KR20180104692A - Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 - Google Patents

Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 Download PDF

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Abstract

특정 양태에서, 본원은 ANGPT2 및/또는 PDGFB 발현을 억제하여, 암, AMD, 및 DME와 같은 혈관신생 관련 질환을 치료하는데 유용한 RNA 복합체(예를 들어, asiRNA 또는 세포 침투성 asiRNA와 같은 비대칭 RNA 복합체)를 제공한다.

Description

ANGPT2 및 PDGFB를 표적화하는 RNA 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료
연관 출원
본 출원은 2016년 2월 2일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/290,330호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
배경
혈관신생은 새로운 혈관의 성장을 설명하기 위해 사용되는 용어이다. 혈관의 성장 및 증식은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 일 예가 종양 발달이며, 종양 내에서 혈관의 발달은 종양이 산소 및 영양소에 대한 접근 증가를 통해 성장하게 하며, 종양 생존을 증가시키고, 종양 전이를 가능하게 한다. 혈관신생을 표적화하는 것은 암을 치료하기 위한 유망한 경로이다.
눈에서의 혈관신생은 일반적으로 눈에 대한 충분한 산소 및 다른 필요 영양소의 공급 및 정상 조직의 발달에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 과도하고 비정상적인 혈관 발달이 발생할 때에는, 습성 노인성황반변성(wet age-related macular degeneration)(wet AMD) 및 당뇨병성황반부종(diabetic macular edema)(DME)과 같은 안질환이 유발될 수 있으며, 일부 경우에는 실명도 야기될 수 있다.
노인성황반변성(AMD)은 눈의 황반에서 망막 색소침착 상피 내벽의 변성으로부터 야기되는 질환이며, 이는 시력 상실을 야기한다. 황반은 눈 뒤쪽의 감광성 조직 내벽으로 이루어진 망막 내의 작은 부분이며, 중심 시력에서 중요한 역할을 한다. AMD는 전세계적으로 실명의 주된 원인 중 하나이다. AMD는 "습성" 및 "건성" 형태로 발생한다. 습성 AMD는 망막에서의 비정상적인 혈관 성장의 결과이다. 습성 AMD에서, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)(VEGF)의 증가된 양은 이 신생 혈관 형성에 기여하므로, 치료 옵션은 VEGF 억제제의 사용을 포함한다. 그러나, VEGF 억제제로 치료된 많은 환자가 치료 수년 이내에, 후기 건성 황반변성의 주요한 증상인 지도모양 위축(geographic atrophy)(GA)을 나타낸다. 당뇨병성황반부종(DME)은 황반 내의 혈관으로부터의 유체 누출로 인해 당뇨병에서의 망막의 팽창으로부터 야기되는 질환이다. 당뇨병 환자에서 좋지 않은 혈액 순환은 황반에서 새로운 혈관 발달을 가속화할 수 있으며, 망막 부종은 두꺼운 또는 약한 벽을 갖는 혈관의 누출로부터 야기될 수 있다. DME는 당뇨병을 앓는 환자에서 실명의 주된 원인이며, 당뇨병 환자 중 10%가 황반 부종을 앓고 있다.
요약
특정 양태에서, 본원은 ANGPT2(Angiopoietin(안지오포이에틴) 2) 또는 PDGFB(Platelet Derived Growth Factor Beta(혈소판 유래 성장 인자 베타))를 표적화하고, AMD(예를 들어, 습성 AMD), DME, 및 암과 같은 혈관신생 관련 질환을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 RNA 복합체를 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 혈관신생을 억제하는 RNA 복합체를 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 상기 RNA 복합체를 포함하는 약학 조성물 및 상기 RNA 복합체 및 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 본원은 ANGPT2 또는 PDGFB mRNA 서열에 대해 서열 상보성을 갖는 안티센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥에 대해 서열 상보성을 갖는 센스 가닥을 포함하는 RNA 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 세포에 의한 ANGPT2 또는 PDGFB 발현을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 비대칭 짧은-듀플렉스 소간섭(asymmetric shorter-duplex small interfering) RNA(asiRNA)이다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 열거된 RNA 복합체이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 RNA 복합체는 화학적 변형을 포함하고, 여기서 변형은 전달 비히클의 부재 하에서 세포막의 침투를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 변형은 2'-O-메틸화 뉴클레오시드, 포스포로티오에이트 결합 또는 소수성 모이어티(moiety)이다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 소수성 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 소수성 모이어티는 콜레스테롤 모이어티이다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 표 2, 표 3, 표 5, 또는 표 6에 열거된 변형 RNA 복합체이다. 특정 실시양태에서, RNA 복합체는 세포독성이 아니다.
특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 약학 조성물은 비경구 전달용으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 경구 전달용으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥내 전달용으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 유리체내 전달용으로 제형화된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 점안액으로 제형화된다.
특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 의한 ANGPT2 또는 PDGFB 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 ANGPT2 또는 PDGFB 유전자 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 노인성황반변성, 당뇨병성황반부종, 또는 암과 같은 혈관신생 관련 질환에 대해 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 ANGPT2를 표적화하는 100 개의 예시적 asiRNA의 유전자 침묵 효율을 나타낸다. SK-N-SH 세포는 0.1 nM asiRNA로 형질감염되었다.
도 2는 ANGPT2를 표적화하는 27 개의 예시적 asiRNA의 유전자 침묵 효율을 나타낸다.
도 3은 ANGPT2를 표적화하는 14 개의 예시적 asiRNA의 유전자 침묵 효과를 나타낸다.
도 4는 ANGPT2를 표적화하는 14 개의 예시적 asiRNA에 의한 ANGPT2 단백질 발현의 억제를 나타낸다.
도 5는 다양한 화학적 변형이 적용된 예시적 ANGPT2-표적화 세포-침투성(cell-penetrating) asiRNA(cp-asiRNA, 또는 cp-asiANGPT2)의 유전자 침묵 효율을 나타낸다.
도 6은 예시적 cp-asiRNA에 의한 ANGPT2 mRNA 발현의 억제를 나타낸다.
도 7은 예시적 cp-asiRNA에 의한 ANGPT2 단백질 발현의 억제를 나타낸다.
도 8은 상이한 안티센스 가닥 길이(19 또는 21 뉴클레오티드)를 갖는 6 개의 cp-asiRNA의 유전자 침묵 효율을 나타낸다.
도 9는 6 개의 예시적 cp-asiRNA에 의한 ANGPT2 단백질 발현의 억제를 나타낸다.
도 10은 인간 ANGPT2 변이체 1의 mRNA 서열을 나타낸다.
도 11은 PDGFB를 표적화하는 100 개의 예시적 asiRNA의 유전자 침묵 효율을 나타낸다.
도 12는 PDGFB를 표적화하는 22 개의 예시적 asiRNA의 유전자 침묵 효율을 나타낸다.
도 13은 PDGFB를 표적화하는 12 개의 예시적 asiRNA의 유전자 침묵 효과를 나타낸다.
도 14는 PDGFB를 표적화하는 12 개의 예시적 asiRNA에 의한 PDGFB 단백질 발현의 억제를 나타낸다.
도 15는 예시적 cp-asiRNA에 의한 PDGFB mRNA 발현의 억제를 나타낸다.
도 16은 예시적 cp-asiRNA에 의한 PDGFB 단백질 발현의 억제를 나타낸다.
도 17은 상이한 안티센스 가닥 길이(19 또는 21 뉴클레오티드) 또는 화학적 변형의 11 개의 cp-asiRNA에 의한 PDGFB 단백질 발현의 억제를 나타낸다.
도 18은 인간 PDGFB 변이체 2의 mRNA 서열을 나타낸다.
상세한 설명
일반사항
특정 양태에서, 본원은 ANGPT2 또는 PDGFB를 억제하여, AMD(예를 들어, 습성 또는 건성 AMD), DME, 및 암과 같은 혈관신생 관련 질환의 치료에 유용한 비대칭 RNA 복합체(예를 들어, asiRNA 또는 cp-asiRNA)를 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 화학적으로 변형되어, 형질감염 비히클의 필요 없이 세포를 침투할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 열거된 RNA 복합체이다. 특정 양태에서, 본원은 상기 RNA 복합체를 포함하는 약학 조성물 및 상기 RNA 복합체 및 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNA 복합체는 asiRNA 또는 cp-asiRNA이다. 본원에 사용된 바에 있어서, 용어 asiRNA는 19-21 nt 안티센스 가닥 및 13-17 nt 센스 가닥을 갖는 이중-가닥 비대칭 짧은-듀플렉스 소간섭 RNA 분자를 지칭한다. asiRNA에 대한 추가 정보는 미국 특허 공개 제2012/0238017호 및 Chang et al., Mol . Ther. 17:725-732 (2009)에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNA 복합체는 리포좀, 양이온성 중합체, 세포 침투성 펩티드(cell penetrating peptide)(CPP), 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain)(PTD), 항체 및/또는 앱타머와 같은 전달 비히클을 사용하여 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNA 복합체는 화학적으로 변형되어, 세포에서 ANGPT2 또는 PDGFB 억제를 매개하기 위하여 상기 전달 비히클의 사용을 필요로 하지 않는다. 상기 RNA 복합체는 본원에서 세포-침투성 asiRNA(cp-asiRNA)로 지칭된다.
정의
편의를 위해, 본 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구항에서 사용되는 특정 용어들이 여기에 수집된다.
관사 "하나" 및 "하나의"는 본원에서 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 바에 있어서, 용어 "투여하는"은 약제 또는 조성물을 대상체에게 제공하는 것을 의미하며, 비제한적으로, 전문 의료진에 의한 투여 및 자가-투여를 포함한다.
본원에서 사용된 바에 있어서, 용어 "면역조절제"는 면역 체계를 약화, 자극, 또는 그 외에 조절하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 예는, 비제한적으로, 류코트리엔 수용체 작용제, 면역억제제(예를 들어, FK-506) 또는 사이토카인을 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "간섭 핵산" 및 "억제 핵산"은 상호교환적으로 사용된다. 간섭 핵산은 일반적으로 환형 서브유닛의 서열을 포함하고, 이들 각각은 염기쌍 형성 모이어티가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성에 의해 핵산(전형적으로 RNA) 내의 표적 서열에 하이브리드화되어, 표적 서열 내에서 핵산: 올리고머 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성하게 하는 서브유닛간의 연결에 의해 연결된 염기쌍 형성 모이어티를 보유한다. 간섭 RNA 분자는, 비제한적으로, 안티센스 분자, siRNA 분자, asiRNA 분자, cp-asiRNA 분자, 단일-가닥 siRNA 분자, miRNA 분자 및 shRNA 분자를 포함한다. 상기 간섭 핵산은 mRNA의 번역을 차단 또는 억제하거나, 천연 프리(pre)-mRNA 스플라이스 가공을 억제하거나, 표적화된 mRNA의 분해를 유도하도록 설계될 수 있으며, 그것이 하이브리드화되는 표적 서열을 "향하거나" 또는 "이에 대해 표적화된다"고 지칭될 수 있다. 간섭 핵산은, 예를 들어 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)(PNA), LNA(locked nucleic acid), 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드 및 RNA 간섭제(siRNA 약제)를 포함할 수 있다. RNAi 분자는 일반적으로 표적 분자와 헤테로듀플렉스를 형성함으로써 작용하며, 이는 선택적으로 분해되거나 "녹 다운(knocked down)"되므로, 표적 RNA를 비활성화시킨다. 일부 조건 하에서, 간섭 RNA 분자는 또한 전사물 번역을 억제하고/하거나 전사물의 전사를 억제함으로써 표적 전사물을 비활성화시킬 수 있다. 간섭 핵산은 상기 기재된 방식으로 표적 핵산에 대해 표적화되었을 때, 단백질과 같은 생물학적 관련 표적에 대해 "표적화된다"고 더욱 일반적으로 지칭된다.
용어 "폴리뉴클레오티드", 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용된다. 이들은 뉴클레오티드의 중합 형태를 지칭하는 것으로 임의 조합 및 임의 길이의 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 라벨링 성분과의 콘쥬게이션(conjugation)에 의해 더욱 변형될 수 있다. 본원에서 제공된 모든 핵산 서열에서, U 핵염기는 T 핵염기와 상호교환될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 액체 또는 고체 필러(filler), 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질과 같이, 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 장애 또는 병태를 "예방하는" 치료제는 장애 또는 병태의 개시 전에 통계적 샘플에 투여되었을 때, 미치료된 대조군 샘플에 비해 치료된 샘플에서 장애 또는 병태의 발생을 감소시키거나, 미치료된 대조군 샘플에 비해 장애 또는 병태의 1 이상의 증상의 개시를 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키는 화합물을 지칭한다.
올리고머가 실질적으로 45℃ 초과, 또는 적어도 50℃, 또는 적어도 60℃-80℃ 또는 그 이상인 Tm을 갖는 생리학적 조건 하에서 표적에 하이브리드화되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드에 "특이적으로 하이브리드화된 다". 상기 하이브리드화는 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건에 상응한다. 소정 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열 중 50%가 상보성 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 온도이다. 다시, 상기 하이브리드화는 표적 서열에 대한 안티센스 올리고머의 "인접한" 또는 "실질적인" 상보성, 및 정확한 상보성으로 생길 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "대상체"는 치료 또는 요법을 위해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
본원에 사용된 어구 "치료적 유효량" 및 "유효량"은 임의의 의학적 치료에 대해 적용 가능한 타당한 이득/위험 비로 대상체에서의 세포의 적어도 아집단에서 소망하는 효과를 생성하기에 효과적인 약제의 양을 의미한다.
대상체에서의 질환을 "치료하는 것" 또는 질환을 갖는 대상체를 "치료하는 것"은 대상체가 약학적 치료, 예를 들어 약물의 투여를 받아, 질환의 적어도 하나의 증상이 감소되거나 악화가 예방되는 것을 지칭한다.
RNA 복합체
특정 양태에서, 본원은 각각 ANGPT2, 및/또는 PDGFB mRNA를 표적화하고, 세포에 의한 ANGPT2, 및/또는 PDGFB 발현을 억제하는 RNA 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 A549 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 SK-N-SH 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 인간 ANGPT2 및 PDGFB mRNA의 핵산 서열은 각각 도 10, 및 도 18에 제공된다.
특정 양태에서, 본원은 ANGPT2 및/또는 PDGFB mRNA 서열(예를 들어, 인간 ANGPT2 또는 PDGFB mRNA 서열)에 대한 서열 상보성을 갖는 안티센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥에 대한 서열 상보성을 갖는 센스 가닥을 포함하는 RNA 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 세포에 의한 ANGPT2 또는 PDGFB 발현을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 비대칭 짧은-듀플렉스 소간섭 RNA(asiRNA)이다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 열거된 RNA 복합체이다. 본원에 기재된 RNA 복합체는 RNA 염기, 비-RNA 염기 또는 RNA 염기와 비-RNA 염기의 혼합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 특정 RNA 복합체는 주로 RNA 염기로 구성될 수 있으나, DNA 염기 또는 비-천연 산출 뉴클레오티드 또한 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 19 뉴클레오티드(nt) 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19 내지 21 nt 길이(즉, 19, 20 또는 21 nt 길이)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 적어도 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 nt는 ANGPT2 또는 PDGFB mRNA 서열에 대해 상보성이다. 완벽한 상보성은 필요하지 않다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 ANGPT2 또는 PDGFB mRNA 서열에 대해 완벽히 상보성이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 24 nt 길이(예를 들어, 적어도 25 nt 길이, 적어도 26 nt 길이, 적어도 27 nt 길이, 적어도 28 nt 길이, 적어도 29 nt 길이, 적어도 30 nt 길이 또는 적어도 31 nt 길이)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 124 nt 길이 이하(예를 들어, 100 nt 길이 이하, 90 nt 길이 이하, 80 nt 길이 이하, 70 nt 길이 이하, 60 nt 길이 이하, 50 nt 길이 이하 또는 40 nt 길이 이하)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 31 nt 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 29, 30 또는 31 nt는 ANGPT2 또는 PDGFB mRNA 서열에 대해 상보성이다. 완벽한 상보성은 필요하지 않다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 ANGPT2 또는 PDGFB mRNA 서열에 대해 완벽히 상보성이다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 15 내지 17 nt 길이(즉, 15 nt 길이, 16 nt 길이 또는 17 nt 길이)이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 적어도 15 nt, 적어도 16 nt 또는 적어도 17 nt는 안티센스 가닥의 서열에 대해 상보성이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 서열에 대해 완벽히 상보성이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥의 3' 말단이 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 말단이 센스 가닥의 3' 말단에 오버행(overhang)되는(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 nt 만큼) 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 센스 가닥의 5' 말단이 안티센스 가닥의 3' 말단에 오버행되는(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 nt 만큼) 복합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, RNA 복합체의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 열거된 서열로부터 선택되는 센스 가닥 서열 및/또는 안티센스 가닥 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 RNA 복합체는 화학적 변형을 포함하고, 여기서 변형은 전달 비히클의 부재 하에서 세포막의 침투를 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 변형은 2'-O-메틸화 뉴클레오시드, 포스포로티오에이트 결합, 또는 소수성 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 RNA 복합체는 소수성 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 모이어티는 소수성 특징을 갖는 임의의 화학 구조체일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 소수성 모이어티는 지질, 친유성 펩티드 및/또는 친유성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 소수성 모이어티는 지질, 예컨대 콜레스테롤, 토코페롤, 또는 10 개 이상의 탄소 원자를 갖는 장쇄 지방산(예를 들어, 스테아르산 또는 팔미트산)이다. 일부 실시양태에서, 소수성 모이어티는 콜레스테롤이다. 일부 실시양태에서, 소수성 모이어티는 콜레스테롤 모이어티이다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 표 2, 표 3, 표 5, 또는 표 6에 열거된 변형 RNA 복합체이다. 특정 실시양태에서, RNA 복합체는 세포독성이 아니다.
본원에 기재된 RNA 복합체는 다양한 올리고뉴클레오티드 화학을 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 화학의 예는, 비제한적으로 펩티드 핵산(PNA), LNA(linked nucleic acid), 포스포로티오에이트, 2'O-Me-변형 올리고뉴클레오티드, 및 모폴리노 화학, 및 상기 것들 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 일반적으로, PNA 화학은 2'O-Me 올리고뉴클레오티드에 비해 상대적으로 높은 이들의 표적 결합 강도 때문에, 더 짧은 표적화 서열을 사용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 2'O-Me-변형 화학은 보통 조합되어, 포스포로티오에이트 백본(backbone)을 가진 2'O-Me-변형 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 예를 들어, PCT 공개 WO/2013/112053호 및 WO/2009/008725호를 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
펩티드 핵산(PNA)은 백본이 데옥시리보오스 백본과 구조적으로 동형인 DNA의 유사체이며, 피리미딘 또는 퓨린 염기가 부착된 N-(2-아미노에틸) 글리신 단위체로 구성된다. 천연 피리미딘 및 퓨린 염기를 함유한 PNA는 왓슨-크릭 염기쌍 형성 규칙을 따르는 상보성 올리고뉴클레오티드, 및 염기쌍 인식 면에서 모방 DNA에 하이브리드화된다. PNA의 백본은 포스포디에스터 결합에 비해 펩티드 결합에 의해 형성되어, 이들이 안티센스 적용에 적합하게 한다(하기 구조 참고). 백본은 비하전되어, 정상보다 큰 열 안정성을 나타내는 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 듀플렉스를 야기한다. PNA는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 인식되지 않는다.
천연 구조로의 라디칼 구조 변화에도 불구하고, PNA는 DNA 또는 RNA에 대해 나선형으로 서열-특이적 결합을 할 수 있다. PNA의 특징은 상보성 DNA 또는 RNA에 대한 높은 결합 친화성, 단일-염기 미스매치(mismatch)에 의해 야기된 불안정화 효과, 뉴클레아제 및 프로테아제에 대한 저항성, 염 농도와 무관한 DNA 또는 RNA와의 하이브리드화 및 호모퓨린 DNA와의 트리플렉스(triplex) 형성을 포함한다. PANAGENE.TM.은 그의 독점 Bts PNA 단량체(Bts; benzothiazole-2-sulfonyl group(벤조티아졸-2-설포닐기)) 및 독점 올리고머화 공정을 개발하였다. Bts PNA 단량체를 사용한 PNA 올리고머화는 탈보호(deprotection), 커플링(coupling) 및 캡핑(capping)의 반복적인 사이클로 구성된다. PNA는 당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 인공적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,969,766호, 제7,211,668호, 제7,022,851호, 제7,125,994호, 제7,145,006호 및 제7,179,896호를 참고한다. 또한, PNA의 제조에 대해 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 참고한다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen et al., Science, 254:1497-1500, 1991에서 찾아볼 수 있다. 전술한 문헌의 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
간섭 핵산은 또한 "LNA" 서브유닛을 함유할 수 있다. "LNA"는 가교된 핵산(bridged nucleic acid)(BNA)으로 지칭되는 변형 부류의 멤버이다. BNA는 C3-엔도(북측) 당 푸커(sugar pucker)에서 리보오스 고리의 입체구조를 잠그는 공유 결합이 특징이다. LNA에 대하여, 가교는 2'-O 및 4'-C 위치 사이의 메틸렌으로 구성된다. LNA는 백본 예비조직화 및 염기 중첩을 향상시켜, 하이브리드화 및 열 안정성을 증가시킨다.
LNA의 구조는, 예를 들어 Wengel, et al., Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54:3607, 및 Accounts of Chem . Research (1999) 32:301); Obika, et al., Tetrahedron Letters (1997) 38:8735; (1998) 39:5401, 및 Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16:9230에서 찾아볼 수 있다. 본원에서 제공되는 화합물은 1 이상의 LNA를 포함할 수 있으며; 일부 경우에, 화합물은 완전히 LNA로 구성될 수 있다. 개별 LNA 뉴클레오시드 서브유닛의 합성 및 올리고뉴클레오티드로의 이의 결합을 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제7,572,582호, 제7,569,575호, 제7,084,125호, 제7,060,809호, 제7,053,207호, 제7,034,133호, 제6,794,499호, 및 제6,670,461호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다. 전형적인 서브유닛간 링커(linker)는 포스포디에스터 및 포스포로티오에이트 모이어티를 포함하고; 대안적으로, 비-인 함유 링커가 사용될 수 있다. 일 실시양태는 각각의 LNA 서브유닛이 DNA 서브유닛에 의해 분리된 LNA-함유 화합물이다. 특정 화합물은 서브유닛간 링커는 포스포로티오에이트인 교차하는 LNA 및 DNA 서브유닛으로 구성된다.
특정 실시양태에서, RNA 복합체는 콜레스테롤 모이어티에 연결된다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 모이어티는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 모이어티는 안티센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 모이어티는 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 모이어티는 안티센스 가닥의 5' 말단에 부착된다.
일부 실시양태에서, RNA 복합체는 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함한다. 2'-O-메틸화 뉴클레오시드는 리보오스 분자의 2'-OH 잔기에 메틸기를 수반한다. 2'-O-Me-RNA는 RNA와 동일한(또는 유사한) 거동을 나타내지만, 뉴클레아제 분해로부터 보호된다. 2'-O-Me-RNA는 또한 추가 안정화를 위해 포스포티오에이트 올리고뉴클레오티드(PTO)와 조합될 수 있다. 2'-O-Me-RNA(포스포디에스터 또는 포스포티오에이트)는 당업계의 일반적 기법에 따라 합성될 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Yoo et al., Nucleic Acids Res. 32:2008-16, 2004를 참고한다).
일부 실시양태에서, 2'-O-메틸 뉴클레오시드는 센스 가닥의 3' 말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 말단 영역은 복수의 2'-O-메틸화 뉴클레오시드(예를 들어, 3' 말단의 6 개 뉴클레오시드 중 2, 3, 4, 5 또는 6 개 2'-O-메틸화 뉴클레오시드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸 뉴클레오시드는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단 영역은 복수의 2'-O-메틸화 뉴클레오시드(예를 들어, 3' 말단의 6 개 뉴클레오시드 중 2, 3, 4, 5 또는 6 개 2'-O-메틸화 뉴클레오시드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 말단 영역 및 안티센스 가닥의 3' 말단 영역 둘 다는 복수의 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 비변형 뉴클레오시드와 교번하는 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 비변형 뉴클레오시드와 교번하는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개 2'-O-메틸화 뉴클레오시드의 연속 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 비변형 뉴클레오시드와 교번하는 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 비변형 뉴클레오시드와 교번하는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개 2'-O-메틸화 뉴클레오시드의 연속 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA 복합체는 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. "포스포로티오에이트"(또는 S-올리고(oligo))는 비-가교 산소 중 하나가 황으로 치환된 정상 DNA의 변이체이다. 뉴클레오티드간 결합의 황화는 5'에서 3'으로 및 3'에서 5'으로 DNA POL 1 엑소뉴클레아제, 뉴클레아제 S1 및 P1, RNase, 혈청 뉴클레아제 및 뱀독포스포디에스테라아제를 비롯한 엔도- 및 엑소뉴클레아제의 작용을 감소시킨다. 포스포로티오에이트는 2 개의 주요 경로에 의해(하이드로겐 포스포네이트에 대한 카본 디설파이드 내의 원소 황 용액의 작용에 의해, 또는 포스파이트 트리에스터를 테트라에틸티우람 디설파이드(TETD) 또는 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드(BDTD)로 황화시키는 방법에 의해) 제조된다(예를 들어, Iyer et al., J. Org . Chem. 55, 4693-4699, 1990을 참고한다). 후자의 방법은 대부분의 유기 용매 내에서 원소 황의 불용성 문제 및 카본 디설파이드의 독성의 문제를 회피한다. TETD 및 BDTD 방법은 또한 높은 순도의 포스포로티오에이트를 생성한다.
일부 실시양태에서, RNA 복합체의 센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%는 포스포로티오에이트 결합이다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체의 센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 전부는 포스포로티오에이트 결합이다.
일부 실시양태에서, RNA 복합체의 안티센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%는 포스포로티오에이트 결합이다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체의 안티센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 전부는 포스포로티오에이트 결합이다.
본원에 기재된 RNA 복합체는 세포와 접촉되거나 유기체(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 대안적으로, RNA 복합체를 코딩하는 구축물 및/또는 벡터는 세포 또는 유기체와 접촉되거나 세포 또는 유기체에 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스성, 레트로바이러스성, 또는 렌티바이러스성 벡터가 사용된다.
본원에 기재된 RNA 복합체는 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNA 복합체는 화학적 합성에 의하거나 시험관내(in vitro) 전사로 제조될 수 있다.
약학 조성물:
특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 눈에 대한 전달용으로(예를 들어, 점안액 또는 주입형 임플란트 또는 용액으로서) 제형화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥내 전달용으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 종양내 전달용으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 종양내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 경구 또는 비경구 전달용으로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 AMD 또는 DME의 치료를 위한 제2 약제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 약제는 라니비주맙이다. 일부 실시양태에서, 제2 약제는 페갑타닙(pegaptanib)이다. 일부 실시양태에서, 제2 약제는 아피버셉트(afibercept)이다. 일부 실시양태에서, 제2 약제는 베바시주맙이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 암의 치료를 위한 제2 약제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 화학요법제(예를 들어, 시클로포스파미드(CTX; 예를 들어, CYTOXANφ), 클로람부실(CHL; 예를 들어, LEUKERAN®), 시스플라틴(Cis P; 예를 들어, PLATINOL®), 부설판(예를 들어, MYLERAN®), 멜팔란, 카무스틴(BCNU), 스트렙토조토신, 트리에틸렌멜라민(TEM), 미토마이신 C 등과 같은 알킬화제 또는 알킬화 작용을 갖는 약제; 메토트렉세이트(MTX), 에토포시드(VP16; 예를 들어, VEPESID®), 6-메르캅토퓨린(6MP), 6-티옥구아닌(6TG), 시타라빈(Ara-C), 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈(예를 들어, XELODA®), 다카바진(DTIC) 등과 같은 대사길항제; 악티노마이신 D, 독소루비신(DXR; 예를 들어, ADRIAMYCIN®), 다우노루비신(다우노마이신), 블레오마이신, 미스라마이신 등과 같은 항생제; 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴(VCR), 빈블라스틴 등과 같은 알칼로이드; 및 다른 항암제, 예컨대 파클리탁셀(예를 들어, TAXOL®) 및 파클리탁셀 유도체, 세포정지제, 덱사메타손(DEX; 예를 들어, DECADRON®)과 같은 글루코코르티코이드 및 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드, 하이드록시유레아와 같은 뉴클레오시드 효소 억제제, 아스파라기나아제와 같은 아미노산 고갈 효소, 류코보린 및 다른 폴산 유도체, 및 유사하고, 다양한 항암제이다. 다음 약제가 또한 추가 약제로서 사용될 수 있다: 아니포스틴(arnifostine)(예를 들어, ETHYOL®), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소 머스터드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 로무스틴(CCNU), 독소루비신 리포(예를 들어, DOXIL®), 젬시타빈(예를 들어, GEMZAR®), 다우노루비신 리포(예를 들어, DAUNOXOME®), 프로카바진, 미토마이신, 도세탁셀(예를 들어, TAXOTERE®), 알데스류킨, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT 11(이리노테칸), 10-하이드록시 7-에틸-캄프토테신(SN38), 플록슈리딘, 플루다라빈, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 플리카마이신, 미토테인, 페가스파가아제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 타목시펜, 테니포시드(teniposide), 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스터드, 비노렐빈, 클로람부실).
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 면역 체크포인트(checkpoint) 억제제이다. 면역 체크포인트 억제는 대략적으로 암 세포가 생성될 수 있는 체크포인트를 억제하여, 면역 반응을 예방하거나 하향조절하는 것을 지칭한다. 면역 체크포인트 단백질의 예는, 비제한적으로, CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 또는 VISTA를 포함한다. 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 단백질에 결합하여 이를 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 면역 체크포인트 억제제의 예는, 비제한적으로, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-224, AMP-514, STI-A1110, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB-0020718C, AUR-012 및 STI-A1010을 포함한다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 형질감염 비히클을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 전달 비히클(예를 들어, 리포좀, 양이온성 중합체, 세포 침투성 펩티드(CPP), 단백질 형질도입 도메인(PTD), 항체 및/또는 앱타머)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 다수(2 이상)의 RNA 복합체의 조합을 포함한다.
이들 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 본원에 기재된 RNA 복합체를 담체 및, 선택적으로 1 이상의 부속 성분과 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본원에 기재된 약제를 액체 담체와 균일하고 친밀하게 연합시킴으로써 제조된다.
치료 방법
특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 의한 ANGPT2 또는 PDGFB 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 변형 RNA 복합체이고, 세포는 형질감염 비히클의 부재 하에서 RNA 복합체와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포는 전달 비히클(예를 들어, 리포좀, 양이온성 중합체, 세포 침투성 펩티드(CPP), 단백질 형질도입 도메인(PTD), 항체 및/또는 앱타머)의 존재 하에서 RNA 복합체와 접촉된다.
특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 RNA 복합체 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, AMD, DME, 또는 암에 대해 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 전달 비히클 없이 투여된다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 종양내로 투여된다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 제2 항암 치료제와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 항암 치료제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 제2 항암 치료제는 면역 체크포인트 억제제이다.
일부 실시양태에서, RNA 복합체는 대상체의 눈에 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 AMD(예를 들어, 습성 또는 건성 AMD)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 DME를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 여성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 남성이다. 특정 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 인간 대상체의 눈에 투여된다. 특정 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 점안액이다.
특정 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 인간 대상체의 종양에 투여된다. 일부 실시양태에서, RNA 복합체는 종양내로 투여된다. 특정 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 정맥내로 투여된다.
일부 실시양태에서, RNA 복합체 또는 약학 조성물은 대상체에 의해 자가-투여된다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 RNA 복합체 및/또는 약학 조성물을 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 임의의 암성 또는 전-암성 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 및/또는 종양의 일부는 정상 또는 증가된 혈관신생을 갖는다. 본원에서 제공된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은, 비제한적으로, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀, 또는 자궁으로부터의 암 세포를 포함한다. 또한, 암은 구체적으로 다음 조직학적 유형의 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대세포 암종 및 방추세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평세포 암종; 림프상피성 암종; 기저세포 암종; 모기질 암종; 이행세포 암종; 유두상 이행세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암; 육주상 선암종; 샘낭암종; 샘종 폴립 내의 선암종; 가족성 대장 폴립증 선암종; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 혐색소 암종; 호산성 암종(acidophil carcinoma); 호산성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종(nonencapsulating sclerosing carcinoma); 부신피질암; 자궁내막양 암종; 피부 부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 반지세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질암; 소엽암; 염증성 암종; 유방성 페이젯 병(mammary paget's disease); 선방세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평상피화생; 악성 흉선종; 악성 난소기질종양; 악성 난포막종; 악성 과립막세포종; 및 악성 아세포종(roblastoma); 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히 세포 종양(malignant leydig cell tumor); 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 갈색세포종; 사구맥관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대색소 모반 내의 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 악성 청색모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 태생형 횡문근육종; 폐포형 횡문근육종; 기질육종; 악성 혼합 종양; 뮐러관 혼합 종양(mullerian mixed tumor); 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종; 악성 브레너 종양(malignant brenner tumor); 악성 엽상종양; 활막육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 태생기암; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모암; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 측피질 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 골거대세포종양; 유잉 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양; 사기질모세포 치성육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 사기질모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 뇌교종; 상의세포종; 별아교세포종; 원형질 별아교세포종; 원섬유 별아교세포종; 별아교모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시신경외배엽; 소뇌육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막모세포종; 후각 신경 종양(olfactory neurogenic tumor); 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경섬유초종; 악성 과립세포종; 악성 림프종; 호지킨병(Hodgkin's disease); 호지킨 림프종; 파라육아종; 소림프구성 악성 림프종; 광범위 큰세포 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상식육종; 다른 특정 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 작은창자병; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만세포성 백혈병; 거핵모구 백혈병; 골수성 육종; 및 모발상세포 백혈병.
본 방법에서, 본원에 기재된 RNA 복합체는, 예를 들어 전달 비히클 없이(예를 들어, cp-asiRNA에 대해), 전달 시약과 조합된 핵산으로서, 및/또는 본원에 기재된 RNA 복합체를 발현하는 서열을 포함하는 핵산으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 당업계에 알려진 임의의 핵산 전달 방법이 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 적합한 전달 시약은, 비제한적으로, 예를 들어 미루스 트랜짓(Mirus Transit) TKO 친유성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 폴리케타이온(polycation)(예를 들어, 폴리리신), 아텔로콜라겐, 나노플렉스 및 리포좀을 포함한다. 핵산 분자에 대한 전달 비히클로서 아텔로콜라겐의 사용은 Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); 및 Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전체가 본원에 포함된다. 예시적 간섭 핵산 전달 시스템은 미국 특허 제8,283,461호, 제8,313,772호, 제8,501,930호, 제8,426,554호, 제8,268,798호 및 제8,324,366호에서 제공되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 리포좀은 본원에 기재된 RNA 복합체를 대상체에게 전달하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 리포좀은 일반적으로 콜레스테롤과 같은 중성 또는 음성 하전된 인지질 및 스테롤을 포함하는 표준 소포(vesicle)-형성 지질로부터 형성될 수 있다. 지질의 선택은 일반적으로 소망하는 리포좀 크기 및 혈류에서 리포좀의 반감기와 같은 인자의 고려에 의해 유도된다. 리포좀을 제조하기 위한 다양한 방법이, 예를 들어 Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys . Bioeng. 9:467; 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호, 및 제5,019,369호(이들 전체 개시물은 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 바와 같이 알려져 있다.
본 방법에서 사용하기 위한 리포좀은 또한 단핵 대식세포계(mononuclear macrophage system)("MMS") 및 세망내피계(reticuloendothelial system)("RES")에 의한 클리어란스(clearance)를 회피하도록 변형될 수 있다. 상기 변형 리포좀은 표면 상에 또는 리포좀 구조 내로 결합된 옵소닌작용 억제 모이어티를 갖는다.
본원에 기재된 리포좀을 제조하는데 사용하기 위한 옵소닌작용 억제 모이어티는 전형적으로 리포좀 막에 결합되는 큰 친수성 중합체이다. 본원에 사용된 바에 있어서, 옵소닌작용 억제 모이어티는 그것이, 예를 들어 막 내로의 자체적인 지질-가용성 앵커(anchor)의 삽입에 의해, 또는 막 지질의 작용기에 직접 결합함으로써, 막에 화학적 또는 물리적으로 부착될 때, 리포좀 막에 "결합"된다. 이들 옵소닌작용 억제 친수성 중합체는, 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,920,016호에 기재된 바와 같이, MMS 및 RES에 의한 리포좀의 섭취를 상당히 감소시키는 보호 표면 막을 형성한다.
일부 실시양태에서, 리포좀을 변형시키기에 적합한 옵소닌작용 억제 모이어티는 약 500 내지 약 40,000 달톤(dalton), 또는 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 수평균 분자량을 갖는 수용성 중합체이다. 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 유도체; 예를 들어, 메톡시 PEG 또는 PPG, 및 PEG 또는 PPG 스테아레이트; 폴리아크릴아마이드 또는 폴리 N-비닐 피롤리돈과 같은 합성 중합체; 선형, 분지형, 또는 덴드리머 폴리아미도아민; 폴리아크릴산; 폴리알코올, 예를 들어 카복시기 또는 아미노기가 화학적으로 연결되는 폴리비닐알코올 및 폴리자일리톨뿐 아니라 강글리오사이드 GM1과 같은 강글리오사이드를 포함한다. PEG, 메톡시 PEG, 또는 메톡시 PPG의 공중합체 또는 이의 유도체가 또한 적합하다. 또한, 옵소닌작용 억제 중합체는 PEG와 폴리아미노산, 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌아민, 또는 폴리뉴클레오티드의 블록 공중합체일 수 있다. 옵소닌작용 억제 중합체는 또한, 아미노산 또는 카복시산, 예를 들어 갈락투론산, 글루쿠론산, 마누론산, 히알루론산, 펙트산, 뉴라민산, 알긴산, 카라기난을 함유한 천연 폴리사카라이드; 아미노화된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드(선형 또는 분지형); 또는, 예를 들어 탄산의 유도체와 반응하여 카복시기의 연결이 생성된 카복시화된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 옵소닌작용 억제 모이어티는 PEG, PPG, 또는 이의 유도체이다. PEG 또는 PEG-유도체로 변형된 리포좀은 간혹 "페길화된(PEGylated) 리포좀"으로 지칭된다.
본원에 개시된 약학 조성물은 정맥내, 종양내, 안구내, 경구, 및 비경구를 포함한 임의의 적합한 투여 경로에 의해 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 전신으로(예를 들어, 경구 또는 정맥내 투여를 통해) 전달된다. 특정 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 주사를 통해 또는 점안액을 통해 눈으로(예를 들어, 유리체내로) 국부적으로 전달된다.
약학 조성물 내의 RNA 복합체의 실제 투여량 수준은 환자에 대한 독성 없이, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대한 소망하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 RNA 복합체의 양을 얻도록 달라질 수 있다.
선택된 투여량 수준은 사용된 특정 약제의 활성, 사용되는 특정 화합물의 투여 경로, 투여 시간, 배출 속도 또는 대사 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 화합물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반 건강 및 이전 병력, 및 의료 업계에 잘 알려진 유사 인자를 포함한 다양한 인자에 의존할 것이다.
당업계의 숙달된 의사는 필요한 약학 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 소망하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준으로 약학 조성물에서 사용되는 약제의 용량을 처방 및/또는 투여하고, 소망하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 RNA 복합체의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 RNA 복합체의 양일 것이다. 상기 유효 용량은 일반적으로 상기 기재된 인자에 의존할 것이다.
실시예
실시예 1: ANGPT2 - 표적화 비대칭 짧은-듀플렉스 소간섭 RNA에 대한 스크리닝
고효율로 ANGPT2를 억제하는 비대칭 짧은-듀플렉스 소간섭 RNA(asiRNA)를 확인하기 위해, 100개의 asiRNA를 합성하고 스크리닝하였다. 스크리닝된 asiRNA의 핵산 서열이 표 1에서 제공된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
표 1에 열거된 asiRNA를 1x siRNA 듀플렉스 완충액(Bioneer Inc., Korea) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. 스크리닝을 위해, 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다. 형질감염 하루 전에, 5 x 103 SK-N-SH 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 0.1 nM의 asiRNA로 SK-N-SH 세포를 형질감염시켰다.
형질감염된 세포에서의 ANGPT2 mRNA 수준은 형질감염 24 시간 후에 실시간 PCR을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, qPCR용 SuperPrep Cell Lysis & RT 키트(TOYOBO)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 총 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix(TOYOBO)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. ANGPT2 TaqMan® Probe (Hs01048042_m1)를 사용하여 ANGPT2의 증폭을 검출하였다. 18S TaqMan® Probe (Hs03928985_g1)를 사용하여 내부 대조군으로서 18S를 증폭시켰다.
100 개의 asiRNA 각각에 의한 ANGPT2 억제 수준이 도 1에 제공된다. 후속 연구에서의 사용을 위해, 우수한 RNAi 효능(> 30%)을 갖는 27 개의 asiRNA 서열, asiANGPT2 #15, #16, #18, #19, #20, #23, #24, #31, #37, #38, #39, #44, #50, #54, #55, #58, #61, #63, #71, #72, #80, #81, #83, #87, #93, #94 및 #95를 선택하였다.
실시예 2: ANGPT2 - 표적화 asiRNA를 사용한 ANGPT2 mRNA 발현의 억제
27 개의 asiRNA 서열, asiANGPT2 #15, #16, #18, #19, #20, #23, #24, #31, #37, #38, #39, #44, #50, #54, #55, #58, #61, #63, #71, #72, #80, #81, #83, #87, #93, #94 및 #95를 ANGPT2 발현을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다.
asiRNA를 1x siRNA 듀플렉스 완충액(Bioneer) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. 스크리닝을 위해, 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다. 형질감염 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 asiRNA로 SK-N-SH 세포를 형질감염시켰다.
구체적으로, RNAiPlus®(TaKaRa)를 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA 500 ng을 사용하여 제조사의 지시에 따라 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA 합성을 하였다. 파워 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)를 사용하여 ANGPT2 유전자의 증폭을 검출하였다. 내부 대조군으로서 GAPDH를 증폭시켰다. 다음 프라이머 서열을 사용하였다:
Figure pct00007
27 개 asiRNA의 ANGPT2 억제 수준이 도 2에 제공된다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 후속 연구에서의 사용을 위해, 가장 효율적인 14 개의 asiRNAs; asiANGPT2 #15, #16, #18, #19, #23, #31, #37, #44, #54, #58, #72, #87, #93 및 #94를 선택하였다.
실시예 3: ANGPT2 - 표적화 asiRNA를 사용한 ANGPT2 mRNA 발현의 억제
14 개의 asiRNA 서열, asiANGPT2#15, #16, #18, #19, #23, #31, #37, #44, #54, #58, #72, #87, #93 및 #94를 1 nM의 형질감염에 의해 ANGPT2 발현을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다.
asiRNA를 1x siRNA 듀플렉스 완충액(Bioneer) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. 스크리닝을 위해, 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다. 형질감염 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 asiRNA로 SK-N-SH 세포를 형질감염시켰다.
구체적으로, RNAiso Plus(TaKaRa)를 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA 500 ng을 사용하여 제조사의 지시에 따라 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA 합성을 하였다. 파워 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)를 사용하여 ANGPT2 유전자의 증폭을 검출하였다. 내부 대조군으로서 GAPDH를 증폭시켰다.
14 개의 asiRNA의 ANGPT2 억제 수준이 도 3에 제공된다.
실시예 4: ANGPT2 - 표적화 asiRNA를 사용한 ANGPT2 단백질 발현의 억제
ANGPT2 단백질의 억제에 대해 asiANGPT2의 효능을 시험하였다.
asiRNA를 1x siRNA 듀플렉스 완충액(Bioneer) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다.
100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다. 형질감염 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 1 nM의 asiRNA로 SK-N-SH 세포를 형질감염시켰다.
asiRNA 형질감염 48 시간 후에, ANGPT2 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다. 형질감염된 SK-N-SH 세포를 SDS 용해 완충액(1% SDS, 100 mM Tris (pH 8.8))으로 용해시켰다. SK-N-SH 세포의 총 단백질 추출물 중 10 ㎍을 9% SDS-PAGE 겔 상에 로딩시키고, 120 V에서 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 1 시간 동안 300 mA에서 메탄올(Merck)에 의해 이미 활성화된 PVDF 막(Bio-rad)으로 단백질을 이동시켰다. 3% BSA(Bioworld)로 1 시간 동안 실온에서 막을 차단한 다음, 항-ANGPT2 항체(Santa Cruz) 및 항-GAPDH 항체(Santa Cruz)를 함유한 3% BSA 중 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어, 막을 1x TBST로 10 분 동안 3 회 세척하고, HRP-콘쥬게이트된 2 차 항체와 함께 1x TBST에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 1x TBST로 10 분 동안 세척하였으며, 1x ECL로 1 분 동안 처리하였다. 이어, Chemidoc 기구(Bio-rad)를 사용하여 ANGPT2 및 GAPDH 밴드를 영상화하였다.
웨스턴 블롯 에세이의 결과를 도 4에 도시하였다. 결과적으로, asiANGPT2#54 및 asiANGPT2#94는 다른 asiANGPT2 가닥에 비해 높은 억제 효율을 나타내었다. 화학적 변형을 위해 이들 가닥을 선택하였다.
실시예 5: 자가-전달을 위한 asiRNA의 화학적 변형
선택된 asiRNA에 화학적 변형을 적용하고, 변형된 asiRNA의 세포 전달을 다른 전달 시약의 부재 하에서 시험하였다. 하기 기재된 바에 있어서, 변형의 일부는 asiRNA의 엔도시토시스(endocytosis) 및 안정성을 개선하였다. 상기 세포 침투성 asiRNA(cp-asiRNA)는 전달 시약의 부재 하에서 세포 내로 전달될 수 있다.
SK-N-SH 세포에서의 ANGPT2 mRNA 억제에 대하여 8 개의 잠재적 cp-asiRNA(표 2)를 스크리닝하였다. SK-N-SH 세포를 전달 시약 없이 1 μM 및 3 μM의 sp-asiRNA와 함께 항온처리하였으며, ANGPT2 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였다.
Figure pct00008
Figure pct00009
100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다.
표 2에 열거된 잠재적 cp-asiRNA를 Opti-MEM 완충액(Gibco) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다.
처치 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 처치 전에, SK-N-SH 세포를 최소 필수 배지(Gibco)로 세척한 다음, OPTI-MEM 완충액 중 잠재적 cp-asiRNA의 존재 하에서 8 및 24 시간 동안 배양하였으며, 각각의 시점에서 asiRNA 함유 OPTI-MEM 배지를 혈청 함유 배지로 교체하였다.
ANGPT2 mRNA 발현 수준은 asiRNA 처치 48 시간 후에 실시간 PCR을 사용하여 결정하였다.
실시예 6: ANGPT2 - 표적화 cp- asiRNA를 사용한 ANGPT2 mRNA 발현의 억제
cp-asiRNA에 의한 ANGPT2 mRNA의 억제를 시험하였다. 각각의 잠재적 cp-asiRNA를 전달 시약 없이 1 μM 및 3 μM의 SK-N-SH 세포와 함께 항온처리하였으며, ANGPT2 mRNA 수준을 실시간 PCR을 사용하여 측정하였다.
100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다.
cp-asiRNA를 Opti-MEM 완충액(Gibco) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다.
처치 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 처치 직전에, SK-N-SH 세포를 최소 필수 배지(Gibco)로 세척한 다음, OPTI-MEM 완충액 중 잠재적 cp-asiRNA의 존재 하에서 24 시간 동안 배양하였으며, 이 시점에서 asiRNA 함유 OPTI-MEM 배지를 혈청 함유 배지로 교체하였다.
ANGPT2 mRNA 발현 수준은 asiRNA 처치 48 시간 후에 실시간 PCR에 의해 결정하였다. RNAiso Plus(TaKaRa)를 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA 500 ng을 사용하여 제조사의 지시에 따라 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA 합성을 하였다. 파워 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)를 사용하여 ANGPT2 유전자의 증폭을 검출하였다. 내부 대조군으로서 GAPDH를 증폭시켰다.
실시예 7: ANGPT2 - 표적화 cp- asiRNA를 사용한 ANGPT2 단백질 발현의 억제
cp-asiRNA에 의한 ANGPT2 단백질의 억제를 시험하였다. 각각의 잠재적 cp-asiRNA를 전달 시약 없이 1 μM 및 3 μM의 SK-N-SH 세포와 함께 항온처리하였다. 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다.
cp-asiRNA를 Opti-MEM 완충액(Gibco) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다.
형질감염 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 처치 직전에, SK-N-SH 세포를 최소 필수 배지(Gibco)로 세척한 다음, OPTI-MEM 완충액(Gibco) 중 cp-asiRNA의 존재 하에서 24 시간 동안 배양하였으며, 이 시점에서 asiRNA 함유 OPTI-MEM 배지를 혈청 함유 배지로 교체하였다.
ANGPT2 단백질 발현 수준은 asiRNA 처치 48 시간 후에 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다. 간략하게는, 형질감염된 SK-N-SH 세포를 SDS 용해 완충액(1% SDS, 100 mM Tris (pH 8.8))으로 용해시켰다. 총 단백질 추출물 중 10 ㎍을 9% SDS-PAGE 겔 상에 로딩시키고, 120 V에서 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 1 시간 동안 300 mA에서 메탄올(Merck)에 의해 이미 활성화된 PVDF 막(Bio-rad)으로 단백질을 이동시켰다. 3% BSA(Bioworld)로 1 시간 동안 실온에서 막을 차단한 다음, 항-ANGPT2 항체(Santa Cruz) 및 항-GAPDH 항체(Santa Cruz)를 함유한 3% BSA 중 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어, 막을 1x TBST로 10 분 동안 3 회 세척하고, HRP-콘쥬게이트된 2 차 항체와 함께 1x TBST에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 1x TBST로 10 분 동안 세척하였으며, 1x ECL로 1 분 동안 처리하였다. 이어, Chemidoc 기구(Bio-rad)를 사용하여 ANGPT2 및 GAPDH 밴드를 영상화하였다.
웨스턴 블롯 에세이의 결과를 도 7에 도시하였다. 결과적으로, 센스 가닥 상에 8 개의 2'-O-메틸화 및 3 개의 포스포로티오에이트 결합 및 안티센스 가닥 상에 2 개의 2'-O-메틸화 및 4 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유한 cp-asiANGPT2#54, 센스 가닥 상에 8 개의 2'-O-메틸화 및 3 개의 포스포로티오에이트 결합 및 안티센스 가닥 상에 2 개의 2'-O-메틸화 및 6 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유한 잠재적 cp-asiANGPT2#94는 최고 수준의 ANGPT2 억제를 나타내었다.
실시예 8: 추가 ANGPT2 - 표적화 cp- asiRNA를 사용한 ANGPT2 mRNA 발현의 억제
가닥 길이 및 갯수가 상이한 2'-O-메틸화 변형 및 포스포로티오에이트 결합을 갖는 다양한 잠재적 cp-asiANGPT2 구조체를 합성하였으며, ANGPT2 발현을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다(표 3).
Figure pct00010
SK-N-SH 세포에서 ANGPT2 mRNA를 억제하는, 표 3에 열거된 1 μM 또는 3 μM의 cp-asiRNA 각각의 능력을 시험하였다.
100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다. 표 3에 열거된 cp-asiRNA를 Opti-MEM 완충액(Gibco) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다.
처치 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 처치 전에, SK-N-SH 세포를 최소 필수 배지(Gibco)로 세척한 다음, OPTI-MEM 완충액 중 잠재적 cp-asiRNA의 존재 하에서 24 시간 동안 배양하였으며, 이 시점에서 asiRNA 함유 OPTI-MEM 배지를 혈청 함유 배지로 교체하였다.
ANGPT2 mRNA 발현 수준은 asiRNA 처치 48 시간 후에 결정하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 센스 가닥 상에 8 개의 2'-O-메틸화 및 4 개의 포스포로티오에이트 결합 및 안티센스 가닥 상에 2 개의 2'-O-메틸화 및 4 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유한 cp-asiANGPT2#54, 센스 가닥 상에 8 개의 2'-O-메틸화 및 3 개의 포스포로티오에이트 결합 및 안티센스 가닥 상에 2 개의 2'-O-메틸화 및 6 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유한 잠재적 cp-asiANGPT2#94는 다른 cp-asiANGPT2에 비해 ANGPT2 억제 능력에서 더 높은 효율을 나타내었다.
실시예 9: 추가 ANGPT2 - 표적화 cp- asiRNA를 사용한 ANGPT2 단백질의 억제
cp-asiRNA를 전달 시약 없이 1 μM 및 3 μM의 SK-N-SH 세포와 함께 항온처리하였으며, ANGPT2 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 최소 필수 배지(Gibco)에서 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)를 이용하였다.
cp-asiRNA를 Opti-MEM 완충액(Gibco) 중 95℃에서 5 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다.
형질감염 하루 전에, 2.5 x 104 SK-N-SH 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 처치 직전에, SK-N-SH 세포를 최소 필수 배지(Gibco)로 세척한 다음, OPTI-MEM 완충액 중 잠재적 cp-asiRNA의 존재 하에서 24 시간 동안 배양하였으며, 이 시점에서 asiRNA 함유 OPTI-MEM 배지를 혈청 함유 배지로 교체하였다.
ANGPT2 단백질 발현의 수준은 asiRNA 처치 48 시간 후에 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다. 치료된 SK-N-SH 세포를 SDS 용해 완충액(1% SDS, 100 mM Tris (pH 8.8))으로 용해시켰다. 총 단백질 추출물 중 10 ㎍을 9% SDS-PAGE 겔 상에 로딩시키고, 120 V에서 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 1 시간 동안 300 mA에서 메탄올(Merck)에 의해 이미 활성화된 PVDF 막(Bio-rad)으로 단백질을 이동시켰다. 3% BSA(Bioworld)로 1 시간 동안 실온에서 막을 차단한 다음, 항-ANGPT2 항체(Santa Cruz) 및 항-GAPDH 항체(Santa Cruz)를 함유한 3% BSA 중 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어, 막을 1x TBST로 10 분 동안 3 회 세척하고, HRP-콘쥬게이트된 2 차 항체와 함께 1x TBST에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 1x TBST로 10 분 동안 세척하였으며, 1x ECL로 1 분 동안 처리하였다. 이어, Chemidoc 기구(Bio-rad)를 사용하여 ANGPT2 및 GAPDH 밴드를 영상화하였다.
웨스턴 블롯 에세이의 결과를 도 9에 도시하였다. 결과적으로, asiANGPT2#54-PS4/19(2,4)는 최고 수준의 ANGPT2 억제를 나타내었다.
실시예 10: PDGFB -특이적 비대칭 짧은-듀플렉스 소간섭 RNA에 대한 스크리닝
고효율로 PDGFB를 억제하는 비대칭 짧은-듀플렉스 소간섭 RNA(asiRNA)를 확인하기 위해, 100 개의 asiRNA를 합성하고 스크리닝하였다. 스크리닝된 asiRNA의 핵산 서열이 표 4에서 제공된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
표 4에 열거된 asiRNA를 1x siRNA 듀플렉스 완충액(STpharm) 중 95℃에서 2 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. 스크리닝을 위해, 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Gibco)에서 배양된 A549 세포(ATCC)를 이용하였다. 형질감염 하루 전에, 5 x 103 A549 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 0.1 nM의 asiRNA로 A549 세포를 형질감염시켰다.
형질감염된 세포에서의 PDGFB mRNA 수준은 형질감염 24 시간 후에 실시간 qRT-PCR을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, TOYOBO 용해 시약을 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, 반응 혼합물 1/5 부피를 사용하여 TOYOBO RT 시약(TOYOBO SuperPrep)을 이용하여 cDNA 합성을 하였다. 합성된 cDNA를 희석한 다음, THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix(TOYOBO)를 사용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다. PDGFB TaqMan® Probe(Hs00966522_m1) 및 18S TaqMan® Probe(Hs03928985_g1)를 사용하여 표적 유전자의 증폭을 검출하였다.
100 개의 asiRNA 각각에 의한 PDGFB 억제의 발현 수준이 도 11에 제공된다. 후속 연구에서의 사용을 위해, PDGFB mRNA를 표적화하는 22 개의 asiRNA 서열, asiRNA(17), asiRNA(24), asiRNA(42), asiRNA(43), asiRNA(47), asiRNA(53), asiRNA(63), asiRNA(64), asiRNA(65), asiRNA(66), asiRNA(67), asiRNA(72), asiRNA(73), asiRNA(79), asiRNA(80), asiRNA(84), asiRNA(85), asiRNA(92), asiRNA(93), asiRNA(94), asiRNA(95), asiRNA(99)를 선택하였다.
실시예 11: PDGFB - 표적화 asiRNA를 사용한 PDGFB mRNA 발현의 억제
PDGFB mRNA를 표적화하는 22 개의 asiRNA 서열, asiRNA(17), asiRNA(24), asiRNA(42), asiRNA(43), asiRNA(47), asiRNA(53), asiRNA(63), asiRNA(64), asiRNA(65), asiRNA(66), asiRNA(67), asiRNA(72), asiRNA(73), asiRNA(79), asiRNA(80), asiRNA(84), asiRNA(85), asiRNA(92), asiRNA(93), asiRNA(94), asiRNA(95), asiRNA(99)를 상이한 농도에서 PDGFB 발현을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. asiRNA를 1x siRNA 듀플렉스 완충액(STpharm) 중 95℃에서 2 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. 스크리닝을 위해, 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 둘베코 변형 이글스 배지(Gibco)에서 배양된 A549 세포(ATCC)를 이용하였다. 형질감염 하루 전에, 2.5 x 104 A549 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 asiRNA로 A549 세포를 형질감염시켰다.
형질감염된 세포에서의 PDGFB mRNA 수준은 형질감염 24 시간 후에 실시간 PCR을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, RNAiso Plus(TaKaRa)를 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA 500 ng을 사용하여 제조사의 지시에 따라 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA 합성을 하였다. 합성된 cDNA를 희석한 다음, StepOne 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 파워 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)를 사용하여 PDGFB 유전자의 증폭을 검출하였다. 내부 대조군으로서 GAPDH를 증폭시켰다. 다음 프라이머 서열을 사용하였다:
Figure pct00018
상이한 농도의 22 개의 asiRNA에 의한 PDGFB 발현 억제 수준이 도 12에 제공된다. 후속 연구에서의 사용을 위해, PDGFB mRNA를 표적화하는 12 개의 asiRNA 서열, asiRNA(24), asiRNA(42), asiRNA(47), asiRNA(64), asiRNA(65), asiRNA(66), asiRNA(67), asiRNA(73), asiRNA(80), asiRNA(94), asiRNA(95), asiRNA(99)를 선택하였다.
실시예 12: PDGFB -특이적 asiRNA를 사용한 PDGFB 단백질 발현의 억제
12 개의 asiRNA를 1x siRNA 듀플렉스 완충액(STpharm) 중 95℃에서 2 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동을 통해 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. 100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(Gibco) 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 둘베코 변형 이글스 배지(Gibco)에서 배양된 A549 세포(ATCC)를 이용하였다. 형질감염 하루 전에, 9.0 x 104 A549 세포를 6-웰 플레이트에 접종하였다. RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 0.3 nM의 asiRNA로 A549 세포를 형질감염시켰다.
형질감염된 세포에서의 PDGFB mRNA 수준은 형질감염 48 시간 후에 실시간 PCR을 사용하여 측정하였으며, PDGFB 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다.
구체적으로, RNAiso Plus(TaKaRa)를 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA 500 ng을 사용하여 제조사의 지시에 따라 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA 합성을 하였다. 합성된 cDNA를 희석한 다음, StepOne 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 파워 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)를 사용하여 PDGFB 유전자의 증폭을 검출하였다. 내부 대조군으로서 GAPDH를 증폭시켰다. 다음 프라이머 서열을 사용하였다:
Figure pct00019
mRNA 수준 결과를 도 13에 도시하였다. PDGFB mRNA를 표적화하는 6 개의 asiRNA 서열, asiRNA(42), asiRNA(47), asiRNA(64), asiRNA(67), asiRNA(94), asiRNA(95)가 효과적인 유전자 침묵 활성(60%~)을 나타낸다.
단백질 수준의 경우에, 형질감염된 A549 세포를 RIPA 완충액(GE)으로 용해시켰다. A549 세포의 총 단백질 추출물 중 20 ㎍을 10% SDS-PAGE 겔 상에 로딩시키고, 120 V에서 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 1 시간 동안 300 mA에서 메탄올(Merck)에 의해 이미 활성화된 PVDF 막(Bio-rad)으로 단백질을 이동시켰다. 5% 탈지유(Seoul Milk)로 1 시간 동안 실온에서 막을 차단한 다음, 항-PDGFB 항체(Abcam) 및 β-액틴 항체(Santa Cruz)를 함유한 5% 탈지유 중 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어, 막을 1x TBST로 10 분 동안 3 회 세척하고, HRP-콘쥬게이트된 2 차 항체와 함께 5% 탈지유에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 1x TBST로 10 분 동안 세척하였으며, 1x ECL로 1 분 동안 처리하였다. 이어, Chemidoc 기구(Bio-rad)를 사용하여 PDGFB 및 β-액틴 밴드를 영상화하였다.
웨스턴 블롯 에세이의 결과를 도 14에 도시하였다. A549 세포의 asiPDGFB(42, 47, 66, 67, 94, 95) 형질감염 세포주에서, 50% 이상의 PDGFB 단백질 억제를 확인하였다(도 14).
다함께 고려하여, 후속 연구에서의 사용을 위해 PDGFB 유전자를 표적화하는 5 개의 asiRNA 서열, asiRNA(42), asiRNA(47), asiRNA(67), asiRNA(94), asiRNA(95)를 선택하였다.
실시예 13: 자가-전달을 위한 asiRNA의 화학적 변형
실시예 3에서 선택된 asiRNA에 화학적 변형을 적용하고, 변형 asiRNA의 세포 전달을 다른 전달 비히클의 부재 하에서 시험하였다. 하기 기재된 바에 있어서, 변형 중 일부는 asiRNA의 엔도시토시스 및 안정성을 개선하였다. 상기 세포 침투성 asiRNA(cp-asiRNA)는 전달 비히클의 부재 하에서 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 기재된 방법을 사용하여 결정된 바와 같은 세포에 의한 PDGFB mRNA의 발현이 도 15에 제공되며, PDGFB 단백질 수준이 도 16에서 제공된다.
A549 세포에서의 혈소판 유래 성장 인자 서브유닛 B(PDGFB) mRNA 억제에 대하여 잠재적 cp-asiRNA(표 5)를 스크리닝하였다. 각각의 잠재적 cp-asiRNA를 전달 비히클 없이 1 μM 및 3 μM의 A549 세포와 함께 항온처리하였으며, PDGFB 발현 수준을 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 연구에 의해 측정하였다.
Figure pct00020
100 mm 세포 배양 접시 내의 10% 소태아혈청(FBS, Gibco), 100 단위/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 함유한 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM, Gibco)에서 배양된 A549 세포(ATCC)를 이용하였다. 표 5에 열거된 잠재적 cp-asiRNA를 Opti-MEM(Gibco) 중 95℃에서 2 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동에 의해 잠재적 cp-asiRNA의 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다.
cp-asiRNA 처치 당일에, 9 x 104 세포를 6 웰 플레이트에 접종한 다음, Opti-MEM 중 잠재적 cp-asiRNA의 존재 하에서 24 시간 동안 배양하였으며, 이 시점에서 cp-asiRNA 함유 Opti-MEM 배지를 혈청 함유 배지로 교체하였다. 24 시간 이후에, A549 세포에서의 PDGFB mRNA 수준을 qRT-PCR을 사용하여 결정하였다. 구체적으로, RNAiPlus®(TaKaRa)를 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, 반응 혼합물 500 ng을 사용하여 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA 합성을 하였다. 합성된 cDNA를 희석한 다음, 파워 SYBR 그린 PCR 마스터 Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
cp-asiRNA 항온처리 48 시간 후에, PDGFB 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다. 간략하게는, 치료된 A549 세포를 포유동물 단백질 추출 완충액(GE Healthcare)으로 용해시켰다. 총 단백질 추출물 중 20 ㎍을 10% SDS-PAGE 겔 상에 로딩시키고, 120 V에서 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 1 시간 동안 300 mA에서 메탄올(Merck)에 의해 이미 활성화된 PVDF 막(Bio-rad)으로 단백질을 이동시켰다. 5% 탈지유(Seoul Milk)로 1 시간 동안 실온에서 막을 차단한 다음, 항-PDGFB 항체(Abcam) 및 항-γ-튜불린 항체(Bethyl)를 함유한 5% 탈지유 중 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어, 막을 TBST로 10 분 동안 3 회 세척하고, HRP-콘쥬게이트된 2 차 항체(Santa Cruz)와 함께 5% 탈지유에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 TBST로 10 분 동안 세척하였으며, ECL 기질(Thermo Scientific)로 처리하였다. 이어, Chemidoc 기구(Bio-rad)를 사용하여 단백질 밴드를 영상화하였다.
9 개의 잠재적 cp-asiRNA 각각에 의한 PDGFB 억제 수준이 도 15 및 16에 제공된다. 시험된 잠재적 cp-asiRNA 중에서, 추가 연구를 위해 cp-asiPDGFB 67(7, 4)을 선택하였다.
실시예 14: 추가 PDGFB cp- asiRNA 구조체
상이한 화학적 변형 또는 서열을 갖는 다른 잠재적 PDGFB cp-asiRNA 구조체를 합성하였으며, PDGFB 발현을 억제하는 이의 능력에 대해 시험하였다(표 6).
Figure pct00021
A549 세포에서 PDGFB 발현을 억제하는, 표 6에 열거된 cp-asiRNA의 능력을 시험하였다. 10% 소태아혈청(FBS, Gibco) 및 100 단위/mL 페니실린 100 ㎍/mL를 함유한 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM, Gibco)에서 배양된 A549 세포(ATCC)를 이용하였다. 표 6에 열거된 cp-asiRNA를 Opti-MEM(Gibco) 중 95℃에서 2 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동에 의해 잠재적 cp-asiRNA의 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. cp-asiRNA 처치 당일에, 2.5 x 104 세포를 24 웰 플레이트에 접종한 다음, Opti-MEM 중 잠재적 cp-asiRNA의 존재 하에서 24 시간 동안 배양하였으며, 이 시점에서 cp-asiRNA 함유 Opti-MEM 배지를 혈청 함유 배지로 교체하였다. 24 시간 이후에, A549 세포에서의 PDGFB 발현 수준을 결정하였다.
cp-asiRNA를 Opti-MEM(Gibco) 중 95℃에서 2 분 동안 및 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 겔 전기영동에 의해 잠재적 cp-asiRNA의 적절한 가닥 어닐링을 확인하였다. 10% 소태아혈청(FBS, Gibco) 및 100 단위/mL 페니실린 및 100 ug/mL 스트렙토마이신을 함유한 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM, Gibco)에서 배양된 A549 세포(ATCC)를 이용하였다. 처치 당일에, 9 x 104 A549 세포를 6-웰 플레이트에 접종한 다음, Opti-MEM 중 잠재적 cp-asiRNA의 존재 하에서 배양하였다. 24 시간 이후에, A549 세포에서의 PDGFB 단백질 수준을 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다. 간략하게는, 치료된 A549 세포를 포유동물 단백질 추출 완충액(GE Healthcare)으로 용해시켰다. 총 단백질 추출물 중 20 ㎍을 10% SDS-PAGE 겔 상에 로딩시키고, 120 V에서 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 1 시간 동안 300 mA에서 메탄올(Merck)에 의해 이미 활성화된 PVDF 막(Bio-rad)으로 단백질을 이동시켰다. 5% 탈지유(Seoul Milk)로 1 시간 동안 실온에서 막을 차단한 다음, 항-PDGFB 항체(Abcam) 및 항-γ-튜불린 항체(Bethyl)를 함유한 5% 탈지유 중 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어, 막을 TBST로 10 분 동안 3 회 세척하고, HRP-콘쥬게이트된 2 차 항체(Santa Cruz)와 함께 5% 탈지유에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 TBST로 10 분 동안 세척하였으며, ECL 기질(Thermo Scientific)로 처리하였다. 이어, Chemidoc 기구(Bio-rad)를 사용하여 표적 단백질 밴드를 영상화하였다.
도 18에 나타낸 바에 있어서, 21 개의 뉴클레오티드 안티센스 가닥으로 구성된 PDGFB 발현 잠재적 cp-asiPDGFB 67 및 19 개의 뉴클레오티드 안티센스 가닥으로 구성된 잠재적 cp-asiRNA는 유사한 수준의 PDGFB 억제를 나타내었다. 또한, cp-asiPDGFB 94(4,4), cp-asiPDGFB 95(4,4), asiPDGFB 95(2,4)는 전달 비히클 없이 효과적인 PDGFB 억제를 나타낸다.
참고로 포함
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타내진 것처럼, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 그 구체적 정의를 포함한 본 출원이 우선할 것이다.
균등물
당업자는 일상적 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 균등물을 인식하거나, 알아낼 수 있을 것이다. 상기 균등물은 다음 청구항에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> LEE, DONG-KI HONG, SUN WOO LEE, TAE YEON LEE, SAE-LO-OOM LEE, HANNA YU, DAYEON EOM, JI <120> TREATMENT OF ANGIOGENESIS-ASSOCIATED DISEASES USING RNA COMPLEXES THAT TARGET ANGPT2 AND PDGFB <130> OPH-00801 <140> 15/422,122 <141> 2017-02-01 <150> 62/290,330 <151> 2016-02-02 <160> 458 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ugucaguauc cgaaucaauc a 21 <210> 2 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gauucggaua cugaca 16 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 gugucaguau ccgaaucaau c 21 <210> 4 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 auucggauac ugacac 16 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 agugucagua uccgaaucaa u 21 <210> 6 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 uucggauacu gacacu 16 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 cagugucagu auccgaauca a 21 <210> 8 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 ucggauacug acacug 16 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 acagugucag uauccgaauc a 21 <210> 10 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 cggauacuga cacugu 16 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 uacaguguca guauccgaau c 21 <210> 12 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ggauacugac acugua 16 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 cuacaguguc aguauccgaa u 21 <210> 14 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 gauacugaca cuguag 16 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 uacuugggcu uccacaucag u 21 <210> 16 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 uguggaagcc caagua 16 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 gucacaguag gccuugaucu c 21 <210> 18 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 caaggccuac ugugac 16 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ugucacagua ggccuugauc u 21 <210> 20 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 aaggccuacu gugaca 16 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 augucacagu aggccuugau c 21 <210> 22 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 aggccuacug ugacau 16 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 caugucacag uaggccuuga u 21 <210> 24 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 ggccuacugu gacaug 16 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ccaugucaca guaggccuug a 21 <210> 26 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gccuacugug acaugg 16 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 uccaugucac aguaggccuu g 21 <210> 28 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ccuacuguga caugga 16 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 caaguuggaa ggaccacaug c 21 <210> 30 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 ugguccuucc aacuug 16 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 ucaaguugga aggaccacau g 21 <210> 32 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 gguccuucca acuuga 16 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 uucaaguugg aaggaccaca u 21 <210> 34 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 guccuuccaa cuugaa 16 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 caugguugug gccuugagcg a 21 <210> 36 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 caaggccaca accaug 16 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 ucaugguugu ggccuugagc g 21 <210> 38 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 aaggccacaa ccauga 16 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 aucaugguug uggccuugag c 21 <210> 40 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 aggccacaac caugau 16 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 caucaugguu guggccuuga g 21 <210> 42 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 ggccacaacc augaug 16 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ucaucauggu uguggccuug a 21 <210> 44 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 gccacaacca ugauga 16 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 aucaucaugg uuguggccuu g 21 <210> 46 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 ccacaaccau gaugau 16 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 gaucaucaug guuguggccu u 21 <210> 48 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 cacaaccaug augauc 16 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 ggaucaucau gguuguggcc u 21 <210> 50 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 acaaccauga ugaucc 16 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 cggaucauca ugguuguggc c 21 <210> 52 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 caaccaugau gauccg 16 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 cuguuuucca guuauuuacu g 21 <210> 54 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 aauaacugga aaacag 16 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 guguucuguu uuccaguuau u 21 <210> 56 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 cuggaaaaca gaacac 16 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 aguguucugu uuuccaguua u 21 <210> 58 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 uggaaaacag aacacu 16 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 aaguguucug uuuuccaguu a 21 <210> 60 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 ggaaaacaga acacuu 16 <210> 61 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 uaaguguucu guuuuccagu u 21 <210> 62 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 gaaaacagaa cacuua 16 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 gucaguaucc gaaucaauca c 21 <210> 64 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 ugauucggau acugac 16 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 ccuacagugu caguauccga a 21 <210> 66 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 auacugacac uguagg 16 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 uaggcugcgg ccaagacaag a 21 <210> 68 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 ucuuggccgc agccua 16 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 auuggacacg uaggggcugg a 21 <210> 70 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ccccuacgug uccaau 16 <210> 71 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 ucccucugca cagcauugga c 21 <210> 72 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 augcugugca gaggga 16 <210> 73 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 guucuccagc acuugcagcc u 21 <210> 74 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 gcaagugcug gagaac 16 <210> 75 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 uguucuccag cacuugcagc c 21 <210> 76 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 caagugcugg agaaca 16 <210> 77 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 auguucucca gcacuugcag c 21 <210> 78 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 aagugcugga gaacau 16 <210> 79 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 ucaucacagc cgucugguuc u 21 <210> 80 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 cagacggcug ugauga 16 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 aucaucacag ccgucugguu c 21 <210> 82 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 agacggcugu gaugau 16 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 uaucaucaca gccgucuggu u 21 <210> 84 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gacggcugug augaua 16 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 cuaucaucac agccgucugg u 21 <210> 86 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 acggcuguga ugauag 16 <210> 87 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 ucuaucauca cagccgucug g 21 <210> 88 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 cggcugugau gauaga 16 <210> 89 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 uucuaucauc acagccgucu g 21 <210> 90 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ggcugugaug auagaa 16 <210> 91 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 uuucuaucau cacagccguc u 21 <210> 92 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 gcugugauga uagaaa 16 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 acuugggcuu ccacaucagu u 21 <210> 94 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 auguggaagc ccaagu 16 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 auacuugggc uuccacauca g 21 <210> 96 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 guggaagccc aaguau 16 <210> 97 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 acuggucugg uccaaaaucu g 21 <210> 98 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 uuuggaccag accagu 16 <210> 99 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 uucacugguc ugguccaaaa u 21 <210> 100 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 ggaccagacc agugaa 16 <210> 101 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 uuucacuggu cugguccaaa a 21 <210> 102 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gaccagacca gugaaa 16 <210> 103 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 auuucacugg ucugguccaa a 21 <210> 104 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 accagaccag ugaaau 16 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 uauuucacug gucuggucca a 21 <210> 106 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 ccagaccagu gaaaua 16 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 uuauuucacu ggucuggucc a 21 <210> 108 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 cagaccagug aaauaa 16 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 uuuauuucac uggucugguc c 21 <210> 110 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 agaccaguga aauaaa 16 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 guuuauuuca cuggucuggu c 21 <210> 112 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 gaccagugaa auaaac 16 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 uguuuauuuc acuggucugg u 21 <210> 114 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 accagugaaa uaaaca 16 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 uuguuuauuu cacuggucug g 21 <210> 116 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 ccagugaaau aaacaa 16 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 uuuguuuauu ucacuggucu g 21 <210> 118 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 cagugaaaua aacaaa 16 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 aguaggccuu gaucucuucu g 21 <210> 120 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 gagaucaagg ccuacu 16 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 caguaggccu ugaucucuuc u 21 <210> 122 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 agaucaaggc cuacug 16 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 acaguaggcc uugaucucuu c 21 <210> 124 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 gaucaaggcc uacugu 16 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 cacaguaggc cuugaucucu u 21 <210> 126 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 aucaaggccu acugug 16 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 ucacaguagg ccuugaucuc u 21 <210> 128 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 ucaaggccua cuguga 16 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 uuccauguca caguaggccu u 21 <210> 130 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 cuacugugac auggaa 16 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gcugaugcug cuuauuuugc c 21 <210> 132 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 aauaagcagc aucagc 16 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 uggcugaugc ugcuuauuuu g 21 <210> 134 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 uaagcagcau cagcca 16 <210> 135 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 uuggcugaug cugcuuauuu u 21 <210> 136 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 aagcagcauc agccaa 16 <210> 137 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 ugguuggcug augcugcuua u 21 <210> 138 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 cagcaucagc caacca 16 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 cugguuggcu gaugcugcuu a 21 <210> 140 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 agcaucagcc aaccag 16 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 uuccugguug gcugaugcug c 21 <210> 142 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 aucagccaac caggaa 16 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 aaaaucauuu ccugguuggc u 21 <210> 144 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 accaggaaau gauuuu 16 <210> 145 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 uaaaaucauu uccugguugg c 21 <210> 146 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 ccaggaaaug auuuua 16 <210> 147 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 cuaaaaucau uuccugguug g 21 <210> 148 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 caggaaauga uuuuag 16 <210> 149 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 gcuaaaauca uuuccugguu g 21 <210> 150 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 aggaaaugau uuuagc 16 <210> 151 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 ugcuaaaauc auuuccuggu u 21 <210> 152 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ggaaaugauu uuagca 16 <210> 153 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 cuuugugcua aaaucauuuc c 21 <210> 154 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 ugauuuuagc acaaag 16 <210> 155 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 ccuuugugcu aaaaucauuu c 21 <210> 156 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 gauuuuagca caaagg 16 <210> 157 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 aaggaccaca ugcaucaaac c 21 <210> 158 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 gaugcaugug guccuu 16 <210> 159 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 gaaggaccac augcaucaaa c 21 <210> 160 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 augcaugugg uccuuc 16 <210> 161 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 uggaaggacc acaugcauca a 21 <210> 162 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 gcaugugguc cuucca 16 <210> 163 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 uuggaaggac cacaugcauc a 21 <210> 164 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 cauguggucc uuccaa 16 <210> 165 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 guuggaagga ccacaugcau c 21 <210> 166 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 augugguccu uccaac 16 <210> 167 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 aguuggaagg accacaugca u 21 <210> 168 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 ugugguccuu ccaacu 16 <210> 169 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 aaguuggaag gaccacaugc a 21 <210> 170 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 gugguccuuc caacuu 16 <210> 171 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 guucaaguug gaaggaccac a 21 <210> 172 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 uccuuccaac uugaac 16 <210> 173 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 uuguggccuu gagcgaauag c 21 <210> 174 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 ucgcucaagg ccacaa 16 <210> 175 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 guuguggccu ugagcgaaua g 21 <210> 176 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 cgcucaaggc cacaac 16 <210> 177 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 gguuguggcc uugagcgaau a 21 <210> 178 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 gcucaaggcc acaacc 16 <210> 179 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 ugguuguggc cuugagcgaa u 21 <210> 180 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 cucaaggcca caacca 16 <210> 181 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 augguugugg ccuugagcga a 21 <210> 182 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 ucaaggccac aaccau 16 <210> 183 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 ucggaucauc augguugugg c 21 <210> 184 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 aaccaugaug auccga 16 <210> 185 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 aaucugcugg ucggaucauc a 21 <210> 186 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 auccgaccag cagauu 16 <210> 187 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 aaaucugcug gucggaucau c 21 <210> 188 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 uccgaccagc agauuu 16 <210> 189 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 gaaaucugcu ggucggauca u 21 <210> 190 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 ccgaccagca gauuuc 16 <210> 191 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 agaaaucugc uggucggauc a 21 <210> 192 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 cgaccagcag auuucu 16 <210> 193 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 uagaaaucug cuggucggau c 21 <210> 194 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 gaccagcaga uuucua 16 <210> 195 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 uuagaaaucu gcuggucgga u 21 <210> 196 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 accagcagau uucuaa 16 <210> 197 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 uuuagaaauc ugcuggucgg a 21 <210> 198 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 ccagcagauu ucuaaa 16 <210> 199 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 auaaguguuc uguuuuccag u 21 <210> 200 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 aaaacagaac acuuau 16 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 201 gagtcaacgg atttggtcgt 20 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 202 gacaagcttc ccgttctcag 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 203 gcaagtgctg gagaacatca 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 204 cacagccgtc tggttctgta 20 <210> 205 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 cagaccagug aaauaa 16 <210> 206 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 uuauuucacu ggucuggucc a 21 <210> 207 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 cagaccagug aaauaa 16 <210> 208 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 uuauuucacu ggucuggucc a 21 <210> 209 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 cagaccagug aaauaa 16 <210> 210 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 uuauuucacu ggucuggucc a 21 <210> 211 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 cagaccagug aaauaa 16 <210> 212 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 uuauuucacu ggucuggucc a 21 <210> 213 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 uccgaccagc agauuu 16 <210> 214 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 aaaucugcug gucggaucau c 21 <210> 215 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 uccgaccagc agauuu 16 <210> 216 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 aaaucugcug gucggaucau c 21 <210> 217 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 uccgaccagc agauuu 16 <210> 218 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 aaaucugcug gucggaucau c 21 <210> 219 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 uccgaccagc agauuu 16 <210> 220 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 aaaucugcug gucggaucau c 21 <210> 221 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 cagaccagug aaauaa 16 <210> 222 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 uuauuucacu ggucugguc 19 <210> 223 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 cagaccagug aaauaa 16 <210> 224 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 uuauuucacu ggucuggucc a 21 <210> 225 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 cagaccagug aaauaa 16 <210> 226 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 uuauuucacu ggucugguc 19 <210> 227 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 uccgaccagc agauuu 16 <210> 228 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 aaaucugcug gucggaucau c 21 <210> 229 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 guuugcaccu cucccu 16 <210> 230 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 agggagaggu gcaaacuccc g 21 <210> 231 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 uuugcaccuc ucccug 16 <210> 232 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 cagggagagg ugcaaacucc c 21 <210> 233 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 uugcaccucu cccugc 16 <210> 234 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 gcagggagag gugcaaacuc c 21 <210> 235 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 agccaacuuu ggaaaa 16 <210> 236 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 uuuuccaaag uuggcuuugc a 21 <210> 237 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 gccaacuuug gaaaaa 16 <210> 238 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 uuuuuccaaa guuggcuuug c 21 <210> 239 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 ccaacuuugg aaaaag 16 <210> 240 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 cuuuuuccaa aguuggcuuu g 21 <210> 241 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 caacuuugga aaaagu 16 <210> 242 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 acuuuuucca aaguuggcuu u 21 <210> 243 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 aacuuuggaa aaaguu 16 <210> 244 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 gcugcugggc gcucuu 16 <210> 276 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 aagagcgccc agcagcgauu c 21 <210> 277 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 cugcugggcg cucuuc 16 <210> 278 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 gaagagcgcc cagcagcgau u 21 <210> 279 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 gcugcuaccu gcgucu 16 <210> 280 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 agacgcaggu agcagcagag a 21 <210> 281 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 cugcuaccug cgucug 16 <210> 282 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 cagacgcagg uagcagcaga g 21 <210> 283 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 ugcuaccugc gucugg 16 <210> 284 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 ccagacgcag guagcagcag a 21 <210> 285 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 gcuaccugcg ucuggu 16 <210> 286 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 accagacgca gguagcagca g 21 <210> 287 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 cuaccugcgu cugguc 16 <210> 288 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 gaccagacgc agguagcagc a 21 <210> 289 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 uaccugcguc ugguca 16 <210> 290 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 ugaccagacg cagguagcag c 21 <210> 291 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 accugcgucu ggucag 16 <210> 292 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 cugaccagac gcagguagca g 21 <210> 293 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 312 uauuaaauaa cccugcccac a 21 <210> 313 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 caggguuauu uaauau 16 <210> 314 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 auauuaaaua acccugccca c 21 <210> 315 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 aggguuauuu aauaug 16 <210> 316 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 cauauuaaau aacccugccc a 21 <210> 317 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 ggguuauuua auaugg 16 <210> 318 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 ccauauuaaa uaacccugcc c 21 <210> 319 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 gguuauuuaa uauggu 16 <210> 320 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 accauauuaa auaacccugc c 21 <210> 321 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 guuauuuaau auggua 16 <210> 322 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 uaccauauua aauaacccug c 21 <210> 323 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 guauuugcug uauugc 16 <210> 324 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 gcaauacagc aaauaccaua u 21 <210> 325 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 uauuugcugu auugcc 16 <210> 326 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 ggcaauacag caaauaccau a 21 <210> 327 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 auuugcugua uugccc 16 <210> 328 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 gggcaauaca gcaaauacca u 21 <210> 329 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 uuugcuguau ugcccc 16 <210> 330 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 ggggcaauac agcaaauacc a 21 <210> 331 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 ugcuguauug ccccca 16 <210> 332 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 ugggggcaau acagcaaaua c 21 <210> 333 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 gcuguauugc ccccau 16 <210> 334 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 334 augggggcaa uacagcaaau a 21 <210> 335 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 335 cuguauugcc cccaug 16 <210> 336 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 336 caugggggca auacagcaaa u 21 <210> 337 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 uguauugccc ccaugg 16 <210> 338 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 338 ccaugggggc aauacagcaa a 21 <210> 339 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 guauugcccc cauggg 16 <210> 340 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 340 cccauggggg caauacagca a 21 <210> 341 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 auugccccca uggggu 16 <210> 342 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 accccauggg ggcaauacag c 21 <210> 343 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 uugcccccau gggguc 16 <210> 344 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 gaccccaugg gggcaauaca g 21 <210> 345 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 345 ugcccccaug gggucc 16 <210> 346 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 346 ggaccccaug ggggcaauac a 21 <210> 347 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 gcccccaugg gguccu 16 <210> 348 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 348 aggaccccau gggggcaaua c 21 <210> 349 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 349 cccccauggg guccuu 16 <210> 350 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 aaggacccca ugggggcaau a 21 <210> 351 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 ccccaugggg uccuug 16 <210> 352 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 caaggacccc augggggcaa u 21 <210> 353 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 gggguccuug gaguga 16 <210> 354 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 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aaggacccca u 21 <210> 361 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 uccuuggagu gauaau 16 <210> 362 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 363 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 guccgucugu cucgau 16 <210> 364 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 364 aucgagacag acggacgagg g 21 <210> 365 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 365 uccgucuguc ucgaug 16 <210> 366 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 366 caucgagaca gacggacgag g 21 <210> 367 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 367 ccgucugucu cgaugc 16 <210> 368 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 gcaucgagac agacggacga g 21 <210> 369 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 gucugucucg augccu 16 <210> 370 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 aggcaucgag acagacggac g 21 <210> 371 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 ucugucucga ugccug 16 <210> 372 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 caggcaucga gacagacgga c 21 <210> 373 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 cugucucgau gccuga 16 <210> 374 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 ucaggcaucg agacagacgg a 21 <210> 375 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 ugucucgaug ccugau 16 <210> 376 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 aucaggcauc gagacagacg g 21 <210> 377 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 gucucgaugc cugauu 16 <210> 378 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 aaucaggcau cgagacagac g 21 <210> 379 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 ucucgaugcc ugauuc 16 <210> 380 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 gaaucaggca ucgagacaga c 21 <210> 381 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 381 cucgaugccu gauucg 16 <210> 382 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 382 cgaaucaggc aucgagacag a 21 <210> 383 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 383 ucgaugccug auucgg 16 <210> 384 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 384 ccgaaucagg caucgagaca g 21 <210> 385 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 385 cgaugccuga uucgga 16 <210> 386 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 386 uccgaaucag gcaucgagac a 21 <210> 387 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 387 gaugccugau ucggac 16 <210> 388 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 388 guccgaauca ggcaucgaga c 21 <210> 389 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 augccugauu cggacg 16 <210> 390 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 cguccgaauc aggcaucgag a 21 <210> 391 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 cugauucgga cggcca 16 <210> 392 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 392 uggccguccg aaucaggcau c 21 <210> 393 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 393 ugauucggac ggccaa 16 <210> 394 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 394 uuggccgucc gaaucaggca u 21 <210> 395 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 395 gauucggacg gccaau 16 <210> 396 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 396 auuggccguc cgaaucaggc a 21 <210> 397 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 397 auucggacgg ccaaug 16 <210> 398 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 398 cauuggccgu ccgaaucagg c 21 <210> 399 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 399 uucggacggc caaugg 16 <210> 400 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 400 ccauuggccg uccgaaucag g 21 <210> 401 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 401 ucggacggcc aauggu 16 <210> 402 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 402 accauuggcc guccgaauca g 21 <210> 403 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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16 <210> 416 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 cuuuacaaac ugaaggaagc a 21 <210> 417 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 cuucaguuug uaaagu 16 <210> 418 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 418 acuuuacaaa cugaaggaag c 21 <210> 419 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 uuauauuuuu gggggc 16 <210> 420 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 420 gcccccaaaa auauaaucac c 21 <210> 421 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 uauauuuuug ggggcu 16 <210> 422 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 agcccccaaa aauauaauca c 21 <210> 423 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 auauuuuugg gggcuu 16 <210> 424 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 424 aagcccccaa aaauauaauc a 21 <210> 425 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 425 uauuuuuggg ggcuuu 16 <210> 426 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 426 aaagccccca aaaauauaau c 21 <210> 427 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 427 auuuuugggg gcuuuc 16 <210> 428 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 428 gaaagccccc aaaaauauaa u 21 <210> 429 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 429 caagggacct gctcatcata tt 22 <210> 430 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 430 taccacagtc tccctcctat tt 22 <210> 431 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 431 gcaggguuau uuaaua 16 <210> 432 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 432 uauuaaauaa cccugcccac a 21 <210> 433 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 433 uauuaaauaa cccugcccac a 21 <210> 434 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 434 uauuaaauaa cccugcccac a 21 <210> 435 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 435 guuauuuaau auggua 16 <210> 436 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 436 uaccauauua aauaacccug c 21 <210> 437 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 uaccauauua aauaacccug c 21 <210> 438 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 438 uaccauauua aauaacccug c 21 <210> 439 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 uccuuggagu gauaau 16 <210> 440 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 440 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 441 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 442 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 443 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 uccuuggagu gauaau 16 <210> 444 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 445 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 445 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 446 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 446 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 447 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 447 auuaucacuc caaggacccc a 21 <210> 448 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 448 auuaucacuc caaggaccc 19 <210> 449 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 449 ccuucaguuu guaaag 16 <210> 450 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 450 cuuuacaaac ugaaggaagc a 21 <210> 451 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 cuuuacaaac ugaaggaagc a 21 <210> 452 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 cuuuacaaac ugaaggaagc a 21 <210> 453 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 cuucaguuug uaaagu 16 <210> 454 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 acuuuacaaa cugaaggaag c 21 <210> 455 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 acuuuacaaa cugaaggaag c 21 <210> 456 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 acuuuacaaa cugaaggaag c 21 <210> 457 <211> 5270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 457 aaagtgattg attcggatac tgacactgta ggatctgggg agagaggaac aaaggaccgt 60 gaaagctgct ctgtaaaagc tgacacagcc ctcccaagtg agcaggactg ttcttcccac 120 tgcaatctga cagtttactg catgcctgga gagaacacag cagtaaaaac caggtttgct 180 actggaaaaa gaggaaagag aagactttca ttgacggacc cagccatggc agcgtagcag 240 ccctgcgttt tagacggcag cagctcggga ctctggacgt gtgtttgccc tcaagtttgc 300 taagctgctg gtttattact gaagaaagaa tgtggcagat tgttttcttt actctgagct 360 gtgatcttgt cttggccgca gcctataaca actttcggaa gagcatggac agcataggaa 420 agaagcaata tcaggtccag catgggtcct gcagctacac tttcctcctg ccagagatgg 480 acaactgccg ctcttcctcc agcccctacg tgtccaatgc tgtgcagagg gacgcgccgc 540 tcgaatacga tgactcggtg cagaggctgc aagtgctgga gaacatcatg gaaaacaaca 600 ctcagtggct aatgaagctt gagaattata tccaggacaa catgaagaaa gaaatggtag 660 agatacagca gaatgcagta cagaaccaga cggctgtgat gatagaaata gggacaaacc 720 tgttgaacca aacagcggag caaacgcgga agttaactga tgtggaagcc caagtattaa 780 atcagaccac gagacttgaa cttcagctct tggaacactc cctctcgaca aacaaattgg 840 aaaaacagat tttggaccag accagtgaaa taaacaaatt gcaagataag aacagtttcc 900 tagaaaagaa ggtgctagct atggaagaca agcacatcat ccaactacag tcaataaaag 960 aagagaaaga tcagctacag gtgttagtat ccaagcaaaa ttccatcatt gaagaactag 1020 aaaaaaaaat agtgactgcc acggtgaata attcagttct tcagaagcag caacatgatc 1080 tcatggagac agttaataac ttactgacta tgatgtccac atcaaactca gctaaggacc 1140 ccactgttgc taaagaagaa caaatcagct tcagagactg tgctgaagta ttcaaatcag 1200 gacacaccac gaatggcatc tacacgttaa cattccctaa ttctacagaa gagatcaagg 1260 cctactgtga catggaagct ggaggaggcg ggtggacaat tattcagcga cgtgaggatg 1320 gcagcgttga ttttcagagg acttggaaag aatataaagt gggatttggt aacccttcag 1380 gagaatattg gctgggaaat gagtttgttt cgcaactgac taatcagcaa cgctatgtgc 1440 ttaaaataca ccttaaagac tgggaaggga atgaggctta ctcattgtat gaacatttct 1500 atctctcaag tgaagaactc aattatagga ttcaccttaa aggacttaca gggacagccg 1560 gcaaaataag cagcatcagc caaccaggaa atgattttag cacaaaggat ggagacaacg 1620 acaaatgtat ttgcaaatgt tcacaaatgc taacaggagg ctggtggttt gatgcatgtg 1680 gtccttccaa cttgaacgga atgtactatc cacagaggca gaacacaaat aagttcaacg 1740 gcattaaatg gtactactgg aaaggctcag gctattcgct caaggccaca accatgatga 1800 tccgaccagc agatttctaa acatcccagt ccacctgagg aactgtctcg aactattttc 1860 aaagacttaa gcccagtgca ctgaaagtca cggctgcgca ctgtgtcctc ttccaccaca 1920 gagggcgtgt gctcggtgct gacgggaccc acatgctcca gattagagcc tgtaaacttt 1980 atcacttaaa cttgcatcac ttaacggacc aaagcaagac cctaaacatc cataattgtg 2040 attagacaga acacctatgc aaagatgaac ccgaggctga gaatcagact gacagtttac 2100 agacgctgct gtcacaacca agaatgttat gtgcaagttt atcagtaaat aactggaaaa 2160 cagaacactt atgttataca atacagatca tcttggaact gcattcttct gagcactgtt 2220 tatacactgt gtaaataccc atatgtcctg aattcaccat cactatcaca attaaaagga 2280 agaaaaaaac tctctaagcc ataaaaagac atattcaggg atattctgag aaggggttac 2340 tagaagttta atatttggaa aaacagttag tgcattttta ctccatctct taggtgcttt 2400 aaatttttat ttcaaaaaca gcgtatttac atttatgttg acagcttagt tataagttaa 2460 tgctcaaata cgtatttcaa atttatatgg tagaaacttc cagaatctct gaaattatca 2520 acagaaacgt gccattttag tttatatgca gaccgtacta tttttttctg cctgattgtt 2580 aaatatgaag gtatttttag taattaaata taacttatta ggggatatgc ctatgtttaa 2640 cttttatgat aatatttaca attttataat ttgtttccaa aagacctaat tgtgccttgt 2700 gataaggaaa cttcttactt ttaatgatga ggaaaattat acatttcatt ctatgacaaa 2760 gaaactttac tatcttctca ctattctaaa acagaggtct gttttctttc ctagtaagat 2820 atatttttat agaactagac tacaatttaa tttctggttg agaaaagcct tctatttaag 2880 aaatttacaa agctatatgt ctcaagattc acccttaaat ttacttaagg aaaaaaataa 2940 ttgacactag taagtttttt tatgtcaatc agcaaactga aaaaaaaaaa agggtttcaa 3000 agtgcaaaaa caaaatctga tgttcataat atatttaaat atttaccaaa aatttgagaa 3060 cacagggctg ggcgcagtgg ctcacaccta taatcccagt acattggtag gcaaggtggg 3120 cagatcacct gaggtcagga gttcaagacc agcctggaca acatggtgaa accctgtctc 3180 tactaaataa tacaaaaatt agccaggcgt gctggcgggc acctgtaatc ccagctactc 3240 gggaggctga ggcagggaga attgcttgca ccagggaggt agaggttgca gtgagccaag 3300 atcgcaccac tgcactccag ccggggcaac agagcaagac tccatctcaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaagaa agaaaagaaa atttgagaac acagctttat actcgggact acaaaaccat 3420 aaactcctgg agttttaact ccttttgaaa ttttcatagt acaattaata ctaatgaaca 3480 tttgtgtaaa gctttataat ttaaaggcaa tttctcatat attcttttct gaatcatttg 3540 caaggaagtt cagagtccag tctgtaacta gcatctacta tatgtctgtc ttcaccttac 3600 agtgttctac cattattttt tctttattcc atttcaaaat ctaatttatt ttaccccaac 3660 ttctccccac cacttgacgt agttttagaa cacacaggtg ttgctacata tttggagtca 3720 atgatggact ctggcaaagt caaggctctg ttttatttcc accaaggtgc acttttccaa 3780 caactattta actagttaag aacctcccta tcttagaact gtatctactt tatatttaag 3840 aaggttttat gaattcaaca acggtatcat ggccttgtat caagttgaaa aacaactgaa 3900 aataagaaaa tttcacagcc tcgaaagaca acaacaagtt tctaggatat ctcaatgaca 3960 agagtgatgg atacttaggt agggaaacgc taatgcagga aaaactggca acaacacaat 4020 ttatatcaat tctctttgta ggcaggtgat aaaaaattca aggacaaatc tcattatgtc 4080 attgtgcatc atatataatc tcttatgagc gagaatgggg ggaatttgtg tttttacttt 4140 acacttcaat tccttacacg gtatttcaaa caaacagttt tgctgagagg agcttttgtc 4200 tctccttaag aaaatgttta taaagctgaa aggaaatcaa acagtaatct taaaaatgaa 4260 aacaaaacaa cccaacaacc tagataacta cagtgatcag ggagcacagt tcaactcctt 4320 gttatgtttt agtcatatgg cctactcaaa cagctaaata acaacaccag tggcagataa 4380 aaatcaccat ttatctttca gctattaatc ttttgaatga ataaactgtg acaaacaaat 4440 taacattttt gaacatgaaa ggcaacttct gcacaatcct gtatccaagc aaactttaaa 4500 ttatccactt aattattact taatcttaaa aaaaattaga acccagaact tttcaatgaa 4560 gcatttgaaa gttgaagtgg aatttaggaa agccataaaa atataaatac tgttatcaca 4620 gcaccagcaa gccataatct ttatacctat cagttctatt tctattaaca gtaaaaacat 4680 taagcaagat ataagactac ctgcccaaga attcagtctt ttttcatttt tgtttttctc 4740 agttctgagg atgttaatcg tcaaattttc tttggactgc attcctcact actttttgca 4800 caatggtctc acgttctcac atttgttctc gcgaataaat tgataaaagg tgttaagttc 4860 tgtgaatgtc tttttaatta tgggcataat tgtgcttgac tggataaaaa cttaagtcca 4920 cccttatgtt tataataatt tcttgagaac agcaaactgc atttaccatc gtaaaacaac 4980 atctgactta cgggagctgc agggaagtgg tgagacagtt cgaacggctc ctcagaaatc 5040 cagtgaccca attctaaaga ccatagcacc tgcaagtgac acaacaagca gatttattat 5100 acatttatta gccttagcag gcaataaacc aagaatcact ttgaagacac agcaaaaagt 5160 gatacactcc gcagatctga aatagatgtg ttctcagaca acaaagtccc ttcagaatct 5220 tcatgttgca taaatgttat gaatattaat aaaaagttga ttgagaaaaa 5270 <210> 458 <211> 2700 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 458 agagagagag agagactgac tgagcaggaa tggtgagatg tttatcatgg gcctcgggga 60 ccccattccc gaggagcttt atgagatgct gagtgaccac tcgatccgct cctttgatga 120 tctccaacgc ctgctgcacg gagaccccgg agaggaagat ggggccgagt tggacctgaa 180 catgacccgc tcccactctg gaggcgagct ggagagcttg gctcgtggaa gaaggagcct 240 gggttccctg accattgctg agccggccat gatcgccgag tgcaagacgc gcaccgaggt 300 gttcgagatc tcccggcgcc tcatagaccg caccaacgcc aacttcctgg tgtggccgcc 360 ctgtgtggag gtgcagcgct gctccggctg ctgcaacaac cgcaacgtgc agtgccgccc 420 cacccaggtg cagctgcgac ctgtccaggt gagaaagatc gagattgtgc ggaagaagcc 480 aatctttaag aaggccacgg tgacgctgga agaccacctg gcatgcaagt gtgagacagt 540 ggcagctgca cggcctgtga cccgaagccc ggggggttcc caggagcagc gagccaaaac 600 gccccaaact cgggtgacca ttcggacggt gcgagtccgc cggcccccca agggcaagca 660 ccggaaattc aagcacacgc atgacaagac ggcactgaag gagacccttg gagcctaggg 720 gcatcggcag gagagtgtgt gggcagggtt atttaatatg gtatttgctg tattgccccc 780 atggggtcct tggagtgata atattgtttc cctcgtccgt ctgtctcgat gcctgattcg 840 gacggccaat ggtgcttccc ccacccctcc acgtgtccgt ccacccttcc atcagcgggt 900 ctcctcccag cggcctccgg cgtcttgccc agcagctcaa gaagaaaaag aaggactgaa 960 ctccatcgcc atcttcttcc cttaactcca agaacttggg ataagagtgt gagagagact 1020 gatggggtcg ctctttgggg gaaacgggct ccttcccctg cacctggcct gggccacacc 1080 tgagcgctgt ggactgtcct gaggagccct gaggacctct cagcatagcc tgcctgatcc 1140 ctgaacccct ggccagctct gaggggaggc acctccaggc aggccaggct gcctcggact 1200 ccatggctaa gaccacagac gggcacacag actggagaaa acccctccca cggtgcccaa 1260 acaccagtca cctcgtctcc ctggtgcctc tgtgcacagt ggcttctttt cgttttcgtt 1320 ttgaagacgt ggactcctct tggtgggtgt ggccagcaca ccaagtggct gggtgccctc 1380 tcaggtgggt tagagatgga gtttgctgtt gaggtggctg tagatggtga cctgggtatc 1440 ccctgcctcc tgccacccct tcctccccac actccactct gattcacctc ttcctctggt 1500 tcctttcatc tctctacctc caccctgcat tttcctcttg tcctggccct tcagtctgct 1560 ccaccaaggg gctcttgaac cccttattaa ggccccagat gatcccagtc actcctctct 1620 agggcagaag actagaggcc agggcagcaa gggacctgct catcatattc caacccagcc 1680 acgactgcca tgtaaggttg tgcagggtgt gtactgcaca aggacattgt atgcagggag 1740 cactgttcac atcatagata aagctgattt gtatatttat tatgacaatt tctggcagat 1800 gtaggtaaag aggaaaagga tccttttcct aattcacaca aagactcctt gtggactggc 1860 tgtgcccctg atgcagcctg tggcttggag tggccaaata ggagggagac tgtggtaggg 1920 gcagggaggc aacactgctg tccacatgac ctccatttcc caaagtcctc tgctccagca 1980 actgcccttc caggtgggtg tgggacacct gggagaaggt ctccaaggga gggtgcagcc 2040 ctcttgcccg cacccctccc tgcttgcaca cttccccatc tttgatcctt ctgagctcca 2100 cctctggtgg ctcctcctag gaaaccagct cgtgggctgg gaatggggga gagaagggaa 2160 aagatcccca agaccccctg gggtgggatc tgagctccca cctcccttcc cacctactgc 2220 actttccccc ttcccgcctt ccaaaacctg cttccttcag tttgtaaagt cggtgattat 2280 atttttgggg gctttccttt tattttttaa atgtaaaatt tatttatatt ccgtatttaa 2340 agttgtaaaa aaaaataacc acaaaacaaa accaaatgaa tccgccggag gtctgtctgt 2400 tggcatcgtg cgtgacaatt aacctttctg ccttggcagg atgtgccgac agcttgcggc 2460 gtgttcctct cactctggga gcctcaggcg tgatctcaca cactggcgtg cacatacaca 2520 cacacacaca tacatgctca cacatgcgtg cacatacacg caggcctgca acttggggga 2580 ggcctctgtc tggcgggaag aagagacaca caggctactc tgttggtctt ggtcctggca 2640 cagctcctga cacgtggact tgtgcgtgtc tctggcagtg acgagagatg ggtttctgca 2700

Claims (95)

  1. ANGPT2 mRNA 서열에 대해 서열 상보성을 갖는 적어도 19 뉴클레오티드(nt) 길이의 안티센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥에 대해 서열 상보성을 갖는 15 내지 17 nt 길이의 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥의 3' 말단이 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 복합체를 형성하는 RNA 복합체.
  2. PDGFB mRNA 서열에 대해 서열 상보성을 갖는 적어도 19 뉴클레오티드(nt) 길이의 안티센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥에 대해 서열 상보성을 갖는 15 내지 17 nt 길이의 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥의 3' 말단이 블런트 말단을 형성하는 복합체를 형성하는 RNA 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    안티센스 가닥이 19 내지 21 nt 길이인 RNA 복합체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    안티센스 가닥이 19 nt 길이인 RNA 복합체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    안티센스 가닥이 20 nt 길이인 RNA 복합체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    안티센스 가닥이 21 nt 길이인 RNA 복합체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    안티센스 가닥이 적어도 24 nt 길이인 RNA 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    센스 가닥이 15 nt 길이인 RNA 복합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    센스 가닥이 16 nt 길이인 RNA 복합체.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    센스 가닥이 17 nt 길이인 RNA 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    센스 가닥이 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 및 표 6에 열거된 센스 가닥 서열로부터 선택된 서열을 갖는 RNA 복합체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥이 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 및 표 6에 열거된 안티센스 가닥 서열로부터 선택된 서열을 갖는 RNA 복합체.
  13. 제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 세포에 의한 안지오포이에틴 2(ANGPT2) 발현을 억제할 수 있는 RNA 복합체.
  14. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 세포에 의한 혈소판 유래 성장 인자 베타(PDGFB) 발현을 억제할 수 있는 RNA 복합체.
  15. 제13항에 있어서,
    세포가 SK-N-SH 세포인 RNA 복합체.
  16. 제14항에 있어서,
    세포가 A549 세포인 RNA 복합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 화학적 변형을 포함하는 RNA 복합체.
  18. 제17항에 있어서,
    화학적 변형이 2'-O-메틸화 뉴클레오시드, 포스포로티오에이트 결합 또는 소수성 모이어티(moiety)인 RNA 복합체.
  19. 제18항에 있어서,
    화학적 변형이 소수성 모이어티인 RNA 복합체.
  20. 제19항에 있어서,
    소수성 모이어티가 콜레스테롤 모이어티인 RNA 복합체.
  21. 제20항에 있어서,
    콜레스테롤 모이어티가 센스 가닥의 3' 말단에 부착되는 RNA 복합체.
  22. 제18항에 있어서,
    RNA 복합체가 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함하는 RNA 복합체.
  23. 제22항에 있어서,
    2'-O-메틸화 뉴클레오시드가 센스 가닥의 3' 말단에 위치하는 RNA 복합체.
  24. 제23항에 있어서,
    센스 가닥의 3' 말단 영역이 복수의 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함하는 RNA 복합체.
  25. 제22항에 있어서,
    2'-O-메틸화 뉴클레오시드가 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하는 RNA 복합체.
  26. 제25항에 있어서,
    안티센스 가닥의 3' 말단 영역이 복수의 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함하는 RNA 복합체.
  27. 제22항에 있어서,
    2'-O-메틸화 뉴클레오시드가 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하는 RNA 복합체.
  28. 제27항에 있어서,
    센스 가닥의 3' 말단 영역이 복수의 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함하고, 안티센스 가닥의 3' 말단 영역이 복수의 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 포함하는 RNA 복합체.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 RNA 복합체.
  30. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 25%가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  31. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 50%가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  32. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 75%가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  33. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 전부가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  34. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 안티센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 25%가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  35. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 안티센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 50%가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  36. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 안티센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 적어도 75%가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  37. 제29항에 있어서,
    RNA 복합체의 안티센스 가닥 내의 리보뉴클레오티드 간의 결합의 전부가 포스포로티오에이트 결합인 RNA 복합체.
  38. 제17항에 있어서,
    RNA 복합체가 표 2, 표 3, 표 5, 및 표 6에 열거된 변형 RNA 복합체인 RNA 복합체.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 전달 비히클의 부재 하에서 세포의 세포막을 침투할 수 있는 RNA 복합체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 세포독성이 아닌 RNA 복합체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 RNA 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 의한 ANGPT2 또는 PDGFB 발현을 억제하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    세포가 A549인 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    세포가 SK-N-SH 세포인 방법.
  44. 제41항에 있어서,
    세포가 종양 세포인 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    종양 세포가 인간 대상체의 종양에 존재하는 방법.
  46. 제41항에 있어서,
    세포가 인간 대상체의 눈에 존재하는 방법.
  47. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 RNA 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관신생 관련 질환을 억제하는 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    혈관신생 관련 질환이 암인 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    암이 고형 종양을 포함하는 방법.
  50. 제47항에 있어서,
    혈관신생 관련 질환이 노인성황반변성(AMD)인 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    AMD가 습성 AMD인 방법.
  52. 제50항에 있어서,
    AMD가 건성 AMD인 방법.
  53. 제47항에 있어서,
    혈관신생 관련 질환이 당뇨병성황반부종(DME)인 방법.
  54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 전달 비히클 없이 투여되는 방법.
  55. 제48항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 종양내로 투여되는 방법.
  56. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 복합체가 대상체의 눈에 투여되는 방법.
  57. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 RNA 복합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대하여 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    RNA 복합체가 전달 비히클 없이 투여되는 방법.
  59. 제57항에 있어서,
    RNA 복합체가 종양내로 투여되는 방법.
  60. 제57항에 있어서,
    RNA 복합체가 정맥내로 투여되는 방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 암 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    제2 암 치료제가 화학요법제인 방법.
  63. 제61항에 있어서,
    제2 암 치료제가 면역 체크포인트(checkpoint) 억제제인 방법.
  64. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 RNA 복합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 AMD 또는 DME를 치료하는 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    AMD가 습성 AMD인 방법.
  66. 제64항에 있어서,
    AMD가 건성 AMD인 방법.
  67. 제64항에 있어서,
    RNA 복합체를 대상체의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서,
    RNA 복합체가 안구내로(예를 들어, 유리체내로) 투여되는 단계를 포함하는 방법.
  69. 제64항에 있어서,
    RNA 복합체가 전달 비히클 없이 투여되는 방법.
  70. 제64항에 있어서,
    RNA 복합체가 비경구적으로 투여되는 방법.
  71. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 RNA 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  72. 제71항의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관신생을 억제하는 방법.
  73. 제71항의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물을 대상체의 종양에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서,
    약학 조성물을 종양내로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료를 위한 제2 약제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  77. 제76항에 있어서,
    제2 약제가 화학요법제인 방법.
  78. 제76항에 있어서,
    제2 약제가 면역 체크포인트 억제제인 방법.
  79. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  80. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물을 경구로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 약학 조성물을 자가-투여하는 방법.
  82. 제71항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 AMD 또는 DME를 치료하는 방법.
  83. 제82항에 있어서,
    대상체가 AMD를 갖는 방법.
  84. 제83항에 있어서,
    AMD가 습성 AMD인 방법.
  85. 제83항에 있어서,
    AMD가 건성 AMD인 방법.
  86. 제82항에 있어서,
    대상체가 DME를 갖는 방법.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물을 대상체의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  88. 제87항에 있어서,
    약학 조성물이 점안액인 방법.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물을 안구내로(예를 들어, 유리체내로) 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  90. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  91. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물을 경구로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  92. 제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 약학 조성물을 자가-투여하는 방법.
  93. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    AMD의 치료를 위한 제2 약제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  94. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    DME의 치료를 위한 제2 약제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서,
    제2 약제가 라니비주맙, 베바시주맙, 페갑타닙(pegaptanib), 또는 아피버셉트(afibercept)인 방법.
KR1020187024040A 2016-02-02 2017-02-01 Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 KR20180104692A (ko)

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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012053741A2 (ko) 2010-10-22 2012-04-26 성균관대학교산학협력단 Rna 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도
DK2853597T3 (en) 2012-05-22 2019-04-08 Olix Pharmaceuticals Inc RNA INTERFERENCE-INducing NUCLEIC ACID MOLECULES WITH CELL PENETENING EQUIPMENT AND USE THEREOF
US10059949B2 (en) 2015-11-16 2018-08-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of age-related macular degeneration using RNA complexes that target MYD88 or TLR3
WO2017134525A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGET lL4Rα, TRPA1, OR F2RL1
EP3411481A4 (en) 2016-02-02 2020-02-26 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH ANGIOGENESIS USING ANGPT2 AND PDGFB TARGETED RNA COMPLEXES
US10301628B2 (en) 2016-04-11 2019-05-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
CN110770343A (zh) 2017-02-10 2020-02-07 成均馆大学校产学协力团 用于rna干扰的长双链rna

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837258A (en) 1991-08-30 1998-11-17 University Of South Florida Induction of tissue, bone or cartilage formation using connective tissue growth factor
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US20080188430A1 (en) 2001-05-18 2008-08-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050282188A1 (en) 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040248835A1 (en) 2001-10-26 2004-12-09 Anja Krebs Use of a double-stranded ribonucleic acid for treating an infection with a positivestrand rna-virus
US20040138163A1 (en) 2002-05-29 2004-07-15 Mcswiggen James RNA interference mediated inhibition of vascular edothelial growth factor and vascular edothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
WO2004080406A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Alnylam Pharmaceuticals Therapeutic compositions
US20040198640A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Dharmacon, Inc. Stabilized polynucleotides for use in RNA interference
US20050136437A1 (en) 2003-08-25 2005-06-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nanoparticles for delivery of nucleic acids and stable double-stranded RNA
US20060134787A1 (en) 2004-12-22 2006-06-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA
WO2005062937A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna
US20060069050A1 (en) 2004-02-17 2006-03-30 University Of Massachusetts Methods and compositions for mediating gene silencing
US7947659B2 (en) 2004-03-12 2011-05-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
JP2008512500A (ja) 2004-09-10 2008-04-24 ソマジェニックス インコーポレーティッド ウィルス遺伝子発現を効率的に阻害する低分子干渉ｒｎａおよびその使用方法
US7528118B2 (en) 2004-09-24 2009-05-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of ApoB and uses thereof
US20060142228A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Ambion, Inc. Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference
TWI386225B (zh) 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
WO2006110688A2 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Rnai therapeutic for respiratory virus infection
ATE546526T1 (de) 2005-05-25 2012-03-15 Univ York Hybrid-interferenz-rna
JP5193856B2 (ja) 2005-06-24 2013-05-08 インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー 不活化キメラワクチン及び関連する使用方法
FR2890859B1 (fr) 2005-09-21 2012-12-21 Oreal Oligonucleotide d'arn double brin inhibant l'expression de la tyrosinase
US7825099B2 (en) 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
AU2007210034A1 (en) 2006-01-26 2007-08-09 University Of Massachusetts RNA silencing agents for use in therapy and nanotransporters for efficient delivery of same
CA2640423C (en) 2006-01-27 2016-03-15 Biogen Idec Ma Inc. Nogo receptor antagonists
US20070218495A1 (en) 2006-03-16 2007-09-20 Dharmacon, Inc. Methods, libraries and computer program products for gene silencing with reduced off-target effects
US7700541B2 (en) 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
US20100105134A1 (en) * 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2008109372A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgf gene expression and uses thereof
CA2679867A1 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf family gene expression and uses thereof
DK2164967T3 (en) 2007-05-31 2015-10-19 Univ Iowa Res Found Reduction of off-target rna interferenstoksicitet
WO2009002462A1 (en) 2007-06-22 2008-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pre-mirna loop-modulated target regulation
JP2010532662A (ja) * 2007-07-06 2010-10-14 イントラダイム コーポレイション 癌および他の血管新生関連疾患の治療のための方法および組成物
WO2009020344A2 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Postech Acad Ind Found Small interfering rnas (sirnas) controlling multiple target genes and method for preparing the same
EP2201022A4 (en) 2007-08-27 2012-01-04 Boston Biomedical Inc COMPOSITION OF ASYMMETRIC RNA DUPLEX AS MICRO-RNA MIMETICUM OR INHIBOTOR
EP2195428B1 (en) 2007-09-19 2013-12-11 Applied Biosystems, LLC SiRNA SEQUENCE-INDEPENDENT MODIFICATION FORMATS FOR REDUCING OFF-TARGET PHENOTYPIC EFFECTS IN RNAi, AND STABILIZED FORMS THEREOF
BRPI0817605A2 (pt) 2007-10-03 2017-05-09 Quark Pharmaceuticals Inc novas estruturas de sirna
US8614311B2 (en) 2007-12-12 2013-12-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. RTP801L siRNA compounds and methods of use thereof
KR100949791B1 (ko) 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
EP2257313A2 (en) 2008-02-21 2010-12-08 University of Kentucky Research Foundation Ultra-small rnas as toll-like receptor-3 antagonists
US20110251258A1 (en) 2008-07-24 2011-10-13 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rnai constructs and uses thereof
JP5294344B2 (ja) 2008-09-08 2013-09-18 学校法人福岡大学 白血病治療用医薬組成物
CA2743981C (en) 2008-09-22 2019-01-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering rnai compounds
US20100227920A1 (en) 2008-09-29 2010-09-09 The Regents Of The University Of California Aldehyde dehydrogenase inhibitors as novel depigmenting agents
US9745574B2 (en) 2009-02-04 2017-08-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US8829179B2 (en) * 2009-02-18 2014-09-09 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of ANG2
JP2012520683A (ja) 2009-03-19 2012-09-10 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
PL3199165T3 (pl) 2009-04-03 2022-09-05 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i kompozycje do specyficznego hamowania kras przez asymetryczne dwuniciowe rna
US8472766B2 (en) 2009-08-14 2013-06-25 Massachusetts Institute Of Technology Waveguide coupler having continuous three-dimensional tapering
KR101207561B1 (ko) 2009-12-15 2012-12-04 주식회사 코리아나화장품 티로시나제의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
CN106074591B (zh) 2010-03-24 2020-01-14 菲奥医药公司 眼部症候中的rna干扰
EP2569445B1 (en) 2010-05-12 2017-01-04 Val-Chum, Limited Partnership Screening assays based on abhd6 for selecting insulin secretion promoting agents
AU2011302152B2 (en) 2010-09-15 2015-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
CN103080314B (zh) * 2010-09-30 2016-04-13 Lsip基金运营联合公司 显性突变基因表达抑制剂
WO2012053741A2 (ko) 2010-10-22 2012-04-26 성균관대학교산학협력단 Rna 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도
AU2011338682B2 (en) 2010-12-06 2017-04-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
CN102719432B (zh) 2011-03-29 2013-10-23 南京大学 特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用
KR101590586B1 (ko) 2011-05-30 2016-02-01 성균관대학교산학협력단 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ
DK2853597T3 (en) 2012-05-22 2019-04-08 Olix Pharmaceuticals Inc RNA INTERFERENCE-INducing NUCLEIC ACID MOLECULES WITH CELL PENETENING EQUIPMENT AND USE THEREOF
WO2014043291A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
AU2014284836B2 (en) 2013-07-05 2017-07-27 Bioneer Corporation Respiratory disease-related gene specific siRNA, double-helical oligo RNA structure containing siRNA, compositon containing same for preventing or treating respiratory disease
WO2015015498A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Qbi Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
US9790506B2 (en) 2013-10-02 2017-10-17 The Regents Of The University Of California Diagnostic and screening methods for atopic dermatitis
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US20170226507A1 (en) 2014-05-05 2017-08-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Coordinate control of pathogenic signaling by the mir-130/301 family in pulmonary hypertension and fibroproliferative diseases
US9139648B1 (en) * 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
EP3277811B1 (en) 2015-04-03 2020-12-23 University of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
CN108138181B (zh) 2015-07-27 2022-05-24 奥利克斯医药有限公司 抑制黑色素生成的rna复合物
US10059949B2 (en) 2015-11-16 2018-08-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of age-related macular degeneration using RNA complexes that target MYD88 or TLR3
WO2017134525A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGET lL4Rα, TRPA1, OR F2RL1
EP3411481A4 (en) 2016-02-02 2020-02-26 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH ANGIOGENESIS USING ANGPT2 AND PDGFB TARGETED RNA COMPLEXES
US10301628B2 (en) 2016-04-11 2019-05-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
CN110770343A (zh) 2017-02-10 2020-02-07 成均馆大学校产学协力团 用于rna干扰的长双链rna

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