CN101835789B - 不对称干扰rna的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够实现序列特异性基因沉默的不对称双链体RNA分子。该RNA分子包括第一链和第二链。第一链长于第二链。该RNA分子包括由第一链和第二链形成的双链区、以及独立地选自5′-突出端、3′-突出端和平头末端的两个末端。本发明的RNA分子可以用作研究工具和/或治疗剂。

Description

不对称干扰RNA的组合物及其用途

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年8月27日提交的美国临时专利申请序列NO.60/968,257、于2008年2月19日提交的美国临时专利申请序列NO.61/029,753、和于2008年3月24日提交的美国临时专利申请序列NO.61/038,954的优先权和利益，这些临时专利申请的完整内容引入本文作为参考。

发明背景

通过使用小或短干扰RNA(siRNA)经由RNAi(RNA干扰)实现基因沉默，已显现为是有力的分子生物学工具，并且具有用于治疗应用的潜力(deFougerolles等人，2007；Kim和Rossi，2007)。

理论上RNAi可以用于特异地有效地敲低(knockdown)或沉默任何疾病基因。对于治疗目的而言RNAi的可能应用范围是广泛的，包括遗传性、外遗传性和传染性疾病，条件是致病基因得到鉴定。

然而，除突出的递送问题外，基于RNAi药物的开发还面临着如下问题：siRNA的有限功效、siRNA的非特异性作用例如干扰素样应答和有义链介导的脱靶基因沉默、以及与siRNA合成相关的高得惊人的或高昂的成本。siRNA的基因沉默功效，对于哺乳动物细胞中的大多数基因，局限在50％或更低。这些分子的制造是昂贵的(比制造反义脱氧核苷酸昂贵得多)、低效的，并且需要化学修饰。最后，观察到合成siRNAs的细胞外施用可能触发干扰素样应答，这为基于RNAi的研究和基于RNAi的治疗开发增加了显著的障碍。

RNAi可以通过合成的短干扰RNA(siRNAs)、或编码随后可以被核糖核酸酶III样酶Dicer切割成siRNA的短发夹RNAs(shRNAs)的遗传元件触发。基因沉默的生化机制仍未完全了解，看起来涉及多蛋白的RNA诱 导沉默复合物(RISC)。RISC结合、展开且并入反义siRNA链，随后其识别并靶向完全互补的mRNA进行切割，从而减少基因表达。有效的基因沉默(1-10天)可归因于RISC复合物的催化性质。RNAi的力量源于能够达到的精致特异性。然而，已知会发生脱靶RNAi效应。另一主要副作用是由siRNA激活的干扰素样应答，其由dsRNA依赖性蛋白质激酶(PKR)和Toll样受体(TLR)介导。siRNA诱导干扰素样应答的能力主要由其长度决定。(同上)。

对于哺乳动物细胞中的基因沉默，现有技术教导siRNA的结构可以是19-21个核苷酸长度和在2个末端上具有3′突出端的对称双链RNA，以在哺乳动物细胞中有效，并且避免细胞先天“抗病毒”应答。(同上)。目前本领域已经充分确立，这种“最佳”结构仍会触发干扰素应答，对基于RNAi的研究和基于RNAi的治疗开发构成显著障碍(Sledz等人，2003)。

需要通过新设计siRNAs开发在哺乳动物细胞中实现有效RNAi的新方法，所述siRNAs具有更佳功效和效力、作用启动快速、更佳持久和具有更短长度的RNA双链体，以避免非特异性干扰素样应答和减少用于RNAi治疗剂的研究和药物开发的合成成本。

本文引用的参考文献不应视为承认是请求保护的本发明的现有技术。

发明概述

本发明涉及新类型的小双链体RNA的令人惊讶的发现，此新类型的小双链体RNA可以在哺乳动物细胞中诱导有效的基因沉默，其在本文中称为不对称干扰RNA(aiRNA)。这种新类型的RNAi诱导物的标志是2条RNA链的长度不对称。此种新的结构设计不仅在实现基因沉默方面是功能上有效的，而且提供了优于现有技术siRNAs的几个优点。在这些优点中，aiRNA可以具有比现有siRNA长度短得多的RNA双链体结构，这将减少合成成本且消除/减少长度依赖性的非特异性干扰素样应答的触发。此外，aiRNA结构的不对称还消除/减少有义链介导的脱靶效应。此外，aiRNA在诱导基因沉默方面比siRNA更有效、有力、快速开始和持久。aiRNA可以用于目前siRNA或shRNA正在应用或考虑应用的所有领域，包括生 物学研究、生物技术和医药工业中的R&D研究、和基于RNAi的治疗。

本发明提供双链体RNA分子。该双链体RNA分子包括具有18-23个核苷酸长度的第一链和具有12-17个核苷酸长度的第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与第一链形成双链区，其中第一链具有1-9个核苷酸的3′-突出端、和0-8个核苷酸的5′-突出端，其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默。在一个实施方案中，第一链包含与靶mRNA序列基本上互补的序列。在再一实施方案中，第一链包含与靶mRNA序列至少70％互补的序列。在另一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。

在一个实施方案中，5′突出端的序列的至少一个核苷酸选自A、U和dT。

在一个实施方案中，双链区的GC含量是20％-70％。

在一个实施方案中，第一链具有19-22个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度。在再一实施方案中，第二链具有14-16个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有15个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有2-4个核苷酸的3′-突出端。在一个更进一步的实施方案中，第一链具有3个核苷酸的3′-突出端。

在一个实施方案中，双链体RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。在一个进一步的实施方案中，该至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链和/或碱基经修饰的核糖核苷酸。在一个更进一步的实施方案中，主链经修饰的核糖核苷酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。在一个实施方案中，磷酸二酯键经修饰而包括氮或硫杂原子中的至少一种。在另一个实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸。

在一个实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是稀有碱基或经修饰的碱基。在另一个实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸或其类似物包括肌苷或三苯甲基化碱基。

在再一实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2′-OH基团由选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN的基团替代，其中每个R独立地是C1-C6烷基、链烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。

在一个实施方案中，第一链包括至少一个脱氧核苷酸。在一个进一步的实施方案中，该至少一个脱氧核苷酸在选自3′-突出端、5′-突出端和双链区的一个或多个区域中。在另一个实施方案中，第二链包括至少一个脱氧核苷酸。

本发明还提供了调节细胞或生物中的基因表达的方法，其包括步骤：在可以发生选择性基因沉默的条件下，使所述细胞或生物与权利要求1的双链体RNA分子接触，和通过该双链体RNA分子介导针对与该双链RNA具有基本上对应的序列部分的靶基因或核酸的选择性基因沉默。在一个进一步的实施方案中，所述接触步骤包括步骤：将所述双链体RNA分子引入培养中的或生物体中的靶细胞内，在所述靶细胞中可以发生选择性基因沉默。在一个更进一步的实施方案中，引入步骤选自转染、脂转染、电穿孔、感染、注射、经口施用、吸入、局部和区域施用。在另一个实施方案中，引入步骤包括使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，其选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳液(nanoemulsion)、脂质和类脂(lipoid)。

在一个实施方案中，该调节方法用于确定基因在细胞或生物中的功能或用途。

在一个实施方案中，该调节方法用于治疗或预防疾病或非期望的状况。

在一个实施方案中，靶基因与哺乳动物中的疾病、病理状况或非期望的状况相关。在一个进一步的实施方案中，靶基因是致病微生物的基因。在一个更进一步的实施方案中，靶基因是病毒基因。在另一个实施方案中，靶基因是肿瘤相关基因。在另外一个实施方案中，靶基因是与选自下述的疾病相关的基因：自身免疫疾病、炎性疾病、退行性疾病、感染性疾病、增生性疾病、代谢疾病、免疫介导的病症、变应性疾病、皮肤病学疾病、 恶性疾病、胃肠道病症、呼吸病症、心血管病症、肾病症、类风湿性病症、神经学病症、内分泌紊乱和衰老。

本发明提供了研究试剂。该试剂包括双链体RNA分子。

本发明进一步提供了试剂盒。该试剂盒包括具有18-23个核苷酸长度的第一RNA链和具有12-17个核苷酸长度的第二RNA链，其中第二链与第一链基本上互补，并且能够与第一链形成双链体RNA分子，其中双链体RNA分子具有1-9个核苷酸的3′-突出端、和0-8个核苷酸的5′-突出端，其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现序列特异性基因沉默。

本发明还提供了制备双链体RNA分子的方法。该方法包括步骤：合成第一链和第二链，在形成能够实现序列特异性基因沉默的双链体RNA分子的条件下，组合所合成的链。在一个实施方案中，权利要求35的方法还包括在合成步骤过程中、在合成后且在组合步骤前、或在组合步骤后，将至少一个经修饰的核苷酸或其类似物引入双链体RNA分子内的步骤。在另一个实施方案中，所述RNA链是化学合成的或生物合成的。

本发明提供表达载体。该载体包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码双链体RNA分子的一个或多个核酸。在一个实施方案中，该载体包括与第一表达控制序列可操作地连接的编码第一链的第一核酸、和与第二表达控制序列可操作地连接的编码第二链的第二核酸。在另一个实施方案中，该载体是病毒、真核或细菌表达载体。

本发明还提供细胞。在一个实施方案中，该细胞包括载体。在另一个实施方案中，该细胞包括双链体RNA分子。在一个进一步的实施方案中，该细胞是哺乳动物、禽类或细菌细胞。

本发明提供双链体RNA分子。该双链体RNA分子包括第一链和第二链，其中第一链长于第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与第一链形成双链区，其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默。在一个实施方案中，双链体RNA分子的2个末端独立地选自1-10个核苷酸的3′-突出端、0-10个核苷酸的5′-突出端和平头末端。在一个实施方案中，第一链与靶mRNA序列基本上互补。在一个备选实施方案中，第二链与靶mRNA序列基本上互补。在一个实施方案中，真核细胞 是哺乳动物细胞或禽类细胞。在另一个实施方案中，双链体RNA分子是分离的双链体RNA分子。

在一个实施方案中，第一链具有1-8个核苷酸的3′-突出端、和1-8个核苷酸的5′-突出端。

在另一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的3′-突出端和平头末端。

在另外一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的5′-突出端和平头末端。

在一个备选实施方案中，RNA双链体具有两个1-8个核苷酸的5′-突出端、或两个1-10个核苷酸的3′-突出端。

在一个实施方案中，第一链具有12-100个核苷酸、12-30个核苷酸、18-23个核苷酸、19-25个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度。

在另一个实施方案中，第二链具有5-30个核苷酸、12-22个核苷酸、12-17个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第二链具有15个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有12-30个核苷酸的长度，并且第二链具有10-29个核苷酸的长度，条件是当双链区是27bp时，RNA分子的2个末端独立地是3′突出端或5′突出端。在一个进一步的实施方案中，第一链具有18-23个核苷酸的长度，并且第二链具有12-17个核苷酸的长度。

在另一个实施方案中，第一链具有19-25个核苷酸的长度，并且第二链具有12-17个核苷酸的长度。

在一个备选实施方案中，第一链具有19-25个核苷酸的长度，并且第二链具有18-24个核苷酸的长度，

条件是当第一链是

5’-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU(SEQ ID NO：1)

5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG(SEQ I D NO：2)或

5’-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA(SEQ I D NO：3)时

第二链具有至多17个核苷酸的长度，或包含至少一个与第一链的错 配，或包含至少一个修饰。

在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有12-17个核苷酸、或14-16个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链比第二链长1-10个核苷酸。 

在一个实施方案中，3′-突出端具有2-6个核苷酸的长度。

在另一个实施方案中，5′-突出端具有0-5个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，基因沉默包括RNA干扰、翻译调节和DNA外遗传调节中的一种或两种或全部。

在一个实施方案中，双链体RNA分子还在所述第一链和第二链的至少一个中包括切口。

在另一个实施方案中，双链区包括一个或多个核苷酸的缺口。

在一个实施方案中，5′突出端的至少一个核苷酸与靶mRNA序列不互补。 

在另一个实施方案中，5′突出端的至少一个核苷酸选自A、U和dT。

在一个实施方案中，双链体RNA分子与选自肽、抗体、聚合物、脂质、寡核苷酸、胆固醇和适体(aptamer)的实体缀合。

在一个实施方案中，该RNA分子还包括至少一个未配对的或错配的核苷酸。

在另一个实施方案中，双链区的GC含量是20-70％。

在一个实施方案中，3′-突出端和/或5′-突出端被稳定化以抵抗降解。

在一个实施方案中，双链体RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。在一个进一步的实施方案中，该至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链和/或碱基经修饰的核糖核苷酸。在一个进一步的实施方案中，主链经修饰的核糖核苷酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。在另一个实施方案中，磷酸二酯键经修饰而包括氮或硫杂原子中的至少一种。在另外一个实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸。

在一个实施方案中，该至少一个经修饰的核苷酸或其类似物包括非天然碱基或经修饰的碱基。在另一个实施方案中，该至少一个经修饰的核苷 酸或其类似物包括肌苷或三苯甲基化碱基。

在再一实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2′-OH基团由选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替代，其中每个R独立地是C1-C6烷基、链烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。

在一个实施方案中，第一链包括至少一个脱氧核苷酸。在一个进一步的实施方案中，该至少一个脱氧核苷酸在选自3′-突出端、5′-突出端和靠近第一链的5′末端的双链区的一个或多个区域中。在另一个实施方案中，第二链包括至少一个脱氧核苷酸。

本发明还提供调节细胞或生物中的基因表达的方法。该方法包括步骤：在可以发生选择性基因沉默的条件下，使所述细胞或生物与权利要求1的双链体RNA分子接触，和由该双链RNA分子介导实现针对与该双链RNA具有基本上对应的序列部分的靶核酸的选择性基因沉默。在一个进一步的实施方案中，所述接触包括步骤：将所述双链体RNA分子引入培养中的或生物体中的靶细胞内，在所述靶细胞中选择性基因沉默可以发生。在一个更进一步的实施方案中，引入步骤选自转染、脂转染、电穿孔、感染、注射、经口施用、吸入、局部和区域施用。在另一个实施方案中，引入步骤包括使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，其选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳液、脂质和类脂。在一个实施方案中，该调节方法用于调节基因在细胞或生物中的表达。

在另一个实施方案中，该调节方法用于治疗或预防疾病或非期望状况。

在一个实施方案中，靶基因是与人或动物疾病相关的基因。在一个进一步的实施方案中，靶基因是致病微生物的基因。在一个更进一步的实施方案中，靶基因是病毒基因。在另一个实施方案中，靶基因是肿瘤相关基因。

在另外一个实施方案中，靶基因是与选自下述的疾病相关的基因：自身免疫疾病、炎性疾病、退行性疾病、感染性疾病、增生性疾病、代谢疾 病、免疫介导的病症、变应性疾病、皮肤病学疾病、恶性疾病、胃肠道病症、呼吸病症、心血管病症、肾病症、类风湿性病症、神经学病症、内分泌紊乱和衰老。

该调节方法还可以用于在体外或体内研究药物靶标。

本发明提供包括双链体RNA分子的试剂。 

本发明还提供试剂盒。该试剂盒包括第一RNA链和第二RNA链，其中第一链长于第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且能够与第一链形成双链体RNA分子，其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现序列特异性基因沉默。

本发明还提供制备权利要求1的双链体RNA分子的方法，其包括步骤：合成第一链和第二链，和在形成能够实现序列特异性基因沉默的双链体RNA分子的条件下，组合所合成的链。在一个实施方案中，RNA链是化学合成的或生物合成的。在另一个实施方案中，第一链和第二链是分开或同时合成的。

在一个实施方案中，该方法进一步包括在合成步骤过程中、在合成后且在组合步骤前、或在组合步骤后，将至少一个经修饰的核苷酸或其类似物引入双链体RNA分子内的步骤。

本发明进一步提供了药物组合物。该药物组合物包括至少一种双链体RNA分子作为活性剂和一种或多种载体，所述载体选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、胆固醇、脂质和类脂。

本发明还提供治疗方法。该方法包括给有需要的受试者施用有效量的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物经由选自iv、sc、吸入、局部、po和区域施用的途径进行施用。

在一个实施方案中，第一链包括与基因的靶mRNA序列基本上互补的序列，所述基因选自：发育基因，癌基因，肿瘤抑制基因和酶基因，以及粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、Winged螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子或其受体、生长/分化因子或其受体、神经递质或其受体、激酶、信号转导蛋白的基因，病毒基因，感染性疾病的基因、ABLI、BCLl、BCL2、BCL6、CBFA2、 CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2，ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC，MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC，NF1、NF2，RB1、TP53、WT1、ACP去饱和酶或羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA或RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶或肽酶、普鲁兰酶、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、k-RAS、β-联蛋白(β-catenin)、Rsk1、PCNA、p70S6K、存活蛋白(Survivin)、mTOR、PTEN、Parp1或p21的基因。

在另一个实施方案中，双链体RNA分子选自

其中A、U、G和C是核苷酸，而a、t、g和c是脱氧核苷酸。

本发明提供修饰第一双链体RNA分子的方法，所述双链体RNA分子具有形成双链区的反义链和有义链。该方法包括：缩短有义链的长度，从而使得反义链具有1-8个核苷酸的3′-突出端和0-8个核苷酸的5′-突出端，和形成第二双链体RNA分子；其中第一双链体RNA分子的至少一种性质得到改善。在一个实施方案中，所述性质选自大小、功效、效力、开始的速度、持久性、合成成本、脱靶效应、干扰素应答和递送。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在形成第二双链体RNA分子的条件下组合反义链和缩短的有义链。在一个进一步的实施方案中，第一双链体RNA分子是siRNA、或dicer-底物siRNA、或siRNA前体。

本发明提供表达载体。该载体包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码权利要求1的双链体RNA分子的一个或多个核酸。在一个实施方案中，该表达载体包括与第一表达控制序列可操作地连接的编码第一链的第一核酸、和与第二表达控制序列可操作地连接的编码第二链的第二核酸。在另一个实施方案中，该表达载体是病毒、真核表达载体或细菌表达载体。

本发明还提供细胞。在一个实施方案中，该细胞包括表达载体。在另一个实施方案中，该细胞包括双链体RNA分子。在另外一个实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞或细菌细胞。

从本文提供的其它描述，包括不同实施例，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。所提供的实施例举例说明在实践本发明中有用的不同组分和方法。实施例不限制请求保护的本发明。基于本公开内容，本领域技术人员可以鉴定和采用对于实践本发明有用的其他组分和方法。

附图简述

图1A显示在第一链上具有3′-突出端和5′-突出端的双链体RNA分子结构。

图1B显示在第一链上具有3′-突出端和5′-突出端以及在双链体中具有切口的双链体RNA分子的结构。

图1C显示在第一链上具有3′-突出端和5′-突出端以及在第二链中具有缺口的双链体RNA分子的结构。

图2A显示具有一个平头末端和在第一链上的5′-突出端的双链体RNA分子的结构。

图2B显示具有一个平头末端和在第一链上的3′-突出端的双链体RNA分子的结构。

图2C显示在双链体的2个末端上均具有3′-突出端并且第一链长于第二链的双链体RNA分子的结构。

图2D显示在双链体的2个末端上均具有5′-突出端并且第一链长于第二链的双链体RNA分子的结构。

图3显示通过aiRNA(不对称干扰RNAs)诱导的β-联蛋白的基因沉默。

图3A显示寡聚物的验证。在退火后，寡聚物通过20％聚丙烯酰胺凝胶加以证实。泳道1，21nt/21nt；泳道2，12nt(a)/21nt；泳道3，12nt(b)/21nt；泳道4，13nt/13nt；泳道5，13nt/21nt；泳道6，14nt/14nt；泳道7，14nt(a)/21nt；泳道8，14nt(b)/21nt；泳道9，15nt/15nt；泳道10，15nt/21nt。

图3B显示寡聚物在基因沉默中的作用。HeLa细胞以200,000细胞/孔接种到6孔培养板内。24小时后，它们用scramble siRNA(泳道1)、靶向E2F1的21-bp siRNA(泳道2，作为特异性的对照)或靶向β-联蛋白的21-bp siRNA(泳道3，作为阳性对照)、或相同浓度的不同长度混合的 aiRNA：12nt(a)/21nt(泳道4)；12nt(b)/21nt(泳道5)；13nt/21nt(泳道6)；14nt(a)/21nt(泳道7)；14nt(b)/21nt(泳道8)；15nt/21nt(泳道9)，进行转染。在转染后48小时收获细胞。通过蛋白质印迹测定β-联蛋白的表达。E2F1和肌动蛋白用作对照。

图4和5显示含或不含碱基置换的aiRNA寡聚物在介导基因沉默中的结构-活性关系。用所示aiRNA转染Hela细胞。在转染后48小时时收获细胞并且产生裂解物。执行蛋白质印迹以检测β-联蛋白和肌动蛋白的水平。si表示β-联蛋白siRNA寡核苷酸。每个泳道上方的数字标记对应于表3中的aiRNA寡聚物。

图6显示对aiRNA触发的基因沉默的机制的分析。

图6a显示在用aiRNA或siRNA转染所示天数的细胞中β-联蛋白mRNA水平的RNA印迹分析。

图6b显示β-联蛋白的5’-RACE-PCR示意图，显示mRNA切割和预期的PCR产物。

图6c显示从用aiRNA转染4或8小时的细胞通过5’-RACE-PCR扩增由aiRNA介导的β-联蛋白切割产物。

图6d显示通过测序5’-RACE-PCR片段验证的β-联蛋白mRNA切割位点的示意图。

图6e显示aiRNA和siRNA的差异RISC装载效率。在用pCMV-Ago2转染后48小时，将aiRNA或siRNA双链体转染到Hela细胞内。在aiRNA或siRNA转染后于所示时间点将Ago2免疫沉淀，并且执行RNA印迹分析以测定与Ago2/RISC结合的小RNA的水平。在IP后通过蛋白质印迹测定Ago2的水平(显示在下方)。

图6f显示敲低Ago2或Dicer对aiRNA和siRNA的基因沉默活性的影响。用scramble siRNA(siCon)、或靶向Ago2(siAgo2)或Dicer(siDicer)的siRNA转染细胞24小时后，用scramble aiRNA(Con)或靶向Stat3的aiRNA(ai)转染。在aiStat3转染后48小时收获细胞，并且执行蛋白质印迹分析。

图7显示与siRNA比较，aiRNA掺入RISC内的优势。

图7A显示aiRNA比siRNA更有效地进入RISC。转染了Ago2表达质粒的细胞用aiRNA或siRNA转染所示时间。在细胞裂解后，将Ago2免疫沉淀，从免疫沉淀物中提取RNA，并且在15％丙烯酰胺凝胶上分离。在转移后，使膜与探针杂交，以检测aiRNA或siRNA的21mer反义链。IgG对照泳道显示与Ago2免疫沉淀物相比缺乏信号。

图7B显示aiRNA的有义链不停留在RISC中。剥离(A)的膜上的探针，并且重新用探针探测，以检测转染的寡聚物的有义链。(A)和(B)中的卡通图说明有义链(上方链)、反义链(下方链)或双链体在膜上的位置。

图8显示通过aiRNA的RISC装载机制。

图8A显示对aiRNA或siRNA的不同链和Ago2之间的相互作用的免疫沉淀分析。包含超表达的Ago2的Hela S-10裂解物与包含³²P末端标记的有义链或反义链的所示aiRNA或siRNA双链体一起温育。(＊)号标明该标记物的位置。在Ago2免疫沉淀后，分离RNA并且在15％丙烯酰胺凝胶上分离，对胶片进行曝光。与Ago2结合的RNAs显示在沉淀级分中，而未与Ago2结合的RNA保留在上清液(Sup)中。

图8B显示有义链切割在aiRNA活性中的作用。用aiRNA、或用有义链在位置8(预测的Ago2切割位点)或位置9(作为对照)处具有2’-O-甲基的aiRNA，转染细胞。在转染后4小时收集RNA，并且执行qRT-PCR，以测定剩余的β-联蛋白mRNA的相对水平。

图9显示aiRNA和siRNA竞争分析。

图9A示例包含³²P末端标记的反义链的siRNA和aiRNA双链体。(＊)号标明该标记的位置。

图9B显示冷aiRNA不与标记的siRNA竞争Ago2。包含超表达的Ago2的Hela S-10裂解物与³²P末端标记的siRNA及冷aiRNA或siRNA双链体一起温育，之后免疫沉淀Ago2。随后分离RNA，并且在15％丙烯酰胺凝胶上分析。

图9C显示冷siRNA不与标记的aiRNA竞争Ago2。将与B中所用相 同的S-10裂解物与³²P末端标记的aiRNA及冷aiRNA或siRNA双链体一起温育，之后免疫沉淀Ago2。随后分离RNA，并且在15％丙烯酰胺凝胶上分析。

图10示例aiRNA和siRNA的模型，显示了在RISC装载和成熟RISC产生中观察到的差异。

图11显示具有反义突出端的14-15bp不对称RNA双链体(aiRNA)诱导了有力、有效的、快速且持久的基因沉默。

图11A为显示靶向β-联蛋白的siRNA和aiRNA的序列和设计的示意图。

图11B显示由各种长度的aiRNA诱导的基因沉默。在用所示aiRNA转染48小时的细胞中，通过蛋白质印迹分析β-联蛋白的蛋白质水平。

图11C显示aiRNA在诱导β-联蛋白的蛋白质耗竭方面比siRNA更有力和有效。用靶向β-联蛋白的aiRNA或siRNA以所示浓度转染Hela细胞。在转染后48小时，制备细胞裂解物并且进行蛋白质印迹分析。

图11D显示aiRNA在减少β-联蛋白的RNA水平方面比siRNA更有效、快速和持久。细胞用10nM 15bp aiRNA或21-mer siRNA转染所示天数后，进行RNA印迹分析。

图12显示aiRNA介导快速且有力的沉默。

图12A显示用于靶向β-联蛋白的aiRNA和siRNA的序列和结构。

图12B显示对来自转染了对照aiRNA或靶向β-联蛋白的aiRNA的细胞的β-联蛋白mRNA的水平进行的RT-PCR。在转染后于所示时间收集RNA。

图12C显示在用对照、aiRNA或siRNA转染所示小时数的细胞中对β-联蛋白的mRNA水平的定量实时RT-PCR。

图12D显示在用对照、aiRNA或siRNA转染所示时间的细胞中对β-联蛋白的蛋白质水平的蛋白质印迹分析。

图13显示aiRNA与siRNA在针对多种靶的基因沉默功效和持久性方面的比较。用scrambled siRNA(c)、靶向(a)β-联蛋白(以10nM)、(b)Stat3、 (c)EF2、或(d)NQO1(以20nM)的aiRNA(ai)或siRNA(si)转染Hela细胞。在所示时间点纯化RNA和蛋白质，并且通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析mRNA水平，和通过蛋白质印迹分析蛋白质水平。相对于siCon转染的细胞，标化qRT-PCR数据。

图14显示aiRNA介导的基因沉默在多种细胞系中对各种基因是有效的。

图14a显示在不同哺乳动物细胞系中aiRNA双链体比siRNA更有效地靶向β-联蛋白。

图14b显示来自用20nM所示aiRNA或siRNA转染48小时的细胞的Nbs1、存活蛋白、Parp1、p21的蛋白质印迹分析。

图14c显示来自用20nM所示aiRNA或siRNA转染48小时的细胞的Rsk1、PCNA、p70S6K、mTOR和PTEN的蛋白质印迹分析。

图14d显示aiRNA对k-Ras的等位基因特异性基因沉默。通过蛋白质印迹分析，测试靶向野生型k-Ras的aiRNA在k-Ras野生型(DLD1)和k-Ras突变型(SW480)细胞系中对k-Ras的沉默。

图15显示aiRNAs的通过有义链的脱靶基因沉默的缺乏、以及aiRNA的免疫刺激作用和血清稳定性。

图15a显示在模拟(mock)处理的或与β-联蛋白siRNA或aiRNA双链体温育16小时的PBMC中干扰素诱导型基因的表达的RT-PCR分析。

图15b显示在模拟转染的或用EF2或存活蛋白aiRNA或siRNA转染24小时的Hela细胞中干扰素诱导型基因的表达的RT-PCR分析。

图15c显示对已知干扰素应答相关基因的表达改变的微阵列分析。通过微阵列分析从aiRNA和siRNA转染的Hela细胞中分离的总RNA。

图15d显示对于aiRNA未检测出有义链介导的脱靶基因沉默。用aiRNA或siRNA和表达Stat3(有义RNA)的质粒或表达反义Stat3(反义RNA)的质粒共转染细胞。在转染后24小时收获细胞并且收集RNA，通过定量实时PCR或RT-PCR测定Stat3有义或反义RNA(插入片段)的相对水平。

图15e显示aiRNA和siRNA双链体在人血清中的稳定性。aiRNA和siRNA双链体在10％人血清中在37℃温育所示时间，之后凝胶电泳。显示剩余的双链体(对照％)。

图15f说明对aiRNA双链体介导的基因特异性沉默所提出的模型。

图16显示在SW480人结肠异种移植小鼠模型中，针对β-联蛋白的aiRNA的有力抗肿瘤活性。具有建立的皮下SW480人结肠癌的免疫抑制小鼠每天静脉内(iv)给予0.6nmol PEI-复合的β-联蛋白siRNAs、PEI-复合的β-联蛋白aiRNAs、或作为阴性对照的PEI-复合的无关siRNA。在处理过程中定期评估肿瘤大小。每个点表示6个肿瘤的平均值±SEM。

图17显示在HT29人结肠异种移植小鼠模型中，针对β-联蛋白的aiRNA的有力抗肿瘤活性。具有建立的皮下HT29人结肠癌的免疫抑制小鼠每隔一天静脉内(iv)给予0.6nmol PEI-复合的β-联蛋白siRNAs、PEI-复合的β-联蛋白aiRNAs、或作为阴性对照的PEI-复合的无关siRNA。在处理过程中定期评估肿瘤大小。每个点表示5个肿瘤的平均值±SEM。

发明详述

本发明涉及能够在真核细胞中实现选择性基因沉默的不对称双链体RNA分子。在一个实施方案中，双链体RNA分子包括第一链和第二链。第一链长于第二链。第二链与第一链基本上互补，并且与第一链形成双链区。

在一个实施方案中，双链体RNA分子具有1-8个核苷酸的3′-突出端和1-8个核苷酸的5′-突出端，1-10个核苷酸的3′-突出端和平头末端，或1-10个核苷酸的5′-突出端和平头末端。在另一个实施方案中，双链体RNA分子具有两个1-8个核苷酸的5′-突出端或两个1-10个核苷酸的3′-突出端。在一个进一步的实施方案中，第一链具有1-8个核苷酸的3′-突出端和1-8个核苷酸的5′-突出端。在一个更进一步的实施方案中，双链体RNA分子是分离的双链体RNA分子。

在一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的3′-突出端、和1-10 个核苷酸的5′-突出端或5′-平头末端。在另一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的3′-突出端和1-10个核苷酸的5′-突出端。在一个备选实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的3′-突出端和5′-平头末端。

在一个实施方案中，第一链具有5-100个核苷酸、12-30个核苷酸、15-28个核苷酸、18-27个核苷酸、19-23个核苷酸、20-22个核苷酸、或21个核苷酸的长度。

在另一个实施方案中，第二链具有3-30个核苷酸、12-26个核苷酸、13-20个核苷酸、14-23个核苷酸、14或15个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有5-100个核苷酸的长度，并且第二链具有3-30个核苷酸的长度；或第一链具有10-30个核苷酸的长度，并且第二链具有3-29个核苷酸的长度；或第一链具有12-30个核苷酸的长度，并且第二链具有10-26个核苷酸的长度；或第一链具有15-28个核苷酸的长度，并且第二链具有12-26个核苷酸的长度；或第一链具有19-27个核苷酸的长度，并且第二链具有14-23个核苷酸的长度；或第一链具有20-22个核苷酸的长度，并且第二链具有14-15个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有13-20个核苷酸、14-19个核苷酸、14-17个核苷酸、14或15个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链比第二链长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。

在一个实施方案中，双链体RNA分子还包括1-10个未配对的或错配的核苷酸。在一个进一步的实施方案中，未配对或错配的核苷酸在3′凹缺末端处或附近。在一个备选实施方案中，未配对或错配核苷酸在5′凹缺末端处或附近。在一个备选实施方案中，未配对或错配核苷酸在双链区处。在另一个实施方案中，未配对或错配的核苷酸序列具有1-5个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施方案中，未配对或错配的核苷酸形成环结构。

在一个实施方案中，第一链或第二链包含至少一个切口或由2个核苷酸片段形成。

在一个实施方案中，基因沉默通过RNA干扰、翻译调节和DNA外遗 传调节中的一种或两种或全部来达到。

在说明书和权利要求中，除非上下文另有明确说明，单数形式“a”、“an”和“the”包括对复数的提及。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所使用的，“双链RNA”、“双链体RNA”或“RNA双链体”指具有2条链并且具有至少一个双链区的RNA，其包括在双链区内或在2个相邻的双链区之间具有至少一个缺口、切口、凸起和/或鼓泡的RNA分子。如果一条链在2个双链区之间具有缺口或单链的未配对核苷酸区，那么该链视为具有多个片段。如本文所使用的，双链RNA可以在任一末端或2个末端上具有末端突出。在某些实施方案中，双链体RNA的2条链可以通过化学接头连接。

如本文所使用的，“反义链”指与靶信使RNA具有基本上的序列互补性的RNA链。反义链可以是siRNA分子的一部分、miRNA/miRNA^＊双链体的一部分、或单链成熟miRNA。

如本文所用的，术语“分离的”或“纯化的”是指，物质实质上或基本上不含在其天然状态下与其正常相伴的成分。纯度和均质性一般利用分析化学技术来确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。

如本文所使用的，“调节”及其语法等同体是指，增加或减少(例如沉默)，换言之，上调或下调。如本文所使用的，“基因沉默”指基因表达的减少，并且可以指靶基因的基因表达的约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％减少。

如本文所用，术语“受试者”是指，任何将作为特定治疗的接受者的动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等。一般，术语“受试者”和“患者”就人类受试者而言在本文可互换使用。

如本文所用的，诸如“治疗”或“缓解”等术语既指1)治愈、减缓、减轻所诊断病情或病症的症状，和/或中断其进展的治疗性措施，又指2)防止或减缓所靶向病情或病症的发展的防范性或预防性措施。因而，需要治疗的包括已经患有病症的那些；易患病症的那些；以及欲预防病症的那些。 如果患者显示出如下一种或多种状况，则该受试者被本发明的方法成功地“治疗”：癌细胞数量的减少或完全无癌细胞；肿瘤大小的减小；抑制或不存在癌细胞向周围器官的浸润、包括癌向软组织和骨的扩散；抑制或不存在肿瘤转移；抑制或不存在肿瘤生长；与具体癌症相关的一种或多种症状的减轻；减小的发病率和死亡率；和生活质量的提高。

如本文所用，当用在生物活性的语境中时，术语“抑制”及其语法等同体是指生物活性的下调，这可以减小或消除所靶向的功能，例如蛋白质的生产或分子的磷酸化。在特别的实施方案中，抑制可以指所靶向活性的约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的减小。当用于病症或疾病的语境中时，该术语是指成功地防止症状发作、缓解症状或消除疾病、病情或病症。

如本文所使用的，术语“基本上互补”是指，在2个核酸之间的碱基配对双链区而非任何单链区中的互补，所述单链区例如末端突出端或2个双链区之间的缺口区。互补无需是完全的；例如，在2个核酸之间可以存在任何数目的碱基对错配。然而，如果错配数目大到即使是在最低严格杂交条件下也无法发生杂交时，那么该序列不是基本上互补的序列。当2个序列在本文中称为“基本上互补”时，意味着这两个序列彼此充分互补以能在所选反应条件下发生杂交。核酸互补性和足以达到特异性的杂交严格性之间的关系是本领域众所周知的。2条基本上互补的链可以例如是完全互补的，或可以包含1个至多个错配，只要杂交条件足以允许例如区分配对序列和非配对序列即可。因此，基本上互补的序列可以指在双链区中具有100、95、90、80、75、70、60、50％或更少或之间的任何百分数的碱基对互补性的序列。

如本文所使用的，antagomirs是miRNA抑制剂，可以用于沉默内源miRNA。如本文所使用的，mimetics或mimics是miRNA激动剂，可以用于作为功能等价物替换内源miRNA，并由此上调受此内源miRNA影响的途径。

1.RNA干扰

RNA干扰(缩写为RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱导的用于靶向破坏单链RNA(ssRNA)的细胞过程。该ssRNA可以是基因转录物例如信使RNA(mRNA)。RNAi是一种转录后基因沉默形式，其中dsRNA可以特异地干扰与dsRNA具有互补序列的基因的表达。dsRNA的反义RNA链靶向互补基因转录物例如信使RNA(mRNA)，以实现由核糖核酸酶的切割。

在RNAi过程中，长dsRNA通过核糖核酸酶蛋白质Dicer加工成称为小干扰RNA(siRNA)的短形式。siRNA分离成引导(guide strand或反义)链和过客(passenger或有义)链。引导链整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)内，其是含核糖核酸酶的多蛋白复合物。复合物随后特异性靶向互补基因转录物进行破坏。

RNAi已被证实是许多真核生物中的常见细胞过程。RISC以及Dicer在真核生物界中是保守的。RNAi被认为在针对病毒和其他外来遗传物质的免疫应答中起作用。

小干扰RNA(siRNA)是一类短双链RNA(dsRNA)分子，发挥多种生物学作用。最显著地，其参与RNA干扰(RNAi)途径，在此途径中siRNA干扰特定基因的表达。此外，siRNA还在例如抗病毒机制或基因组的染色质结构成形等过程中起作用。在一个实施方案中，siRNA具有短(19-21nt)双链RNA(dsRNA)区以及2-3个核苷酸的3′突出端和5′-磷酸和3′-羟基末端。

微小RNA(miRNA)是一类内源、单链或双链、长约22个核苷酸的RNA分子，其调节多达30％的哺乳动物基因(Czech，2006；Eulalio等人，2008；Mack，2007)。miRNA通过阻断翻译或引起转录物降解来阻遏蛋白质产生。miRNA可以靶向250-500种不同mRNA。miRNA是miRNA前体的Dicer消化产物，所述miRNA前体是初级miRNA(pri-miRNA)的产物。

如本文所使用的，antagomirs是miRNA抑制剂，可以用于沉默内源miRNA。如本文所使用的，mimetics是miRNA激动剂，可以用于替换miRNA和下调mRNA。

Dicer是RNA酶III核糖核酸酶家族成员。Dicer将长双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)前体、和短发夹RNA(shRNA)切割成约20-25个核苷酸长度的、通常在3′末端上具有2个碱基突出的短双链RNA片段，称为小干扰RNA(siRNA)。Dicer催化RNA干扰途径中的第一个步骤，并且起始RNA诱导的沉默复合物(RISC)的形成，该复合物的催化组分argonaute是能够降解信使RNA(mRNA)的核酸内切酶，其中该信使RNA的序列与siRNA引导链的序列互补。

如本文所使用的，有效siRNA序列是在触发RNAi以降解靶基因的转录物方面有效的siRNA。并非与靶基因互补的每一个siRNA都可以有效地触发RNAi降解基因的转录物。事实上，通常需要耗费时间的筛选以鉴定有效的siRNA序列。在一个实施方案中，有效siRNA序列能够使靶基因表达减少90％以上、80％以上、70％以上、60％以上、50％以上、40％以上或30％以上。

本发明提供称为不对称干扰RNA(aiRNA)的新结构支架，其可以用于实现siRNA样结果，也可以用于调节miRNA途径活性(在与本申请同一天提交的、名为“Composition of Asymmetric RNA Duplex as MicroRNAMimetic or Inhibitor”的、共同拥有的PCT和美国申请中详细描述，其完整内容引入本文作为参考)。

aiRNA的新结构设计不仅在实现基因调节方面是功能上有效的，还提供超过现有技术RNAi调节剂(主要是反义，siRNA)的几个优点。在这些优点中，aiRNA可以比现有siRNA构建体具有长度短得多的RNA双链体结构，这将减少合成成本和消除或减少长度依赖性的、自宿主细胞的非特异性干扰素样免疫应答的触发。aiRNA中过客链的较短长度还将消除或减少RISC中过客链的非故意掺入，从而又可以减少在miRNA介导的基因沉默中观察到的脱靶效应。aiRNA可以用于目前基于miRNA的技术正在应用或考虑应用的所有领域，包括生物学研究、生物技术和医药工业中的R&D研究、以及基于miRNA的诊断和治疗。

2.aiRNA结构支架

Elbashir等人测试了几种不对称双链体RNA分子以及对称siRNA分子(Elbashir等人，2001c)。该不对称双链体RNA分子和相应的siRNA分子在表1中列出。

表1：

然而，与相应的对称siRNA分子比较，这些不对称双链体RNA分子未能实现选择性基因沉默(同上引文)。

本发明涉及能够实现序列特异性基因沉默的不对称双链体RNA分子。在一个实施方案中，本发明的RNA分子包括第一链和第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与第一链形成双链区，其中第一链长于第二链；排除Elbashir(Elbashir等人，2001c)中公开的不对称双链体RNA分子，特别是表1中列出的不对称双链体RNA分子。RNA分子包括双链区、以及独立地选自5′-突出端、3′-突出端和平头末端的2个末端。该RNA链可以具有未配对或不完全配对的核苷酸。

在一个实施方案中，第一链比第二链长至少1nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nt。在另一个实施方案中，第一链比 第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长3-10nt。

在一个实施方案中，双链区具有3-98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10-19bp的长度。双链区的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30bp。

在一个实施方案中，RNA分子的双链区不包含任何错配或凸起。在另一个实施方案中，RNA分子的双链区包含错配和/或凸起。

在一个实施方案中，当第一链是

5’-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU (SEQ ID NO：1)

5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG (SEQ ID NO：2)或

5’-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA (SEQ ID NO：3)时，

第二链具有至多17个核苷酸的长度，或包含至少一个与第一链的错配，或包含至少一个修饰。

在一个备选实施方案中，第一链不是

5’-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU (SEQ ID NO：1)

5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG (SEQ ID NO：2)或

5’-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA (SEQ ID NO：3)。

在一个实施方案中，第一链包括与靶mRNA序列基本上互补的序列。在另一个实施方案中，第二链包括与靶mRNA序列基本上互补的序列。

本发明涉及能够实现基因沉默的不对称双链RNA分子。在一个实施方案中，本发明的RNA分子包括第一链和第二链，其中第二链与第一链基本上互补或部分互补，并且第一链和第二链形成至少一个双链区，其中第一链长于第二链(长度不对称)。本发明的RNA分子具有至少一个双链区、以及独立地选自5′-突出端、3′-突出端和平头末端的2个末端(例如，参见图1A，2A-2D)。

在单个核苷酸的改变、添加和缺失可关键性地影响分子的功能性 (Elbashir等人，2001c)的小RNA调节剂制备领域中，aiRNA支架提供了与具有21-nt双链RNA的经典siRNA结构不同的结构平台，经典siRNA结构在每条链及其相应的3′突出端上都是对称的。此外，本发明的aiRNA提供一种非常需要的设计新型小分子调节剂的新方法，如下文实施例中的数据显示的，该新型小分子调节剂可以克服目前在基于RNAi的研究和药物开发中遇到的障碍。例如，自结构上模拟siRNA的aiRNA得到的数据显示，aiRNA在诱导基因沉默方面比siRNA更有效、有力、快速开始、持久和特异。

本发明RNA分子的任何单链区，包括任何末端突出和在2个双链区之间的缺口，都可以通过化学修饰或二级结构进行抵抗降解的稳定化处理。RNA链可以具有未配对或不完全配对的核苷酸。每条链可以具有一个或多个切口(在核酸主链中的切口，例如参见图1B)、缺口(具有一个或多个缺失核苷酸的断裂链，例如参见图1C)、和经修饰的核苷酸或核苷酸类似物。不仅RNA分子中的任何或所有核苷酸可以进行化学修饰，而且每条链可以与一个或多个结构部分缀合以增强其功能性，所述结构部分例如一或多个肽、抗体、抗体片段、适体、聚合物等等。

在一个实施方案中，第一链比第二链长至少1nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nt。在另一个实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长3-10nt。

在一个实施方案中，第一链或长链具有5-100nt、或优选10-30或12-30nt、或更优选15-28nt的长度。在一个实施方案中，第一链长度是21个核苷酸。在一个实施方案中，第二链或短链具有3-30nt、或优选3-29nt或10-26nt、或更优选12-26nt的长度。在一个实施方案中，第二链具有15个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，双链区具有3-98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中， 双链区具有10-19bp的长度。双链区的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30bp。

在一个实施方案中，RNA分子的双链区不包含任何错配或凸起，并且2条链在双链区中彼此完全互补。在另一个实施方案中，RNA分子的双链区包含错配和/或凸起。

在一个实施方案中，末端突出端是1-10个核苷酸。在一个进一步的实施方案中，末端突出端是1-8个核苷酸。在另一个实施方案中，末端突出端是3nt。

2.1.在第一链上具有5′-突出端和3′-突出端的双链体RNA分子

参考图1A，在本发明的一个实施方案中，双链RNA分子在第一链上具有5′-突出端和3′-突出端。该RNA分子包括第一链和第二链；第一链和第二链形成具有基本上互补序列的至少一个双链区，其中第一链长于第二链。在第一链上，在双链区侧翼，在5′和3′末端上都存在未配对的突出端。

在一个实施方案中，第一链比第二链长至少2nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nt。在另一个实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长3-10nt。

在一个实施方案中，第一链具有5-100nt的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-30个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施方案中，第一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-18个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有10-30个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有10-30个核苷酸的长度，并且第二链具有3-28个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施方案中，第一链具有10-30个核苷酸的长度，并且第二链具有3-19个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-24个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-19个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30nt的长度。在另一个实施方案中，第二链具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28nt的长度。

在一个实施方案中，第一链具有21nt的长度，并且第二链具有15nt的长度。

在一个实施方案中，3′-突出端具有1-10nt的长度。在一个进一步的实施方案中，3′-突出端具有1-8nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，3′-突出端具有2-6nt的长度。在一个实施方案中，3′-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的长度。

在一个实施方案中，5′-突出端具有1-10nt的长度。在一个进一步的实施方案中，5′-突出端具有1-6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，5′-突出端具有2-4nt的长度。在一个实施方案中，5′-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的长度。

在一个实施方案中，3′-突出端的长度等于5′-突出端的长度。在另一个实施方案中，3′-突出端长于5′-突出端。在一个备选实施方案中，3′-突出端短于5′-突出端。

在一个实施方案中，双链体RNA分子包括约15nt的基本上互补序列的双链区、3-nt 3′-突出端和3-nt 5′-突出端。第一链是21nt并且第二链是15nt。在一个特征中，各种实施方案的双链区由完全互补的序列组成。在一个备选特征中，双链区包括至少一个切口(图1B)、缺口(图1C)或错配(凸起或环)。

在一个实施方案中，双链区具有3-98bp的长度。在一个进一步的实 施方案中，双链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10-19bp的长度。双链区的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30bp。可以存在一个以上双链区。

在一个实施方案中，第一链是反义链，其能够靶向基本上互补的基因转录物例如信使RNA(mRNA)，通过切割或通过翻译阻遏实现基因沉默。

本发明还提供双链体RNA分子，其包括具有18-23个核苷酸长度的第一链和具有12-17个核苷酸长度的第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与第一链形成双链区，其中第一链具有1-9个核苷酸的3′-突出端和1-8个核苷酸的5′-突出端，其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默。在一个实施方案中，第一链包括与靶mRNA序列基本上互补的序列。

在一个实施方案中，第一链具有20、21或22个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，第二链具有14、15或16个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有15个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有1、2、3、4、5或6个核苷酸的3′-突出端。在一个更进一步的实施方案中，第一链具有3个核苷酸的3′-突出端。

2.2.具有一个平头末端以及在第一链上的5′-突出端或3′-突出端的双链体RNA分子

在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、一个平头末端和一个5′-突出端或3′-突出端(参见例如图2A和2B)。该RNA分子包括第一链和第二链，其中第一链和第二链形成双链区，其中第一链长于第二链。

在一个实施方案中，双链区具有3-98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10-18bp的长度。双链区的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29或30bp。双链区可以具有与就其他实施方案描述的特性类似的特性，故不必在此重复。例如，双链区可以由完全互补的序列组成，或包括至少一个切口、缺口或错配(凸起或环)。

在一个实施方案中，第一链比第二链长至少1nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nt。在另一个实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长4-10nt。

在一个实施方案中，第一链具有5-100nt的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-30个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施方案中，第一链具有10-30nt的长度，并且第二链具有3-19个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-19个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、平头末端和3′-突出端(参见例如图2B)。

在一个实施方案中，3′-突出端具有1-10nt的长度。在一个进一步的实施方案中，3′-突出端具有1-8nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，3′-突出端具有2-6nt的长度。在一个实施方案中，3′-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的长度。

在一个备选实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、平头末端和5′-突出端(参见例如图2A)。

在一个实施方案中，5′-突出端具有1-10nt的长度。在一个进一步的实施方案中，5′-突出端具有1-6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，5′-突出端具有2-4nt的长度。在一个实施方案中，5′-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的长度。

2.3.具有两个5′-突出端或两个3′-突出端的双链体RNA分子

在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、和两个3′-突出端 或两个5′-突出端(参见例如图2C和2D)。该RNA分子包括第一链和第二链，其中第一链和第二链形成双链区，其中第一链长于第二链。

在一个实施方案中，双链区具有3-98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10-18bp的长度。双链区的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30bp。

在一个实施方案中，第一链比第二链长至少1nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nt。在另一个实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长4-10nt。

在一个实施方案中，第一链具有5-100nt的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-30个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施方案中，第一链具有10-30nt的长度，并且第二链具有3-18个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-16个核苷酸的长度。

在一个备选实施方案中，双链体RNA分子包括双链区和两个3′-突出端(参见例如图2C)。双链区具有与就其他实施方案所描述的类似特性。

在一个实施方案中，3′-突出端具有1-10nt的长度。在一个进一步的实施方案中，3′-突出端具有1-6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，3′-突出端具有2-4nt的长度。在一个实施方案中，3′-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的长度。

在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区和两个5′-突出端(参见例如图2D)。

在一个实施方案中，5′-突出端具有1-10nt的长度。在一个进一步的实施方案中，5′-突出端具有1-6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，5′-突出端具有2-4nt的长度。在一个实施方案中，5′-突出端具有1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10nt的长度。

3.aiRNA的设计

siRNA和miRNA已经广泛用作研究工具，并且被开发作为药物候选物。(参见例如，Dykxhoorn，Novina&Sharp.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4：457-467(2003)；Kim&Rossi，Nature Rev.Genet.8：173-184(2007)；deFougerolles等人Nature Rev.Drug Discov.6：443-453(2007)；Czech，NEJM354：1194-1195(2006)；和Mack，Nature Biotech.25：631-638(2007))。本发明的双链体RNA分子，即aiRNA，可以衍生自本领域已知的siRNA和miRNA。

本发明提供将siRNA或miRNA转化成aiRNA的方法。该转化导致与原始分子相比具有至少一种改善的性质的新双链体RNA分子。该性质可以是大小、功效、效力、开始的速度、持久性、合成成本、脱靶效应、干扰素应答或递送。

在一个实施方案中，原始分子是双链体RNA分子，例如siRNA。该双链体RNA分子包括形成至少一个双链区的反义链(例如引导链)和有义链(例如过客链)。该方法包括改变一条或两条链的长度，从而使得反义链长于有义链。在一个实施方案中，有义过客链被缩短。在另一个实施方案中，反义链被延长。在一个更进一步的实施方案中，有义链被缩短并且反义链被延长。可以合成不变的或具有改变大小的反义和有义RNA链，并且随后在形成aiRNA分子的条件下组合。

在再一实施方案中，该方法包括改变反义和/或有义链的长度，从而使得形成具有1-6个核苷酸的3′-突出端和1-6个核苷酸的5′-突出端中的至少之一的双链体RNA分子。

备选地，可以从头设计本发明的双链体RNA分子。利用siRNA和miRNA的设计方法，例如基因步移法，可以设计本发明的双链体RNA分子。

本发明的RNA分子可以用生物信息学方法进行设计，并且随后在体 外和体内进行测试，以确定其对靶基因的调节功效和任何脱靶效应的存在。基于这些研究，随后可以选择且修饰该RNA分子的序列，以改善对靶基因的调节功效和使脱靶效应最小化。(参见例如，Patzel，Drug DiscoveryToday 12：139-148(2007))。

3.1.双链体RNA分子中的来配对或错配区域

aiRNA双链体的2条单链可以具有至少一个未配对的或不完全配对的(包含例如一个或多个错配)区域。在一个实施方案中，未配对或不完全配对的区域是RNA分子的至少一个末端区域，包括具有平头末端的末端区域、具有3′-凹缺或5′突出端的末端区域、和具有5′凹缺或3′突出端的末端区域。如本文所使用的，末端区域是RNA分子中包括一个末端和邻近区域的区域。

在一个实施方案中，未配对或不完全配对的区域在aiRNA分子的双链区中。在一个进一步的实施方案中，不对称RNA双链体具有未配对的凸起或环结构。

3.2.双链体RNA分子中的序列基序

在本发明aiRNA分子的设计中，总体GC含量可以改变。在一个实施方案中，双链区的GC含量是20-70％。在一个进一步的实施方案中，双链区的GC含量小于50％、或优选30-50％，以使得链分离更容易，这是因为G-C配对强于A-U配对。

在某些实施方案中，末端突出端，例如5′末端，的核苷酸序列可以独立于任何模板序列(例如靶mRNA序列)进行设计，即不必与靶mRNA(在siRNA或miRNA模拟物的情况下)或靶miRNA(在miRNA抑制剂的情况下)基本上互补。在一个实施方案中，较长链或反义链的突出端，例如在5′或3′，是“AA”、“UU”或“dTdT”基序，其与某些其他基序比较已显示出增加的功效。在一个实施方案中，较长链或反义链的5′突出端具有“AA”基序。在另一个实施方案中，较长链或反义链的3′突出端具有“UU”基序。

3.3.核苷酸置换

本发明RNA分子中的一个或多个核苷酸可以用脱氧核苷酸或经修饰的核苷酸或核苷酸类似物进行置换。置换可以在RNA分子中的任何地方发生，例如发生在一个或两个突出端区域、和/或双链区。在某些情况下，置换增强RNA分子的物理性质，例如链亲和力、溶解性和抵抗RNA酶降解的抗性或其他方面增强的稳定性。

在一个实施方案中，经修饰的核苷酸或类似物是糖、主链和/或碱基经修饰的核糖核苷酸。主链经修饰的核糖核苷酸可以在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。在一个实施方案中，RNA分子中的磷酸二酯键被修饰，以包括至少氮和/或硫杂原子。在一个实施方案中，经修饰的核苷酸或类似物是稀有碱基或经修饰的碱基。在一个实施方案中，经修饰的核苷酸或类似物是肌苷或三苯甲基化碱基。

在再一实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2′-OH基团由选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂和CN的基团替代，其中每个R独立地选自C1-C6烷基、链烯基和炔基，并且卤素选自F、Cl、Br和I。

在一个实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸。

4.用途

本发明还提供调节细胞或生物中的基因表达的方法(沉默方法)。该方法包括步骤：在可以发生选择性基因沉默的条件下，使所述细胞或生物与双链体RNA分子接触，和由所述双链体RNA分子介导实现针对与双链RNA具有基本上对应的序列部分的靶核酸的选择性基因沉默。

在一个实施方案中，接触步骤包括将所述双链体RNA分子引入培养中的或生物体中的靶细胞内的步骤，在所述靶细胞中可以发生选择性基因沉默。在一个更进一步的实施方案中，引入步骤包括转染、脂转染、感染、 电穿孔或其他递送技术。

在一个实施方案中，该沉默方法用于确定基因在细胞或生物中的功能或用途。

该沉默方法可以用于调节基因在细胞或生物中的表达。在一个实施方案中，所述基因与疾病例如人类疾病或动物疾病、病理状态或非期望状况相关。在一个进一步的实施方案中，基因是致病微生物的基因。在一个更进一步的实施方案中，基因是病毒基因。在另一个实施方案中，基因是肿瘤相关基因。

在一个备选实施方案中，基因是与选自下述的疾病相关的基因：自身免疫疾病、炎性疾病、退行性疾病、感染性疾病、增生性疾病、代谢疾病、免疫介导的病症、变应性疾病、皮肤病学疾病、恶性疾病、胃肠道病症、呼吸病症、心血管病症、肾病症、类风湿性病症、神经学病症、内分泌紊乱和衰老。

4.1.研究工具

相对于基因工程敲除(knock-out)模型，本发明的RNA分子可以用于在动物模型中造成基因“敲低”，以发现基因功能。该方法还可以用于在体外沉默基因。例如，可以向细胞转染aiRNA。aiRNA可以在药物研究和开发中用作研究工具用于药物靶标/途径的鉴定和验证、以及其他生物医学研究。

4.2治疗用途

本发明的RNA分子可以用于治疗和/或预防各种疾病或非期望状况，包括概述的疾病(Czech，2006；de Fougerolles等人，2007；Dykxhoorn等人，2003；Kim和Rossi，2007；Mack，2007)。

在一个实施方案中，本发明可以用作癌症治疗或用于预防癌症。本发明的RNA分子可以用于沉默或敲低涉及细胞增殖或其他癌症表型的基因。这些基因的例子是k-Ras、β-联蛋白、Nbs1、EF2、Stat3、PTEN、p70S6K、 mTOR、Rsk1、PCNA、Parp1、存活蛋白、NQO1和p21。特别地，k-Ras和β-联蛋白是结肠癌的治疗基因。这些癌基因在大多数临床病例中是活跃和相关的。

这些RNA分子还可以用于沉默或敲低非癌基因靶。本发明的RNA分子还可以用于治疗或预防眼疾病(例如老年性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病变(DR))；感染性疾病(例如HIV/AIDS、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、RCV、巨细胞病毒(CMV)、登革热、西尼罗病毒)；呼吸性疾病(例如呼吸道合胞病毒(RSV)、哮喘、囊性纤维化)；神经学疾病(例如亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊柱损伤、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、疼痛)；心血管疾病；代谢病症(例如糖尿病)；遗传病症；和炎性病状(例如，炎性肠病(IBD)、关节炎、类风湿性疾病、自身免疫病症)、皮肤病学疾病。

可以使用本发明的不对称双链体RNA分子沉默各种基因。在一个实施方案中，第一链包括与选自下述的基因的靶mRNA序列基本上互补的序列：发育基因，癌基因，肿瘤抑制基因和酶基因，以及粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、Winged螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子或其受体、生长/分化因子或其受体、神经递质或其受体、ABLI、BCLl、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2，ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC，MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)(例如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC，NF1、NF2，RB1、TP53、WT1、ACP去饱和酶或羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA或RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶或肽酶、普鲁兰酶、重 组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、k-RAS、β-联蛋白、Rsk1、PCNA、p70S6K、存活蛋白、mTOR、PTEN、Parp1或p21的基因。

本发明提供治疗疾病或非期望状况的方法。该方法包括使用不对称双链体RNA分子，以实现与疾病或非期望状况相关的基因的基因沉默。

4.3.将RNA分子(aiRNA)转化成药物

4.3.1.RNA分子的修饰

裸RNA分子是相对不稳定的，可以在体内被相对快速地降解。化学修饰可以引入本发明的RNA分子中，以改善其半衰期和进一步减少非特异性基因打靶效应的危险而不降低其生物活性。

为改善各种RNA分子，包括反义RNA、核酶、适体和RNAi，的稳定性，已研究了对RNA分子的修饰(Chiu和Rana，2003；Czauderna等人，2003；de Fougerolles等人，2007；Kim和Rossi，2007；Mack，2007；Zhang等人，2006；和Schmidt，Nature Biotech.25：273-275(2007))。

本领域技术人员已知的任何稳定化修饰均可以用于改善本发明RNA分子的稳定性。在本发明RNA分子内，可以将化学修饰引入磷酸主链(例如，硫代磷酸酯酯键、核糖(例如，锁核酸、2′-脱氧-2′-氟尿苷、2′-O-甲基)、和/或碱基(例如，2′-氟嘧啶)。此种化学修饰的几个例子在下文中概述。

可以采用在核糖的2′位处的化学修饰，例如2’-O-甲基嘌呤和2’-氟嘧啶(其可以增加抵抗血清中的核酸内切酶活性的抗性)，稳定本发明的RNA分子。应小心选择引入该修饰的位置，以避免显著降低RNA分子的沉默效力。例如，在引导链的5′末端上的该修饰可以减少沉默活性。另一方面，2’-O-甲基修饰可以在双链区在2条RNA链之间交错，以改善稳定性同时保存基因沉默效力。2’-O-甲基修饰还可以消除或减少干扰素诱导。

另一种稳定化修饰是硫代磷酸酯(P＝S)连接。硫代磷酸酯(P＝S)键引入RNA分子内，例如在3′-突出端处，可以提供对抗核酸外切酶的保护作用。

脱氧核糖核苷酸引入RNA分子内也可以减少制造成本且增加稳定性。

在一个实施方案中，对3′-突出端、5′-突出端或两者进行抗降解作用 的稳定化。

在一个实施方案中，RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。在一个进一步的实施方案中，经修饰的核糖核苷酸在其糖、主链、碱基或三者的任何组合上是经修饰的。

在一个实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸。在一个进一步的实施方案中，核苷酸类似物的2′-OH基团由选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替代，其中每个R独立地是C1-C6烷基、链烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。

在一个备选实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸。

在一个实施方案中，双链体RNA分子包含至少一个脱氧核苷酸。在一个进一步的实施方案中，第一链包括1-6个脱氧核苷酸。在一个更进一步的实施方案中，第一链包括1-3个脱氧核苷酸。在另一个实施方案中，3′-突出端包括1-3个脱氧核苷酸。在一个进一步的实施方案中，5′-突出端包括1-3个脱氧核苷酸。在一个备选实施方案中，第二链包括1-5个脱氧核苷酸。

在一个实施方案中，双链体RNA分子包括包含至少一个脱氧核苷酸的3′-突出端或5′-突出端。在另一个实施方案中，RNA 3′-突出端和/或5′-突出端由脱氧核苷酸组成。

在一个实施方案中，双链体RNA分子与实体缀合。在一个进一步的实施方案中，实体选自肽、抗体、聚合物、脂质、寡核苷酸和适体。

在另一个实施方案中，第一链和第二链通过化学接头连接。

4.4.RNA分子的体内递送

RNAi治疗应用的一个主要障碍是siRNA向靶细胞的递送(Zamore和Aronin，2003)。已开发各种方法用于递送RNA分子，特别是siRNA分子(de Fougerolles等人，2007；Dykxhoorn等人，2003；Kim和Rossi，2007)。本领域技术人员已知的任何递送方法都可以用于递送本发明的RNA分子。

递送中的主要问题包括在血清中的不稳定性、非特异性分布、组织屏障和非特异性干扰素应答(Lu&Woodle，Methods in Mol Biology 437：93-107(2008))。与其siRNA和miRNA对应物比较，aiRNA分子具有几个优点，这些优点使得更广泛范围的方法能够用于递送目的。首先，aiRNA可以设计为比其siRNA和miRNA对应物小，由此减少或消除任何干扰素应答。其次，aiRNA更有力、开始得更快速、更有效且持续更久，因此为达到治疗目标需要更少量/剂量的aiRNA。第三，aiRNA是双链的且比单链反义寡聚物和miRNA更稳定，并且它们可以进一步进行化学修饰以增强稳定性。因此，本发明的RNA分子可以经由各种全身或局部递送途径递送到受试者内。在某些实施方案中，本发明的分子通过全身递送途径进行递送，包括静脉内(I.V.)和腹膜内(ip)。在其他实施方案中，本发明的分子通过局部递送途径进行递送，例如鼻内、玻璃体内、气管内、脑内、肌内、关节内和肿瘤内。

递送技术的例子包括裸RNA分子的直接注射、RNA分子与天然配体例如胆固醇或适体的缀合、脂质体制剂的递送、和与抗体-鱼精蛋白融合蛋白的非共价结合。其他载体选择包括带正电的载体(例如，阳离子脂质和聚合物)和各种蛋白质载体。在一个实施方案中，本发明分子的递送使用基于阳离子脂质体复合物或聚合物复合物系统的配体靶向递送系统(Woodle等人J Control Release 74：309-311；Song等人Nat Biotechnol.23(6)：709-717(2005)；Morrissey等人Nat Biotechnol.23(8)：1002-1007(2005))。

在一个实施方案中，本发明的分子用胶原载体例如atelocollagen进行配制，用于体内递送。已报告atelocollagen保护siRNA免遭RNA酶降解，并且使得能够持续释放(Minakuchi等人Nucleic Acids Res.32：e109(2004)；Takei等人Cancer Res.64：3365-3370(2004))。在另一个实施方案中，本发明的分子用纳米颗粒进行配制或形成纳米乳液，例如RGD肽配体靶向的纳米颗粒。已证实，不同的siRNA寡聚物可以组合在相同的RGD配体靶向纳米颗粒中，以同时靶向几种基因(Woodle等人Materials Today8(suppl 1)：34-41(2005))。

病毒载体也可以用于递送本发明的RNA分子。在一个实施方案中，慢病毒载体用于递送RNA分子转基因，该转基因可以整合到基因组内用于稳定表达。在另一个实施方案中，腺病毒和腺相关病毒(AAy)用于递送RNA分子转基因，该转基因不整合到基因组内并具有附加型表达。

此外，细菌可以用于递送本发明的RNA分子(Xiang等人，2006)。

5.药物组合物和制剂

本发明进一步提供药物组合物。该药物包括至少一种不对称双链体RNA分子作为活性剂和一种或多种载体，所述载体选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳液、脂质和类脂。在一个实施方案中，组合物用于诊断应用或用于治疗应用。

本发明的药物组合物和制剂，除RNA成分外，可以与针对siRNA、miRNA和反义RNA开发的药物组合物和制剂相同或相似(de Fougerolles等人，2007；Kim和Rossi，2007)。这些药物组合物和制剂中的siRNA、miRNA和反义RNA可以由本发明的双链体RNA分子替换。药物组合物和制剂还可以进一步修饰，以适应本发明的双链体RNA分子。

所公开的双链体RNA分子的“药学上可接受的盐”或“盐”是所公开的双链体RNA分子的产物，其包含离子键，并且一般通过使所公开的双链体RNA分子与酸或碱反应而产生，且适于施用给受试者。药学上可接受的盐可以包括但不限于，酸加成盐，包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐；碱金属阳离子，例如Na、K、Li，碱土金属盐，例如Mg或Ca，或有机胺盐。

“药物组合物”是以适于施用给受试者的形式包含所公开的双链体RNA分子的制剂。在一个实施方案中，药物组合物是散装或单位剂型。单位剂型可以是各种形式，包括例如胶囊、IV袋、片剂、气雾剂吸入器上的单泵、或小瓶。在单位剂量组合物中活性成分(例如所公开的双链体RNA分子或其盐的制剂)量是有效量，可以根据所涉及的具体治疗而改变。本领 域技术人员将明了依赖于患者的年龄和状况，有时必须对剂量进行常规的改变。剂量还取决于施用途径。可以考虑各种途径，包括经口、肺、直肠、肠胃外、经皮、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内等。用于本发明双链体RNA分子的局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。在一个实施方案中，活性双链体RNA分子在无菌条件下与药学上可接受的载体，以及需要的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。

本发明提供治疗方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物经由选自iv、sc、局部、po和ip的途径进行施用。在另一个实施方案中，有效量是1ng至1g/天、100ng至1g/天、或1μg至1mg/天。

本发明还提供药物制剂，其包括与至少一种药学上可接受的赋形剂或载体组合的本发明双链体RNA分子。如本文所使用的，“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”意欲包括与药学施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适载体在“Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，”Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA.中描述，其引入本文作为参考。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒介物，例如不挥发性油。此种介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域众所周知的。除非任何方便的介质或试剂与活性双链体RNA分子不相容，否则考虑其在组合物中的使用。增补性活性双链体RNA分子也可以掺入组合物内。

用于配制的方法公开于PCT国际申请PCT/US02/24262(WO03/011224)、美国专利申请公开号2003/0091639和美国专利申请公开号2004/0071775中，所述专利申请各自引入本文作为参考。

本发明的双链体RNA分子可以以通过下述方式制备的合适剂型进行施用：根据常规工艺(即，通过产生本发明的药物组合物)，将治疗有效量(例 如，足以通过抑制肿瘤生长、杀死肿瘤细胞、治疗或预防细胞增生性病症等达到所需疗效的有效水平)的本发明双链体RNA分子(作为活性成分)与标准药学载体或稀释剂混合。这些工艺可以酌情地包括混合、粒化和压片或溶解成分以获得所需制剂。在另一个实施方案中，治疗有效量的本发明双链体RNA分子在不合标准药学载体或稀释剂的合适剂型中施用。

药学上可接受的载体包括固体载体，例如乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域已知的时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独地或连同蜡、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等。其他填充剂、赋形剂、调味剂和其他添加剂，例如本领域已知的那些，也可以包括在本发明的药物组合物中。

包含本发明的活性双链体RNA分子的药物组合物可以以一般已知的方式进行制造，例如借助于常规混合、溶解、粒化、锭剂制造、研末、乳化、封装、截留或冻干工艺。药物组合物可以使用一种或多种生理可接受的载体，包括赋形剂和/或辅助剂，以常规方式配制，所述载体可以促进活性双链体RNA分子加工成可以药学使用的制剂。当然，合适制剂依赖于所选择的施用途径。

本发明的双链体RNA分子或药物组合物可以通过目前用于化学治疗的许多熟知方法施用给受试者。例如，对于癌症的治疗，本发明的双链体RNA分子可以直接注射到肿瘤内、注射到血流内或体腔内或口服或用贴剂通过皮肤应用。对于银屑病的治疗，全身施用(例如经口施用)或局部施用于受累的皮肤区域是优选的施用途径。所选择的剂量应足以构成有效治疗，但又不高至引起无法接受的副作用。在治疗过程中和治疗后的一段合理时期应紧密监视疾病(例如癌症、银屑病等)的状况和患者的健康。

实施例

下文提供了实施例以进一步举例说明本发明的不同特征。这些实施例 还举例说明对于实践本发明有用的方法。这些实施例对请求保护的本发明不构成限制。

RNA干扰(RNAi)是真核生物中催化性的基因特异性沉默机制，具有对生物学和医学具有深远的意义(Fire等人，1998)，12。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)(Hammond等人，2000；Martinez和Tuschl，2004；Rana，2007)在掺入具有3′突出端的19-21个碱基对(bp)的小干扰RNA(siRNA)后介导，所述siRNA是已知进入RISC内且介导RNAi的最小RNA双链体(Elbashir等人，2001a；Elbashir等人，2001b；Elbashir等人，2001c；Fire等人，1998；Zamore等人，2000)。作为RISC酶复合物的天然底物，siRNA可以化学合成或通过Dicer催化加工其各种前体而产生(Donze和Picard，2002；Hammond等人，2000；Kim等人，2005；Paddison等人，2002)。尽管广泛用于基因沉默，但siRNA的基因沉默效力有限，对于哺乳动物细胞中的众多基因具有低沉默功效(de Fougerolles等人，2007；Iorns等人，2007)。在此我们研究了在哺乳动物细胞中有效RNAi介体的结构支架需求。令我们惊讶的是，我们发现具有双反义突出端的14-15bp不对称RNA双链体在哺乳动物细胞中可以介导有力和有效的基因沉默。结构特征在于具有3′和5′反义突出端的14-15bp双链体RNA的该不对称干扰RNA(aiRNA)，比siRNA更高效地掺入RISC内。该aiRNA在哺乳动物细胞中引起序列特异性的mRNA切割和靶向的基因沉默。当靶向β-联蛋白mRNA的相同序列时，aiRNA在体外介导基因沉默方面比siPNA更有效(接近100％)、有力(picoM)、快速开始(小于24小时)和持久(高达1周)。这些结果说明，aiRNA是掺入RISC中的最小RNA双链体支架并且是在哺乳动物细胞中比siRNA更有效地沉默基因的非siRNA型RNAi介体。因此，aiRNA可以具有显著的广泛RNAi应用潜力。

方法与材料

细胞培养和试剂

Hela、SW480、DLD1、HT29和H1299细胞得自ATCC，并且在包 含10％胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)中培养。新鲜的外周血单核细胞(PBMC)得自AllCells LLC，并且维持在包含10％FBS和pen/strep(Invitrogen)的RPMI-1640培养基中。本研究中描述的小RNA由Dharmacon、Qiagen或Integrated DNA technologies合成(表2)，并且根据制造商的说明书进行退火(图3a)。靶向人Ago2和Dicer的siRNA(Ambion)以100nM使用。使用DharmaFECT1(Dharmacon)以所示浓度执行RNA的转染。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染人Argonaute2(Ago2)表达载体(OriGene)。通过使aiRNA或siRNA双链体与10％人血清(Sigma)一起温育所示时间量，随后进行非变性TBE-丙烯酰凝胶电泳和溴化乙啶染色，测定血清稳定性。

RNA印迹分析

为了测定β-联蛋白的水平，在不同时间点用TRIZOL(Invitrogen)从siRNA或aiRNA转染的Hela细胞中提取总RNA。将20μg总细胞RNA加载到变性琼脂糖凝胶的各泳道。在电泳后，将RNA转移至Hybond-XLNylon膜(Amersham Biosciences)，UV交联，并且在80℃烘烤30分钟。使用Prime-It II Random Primer Labeling Kit(Stratagene)，由β-联蛋白cDNA片段(1-568nt)和肌动蛋白cDNA片段(1-500nt)，制备检测β-联蛋白和肌动蛋白mRNA的探针。为了分析小RNA RISC装载，在用pCMV-Ago2转染后48小时，将siRNA或aiRNA转染到Hela细胞内。细胞在所示时间点进行裂解，并且用Ago2抗体进行免疫沉淀。洗涤免疫沉淀物，通过TRIZOL提取从复合物中分离RNA，并且加载到15％TBE-Urea PAGE凝胶(Bio-Rad)上。在电泳后，将RNA转移至Hybond-XL Nylon膜。mirVanamiRNA Probe Kit(Ambion)用于产生5’³²P标记的RNA探针。反义探针(5’-GUAGCUGAUAUUGAUGGACUU-3’(SEQ ID NO：71))。有义探针(5’-UCCAUCAAU AUCAGC-3’(SEQ ID NO：72))

体外Ago2-RISC装载

aiRNA或siRNA有义和反义链使用T4激酶(Promega)进行³²P末端标记。末端标记的RNA通过苯酚/氯仿/异戊醇纯化，用EtOH沉淀，并重悬于水中。标记的RNA随后与所述的siRNA或aiRNA反义链退火。对于体外裂解物，Hela细胞用人Ago2表达载体转染24小时，并且基本上如所述的(Dignam等人，1983)产生S10裂解物。随后将5′有义链或反义链标记的双链体aiRNA或siRNA加入Ago2-S10裂解物中。在37℃温育5分钟后，如所述的免疫沉淀Ago2，在20％TBE-丙烯酰胺凝胶上分离Ago2-结合的(沉淀)和Ago2-未结合的(上清液)级分，用凝胶曝光胶片以检测有义链-Ago2结合。对于aiRNA和siRNA竞争实验，高达100倍的冷aiRNA和siRNA用于与32P标记的aiRNA或siRNA竞争装载至RISC。简言之，由转染了所述Ago2表达载体的Hela细胞产生S10裂解物。随后将标记的aiRNA或siRNA加入S10裂解物中，紧接着加入未标记的aiRNA或siRNA。使反应在37℃温育5分钟，并且如上所述进行加工。

qRT-PCR

在转染后所示时间点收获用所示aiRNA或siRNA转染的细胞。用TRIZOL分离RNA，并且使用TaqMan一步RT-PCR试剂和用于所示mRNA的引物探针组(Applied Biosystems)执行qRT-PCR。数据相对于对照转染细胞呈现，并且每个样品相对于肌动蛋白mRNA水平进行标准化。对于图14d中的实验，通过将Stat3cDNA(Origene)克隆到pcDNA3.1+或pcDNA3.1^-内的HindIII-Xh01位点，制备Stat3构建体。随后用Stat3正向或反向表达载体与aiSta3或siStat3共转染Hela细胞24小时。随后收获细胞，通过TRIZOL分离RNA，并且使用TaqMan一步RT-PCR试剂和用于Stat3或肌动蛋白的引物探针组(Applied Biosystems)执行qRT-PCR。使用Superscript One-Step RT-PCR试剂盒(Invitrogen)，以及Stat3正向(5’-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC-3’(SEQ ID NO：73))和Stat3反向(5’-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG-3’(SEQ ID NO：74))引物， 以及肌动蛋白正向(5’-CCATGGATGATGATATCGCC-3’(SEQ ID NO：75))和肌动蛋白反向(5’-TAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’(SEQ ID NO：76))引物，对相同RNA样品执行RT-PCR。

RT-PCR

使用TRIZOL制备总RNA，并且使用随机引物用ThermoscriptRT-PCR System(Invitrogen)合成cDNA。PCR使用Pfx聚合酶运行20个循环。引物：肌动蛋白-1，5’CCATGGATGATGATATCGCC-3’(SEQ IDNO：75)；肌动蛋白-2，5’-TAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’(SEQIDNO：76)；β-联蛋白-1，5’-GACAATGGCTACTCAAGCTG-3’(SEQ IDNO：77)；β-联蛋白-2，5’-CAGGTCAGTATCAAACCAGG-3’(SEQ IDNO：78)。

蛋白质印迹

细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤2次，并且在裂解缓冲液(50mMHEPES、pH 7.5、0.5％Nonidet P-40、150mM NaCl、1mM EDTA、1mMEGTA、1mM原钒酸钠、1mM二硫苏糖醇、1mM NaF、2mM苯甲基磺酰氟以及各10μg/ml的胃酶抑素、亮抑酶肽和抑肽酶)中裂解。通过SDS-PAGE分离20μg可溶蛋白质，并且转移至PVDF膜。在本研究中使用抗β-联蛋白、Nbs1、存活蛋白、p21、Rsk1、k-Ras、Stat3、PCNA、NQO1、肌动蛋白(Santa Cruz)、EF2、p70S6K、mTOR、PTEN(Cell SignalingTechnology)、Ago2(Wako)、Dicer(Novus)和Parp1(EMD Biosciences)的一抗。通过增强的化学发光(GE Biosciences)显现抗原-抗体复合物。

5’-RACE分析

无需任何先前加工，来自用非沉默aiRNA或aiRNA处理的Hela细胞的总RNA(5μg)与GeneRacer^TM  RNA  衔接子(Invitrogen，5’-CGACUGGAGCACGAG GACAC UGACAUGGACU GAAGGAG UAGAAA-3’(SEQ ID NO：79))连接。使用随机引物将连接的RNA逆转录成cDNA。为了检测切割产物，使用与RNA衔接子互补的引物(GeneRacerTM  5’Nested  Primer：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’(SEQ ID NO：80))和β-联蛋白特异性引物(GSP：5’-CGCATGATAGCGTGTCTGGAAGCTT-3’(SEQ ID NO：81))执行PCR。扩增片段在1.4％琼脂糖凝胶上分离，并且使用1-kb Plus DNALadder(Invitrogen)确定大小。通过DNA测序进一步验证特异性切割位点。

干扰素应答检测

对于图15a中的实验，使PBMC直接与100nM β-联蛋白siRNA或aiRNA一起温育。在16小时使用TRIZOL纯化总RNA，并且按制造商(System Biosciences)所述的通过RT-PCR测定响应干扰素的基因表达的水平。对于图15b中的实验，Hela细胞进行模拟转染或用100nM所示aiRNA或siRNA转染24小时。使用TRIZOL纯化总RNA，并且通过RT-PCR测定响应干扰素的基因表达的水平。对于微阵列分析，Hela细胞用100nMaiRNA或siRNA进行转染。在24小时使用TRIZOL纯化总RNA，并且根据制造商的方案(ExpressionAnalysis，Inc.)，RNA用于与Human GenomeU133Plus 2.0GeneChip(Affymetrix)杂交。来自DharmaFECT 1处理的细胞的RNA用作对照。为了计算转录物表达值，使用Microarray Suite 5.0以及分位数标化(quantile normalization)，在本研究中使用具有足够杂交信号而被称为存在(P)的转录物。

aiRNA和siRNA序列

aiRNA和siRNA双链体的序列和结构在表2中列出。在k-Ras aiRNA中框出了点突变的位置。

表2

In Life评估

还进行每只动物的健康状况的每日检查。每3天检查体重。根据实验室的动物饲养操作每天供应食物和水。产生＞20％致死率和/或＞20％净体重减轻的处理被视为毒性的。结果表示为平均肿瘤体积(mm³)±SE。P值＜0．05视为统计上相关的。

动物管理：

4-5周龄的雄性或雌性无胸腺裸鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA.)在研究开始前适应动物畜舍设施至少一周。所利用的所有实验方法与美国生理学会(American Physiology Society)所给出的指南 以及实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals)相符，并且也得到了波士顿生物医学公司(Boston Biomedical Inc.)研究所动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)的批准。动物4只一组关进木屑铺底的笼中，置于具有控制的温度(68°F-72°F)、光照(12小时光-暗周期)和湿度(45-55％)的房间。实验期间动物自由饮水摄食。

实施例1.不对称干扰RNA(aiRNA)在哺乳动物细胞中引起基因特异性沉默

siRNA结构支架被认为是掺入RISC和介导RNAi的必需构型(Elbashir等人，2001a；Elbashir等人，2001b；Elbashir等人，2001c；Rana，2007；Zamore等人，2000)。然而，关于RISC掺入和基因沉默对RNA双链体支架的要求却知之甚少。为了研究有效的RNAi介体和RISC底物所需的结构支架，我们首先测定比siRNA短的RNA双链体是否能够介导基因沉默。双链(ds)RNA的长度是决定其激活蛋白质激酶R(PKR)-介导的非特异性干扰素应答的倾向、增加的合成成本和递送问题的一个重要因素(Elbashir等人，2001b；Sledz等人，2003)。我们设计了靶向不同哺乳动物基因的一系列12至21bp短dsRNA，该短dsRNA具有2核苷酸3′突出端或平头末端。在长度减少到低于19bp后检测不到基因沉默(数据未显示)，这与在黑腹果蝇(Drosophila Melanogaster)细胞裂解物中的先前报告一致(Elbashir等人，2001b)，并与19-21bp是介导RNAi的最短siRNA双链体的观念一致(Elbashir等人，2001a；Elbashir等人，2001b；Elbashir等人，2001c；Rana，2007；Zamore等人，2000)。

接下来我们测试了具有不对称构型的突出端的非siRNA支架RNA双链体是否能够介导基因沉默。siRNA双链体包含对称的有义链和反义链。虽然包含3′突出端的双链体siRNA结构是掺入RISC复合物内所需的，但在Argonaute(Ago)介导的有义链切割后，由反义链指导靶mRNA的切割(Hammond等人，2001；Matranga等人，2005；Tabara等人，1999)。我 们寻求制备在反义链的3′和5′末端具有突出端的各种长度的不对称RNA双链体。

在退火后通过20％聚丙烯酰胺凝胶验证具有表3中所示序列的寡聚物。如图3A中所示，每个泳道按如下加样：泳道1，21nt/21nt；泳道2，12nt(a)/21nt；泳道3，12nt(b)/21nt；泳道4，13nt/13nt；泳道5，13nt/21nt；泳道6，14nt/14nt；泳道7，14nt(a)/21nt；泳道8，14nt(b)/21nt；泳道9，15nt/15nt；泳道10，15nt/21nt。

表3

HeLa细胞以200,000细胞/孔接种到6孔培养板内。如图3B中所示，24小时后，它们用scrambled siRNA(泳道1)、靶向E2F1的21-bp siRNA(泳道2，作为特异性的对照)或靶向β-联蛋白的21-bp siRNA(泳道3，作为阳性对照)、或相同浓度的不同长度混合的aiRNA：12nt(a)/21nt(泳道4)；12nt(b)/21nt(泳道5)；13nt/21nt(泳道6)；14nt(a)/21nt(泳道7)；14nt(b)/21nt(泳道8)；15nt/21nt(泳道9)，进行转染。在转染后48小时收获细胞。通过蛋白质印迹测定β-联蛋白的表达。E2F1和肌动蛋白用作对照。结果证实不对称干扰RNA(aiRNA)在哺乳动物细胞中引起基因特异性沉默。

为了确定在aiRNA功能中重要的aiRNA结构特征，基于对核心15/21双重反义突出端结构的修饰，我们产生了多种aiRNA寡核苷酸(表4)。在表4中概括的aiRNA包含修饰，包括但不限于，有义和反义链的长度、有义和反义突出端的程度、和RNA-DNA杂合寡核苷酸。

通过改变有义链、反义链或两者，对亲本15/21aiRNA结构进行了修饰(表4)。以50nM用经修饰的aiRNA双链体转染Hela细胞48小时。使用β-联蛋白和肌动蛋白的蛋白质印迹，检查与亲本15/21aiRNA和常规siRNA结构相比的基因沉默程度。还测试了包含双重有义链突出端的aiRNA修饰。这些寡核苷酸包含与不同长度反义链配对的21碱基有义链。此外，还检查了已用DNA碱基进行修饰的aiRNA寡核苷酸的活性。对反义和有义链均进行了DNA置换(表3)。所测试的RNA-DNA杂合寡核苷酸包含在有义或反义链中的1个或多个DNA置换，或包含与所示长度的DNA有义链配对的21碱基反义RNA。这各种aiRNA的基因沉默结果显示于图4和5中。

这些数据总的提供了关于aiRNA功能的结构线索。

就有义链而言，我们的数据指出15个碱基的长度工作良好，而14至19个碱基的长度保持功能。有义链可以匹配反义链的任何部分，条件是满足反义突出端规则。在有义链的5′或3′末端处单RNA碱基的DNA替换是耐受的，并且甚至可能提供增加的活性。

就反义链长度而言，21个碱基的长度工作良好，19-22个碱基保持活性，当长度降到低于19个碱基或增至超过22个碱基时，活性降低。反义链的3′末端要求1-5个碱基的突出端，其中2-3碱基突出端是优选的，平头末端显示活性的减少。与靶RNA序列的碱基配对是优选的，并且不超过3个碱基的DNA碱基替换在无同时的5′DNA碱基替换时是耐受的。反义链的5′末端优选0-4碱基突出端，并且不需要突出端以保持活性。反义链的5′末端可以耐受2个碱基不匹配靶RNA序列，并且在无同时的3′DNA碱基替换时可以耐受高达3个碱基的DNA碱基置换。

就错配或化学修饰的碱基而言，我们发现，对有义或反义链中的错配 和一个或多个化学修饰碱基，aiRNA结构均可以耐受。

表4：用于图4-5的aiRNA序列

 [0344]

在表4中，A、U、G和C表示核苷酸，而a、t、g和c表示脱氧核苷酸。

实施例2.由aiRNA触发的基因沉默的机制

为了研究由aiRNA诱导的基因敲低的机制，我们首先确定由aiRNA导致的基因沉默在翻译水平还是mRNA水平上发生。在用10nM 15bpaiRNA转染的细胞中进行β-联蛋白的RNA印迹分析，显示aiRNA在24小时内使mRNA水平减少超过95％，并且该减少持续4天以上(图6a)，提示aiRNA在mRNA水平上介导基因沉默。与siRNA相比，由aiRNA诱导的β-联蛋白mRNA减少实质性地更快速、更有效和持久(图6a)。我们进一步确定15bp aiRNA是否催化β-联蛋白mRNA的位点特异性切割。通过cDNA末端的快速扩增(5’-RACE)和PCR，就β-联蛋白mRNA切割片段的存在，检查从用15bp aiRNA转染的细胞中分离的总RNA(图6b)。在aiRNA转染后4和8小时检测到β-联蛋白切割片段(图6c)。序列分析显示切割在aiRNA靶序列内在相对于aiRNA反义链5′末端的碱基10和11之间发生(图6d)。在用scrambled aiRNA转染后未观察到此种切割片段(图6c)。这些结果证实aiRNA通过序列特异性切割靶mRNA而诱导强有力的有效基因沉默。

接下来我们确定该新的aiRNA不对称支架是否能够掺入RISC内。RNAi通过RISC酶复合物催化，其中Argonaute蛋白质(Ago)作为复合物的催化单位(Liu等人，2004；Matranga等人，2005)。为了确定aiRNA是否掺入Ago/RISC复合物内，在用aiRNA转染细胞后，自表达myc标签-Ago1的细胞免疫沉淀myc标签-人Ago1(Siolas等人，2005)。通过对Ago免疫沉淀物的RNA印迹，检测与RISC复合物结合的小RNA。RNA印迹分析揭示aiRNA以高效率进入RISC复合物内(图6e)。这些数据说明aiRNA的不对称支架可以有效掺入RISC内。

因为aiRNA诱导比siRNA更有效的基因沉默，所以我们测试aiRNA是否能够比siRNA更有效地产生RISC复合物。如图6e中所示，aiRNA-Ago2/RISC复合物比siRNA-Ago2/RISC复合物更快速且更有效地形成，其中在RISC复合物中包含的aiRNA比相应siRNA多(图6e和图 7A)。值得注意的是，siRNA表现出典型模式(21)，这与siRNA形成二级结构相一致(图6e和图7)。相反地，aiRNA表现出单条带，说明长度较短的aiRNA可以减少或消除伴随siRNA发生的二级结构形成。

此外，aiRNA的不对称构型可以促进具有反义链的活性RISC的形成，减少由有义链形成的无效RISC(参考文献16)。我们的数据证明确实如此(如图7B中所示)，在RISC复合物中不能检测出有义链。图8A还证实尽管aiRNA的反义链与Ago 2强烈结合，但有义链却不发生结合。相反地，siRNA的反义和有义链都与Ago 2结合。这些数据提示，aiRNA在细胞中具有比siRNA更高的RISC形成效率，这可解释aiRNA的优良基因沉默效率。

此外，已证实，为了具有功能，siRNA的有义链需要被切割。因此，我们测试了对于aiRNA是否存在相同需求。为此，用2’-O-甲基修饰在aiRNA有义链的位置8或9处的核苷酸，以使得其无法切割。结果显示，具有无法切割的有义链的aiRNA仍是有功能的(图8B)，说明aiRNA就其机制而言与siRNA非常不同。

进一步，我们调查了对于aiRNA和siRNA是否存在任何不同的装载口袋。使用冷aiRNA或siRNA与放射性标记的siRNA或aiRNA竞争RISC复合物(图9)。令人惊讶的是，结果显示，冷aiRNA不与siRNA竞争RISC复合物(图9B)，并且冷siRNA也不与aiRNA竞争RISC复合物(图9C)。这些数据指出aiRNA和siRNA可能装载至RISC复合物的不同口袋。

上面的数据总的说明，aiRNA是可以掺入RISC内的第一种非siRNA支架，由此提供了与RISC相互作用的新结构支架。aiRNA和siRNA的RISC装载差异在图10显示的模型中说明。简言之，因为不对称性质，仅反义链被选择保留在RISC复合物中，由此导致100％的链选择效率。相反地，siRNA在结构上是对称的。siRNA的反义链和有义链都有机会被选择保留在RISC复合物中，因此siRNA具有低效的链选择，并且同时由于有义链RISC复合物而可引起非特异性基因沉默。

实施例3.aiRNA介导比siRNA更快速、有力、有效且持久的基因沉默

为了比较aiRNA与siRNA的基因沉默性质，我们首先确定用于基因沉默的最佳aiRNA结构。

siRNA双链体包含对称的有义链和反义链。虽然包含3′突出端的双链体siRNA结构是掺入RISC复合物内所需的，但在Argonaute(Ago)介导的有义链切割后，靶mRNA的切割由反义链指导(Hammond等人，2001；Matranga等人，2005；Tabara等人，1999)。我们寻求制备在反义链的3′和5′末端处具有突出端的各种长度的不对称RNA双链体。设计了具有3′和5′反义突出端的12至15bp的一组不对称RNA双链体，以靶向β-联蛋白(图11A)，β-联蛋白是牵涉癌症和干细胞的一种内源基因(Clevers，2006)。具有标准构型的最佳化siRNA已被设计出来靶向β-联蛋白用于触发RNAi(Xiang等人，2006)。在由siRNA靶向的相同序列内设计针对β-联蛋白的所有aiRNA(图11A)。结果显示，用15bp aiRNA达到了最佳基因沉默(图11B)。因此，我们在后续实验中使用15bp aiRNA与21-mer siRNA双链体进行比较。

令人惊讶的是，发现aiRNA诱导对β-联蛋白蛋白质的有力和高效减少，同时不伤害非靶对照基因肌动蛋白(图11C)。

接下来，我们检查了由靶向β-联蛋白的aiRNA和siRNA介导的基因沉默的开始。所使用的aiRNA和siRNA的序列显示于图11A中。如图12中所示，aiRNA具有更快的开始(图12C和D)以及更佳的功效(图12B和D)。

还比较了aiRNA和siRNA对各种靶和多种人细胞系的基因沉默作用。在已经被siRNA以低效率靶向的相同序列(Rogoff等人、2004)处，设计aiRNA以靶向不同功能类型的基因，包括Stat3(图13b)、NQO1(图12d)、延伸因子2(EF2)(图13c)、Nbs1(图14b)、存活蛋白(图14b)、Parp1(图14b)、p21(图14b)、Rsk1(图14c)、PCNA(图14c)、p70S6K(图14c)、mTOR(图14c)和PTEN(图14c)以及β-联蛋白(图13a)。如图13和14中所示，aiRNA 在沉默Stat3、β-联蛋白、Rsk1、p70S6K、Nbs1、mTOR和EF2方面比siRNA更有效，在沉默NQO1、PCNA、存活蛋白、PTEN、Parp1和p21方面与siRNA一样有效。因为靶序列是基于针对siRNA的优化来选择的，所以可能地aiRNA的功效和效力可以通过针对aiRNA优化的靶位点而得到进一步增加。此外，我们的数据还显示aiRNA可以在多种细胞系，包括Hela(图13a)、H1299(图14a，左图)和Dld1(图14a，右图)，中比siRNA更有效地抗β-联蛋白。

总之，这些数据证实aiRNA在哺乳动物细胞中可以比siRNA更有效、有力、快速开始和持久地介导基因沉默。

实施例4.由aiRNA介导的基因沉默的特异性

接下来，我们研究了由aiRNA介导的基因沉默的特异性。首先分析靶向野生型k-Ras等位基因的aiRNA。DLD1细胞包含野生型k-Ras，而SW480细胞包含具有单碱基对置换的突变型k-Ras(图14d)。用靶向野生型k-Ras的aiRNA转染DLD1细胞显示出有效沉默，但在SW480细胞中未观察到突变型k-Ras的沉默。这些数据证实aiRNA介导等位基因特异性基因沉默。

干扰素样应答的激活是基因沉默的主要非特异性机制。siRNA用于基因沉默的一个主要原因是短于30bp的dsRNA在哺乳动物细胞中具有降低的激活干扰素样应答的能力(Bernstein等人，2001；Martinez和Tuschl，2004；Sledz等人，2003)。我们检查了aiRNA是否在哺乳动物细胞中显示出激活干扰素样应答的任何迹象。从转染了抗β-联蛋白的aiRNA的PBMC细胞和转染了抗EF2或存活蛋白的aiRNA的Hela细胞中收集RNA，通过RT-PCR分析干扰素诱导型基因。通过RT-PCR发现aiRNA转染显示出不增加所测试的任何干扰素诱导型基因，而靶mRNA的水平相对于对照转染细胞减少(图15a和b)。还执行微阵列分析，以比较由aiRNA和siRNA诱导的已知干扰素应答相关基因的表达改变。如图15c中所示，与siRNA比较，对于aiRNA观察到少得多的改变。

此外，如上所述，有义链-RISC复合物可以引起非特异性基因沉默。为了比较aiRNA和siRNA通过有义链-RISC复合物介导的非特异性基因沉默，用aiRNA或siRNA和表达Stat3(有义RNA)的质粒或表达反义Stat3(反义RNA)的质粒共转染细胞。在转染后24小时收获细胞并且收集RNA，通过定量实时PCR或RT-PCR测定Stat3有义或反义RNA(插入片段)的相对水平。结果显示，aiRNA对反义Stat3mRNA没有作用，而siRNA则有作用(图15d)。这个结果说明aiRNA完全消除了由有义链-RISC复合物介导的非期望的非特异性基因沉默。

总之，已证实，aiRNA是新一类的基因沉默诱导物、非siRNA型的最小的RISC底物结构支架、和RNAi介体(图15f)。我们的数据提示，aiRNA通过RISC——细胞RNAi机器——工作。在掺入RISC后，aiRNA介导在相对于aiRNA反义链5′末端的碱基10和11之间对mRNA的序列特异性切割。aiRNA的不对称构型可以比siRNA更有效地与RISC相互作用。与高RISC结合效率一致，aiRNA在介导针对本研究中测试的基因的基因特异性沉默方面比siRNA更有力、有效、快速开始和持久。尽管先前研究已提出Dicer在促进有效RISC形成中的作用，但我们的数据说明，aiRNA可以不依赖于Dicer介导的加工而以高效率导致活性RISC复合物。

这种新RNA双链体支架的关键特征是在3′和5′末端的反义突出端。12-15bp aiRNA是已知诱导RNAi的最短RNA双链体。尽管长dsRNA在秀丽线虫(C.elegans)和黑腹果蝇中触发有力的基因沉默，但在哺乳动物细胞中基因特异性沉默在使用siRNA双链体前是不可能的。由Dicer消化限定的siRNA支架的特征在于19-21bp链长度和3′突出端上的对称性(Bernstein等人，2001)，这已被视为是掺入RISC以介导RNAi所必需的结构。因此，对RNAi诱导物的优化努力一直集中于siRNA前体，其总是大于siRNA(Soutschek等人，2004；Zhang和Farwell，2007)。我们的数据提示，siRNA不是掺入RISC以介导RNAi的必需支架。不同长度的aiRNA显示出了一系列的基因沉默功效和RISC掺入效率，从而提供了理解RISC掺入和激活机制的独特机会。需要研究以进一步理解aiRNA在 RISC掺入和RNAi诱导中的结构-活性关系，这将有助于建立通过靶序列选择、长度、结构、化学组成和修饰来优化aiRNA用于各种RNAi应用的理论基础。

实施例5.aiRNA在体内比siRNA更有效

为了研究aiRNA在体内是否有效并且与siRNA比较，测试了aiRNA和siRNA在人结肠癌异种移植物模型中的作用。

人结肠癌是美国第二大癌症死亡原因。Wntβ-联蛋白信号途径受到紧密调节，并且在发育、组织稳态和再生中具有重要功能。Wnt/β-联蛋白信号的失调在各种人癌症中频繁出现。单独80％的结直肠癌就揭示出通过肿瘤抑制基因腺瘤性结肠息肉的失活或原癌基因β-联蛋白的突变而激活该途径。

已发现Wnt/β-联蛋白信号的激活对于不同组织癌症的起始和发展都是重要的。因此，Wnt/β-联蛋白信号的靶向抑制是用于治疗各种起源的癌症的合理和有希望的新方法。

在体外，通过核酶靶向，已证实β-联蛋白表达在人结肠癌SW480细胞中的减少和相关的细胞死亡诱导的减少，说明β-联蛋白表达对于体外的肿瘤生长是限速的。

将SW480人结肠癌细胞皮下接种到雌性无胸腺裸鼠(8x10⁶细胞/小鼠)内，并且允许形成可触摸肿瘤。在这个研究中，当肿瘤达到约120mm³时开始给药。动物每天静脉内(iv)给予0.6nmol PEI-复合的β-联蛋白siRNA、PEI-复合的β-联蛋白aiRNA、或作为阴性对照的PEI-复合的无关siRNA。动物接受总共10剂siRNA、aiRNA或对照。在处理过程中测量肿瘤。如图16中所示，用siRNA和aiRNA作为单一疗法以0.6nmol mg/kg进行的静脉内处理显著地抑制了肿瘤生长。siRNA的％T/C值经计算为48.8％，p值为0.0286。而用β-联蛋白-特异性aiRNA进行的处理导致了肿瘤生长有力得多的减少。％T/C值经计算为9.9％，p值为0.0024。无由于siRNA、aiRNA或对照的iv施用导致的体重显著改变。这些数据说明，通过PEI 复合全身性体内应用aiRNA以靶向β-联蛋白，提供了一种开发高效、特异且安全的药剂用于治疗应用于结肠癌患者的途径。

此外，我们还在HT29人结肠癌异种移植物模型中测试了aiRNA和siRNA的作用。将HT29人结肠癌细胞皮下接种到雌性无胸腺裸鼠(6x10⁶细胞/小鼠)内，并且允许形成可触摸肿瘤。在这个研究中，当肿瘤达到约200mm³时开始给药。动物每隔一天用0.6nmol PEI-复合的β-联蛋白siRNA、PEI-复合的β-联蛋白aiRNA、或作为阴性对照的PEI-复合的无关siRNA进行静脉内(iv)处理。动物接受总共8剂siRNA、aiRNA或对照。在处理中测量肿瘤。如图17中所示，用siRNA和aiRNA作为单一疗法以0.6nmol mg/kg进行的静脉内处理显著地抑制了肿瘤生长。siRNA的％T/C值经计算为78％，p值为0.21。再次，用β-联蛋白-特异性aiRNA的处理导致了肿瘤生长甚至更为有力的减少。％T/C值经计算为41％，p值为0.016。不存在由于siRNA、aiRNA或对照的iv施用导致的体重显著改变。这些数据再次说明，通过PEI复合全身性体内应用aiRNA靶向β-联蛋白，提供了一种开发高效、特异且安全的药剂用于治疗应用于结肠癌患者的途径。

总之，aiRNA可以显著改善广泛的RNAi应用。基于siRNA的治疗已遇到挑战，包括有限的功效、递送困难、干扰素样应答和制造成本(deFougerolles等人，2007；Iorns等人，2007；Rana，2007)。aiRNA的改善的功效、效力、持久性和更小的尺寸可以帮助或克服这些挑战，这是因为aiRNA更小并可能需要更少的材料用于其递送。因此，aiRNA代表了新的进入RISC的最小RNA双链体，其在哺乳动物细胞中比siRNA更有效、有力、更快开始作用和更持久地介导基因沉默，其对于基因功能研究和基于RNAi治疗中的广泛RNAi应用，具有显著的潜力。

其他实施方案在下述权利要求内。尽管已显示且描述了几个实施方案，但无需背离本发明的精神和范围即可进行各种修饰。

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Claims (17)

1.一种不对称干扰RNA双链体分子，其包括

-由19-23个核苷酸组成的反义链，其中该反义链包含3’突出端和5’突出端，其中3’突出端与靶RNA碱基配对，且其中5’突出端的至少一个核苷酸选自A、U或dT，

-由14-17个核苷酸组成的有义链，

其中所述有义链与所述反义链至少70％互补，

其中所述反义链与靶mRNA序列至少70％互补，

并且所述有义链与所述反义链形成14、15、16、或17个碱基对的双链区，

其中所述RNA双链体分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默。

2.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述有义链为15个核苷酸。

3.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述反义链为21个核苷酸。

4.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述反义链为21个核苷酸，其中所述有义链为15个核苷酸，且其中有义链与反义链形成15个核苷酸碱基对的双链区。

5.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述双链区的GC含量是30％-70％。

6.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。

7.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链和／或碱基经修饰的核糖核苷酸。

8.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链和／或碱基经修饰的核糖核苷酸，其中所述主链经修饰的核糖核苷酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。

9.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链和／或碱基经修饰的核糖核苷酸，其中所述主链经修饰的核糖核苷酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰，其中所述磷酸二酯键经修饰而包括氮或硫杂原子中的至少一种。

10.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是稀有碱基或经修饰的碱基。

11.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物包括肌苷或三苯甲基化碱基。

12.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2′-OH基团由选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN的基团替代，其中每个R独立地是C1-C6烷基、链烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。

13.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸。

14.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述反义链包括至少一个脱氧核苷酸。

15.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述反义链包括至少一个脱氧核苷酸，其中所述至少一个脱氧核苷酸在选自3′-突出端、5′-突出端和双链区的一个或多个区域中。

16.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述有义链包括至少一个脱氧核苷酸。

17.权利要求1的RNA双链体分子，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。