
6により多くのミスマッチを追加した。これには、デュアルミスマッチ(標的モチーフ5
’-AAGの反対側の5’-CGG)に加えて、27、98、および115番目のアデノ
シンでの編集(arRNA111-AG9)を軽減する3つの別のA-Gミスマッチが追
加された(上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)。その結果、標
的部位(A76)での編集率をさらに損なうことなく、編集の特異性を大幅に向上させる
ことができた(図17I)。要約すると、他のルールを組み込んだ工学操作されたLEA
PERは、内因性転写産物の効率的でより正確なRNA編集を可能にする。
実施例10
LEAPERのRNA編集特異性
arRNAで覆われたdsRNA領域内で起こりうるオフターゲット効果に加えて、a
rRNAの部分的な塩基対形成による他の転写産物への潜在的なオフターゲット効果につ
いても懸念していた。そして、トランスクリプトーム全体のRNAシーケンシング解析を
実行して、LEAPERのグローバルなオフターゲット効果を評価した。RNAシーケン
ス解析を行う前に、細胞に対照RNA151またはPPIB特異的arRNA(arRN
A151-PPIB)発現プラスミドをトランスフェクトした。対照RNA151グルー
プ(図20A)で6つの潜在的なオフターゲットを特定し、arRNA151-PPIB
グループ(図20B)で5つを特定し、NGS解析に基づくPPIBオンターゲット率は
約37%であった(図20B)。さらなる解析により、EIF2AK2転写産物からの2
つの部位を除くすべての部位がSINE(Alu)またはLINE領域のいずれかに位置
し(図20A、B)、両方ともADARを介した編集の傾向があることが明らかになり(
非特許文献45)、これらのオフターゲットが標的転写産物とarRNAまたは対照RN
Aとのペアリングに由来しない場合があることは示された。注目すべきなことに、オフタ
ーゲティング転写物、WDR73とSMYD4が両方のグループに現れ、それらが配列依
存性のRNA編集である可能性が低いことを示唆している。実際、最小自由エネルギー解
析は、これらの可能なオフターゲット転写物すべてが、対照RNA151またはarRN
A151-PPIBのいずれかと安定した二重鎖を形成できなかったことを示唆した(図
20C)。arRNAが配列依存のオフターゲットを生成するかどうかをさらにテストす
るために、NCBI BLASTを使用してarRNA151-PPIBとarRNA1
11-FANCCの配列の類似性を比較することにより、潜在的なオフターゲットサイト
を選択した。arRNA151-PPIBのTRAPPC12転写物およびarRNA1
11-FANCCのST3GAL1、OSTM1-AS1およびEHD2転写物の3つの
部位が最もよい候補であった(図20Dおよび図21A)。NGS解析により、これらの
予測されたオフターゲットサイトのいずれでも編集が検出されなかったことが明らかにな
った(図20Dおよび図21B)。これらの結果は、LEAPERが、トランスクリプト
ーム全体の特異性を維持しながら、標的部位での効率的な編集を許可し、配列依存のオフ
ターゲット編集を検出しなかったことを示している。
LEAPERのRNA編集特異性
arRNAで覆われたdsRNA領域内で起こりうるオフターゲット効果に加えて、a
rRNAの部分的な塩基対形成による他の転写産物への潜在的なオフターゲット効果につ
いても懸念していた。そして、トランスクリプトーム全体のRNAシーケンシング解析を
実行して、LEAPERのグローバルなオフターゲット効果を評価した。RNAシーケン
ス解析を行う前に、細胞に対照RNA151またはPPIB特異的arRNA(arRN
A151-PPIB)発現プラスミドをトランスフェクトした。対照RNA151グルー
プ(図20A)で6つの潜在的なオフターゲットを特定し、arRNA151-PPIB
グループ(図20B)で5つを特定し、NGS解析に基づくPPIBオンターゲット率は
約37%であった(図20B)。さらなる解析により、EIF2AK2転写産物からの2
つの部位を除くすべての部位がSINE(Alu)またはLINE領域のいずれかに位置
し(図20A、B)、両方ともADARを介した編集の傾向があることが明らかになり(
非特許文献45)、これらのオフターゲットが標的転写産物とarRNAまたは対照RN
Aとのペアリングに由来しない場合があることは示された。注目すべきなことに、オフタ
ーゲティング転写物、WDR73とSMYD4が両方のグループに現れ、それらが配列依
存性のRNA編集である可能性が低いことを示唆している。実際、最小自由エネルギー解
析は、これらの可能なオフターゲット転写物すべてが、対照RNA151またはarRN
A151-PPIBのいずれかと安定した二重鎖を形成できなかったことを示唆した(図
20C)。arRNAが配列依存のオフターゲットを生成するかどうかをさらにテストす
るために、NCBI BLASTを使用してarRNA151-PPIBとarRNA1
11-FANCCの配列の類似性を比較することにより、潜在的なオフターゲットサイト
を選択した。arRNA151-PPIBのTRAPPC12転写物およびarRNA1
11-FANCCのST3GAL1、OSTM1-AS1およびEHD2転写物の3つの
部位が最もよい候補であった(図20Dおよび図21A)。NGS解析により、これらの
予測されたオフターゲットサイトのいずれでも編集が検出されなかったことが明らかにな
った(図20Dおよび図21B)。これらの結果は、LEAPERが、トランスクリプト
ーム全体の特異性を維持しながら、標的部位での効率的な編集を許可し、配列依存のオフ
ターゲット編集を検出しなかったことを示している。
実施例11
哺乳類細胞におけるLEAPERの安全性評価
arRNAは標的転写産物の編集を内因性ADARタンパク質に依存しているため、外
因性arRNAの添加は、ADAR1またはADAR2タンパク質を過剰に占有すること
により、ネイティブRNA編集イベントに影響を与えるかどうかを知りたかった。そのた
め、トランスクリプトーム全体のRNAシーケンシング結果から、模擬グループとarR
NA151-PPIBグループが共有するAからIへのRNA編集部位を解析し、模擬グ
ループと対照RNA151グループの比較も解析した。対照RNA151グループもar
RNA151-PPIBグループも模擬グループと比較して有意差を示さず(図22A、
B)、LEAPERがネイティブAからIへの編集イベントを触媒する内因性ADAR1
の正常な機能にほとんど影響を与えなかったことを示している。
哺乳類細胞におけるLEAPERの安全性評価
arRNAは標的転写産物の編集を内因性ADARタンパク質に依存しているため、外
因性arRNAの添加は、ADAR1またはADAR2タンパク質を過剰に占有すること
により、ネイティブRNA編集イベントに影響を与えるかどうかを知りたかった。そのた
め、トランスクリプトーム全体のRNAシーケンシング結果から、模擬グループとarR
NA151-PPIBグループが共有するAからIへのRNA編集部位を解析し、模擬グ
ループと対照RNA151グループの比較も解析した。対照RNA151グループもar
RNA151-PPIBグループも模擬グループと比較して有意差を示さず(図22A、
B)、LEAPERがネイティブAからIへの編集イベントを触媒する内因性ADAR1
の正常な機能にほとんど影響を与えなかったことを示している。
一方、RNA-seqデータを用いた差次的遺伝子発現解析を行い、arRNAがグロ
ーバルな遺伝子発現に影響を与えるかどうかを検証した。対照RNA151もarRNA
151-PPIBも、模擬グループと比較してグローバルな遺伝子発現に影響を与えない
ことがわかった(図22C、D)。我々の以前の観察(図18A)と一致して、arRN
AはPPIBの発現に対してRNAi効果を示さなかった(図22C、D)。
ーバルな遺伝子発現に影響を与えるかどうかを検証した。対照RNA151もarRNA
151-PPIBも、模擬グループと比較してグローバルな遺伝子発現に影響を与えない
ことがわかった(図22C、D)。我々の以前の観察(図18A)と一致して、arRN
AはPPIBの発現に対してRNAi効果を示さなかった(図22C、D)。
arRNAが標的転写物とRNA二重鎖を形成し、RNA二重鎖が自然免疫応答を誘発
する可能性があることを考慮して、arRNAの導入がそのような効果をもたらすかどう
かを調査した。これをテストするために、効果が証明されている4つの遺伝子転写産物を
標的とするarRNAを選択した。自然免疫活性化の2つの特徴であるインターフェロン
-β(IFN-β)(図22E)またはインターロイキン-6(IL-6)(図22F)
のmRNA誘導は観察されなかった。陽性対照として、二本鎖RNAの合成類似体-ポリ
(I:C)は強いIFN-βおよびIL-6発現を誘導した(図22E、F)。LEAP
ERは、標的細胞に、安全な治療に重要な特徴である免疫原性を誘発しないようである。
する可能性があることを考慮して、arRNAの導入がそのような効果をもたらすかどう
かを調査した。これをテストするために、効果が証明されている4つの遺伝子転写産物を
標的とするarRNAを選択した。自然免疫活性化の2つの特徴であるインターフェロン
-β(IFN-β)(図22E)またはインターロイキン-6(IL-6)(図22F)
のmRNA誘導は観察されなかった。陽性対照として、二本鎖RNAの合成類似体-ポリ
(I:C)は強いIFN-βおよびIL-6発現を誘導した(図22E、F)。LEAP
ERは、標的細胞に、安全な治療に重要な特徴である免疫原性を誘発しないようである。
実施例12
LEAPERによるp53の転写調節活性の回復
外因的タンパク質を導入することなくRNA編集ができる新しい方法を確立したので、
その治療的有用性を実証することを試みた。まず、細胞の恒常性の維持に重要な役割を果
たすことが知られている腫瘍抑制遺伝子TP53を標的としたが、ヒトの癌の50%超え
で頻繁に変異が起こる(非特許文献46)。TP53中のc.158G>Aの変異は、臨
床的に関連のあるナンセンス変異(Trp53Ter)であり、機能しないトランケート
されたタンパク質をもたらす(非特許文献46)。1つのarRNA111と2つの代替
arRNA(arRNA111-AG1とarRNA111-AG4)(上記のこの研究
で使用したarRNAと対照RNAの配列)を設計した。これらはいずれもTP53W5
3X転写産物を標的としており(図23A)、後者の2つは最小化した潜在的なオフター
ゲットに設計されている。ネイティブp53タンパク質の影響を排除するために、HEK
293T TP53-/-細胞株を生成した。TP53W53Xを標的とするarRNA
の3つの形態はすべて、変異したアデノシン部位でTP53W53X転写産物の約25~
35%を変換し(図23B)、arRNA111-AG1およびarRNA111-AG
4の不要な編集を可変的に削減した(図24)。ウエスタンブロットは、arRNA11
1、arRNA111-AG1、およびarRNA111-AG4がすべて、HEK29
3T TP53-/-細胞におけるTP53W53X転写産物に基づく完全長p53タン
パク質の産生を救うことができるのに対し、対照RNA111が救うことができないこと
を示した(図23C)。
LEAPERによるp53の転写調節活性の回復
外因的タンパク質を導入することなくRNA編集ができる新しい方法を確立したので、
その治療的有用性を実証することを試みた。まず、細胞の恒常性の維持に重要な役割を果
たすことが知られている腫瘍抑制遺伝子TP53を標的としたが、ヒトの癌の50%超え
で頻繁に変異が起こる(非特許文献46)。TP53中のc.158G>Aの変異は、臨
床的に関連のあるナンセンス変異(Trp53Ter)であり、機能しないトランケート
されたタンパク質をもたらす(非特許文献46)。1つのarRNA111と2つの代替
arRNA(arRNA111-AG1とarRNA111-AG4)(上記のこの研究
で使用したarRNAと対照RNAの配列)を設計した。これらはいずれもTP53W5
3X転写産物を標的としており(図23A)、後者の2つは最小化した潜在的なオフター
ゲットに設計されている。ネイティブp53タンパク質の影響を排除するために、HEK
293T TP53-/-細胞株を生成した。TP53W53Xを標的とするarRNA
の3つの形態はすべて、変異したアデノシン部位でTP53W53X転写産物の約25~
35%を変換し(図23B)、arRNA111-AG1およびarRNA111-AG
4の不要な編集を可変的に削減した(図24)。ウエスタンブロットは、arRNA11
1、arRNA111-AG1、およびarRNA111-AG4がすべて、HEK29
3T TP53-/-細胞におけるTP53W53X転写産物に基づく完全長p53タン
パク質の産生を救うことができるのに対し、対照RNA111が救うことができないこと
を示した(図23C)。
修復されたp53タンパク質が完全に機能するかどうかを検証するために、p53の転
写調節活性をp53-ルシフェラーゼシス報告システムでテストした(非特許文献47、
48)。arRNAの3つのバージョンすべてがp53活性を回復する可能性があり、最
適化されたバージョンarRNA111-AG1が最高のパフォーマンスを示した(図2
3D)。結論として、LEAPERがTP53の癌関連の早期終止コドン(pre-ma
ture stop codon)を修復し、その機能を回復できることを示した。
写調節活性をp53-ルシフェラーゼシス報告システムでテストした(非特許文献47、
48)。arRNAの3つのバージョンすべてがp53活性を回復する可能性があり、最
適化されたバージョンarRNA111-AG1が最高のパフォーマンスを示した(図2
3D)。結論として、LEAPERがTP53の癌関連の早期終止コドン(pre-ma
ture stop codon)を修復し、その機能を回復できることを示した。
実施例13
LEAPERによる病原性突然変異の修正
次に、LEAPERを使用してより病原性の高い変異を修正できるかどうかを調査した
。エーラース・ダンロス症候群のCOL3A1、原発性肺高血圧症のBMPR2、ジュベ
ール症候群のAHI1、ファンコニ貧血のFANCC、原発性家族性肥大性心筋症のMY
BPC3、及びX連鎖重症複合免疫不全症のIL2RGの6つの病原性遺伝子からの臨床
的に関連する変異を目指して、対応する病原性G>A変異を有するこれらの遺伝子のそれ
ぞれに対して111-nt arRNAを設計した(図25および上記のこの研究で使用
されたarRNAと対照RNAの配列、およびこの研究で使用された以下の疾患関連cD
NA)。
LEAPERによる病原性突然変異の修正
次に、LEAPERを使用してより病原性の高い変異を修正できるかどうかを調査した
。エーラース・ダンロス症候群のCOL3A1、原発性肺高血圧症のBMPR2、ジュベ
ール症候群のAHI1、ファンコニ貧血のFANCC、原発性家族性肥大性心筋症のMY
BPC3、及びX連鎖重症複合免疫不全症のIL2RGの6つの病原性遺伝子からの臨床
的に関連する変異を目指して、対応する病原性G>A変異を有するこれらの遺伝子のそれ
ぞれに対して111-nt arRNAを設計した(図25および上記のこの研究で使用
されたarRNAと対照RNAの配列、およびこの研究で使用された以下の疾患関連cD
NA)。
この研究で使用された疾患関連cDNA
HEK293T細胞でarRNA/cDNAペアを共発現させることにより、すべての
テストでA>G修正を行った有意な量の標的転写産物を同定した(図24)。G>A変異
は、ヒトの既知の致病点変異のほぼ半分を占めるため(非特許文献10、49)、LEA
PERによるA>G変換は治療に巨大な機会を提供することができる。
テストでA>G修正を行った有意な量の標的転写産物を同定した(図24)。G>A変異
は、ヒトの既知の致病点変異のほぼ半分を占めるため(非特許文献10、49)、LEA
PERによるA>G変換は治療に巨大な機会を提供することができる。
実施例14
LEAPERによる複数のヒト初代細胞でのRNA編集
LEAPERの臨床的有用性をさらに探求するために、複数のヒト初代細胞でこの方法
をテストすることに着手した。まず、レポーター1を編集するために151 nt ar
RNA(上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)を使用して、ヒト初
代肺線維芽細胞とヒト初代気管支上皮細胞でLEAPERをテストした(図15A)。E
GFP陽性細胞の35~45%は、両方のヒト初代細胞でLEAPERによって取得でき
た(図27A)。次に、これら2つの初代細胞とヒト初代T細胞でのLEAPERによる
内因性遺伝子PPIBの編集をテストしたところ、arRNA151-PPIBがヒト初
代肺線維芽細胞、初代気管支上皮細胞(図27B)および初代T細胞(図27C)での編
集率が>40%、>80%、>30%を達成できることを発見した。ヒト初代細胞におけ
るLEAPERの高い編集効率は、治療におけるその潜在的な用途のため特に有望である
。
LEAPERによる複数のヒト初代細胞でのRNA編集
LEAPERの臨床的有用性をさらに探求するために、複数のヒト初代細胞でこの方法
をテストすることに着手した。まず、レポーター1を編集するために151 nt ar
RNA(上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)を使用して、ヒト初
代肺線維芽細胞とヒト初代気管支上皮細胞でLEAPERをテストした(図15A)。E
GFP陽性細胞の35~45%は、両方のヒト初代細胞でLEAPERによって取得でき
た(図27A)。次に、これら2つの初代細胞とヒト初代T細胞でのLEAPERによる
内因性遺伝子PPIBの編集をテストしたところ、arRNA151-PPIBがヒト初
代肺線維芽細胞、初代気管支上皮細胞(図27B)および初代T細胞(図27C)での編
集率が>40%、>80%、>30%を達成できることを発見した。ヒト初代細胞におけ
るLEAPERの高い編集効率は、治療におけるその潜在的な用途のため特に有望である
。
実施例15
レンチウイルスの発現とarRNAの化学合成による効率的な編集
次に、LEAPERをより臨床的に適切な方法で送達できるかどうかを調査した。まず
、レンチウイルスベースの発現を介してarRNAの効果をテストした。レポーター-1
を標的とするarRNA151は、感染2日後(dpi)にHEK293T細胞でレポー
ター-1を保有する全細胞の40%以上で強力なEGFP発現を誘導した。8dpiでは
、EGFP比は約38%の同等レベルに維持され(図28Aおよび上記のこの研究で使用
されたarRNAと対照RNAの配列)、LEAPERは、継続的な投与を必要とする治
療法に適用できることを示唆している。ネイティブ遺伝子編集では、HEK293T細胞
でレンチウイルス形質導入を介してPPIBターゲティングarRNA151を送達し、
6dpiで6%を超える標的編集を観察した(図28B)。
次に、LEAPERのための合成arRNAオリゴヌクレオチドとエレクトロポレーシ
ョンデリバリー法をテストした。PPIB転写産物を標的とする、111-ntを有する
arRNAおよび対照RNAは化学的に合成され、arRNAの最初の3つおよび最後の
3つの残基で2’-O-メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を行った(図28C)
。エレクトロポレーションによってT細胞に導入された後、arRNA111-PPIB
オリゴはPPIB転写産物の編集の約20%(~20%)を達成し(図28D)、LEA
PERがオリゴヌクレオチド薬の開発に有望であることを示している。
レンチウイルスの発現とarRNAの化学合成による効率的な編集
次に、LEAPERをより臨床的に適切な方法で送達できるかどうかを調査した。まず
、レンチウイルスベースの発現を介してarRNAの効果をテストした。レポーター-1
を標的とするarRNA151は、感染2日後(dpi)にHEK293T細胞でレポー
ター-1を保有する全細胞の40%以上で強力なEGFP発現を誘導した。8dpiでは
、EGFP比は約38%の同等レベルに維持され(図28Aおよび上記のこの研究で使用
されたarRNAと対照RNAの配列)、LEAPERは、継続的な投与を必要とする治
療法に適用できることを示唆している。ネイティブ遺伝子編集では、HEK293T細胞
でレンチウイルス形質導入を介してPPIBターゲティングarRNA151を送達し、
6dpiで6%を超える標的編集を観察した(図28B)。
次に、LEAPERのための合成arRNAオリゴヌクレオチドとエレクトロポレーシ
ョンデリバリー法をテストした。PPIB転写産物を標的とする、111-ntを有する
arRNAおよび対照RNAは化学的に合成され、arRNAの最初の3つおよび最後の
3つの残基で2’-O-メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を行った(図28C)
。エレクトロポレーションによってT細胞に導入された後、arRNA111-PPIB
オリゴはPPIB転写産物の編集の約20%(~20%)を達成し(図28D)、LEA
PERがオリゴヌクレオチド薬の開発に有望であることを示している。
実施例16
LEAPERによるハーラー(Hurler)症候群患者由来の初代線維芽細胞におけ
るα-L-イデュロニダーゼ活性の回復
最後に、単一遺伝子疾患-ハーラー(Hurler)症候群の治療におけるLEAPE
Rの可能性を検討した。この疾患は、ムコ多糖の分解に関与するリソソーム代謝酵素であ
るα-L-イズロニダーゼ(IDUA)の欠損によるムコ多糖症I型(MPS I)の最
も重篤なサブタイプ(MPS I)である(非特許文献50)。もともとハーラー症候群
患者から分離された初代線維芽細胞GM06214を選択した。GM06214細胞は、
IDUA遺伝子のエクソン9にホモ接合のTGG>TAG変異を含み、タンパク質にTr
p402Ter変異をもたらす。化学修飾された合成RNAオリゴヌクレオチドによって
、IDUAの成熟mRNAとプレmRNAをそれぞれ標的とするarRNA111-ID
UA-V1とarRNA111-IDUA-V2の2つのバージョンのarRNAを設計
した(図29A及び上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)。エレ
クトロポレーションによりGM06214細胞にarRNA111-IDUA-V1また
はarRNA111-IDUA-V2を導入した後、NGS解析により標的RNA編集率
を測定し、4-MU-α-L-イズロニダーゼの基質によるα-L-イズロニダーゼの触
媒活性を異なる時点で測定した。arRNA111-IDUA-V1とarRNA111
-IDUA-V2はどちらも、エレクトロポレーション後の時間の経過とともにIDUA
欠損GM06214細胞のIDUA触媒活性を徐々に回復させ、arRNA111-ID
UA-V2はarRNA111-IDUA-V1よりもはるかに優れた性能を示し、α-
L-イズロニダーゼ活性は、3つの対照群で検出できなかった(図29B)。
LEAPERによるハーラー(Hurler)症候群患者由来の初代線維芽細胞におけ
るα-L-イデュロニダーゼ活性の回復
最後に、単一遺伝子疾患-ハーラー(Hurler)症候群の治療におけるLEAPE
Rの可能性を検討した。この疾患は、ムコ多糖の分解に関与するリソソーム代謝酵素であ
るα-L-イズロニダーゼ(IDUA)の欠損によるムコ多糖症I型(MPS I)の最
も重篤なサブタイプ(MPS I)である(非特許文献50)。もともとハーラー症候群
患者から分離された初代線維芽細胞GM06214を選択した。GM06214細胞は、
IDUA遺伝子のエクソン9にホモ接合のTGG>TAG変異を含み、タンパク質にTr
p402Ter変異をもたらす。化学修飾された合成RNAオリゴヌクレオチドによって
、IDUAの成熟mRNAとプレmRNAをそれぞれ標的とするarRNA111-ID
UA-V1とarRNA111-IDUA-V2の2つのバージョンのarRNAを設計
した(図29A及び上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)。エレ
クトロポレーションによりGM06214細胞にarRNA111-IDUA-V1また
はarRNA111-IDUA-V2を導入した後、NGS解析により標的RNA編集率
を測定し、4-MU-α-L-イズロニダーゼの基質によるα-L-イズロニダーゼの触
媒活性を異なる時点で測定した。arRNA111-IDUA-V1とarRNA111
-IDUA-V2はどちらも、エレクトロポレーション後の時間の経過とともにIDUA
欠損GM06214細胞のIDUA触媒活性を徐々に回復させ、arRNA111-ID
UA-V2はarRNA111-IDUA-V1よりもはるかに優れた性能を示し、α-
L-イズロニダーゼ活性は、3つの対照群で検出できなかった(図29B)。
LEAPERによってGM06214で回復されたIDUA活性がハーラー症候群を軽
減する程度をさらに評価するために、シャイエ(Scheie)症候群の患者からの別の
初代線維芽細胞であるGM01323細胞でのIDUA活性を調べた。これは、ハーラー
症候群よりもはるかに軽度のMPS Iのサブタイプであり、IDUA遺伝子のヘテロ接
合遺伝子型に起因する残りのIDUA活性によるものである。arRNA111-IDU
A-V2を含むGM06214細胞におけるIDUAの触媒活性は、エレクトロポレーシ
ョンの48時間後にGM01323細胞よりも高いことがわかった(図29B)。これら
の結果と一致して、NGS解析は、arRNA111-IDUA-V2がAからIへの編
集のほぼ30%を変換し、arRNA111-IDUA-V1の変換率よりもはるかに高
いことを示した(図29C)。さらなる解析により、IDUA転写産物のarRNAで覆
われた領域内で最小限の不要な編集が検出されたことが明らかになった(図29D)。重
要なことに、LEAPERは一次細胞で免疫応答を引き起こすことがなく、すでに証明し
たように、陽性対照として機能するRNA二重鎖ポリ(I:C)とは異なり、arRNA
111-IDUA-V1もarRNA111-IDUA-V2も、I型インターフェロン
および炎症誘発性応答に関与する遺伝子の発現を誘導しない(図29E)。これらの結果
は、特定の単一遺伝子疾患を標的とするLEAPERの治療の可能性を示している。
減する程度をさらに評価するために、シャイエ(Scheie)症候群の患者からの別の
初代線維芽細胞であるGM01323細胞でのIDUA活性を調べた。これは、ハーラー
症候群よりもはるかに軽度のMPS Iのサブタイプであり、IDUA遺伝子のヘテロ接
合遺伝子型に起因する残りのIDUA活性によるものである。arRNA111-IDU
A-V2を含むGM06214細胞におけるIDUAの触媒活性は、エレクトロポレーシ
ョンの48時間後にGM01323細胞よりも高いことがわかった(図29B)。これら
の結果と一致して、NGS解析は、arRNA111-IDUA-V2がAからIへの編
集のほぼ30%を変換し、arRNA111-IDUA-V1の変換率よりもはるかに高
いことを示した(図29C)。さらなる解析により、IDUA転写産物のarRNAで覆
われた領域内で最小限の不要な編集が検出されたことが明らかになった(図29D)。重
要なことに、LEAPERは一次細胞で免疫応答を引き起こすことがなく、すでに証明し
たように、陽性対照として機能するRNA二重鎖ポリ(I:C)とは異なり、arRNA
111-IDUA-V1もarRNA111-IDUA-V2も、I型インターフェロン
および炎症誘発性応答に関与する遺伝子の発現を誘導しない(図29E)。これらの結果
は、特定の単一遺伝子疾患を標的とするLEAPERの治療の可能性を示している。
実施例17
LEAPERによるハーラー症候群マウスのα-L-イデュロニダーゼ活性の回復
LEAPERがマウスで実験を行う可能性を提供するので、我々は、インビボで単一遺
伝子疾患-ハーラー症候群を治療するためのLEAPERの可能性を調べた。アデノ随伴
ウイルス(AAV)が送達システムとして選択されている。2つの配列(配列番号341
および配列番号342)をプラスミドAAV-U6-CMV-GFPベクターに挿入し、
そしてプラスミドをPackGene BiotechによってAAV8ウイルスにパッ
ケージングした(図31を参照)。ウイルス力価は次のとおりである。
LEAPERによるハーラー症候群マウスのα-L-イデュロニダーゼ活性の回復
LEAPERがマウスで実験を行う可能性を提供するので、我々は、インビボで単一遺
伝子疾患-ハーラー症候群を治療するためのLEAPERの可能性を調べた。アデノ随伴
ウイルス(AAV)が送達システムとして選択されている。2つの配列(配列番号341
および配列番号342)をプラスミドAAV-U6-CMV-GFPベクターに挿入し、
そしてプラスミドをPackGene BiotechによってAAV8ウイルスにパッ
ケージングした(図31を参照)。ウイルス力価は次のとおりである。
6匹のMPSI(idua W392Xマウス、B6.129S-Iduatm1.1
Kmke/J)雄マウス(4~10週齢)を選択して2つのグループに分け、第1のグル
ープの3匹のマウスのそれぞれにプラスミドAAV8-IDUA-adRNA151-K
D2がパッケージされたAAV8ウイルスの1E12GCを尾静脈を通して注射し、第2
のグループの他の3匹のマウスのそれぞれに、プラスミドAAV8-Random151
-KD2がパッケージされたAAV8ウイルスの1E12GCと対照を尾静脈を通して注
射した。注射の28日後、マウスを頸椎脱臼により殺処分し、肝臓を採取した。2つのグ
ループの各マウスについて、4-MU-α-L-イズロニダーゼ基質を有するマウス肝細
胞におけるα-L-イズロニダーゼの酵素活性を測定した。肝臓は細かく分割されており
、粉砕後の一部は(すぐに)酵素活性測定に使用された。第1のグループの平均相対酵素
活性は、第2のグループのそれよりも高い(図32Aを参照)。第1のグループの各マウ
スの相対的な酵素活性は、第2のグループのそれよりも高い(図32B、対照としてGM
01323は、野生型細胞と比較して0.3%のα-L-イズロニダーゼ酵素活性を有す
る)。酵素活性の結果から、第1のグループのマウスのα-L-イドロニダーゼ活性が回
復していることがわかる。TGG>TAG変異が回復し、LEAPERが効果的なRNA
編集を提供することを確認するために、次に、粉砕された肝臓の他の部分を使用して、2
つのグループの各マウスの次世代シーケンシング解析によりマウス肝細胞の標的RNA編
集率を測定した。他の部分はNGS用のtrizolが添加された。第1のグループの平
均RNA編集効率は、第2のグループのそれよりも高い(図33Aを参照)。第1のグル
ープの各マウスのRNA編集効率は、第2のグループのそれよりもほぼ高い(図33Bを
参照)。RNA編集効率の結果から、LEAPER法は最大7%の効果的なRNA編集を
提供できることがわかる。
Kmke/J)雄マウス(4~10週齢)を選択して2つのグループに分け、第1のグル
ープの3匹のマウスのそれぞれにプラスミドAAV8-IDUA-adRNA151-K
D2がパッケージされたAAV8ウイルスの1E12GCを尾静脈を通して注射し、第2
のグループの他の3匹のマウスのそれぞれに、プラスミドAAV8-Random151
-KD2がパッケージされたAAV8ウイルスの1E12GCと対照を尾静脈を通して注
射した。注射の28日後、マウスを頸椎脱臼により殺処分し、肝臓を採取した。2つのグ
ループの各マウスについて、4-MU-α-L-イズロニダーゼ基質を有するマウス肝細
胞におけるα-L-イズロニダーゼの酵素活性を測定した。肝臓は細かく分割されており
、粉砕後の一部は(すぐに)酵素活性測定に使用された。第1のグループの平均相対酵素
活性は、第2のグループのそれよりも高い(図32Aを参照)。第1のグループの各マウ
スの相対的な酵素活性は、第2のグループのそれよりも高い(図32B、対照としてGM
01323は、野生型細胞と比較して0.3%のα-L-イズロニダーゼ酵素活性を有す
る)。酵素活性の結果から、第1のグループのマウスのα-L-イドロニダーゼ活性が回
復していることがわかる。TGG>TAG変異が回復し、LEAPERが効果的なRNA
編集を提供することを確認するために、次に、粉砕された肝臓の他の部分を使用して、2
つのグループの各マウスの次世代シーケンシング解析によりマウス肝細胞の標的RNA編
集率を測定した。他の部分はNGS用のtrizolが添加された。第1のグループの平
均RNA編集効率は、第2のグループのそれよりも高い(図33Aを参照)。第1のグル
ープの各マウスのRNA編集効率は、第2のグループのそれよりもほぼ高い(図33Bを
参照)。RNA編集効率の結果から、LEAPER法は最大7%の効果的なRNA編集を
提供できることがわかる。
ADAR1(p110) cDNA
5’-ATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAA
ATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGG
ACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGA
AACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAA
ATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCA
GAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTG
GGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCT
CCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGG
CTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCG
ATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATG
CAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTAT
TCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAG
CCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTG
CCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTG
GCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCC
TGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGA
GATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTC
GACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGC
ACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAAC
GCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAA
GCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACAC
TCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACA
TGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAAT
GACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGAC
TGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATA
TCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGC
CACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGA
ATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCC
TACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTG
GGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGG
ACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGA
CTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGAT
GGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCG
CAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAA
AAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA GA
TTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ)TAG-3’ (配列番号332)
5’-ATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAA
ATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGG
ACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGA
AACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAA
ATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCA
GAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTG
GGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCT
CCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGG
CTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCG
ATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATG
CAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTAT
TCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAG
CCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTG
CCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTG
GCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCC
TGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGA
GATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTC
GACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGC
ACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAAC
GCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAA
GCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACAC
TCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACA
TGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAAT
GACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGAC
TGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATA
TCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGC
CACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGA
ATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCC
TACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTG
GGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGG
ACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGA
CTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGAT
GGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCG
CAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAA
AAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA GA
TTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ)TAG-3’ (配列番号332)
ADAR1(p150) cDNA
5’ATGAATCCGCGGCAGGGGTATTCCCTCAGCGGATACTACACCCATCCATTTCAAGGCTATGAGCACAGACAGCTCAG
ATACCAGCAGCCTGGGCCAGGATCTTCCCCCAGTAGTTTCCTGCTTAAGCAAATAGAATTTCTCAAGGGGCAGCTCCCAG
AAGCACCGGTGATTGGAAAGCAGACACCGTCACTGCCACCTTCCCTCCCAGGACTCCGGCCAAGGTTTCCAGTACTACTT
GCCTCCAGTACCAGAGGCAGGCAAGTGGACATCAGGGGTGTCCCCAGGGGCGTGCATCTCGGAAGTCAGGGGCTCCAGAG
AGGGTTCCAGCATCCTTCACCACGTGGCAGGAGTCTGCCACAGAGAGGTGTTGATTGCCTTTCCTCACATTTCCAGGAAC
TGAGTATCTACCAAGATCAGGAACAAAGGATCTTAAAGTTCCTGGAAGAGCTTGGGGAAGGGAAGGCCACCACAGCACAT
GATCTGTCTGGGAAACTTGGGACTCCGAAGAAAGAAATCAATCGAGTTTTATACTCCCTGGCAAAGAAGGGCAAGCTACA
GAAAGAGGCAGGAACACCCCCTTTGTGGAAAATCGCGGTCTCCACTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGAC
CAGACGGTCATAGCCAAGGAGCCCCAAACTCAGACCCGAGTTTGGAACCGGAAGACAGAAACTCCACATCTGTCTCAGAA
GATCTTCTTGAGCCTTTTATTGCAGTCTCAGCTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACAGTCATAG
CCAAGGATCCCCAAACTCAGACCCAGGTTTGGAACCTGAAGACAGCAACTCCACATCTGCCTTGGAAGATCCTCTTGAGT
TTTTAGACATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCT
AAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACA
AGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTC
CTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCC
TCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAG
ACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCC
AGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATG
CCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAG
CGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAAC
CTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAG
GATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCA
CTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGA
AGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGC
CCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAA
AGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACC
AGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTC
GTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTT
GGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCT
GCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCA
GAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCC
AGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCA
ACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAG
GACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGT
CAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCC
AGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTG
TATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATC
CCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTG
TGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAA
ATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCAC
ATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGG
ATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGG
AAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGT
GGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTT
ACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTC
AAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGT
A GATTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ) TAG-3’ (配列番号333)
5’ATGAATCCGCGGCAGGGGTATTCCCTCAGCGGATACTACACCCATCCATTTCAAGGCTATGAGCACAGACAGCTCAG
ATACCAGCAGCCTGGGCCAGGATCTTCCCCCAGTAGTTTCCTGCTTAAGCAAATAGAATTTCTCAAGGGGCAGCTCCCAG
AAGCACCGGTGATTGGAAAGCAGACACCGTCACTGCCACCTTCCCTCCCAGGACTCCGGCCAAGGTTTCCAGTACTACTT
GCCTCCAGTACCAGAGGCAGGCAAGTGGACATCAGGGGTGTCCCCAGGGGCGTGCATCTCGGAAGTCAGGGGCTCCAGAG
AGGGTTCCAGCATCCTTCACCACGTGGCAGGAGTCTGCCACAGAGAGGTGTTGATTGCCTTTCCTCACATTTCCAGGAAC
TGAGTATCTACCAAGATCAGGAACAAAGGATCTTAAAGTTCCTGGAAGAGCTTGGGGAAGGGAAGGCCACCACAGCACAT
GATCTGTCTGGGAAACTTGGGACTCCGAAGAAAGAAATCAATCGAGTTTTATACTCCCTGGCAAAGAAGGGCAAGCTACA
GAAAGAGGCAGGAACACCCCCTTTGTGGAAAATCGCGGTCTCCACTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGAC
CAGACGGTCATAGCCAAGGAGCCCCAAACTCAGACCCGAGTTTGGAACCGGAAGACAGAAACTCCACATCTGTCTCAGAA
GATCTTCTTGAGCCTTTTATTGCAGTCTCAGCTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACAGTCATAG
CCAAGGATCCCCAAACTCAGACCCAGGTTTGGAACCTGAAGACAGCAACTCCACATCTGCCTTGGAAGATCCTCTTGAGT
TTTTAGACATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCT
AAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACA
AGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTC
CTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCC
TCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAG
ACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCC
AGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATG
CCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAG
CGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAAC
CTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAG
GATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCA
CTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGA
AGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGC
CCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAA
AGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACC
AGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTC
GTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTT
GGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCT
GCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCA
GAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCC
AGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCA
ACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAG
GACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGT
CAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCC
AGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTG
TATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATC
CCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTG
TGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAA
ATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCAC
ATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGG
ATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGG
AAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGT
GGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTT
ACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTC
AAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGT
A GATTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ) TAG-3’ (配列番号333)
ADAR2 cDNA
5’-ATGGATATAGAAGATGAAGAAAACATGAGTTCCAGCAGCACTGATGTGAAGGAAAACCGCAATCTGGACAACGTGT
CCCCCAAGGATGGCAGCACACCTGGGCCTGGCGAGGGCTCTCAGCTCTCCAATGGGGGTGGTGGTGGCCCCGGCAGAAAG
CGGCCCCTGGAGGAGGGCAGCAATGGCCACTCCAAGTACCGCCTGAAGAAAAGGAGGAAAACACCAGGGCCCGTCCTCCC
CAAGAACGCCCTGATGCAGCTGAATGAGATCAAGCCTGGTTTGCAGTACACACTCCTGTCCCAGACTGGGCCCGTGCACG
CGCCTTTGTTTGTCATGTCTGTGGAGGTGAATGGCCAGGTTTTTGAGGGCTCTGGTCCCACAAAGAAAAAGGCAAAACTC
CATGCTGCTGAGAAGGCCTTGAGGTCTTTCGTTCAGTTTCCTAATGCCTCTGAGGCCCACCTGGCCATGGGGAGGACCCT
GTCTGTCAACACGGACTTCACATCTGACCAGGCCGACTTCCCTGACACGCTCTTCAATGGTTTTGAAACTCCTGACAAGG
CGGAGCCTCCCTTTTACGTGGGCTCCAATGGGGATGACTCCTTCAGTTCCAGCGGGGACCTCAGCTTGTCTGCTTCCCCG
GTGCCTGCCAGCCTAGCCCAGCCTCCTCTCCCTGCCTTACCACCATTCCCACCCCCGAGTGGGAAGAATCCCGTGATGAT
CTTGAACGAACTGCGCCCAGGACTCAAGTATGACTTCCTCTCCGAGAGCGGGGAGAGCCATGCCAAGAGCTTCGTCATGT
CTGTGGTCGTGGATGGTCAGTTCTTTGAAGGCTCGGGGAGAAACAAGAAGCTTGCCAAGGCCCGGGCTGCGCAGTCTGCC
CTGGCCGCCATTTTTAACTTGCACTTGGATCAGACGCCATCTCGCCAGCCTATTCCCAGTGAGGGTCTTCAGCTGCATTT
ACCGCAGGTTTTAGCTGACGCTGTCTCACGCCTGGTCCTGGGTAAGTTTGGTGACCTGACCGACAACTTCTCCTCCCCTC
ACGCTCGCAGAAAAGTGCTGGCTGGAGTCGTCATGACAACAGGCACAGATGTTAAAGATGCCAAGGTGATAAGTGTTTCT
ACAGGAACAAAATGTATTAATGGTGAATACATGAGTGATCGTGGCCTTGCATTAAATGACTGCCATGCAGAAATAATATC
TCGGAGATCCTTGCTCAGATTTCTTTATACACAACTTGAGCTTTACTTAAATAACAAAGATGATCAAAAAAGATCCATCT
TTCAGAAATCAGAGCGAGGGGGGTTTAGGCTGAAGGAGAATGTCCAGTTTCATCTGTACATCAGCACCTCTCCCTGTGGA
GATGCCAGAATCTTCTCACCACATGAGCCAATCCTGGAAGAACCAGCAGATAGACACCCAAATCGTAAAGCAAGAGGACA
GCTACGGACCAAAATAGAGTCTGGTGAGGGGACGATTCCAGTGCGCTCCAATGCGAGCATCCAAACGTGGGACGGGGTGC
TGCAAGGGGAGCGGCTGCTCACCATGTCCTGCAGTGACAAGATTGCACGCTGGAACGTGGTGGGCATCCAGGGATCCCTG
CTCAGCATTTTCGTGGAGCCCATTTACTTCTCGAGCATCATCCTGGGCAGCCTTTACCACGGGGACCACCTTTCCAGGGC
CATGTACCAGCGGATCTCCAACATAGAGGACCTGCCACCTCTCTACACCCTCAACAAGCCTTTGCTCAGTGGCATCAGCA
ATGCAGAAGCACGGCAGCCAGGGAAGGCCCCCAACTTCAGTGTCAACTGGACGGTAGGCGACTCCGCTATTGAGGTCATC
AACGCCACGACTGGGAAGGATGAGCTGGGCCGCGCGTCCCGCCTGTGTAAGCACGCGTTGTACTGTCGCTGGATGCGTGT
GCACGGCAAGGTTCCCTCCCACTTACTACGCTCCAAGATTACCAAACCCAACGTGTACCATGAGTCCAAGCTGGCGGCAA
AGGAGTACCAGGCCGCCAAGGCGCGTCTGTTCACAGCCTTCATCAAGGCGGGGCTGGGGGCCTGGGTGGAGAAGCCCACC
GAGCAGGACCAGTTCTCACTCACGCCC GATTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ)TAG-3’ (配列番号3
34)
5’-ATGGATATAGAAGATGAAGAAAACATGAGTTCCAGCAGCACTGATGTGAAGGAAAACCGCAATCTGGACAACGTGT
CCCCCAAGGATGGCAGCACACCTGGGCCTGGCGAGGGCTCTCAGCTCTCCAATGGGGGTGGTGGTGGCCCCGGCAGAAAG
CGGCCCCTGGAGGAGGGCAGCAATGGCCACTCCAAGTACCGCCTGAAGAAAAGGAGGAAAACACCAGGGCCCGTCCTCCC
CAAGAACGCCCTGATGCAGCTGAATGAGATCAAGCCTGGTTTGCAGTACACACTCCTGTCCCAGACTGGGCCCGTGCACG
CGCCTTTGTTTGTCATGTCTGTGGAGGTGAATGGCCAGGTTTTTGAGGGCTCTGGTCCCACAAAGAAAAAGGCAAAACTC
CATGCTGCTGAGAAGGCCTTGAGGTCTTTCGTTCAGTTTCCTAATGCCTCTGAGGCCCACCTGGCCATGGGGAGGACCCT
GTCTGTCAACACGGACTTCACATCTGACCAGGCCGACTTCCCTGACACGCTCTTCAATGGTTTTGAAACTCCTGACAAGG
CGGAGCCTCCCTTTTACGTGGGCTCCAATGGGGATGACTCCTTCAGTTCCAGCGGGGACCTCAGCTTGTCTGCTTCCCCG
GTGCCTGCCAGCCTAGCCCAGCCTCCTCTCCCTGCCTTACCACCATTCCCACCCCCGAGTGGGAAGAATCCCGTGATGAT
CTTGAACGAACTGCGCCCAGGACTCAAGTATGACTTCCTCTCCGAGAGCGGGGAGAGCCATGCCAAGAGCTTCGTCATGT
CTGTGGTCGTGGATGGTCAGTTCTTTGAAGGCTCGGGGAGAAACAAGAAGCTTGCCAAGGCCCGGGCTGCGCAGTCTGCC
CTGGCCGCCATTTTTAACTTGCACTTGGATCAGACGCCATCTCGCCAGCCTATTCCCAGTGAGGGTCTTCAGCTGCATTT
ACCGCAGGTTTTAGCTGACGCTGTCTCACGCCTGGTCCTGGGTAAGTTTGGTGACCTGACCGACAACTTCTCCTCCCCTC
ACGCTCGCAGAAAAGTGCTGGCTGGAGTCGTCATGACAACAGGCACAGATGTTAAAGATGCCAAGGTGATAAGTGTTTCT
ACAGGAACAAAATGTATTAATGGTGAATACATGAGTGATCGTGGCCTTGCATTAAATGACTGCCATGCAGAAATAATATC
TCGGAGATCCTTGCTCAGATTTCTTTATACACAACTTGAGCTTTACTTAAATAACAAAGATGATCAAAAAAGATCCATCT
TTCAGAAATCAGAGCGAGGGGGGTTTAGGCTGAAGGAGAATGTCCAGTTTCATCTGTACATCAGCACCTCTCCCTGTGGA
GATGCCAGAATCTTCTCACCACATGAGCCAATCCTGGAAGAACCAGCAGATAGACACCCAAATCGTAAAGCAAGAGGACA
GCTACGGACCAAAATAGAGTCTGGTGAGGGGACGATTCCAGTGCGCTCCAATGCGAGCATCCAAACGTGGGACGGGGTGC
TGCAAGGGGAGCGGCTGCTCACCATGTCCTGCAGTGACAAGATTGCACGCTGGAACGTGGTGGGCATCCAGGGATCCCTG
CTCAGCATTTTCGTGGAGCCCATTTACTTCTCGAGCATCATCCTGGGCAGCCTTTACCACGGGGACCACCTTTCCAGGGC
CATGTACCAGCGGATCTCCAACATAGAGGACCTGCCACCTCTCTACACCCTCAACAAGCCTTTGCTCAGTGGCATCAGCA
ATGCAGAAGCACGGCAGCCAGGGAAGGCCCCCAACTTCAGTGTCAACTGGACGGTAGGCGACTCCGCTATTGAGGTCATC
AACGCCACGACTGGGAAGGATGAGCTGGGCCGCGCGTCCCGCCTGTGTAAGCACGCGTTGTACTGTCGCTGGATGCGTGT
GCACGGCAAGGTTCCCTCCCACTTACTACGCTCCAAGATTACCAAACCCAACGTGTACCATGAGTCCAAGCTGGCGGCAA
AGGAGTACCAGGCCGCCAAGGCGCGTCTGTTCACAGCCTTCATCAAGGCGGGGCTGGGGGCCTGGGTGGAGAAGCCCACC
GAGCAGGACCAGTTCTCACTCACGCCC GATTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ)TAG-3’ (配列番号3
34)
疾患関連遺伝子のコード配列(CDS)
COL3A1
5’-atgatgagctttgtgcaaaaggggagctggctacttctcgctctgcttcatcccactattattttggcacaacagg
aagctgttgaaggaggatgttcccatcttggtcagtcctatgcggatagagatgtctggaagccagaaccatgccaaata
tgtgtctgtgactcaggatccgttctctgcgatgacataatatgtgacgatcaagaattagactgccccaacccagaaat
tccatttggagaatgttgtgcagtttgcccacagcctccaactgctcctactcgccctcctaatggtcaaggacctcaag
gccccaagggagatccaggccctcctggtattcctgggagaaatggtgaccctggtattccaggacaaccagggtcccct
ggttctcctggcccccctggaatctgtgaatcatgccctactggtcctcagaactattctccccagtatgattcatatga
tgtcaagtctggagtagcagtaggaggactcgcaggctatcctggaccagctggccccccaggccctcccggtccccctg
gtacatctggtcatcctggttcccctggatctccaggataccaaggaccccctggtgaacctgggcaagctggtccttca
ggccctccaggacctcctggtgctataggtccatctggtcctgctggaaaagatggagaatcaggtagacccggacgacc
tggagagcgaggattgcctggacctccaggtatcaaaggtccagctgggatacctggattccctggtatgaaaggacaca
gaggcttcgatggacgaaatggagaaaagggtgaaacaggtgctcctggattaaagggtgaaaatggtcttccaggcgaa
aatggagctcctggacccatgggtccaagaggggctcctggtgagcgaggacggccaggacttcctggggctgcaggtgc
tcggggtaatgacggtgctcgaggcagtgatggtcaaccaggccctcctggtcctcctggaactgccggattccctggat
cccctggtgctaagggtgaagttggacctgcagggtctcctggttcaaatggtgcccctggacaaagaggagaacctgga
cctcagggacacgctggtgctcaaggtcctcctggccctcctgggattaatggtagtcctggtggtaaaggcgaaatggg
tcccgctggcattcctggagctcctggactgatgggagcccggggtcctccaggaccagccggtgctaatggtgctcctg
gactgcgaggtggtgcaggtgagcctggtaagaatggtgccaaaggagagcccggaccacgtggtgaacgcggtgaggct
ggtattccaggtgttccaggagctaaaggcgaagatggcaaggatggatcacctggagaacctggtgcaaatgggcttcc
aggagctgcaggagaaaggggtgcccctgggttccgaggacctgctggaccaaatggcatcccaggagaaaagggtcctg
ctggagagcgtggtgctccaggccctgcagggcccagaggagctgctggagaacctggcagagatggcgtccctggaggt
ccaggaatgaggggcatgcccggaagtccaggaggaccaggaagtgatgggaaaccagggcctcccggaagtcaaggaga
aagtggtcgaccaggtcctcctgggccatctggtccccgaggtcagcctggtgtcatgggcttccccggtcctaaaggaa
atgatggtgctcctggtaagaatggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggaaagaatggt
gaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaagg
attacaaggcttgcctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccg
gtgcacctggagctccaggaggcaagggtgatgctggtgcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggcccca
ggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctgggccacctggtgctgc
tggtactcctggtctgcaaggaatgcctggagaaagaggaggtcttggaagtcctggtccaaagggtgacaagggtgaac
caggcggtccaggtgctgatggtgtcccagggaaagatggcccaaggggtcctactggtcctattggtcctcctggccca
gctggccagcctggagataagggtgaaggtggtgcccccggacttccaggtatagctggacctcgtggtagccctggtga
gagaggtgaaactggccctccaggacctgctggtttccctggtgctcctggacagaatggtgaacctggtggtaaaggag
aaagaggggctccgggtgagaaaggtgaaggaggccctcctggagttgcaggaccccctggaggttctggacctgctggt
cctcctggtccccaaggtgtcaaaggtgaacgtggcagtcctggtggacctggtgctgctggcttccctggtgctcgtgg
tcttcctggtcctcctggtagtaatggtaacccaggacccccaggtcccagcggttctccaggcaaggatgggcccccag
gtcctgcgggtaacactggtgctcctggcagccctggagtgtctggaccaaaaggtgatgctggccaaccaggagagaag
ggatcgcctggtgcccagggcccaccaggagctccaggcccacttgggattgctgggatcactggagcacggggtcttgc
aggaccaccaggcatgccaggtcctaggggaagccctggccctcagggtgtcaagggtgaaagtgggaaaccaggagcta
acggtctcagtggagaacgtggtccccctggaccccagggtcttcctggtctggctggtacagctggtgaacctggaaga
gatggaaaccctggatcagatggtcttccaggccgagatggatctcctggtggcaagggtgatcgtggtgaaaatggctc
tcctggtgcccctggcgctcctggtcatccaggcccacctggtcctgtcggtccagctggaaagagtggtgacagaggag
aaagtggccctgctggccctgctggtgctcccggtcctgctggttcccgaggtgctcctggtcctcaaggcccacgtggt
gacaaaggtgaaacaggtgaacgtggagctgctggcatcaaaggacatcgaggattccctggtaatccaggtgccccagg
ttctccaggccctgctggtcagcagggtgcaatcggcagtccaggacctgcaggccccagaggacctgttggacccagtg
gacctcctggcaaagatggaaccagtggacatccaggtcccattggaccaccagggcctcgaggtaacagaggtgaaaga
ggatctgagggctccccaggccacccagggcaaccaggccctcctggacctcctggtgcccctggtccttgctgtggtgg
tgttggagccgctgccattgctgggattggaggtgaaaaagctggcggttttgccccgtattatggagatgaaccaatgg
atttcaaaatcaacaccgatgagattatgacttcactcaagtctgttaatggacaaatagaaagcctcattagtcctgat
ggttctcgtaaaaaccccgctagaaactgcagagacctgaaattctgccatcctgaactcaagagtggagaatactgggt
tgaccctaaccaaggatgcaaattggatgctatcaaggtattctgtaatatggaaactggggaaacatgcataagtgcca
atcctttgaatgttccacggaaacactggtggacagattctagtgctgagaagaaacacgtttggtttggagagtccatg
gatggtggttttcagtttagctacggcaatcctgaacttcctgaagatgtccttgatgtgcagctggcattccttcgact
tctctccagccgagcttcccagaacatcacatatcactgcaaaaatagcattgcatacatggatcaggccagtggaaatg
taaagaaggccctgaagctgatggggtcaaatgaaggtgaattcaaggctgaaggaaatagcaaattcacctacacagtt
ctggaggatggttgcacgaaacacactggggaatggagcaaaacagtctttgaatatcgaacacgcaaggctgtgagact
acctattgtagatattgcaccctatgacattggtggtcctgatcaagaatttggtgtggacgttggccctgtttgctttt
tataa-3’ (配列番号335)
COL3A1
5’-atgatgagctttgtgcaaaaggggagctggctacttctcgctctgcttcatcccactattattttggcacaacagg
aagctgttgaaggaggatgttcccatcttggtcagtcctatgcggatagagatgtctggaagccagaaccatgccaaata
tgtgtctgtgactcaggatccgttctctgcgatgacataatatgtgacgatcaagaattagactgccccaacccagaaat
tccatttggagaatgttgtgcagtttgcccacagcctccaactgctcctactcgccctcctaatggtcaaggacctcaag
gccccaagggagatccaggccctcctggtattcctgggagaaatggtgaccctggtattccaggacaaccagggtcccct
ggttctcctggcccccctggaatctgtgaatcatgccctactggtcctcagaactattctccccagtatgattcatatga
tgtcaagtctggagtagcagtaggaggactcgcaggctatcctggaccagctggccccccaggccctcccggtccccctg
gtacatctggtcatcctggttcccctggatctccaggataccaaggaccccctggtgaacctgggcaagctggtccttca
ggccctccaggacctcctggtgctataggtccatctggtcctgctggaaaagatggagaatcaggtagacccggacgacc
tggagagcgaggattgcctggacctccaggtatcaaaggtccagctgggatacctggattccctggtatgaaaggacaca
gaggcttcgatggacgaaatggagaaaagggtgaaacaggtgctcctggattaaagggtgaaaatggtcttccaggcgaa
aatggagctcctggacccatgggtccaagaggggctcctggtgagcgaggacggccaggacttcctggggctgcaggtgc
tcggggtaatgacggtgctcgaggcagtgatggtcaaccaggccctcctggtcctcctggaactgccggattccctggat
cccctggtgctaagggtgaagttggacctgcagggtctcctggttcaaatggtgcccctggacaaagaggagaacctgga
cctcagggacacgctggtgctcaaggtcctcctggccctcctgggattaatggtagtcctggtggtaaaggcgaaatggg
tcccgctggcattcctggagctcctggactgatgggagcccggggtcctccaggaccagccggtgctaatggtgctcctg
gactgcgaggtggtgcaggtgagcctggtaagaatggtgccaaaggagagcccggaccacgtggtgaacgcggtgaggct
ggtattccaggtgttccaggagctaaaggcgaagatggcaaggatggatcacctggagaacctggtgcaaatgggcttcc
aggagctgcaggagaaaggggtgcccctgggttccgaggacctgctggaccaaatggcatcccaggagaaaagggtcctg
ctggagagcgtggtgctccaggccctgcagggcccagaggagctgctggagaacctggcagagatggcgtccctggaggt
ccaggaatgaggggcatgcccggaagtccaggaggaccaggaagtgatgggaaaccagggcctcccggaagtcaaggaga
aagtggtcgaccaggtcctcctgggccatctggtccccgaggtcagcctggtgtcatgggcttccccggtcctaaaggaa
atgatggtgctcctggtaagaatggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggaaagaatggt
gaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaagg
attacaaggcttgcctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccg
gtgcacctggagctccaggaggcaagggtgatgctggtgcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggcccca
ggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctgggccacctggtgctgc
tggtactcctggtctgcaaggaatgcctggagaaagaggaggtcttggaagtcctggtccaaagggtgacaagggtgaac
caggcggtccaggtgctgatggtgtcccagggaaagatggcccaaggggtcctactggtcctattggtcctcctggccca
gctggccagcctggagataagggtgaaggtggtgcccccggacttccaggtatagctggacctcgtggtagccctggtga
gagaggtgaaactggccctccaggacctgctggtttccctggtgctcctggacagaatggtgaacctggtggtaaaggag
aaagaggggctccgggtgagaaaggtgaaggaggccctcctggagttgcaggaccccctggaggttctggacctgctggt
cctcctggtccccaaggtgtcaaaggtgaacgtggcagtcctggtggacctggtgctgctggcttccctggtgctcgtgg
tcttcctggtcctcctggtagtaatggtaacccaggacccccaggtcccagcggttctccaggcaaggatgggcccccag
gtcctgcgggtaacactggtgctcctggcagccctggagtgtctggaccaaaaggtgatgctggccaaccaggagagaag
ggatcgcctggtgcccagggcccaccaggagctccaggcccacttgggattgctgggatcactggagcacggggtcttgc
aggaccaccaggcatgccaggtcctaggggaagccctggccctcagggtgtcaagggtgaaagtgggaaaccaggagcta
acggtctcagtggagaacgtggtccccctggaccccagggtcttcctggtctggctggtacagctggtgaacctggaaga
gatggaaaccctggatcagatggtcttccaggccgagatggatctcctggtggcaagggtgatcgtggtgaaaatggctc
tcctggtgcccctggcgctcctggtcatccaggcccacctggtcctgtcggtccagctggaaagagtggtgacagaggag
aaagtggccctgctggccctgctggtgctcccggtcctgctggttcccgaggtgctcctggtcctcaaggcccacgtggt
gacaaaggtgaaacaggtgaacgtggagctgctggcatcaaaggacatcgaggattccctggtaatccaggtgccccagg
ttctccaggccctgctggtcagcagggtgcaatcggcagtccaggacctgcaggccccagaggacctgttggacccagtg
gacctcctggcaaagatggaaccagtggacatccaggtcccattggaccaccagggcctcgaggtaacagaggtgaaaga
ggatctgagggctccccaggccacccagggcaaccaggccctcctggacctcctggtgcccctggtccttgctgtggtgg
tgttggagccgctgccattgctgggattggaggtgaaaaagctggcggttttgccccgtattatggagatgaaccaatgg
atttcaaaatcaacaccgatgagattatgacttcactcaagtctgttaatggacaaatagaaagcctcattagtcctgat
ggttctcgtaaaaaccccgctagaaactgcagagacctgaaattctgccatcctgaactcaagagtggagaatactgggt
tgaccctaaccaaggatgcaaattggatgctatcaaggtattctgtaatatggaaactggggaaacatgcataagtgcca
atcctttgaatgttccacggaaacactggtggacagattctagtgctgagaagaaacacgtttggtttggagagtccatg
gatggtggttttcagtttagctacggcaatcctgaacttcctgaagatgtccttgatgtgcagctggcattccttcgact
tctctccagccgagcttcccagaacatcacatatcactgcaaaaatagcattgcatacatggatcaggccagtggaaatg
taaagaaggccctgaagctgatggggtcaaatgaaggtgaattcaaggctgaaggaaatagcaaattcacctacacagtt
ctggaggatggttgcacgaaacacactggggaatggagcaaaacagtctttgaatatcgaacacgcaaggctgtgagact
acctattgtagatattgcaccctatgacattggtggtcctgatcaagaatttggtgtggacgttggccctgtttgctttt
tataa-3’ (配列番号335)
BMPR2
5’-atgacttcctcgctgcagcggccctggcgggtgccctggctaccatggaccatcctgctggtcagcgctgcggctg
cttcgcagaatcaagaacggctatgtgcgtttaaagatccgtatcagcaagaccttgggataggtgagagtagaatctct
catgaaaatgggacaatattatgctcgaaaggtagcacctgctatggcctttgggagaaatcaaaaggggacataaatct
tgtaaaacaaggatgttggtctcacattggagatccccaagagtgtcactatgaagaatgtgtagtaactaccactcctc
cctcaattcagaatggaacataccgtttctgctgttgtagcacagatttatgtaatgtcaactttactgagaattttcca
cctcctgacacaacaccactcagtccacctcattcatttaaccgagatgagacaataatcattgctttggcatcagtctc
tgtattagctgttttgatagttgccttatgctttggatacagaatgttgacaggagaccgtaaacaaggtcttcacagta
tgaacatgatggaggcagcagcatccgaaccctctcttgatctagataatctgaaactgttggagctgattggccgaggt
cgatatggagcagtatataaaggctccttggatgagcgtccagttgctgtaaaagtgttttcctttgcaaaccgtcagaa
ttttatcaacgaaaagaacatttacagagtgcctttgatggaacatgacaacattgcccgctttatagttggagatgaga
gagtcactgcagatggacgcatggaatatttgcttgtgatggagtactatcccaatggatctttatgcaagtatttaagt
ctccacacaagtgactgggtaagctcttgccgtcttgctcattctgttactagaggactggcttatcttcacacagaatt
accacgaggagatcattataaacctgcaatttcccatcgagatttaaacagcagaaatgtcctagtgaaaaatgatggaa
cctgtgttattagtgactttggactgtccatgaggctgactggaaatagactggtgcgcccaggggaggaagataatgca
gccataagcgaggttggcactatcagatatatggcaccagaagtgctagaaggagctgtgaacttgagggactgtgaatc
agctttgaaacaagtagacatgtatgctcttggactaatctattgggagatatttatgagatgtacagacctcttcccag
gggaatccgtaccagagtaccagatggcttttcagacagaggttggaaaccatcccacttttgaggatatgcaggttctc
gtgtctagggaaaaacagagacccaagttcccagaagcctggaaagaaaatagcctggcagtgaggtcactcaaggagac
aatcgaagactgttgggaccaggatgcagaggctcggcttactgcacagtgtgctgaggaaaggatggctgaacttatga
tgatttgggaaagaaacaaatctgtgagcccaacagtcaatccaatgtctactgctatgcagaatgaacgcaacctgtca
cataataggcgtgtgccaaaaattggtccttatccagattattcttcctcctcatacattgaagactctatccatcatac
tgacagcatcgtgaagaatatttcctctgagcattctatgtccagcacacctttgactataggggaaaaaaaccgaaatt
caattaactatgaacgacagcaagcacaagctcgaatccccagccctgaaacaagtgtcaccagcctctccaccaacaca
acaaccacaaacaccacaggactcacgccaagtactggcatgactactatatctgagatgccatacccagatgaaacaaa
tctgcataccacaaatgttgcacagtcaattgggccaacccctgtctgcttacagctgacagaagaagacttggaaacca
acaagctagacccaaaagaagttgataagaacctcaaggaaagctctgatgagaatctcatggagcactctcttaaacag
ttcagtggcccagacccactgagcagtactagttctagcttgctttacccactcataaaacttgcagtagaagcaactgg
acagcaggacttcacacagactgcaaatggccaagcatgtttgattcctgatgttctgcctactcagatctatcctctcc
ccaagcagcagaaccttcccaagagacctactagtttgcctttgaacaccaaaaattcaacaaaagagccccggctaaaa
tttggcagcaagcacaaatcaaacttgaaacaagtcgaaactggagttgccaagatgaatacaatcaatgcagcagaacc
tcatgtggtgacagtcaccatgaatggtgtggcaggtagaaaccacagtgttaactcccatgctgccacaacccaatatg
ccaatgggacagtactatctggccaaacaaccaacatagtgacacatagggcccaagaaatgttgcagaatcagtttatt
ggtgaggacacccggctgaatattaattccagtcctgatgagcatgagcctttactgagacgagagcaacaagctggcca
tgatgaaggtgttctggatcgtcttgtggacaggagggaacggccactagaaggtggccgaactaattccaataacaaca
acagcaatccatgttcagaacaagatgttcttgcacagggtgttccaagcacagcagcagatcctgggccatcaaagccc
agaagagcacagaggcctaattctctggatctttcagccacaaatgtcctggatggcagcagtatacagataggtgagtc
aacacaagatggcaaatcaggatcaggtgaaaagatcaagaaacgtgtgaaaactccctattctcttaagcggtggcgcc
cctccacctgggtcatctccactgaatcgctggactgtgaagtcaacaataatggcagtaacagggcagttcattccaaa
tccagcactgctgtttaccttgcagaaggaggcactgctacaaccatggtgtctaaagatataggaatgaactgtctgtg
a-3’ (配列番号336)
5’-atgacttcctcgctgcagcggccctggcgggtgccctggctaccatggaccatcctgctggtcagcgctgcggctg
cttcgcagaatcaagaacggctatgtgcgtttaaagatccgtatcagcaagaccttgggataggtgagagtagaatctct
catgaaaatgggacaatattatgctcgaaaggtagcacctgctatggcctttgggagaaatcaaaaggggacataaatct
tgtaaaacaaggatgttggtctcacattggagatccccaagagtgtcactatgaagaatgtgtagtaactaccactcctc
cctcaattcagaatggaacataccgtttctgctgttgtagcacagatttatgtaatgtcaactttactgagaattttcca
cctcctgacacaacaccactcagtccacctcattcatttaaccgagatgagacaataatcattgctttggcatcagtctc
tgtattagctgttttgatagttgccttatgctttggatacagaatgttgacaggagaccgtaaacaaggtcttcacagta
tgaacatgatggaggcagcagcatccgaaccctctcttgatctagataatctgaaactgttggagctgattggccgaggt
cgatatggagcagtatataaaggctccttggatgagcgtccagttgctgtaaaagtgttttcctttgcaaaccgtcagaa
ttttatcaacgaaaagaacatttacagagtgcctttgatggaacatgacaacattgcccgctttatagttggagatgaga
gagtcactgcagatggacgcatggaatatttgcttgtgatggagtactatcccaatggatctttatgcaagtatttaagt
ctccacacaagtgactgggtaagctcttgccgtcttgctcattctgttactagaggactggcttatcttcacacagaatt
accacgaggagatcattataaacctgcaatttcccatcgagatttaaacagcagaaatgtcctagtgaaaaatgatggaa
cctgtgttattagtgactttggactgtccatgaggctgactggaaatagactggtgcgcccaggggaggaagataatgca
gccataagcgaggttggcactatcagatatatggcaccagaagtgctagaaggagctgtgaacttgagggactgtgaatc
agctttgaaacaagtagacatgtatgctcttggactaatctattgggagatatttatgagatgtacagacctcttcccag
gggaatccgtaccagagtaccagatggcttttcagacagaggttggaaaccatcccacttttgaggatatgcaggttctc
gtgtctagggaaaaacagagacccaagttcccagaagcctggaaagaaaatagcctggcagtgaggtcactcaaggagac
aatcgaagactgttgggaccaggatgcagaggctcggcttactgcacagtgtgctgaggaaaggatggctgaacttatga
tgatttgggaaagaaacaaatctgtgagcccaacagtcaatccaatgtctactgctatgcagaatgaacgcaacctgtca
cataataggcgtgtgccaaaaattggtccttatccagattattcttcctcctcatacattgaagactctatccatcatac
tgacagcatcgtgaagaatatttcctctgagcattctatgtccagcacacctttgactataggggaaaaaaaccgaaatt
caattaactatgaacgacagcaagcacaagctcgaatccccagccctgaaacaagtgtcaccagcctctccaccaacaca
acaaccacaaacaccacaggactcacgccaagtactggcatgactactatatctgagatgccatacccagatgaaacaaa
tctgcataccacaaatgttgcacagtcaattgggccaacccctgtctgcttacagctgacagaagaagacttggaaacca
acaagctagacccaaaagaagttgataagaacctcaaggaaagctctgatgagaatctcatggagcactctcttaaacag
ttcagtggcccagacccactgagcagtactagttctagcttgctttacccactcataaaacttgcagtagaagcaactgg
acagcaggacttcacacagactgcaaatggccaagcatgtttgattcctgatgttctgcctactcagatctatcctctcc
ccaagcagcagaaccttcccaagagacctactagtttgcctttgaacaccaaaaattcaacaaaagagccccggctaaaa
tttggcagcaagcacaaatcaaacttgaaacaagtcgaaactggagttgccaagatgaatacaatcaatgcagcagaacc
tcatgtggtgacagtcaccatgaatggtgtggcaggtagaaaccacagtgttaactcccatgctgccacaacccaatatg
ccaatgggacagtactatctggccaaacaaccaacatagtgacacatagggcccaagaaatgttgcagaatcagtttatt
ggtgaggacacccggctgaatattaattccagtcctgatgagcatgagcctttactgagacgagagcaacaagctggcca
tgatgaaggtgttctggatcgtcttgtggacaggagggaacggccactagaaggtggccgaactaattccaataacaaca
acagcaatccatgttcagaacaagatgttcttgcacagggtgttccaagcacagcagcagatcctgggccatcaaagccc
agaagagcacagaggcctaattctctggatctttcagccacaaatgtcctggatggcagcagtatacagataggtgagtc
aacacaagatggcaaatcaggatcaggtgaaaagatcaagaaacgtgtgaaaactccctattctcttaagcggtggcgcc
cctccacctgggtcatctccactgaatcgctggactgtgaagtcaacaataatggcagtaacagggcagttcattccaaa
tccagcactgctgtttaccttgcagaaggaggcactgctacaaccatggtgtctaaagatataggaatgaactgtctgtg
a-3’ (配列番号336)
AHI1
5’-atgcctacagctgagagtgaagcaaaagtaaaaaccaaagttcgctttgaagaattgcttaagacccacagtgatc
taatgcgtgaaaagaaaaaactgaagaaaaaacttgtcaggtctgaagaaaacatctcacctgacactattagaagcaat
cttcactatatgaaagaaactacaagtgatgatcccgacactattagaagcaatcttccccatattaaagaaactacaag
tgatgatgtaagtgctgctaacactaacaacctgaagaagagcacgagagtcactaaaaacaaattgaggaacacacagt
tagcaactgaaaatcctaatggtgatgctagtgtagaggaagacaaacaaggaaagccaaataaaaaggtgataaagacg
gtgccccagttgactacacaagacctgaaaccggaaactcctgagaataaggttgattctacacaccagaaaacacatac
aaagccacagccaggcgttgatcatcagaaaagtgagaaggcaaatgagggaagagaagagactgatttagaagaggatg
aagaattgatgcaagcatatcagtgccatgtaactgaagaaatggcaaaggagattaagaggaaaataagaaagaaactg
aaagaacagttgacttactttccctcagatactttattccatgatgacaaactaagcagtgaaaaaaggaaaaagaaaaa
ggaagttccagtcttctctaaagctgaaacaagtacattgaccatctctggtgacacagttgaaggtgaacaaaagaaag
aatcttcagttagatcagtttcttcagattctcatcaagatgatgaaataagctcaatggaacaaagcacagaagacagc
atgcaagatgatacaaaacctaaaccaaaaaaaacaaaaaagaagactaaagcagttgcagataataatgaagatgttga
tggtgatggtgttcatgaaataacaagccgagatagcccggtttatcccaaatgtttgcttgatgatgaccttgtcttgg
gagtttacattcaccgaactgatagacttaagtcagattttatgatttctcacccaatggtaaaaattcatgtggttgat
gagcatactggtcaatatgtcaagaaagatgatagtggacggcctgtttcatcttactatgaaaaagagaatgtggatta
tattcttcctattatgacccagccatatgattttaaacagttaaaatcaagacttccagagtgggaagaacaaattgtat
ttaatgaaaattttccctatttgcttcgaggctctgatgagagtcctaaagtcatcctgttctttgagattcttgatttc
ttaagcgtggatgaaattaagaataattctgaggttcaaaaccaagaatgtggctttcggaaaattgcctgggcatttct
taagcttctgggagccaatggaaatgcaaacatcaactcaaaacttcgcttgcagctatattacccacctactaagcctc
gatccccattaagtgttgttgaggcatttgaatggtggtcaaaatgtccaagaaatcattacccatcaacactgtacgta
actgtaagaggactgaaagttccagactgtataaagccatcttaccgctctatgatggctcttcaggaggaaaaaggtaa
accagtgcattgtgaacgtcaccatgagtcaagctcagtagacacagaacctggattagaagagtcaaaggaagtaataa
agtggaaacgactccctgggcaggcttgccgtatcccaaacaaacacctcttctcactaaatgcaggagaacgaggatgt
ttttgtcttgatttctcccacaatggaagaatattagcagcagcttgtgccagccgggatggatatccaattattttata
tgaaattccttctggacgtttcatgagagaattgtgtggccacctcaatatcatttatgatctttcctggtcaaaagatg
atcactacatccttacttcatcatctgatggcactgccaggatatggaaaaatgaaataaacaatacaaatactttcaga
gttttacctcatccttcttttgtttacacggctaaattccatccagctgtaagagagctagtagttacaggatgctatga
ttccatgatacggatatggaaagttgagatgagagaagattctgccatattggtccgacagtttgacgttcacaaaagtt
ttatcaactcactttgttttgatactgaaggtcatcatatgtattcaggagattgtacaggggtgattgttgtttggaat
acctatgtcaagattaatgatttggaacattcagtgcaccactggactataaataaggaaattaaagaaactgagtttaa
gggaattccaataagttatttggagattcatcccaatggaaaacgtttgttaatccataccaaagacagtactttgagaa
ttatggatctccggatattagtagcaaggaagtttgtaggagcagcaaattatcgggagaagattcatagtactttgact
ccatgtgggacttttctgtttgctggaagtgaggatggtatagtgtatgtttggaacccagaaacaggagaacaagtagc
catgtattctgacttgccattcaagtcacccattcgagacatttcttatcatccatttgaaaatatggttgcattctgtg
catttgggcaaaatgagccaattcttctgtatatttacgatttccatgttgcccagcaggaggctgaaatgttcaaacgc
tacaatggaacatttccattacctggaatacaccaaagtcaagatgccctatgtacctgtccaaaactaccccatcaagg
ctcttttcagattgatgaatttgtccacactgaaagttcttcaacgaagatgcagctagtaaaacagaggcttgaaactg
tcacagaggtgatacgttcctgtgctgcaaaagtcaacaaaaatctctcatttacttcaccaccagcagtttcctcacaa
cagtctaagttaaagcagtcaaacatgctgaccgctcaagagattctacatcagtttggtttcactcagaccgggattat
cagcatagaaagaaagccttgtaaccatcaggtagatacagcaccaacggtagtggctctttatgactacacagcgaatc
gatcagatgaactaaccatccatcgcggagacattatccgagtgtttttcaaagataatgaagactggtggtatggcagc
ataggaaagggacaggaaggttattttccagctaatcatgtggctagtgaaacactgtatcaagaactgcctcctgagat
aaaggagcgatcccctcctttaagccctgaggaaaaaactaaaatagaaaaatctccagctcctcaaaagcaatcaatca
ataagaacaagtcccaggacttcagactaggctcagaatctatgacacattctgaaatgagaaaagaacagagccatgag
gaccaaggacacataatggatacacggatgaggaagaacaagcaagcaggcagaaaagtcactctaatagagta-3’ (
配列番号337)
5’-atgcctacagctgagagtgaagcaaaagtaaaaaccaaagttcgctttgaagaattgcttaagacccacagtgatc
taatgcgtgaaaagaaaaaactgaagaaaaaacttgtcaggtctgaagaaaacatctcacctgacactattagaagcaat
cttcactatatgaaagaaactacaagtgatgatcccgacactattagaagcaatcttccccatattaaagaaactacaag
tgatgatgtaagtgctgctaacactaacaacctgaagaagagcacgagagtcactaaaaacaaattgaggaacacacagt
tagcaactgaaaatcctaatggtgatgctagtgtagaggaagacaaacaaggaaagccaaataaaaaggtgataaagacg
gtgccccagttgactacacaagacctgaaaccggaaactcctgagaataaggttgattctacacaccagaaaacacatac
aaagccacagccaggcgttgatcatcagaaaagtgagaaggcaaatgagggaagagaagagactgatttagaagaggatg
aagaattgatgcaagcatatcagtgccatgtaactgaagaaatggcaaaggagattaagaggaaaataagaaagaaactg
aaagaacagttgacttactttccctcagatactttattccatgatgacaaactaagcagtgaaaaaaggaaaaagaaaaa
ggaagttccagtcttctctaaagctgaaacaagtacattgaccatctctggtgacacagttgaaggtgaacaaaagaaag
aatcttcagttagatcagtttcttcagattctcatcaagatgatgaaataagctcaatggaacaaagcacagaagacagc
atgcaagatgatacaaaacctaaaccaaaaaaaacaaaaaagaagactaaagcagttgcagataataatgaagatgttga
tggtgatggtgttcatgaaataacaagccgagatagcccggtttatcccaaatgtttgcttgatgatgaccttgtcttgg
gagtttacattcaccgaactgatagacttaagtcagattttatgatttctcacccaatggtaaaaattcatgtggttgat
gagcatactggtcaatatgtcaagaaagatgatagtggacggcctgtttcatcttactatgaaaaagagaatgtggatta
tattcttcctattatgacccagccatatgattttaaacagttaaaatcaagacttccagagtgggaagaacaaattgtat
ttaatgaaaattttccctatttgcttcgaggctctgatgagagtcctaaagtcatcctgttctttgagattcttgatttc
ttaagcgtggatgaaattaagaataattctgaggttcaaaaccaagaatgtggctttcggaaaattgcctgggcatttct
taagcttctgggagccaatggaaatgcaaacatcaactcaaaacttcgcttgcagctatattacccacctactaagcctc
gatccccattaagtgttgttgaggcatttgaatggtggtcaaaatgtccaagaaatcattacccatcaacactgtacgta
actgtaagaggactgaaagttccagactgtataaagccatcttaccgctctatgatggctcttcaggaggaaaaaggtaa
accagtgcattgtgaacgtcaccatgagtcaagctcagtagacacagaacctggattagaagagtcaaaggaagtaataa
agtggaaacgactccctgggcaggcttgccgtatcccaaacaaacacctcttctcactaaatgcaggagaacgaggatgt
ttttgtcttgatttctcccacaatggaagaatattagcagcagcttgtgccagccgggatggatatccaattattttata
tgaaattccttctggacgtttcatgagagaattgtgtggccacctcaatatcatttatgatctttcctggtcaaaagatg
atcactacatccttacttcatcatctgatggcactgccaggatatggaaaaatgaaataaacaatacaaatactttcaga
gttttacctcatccttcttttgtttacacggctaaattccatccagctgtaagagagctagtagttacaggatgctatga
ttccatgatacggatatggaaagttgagatgagagaagattctgccatattggtccgacagtttgacgttcacaaaagtt
ttatcaactcactttgttttgatactgaaggtcatcatatgtattcaggagattgtacaggggtgattgttgtttggaat
acctatgtcaagattaatgatttggaacattcagtgcaccactggactataaataaggaaattaaagaaactgagtttaa
gggaattccaataagttatttggagattcatcccaatggaaaacgtttgttaatccataccaaagacagtactttgagaa
ttatggatctccggatattagtagcaaggaagtttgtaggagcagcaaattatcgggagaagattcatagtactttgact
ccatgtgggacttttctgtttgctggaagtgaggatggtatagtgtatgtttggaacccagaaacaggagaacaagtagc
catgtattctgacttgccattcaagtcacccattcgagacatttcttatcatccatttgaaaatatggttgcattctgtg
catttgggcaaaatgagccaattcttctgtatatttacgatttccatgttgcccagcaggaggctgaaatgttcaaacgc
tacaatggaacatttccattacctggaatacaccaaagtcaagatgccctatgtacctgtccaaaactaccccatcaagg
ctcttttcagattgatgaatttgtccacactgaaagttcttcaacgaagatgcagctagtaaaacagaggcttgaaactg
tcacagaggtgatacgttcctgtgctgcaaaagtcaacaaaaatctctcatttacttcaccaccagcagtttcctcacaa
cagtctaagttaaagcagtcaaacatgctgaccgctcaagagattctacatcagtttggtttcactcagaccgggattat
cagcatagaaagaaagccttgtaaccatcaggtagatacagcaccaacggtagtggctctttatgactacacagcgaatc
gatcagatgaactaaccatccatcgcggagacattatccgagtgtttttcaaagataatgaagactggtggtatggcagc
ataggaaagggacaggaaggttattttccagctaatcatgtggctagtgaaacactgtatcaagaactgcctcctgagat
aaaggagcgatcccctcctttaagccctgaggaaaaaactaaaatagaaaaatctccagctcctcaaaagcaatcaatca
ataagaacaagtcccaggacttcagactaggctcagaatctatgacacattctgaaatgagaaaagaacagagccatgag
gaccaaggacacataatggatacacggatgaggaagaacaagcaagcaggcagaaaagtcactctaatagagta-3’ (
配列番号337)
FANCC
5’-atggctcaagattcagtagatctttcttgtgattatcagttttggatgcagaagctttctgtatgggatcaggctt
ccactttggaaacccagcaagacacctgtcttcacgtggctcagttccaggagttcctaaggaagatgtatgaagccttg
aaagagatggattctaatacagtcattgaaagattccccacaattggtcaactgttggcaaaagcttgttggaatccttt
tattttagcatatgatgaaagccaaaaaattctaatatggtgcttatgttgtctaattaacaaagaaccacagaattctg
gacaatcaaaacttaactcctggatacagggtgtattatctcatatactttcagcactcagatttgataaagaagttgct
cttttcactcaaggtcttgggtatgcacctatagattactatcctggtttgcttaaaaatatggttttatcattagcgtc
tgaactcagagagaatcatcttaatggatttaacactcaaaggcgaatggctcccgagcgagtggcgtccctgtcacgag
tttgtgtcccacttattaccctgacagatgttgaccccctggtggaggctctcctcatctgtcatggacgtgaacctcag
gaaatcctccagccagagttctttgaggctgtaaacgaggccattttgctgaagaagatttctctccccatgtcagctgt
agtctgcctctggcttcggcaccttcccagccttgaaaaagcaatgctgcatctttttgaaaagctaatctccagtgaga
gaaattgtctgagaaggatcgaatgctttataaaagattcatcgctgcctcaagcagcctgccaccctgccatattccgg
gttgttgatgagatgttcaggtgtgcactcctggaaaccgatggggccctggaaatcatagccactattcaggtgtttac
gcagtgctttgtagaagctctggagaaagcaagcaagcagctgcggtttgcactcaagacctactttccttacacttctc
catctcttgccatggtgctgctgcaagaccctcaagatatccctcggggacactggctccagacactgaagcatatttct
gaactgctcagagaagcagttgaagaccagactcatgggtcctgcggaggtccctttgagagctggttcctgttcattca
cttcggaggatgggctgagatggtggcagagcaattactgatgtcggcagccgaaccccccacggccctgctgtggctct
tggccttctactacggcccccgtgatgggaggcagcagagagcacagactatggtccaggtgaaggccgtgctgggccac
ctcctggcaatgtccagaagcagcagcctctcagcccaggacctgcagacggtagcaggacagggcacagacacagacct
cagagctcctgcacaacagctgatcaggcaccttctcctcaacttcctgctctgggctcctggaggccacacgatcgcct
gggatgtcatcaccctgatggctcacactgctgagataactcacgagatcattggctttcttgaccagaccttgtacaga
tggaatcgtcttggcattgaaagccctagatcagaaaaactggcccgagagctccttaaagagctgcgaactcaagtcta
g-3’ (配列番号338)
5’-atggctcaagattcagtagatctttcttgtgattatcagttttggatgcagaagctttctgtatgggatcaggctt
ccactttggaaacccagcaagacacctgtcttcacgtggctcagttccaggagttcctaaggaagatgtatgaagccttg
aaagagatggattctaatacagtcattgaaagattccccacaattggtcaactgttggcaaaagcttgttggaatccttt
tattttagcatatgatgaaagccaaaaaattctaatatggtgcttatgttgtctaattaacaaagaaccacagaattctg
gacaatcaaaacttaactcctggatacagggtgtattatctcatatactttcagcactcagatttgataaagaagttgct
cttttcactcaaggtcttgggtatgcacctatagattactatcctggtttgcttaaaaatatggttttatcattagcgtc
tgaactcagagagaatcatcttaatggatttaacactcaaaggcgaatggctcccgagcgagtggcgtccctgtcacgag
tttgtgtcccacttattaccctgacagatgttgaccccctggtggaggctctcctcatctgtcatggacgtgaacctcag
gaaatcctccagccagagttctttgaggctgtaaacgaggccattttgctgaagaagatttctctccccatgtcagctgt
agtctgcctctggcttcggcaccttcccagccttgaaaaagcaatgctgcatctttttgaaaagctaatctccagtgaga
gaaattgtctgagaaggatcgaatgctttataaaagattcatcgctgcctcaagcagcctgccaccctgccatattccgg
gttgttgatgagatgttcaggtgtgcactcctggaaaccgatggggccctggaaatcatagccactattcaggtgtttac
gcagtgctttgtagaagctctggagaaagcaagcaagcagctgcggtttgcactcaagacctactttccttacacttctc
catctcttgccatggtgctgctgcaagaccctcaagatatccctcggggacactggctccagacactgaagcatatttct
gaactgctcagagaagcagttgaagaccagactcatgggtcctgcggaggtccctttgagagctggttcctgttcattca
cttcggaggatgggctgagatggtggcagagcaattactgatgtcggcagccgaaccccccacggccctgctgtggctct
tggccttctactacggcccccgtgatgggaggcagcagagagcacagactatggtccaggtgaaggccgtgctgggccac
ctcctggcaatgtccagaagcagcagcctctcagcccaggacctgcagacggtagcaggacagggcacagacacagacct
cagagctcctgcacaacagctgatcaggcaccttctcctcaacttcctgctctgggctcctggaggccacacgatcgcct
gggatgtcatcaccctgatggctcacactgctgagataactcacgagatcattggctttcttgaccagaccttgtacaga
tggaatcgtcttggcattgaaagccctagatcagaaaaactggcccgagagctccttaaagagctgcgaactcaagtcta
g-3’ (配列番号338)
MYBPC3
5’-atgcctgagccggggaagaagccagtctcagcttttagcaagaagccacggtcagtggaagtggccgcaggcagcc
ctgccgtgttcgaggccgagacagagcgggcaggagtgaaggtgcgctggcagcgcggaggcagtgacatcagcgccagc
aacaagtacggcctggccacagagggcacacggcatacgctgacagtgcgggaagtgggccctgccgaccagggatctta
cgcagtcattgctggctcctccaaggtcaagttcgacctcaaggtcatagaggcagagaaggcagagcccatgctggccc
ctgcccctgcccctgctgaggccactggagcccctggagaagccccggccccagccgctgagctgggagaaagtgcccca
agtcccaaagggtcaagctcagcagctctcaatggtcctacccctggagcccccgatgaccccattggcctcttcgtgat
gcggccacaggatggcgaggtgaccgtgggtggcagcatcaccttctcagcccgcgtggccggcgccagcctcctgaagc
cgcctgtggtcaagtggttcaagggcaaatgggtggacctgagcagcaaggtgggccagcacctgcagctgcacgacagc
tacgaccgcgccagcaaggtctatctgttcgagctgcacatcaccgatgcccagcctgccttcactggcagctaccgctg
tgaggtgtccaccaaggacaaatttgactgctccaacttcaatctcactgtccacgaggccatgggcaccggagacctgg
acctcctatcagccttccgccgcacgagcctggctggaggtggtcggcggatcagtgatagccatgaggacactgggatt
ctggacttcagctcactgctgaaaaagagagacagtttccggaccccgagggactcgaagctggaggcaccagcagagga
ggacgtgtgggagatcctacggcaggcacccccatctgagtacgagcgcatcgccttccagtacggcgtcactgacctgc
gcggcatgctaaagaggctcaagggcatgaggcgcgatgagaagaagagcacagcctttcagaagaagctggagccggcc
taccaggtgagcaaaggccacaagatccggctgaccgtggaactggctgaccatgacgctgaggtcaaatggctcaagaa
tggccaggagatccagatgagcggcagcaagtacatctttgagtccatcggtgccaagcgtaccctgaccatcagccagt
gctcattggcggacgacgcagcctaccagtgcgtggtgggtggcgagaagtgtagcacggagctctttgtgaaagagccc
cctgtgctcatcacgcgccccttggaggaccagctggtgatggtggggcagcgggtggagtttgagtgtgaagtatcgga
ggagggggcgcaagtcaaatggctgaaggacggggtggagctgacccgggaggagaccttcaaataccggttcaagaagg
acgggcagagacaccacctgatcatcaacgaggccatgctggaggacgcggggcactatgcactgtgcactagcgggggc
caggcgctggctgagctcattgtgcaggaaaagaagctggaggtgtaccagagcatcgcagacctgatggtgggcgcaaa
ggaccaggcggtgttcaaatgtgaggtctcagatgagaatgttcggggtgtgtggctgaagaatgggaaggagctggtgc
ccgacagccgcataaaggtgtcccacatcgggcgggtccacaaactgaccattgacgacgtcacacctgccgacgaggct
gactacagctttgtgcccgagggcttcgcctgcaacctgtcagccaagctccacttcatggaggtcaagattgacttcgt
acccaggcaggaacctcccaagatccacctggactgcccaggccgcataccagacaccattgtggttgtagctggaaata
agctacgtctggacgtccctatctctggggaccctgctcccactgtgatctggcagaaggctatcacgcaggggaataag
gccccagccaggccagccccagatgccccagaggacacaggtgacagcgatgagtgggtgtttgacaagaagctgctgtg
tgagaccgagggccgggtccgcgtggagaccaccaaggaccgcagcatcttcacggtcgagggggcagagaaggaagatg
agggcgtctacacggtcacagtgaagaaccctgtgggcgaggaccaggtcaacctcacagtcaaggtcatcgacgtgcca
gacgcacctgcggcccccaagatcagcaacgtgggagaggactcctgcacagtacagtgggagccgcctgcctacgatgg
cgggcagcccatcctgggctacatcctggagcgcaagaagaagaagagctaccggtggatgcggctgaacttcgacctga
ttcaggagctgagtcatgaagcgcggcgcatgatcgagggcgtggtgtacgagatgcgcgtctacgcggtcaacgccatc
ggcatgtccaggcccagccctgcctcccagcccttcatgcctatcggtccccccagcgaacccacccacctggcagtaga
ggacgtctctgacaccacggtctccctcaagtggcggcccccagagcgcgtgggagcaggaggcctggatggctacagcg
tggagtactgcccagagggctgctcagagtgggtggctgccctgcaggggctgacagagcacacatcgatactggtgaag
gacctgcccacgggggcccggctgcttttccgagtgcgggcacacaatatggcagggcctggagcccctgttaccaccac
ggagccggtgacagtgcaggagatcctgcaacggccacggcttcagctgcccaggcacctgcgccagaccattcagaaga
aggtcggggagcctgtgaaccttctcatccctttccagggcaagccccggcctcaggtgacctggaccaaagaggggcag
cccctggcaggcgaggaggtgagcatccgcaacagccccacagacaccatcctgttcatccgggccgctcgccgcgtgca
ttcaggcacttaccaggtgacggtgcgcattgagaacatggaggacaaggccacgctggtgctgcaggttgttgacaagc
caagtcctccccaggatctccgggtgactgacgcctggggtcttaatgtggctctggagtggaagccaccccaggatgtc
ggcaacacggagctctgggggtacacagtgcagaaagccgacaagaagaccatggagtggttcaccgtcttggagcatta
ccgccgcacccactgcgtggtgccagagctcatcattggcaatggctactacttccgcgtcttcagccagaatatggttg
gctttagtgacagagcggccaccaccaaggagcccgtctttatccccagaccaggcatcacctatgagccacccaactat
aaggccctggacttctccgaggccccaagcttcacccagcccctggtgaaccgctcggtcatcgcgggctacactgctat
gctctgctgtgctgtccggggtagccccaagcccaagatttcctggttcaagaatggcctggacctgggagaagacgccc
gcttccgcatgttcagcaagcagggagtgttgactctggagattagaaagccctgcccctttgacgggggcatctatgtc
tgcagggccaccaacttacagggcgaggcacggtgtgagtgccgcctggaggtgcgagtgcctcagtga-3’ (配列
番号339)
5’-atgcctgagccggggaagaagccagtctcagcttttagcaagaagccacggtcagtggaagtggccgcaggcagcc
ctgccgtgttcgaggccgagacagagcgggcaggagtgaaggtgcgctggcagcgcggaggcagtgacatcagcgccagc
aacaagtacggcctggccacagagggcacacggcatacgctgacagtgcgggaagtgggccctgccgaccagggatctta
cgcagtcattgctggctcctccaaggtcaagttcgacctcaaggtcatagaggcagagaaggcagagcccatgctggccc
ctgcccctgcccctgctgaggccactggagcccctggagaagccccggccccagccgctgagctgggagaaagtgcccca
agtcccaaagggtcaagctcagcagctctcaatggtcctacccctggagcccccgatgaccccattggcctcttcgtgat
gcggccacaggatggcgaggtgaccgtgggtggcagcatcaccttctcagcccgcgtggccggcgccagcctcctgaagc
cgcctgtggtcaagtggttcaagggcaaatgggtggacctgagcagcaaggtgggccagcacctgcagctgcacgacagc
tacgaccgcgccagcaaggtctatctgttcgagctgcacatcaccgatgcccagcctgccttcactggcagctaccgctg
tgaggtgtccaccaaggacaaatttgactgctccaacttcaatctcactgtccacgaggccatgggcaccggagacctgg
acctcctatcagccttccgccgcacgagcctggctggaggtggtcggcggatcagtgatagccatgaggacactgggatt
ctggacttcagctcactgctgaaaaagagagacagtttccggaccccgagggactcgaagctggaggcaccagcagagga
ggacgtgtgggagatcctacggcaggcacccccatctgagtacgagcgcatcgccttccagtacggcgtcactgacctgc
gcggcatgctaaagaggctcaagggcatgaggcgcgatgagaagaagagcacagcctttcagaagaagctggagccggcc
taccaggtgagcaaaggccacaagatccggctgaccgtggaactggctgaccatgacgctgaggtcaaatggctcaagaa
tggccaggagatccagatgagcggcagcaagtacatctttgagtccatcggtgccaagcgtaccctgaccatcagccagt
gctcattggcggacgacgcagcctaccagtgcgtggtgggtggcgagaagtgtagcacggagctctttgtgaaagagccc
cctgtgctcatcacgcgccccttggaggaccagctggtgatggtggggcagcgggtggagtttgagtgtgaagtatcgga
ggagggggcgcaagtcaaatggctgaaggacggggtggagctgacccgggaggagaccttcaaataccggttcaagaagg
acgggcagagacaccacctgatcatcaacgaggccatgctggaggacgcggggcactatgcactgtgcactagcgggggc
caggcgctggctgagctcattgtgcaggaaaagaagctggaggtgtaccagagcatcgcagacctgatggtgggcgcaaa
ggaccaggcggtgttcaaatgtgaggtctcagatgagaatgttcggggtgtgtggctgaagaatgggaaggagctggtgc
ccgacagccgcataaaggtgtcccacatcgggcgggtccacaaactgaccattgacgacgtcacacctgccgacgaggct
gactacagctttgtgcccgagggcttcgcctgcaacctgtcagccaagctccacttcatggaggtcaagattgacttcgt
acccaggcaggaacctcccaagatccacctggactgcccaggccgcataccagacaccattgtggttgtagctggaaata
agctacgtctggacgtccctatctctggggaccctgctcccactgtgatctggcagaaggctatcacgcaggggaataag
gccccagccaggccagccccagatgccccagaggacacaggtgacagcgatgagtgggtgtttgacaagaagctgctgtg
tgagaccgagggccgggtccgcgtggagaccaccaaggaccgcagcatcttcacggtcgagggggcagagaaggaagatg
agggcgtctacacggtcacagtgaagaaccctgtgggcgaggaccaggtcaacctcacagtcaaggtcatcgacgtgcca
gacgcacctgcggcccccaagatcagcaacgtgggagaggactcctgcacagtacagtgggagccgcctgcctacgatgg
cgggcagcccatcctgggctacatcctggagcgcaagaagaagaagagctaccggtggatgcggctgaacttcgacctga
ttcaggagctgagtcatgaagcgcggcgcatgatcgagggcgtggtgtacgagatgcgcgtctacgcggtcaacgccatc
ggcatgtccaggcccagccctgcctcccagcccttcatgcctatcggtccccccagcgaacccacccacctggcagtaga
ggacgtctctgacaccacggtctccctcaagtggcggcccccagagcgcgtgggagcaggaggcctggatggctacagcg
tggagtactgcccagagggctgctcagagtgggtggctgccctgcaggggctgacagagcacacatcgatactggtgaag
gacctgcccacgggggcccggctgcttttccgagtgcgggcacacaatatggcagggcctggagcccctgttaccaccac
ggagccggtgacagtgcaggagatcctgcaacggccacggcttcagctgcccaggcacctgcgccagaccattcagaaga
aggtcggggagcctgtgaaccttctcatccctttccagggcaagccccggcctcaggtgacctggaccaaagaggggcag
cccctggcaggcgaggaggtgagcatccgcaacagccccacagacaccatcctgttcatccgggccgctcgccgcgtgca
ttcaggcacttaccaggtgacggtgcgcattgagaacatggaggacaaggccacgctggtgctgcaggttgttgacaagc
caagtcctccccaggatctccgggtgactgacgcctggggtcttaatgtggctctggagtggaagccaccccaggatgtc
ggcaacacggagctctgggggtacacagtgcagaaagccgacaagaagaccatggagtggttcaccgtcttggagcatta
ccgccgcacccactgcgtggtgccagagctcatcattggcaatggctactacttccgcgtcttcagccagaatatggttg
gctttagtgacagagcggccaccaccaaggagcccgtctttatccccagaccaggcatcacctatgagccacccaactat
aaggccctggacttctccgaggccccaagcttcacccagcccctggtgaaccgctcggtcatcgcgggctacactgctat
gctctgctgtgctgtccggggtagccccaagcccaagatttcctggttcaagaatggcctggacctgggagaagacgccc
gcttccgcatgttcagcaagcagggagtgttgactctggagattagaaagccctgcccctttgacgggggcatctatgtc
tgcagggccaccaacttacagggcgaggcacggtgtgagtgccgcctggaggtgcgagtgcctcagtga-3’ (配列
番号339)
IL2RG
5’-atgttgaagccatcattaccattcacatccctcttattcctgcagctgcccctgctgggagtggggctgaacacga
caattctgacgcccaatgggaatgaagacaccacagctgatttcttcctgaccactatgcccactgactccctcagtgtt
tccactctgcccctcccagaggttcagtgttttgtgttcaatgtcgagtacatgaattgcacttggaacagcagctctga
gccccagcctaccaacctcactctgcattattggtacaagaactcggataatgataaagtccagaagtgcagccactatc
tattctctgaagaaatcacttctggctgtcagttgcaaaaaaaggagatccacctctaccaaacatttgttgttcagctc
caggacccacgggaacccaggagacaggccacacagatgctaaaactgcagaatctggtgatcccctgggctccagagaa
cctaacacttcacaaactgagtgaatcccagctagaactgaactggaacaacagattcttgaaccactgtttggagcact
tggtgcagtaccggactgactgggaccacagctggactgaacaatcagtggattatagacataagttctccttgcctagt
gtggatgggcagaaacgctacacgtttcgtgttcggagccgctttaacccactctgtggaagtgctcagcattggagtga
atggagccacccaatccactgggggagcaatacttcaaaagagaatcctttcctgtttgcattggaagccgtggttatct
ctgttggctccatgggattgattatcagccttctctgtgtgtatttctggctggaacggacgatgccccgaattcccacc
ctgaagaacctagaggatcttgttactgaataccacgggaacttttcggcctggagtggtgtgtctaagggactggctga
gagtctgcagccagactacagtgaacgactctgcctcgtcagtgagattcccccaaaaggaggggcccttggggaggggc
ctggggcctccccatgcaaccagcatagcccctactgggcccccccatgttacaccctaaagcctgaaacctga-3’ (
配列番号340)
5’-atgttgaagccatcattaccattcacatccctcttattcctgcagctgcccctgctgggagtggggctgaacacga
caattctgacgcccaatgggaatgaagacaccacagctgatttcttcctgaccactatgcccactgactccctcagtgtt
tccactctgcccctcccagaggttcagtgttttgtgttcaatgtcgagtacatgaattgcacttggaacagcagctctga
gccccagcctaccaacctcactctgcattattggtacaagaactcggataatgataaagtccagaagtgcagccactatc
tattctctgaagaaatcacttctggctgtcagttgcaaaaaaaggagatccacctctaccaaacatttgttgttcagctc
caggacccacgggaacccaggagacaggccacacagatgctaaaactgcagaatctggtgatcccctgggctccagagaa
cctaacacttcacaaactgagtgaatcccagctagaactgaactggaacaacagattcttgaaccactgtttggagcact
tggtgcagtaccggactgactgggaccacagctggactgaacaatcagtggattatagacataagttctccttgcctagt
gtggatgggcagaaacgctacacgtttcgtgttcggagccgctttaacccactctgtggaagtgctcagcattggagtga
atggagccacccaatccactgggggagcaatacttcaaaagagaatcctttcctgtttgcattggaagccgtggttatct
ctgttggctccatgggattgattatcagccttctctgtgtgtatttctggctggaacggacgatgccccgaattcccacc
ctgaagaacctagaggatcttgttactgaataccacgggaacttttcggcctggagtggtgtgtctaagggactggctga
gagtctgcagccagactacagtgaacgactctgcctcgtcagtgagattcccccaaaaggaggggcccttggggaggggc
ctggggcctccccatgcaaccagcatagcccctactgggcccccccatgttacaccctaaagcctgaaacctga-3’ (
配列番号340)
討論
ゲノム編集技術は生物医学研究を徹底的に変えている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ
(ZFN)(非特許文献1)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN
)(非特許文献2-4)、およびCRISPRのCasタンパク質(クラスター化して規
則的な配置の短い回文配列リピート)システム(非特許文献5-7)などの高活性ヌクレ
アーゼは、無数の生物のゲノムを操縦するように成功裏に操作された。最近、デアミナー
ゼは、二本鎖DNAを破壊することなく遺伝暗号を正確に変更するために利用されている
。シチジンまたはアデノシンデアミナーゼをCRISPR-Cas9システムと結合する
ことにより、研究者は、ゲノムDNA中のC・GからT・AまたはA・TからG・Cへの
変換(非特許文献8-10)を可能にするプログラム可能な塩基編集器を作製し、致病変
異の修正の新しい機会を提供する。
ゲノム編集技術は生物医学研究を徹底的に変えている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ
(ZFN)(非特許文献1)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN
)(非特許文献2-4)、およびCRISPRのCasタンパク質(クラスター化して規
則的な配置の短い回文配列リピート)システム(非特許文献5-7)などの高活性ヌクレ
アーゼは、無数の生物のゲノムを操縦するように成功裏に操作された。最近、デアミナー
ゼは、二本鎖DNAを破壊することなく遺伝暗号を正確に変更するために利用されている
。シチジンまたはアデノシンデアミナーゼをCRISPR-Cas9システムと結合する
ことにより、研究者は、ゲノムDNA中のC・GからT・AまたはA・TからG・Cへの
変換(非特許文献8-10)を可能にするプログラム可能な塩基編集器を作製し、致病変
異の修正の新しい機会を提供する。
RNA修飾がゲノムに永続的な変化をもたらすことなくタンパク質の機能を変化させる
ことができるため、DNAの他に、RNAは遺伝子修正に使用される注目される標的であ
る。現在、ADARアデノシンデアミナーゼは、RNAの正確な塩基編集を実現するため
に利用されている。哺乳類では、ADAR1(アイソフォームp110およびp150)
、ADAR2およびADAR3(触媒不活性)(非特許文献11、12)の3種類のAD
ARタンパク質が同定されており、その基質は二本鎖RNAであり、シトシン(C)とミ
スマッチするアデノシン(A)は優先的にイノシン(I)に脱アミノ化される。イノシン
は、翻訳中にグアノシン(G)を模倣できると考えられている(非特許文献13、14)
。標的RNA編集を実現するために、ADARタンパク質またはその触媒ドメインをλN
ペプチド(非特許文献15-17)、SNAP-tag(非特許文献18-22)または
Casタンパク質(dCas13b)(非特許文献23)と融合させ、キメラADARタ
ンパク質を特定の部位に動員するガイドRNAが設計された。あるいは、過剰発現された
ADAR1またはADAR2タンパク質をR/Gモチーフを持つガイドRNAと一緒に標
的RNAの編集を実現することができることも報告されている(非特許文献24-27)
。
ことができるため、DNAの他に、RNAは遺伝子修正に使用される注目される標的であ
る。現在、ADARアデノシンデアミナーゼは、RNAの正確な塩基編集を実現するため
に利用されている。哺乳類では、ADAR1(アイソフォームp110およびp150)
、ADAR2およびADAR3(触媒不活性)(非特許文献11、12)の3種類のAD
ARタンパク質が同定されており、その基質は二本鎖RNAであり、シトシン(C)とミ
スマッチするアデノシン(A)は優先的にイノシン(I)に脱アミノ化される。イノシン
は、翻訳中にグアノシン(G)を模倣できると考えられている(非特許文献13、14)
。標的RNA編集を実現するために、ADARタンパク質またはその触媒ドメインをλN
ペプチド(非特許文献15-17)、SNAP-tag(非特許文献18-22)または
Casタンパク質(dCas13b)(非特許文献23)と融合させ、キメラADARタ
ンパク質を特定の部位に動員するガイドRNAが設計された。あるいは、過剰発現された
ADAR1またはADAR2タンパク質をR/Gモチーフを持つガイドRNAと一緒に標
的RNAの編集を実現することができることも報告されている(非特許文献24-27)
。
哺乳類のシステムで報告されているこれらすべての核酸編集方法は、酵素とガイドRN
Aの2つの成分の異所性発現に依存している。これらのバイナリシステムはほとんどの研
究で効率的に機能するが、いくつかの固有の障害が、それらの幅広い使用、特に治療にお
ける使用を制限する。遺伝子治療のための最も効果的なインビボ送達はウイルスベクター
(非特許文献28)によるものであり、非常に望ましいアデノ随伴ウイルス(AAV)ベ
クターは荷重サイズ(~4.5kb)に制限されているため、タンパク質とガイドRNA
の両方を収容するのはチャレンジである(非特許文献29、30)。ADAR1の過剰発
現は、RNAの異常な過剰編集により多発性骨髄腫に発癌性を与え(非特許文献31)、
大量なグローバルなオフターゲティング編集を生成することが最近報告されている(非特
許文献32)。さらに、タンパク質またはヒト以外に由来するドメインの異所性発現は、
免疫原性を誘発する潜在的なリスクを持っている(非特許文献30、33)。また、既存
の適応免疫とp53を介したDNA損傷応答は、Cas9(非特許文献34-38)など
の治療用タンパク質の有効性を損なう可能性がある。RNA編集に内因性メカニズムを利
用することが試みられたが、これは、事前に組み立てられた標的転写物であるRNA二重
鎖をXenopus胚に注入することによってのみ試みられた(非特許文献39)。タン
パク質の異所性発現に依存しない、堅牢な核酸編集のための代替技術が非常に必要とされ
ている。ここでは、RNA編集のために内因性ADARを活用する新しいアプローチを開
発した。意図的に設計されたガイドRNAを発現させることにより、内因性RNAの効率
的かつ正確な編集が可能になり、病原性変異が修正されることを示した。この単一核酸編
集プラットフォームは、治療と研究のための新しい道を開くことができる。
Aの2つの成分の異所性発現に依存している。これらのバイナリシステムはほとんどの研
究で効率的に機能するが、いくつかの固有の障害が、それらの幅広い使用、特に治療にお
ける使用を制限する。遺伝子治療のための最も効果的なインビボ送達はウイルスベクター
(非特許文献28)によるものであり、非常に望ましいアデノ随伴ウイルス(AAV)ベ
クターは荷重サイズ(~4.5kb)に制限されているため、タンパク質とガイドRNA
の両方を収容するのはチャレンジである(非特許文献29、30)。ADAR1の過剰発
現は、RNAの異常な過剰編集により多発性骨髄腫に発癌性を与え(非特許文献31)、
大量なグローバルなオフターゲティング編集を生成することが最近報告されている(非特
許文献32)。さらに、タンパク質またはヒト以外に由来するドメインの異所性発現は、
免疫原性を誘発する潜在的なリスクを持っている(非特許文献30、33)。また、既存
の適応免疫とp53を介したDNA損傷応答は、Cas9(非特許文献34-38)など
の治療用タンパク質の有効性を損なう可能性がある。RNA編集に内因性メカニズムを利
用することが試みられたが、これは、事前に組み立てられた標的転写物であるRNA二重
鎖をXenopus胚に注入することによってのみ試みられた(非特許文献39)。タン
パク質の異所性発現に依存しない、堅牢な核酸編集のための代替技術が非常に必要とされ
ている。ここでは、RNA編集のために内因性ADARを活用する新しいアプローチを開
発した。意図的に設計されたガイドRNAを発現させることにより、内因性RNAの効率
的かつ正確な編集が可能になり、病原性変異が修正されることを示した。この単一核酸編
集プラットフォームは、治療と研究のための新しい道を開くことができる。
特に、十分な長さの線形arRNAの発現は、内因性ADARタンパク質を誘導して、
標的転写物上のアデノシンをイノシンに編集できることを示した。LEAPERと呼ばれ
るこのシステムは、内因性ADARタンパク質を利用して、プログラム可能な核酸編集を
実現するため、既存の方法と比べて優勢がある。
標的転写物上のアデノシンをイノシンに編集できることを示した。LEAPERと呼ばれ
るこのシステムは、内因性ADARタンパク質を利用して、プログラム可能な核酸編集を
実現するため、既存の方法と比べて優勢がある。
LEAPERは、RNA編集のために小さいRNA分子のみに依存して内因性タンパク
質をガイドするため、その珍しい品質が簡単さである。これはRNAiを想到させ、小さ
いdsRNAが標的RNA分解のネイティブメカニズムを引き起こすことができる(非特
許文献51)。サイズが小さいため、arRNAはさまざまなウイルスおよび非ウイルス
ビヒクルによって容易に送達できる。RNAiとは異なり、LEAPERは、標的となる
転写産物の切断や分解を引き起こすことなく、正確なAからIへの変換を触媒する(図1
8A)。arRNAの必要な長さはRNAiよりも長いであるが、細胞レベルで免疫刺激
効果を誘発することもなく(図22E、Fおよび図29E)、内因性ADARタンパク質
の機能に影響を与えることもなく(図22A、B)、RNAターゲティングのための安全
な戦略となる。注目すべきことに、ADARタンパク質またはその触媒ドメインの異所性
発現は、大量なグローバルなオフターゲット編集を誘発し(非特許文献32)、癌を誘発
する可能性があることが報告されている(非特許文献31)。
質をガイドするため、その珍しい品質が簡単さである。これはRNAiを想到させ、小さ
いdsRNAが標的RNA分解のネイティブメカニズムを引き起こすことができる(非特
許文献51)。サイズが小さいため、arRNAはさまざまなウイルスおよび非ウイルス
ビヒクルによって容易に送達できる。RNAiとは異なり、LEAPERは、標的となる
転写産物の切断や分解を引き起こすことなく、正確なAからIへの変換を触媒する(図1
8A)。arRNAの必要な長さはRNAiよりも長いであるが、細胞レベルで免疫刺激
効果を誘発することもなく(図22E、Fおよび図29E)、内因性ADARタンパク質
の機能に影響を与えることもなく(図22A、B)、RNAターゲティングのための安全
な戦略となる。注目すべきことに、ADARタンパク質またはその触媒ドメインの異所性
発現は、大量なグローバルなオフターゲット編集を誘発し(非特許文献32)、癌を誘発
する可能性があることが報告されている(非特許文献31)。
最近、いくつかの研究グループが、エフェクタータンパク質の発現により、シトシン塩
基編集器がマウス胚、イネ、またはヒト細胞株で大量なオフターゲット単一塩基変異体を
生成する可能性があることを報告した。これは、潜在的な治療用途におけるLEAPER
の利点を示している(非特許文献52-54)。喜ばしいことに、LEAPERは効率的
な編集を可能にし、まれなグローバルなオフターゲット編集を引き出す(図20および図
21)。さらに、LEAPERは、潜在的な免疫原性を最小限に抑えるか、外来タンパク
質の導入を必要とする他の方法で一般的に存在する送達の障害を克服することができる。
基編集器がマウス胚、イネ、またはヒト細胞株で大量なオフターゲット単一塩基変異体を
生成する可能性があることを報告した。これは、潜在的な治療用途におけるLEAPER
の利点を示している(非特許文献52-54)。喜ばしいことに、LEAPERは効率的
な編集を可能にし、まれなグローバルなオフターゲット編集を引き出す(図20および図
21)。さらに、LEAPERは、潜在的な免疫原性を最小限に抑えるか、外来タンパク
質の導入を必要とする他の方法で一般的に存在する送達の障害を克服することができる。
LEAPERの場合、望ましい活性を達成するために、最小サイズが70ntを超える
arRNAを使用することを勧める。自然環境では、ADARタンパク質は300-nt
以上の二重鎖を持つAluリピートを非特異的に編集する(非特許文献55)。注目すべ
きことに、Aluリピートは安定した分子内二重鎖を形成するが、LEAPERはarR
NAとmRNAまたはpre-mRNAの間に分子間二重鎖をもたらす。これは安定性が
低く、形成がより困難であると考えられている。したがって、70ntより長いRNA二
重鎖は、効果的な編集のためにADARタンパク質を動員またはドッキングするために化
学量論的に重要であると仮定した。実際、より長いarRNAは、異所的に発現されたレ
ポーターと内因性転写物の両方でより高い編集収率をもたらした(図16Dおよび図17
B)。ただし、ADARタンパク質はRNA二重鎖のアデノシン塩基を乱雑に脱アミ化す
るため、arRNAが長いほど、ターゲティングウィンドウ内でより多くのオフターゲッ
トが発生する可能性がある。
arRNAを使用することを勧める。自然環境では、ADARタンパク質は300-nt
以上の二重鎖を持つAluリピートを非特異的に編集する(非特許文献55)。注目すべ
きことに、Aluリピートは安定した分子内二重鎖を形成するが、LEAPERはarR
NAとmRNAまたはpre-mRNAの間に分子間二重鎖をもたらす。これは安定性が
低く、形成がより困難であると考えられている。したがって、70ntより長いRNA二
重鎖は、効果的な編集のためにADARタンパク質を動員またはドッキングするために化
学量論的に重要であると仮定した。実際、より長いarRNAは、異所的に発現されたレ
ポーターと内因性転写物の両方でより高い編集収率をもたらした(図16Dおよび図17
B)。ただし、ADARタンパク質はRNA二重鎖のアデノシン塩基を乱雑に脱アミ化す
るため、arRNAが長いほど、ターゲティングウィンドウ内でより多くのオフターゲッ
トが発生する可能性がある。
LEAPERはネイティブの転写物を効果的に標的にすることができたが、編集効率と
オフターゲット率はさまざまであった。PPIB転写物ターゲティングの場合、カバーウ
ィンドウ内に明らかなオフターゲットがなくても、標的アデノシンの50%をイノシンに
変換できる(図17B、F)。オフターゲットは、他の転写物ではより深刻になった。A
-Gミスマッチや連続ミスマッチを導入して不要な編集を抑制するなど、オフターゲット
を減らすことができた。ただし、ミスマッチが多すぎると、オンターゲットの効率が低下
する可能性がある。効率と潜在的なオフターゲットを考慮すると、内因性転写産物の編集
には、長さが100~150ntの範囲のarRNAの使用を勧める。選択肢がある場合
は、不要な編集の可能性を最小限に抑えるために、アデノシンの少ない領域を選択するこ
とを勧める。心強いことに、arRNAを標的とする転写二重鎖以外のオフターゲットは
検出されなかった(図20)。
オフターゲット率はさまざまであった。PPIB転写物ターゲティングの場合、カバーウ
ィンドウ内に明らかなオフターゲットがなくても、標的アデノシンの50%をイノシンに
変換できる(図17B、F)。オフターゲットは、他の転写物ではより深刻になった。A
-Gミスマッチや連続ミスマッチを導入して不要な編集を抑制するなど、オフターゲット
を減らすことができた。ただし、ミスマッチが多すぎると、オンターゲットの効率が低下
する可能性がある。効率と潜在的なオフターゲットを考慮すると、内因性転写産物の編集
には、長さが100~150ntの範囲のarRNAの使用を勧める。選択肢がある場合
は、不要な編集の可能性を最小限に抑えるために、アデノシンの少ない領域を選択するこ
とを勧める。心強いことに、arRNAを標的とする転写二重鎖以外のオフターゲットは
検出されなかった(図20)。
arRNAの設計を最適化して編集効率を向上させ、LEAPERを利用して遺伝子機
能を操作したり病原性変異を修正したりできることを実証した。また、LEAPERはU
AGでのみ機能するだけでなく、隣接するヌクレオチドに関係なく、任意のアデノシンと
一緒に使用できることも示した(図16F、G、および図17C)。このような柔軟性は
、特定の単一点突然変異によって引き起こされる遺伝病の潜在的な治療的修正に有利であ
る。興味深いことに、IDUA転写産物の編集では、pre-mRNAを標的とするar
RNAは成熟RNAを標的とするものよりも効果的であり、核がADARタンパク質の主
要な作用部位であり、LEAPERを利用してpre-mRNA内のスプライシング部位
を修飾することでスプライシングを操作できることを示している。さらに重要なのは、L
EAPERは、複数の遺伝子転写産物を同時に標的とする高い効率を示している(図17
D)。LEAPERのこの多重化機能は、将来、特定の多遺伝子性疾患を治療するために
開発される可能性がある。
能を操作したり病原性変異を修正したりできることを実証した。また、LEAPERはU
AGでのみ機能するだけでなく、隣接するヌクレオチドに関係なく、任意のアデノシンと
一緒に使用できることも示した(図16F、G、および図17C)。このような柔軟性は
、特定の単一点突然変異によって引き起こされる遺伝病の潜在的な治療的修正に有利であ
る。興味深いことに、IDUA転写産物の編集では、pre-mRNAを標的とするar
RNAは成熟RNAを標的とするものよりも効果的であり、核がADARタンパク質の主
要な作用部位であり、LEAPERを利用してpre-mRNA内のスプライシング部位
を修飾することでスプライシングを操作できることを示している。さらに重要なのは、L
EAPERは、複数の遺伝子転写産物を同時に標的とする高い効率を示している(図17
D)。LEAPERのこの多重化機能は、将来、特定の多遺伝子性疾患を治療するために
開発される可能性がある。
RNAレベルで遺伝子修正を行うことは有益である。第一に、標的転写物を編集しても
、ゲノムまたはトランスクリプトームのレパートリー(transcriptome r
epertoire)が恒久的に変化することはなく、RNA編集法はゲノム編集法より
も治療に安全に使用される。さらに、一時的な編集は、特定の状態のまれの変化によって
引き起こされる疾患の一時的な制御及び治療に非常に適している。第二に、LEAPER
および他のRNA編集方法はゲノムにDSBを導入せず、大きなDNAフラグメントの望
ましくない欠失を生成するリスクを回避する(非特許文献37)。ニッカーゼCas9を
採用したDNA塩基編集法は、依然としてゲノムに挿入欠失を生成する可能性がある(非
特許文献8)。さらに、ネイティブDNA修復メカニズムとは独立して、LEAPERは
ADAR2の高発現を伴う小脳細胞などの有糸分裂後の細胞でも機能するはずである(非
特許文献11)。
、ゲノムまたはトランスクリプトームのレパートリー(transcriptome r
epertoire)が恒久的に変化することはなく、RNA編集法はゲノム編集法より
も治療に安全に使用される。さらに、一時的な編集は、特定の状態のまれの変化によって
引き起こされる疾患の一時的な制御及び治療に非常に適している。第二に、LEAPER
および他のRNA編集方法はゲノムにDSBを導入せず、大きなDNAフラグメントの望
ましくない欠失を生成するリスクを回避する(非特許文献37)。ニッカーゼCas9を
採用したDNA塩基編集法は、依然としてゲノムに挿入欠失を生成する可能性がある(非
特許文献8)。さらに、ネイティブDNA修復メカニズムとは独立して、LEAPERは
ADAR2の高発現を伴う小脳細胞などの有糸分裂後の細胞でも機能するはずである(非
特許文献11)。
LEAPERは、ヒト細胞株(図14C)、マウス細胞株(図14D)、および初代T
細胞を含むヒト初代細胞(図27および図28D)などの幅広い細胞タイプに適用できる
ことを実証した。レンチウイルスデリバリーまたは合成オリゴによる効率的な編集により
、治療法開発の可能性が高まる(図28)。さらに、LEAPERは、p53の転写調節
活性の回復(図7)、病原性変異の修正(図26)、ハーラー症候群患者由来の初代線維
芽細胞のα-L-イドロニダーゼ活性の回復(図29)など、さまざまな使用で表現型ま
たは生理学的変化を引き起こすことができる。したがって、LEAPERは疾患治療にお
いて大きな可能性を秘めていると考えられる。
細胞を含むヒト初代細胞(図27および図28D)などの幅広い細胞タイプに適用できる
ことを実証した。レンチウイルスデリバリーまたは合成オリゴによる効率的な編集により
、治療法開発の可能性が高まる(図28)。さらに、LEAPERは、p53の転写調節
活性の回復(図7)、病原性変異の修正(図26)、ハーラー症候群患者由来の初代線維
芽細胞のα-L-イドロニダーゼ活性の回復(図29)など、さまざまな使用で表現型ま
たは生理学的変化を引き起こすことができる。したがって、LEAPERは疾患治療にお
いて大きな可能性を秘めていると考えられる。
Stafforstらは、合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して内因性AD
ARを動員することで機能する、RESTOREと呼ばれる新しい一見類似したRNA編
集方法を報告した(非特許文献56)。RESTOREとLEAPERの根本的な違いは
、内因性ADARを動員するためのガイドRNAの独特な性質にある。RESTOREの
ガイドRNAは、複雑な化学修飾に応じて化学合成アンチセンスオリゴヌクレオチド(A
SO)に限定されるが、LEAPERのarRNAは、ウイルスまたは非ウイルスベクタ
ーを通じる化学合成および発現など、さまざまな方法で生成できる(図28および図29
)。重要なのは、化学的に大幅に修飾されているため、ASOは疾患の治療で一時的に作
用するしかないに対して、arRNAは発現によって生成されることができ、これは、絶
え間ない編集を行うために特に重要な特徴である。
ARを動員することで機能する、RESTOREと呼ばれる新しい一見類似したRNA編
集方法を報告した(非特許文献56)。RESTOREとLEAPERの根本的な違いは
、内因性ADARを動員するためのガイドRNAの独特な性質にある。RESTOREの
ガイドRNAは、複雑な化学修飾に応じて化学合成アンチセンスオリゴヌクレオチド(A
SO)に限定されるが、LEAPERのarRNAは、ウイルスまたは非ウイルスベクタ
ーを通じる化学合成および発現など、さまざまな方法で生成できる(図28および図29
)。重要なのは、化学的に大幅に修飾されているため、ASOは疾患の治療で一時的に作
用するしかないに対して、arRNAは発現によって生成されることができ、これは、絶
え間ない編集を行うために特に重要な特徴である。
LEAPERの効率と特異性に関してはまだ改善の余地がある。LEAPERは内因性
ADARに依存しているため、標的細胞におけるADARタンパク質の発現レベルは、編
集を成功させるための決定要因の1つである。以前の報告(非特許文献57)と我々の観
察(図14A、B)によると、ADAR1p110は組織全体に遍在的に発現しており、
LEAPERの幅広い適用性を保証している。ADAR1p150はインターフェロン誘
導性アイソフォーム(非特許文献58)であり、LEAPERで機能することが証明され
ている(図11E、図12B)。したがって、インターフェロン刺激RNAとarRNA
の同時トランスフェクションは、特定の状況下で編集効率をさらに向上させる可能性があ
る。あるいは、ADAR3が阻害的役割を果たすため、ADAR3の阻害は、ADAR3
発現細胞の編集効率を高める可能性がある。さらに、arRNAの他の変更により、編集
効率が向上する可能性がある。たとえば、特定のADAR動員スキャフォールドと融合し
たarRNAは、局所のADARタンパク質濃度を増加させ、その結果、編集の収量を高
める。これまでのところ、AからIへの塩基変換には内因性ADAR1/2タンパク質し
か活用できなかった。より多くのネイティブメカニズムを同様に遺伝子要素の修飾に利用
できるかどうか、特に効果的な核酸編集を実現するために調査することは興味深いことで
ある。
ADARに依存しているため、標的細胞におけるADARタンパク質の発現レベルは、編
集を成功させるための決定要因の1つである。以前の報告(非特許文献57)と我々の観
察(図14A、B)によると、ADAR1p110は組織全体に遍在的に発現しており、
LEAPERの幅広い適用性を保証している。ADAR1p150はインターフェロン誘
導性アイソフォーム(非特許文献58)であり、LEAPERで機能することが証明され
ている(図11E、図12B)。したがって、インターフェロン刺激RNAとarRNA
の同時トランスフェクションは、特定の状況下で編集効率をさらに向上させる可能性があ
る。あるいは、ADAR3が阻害的役割を果たすため、ADAR3の阻害は、ADAR3
発現細胞の編集効率を高める可能性がある。さらに、arRNAの他の変更により、編集
効率が向上する可能性がある。たとえば、特定のADAR動員スキャフォールドと融合し
たarRNAは、局所のADARタンパク質濃度を増加させ、その結果、編集の収量を高
める。これまでのところ、AからIへの塩基変換には内因性ADAR1/2タンパク質し
か活用できなかった。より多くのネイティブメカニズムを同様に遺伝子要素の修飾に利用
できるかどうか、特に効果的な核酸編集を実現するために調査することは興味深いことで
ある。
全体として、RNA転写物を編集するために細胞内の内因性メカニズムを共同選択でき
ることを証明するための原理を提供した。LEAPERはシンプルで効率的かつ安全なシ
ステムであり、遺伝子編集に基づく治療法と研究に新しい道を開いたことを実証した。
ることを証明するための原理を提供した。LEAPERはシンプルで効率的かつ安全なシ
ステムであり、遺伝子編集に基づく治療法と研究に新しい道を開いたことを実証した。
Claims (27)
- インビトロで宿主細胞における標的RNAを編集する方法であって、標的RNAとハイブリダイズさせた複合体ではないdRNA、または前記dRNAをコードする構築体を前記宿主細胞に導入することを含み、
前記dRNAは、前記宿主細胞内で前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列と、前記標的RNA中の標的アデノシンの真向かいのシチジンまたはアデノシンのミスマッチを含み、
前記シチジンまたはアデノシンのミスマッチは、前記dRNAの5’末端から少なくとも20ヌクレオチド離れ、前記dRNAの3’末端から少なくとも5ヌクレオチド離れて位置し、
前記dRNAは50~260ヌクレオチド長であり、
前記dRNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、前記宿主細胞によって内因的に発現されたADAR1またはADAR2を動員することができ、
前記dRNAがADAR動員ドメインを含まず、
前記宿主細胞は真核細胞である、方法。 - 前記dRNAが100~150ヌクレオチド長である、請求項1に記載の方法。
- 前記dRNAをコードする、ウイルスベクターまたはプラスミドである構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記シチジンのミスマッチが、前記dRNAの中心から10ヌクレオチド以内に位置する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相補的RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグアノシンをさらに含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相補的RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3塩基モチーフがUAGであり、
前記dRNAが、前記3塩基モチーフのウリジンの真向かいのA、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシンまたはウリジンを含む、請求項7に記載の方法。 - それぞれ異なる標的RNAを標的とする複数のdRNAを導入することを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 宿主細胞における標的RNAを編集するための医薬組成物の調製における、標的RNAとハイブリダイズさせた複合体ではないdRNA、または前記dRNAをコードする構築体の使用であって、
前記dRNAは、前記宿主細胞内で前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列と、前記標的RNA中の標的アデノシンの真向かいのシチジンまたはアデノシンのミスマッチを含み、
前記シチジンまたはアデノシンのミスマッチは、前記dRNAの5’末端から少なくとも20ヌクレオチド離れ、前記dRNAの3’末端から少なくとも5ヌクレオチド離れて位置し、
前記dRNAは50~260ヌクレオチド長であり、
前記dRNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、前記宿主細胞によって内因的に発現されたADAR1またはADAR2を動員することができ、
前記dRNAがADAR動員ドメインを含まず、
前記宿主細胞は真核細胞である、使用。 - 前記dRNAが100~150ヌクレオチド長である、請求項12に記載の使用。
- 前記シチジンのミスマッチが、前記dRNAの中心から10ヌクレオチド以内に位置する、請求項12または13に記載の使用。
- 前記相補的RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグアノシンをさらに含む、請求項12~14のいずれか一項に記載の使用。
- 前記相補的RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、請求項12~15のいずれか一項に記載の使用。
- 前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、請求項12~16のいずれか一項に記載の使用。
- 前記3塩基モチーフがUAGであり、
前記dRNAが、前記3塩基モチーフのウリジンの真向かいのA、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシンまたはウリジンを含む、請求項17に記載の使用。 - 前記宿主細胞が哺乳動物細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項12~18のいずれか一項に記載の使用。
- 宿主細胞における標的RNAの編集に使用するための、標的RNAとハイブリダイズさせた複合体ではないdRNA、または前記dRNAをコードする構築体であって、
前記dRNAは、前記宿主細胞内で前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列と、前記標的RNA中の標的アデノシンの真向かいのシチジンまたはアデノシンのミスマッチを含み、
前記シチジンまたはアデノシンのミスマッチは、前記dRNAの5’末端から少なくとも20ヌクレオチド離れ、前記dRNAの3’末端から少なくとも5ヌクレオチド離れて位置し、
前記dRNAは50~260ヌクレオチド長であり、
前記dRNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、前記宿主細胞によって内因的に発現されたADAR1またはADAR2を動員することができ、
前記dRNAがADAR動員ドメインを含まず、
前記宿主細胞は真核細胞である、dRNAまたは構築体。 - 前記dRNAが100~150ヌクレオチド長である、請求項20に記載のdRNAまたは構築体。
- 前記シチジンのミスマッチが、前記dRNAの中心から10ヌクレオチド以内に位置する、請求項20または21に記載のdRNAまたは構築体。
- 前記相補的RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグアノシンをさらに含む、請求項20~22のいずれか一項に記載のdRNAまたは構築体。
- 前記相補的RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、請求項20~23のいずれか一項に記載のdRNAまたは構築体。
- 前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、請求項20~24のいずれか一項に記載のdRNAまたは構築体。
- 前記3塩基モチーフがUAGであり、
前記dRNAが、前記3塩基モチーフのウリジンの真向かいのA、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシンまたはウリジンを含む、請求項25に記載のdRNAまたは構築体。 - 前記宿主細胞が哺乳動物細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項20~26のいずれか一項に記載のdRNAまたは構築体。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNPCT/CN2018/110105 | 2018-10-12 | ||
CN2018110105 | 2018-10-12 | ||
CNPCT/CN2019/082713 | 2019-04-15 | ||
CN2019082713 | 2019-04-15 | ||
JP2021520227A JP7252328B2 (ja) | 2018-10-12 | 2019-10-12 | Rnaを編集する方法および組成物 |
PCT/CN2019/110782 WO2020074001A1 (en) | 2018-10-12 | 2019-10-12 | Methods and Compositions for Editing RNAs |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021520227A Division JP7252328B2 (ja) | 2018-10-12 | 2019-10-12 | Rnaを編集する方法および組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023078373A true JP2023078373A (ja) | 2023-06-06 |
Family
ID=70163607
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021520227A Active JP7252328B2 (ja) | 2018-10-12 | 2019-10-12 | Rnaを編集する方法および組成物 |
JP2023045897A Pending JP2023078373A (ja) | 2018-10-12 | 2023-03-22 | Rnaを編集する方法および組成物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021520227A Active JP7252328B2 (ja) | 2018-10-12 | 2019-10-12 | Rnaを編集する方法および組成物 |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20210355494A1 (ja) |
EP (2) | EP4306116A3 (ja) |
JP (2) | JP7252328B2 (ja) |
KR (1) | KR102666695B1 (ja) |
CN (4) | CN115651927B (ja) |
AU (2) | AU2019357450B2 (ja) |
BR (1) | BR112021006844A8 (ja) |
CA (1) | CA3115864A1 (ja) |
CL (1) | CL2021000880A1 (ja) |
CO (1) | CO2021005956A2 (ja) |
CR (1) | CR20210243A (ja) |
DK (1) | DK3864152T3 (ja) |
EC (1) | ECSP21033637A (ja) |
ES (1) | ES2962434T3 (ja) |
IL (1) | IL282191A (ja) |
MX (1) | MX2021004187A (ja) |
PE (1) | PE20211402A1 (ja) |
PH (1) | PH12021550805A1 (ja) |
SG (1) | SG11202103666PA (ja) |
TW (1) | TW202028466A (ja) |
WO (1) | WO2020074001A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11932856B2 (en) | 2017-03-03 | 2024-03-19 | The Regents Of The University Of California | RNA targeting of mutations via suppressor tRNAs and deaminases |
JP2022526455A (ja) | 2019-04-15 | 2022-05-24 | 北京大学 | Rnaを編集する方法および組成物 |
CA3146771A1 (en) | 2019-07-12 | 2021-01-21 | Peking University | Targeted rna editing by leveraging endogenous adar using engineered rnas |
EP4069842A1 (en) | 2019-12-02 | 2022-10-12 | Shape Therapeutics Inc. | Therapeutic editing |
CR20220365A (es) | 2019-12-30 | 2022-12-06 | Edigene Therapeutics Beijing Inc | Método basado en tecnología leaper para el tratamiento de mucopolisacaridosis ih y composición |
EP4086346A4 (en) | 2019-12-30 | 2024-03-20 | Edigene Therapeutics Beijing Inc | METHOD FOR TREATMENT OF USHER SYNDROME AND ASSOCIATED COMPOSITION |
WO2021209010A1 (zh) * | 2020-04-15 | 2021-10-21 | 博雅辑因(北京)生物科技有限公司 | 一种治疗赫勒氏综合征的方法和药物 |
KR20230033651A (ko) * | 2020-05-28 | 2023-03-08 | 코로 바이오, 인크. | Serpina1의 adar-매개 편집을 위한 방법 및 조성물 |
JP2023532375A (ja) | 2020-07-06 | 2023-07-27 | 北京▲輯▼因医▲療▼科技有限公司 | 改良されたrna編集方法 |
CN113897359A (zh) * | 2020-07-06 | 2022-01-07 | 博雅辑因(北京)生物科技有限公司 | 一种改善的rna编辑方法 |
IL278401A (en) | 2020-10-29 | 2022-05-01 | Yeda Res & Dev | Polynucleotides for editing RNA and a method for using them |
WO2022147573A1 (en) * | 2021-01-04 | 2022-07-07 | The Regents Of The University Of California | Programmable rna editing in vivo via recruitment of endogenous adars |
CN117015605A (zh) * | 2021-01-12 | 2023-11-07 | 北京大学 | 使用工程化rna通过利用内源性adar进行靶向rna编辑 |
US20230123513A1 (en) * | 2021-06-15 | 2023-04-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Deaminase-based rna sensors |
WO2023278436A1 (en) * | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Shape Therapeutics Inc. | Engineered guide rnas and polynucleotides |
TW202321451A (zh) * | 2021-08-18 | 2023-06-01 | 北京大學 | 工程化的 adar 招募 rnas 及其使用方法 |
WO2023060186A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Hepatx Corporation | Methods of tracking donor cells in a recipient |
CA3236236A1 (en) * | 2021-10-29 | 2023-05-04 | Z. Josh Huang | Compositions and systems for rna-programmable cell editing and methods of making and using same |
WO2023143539A1 (en) * | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Edigene Therapeutics (Beijing) Inc. | Engineered adar-recruiting rnas and methods of use thereof |
WO2023185231A1 (en) * | 2022-04-02 | 2023-10-05 | Edigene Therapeutics (Beijing) Inc. | Engineered adar-recruiting rnas and methods of use for usher syndrome |
WO2024086650A1 (en) * | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Locanabio, Inc. | Compositions and methods comprising programmable snrnas for rna editing |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101297830B1 (ko) * | 2010-09-10 | 2013-08-19 | 한국생명공학연구원 | 신규한 rna 결합 단백질 및 이를 이용한 무표지 마이크로 rna 검출방법 |
EP3230445B1 (en) * | 2014-12-12 | 2024-01-24 | Tod M. Woolf | Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides |
AU2015367378A1 (en) * | 2014-12-17 | 2017-06-15 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Targeted RNA editing |
US11390865B2 (en) * | 2015-07-14 | 2022-07-19 | Fukuoka University | Method for introducing site-directed RNA mutation, target editing guide RNA used in the method and target RNA-target editing guide RNA complex |
DE102015012522B3 (de) * | 2015-09-26 | 2016-06-02 | Eberhard Karls Universität Tübingen | Verfahren und Substanzen zur gerichteten RNA-Editierung |
EP3475424A1 (en) * | 2016-06-22 | 2019-05-01 | ProQR Therapeutics II B.V. | Single-stranded rna-editing oligonucleotides |
PL3507366T3 (pl) * | 2016-09-01 | 2021-05-04 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Chemicznie modyfikowane jednoniciowe oligonukleotydy edytujące rna |
WO2018134301A1 (en) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Oligonucleotide complexes for use in rna editing |
US11932856B2 (en) * | 2017-03-03 | 2024-03-19 | The Regents Of The University Of California | RNA targeting of mutations via suppressor tRNAs and deaminases |
KR102185464B1 (ko) * | 2017-03-15 | 2020-12-03 | 매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 신규 cas13b 오르소로그 crispr 효소 및 시스템 |
-
2019
- 2019-10-12 CN CN202210717093.4A patent/CN115651927B/zh active Active
- 2019-10-12 AU AU2019357450A patent/AU2019357450B2/en active Active
- 2019-10-12 CA CA3115864A patent/CA3115864A1/en active Pending
- 2019-10-12 CR CR20210243A patent/CR20210243A/es unknown
- 2019-10-12 EP EP23184286.5A patent/EP4306116A3/en active Pending
- 2019-10-12 ES ES19870299T patent/ES2962434T3/es active Active
- 2019-10-12 KR KR1020217014349A patent/KR102666695B1/ko active IP Right Grant
- 2019-10-12 US US17/284,232 patent/US20210355494A1/en active Pending
- 2019-10-12 DK DK19870299.5T patent/DK3864152T3/da active
- 2019-10-12 BR BR112021006844A patent/BR112021006844A8/pt unknown
- 2019-10-12 PE PE2021000498A patent/PE20211402A1/es unknown
- 2019-10-12 JP JP2021520227A patent/JP7252328B2/ja active Active
- 2019-10-12 CN CN202210724157.3A patent/CN116218836A/zh active Pending
- 2019-10-12 WO PCT/CN2019/110782 patent/WO2020074001A1/en unknown
- 2019-10-12 EP EP19870299.5A patent/EP3864152B1/en active Active
- 2019-10-12 SG SG11202103666PA patent/SG11202103666PA/en unknown
- 2019-10-12 CN CN201980067380.1A patent/CN113631708B/zh active Active
- 2019-10-12 MX MX2021004187A patent/MX2021004187A/es unknown
- 2019-10-12 CN CN202210740517.9A patent/CN116042611A/zh active Pending
- 2019-10-14 TW TW108136892A patent/TW202028466A/zh unknown
-
2021
- 2021-04-08 IL IL282191A patent/IL282191A/en unknown
- 2021-04-09 CL CL2021000880A patent/CL2021000880A1/es unknown
- 2021-04-09 US US17/226,961 patent/US20210310026A1/en active Pending
- 2021-04-12 PH PH12021550805A patent/PH12021550805A1/en unknown
- 2021-05-06 CO CONC2021/0005956A patent/CO2021005956A2/es unknown
- 2021-05-12 EC ECSENADI202133637A patent/ECSP21033637A/es unknown
-
2023
- 2023-03-22 JP JP2023045897A patent/JP2023078373A/ja active Pending
- 2023-04-11 AU AU2023202184A patent/AU2023202184A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7252328B2 (ja) | Rnaを編集する方法および組成物 | |
AU2020259548B2 (en) | Methods and compositions for editing RNAs | |
US20230365962A1 (en) | Targeted rna editing by leveraging endogenous adar using engineered rnas | |
AU2016206870B2 (en) | Gene editing through microfluidic delivery | |
EP3589751A1 (en) | RNA TARGETING OF MUTATIONS VIA SUPPRESSOR tRNAs AND DEAMINASES | |
WO2022150974A1 (en) | Targeted rna editing by leveraging endogenous adar using engineered rnas | |
JP2024522171A (ja) | Dna改変のためのcrispr-トランスポゾンシステム |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230421 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240507 |