JP2010537640A - マイクロｒｎａ模倣剤または阻害剤としての非対称性ｒｎａ二重鎖の組成物 - Google Patents

マイクロｒｎａ模倣剤または阻害剤としての非対称性ｒｎａ二重鎖の組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、鎖長が非対称である二本鎖ＲＮＡ分子を提供する。本発明のＲＮＡ分子である、非対称性ＲＮＡ二重鎖は、末端に１つまたは２つの突出を有する。一態様において、これらの新規のＲＮＡ二重鎖分子は、ｍｉＲＮＡの有効な模倣剤として役立つ。別の態様において、これらは、ｍｉＲＮＡの有効な阻害剤として機能するように設計される。したがって、本発明のＲＮＡ分子を用いてｍｉＲＮＡ経路の活性を調節することができ、これは、研究、薬剤発見および開発、ならびにヒト疾患の治療に多大な意義を有する。

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９６８，２５７号、２００８年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０２９，７５３号、および２００８年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／０３８，９５４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳レベルにおいて遺伝子発現を調節することがまず発見され、細胞のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構の一部である、内因性の小ＲＮＡ分子のクラスである。まずＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて発見されたｍｉＲＮＡは、植物およびヒトを含む動物の両方において見出されている。多くのｍｉＲＮＡの配列が異なる生物間で相同であることにより、ｍｉＲＮＡは、比較的古く重要な調節経路を代表することが示唆される（非特許文献１）。ＤＮＡから転写されるが、タンパク質には翻訳されない遺伝子によりコードされるｍｉＲＮＡ（非タンパク質コードＲＮＡ）は、哺乳動物遺伝子の最大３０％を調節している（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。近年の研究では、ｍｉＲＮＡが、翻訳を遮断するかまたは転写物を分解することによりタンパク質の生成を抑制し、これにより遺伝子の発現を調節することが分かっている。単一のｍｉＲＮＡは、２５０〜５００種の異なるｍＲＮＡを標的とすることが可能であり、このクラスのＲＮＡが、広範な細胞機能の極めて重要なメディエーターであることを裏付けている。ｍｉＲＮＡによって調節される遺伝子の多くは疾患原因遺伝子であり、したがって、ｍｉＲＮＡの機能性を調節する任意の機構は、大きな治療的潜在力を有する。
動物において、ｍｉＲＮＡは、まず、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ転写物としてゲノムから発現される。これらはＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写され、ヘアピン構造を形成する可能性が高い。核内において、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａにより、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる、約７０〜１００ヌクレオチド長のより短いステムループ構造へとプロセシングされ、次いで、これが、おそらくエクスポーチン５（Ｅｘｐ５）により細胞質内へと輸送される（非特許文献５）。細胞質内において、ＲＮａｓｅＩＩＩリボヌクレアーゼファミリーのメンバーであるＤｉｃｅｒにより、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、両末端に３’突出を有する二本鎖のガイド／パッセンジャー（ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊）二重鎖に切断される。ｍｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖は、それらの配列の不完全な相補性によりミスマッチを有することが多く、それらが分離されるとき、多くの場合に約１９〜２３ヌクレオチド長である成熟ｍｉＲＮＡには、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）または類似のタンパク質複合体が結合する。ＲＩＳＣはまた、小さいかまたは短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介する標的特異的なｍＲＮＡ分解を実施するタンパク質複合体でもある。
現時点では、ｍｉＲＮＡ二重鎖または一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡがどのような形でＲＩＳＣと相互作用するのか完全に明らかというわけではないが、ＲＩＳＣの触媒成分であるａｒｇｏｎａｕｔｅによりガイド鎖として選択されると、成熟ｍｉＲＮＡは該複合体内に組込まれ、完全にではないことが多いが著明に相補的な配列を有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に結合する。パッセンジャー鎖であるｍｉＲＮＡ＊は、分解される可能性が高い。次いで、ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体により結合されたｍＲＮＡの翻訳が抑制される結果、対応する遺伝子の発現が低下する。場合によって、結合されたｍＲＮＡは切断されるか、または脱アデニル化されて分解される。
本明細書で引用される参考文献は、優先権が主張される本発明に対する先行技術として容認されるわけではない。
Ｇｒｏｓｓｈａｎｓら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第１５６巻、１７〜２１頁（２００２年） Ｃｚｅｃｈ、ＮＥＪＭ、第３５４巻、１１９４〜１１９５頁（２００６年） Ｍａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第２５巻、６３１〜６３８頁（２００７年） Ｅｕｌａｌｉｏら、Ｃｅｌｌ、第１３２巻、９〜１４頁（２００８年） Ｙｉら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、第１７巻、３０１１〜３０１６頁（２００３年）
本発明は、本明細書において「非対称性干渉ＲＮＡ」（ａｉＲＮＡ）と称する新たなクラスの二重鎖ＲＮＡが、哺乳動物細胞におけるｍｉＲＮＡ活性を有効に調節しうるという発見をめぐる発明である。この新たなクラスのＲＮＡの特徴は、２本のＲＮＡ鎖間における非対称的な長さである。本発明は、鎖長が非対称である二本鎖ＲＮＡを構築することで、細胞内におけるｍｉＲＮＡを模倣または阻害し、ｍｉＲＮＡ経路の活性を両方向、すなわち上方および下方へと調節しうるという証拠を提供する。
一態様において、本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の模倣剤であって、以下：第１の長さの第１鎖と第２のより短い長さの第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が前記ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同じ配列を有し、前記第１鎖および第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、１〜１０ヌクレオチドの末端突出をさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子、を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の模倣剤を提供し、前記模倣剤は少なくとも１つの遺伝子の発現の調節において前記ｍｉＲＮＡを模倣するように適合されている。
好ましい態様において、本発明は、成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の模倣剤を提供し、該模倣剤は、１５〜２８ヌクレオチドの第１鎖と１２〜２６ヌクレオチドのより短い第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が前記成熟ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同じ配列を有し、前記第１鎖および第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、前記第１鎖が１〜８ヌクレオチドの３’突出と１〜８ヌクレオチドの５’突出とをさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、前記模倣剤は、少なくとも１つの遺伝子の発現の調節において前記成熟ｍｉＲＮＡを模倣するように適合される。
一特徴において、本発明の模倣剤により模倣されるｍｉＲＮＡは、ガイド鎖または成熟ｍｉＲＮＡである。一実施形態において、該ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡおよびこれと実質的に相補的なパッセンジャー鎖を含む内因性ｍｉＲＮＡ二重鎖であり、前記模倣剤の前記第２鎖が前記パッセンジャー鎖の少なくとも一部と実質的に同じ配列を有する。
さらなる態様において、本発明は、第１の長さの第１鎖と第２のより短い長さの第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が標的ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な配列を有し、前記第１鎖および第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、１〜１０ヌクレオチドの末端突出をさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の阻害剤を提供し、前記阻害剤が前記標的ｍｉＲＮＡを阻害するように適合される。
また、好ましい態様において、本発明は、１５〜２８ヌクレオチドの第１鎖と１２〜２６ヌクレオチドのより短い第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が前記成熟ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な配列を有し、前記第１鎖および第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、前記第１鎖が１〜８ヌクレオチドの３’突出と１〜８ヌクレオチドの５’末端突出とをさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の阻害剤を提供し、前記阻害剤は前記標的ｍｉＲＮＡを阻害するように適合される。
一特徴において、本発明の阻害剤により標的とされるｍｉＲＮＡは、ガイド鎖または成熟鎖である。一部の実施形態において、本発明の阻害剤は、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９０％だけ成熟ｍｉＲＮＡ量を低下させることが可能である。
一特徴において、本発明の模倣剤および阻害剤は、前記第１鎖と第２鎖との間において、配列がミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む。一実施形態において、該ミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドは、ループを形成する。代替的な実施形態において、模倣剤および阻害剤における該第１鎖および第２鎖は、前記二本鎖領域において互いに完全に相補的である。
本発明の模倣剤および阻害剤の末端突出は、一部の実施形態において１〜８ヌクレオチドであり、他の一部の実施形態において１〜３ヌクレオチドである。該末端突出は３’突出でありえ、好ましい実施形態において、より長い鎖である該第１鎖上にある。別の実施形態において、該末端突出は５’突出であり、好ましい実施形態において、該第１鎖上にある。一部の実施形態において、該模倣剤および阻害剤は、前記第１鎖上において、３’突出および５’突出の両方を有し、前記３’突出および５’突出の両方が、１〜３ヌクレオチドであることが好ましい。別の実施形態において、本発明の模倣剤および阻害剤は、一方の末端上に１つの末端突出を、他の末端上に平滑末端を有する。
模倣剤の各種の実施形態において：前記第１鎖（より長い鎖）は１３〜１００ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；前記第１鎖は１５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は１２〜２９ヌクレオチドの長さを有し；前記第１鎖は１５〜２８ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し；前記第１鎖は１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は１２〜２４ヌクレオチドの長さを有し；前記第１鎖は１９〜２３ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は１４〜２０ヌクレオチドの長さを有する。
阻害剤の各種の実施形態において：前記第１鎖（より長い鎖）は１０〜１００ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；前記第１鎖は１５〜６０ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は５〜２８ヌクレオチドの長さを有し；前記第１鎖は１５〜２８ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し；前記第１鎖は１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖は１２〜２０ヌクレオチドの長さを有する。
一特徴において、本発明の模倣剤および阻害剤では、前記第１鎖が、前記第２鎖よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０ヌクレオチドからなる群から選択される長さだけ長い。
一特徴において、本発明の模倣剤および阻害剤では、前記末端突出が分解に対して安定化される。
一特徴において、模倣剤および阻害剤は、前記第１鎖および第２鎖の少なくとも１つにおいて少なくとも１つのニックをさらに有する。別の特徴において、模倣剤または阻害剤の二本鎖領域は、１つまたは複数の対合されないヌクレオチドのギャップをさらに含む。
一特徴において、模倣剤および阻害剤は、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む。別の特徴において、それらは、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含み、それは、３’突出、５’突出、および二本鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域内に存在しうる。
一特徴において、本発明の模倣剤では、前記第１鎖が、前記ｍｉＲＮＡの少なくとも前記一部と少なくとも６０パーセント、または一部の実施形態において少なくとも７０パーセント同じ配列を有する。一実施形態において、模倣剤の前記第１鎖は、前記ｍｉＲＮＡと同じシード領域を有する。
一特徴において、本発明の阻害剤では、前記第１鎖が、その標的ｍｉＲＮＡの少なくとも前記一部と少なくとも６０パーセント、または一部の実施形態において少なくとも７０パーセント相補的な配列を有する。
一実施形態において、本発明の模倣剤および阻害剤内の二本鎖領域のＧＣ含量は、約２０〜６０％であるか、または好ましくは、約３０〜５０％である。
模倣剤および阻害剤の一実施形態において、前記第１鎖は、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを有する配列モチーフを含む。さらなる一実施形態において、５’突出は、配列モチーフ「ＡＡ」、「ＵＵ」、または「ｄＴｄ」を有する。一特徴において、本発明の模倣剤および阻害剤は、ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とさらにコンジュゲートしている。
本発明の模倣剤および阻害剤の一特徴において、該二本鎖ＲＮＡ分子は、合成であるかまたは単離される。一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、模倣剤または阻害剤のいずれであれ、組換えベクターまたはその後代から転写される。
一特徴において、本発明の模倣剤は、前記少なくとも１つの遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％調節するように適合される。一実施形態において、本発明の模倣剤は、Ｌｅｔ７ファミリーのｍｉＲＮＡを模倣する。
一実施形態において、本発明の模倣剤は、以下の二重鎖配列：
の１つを含む。
別の実施形態において、本発明の阻害剤は、以下の二重鎖配列：
の１つを含む。
一態様において、本発明は、本発明の模倣剤および阻害剤の二本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも第１鎖をコードするＤＮＡ配列であって、発現制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結したＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
一実施形態において、発現ベクターは、本発明の模倣剤および阻害剤の二本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも第２鎖をコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２のプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列をさらに含む。
一態様において、本発明は、上記発現ベクターを含む細胞を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子を含む細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の模倣剤を作製する方法であって、ｍｉＲＮＡ配列を選択するステップと、前記ｍｉＲＮＡ内の連続するヌクレオチドの少なくとも一部と実質的に同じ領域を有する第１のＲＮＡ鎖を合成するステップと、第２のより短いＲＮＡ鎖を合成するステップと、前記ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの遺伝子の発現の調節において前記ｍｉＲＮＡを模倣することが可能となるように、少なくとも１つの末端突出を有する二本鎖ＲＮＡ分子を形成するのに適する条件下で、合成された鎖を混合するステップとを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の阻害剤を作製する方法であって、標的ｍｉＲＮＡ配列を選択するステップと、前記標的ｍＲＮＡ内の少なくとも一部の連続するヌクレオチドと実質的に相補的な領域を有する第１のＲＮＡ鎖を合成するステップと、第２のより短いＲＮＡ鎖を合成するステップと、前記ＲＮＡ分子が、前記標的ｍｉＲＮＡを阻害することが可能となるように、少なくとも１つの末端突出を有する二本鎖ＲＮＡ分子を形成するのに適する条件下で、合成された鎖を組み合わせるステップとを含む方法を提供する。
一特徴において、本発明による模倣剤または阻害剤を作製する方法は、以下のステップ：前記少なくとも１つの末端突出を分解に対して化学修飾するステップと、前記二本鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを導入するステップと、前記二本鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を導入するステップと、前記二本鎖領域内に、少なくとも１つのミスマッチ、ニック、またはギャップを導入するステップと、前記第１鎖および第２鎖の少なくとも１つを、ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とコンジュゲートさせるステップと、該鎖の１つにおける少なくとも１つの塩基を修飾するステップの１つまたは複数をさらに含む。一実施形態において、模倣剤または阻害剤を作製する方法は、合成するステップの間、合成するステップの後から組み合わせるステップの前まで、または組み合わせるステップの後において、二重鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１種の修飾ヌクレオチド類似体を導入するステップをさらに含む。
一特徴において、模倣剤または阻害剤を作製する方法では、少なくとも１つのＲＮＡ鎖が酵素的または生物学的に合成される。一部の実施形態において、該第１鎖および該第２鎖は、別々にまたは同時に合成される。
別の態様において、本発明は、細胞または生物におけるｍｉＲＮＡ経路を調節する方法であって、前記ｍｉＲＮＡの前記模倣を行うことができる条件下で、前記細胞または生物を本発明の模倣剤と接触させるステップと、前記模倣剤を用いて少なくとも１つの遺伝子の発現を調節し、これにより、内因性ｍｉＲＮＡ経路を調節するステップとを含む方法を提供する。一実施形態において、該模倣剤の該二本鎖ＲＮＡ分子内における第１鎖は、そのＲＩＳＣとの相互作用において、前記内因性ｍｉＲＮＡを模倣する。
別の態様において、本発明は、細胞内におけるｍｉＲＮＡ経路を調節する方法であって、前記標的ｍｉＲＮＡの前記阻害を行うことができる条件下で、前記細胞または生物を本発明の阻害剤と接触させるステップと、前記阻害剤を利用可能な標的ｍｉＲＮＡの量を低下させ、これにより、内因性ｍｉＲＮＡ経路を調節するステップとを含む方法を提供する。
一特徴において、本発明の調節法は、模倣剤または阻害剤のいずれを用いるのであれ、遺伝子発現の調節を行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖ＲＮＡ分子を導入するステップをさらに含む。
一実施形態において、導入するステップは、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所（ｔｏｐｉｃ）投与、および局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与からなる群から選択される。さらに、導入するステップは、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を用いうる。
別の態様において、本発明は、細胞または生物における遺伝子の機能または有用性を決定する目的と、細胞または生物における少なくとも１つの遺伝子の発現を調節する目的とを含む各種の目的のための本発明の調節法の使用を提供する。一実施形態において、該遺伝子は、疾患、病理学的状態、または望ましくない状態と関連する。別の実施形態において、該遺伝子は、ヒトまたは動物の疾患と関連する。該遺伝子は、病原性微生物の遺伝子、ウイルス遺伝子、腫瘍関連遺伝子などでありうる。一実施形態において、該遺伝子は、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する。一特徴において、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物標的を研究するのに用いられる。さらなる特徴において、本発明の方法は、疾患または望ましくない状態を治療または予防するのに用いられる。
別の態様において、本発明は、活性作用物質としての、本発明の少なくとも１種の模倣剤または阻害剤と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。担体は、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択することができる。
別の態様において、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む治療法を提供する。各種の実施形態において、該医薬組成物は、静脈内（ｉｖ）経路、皮下（ｓｃ）経路、局所経路、経口経路、吸入経路、筋肉内経路、腹腔内（ｉｐ）経路、および局所経路からなる群から選択される経路を介して投与される。各種の実施形態において、医薬組成物の有効量は、１日当たり約１ｎｇ〜１ｇ、１日当たり１００ｎｇ〜１ｇ、または１日当たり１μｇ〜５００ｍｇである。一実施形態において、該方法は、癌を治療するのに用いられる。
さらなる態様において、本発明は、本発明の模倣剤または本発明の阻害剤を含む、研究用試薬を提供する。本発明はまた、前記研究用試薬を含むキットも提供する。
さらに別の態様において、本発明は、疾患または状態について患者を診断する方法であって、該患者の細胞を本発明の模倣剤または阻害剤と接触させるステップと、前記疾患または状態を示す少なくとも１つの変化を探索するステップとを含む方法を提供する。
本発明の他の特徴および利点は、異なる例を含む、本明細書で提供されるさらなる説明から明らかである。提供される例は、本発明を実施するのに有用な異なる成分および方法を例示する。該例は、優先権が主張される本発明を制限するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明を実施するのに有用な他の成分および方法を同定し、用いることができる。
図１Ａは、３’突出と５’突出の両方を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図１Ｂは、鎖の一方中にニックを有する図１Ａの二重鎖ＲＮＡ分子を示す図である。図１Ｃは、鎖の一方中にギャップを有する図１Ａの二重鎖ＲＮＡ分子を示す図である。 図２Ａは、平滑末端、および５’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図２Ｂは、平滑末端、および３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図２Ｃは、両末端上に３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図２Ｄは、両末端上に５’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。 図２Ｅは、３’突出と５’突出の両方を有する二重鎖ＲＮＡ分子の代替構造を示す図である。図２Ｆは、両末端上に３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子の代替構造を示す図である。 ａｉＲＮＡ（非対称性干渉ＲＮＡ）によるβ−カテニンの遺伝子サイレンシングの誘導を示す図である。図３Ａはオリゴの確認を示す図である。アニーリング後、オリゴを２０％ポリアクリルアミドゲルによって確認した。レーン１、２１ｎｔ／２１ｎｔ；レーン２、１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン３、１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン４、１３ｎｔ／１３ｎｔ；レーン５、１３ｎｔ／２１ｎｔ；レーン６、１４ｎｔ／１４ｎｔ；レーン７、１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン８、１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン９、１５ｎｔ／１５ｎｔ；レーン１０、１５ｎｔ／２１ｎｔ。
図３Ｂは、遺伝子サイレンシングにおけるオリゴの影響を示す図である。ＨｅＬａ細胞を２００，０００細胞／ウエルで６ウエル培養プレートに平板培養した。２４時間後、それらをスクランブルｓｉＲＮＡ（レーン１）、２１−ｂｐｓｉＲＮＡ標的化Ｅ２Ｆ１（レーン２、特異性の対照として）またはβ−カテニンを標的とする２１−ｂｐｓｉＲＮＡ（レーン３、陽性対照として）、または異なる長さの混合物：１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン４）；１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン５）；１３ｎｔ／２１ｎｔ（レーン６）；１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン７）；１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン８）；１５ｎｔ／２１ｎｔ（レーン９）の同じ濃度のａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション後４８時間で採取した。β−カテニンの発現はウエスタンブロットによって決定した。Ｅ２Ｆ１およびアクチンは対照として使用した。
遺伝子サイレンシングの媒介における、塩基置換有りまたは無しのａｉＲＮＡオリゴの構造−活性関係を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は示したａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後４８時間で溶解物を生成した。ウエスタンブロットを実施してβ−カテニンおよびアクチンのレベルを検出した。ｓｉはβ−カテニンｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを表す。それぞれのレーン上の数値ラベルは表３中のａｉＲＮＡオリゴに対応する。 遺伝子サイレンシングの媒介における、塩基置換有りまたは無しのａｉＲＮＡオリゴの構造−活性関係を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は示したａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後４８時間で溶解物を生成した。ウエスタンブロットを実施してβ−カテニンおよびアクチンのレベルを検出した。ｓｉはβ−カテニンｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを表す。それぞれのレーン上の数値ラベルは表３中のａｉＲＮＡオリゴに対応する。 ａｉＲＮＡによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズムの分析を示す図である。
図６ａは、示した日数でａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における、β−カテニンｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示す図である。
図６ｂは、ｍＲＮＡの切断および予想ＰＣＲ産物を示す、β−カテニンの５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの概略を示す図である。
図６ｃは、ａｉＲＮＡによって媒介されたβ−カテニン切断産物を、４または８時間ａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞から５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって増幅したことを示す図である。
ａｉＲＮＡによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズムの分析を示す図である。
図６ｄは、５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ断片を配列決定することによって確認したβ−カテニンｍＲＮＡ切断部位の概略を示す図である。
図６ｅは、ａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの差次的ＲＩＳＣローディング効率を示す図である。ｐＣＭＶ−Ａｇｏ２を用いたトランスフェクション後４８時間でＨｅｌａ細胞にａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ二重鎖をトランスフェクトした。Ａｇｏ２はａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのトランスフェクション後に示した時間時点で免疫沈降させ、ノーザンブロット分析を実施してＡｇｏ２／ＲＩＳＣ結合小ＲＮＡのレベルを決定した。（以下に示す）Ａｇｏ２のレベルはＩＰ後にウエスタンブロットによって決定した。
図６ｆは、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に対するＡｇｏ２またはＤｉｃｅｒのノックダウンの影響を示す図である。細胞はスクランブルａｉＲＮＡ（Ｃｏｎ）またはａｉＲＮＡ標的化Ｓｔａｔ３（ａｉ）を用いたトランスフェクションの２４時間前に、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎ）、またはｓｉＲＮＡ標的化Ａｇｏ２（ｓｉＡｇｏ２）、またはＤｉｃｅｒ（ｓｉＤｉｃｅｒ）でトランスフェクトした。細胞を採取し、ａｉＳｔａｔ３トランスフェクション後４８時間でウエスタンブロット分析を実施した。
ｓｉＲＮＡと比較したＲＩＳＣへのａｉＲＮＡの取り込みの利点を示す図である。
図７Ａは、ａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡより良い効率でＲＩＳＣに進入することを示す図である。Ａｇｏ２発現プラスミドでトランスフェクトした細胞を、示した時間ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞溶解後、Ａｇｏ２を免疫沈降させ、ＲＮＡを免疫沈降物から抽出し、１５％アクリルアミドゲル上で分離した。移動後、膜をプローブとハイブリダイズさせてａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの２１ｍｅｒアンチセンス鎖を検出した。ＩｇＧ対照レーンは、Ａｇｏ２免疫沈降物と比較したシグナルの欠如を示す。
図７Ｂは、ａｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ中に存在しないことを示す図である。（Ａ）からの膜を剥離し、再度プローブ処理してトランスフェクトしたオリゴのセンス鎖を検出した。（Ａ）および（Ｂ）中の絵図は、膜上のセンス鎖（上側の鎖）、アンチセンス鎖（下側の鎖）、または二重鎖の位置を示す。
ａｉＲＮＡによるＲＩＳＣローディングのメカニズムの図である。
図８Ａは、ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡおよびＡｇｏ２の異なる鎖間の相互作用の免疫沈降分析を示す図である。過剰発現Ａｇｏ２を含有するＨｅｌａＳ−１０溶解物を、３２Ｐ末端標識センス鎖またはアンチセンス鎖を含有する示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ二重鎖とインキュベートした。（＊）は標識の位置を示す。Ａｇｏ２免疫沈降後、ＲＮＡを単離し、１５％アクリルアミドゲル上で分離し、フィルムに感光させた。Ａｇｏ２結合ＲＮＡはペレット画分中に示され、一方非Ａｇｏ２結合ＲＮＡは上清（Ｓｕｐ）中に残る。
図８Ｂは、ａｉＲＮＡ活性におけるセンス鎖切断の役割を示す図である。細胞はａｉＲＮＡで、または位置８（予想されるＡｇｏ２切断部位）が２’−Ｏ−メチルであるセンス鎖を有するａｉＲＮＡで、または対照として位置９が２’−Ｏ−メチルであるセンス鎖を有するａｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＮＡをトランスフェクション後４時間で回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施して残りのβ−カテニンｍＲＮＡの相対的レベルを決定した。
ａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの競合分析を示す図である。
図９Ａは、３２Ｐ末端標識アンチセンス鎖を含有するｓｉＲＮＡ二重鎖およびａｉＲＮＡ二重鎖を示す図である。（＊）は標識の位置を示す。
図９Ｂは、非放射能のａｉＲＮＡはＡｇｏ２に関して標識ｓｉＲＮＡと競合しないことを示す図である。過剰発現Ａｇｏ２を含有するＨｅｌａＳ−１０溶解物は、Ａｇｏ２の免疫沈降前に３２Ｐ末端標識ｓｉＲＮＡおよび非放射能のａｉＲＮＡ二重鎖または非放射能のｓｉＲＮＡ二重鎖とインキュベートした。次いでＲＮＡを単離し、１５％アクリルアミドゲル上で分析した。
図９Ｃは、非放射能のｓｉＲＮＡはＡｇｏ２に関して標識ａｉＲＮＡと競合しないことを示す図である。Ｂ中で使用したのと同じＳ−１０溶解物を、Ａｇｏ２の免疫沈降前に３２Ｐ末端標識ａｉＲＮＡおよび非放射能のａｉＲＮＡ二重鎖または非放射能のｓｉＲＮＡ二重鎖とインキュベートした。次いでＲＮＡを単離し、１５％アクリルアミドゲル上で分析した。
ＲＩＳＣローディングおよび成熟ＲＩＳＣの生成において観察した差を示す、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのモデルを示す図である。 アンチセンス突出を有する１４〜１５ｂｐの非対称性ＲＮＡ二重鎖（ａｉＲＮＡ）が、強力、有効、迅速、および持続的遺伝子サイレンシングを誘導したことを示す図である。
図１１Ａは、β−カテニンを標的とするｓｉＲＮＡおよびβ−カテニンを標的とするａｉＲＮＡの配列および設計を示すダイアグラムを示す図である。
図１１Ｂは、様々な長さのａｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの誘導を示す図である。β−カテニンタンパク質レベルを、示したａｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした細胞においてウエスタンブロットによって分析した。
アンチセンス突出を有する１４〜１５ｂｐの非対称性ＲＮＡ二重鎖（ａｉＲＮＡ）が、強力、有効、迅速、および持続的遺伝子サイレンシングを誘導したことを示す図である。
図１１Ｃは、ａｉＲＮＡがβ−カテニンタンパク質欠乏の誘導においてｓｉＲＮＡより強力かつ有効であることを示す図である。Ｈｅｌａ細胞は示した濃度でβ−カテニンを標的とするａｉＲＮＡまたはβ−カテニンを標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、細胞溶解物を作製し、ウエスタンブロット分析を行った。
図１１Ｄは、ａｉＲＮＡがβ−カテニンＲＮＡレベルの低減においてｓｉＲＮＡより有効、迅速、および持続的であることを示す図である。細胞はノーザンブロット分析前に示した日数１０ｎＭの１５ｂｐのａｉＲＮＡまたは２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。
ａｉＲＮＡが迅速かつ強力なサイレンシングを媒介することを示す図である。
図１２Ａは、β−カテニンを標的化するために使用したａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの配列および構造を示す図である。
図１２Ｂは、対照ａｉＲＮＡまたはβ−カテニンを標的とするａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来のβ−カテニンｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲを示す図である。ＲＮＡはトランスフェクション後の示した時間で回収した。
ａｉＲＮＡが迅速かつ強力なサイレンシングを媒介することを示す図である。
図１２Ｃは、示した時間数の、対照、ａｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−カテニンｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す図である。
図１２Ｄは、示した時間の、対照、ａｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−カテニンタンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す図である。
複数の標的に対する遺伝子サイレンシングの効力および持続性におけるｓｉＲＮＡとａｉＲＮＡの比較を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は（ａ）β−カテニン、１０ｎＭ、（ｂ）Ｓｔａｔ３、（ｃ）ＥＦ２、または（ｄ）ＮＱＯ１、２０ｎＭを標的化するスクランブルｓｉＲＮＡ（ｃ）、ａｉＲＮＡ（ａｉ）、またはｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした。ＲＮＡおよびタンパク質を示した時間時点で精製し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルに関して分析し、タンパク質レベルはウエスタンブロットによって分析した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータはｓｉＣｏｎトランスフェクト細胞に正規化する。 複数の標的に対する遺伝子サイレンシングの効力および持続性におけるｓｉＲＮＡとａｉＲＮＡの比較を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は（ａ）β−カテニン、１０ｎＭ、（ｂ）Ｓｔａｔ３、（ｃ）ＥＦ２、または（ｄ）ＮＱＯ１、２０ｎＭを標的化するスクランブルｓｉＲＮＡ（ｃ）、ａｉＲＮＡ（ａｉ）、またはｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした。ＲＮＡおよびタンパク質を示した時間時点で精製し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルに関して分析し、タンパク質レベルはウエスタンブロットによって分析した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータはｓｉＣｏｎトランスフェクト細胞に正規化する。 ａｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、複数の細胞系中の様々な遺伝子に対して有効であることを示す図である。
図１４ａは、ａｉＲＮＡ二重鎖は、異なる哺乳動物細胞系中のβ−カテニンの標的化においてｓｉＲＮＡより有効であることを示す図である。
図１４ｂは、４８時間２０ｎＭの示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来のＮｂｓ１、サバイビン、Ｐａｒｐ１、ｐ２１のウエスタンブロット分析を示す図である。
ａｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、複数の細胞系中の様々な遺伝子に対して有効であることを示す図である。
図１４ｃは、４８時間２０ｎＭの示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来のＲｓｋ１、ＰＣＮＡ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｍＴＯＲ、およびＰＴＥＮのウエスタンブロット分析を示す図である。
図１４ｄは、ａｉＲＮＡによるｋ−Ｒａｓの対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを示す図である。ウエスタンブロット分析によって、野生型ｋ−Ｒａｓを標的化するａｉＲＮＡを、ｋ−Ｒａｓ野生型（ＤＬＤ１）とｋ−Ｒａｓ突然変異体（ＳＷ４８０）細胞系の両方においてｋ−Ｒａｓのサイレンシングに関して試験した。
センス鎖、免疫刺激によるオフターゲット遺伝子サイレンシングの欠如、およびａｉＲＮＡの血清中安定性を示す図である。
図１５ａは、モック処理したＰＢＭＣまたは１６時間β−カテニンのｓｉＲＮＡ二重鎖またはβ−カテニンのａｉＲＮＡ二重鎖でインキュベートしたＰＢＭＣにおける、インターフェロン誘導性遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
図１５ｂは、モックトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞または２４時間ＥＦ２のａｉＲＮＡまたはＥＦ２のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞または２４時間サバイビンのａｉＲＮＡまたはサバイビンのｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞における、インターフェロン誘導性遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
図１５ｃは、既知のインターフェロン応答関連遺伝子の発現の変化に関するマイクロアレイ分析を示す図である。ａｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞およびｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞から単離した全てのＲＮＡを、マイクロアレイによって分析した。
センス鎖、免疫刺激によるオフターゲット遺伝子サイレンシングの欠如、およびａｉＲＮＡの血清中安定性を示す図である。
図１５ｄは、センス鎖媒介のオフターゲット遺伝子サイレンシングがａｉＲＮＡに関して検出されないことを示す図である。細胞はａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとＳｔａｔ３（センスＲＮＡ）を発現するプラスミドまたはアンチセンスＳｔａｔ３（アンチセンスＲＮＡ）を発現するプラスミドのいずれかとコトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後２４時間でＲＮＡを回収し、Ｓｔａｔ３センスＲＮＡまたはＳｔａｔ３アンチセンスＲＮＡの相対的レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって決定した（挿入図）。
図１５ｅは、ヒト血清中でのａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ二重鎖の安定性を示す図である。ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ二重鎖は、ゲル電気泳動前に示した量の時間３７℃で１０％ヒト血清中においてインキュベートした。残存する二重鎖（対照の％）を示している。
センス鎖、免疫刺激によるオフターゲット遺伝子サイレンシングの欠如、およびａｉＲＮＡの血清中安定性を示す図である。
図１５ｆは、ａｉＲＮＡ二重鎖によって媒介される遺伝子特異的サイレンシングに関して提案されるモデルを示す図である。
ＳＷ４８０ヒト結腸異種移植マウスモデルにおけるβ−カテニンに対するａｉＲＮＡの強力な抗腫瘍活性を示す図である。樹立皮下ＳＷ４８０ヒト結腸癌を有する免疫抑制マウスに、毎日０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合無関連ｓｉＲＮＡを静脈内（ｉｖ）に与えた。腫瘍の大きさを治療中定期的に評価した。それぞれの時点は６個の腫瘍の平均値±ＳＥＭを表す。 ＨＴ２９ヒト結腸異種移植マウスモデルにおけるβ−カテニンに対するａｉＲＮＡの強力な抗腫瘍活性を示す図である。樹立皮下ＨＴ２９ヒト結腸癌を有する免疫抑制マウスに、１日おきに０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合無関連ｓｉＲＮＡを静脈内（ｉｖ）に与えた。腫瘍の大きさを治療中定期的に評価した。それぞれの時点は５個の腫瘍の平均値±ＳＥＭを表す。 Ｌｅｔ−７ａ模倣剤ａｉＲＮＡは、同等以上の効率でＬｅｔ−７ａとして機能することができることを示す図である。
図１８Ａは、Ｌｅｔ−７ａおよびＬｅｔ−７ａ模倣剤ａｉＲＮＡの配列を示す図である。
図１８Ｂは、Ｌｅｔ−７ａ模倣剤ａｉＲＮＡは、Ｌｅｔ−７ａ標的ｋ−ＲａｓのｍＲＮＡレベルを下方制御することができることを示す図である。
図１９Ａは、示したａｉＲＮＡ模倣剤および阻害剤の配列および構造を示す図である。図１９Ｂは、示した成熟ｍｉＲＮＡの配列を示す図である。 図２０Ａは、ｋ−ＲａｓのｍＲＮＡレベルに対するＬｅｔ−７ｃ模倣剤ａｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡ Ｌｅｔ−７ｃ阻害剤の影響を示す図である。図２０Ｂは、ｋ−Ｒａｓのタンパク質レベルに対するＬｅｔ−７ｃ模倣剤ａｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡ Ｌｅｔ−７ｃ阻害剤の影響を示す図である。 設計したａｉＲＮＡがｍｉＲＮＡを阻害することができることを示す図である。
図２１Ａは、抗Ｌｅｔ７ｃ ａｉＲＮＡがＬｅｔ−７ｃの発現を強く阻害することを示す図である。
図２１Ｂは、抗ｍｉＲ２１ ａｉＲＮＡがｍｉＲ２１の発現を強く阻害することを示す図である。
設計したａｉＲＮＡがｍｉＲＮＡを阻害することができることを示す図である。
図２１Ｃは、抗ｍｉＲ１５５ ａｉＲＮＡがｍｉＲ１５５の発現を強く阻害することを示す図である。
図２２Ａは、ＭＣＦ７細胞が高レベルのｍｉＲ−２１を発現することを示す図である。図２２Ｂは、ＦａＤｕ細胞が高レベルのｍｉＲ−１５５を発現することを示す図である。 抗Ｌｅｔ７ｃ ａｉＲＮＡが市販のｍｉＲＮＡ阻害剤より有効であることを示す図である。 抗ｍｉＲ２１ ａｉＲＮＡが市販のｍｉＲＮＡ阻害剤より有効であることを示す図である。 抗ｍｉＲ１５５ ａｉＲＮＡが市販のｍｉＲＮＡ阻害剤より有効であることを示す図である。 抗Ｌｅｔ７ｃ ａｉＲＮＡと市販のｍｉＲＮＡ阻害剤の効力を比較する図である。 抗ｍｉＲ２１ ａｉＲＮＡと市販のｍｉＲＮＡ阻害剤の効力を比較する図である。 抗ｍｉＲ１５５ ａｉＲＮＡと市販のｍｉＲＮＡ阻害剤の効力を比較する図である。 ａｉＲＮＡによるｍｉＲＮＡの阻害に関する１つの考えられるメカニズムを理論付ける図である。 知られているヒトｍｉＲＮＡを列挙する図である。 知られているヒトｍｉＲＮＡを列挙する図である。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡により明らかに別段に指示されていない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「ａ ｃｅｌｌ」は、その混合物を含めた複数の細胞を含む。
本明細書で使用する場合、「二本鎖ＲＮＡ」、「二重鎖ＲＮＡ」、または「ＲＮＡ二重鎖」は、２本の鎖のＲＮＡ、および少なくとも１つの二本鎖領域を有するＲＮＡを指し、二本鎖領域内、または２つの隣接する二本鎖領域の間に、少なくとも１つのギャップ、ニック、バルジ、ループ、および／またはバブルを有するＲＮＡ分子を含む。１本の鎖が、２つの二本鎖領域の間にギャップまたは非対応ヌクレオチドの一本鎖領域を有する場合、その鎖は、複数の断片を有するとみなされる。二本鎖ＲＮＡは、ここで使用する場合、いずれかの末端または両末端に末端突出を有することができる。いくつかの実施形態において、二重鎖ＲＮＡの２本の鎖は、ある特定の化学リンカーを介して連結することができる。
本明細書で使用する場合、「アンチセンス鎖」は、標的メッセンジャーＲＮＡに対して実質的な配列相補性を有するＲＮＡ鎖を指す。アンチセンス鎖は、ｓｉＲＮＡ分子の一部、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の一部、または一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡでありうる。
用語「単離された」または「精製された」は、本明細書で使用する場合、その天然の状態に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は、一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して求められる。
本明細書で使用する場合、「調節すること」およびその文法的な等価用語は、増大させること、または減少させること（例えば、サイレンシング）、言い換えれば、上方制御すること、または下方制御することを指す。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、それだけに限らないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含めた任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、これは、特定の治療のレシピエントとなる。一般に、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関して、本明細書で互換的に使用される。
「治療すること」、「治療」、「治療すること」、「軽減すること」および「軽減するため」などの用語は、本明細書で使用する場合、（１）診断された病的状態または障害の症状を治癒、減速し、和らげ、および／または診断された病的状態または障害の進行を停止する治療手段、ならびに（２）標的にされる病的状態または障害の発症を予防し、または遅らせる予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。したがって、治療を必要とするものには、既に障害を有しているもの、障害を有しやすいもの、および障害が予防されるべきものが含まれる。患者が、以下のうちの１つまたは複数を示す場合、対象は、本発明の方法によって順調に「治療」される：癌細胞の数の低減、または完全な欠如；腫瘍サイズの低減；軟部組織および骨への癌の伝播を含めた、周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害または欠如；腫瘍転移の阻害または欠如；腫瘍増殖の阻害または欠如；特定の癌に関連する１つまたは複数の症状の軽減；罹患率および死亡率の低減；ならびに生活の質の改善。
本明細書で使用する場合、用語「阻害すること」、「阻害すること」、およびこれらの文法的な等価用語は、生物活性の脈絡において使用されるとき、生物活性の下方制御を指し、これは、タンパク質の産生、または分子のリン酸化などの標的にされる機能を低減、または排除することができる。特定の実施形態において、阻害は、標的にされる活性の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の低減を指す。障害または疾患の脈絡において使用されるとき、この用語は、症状の発症の予防、症状の軽減、または疾患、病状もしくは障害の排除における成功を指す。
本明細書で使用する場合、用語「実質的に相補性」は、２つの核酸の間であって、２つの二本鎖領域の間の末端突出またはギャップ領域などのいずれの一本鎖領域でもない、塩基対形成した二本鎖領域における相補性を指す。相補性は、完全である必要はなく、例えば、２つの核酸の間で任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかし、ミスマッチの数が多すぎて、最低のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下でさえ、まったくハイブリダイゼーションが起こり得ない場合、この配列は、実質的に相補性の配列ではない。２つの配列が、本明細書で「実質的に相補性」と呼ばれるとき、これらの配列は、選択された反応条件下でハイブリダイズするために、互いに十分に相補的であることを意味する。特異性を実現するのに十分な、核酸の相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの関係は、当技術分野で周知である。２本の実質的に相補性の鎖は、例えば、完全に相補的でありえ、またはハイブリダイゼーション条件が、例えば、対形成配列と非対形成配列の間の識別を可能にするのに十分である限り、１つから多くのミスマッチを含むことができる。したがって、実質的に相補性の配列は、二本鎖領域において、１００、９５、９０、８０、７５、７０、６０、５０パーセントもしくはそれ未満、またはその間の任意の数値の塩基対の相補性を有する配列を指すことができる。
本明細書で使用する場合、ａｎｔａｇｏｍｉｒはｍｉＲＮＡ阻害剤であり、内因性ｍｉＲＮＡのサイレンシングにおいて使用することができる。
本明細書で使用する場合、模倣剤または模倣体は、ｍｉＲＮＡアゴニストであり、機能等価物として内因性のｍｉＲＮＡを置換するために使用することができ、それによってそのような内因性のｍｉＲＮＡによって影響される経路を上方制御する。
転写後の遺伝子サイレンシングの自然形態として、およびそれぞれが広範囲の標的を伴って、ｍｉＲＮＡは、疾患の治療および予防において大きな機会を提供する。想像することができるように、特定のｍｉＲＮＡの制御標的に応じて、細胞におけるそのｍｉＲＮＡのレベルを上方制御または下方制御することが望ましい場合がある。例えば、そのｍＲＮＡ標的が１つまたは複数の腫瘍抑制遺伝子に対応する場合、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−２１を下方制御することが望まれる場合がある。他方では、その標的が、発癌遺伝子のｍＲＮＡを含む場合、ｍｉＲＮＡ、例えば、発癌遺伝子のＲＡＳファミリーのｍＲＮＡを標的にするｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡを上方制御することが望まれる場合がある。複数のｍｉＲＮＡが、単一の遺伝子標的または関連遺伝子標的のネットワークを調節する状態では、ある特定のｍｉＲＮＡを上方制御すると同時に、他のｍｉＲＮＡを下方制御することが望ましい場合がある。
現在、ＲＮＡを制御するために考案された有効な手段には、一本鎖ＲＮＡ（例えば、アンチセンス）、および２本の鎖が全く同じ長さである二本鎖ＲＮＡ（例えば、対称な２ｎｔの３’突出を含む２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ）が含まれる。これらの中で、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとは別の外因性の機構を介して（一般にウイルス性または人工の導入を介して）、真核生物においてＲＮＡｉを誘発するが、結局、これは、より特異的な遺伝子サイレンシングを行うために、ｍｉＲＮＡが利用するのと同じＲＩＳＣを利用する。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞中で安定ではなく、様々な化学修飾がこれらに対して試みられているが、これらは、ｍｉＲＮＡ阻害剤として大部分は効果的でないままである（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ Ａ．ら ＲＮＡ １３巻：７２６〜７３０頁（２００７年））。つまり、ｍｉＲＮＡが、１０年を超えて発見されている間に、模倣剤であっても阻害剤であっても、ｍｉＲＮＡの有効なモジュレーターを考案することにおいて、わずかな進展しかしていない（Ｍａｃｋ Ｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２５巻（６号）：６３１〜６３８頁（２００７年））。
本発明は、ｓｉＲＮＡのような結果をもたらし（「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」の表題で、本願と同日に出願され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、共同所有されたＰＣＴおよび米国出願に詳細に記載されている）、またｍｉＲＮＡ経路の活性を調節するために使用することができる、非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）と呼ばれる、新規の構造足場を提供する。
ａｉＲＮＡの新規の構造的設計は、遺伝子調節を行うことにおいて機能的に強力であるだけでなく、現況技術のＲＮＡｉ調節因子（主にアンチセンス、ｓｉＲＮＡ）に対していくつかの利点も提供する。これらの利点の中で、ａｉＲＮＡは、現在のｓｉＲＮＡコンストラクトよりはるかに短い長さのＲＮＡ二重鎖構造を有することができ、これは、合成費用を低減し、宿主細胞からの非特異的インターフェロン様免疫応答の長さ依存性誘発を阻止、または低減するはずである。ａｉＲＮＡ中のより短い長さのパッセンジャー鎖はまた、ＲＩＳＣにおけるパッセンジャー鎖の意図されない取り込みも排除または低減し、その結果としてｍｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングにおいて観察されるオフターゲット効果を低減するはずである。ａｉＲＮＡは、バイオテクノロジー産業および医薬産業、ならびにｍｉＲＮＡに基づく診断および治療における生物学研究、Ｒ＆Ｄを含めて、現在のｍｉ−ＲＮＡに基づく技術が適用されているか、適用されることが企図されているすべての範囲において使用することができる。
１．０．ａｉＲＮＡ構造足場
本発明は、ｍｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを調節することができる非対称性二本鎖ＲＮＡ分子に関する。一実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、第２鎖は、第１鎖と実質的に相補的であり、第１鎖と第２鎖は、少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、第１鎖は、第２鎖より長い（長さ非対称）。本発明のＲＮＡ分子は、少なくとも１つの二本鎖領域、ならびに５’突出、３’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される２つの末端を有する（例えば、図１Ａ、２Ａ〜２Ｄを参照されたい）。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より短い。この２本は、少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、５’突出、３’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される２つの末端を有することができる（例えば、図２Ｅ〜２Ｆを参照されたい）。
１個のヌクレオチドの変更、付加、および欠失が、分子の機能性に決定的に影響し得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０巻：６８７７〜６８８８頁（２００１年））、小ＲＮＡ制御因子を作製する分野では、ａｉＲＮＡ足場は、それぞれの鎖、およびそのそれぞれの３’突出において対称である、２１ｎｔの二本鎖ＲＮＡの古典的なｓｉＲＮＡ構造と異なる構造的なプラットホームを提供する。さらに、本発明のａｉＲＮＡは、以下の例に含められたデータによって示されるように、ＲＮＡｉに基づく研究、および薬剤開発において現在遭遇する障害を克服することができる、新しいクラスの小分子制御因子を設計することにおいて、切望される新しい手法を提供する。例えば、ｓｉＲＮＡを構造的に模倣するａｉＲＮＡからのデータは、ａｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを誘発することにおいて、ｓｉＲＮＡよりも有効であり、強力であり、迅速に開始し、耐久性があり、特異的であることを示す。ａｉＲＮＡは、模倣体または阻害剤としてｍｉＲＮＡ経路を制御するために設計することができるというさらなる証拠が以下に提供される。
任意の末端突出および２つの二本鎖領域の間のギャップを含めた、本発明のＲＮＡ分子の任意の一本鎖領域は、化学修飾または二次構造を介して劣化に対して安定化させることができる。ＲＮＡ鎖は、非対応のヌクレオチド、または不完全に対応したヌクレオチドを有することができる。それぞれの鎖は、１つまたは複数のニック（核酸の骨格中の切れ目、例えば、図１Ｂを参照されたい）、ギャップ（１つまたは複数の欠損したヌクレオチドを有する断片化された鎖、例えば、図１Ｃを参照されたい）、および修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を有することができる。ＲＮＡ分子中の任意およびすべてのヌクレオチドを化学的に修飾することができるだけでなく、それぞれの鎖は、その機能性を増強するために、１つまたは複数の部分、例えば、１つまたは複数のペプチド、抗体、抗体断片、アプタマー、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチドなどの部分と結合することができる。いくつかの実施形態において、この部分は、送達を増強するために付加される。他のいくつかの実施形態において、この部分は、１つまたは複数の薬理学的特性、例えば、薬剤吸収を増強するために付加される。
一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より３〜１０ｎｔ長い。
一実施形態において、第１鎖、または長い鎖は、５〜１００ｎｔ、または好ましくは１０〜３０ｎｔもしくは１２〜３０ｎｔ、またはより好ましくは１５〜２８ｎｔの長さを有する。一実施形態において、第１鎖は、長さが２１ヌクレオチドである。一実施形態において、第２鎖、または短い鎖は、３〜３０ｎｔ、または好ましくは３〜２９ｎｔもしくは１０〜２６ｎｔ、またはより好ましくは１２〜２６ｎｔの長さを有する。一実施形態において、第２鎖は、１５ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１９ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。
一実施形態において、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、いずれのミスマッチまたはバルジも含まず、２本の鎖は、二本鎖領域内で互いに完全に相補的である。別の実施形態において、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、ミスマッチおよび／またはバルジを含む。
一実施形態において、末端突出は１〜１０ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、末端突出は１〜８ヌクレオチドである。別の実施形態において、末端突出は３ｎｔである。
１．１．５’突出および３’突出の両方を有する二重鎖ＲＮＡ分子
図１Ａを参照すると、本発明の一実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、第１鎖上に５’突出および３’突出の両方を有する。ＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、第１鎖と第２鎖は、実質的に相補性の配列を有する少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、第１鎖は、第２鎖より長い。第１鎖上で、二本鎖領域に隣接して、５’末端および３’末端の両方上に非対応の突出が存在する。
一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも２ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は第２鎖より少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より３〜１０ｎｔ長い。
一実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜１８ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、３〜２８ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、３〜１９ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜２４ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜１９ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態において、第１鎖は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｔの長さを有する。別の実施形態において、第２鎖は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８ｎｔの長さを有する。
一実施形態において、第１鎖は、２１ｎｔの長さを有し、第２鎖は、１５ｎｔの長さを有する。この特定の実施形態は、本明細書の以下で「１５／２１」構造と時折呼ばれる。いくつかの「１５／２１」構造では、より長い鎖は、３’末端と５’末端の両方において３ｎｔの突出を有する。
一実施形態において、３’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、３’突出は、１〜８ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、３’突出は、２〜６ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。
一実施形態において、５’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、５’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、５’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。
一実施形態において、３’突出の長さは、５’突出の長さに等しい。別の実施形態において、３’突出は、５’突出より長い。代替の実施形態において、３’突出は、５’突出より短い。
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、約１５ｎｔの実質的に相補性の配列の二本鎖領域、３ｎｔの３’突出、および３ｎｔの５’突出を含む。第１鎖は２１ｎｔであり、第２鎖は１５ｎｔである。一特徴では、様々な実施形態の二本鎖領域は、完全に相補性の配列からなる。代替の特徴では、二本鎖領域は、少なくとも１つのニック（図１Ｂ）、ギャップ（図１Ｃ）、および／またはミスマッチ（バルジもしくはループ）を含む。
一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１９ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。２つ以上の二本鎖領域が存在することができる。
一実施形態において、第１鎖はガイド鎖であり、これは、切断によるかまたは翻訳抑制による遺伝子サイレンシングのために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの実質的に相補性の遺伝子転写物を標的にすることができる。
上記に論じた同じ原理および特徴は、第２鎖が第１鎖より長い実施形態にもあてはまる（図２Ｅ）。
１．２．平滑末端、および５’突出または３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、平滑末端、および５’突出または３’突出を含む（例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。このＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、第１鎖と第２鎖は、二本鎖領域を形成し、第１鎖は、第２鎖より長い。
一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１８ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。この二本鎖領域は、他の実施形態に関して記載したものと同様の特徴を有することができ、必ずしもここで繰り返されない。例えば、二本鎖領域は、完全に相補性の配列からなり、または少なくとも１つのニック、ギャップ、および／またはミスマッチ（バルジまたはループ）を含むことができる。
一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より４〜１０ｎｔ長い。
一実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜１９ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜１９ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、平滑末端、および３’突出を含む（例えば、図２Ｂを参照されたい）。
一実施形態において、３’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、３’突出は、１〜８ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、３’突出は、２〜６ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。
代替の実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、平滑末端、および５’突出を含む（例えば、図２Ａを参照されたい）。
一実施形態において、５’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、５’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、５’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。
１．３．２つの５’突出、または２つの３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、および２つの３’突出、または２つの５’突出を含む（例えば、図２Ｃおよび２Ｄを参照されたい）。ＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、第１鎖と第２鎖は、二本鎖領域を形成し、第１鎖は、第２鎖より長い。
一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを含む。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１８ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。
一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より４〜１０ｎｔ長い。
一実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜１８ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜１６ヌクレオチドの長さを有する。
代替の実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、および２つの３’突出を含む（例えば、図２Ｃを参照されたい）。この二本鎖領域は、他の実施形態に関して記載したのと同様の特徴を有する。
一実施形態において、３’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、３’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、３’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、および２つの５’突出を含む（例えば、図２Ｄを参照されたい）。
一実施形態において、５’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、５’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。
上記に論じた同じ原理および特徴が、第２鎖が第１鎖より長い実施形態にも当てはまる（図２Ｆ）。
２．０．ａｉＲＮＡの設計
理解を容易にするために、本発明の原理は、例を使用して以下に時折説明および例示され、ここで、（ａ）ｓｉＲＮＡ用途において、アンチセンス鎖は、ａｉＲＮＡ分子のより長い鎖であり、（ｂ）ｍｉＲＮＡ模倣剤用途において、成熟ｍｉＲＮＡと同様の配列を有するアンチセンス鎖は、ａｉＲＮＡ分子のより長い鎖であり、（ｃ）ｍｉＲＮＡ阻害剤用途において、成熟ｍｉＲＮＡと実質的に相補性の配列を有するセンス鎖は、ａｉＲＮＡ分子のより長い鎖である。しかし、反対の状態も真となり得、本発明の一部であることが企図され、すなわち、アンチセンス鎖は、ｓｉＲＮＡ用途およびｍｉＲＮＡ模倣剤用途の両方において、ａｉＲＮＡ分子のより短い鎖でありえ、センス鎖は、ｍｉＲＮＡ阻害剤用途において、より短い鎖でありえ、他の例において記載された同じ特徴および原理が、これらの状態に当てはまり、必ずしも繰り返されない。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、研究手段として広く使用され、薬剤候補として開発される。（例えば、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ、Ｎｏｖｉｎａ ＆ Ｓｈａｒｐ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４巻：４５７〜４６７頁（２００３年）；Ｋｉｍ ＆ Ｒｏｓｓｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ８巻：１７３〜１８４頁（２００７年）；ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ６巻：４４３〜４５３頁（２００７年）；Ｃｚｅｃｈ、ＮＥＪＭ ３５４巻：１１９４〜１１９５頁（２００６年）；およびＭａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻：６３１〜６３８頁（２００７年）を参照されたい）。本発明の二重鎖ＲＮＡ分子、すなわち、ａｉＲＮＡは、当分野で既知のｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡから導出することができる。
本発明は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを変換してａｉＲＮＡにする方法を提供する。この変換は、最初の分子と比較して改善された、少なくとも１つの特性を有する、新しい二重鎖ＲＮＡ分子をもたらす。この特性は、サイズ、効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）、効能（ｐｏｔｅｎｃｙ）、開始速度、耐久性、合成費用、オフターゲット効果、インターフェロン応答、または送達とすることができる。
一実施形態において、最初の分子は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊（ガイド／パッセンジャー）二重鎖などの二重鎖ＲＮＡ分子である。二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの二本鎖領域を形成する、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）およびセンス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）を含む。この方法は、アンチセンス鎖がセンス鎖より長いように一方または両方の鎖の長さを変更するステップを含む。一実施形態において、センスパッセンジャー鎖が短縮される。別の実施形態において、アンチセンスガイド鎖が伸長される。なおさらなる実施形態において、センス鎖が短縮され、アンチセンス鎖が伸長される。無傷またはサイズが変更されたアンチセンスおよびセンスＲＮＡ鎖は、合成し、ａｉＲＮＡ分子が形成される条件下で組み合わせることができる。
さらなる実施形態において、この方法は、二重鎖ＲＮＡ分子が、１〜６ヌクレオチドの３’突出、および１〜６ヌクレオチドの５’突出のうちの少なくとも１つを有して形成されるように、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の長さを変更するステップを含む。
一実施形態において、最初の分子は、成熟ガイドｍｉＲＮＡ、またはパッセンジャーｍｉＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ分子である。この方法は、一本鎖鋳型またはその一部と実質的に相補的である、より短いＲＮＡ鎖を合成するステップと、非対称鎖長のａｉＲＮＡ分子が形成されるハイブリダイズ条件下で、合成された鎖を、最初の一本鎖ＲＮＡ分子またはその短縮型と組み合わせるステップとを含む。一実施形態において、鋳型ＲＮＡは、成熟ガイドｍｉＲＮＡであり、得られるａｉＲＮＡはその模倣剤である。別の実施形態において、鋳型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖中のパッセンジャー鎖（ｍｉＲＮＡ＊）であり、得られるａｉＲＮＡは、ガイドｍｉＲＮＡの阻害剤である。
あるいは、本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、新規に設計することができる。本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子ウォークの方法などの、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのための設計方法を利用して設計することができる。
本発明のＲＮＡ分子は、バイオインフォマティクス手法を用いて設計し、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することによって、標的遺伝子に対するその調節効力、および任意のオフターゲット効果の存在を判定することができる。これらの研究に基づいて、次いでＲＮＡ分子の配列を選択し、修飾することによって、標的遺伝子に対する調節効力を改善し、オフターゲット効果を最小限にすることができる。（例えば、Ｐａｔｚｅｌ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １２巻：１３９〜１４８頁（２００７年）を参照されたい）。
２．１．二重鎖ＲＮＡ分子中の非対応領域またはミスマッチ領域
ａｉＲＮＡ二重鎖の２つの一本鎖は、例えば、１つまたは複数のミスマッチを含む、少なくとも１つの非対応の領域、または不完全に対応した領域を有することができる。一実施形態において、非対応の、または不完全に対応した領域は、平滑末端を有する末端領域、３’−凹部または５’突出を有する末端領域、および５’凹部または３’突出を有する末端領域を含めた、ＲＮＡ分子の少なくとも１つの末端領域である。本明細書で使用する場合、末端領域は、１つの末端および隣接する範囲を含む、ＲＮＡ分子の領域である。
一実施形態において、非対応の領域、または不完全に対応した領域は、ａｉＲＮＡ分子の二本鎖領域内にある。さらなる実施形態において、非対称性ＲＮＡ二重鎖は、非対応のバルジまたはループ構造を有する。
２．２．二重鎖ＲＮＡ分子内の配列モチーフ
本発明のａｉＲＮＡ分子の設計において、総ＧＣ含量は変化し得る。一実施形態において、二本鎖領域のＧＣ含量は、２０〜７０％である。さらなる実施形態において、Ｇ−Ｃ対形成は、Ａ−Ｕ対形成より強いので、鎖の分離をより容易にするために、二本鎖領域のＧＣ含量は、５０％未満、または好ましくは３０〜５０％である。
末端の突出でのヌクレオチド配列、いくつかの実施形態において、例えば、５’末端は、任意の鋳型配列（例えば、標的ｍＲＮＡ配列）から独立に設計することができ、すなわち、標的ｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣剤の場合）、または標的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ阻害剤の場合）と実質的に相補的である必要はない。一実施形態において、より長い鎖またはアンチセンス鎖の、例えば５’または３’での突出は、少なくとも１つのＡ、Ｕ、またはｄＴを有する。一実施形態において、突出は、少なくとも１つの「ＡＡ」、「ＵＵ」または「ｄＴｄＴ」モチーフを有し、これは、いくつかの他のモチーフと比較して、効力の増大を示した。一実施形態において、より長い鎖またはアンチセンス鎖の５’突出は、「ＡＡ」モチーフを有する。別の実施形態において、より長い鎖またはアンチセンス鎖の３’突出は、「ＵＵ」モチーフを有する。
２．３．ヌクレオチド置換
本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドの１つまたは複数は、デオキシヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と置換することができる。置換は、ＲＮＡ分子内のどこにおいても、例えば、一方もしくは両方の突出領域、および／または二本鎖領域で起こり得る。場合によっては、置換により、ＲＮＡ分子の物理的特性、例えば、鎖親和性、溶解度、およびＲＮａｓｅ劣化に対する抵抗力、または別の方法で増強された安定性が増強される。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは類似体は、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである。骨格修飾リボヌクレオチドは、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合内の修飾を有することができる。一実施形態において、ＲＮＡ分子内のホスホジエステル結合は、修飾されることによって、少なくとも１個の窒素ヘテロ原子および／または硫黄ヘテロ原子を含む。一実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは類似体は、非天然塩基または修飾塩基である。一実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは類似体は、イノシン、またはトリチル化塩基である。
さらなる実施形態において、ヌクレオチド類似体は、糖修飾リボヌクレオチドであり、この中で２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、およびＣＮからなる群から選択される基によって置換され、各Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルおよびアルキニルからなる群から独立に選択され、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される。
一実施形態において、ヌクレオチド類似体は、ホスホチオエート基を含む骨格修飾リボヌクレオチドである。
２．４．ｍｉＲＮＡ模倣剤としてのａｉＲＮＡ
対象における、機能性、内因性のｍｉＲＮＡの欠如または不十分なレベルを補償するために、二本鎖ａｉＲＮＡの新規なコンストラクトを提供することができる。第１の手法では、成熟ｍｉＲＮＡに関与する内因性の二本鎖領域が、ａｉＲＮＡ模倣剤の設計のための鋳型として選択される。そのような鋳型は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのリボヌクレアーゼＤｉｃｅｒ消化から生じるガイド／パッセンジャー（ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊）二重鎖を含めた一本鎖成熟ｍｉＲＮＡに対する任意の適当な内因性の前駆体とすることができる。図１８Ａを参照すると、これらの潜在的な鋳型は、ａｉＲＮＡ設計物中にコピーすることができる二本鎖領域内のヌクレオチドミスマッチからのバルジなどの二次構造を保護する。そのような二次構造は、成熟ｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング機能、例えば、鎖分離の促進において役割を果たすことができるので、この手法は、ａｉＲＮＡについてのこの可能性を有利に保護する。
図１８Ａに示される特定の実施形態において、下に示されたステムループ構造は、ヒトＬｅｔ７ａ遺伝子のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−Ｌｅｔ−７ａ）を表し、ここで、最終的に成熟ｍｉＲＮＡになる２２ヌクレオチドに下線が引かれている。ｈｓａ−Ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡのａｉＲＮＡ模倣剤（「Ｌｅｔ−７ａ ａｉＲＮＡオリゴ」）の設計において、二本鎖領域内のその下線を引かれた部分は、ａｉＲＮＡの２１ｎｔのより長い鎖のための基盤として使用される。全体が一本鎖のステムループヘアピン分子である、ｐｒｅ−Ｌｅｔ−７ａの二本鎖領域内の実質的に、しかし不完全に相補性の配列からの１５ｎｔのストレッチは、ａｉＲＮＡ設計物を完成するために、より短い鎖として使用される。図に示されるように、少なくとも、最初のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ中の「ＧＵ／ＵＧ」ミスマッチから生じるバブル構造は、ａｉＲＮＡ設計物において保存される。この特定の例では、ａｉＲＮＡのより長い鎖は、３’および５’の両末端上に３ｎｔの突出を有する。
セクション２．０において上述したように、ガイド／パッセンジャーｍｉＲＮＡ二重鎖は、鎖長を変更することによって変換してａｉＲＮＡにすることができる。
第２の手法では、成熟ｍｉＲＮＡ配列の一部が、ａｉＲＮＡのより長い鎖中にコピーされ、成熟ｍｉＲＮＡの天然前駆体に存在していた場合のあるいずれの二次構造に関係することなく、実質的に相補性の、好ましくは完全に相補性のより短い鎖が生成される。図４Ａはとりわけ、ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｃ ｍｉＲＮＡの模倣剤（「ａｉＬｅｔ−７ｃ模倣体」）を示す。成熟したヒトＬｅｔ７ｃ ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）アクセション番号ＭＩＭＡＴ０００００６４）についての配列は、：
ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｃ：５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ
である。最初の１９ヌクレオチド（図１９Ａ中で下線を引かれている）は、ａｉＬｅｔ−７ｃ模倣体のより長い鎖中に、５’末端の「ＡＡ」モチーフの後にコピーされる。次いで、１５ヌクレオチドからなる完全に相補性の配列が、より短い鎖として提供され、より長い鎖の３’末端および５’末端の両末端上に３ｎｔの突出を残す。「ＡＡ」モチーフがより長い鎖の５’末端に付加されるが、これは、試みたモチーフの中で、このモチーフが、ａｉＲＮＡの機能性を増強することにおいていくつかの利点を提供すると思われるためである。以下の例で示されるように、両手法は機能する。一実施形態において、ａｉＲＮＡ模倣剤は、「１５／２１」構造をとる。しかし、他のａｉＲＮＡ構造も、もちろんここで使用することができる。
本発明は、植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、昆虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ならびにマウスおよびヒトのような哺乳動物種を含めた動物を含む、任意の種の任意の所与のｍｉＲＮＡの模倣剤を作製するのに使用することができる。現在知られており、本発明のＲＮＡ分子を生成するのに使用することができるヒトｍｉＲＮＡのリストは、図３０および３１に提供されている。
２．５．ｍｉＲＮＡ阻害剤としてのａｉＲＮＡ
二本鎖ａｉＲＮＡは、例えば、細胞中の活性なｍｉＲＮＡのレベルを低減することによって、内因性のｍｉＲＮＡを阻害するために提供することもできる。現在のａｎｔａｇｏｍｉｒは、一本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づき、これは、真核細胞中で不安定であることで有名である。対照的に、本ａｉＲＮＡ構造足場は二本鎖であり、したがって細胞中ではるかに安定である。その新規非対称性設計物は、以下の実施例７で示されるように、哺乳動物細胞内部の標的ｍｉＲＮＡの強力な阻害を行うことにおいて明らかに機能する。
一実施形態において、ａｉＲＮＡの第１鎖、好ましくはより長い鎖は、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補性の配列からなる。次いで他方のａｉＲＮＡ鎖、好ましくはより短い鎖が、配列中の第１鎖を実質的に補完する、例えば、完全に補完するために作製される。一実施形態において、より短い鎖は、二本鎖領域におけるより長い鎖と不完全に、すなわちただ部分的に相補的である。
一実施形態において、ａｉＲＮＡコンストラクトのより長い鎖は、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と完全に相補的であるように設計される。例えば、図１９Ａは、とりわけ、それぞれｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−１５５の３つの阻害剤コンストラクトを示す。それぞれの阻害剤についての対応する標的ｍｉＲＮＡ配列は、図１９Ｂに示されている。それぞれの阻害剤は、５’末端の「ＡＡ」モチーフの後に、成熟した標的ｍｉＲＮＡの最初の１９ヌクレオチドと完全に相補性の配列を含む。示された実施例において、ａｉＲＮＡコンストラクトは、「１５／２１」構造をとり、より長い２１ｎｔの鎖は、３’および５’の両末端に突出を有する。他のａｉＲＮＡ構造も、もちろんここで使用することができる。
理論によって束縛されないが、本発明のａｉＲＮＡによるｍｉＲＮＡの阻害についての１つの可能な機構は、図２９によって例示されており、以下の通りである：細胞内部で、内因性のｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖および導入されたａｉＲＮＡ二重鎖の両方の鎖は、常に動的平衡にあり、その条件下で、一部の二重鎖は、常に一緒になって塩基対形成している一方で、他の二重鎖は、常に分離している。形成した二重鎖とほどけた二重鎖の間、または言い換えれば、結合速度と解離速度の間の、任意の所与の時間での比は、二重鎖を形成している２本の鎖の間の親和性に大部分は依存する。現時点で明らかでないが、ａｉＲＮＡのより長い鎖は、場合により、その設計された相補性、または鎖分離を促進する構造の欠如によって、標的ｍｉＲＮＡ鎖と塩基対形成すると、内因性のパッセンジャーｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ＊）鎖より、標的ｍｉＲＮＡに対してより強い親和性（すなわち、より低い解離速度）を示す。これは、解離に有利である内因性のｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖内にミスマッチ領域または非対応領域が存在するとき、特に真となり得る。結果として、時間の経過とともに、ａｉＲＮＡのより長い鎖は、成熟ガイドｍｉＲＮＡと、より長く続く二重鎖を形成することにおいて、内因性のパッセンジャーｍｉＲＮＡと競合することができるようになり、したがって、意図された遺伝子サイレンシングを行うのに利用可能な、任意の所与の時間での非結合ガイドｍｉＲＮＡの量を低減する。長さ非対称のａｉＲＮＡコンストラクトは、対称なコンストラクトと比較して、より長い鎖とより短い鎖の間の解離に有利であり、より多くのより長い鎖を標的ｍｉＲＮＡ鎖獲得のために競合するのに利用可能にしている。
好ましい実施形態において、ａｉＲＮＡのより長い鎖は、標的とされたガイドｍｉＲＮＡの少なくとも一部と完全な塩基対相補性を有するが、相補性が、ガイドｍｉＲＮＡと二重鎖を形成することに関して、内因性のパッセンジャーｍｉＲＮＡと競合するのに、より長い鎖にとって十分高い限り、これは真である必要はない。
本発明は、植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、昆虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ならびにマウスおよびヒトのような哺乳動物種を含めた動物を含む、任意の種の任意の所与のｍｉＲＮＡの阻害剤を作製するのに使用することができる。現在知られており、本発明のＲＮＡ分子を生成するのに使用することができるヒトｍｉＲＮＡのリストは、図３０および３１に提供されている。
３．有用性
３．１．研究および薬剤発見ツール
マイクロＲＮＡは、細胞における遺伝子制御機能の役割を果たす。いくつかは、癌、ウイルス感染症などを含めた様々なタイプのヒト疾患に関連することが見出された。したがって、ｍｉＲＮＡ模倣剤および阻害剤は、ｍｉＲＮＡによって調節される遺伝子標的、ならびに様々なｍｉＲＮＡ経路およびこれらの相互作用の機構および成分を研究するのに使用することができる。
本発明の方法およびコンストラクトは、ｍｉＲＮＡ経路および関連遺伝子機能をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで研究するために使用することができる。本発明のＲＮＡ分子は、薬剤標的／経路の同定および検証における研究ツールとして、培養された動物細胞を形質移入するためにも使用することができる。例えば、宿主細胞中に本発明のＲＮＡ分子を形質移入するか、さもなければ送達した後、これらの細胞は、対象とするいくつかの経路が影響されたことを示す、表現型または形態の変化についてモニターすることができる。そのような表現型の変化は、核の数、核形態、細胞死、細胞増殖、ＤＮＡ断片化、細胞表面マーカー、および有糸分裂指数などを伴うことができる。別の例では、宿主細胞中の分子／基質と、細胞中に形質移入されたｍｉＲＮＡモジュレーター（模倣剤または阻害剤）との相互作用は、単離または同定することによって、潜在的な治療標的を発見することができる。その標的は上流にあって、ｍｉＲＮＡ活性を調節することができ、または標的は下流にあることができ、その活性は、ｍｉＲＮＡによって調節される。さらに、本発明のＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、患部組織の異種移植片を有する動物モデルまたは細胞集団において、薬物標的発見および検証を行うために使用することができる。
ネットワークまたはいくつかのｍｉＲＮＡは、同じ遺伝子産物または経路を標的にすることができる（Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ Ｐら ＲＮＡ １２巻：１９２〜１９７頁（２００６年））という証拠を伴って、様々なｍｉＲＮＡの模倣剤、様々なｍｉＲＮＡの阻害剤、ならびに様々なｍｉＲＮＡの模倣剤および阻害剤の混合物を含めた本発明の複数のＲＮＡ分子は、同じ遺伝子産物の同時制御を含めた様々なｍｉＲＮＡ経路間の相互関係を研究するために使用することができる。
追加のｉｎ ｖｉｖｏ用途に関して、本発明は、機能的なｍｉＲＮＡ模倣剤および阻害剤を提供するので、これらが宿主体中にそれぞれ導入された後、システム生物学の手法を、様々な細胞型および様々な組織上で模倣または阻害されている、ある特定のｍｉＲＮＡの効果を研究することに採用することができる。
さらに、ｍｉＲＮＡによって媒介された転写後の遺伝子サイレンシングを調節するその能力を伴って、本発明のＲＮＡ分子は、遺伝子機能を研究および検証するために、遺伝子操作されたノックアウトモデルとは対照的に、動物モデルにおいて遺伝子「ノックダウン」を作り出すために使用することができる。
本発明のＲＮＡ分子は、二本鎖の二重鎖で、または二本鎖形態で使用される一本鎖として分離されて、研究試薬として供給することができる。したがって、本発明は、上述したものを含めた任意の適当な形態で本発明のＲＮＡ分子を含むキットも提供する。
３．２．治療用途
本発明のＲＮＡ分子は、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ、Ｎｏｖｉｎａ ＆ Ｓｈａｒｐ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４巻：４５７〜４６７頁（２００３年）；Ｋｉｍ ＆ Ｒｏｓｓｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ８巻：１７３〜１８４頁（２００７年）；ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ６巻：４４３〜４５３頁（２００７年）；Ｃｚｅｃｈ、ＮＥＪＭ ３５４巻：１１９４〜１１９５頁（２００６年）；ならびにＭａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻：６３１〜６３８頁（２００７年）；ＴｏｎｇおよびＮｅｍｕｎａｉｔｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５巻：３４１〜３５５頁（２００８年）に要約されている疾患を含めた様々な疾患の治療およびまたは予防のために使用することができる。
一実施形態において、本発明の模倣剤は、所望のｍｉＲＮＡ機能を正常なレベルに再構成し、それによって疾患を治療し、または症状を軽減するために使用される。別の実施形態において、本発明の阻害剤は、望まれないｍｉＲＮＡ活性を低減または排除し、それによってｍｉＲＮＡの過剰発現または異所性発現によって生じる疾患を治療するために使用される。複数の模倣剤、複数の阻害剤、ならびに模倣剤および阻害剤の混合物の組合せの使用も使用することができる。
一実施形態において、本発明は、１つまたは複数の癌関連遺伝子を標的にすることによって、癌療法として、または癌を予防するために使用される。この方法は、本発明のｍｉＲＮＡ模倣剤および／または阻害剤を使用して、腫瘍抑制遺伝子を上方制御することによって、および／または本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤および／または模倣剤を使用して、細胞増殖または他の癌表現型に関与する遺伝子をサイレンシングすることによって行われる。
一実施形態において、本発明による治療的模倣剤は、発癌遺伝子を標的にするｍｉＲＮＡを模倣する。そのような腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの例として、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５などを挙げることができる。これらのｍｉＲＮＡによって標的にされる様々な発癌遺伝子の例には、ｋ−Ｒａｓおよびｂｃｌ−２が含まれる。例えば、ｋ−Ｒａｓは、ｍｉＲＮＡ Ｌｅｔ−７によって制御されることが示されている。これらの発癌遺伝子は、大多数の臨床症例において活性であり、関連している。例えば、ｋ−Ｒａｓは、大多数のヒト結腸癌、膵癌、および非小細胞肺癌において異常に活性である。さらに、ｋ−Ｒａｓ突然変異は、化学療法および現在の標的療法に対する抵抗力を付与する。
一実施形態において、本発明による治療的阻害剤は、腫瘍抑制遺伝子を標的にするｍｉＲＮＡを阻害する。そのようなｍｉＲＮＡの例として、ｍｉＲ−１７／９２クラスター、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２などを挙げることができる。これらのｍｉＲＮＡによって標的にされる腫瘍抑制遺伝子の例には、ＥＲＫ５およびｐ２７（ｋｉｐ１）が含まれる（ＴｏｎｇおよびＮｅｍｕｎａｉｔｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５巻：３４１〜３５５頁（２００８年））。
これらのＲＮＡ分子は、模倣または阻害されているｍｉＲＮＡによって標的にされる非癌遺伝子を調節するためにも使用することができる。本発明のＲＮＡ分子は、眼疾患（例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ））；感染症（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＲＣＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デング熱、西ナイル熱）；呼吸器疾患（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、喘息、嚢胞性線維症）；神経疾患（例えば、ハンチンドン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、疼痛）；心血管疾患；代謝障害（例えば、糖尿病）；遺伝子障害；ならびに炎症状態（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節炎、リウマチ様疾患、自己免疫障害）、皮膚病、精神障害（例えば、双極性障害）を治療または予防するためにも使用することができる。
４．製造および使用
４．１．ａｉＲＮＡ分子の作製
本発明のＲＮＡ分子は、化学反応および合成を介するもの、生物学的プロセス、および／または酵素で生じるプロセスを介するものを含めて、任意の適当な手段によって作製することができる。
所与の配列のＲＮＡ分子の化学合成は、当技術分野で周知である。ＲＮＡ分子を作製するための生物学的プロセスも周知である。例えば、ウイルス性、真核生物、または細菌性のＤＮＡ発現ベクターは、適切なプロモーターと構築することによって、宿主細胞（例えば、細菌）中に形質移入されると、対応するＤＮＡ配列を設計されたＲＮＡ配列へ転写することができる。一実施形態において、転写物は、リボヌクレアーゼで生じる部位特異的切断などの酵素作用が必要とされるような、最終のＲＮＡ二重鎖に対する前駆体とすることができる。例えば、本発明のａｉＲＮＡ分子の両方の鎖は、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子を形成するために２本の別々の鎖に切断されることを必要とする一本鎖へと転写され得る。
本発明の一態様は、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子の一部またはすべて（例えば、非対称の鎖の１つ）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを対象とし、ＤＮＡ配列は、発現制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態において、ベクターは一本鎖である。さらなる実施形態において、本発明のＲＮＡ分子の異なる鎖をそれぞれコードする２つの異なるベクターが提供されることによって、細胞に同時形質移入し、この細胞内で２本の発現された鎖が二重鎖を形成する。別の実施形態において、ベクターは二本鎖であり、それぞれの鎖は、発現制御配列に作動可能に連結したＲＮＡ分子の異なる鎖のためのＤＮＡ配列を含む。さらに、本発明は、そのような発現ベクターを含む細胞を提供する。細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞、または細菌細胞とすることができる。
ａｉＲＮＡ分子の２本の鎖は、任意の上記プロセスで、別々に、または同時に製造することができる。例えば、生物学的プロセスにおいて、２つのベクターを構築することによって、ａｉＲＮＡのより短い鎖およびより長い鎖を別々に発現することができ、または２本の鎖を有する単一のベクターを構築することによって、ａｉＲＮＡ分子の２本の鎖を同時に発現することができる。
４．２．ＲＮＡ分子の修飾
裸のＲＮＡ分子は、相対的に不安定であり、ｉｎ ｖｉｖｏで相対的に迅速に劣化し得る。ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの模倣剤、ｍｉＲＮＡの阻害剤を含めた、本発明のＲＮＡ分子に化学修飾を導入することによって、これらの生物活性を低減することなく、これらの半減期を改善し、遺伝子標的化の非特異的効果のリスクをさらに低減することができる。
ＲＮＡ分子の修飾は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、およびＲＮＡｉを含めた様々なＲＮＡ分子の安定性を改善するために調査されている。（例えば、Ｃｈｉｕ ＆ Ｒａｎａ、ＲＮＡ ９巻：１０３４〜１０４８頁（２００３年）；Ｃｚａｕｄｅｒｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１巻：２７０５〜２７１６頁（２００３年）；Ｚｈａｎｇ ＨＹら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ６巻：８９３〜９００頁（２００６年）；Ｋｉｍ ＆ Ｒｏｓｓｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ８巻：１７３〜１８４頁（２００７年）；ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ６巻：４４３〜４５３頁（２００７年）；およびＳｃｈｍｉｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻：２７３〜２７５頁（２００７）年；およびＭａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻：６３１〜６３８頁（２００７年）を参照されたい）。
当業者に既知の任意の安定化修飾を使用することによって、本発明のＲＮＡ分子の安定性を改善することができる。本発明のＲＮＡ分子内で、化学修飾は、リン酸骨格（例えば、ホスホロチオエート連結）、リボース（例えば、ロックされた核酸、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン、２’−Ｏ−メチル（ｍｔｈｙｌ））、および／または塩基（例えば、２’−フルオロピリミジン）に導入することができる。そのような化学修飾のいくつかの例を以下に要約する。
血清中でエンドヌクレアーゼ活性に対する抵抗力を増大させる、２’−Ｏ−メチルプリンおよび２’−フルオロピリミジンなどの、リボースの２’位での化学修飾を採用することによって、本発明のＲＮＡ分子を安定化することができる。修飾を導入するための位置は、ＲＮＡ分子のサイレンシング効力を著しく低減することを回避するために、慎重に選択されるべきである。例えば、ガイド鎖の５’末端上の修飾は、サイレンシング活性を低減し得る。一方、２’−Ｏ−メチル修飾を、二本鎖領域での２本のＲＮＡ鎖の間に交互に配置することによって、遺伝子サイレンシング効力を保存しながら安定性を改善することができる。２’−Ｏ−メチル修飾は、インターフェロンの誘発を排除または低減することもできる。
別の安定化修飾は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）連結である。例えば、３’突出での、ＲＮＡ分子中へのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）連結の導入は、エキソヌクレアーゼに対する保護を提供することができる。
ＲＮＡ分子中へのデオキシリボヌクレオチドの導入も、製造費用を低減し、安定性を増大させることができる。
一実施形態において、３’突出、５’突出、またはその両方が、劣化に対して安定化される。一実施形態において、ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含む。さらなる実施形態において、修飾リボヌクレオチドは、その糖、骨格、塩基、またはこの３つの任意の組合せにおいて修飾される。
一実施形態において、ヌクレオチド類似体は、糖修飾リボヌクレオチドである。さらなる実施形態において、ヌクレオチド類似体の２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮから選択される基によって置換され、各Ｒは独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
代替の実施形態において、ヌクレオチド類似体は、ホスホチオエート基を含む骨格修飾リボヌクレオチドである。
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、第１鎖は、１〜６つのデオキシヌクレオチドを含む。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１〜３つのデオキシヌクレオチドを含む。別の実施形態において、３’突出は、１〜３つのデオキシヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜３つのデオキシヌクレオチドを含む。代替の実施形態において、第２鎖は１〜５つのデオキシヌクレオチドを含む。
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む３’突出または５’突出を含む。別の実施形態において、ＲＮＡの３’突出および／または５’突出は、デオキシヌクレオチドからなる。
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、実体とコンジュゲートしている。さらなる実施形態において、実体は、ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、およびアプタマーからなる群から選択される。
別の実施形態において、第１鎖と第２鎖は、化学リンカーによって結合されている。
４．３．ＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ送達
ＲＮＡｉの治療用途にとっての１つの主な障害は、標的細胞へのｓｉＲＮＡの送達である（Ｚａｍｏｒｅ ＰＤ、Ａｒｏｎｉｎ Ｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９巻：２６６〜８頁（２００３年））。様々な手法が、ＲＮＡ分子、特にｓｉＲＮＡ分子の送達のために開発された（例えば、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ、Ｎｏｖｉｎａ ＆ Ｓｈａｒｐ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４巻：４５７〜４６７頁（２００３年）；Ｋｉｍ ＆ Ｒｏｓｓｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ８巻：１７３〜１８４頁（２００７年）；およびｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ６巻：４４３〜４５３頁（２００７年）を参照されたい）。当業者に既知の任意の送達手法を、本発明のＲＮＡ分子の送達のために使用することができる。
送達における主な問題点として、血清中の不安定性、非特異的な分布、組織障壁、および非特異的なインターフェロン応答が挙げられる（Ｌｕ ＆ Ｗｏｏｄｌｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４３７巻：９３〜１０７頁（２００８年））。そのｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ対応物と比較して、ａｉＲＮＡ分子はいくつかの利点を有し、これは、より広い範囲の方法を送達目的のために利用可能にするはずである。第１に、ａｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ対応物より小さいように設計することができ、したがって、任意のインターフェロン応答を低減または排除することができる。第２に、ａｉＲＮＡは、より強力であり、より速く開始し、より有効であり、より長く持続し、したがって、治療目的を実現するのに、より少ない量／投与量のａｉＲＮＡを必要とする。第３に、ａｉＲＮＡは二本鎖であり、一本鎖のアンチセンスオリゴおよびｍｉＲＮＡより安定であり、これらは、化学的にさらに修飾されることによって、安定性を増強することができる。したがって、本発明のＲＮＡ分子は、様々な全身的または局所的な送達経路を介して対象中に送達することができる。いくつかの実施形態において、本発明の分子は、静脈内（Ｉ．Ｖ．）および腹腔内（ｉｐ）を含む全身送達経路を介して送達される。他の実施形態において、本発明の分子は、局所的な送達経路、例えば、鼻腔内、硝子体内、気管内、脳内、筋肉内、関節内、および腫瘍内を介して送達される。
送達技術の例として、裸のＲＮＡ分子の直接注射、コレステロールなどの天然リガンドへのＲＮＡ分子の結合、またはアプタマー、リポソーム調合送達、および抗体−プロタミン融合タンパク質への非共有結合が挙げられる。他の担体の選択肢には、正に帯電した担体（例えば、陽イオン性の脂質およびポリマー）ならびに様々なタンパク質担体が含まれる。一実施形態において、本発明の分子の送達は、陽イオン性リポソーム複合体またはポリマー複合体系に基づくリガンド標的送達系を使用する（Ｗｏｏｄｌｅら Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ７４巻：３０９〜３１１頁；Ｓｏｎｇら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（６号）：７０９〜７１７頁（２００５年）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（８号）：１００２〜１００７頁（２００５年））。
一実施形態において、本発明の分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、コラーゲン担体、例えば、アテロコラーゲンと製剤化される。アテロコラーゲンは、ｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅによって消化されることから保護し、徐放を可能にすることが報告されている（Ｍｉｎａｋｕｃｈｉら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２巻：ｅ１０９頁（２００４年）；Ｔａｋｅｉら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４巻：３３６５〜３３７０頁（２００４年））。別の実施形態において、本発明の分子は、ナノ粒子と製剤化され、またはナノエマルジョン、例えば、ＲＧＤペプチドリガンド標的ナノ粒子を形成する。異なるｓｉＲＮＡオリゴを、同じＲＧＤリガンド標的ナノ粒子中で混合することによって、いくつかの遺伝子を同時に標的にすることができることが示された（Ｗｏｏｄｌｅら Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｏｄａｙ ８巻（補遺１）：３４〜４１頁（２００５年））。
ウイルスベクターも、本発明のＲＮＡ分子の送達のために使用することができる。一実施形態において、レンチウイルスベクターが、安定な発現のためにゲノムに組み込むＲＮＡ分子導入遺伝子を送達するために使用される。別の実施形態において、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、ゲノムに組み込まれないで、エピソーム発現を有するＲＮＡ分子導入遺伝子を送達するために使用される。
さらに、本発明のＲＮＡ分子の送達のために、細菌を使用することができる。（Ｘｉａｎｇ、Ｆｒｕｅｈａｕｆ、＆ Ｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４巻：６９７〜７０２頁（２００６年）を参照されたい）。
４．４．医薬組成物および製剤
本発明の医薬組成物および製剤は、ＲＮＡ成分を除いて、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡに対して開発された医薬組成物および製剤と同じであるか、同様であってもよい（例えば、Ｋｉｍ ＆ Ｒｏｓｓｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ８巻：１７３〜１８４頁（２００７年）；およびｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ６巻：４４３〜４５３頁（２００７年）を参照されたい）。医薬組成物および製剤中のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡは、本情報の二重鎖ＲＮＡ分子によって置換することができる。医薬組成物および製剤は、さらに改変することによって、本情報の二重鎖ＲＮＡ分子に適応させることもできる。
開示された二重鎖ＲＮＡ分子の「薬学的に許容される塩」または「塩」は、イオン結合を含む開示された二重鎖ＲＮＡ分子の生成物であり、一般に、開示された二重鎖ＲＮＡ分子を、対象に投与するのに適した酸または塩基と反応させることによって生成される。薬学的に許容される塩として、それだけに限らないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、および酒石酸塩を含めた酸付加塩；Ｎａ、Ｋ、Ｌｉなどのアルカリ金属陽イオン、ＭｇまたはＣａなどのアルカリ土類金属塩、または有機アミン塩を挙げることができる。
「医薬組成物」は、対象への投与に適した形態での、開示された二重鎖ＲＮＡ分子を含む製剤である。一実施形態において、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器上の単一ポンプ、またはバイアルを含めた様々な形態のいずれかである。単位用量の組成物中の活性成分（例えば、開示された二重鎖ＲＮＡ分子またはその塩の製剤）の量は、有効量であり、関与する特定の治療によって変化する。当業者は、患者の年齢および状態に応じて、投与量に対して日常の変更を行うことが時折必要であることを理解するであろう。投与量は、投与経路にも依存する。様々な経路は、経口、肺性、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内などを含めて企図されている。本発明の二重鎖ＲＮＡ分子の局所または経皮投与のための剤形として、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション剤、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。一実施形態において、活性な二重鎖ＲＮＡ分子は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされる任意の保存剤、緩衝液、または噴霧剤と混合される。
本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体と組み合わせた、本発明の二重鎖ＲＮＡ分子を含む医薬製剤も提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」は、薬剤投与に適合性である、任意の、およびすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれることが意図されている。適当な担体は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。そのような担体または希釈剤の例として、それだけに限らないが、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび固定油などの非水性のビヒクルも使用することができる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および作用剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒質または作用剤が、活性な二重鎖ＲＮＡ分子と不適合である場合を除いて、組成物中でのこれらの使用は企図されている。追加の活性な二重鎖ＲＮＡ分子も、組成物中に組み込むことができる。
一実施形態において、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤は、静脈内送達のための脂質を含む。脂質は、リン脂質、合成ホファチジルコリン、天然ホファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミド、ホファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、コレステロール、コレステロール硫酸、ならびにハプテンおよびＰＥＧ結合脂質とすることができる。脂質は、ナノエマルジョン、ミセル、エマルジョン、懸濁液、ナノ懸濁液、ニオソーム、またはリポソームの形態であってもよい。一実施形態において、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤は、ミセルエマルジョン、懸濁液、またはナノ粒子懸濁液の形態であり、これは、静脈内送達のために、静脈内で許容されるタンパク質、例えば、ヒトアルブミンまたはその誘導体をさらに含む。
一実施形態において、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤は、経口送達のためのワックス状物質を含む。ワックス状物質は、モノ−、ジ−、またはトリグリセリド、ＰＥＧのモノ−、ジ脂肪酸エステル、ＰＥＧ結合ビタミンＥ（ビタミンＥ ＴＰＧ）、ゲルシレおよび／またはゲルシレ４４／１４とすることができる。一実施形態において、薬学的に許容される賦形剤、例えば、ゲルシレ４４／１４は、Ｔｗｅｅｎ８０またはＴｗｅｅｎ２０であってもよい界面活性剤と混合される。これらの実施形態の医薬組成物は、経口投与のためにさらに製剤化することができる。製剤のための方法は、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２４２６２（ＷＯ０３／０１１２２４）、米国特許出願公開第２００３／００９１６３９号、および米国特許出願公開第２００４／００７１７７５号に開示されており、そのそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。
本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、治療有効量（例えば、腫瘍増殖の阻害、腫瘍細胞の死滅、細胞増殖性障害の治療または予防などによる所望の治療効果を実現するのに十分な有効なレベル）の本発明の二重鎖ＲＮＡ分子（活性成分として）を、従来の手順によって標準的な医薬担体または希釈剤と組み合わせることによって（すなわち、本発明の医薬組成物を製造することによって）調製された適当な剤形で投与される。これらの手順は、所望の製剤を得るために、適切な場合、成分の混合、顆粒化、および圧縮または溶解を伴う場合がある。別の実施形態において、治療有効量の本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、標準的な医薬担体または希釈剤を含まない適当な剤形で投与される。
薬学的に許容される担体として、固体担体、例えば、ラクトース、テラアルバ、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などが挙げられる。例示的な液体担体として、シロップ、ラッカセイ油、オリーブ油、水などが挙げられる。同様に、担体または希釈剤として、当技術分野で既知の時間遅延物質、例えば、単独の、またはワックスを含むモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなどを挙げることができる。他の充填剤、賦形剤、香味剤、および当技術分野で既知のものなどの他の添加剤も、本発明による医薬組成物中に含めることができる。
本発明の活性な二重鎖ＲＮＡ分子を含む医薬組成物は、一般に既知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸作製、湿式混合、乳化、カプセル封入、エントラッピング、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物は、活性な二重鎖ＲＮＡ分子の薬学的に使用することができる製剤への加工を促進する賦形剤および／または助剤を含む、１つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化することができる。もちろん、適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
本発明の二重鎖ＲＮＡ分子または医薬組成物は、化学療法剤治療に対して現在使用されている、多くの周知の方法で対象に投与することができる。例えば、癌の治療のために、本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、腫瘍中に直接注射し、血流もしくは体腔中に注射し、または経口服用し、またはパッチを用いて皮膚を介して適用することができる。乾癬状態の治療については、全身投与（例えば、経口投与）、または皮膚の患部への局所投与は、好適な投与経路である。選択される用量は、有効な治療となるのに十分であるが、容認できない副作用を生じるほど高くあるべきでない。患者の病状（例えば、癌、乾癬など）および健康は、治療の間、および治療後の妥当な期間密接にモニターされるべきである。
本発明の二重鎖ＲＮＡ分子または医薬組成物は、任意の適当な投薬範囲、投薬頻度、および血漿濃度で対象に投与することができる。一実施形態において、対象は、１日当たり１ｎｇ〜１ｇ、１日当たり１００ｎｇ〜１ｇ、または１日当たり１μｇ〜５００ｍｇなどの有効投与量で、本発明の医薬組成物を用いて治療されている。
本発明の様々な特徴をさらに例示するために、いくつかの実施例を以下に示す。これらの実施例は、本発明を実施するのに有用な方法も例示する。これらの実施例は、特許請求に係る本発明を制限するものではない。
方法および材料
細胞培養および試薬
Ｈｅｌａ、ＳＷ４８０、ＤＬＤ１、ＨＴ２９、およびＨ１２９９細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＡｌｌＣｅｌｌｓ ＬＬＣから得て、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。この試験中に記載する小ＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ、Ｑｉａｇｅｎ、またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ技術（表２）によって合成され、製造者の説明書に従いアニーリングした（図３ａ）。ヒトＡｇｏ２を標的とするｓｉＲＮＡ、およびＤｉｃｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）は１００ｎＭで使用した。ＲＮＡのトランスフェクションは示した濃度でＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して実施した。ヒトＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ）は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。血清中安定性は、示した時間量のａｉＲＮＡ二重鎖またはｓｉＲＮＡ二重鎖を１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベーション、次に非変性ＴＢＥ−アクリルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって決定した。
ノーザンブロット分析。
β−カテニンのレベルを決定するために、様々な時間時点でｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡトランスフェクトＨｅｌａ細胞からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。２０μｇの全細胞ＲＮＡを変性アガロースゲルのそれぞれのレーンに載せた。電気泳動後、ＲＮＡはＨｙｂｏｎｄ−ＸＬナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移し、ＵＶ架橋させ、３０分間８０℃で焼いた。β−カテニンおよびアクチンｍＲＮＡを検出するプローブを、β−カテニンｃＤＮＡ断片（１〜５６８ｎｔ）およびアクチンｃＤＮＡ断片（１〜５００ｎｔ）から、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩランダムプライマー標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して調製した。小ＲＮＡのＲＩＳＣローディングを分析するために、ｐＣＭＶ−Ａｇｏ２を用いたトランスフェクション後４８時間でｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。細胞は示した時間時点で溶かし、Ａｇｏ２抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を洗浄し、ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬ抽出によって複合体から単離し、１５％ＴＢＥ−尿素ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に載せた。電気泳動後、ＲＮＡはＨｙｂｏｎｄ−ＸＬナイロン膜に移した。ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡプローブキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して５’３２Ｐ標識ＲＮＡプローブを作製した。アンチセンスプローブ（５’−ＧＵＡＧＣＵＧＡＵＡＵＵＧＡＵＧＧＡＣＵＵ−３’）。センスプローブ（５’−ＵＣＣＡＵＣＡＡＵＡＵＣＡＧＣ−３’）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｇｏ２−ＲＩＳＣローディング。
ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡセンスおよびアンチセンス鎖を、Ｔ４キナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３２Ｐ末端標識した。末端標識ＲＮＡはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによって精製し、ＥｔＯＨで沈殿させ、水中に再懸濁した。次いで標識ＲＮＡを、記載したようにｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡアンチセンス鎖とアニーリングさせた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解物用に、Ｈｅｌａ細胞をヒトＡｇｏ２発現ベクターで２４時間トランスフェクトし、Ｓ１０溶解物をほぼ記載したように生成した（Ｄｉｇｎａｍら、１９８３年）。５’センス鎖またはアンチセンス鎖標識二重鎖ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを、次いでＡｇｏ２−Ｓ１０溶解物に加えた。３７℃で５分間のインキュベーション後、Ａｇｏ２を記載したように免疫沈降させ、Ａｇｏ２結合（ペレット）と非Ａｇｏ２結合（上清）画分を２０％ＴＢＥ−アクリルアミドゲル上で分離し、ゲルをフィルムに感光させてセンス鎖−Ａｇｏ２結合を検出した。ａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの競合実験用に、１００倍までの非放射能のａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを使用して、３２Ｐ標識ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと競合させＲＩＳＣをローディングした。簡単に言うと、Ｓ１０溶解物を記載したようにＡｇｏ２発現ベクターでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞から生成した。次いで標識ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをＳ１０溶解物に加え、次いで直後に非標識ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを加えた。反応物は５分間３７℃でインキュベートし、上に記載したように処理した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ｓｉＲＮＡ、示したａｉＲＮＡ、示したａｉＲＮＡ抗ｍｉＲＮＡ、または市販のｍｉＲＮＡ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）でトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後に示した時間時点で採取した。ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬで単離した。ｍＲＮＡ用に、ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲでのＴａｑＭａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲ試薬および示したｍＲＮＡ用のプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。データは対照トランスフェクト細胞に対して表し、それぞれの試料はアクチンｍＲＮＡレベルに正規化する。ｍｉＲＮＡ用に、ｍｉＲＮＡの逆転写はＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施し、ｃＤＮＡはＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するリアルタイムＰＣＲを施し、それぞれの試料はＵ６ｓｎＲＮＡに正規化する。図１４ｄ中の実験用に、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈｏ１部位でのｐｃＤＮＡ３．１＋またはｐｃＤＮＡ３．１−のいずれかへのＳｔａｔ３ｃ ＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）のクローニングによってＳｔａｔ３構築物を作製した。次いでＳｔａｔ３順方向または逆方向発現ベクターを、２４時間ａｉＳｔａｔ３またはｓｉＳｔａｔ３を用いてＨｅｌａ細胞にコトランスフェクトした。次いで細胞を採取し、ＴＲＩＺＯＬによってＲＮＡを単離し、ＴａｑＭａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲ試薬およびＳｔａｔ３またはアクチン用のプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ワンステップ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＳｔａｔ３順方向（５’−ＧＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣ−３’）およびＳｔａｔ３逆方向（５’−ＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＧ−３’）プライマーおよびアクチン順方向（５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣ−３’）およびアクチン逆方向（５’−ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’）プライマーを使用して同じＲＮＡ試料で実施した。
ＲＴ−ＰＣＲ。
全ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して調製し、ｃＤＮＡはランダムプライマーおよびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。ＰＣＲはＰｆｘポリメラーゼを使用して２０サイクルで実施した。プライマー：アクチン−１、５’ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣ−３’；アクチン−２、５’−ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’；β−カテニン−１、５’−ＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’；β−カテニン−２、５’−ＣＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＧＧ−３’。
ウエスタンブロット
細胞を氷冷リン酸塩緩衝化食塩水で二回洗浄し、溶解バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＮａＦ、２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、および１０μｇ／ｍｌのそれぞれのペプスタチン、リューペプチン、およびアプロチニン）中で溶解した。２０μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。β−カテニン、Ｎｂｓ１、サバイビン、ｐ２１、Ｒｓｋ１、ｋ−Ｒａｓ、Ｓｔａｔ３、ＰＣＮＡ、ＮＱＯ１、アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＥＦ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｍＴＯＲ、ＰＴＥＮ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｇｏ２（Ｗａｋｏ）、Ｄｉｃｅｒ（Ｎｏｖｕｓ）、およびＰａｒｐ１（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する一次抗体をこの試験中で使用した。抗原−抗体複合体は増強化学発光（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって目に見える状態にした。
ｍｉＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析
Ｈｅｌａ細胞を１００ｎＭの示したａｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡ用に、または氷上で３０分間のインキュベーションにより全細胞抽出バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭの塩化マグネシウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１ｍＭのジチオスレイトール、１×哺乳動物プロテアーゼ阻害剤カクテル［Ｓｉｇｍａ］、１×ホスファターゼ阻害剤カクテルＩおよびＩＩ［Ｓｉｇｍａ］）を使用してタンパク質用に細胞を採取した。可溶性タンパク質は微小遠心機中の１３，０００×ｇでの遠心分離によって分離し、上清は−７０℃で保存した。タンパク質はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によって分離し、エレクトロブロッティングによってポリビニリデンジフルオリド膜に移した。ｋ−Ｒａｓおよびアクチンを検出するために使用した一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を膜とともにインキュベートし、次にＨＲＰ結合二次抗体（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でインキュベートし、化学発光によって目に見える状態にした（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ワンステップ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｋ−Ｒａｓ順方向（５’−ＡＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴ）、ｋ−Ｒａｓ逆方向（５’−ＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴ）、アクチン順方向（５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣ）およびアクチン逆方向（５’−ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣ）プライマーを使用してＲＮＡ試料で実施した。
５’−ＲＡＣＥ分析
非サイレンシングａｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡで処理したＨｅｌａ細胞由来の全ＲＮＡ（５μｇ）を、任意の事前処理なしでＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ＲＮＡアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５’−ＣＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＧＡＡＡ−３’）と連結させた。連結ＲＮＡはランダムプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写した。切断産物を検出するために、ＲＮＡアダプターと相補的なプライマー（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’ネステッドプライマー：５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’）およびβ−カテニン特異的プライマー（ＧＳＰ：５’−ＣＧＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴ−３’）を使用してＰＣＲを実施した。増幅断片は１．４％アガロースゲルで分けて、１−ｋｂのＰｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分子量を決めた。特異的切断部位をＤＮＡ配列決定によってさらに確認した。
インターフェロン応答の検出。
図１５ａ中の実験用に、ＰＢＭＣを１００ｎＭのβ−カテニンｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡと直接インキュベートした。全てのＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して１６時間で精製し、インターフェロン応答遺伝子の発現のレベルは、製造者（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって記載されたようにＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図１５ｂ中の実験用に、Ｈｅｌａ細胞をモックトランスフェクトしたかまたは２４時間１００ｎＭの示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。全てのＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して精製し、インターフェロン応答遺伝子の発現のレベルはＲＴ−ＰＣＲによって決定した。マイクロアレイ分析用に、Ｈｅｌａ細胞を１００ｎＭのａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。全てのＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して２４時間で精製し、ＲＮＡは製造者のプロトコル（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ、Ｉｎｃ．）に従いヒトゲノムＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）とのハイブリダイゼーションに使用した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１処理細胞由来のＲＮＡを対照として使用した。転写産物の発現値を計算するために、マイクロアレイＳｕｉｔｅ５．０をクオンタイル正規化で使用し、存在すると言われる（Ｐ）十分なハイブリダイゼーションシグナルを有する転写産物をこの試験中で使用した。
ａｉＲＮＡ配列およびｓｉＲＮＡ配列
ａｉＲＮＡ二重鎖およびｓｉＲＮＡ二重鎖の配列および構造を表２中に挙げる。点突然変異の位置をｋ−Ｒａｓ ａｉＲＮＡにおいて枠で囲む。
寿命評価
それぞれの動物の健康状態の毎日の検査も実施した。体重を３日毎に調べた。食餌および水は動物飼育施設の手順に従い毎日供給した。２０％を超える死亡率およびまたは２０％を超える正味体重の減少をもたらした治療は毒性であると考えた。結果は平均腫瘍体積（ｍｍ３）±ＳＥとして表す。０．０５未満のＰ値は統計上関連があると考える。
動物飼育
オスまたはメスの無胸腺ヌードマウス４〜５週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ．）を、試験開始前に少なくとも１週間動物飼育施設に順応させた。使用した全ての実験手順はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ＳｏｃｉｅｔｙおよびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓによって概説されたガイドラインと一致し、これらはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．によっても承認された。動物は制御温度（６８°Ｆ〜７２°Ｆ）、光（１２時間明−暗サイクル）、および湿度（４５〜５５％）を有する室内で、木材チップを敷き詰めたケージにおいて４群で飼育した。実験中、動物は水および食餌に自由にアクセスさせた。
（実施例１．）
非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、哺乳動物細胞において遺伝子特異的サイレンシングを引き起こす。
ｓｉＲＮＡの構造的足場は、ＲＩＳＣ中に組込みＲＮＡｉを媒介するのに必要な形状であると考えられる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ；Ｒａｎａ、２００７年；Ｚａｍｏｒｅら、２０００年）。しかしながら、ＲＩＳＣの組込みおよび遺伝子サイレンシングに関するＲＮＡ二重鎖足場の要件についてはほとんど知られていない。有効なＲＮＡｉメディエーターおよびＲＩＳＣ基質に関する構造的足場の要件を調べるために、本発明者らは最初に、ｓｉＲＮＡより短いＲＮＡ二重鎖が遺伝子サイレンシングを媒介することができたかどうか決定した。二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの長さは、タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）媒介非特異的インターフェロン応答の活性化、合成コストの増大、および送達問題における、その傾向の重要な決定因子である（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ；Ｓｌｅｄｚら、２００３年）。本発明者らは、異なる哺乳動物の遺伝子を標的化する２ヌクレオチド３’突出または平滑末端を有する１２〜２１ｂｐの範囲に一連の短いｄｓＲＮＡを設計した。長さが１９ｂｐ未満に低減した後に遺伝子サイレンシングは検出せず（データ示さず）、これはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの細胞溶解物における以前の報告（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ）、および１９〜２１ｂｐがＲＮＡｉを媒介する最も短いｓｉＲＮＡ二重鎖であるという概念と一致する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ；Ｒａｎａ、２００７年；Ｚａｍｏｒｅら、２０００年）。
次に本発明者らは、突出の非対称性構造を有する非ｓｉＲＮＡ足場のＲＮＡ二重鎖が、遺伝子サイレンシングを媒介することができるかどうか試験した。ｓｉＲＮＡ二重鎖は対称センス鎖およびアンチセンス鎖を含有する。３’突出を含有する二重鎖ｓｉＲＮＡ構造はＲＩＳＣ複合体中への取り込みに必要とされるが、センス鎖のＡｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）媒介切断後、アンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡの切断を誘導する（Ｈａｍｍｏｎｄら、２００１年；Ｍａｔｒａｎｇａら、２００５年；Ｔａｂａｒａら、１９９９年）。本発明者らは、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端に突出を有する様々な長さの非対称性ＲＮＡ二重鎖を作製しようと努めた。
表３中に示す配列を有するオリゴを、アニーリング後２０％ポリアクリルアミドゲルによって確認した。図３Ａ中に示すように、それぞれのレーンには以下のように載せた：レーン１、２１ｎｔ／２１ｎｔ；レーン２、１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン３、１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン４、１３ｎｔ／１３ｎｔ；レーン５、１３ｎｔ／２１ｎｔ；レーン６、１４ｎｔ／１４ｎｔ；レーン７、１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン８、１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン９、１５ｎｔ／１５ｎｔ；レーン１０、１５ｎｔ／２１ｎｔ。
ＨｅＬａ細胞を２００，０００細胞／ウエルで６ウエル培養プレートに平板培養した。図３Ｂ中に示すように、２４時間後、それらをスクランブルｓｉＲＮＡ（レーン１）、Ｅ２Ｆ１標的化２１−ｂｐ ｓｉＲＮＡ（レーン２、特異性の対照として）またはβ−カテニン標的化２１−ｂｐ ｓｉＲＮＡ（レーン３、陽性対照として）、または異なる長さの混合物：１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン４）；１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン５）；１３ｎｔ／２１ｎｔ（レーン６）；１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン７）；１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン８）；１５ｎｔ／２１ｎｔ（レーン９）の同じ濃度のａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション後４８時間で採取した。β−カテニンの発現はウエスタンブロットによって決定した。Ｅ２Ｆ１およびアクチンは対照として使用した。これらの結果は、非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は哺乳動物細胞において遺伝子特異的サイレンシングを引き起こすことを実証する。
ａｉＲＮＡの機能において重要なａｉＲＮＡの構造特徴を決定するために、本発明者らは、コア１５／２１二重アンチセンス突出構造の修飾に基づいて、複数のａｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを作製した（表４）。表４中に要約したａｉＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖の長さ、センスおよびアンチセンス突出の程度、およびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドだけには限られないが、これらを含めた修飾を含有していた。
親１５／２１ａｉＲＮＡ構造に対する修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の改変によって行った（表４）。修飾ａｉＲＮＡ二重鎖を、５０ｎＭで４８時間Ｈｅｌａ細胞にトランスフェクトした。β−カテニンおよびアクチンに関するウエスタンブロットを使用して、親１５／２１ａｉＲＮＡと従来のｓｉＲＮＡ構造と比較した遺伝子サイレンシングの程度を調べた。二重センス鎖突出を含有するａｉＲＮＡ修飾体も試験した。これらのオリゴヌクレオチドは、異なる長さのアンチセンス鎖と対形成する２１塩基のセンス鎖を含有する。さらに、本発明者らは、ＤＮＡ塩基で修飾したａｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの活性も調べた。ＤＮＡ置換はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方で行った（表３）。試験したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか中に１つまたは複数のＤＮＡ置換を含有しており、または示した長さのＤＮＡセンス鎖と対形成する２１塩基のアンチセンスＲＮＡを含有していた。これらの様々なａｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの結果は図４および５中に示した。
まとめると、これらのデータはａｉＲＮＡ機能に対する構造的手掛かりを与える。
センス鎖に関して、本発明者らのデータは、１５塩基の長さは十分働き、一方１４塩基と１９塩基の間の長さは依然機能的であることを示す。アンチセンス突出の法則に見合うという条件で、センス鎖はアンチセンス鎖の任意の部分に適合し得る。センス鎖の５’末端または３’末端のいずれかにおけるＤＮＡと１つのＲＮＡ塩基の交換は許容され、活性の増大をさらにもたらす可能性がある。
アンチセンス鎖の長さに関しては、２１塩基の長さは十分働き、１９〜２２塩基は活性を保持し、および長さが１９塩基未満に低減するまたは２２塩基を超えて増大するとき、活性は低下する。アンチセンス鎖の３’末端は１〜５塩基の突出を必要とし、２〜３塩基の突出が好ましく、平滑末端は活性の低下を示す。標的ＲＮＡ配列と対形成する塩基が好ましく、３塩基までのＤＮＡ塩基の交換が同時の５’ＤＮＡ塩基の交換なしで許容される。アンチセンス鎖の５’末端は０〜４塩基の突出を好み、活性状態を保つために突出を必要としない。アンチセンス鎖の５’末端は標的ＲＮＡ配列に適合しない２塩基を許容することができ、３塩基までのＤＮＡ塩基の交換を同時の３’ＤＮＡ塩基の交換なしで許容することができる。
ミスマッチまたは化学的に修飾した塩基に関して、本発明者らは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか中のミスマッチと１つまたは複数の化学的に修飾した塩基の両方が、ａｉＲＮＡ構造によって許容されることを発見している。
表４中、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃはヌクレオチドを表し、一方ａ、ｔ、ｇ、ｃはデオキシヌクレオチドを表す。
（実施例２．）
ａｉＲＮＡによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズム。
ａｉＲＮＡによって誘導される遺伝子ノックダウンのメカニズムを調べるために、本発明者らは最初に、ａｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングが翻訳レベルまたはｍＲＮＡレベルで起こるかどうか決定した。１０ｎＭの１５ｂｐ ａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−カテニンのノーザンブロット分析は、ａｉＲＮＡはｍＲＮＡレベルを２４時間以内に９５％を超えて低下させ、かつその低下は４日を超えて続いたことを示し（図６ａ）、ａｉＲＮＡがｍＲＮＡレベルで遺伝子サイレンシングを媒介することを示唆した。ａｉＲＮＡによって誘導されるβ−カテニンｍＲＮＡの低減は、ｓｉＲＮＡによる誘導より実質的により迅速、有効および持続的であった（図６ａ）。本発明者らはさらに、１５ｂｐ ａｉＲＮＡがβ−カテニンｍＲＮＡの部位特異的切断を触媒したかどうか決定した。１５ｂｐ ａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞から単離した全てのＲＮＡを、ｃＤＮＡ末端（５’−ＲＡＣＥ）の迅速な増幅およびβ−カテニンｍＲＮＡ切断断片の存在に関するＰＣＲによって調べた（図６ｂ）。本発明者らは、ａｉＲＮＡトランスフェクション後４および８時間でβ−カテニン切断断片を検出した（図６ｃ）。配列分析は、ａｉＲＮＡアンチセンス鎖の５’末端に対してａｉＲＮＡ標的配列内、塩基１０と塩基１１の間で切断が起こっていたことを示した（図６ｄ）。スクランブルａｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後、このような切断断片は観察しなかった（図６ｃ）。これらの結果は、ａｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの配列特異的切断によって、強力かつ有効な遺伝子サイレンシングを誘導したことを実証する。
次に本発明者らは、非対称性ａｉＲＮＡの新規の足場をＲＩＳＣ中に取り込ませることが可能であるかどうか決定した。複合体の触媒単位としてのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Ａｇｏ）とのＲＩＳＣ酵素複合体によってＲＮＡｉが触媒される（Ｌｉｕら、２００４年；Ｍａｔｒａｎｇａら、２００５年）。ａｉＲＮＡがＡｇｏ／ＲＩＳＣ複合体中に取り込まれるかどうか決定するために、本発明者らは、細胞をａｉＲＮＡでトランスフェクトした後、ｍｙｃタグ化Ａｇｏ１（Ｓｉｏｌａｓら、２００５年）を発現する細胞由来のｍｙｃタグ化ヒトＡｇｏ１を免疫沈降させた。ＲＩＳＣ複合体と結合した小ＲＮＡは、Ａｇｏ免疫沈降物のノーザンブロッティングによって検出した。ノーザンブロット分析は、ａｉＲＮＡは高い効率でＲＩＳＣ複合体に進入することを明らかにした（図６ｅ）。これらのデータは、非対称性ａｉＲＮＡの新規の足場を効率良くＲＩＳＣ中に取り込ませることが可能であることを示唆する。
ａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡより効率良く遺伝子サイレンシングを誘導したので、本発明者らは、ａｉＲＮＡがｓｉＲＮＡより効率良くＲＩＳＣ複合体を生成することができるかどうか試験した。図６ｅ中に示すように、ａｉＲＮＡ−Ａｇｏ２／ＲＩＳＣ複合体がｓｉＲＮＡ−Ａｇｏ２／ＲＩＳＣ複合体より速くより効率良く形成され、対応するｓｉＲＮＡより多くのａｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体中に含有されていた（図６ｅおよび図７Ａ）。注目すべきことに、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡによる二次構造の形成と一致する典型的なパターン（２１）を示した（図６ｅおよび図７）。対照的に、ａｉＲＮＡは１つのバンドを示し、短い長さのａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡで起こる二次構造形成を低減または除去する可能性があることが示唆された。
さらに、ａｉＲＮＡの非対称性構造はアンチセンス鎖を有する活性ＲＩＳＣの形成を容易にし、センス鎖で形成される無効なＲＩＳＣを低減する可能性がある（Ｒｅｆ．１６）。本発明者らのデータは、図７Ｂ中に示すようにこれは真実であり、センス鎖はＲＩＳＣ複合体において検出することができないことを証明した。図８Ａも、ａｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＡｇｏ２と強く結合するが、センス鎖はしないことを実証する。対照的に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の両方がＡｇｏ２と結合する。これらのデータは、ａｉＲＮＡが細胞中でのＲＩＳＣの形成においてｓｉＲＮＡより高い効率を有することを示唆し、これがａｉＲＮＡの優れた遺伝子サイレンシング効率の根底にある可能性がある。
さらに、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、機能的であるために切断されることが必要であることが示されている。したがって本発明者らは、同じ要件がａｉＲＮＡに当てはまるかどうか試験した。それを実施するために、ａｉＲＮＡセンス鎖の位置８または９におけるヌクレオチドを２’−Ｏ−メチルで修飾してそれを切断不能にした。本発明者らの結果は、切断不能なセンス鎖を有するａｉＲＮＡは依然機能的であることを示し（図８Ｂ）、それらのメカニズムの点でａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡと全く異なることを実証する。
さらに本発明者らは、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡに関する何らかの異なるローディングポケットが存在するかどうか調べた。本発明者らは非放射能のａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用して、ＲＩＳＣ複合体に関して放射標識ｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡと競合させた（図９）。驚くことに、これらの結果は、非放射能のａｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体に関してｓｉＲＮＡと競合しないこと（図９Ｂ）、および非放射能のｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体に関してａｉＲＮＡと競合しないこと（図９Ｃ）も示す。これらのデータは、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡをＲＩＳＣ複合体の異なるポケットに充填することが可能であることを示す。
まとめると、前述のデータは、ａｉＲＮＡはＲＩＳＣ中に組み込まれる第１の非ｓｉＲＮＡ足場を示し、ＲＩＳＣと相互作用する新規な構造足場を与えることを示唆する。ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのＲＩＳＣローディングの差は、図１０中に示す本発明者らのモデル中で例示する。簡単に言うと、非対称性の性質のために、アンチセンス鎖のみが選択されてＲＩＳＣ複合体中に存在し、鎖選択において１００％の効率をもたらす。対照的に、ｓｉＲＮＡは構造上対称性である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の両方が、選択されてＲＩＳＣ複合体中に存在する可能性を有し、したがってｓｉＲＮＡは無効な鎖選択を有し、同時にセンス鎖ＲＩＳＣ複合体のために非特異的遺伝子サイレンシングを引き起こす可能性がある。
（実施例３．）
ａｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡより迅速、強力、有効、および持続的な遺伝子サイレンシングを媒介する。
遺伝子サイレンシングの性質においてｓｉＲＮＡとａｉＲＮＡを比較するために、本発明者らは最初に、遺伝子サイレンシングに最適なａｉＲＮＡ構造を決定した。
ｓｉＲＮＡ二重鎖は、対称性のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有する。３’突出を含有する二重鎖ｓｉＲＮＡ構造は、センス鎖のＡｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）媒介切断後に、ＲＩＳＣ複合体中への組込みに必要とされる一方で、アンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡの切断を誘導する（Ｈａｍｍｏｎｄら、２００１年；Ｍａｔｒａｎｇａら、２００５年；Ｔａｂａｒａら、１９９９年）。本発明者らは、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端に突出を有する様々な長さの非対称性ＲＮＡ二重鎖を作製しようと努めた。本発明者らは、３’および５’アンチセンス突出を有する１２〜１５ｂｐの一組のこのような非対称性ＲＮＡ二重鎖を設計して、β−カテニン（図１１Ａ）、癌細胞および幹細胞に関係する内因性遺伝子（Ｃｌｅｖｅｒｓ、２００６年）を標的化した。標準構造の最適ｓｉＲＮＡを設計して、ＲＮＡｉを誘発するためにβ−カテニンを標的化した（Ｘｉａｎｇら、２００６年）。β−カテニンに対する全てのａｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによって標的化した同じ配列内に設計した（図１１Ａ）。これらの結果は、最適な遺伝子サイレンシングは１５ｂｐのａｉＲＮＡで得たことを示した（図１１Ｂ）。したがって、本発明者らは１５ｂｐのａｉＲＮＡを使用して、後の実験中で２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖と比較した。
本発明者らが驚いたことに、本発明者らは、ａｉＲＮＡは、非標的対照遺伝子アクチンを維持しながら、β−カテニンタンパク質の強力かつ非常に有効な低減を誘導したことを発見した（図１１Ｃ）。
次に本発明者らは、β−カテニンを標的化するａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの発生を調べた。使用したａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの配列は図１１Ａ中に示す。図１２中に示すように、ａｉＲＮＡにはより迅速な発生（図１２ＣおよびＤ）、およびより良い効力（図１２ＢおよびＤ）もある。
本発明者らは、様々な標的および複数のヒト細胞系に対する、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの影響も比較した。複数のａｉＲＮＡを設計して、低い効率でｓｉＲＮＡによって標的化した同じ配列で、Ｓｔａｔ３（図１３ｂ）、ＮＱＯ１（図１２ｄ）、延長因子２（ＥＦ２）（図１３ｃ）、Ｎｂｓ１（図１４ｂ）、サバイビン（図１４ｂ）、Ｐａｒｐ１（図１４ｂ）、ｐ２１（図１４ｂ）、Ｒｓｋ１（図１４ｃ）、ＰＣＮＡ（図１４ｃ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ（図１４ｃ）、ｍＴＯＲ（図１４ｃ）、およびＰＴＥＮ（図１４ｃ）、およびβ−カテニン（図１３ａ）を含めた異なる機能範囲の遺伝子を標的化した（Ｒｏｇｏｆｆら、２００４年）。図１３および１４中に示すように、ａｉＲＮＡはＳｔａｔ３、β−カテニン、Ｒｓｋ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、Ｎｂｓ１、ｍＴＯＲ、およびＥＦ２を抑制する際にｓｉＲＮＡより有効であり、ＮＱＯ１、ＰＣＮＡ、サバイビン、ＰＴＥＮ、Ｐａｒｐ１、およびｐ２１をサイレンシングする際にｓｉＲＮＡと同程度有効である。標的配列はｓｉＲＮＡの最適化に基づいて選択したので、ａｉＲＮＡの効力および効能を、ａｉＲＮＡ用に最適化した部位を標的化することによってさらに増大することが可能であると考えられる。さらに、本発明者らのデータは、Ｈｅｌａ（図１３ａ）、Ｈ１２９９（図１４ａ、左図）およびＤｌｄ１（図１４ａ、右図）を含めた複数の細胞系において、ａｉＲＮＡはｂ−カテニンに対してｓｉＲＮＡより有効であることも示す。
まとめると、これらのデータは、ａｉＲＮＡは、哺乳動物細胞中で遺伝子サイレンシングを媒介する際にｓｉＲＮＡより有効、強力、発生が迅速、および持続的であることを実証する。
（実施例４．）
ａｉＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性
次に本発明者らは、ａｉＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性を調べた。本発明者らは最初に、野生型ｋ−Ｒａｓ対立遺伝子を標的化するａｉＲＮＡを分析した。ＤＬＤ１細胞は野生型ｋ−Ｒａｓを含有し、一方ＳＷ４８０細胞は１つの塩基対置換を有する突然変異体ｋ−Ｒａｓを含有する（図１４ｄ）。野生型ｋ−Ｒａｓを標的化するａｉＲＮＡでのＤＬＤ１細胞のトランスフェクションは有効なサイレンシングを示したが、ＳＷ４８０細胞において突然変異体ｋ−Ｒａｓのサイレンシングは観察しなかった。これらのデータは、ａｉＲＮＡが対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを媒介することを実証する。
インターフェロン様応答の活性化は、遺伝子サイレンシングの主な非特異的メカニズムである。遺伝子サイレンシングにｓｉＲＮＡを使用する主な理由は、３０ｂｐより短いｄｓＲＮＡが、哺乳動物細胞中でインターフェロン様応答を活性化する低い能力を有することである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１年；ＭａｒｔｉｎｅｚおよびＴｕｓｃｈｌ、２００４年；Ｓｌｅｄｚら、２００３年）。本発明者らは、ａｉＲＮＡが哺乳動物細胞中でインターフェロン様応答を活性化する何らかの兆候を示したかどうか試験した。β−カテニンに対するａｉＲＮＡでトランスフェクトしたＰＢＭＣ細胞およびＥＦ２またはサバイビンに対するａｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞から回収したＲＮＡを、インターフェロン誘導性遺伝子に関するＲＴ−ＰＣＲによって分析した。本発明者らは、ａｉＲＮＡトランスフェクションは、試験した任意のインターフェロン誘導性遺伝子のＲＴ−ＰＣＲにより如何なる増大も示さず、一方標的化ｍＲＮＡのレベルは対照トランスフェクト細胞に比べ低減したことを発見した（図１５ａおよびｂ）。マイクロアレイ分析も実施して、ａｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡによって誘導された既知のインターフェロン応答関連遺伝子の発現の変化を比較した。図１５ｃ中に示すように、ｓｉＲＮＡと比較してａｉＲＮＡに関するはるかに少ない変化を観察した。
さらに、前述のように、センス鎖−ＲＩＳＣ複合体は非特異的遺伝子サイレンシングを引き起こし得る。センス鎖−ＲＩＳＣ複合体によって媒介される非特異的遺伝子サイレンシングにおいてａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡを比較するために、細胞はａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡおよびＳｔａｔ３（センスＲＮＡ）を発現するプラスミドまたはアンチセンスＳｔａｔ３（アンチセンスＲＮＡ）を発現するプラスミドのいずれかとコトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後２４時間でＲＮＡを回収し、Ｓｔａｔ３センスまたはアンチセンスＲＮＡの相対的レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって決定した（挿入図）。結果は、ａｉＲＮＡはアンチセンスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡに対して影響がなく、一方ｓｉＲＮＡは影響があることを示す（図１５ｄ）。この結果は、ａｉＲＮＡは、センス鎖−ＲＩＳＣ複合体によって媒介される望ましくない非特異的遺伝子サイレンシングを完全に無効することを実証する。
要約すると、本発明者らは、ａｉＲＮＡが新規なクラスの遺伝子サイレンシングインデューサーであること、ＲＩＳＣ基質およびＲＮＡｉメディエーターの非ｓｉＲＮＡ型および最小構造足場を示した（図１５ｆ）。本発明者らのデータは、ａｉＲＮＡがＲＩＳＣ、細胞のＲＮＡｉ機構中で働くことを示唆する。ＲＩＳＣ中への組込み後、ａｉＲＮＡはａｉＲＮＡアンチセンス鎖の５’末端に対して塩基１０と塩基１１の間のｍＲＮＡの配列特異的切断を媒介する。非対称構造のａｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡより効率良くＲＩＳＣと相互作用することができる。高いＲＩＳＣ結合効率と一致して、ａｉＲＮＡは、本発明者らの実験中で試験した遺伝子に対する遺伝子特異的サイレンシングを媒介する際にｓｉＲＮＡより強力、有効、発生が迅速、および持続的である。以前の実験は有効なＲＩＳＣ形成を容易にする際のＤｉｃｅｒの役割を示しているが、本発明者らのデータは、ａｉＲＮＡはＤｉｃｅｒ媒介プロセシングとは無関係に高い効率で活性ＲＩＳＣ複合体を生成することができることを示唆する。
この新規なＲＮＡ二重鎖足場の重要な特徴は、３’および５’末端のアンチセンス突出である。１２〜１５ｂｐのａｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘導することが知られている最も短いＲＮＡ二重鎖である。長いｄｓＲＮＡはＣ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて強力な遺伝子サイレンシングを誘発したが、哺乳動物細胞における遺伝子特異的サイレンシングは、ｓｉＲＮＡ二重鎖を使用するまで可能ではなかった。Ｄｉｃｅｒ消化によって画定するｓｉＲＮＡ足場は、１９〜２１ｂｐの鎖の長さ部分および３’突出中の対称性によって特徴付けられ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１年）、これはＲＮＡｉを媒介するためのＲＩＳＣ中への組込みに必要な構造であると考えられている。したがって、ＲＮＡｉインデューサーの最適化努力は、ｓｉＲＮＡより常に大きいｓｉＲＮＡ前駆体に焦点を当てている（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、２００４年；ＺｈａｎｇおよびＦａｒｗｅｌｌ、２００７年）。本発明者らのデータは、ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを媒介するためのＲＩＳＣ中への組込みに必要な足場ではないことを示唆する。異なる長さのａｉＲＮＡは一連の遺伝子サイレンシング効力およびＲＩＳＣ組込み効率を示し、ＲＩＳＣの組込みおよび活性化のメカニズムを理解するまたとない機会を与える。ＲＩＳＣの組込みおよびＲＮＡｉの誘導におけるａｉＲＮＡの構造−活性関係をさらに理解するために研究が必要とされ、これは標的配列の選択、長さ、構造、化学組成、および様々なＲＮＡｉ用途の変更に関してａｉＲＮＡを最適化するための合理的根拠を確立するのを手助けするはずである。
（実施例５．）
ａｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏにおいてｓｉＲＮＡより有効である
ａｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効であるかどうか調べるため、およびそれをｓｉＲＮＡと比較するため、本発明者らは、ヒト結腸癌異種移植モデルにおけるａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの影響を試験した。
ヒト結腸癌は、米国では癌による死亡原因の第２位である。Ｗｎｔβ−カテニンシグナル伝達経路は厳重に制御されており、発生、組織の恒常性、および再生において重要な機能を有する。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の規制解除は様々なヒトの癌において頻繁に見られる。８０パーセントの結腸直腸癌のみが、腫瘍抑制遺伝子大腸腺腫性ポリポーシスの不活性化、またはプロト発癌遺伝子β−カテニンの突然変異のいずれかによって、この経路の活性化を明らかにする。
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、異なる組織の癌の発症と進行の両方に重要であることが分かっている。したがって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の標的化阻害は、様々な起源の癌の治療用の合理的で有望な新しい手法である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明者らは、リボザイム標的化によって、ヒト結腸癌ＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニン発現の低減および関連する細胞死の誘導を実証しており、β−カテニン発現はｉｎ ｖｉｔｒｏでは腫瘍増殖に対して律速的であることを示す。
ＳＷ４８０ヒト結腸癌細胞をメスの無胸腺ヌードマウスに皮下接種し（８×１０６個の細胞／マウス）、放置して触診可能な腫瘍を形成した。この試験では、腫瘍が約１２０ｍｍ３に達したときに投薬を開始した。動物は、毎日０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合化β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合化β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合化無関連ｓｉＲＮＡで静脈内（ｉｖ）治療した。動物にはｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照を合計１０用量投与した。腫瘍は治療全体で測定した。図１６中に示すように、０．６ｎｍｏｌ ｍｇ／ｋｇでの単剤治療としてｓｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡを用いた静脈内治療は、腫瘍増殖を有意に阻害した。ｓｉＲＮＡのＴ／Ｃ％値は、０．０２８６のｐ値で４８．８％であると計算した。しかしながら、β−カテニン特異的ａｉＲＮＡを用いた治療は、腫瘍増殖のはるかに一層大幅な低減をもたらした。Ｔ／Ｃ％値は、０．００２４のｐ値で９．９％であると計算した。ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照の静脈内投与が原因の体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、β−カテニンの標的化によるＰＥＩ複合体形成を介したａｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ全身施用は、結腸癌を有する患者の治療用途の、非常に有効、特異的および安全な作用物質を開発するための手段を与えることを示唆する。
さらに、本発明者らは、ＨＴ２９ヒト結腸癌異種移植モデルにおけるａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの影響も試験した。ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞をメスの無胸腺ヌードマウスに皮下接種し（６×１０６個の細胞／マウス）、放置して触診可能な腫瘍を形成した。この試験では、腫瘍が約２００ｍｍ３に達したときに投薬を開始した。動物は、１日おきに０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合化β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合化β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合化無関連ｓｉＲＮＡで静脈内（ｉｖ）治療した。動物にはｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照を合計８用量投与した。腫瘍は治療全体で測定した。図１７中に示すように、０．６ｎｍｏｌｍｇ／ｋｇでの単剤治療としてｓｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡを用いた静脈内治療は、腫瘍増殖を有意に阻害した。ｓｉＲＮＡのＴ／Ｃ％値は、０．２１のｐ値で７８％であると計算した。ここでも、β−カテニン特異的ａｉＲＮＡを用いた治療は、腫瘍増殖のはるかに一層大幅な低減をもたらした。Ｔ／Ｃ％値は、０．０１６のｐ値で４１％であると計算した。ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照の静脈内投与が原因の体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、β−カテニンの標的化によるＰＥＩ複合体形成を介したａｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ全身施用は、結腸癌を有する患者の治療用途の、非常に有効、特異的および安全な作用物質を開発するための手段を与えることを支持する。
まとめると、ａｉＲＮＡは広範囲のＲＮＡｉ用途を有意に改善することができる。ｓｉＲＮＡベースの治療は、限られた効力、送達の難点、インターフェロン様応答および製造コストを含めた課題に対応している（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、２００７年；Ｉｏｒｎｓら、２００７年；Ｒａｎａ、２００７年）。改善された効力、効能、持続性、および小さなサイズのａｉＲＮＡはこれらの課題を手助けまたは克服することができる。ａｉＲＮＡはより小さく、その送達により少ない物質を必要とし得るからである。したがってａｉＲＮＡは、遺伝子機能試験およびＲＮＡｉベースの治療における広範囲のＲＮＡｉ用途に関する相当な可能性を有する、哺乳動物細胞においてｓｉＲＮＡより良い効力、効能、作用発現、および持続性の、ＲＩＳＣに進入し遺伝子サイレンシングを媒介する新しい小さなＲＮＡ二重鎖となる。
（実施例６．）
ａｉＲＮＡは模倣剤ｍｉＲＮＡとして機能する
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｓｉＲＮＡとある程度の類似性を有する遺伝子発現の他のレギュレーターである。しかしながら、ｍｉＲＮＡは主に、ｓｉＲＮＡ媒介標的切断と異なる（１つまたは複数の）メカニズムによって遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡによるサイレンシングは、翻訳阻害および／または標的ＲＮＡの分解をもたらす標的ＲＮＡの３’ 非翻訳領域（ＵＴＲ）とｍｉＲＮＡの相互作用によって起こる。ｓｉＲＮＡの１つの標的特異性と異なり、１つのｍｉＲＮＡは複数の標的の発現を制御することができる。
ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）として機能するその能力に関して、ａｉＲＮＡ構造を試験した。具体的には、この実施例中では、いずれもより長い鎖上に存在する３ｎｔ ３’突出および３ｎｔ ５’突出と隣接する１５ｎｔの二本鎖領域を形成する２１ｎｔのより長い鎖および１５ｎｔのより短い鎖を有する、ａｉＲＮＡ（Ｌｅｔ−７ａ ａｉＲＮＡ）を構築した。Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡの模倣剤としてａｉＲＮＡを構築した。図１８Ａ中に示すように、全ａｉＲＮＡ構築物（囲み領域）は、Ｌｅｔ−７ａのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−Ｌｅｔ−７ａ）のステムループ構造の一部分に直接由来し、二次構造、内因性ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構造中の２ｂｐのミスマッチから生じた突出部分を維持する。囲み領域は、ａｉＲＮＡのより長い鎖がＬｅｔ−７ａの成熟ガイドｍｉＲＮＡの大部分を含有するように選択し、その配列はｐｒｅ−Ｌｅｔ−７ａ構造中に下線を引く。
Ｌｅｔ−７ａ ａｉＲＮＡと同じＬｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ配列（下線）の部分を含む、陽性対照Ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡオリゴ、対称的鎖長（２３ｎｔ）の二本鎖ＲＮＡ分子の配列構造も、図１８Ａ中に示す。ＨｅｌａおよびＤｌｄ１細胞は、２４時間１００ｎＭでｍｉＲＮＡ二重鎖またはａｉＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトし、そのときＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを実施してｋ−Ｒａｓ ｍＲＮＡ、Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡの既知のサイレンシング標的のレベルを検出した。図１８Ｂ中に示すように、（ａｉＬｅｔ７として示す）ａｉＲＮＡ二重鎖と（ｍｉＬｅｔ７として示す）ｍｉＲＮＡ二重鎖の両方が、両方の細胞系においてｋ−Ｒａｓ ｍＲＮＡの低下をもたらした。これらのデータは、ａｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ経路において模倣剤として機能して、遺伝子発現を変えることができることを示唆する。
次に本発明者らは、ｍｉＲＮＡ模倣剤ａｉＲＮＡが、既知のｍｉＲＮＡ標的のタンパク質レベルを変えることができるかどうか決定した。ｋ−Ｒａｓ遺伝子は、Ｌｅｔ７ ｍｉＲＮＡファミリーのメンバーによって制御され得る。したがって本発明者らは、ｍｉＲＮＡ模倣剤ａｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後に、ｋ−ＲａｓｍＲＮＡおよび／またはタンパク質が調節されたかどうか決定した。ｋ−ＲａｓのｍＲＮＡのレベルはＲＴ−ＰＣＲによって決定し、かつｋ−Ｒａｓのタンパク質のレベルはウエスタンブロット分析によって決定した（図１９）。ｋ−ＲａｓのｍＲＮＡのレベルはＬｅｔ７模倣剤ａｉＲＮＡによって下方制御され（図２０Ａ）、かつタンパク質のレベルもＬｅｔ７模倣剤ａｉＲＮＡによって下方制御された（図２０Ｂ）。
（実施例７．）
ａｉＲＮＡはｍｉＲＮＡ阻害剤として機能する
ａｉＲＮＡ構造を使用してｍｉＲＮＡの阻害剤を作製することができることができるかどうか調べるため、本発明者らは、ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１５５に対するａｉＲＮＡを設計した。それらの配列は図１９Ａ中に示す。完全長の成熟ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１５５は図１９Ｂ中に示す。ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析を実施して、ｋ−Ｒａｓ、Ｌｅｔ−７ｃの標的の１つの発現に対するａｉＲＮＡ−Ｌｅｔ７ｃ阻害剤の影響を分析した。図２０Ａ中に示すように、ｋ−ＲａｓのｍＲＮＡのレベルはａｉＲＮＡ−Ｌｅｔ７ｃ模倣剤によって下方制御され、ａｉＲＮＡ−Ｌｅｔ７ｃ阻害剤によって上方制御された。図２０Ｂ中に示すように、同様の結果をタンパク質のレベルで観察した。
ａｉＲＮＡ−Ｌｅｔ７ｃ阻害剤で処理したＨｅｌａ細胞中のＬｅｔ−７ｃ（図２１Ａ）、ａｉＲＮＡ−ｍｉＲ２１阻害剤で処理したＭＣＦ−７細胞中のｍｉＲ−２１（図２１Ｂ）、またはａｉＲＮＡ−ｍｉＲ−１５５阻害剤で処理したＦａＤｕ細胞中のｍｉＲ−１５５（図２１Ｃ）の相対的レベルも、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図２１中に示すように、これらのａｉＲＮＡはその特異的標的−内因性の対応するｍｉＲＮＡを強く阻害することができる。ここで留意すべきは、ＭＣＦ７細胞が比較的高レベルのｍｉＲ−２１を含有すること（図２２Ａ）、およびＦａＤｕ細胞が比較的高レベルのｍｉＲ−１５５を含有すること（図２２Ｂ）である。したがってこれらの細胞系を使用して、ａｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ阻害剤のトランスフェクションが、それぞれＭＣＦ７およびＦａＤｕ細胞中のｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−１５５のレベルを低減することができたかどうか試験した。
次に本発明者らは、ａｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ阻害剤と市販のｍｉＲＮＡ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）の効力を比較した。１００ｎＭのａｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ阻害剤またはＡｍｂｉｏｎ阻害剤のいずれかのトランスフェクションは、トランスフェクション後２４時間でＬｅｔ−７ｃ（図２３）、７２時間でｍｉＲ−２１（図２４）、および７２時間でｍｉＲ−１５５（図２５）のレベルの低下をもたらした。全ての場合において、ａｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡは同等または増強した効力を示した。
次に本発明者らは、ａｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ阻害剤とＡｍｂｉｏｎからの市販の阻害剤の効能を比較した。細胞は、２４時間１、１０、および１００ｎＭにおいて、Ｌｅｔ−７ｃ（図２６）、ｍｉＲ−２１（図２７）、またはｍｉＲ−１５５（図２８）を標的化するａｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトした。次いで定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を実施して、非標的対照ａｉＲＮＡトランスフェクト細胞に対する、残存するｍｉＲＮＡのレベルを決定した。ａｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡは、１０および１００ｎＭの用量において市販の阻害剤と類似した効能を示した。１ｎＭの用量において、ａｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２１の場合は増強した効能、ｍｉＲ−１５５の場合は類似した効能、またはＬｅｔ−７ｃの場合は低減した効能を示した。
まとめるとこれらのデータは、ａｉＲＮＡ構造は、ａｎｔａｇｏｍｉｒと比較して遺伝子サイレンシングの効力および／または期間の亢進を示し得る内因性ｍｉＲＮＡの阻害剤として、かつｍｉＲＮＡ機能の模倣剤としても機能することができ、内因性ｍｉＲＮＡの標的遺伝子発現の抑制を引き起こすことができることを実証する。
本明細書に挙げる全ての参照文献は、それぞれ個々の刊行物または特許または特許出願が、あらゆる目的でそれらの全容が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別の示される場合と同程度に、それらの全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に組み込む。参照によって組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書中に含まれる本開示と相反する程度で、本明細書は任意のこのような相反する構成要素に優先するおよび／またはそれに勝るものとする。
本明細書および特許請求の範囲中で使用する、成分の量、反応条件、分析結果などを表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解されたい。したがって、反対のことを示さない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲中に示す数値パラメーターは、本発明によって得ようと努める望ましい性質に応じて変わり得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲の均等物の原則の適用を制限するための試みとしてではなく、それぞれの数値パラメーターは、有効桁数および通常の丸め法を考慮して解釈すべきである。
本発明の変更および変形は、当業者には明らかであるように、その精神および範囲から逸脱せずに作製することができる。本明細書に記載する具体的な実施形態は単なる例によって与え、決して限定的であることを意味するものではない。本明細書および実施例は単なる例示的なものとして考えられ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。

Claims (146)

  1. マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の模倣剤であって、
    第１の長さの第１鎖と第２のより短い長さの第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が前記ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同じ配列を有し、前記第１鎖および第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、１〜１０ヌクレオチドの末端突出をさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、
    少なくとも１つの遺伝子の発現の調節において前記ｍｉＲＮＡを模倣するように適合される模倣剤。
  2. 前記ｍｉＲＮＡがガイド鎖である、請求項１に記載の模倣剤。
  3. 前記ｍｉＲＮＡが成熟ｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の模倣剤。
  4. 前記ｍｉＲＮＡが成熟ｍｉＲＮＡおよび実質的に相補的なパッセンジャー鎖を含む内因性ｍｉＲＮＡ二重鎖であり、前記模倣剤の前記第２鎖が前記パッセンジャー鎖の少なくとも一部と実質的に同じ配列を有する、請求項１に記載の模倣剤。
  5. 前記第１鎖と前記第２鎖との間において、配列がミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の模倣剤。
  6. 前記ミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドによりループが形成される、請求項５に記載の模倣剤。
  7. 前記第１鎖および前記第２鎖が、前記二本鎖領域において互いに完全に相補的である、請求項１に記載の模倣剤。
  8. 前記末端突出が１〜８ヌクレオチドである、請求項１に記載の模倣剤。
  9. 前記末端突出が１〜３ヌクレオチドである、請求項１に記載の模倣剤。
  10. 前記末端突出が３’突出である、請求項１に記載の模倣剤。
  11. 前記３’突出が前記第１鎖上にある、請求項１０に記載の模倣剤。
  12. 前記末端突出が５’突出である、請求項１に記載の模倣剤。
  13. 前記５’突出が前記第１鎖上にある、請求項１２に記載の模倣剤。
  14. 前記第１鎖上において、３’突出および５’突出の両方をさらに含む、請求項１に記載の模倣剤。
  15. 前記３’突出および５’突出の両方が１〜３ヌクレオチドである、請求項１４に記載の模倣剤。
  16. 一方の末端上に１つの末端突出を、他方の末端上に平滑末端をさらに含む、請求項１に記載の模倣剤。
  17. 前記第１鎖が１３〜１００ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の模倣剤。
  18. 前記第１鎖が１５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜２９ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の模倣剤。
  19. 前記第１鎖が１５〜２８ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜２６ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の模倣剤。
  20. 前記第１鎖が１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜２４ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の模倣剤。
  21. 前記第１鎖が１９〜２３ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１４〜２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の模倣剤。
  22. 前記第１鎖が、前記第２鎖よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０ヌクレオチドからなる群から選択される長さだけ長い、請求項１に記載の模倣剤。
  23. 前記末端突出が分解に対して安定化される、請求項１に記載の模倣剤。
  24. 前記第１鎖および前記第２鎖の少なくとも１つにおいてニックをさらに含む、請求項１に記載の模倣剤。
  25. 前記二本鎖領域が、１つまたは複数の対合されないヌクレオチドのギャップを含む、請求項１に記載の模倣剤。
  26. 修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項１に記載の模倣剤。
  27. 前記修飾ヌクレオチドまたは類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである、請求項２６に記載の模倣剤。
  28. 前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、請求項２７に記載の模倣剤。
  29. 前記ホスホジエステル結合が、少なくとも１つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、請求項２７に記載の模倣剤。
  30. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは類似体が、非天然塩基または修飾塩基である、請求項２７に記載の模倣剤。
  31. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基である、請求項２７に記載の模倣剤。
  32. 前記ヌクレオチド類似体が、２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、およびＣＮからなる群から選択される基により置換され、各ＲがＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から独立に選択され、ハロがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される糖修飾リボヌクレオチドである、請求項２６に記載の模倣剤。
  33. 前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、請求項２６に記載の模倣剤。
  34. デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の模倣剤。
  35. 前記デオキシヌクレオチドが、３’突出、５’突出、および二本鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域内にある、請求項３４に記載の模倣剤。
  36. 前記第１鎖が、前記ｍｉＲＮＡの少なくとも前記一部と少なくとも６０パーセント同じ配列を有する、請求項１に記載の模倣剤。
  37. 前記第１鎖が、前記ｍｉＲＮＡと同じシード領域を有する、請求項１に記載の模倣剤。
  38. 前記二本鎖領域のＧＣ含量が約２０〜６０％である、請求項１に記載の模倣剤。
  39. 前記第１鎖が、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを有する５’突出を含む、請求項１に記載の模倣剤。
  40. ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とさらにコンジュゲートしている、請求項１に記載の模倣剤。
  41. 前記二本鎖ＲＮＡ分子が、合成であるかまたは単離される、請求項１に記載の模倣剤。
  42. 前記二本鎖ＲＮＡ分子が、組換えベクターまたはその後代から転写される、請求項１に記載の模倣剤。
  43. 前記少なくとも１つの遺伝子の発現を、少なくとも２０％調節するように適合される、請求項１に記載の模倣剤。
  44. 前記ｍｉＲＮＡがＬｅｔ７ファミリーである、請求項１に記載の模倣剤。
  45. 以下の二重鎖配列：
    の１つを含む、請求項１に記載の模倣剤。
  46. 成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の模倣剤であって、
    １５〜２８ヌクレオチドの第１鎖と１２〜２６ヌクレオチドのより短い第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が前記成熟ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同じ配列を有し、前記第１鎖および前記第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、前記第１鎖が１〜８ヌクレオチドの３’突出と１〜８ヌクレオチドの５’突出とをさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、
    少なくとも１つの遺伝子の発現の調節において前記成熟ｍｉＲＮＡを模倣するように適合される模倣剤。
  47. 前記第２鎖が、前記成熟ｍｉＲＮＡと内因性二重鎖を形成するパッセンジャーＲＮＡ鎖の少なくとも一部と実質的に同じ配列を有する、請求項４６に記載の模倣剤。
  48. 前記第１鎖と前記第２鎖との間において、配列がミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む、請求項４６に記載の模倣剤。
  49. 前記ミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドによりループが形成される、請求項４８に記載の模倣剤。
  50. デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項４６に記載の模倣剤。
  51. 前記３’突出および前記５’突出の少なくとも１つが分解に対して安定化される、請求項４６に記載の模倣剤。
  52. 前記第１鎖および前記第２鎖の少なくとも１つにおいてニックをさらに含む、請求項４６に記載の模倣剤。
  53. 前記二本鎖領域が、１つまたは複数の対合されないヌクレオチドのギャップを含む、請求項４６に記載の模倣剤。
  54. 修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項４６に記載の模倣剤。
  55. マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の阻害剤であって、
    第１の長さの第１鎖と第２のより短い長さの第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が標的ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な配列を有し、前記第１鎖および前記第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、１〜１０ヌクレオチドの末端突出をさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、
    前記標的ｍｉＲＮＡを阻害するように適合される阻害剤。
  56. 前記標的ｍｉＲＮＡがガイド鎖である、請求項５５に記載の阻害剤。
  57. 前記標的ｍｉＲＮＡが成熟ｍｉＲＮＡである、請求項５５に記載の阻害剤。
  58. 前記第１鎖と前記第２鎖との間において、配列がミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む、請求項５５に記載の模倣剤。
  59. 前記ミスマッチするかまたはマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドによりループが形成される、請求項５８に記載の模倣剤。
  60. 前記第１鎖および前記第２鎖が、前記二本鎖領域において互いに完全に相補的である、請求項５５に記載の阻害剤。
  61. 前記末端突出が１〜８ヌクレオチドである、請求項５５に記載の阻害剤。
  62. 前記末端突出が１〜３ヌクレオチドである、請求項５５に記載の阻害剤。
  63. 前記末端突出が３’突出である、請求項５５に記載の阻害剤。
  64. 前記３’突出が前記第１鎖上にある、請求項６３に記載の阻害剤。
  65. 前記末端突出が５’突出である、請求項５５に記載の阻害剤。
  66. 前記５’突出が前記第１鎖上にある、請求項６５に記載の阻害剤。
  67. 前記第１鎖上において、３’突出および５’突出の両方をさらに含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  68. 前記３’突出および前記５’突出の両方が１〜３ヌクレオチドである、請求項６７に記載の阻害剤。
  69. 一方の末端上に１つの末端突出を、他方の末端上に平滑末端をさらに含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  70. 前記第１鎖が１０〜１００ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５５に記載の阻害剤。
  71. 前記第１鎖が１５〜６０ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が５〜２８ヌクレオチドの長さを有する、請求項５５に記載の阻害剤。
  72. 前記第１鎖が１５〜２８ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜２６ヌクレオチドの長さを有する、請求項５５に記載の阻害剤。
  73. 前記第１鎖が１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５５に記載の阻害剤。
  74. 前記第１鎖が、前記第２鎖よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０ヌクレオチドからなる群から選択される長さだけ長い、請求項５５に記載の阻害剤。
  75. 前記末端突出が分解に対して安定化される、請求項５５に記載の阻害剤。
  76. 前記第１鎖および前記第２鎖の少なくとも１つにおいてニックをさらに含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  77. 前記二本鎖領域が、１つまたは複数の対合されないヌクレオチドのギャップを含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  78. 修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  79. 前記修飾ヌクレオチドまたは類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである、請求項７８に記載の阻害剤。
  80. 前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、請求項７９に記載の阻害剤。
  81. 前記ホスホジエステル結合が、少なくとも１つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、請求項７９に記載の阻害剤。
  82. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは類似体が、非天然塩基または修飾塩基である、請求項７９に記載の阻害剤。
  83. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基である、請求項７９に記載の阻害剤。
  84. 前記ヌクレオチド類似体が、２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、およびＣＮからなる群から選択される基により置換され、各ＲがＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から独立に選択され、ハロがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される糖修飾リボヌクレオチドである、請求項７８に記載の阻害剤。
  85. 前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、請求項７８に記載の阻害剤。
  86. デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  87. 前記デオキシヌクレオチドが、３’突出、５’突出、および二本鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域内にある、請求項８６に記載の阻害剤。
  88. 前記第１鎖が、前記標的ｍｉＲＮＡの少なくとも前記一部と少なくとも６０パーセント相補的な配列を有する、請求項５５に記載の阻害剤。
  89. 前記二本鎖領域のＧＣ含量が約２０〜６０％である、請求項５５に記載の阻害剤。
  90. 前記第１鎖が、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを有する５’突出を含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  91. ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、およびアプタマーからなる群から選択される実体とさらにコンジュゲートしている、請求項５５に記載の阻害剤。
  92. 前記二本鎖ＲＮＡ分子が、合成であるかまたは単離される、請求項５５に記載の阻害剤。
  93. 前記二本鎖ＲＮＡ分子が、組換えベクターまたはその後代から転写される、請求項５５に記載の阻害剤。
  94. 前記標的ｍｉＲＮＡが、Ｌｅｔ７、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−１５５からなる群から選択される、請求項５５に記載の阻害剤。
  95. 以下の二重鎖配列：
    の１つを含む、請求項５５に記載の阻害剤。
  96. 成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の阻害剤であって、
    １５〜２８ヌクレオチドの第１鎖と１２〜２６ヌクレオチドのより短い第２鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第１鎖が前記成熟ｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な配列を有し、前記第１鎖および前記第２鎖が少なくとも１つの二本鎖領域を形成するように互いに実質的に相補的であり、前記第１鎖が１〜８ヌクレオチドの３’突出と１〜８ヌクレオチドの５’突出とをさらに含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、
    前記標的ｍｉＲＮＡを阻害するように適合される阻害剤。
  97. 成熟ｍｉＲＮＡの量を少なくとも３０％低下させることが可能である、請求項９６に記載の阻害剤。
  98. 前記標的ｍｉＲＮＡが、Ｌｅｔ７、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−１５５からなる群から選択される、請求項５５に記載の阻害剤。
  99. 請求項１、４６、５５、または９６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも第１鎖をコードするＤＮＡ配列であって、プロモーターに作動可能に連結したＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
  100. 請求項１、４６、５５、または９６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも第２鎖をコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２のプロモーターに作動可能に連結した第２のＤＮＡ配列をさらに含む、請求項９９に記載の発現ベクター。
  101. ウイルス、真核生物、および細菌の発現ベクターからなる群から選択される、請求項９９に記載の発現ベクター。
  102. 請求項９９に記載の発現ベクターを含む細胞。
  103. 請求項１、４６、５５、または９６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子を含む細胞。
  104. マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の模倣剤を作製する方法であって、
    ｍｉＲＮＡ配列を選択するステップと、
    前記ｍｉＲＮＡ内の連続するヌクレオチドの少なくとも一部と実質的に同じ領域を有する第１のＲＮＡ鎖を合成するステップと、
    第２のより短いＲＮＡ鎖を合成するステップと、
    前記ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの遺伝子の発現の調節において前記ｍｉＲＮＡを模倣することが可能となるように、少なくとも１つの末端突出を有する二本鎖ＲＮＡ分子を形成するのに適する条件下で、前記合成された鎖を組み合わせるステップと
    を含む方法。
  105. 前記少なくとも１つの末端突出を分解に対して化学修飾するステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記二本鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを導入するステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  107. 前記二本鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を導入するステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  108. 合成するステップの間、合成するステップの後から組み合わせるステップの前、または組み合わせるステップの後において、前記二重鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１種の修飾ヌクレオチドまたは類似体を導入するステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  109. 前記二本鎖領域内に、少なくとも１つのミスマッチ、ニック、またはギャップを導入するステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  110. 前記第１鎖および前記第２鎖の少なくとも１つを、ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とコンジュゲートさせるステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  111. 少なくとも１つの前記ＲＮＡ鎖が酵素的または生物学的に合成される、請求項１０４に記載の方法。
  112. 前記第１鎖および前記第２鎖が、別々にまたは同時に合成される、請求項１０４に記載の方法。
  113. 前記鎖の１つにおける少なくとも１つの塩基を修飾するステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  114. 標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の阻害剤を作製する方法であって、
    標的ｍｉＲＮＡ配列を選択するステップと、
    前記標的ｍＲＮＡ内の連続するヌクレオチドの少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有する第１のＲＮＡ鎖を合成するステップと、
    第２のより短いＲＮＡ鎖を合成するステップと、
    前記ＲＮＡ分子が、前記標的ｍｉＲＮＡを阻害することが可能となるように、少なくとも１つの末端突出を有する二本鎖ＲＮＡ分子を形成するのに適する条件下で、前記合成された鎖を混合するステップと
    を含む方法。
  115. 前記少なくとも１つの末端突出を分解に対して化学修飾するステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記二本鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを導入するステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
  117. 前記二本鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を導入するステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
  118. 前記二本鎖領域内に、少なくとも１つのミスマッチ、ニック、またはギャップを導入するステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
  119. 前記第１鎖および前記第２鎖の少なくとも１つを、ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とコンジュゲートさせるステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
  120. 少なくとも１つの前記ＲＮＡ鎖が酵素的または生物学的に合成される、請求項１１４に記載の方法。
  121. 前記第１鎖および前記第２鎖が、別々にまたは同時に合成される、請求項１１４に記載の方法。
  122. 前記鎖の１つにおける少なくとも１つの塩基を修飾するステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
  123. 細胞または生物におけるｍｉＲＮＡ経路を調節する方法であって、
    前記細胞または前記生物を、前記ｍｉＲＮＡの前記模倣を行うことができる条件下で、請求項１または４６に記載の模倣剤と接触させるステップと、
    前記模倣剤を用いて少なくとも１つの遺伝子の発現を調節し、これにより、内因性ｍｉＲＮＡ経路を調節するステップと
    を含む方法。
  124. 前記模倣剤における前記二本鎖ＲＮＡ分子内の前記第１鎖が、そのもののＲＩＳＣとの相互作用において、前記内因性ｍｉＲＮＡを模倣する、請求項１２３に記載の方法。
  125. 細胞内におけるｍｉＲＮＡ経路を調節する方法であって、
    前記細胞または生物を、前記標的ｍｉＲＮＡの前記阻害を行うことができる条件下で、請求項５５または９６に記載の阻害剤と接触させるステップと、
    前記阻害剤とともに使われる標的ｍｉＲＮＡの量を低下させ、これにより、内因性ｍｉＲＮＡ経路を調節するステップと
    を含む方法。
  126. 前記接触させるステップが、遺伝子発現の調節を行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記模倣剤または前記阻害剤をそれぞれ導入するステップを含む、請求項１２３または１２５に記載の方法。
  127. 前記導入するステップが、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所（ｔｏｐｉｃ）投与、および局所投与からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記導入するステップが、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む、請求項１２６に記載の方法。
  129. 細胞または生物における遺伝子の機能または有用性を決定するための、請求項１２３または１２５に記載の方法の使用。
  130. 細胞または生物における少なくとも１つの遺伝子の発現を調節するための、請求項１２３または１２５に記載の方法の使用。
  131. 前記遺伝子が、疾患、病理学的状態、または望ましくない状態と関連する、請求項１３０に記載の使用。
  132. 前記遺伝子が、ヒトまたは動物の疾患と関連する、請求項１３０に記載の使用。
  133. 前記遺伝子が病原性微生物の遺伝子である、請求項１３２に記載の使用。
  134. 前記遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項１３２に記載の使用。
  135. 前記遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、請求項１３２に記載の使用。
  136. 前記遺伝子が、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する、請求項１３２に記載の使用。
  137. ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける薬剤標的を研究するための、請求項１２３または１２５に記載の方法の使用。
  138. 疾患または望ましくない状態を治療または予防するための、請求項１２３または１２５に記載の方法の使用。
  139. 活性作用物質としての、請求項１、４６、５５、または９６に記載の少なくとも１種の模倣剤または阻害剤と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物。
  140. 前記担体が、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、請求項１３９に記載の医薬組成物。
  141. 有効量の請求項１３９に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む治療法。
  142. 前記医薬組成物が、静脈内（ｉｖ）経路、皮下（ｓｃ）経路、局所経路、経口経路、吸入経路、筋肉内経路、腹腔内（ｉｐ）経路、および領域経路からなる群から選択される経路を介して投与される、請求項１４１に記載の方法。
  143. 癌を治療するのに用いられる、請求項１４１に記載の方法。
  144. 請求項１、４６に記載の模倣剤または請求項５５、もしくは９６に記載の阻害剤を含む、研究用試薬。
  145. 請求項１４４に記載の研究用試薬を含むキット。
  146. 疾患または状態について患者を診断する方法であって、
    前記患者の細胞を請求項１、４６に記載の模倣剤または請求項５５、もしくは９６に記載の阻害剤と接触させるステップと、
    前記疾患または前記状態を示す少なくとも１つの変化を探索するステップと
    を含む方法。
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