JP2023509179A

JP2023509179A - Ｌｅａｐｅｒ技術に基づくｍｐｓｉｈの治療方法及び組成物

Info

Publication number: JP2023509179A
Application number: JP2022540985A
Authority: JP
Inventors: ▲鵬▼▲飛▼ 袁; ▲艷▼霞 ▲趙▼; 能▲銀▼ ▲劉▼; ▲澤▼▲軒▼ 易; ▲剛▼彬 ▲湯▼
Original assignee: Edigene Therapeutics Beijing Inc
Current assignee: Edigene Therapeutics Beijing Inc
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2023-03-07
Also published as: CN114846139A; CL2022001776A1; EP4086345A1; MX2022008190A; US20230060518A1; TW202128193A; AU2020418228A1; ECSP22059741A; KR20220119129A; CR20220365A; CO2022010432A2; WO2021136408A1; IL294201A; PE20230037A1; EP4086345A4; CA3163272A1

Abstract

ＬＥＡＰＥＲ技術を使用してＲＮＡのアデノシンからヒポキサンチンベースへのインビボ編集を安全かつ効果的に行い、病原性変異部位を正確に修復し、Ｇ＞Ａ変異によって引き起こされるすべての疾患、例えば、ＭＰＳＩＨの治療を達成することを含む、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づくＲＮＡのターゲティング編集の方法である。【選択図】なし

Description

本願は、遺伝子編集療法の分野に属し、特に、ＬＥＡＰＥＲ（ＬｅｖｅｒａｇｉｎｇＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡＤＡＲｆｏｒＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＥｄｉｔｉｎｇｏｎＲＮＡ；ＲＮＡのプログラム可能な編集のための内因性ＡＤＡＲの活用）技術に基づいてＲＮＡをターゲティング編集することによってＭＰＳＩＨを治療する方法に関し、該方法は、ＭＰＳＩＨなどのＧ＞Ａ変異による疾患を治療するために、ＬＥＡＰＥＲ技術を使用してＲＮＡのＡからＩ塩基へのインビボ部位特異的編集を含む。

ムコ多糖症ＩＨ（ＭｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓＩＨ，ＭＰＳＩＨ）またはムコ多糖症ＩＨとしても知られるハーラー症候群（Ｈｕｒｌｅｒｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、ＭＰＳＩの、ＩＨ、ＩＨ／Ｓ、及びＩＳの３つのサブタイプの中で最も深刻な１つであり、これは、この疾患の患者体内のα－Ｌ－イズロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＩＤＵＡ）の欠如によって引き起こされる、障害を起こし致命的な遺伝性代謝疾患であり、常染色体劣性遺伝性疾患（ａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅ，ＡＲ，ＡＲ）である。ハーラー症候群の根本的な原因は、ＩＤＵＡタンパク質をコードするヒト４番染色体上の４ｐ１６．３でのＩＤＵＡ遺伝子変異であり、これまでに２００余りの病原性変異があり、その中で最も一般的なタイプはα－Ｌ－イズロニダーゼのｃＤＮＡの１２０５位でのＧからＡへの変異である。この変異により、元のトリプトファンが終止コドンに変化し、最終的に翻訳されたタンパク質は、この部位以降のすべてのアミノ酸（ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ））を欠き、ＩＤＵＡのすべての酵素活性を失う。この突然変異タイプは、人口の総発生数の６３％を占め得る（ＷｏｒｌｄｗｉｄｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎＩＤＵＡｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｖａｒｉａｎｔｓ，Ｐｏｌｅｔｔｏ，Ｅｄｉｎａ（２０１８）．ＣｌｉｎｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ．９４．１０．１１１１／ｃｇｅ．１３２２４．）。α－Ｌ－イズロニダーゼは、リソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ）内のグリコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，ＧＡＧ）の分解に関与している。ハーラー症候群の患者は個人によって大きく異なり、出生時には正常である可能性があり、３～６か月の初期の兆候は、顔の輪郭が粗く、その後に前頭骨の突出、骨格の変形、成長停止、言語障害などの症状が続き、患者は通常１０歳以上生きていない。

ハーラー症候群を治癒する方法はなく、酵素補充療法（ＥＲＴ）と造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）との、現在承認されている２つの治療法が知られている。ＥＲＴは、肝臓のサイズの縮小、呼吸機能の改善、患者の可動性の全体的な改善など、内臓の表現型に関して良好な結果を達成している。不利なことに、それは中枢神経系に到達することができないため、認知障害を防ぐことができない。一方、ＨＳＣＴが成功すると、神経系症状を含むほとんどの臨床症状が予防され得るが、臨床症状が現れる前に（できれば生後８か月前に）治療する必要がある。この治療法の死亡率が高いため、重症患者のみに適している（ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｓｔｈｅｒａｐｙｆｏｒＨｕｒｌｅｒＳｙｎｄｒｏｍｅ．Ｔｏｌａｒ，Ｊ（２００８）．Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．４１．５３１－５．１０．１０３８／ｓｊ．ｂｍｔ．１７０５９３４）。

現在、ハーラー症候群の治療のために研究されている遺伝子編集技術の原理は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）及びアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）を使用して、正常なＩＤＵＡタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を肝細胞のゲノムに部位特異的に挿入することであるが、この方法ではハーラー症候群の脳や骨格系の症状を解決することはできず、ＤＮＡ編集によるオフターゲット（оｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）は注意が必要な問題である。

理論的には、急速に発展しているゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ）もハーラー症候群の治療に使用できる。多くの研究者やバイオテクノロジー企業も、この技術の臨床応用に努力している。例えば、２０１９年９月に、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して幹細胞を編集し、ＡＩＤＳと白血病の治療のために患者に再注入する臨床試験の結果が初めて報告され、遺伝子治療の方向でＣＲＩＳＰＲ技術の変革に大きく貢献した。ＣＲＩＳＰＲ技術には大きな潜在的な応用の見通しがあるが、一連の欠陥もあり、科学研究段階から臨床治療応用へのこの技術の変換を困難にしている。問題の１つは、ＣＲＩＳＰＲ技術に使用する核心的な酵素Ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲに基づくＤＮＡ編集技術では、Ｃａｓ９または同様の機能を持つ他のヌクレアーゼの外因性発現が必要であり、これにより以下の問題が発生する。第一に、通常外因性発現を必要とするヌクレアーゼは、通常、高分子量を有し、これは、ウイルスベクターを介した体内へのそれらの送達の効率を劇的に低下させる。第二に、ヌクレアーゼの外因性発現のために、潜在的なヌクレアーゼのオフターゲットの可能性があり、それによりその適用には潜在的な発癌性のリスクがある。最後に、外因的に発現されたヌクレアーゼは細菌に見られ、ヒトや哺乳動物には自然に存在しないため、患者に免疫応答を誘発し得、患者自身に損傷を与える可能性がある一方、外因的に発現されたヌクレアーゼが中和され、それによってその本来の活性を失うか、またはさらなる介入を妨げる可能性がある。

２０１７年、張鋒のグループは、ＲＥＰＡＩＲ（プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集、ＲＮＡＥｄｉｔｉｎｇｆｏｒＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＡｔｏＩＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＲＮＡ編集技術を報告した（ＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｗｉｔｈＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３，Ｃｏｘｅｔａｌ．，２０１７）。この技術は、Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合タンパク質とシングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）の外因性発現により、ＡからＩへの目的ＲＮＡを標的とする編集も実現できるが、ＣＲＩＳＰＲ技術と同様に、この方法でも外因性タンパク質の編集が必要であり、外来タンパク質の発現による問題を解決できない。

２０１９年１月、ＴｈｏｒｓｔｅｎＳｔａｆｆｏｒｓｔのグループは、ＲＥＳＴＯＲＥと呼ばれる核酸編集技術を報告した（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡＤＡＲｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ，Ｍｅｒｋｌｅｅｔａｌ．，２０１９）。この技術は、外来タンパク質への依存を取り除くことができる。しかし、まず第一に、ＲＥＳＴＯＲＥ技術はＩＦＮ－γの存在下でしか高い編集効率を備えることができず、ＩＦＮ－γは自己免疫の発達と重症度を決定する重要な要素であり（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ａｎｄｓｙｓｔｅｍｉｃａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｐｏｌｌａｒｄｅｔａｌ．，２０１３）、医療分野でのこの技術の適用を大幅に減らす。一方、ＲＥＳＴＯＲＥ技術ではガイドＲＮＡも使用されており、使用されるガイドＲＮＡは化学的に合成したオリゴヌクレオチドであり、合成オリゴヌクレオチドは、安定性を確保するために人工的に大量の化学修飾を導入する必要がある。

２０１９年、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１１０７８２及びＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０８４９２２出願は、ターゲット転写産物に部分的に相補的な操作されたＲＮＡを提供し、天然ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を動員して、標的ＲＮＡの特定の部位でアデノシンをイノシンに変換し、この方法は「ＬＥＡＰＥＲ（ＲＮＡのプログラム可能な編集のための内因性ＡＤＡＲの活用、ＬｅｖｅｒａｇｉｎｇＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡＤＡＲｆｏｒＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＥｄｉｔｉｎｇｏｎＲＮＡ）」（内因性ＡＤＡＲを使用したＲＮＡのプログラム可能な編集）と呼ばれ、ＡＤＡＲを動員するＲＮＡは「ｄＲＮＡ」または「ａｒＲＮＡ」と呼ばれる。ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。

本願は、ハーラー症候群のＩＤＵＡ病原性遺伝子のＧからＡへの突然変異、特に最も高い割合の突然変異タイプ（ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ））に対して新しい技術案を提供し、その技術案により、標的ＲＮＡでは変異部位を正確に編集することができる。

具体的には、本願は少なくとも下記の技術案を提供する。
１、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく標的細胞中の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法であって、前記標的ＲＮＡが、ＩＤＵＡ遺伝子転写物にＧからＡへの突然変異を含むＲＮＡであり、前記方法が、
標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築物または前記ａｒＲＮＡをコードする構築物を前記標的細胞に送達することを含み、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）を脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、
前記方法。

２、前記ａｒＲＮＡが、標的Ａとペアリングする塩基Ｃ、Ａ、ＵまたはＧを含む、項１に記載の方法。
いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、標的Ａとペアリングする塩基Ｃが導入される。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、標的Ａとペアリングする塩基Ａが導入される。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、標的Ａとペアリングする塩基Ｕが導入される。

３、前記ａｒＲＮＡの長さが約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ、または８１～６６ｎｔである、項１または２に記載の方法。本願は、前記数値範囲内の任意の自然数を開示し、包含する。

４、前記ａｒＲＮＡの３’端からのターゲティング塩基の長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、または２４ｎｔ～１１ｎｔである、項３に記載の方法。本願は、前記数値範囲内の任意の自然数を開示し、包含する。

５、前記ａｒＲＮＡの５’端からのターゲティング塩基の長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、または５５ｎｔ～４５ｎｔである、項３または４に記載の方法。本願は、前記数値範囲内の任意の自然数を開示し、包含する。

６、前記標的細胞がヒト細胞である、項１～５のいずれか一項に記載の方法。

７、前記標的ＲＮＡが、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異部位を含むＲＮＡである、項１～６のいずれか一項に記載の方法。

８、前記ａｒＲＮＡが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３４を含む、項１～７のいずれか一項に記載の方法。

９、前記ａｒＲＮＡが、配列番号４４または配列番号５２から選択される配列を含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法。

１０、前記ａｒＲＮＡが化学的に修飾されている、項１～９のいずれか一項に記載の方法。

１１、前記化学修飾が、２'－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）またはホスホロチオエート修飾を含む、項１０に記載の方法。

１２、前記化学修飾が、
配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であること、
配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡであること、
ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣであること、
ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されていること、
最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、及び
最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されていること
から選択される１つまたは複数である、項１１に記載の方法。

いくつかの特定の実施形態において、前記化学修飾は、以下から選択される１つまたは複数である：
ＣＭ１：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されている；
ＣＭ２：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡである；
ＣＭ３：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣである；
ＣＭ４：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されている；及び
ＣＭ６：配列の最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されている。

１３、前記ａｒＲＮＡをコードする前記構築物が、線状核酸鎖、ウイルスベクター、またはプラスミドである、項１～９のいずれか一項に記載の方法。

１４、前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルス発現ベクターである、項１３に記載の方法。

１５、前記送達方法が、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、脂質－ナノ粒子（ｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＬＮＰ）送達または感染である、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

１６、標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築物、または前記ａｒＲＮＡをコードする構築物をＬＮＰを介して前記標的細胞に送達する、項１５に記載の方法。

１７、前記ａｒＲＮＡの送達濃度が、２．５以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、または２０ｎＭ以上である、項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

上記の実施形態において、前記標的細胞は、肝細胞または線維芽細胞を含む。

１８、ＬＥＡＰＥＲ技術を介して標的細胞中の標的ＲＮＡをターゲティング編集するａｒＲＮＡまたはそのコード配列であって、前記ａｒＲＮＡが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４４、または配列番号５２のいずれかを含むか、またはそのいずれかからなる、前記ａｒＲＮＡまたはそのコード配列。

１９、項１８に記載のａｒＲＮＡまたはそのコード配列を含むプラスミド、ウイルスベクター、リポソームまたは脂質ナノ粒子。

２０、項１８に記載のａｒＲＮＡもしくはそのコード配列、または項１９に記載のプラスミド、ウイルスベクター、リポソームもしくは脂質ナノ粒子を含む組成物、製剤、キットまたは生物学的製品。

２１、項１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して、個体の標的細胞におけるＭＰＳＩＨ疾患に関連するＧからＡへの突然変異を修正することを含む、前記個体のＭＰＳＩＨを治療する方法。

２２、前記突然変異が、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異である、項２０に記載の方法。

２３、前記ａｒＲＮＡの使用頻度が≧２１日／回、≧１７日／回、≧１４日／回、または≧１０日／回である、項２０または２１に記載の方法。

いくつかの実施形態では、本願はまた、ＭＰＳＩＨ疾患を治療する薬剤の調製における、配列番号１４、配列番号１５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４４、または配列番号５２から選択される配列の使用に係る。

本出願の技術案を使用して、標的細胞（たとえば肝細胞または線維芽細胞）内のＡからＩ塩基へのＲＮＡのインビボ編集を安全かつ効果的に行うことができ、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異などの病原性突然変異部位を正確に修復することができ、ＲＮＡによってコードするタンパク質のインビボでの正常な発現を回復し、ＭＳＰＩＨを治療する目的を達成することができる。

図１は、ＧＭ０６２１４細胞でのＩＤＵＡ遺伝子型の検出を示す図である。図２は、細胞エレクトロトランスフェクション条件についてのテストを示す図である。図３Ａ～Ｂは、編集後の細胞機能をテストするためのＩＤＵＡｐｒｅ－ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡのａｒＲＮＡの設計と、細胞編集効率をテストするためのＩＤＵＡｐｒｅ－ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡのａｒＲＮＡの設計を示す図である。図３Ａ～Ｂは、編集後の細胞機能をテストするためのＩＤＵＡｐｒｅ－ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡのａｒＲＮＡの設計と、細胞編集効率をテストするためのＩＤＵＡｐｒｅ－ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡのａｒＲＮＡの設計を示す図である。図４ＡはＩＤＵＡ－レポーター細胞株の設計を示す図であり、図４Ｂは２９３Ｔ－ＩＤＵＡ－レポーターで異なる長さ（対称的なトランケーション）のａｒＲＮＡの編集効率の検出を示す図である。図４ＡはＩＤＵＡ－レポーター細胞株の設計を示す図であり、図４Ｂは２９３Ｔ－ＩＤＵＡ－レポーターで異なる長さ（対称的なトランケーション）のａｒＲＮＡの編集効率の検出を示す図である。図５Ａ～Ｂは、ＧＭ０６２１４細胞に異なる長さ（対称的なトランケーション）のａｒＲＮＡをトランスフェクトした後のさまざまな時点での酵素活性と編集効率の検出を示す図である。図５Ａ～Ｂは、ＧＭ０６２１４細胞に異なる長さ（対称的なトランケーション）のａｒＲＮＡをトランスフェクトした後のさまざまな時点での酵素活性と編集効率の検出を示す図である。図６は、ＧＭ０６２１４細胞におけるリポフェクチンＲＮＡｉＭＡＸによるａｒＲＮＡ（対称トランケーション、３’トランケーション及び５’トランケーション）のトランスフェクション後のＩＤＵＡ酵素活性と編集効率の検出を示す図である。図７Ａは、ヒトＩＤＵＡの変異部位を標的とするａｒＲＮＡが好ましい５５－ｃ－２５と５５－ｃ－１０の間において、３’末端から塩基ごとに減少させ、ＧＭ０６２１４細胞を使用して酵素活性アッセイによって最適な長さを選択したことを示す図である。図７Ｂは、マウスＩＤＵＡ変異部位を標的とするａｒＲＮＡが５５－ｃ－５５と５５－ｃ－１０の間において、３’末端から５塩基ごとに漸減し、ＭＰＳＩマウスＭＥＦ細胞（ＭＳＰＩＭＥＦ（ＭＳＰＩｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ））を使用して酵素活性アッセイによって最適なａｒＲＮＡ長さの配列を選択したことを示す図である。図７Ａは、ヒトＩＤＵＡの変異部位を標的とするａｒＲＮＡが好ましい５５－ｃ－２５と５５－ｃ－１０の間において、３’末端から塩基ごとに減少させ、ＧＭ０６２１４細胞を使用して酵素活性アッセイによって最適な長さを選択したことを示す図である。図７Ｂは、マウスＩＤＵＡ変異部位を標的とするａｒＲＮＡが５５－ｃ－５５と５５－ｃ－１０の間において、３’末端から５塩基ごとに漸減し、ＭＰＳＩマウスＭＥＦ細胞（ＭＳＰＩＭＥＦ（ＭＳＰＩｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ））を使用して酵素活性アッセイによって最適なａｒＲＮＡ長さの配列を選択したことを示す図である。図８Ａは、好ましい２つの３’端の長さの下で、５’端の長さを徐々にトランケートして最適な長さの範囲を選択したことを示す図である。図８Ｂは、酵素活性に対する、３’末端の長さを１４ｎｔに固定した後、５’末端を塩基ごとにトランケートした後に形成したａｒＲＮＡの効果を示し、図８Ａと８Ｂを組み合わせることによって最適なａｒＲＮＡの長さを選別した図である。図８Ａは、好ましい２つの３’端の長さの下で、５’端の長さを徐々にトランケートして最適な長さの範囲を選択したことを示す図である。図８Ｂは、酵素活性に対する、３’末端の長さを１４ｎｔに固定した後、５’末端を塩基ごとにトランケートした後に形成したａｒＲＮＡの効果を示し、図８Ａと８Ｂを組み合わせることによって最適なａｒＲＮＡの長さを選別した図である。図９は、好ましい２つのａｒＲＮＡの長さでのａｒＲＮＡ編集効率（酵素活性として表される）に対するさまざまな化学修飾の影響の比較を示す図である。図１０Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、異なるａｒＲＮＡ濃度でのＩＤＵＡｍＲＮＡのヒト及びマウスａｒＲＮＡ編集による編集効率と、編集後に機能的なＩＤＵＡタンパク質を生成する能力を示す図である。図１０Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、異なるａｒＲＮＡ濃度でのＩＤＵＡｍＲＮＡのヒト及びマウスａｒＲＮＡ編集による編集効率と、編集後に機能的なＩＤＵＡタンパク質を生成する能力を示す図である。図１０Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、異なるａｒＲＮＡ濃度でのＩＤＵＡｍＲＮＡのヒト及びマウスａｒＲＮＡ編集による編集効率と、編集後に機能的なＩＤＵＡタンパク質を生成する能力を示す図である。図１０Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、異なるａｒＲＮＡ濃度でのＩＤＵＡｍＲＮＡのヒト及びマウスａｒＲＮＡ編集による編集効率と、編集後に機能的なＩＤＵＡタンパク質を生成する能力を示す図である。図１１Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、１回のトランスフェクション後のさまざまな時点でヒトまたはマウス細胞で測定されたＩＤＵＡ酵素活性を示す図である。図１１Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、１回のトランスフェクション後のさまざまな時点でヒトまたはマウス細胞で測定されたＩＤＵＡ酵素活性を示す図である。図１１Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、１回のトランスフェクション後のさまざまな時点でヒトまたはマウス細胞で測定されたＩＤＵＡ酵素活性を示す図である。図１１Ａ～Ｄは、好ましい長さ及び好ましい化学修飾の組み合わせの下で、１回のトランスフェクション後のさまざまな時点でヒトまたはマウス細胞で測定されたＩＤＵＡ酵素活性を示す図である。図１２Ａ～Ｂは、ヒト及びマウスの初代肝細胞において様々な方法によるａｒＲＮＡ送達によって達成されたターゲティング部位の編集効率を示す図である。図１２Ａ～Ｂは、ヒト及びマウスの初代肝細胞において様々な方法によるａｒＲＮＡ送達によって達成されたターゲティング部位の編集効率を示す図である。図１３は、初代培養ヒト及びマウス肝細胞にＬＮＰにより送達されたＩＤＵＡターゲティングａｒＲＮＡの編集効率を示す図である。図１４は、マウスＩＤＵＡ変異を標的とするスクリーニングされたａｒＲＮＡ（配列番号５２）をＬＮＰにパッケージ化し、尾静脈を介して異なる濃度で２４時間マウスに投与した後の、マウス肝細胞におけるＩＤＵＡ編集効率を示す図である。

定義
ＲＮＡ編集とは、真核細胞に存在する自然なプロセスのことであり、ＲＮＡ編集は、ＤＮＡ転写後、タンパク質翻訳前にＲＮＡレベルで発生する塩基Ａ（アデニン）からＩ（ヒポキサンチン）への編集であり、ヒポキサンチンは翻訳中にＧとして認識され、ＲＮＡのＡからＩへの編集はトランスクリプトームを多様化する。ＲＮＡの総量は、ＲＮＡ分子の部位特異的かつ正確な変化によって数倍に増加する。この編集はＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ、ＡｄｅｎｏｓｉｎｅＤｅａｍｉｎａｓｅＡｃｔｉｎｇｏｎＲＮＡ）プロテアーゼによって触媒され、部位特異的ＲＮＡ編集と呼ばれる。編集は、イントロン及びエキソン配列を含むコーディング領域に発生することもあるし、非コーディング領域で発生することもあり、コーディング領域での編集は、タンパク質コード配列を再定義することができる。

本明細書で使用される場合、「ＬＥＡＰＥＲ技術」、すなわち、操作されたＲＮＡを使用して内因性ＡＤＡＲを動員することによるＲＮＡ編集のための技術とは、ＷＯ２０２００７４００１Ａ１で報告されたようなＲＮＡ編集技術を指す。本明細書で使用される操作されたＲＮＡはすなわちアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）であり、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲドメインを含む特定の複合体を動員することによってＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化することができるＲＮＡを指す。

本明細書で使用される場合、「アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）」という用語は、真核生物（ヒトなどの哺乳動物を含む）の様々な組織で広く発現され、ＲＮＡ分子内のアデノシンＡからイノシンＩへの変換を触媒することができるアデノシンデアミナーゼのクラスを指す。真核生物のタンパク質合成の過程で、Ｉは通常Ｇとして翻訳される。

本明細書で使用される場合、核酸の「相補」とは、従来のワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成によって別の核酸と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、別の核酸と水素結合（すなわち、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち約５、６、７、８、９、１０がそれぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つである相補性の程度、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。単一の塩基または単一のヌクレオチドの場合、ワトソン－クリックの塩基対形成の原理に従って、ＡがＴまたはＵと、ＣがＧまたはＩとペアリングする場合、それは相補的またはマッチングと呼ばれ、その逆も同様である。これ以外のすべての塩基対形成は、非相補的または非マッチングと呼ばれる。

「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。前記水素結合は、ワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、またはその他の配列特異的な方法で発生できる。所定の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補配列」と呼ばれる。

本明細書で使用される「エレクトロトランスフェクション」という用語は、エレクトロポレーショントランスフェクション技術を指し、これは、細胞に数マイクロ秒から数ミリ秒の電界を印加することによって細胞膜に一時的に小さな細孔または開口部を形成し、ＤＮＡなどの高分子を細胞に送達する技術である。

本明細書で使用される場合、「リポフェクション（Ｌｉｐｏ）」という用語は、インビボ及びインビトロでの送達ビヒクルとしてリポソームを使用するトランスフェクション技術を指す。リポソームには、中性リポソーム及びカチオン性リポソームが含まれ、中性リポソームは脂質膜を使用して核酸などの高分子をカプセル化し、脂質膜によって前記高分子を細胞膜に送達する；カチオン性脂質リポソームは正に帯電しており、それが送達する高分子はあらかじめ埋め込まれていないが、高分子自体の負の電荷により正に帯電したリポソームに自動的に結合し、高分子-カチオン性リポソーム複合体を形成し、負に帯電した細胞膜表面に吸着され、エンドサイトーシスを介して細胞に送達される。

本明細書で使用される場合、「脂質－ナノ粒子（ＬＮＰ）送達」という用語は、脂質ナノ粒子を介した細胞への核酸、タンパク質などの高分子の膜貫通送達を指す。その中で、脂質ナノ粒子とは、イオン化可能な脂質、補助リン脂質、コレステロールとＰＥＧ脂質を含むエタノール相と、核酸やタンパク質などの高分子を含む酸性水相との２つの相を混合して合成された粒子を指す。例えば、ＲＮＡでカプセル化されたＬＮＰは、エンドサイトーシスによって細胞質に入る可能性がある。

本明細書において、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異とは、ＩＤＵＡ遺伝子番号０００２０３．４の転写産物の１２０５位でのＧからＡへの変異を指し、この変異により、転写産物によって翻訳されたペプチド鎖の４０２位のトリプトファン（Ｔｒｐ）コード配列が終止コドン（Ｔｅｒ）に変換され、最終的に翻訳されたアミノ酸の４０２位以降のすべてのアミノ酸が欠失し、それによってＩＤＵＡ酵素活性を失ってしまう。この変異を持つ患者は、活性型α－Ｌ－イズロニダーゼが不足しているため、リソソーム内のグリコサミノグリカンの分解に影響を及ぼし、最終的には患者に催奇形性を引き起こし、さらには死さえも引き起こす可能性がある。本願の技術案は、転写レベルでこの変異を逆転させることにより、ＩＤＵＡ酵素の活性を回復させることができる。

本明細書で使用される場合、「標的ＲＮＡ」という用語は、編集されるアデノシン（Ａ）を含む、編集される標的ＲＮＡを指す。前記標的ＲＮＡは成熟ｍＲＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡ前駆体であってもよい。本願では、ｍＲＮＡ前駆体の方がより好ましい。本明細書において、「標的ＲＮＡ」を含む細胞は、標的細胞と呼ばれる。編集されるアデノシンは、「標的塩基」、「標的アデノシン」または「標的Ａ」と呼ばれる。本願では、「標的塩基」、「標的アデノシン」、または「標的Ａ」は置き換えて使用できる。標的ＲＮＡの５’末端で標的アデノシンに隣接する塩基は「５’隣接塩基」と呼ばれ、標的ＲＮＡの３’末端で標的アデノシンに隣接する塩基は「３’隣接塩基」と呼ばれ、標的塩基ならびにその３’及び５’隣接塩基からなる塩基トリプレットは、本明細書では「標的塩基トリプレット」と呼ばれる。ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的塩基の反対側のａｒＲＮＡ上の塩基は「ターゲティング塩基」と呼ばれ、ａｒＲＮＡの５’末端でターゲティング塩基に隣接する塩基は「５’最近傍塩基」と呼ばれ、ａｒＲＮＡの３’末端でターゲティング塩基に隣接する塩基は「３’最近傍塩基」と呼ばれ、ターゲティング塩基ならびにその３’及び５’最近傍塩基からなる塩基トリプレットは、「ターゲティング塩基トリプレット」と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「構築物」という用語は、核酸配列を含む核酸ベクターを指し、前記核酸ベクターは、線状核酸分子、プラスミドまたはウイルスベクターなどであり得る。前記核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。前記核酸配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、転写、翻訳、または発現されることなく直接機能する。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、転写されてＲＮＡを形成した後、ＲＮＡ分子として機能するＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、翻訳された後にポリペプチドまたはタンパク質として機能するＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、タンパク質を形成するための転写及び翻訳ステップの後にタンパク質として機能するＤＮＡである。前記構築物は、ウイルス、脂質ナノ粒子、またはエクソソームの形で標的細胞にパッケージングすることができ、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、化学形質転換などによって標的細胞に導入することもできる。

本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、何らかの手段によって、細胞膜の外側から細胞膜への核酸やタンパク質などの生物学的高分子の導入を指す。「送達」としては、例えば、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、脂質－ナノ粒子送達、ウイルス送達、エクソソーム送達などが挙げられる。

本明細書で使用される「修飾」という用語は、遺伝子工学的方法などの化学的または生物学的方法によって核酸またはタンパク質の組成または構造を変化させ、それによって前記核酸またはタンパク質の１つまたは複数の特性または機能を変化させることを指す。

本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

ＲＮＡ編集方法
本出願は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて標的細胞におけるＧからＡへの変異を含むＩＤＵＡ標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法を提供し、この方法は、標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築物または前記ａｒＲＮＡをコードする構築物を前記標的細胞に送達することを含み、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）を脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体である。いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡは成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ＮＭ＿００２０２３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異部位を含む、転写されたＩＤＵＡ標的ＲＮＡである。

いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、標的Ａとペアリングする塩基Ｃ、Ａ、ＵまたはＧを含む。前記標的Ａとペアリングする塩基の好ましい順はＣ、Ａ、Ｕ、Ｇである。すなわち、ａｒＲＮＡの長さが同じであり、ターゲティング塩基と５’末端との間の距離が同じであり、ターゲティング塩基と３’末端との間の距離が同じであり、かつターゲティング塩基以外のａｒＲＮＡ配列が完全に同じである場合には。ターゲティング塩基の好ましい順はＣ＞Ａ＞Ｕ＞Ｇである。前記ターゲティング塩基がＣの場合、前記ａｒＲＮＡはＸｎｔ－ｃ－Ｙｎｔとして表すことができ、ここで、Ｘは、ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ターゲティング塩基の距離がＸｎｔであることを表し、Ｙは、ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ターゲティング塩基の距離がＹｎｔであることを表し、ＸとＹは任意の自然数を表すことができる。

いくつかの実施形態では、前記標的細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記標的細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、肝細胞または線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、ヒトまたはマウス細胞である。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ、または８１～６６ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の３’末端からの長さは、４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎ、または２４ｎｔ～１１ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’末端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、または５５ｎｔ～４５ｎｔである。ここで、前記ターゲティング塩基の３’末端からの長さとは、前記ターゲティング塩基の３’の最近傍塩基から３’の最末端の塩基までのすべての塩基数を指す。前記ターゲティング塩基の５’末端からの長さとは、ターゲティング塩基の５’の最近傍塩基から５’の最末端の塩基までのすべての塩基数を指す。

いくつかの実施形態では、前記標的細胞はヒト細胞であり、前記標的ＲＮＡは、ＮＭ＿００２０２３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異部位を含む、転写されたＩＤＵＡ標的ＲＮＡであり、前記ａｒＲＮＡの全長は６６ｎｔ以上であり、例えば、長さは約１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、１０１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ、または８１～６６ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの全長は、上記の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９１ｎｔ、９５ｎｔ、１００ｎｔ、１１０ｎｔ、１１５ｎｔ、１２０ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からのターゲティング塩基の長さは、４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、または２４ｎｔ～１１ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの３’末端からのターゲティング塩基の距離は、上記の３’末端からのターゲティング塩基の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡの５’末端からのターゲティング塩基の長さは、８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔまたは５５ｎｔ～４５ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの５’末端からのターゲティング塩基の距離は、上記の５’末端からのターゲティング塩基の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４から選択される配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記標的細胞はマウス細胞（例えば、Ｗ３９２Ｘマウス細胞）であり、前記標的ＲＮＡは、ヒトＷ４０２Ｘ突然変異に対応するＩＤＵＡ突然変異を含んで転写された標的ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、Ｗ３９２Ｘマウス細胞である。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡの全長は約１２１～５３ｎｔ、１１１～６１ｎｔ、１０１～６１ｎｔ、９１～６１ｎｔ、８１～６１ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、または１０５～６６ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの全長は、上記の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９１ｎｔ、９５ｎｔ、１００ｎｔ、１１０ｎｔ、１１５ｎｔ、１２０ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からのターゲティング塩基の長さは、５５ｎｔ～１０ｎｔまたは５０ｎｔ～１０ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの３’末端からのターゲティング塩基の距離は、上記の３’末端からのターゲティング塩基の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、３５ｎｔ、３５ｎｔ、３７ｎｔ、３８ｎｔ、３９ｎｔ、４０ｎｔ、４１ｎｔ、４２ｎｔ、４３ｎｔ、４４ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡの５’末端からのターゲティング塩基の長さは、８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔまたは５５ｎｔ～４５ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの５’末端からのターゲティング塩基の距離は、上記の５’末端からのターゲティング塩基の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、３３ｎｔ、３６ｎｔ、４７ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７５ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、配列番号４４または配列番号５２から選択される配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡが化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、前記化学修飾は、２'－Ｏ－メチル化及び／またはホスホロチオエート修飾である。いくつかの実施形態において、前記化学修飾は、
配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であること、
配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡであること、
ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣであること、
ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されていること、
最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、及び
最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されていること
から選択される１つまたは複数である。

本明細書に記載されるように、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物はすなわち、前記ａｒＲＮＡコード配列を含む構築物である。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物が標的細胞に送達された後、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物から転写される。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物は、線状核酸鎖、ウイルスベクター、またはプラスミドである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物が標的細胞に送達されると、相同組換えまたは非相同組換えによって前記ａｒＲＮＡをコードする配列を標的細胞のゲノムに挿入し、それによって連続的に転写して前記ａｒＲＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物は、標的細胞に送達されると、前記ａｒＲＮＡをコードする配列がエピソーム核酸の一部として標的細胞に存在することを可能にし、その結果、前記ａｒＲＮＡをコードする配列は、一定期間内に転写され前記ａｒＲＮＡが生成され得る。

いくつかの実施形態において、前記送達は、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、または脂質－ナノ粒子（ｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＬＮＰ）送達または感染である。いくつかの実施形態において、前記標的細胞が肝細胞の場合、前記送達はＬＮＰ送達である。いくつかの実施形態において、前記標的細胞が線維芽細胞である場合、前記送達はリポフェクションである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡの送達濃度が、≧２．５～５ｎＭであり、好ましくは≧１０～２０ｎＭ、例えば、≧１５ｎＭである。本願において、前記送達濃度とは、前記ａｒＲＮＡ構築物を前記標的細胞に送達するときに、ａｒＲＮＡ及び前記標的細胞を含む送達システム１体積単位に含まれるａｒＲＮＡの量を指す。前記送達システムは、ａｒＲＮＡまたはその構築物、標的細胞、ならびに前記ａｒＲＮＡ及び標的細胞を取り囲む液体マトリックスを含む。いくつかの実施形態において、前記液体マトリックスは、細胞培養培地、ＰＢＳ、または細胞質と等張であり、細胞の安定した生存状態を一定期間維持することができる他の溶液であり得る。いくつかの実施形態では、前記送達システムは、送達を促進する試薬をさらに含む。

ａｒＲＮＡ
本出願はまた、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく標的細胞における標的ＲＮＡのターゲティング編集に使用することができるａｒＲＮＡ、例えば、ＮＭ＿００２０２３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異部位を含む、転写されたａｒＲＮＡを提供し、これによって、標的ＲＮＡの標的Ａを脱アミノ化してヒポキサンチンＩとなる。その後の標的細胞の翻訳過程で、ＩはＧとして認識され、Ｇ＞Ａの変異がＧに復元され、ａｒＲＮＡ編集後に標的ＲＮＡを正しいタンパク質に翻訳できるようになる。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体である。いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡは成熟ｍＲＮＡである。

いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、標的Ａとペアリングする塩基（ターゲティング塩基）を導入する編集効率がＣ、Ａ、Ｕ、Ｇの降順である。いくつかの実施形態において、降順ａｒＲＮＡのすべての塩基は、ターゲティング塩基を除いて、標的ＲＮＡに相補的でペアリングできる。いくつかの実施形態において、ターゲティング塩基に加えて、ａｒＲＮＡ中の１つ以上の塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成する。

いくつかの実施形態では、前記標的細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記標的細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、肝細胞または線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、ヒトまたはマウス細胞（例えば、Ｗ３９２Ｘマウス細胞）である。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ、または８１～６６ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からのターゲティング塩基の長さは、４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎ、または２４ｎｔ～１１ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、５’末端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、または５５ｎｔ～４５ｎｔである。ここで、前記ターゲティング塩基の３’末端からの長さとは、ターゲティング塩基の３’の最近傍塩基から３’の最末端の塩基までのすべての塩基数を指す。前記ターゲティング塩基の５’末端からの長さとは、ターゲティング塩基の５’の最近傍塩基から５’の最末端の塩基までのすべての塩基数を指す。

いくつかの実施形態では、前記標的細胞はマウス細胞（例えば、Ｗ３９２Ｘマウス細胞）であり、前記標的ＲＮＡは、ヒトＷ４０２Ｘ突然変異に対応するＩＤＵＡ突然変異を含んで転写された標的ＲＮＡであり、前記ａｒＲＮＡの長さは約１２１～５３ｎｔ、１１１～６１ｎｔ、１０１～６１ｎｔ、９１～６１ｎｔ、８１～６１ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、または１０５～６６ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの全長は、上記の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９１ｎｔ、９５ｎｔ、１００ｎｔ、１１０ｎｔ、１１５ｎｔ、１２０ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からのターゲティング塩基の長さは、５５ｎｔ～１０ｎｔまたは５０ｎｔ～１０ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの３’末端からのターゲティング塩基の距離は、上記の３’末端からのターゲティング塩基の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、３５ｎｔ、３５ｎｔ、３７ｎｔ、３８ｎｔ、３９ｎｔ、４０ｎｔ、４１ｎｔ、４２ｎｔ、４３ｎｔ、４４ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡの５’末端からのターゲティング塩基の長さは、８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔまたは５５ｎｔ～４５ｎｔである。つまり、前記ａｒＲＮＡの５’末端からのターゲティング塩基の距離は、上記の５’末端からのターゲティング塩基の長さの範囲から選択される任意の自然数であり、例えば、３３ｎｔ、３６ｎｔ、４７ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７５ｎｔである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、配列番号４４または配列番号５２から選択される配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物から転写して発現される。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物からインビトロで転写及び発現され、そして精製して得られる。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、前記ａｒＲＮＡをコードする構築物からインビボで直接発現されて編集の役割を果たす。いくつかの実施形態において、前記構築物は、ウイルスベクター、プラスミド、及び線状核酸から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、ＡＡＶまたはレンチウイルスである。

いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡが化学的に合成されている。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡが化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、前記化学修飾は、２'－Ｏ－メチル化及び／またはホスホロチオエート修飾である。いくつかの実施形態において、前記化学修飾は、
配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であること、
配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡであること、
ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣであること、
ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されていること、
最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、及び
最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されていること
から選択される１つまたは複数である。

構築物
本出願はまた、前述のａｒＲＮＡをコードする構築物を提供する。いくつかの実施形態において、前述構築物は、ウイルスベクター、プラスミド、及び線状核酸から選択される。いくつかの実施形態において、前述ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルス発現ベクターである。

本出願はさらに、構築物を含むウイルス、ないしナノ粒子、リポソーム、エクソソームまたは細胞を提供する。

製剤及び生物製品
本出願はまた、ＩＤＵＡ遺伝子の正常な機能を回復するように標的細胞中に転写されたＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異部位を含む標的ＲＮＡの編集に使用することができる、前述のａｒＲＮＡのいずれかまたは前述の構築物のいずれかを含む組成物、製剤及び生物学的製品を提供する。いくつかの実施形態において、前述ａｒＲＮＡまたは構築物は、リポソームにカプセル化される。いくつかの実施形態において、前述ａｒＲＮＡまたは前述構築物は、脂質ナノ粒子を形成するように調製される。いくつかの実施形態において、前述ａｒＲＮＡまたは前述構築物は、ウイルス送達（例えば、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルス）によって被験者の体内に導入される。

いくつかの実施形態では、ａｒＲＮＡを含む製剤は、疾患の治療のために患者に注入することができる治療薬剤である。いくつかの実施形態において、前述注入は、局所注射、局所注入または静脈内注入、局所注入または局所注射である。いくつかの実施形態において、前述薬剤は、肝臓への局所注射、例えば、肝動脈注入に適した剤形である。いくつかの実施形態において、前述薬剤は、筋肉内注射に適した剤形である。いくつかの実施形態において、前述薬剤は、静脈内注射に適した剤形である。

キット
本出願はまた、前述のａｒＲＮＡ、前述のａｒＲＮＡをコードする前述の構築物、または前述の製剤を含む、標的細胞内の標的ＲＮＡを編集するためのキットを提供する。このキットは、標的細胞に転写されたＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異部位を含む標的ＲＮＡのターゲティング編集に使用できる。

いくつかの実施形態において、前記キットは、前述のａｒＲＮＡまたは前述のａｒＲＮＡをコードする構築物、及び染色助剤を含み、前記ａｒＲＮＡまたは構築物及び染色助剤は、それぞれ異なる容器に入れられている。いくつかの実施形態では、前記染色助剤は脂質溶液である。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＬｉｐｏ（ｌｉｐｏｆｅｃｔｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸカタログ番号：１３７７８１５０）またはそれと同じ機能成分を持つ試薬である。

いくつかの実施形態では、前記キットは、キットに含まれる様々な成分及びそれらの含有量、ならびに／またはキットを使用する方法をユーザーに示すための取扱説明書をさらに含む。

治療
本出願はさらに、個体のムコ多糖症ＩＨ型を治療する方法を提供し、前述の方法、例えば、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異などの、個体の細胞におけるＩＤＵＡ遺伝子のＧからＡへの突然変異を修正することを含む。いくつかの実施形態では、疾患はハーラー症候群を含む。いくつかの実施形態では、前記個体がヒトである場合、ａｒＲＮＡの使用頻度が≧２１日／回、≧１７日／回、≧１４日／回、または≧１０日／回である。いくつかの実施形態では、前記個体がマウスである場合、ａｒＲＮＡの使用頻度が≧８日／回である。いくつかの実施形態において、前記治療は、ａｒＲＮＡをコードする構築物を使用し、前記構築物は、ａｒＲＮＡをコードする配列を標的細胞に組み込むことができる場合、前記ａｒＲＮＡは、１回だけ使用される。

本願で提供されるＬＥＡＰＥＲ技術を使用してＲＮＡをターゲティング編集する方法には、次の利点がある。
１．この方法は外因性タンパク質の発現に依存しないため、タンパク質の分子量が大きすぎることからウイルスベクターを介してパッケージ及び人体に送達することは難しくはない。外因性タンパク質の過剰発現によるオフターゲット効果はない。外因性タンパク質の発現によって引き起こされる生体の免疫応答や損傷を引き起こすことはない。また、生体内に存在する抗体による外因性編集酵素やエフェクタータンパク質の中和によって遺伝子編集が失敗することはない。
２．本願で提供される酵素指向の部位特異的ＲＮＡ編集方法は、可逆的で制御可能である点でＤＮＡ編集とは異なる。アミノ酸コドンを再コード化することで疾患を治療することができ、タンパク質及びＲＮＡの機能を研究することができる。ＲＮＡ編集の潜在的な副作用は可逆的であるため、より安全である。
３．従来技術と比較して、この方法は、ａｒＲＮＡの化学合成後のエレクトロトランスフェクションまたはリポフェクションによって完了することができるだけでなく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びレンチウイルスなどのベクターを介して患者に送達して機能させることもできる。これにより、送達方法の選択がより柔軟になり、編集がより効率的になる。

本発明の好ましい実施形態は、以上で詳細に説明されてきたが、本発明はそれに限定されない。本発明の技術構想の範囲内で、他の適切な方法で様々な技術的特徴を組み合わせるなど、本発明の技術案に対して様々な簡単な変形を行うことができる。これらの簡単な変形及び組み合わせもまた、本発明によって開示される内容と見なされるべきであり、すべてが本発明の保護範囲に属する。

以下、本発明の技術案は、具体的な実施例によりさらに詳細に説明されるが、本発明は、以下の実施例に限定されない。特に断りのない限り、下記の試薬は市販されている。簡潔にするために、いくつかの操作は、使用されるパラメータ、ステップ、及び機器を詳述しておらず、これらは、当業者によってよく知られており、再現可能であることを理解されたい。本明細書で使用されている細胞（ＧＭ０６２１４）は、米国のＣｏｒｉｅｌｌ社から購入し、ハーラー症候群の患者に由来する線維芽細胞である。編集用のａｒＲＮＡは米国のＳｙｎｔｈｅｇｏ社または蘇州ＢＩＯＳＹＮＴＥＣＨ社によって合成され、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングは北京ＲｕｉＢｉｏｔｅｃｈ社によって完了され、次世代シーケンシングは北京Ｎｏｖｏｇｅｎｅ社または中国科学院イネ研究所のシーケンシングプラットフォームによって完了された。

実施例１：ＧＭ０６２１４変異遺伝子型の検出
ＧＭ０６２１４細胞（ハーラー症候群（Ｈｕｒｌｅｒｓｙｎｄｒｏｍｅ）患者由来線維芽細胞）を、１５％血清を含む線維芽細胞培養培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＦＭ培地、カタログ番号：２３０１）に入れ、１％線維芽細胞増殖サプリメント（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＧＦＳ、カタログ番号：２３０１）を添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで２～３日間培養した。細胞のコンフルエンスが９０％に達したら、０．２５％のトリプシンで消化し、１５％の血清を含む線維芽細胞培地で消化を停止させた。ＤＮＡ抽出は、ＴｉａｎＧｅｎｅ（登録商標）（ＴＩＡＮＧＥＮＢｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）細胞ＤＮＡ抽出キット（カタログ番号：ＤＰ３０４－０３）を使用して、取扱説明書に従って実施した。

ＮＣＢＩ－Ｐｒｉｍｅｒｂｌａｓｔ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／）を使用して、ＩＤＵＡ変異部位の上流及び下流配列のプライマーを設計した。配列番号１：ＣＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＣ（フォワードプライマーｈＩＤＵＡ－Ｆ１）；配列番号２：ＣＴＣＧＣＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧ（リバースプライマーｈＩＤＵＡ－Ｒ１）。ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングにかけた。図１に示すように、細胞の変異型は、ＩＤＵＡゲノムの１５７０４位でＧがＡに変化した病原型であると判断された。

実施例２：ＧＭ０６２１４細胞のエレクトロトランスフェクション条件のスクリーニング
ＧＭ０６２１４細胞が約９０％のコンフルエンスに成長したら細胞を消化し、消化を停止してカウントした。エレクトロトランスフェクション中に、６００万個の細胞を４００μｌのプレミックスエレクトロトランスフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：Ｖ４ＸＰ－３０２４）で再懸濁し、２０μｇのＧＦＰプラスミド（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：Ｖ４ＸＰ－３０２４）を追加し、均一に混合した後、各２０μｌを１つのエレクトロトランスフェクションシステムとして使用し、ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して７つのエレクトロトランスフェクション条件（図２を参照）及び１つの陰性対照を合計８つテストし、各条件で２回繰り返した。エレクトロトランスフェクション後、細胞を１５％血清を含む２ｍｌの線維芽細胞培養液（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＦＭ培地、カタログ番号：２３０１）に迅速に移し、各条件の細胞を２つのウェル（６ウェルプレート）に分けて培養プレートに播種し、細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ₂インキュベーターで培養した。エレクトロトランスフェクションの２４時間後、各エレクトロトランスフェクション条件の２ウェルのうちの１ウェルの細胞を消化し、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。エレクトロトランスフェクションの４８時間後、各エレクトロトランスフェクション条件の２ウェルのうちの他の１ウェルの細胞を消化し、フローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。細胞を得るための最適なエレクトロトランスフェクション条件は、図２に示すように、ＣＡ－１３７群のエレクトロトランスフェクション条件であった。

実施例３：ＧＭ０６２１４細胞におけるａｒＲＮＡのエレクトロトランスフェクション後のＩＤＵＡ酵素活性及び編集効率に関する研究
転写後のＩＤＵＡ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体）及びｍａｔｕｒｅ－ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ）変異部位の上流及び下流配列について、以下のａｒＲＮＡ配列を設計及び合成した。配列番号３：ＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＵＧＵＧＧＵＵＧＣＵＧＵＣＣＡＧＧＡＣＧＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＣＧＡＣＡＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＵＧＣＵＣＣＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＵＵ（Ｐｒｅ－５５ｎｔ－ｃ－５５ｎｔ）；配列番号４：ＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＵＧＵＧＧＵＵＧＣＵＧＵＣＣＡＧＧＡＣＧＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＣＧＡＣＡＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＵＧＣＵＣＣＵＣＡＵＣＵＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＧＵＣＧＣＣＧＣＧＵＧＧＧＧＵＣＧＵＵＧ（ｍ－５５ｎｔ－ｃ－５５ｎｔ）；配列番号５：ＵＡＣＣＧＣＵＡＣＡＧＣＣＡＣＧＣＵＧＡＵＵＵＣＡＧＣＵＡＵＡＣＣＵＧＣＣＣＧＧＵＡＵＡＡＡＧＧＧＡＣＧＵＵＣＡＣＡＣＣＧＣＧＡＵＧＵＵＣＵＣＵＧＣＵＧＧＧＧＡＡＵＵＧＣＧＣＧＡＵＡＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＡＡＡＧＡＡＧＵＧＣ（Ｒａｎｄｏｍ－１１１ｎｔ）。その中で、合成されたａｒＲＮＡの変異部位に対応する塩基がＴからＣに変化し、Ａ－Ｃミスマッチを形成する。合成されたａｒＲＮＡの長さは１１１ｎｔが好ましい。実施例２で得られた最適なエレクトロトランスフェクション条件を使用して細胞をエレクトロトランスフェクトし、エレクトロトランスフェクションの４８時間後、酵素活性アッセイ及び編集効率の検出のために細胞を収集した。

編集効率の検出：
設計及び合成したａｒＲＮＡをＲＮａｓｅフリー水（ＴｒａｎｓＧｅｎ、カタログ番号：ＧＩ２０１－０１）で所定の濃度に溶解し、－８０℃で保存した。ＧＭ０６２１４細胞が約９０％のコンフルエンスに成長したら細胞を消化し、消化を停止してカウントした。１００万個の細胞を取り、２００ｐｍｏｌのａｒＲＮＡを１００μｌの容量までに加え、ＣＡ－１３７条件下でエレクトロトランスフェクトした。エレクトロトランスフェクションの４８時間後、細胞をカウントし、生存率を測定した。細胞をＲＮａｓｅフリーの遠心チューブに移し、遠心分離した後に上清を捨て、ＱＩＡＧＥＮＲＮＡ抽出キットを使用してＲＮＡを抽出した（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４１３４）。取扱説明書に従って、ピペッティングにより０．３５ｍｌのＢｕｆｆｅｒＲＬＴＰｌｕｓを５×１０⁵細胞に加え、均一に混合した（凍結保存した細胞からＲＮＡを直接抽出する場合は、ＰＢＳで１回洗浄することを勧める）。溶解した細胞溶液をｇＤＮＡＥｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラム（ｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ）に加え、８０００ｇ以上で３０秒間遠心分離し、カラムを捨てて液体を残した。７０％エタノールを１倍量加え、ピペッティングで均一に混合し、すぐに次のステップに進んだ。液体をＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で１５秒間遠心分離し、廃液を捨てた。７００μｌのＢｕｆｆｅｒＲＷ１をＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で１５秒間遠心分離し、廃液を捨てた。５００μｌのＢｕｆｆｅｒＲＰＥをＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で１５秒間遠心分離し、廃液を捨てた。５００μｌの８０％エタノールをＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で２分間遠心分離し、廃棄物を捨てた。ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを新しい２ｍｌコレクションカラムに入れ、キャップを開いた状態で最高速度で５分間遠心分離し、カラムを乾燥させた。ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを新しい１．５ｍｌコレクションカラムに入れ、カラムメンブレンの中央に１４μｌのＲＮａｓｅフリー水を滴下し、最高速度で１分間遠心分離してＲＮＡを溶出した。
抽出したＲＮＡの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００）で測定し、１μｇのＲＮＡを逆転写（Ｔｈｅｒｍｏ、逆転写酵素カタログ番号：２８０２５０１３）に使用した。逆転写システムは表１に示すように構成し、６５°Ｃで５分間インキュベートした後、すぐに氷浴で冷却した。インキュベーションを３７℃で５０分間続けた。逆転写酵素を７０°Ｃで１５分間不活性化した。表３に示す条件下で、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲの終了後、２μｌのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動に使用し、電気泳動の結果からＰＣＲ産物の濃度及びバンドのサイズが正しいかどうかを初歩的に確認した。精製後、ＰＣＲ産物についてライブラリーを構築し、次世代シーケンシングに送った。

酵素活性の検出：
ＧＭ０６２１４細胞を消化し、遠心分離し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む２８μｌの１×ＰＢＳに再懸濁し、氷上で３０分間溶解した。次に、２５μｌの細胞溶解物を１９０μｍの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｌ－イズロニダーゼ（４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ－α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含む２５μｌの基質（Ｃａｙｍａｎ、２Ａ－１９５４３－５００、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有、ｐＨ３．５、０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液に溶解）に添加した。暗所で３７℃で９０分間インキュベートした。２００μｌの０．５ＭＮａＯＨ／グリシン溶液（北京化工、ＮａＯＨ、カタログ番号：ＡＲ５００Ｇ；Ｓｏｌａｂｒｉо、Ｇｌｙｃｉｎｅ、カタログ番号：Ｇ８２００）、ｐＨ１０．３を加えて、触媒反応を不活性化した。４℃で２分間遠心した。上清を９６ウェルプレートに移し、ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００機器（ＴＥＣＡＮ）を使用して３６５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの励起波長を使用して蛍光値を測定した。

本願では、酵素活性検出結果のすべてのデータは、ＧＭ０１３２３細胞の酵素活性の倍数として表される。その中で、ＧＭ０１３２３細胞はシャイエ症候群の患者に由来する線維芽細胞である。シャイエ症候群はムコ多糖症の軽度の形態であり、ハーラー症候群よりもはるかに軽度の症状を示す。シャイエ症候群の患者は予後が良くなる傾向があり、寿命は一般的に正常であり、成人期まで生きることができる。シャイエ症候群の患者の線維芽細胞におけるＩＤＵＡ酵素活性は、健康なヒト野生型線維芽細胞の酵素活性の０．３％である。
図３に示すように、結果から分かるように、ａｒＲＮＡがｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）を標的とする場合、より高い酵素活性及び編集効率を示すことができるのに対し、成熟ｍＲＮＡ（ｍａｔｕｒｅ－ｍＲＮＡ）を標的とするａｒＲＮＡは著しく低い酵素活性及び編集効率を示す。したがって、以下の実施例に係るａｒＲＮＡはすべてｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）を標的としている。

実施例４：ＩＤＵＡレポーター細胞株でのａｒＲＮＡのエレクトロトランスフェクション後のＩＤＵＡ標的部位編集効率の検出
図４Ａに示すように、レンチウイルスプラスミド上のｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰタンパク質を発現する配列の間に、ＩＤＵＡ変異部位を有し、且つ上流及び下流にそれぞれ約１００ｂｐの配列を挿入して、プラスミドを構築した。上記のように構築されたプラスミドをウイルスにパッケージし、２９３Ｔ細胞に感染し、ゲノムに組み込んた後、ＩＤＵＡ－レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）モノクローナル細胞をスクリーニングした。このモノクローナル細胞は、挿入配列のＩＤＵＡ変異部位のＴＡＧ終止コドンの影響を受けるため、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のみを発現するが、細胞をａｒＲＮＡで編集すると、ＴＡＧ－＞ＴＧＧが発生し、その後にあるＧＦＰタンパク質を正常に発現させることができる。ＧＦＰタンパク質の発現は、ａｒＲＮＡで細胞を編集する編集効率と見なすことができる。以下の表４に示すように、５１ｎｔから１１１ｎｔまでの長さが異なる４つのａｒＲＮＡを好ましく設計し、細胞について実施例２のエレクトロトランスフェクション条件で異なる長さのａｒＲＮＡをエレクトロトランスフェクトした後、それぞれ１日目から７日目に細胞内のＧＦＰの比率を検出し、編集効率を初歩的に検出した。図４Ｂから分かるように、編集効率が最も高い配列は９１ｎｔ：４５－ｃ－４５であり、編集の最高ピークは２日目（４８時間）に現れた。ａｒＲＮＡの長さに関しては、配列が長いほど編集効率が高くなるわけではないことがわかる。

実施例５：ＧＭ０６２１４細胞に対する異なる長さのａｒＲＮＡのエレクトロトランスフェクション後の異なる時点での細胞内ＩＤＵＡ酵素活性及び細胞内ＲＮＡ編集効率の検出
実施例２のエレクトロトランスフェクション条件を使用して、ＧＭ０６２１４細胞上で異なる長さのａｒＲＮＡをエレクトロトランスフェクトし（表４を参照）、実施例３の方法により、エレクトロトランスフェクションの２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目、及び１４日目に、それぞれ細胞内酵素活性を検出し、２日目と４日目に細胞内ＲＮＡの編集効率を検出した。その結果、図５に示すように、９１ｎｔ：４５－ｃ－４５酵素活性が最も高く、エレクトロトランスフェクション後６日目もＩＤＵＡ酵素活性は高いレベルを維持した。編集効率に関しては、９１ｎｔと１１１ｎｔはほぼ同じ編集効率を示した。

実施例６：ａｒＲＮＡの異なる位置に対応する編集部位Ａの編集効率
長さ１１１ｎｔのａｒＲＮＡを例にすると、変異部位の両端から同時にトランケートし、及び５’または３’末端の両端からトランケートして、ａｒＲＮＡの異なる位置に対応するターゲティング塩基の編集効率を調べた。
この研究では、ａｒＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによって細胞に導入した。まず、ａｒＲＮＡ配列を両端から同時にトランケートして、次にそれらの一端を固定してもう一方の端からトランケートし、以下の表５に示すように、１４のａｒＲＮＡ及び同じ長さの４つのランダム配列を得た。トランスフェクションの４８時間後のＩＤＵＡ酵素活性及びＲＮＡ編集効率の検出から分かるように、８１ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ（配列番号１４）、７１ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ（配列番号１５）、９１ｎｔ：４５ｎｔ－ｃ－４５ｎｔ（配列番号９）、９１ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ（配列番号１３）、１０１ｎｔ：４５ｎｔ－ｃ－５５ｎｔ（配列番号１７）は、図６に示すように、検出された配列において、ＩＤＵＡ酵素活性及びＲＮＡ編集効率が他の配列よりも優れている。

実施例７：編集効率に対するターゲティング塩基の３’端からの長さの影響
実施例６では、８１ｎｔ：５５－ｃ－２５、７１ｎｔ：５５－ｃ－１５配列において、高いＩＤＵＡ酵素活性及び編集効率が検出された。最短で最適な３’末端からの長さを見つけるために、表６に示すように、３’末端のターゲティング塩基からの２５ｎｔ（８１ｎｔ：５５－ｃ－２５）から１０ｎｔ（６６ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ）までの配列を１つずつトランケートした。最後に、図７Ａに示すように、ＩＤＵＡ酵素活性アッセイによってスクリーニングされた３’末端からのターゲティング塩基の最適な長さは２４ｎｔ－１１ｎｔであった。また、比較すると分かるように、８０ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－２４ｎｔ（配列番号２２）、７９ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－２３ｎｔ（配列番号２３）、７２ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ（配列番号３０）、７０ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ（配列番号３１）、６７ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔ（配列番号３４）は、配列番号１４及び配列番号１５と同等またはより高いＩＤＵＡ酵素活性をもたらす可能性がある。

さらに、マウスＩＤＵＡ変異部位（ヒトＩＤＵＡ－Ｗ４０２Ｘ変異に対応する変異部位）を標的とするａｒＲＮＡにおいて、３’末端からのターゲティング塩基の最適な長さのスクリーニングをした。表７に示すように、ａｒＲＮＡの３’からのターゲティング塩基の長さは５５ｎｔから、５塩基ごとにトランケートした。図７Ｂに示すように、ＩＤＵＡ酵素活性アッセイによってスクリーニングされたマウスの３’末端からのターゲティング塩基の長さは５５ｎｔ－１０ｎｔであり、最適な長さは５５ｎｔ－１０ｎｔであった。その中で、１１１ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－５０ｎｔ（配列番号４４）及び６６ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ（配列番号５２）は比較的優れた編集効率を示した。

実施例８：編集効率に対する５’端の長さの影響
異なる長さの２つのａｒＲＮＡ：７６ｎｔ：５５－ｃ－２０、７１ｎｔ：５５－ｃ－１５を選択し、表８に示すように、３’末端の固定長に基づいて、５’末端は徐々にトランケートされた。ＩＤＵＡ酵素活性実験により測定した結果、５’末端の長さが５５ｎｔから４５ｎｔの場合、ａｒＲＮＡで編集した細胞のＩＤＵＡ酵素活性が高く、ａｒＲＮＡの全長は、図８Ａに示すように、ＩＤＵＡ酵素活性が６５ｎｔから６１ｎｔの間に顕著な減少があった。図８Ｂに示すように、３’末端の長さが１４ｎｔに固定されている場合、５’末端の長さは５１ｎｔ（すなわち、全長は６６ｎｔ）から塩基が１つずつトランケートされ、５’末端の長さは５１ｎｔから５０ｎｔ（すなわち、全長は６５ｎｔ）にトランケートされたとき、ＩＤＵＡ酵素活性が大幅に低下したため、５’末端でのａｒＲＮＡのトランケーションでは、ａｒＲＮＡの全長が６６ｎｔ以上である必要がある。

実施例９：編集効率に対するＲＮＡ化学修飾の影響
ＲＮＡ合成時のＲＮＡに対するさまざまな種類の化学修飾は、ＲＮＡの安定性を高め、オフターゲットの可能性を減らすことができる。ＲＮＡに対するより一般的な化学修飾は２’－ＯＭｅ及びチオールである。表８に示すように、７１ｎｔと７６ｎｔとの２つの異なる長さのａｒＲＮＡを選択し、２つの化学修飾の異なる組み合わせを実行した。具体的な修飾方法で表される意味は次のとおりである。
ＣＭ１：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されている。
ＣＭ２：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡである。
ＣＭ３：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣである。
ＣＭ４：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であるとともに、ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されている。
ＣＭ５：ターゲティング塩基、及び５’末端に隣接する５つの塩基、及び３’末端に隣接する５つの塩基を除いて、すべてのヌクレオチドは２’－ＯＭｅによって修飾されるとともに、配列の最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合である。
ＣＭ６：配列の最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されており、最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されている。

ＧＭ０６２１４細胞に、異なるａｒＲＮＡをトランスフェクトして細胞内ＩＤＵＡを編集し、トランスフェクションの４８時間後の細胞をＩＤＵＡ酵素活性アッセイのために収集した。実験結果から見て、図９に示すように、ＣＭ５（５番目の修飾：すべて２’－ＯＭｅ、ターゲティング塩基近傍の１１ｎｔを除く）を除いて、他のいくつかの修飾の組み合わせは、優れた酵素活性を有する。

実施例１０：編集効率に対する化学修飾の影響
本実施例では、ヒトＩＤＵＡの変異部位を標的とする３つの好ましいａｒＲＮＡ及びマウスＩＤＵＡの変異部位を標的とする１つの好ましいａｒＲＮＡを使用して、ＣＭ１法の化学修飾法を使用して、ＧＭ０６２１４細胞及びＭＳＰＩＭＥＦ（ＭＳＰＩマウス胚線維芽細胞（ＭＳＰＩｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＭＥＦ）、ＩＤＵＡホモ接合変異胎児マウス（ｉｄｕａＷ３９２Ｘマウス、Ｂ６．１２９Ｓ－Ｉｄｕａ^tm1.1Kmke／Ｊ）から単離された）（ＷａｎｇＤ，ＳｈｕｋｌａＣ，ＬｉｕＸ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎＭＰＳＩ－Ｈｋｎｏｃｋ－ｉｎｍｏｕｓｅｔｈａｔｃａｒｒｉｅｓａｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｏｇｏｕｓｔｏｔｈｅｈｕｍａｎＩＤＵＡ－Ｗ４０２Ｘｍｕｔａｔｉｏｎ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎａｐｐｅａｒｓｉｎＭｏｌＧｅｎｅｔＭｅｔａｂ．２０１０Ａｐｒ；９９（４）：４３９］．ＭｏｌＧｅｎｅｔＭｅｔａｂ．２０１０；９９（１）：６２－７１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２００９．０８．００２））細胞において濃度勾配実験を実施した。

実施例７の実験結果から、ヒトＩＤＵＡを標的とする、長さがそれぞれ５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔである３つのａｒＲＮＡ、及びマウスＩＤＵＡを標的とする１つのａｒＲＮＡ：５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔを選択した。さらに、ランダムａｒＲＮＡ配列ＲＭ－６７ＣＭ１を対照として選択した。実施例９から、表９に示すように、ＣＭ１（すべてｕ：２’－ＯＭｅ）の化学修飾を選択して、ＩＤＵＡを標的とする上記のａｒＲＮＡを合成した。ヒトＧＭ０６２１４細胞及びＭＳＰＩマウスＭＥＦ細胞でａｒＲＮＡ濃度勾配トランスフェクションを行った。ａｒＲＮＡ濃度は、１６０ｎＭ、８０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、及び０．６２５ｎＭで、合計９つの濃度であった。細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、プレーティングの２４時間後にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に細胞を消化し、細胞の半分をＩＤＵＡ酵素活性検出用に採取し、細胞の半分をＲＮＡ編集効率検出用に抽出した。図１０Ａ及び１０Ｃに示すように、酵素活性検出の結果は、ａｒＲＮＡのトランスフェクション濃度が≧２．５～５ｎＭの場合、より高い酵素活性を達成でき、≧１０～２０ｎＭの場合、その酵素活性はプラトーに達し、また、図１０Ｂと１０Ｄに示すように、同じ濃度のａｒＲＮＡを同時にヒト細胞（ＧＭ０６２１４）及びマウス細胞（ＭＳＰＩＭＥＦ）にトランスフェクトすると、生成されたＩＤＵＡ酵素活性及び編集効率が異なった。

実施例１１：ａｒＲＮＡ編集後のＩＤＵＡはプロテアーゼ活性を維持可能
この実験では、ヒトＩＤＵＡの変異部位を標的とする３つの好ましいａｒＲＮＡ及びマウスＩＤＵＡの変異部位を標的とする１つの好ましいａｒＲＮＡを使用し、ＣＭ１方式で化学的に修飾し、ＧＭ０６２１４細胞とＭＳＰＩＭＥＦ（マウス胚線維芽細胞）細胞で有意に増加したＩＤＵＡ酵素活性が得られ、約３週間以上持続した。

実施例１０では、ヒト及びマウスの好ましいＩＤＵＡターゲティングａｒＲＮＡのさまざまな濃度でのトランスフェクションの４８時間後の比較を行った。この実施例では、２０ｎＭの濃度を選択してさまざまな時間でＩＤＵＡ酵素活性及び編集効率によって比較した。図１１Ａに示すように、ａｒＲＮＡをＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトした後、１４日間ＩＤＵＡ酵素活性を継続的に検出し、トランスフェクション後の酵素活性のピークは４日目から９日目であり、１４日目の酵素活性は２日目よりもまだ高かったので、トランスフェクション後のより長い時点で２日、すなわち、１７日目及び２１日目に検出した。図１０Ａから分かるように、２１日目の酵素活性はトランスフェクション後の１日目よりもまだ高く、酵素活性はＧＭ０１３２３の約６～１０倍であった（図１１Ｂ）。ＭＳＰＩＭＥＦ細胞でのａｒＲＮＡトランスフェクション後、８日間継続的にＩＤＵＡ酵素活性を検出した。図１１Ｃからわかるように、ａｒＲＮＡトランスフェクションの２４時間後、酵素活性は８日目までＧＭ１３２３細胞の約２倍であり、図１１Ｄの編集効率の検出から分かるように、ＩＤＵＡの編集効率は２４時間でピークに達し、その後低下し続けた。

ヒトとマウスのデータを比較することにより、マウスでのａｒＲＮＡの編集ピークはトランスフェクションの２４時間後、ヒトでは４８時間であり、編集後のＩＤＵＡプロテアーゼ活性の持続時間はヒト細胞では２１日を超え、マウスでは８日を超えたことが分かる。

実施例１２：編集効率に対するａｒＲＮＡ送達方法の影響
この実験では、初代培養ヒト及びマウス肝細胞でＬＥＡＰＥＲ技術を使用して野生型ＰＰＩＢ遺伝子座を編集し、さまざまな方法でａｒＲＮＡを送達して、最適な送達方法を選別した。

「ＰＰＩＢ」とは、ヒトＮＭ＿０００９４２（ＰＰＩＢＧｅｎｏｍｉｃｃｈｒ１５（－）：６４１６３０８２）ＵＴＲ領域野生部位またはマウスＮＭ＿０１１１４９（ＰＰＩＢＧｅｎｏｍｉｃｃｈｒ９（＋）：６６０６６４９０）ＵＴＲ領域野生部位を指し、成熟ｍＲＮＡであってもよいし、前駆体ｍＲＮＡであってもよい。ＰＰＩＢのＵＴＲセグメントにひとつのＴＡＧがある。この実施例では、前記ＴＡＧ中のＡを標的として編集し、肝細胞における本願のａｒＲＮＡの編集効率を測定した。

表１１に示すように、ＰＰＩＢＵＴＲ領域を標的とするａｒＲＮＡ（５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ）を設計及び合成した。合成したａｒＲＮＡの一部を溶解して分けて包装し、Ｌｉｐｏ（ｌｉｐｏｆｅｃｔｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ）のトランスフェクションのために－８０°Ｃで保存し、残りはＬＮＰにパッケージした。ＬＮＰのパッケージング方法について、参考文献に記載の方法を参照されたい（参考文献：ＷｉｔｚｉｇｍａｎｎＤ，ＫｕｌｋａｒｎｉＪＡ，ＬｅｕｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒ［Ｊ］．ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ，２０２０．；ＫａｕｆｆｍａｎＫＪ，ＤｏｒｋｉｎＪＲ，ＹａｎｇＪＨ，ｅｔａｌ．ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｆｏｒｍＲＮＡｄｅｌｉｖｅｒｙｉｎｖｉｖｏｗｉｔｈｆｒａｃｔｉｏｎａｌｆａｃｔｏｒｉａｌａｎｄｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｄｅｓｉｇｎｓ［Ｊ］．Ｎａｎｏｌｅｔｔｅｒｓ，２０１５，１５（１１）：７３００－７３０６．；ＲｅｉｓＪ，ＫａｎａｇａｒａｊＳ，ＦｏｎｓｅｃａＡ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｔｒｏｓｔｕｄｉｅｓｏｆｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ／ｕｌｔｒａｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｗｉｔｈｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅＭＧ６３ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＢｒａｚｉｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，４３（５）：４７６－４８２．）。

ヒト肝臓初代細胞はＬＯＮＺＡ（カタログ番号：ＨＵＣＰＩ）から購入し、製造元の説明書に従って細胞を回復して培養した（回復培地カタログ番号：ＭＣＨＴ５０、プレーティング培地カタログ番号：ＭＰ１００）。細胞が付着した後、肝細胞維持培地５Ｃに変更した（参考文献：ＸｉａｎｇＣ，ＤｕＹ，ＭｅｎｇＧ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，３６４（６４３８）：３９９－４０２）。

マウス肝臓初代細胞は、Ｃ５７ＢＪマウスから分離された（参考文献：Ｃｈａｒｎｉ－ＮａｔａｎＭ，ＧｏｌｄｓｔｅｉｎＩ．ＰｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒＰｒｉｍａｒｙＭｏｕｓｅＨｅｐａｔｏｃｙｔｅＩｓｏｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＳＴＡＲｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０２０，１（２）：１０００８６．）。分離された肝細胞が付着した後、維持培地５Ｃに変更した。

ヒト肝細胞の回復から２４時間後、ａｒＲＮＡの送達を行い、ＬＮＰ及びＬｉｐｏの送達濃度は両方とも２０ｎＭであった。マウス肝細胞の分離培養の２４時間後、ａｒＲＮＡ送達を行い、ＬＮＰ及びＬｉｐｏの送達濃度は両方とも２０ｎＭであった。ヒト及びマウスの肝細胞はそれぞれ、ａｒＲＮＡ送達の２４時間後及び４８時間後にＲＮＡを回収し、編集効率を次世代シーケンシングによって検出した。図１２Ａからわかるように、ヒト肝細胞では、２つの方法でのａｒＲＮＡ送達の４８時間後の編集効率はいずれも２４時間後の編集効率よりも高く、ＬＮＰで送達されたａｒＲＮＡの編集効率は２４時間でＬｉｐｏよりも優れ、４８時間での２つの送達方法の編集効率は近かった。図１２Ｂからわかるように、マウス肝細胞では、２つの方法でのａｒＲＮＡ送達の２４時間後の編集効率は、４８時間後の編集効率よりも高く、Ｌｉｐｏによって送達されたａｒＲＮＡの編集効率は、２４時間及び４８時間では、ＬＮＰによる送達の同時点の編集効率よりも高かった。

したがって、初代肝細胞のＰＰＩＢ部位の編集効率を比較することにより、マウス肝細胞の編集ピークはａｒＲＮＡ送達後２４時間に位置し、ヒト肝細胞の編集ピークは４８時間に位置すると結論付けることができる。これは、ヒトＧＭ０６２１４細胞及びマウスＭＳＰＩＭＥＦ細胞のデータと一致していた。ヒト肝細胞におけるａｒＲＮＡの送達では、ＬＮＰはＬｉｐｏの送達に等しいかＬｉｐｏよりも優れていた。マウスの肝細胞におけるａｒＲＮＡの送達では、ＬｉｐｏはＬＮＰの送達よりもはるかに優れていた。

実施例１３：ＬＮＰ送達の編集効率
この実験は、初代培養ヒト及びマウス肝細胞でＬＮＰを使用してＩＤＵＡを送達したａｒＲＮＡがＩＤＵＡに対する編集効率の研究に関する。

表１２に示すように、ヒトＩＤＵＡＣＤＳ領域の野生部位を標的とするａｒＲＮＡを設計及び合成した。図１３に示すように、ヒト及びマウスのａｒＲＮＡ（２０ｎＭ）をそれぞれＬＮＰを介してヒト初代肝細胞及びマウス初代肝細胞に送達し、送達後それぞれ２４時間及び４８時間で編集効率を検出した。この図から分かるように、インビトロでの初代培養肝細胞におけるＩＤＵＡの編集効率の中で、ヒトＩＤＵＡの編集効率は４８時間で約３０％に達することができ、マウスでの最高の編集効率は２４時間で約１５％であった。さらに、ＬＮＰはヒト細胞、特にヒト初代肝細胞でより高い送達効率を達成できることが示されている。

実施例１４：ＭＳＰＩモデルマウスにおけるＩＤＵＡに対するａｒＲＮＡの治療効果
この実験では、ＭＰＳＩモデルマウス（ｉｄｕａＷ３９２Ｘマウス、Ｂ６．１２９Ｓ－Ｉｄｕａ^tm1.1Kmke／Ｊ）を使用した（ＷａｎｇＤ，ＳｈｕｋｌａＣ，ＬｉｕＸ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎＭＰＳＩ－Ｈｋｎｏｃｋ－ｉｎｍｏｕｓｅｔｈａｔｃａｒｒｉｅｓａｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｏｇｏｕｓｔｏｔｈｅｈｕｍａｎＩＤＵＡ－Ｗ４０２Ｘｍｕｔａｔｉｏｎ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎａｐｐｅａｒｓｉｎＭｏｌＧｅｎｅｔＭｅｔａｂ．２０１０Ａｐｒ；９９（４）：４３９］．ＭｏｌＧｅｎｅｔＭｅｔａｂ．２０１０；９９（１）：６２－７１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２００９．０８．００２）。この変異は、ヒトＩＤＵＡ－Ｗ４０２Ｘ変異に対応し、タンパク質合成を早期に終了させ、ハーラームコ多糖症（ＭＰＳＩ－Ｈ）症候群の患者に一般的に存在している。酵素α－Ｌ－イズロニダーゼの欠乏は、このリソソーム蓄積障害を引き起こす。α－Ｌ－イドロニダーゼ活性は、５、１０、及び３０週齢のホモ接合マウスの脳及び肝臓組織では検出されなかった。この突然変異のホモ接合性のマウスは生存可能で生育力があったが、平均寿命は６９週間であった。ホモ接合体は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の尿中排泄の漸進的な増加と、組織内でのＧＡＧの漸進的な蓄積を示した。定常状態のＩｄｕａｍＲＮＡレベルは３０～５０％減少した。組織学的分析は、プルキンエ細胞、延髄ニューロンの細胞質におけるリソソーム貯蔵封入体の進行性の蓄積、及び年齢とともに増加する泡沫状マクロファージ浸潤を示した。レントゲン（X線）写真は、頬骨弓と大腿骨の肥厚が１５週齢で見られ、３５週齢で肥厚の増加を示した。３５週齢では、大腿骨の骨密度が増加し、体脂肪率が低下した。スクリーニングしたマウス変異ＩＤＵＡを標的とするａｒＲＮＡ：５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔＣＭ１（配列番号５２）をＬＮＰにパッケージ化した。異なる濃度のａｒＲＮＡを尾静脈から注射し、前記異なる濃度はそれぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ；０．５ｍｇ／ｋｇ；２ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇであった。図１４に示すように、投与の２４時間後、ＩＤＵＡ編集効率の検出のためにマウス肝細胞を採取した。投与２４時間後、１０ｍｇ／ｋｇ群で約２％の編集効率が検出された。この実施例の結果は、ＭＳＰＩモデルマウスのＩＤＵＡを標的とするａｒＲＮＡが、インビボで肝細胞の変異ＩＤＵＡ遺伝子の正確な編集を実現し、ＩＤＵＡ変異を修正し、ＭＰＳＩの治療目的を達成できることを証明した。

Claims

ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく標的細胞中の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法であって、前記標的ＲＮＡが、ＩＤＵＡ遺伝子転写物にＧからＡへの突然変異を含むＲＮＡであり、前記方法が、
標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築物または前記ａｒＲＮＡをコードする構築物を前記標的細胞に送達することを含み、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）を脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、
前記方法。
前記ａｒＲＮＡが、標的Ａとペアリングする塩基Ｃ、Ａ、ＵまたはＧを含む、請求項１に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡの長さが約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ、または８１～６６ｎｔである、請求項１または２に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の３’端からの長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、または２４ｎｔ～１１ｎｔである、請求項３に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、または５５ｎｔ～４５ｎｔである、請求項３または４に記載の方法。
前記標的細胞がヒト細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記標的ＲＮＡが、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異部位を含むＲＮＡである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３４を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが、配列番号４４または配列番号５２から選択される配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが化学修飾されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記化学修飾が、２'－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）またはホスホロチオエート修飾を含む、請求項１０に記載の方法。
前記化学修飾が、
配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であること、
配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡであること、
ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣであること、
ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されていること、
最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、及び
最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されていること
から選択される１つまたは複数である、請求項１１に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡをコードする前記構築物が、線状核酸鎖、ウイルスベクター、またはプラスミドである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルス発現ベクターである、請求項１３に記載の方法。
前記送達方法が、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、脂質－ナノ粒子（ｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＬＮＰ）送達または感染である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築物、または前記ａｒＲＮＡをコードする構築物をＬＮＰを介して前記標的細胞に送達する、請求項１５に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡの送達濃度が、２．５以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、または２０ｎＭ以上である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
ＬＥＡＰＥＲ技術を介して標的細胞中の標的ＲＮＡをターゲティング編集するａｒＲＮＡまたはそのコード配列であって、前記ａｒＲＮＡが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４４、または配列番号５２のいずれかを含むか、またはそのいずれかからなる、前記ａｒＲＮＡまたはそのコード配列。
請求項１８に記載のａｒＲＮＡまたはそのコード配列を含むプラスミド、ウイルスベクター、リポソームまたは脂質ナノ粒子。
請求項１８に記載のａｒＲＮＡもしくはそのコード配列、または請求項１９に記載のプラスミド、ウイルスベクター、リポソームもしくは脂質ナノ粒子を含む組成物または生物学的製品。
請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して、個体の標的細胞におけるＭＰＳＩＨ疾患に関連するＧからＡへの突然変異を修正することを含む、前記個体のＭＰＳＩＨを治療する方法。
前記突然変異が、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）突然変異である、請求項２０に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡの使用頻度が≧２１日／回、≧１７日／回、≧１４日／回、または≧１０日／回である、請求項２０または２１に記載の方法。