CN112662674A - 靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用，属于基因编辑技术领域。所述gRNA序列靶向破坏VEGFA基因的的外显子区域，所述gRNA序列的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:5‑21，SEQ ID NO:25‑53中任一所示基础序列，或与所述基础序列相似性≥90％的扩展序列。采用该gRNA序列，特异性靶向破坏VEGFA基因启动子区域而有效降低VEGFA mRNA水平。从而治疗癌症、年龄相关性黄斑变性、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征等有关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用。
背景技术
血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)参与的新生血管信号通路调控多种生物体生理过程及疾病相关信号通路，如从胚胎发育到各个器官、组织的血管新生过程。当特定组织或器官处于缺氧状态时，细胞中VEGFA会被缺氧诱导因子HIF转录因子激活并表达上调，表达上调的VEGFA结合其受体，激活新生血管信号途径，为机体提供养分。而在各种癌症等疾病中，组织均处于缺氧状态，VEGFA都会被显著性上调表达，激活新生血管途径。研究发现，VEGFA相关新生血管信号途径会在各种病理过程中上调，如肺癌、乳腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤等各种癌症病程，以及糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征等各大疾病中VEGF明显上调表达。
已经上市VEGF抗体阿柏西普及正在临床试验的过表达anti-VEGF的药物RGX-314都被用于治疗糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)，视网膜静脉闭塞后斑斑水肿(Macular Edema Following Retinal Vein Occlusion，RVO)、糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)等，且效果较佳。拜耳公司的anti-VEGF阿柏西普(Aflibercept)用于结直肠癌的试验已经处于临床三期，同时用于非小细胞肺癌也处于临床三期试验。基因泰克公司的Anti-VEGF贝伐珠单抗(Bevacizumab)用于治疗结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤母细胞瘤和肾癌等，治疗结肠癌和乳腺癌的临床试验已经进入三期。但频繁玻璃体注射抗体药严重影响病人生活质量，因此开发一款永久性下调VEGFA的药物对于人类健康具有极强的必要性和紧迫性。
年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)已成为全球50岁以上老年人的首要致盲原因，造成不可逆转的视力损伤。AMD分为干性或称萎缩性和新生血管性或称湿性。其中10-15％为新生血管性年龄相关性黄斑变性(neovascular agerelated macular degeneration，nAMD)，是引起视力丧失的最主要原因之一。nAMD患者临床症状为逐渐或突然产生严重视力障碍，眼底出血、渗出并伴有脉络膜新血管生成及黄斑区盘状瘢痕。新生血管性年龄相关性黄斑变性发病始于50岁，在60岁以上老年人群中发病率高达13％。目前研究已证明，nAMD的关键分子机制是视网膜色素上皮细胞(retinalpigment epithelium,RPE)因遗传或外界压力刺激过量表达血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGFA)，从而激活新血管生成信号通路，造成视网膜渗血，严重损伤视力。因此，通过眼部玻璃体注射VEGF抗体药，能够有效抑制视网膜和脉络膜新血管生成和中央视力损伤的恶化。
玻璃体注射VEGF抗体药是目前治疗nAMD效果较好且市场份额最大的治疗方案。然而所有VEGF抗体药均需每隔1-3个月进行玻璃体注射，过于频繁的玻璃体注射以及高昂费用，带给老年人难以承受的术后生活和经济压力。
CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统是目前应用最为广泛的基因编辑技术。现有技术已出现针对VEGFA基因进行基因编辑的CRISPR-Cas基因编辑体系，已尝试了包含多种Cas核酸酶、靶向不同位点的gRNA，付出了许多努力，但目前普遍存在编辑效率较低的问题，难以达到好的治疗效果；另外编辑VEGFA基因后有时还会产生无法预知的毒性。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA，采用该gRNA序列，可特异性靶向破坏VEGFA基因外显子区域而有效降低VEGFA mRNA水平。
本发明提供一种gRNA，所述gRNA为单分子gRNA(sgRNA)，靶向破坏VEGFA基因的外显子区域，所述gRNA的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:5-21，SEQ ID NO:25-53中任一所示基础序列，或与所述基础序列相似性≥90％的扩展序列。
可以理解的，所述扩展序列优选与上述基础序列具有≥95％、≥96％、≥97％或≥98％的序列相似性。
可以理解的，所述gRNA包含与靶序列相同的靶向结构域，以及固定序列结构域(骨架序列)，如图1所示，其中，固定序列结构域按照常规方式设计即可。
本发明gRNA通过靶向结构域和骨架序列足以允许Cas9核酸酶分子靶向VEGFA基因。发明人提供的gRNA发明的核心在于靶向结构域，本领域技术人员可以知道，将本发明的gRNA靶向结构域与任意合适的骨架序列连接后形成的单分子gRNA都可以实现将Cas9靶向至VEGFA的功能，达到本发明的技术效果。
本发明人在前期研究中发现，现有技术针对VEGFA基因进行基因编辑的CRISPR-Cas基因编辑体系，已尝试了包含多种Cas核酸酶、靶向不同位点的gRNA，付出了许多努力，但目前成果并不明显，存在编辑效率较低的问题。本发明人在此基础上，通过大量的实验摸索和筛选，得到的gRNA编辑效率具有显著的提高，且有效地降低VEGFA的表达水平，在用于疾病治疗时能达到更好的效果，并且，本发明的gRNA还具有更高的安全性。
在其中一些实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO:5-21，SEQ ID NO:25-43，SEQID NO:45-52所示序列。采用上述序列作为gRNA的靶向结构域序列，具有较好的编辑效率。
在其中一些实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO:5-21，SEQ ID NO:25-32，SEQID NO:45-52所示序列。采用上述序列作为gRNA的靶向结构域序列，具有最佳的编辑效率。
在一些实施例中，所述gRNA使用SaCas9或SpCas9系统通用的gRNA骨架序列。
在一些实施例中，所述gRNA骨架序列使用SaCas9系统通用的gRNA骨架序列。
在一些实施例中，所述SaCas9系统通用的gRNA骨架序列为5’-GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUU-3’(SEQ IDNO:57)。
在一些实施例中，所述gRNA骨架序列使用SpCas9系统通用的gRNA骨架序列。
在一些实施例中，所述SpCas9系统通用的gRNA骨架序列为5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO:56)。
本发明还公开了一种编辑靶向VEGFA基因外显子区域的gRNA表达载体，包含编码如上述的gRNA的核苷酸序列。
上述表达载体，可表达用于靶向编辑VEGFA基因的gRNA，可以理解的，本领域技术人员可参照常规技术构建。
本发明还公开了一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的组合物，所述组合物包含gRNA系统和Cas9酶系统，所述gRNA系统直接或间接包含上述的gRNA，所述Cas9酶系统直接或间接包含Cas9酶。
可以理解的，上述直接包含gRNA指直接使用gRNA(包括但不限于化学合成的gRNA)进行配制，间接包含gRNA指可通过基因工程的转录等常规手段产生gRNA；同样的，对于直接包含Cas9酶指直接使用纯化的Cas9蛋白进行配制，间接包含Cas9酶指通过基因工程的手段间接产生Cas9酶。
在其中一些实施例中，所述gRNA至少为2条。将Cas9酶与至少2条所述gRNA组合使用来进行基因编辑，或使用它们的编码核酸。进一步地，在其中一些实施例中，所述Cas9酶为SaCas9或SpCas9。
本发明还公开了一种VEGFA基因经过修饰的细胞，将细胞与上述包含gRNA系统和Cas9酶系统的组合物接触，实现VEGFA基因的修饰，即得。
本发明还公开了一种递送包含gRNA系统和Cas9酶系统的上述组合物的递送系统，所述递送系统采用RNP递送、脂质体递送、纳米粒递送、病毒递送中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述递送系统采用病毒递送。进一步地，在其中一些实施例中，所述递送系统采用AAV(腺相关病毒)递送。
本发明还公开了上述的gRNA、上述的gRNA表达载体、上述的组合物、上述的细胞、上述的递送系统在制备治疗下调VEGFA有利的疾病的药物中的应用。例如，在用于制备治疗VEGFA过表达相关疾病的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述下调VEGFA有利的疾病包括：癌症、年龄相关性黄斑变性、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣、卵巢过度刺激综合征。优选年龄相关性黄斑变性(AMD)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA，是基于CRISPR/Cas体系，提供靶向VEGFA基因外显子区域的多条新的gRNA序列，可利用载体递送至细胞后，直接破坏VEGFA基因外显子，降低VEGFA转录水平。可用于治疗VEGFA过表达相关的疾病，或通过将常规VEGFA mRNA水平下调而治疗疾病，包括癌症、年龄相关性黄斑变性、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征等。
2.与现有技术靶向VEGFA基因的编辑系统相比，本发明gRNA的编辑效率显著提高，且更有效地降低VEGFA的表达水平，在用于疾病治疗时能达到更好的效果。
3.进一步地，尤其是本发明的部分gRNA相比靶向临近位点的gRNA取得了预料不到的技术效果。
4.实验表明，本发明的部分gRNA具有更高的安全性。
附图说明
图1为靶DNA-Cas9-gRNA系统示意图；
图2为实施例中部分gRNA在人VEGFA基因上的靶向位置示意图一；
图3为实施例中部分gRNA在人VEGFA基因上的靶向位置示意图二；
图4为实施例中部分gRNA在人VEGFA基因上的靶向位置示意图三；
图5为实施例中部分gRNA在人VEGFA基因上的靶向位置示意图四；
图6示例性地给出了实施例1中部分重组质粒Sanger测序DNA峰图；
其中：A为gRNA#5-2重组质粒Sanger测序DNA峰图，B为gRNA#7-2重组质粒Sanger测序DNA峰图；
图7为gRNA#1、gRNA#2和gRNA#5-2组小鼠体内编辑效率示意图；
图8为gRNA#1、gRNA#2和gRNA#5-2组小鼠Vegfa蛋白表达量示意图；
图9为gRNA#1、gRNA#2和gRNA#5-2组小鼠CNV面积示意图；
图10为gRNA#1体内脱靶效率检测；
图11为gRNA#2体内脱靶效率检测；
图12为gRNA#5-2体内脱靶效率检测；
图13为gRNA#1、gRNA#2和gRNA#5-2组的小鼠体内毒性检测结果；
其中：图13A、13B分别为注射AAV 7天、6周后的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义：
本发明所述的“Cas9”包括但不限于SpCas9、SaCas9、Nme2Cas9、Nme3Cas9、CjCas9、NmCas9、St1Cas9、FnCas9、TdCas9、St3Cas9、GeoCas9、BlatCas9、ScCas9和SmacCas9，它们的融合蛋白，或上述蛋白的突变体。
本实施例所用试剂、材料如无特殊说明，均为市售可得；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
CRISPR基因编辑方法破坏VEGFA基因外显子实验。
本实施例所涉及的限制性内切酶购于NEB公司，小量质粒DNA提取试剂盒与2×Accurate Taq master Mix，基因组DNA提取试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司(Accurate Biotech)，OPTI-MEM、T4 DNA连接酶以及Lipofectamine 2000转染试剂购自Thermo公司。Stbl3感受态细菌购自深圳康体生命科技有限公司。gRNA、PCR与测序所用的引物均由常规方法合成。
一、重组质粒的构建
1.gRNA设计。
首先确定gRNA靶向结构域，即靶向VEGFA基因的区域，本发明靶向VEGFA基因的外显子1和3区域，随即，再根据人VEGFA基因序列，设计靶向结构域长度为17-24nt的gRNA，如下表1所示，并挑选其中部分gRNA进行实验，具体如下表2所示，并以靶向细菌LacZ基因的SaCas9-gRNA序列作阴性对照，如表3所示。
表1.gRNA的靶向结构域序列
表2.gRNA的靶向结构域序列
表3.阴性对照序列
2.构建质粒。
gRNA#1被设计用于在CjCas9体系中编辑VEGFA基因，这里作为本发明的对照组。gRNA#2被设计用于在SpCas9体系中编辑VEGFA基因，作为本发明中的对照。为了与两个对照组比较有效性和安全性，我们使用常规方法将所有gRNAs单独构建在改造后的pX552质粒(Addgene,60958)骨架中，三种Cas9(CjCas9,SpCas9,SaCas9)分别构建为CMV启动表达的单独质粒。
所有gRNAs重组质粒通过酶切pX552，与gRNA靶向序列及对应每种Cas核酸酶的特异性骨架连接而得。CjCas9、SpCas9、SaCas9相对应的gRNA骨架序列依次为：
GUUUUAGUCCCUGAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGC(SEQ ID NO:55)、
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:56)、
GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUU(SEQ ID NO:57)。
其中pAAV-U6-gRNA#1通过GAAA或TGAA接头来连接gRNA#1靶向结构域序列与CjCas9对应的tracrRNA(反式激活crRNA)序列和pre-crRNA(前体CRISPR RNA)序列构建而成。gRNA#2靶向结构域序列以及SpCas9相对应的gRNA骨架构建为pAAV-U6-gRNA#2。而gRNA#3-gRNA#16和gRNA#LacZ分别连接SaCas9所对应的gRNA骨架构建，通过常规方法合成得到gRNA靶序列对应的DNA序列正义链和反义链(正义链的5’-端加caccg，在反义链的5’-端加aaac，反义链的3’-端加C)。
pX551-CMV-CjCas9(Addgene,107035)购买于Addgene；pAAV-CMV-SpCas9通过改造替换pX551(Addgene,60975)中SpCas9原本的pMecp2启动子为CMV启动子；pAAV-CMV-SaCas9来自去除U6-gRNA片段的pX601(Addgene，61591)。由于SaCas9与SpCas9的PAM序列(‘NGG’)和(‘NNGRRT’)部分重叠，因此本发明中部分gRNA序列通用于这两个核酸酶，部分SpCas9对应的pAAV-U6-gRNAs重组质粒gRNA同上的构建方法，将相应gRNA靶向序列及SpCas9对应的gRNA骨架序列连接在改造后的pX552质粒中。
按照以下反应体系，将上述gRNA靶序列对应的DNA序列正义链和反义链分别取2μl混合，加入2μl NEB 10x cuttersmart buffer，14μl H2O在PCR仪内95℃孵育5分钟，随后立刻取出并在冰上孵育5分钟，退火形成含粘性末端的双链DNA。
表4.反应体系
| 反应总体积 | 20μl |
| Oligo-F(100μM) | 2μl |
| Oligo-R(100μM) | 2μl |
| 10×NEB Cutter smart buffer | 2μl |
| 去离子水 | 14μl |
因此按照以下反应体系依次加入酶切后质粒及退火引物，及DNA Ligation KitVer.2.1(TAKARA，6022Q)在PCR仪内16℃孵育1小时，使退火产物与线性化的骨架完成连接，得到不同的pAAV-U6-gRNAs质粒。
表5.反应体系
| 反应总体积 | 6μl |
| 2x SolutionⅠ | 3μl |
| annealed primers | 2μl |
| digested plasmid | 1μl |
3.质粒转化
在超净台内，将全部T4连接的反应产物迅速加入到1管(50微升)大肠杆菌Stbl3感受态细胞内(康体生命，KTSM110L)，随后将其放冰上孵育30分钟。将感受态细胞浸入42℃水浴锅中热击90秒，再放回冰上孵育2分钟。在超净台内，加入400μL不含抗生素的LB培养基，随后将菌液放到细菌摇床内，37℃下200rpm培养复苏45分钟。复苏期间，开启生化培养箱，将含适量氨苄青霉素的LB琼脂平板放入使其干燥。菌液室温12000rpm离心1分钟，吸取移除大部分上清液，保留约50μL后充分重悬沉淀。吸取菌液滴到含氨苄青霉素LB琼脂平板的边缘，使用移液器吸头在平板上划线。随后将平板倒置放入生化培养箱中，继续培养16小时。
4.阳性克隆鉴定。
超净台内使用1-10μl移液器吸头分别挑取7个单克隆到50μl含氨苄青霉素LB培养基中，吹打数次使菌体与LB培养基混匀。吸取2μL菌液加入到菌落PCR反应液(如下表)中，混合均匀后瞬时离心使液体聚集于管底，随后进行PCR反应。剩余菌液置于生化培养箱中继续培养。
表6.反应体系
| 反应总体积 | 30μl |
| 2X Accurate Taq Master Mix(Accurate Biotech，AG11019) | 15μl |
| gRNA-F(每条gRNA特异性正向引物*) | 1μl |
| 改造后的pX552载体反向引物 | 1μl |
| template | 1μl |
| 去离子水 | 12μl |
*每条gRNA特异性正向引物：用于构建pAAV-U6-gRNAs载体时引物退火中的正向引物。
PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，选取电泳条带大小正确、单一、亮度正常的克隆视为阳性克隆。取10μl菌液送Sanger测序。剩余菌液用于质粒提取，操作流程按照Accurate质粒提取试剂盒(Accurate Biotech,AG21001)的说明书，最后用50μl Elution Buffer洗脱。按Qubit4 Fluorometer的操作方法，用Qubit dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen,Q32853)测定浓度。每个质粒选取一个阳性克隆，提供5-10μl用于Sanger测序，测序引物选用通用的U6-Promoter-F(ACGATACAAGGCTGTTAGAG)。重组质粒构建成功。图6示例性地给出了部分测序结果图。
二、检测编辑效率
1.编辑效率的检测。
严格按照Life Tech公司Lipofectamine 2000(Thermo Fisher 11668019)试剂使用步骤，转染HEK293T细胞。转染前一天，将状态良好的HEK293T细胞按1×105/孔接种至24孔板。转染当天，分别取相应体积的重组gRNA质粒500ng加入50μl OPTI-MEM(Thermo，2120588)，各取1μl Lipofactamine 2000加入50μl OPTI-MEM培养基，混匀后室温静置5mins，之后将稀释后的质粒DNA与Lipofactamine2000混匀，室温静置15mins，接着将100μl质粒DNA复合物加入24孔板的每孔细胞中，轻轻晃动培养板混匀。放置37℃培养72h。
转染后72h收集细胞，按照Accurate通用型基因组DNA提取试剂盒(Accurate，AG21009)标准方法提取基因组DNA。用特异性引物扩增gRNA结合位点上下游约800bp的序列。不同gRNA对应的引物不同。序列如下：
表7.各gRNA对应的扩增引物
配制PCR反应体系如下，总体积50μl：
表8.PCR反应体系
| 反应总体积 | 50μl |
| 2x taq master mix | 25μl |
| VEGFA-PCR-F1 | 1μl |
| VEGFA-PCR-R1 | 1μl |
| template | 1μl |
| 去离子水 | 22μl |
1％琼脂糖电泳检测PCR产物，PCR产物进行Sanger测序。测序结果导入TIDE分析网站(https://ice.synthego.com/#/)。所有重组质粒转染HEK293T细胞实验，重复三次。最终获取平均编辑效率，见表9。
表9.各组的基因编辑效率
从上表中可以看出，本发明所设计gRNA中部分能对VEGFA基因进行编辑，与对照gRNA#1组和gRNA#2组相比，本发明的gRNA编辑效率显著性提高。其中编辑效率最高的是gRNA#5系列、gRNA#6、gRNA#7系列、gRNA#9系列、gRNA#15系列，其次为gRNA#10、gRNA#11系列、gRNA#12、gRNA#13。
实施例2
VEGFA-Cas9-gRNA体系调控HEK293T细胞中VEGFA基因转录水平实验。
本实施例所涉及的核酸纯化试剂盒、逆转录试剂盒、2X
Green Pro Taq HSPremix购自湖南艾科瑞生物工程有限公司(Accurate Biotech)，OPTI-MEM以及Lipofectamine 2000转染试剂购自Thermo公司。PCR与测序所用的引物、相关RNA由试剂公司合成。
一、细胞转染。
参照实施例1中质粒转染细胞的步骤，将重组质粒(包括对照质粒)转染HEK293T细胞。转染前一天，将状态良好的HEK293T细胞按1×105/孔接种至24孔板。转染当天，分别取相应体积的重组gRNA质粒500ng加入50μl OPTI-MEM(Thermo，2120588)，各取1μlLipofactamine 2000(Thermo Fisher 11668019)加入50μl OPTI-MEM培养基，混匀后室温静置5mins，之后将稀释后的质粒DNA与Lipofactamine 2000混匀，室温静置15mins，接着将100μl质粒DNA复合物加入24孔板的每孔细胞中，轻轻晃动培养板混匀。培养72h之后收集细胞提取RNA。
二、检测转录水平的改变
1.提取total RNA并且反转为cDNA。
选取所有高编辑效率的重组质粒转染HEK293T细胞72h之后，收集细胞，使用SteadyPure Universal RNA Extraction Kit(Accurate Biotech，AG21017)提取RNA。用QubitTM RNA BR Assay Kit(Thermo Fisher，Q10210)试剂盒测定RNA浓度，接着使用Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II(Accurate Biotech，AG11711)去除基因组gDNA并且逆转录反应，合成cDNA。
2.qPCR检测SaCas9-gRNA和SpCas9-gRNA调控VEGFA基因的转录水平。
使用Accurate SYBR Green Pro Taq HS(Accurate Biotech，AG11701)相对实时定量qPCR检测VEGFA mRNA的相对表达量变化，以GAPDH为内参。引物序列如下表所示。针对每个外显子区域gRNA设计特异性引物，只能扩增野生型的序列，而编辑后的mRNA不能被扩增出来。LacZ组用所有gRNAs特异性引物qPCR检测VEGFA mRNA的相对表达量变化，并且作为阴性对照。
表10.VEGFA mRNA的相对表达量变化引物
表11.qPCR反应体系
| 反应总体积 | 10μl |
| SYBR Green Pro Taq HS | 5μl |
| forward primer/10μM | 0.2μl |
| reverse primer/10μM | 0.2μl |
| 稀释3倍的cDNA | 3μl |
| 去离子水 | 1.2μl |
重组质粒转染细胞、提取RNA、反转合成cDNA以及qPCR均需独立的3次生物性重复实验，通过2-ΔΔCT计算方法获得三次平均结果，结果见下表。
表12.各组基因编辑效率及mRNA的改变
综合上表9编辑效率数据和表12的转录验证数据分析，与对照gRNA#1组和gRNA#2组相比，本发明的gRNA导致细胞中VEGFA基因的转录水平明显降低，显著提高编辑效率。对VEGFA基因编辑效果最好的是gRNA#5系列、gRNA#6、gRNA#7系列、gRNA#9系列、gRNA#15系列，较好的为gRNA#10、gRNA#11系列、gRNA#12、gRNA#13。
本发明人在进行数据分析时发现，gRNA#16系列对VEGFA基因的编辑效果不佳，然而，gRNA#5-gRNA#6、gRNA#12-gRNA#13在基因组上的靶向位置虽与gRNA#16靶向位置很接近(如图2所示)，但令人意外地具有明显增强的编辑效果。包括编辑效率大幅提高，并且编辑后mRNA水平大为降低。联合Cas9进行基因编辑时，gRNA#5-gRNA#6相比gRNA#2也有明显增强的编辑效果。
类似地情况还出现在gRNA#7系列。gRNA#7系列和gRNA#8系列靶向位置接近(如图3所示)，但gRNA#7系列的编辑效果明显更好。
同样，gRNA#9-1、gRNA#9-2、gRNA#9-3相比靶向临近基因组位置的gRNA#3(如图4所示)，具有明显增强的编辑效果。
类似的情况也发生在gRNA#11-1、gRNA#11-2、gRNA#11-3、gRNA#15-1、gRNA#15-2和gRNA#15-3上，上述gRNA相比靶向临近基因组位置的gRNA#14(如图5所示)同样具有明显增强的编辑效果。
上述实验还证实了本发明中对于靶向切割特定位点的一些gRNA，靶向结构域序列长度在17-24nt范围内变化时，对编辑效果的影响并不是很大。
实施例3
小鼠体内的编辑效率和安全性检测。
一、AAV载体构建及AAV病毒包装和纯化。
AAV包装：将AAV8衣壳质粒，pHelper质粒和特异性质粒pX551-CMV-CjCas9(Addgene,107035)、pAAV-U6-gRNA#1、pAAV-CMV-SpCas9、pAAV-U6-gRNA#2、pAAV-CMV-SaCas9、pAAV-U6-gRNA#5-2或pAAV-U6-gRNA#LacZ采用磷酸钙法共转染HEK293T细胞。通过以1:1:1(AAV8衣壳质粒:pHelper质粒:特异性基因质粒)的摩尔比混合室温静置20min后，将复合物加入在HEK293T细胞中培养72小时后，之后用AAV病毒提取和纯化试剂盒(TAKALA,6666,
Purification Kit Maxi)进行分离和纯化。通过ITR引物(5‘-ggaacccctagtgatggagtt(SEQ ID NO:94)和5’-cggcctcagtgagcga(SEQ ID NO:95))qPCR定量病毒载体基因组的数量。
二、小鼠眼底注射和激光诱导视网膜新生血管。
本研究中使用的所有动物的管理、使用和处理均在广州瑞风生物科技有限公司动物护理和使用委员会、眼科学和安全性研究的严格协议所提供的指导下进行。在本研究中，使用特定的雄性8周龄的C57BL/6J小鼠。小鼠维持在12小时亮/暗循环中。
小鼠视网膜下腔注射。将5％水合氯醛(100μL/10g体重)注射到8周龄小鼠的中腹腔麻醉，小鼠彻底麻醉后，依次用美丽多复方托吡卡胺滴眼液和Alcon盐酸丙美卡因滴眼液用于散瞳和局部麻醉，益术康的透明质酸钠涂于小鼠眼球周围提高眼球内部可视化。先用30G尖针头(Hamilton，7803-01)从小鼠角膜边缘1mm处扎孔，接着使用已经连接Hamilton33G平针头(Hamilton，7803-05)的Hamilton 10μL微量注射器(Hamilton，7653-01)，在手术显微镜(Leica Microsystems Ltd.)下将AAV8-CMV-CjCas9和AAV8-gRNA#1视网膜下腔注射各1μL(9×109个病毒基因组)到实验小鼠组#1，AAV8-CMV-SpCas9和AAV8-gRNA#2各1μL(9×109个病毒基因组)到实验小鼠组#2，AAV8-CMV-SaCas9和AAV8-gRNA#5-2各1μL(9×109个病毒基因组)到实验小鼠组#3，AAV8-CMV-SaCas9和AAV8-gRNA#LacZ各1μL(9×109个病毒基因组)到实验小鼠组#4(作为阴性对照组)。视网膜下腔注射分为两批实验，第一批激光造模前6周给药，第二批激光造模前7天给药。
激光诱导脉络膜新生血管。在小鼠视网膜下腔注射7天或6周后，两批给药小鼠同时激光造模。同上文一样的方法麻醉小鼠并且散瞳。使用法国光太Vitra眼底激光治疗仪，激光的参数为波长532nm，光斑尺寸100μm，功率250mW，曝光时间100ms。在视神经附近诱发激光烧伤3-4个光斑。仅将没有视网膜出血且产生气泡的烧伤用于研究。
视网膜血管破裂的定量和定性分析。在激光造模1周后，在室温下用4％多聚甲醛固定眼球1小时，仔细分离去除晶状体、角膜、视网膜等，保留脉络膜并制作脉络膜/RPE铺片。使用isolectin-B4(Thermo Fisher Scientific，I21413，1:100)或者anti-opsinantibody(Millipore,AB5405，1:1,000)，在4℃下对RPE(RPE/脉络膜/巩膜)进行免疫染色过夜。将RPE/脉络膜铺片，并使用荧光显微镜(Eclipse 90i，Nikon)在100×放大倍率下进行可视化。使用Image J软件(1.47v，NIH)检测CNV位点。分析每个眼球3-4个CNV位点的平均。每组由9-10个眼球组成。
体内编辑效率的检测。造模一周后取小鼠眼球，PBS洗涤组织样品。通过在裂解缓冲液(NucleoSpin Tissue，Macherey-Nagel)中涡旋30秒，将视网膜上皮(Retinal pigmentepithelium，RPE)细胞与脉络膜/巩膜分离。部分RPE组织提取基因组DNA进行编辑效率和体内脱靶效率的分析。同时将部分样品组织在120μL细胞裂解缓冲液(CST#9803)中进行裂解，并使用小鼠VEGF Quantikine ELISA试剂盒(MMV00，R&D Systems)测量Vegfa蛋白的量。
体内脱靶效应的检测。小鼠视网膜下腔注射AAV 6周之后，分离眼球，去除角膜、晶状体、视网膜，只保留RPE和脉络膜组织，提取基因组DNA。通过CRISPOR软件预测的offtarget位点，我们挑选top12的位点，以RPE基因组DNA为模板，特异性靶向深度测序，分析每个位点的脱靶率。
数据分析。使用单因素ANOVA和Tukey事后检验。
三、体内编辑效率的检测。
为了检测小鼠组织视网膜上皮细胞(RPE)中编辑效率，视网膜下腔分别注射3个AAV病毒的三组小鼠(每组10只小鼠，20只眼睛)培养6周后，取各组小鼠的眼睛，分别剥离RPE细胞，提取基因组DNA检测编辑效率，结果如图7所示，结果显示，其中CjCas9+gRNA#1、SpCas9+gRNA#2和SaCas9+gRNA#5-2组的RPE中编辑效率依次为：19％、18％、38％。同时通过ELISA测量Vegfa蛋白的量结果如图8所示，从图中可以看出，与体内低编辑效率的CjCas9+gRNA#1、SpCas9+gRNA#2相比，SaCas9+gRNA#5-2注射小鼠6周后，Vegfa蛋白的表达水平降低更加明显，下降40％；
本发明首先分别用不同组合的AAV注射小鼠眼球，6周或7天后进行激光处理诱导脉络膜新生血管模型，然后在激光处理后一周检测CNV面积。将造模后一周的四个实验小鼠组，分别制作脉络膜铺片，Isolectin-B4染色后，定量统计CNV面积，结果如图9所示，其中结果显示与阴性对照相比，三个给药小鼠组分别降低20％、19％和39％。
四、检测体内脱靶效应。
CRISPR/Cas9基因编辑系统用作制药工具，亟需解决的首要问题就是脱靶效率和体内安全性。我们采用技术检测细胞水平的脱靶效应，结果显示，三个给药组CjCas9+gRNA#1(图10)、SpCas9+gRNA#2(图11)和SaCas9+gRNA#5-2(图12)，均没有检测到频率大于0.1％的Cas9诱导的插入缺失，表明在测序错误率以外没有诱导脱靶突变。各个脱靶位点的突变频率如图10-12所示。
五、小鼠体内长期的安全性检测
已有研究表明，条件性敲除RPE细胞中的Vegfa基因会导致视网膜中锥体功能障碍，因此本发明重点检测RPE细胞中由AAV诱导的基因敲除引起的毒副作用的原因。我们检测视网膜下腔注射AAV病毒7天后和6周后两个时间点，剥离视网膜组织并且制作冰冻切片，用opsin抗体染色，显微镜下测量视网膜中视蛋白阳性位点的尺寸。结果如图13A所示，结果表明，AAV注射7天后，与阴性对照相比，CjCas9-gRNA#1导致小鼠视网膜视蛋白区域一定程度的减小，其余两组与对照组差异不大。
然而AAV在小鼠中注射6周后，与阴性对照相比，CjCas9+gRNA#1和SpCas9+gRNA#2处理过的视网膜中，视蛋白区域尺寸分别减小了31％和18％，结果见图13B。然而，本发明中SaCas9+gRNA#5-2并不诱导锥体功能障碍。
以上结果表明，本发明中的SaCas9+gRNA#5-2在小鼠体内有更高的有效性和安全性。
根据CjCas9+gRNA#1和SpCas9+gRNA#2在体内长期表达后的毒性结果，推测由于gRNA#1诱导切割VEGFA基因之后，可能产生一种新的起始位点，从而翻译为新的蛋白，在体内长期表达后，导致视网膜的正常功能紊乱。
gRNA#2和gRNA#5-2切割VEGFA之后，由于切割方式和切割位点的不同，最终可能产生不同长度、不同序列的新的氨基酸链。gRNA#2在体内编辑VEGFA基因后，体内很可能产生了新的突变氨基酸链，该突变氨基酸链影响了视网膜的正常功能和结构。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州瑞风生物科技有限公司
<120> 靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用
<160> 93
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agucgcgcug acggacagac ag 22
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cuccuggaag auguccacca 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acuccuggaa gauguccac 19
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gguacuccug gaagaugucc ac 22
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<212> RNA
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ggguacuccu ggaagauguc cac 23
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<212> RNA
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aggguacucc uggaagaugu ccac 24
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<212> RNA
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gacccuggug gacaucuucc 20
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<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaagccggg cucaugg 17
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<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggaagccgg gcucaugg 18
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> RNA
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cucggaagcc gggcucaugg 20
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gcucggaagc cgggcucaug g 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgcucggaag ccgggcucau gg 22
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<212> RNA
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<400> 20
gcgcucggaa gccgggcuca ugg 23
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<212> RNA
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<400> 21
ggcgcucgga agccgggcuc augg 24
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agcccggcuu ccgagcg 17
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
guccaugagc ccggcuuccg agcg 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggagcccgc gcccggagg 19
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<211> 20
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gggccggagc ccgcgcccgg agg 23
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<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggggccggag cccgcgcccg gagg 24
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cugcugcaau gacgagggcc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcugcugca augacgaggg cc 22
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<212> RNA
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ggggcugcug caaugacgag ggcc 24
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<212> RNA
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gauguccacc agggucucga 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaggaguac ccugaugaga 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcaucgcau caggggcaca 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggccuggagu gugugcccac ug 22
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggccuggag ugugugccca cug 23
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<212> RNA
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agggccugga gugugugccc acug 24
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cuuccaggag uacccugaug aga 23
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<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gcgattaagt tgggtaacgc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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guuuuagucc cugaagggac uaaaauaaag aguuugcggg acucugcggg guuacaaucc 60
ccuaaaaccg c 71
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<211> 76
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugc 76
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca aaaugccgug uuuaucucgu 60
caacuuguug gcgagauuuu u 81
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtcgaggaa gagagagacg 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggtaccc tcccacctag 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcatccagc ttcccaaaca 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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ggcgagctac tcttcctccc c 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttcggaggc ccgaccgggg 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
catctctcct atgtgctggc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agctactgcc atccaatcga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggagtacc ctgatgagat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgatgttgga ctcctcagtg 20
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gtgcccctga tgcgatgcgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctggcctt ggtgaggttt 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggagtgtg tgcccactga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
actcctcagt gggcacacac 20
Claims (10)
1.一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA，其特征在于，所述gRNA序列靶向破坏VEGFA基因的的外显子区域，所述gRNA的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:5-21，SEQ ID NO:25-53中任一所示基础序列，或与所述基础序列相似性≥90％的扩展序列。
2.根据权利要求1所述的靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO:5-21，SEQ ID NO:25-43，SEQ ID NO:45-52任一所示序列。
3.根据权利要求1所述的靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO:5-21，SEQ ID NO:25-32，SEQ ID NO:45-52任一所示序列。
4.一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA表达载体，其特征在于，包含编码如权利要求1-3任一项所述的gRNA的核苷酸序列。
5.一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的组合物，其特征在于：包含gRNA系统和Cas9酶系统，所述gRNA系统直接或间接包含权利要求1-3任一项所述的gRNA，所述Cas9酶系统直接或间接包含Cas9酶。
6.根据权利要求5所述的靶向编辑VEGFA基因外显子区域的组合物，其特征在于：所述gRNA至少为2条。
7.一种VEGFA基因经过修饰的细胞，其特征在于，将细胞与包含权利要求5或6所述的组合物接触，实现VEGFA基因的修饰，即得。
8.一种递送权利要求5所述组合物的递送系统，所述递送系统采用RNP递送、脂质体递送、纳米粒递送、病毒递送中的至少一种。
9.权利要求1-3中任一项所述的gRNA、权利要求4所述的gRNA表达载体、权利要求5-6中任一项所述的组合物、权利要求7所述的细胞、权利要求8所述的递送系统在制备治疗下调VEGFA有利的疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括：癌症、年龄相关性黄斑变性、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征。
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