CN110770343A - 用于rna干扰的长双链rna - Google Patents

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Abstract

本发明部分涉及抑制基因表达的长双链RNA(dsRNA)(例如30个或更多个碱基对)。

Description

用于RNA干扰的长双链RNA
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月10日提交的美国临时专利申请号62/457,282的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明部分涉及用于抑制基因表达的长双链RNA。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已通过EFS-Web以ASCII格式提交，在此通过引用整体并入。所述ASCII副本于2018年2月12日创建，名为OLX-003PC_Sequence Listing_ST25.txt，大小为8,192个字节。
技术背景
RNA干扰(RNAi)是进化上保守的生物学过程，其中双链RNA(dsRNA)通过中和具有互补核苷酸序列的靶向信使RNA(mRNA)来抑制基因表达(Hannon等,Nature,418:244-251,2002)。RNAi途径由Dicer核酸内切酶启动，该酶将长dsRNA切割成短干扰RNA(siRNA)片段，该片段具有19个互补碱基配对的核苷酸，并且在每个末端具有两个核苷酸的3'突出端。siRNA解链为两条单链RNA，即一条过客链和一条引导链。引导链被结合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。当引导链中的反义序列与mRNA中的互补序列配对并通过Argonaute 2(Ago2)诱导切割时，就会发生转录后基因沉默，Ago2是RISC复合物的催化成分。
RNAi首先发现于线虫和节肢动物中(Fire等,Nature,391:806-811,1998)。在这些门中，可用0.3至1kb的dsRNA诱导RNAi。由于免疫应答的激活，这种RNAi程序在哺乳动物细胞中失效(Stark等,Annu.Rev.Biochem.,67:227-264,1998)。这种形式的先天免疫表现为干扰素表达的诱导，由模式识别受体介导，该模式识别受体与通常与病毒感染有关的RNA形式结合。为了避免激活抗病毒应答，常常使用模拟切丁酶消化产物的合成21-mer siRNA在哺乳动物细胞中诱导RNAi(Elbashir等,Nature,411:494-498,2001)。
长度为25-30个核苷酸的RNA双链体的效力可比相应的常规21-mer siRNA高100倍。这些25-30bp的双链体增强的效力归因于它们是Dicer底物的事实，直接将siRNA的产生与结合到RISC复合物中联系起来(Kim等,Nat.Biotechnol.23:222-6,2005)。更长的dsRNA双链体甚至可以抑制两个不同靶mRNA序列的表达。当反义序列的5'末端位于dsRNA的任一末端时，用单个dsRNA构建体同时下调两个mRNA最有效(Chang等,Mol.Cells 27,689-695,2009)。
将平末端dsRNA的长度增加至27bp诱导了免疫敏感T98G细胞系中的干扰素表达(Marques等,Nat.Biotechnol.24:559-65,2006)。这样的观察结果不支持更长的干扰RNA的开发。
需要具有最小先天免疫应答激活的有效基因沉默构建体，包括可以选择性靶向多于一个mRNA或多于一个mRNA区域的构建体。本发明满足了这一目的和其他目的。
附图简要说明
图1A是长度不同的多种平末端dsRNA的两条链的互补核苷酸序列(即长度为19bp(顶链为SEQ ID NO：1；底链为SEQ ID NO：2)、38bp(顶链为SEQ ID NO：3；底链为SEQ ID NO：4)、50bp(顶链为SEQ ID NO：5；底链为SEQ ID NO：6)和60bp(顶链为SEQ ID NO：7；底链为SEQ ID NO：8)的平末端dsRNA)。
图1B是长度不同的具有2bp 3'突出端的多种dsRNA的两条链的互补核苷酸序列(即，长度为19+2(顶链为SEQ ID NO：9；底链为SEQ ID NO：10)、38+2(顶链为SEQ ID NO：11；底链为SEQ ID NO：12)、50+2(顶链为SEQ ID NO：13；底链为SEQ ID NO：14)和60+2(顶链为SEQ ID NO：15；底链为SEQ ID NO：16)的dsRNA)。
图1C是显示野生型RAW 264.7细胞和RAW 264.7RIG-I敲除细胞中所示dsRNA激活的抗病毒应答的图。
图2是显示在野生型RAW 264.7细胞、RAW 264.7RIG-I敲除细胞和RAW 264.7MDA5敲除细胞中，靶向具有30、40、50和60个碱基对长度的存活素基因的平末端dsRNA的相对ISG表达和靶向具有两个核苷酸3'突出端的存活素基因的dsRNA的相对ISG表达的图。
图3是显示在用长度为40bp和60bp的靶向存活素基因的平末端dsRNA转染的的细胞中IFN-β和IFIT1(ISG56)的基因表达的图。
图4是显示与用于存活素的常规siRNA相比，具有30bp、30+2、40bp、40+2、50bp、50+2和60bp的靶向存活素的dsRNA敲降了靶存活素mRNA的图。
图5A是显示40+2、50+2和60+2的靶向存活素的dsRNA的核苷酸序列的表。
图5B是显示30bp、30+2、40bp、40+2、50bp、50+2和60bp的靶向存活素的dsRNA的凝胶条带的图像。
图6A是显示实施例1的靶向荧光素酶-GFP的dsRNA的核苷酸序列的表。
图6B是显示实施例2的靶向存活素的dsRNA的核苷酸序列的表(即30bp、30+2、40bp、40+2、50bp、50+2、60bp和60+2)。图6B还显示了常规存活素siRNA(si-存活素；si-sur19+2)的核苷酸序列。
发明内容
本发明提供了可以在不诱导显著的抗病毒应答的情况下抑制哺乳动物细胞中基因表达的长双链RNA(ldRNA)，以及使用其的基因沉默方法。出人意料的是，尽管已显示平末端38-mer dsRNA强烈诱导干扰素表达，但是当平末端dsRNA的长度增加时，包括对具有50或60个碱基对和任选地一个或多个3’二核苷酸突出端的构建体，都未观察到这种细胞应答。这些更长的构建体可以是有效的基因沉默子，并且可以提供沉默多个mRNA或mRNA区域的能力。
根据实施方案，ldRNA的每个末端可以是平末端的，或者其可以具有3'突出端。一些ldRNA在两个末端都是平末端。切丁酶切割事件的siRNA产物在两个末端具有两个核苷酸的3'突出端。这些3'突出端抑制识别RIG-I，这是一种具有RNA解旋酶活性的模式识别受体(Marques等,Nat.Biotechnol.24:559-65,2006)。相反，某些病毒产生具有平末端的dsRNA。这些外源dsRNA可以诱导干扰素和具有其他先天免疫特征的基因的表达。然而，根据本发明的实施方案的多种ldRNA几乎不引起或不引起抗病毒应答的激活。
本发明的多种ldRNA包含长度为至少40bp、或至少45bp、或至少50bp、或至少60bp、或至少80bp、或至少100bp的双链体。在多个实施方案中，ldRNA包含长度不超过200bp、或不超过150bp、或不超过100bp的双链体。例如，根据本发明的实施方案的多种ldRNA包含长度为40至200bp、或长度为40至150bp、或长度为40至100bp；或长度为50至200bp、或长度为50至150bp、或长度为50至100bp的双链体。在一些实施方案中，ldRNA包含长度为40至80bp、长度为45至80bp、长度为50至80bp、长度为40至60bp、长度为45至60bp或长度为50至60bp的双链体。
在多个实施方案中，双链体包含两条基本互补的RNA链。在一些实施方案中，双链体仅包含具有完全互补性的规范碱基对。在一些实施方案中，RNA包含最多10个或最多5个(例如1、2或3个)错配的碱基或非规范碱基对(例如G:U碱基对)。
在一些实施方案中，ldRNA的两个末端是平末端。在一些实施方案中，一个末端或两个末端在3'末端上包括突出端。在一些实施方案中，突出端是二核苷酸突出端(例如，dTdT)。
通过测量相对干扰素激活来确定抗病毒(先天免疫)应答的诱导。在以下细胞系中，本发明的多种ldRNA诱导的干扰素或IRF表达的水平是模拟转染诱导的表达水平的不超过15倍、不超过10倍或不超过5倍，所述细胞系包括但不限于野生型RAW 264.7细胞、RAW264.7RIG-I敲除细胞和RAW264.7MDA5敲除细胞。
本发明的多种ldRNA可以通过RNAi途径减少靶基因的表达。这些ldRNA包含与靶mRNA互补的至少8bp的引导序列。在一些实施方案中，ldRNA包含与单个mRNA内的不同区段互补的2、3、4或更多条引导序列。在其他实施方案中，本发明的ldRNA具有与2、3、4或更多个不同的靶mRNA互补的引导序列。在一些实施方案中，与mRNA互补的序列独立地选自在8至50个核苷酸范围内，或在8至40个核苷酸范围内，或在8至30个核苷酸范围内或在8至20个核苷酸范围内的序列。在一些实施方案中，与mRNA互补的序列独立地选自15至50个核苷酸范围内、或15至40个核苷酸范围内、或15至30个核苷酸范围内或15至20个核苷酸范围内的序列。例如，互补序列可以是约15nt、约16nt、约17nt、约18nt、约19nt或约20nt。
ldRNA中的引导序列是反义序列。它们可以与5'非翻译区、起始位点、编码序列、终止位点或3'非翻译区中的mRNA结合。优选地，它们结合靶mRNA内的可及区段。
ldRNA是其中两条链彼此互补且方向相反的dsRNA。因此，一条RNA链的5'末端和另一条RNA链的3'末端位于ldRNA的同一末端。一些ldRNA包含一条引导序列，其中该引导序列的5'末端位于该ldRNA的一条RNA链的5'末端。其他ldRNA包含两条引导序列，其中两条引导序列的5'末端位于两条RNA链的5'末端，而这两条RNA链本身位于ldRNA的相对末端。
ldRNA的RNAi活性可以通过使用常规方法(例如Northern印迹、定量rtPCR和本领域众所周知的其他技术)测量靶mRNA的水平来确定。如果ldRNA具有RNAi活性，则靶mRNA水平将降低。如果ldRNA的RNAi活性对靶mRNA具有特异性，则非靶mRNA的水平不会降低。或者，可以通过定量由靶mRNA编码的蛋白质的表达或活性来间接测量RNAi活性。蛋白质表达和活性通过本领域已知的常规方法来测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和酶测定。
ldRNA中的RNA链可以具有修饰的骨架、修饰的核苷酸和/或其他化学修饰。
ldRNA中一条或两条RNA链的磷酸骨架可以被一个或多个硫代磷酸酯键取代。自然界中发现的规范RNA主链包括核苷酸之间的磷酸二酯键。硫代磷酸酯键的修饰通过用硫原子取代非桥连氧之一来改变磷酸酯键。这种改变改变了多核苷酸的整体化学性质。特别地，添加硫代磷酸酯键可以稳定多核苷酸主链以抵抗核酸酶降解，从而有效地增加其在细胞环境中的半衰期。硫代磷酸酯键可以整合到ldRNA的任一或两条链中。在一些实施方案中，ldRNA的至少约1％、2％、4％、8％、16％、32％或约50％的核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。
ldRNA可以由非规范核苷酸合成，例如但不限于，假尿苷、N1-甲基假尿苷和/或5-甲基胞苷。这样的核苷酸可以减少通过toll样受体的先天免疫激活。
可以将ldRNA设计为靶向几乎任何mRNA。例如，多种ldRNA降低编码酶、转录因子、信号传导蛋白、激酶、磷酸酶、离子通道、细胞质蛋白、膜蛋白和分泌蛋白的mRNA水平。
ldRNA可以靶向病毒mRNA。在一些实施方案中，ldRNA中的多条引导序列与单个靶病毒mRNA的不同区段互补。在其他实施方案中，单个ldRNA内的引导序列与两个或更多个病毒mRNA靶中的序列互补。
多种ldRNA靶向编码与癌细胞生长和/或存活至关重要的途径相关的蛋白的mRNA。减少此类蛋白的表达降低癌细胞的生长或存活。在多个实施方案中，本发明的ldRNA包含两条或更多条针对与癌细胞生长和/或存活至关重要的途径相关的蛋白的引导序列。本发明还提供了用ldRNA治疗癌症患者的方法，该ldRNA降低了与癌症相关的mRNA的水平。
多种ldRNA靶向编码信号转导蛋白的mRNA。ldRNA可以靶向编码信号转导蛋白的mRNA的两个或更多个不同区段。或者，单个多功能ldRNA中的引导序列可靶向两个或更多个编码相关信号转导蛋白的mRNA。相关信号转导蛋白可以在相同的信号转导途径中、在平行的信号转导途径中或在不同于共同来源的信号转导途径中起作用。多功能ldRNA还可靶向编码可在独立信号转导途径中起作用的蛋白的mRNA。
本发明包括通过向细胞、组织或动物施用本发明的ldRNA来降低靶基因表达的方法。受试者可以是需要治疗疾病或病况或处于疾病或病况风险的人或动物受试者或患者。该组合物可以离体或体内施用于细胞。
任何哺乳动物细胞都适用于ldRNA治疗，无论它对dsDNA诱导先天免疫是敏感还是不敏感。例如，可以将ldRNA施用于免疫敏感性T98G胶质母细胞瘤细胞和免疫不敏感性HeLa癌细胞。靶基因的表达在两种细胞类型中都可以被抑制，并且在施用ldRNA后干扰素的表达将比在施用平末端38bp dsRNA后更低。可以通过与ldRNA接触而诱导表达蛋白的细胞类型的非限制性实例包括角质形成细胞、黑素细胞、巨噬细胞、肝细胞、肺细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和淋巴细胞(例如，B细胞或T细胞或其前体细胞)。此外，ldRNA可以通过增生细胞、恶性细胞和干细胞诱导蛋白表达。在多个实施方案中，靶细胞选自抗原呈递细胞、树突细胞、巨噬细胞、神经细胞、脾细胞、淋巴样细胞、肺细胞(例如肺泡细胞)、皮肤细胞(例如角质形成细胞或成纤维细胞)、内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、间充质细胞、上皮细胞或造血细胞。
可以将ldRNA施用到多种组织，包括皮肤、视网膜、肺、肝、心脏等。另外，可以将ldRNA全身性施用于整个动物。预期全身性施用将导致免疫敏感性和免疫抗性细胞摄取。可以将ldRNA安全地施用于包括免疫敏感性细胞在内的混合细胞群，因为它的免疫原性低于其他dsRNA。
在多个实施方案中，本发明的ldRNA可以引入药物制剂中。药物制剂的非限制性实例包括局部乳膏或软膏或水溶液或缓冲溶液，其任选包含稳定剂。药物制剂还可以包含运载体，以促进细胞和组织对细胞的摄取。
药学上可接受的载体或稀释剂是本领域技术人员众所周知的。在多个实施方案中，载体或稀释剂可以是用于固体制剂的固体载体或稀释剂，用于液体制剂的液体载体或稀释剂或它们的混合物。
在另一个实施方案中，固体载体/稀释剂包括但不限于树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯酸甲酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或它们的混合物。
在一些实施方案中，药物组合物是控释组合物，即其中ldRNA在施用后一段时间内释放的组合物。控释或缓释组合物包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在另一个实施方案中，该组合物是速释组合物，即在施用后立即释放全部化合物的组合物。
在另一实施方案中，将ldRNA以中和的药学上可接受的盐形式配制成组合物。
本领域技术人员将理解，向受试者施用ldRNA的方式将取决于靶mRNA、靶细胞、待治疗的疾病或病状以及药物制剂的形式。
可以通过本领域已知的多种方法来施用ldRNA。例如，ldRNA的施用可以是吸入、静脉内注射或局部施用。在一些实施方案中，将ldRNA以有效量施用于患者，例如通过皮下注射、皮内注射、肌内注射、眼内注射或肿瘤内注射，或其他肠胃外施用形式。
在一些实施方案中，ldRNA口服施用，并因此被配制成适于口服施用的形式，即作为固体或液体制剂。合适的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、弹丸剂(pellet)等。合适的液体口服制剂包括溶液、悬浮液、分散体、乳液、油等。在本发明的另一个实施方案中，将ldRNA配制在胶囊中。根据该实施方案，除了活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包含硬明胶胶囊。
在另一个实施方案中，将ldRNA局部施用至体表，并因此以适于局部施用的形式配制。合适的局部制剂包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等。对于局部施用，制备组合物或其生理学耐受的衍生物，并以在具有或不具有药物载体的生理学可接受的稀释剂中的溶液、悬浮液或乳剂形式施用。
在另一个实施方案中，ldRNA作为栓剂施用，例如直肠栓剂或尿道栓剂。在另一个实施方案中，药物组合物通过皮下植入弹丸剂来施用。在另一个实施方案中，弹丸剂提供试剂在一段时间内的受控释放。
在多个实施方案中，剂量是每日剂量、每周剂量、每月剂量或每年剂量。在一些实施方案中，该剂量是一次剂量，或该组合物被施用至少10次。在一些实施方案中，所述组合物每年至少施用6次或至少12次，持续数年。
本发明提供了通过施用ldRNA治疗多种疾病或病况的方法。ldRNA将减少一种或多种有害靶基因的表达，从而治疗该疾病或病况。例如，可以用ldRNA治疗影响皮肤的疾病或病况。适用于用ldRNA治疗的皮肤疾病或病况包括皮肤增白(skin whitening)、变黑或疤痕，特应性皮炎，牛皮癣，硬皮病，脱毛或皮肤皱纹。还可以施用ldRNA来治疗表现为纤维化的疾病或病况。可以用ldRNA治疗的纤维化疾病或病况是肝纤维化、视网膜纤维化和肺纤维化(例如特应性肺纤维化)。可以用ldRNA治疗的眼部病况包括黄斑变性(湿性或干性AMD)。可以用ldRNA治疗的炎性病况包括类风湿关节炎和克罗恩氏病。在一些实施方案中，所述病况是神经性疼痛。在一些实施方案中，所述病况是高胆固醇血症、动脉粥样硬化或心脏病。
在一些实施方案中，ldRNA靶向多个mRNA。示例性靶标包括编码CTGF的mRNA和编码MYD88的mRNA。
ldRNA是带负电荷的核酸聚合物。为了促进细胞摄取，可以用将核酸转运到细胞中的运载体配制ldRNA。合适的运载体包括磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物、聚乙烯亚胺和基于蛋白质的转染试剂。
在一些实施方案中，转染试剂形成脂质体。脂质体可以增加细胞内稳定性，提高摄取效率并改善生物活性。脂质体是由脂质构成的中空球形囊泡，脂质的排列方式与构成细胞膜的脂质相似。它们可能具有内部水空间，用于俘获水溶性化合物，其大小范围为直径从0.2微米到几微米。参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat等,in Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327。
亲脂性部分可以与ldRNA中的一个或多个核苷酸缀合。优选地，亲脂性部分缀合至ldRNA的RNA链之一的5'末端。亲脂性部分的非限制性实例包括胆固醇、生育酚和具有10个或更多个碳原子的长链脂肪酸，例如硬脂酸或棕榈酸。共价结合的亲脂性部分可以促进ldRNA进入细胞。这样的方法是已知的并且在例如PCT/KR2013/004463和US 2015/0111948中进行了描述，其全部内容通过引用整体并入本文。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。通常，本文使用的术语是本领域公知的并且通常使用的。
实施例
实施例1：对多种dsRNA的免疫应答
为了测量免疫应答，在补充了10％胎牛血清、100μg/ml Normocin(InvivoGen)和200μg/ml博来霉素(InvivoGen)的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco)中繁殖RAW 264.7细胞。将细胞以1.0×104个细胞/cm2的密度接种在96孔板中，并在无抗生素的情况下培养24小时。使用RNAiMAX转染剂(Thermo Fisher Scientific)用10nM dsRNA转染细胞。转染后24小时和48小时，将10μl上清液等分试样取样到96孔白板中。将50μl Quanti-Luc荧光素酶底物(InvivoGen)添加到每个孔中，并立即使用酶标仪(PerkinElmer)读取板的荧光素酶活性。
合成长度为19、38、50和60个碱基对的平末端dsRNA(图1A和6A)。通过测量相对IRF激活来确定对这些dsRNA的抗病毒应答(图1C)。如所预期的，38bp dsRNA诱导了强烈的抗病毒应答，而短的19bp dsRNA却没有。令人惊讶地，与对38-mer的应答相比，对50bp dsRNA的抗病毒应答降低了＞80％，并且对于60-mer观察到更低的应答。所有这些抗病毒应答在RIG-I敲除细胞中均被基本消除，这证实RIG-I是识别平末端dsRNA的dsRNA传感器。其他测试显示对阳性对照polyIC有抗病毒应答，而在模拟处理的细胞中无应答。此外，在dsRNA上添加2个核苷酸的3'突出端(图1B和6A)也消除了抗病毒应答，这与先前的研究一致，先前的研究表明RIG-I未被具有3'突出端的dsRNA激活(Marques等,Nat.Biotechnol.24:559-65,2006)。
实施例2：长dsRNA的免疫应答和敲降效力
合成了靶向存活素基因的平末端dsRNA，其长度为30、40、50和60个碱基对(见图6B)。还合成了具有两个核苷酸3'突出端的dsRNA(即30+2；40+2；50+2；和60+2)。参见图5A和6B。上述公开的靶向存活素的dsRNA的识别示于图5B。通过测量相对ISG表达确定对这些dsRNA的抗病毒应答(图2)。在野生型(WT)、RIG-I阴性(RIG-I(-/-))或MDA5阴性(MDA5(-/-))的RAW 264.7细胞中测试了dsRNA。
结果表明，40bp和50bp dsRNA产生了一些免疫刺激(通过相对ISG表达测量)。图2。但是，与常规概念相反，与60bp dsRNA产生的相对ISG相比，40bp和50bp dsRNA表达多得多的相对ISG。图2。
40+2、50+2和60bp ldRNA显示出非常少的ISG表达。图2。数据显示在3'末端的两个核苷酸RNA突出端(例如40+2和50+2)有效地绕过了先天免疫系统。图2。
结果还表明，RIG-I缺陷细胞(RIG-I(-/-))不诱导ISG蛋白的表达，这表明RIG-I是识别化学合成的长dsRNA的模式识别受体(PRR)。图2。
图3显示了用60bp dsRNA转染未上调IFN-β和IFIT1(ISG56)基因的表达。该结果表明ISG54不被60bp dsRNA上调的原因不是由于PKR的翻译抑制，而是由于60bp dsRNA不激活先天免疫系统。
图4显示了上述公开的30bp、30+2、40bp、40+2、50bp、50+2和60bp的靶向存活素的dsRNA可以沉默存活素基因表达，其功效与存活素的常规siRNA(si-sur 19+2)相同。
等同物
尽管已经结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，本发明能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖总体上遵循本发明的原理的本发明的任何变化、使用或修改，包括在本发明所属领域内的已知或惯常实践之内的偏离本发明的并且可以应用于上文阐述的基本特征以及所附权利要求的范围内的与本公开的偏离。
仅使用常规实验，本领域技术人员就能认识到或能够确定本文具体描述的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在包含在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 李东起
<120> 用于RNA干扰的长双链RNA
<130> OLX-003PC
<150> US62457282
<151> 2017-02-10
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
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ttaaguggaa cuacgguaag aaccggauuc gaggguuagu agguuuuuua au 52
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uucaccuuga ugccauucuu ggccuugucg anaaaaagcu cccaaucauc caaaaaauua 60
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ac 62
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aaacuuuuac aacuagagga aaggauucug uaacgauucc ccgggugucc uuccgaccac 60
cg 62
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<223> 合成多核苷酸
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ucacacacaa gucaugcaut t 21
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成多核苷酸
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ttagugugug uucaguacgu a 21

Claims (47)

1.一种能够通过RNA干扰(RNAi)机制触发基因沉默的长双链RNA(ldRNA)，其包含：两条具有至少40个碱基对的双链体长度的基本互补的RNA链，以及至少一条引导序列。
2.根据权利要求1所述的ldRNA，其包含一个或多个修饰的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的ldRNA，其包含一个或多个硫代磷酸酯连接的核苷酸。
4.根据权利要求2或3任一项所述的ldRNA，其包含抑制Toll样受体的RNA识别的一个或多个修饰的核苷酸。
5.根据权利要求4所述的ldRNA，其中修饰的核苷酸包括假尿苷。
6.根据权利要求4所述的ldRNA，其中修饰的核苷酸包括5-甲基胞苷。
7.根据权利要求5所述的ldRNA，其中修饰的核苷酸包括N1-甲基假尿苷。
8.根据权利要求1至7任一项所述的ldRNA，其还包含亲脂性缀合物。
9.根据权利要求8所述的ldRNA，其中亲脂性缀合物选自胆固醇、胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯、胆汁酸、胆酸、脱氧胆酸或脱氢胆酸。
10.根据权利要求8所述的ldRNA，其中亲脂性部分是胆固醇。
11.根据权利要求8至10任一项所述的ldRNA，其中亲脂性缀合物缀合至多核糖核苷酸的3'末端。
12.根据权利要求1至11任一项所述的ldRNA，其中ldRNA的一个或两个末端是平末端。
13.根据权利要求1至12任一项所述的ldRNA，其中双链体长度为至少45bp。
14.根据权利要求1至12任一项所述的ldRNA，其中双链体长度为至少50bp。
15.根据权利要求1至12任一项所述的ldRNA，其中双链体长度为至少60bp。
16.根据权利要求1至15任一项所述的ldRNA，其中相对IRF激活不大于10。
17.根据权利要求1至15任一项所述的ldRNA，其中相对IRF激活不大于5。
18.根据权利要求1至17任一项所述的ldRNA，其包含与一种或多种mRNA互补的一条或多条至少8bp的序列。
19.根据权利要求18所述的ldRNA，其包含与相同mRNA互补的两条或更多条至少8bp的序列。
20.根据权利要求18所述的ldRNA，其包含与两种或更多种不同mRNA互补的两条或更多条至少8bp的序列。
21.根据权利要求18所述的ldRNA，其包含与三种或更多种不同mRNA互补的三条或更多条至少8bp的序列。
22.根据权利要求1至21任一项所述的ldRNA，其中ldRNA的一个末端包含与mRNA互补的反义序列的5'末端。
23.根据权利要求1至21任一项所述的ldRNA，其中ldRNA的两个末端包含与mRNA互补的反义序列的5'末端。
24.根据权利要求18至23任一项所述的ldRNA，其中与mRNA互补的序列独立地选自长度为8至50个核苷酸的序列。
25.根据权利要求24所述的ldRNA，其中与mRNA互补的序列独立地选自长度为15至50个核苷酸的序列。
26.根据权利要求18至25任一项所述的ldRNA，其中mRNA是病毒mRNA。
27.根据权利要求18至25任一项所述的ldRNA，其中mRNA涉及对于癌细胞生长和存活至关重要的多个途径。
28.根据权利要求18至25任一项所述的ldRNA，其中mRNA在相同的信号转导途径中起作用。
29.根据权利要求9至25任一项所述的ldRNA，其中mRNA在发出共同信号的两个或更多个信号转导途径中起作用。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至29任一项所述的ldRNA和药学上可接受的载体。
31.根据权利要求30所述的组合物，其还包含促进多核苷酸向细胞内运输的运载体。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述运载体是磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物、聚乙烯亚胺或基于蛋白质的转染试剂。
33.一种降低一种或多种mRNA水平的方法，其包括向哺乳动物细胞、组织或动物施用根据权利要求1-29任一项所述的ldRNA或根据权利要求30至32任一项所述的药物组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中细胞对siRNA处理免疫敏感。
35.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种mRNA编码酶。
36.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种mRNA编码转录因子。
37.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种mRNA编码分泌的信号转导蛋白。
38.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种mRNA编码信号转导蛋白。
39.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种mRNA编码激酶或磷酸酶。
40.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种mRNA编码细胞受体或离子通道。
41.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种mRNA编码分泌的蛋白。
42.根据权利要求33至41任一项所述的方法，其中ldRNA组合物是局部施用的。
43.根据权利要求33至41任一项所述的方法，其中ldRNA组合物通过肠胃外施用来施用。
44.根据权利要求33至41任一项所述的方法，其中ldRNA组合物通过吸入施用。
45.根据权利要求33至41任一项所述的方法，其中ldRNA组合物是静脉内施用的。
46.根据权利要求33至45任一项所述的方法，其中疾病或病况影响皮肤。
47.一种减少受试者细胞中一种或多种mRNA表达的方法，其包括向受试者施用根据权利要求30至32任一项所述的ldRNA组合物。
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