ES2872527T3 - miARN natural para controlar la expresión génica y uso del mismo - Google Patents

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Yasuhiko Yoshida
Shiori Kato
Tadaaki Ohgi
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Abstract

Un miARN de tipo natural, que es un ácido nucleico monocatenario que comprende la región X y la región Y, en el que el extremo 3' de dicha región X y el extremo 5' de dicha región Y están unidos mediante una región conectora de una estructura no nucleotídica, dicha región X comprende (a) una secuencia de cadena guía o (b) una secuencia de cadena pasajera de un miARN maduro, cuando la región X comprende (a), dicha región Y comprende una secuencia de cadena pasajera de dicho miARN maduro, cuando la región X comprende (b), dicha región Y comprende una secuencia de cadena guía de dicho miARN maduro, dicha región X comprende además una secuencia adicional, en la que la longitud de dicha secuencia adicional es de 3 a 5 bases, y dicha secuencia de la cadena guía y dicha secuencia de cadenas pasajeras forman una estructura de doble cadena.

Description

DESCRIPCIÓN
miARN natural para controlar la expresión génica y uso del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un miARN de tipo natural que inhibe la expresión génica, y a su uso.
Antecedentes
Se conoce como microARN (miARN) a una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión génica y que, según se ha dado a conocer, inhibe la transcripción de una proteína codificada por un gen a través de, por ejemplo, el siguiente proceso de producción. Es decir, se produce en el núcleo un producto de transcripción de miARN (PrimiARN) que tiene una estructura de caperuza en el extremo 5' y poli (A) en el extremo 3'. El Pri-miARN antes mencionado es escindido por RNase (Drosha) para producir un precursor de miARN (Pre-miARN). El Pre-miARN antes mencionado forma una estructura de horquilla que tiene una región de bucle y una región de tallo. El pre-miARN sale del núcleo y es degradado por la RNase (Dicer) en el citoplasma, y se escinde un miARN bicatenario (miARN maduro) que tiene un saliente de 1 -4 bases en el extremo 3 '. Una de las cadenas del miARN bicatenario se llama cadena guía y la otra cadena se llama cadena pasajera, y la cadena guía antes mencionada está unida a un complejo similar al Complejo Silenciador Inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés). Este complejo miARN/RISC se une a la región no traducida 3' (3'UTR) de un ARNm particular para inhibir la traducción de la proteína a partir del ARNm antes mencionado.
Se ha dilucidado que el miARN está profundamente involucrado en fenómenos vitales como la diferenciación, proliferación celular, apoptosis y similares, y en muchas enfermedades como las infecciones virales, el cáncer y similares (documento de patente 1, documento no de patente 1, documento no de patente 2). De ahí su aplicación en, particularmente, el campo médico.
El documento de patente 2 describe una molécula de ARN monocatenario que tiene un esqueleto alicíclico que contiene nitrógeno.
El documento de patente 3 describe la modificación química de ARN en horquilla pequeños para la inhibición de la expresión génica.
El documento de patente 4 describe una molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene un esqueleto de aminoácidos.
El documento de patente 5 describe una molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene un esqueleto peptídico. El documento de patente 6 describe una molécula de ácido nucleico monocatenario para regular la expresión de un gen.
El documento de patente 7 describe un inhibidor de micro-ARN.
El documento de patente 8 describe métodos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN. El documento no de patente 3 describe que la administración sistémica de miméticos de microARN supresores de tumores usando una emulsión de lípidos neutrales inhibe los tumores pulmonares en ratones.
[Lista de documentos]
[Documentos de patentes]
documento de patente 1: WO 2010/056737 A2
documento de patente 2: EP 2436767 A1
documento de patente 3: WO 2011008730 A2
documento de patente 4: EP 2801617 A1
documento de patente 5: JP 2013153736 A
documento de patente 6: WO 2013077446 A1
documento de patente 7: WO 2013133221 A1
documento de patente 8: WO 2006137941 A2
[Documentos no de patentes]
documento no de patente 1: Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60
documento no de patente 2: Takeshita y col., 2010, Mol. Ther., 18, 181 -187
documento no de patente 3: Phong Trang y col., 2011, Mol. Ther., 19 (6), 1116-1122
Compendio de la invención
[Problemas que plantea la invención]
Para la aplicación del miARN antes mencionado, se encuentra disponible, por ejemplo, un método que incluye el uso de un miARN maduro de doble cadena o pre-miARN, y similares. Sin embargo, el primero requiere, antes de la aplicación, la hibridación de dos moléculas de ácido nucleico monocatenario, lo que produce la posibilidad de desarrollar autoinmunidad por TLR3 y similares que reconocen la doble cadena. Por otro lado, en el último caso, un gran número de nucleótidos hace que la síntesis no sea fácil, es desventajosa en términos de coste y también plantea problemas de transferibilidad intracelular y farmacocinética.
Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un miARN de tipo natural que utiliza la estructura de un miARN maduro.
En la presente memoria, "un miARN de tipo natural" significa una molécula de ácido nucleico monocatenario que comprende una cadena guía y una cadena pasajera de un miARN maduro natural, y que tiene la misma calidad de actividad que un miARN maduro (es decir, actividad de inhibir la expresión del gen diana), y una parte distinta de la cadena guía y la cadena pasajera puede contener un elemento constituyente artificial.
[Medios para resolver los problemas]
Para lograr el objeto antes mencionado, el miARN de tipo natural de la presente invención es un ácido nucleico monocatenario que comprende una región X y una región Y, caracterizado porque el extremo 3' de la región X antes mencionada y el extremo 5' de la región Y antes mencionada están unidos a través de una región conectora de una estructura no nucleotídica,
la región X antes mencionada comprende (a) una secuencia de cadena guía o (b) una secuencia de cadena pasajera de un miARN maduro,
cuando la región X comprende (a), la región Y antes mencionada comprende una secuencia de cadena pasajera del miARN maduro antes mencionado,
cuando la región X comprende (b), la región Y antes mencionada comprende una secuencia de cadena guía del miARN maduro antes mencionado,
dicha región X comprende además una secuencia adicional, en la que la longitud de dicha secuencia adicional es de 3 a 5 bases, y
la secuencia de la cadena guía antes mencionada y la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada forman una estructura bicatenaria.
La composición de la presente invención es una composición para inhibir la expresión de un gen diana y, de forma característica, contiene el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención.
La composición de la presente invención es una composición farmacéutica que contiene característicamente el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención.
El método inhibidor de expresión de la presente invención es un método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana, que usa característicamente el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención.
El ácido nucleico monocatenario de la presente invención para uso en un método de tratamiento de una enfermedad es el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención, en el que la secuencia de la cadena guía antes mencionada en el miARN de tipo natural antes mencionado es una secuencia de cadena guía de un miARN maduro que inhibe la expresión de genes implicados en la enfermedad antes mencionada.
Efecto de la invención
El miARN de tipo natural de la presente invención se puede sintetizar fácilmente a bajo coste y puede inhibir la traducción de la proteína codificada por los genes mencionados anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un esquema que representa un miARN de tipo natural como se describe en el presente documento.
La Fig. 2 es un gráfico que
Figure imgf000004_0001
representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de AXL en el Ejemplo 1. La Fig. 3 es un gráfico que
Figure imgf000004_0002
representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de AXL en el Ejemplo 2. La Fig. 4 es un gráfico que
Figure imgf000004_0003
representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de AXL en el Ejemplo 3. La Fig. 5 es un gráfico que
Figure imgf000004_0004
representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de HMGA2 en el Ejemplo 4. La Fig. 6 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de COL1A1 en el Ejemplo 5.
La Fig. 7 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de AXL en el Ejemplo 6.
La figura 8 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de HMGA2 en el ejemplo 7.
La Fig. 9 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de COL1A1 en el Ejemplo 8.
La Fig. 10 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de AXL en el Ejemplo 9.
La Fig. 11 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de COL1A1 en el Ejemplo 10.
La Fig. 12 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de COL1A1 en el Ejemplo 11.
La Fig. 13 es un gráfico que representa los valores relativos de la cantidad de ARNm de COL1A1 en el Ejemplo 11.
Descripción de realizaciones
A menos que se especifique lo contrario, los términos usados en la presente memoria descriptiva significan lo que generalmente se entiende por ellos en la técnica.
(1) miARN de tipo natural
El miARN de tipo natural de la presente invención es, como se mencionó anteriormente, un ácido nucleico monocatenario que comprende la región X y la región Y, caracterizado porque
el extremo 3' de la región X antes mencionada y el extremo 5' de la región Y antes mencionada están unidos a través de una región conectora de una estructura no nucleotídica,
la región X antes mencionada comprende (a) una secuencia de cadena guía o (b) una secuencia de cadena pasajera de un miARN maduro,
cuando la región X comprende (a), la región Y antes mencionada comprende una secuencia de cadena pasajera del miARN maduro antes mencionado,
cuando la región X comprende (b), la región Y antes mencionada comprende una secuencia de cadena guía del miARN maduro antes mencionado,
dicha región X comprende además una secuencia adicional, en la que la longitud de dicha secuencia adicional es de
3 a 5 bases, y
la secuencia de la cadena guía antes mencionada y la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada forman una estructura de doble cadena.
No está necesariamente limitado si la región X antes mencionada contiene (a) una secuencia de cadena guía o (b) una secuencia de cadena pasajera. Preferiblemente, una secuencia de cadena guía y una secuencia de cadena pasajera están dispuestas en la misma dirección que el pre-miARN de origen natural (es decir, dirección 5 '^ 3' o dirección 3 '^ 5'). Cuando el pre-miARN de origen natural está compuesto de cadena guía - región de bucle - cadena pasajera en este orden desde la dirección 5', el miARN de tipo natural de la presente invención contiene preferiblemente una secuencia de cadena guía en la región X antes mencionada. Por el contrario, cuando el premiARN de origen natural está compuesto de cadena guía - región de bucle - cadena pasajera en este orden desde la dirección 3 ', el miARN de tipo natural de la presente invención contiene preferiblemente una secuencia de cadena pasajera en la región X antes mencionada.
En los ejemplos mencionados a continuación, miR-34a y let-7a contienen preferiblemente una secuencia de cadena guía en la región X antes mencionada, y miR-29b contiene preferiblemente una secuencia de cadena pasajera en la región X antes mencionada.
El miARN de tipo natural de la presente invención puede inhibir, por ejemplo, la expresión del gen diana. La inhibición
de la expresión significa, por ejemplo, la inhibición de la traducción del gen diana antes mencionado, es decir, la inhibición de la traducción de una proteína codificada por el gen diana antes mencionado, más particularmente, la inhibición de la traducción de la proteína mencionada a partir del ARNm del gen diana antes mencionado. La inhibición antes mencionada de la expresión del gen diana se puede verificar mediante, por ejemplo, una disminución en la cantidad de un producto de transcripción obtenido a partir del gen diana; una disminución en la actividad del producto de transcripción antes mencionado; una disminución en la cantidad de un producto de traducción generado a partir del gen diana antes mencionado; una disminución en la actividad del producto de traducción antes mencionado; o similar. Las proteínas mencionadas anteriormente pueden ser, por ejemplo, proteínas maduras, proteínas precursoras antes de ser sometidas a procesamiento o modificación postraduccional.
Dado que el miARN de tipo natural de la presente invención es una molécula de ácido nucleico monocatenario, no es necesaria la hibridación de dos cadenas simples a diferencia de los miARN maduros, y se puede producir a bajo coste. Además, dado que el miARN de tipo natural de la presente invención es una molécula de ácido nucleico monocatenario, puede evitar, por ejemplo, su reconocimiento por TLR3, RIG-I, MDA5 y similares implicados en la autoinmunidad.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, una secuencia de cadena guía y una secuencia de cadena pasajera se unen mediante una molécula conectora de estructura no nucleotídica. Por lo tanto, el miARN puede sintetizarse fácilmente y proporcionarse a bajo costo, y también es superior en farmacocinética y transferibilidad intracelular, comparado con una molécula de ácido nucleico monocatenario que comprende un pre-miARN que tiene un bucle de nucleótidos comparativamente largo.
En la figura 1 se representa un esquema de la relación de configuración entre la región X antes mencionada y la región Y antes mencionada en el miARN de tipo natural de la presente invención. La figura 1 representa un esquema y, por ejemplo, la longitud, forma y similares de cada región no están limitadas. El miARN de tipo natural de la presente invención tiene, como se representa en la Fig.1, la región X antes mencionada en el lado 5' y la región Y antes mencionada en el lado 3', y el extremo 3' de la región X antes mencionada. y el extremo 5' de la región Y antes mencionada están conectos a través de la región conectora (mostrada como "P" en la Figura) de una estructura no nucleotídica.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, la región X antes mencionada contiene una secuencia de cadena guía o una secuencia de cadena pasajera de cualquier miARN maduro. Cuando la región X antes mencionada contiene la secuencia de la cadena guía antes mencionada, la región Y mencionada contiene una secuencia de la cadena pasajera del miARN maduro antes mencionado, y cuando la región X antes mencionada contiene la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada, la región Y antes mencionada contiene una secuencia de la cadena guía. del miARN maduro antes mencionado, en donde la región X antes mencionada y la región Y antes mencionada están hibridadas intramolecularmente (lo que también se conoce como autohibridación) entre la secuencia de la cadena guía antes mencionada y la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada. Por consiguiente, el miARN de tipo natural de la presente invención forma una estructura bicatenaria en la región hibridada intramolecularmente antes mencionada.
El miARN de tipo natural de la presente invención es una molécula de ácido nucleico monocatenario lineal, en la que su extremo 5' y su extremo 3' están desconectados. Para mantener la desconexión entre ambos extremos, el extremo 5' del miARN de tipo natural de la presente invención es preferiblemente, por ejemplo, un grupo no fosfato.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, la región X antes mencionada contiene, como se mencionó anteriormente, una secuencia de cadena guía (una secuencia de cadena pasajera) de un miARN maduro. Por otro lado, la región Y antes mencionada contiene una secuencia de cadena pasajera (una secuencia de cadena guía) del miARN maduro antes mencionado. La secuencia de la cadena guía y una secuencia de la cadena pasajera de un miARN maduro están registradas, por ejemplo, en diversas bases de datos (por ejemplo, http://www.mirbase.org/, etc.). Por lo tanto, la región X antes mencionada y la región Y antes mencionada se pueden establecer basándose, por ejemplo, en la información de miARN maduros conocidos. La cadena guía del miARN maduro antes mencionado es una cadena, que se incorpora en una proteína Argonaute (Ago) del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y se une al ARNm de la diana, y la cadena pasajera del miARN maduro antes mencionado es un cadena complementaria a la cadena guía del miARN maduro, y finalmente separada del RISC. Generalmente, una cadena guía y una cadena pasajera de un miARN maduro no son completamente complementarias y cada una contiene de 1 a varias bases desapareadas.
En la siguiente explicación, se describe en detalle como ejemplo la región X antes mencionada que contiene la secuencia de la cadena guía antes mencionada . Los expertos en la técnica pueden comprender fácilmente, a partir de la siguiente descripción, la constitución del miARN de tipo natural de la presente invención en una realización en la que la región X antes mencionada contiene la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada.
La región X antes mencionada comprende la secuencia de la cadena guía antes mencionada y una secuencia adicional. La región X antes mencionada consta, por ejemplo, de la secuencia de cadena guía antes mencionada y la secuencia adicional antes mencionada, y la secuencia adicional antes mencionada está unida, por ejemplo, al extremo 3' de la secuencia de cadena guía antes mencionada.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, cuando la secuencia de la cadena guía antes mencionada y la secuencia pasajera antes mencionada están alineadas y el lado del extremo 3' de la cadena guía tiene un saliente, la región Y antes mencionada contiene una secuencia complementaria a la secuencia del saliente antes mencionado, en el lado del extremo 5' de la cadena pasajera antes mencionada. Además, cuando la región X antes mencionada y la región Y antes mencionada están alineadas, la región Y antes mencionada tiene una secuencia complementaria a la secuencia adicional de la región X antes mencionada. Cuando la secuencia adicional de la región X antes mencionada se une al extremo 3' de la secuencia de la cadena guía antes mencionada, la secuencia complementaria antes mencionada se une al extremo 5' de la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada. Si bien la secuencia complementaria antes mencionada puede no ser completamente complementaria siempre que pueda formar una estructura bicatenaria continua a una doble cadena de la secuencia de la cadena guía antes mencionada y la secuencia pasajera antes mencionada, es deseable que sea completamente complementaria. La región Y antes mencionada puede consistir solo en la secuencia pasajera antes mencionada y una secuencia complementaria a la secuencia adicional de la región X antes mencionada, y además puede tener un tramo saliente de bases no emparejadas con la región X antes mencionada. Es decir, en el miARN de tipo natural de la presente invención, cuando, por ejemplo, la región Y antes mencionada y la región X antes mencionada están alineadas, la región Y antes mencionada puede tener un tramo saliente de bases en el extremo 3'. Como se usa aquí, el tramo saliente de bases antes mencionado en la región Y es, por ejemplo, una base terminal más en [la región Y antes mencionada en comparación con la región X antes mencionada, cuando la región Y antes mencionada y la región X antes mencionada están alineadas. La longitud (O) del tramo saliente es, por ejemplo, como se representa en la siguiente fórmula.
longitud (O) del tramo saliente=[número de bases de longitud completa (Y) de la región Y]-[número bases de longitud completa (X) de la región X]
Dado que muchos miARN maduros tienen un tramo saliente no emparejado con una cadena guía, en el extremo 3' de la cadena pasajera, la adición adicional de un tramo saliente artificial al extremo 3' antes mencionado de la cadena pasajera es mayormente innecesaria en la región Y antes mencionada.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, la longitud de cada región no está particularmente limitada. Aunque a continuación se representan ejemplos de las condiciones, el miARN de tipo natural de la presente invención no está limitado por dicha descripción. En la presente invención, el intervalo numérico del número de bases engloba todos los números enteros positivos que se encuentran dentro del intervalo y, por ejemplo, "1 - 4 bases" significa todos los números de "1,2, 3, 4 bases" (lo mismo en adelante).
En la región X antes mencionada, la longitud de la secuencia de la cadena guía antes mencionada no está particularmente limitada y puede ser, por ejemplo, la longitud de una secuencia de la cadena guía de un miARN maduro referido. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen un límite inferior de 19 bases de longitud, 20 bases de longitud, y un límite superior de 25 bases de longitud, 24 bases de longitud, e intervalos de 19-25 bases de longitud, longitud de base 20 - 24.
La longitud de la secuencia adicional antes mencionada de la región X antes mencionada tiene un intervalo de 3 a 5 bases.
La secuencia de bases de la secuencia adicional antes mencionada en la región X antes mencionada no está particularmente limitada. Cuando la longitud de la secuencia adicional antes mencionada es de 3 bases de longitud, por ejemplo, se pueden mencionar UAA, UGG, UCC, CAA, CGG, CCC y similares. Cuando la longitud de la secuencia adicional antes mencionada es de 4 bases de longitud, por ejemplo, se pueden mencionar UAAU, UUAA, UUGG, UUUU y similares. Cuando la longitud de la secuencia adicional antes mencionada es de 5 bases de longitud, por ejemplo, se pueden mencionar UAAUU, UCCGG, UUUUU, UUUUA, UUUAU, UUAUU, UAUUU, UUUAA, UUAUA, UAUUA, UUAAU, UAUAU, UUAAA, UAUAA, UAAUA, UAAAU, UAAAA, UUUGG, AUUAA, AUUUU, CUUAA, CUUUU, GUUAA, GUUUU y similares. La secuencia de bases de la secuencia adicional antes mencionada y la secuencia de bases de la secuencia complementaria a la secuencia adicional mencionada es preferiblemente rica en AU.
La longitud de la región X antes mencionada no está particularmente limitada, el límite inferior es, por ejemplo, 19 bases de longitud, 21 bases de longitud, 23 bases de longitud, el límite superior es, por ejemplo, 35 bases de longitud, 30 bases de longitud, 28 bases de longitud, 26 bases de longitud, y el intervalo es, por ejemplo, 19 - 35 bases de longitud, 19 - 30 bases de longitud, 21 - 28 bases de longitud, 23 - 26 bases de longitud.
La longitud del tramo saliente antes mencionado en la región Y antes mencionada (cuando la propia cadena pasajera antes mencionada tiene un tramo saliente, la longitud lo incluye) no está particularmente limitada, y el límite inferior es, por ejemplo, 0 bases de longitud, 1 base de longitud, y el límite superior es, por ejemplo, 4 bases de longitud, 3 bases de longitud, y el intervalo es, por ejemplo, 0 - 4 bases de longitud, 1 - 3 bases de longitud, 2 bases de longitud.
La secuencia del tramo saliente antes mencionado no está particularmente limitada y es, por ejemplo, UU, CU, GC, UA, AA, CC, UG, CG, AU, TT y similares, a partir del lado 3'. El tramo saliente antes mencionado puede conferir resistencia a la ribonucleasa cuando es, por ejemplo, TT.
La longitud de la región Y antes mencionada no está particularmente limitada, y el límite inferior es, por ejemplo, 19 bases de longitud, 21 bases de longitud, 23 bases de longitud, y el límite superior es, por ejemplo, 37 bases de longitud, 32 bases de longitud, 30 longitud de la base, 28 longitud de la base y el intervalo es, por ejemplo, 19 - 37 longitud de la base, 19 - 32 longitud de la base, 21 - 37 longitud de la base, 21 - 30 longitud de la base, 23 - 28 longitud de la base.
La longitud completa (T) del miARN de tipo natural de la presente invención no está particularmente limitada, y el límite inferior es, por ejemplo, 38 bases de longitud, 42 bases de longitud, 46 bases de longitud, el límite superior es, por ejemplo, 72 bases de longitud, 62 bases de longitud, 58 bases de longitud, 54 bases de longitud, y el intervalo es, por ejemplo, 38-72 bases de longitud, 40-68 bases de longitud, 38-62 bases de longitud, 42-58 bases de longitud, 46 - 54 bases de longitud.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, el tipo de miARN maduro antes mencionado no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con el tipo de gen diana.
Ejemplos de los miARN maduros mencionados anteriormente incluyen miARN maduros tales como hsa-miR-34a (número de acceso en miRBase MI0000268), hsa-let-7a (número de acceso en miRBase MI0000060), hsa-let-7f (número de acceso en miRBase MI0000067), hsa-miR-150 (número de acceso en miRBase MI0000479), hsa-miR-29b (número de acceso en miRBase MI0000105) y similares.
hsa-miR-34a (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU / CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU
hsa-let-7a (SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU/ CUAUACAAUCUACUGUCUUUC
hsa-let-7f (SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6)
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU/ CUAUACAAUCUAUUGCCUUCCC
hsa-miR-150 (SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8)
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG / CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG
hsa-miR-29b (SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 9)
GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA / UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
Aquí, cada secuencia de nucleótidos se describe en la dirección 5' ^ 3' en el orden de secuencia de la cadena guía / secuencia pasajera (secuencia de la cadena pasajera / secuencia de la cadena guía solo para hsa-miR-29b).
La cadena guía de las dianas de miR-34a, por ejemplo, AXL, MET, CDK4, CDK6, SIRT1, CCND1, SIRT1, BCL-2 y similares, y la inhibición de la expresión de estos genes diana pueden prevenir o tratar enfermedades como cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de mama y similares.
La cadena guía de las dianas let-7a, por ejemplo, HMGA2 (grupo de alta movilidad AT-hook 2), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4 y similares, y la inhibición de la expresión de estos genes diana pueden prevenir o tratar enfermedades tales como cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de mama y similares.
La cadena guía de las dianas let-7f, por ejemplo, HMGA2 (grupo de alta movilidad AT-hook 2), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4 y similares, y la inhibición de la expresión de estos genes objetivo pueden prevenir o tratar enfermedades tales como cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de mama y similares.
La cadena guía de las dianas miR-150, por ejemplo, COL1A1, COL4A4, SMAD2, SP1 y similares, y la inhibición de la expresión de estos genes diana pueden prevenir o tratar enfermedades tales como fibrosis pulmonar, fibrosis hepática y similares.
La cadena guía de las dianas miR-29b, por ejemplo, COL1A1, MCL1, DNMT3A, DNMT3B, TCL1A, TGFb3 y similares, y la inhibición de la expresión de estos genes diana pueden prevenir o tratar enfermedades como el cáncer de pulmón, el cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de mama, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática y similares.
Las unidades de constitución del miARN de tipo natural de la presente invención no están particularmente limitadas. Los ejemplos de ellas incluyen restos de nucleótidos. Los ejemplos de los restos de nucleótidos mencionados anteriormente incluyen un resto de ribonucleótido y un resto de desoxirribonucleótido. En el miARN de tipo natural de la presente invención, el resto de nucleótido antes mencionado es preferiblemente, por ejemplo, un resto de ribonucleótido. El resto de nucleótido antes mencionado puede ser, por ejemplo, uno que no está modificado (resto de nucleótido no modificado) o uno que se ha modificado (resto de nucleótido modificado). Configurando el miARN de tipo natural de la presente invención para incluir el resto de nucleótido modificado, antes mencionado, por ejemplo, se puede mejorar la resistencia del miARN de tipo natural a la nucleasa, permitiendo así mejorar la estabilidad del miARN de tipo natural. Además, el miARN de tipo natural de la presente invención puede incluir además, por ejemplo, un resto no nucleotídico además del resto nucleotídico antes mencionado.
Cuando el miARN de tipo natural incluye, por ejemplo, el resto o los restos de ribonucleótidos modificados, antes mencionados, además de los restos de ribonucleótidos no modificados, antes mencionados, el número de restos de ribonucleótidos modificados, antes mencionados, no está particularmente limitado y es, por ejemplo, "de uno a varios", específicamente, por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 4, más preferiblemente 1 a 3, y lo más preferiblemente 1 o 2. El resto de ribonucleótido modificado, antes mencionado, en contraste con el resto de ribonucleótido no modificado, antes mencionado, puede ser, por ejemplo, el resto de desoxirribonucleótido antes mencionado obtenido sustituyendo un resto de ribosa por un resto de desoxirribosa. Cuando el miARN de tipo natural de la presente invención incluye, por ejemplo, el(los) resto(s) de desoxirribonucleótido antes mencionado(s) además del resto(s) de ribonucleótido no modificado antes mencionado, el número de resto(s) de desoxirribonucleótido antes mencionado no está particularmente limitado, y es, por ejemplo, "uno a varios", específicamente, por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 4, más preferiblemente 1 a 3 y lo más preferiblemente 1 o 2.
El resto de nucleótido antes mencionado incluye, por ejemplo, un azúcar, una base y un fosfato como sus componentes. El resto de ribonucleótido antes mencionado tiene, por ejemplo, un resto de ribosa como azúcar; y adenina (A), guanina (G), citosina (C) o uracilo (U) como base. El resto de desoxirribosa antes mencionado tiene, por ejemplo, un resto de desoxirribosa como azúcar; y adenina (A), guanina (G), citosina (C) o timina (T) como base.
Los componentes antes mencionados del resto de nucleótido no modificado antes mencionado son los mismos o sustancialmente los mismos que, por ejemplo, los componentes de un resto de nucleótido de origen natural. Específicamente, por ejemplo, los componentes son los mismos o sustancialmente los mismos que los componentes de un resto de nucleótido que se encuentra naturalmente en un cuerpo humano.
Por ejemplo, el resto de nucleótido modificado, antes mencionado, puede ser tal que cualquiera de los componentes del resto de nucleótido no modificado, antes mencionado, esté modificado. Los ejemplos del resto de nucleótido modificado, antes mencionado, incluyen restos de nucleótidos de origen natural y restos de nucleótidos modificados artificialmente.
El resto de nucleótido modificado, antes mencionado, puede ser, por ejemplo, un resto de una alternativa del nucleótido antes mencionado. Los ejemplos de la alternativa antes mencionada incluyen restos de monómero de ácido nucleico artificiales. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen PNA (ácido nucleico peptídico), LNA (ácido nucleico bloqueado) y ENA (ácidos nucleicos con puente de etileno 2'-O, 4'-C).
En el resto de nucleótido antes mencionado, la base antes mencionada no está particularmente limitada. La base antes mencionada puede ser, por ejemplo, una base natural o una base no natural. La base antes mencionada puede ser, por ejemplo, una base de origen natural o una base sintética. Como base antes mencionada, por ejemplo, se puede usar una base común, un análogo modificado de la misma y similares.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, la región conectora de la estructura no nucleotídica antes mencionada contiene preferiblemente al menos un resto seleccionado del grupo que consiste en un resto de aminoácido, un resto de poliamina y un resto de ácido policarboxílico. La región conectora antes mencionada puede contener o no un resto distinto del resto de aminoácido, el resto de poliamina y el resto de ácido policarboxílico. Por ejemplo, la región conectora antes mencionada puede contener cualquiera de un resto de ácido policarboxílico, un resto de ácido tereftálico y un resto de aminoácido.
En la presente invención, la "poliamina" significa cualquier compuesto que contiene una pluralidad (dos, tres o más) de grupos amino. El "grupo amino" antes mencionado no se limita a un grupo -NH2 y también incluye un grupo imino (-NH-). En la presente invención, la poliamina antes mencionada no está particularmente limitada, y los ejemplos de la misma incluyen 1,4-diaminobenceno, 1,3-diaminobenceno, 1,2-diaminobenceno y similares. En la presente invención, además, "ácido policarboxílico" significa cualquier compuesto que contiene una pluralidad (dos, tres o más) de grupos carboxi. En la presente invención, el ácido policarboxílico antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen 1,4-dicarboxibenceno (ácido tereftálico), 1,3-dicarboxibenceno (ácido isoftálico), 1,2-dicarboxibenceno (ácido ftálico) y similares. En la presente invención, además, el "aminoácido" significa cualquier compuesto orgánico que contiene uno o más grupos amino y uno o más grupos carboxi en una molécula, como se menciona a continuación. El "grupo amino" antes mencionado no se limita a un grupo -NH2 y también incluye un grupo imino (-NH-).
En el miARN de tipo natural de la presente invención, el resto de aminoácido antes mencionado puede estar compuesto por una pluralidad de restos de aminoácidos interconectados. En la presente invención, el resto de aminoácido que es una pluralidad de restos de aminoácidos interconectados es, por ejemplo, un resto que contiene una estructura peptídica. Más específicamente, el resto de aminoácido antes mencionado que es una pluralidad de restos de aminoácido interconectados es, por ejemplo, un resto de aminoácido de la fórmula química (I) mencionada a continuación, en donde la fórmula química (Ia) mencionada a continuación es un péptido (por ejemplo, dímero de glicina o trímero de glicina, etc.).
En el miARN de tipo natural de la presente invención, el resto de aminoácido antes mencionado puede ser un resto de glicina, un resto de amida de ácido tereftálico, un resto de prolina o un resto de lisina. El resto de aminoácido antes mencionado puede ser un resto de aminoácido modificado o un derivado de aminoácido.
En el miARN de tipo natural de la presente invención, la región conectora antes mencionada está representada, por ejemplo, por la siguiente fórmula química (I-0).
Figure imgf000009_0001
en la fórmula química antes mencionada (I-0),
Q11 y Q12 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2 (un grupo metileno), NH (un grupo imino), C=O (un grupo carbonilo), C=S (un grupo tiocarbonilo), C=NH (un grupo iminometileno), O, o S,
Q1 y Q2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2 (un grupo metileno), NH (un grupo imino), C=O (un grupo carbonilo), C=S (un grupo tiocarbonilo), C=NH (un grupo iminometileno), O, o S,
Y1 y Y2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2, NH, O o S;
L1 es una cadena de alquileno que tiene n átomos de carbono, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido por OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH o SRa, o
L1 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en la cadena de alquileno antes mencionada por un átomo de oxígeno,
siempre que: cuando Y1 es NH, O, o S, un átomo unido a Y1 en L1 es carbono, un átomo unido a OR1 en L1 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
L2 es una cadena de alquileno que tiene m átomos de carbono, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido por OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRc, SH o SRc, o
L2 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en la cadena de alquileno antes mencionada por un átomo de oxígeno,
siempre que: cuando Y2 es NH, O, o S, un átomo unido a Y2 en L2 es carbono, un átomo unido a OR2 en L2 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
Ra, Rb, Rc y Rd son cada uno independientemente un sustituyente o un grupo protector;
m es un número entero en el intervalo de 0 a 30;
n es un número entero en el intervalo de 0 a 30;
cada una de las regiones X e Y mencionadas anteriormente está unida al resto conector antes mencionado a través de -OR1- u -OR2-, donde R1 y R2 pueden estar presentes o no, y cuando están presentes, R1 y R2 son cada uno independientemente un resto de nucleótido o la estructura antes mencionada (I-0); y
A es cualquier grupo atómico.
La combinación de las regiones (X) e (Y) mencionadas anteriormente con -OR1- y -OR2- no está particularmente limitada y puede ser, por ejemplo, cualquiera de las siguientes condiciones.
Condición (1):
las regiones (X) e (Y) mencionadas anteriormente están unidas a la estructura de la fórmula (I) antes mencionada a través de -OR2- y -OR1-, respectivamente.
Condición (2):
las regiones (X) e (Y) mencionadas anteriormente están unidas a la estructura de la fórmula (I) antes mencionada a través de -OR1- y -OR2-, respectivamente.
En la fórmula química antes mencionada (I-0), por ejemplo, Q11 puede ser C=O (un grupo carbonilo) y Q1 puede ser NH (un grupo imino). Además, por ejemplo, Q11 puede ser NH (un grupo imino) y Q1 puede ser C=O (un grupo carbonilo). Además, por ejemplo, Q12 puede ser C=O (un grupo carbonilo) y Q2 puede ser NH (un grupo imino). Además, por ejemplo, Q12 puede ser NH (un grupo imino) y Q2 puede ser C=O (un grupo carbonilo).
En la fórmula química antes mencionada (I-0), cada uno de Q11 y Q12 puede ser, por ejemplo, un grupo carbonilo. En este caso, cada uno de Q1 y Q2 es preferiblemente un grupo imino. Además, en este caso, la estructura de la siguiente fórmula química (la) está representada más preferiblemente por la siguiente fórmula química (Ia2).
Figure imgf000010_0001
( I a 2 )
En la fórmula química antes mencionada (Ia2),
R100 es cualquier sustituyente, que puede estar presente o no. Cuando está presente, puede estar presente individualmente o en pluralidad. Cuando está presente en pluralidad, pueden ser iguales o diferentes entre sí. Ejemplos de cualquier sustituyente para R100 antes mencionado incluyen los sustituyentes mencionados a continuación ejemplificados como los Ra, Rb, Rc y Rd. antes mencionados. Ejemplos más específicos de los mismos incluyen halógeno, hidroxi, alcoxi, amino, carboxi, sulfo, nitro, carbamoilo, sulfamoilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, aminoalquilo, sililo, sililoxialquilo, pirrolilo, imidazolilo y similares. La estructura de la fórmula química antes mencionada (Ia2) está representada más preferiblemente por la siguiente fórmula química (Ia3).
Figure imgf000010_0002
Cuando Q11 y Q12 son grupos carbonilo, y Q1 y Q2 son grupos imino, el resto conector de la fórmula química (I-0) antes mencionada puede ser un resto de amida de ácido carboxílico o un resto de ácido carboxílico. Por ejemplo, la estructura de "TPA" en el ejemplo mencionado a continuación puede ser un resto de tereftalamida o un resto de ácido tereftálico representado por la fórmula química (Ia3) antes mencionada.
En la fórmula química antes mencionada (I-0), cada uno de Q11 y Q12 puede ser un grupo imino. En este caso, cada uno de Q1 y Q2 es preferiblemente un grupo carbonilo. En este caso, la estructura de la siguiente fórmula química (Ip) está representada más preferiblemente por la siguiente fórmula química (I p2).
Figure imgf000011_0001
En la fórmula química antes mencionada (Ip2),
R100 es cualquier sustituyente, que puede estar presente o no. Cuando está presente, puede estar presente individualmente o en pluralidad. Cuando está presente en pluralidad, pueden ser iguales o diferentes entre sí. En concreto, por ejemplo, es lo mismo que R100 en la fórmula química antes mencionada (Ia2). Además, la estructura de la fórmula química antes mencionada (Ip2) está representada más preferiblemente por la siguiente fórmula química (Ip3).
En el miARN de tipo natural de la presente invención, cuando el resto conector antes mencionado es un resto de aminoácido, el resto de aminoácido antes mencionado está representado por, por ejemplo, la siguiente fórmula química (I). La estructura de la siguiente fórmula química (I) es un ejemplo de la estructura representada por la fórmula química (I-0) antes mencionada.
Figure imgf000011_0002
( I )
En la fórmula (I) antes mencionada, por ejemplo, X1, X2, Y1, Y2, L1 y y L2 son como se definen anteriormente.
La secuencia complementaria a la secuencia del microARN antes mencionado está unida cada una al resto de aminoácido antes mencionado a través de -OR1- o OR2-,
donde R1 y R2 pueden estar presentes o no, y cuando están presentes, R1 y R2 son cada uno independientemente un resto de nucleótido o la estructura (I) antes mencionada; y
A es cualquier grupo atómico, siempre que la siguiente fórmula química (Ia) sea un aminoácido o péptido.
Figure imgf000011_0003
El grupo atómico A en la fórmula química (I), (Ia) o (Ia) antes mencionada puede contener o no, por ejemplo, al mens uno seleccionado del grupo que consiste en grupo atómico de cadena, grupo atómico alicíclico, grupo atómico aromático, grupo atómico heteroaromático y grupo atómico heteroalicíclico. Aunque el grupo atómico de cadena antes mencionado no está particularmente limitado, se pueden mencionar, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, aminoalquilo, sililo, sililoxialquilo y similares. Si bien el grupo atómico alicíclico antes mencionado no está particularmente limitado, se pueden mencionar, por ejemplo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, ciclilalquilo y similares. Aunque el grupo atómico aromático antes mencionado no está particularmente limitado, por ejemplo, se pueden mencionar arilo, arilalquilo, alquilarilo, arilo de anillo condensado, arilalquilo de anillo condensado, alquilarilo de anillo condensado y similares. El grupo atómico heteroaromático antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen heteroarilo, heteroarilalquilo, alquilheteroarilo, heteroarilo de anillo condensado, heteroarilalquilo de anillo condensado, alquilheteroarilo de anillo condensado y similares. En el grupo atómico A en la fórmula química (I), (Ia) o (Ia) antes mencionada, cada uno de los grupos atómicos antes mencionados puede tener o no un sustituyente o un grupo protector. Cuando el sustituyente o grupo protector antes mencionado está en pluralidad, pueden ser iguales o diferentes. Los sustituyentes mencionados anteriormente son, por ejemplo, los ejemplificados para los Ra, Rb, Rc y Rd, antes mencionado, más específicamente, por ejemplo, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino, carboxi, sulfo, nitro, carbamoilo, sulfamoilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, sililo, sililoxialquilo, pirrolilo, imidazolilo y similares. Los grupos protectores antes mencionados son, por ejemplo, los mismos que los ejemplificados para los Ra, Rb, Rc y Rd antes mencionados.
En la presente invención, el "aminoácido" se refiere, como se mencionó anteriormente, a cualquier compuesto orgánico que contiene al menos un grupo amino y al menos un grupo carboxi en una molécula. El "grupo amino" antes mencionado no se limita a un grupo -NH2, y también incluye grupo imino (-NH-). Por ejemplo, prolina, hidroxiprolina y similares que no contienen un grupo -NH2 en una molécula pero que contienen un grupo imino (-NH-) se incluyen en la definición del "aminoácido" en la presente invención. En la presente invención, el "aminoácido" antes mencionado puede ser, como se menciona a continuación, un aminoácido natural o un aminoácido artificial. Por ejemplo, dado que un compuesto representado por la fórmula química (Ia2) o (Ia3) mencionada a continuación contiene un grupo amino y un grupo carboxi en una molécula, está incluido en la definición del "aminoácido" en la presente invención. Por lo tanto, por ejemplo, la fórmula química (I) antes mencionada en la que el grupo atómico A es una estructura mostrada por la fórmula química (A2) o la fórmula química (A2a) mencionadas a continuación se incluye en la definición de "resto de aminoácido" en la presente invención. Por ejemplo, la estructura de "TPA" en el Ejemplo mencionado a continuación también se incluye en la definición del "resto de aminoácido" en la presente invención. El "péptido" en la presente invención se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura en la que no menos de 2 moléculas de aminoácidos están unidas mediante un enlace peptídico. El enlace peptídico antes mencionado puede ser una estructura de amida de ácido o una estructura de imida de ácido. Cuando están presentes varios grupos amino en la molécula de aminoácido o péptido representada por la fórmula química (Ia) antes mencionada, el grupo amino que se representa claramente en la fórmula química (Ia) antes mencionada puede ser cualquier grupo amino. Además, cuando están presentes varios grupos carboxi en la molécula de aminoácido o péptido representada por la fórmula química (Ia) antes mencionada, el grupo carboxi claramente mostrado en la fórmula química (Ia) antes mencionada puede ser cualquier grupo carboxi.
En el resto de aminoácido antes mencionado del miARN de tipo natural de la presente invención, el aminoácido antes mencionado puede ser, como se mencionó anteriormente, un aminoácido natural o un aminoácido artificial. En la presente invención, el "aminoácido natural" se refiere a un aminoácido que tiene una estructura natural o un isómero óptico del mismo. El método de producción del aminoácido natural antes mencionado no está particularmente limitado y, por ejemplo, se puede extraer de la naturaleza o se puede sintetizar. En la presente invención, además, el "aminoácido artificial" se refiere a un aminoácido que tiene una estructura que no se encuentra en la naturaleza. Es decir, el aminoácido artificial antes mencionado es un aminoácido, es decir, un derivado de ácido carboxílico que contiene un grupo amino (compuesto orgánico que contiene al menos un grupo amino y al menos un grupo carboxi en una molécula) y que tiene una estructura que no se encuentra naturalmente. Preferiblemente, el aminoácido artificial antes mencionado no contiene, por ejemplo, un heterociclo. El aminoácido antes mencionado puede ser un aminoácido que constituya, por ejemplo, una proteína. El aminoácido antes mencionado puede ser, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en glicina, a-alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, glutamina, ácido glutámico, histidina, isoleucina, leucina, lisina, hidroxilisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, valina, prolina, 4-hidroxiprolina, triptófano, p-alanina, 1-amino-2-carxiciclopentano, ácido aminobenzoico, ácido aminopiridincarboxílico y aminoácido representado por la siguiente fórmula química (Ia2), y puede tener o no un sustituyente o un grupo protector. Los ejemplos del sustituyente antes mencionado incluyen los sustituyentes ejemplificados para los Ra, Rb, Rc y Rd antes mencionados. Más específicamente, por ejemplo, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino, carboxi, sulfo, nitro, carbamoílo, sulfamoílo, alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, hidroxialquilo, hidroxialquilo Se pueden mencionar aminoalquilo, sililo, sililoxialquilo, pirrolilo, imidazolilo y similares. El grupo protector antes mencionado es el mismo que, por ejemplo, los grupos protectores ejemplificados para el R antes mencionadoa, RB, RC y RD. Cuando el aminoácido de la fórmula química (Ia) antes mencionada, que no es péptido, contiene isómeros tales como isómero óptico, isómero geométrico, estereoisómero y similares, se puede usar cualquier isómero.
Figure imgf000013_0001
En la fórmula química antes mencionada (Ia2), R100 es un sustituyente opcional y puede estar presente o no. Cuando está presente, el número de los mismos puede ser uno o más y, cuando está presente en pluralidad, pueden ser iguales o diferentes. Ejemplos del sustituyente opcional antes mencionado para R100 incluyen los sustituyentes ejemplificados para los Ra, Rb, Rc y Rd antes mencionados, más específicamente, por ejemplo, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino, carboxi, sulfo, nitro, carbamoilo, sulfamoilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, sililo, sililoxialquilo, pirrolilo, imidazolilo y similares. La estructura de la fórmula química antes mencionada (Ia2) puede ser, por ejemplo, la siguiente fórmula química (Ia3).
Figure imgf000013_0002
Cuando la estructura de la fórmula química (Ia) antes mencionada es la fórmula (Ia2) antes mencionada, la estructura del grupo atómico A en la fórmula (I) antes mencionada está representada por la fórmula (A2) siguiente. R100 en la siguiente fórmula química (A2) es el mismo que en la fórmula química antes mencionada (Ia2). Cuando la estructura de la fórmula química (Ia) antes mencionada es la fórmula (Ia3) antes mencionada, la estructura del grupo atómico A en la fórmula (I) antes mencionada está representada por la fórmula (A2a) siguiente.
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La estructura de la fórmula química (I) antes mencionada es, por ejemplo, las siguientes fórmulas químicas (I-1) - (1­ 7), en las que n y m son los mismos que los de la fórmula química (I) antes mencionada.
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En las fórmulas químicas mencionadas anteriormente (I-1) -(I-7), n y m no están particularmente limitados, y son como se describió anteriormente. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen n=11 y m=12, o n=5 y m=4 en la fórmula química (I-1) antes mencionada, n=5 y m=4 en la fórmula química (I-4) antes mencionada, n=4 y m=4 en la fórmula química (I-6) antes mencionada, y n=5 y m=4 en la fórmula química (1-7) antes mencionada. Las estructuras de los mismos se representan en las siguientes fórmulas químicas (I-1 a), (I-1b), (I-4a), (I-6a) y (I-7a).
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En el miARN de tipo natural de la presente invención, la región conectora antes mencionada está representada, por ejemplo, por la siguiente fórmula (II):
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En la fórmula (II) antes mencionada, por ejemplo,
X1 y X2 son cada uno independientemente H2, O, S o NH;
Y1 y Y2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2, NH, O o S;
R3 es un átomo de hidrógeno o un sustituyente que está unido a C-3, C-4, C-5 o C-6 en el anillo A,
L1 es una cadena de alquileno que tiene n átomos, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido con OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRB, SH, o SRa, o,
L1 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en la cadena de alquileno antes mencionada con un átomo de oxígeno,
siempre que: cuando Y1 es NH, O o S, un átomo unido a Y1 en L1 es carbono, un átomo unido a OR1 en L1 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
L2 es una cadena de alquileno que tiene m átomos, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido con OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH o SRc, o
L2 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono de la cadena de alquileno antes mencionada por un átomo de oxígeno, siempre que: cuando Y2 es NH, O o S, un átomo unido a Y2 en L2 es carbono, un átomo unido a OR2 en L2 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
Ra, Rb, Rc y Rd son cada uno independientemente un sustituyente o un grupo protector;
l es 1 o 2;
m es un número entero en el intervalo de 0 a 30;
n es un número entero en el intervalo de 0 a 30; y
en el anillo A, un átomo de carbono distinto del C-2 antes mencionado en el anillo A puede estar sustituido por nitrógeno, oxígeno o azufre, y puede contener, en el anillo A antes mencionado, un doble enlace carbono-carbono o un doble carbono-nitrógeno,
cada una de las regiones (X) e (Y) mencionadas anteriormente está unida a la estructura no nucleotídica mencionada a través de -OR1- o -OR2-, donde R1 y R2 pueden estar presentes o no, y cuando están presentes, R1 y R2 son cada uno independientemente un resto de nucleótido o la estructura (II) antes mencionada.
En la fórmula (II) antes mencionada, por ejemplo, X1 y X2 son cada uno independientemente H2, O, S, o NH. En la fórmula (II) antes mencionada, "X1 es H2" significa que X1 forma CH2 (un grupo metileno) junto con un átomo de carbono al que X1 se une. Lo mismo se aplica a X2.
En la fórmula (II) antes mencionada, Y1 y Y2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2, NH, O, o S. En la fórmula (II) antes mencionada, l en el anillo A es 1 o 2. Cuando l=1, el anillo A es un anillo de 5 miembros, por ejemplo, el esqueleto de pirrolidina antes mencionado. El esqueleto de pirrolidina antes mencionado es, por ejemplo, esqueleto de prolina, esqueleto de prolinol o similares, y está ejemplificado por sus estructuras divalentes. Cuando l=2, el anillo A es un anillo de 6 miembros, por ejemplo, el esqueleto de piperidina antes mencionado. En el anillo A, un átomo de carbono distinto de C-2 en el anillo A puede estar sustituido por nitrógeno, oxígeno o azufre. El anillo A puede contener, en el anillo A, un doble enlace carbono-carbono o un doble enlace carbono-nitrógeno. El anillo A es, por ejemplo, tipo L o tipo D.
En la fórmula (II) antes mencionada, R3 es un átomo de hidrógeno o sustituyente unido a C-3, C-4, C-5 o C-6 en el anillo A. Cuando R3 es el sustituyente antes mencionado, sustituyente R3 puede ser uno o más, o puede estar ausente. Cuando R3 está presente en pluralidad, pueden ser iguales o diferentes.
El sustituyente R3 es, por ejemplo, halógeno, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4, grupo oxo (=O) y similares.
R4 y R5 son, por ejemplo, cada uno independientemente un sustituyente o un grupo protector, y pueden ser iguales o diferentes. Los ejemplos del sustituyente antes mencionado incluyen halógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, aminoalquilo, heterociclilalquenilo, heterociclilalquilo, heteroarilalquilo, sililo, sililoxialquilo y similares. Lo mismo se aplica a continuación. El sustituyente R3 puede seleccionarse entre los sustituyentes enumerados anteriormente.
El grupo protector antes mencionado es un grupo funcional que inactiva, por ejemplo, un grupo funcional altamente reactivo. Los ejemplos del grupo protector incluyen grupos protectores conocidos y similares, incluidos los descritos en J.F.W. McOmie, "Protecting Groups in Organic Chemistry", Prenum Press, Londres y Nueva York, 1973. El grupo protector antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen un grupo tercbutildimetilsililo (TBDMS), un grupo bis (2-acetoxietiloxi) metilo (ACE), un grupo triisopropilsililoximetilo (TOM), un grupo 1 -(2-cianoetoxi) etilo (CEE), un grupo 2-cianoetoximetilo (CEM), un grupo tolilsulfoniletoximetilo (TEM), un grupo dimetoxitritilo (DMTr) y similares. Cuando R3 es OR4, el grupo protector antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen un grupo TBDMS, un grupo ACE, un grupo TOM, un grupo CEE, un grupo CEM, un grupo TEM y similares. Otros ejemplos del grupo protector incluyen grupos que contienen sililo. Lo mismo se aplica a continuación.
En la fórmula (II) antes mencionada, L1 es una cadena de alquileno que tiene n átomos. Un átomo(s) de hidrógeno en el(los) átomo(s) de carbono de alquileno antes mencionados puede o no estar sustituido con, por ejemplo, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH o SRa. Alternativamente, L1 puede ser una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en la cadena de alquileno antes mencionada con un átomo de oxígeno. La cadena de poliéter antes mencionada es, por ejemplo, polietilenglicol. Cuando Y1 es NH, O o S, un átomo unido a Y1 en L1 es carbono, un átomo unido a OR1 en L1 es carbono, y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí. Es decir, por ejemplo, cuando Y1 es O, este átomo de oxígeno y el átomo de oxígeno en L1 no son adyacentes entre sí, y el átomo de oxígeno en OR1 y el átomo de oxígeno en L1 no son adyacentes entre sí.
En la fórmula (II) antes mencionalda, L2 es una cadena de alquileno que tiene m átomos. Un átomo(s) de hidrógeno en el(los) átomo(s) de carbono de alquileno antes mencionado puede o no estar sustituido con, por ejemplo, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH o SRc. Alternativamente, L2 puede ser una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en la cadena de alquileno antes mencionada por un átomo de oxígeno. Cuando Y2 es NH, O o S, un átomo unido a Y2 en L2 es carbono, un átomo unido a OR2 en L2 es carbono, y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí. Es decir, por ejemplo, cuando Y2 es O, este átomo de oxígeno y el átomo de oxígeno en L2 no son adyacentes entre sí, y el átomo de oxígeno en OR2 y el átomo de oxígeno en L2 no son adyacentes entre sí.
n de L1 y m de L2 no están particularmente limitados, y el límite inferior de cada uno de ellos puede ser 0, por ejemplo, y el límite superior de los mismos no está particularmente limitado. Por ejemplo, n y m se pueden establecer según sea apropiado dependiendo de la longitud deseada de la estructura no nucleotídica antes mencionada. Por ejemplo, desde el punto de vista del coste de fabricación, rendimiento y similares, n y m son cada uno preferiblemente de 0 a 30, más preferiblemente de 0 a 20, y aún más preferiblemente de 0 a 15. n y m pueden ser iguales (n=m) o diferentes. n m es, por ejemplo, de 0 a 30, preferiblemente de 0 a 20 y más preferiblemente de 0 a 15.
Por ejemplo, Ra, Rb, Rb y Rd son cada uno independientemente un sustituyente o un grupo protector. Los ejemplos del sustituyente antes mencionado y el grupo protector antes mencionado son los mismos que los anteriores.
En la fórmula (II) antes mencionada, cada átomo de hidrógeno puede estar sustituido independientemente con, por ejemplo, un halógeno tal como Cl, Br, F, I y similares.
La región X antes mencionada y la región Y antes mencionada están unidas cada una a la estructura no nucleotídica antes mencionada mediante, por ejemplo, -OR1- u OR2-. Aquí, R1 y R2 puede estar presente o no. Cuando R1 y R2 están presentes, R1 y R2 son cada uno independientemente un resto de nucleótido o la estructura representada por la fórmula (II) antes mencionada. Cuando R1 y/o R2 son cada uno independientemente un resto nucleotídico o la estructura representada por la fórmula (II) antes mencionada. Cuando R1 y/o R2 son(es) el resto nucleotídico antes mencionado, la estructura no nucleotídica antes mencionada está formada por, por ejemplo, el resto no nucleotídico antes mencionado que tiene la estructura de la fórmula (II) antes mencionada excluyendo el resto nucleotídico R1 y/o R2, y el resto o restos de nucleótidos mencionados anteriormente. Cuando R1 y/o R2 son(es) la estructura representada por la fórmula (II) antes mencionada, la estructura de la estructura no nucleotídica antes mencionada es tal que, por ejemplo, dos o más de los restos no nucleotídicos mencionados anteriormente que tienen la estructura de la fórmula (II) antes mencionada están conectados entre sí. El número de estructuras de la fórmula (II) antes mencionada puede ser, por ejemplo, 1,2, 3 o 4. Cuando la estructura mencionada incluye una pluralidad de las estructuras mencionadas, las estructuras de la (II) antes mencionada pueden estar unidas, por ejemplo, directamente o mediante el resto o restos de nucleótidos mencionados anteriormente. Por otro lado, cuando R1 y R2 no están presentes, la estructura no nucleotídica antes mencionada está formada por, por ejemplo, el resto no nucleotídico antes mencionado que tiene la estructura de la fórmula (II) antes mencionada solo.
La combinación de las regiones X e Y mencionadas anteriormente con -OR1- y -OR2- no está particularmente limitado y puede ser, por ejemplo, cualquiera de las siguientes condiciones:
condiciones (1)
las regiones X e Y mencionadas anteriormente están unidas a la estructura de la fórmula (II) antes mencionada a través de -OR2- y - OR1-, respectivamente;
condiciones (2)
las regiones X e Y mencionadas anteriormente están unidas a la estructura de la fórmula (II) antes mencionada a través de -OR1- y - OR2-, respectivamente.
Los ejemplos de la estructura de la fórmula (II) antes mencionada incluyen las estructuras de las siguientes fórmulas (II-1) a (II-9). En las siguientes fórmulas, n y m son los mismos que en la fórmula (II) antes mencionada. En las siguientes fórmulas, q es un número entero de 0 a 10.
En las fórmulas (II-1) a (II-9) mencionadas anteriormente, n, m y q no están particularmente limitadas y son como se describieron anteriormente. Un ejemplo específico de la misma es la fórmula (II-1) antes mencionada en la que n=8, la fórmula (II-2) antes mencionada en la que n=3, la fórmula (II-3) antes mencionada en la que n=4 u 8, la fórmula (II-4) donde n=7 u 8, la fórmula (II-5) antes mencionada donde n=3 y m=4, la fórmula (II-6) antes mencionada donde n=8 y m=4, la fórmula (II-7) antes mencionada donde n=8 y m=4, la fórmula (II-8) antes mencionada en la que n=5 y m=4, y la fórmula anteriormente mencionada (II-9) en la que q=1 y m=4. Una realización (n=8) de la fórmula (II-4) antes mencionada se representa en la siguiente fórmula (II-4a), y una realización (n=5, m=4) de la fórmula (II-8) antes mencionada se representa en la siguiente fórmula (II-8a).
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En la presente invención, el término "alquilo" abarca, por ejemplo, grupos alquilo de cadena lineal y ramificada. El número de átomos de carbono en el alquilo antes mencionado no está particularmente limitado y es, por ejemplo, de 1 a 30, preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4. Ejemplos del grupo alquilo antes mencionado incluyen: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo y n-decilo y similares . Entre ellos, por ejemplo, se prefieren metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo y similares.
En la presente invención, el término "alquenilo" abarca, por ejemplo, alquenilos de cadena lineal y ramificada. Los ejemplos del alquenilo antes mencionado incluyen los alquilos antes mencionados que tienen uno o más dobles enlaces y similares. El número de átomos de carbono en el alquenilo antes mencionado no está particularmente limitado y es, por ejemplo, el mismo que en el alquilo antes mencionado, preferiblemente de 2 a 8. Ejemplos del alquenilo antes mencionado incluyen vinilo, 1 -propenilo, 2-propenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1,3-butadienilo, 3-metil-2-butenilo y similares.
En la presente invención, el término "alquinilo" abarca, por ejemplo, alquinilos de cadena lineal y ramificada. Los ejemplos del alquinilo antes mencionado incluyen los alquilos mencionados anteriormente que tienen uno o más triples enlaces y similares. El número de átomos de carbono en el alquinilo antes mencionado no está particularmente limitado y es, por ejemplo, el mismo que en el alquilo antes mencionado, preferiblemente de 2 a 8. Los ejemplos del alquinilo antes mencionado incluyen etinilo, propinilo, butinilo y similares. El alquinilo antes mencionado puede incluir además, por ejemplo, uno o más dobles enlaces.
En la presente invención, el término "arilo" abarca, por ejemplo, grupos hidrocarbonados aromáticos monocíclicos y grupos hidrocarbonados aromáticos policíclicos. Los ejemplos del grupo hidrocarburo aromático monocíclico antes mencionado incluyen fenilo y similares. Ejemplos del grupo hidrocarbonado aromático policíclico antes mencionado incluyen 1 -naftilo, 2-naftilo, 1 -antrilo, 2-antrilo, 9-antrilo, 1 -fenantrilo, 2-fenantrilo, 3-fenantrilo, 4-fenantrilo, 9-fenantrilo y similares. Entre ellos, por ejemplo, se prefieren fenilo, naftilos tales como 1 -naftilo y 2-naftilo, y similares.
En la presente invención, el término "heteroarilo" abarca, por ejemplo, grupos heterocíclicos aromáticos monocíclicos y grupos heterocíclicos aromáticos condensados. Los ejemplos del heteroarilo antes mencionado incluyen furilos (p. ej., 2-furilo, 3-furilo), tienilos (p. ej., 2-tienilo, 3-tienilo), pirrolilos (p. ej., 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo), imidazolilos (p. ej., 1-imidazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo), pirazolilos (p. ej., 1 -pirazolilo, 3-pirazolilo, 4-pirazolilo), triazolilos (p. ej., 1,2,4-triazol-1-ilo, 1,2,4-triazol-3-ilo, 1,2,4-triazol-4-ilo), tetrazolilos (p. ej., 1 -tetrazolilo, 2-tetrazolilo, 5-tetrazolilo), oxazolilos (p. ej., 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo), isoxazolilos (p. ej., 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo), tiazolilos (p. ej., 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo), tiadiazolilos, isotiazolilos (p. ej., 3- isotiazolilo, 4-isotiazolilo, 5-isotiazolilo), piridilos (p. ej., 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo), piridazinilos (p. ej., 3-piridazinilo, 4-piridazinilo), pirimidinilos (p. ej., 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo), furazanilos (p. ej., 3-furazanilo), pirazinilos (p. ej., 2-pirazinilo), oxadiazolilos (p. ej., 1,3,4-oxadiazol-2-ilo), benzofurilos (p. ej., 2-benzo[b]furilo, 3-benzo[b]furilo, 4-benzo[b]furilo, 5 benzo[b]furilo, 6-benzo[b]furilo, 7-benzo[b]furilo), benzotienilos (p. ej., 2-benzo[b]tienilo, 3-benzo[b]tienilo, 4-benzo[b]tienilo, 5-benzo[b]tienilo, 6-benzo[b]tienilo, 7-benzo[b]tienilo), bencimidazolilos (p. ej., 1-bencimidazolilo, 2-bencimidazolilo, 4-bencimidazolilo, 5-bencimidazolilo), dibenzofurilos, benzoxazolilo, benzotiazolilo, quinoxalinilo (p. ej., 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 6-quinoxalinilo), cinolinilos, p. ej. cinolinilo, 5-cinolinilo, 6-cinolinilo, 7-cinolinilo, 8-cinolinilo), quinazolinilos (p. ej., 2-quinazolinilo, 4-quinazolinilo, 5-quinazolinilo, 6-quinazolinilo, 7-quinazolinilo, 8-quinazolinilo), quinolilos (p. ej., 2-quinolilo, 3-quinolilo, 4-quinolilo, 5-quinolilo, 6-quinolilo, 7-quinolilo, 8-quinolilo), ftalazinilos (p. ej., 1-ftalazinilo, 5-ftalazinilo, 6-ftalazinilo), isoquinolilos (p. ej., 1 -isoquinolilo, 3-isoquinolilo, 4-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 6-isoquinolilo, 7-isoquinolilo, 8-isoquinolilo), purilos, pteridinilos (p. ej., 2-pteridinilo, 4-pteridinilo, 6-pteridinilo, 7-pteridinilo), carbazolilos, fenantridinilos, acridinilos (p. ej., 1-acridinilo, 2-acridinilo, 3-acridinilo, 4-acridinilo, 9-acridinilo), indolilos (p. ej., 1 -indolilo, 2-indolilo, 3-indolilo, 4-indolilo, 5-indolilo, 6-indolilo, 7-indolilo), isoindolilos, fenazinilos (p. ej., 1 -fenazinilo, 2-fenazinilo) y fenotiazinilos (p. ej., 1 -fenotiazinilo, 2-fenotiazinilo, 3-fenotiazinilo, 4-fenotiazinilo) y similares.
En la presente invención, por ejemplo, el término "cicloalquilo" se refiere a grupos hidrocarbonados saturados cíclicos y el número de átomos de carbono en el cicloalquilo es, por ejemplo, de 3 a 15. Ejemplos del cicloalquilo antes mencionado incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, grupos hidrocarbonados cíclicos con puentes, grupos hidrocarburos espiro y similares. Entre ellos, se prefieren ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, grupos hidrocarbonados cíclicos con puentes y similares.
En la presente invención, los ejemplos de "grupos hidrocarbonados cíclicos con puentes" incluyen biciclo [2.1.0] pentilo, biciclo[2.2.1]heptilo, biciclo[2.2.2]octilo y biciclo[3.2.1]octilo, triciclo[2.2.1.0]heptilo, biciclo[3.3.1]nonano, 1-adamantilo, 2-adamantilo y similares.
En la presente invención, los ejemplos de "grupos hidrocarbonados espiro" incluyen espiro[3.4]octilo y similares.
En la presente invención, el término "cicloalquenilo" abarca, por ejemplo, grupos hidrocarbonados alifáticos cíclicos insaturados y el número de átomos de carbono en el cicloalquenilo es, por ejemplo, de 3 a 7. Ejemplos del cicloalquenilo antes mencionado incluyen ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y similares. Entre ellos, se prefieren ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo y similares. El término "cicloalquenilo" antes mencionado también abarca, por ejemplo, grupos hidrocarbonados cíclicos con puentes y grupos hidrocarburos espiro que tienen un enlace insaturado en sus anillos.
En la presente invención, los ejemplos del "arilalquilo" incluyen bencilo, 2-fenetilo, naftalenilmetilo y similares. Los ejemplos de "cicloalquilalquilo" y "ciclilalquilo" incluyen ciclohexilmetilo, adamantilmetilo y similares. Los ejemplos del "hidroxialquilo" incluyen hidroximetilo, 2-hidroxietilo y similares.
En la presente invención, el "alcoxi" abarca, por ejemplo, grupos compuestos por cualquiera de los alquilos y oxígeno (grupos alquil-O) antes mencionados y ejemplos de los mismos incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi y similares. Los ejemplos del "alcoxialquilo" incluyen metoximetilo y similares. Los ejemplos del "aminoalquilo" incluyen 2-aminoetilo y similares.
En la presente invención, los ejemplos del "heterociclilo" incluyen 1 -pirrolinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, 1 -pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo, 3-pirrolidinilo, pirrolidinona, 1 -imidazolinilo, 2-imidazolinilo, 4-imidazolinilo, 1 -imidazolidinilo, 2-imidazolidinilo, 4-imidazolidinilo, imidazolidinona, 1 -pirazolinilo, 3-pirazolinilo, 4-pirazolinilo, 1 -pirazolidinilo, 3-pirazolidinilo, 4-pirazolidinilo, piperidinona, piperidino, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo 4-piperidinilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo, piperazinona, 2-morfolinilo, 3-morfolinilo, morfolino, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo y similares.
En la presente invención, los ejemplos del "heterociclilalquilo" incluyen piperidinilmetilo, piperazinilmetilo y similares. Los ejemplos del "heterociclilalquenilo" incluyen 2-piperidiniletenilo y similares. Los ejemplos del "heteroarilalquilo" incluyen piridilmetilo, quinolin-3-ilmetilo y similares.
En la presente invención, el término "sililo" abarca grupos representados por la fórmula química RaSi-, donde R independientemente se puede seleccionar de los alquilos, arilos y cicloalquilos antes mencionados. Los ejemplos del sililo incluyen un grupo trimetilsililo, un grupo terc-butildimetilsililo y similares. Los ejemplos del "sililoxi" incluyen un grupo trimetilsililoxi y similares. Los ejemplos del "sililoxialquilo" incluyen trimetilsililoximetilo y similares.
En la presente invención, los ejemplos del "alquileno" incluyen metileno, etileno, propileno y similares.
En la presente invención, los diversos grupos descritos anteriormente pueden estar sustituidos. Los ejemplos del sustituyente antes mencionado incluyen hidroxi, carboxi, sulfo, halógeno, haluro de alquilo (haloalquilo, p. ej., CF3, CH2CF3, CFbCCh), nitro, nitroso, ciano, alquilo (p. ej., metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo), alquenilo (p. ej., vinilo), alquinilo (p. ej., etinilo), cicloalquilo (p. ej., ciclopropilo, adamantilo), cicloalquilalquilo (p. ej., ciclohexilmetilo, adamantilmetilo), cicloalquenilo (p. ej., ciclopropenilo), ciclilalquilo, hidroxialquilo (p. ej., hidroximetilo, hidroxietilo), alcoxialquilo (p. ej., metoximetilo, etoximetilo, etoxietilo), arilo (p. ej., fenilo, naftilo), alquilarilo (p. ej., p-metilfenilo), heteroarilo (p. ej., piridilo, furilo), heteroarilalquilo (p. ej., piridilmetilo), heterociclilo (p. ej., piperidilo), heterociclilalquenilo, heterociclilalquilo (p. ej., morfolilmetilo), alcoxi (p. ej., metoxi, propoxi, butoxi), alcoxi halogenado (p. ej., OCF3), alqueniloxi (p. ej., viniloxi, aliloxi), ariloxi (p. ej., feniloxi), alquiloxicarbonilo (p. ej., metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo), arilalquiloxi (p. ej., benciloxi), amino [alquilamino, (p. ej., etilamino, metilamino, dimetilamino), acilamino (p. ej., acetilamino, benzoilamino), arilalquilamino (p. ej., bencilamino, tritilamino), hidroxiamino], aminoalquilo (p. ej., aminometilo), alquilaminoalquilo (p. ej., dietilaminometilo), carbamoílo, sulfamoílo, oxo, sililo, sililoxialquilo y similares.
El miARN de tipo natural de la presente invención puede incluir, por ejemplo, una sustancia marcadora y puede estar marcado con la sustancia marcadora antes mencionada. La sustancia marcadora antes mencionada no está particularmente limitada y puede ser, por ejemplo, una sustancia fluorescente, un tinte, un isótopo o similares. Los ejemplos de la sustancia marcadora antes mencionada incluyen: fluoróforos tales como pireno, TAMRA, fluoresceína, un tinte Cy3, un tinte Cy5 y similares. Los ejemplos del tinte antes mencionado incluyen tintes Alexa tales como Alexa 488 y similares. Los ejemplos del isótopo antes mencionado incluyen isótopos estables y radioisótopos. Entre ellos, se prefieren los isótopos estables. Además, por ejemplo, el isótopo estable antes mencionado no cambia las propiedades físicas de un compuesto marcado con él y, por lo tanto, tiene una propiedad excelente como trazador. El isótopo estable antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen 2H 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S y 36S.
Como se describió anteriormente, el miARN de tipo natural de la presente invención puede inhibir la expresión antes mencionada de un gen diana. Por tanto, el miARN de tipo natural de la presente invención puede usarse, por ejemplo, como agente terapéutico para tratar una enfermedad causada por un gen. Cuando el miARN de tipo natural de la presente invención tiene una secuencia de cadena guía de un miARN maduro que inhibe la expresión de un gen que causa la enfermedad mencionada, por ejemplo, es posible tratar la enfermedad mencionada inhibiendo la expresión del gen diana antes mencionado. En la presente invención, el término "tratamiento" abarca la prevención de las enfermedades mencionadas anteriormente; mejora de las enfermedades; y mejora en el pronóstico, por ejemplo, y puede significar cualquiera de ellos. La enfermedad antes mencionada no está particularmente limitada y, por ejemplo, la secuencia antes mencionada que inhibe la expresión se puede establecer de manera apropiada según la enfermedad objeto. Los ejemplos de la enfermedad antes mencionada incluyen cáncer como cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de próstata, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, osteosarcoma, leucemia y similares, y enfermedades tales como fibrosis pulmonar, fibrosis hepática y similares.
El miARN de tipo natural antes mencionado se puede administrar a un sujeto que tiene el gen diana antes mencionado.
Los ejemplos del sujeto antes mencionado incluyen células, tejidos y órganos. Los ejemplos del sujeto antes mencionado también incluyen seres humanos, animales no humanos tales como mamíferos no humanos excluyendo seres humanos. La administración antes mencionada se puede realizar, por ejemplo, in vivo o in vitro. Las células mencionadas anteriormente no están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen: diversas células cultivadas tales como células HeLa, células 293, células NIH3T3, células COS y similares; células madre tales como células madre embrionarias, células madre hematopoyéticas y similares; y células aisladas de organismos vivos, tales como células de cultivo primario y similares.
En la presente invención, el gen diana antes mencionado cuya expresión se va a inhibir no está particularmente limitado, y cualquier gen deseado se puede establecer como gen diana. Como se mencionó anteriormente, el miARN maduro antes mencionado se puede seleccionar de acuerdo con el tipo de gen diana antes mencionado.
En cuanto al uso del miARN de tipo natural de la presente invención, se puede hace referencia a la siguiente descripción con respecto a la composición para su uso en la inhibición de la expresión de un gen diana, la composición farmacéutica, el método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana y el ácido nucleico monocatenario para uso en el tratamiento de una enfermedad según la presente invención.
Dado que el miARN de tipo natural de la presente invención puede inhibir la expresión de un gen diana como se describió anteriormente, por ejemplo, es útil como producto farmacéutico, agente de diagnóstico, producto agroquímico y herramienta para realizar investigaciones en agricultura, ciencia medicinal, ciencias de la vida y similares.
El método para sintetizar el miARN de tipo natural de la presente invención no está particularmente limitado, y se puede emplear un método de producción de ácido nucleico conocido convencionalmente. Los ejemplos del método de síntesis antes mencionado incluyen métodos de síntesis de acuerdo con procedimientos de ingeniería genética, métodos de síntesis química y similares. Los ejemplos de los procedimientos de ingeniería genética incluyen: métodos de síntesis que utilizan la transcripción in vitro; métodos que utilizan un vector; métodos llevados a cabo usando un casete de PCR y similares. El vector antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen vectores no virales tales como plásmidos y similares, y vectores virales y similares. Los métodos de síntesis química mencionados anteriormente no están particularmente limitados, y los ejemplos de los mismos incluyen un método de fosforamidita, un método de H-fosfonato y similares. Los métodos de síntesis química mencionados anteriormente se pueden llevar a cabo, por ejemplo, usando un sintetizador automático de ácidos nucleicos disponible comercialmente. En los métodos de síntesis química mencionados anteriormente, generalmente se usa una amidita. La amidita antes mencionada no está particularmente limitada. Ejemplos de amiditas disponibles comercialmente incluyen ARN fosforamiditas (2'-O-TBDMSi, nombre comercial, Samchully Pharm. Co., Ltd.), amidita ACE, amidita TOM, amidita CEE, amidita c Em , amidita t Em y similares.
(2) Composición
La composición inhibidora de la expresión según la presente invención es, como se describió anteriormente, una composición para inhibir la expresión de un gen diana, que contiene característicamente el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención. La composición de la presente invención se caracteriza porque contiene el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención, y otras configuraciones no están limitadas de ninguna manera. La composición inhibidora de la expresión de la presente invención también puede denominarse, por ejemplo, reactivo inhibidor de la expresión.
Según la presente invención, es posible inhibir la expresión del gen diana antes mencionado.
Además, como se describió anteriormente, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención contiene característicamente el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención. La composición de la presente invención se caracteriza porque contiene el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención, y otras configuraciones no están limitadas de ninguna manera. La composición farmacéutica de la presente invención también puede denominarse, por ejemplo, producto farmacéutico.
Se proporciona el miARN de tipo natural de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, la administración del miARN de tipo natural de la presente invención a un paciente con una enfermedad causada por un gen puede inhibir la expresión del gen antes mencionado, tratando así la enfermedad antes mencionada. El término "tratamiento" abarca, como se mencionó anteriormente, la prevención de las enfermedades mencionadas anteriormente; mejora de las enfermedades; y mejora en el pronóstico, por ejemplo, y puede significar cualquiera de ellos.
En la presente invención, una enfermedad a tratar no está particularmente limitada y los ejemplos de la misma incluyen enfermedades causadas por la expresión de genes. Dependiendo del tipo de enfermedad antes mencionada, se puede establecer un gen que causa la enfermedad como gen diana antes mencionado y, además, dependiendo del gen diana antes mencionado, se puede seleccionar la secuencia de la cadena guía antes mencionada del miARN maduro antes mencionado.
El miARN de tipo natural de la presente invención para uso en el tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la presente invención puede estar en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, y el tratamiento puede incluir, por ejemplo, administrar el miARN de tipo natural antes mencionado a un sujeto que tiene el gen diana antes mencionado.
Los ejemplos del sujeto antes mencionado incluyen seres humanos, animales no humanos tales como mamíferos no humanos que excluyen a los seres humanos. La administración antes mencionada se puede realizar, por ejemplo, in vivo.
El método de administración antes mencionado no está particularmente limitado y puede determinarse, por ejemplo, según sea apropiado dependiendo del sujeto.
Por ejemplo, cada una de las composiciones de la presente invención puede contener solo el miARN de tipo natural de la presente invención o además puede contener uno o más aditivos además del miARN de tipo natural. El aditivo antes mencionado no está particularmente limitado y es preferiblemente, por ejemplo, un aditivo farmacéuticamente aceptable. El tipo del aditivo antes mencionado no está particularmente limitado y puede seleccionarse según sea apropiado dependiendo, por ejemplo, del tipo de sujeto.
En la composición de la presente invención, por ejemplo, el miARN de tipo natural antes mencionado puede formar un complejo con el aditivo antes mencionado. El aditivo antes mencionado también puede denominarse, por ejemplo, agente complejante. La formación del complejo antes mencionada permite, por ejemplo, administrar eficazmente el miARN de tipo natural antes mencionado.
El agente complejante antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen polímeros, ciclodextrinas, adamantina y similares. Los ejemplos de las ciclodextrinas mencionadas anteriormente incluyen copolímeros de ciclodextrina lineal, copolímeros de ciclodextrina oxidada lineal y similares.
Otros ejemplos del aditivo antes mencionado incluyen un vehículo, una sustancia aglutinante que se une a una célula diana, un agente de condensación, un agente fusogénico, un excipiente y similares.
(3) Método inhibidor de la expresión in vitro
El método inhibidor de la expresión in vitro de acuerdo con la presente invención es, como se describió anteriormente, un método para inhibir la expresión de un gen diana, en el que se usa el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención. En el método inhibidor de la expresión in vitro de la presente invención, el miARN de tipo natural antes mencionado se administra a una célula, tejido u órgano, y otras etapas y condiciones no están limitadas de ninguna manera.
En el método inhibidor de la expresión in vitro de la presente invención, el mecanismo por el cual se inhibe la expresión del gen diana antes mencionado no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen la inhibición de la expresión por miARN maduro.
El método inhibidor de la expresión de la presente invención incluye, por ejemplo, la etapa de administrar el miARN de tipo natural antes mencionado a una célula, un tejido o un órgano en el que está presente el gen diana antes mencionado. Mediante la etapa de administración antes mencionada, por ejemplo, el miARN de tipo natural antes mencionado se pone en contacto con la célula, tejido u órgano antes mencionado.
En el método inhibidor de la expresión in vitro de la presente invención, por ejemplo, el miARN de tipo natural antes mencionado puede administrarse en solitario a una célula, tejido u órgano.
Las células mencionadas anteriormente no están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen: varias células cultivadas tales como células HeLa, células 293, células NIH3T3, células COS y similares; células madre tales como células madre embrionarias, células madre hematopoyéticas y similares; y células aisladas de organismos vivos, tales como células de cultivo primario y similares.
El método de administración antes mencionado no está particularmente limitado y puede determinarse, por ejemplo, según sea apropiado dependiendo de la célula, tejido u órgano. Cuando la célula, tejido u órgano antes mencionado es una célula cultivada, el método de administración puede ser, por ejemplo, un método que utiliza un reactivo de transfección, un método de electroporación o similares.
(4) miARN de tipo natural para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad
Como se describió anteriormente, el ácido nucleico monocatenario de la invención puede usarse en el tratamiento de una enfermedad. El tratamiento puede incluir la etapa de administrar el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención a un paciente, en el que la secuencia de la cadena guía antes mencionada en el miARN de tipo natural antes mencionado es la secuencia de la cadena guía de un miARN maduro que inhibe la expresión de un gen que causa la enfermedad antes mencionada.
El ácido nucleico monocatenario según la presente invención es un ácido nucleico monocatenario para su uso en el tratamiento de una enfermedad. El ácido nucleico monocatenario antes mencionado es el miARN de tipo natural antes mencionado de la presente invención, y la secuencia de la cadena guía antes mencionada en el miARN de tipo natural antes mencionado es la secuencia de la cadena guía de un miARN maduro que inhibe la expresión de un gen que causa la enfermedad antes mencionada.
A continuación, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos y similares. Debe observarse, sin embargo, que la presente invención no se limita en modo alguno a ellos.
Ejemplos
Ejemplo 1
En base a la información de la secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera del miR-34a maduro (núm. de acceso en miRBase MI0000268), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención con longitudes de bases diferentes en la secuencia adicional (espaciador), se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm del gen diana AXL.
(1) Síntesis de miARN
Se sintetizó un miR-34a maduro humano bicatenario (NI-0208) compuesto por la cadena guía (SEQ ID NO: 1) y la cadena pasajera (SEQ ID NO: 2), que se representan a continuación, como miARN de control positivo, y se sintetizó un miR-34a de tipo natural monocatenario (NM-0004) en el que la cadena guía antes mencionada está conectada a la cadena pasajera antes mencionada a través de la secuencia de una región de bucle de pre-miR-34a.
Como control negativo, se sintetizó ARN bicatenario (NI-0000) compuesto por una secuencia libre de complementariedad con todas las secuencias registradas en bases de datos de ácidos nucleicos y una secuencia complementaria a la misma.
NM-0004 (64 meros)
u g g c a g u g u - c u u a gc u g g u u g u u ~ g u g a g c a a
U CCGUCAyAyGAA- * ^AAGGAA^GA U
NI-0208 (22/22 meros)
u g g c a g u g u - c u u a g c u g g u u g u
CCGUCA^A G A A -CGAC^AAC
*
En la secuencia antes mencionada, un asterisco representa una base no complementaria a la base de la cadena guía correspondiente.
En la siguiente secuencia, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, y las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada.
NM-0004 (SEQ ID NO: 11)
5 ' -
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGcaaucaqcaaguauacuqccc
u - 3 '
N I-020 8 (SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2)
5 ' - UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU- 3 ' /5 '- c a a u c a g c a a g u a u a c u g c c c u -3 '
N I-000 0 (SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 13)
5 ' -UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3 ' /5'-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3'
Como miARN de tipo natural del Ejemplo, se sintetizó un miR-34a de tipo natural en el que la región X compuesta por la cadena guía antes mencionada (SEQ ID NO: 1) y una secuencia adicional (longitud de 0, 3, 5 o 7 bases), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena pasajera antes mencionada, una región saliente de la cadena guía antes mencionada y una secuencia completamente complementaria a la secuencia adicional antes mencionada, están unidas a través de una estructura no nucleotídica de un derivado de prolina de la fórmula siguiente. En la síntesis del miARN de tipo natural antes mencionado, las estructuras no nucleotídicas de los derivados de prolina de las siguientes fórmulas se introdujeron utilizando amidita de L-prolina diamida (véase WO 2012/017919) .
Figure imgf000024_0001
espaciador 5
PH-0036 (46 meros) PH-0066 (56 meros)
u
GGCAGUGU-CUU GCUGGUUGU
CCGUCAy/ yG A A -CGACy&ACA
°s
Figure imgf000024_0002
espaciador 3 espaciador 7
PH-0038 (52 meros) PH-0068 (60 meros)
UGGCAGUGU-CUUAGCUGGUUGUUCC UGGCAGUGU- c u iA s c u g g u u g u u c c g g c c
^CCGUCAyAyGAA-CGACyAACAAGG3 ^^CCGUCAyA^GAA-CGACyAACAAGGCCGG
En las secuencias antes mencionadas, un asterisco representa una base no complementaria a la cadena guía correspondiente. Además, el número después del "espaciador" representa la longitud de bases de la secuencia adicional de la región X antes mencionada.
En la siguiente secuencia, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, y las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada. Además, [P] representa una estructura no nucleotídica del derivado de prolina antes mencionado.
PH-0036 (SEQ ID NO: 14)
PH-0038 (SEQ ID NO: 15)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]
GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0066 (SEQ ID NO: 16)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0068 (SEQ ID NO: 17)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGGCC-[P]-GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
(2) Medición del nivel de expresión del gen AXL
Cada uno de los ARN mencionados anteriormente se disolvió en agua destilada para inyección (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) a 2 pmol/L, con lo que se preparó una solución de ARN.
Como células, se utilizaron células H1299 (ATCC). Como medio, se usó Medio RPMI 1640 (Life Technologies) que contenía FBS al 10%. Las condiciones de cultivo se establecieron en 37°C, 5% CO2.
Primero, las células se cultivaron en el medio antes mencionado, y la solución cultivada se dispensó a una placa de 24 pocillos de modo que cada pocillo contenía 400 pL de la solución cultivada para lograr una densidad de 4 x 104 células/pocillo. Las células se transfectaron con el ARN antes mencionado usando (A) reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo adjunto al reactivo de transfección antes mencionado. Específicamente, la transfección se llevó a cabo ajustando la composición por pocillo de la siguiente manera. En la siguiente composición, (B) es Opti-MEM (Life Technologies), (C) es la solución de ARN de 2 pmol/L antes mencionada, se agregaron 98,5 pL en total. La concentración final del ARN antes mencionado en el pocillo antes mencionado se ajustó a 1 nmol/L.
Tabla 1
(composición por pocillo: pL)
solución cultivada 400
reactivo de transfección 1.5
(B) (C)___________________ 98.5
total 500
Después de la transfección, las células de los pocillos antes mencionados se cultivaron durante 24 horas y, a continuación, se recogió el ARN usando un kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Países Bajos) de acuerdo con el protocolo suministrado con el mismo. Posteriormente, el ADNc se sintetizó a partir del ARN antes mencionado usando el kit Transcriptor First Strand ADNc Synthesis Kit (Roche) de acuerdo con el protocolo suministrado con el mismo. A continuación, como se representa más abajo, se llevó a cabo la PCR utilizando como plantilla el ADNc sintetizado antes mencionado, y se midieron el nivel de expresión del gen AXL y el del gen GAPDH como patrón interno. El nivel de expresión antes mencionado del gen AXL se normalizó con referencia al del gen GAPDH antes mencionado. La PCR antes mencionada se llevó a cabo utilizando LightCycler 480 SYBR Green I Master (nombre comercial, Roche) como reactivo y LightCycler 480 Instrument II (nombre comercial, Roche) como instrumento (en adelante, el mismo). Los genes AXL y GAPDH mencionados anteriormente se amplificaron utilizando los siguientes conjuntos de cebadores, respectivamente.
Juego de cebadores de PCR para el gen AXL
(SEQ ID NO: 18) 5'-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3'
(SEQ ID NO: 19) 5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’
conjunto de imprimaciones para el gen GAPDH
(SEQ ID NO: 20) 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
(SEQ ID NO: 21) 5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’
Como control 1, con respecto a las células a las que se habían añadido 100 pL de la solución (B) antes mencionada sola a la solución cultivada antes mencionada, también se midieron los niveles de expresión de los genes (-). Además, como control 2, con respecto a las células sometidas a los mismos procedimientos de transfección que antes excepto que no se añadió la solución de ARN antes mencionada y que se añadió el (B) antes mencionado y 1.5 pL del (A) antes mencionado para que la cantidad total de (A) y (B) fuera 100 pL, también se midió (simulacro) el nivel de expresión del gen.
En cuanto a los niveles de expresión del gen AXL normalizado, el valor relativo del nivel de expresión en la célula introducida con cada ARN se determinó en base al nivel de expresión en las células del control (-) como 1.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 2, el miR-34a de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión de ARNm de AXL al mismo nivel que el del control positivo miR-34a maduro y la variante pre-miR-34a. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de AXL incluso cuando se cambiaba la longitud de bases de la secuencia adicional de la región X.
Ejemplo 2
En el miR-34a de tipo natural (PH-0036) del Ejemplo 1, se modificó la estructura no nucleotídica de la región conectora y se examinó de manera similar un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de AXL.
(1) Síntesis de miARN
Se sintetizaron las moléculas mostradas a continuación, a saber, la molécula (KH-0006) en la que la estructura no nucleotídica de un derivado de lisina de la siguiente fórmula fue sustituida por una región conectora de PH-0036,
Figure imgf000026_0001
la molécula (XH-0011) en la que la estructura no nucleotídica de un derivado de glicina de la siguiente fórmula fue sustituida por una región conectora de PH-0036,
Figure imgf000026_0002
la molécula (XH-0013) en la que la estructura no nucleotídica de un derivado de glicilglicina de la siguiente fórmula se sustituyó por una región conectora de PH-0036,
Figure imgf000027_0001
(G 2)
GlyGly en la fórmula química antes mencionada (G2) es un grupo atómico representado por la siguiente fórmula química (GlyGly), en la que el carbono carbonílico terminal está unido al átomo de N en la fórmula química antes mencionada (G2), y el átomo de nitrógeno terminal en la siguiente fórmula química (GlyGly) está unido al carbono carbonílico en la fórmula química antes mencionada (G2),
(GlyGly)
-HN-CH2-CO-HN-CH2-CO-, y
la molécula (XH-0015) en la que la estructura no nucleotídica de un derivado de ácido tereftálico de la siguiente fórmula fue sustituida por una región conectora de PH-0036,
Figure imgf000027_0002
La estructura no nucleotídica del derivado de lisina antes mencionado se introdujo usando amidaamidita de L-lisina (ver WO 2013/103146), la estructura no nucleotídica del derivado de glicina antes mencionado se introdujo usando amidaamidita de glicina (ver WO 2013/103146), la estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina antes mencionado se introdujo usando amidaamidita de glicilglicina (ver WO 2013/133221), y la estructura no nucleotídica del derivado de ácido tereftálico antes mencionado se introdujo utilizando amidita de ácido tereftálico (ver WO 2013/103221).
KH-0006 uggcagugu- cuuagcugguugu XH-0013 uggcagugu- cuuagcugguugu__
CCGUCAUA GAA-CGACUAACAK
UC ü ^CCGUCAUAyGAA-CGACUAACAGly_Gly
1 y
XH-0011 uggcagugu- cuuagcugguugu XH-0015 Uggcagugu- cuuAgctjgguugu
u<.CCGUCAUAi;GAA-CGACUAACAG,y UCCCGUCAUAyGAA-CGACUAACA*^
En la siguiente secuencia, [K] representa la estructura no nucleotídica del derivado de lisina antes mencionado, [Gly] representa la estructura no nucleotídica del derivado de glicina antes mencionado, [GlyGly] representa la estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina antes mencionado, y [TP] representa la estructura no nucleotídica del ácido tereftálico antes mencionado. En las siguientes secuencias, la región del lado 5' de cada conector es la región X, y en la región X antes mencionada, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, el resto es la secuencia adicional antes mencionada y la región del lado 3' de cada conector es la región Y, y en la región Y antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada.
KH-0006 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0011 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0013 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0015 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
De manera similar al Ejemplo 1, se usaron NM-0004 y NI-0208 como control positivo, y se usó NI-0000 como control negativo.
(2) Medición del nivel de expresión del gen AXL
Por un método similar al del Ejemplo 1, se transfectaron células H1299 (ATCC) con cada uno de los ARN mencionados anteriormente y se determinó el nivel de expresión del ARNm de AXL.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 3, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de AXL incluso cuando se alteró la estructura no nucleotídica de la región conectora.
Ejemplo 3
Luego, se examinó el efecto de la introducción de una secuencia adicional en la región X sobre XH-0015 que tiene una región conectora de la estructura no nucleotídica del derivado de ácido tereftálico, que se usó en el Ejemplo 2. La estructura y secuencia del miR-34a de tipo natural utilizado se representa a continuación.
XH-0015 (46 meros)
u g g c a g u g u - c u u a g c u g g u u g u
TP CCGUCAUA GAA-CGACUAACA
UC * U *
XH-0024 (52 meros) espaciador
u g g c a g u g u - c u u a g c u g g u u g u u c c .
^CCGUCAyAyGAA-CGACyAACAAGG TP
En la secuencia antes mencionada, un asterisco representa una base no complementaria a la cadena guía correspondiente. El "espaciador" representa que la región X antes mencionada contiene una secuencia adicional. En la siguiente secuencia, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, y las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada. [TP] representa la estructura no nucleotídica del derivado de ácido tereftálico antes mencionado.
XH-0015 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0024 (SEQ ID NO: 15)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
Por un método similar al del Ejemplo 1, se transfectaron células H1299 (ATCC) con cada uno de los ARN mencionados anteriormente y se determinó el nivel de expresión del ARNm de AXL.
Como resultado, tal como se representa en la Fig. 4, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de AXL incluso cuando se añadió una secuencia adicional a la región X.
Ejemplo 4
En base a la información de la secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera de let-7a maduro (núm. de acceso en miRBase MI0000060), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una estructura no nucleotídica diferente en la región conectora, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm del gen diana HMGA2. Cuando el miARN de tipo natural usa un conector que tiene una estructura no nucleotídica de un derivado de prolina, también se sintetizó uno que tiene una secuencia adicional introducida en la región X.
(1) Síntesis de miARN
Se sintetizó, como miARN de control positivo, un let-7a maduro humano bicatenario (NI-0205) compuesto por la cadena guía (SEQ ID NO: 3) y la cadena pasajera (SEQ ID NO: 4), que se representan a continuación, y se sintetizó un tipo natural de let-7a monocatenario (NM-0003) en el que la cadena guía antes mencionada está unida con la cadena pasajera antes mencionada a través de la secuencia de una región de bucle de pre-let-7a.
Además, como control negativo, se utilizó el NI-0000 antes mencionado.
NM-0003 (72 meros)
U UUAGGGU CACAC,
g a g g u a g u a g g u u g u a u a g u u
CU-UUC UCAUCUAACA.UAUC
* UG * a a u a g a g g g u c a c c a
NI-0205 (22/21 meros)
u g a g g u a g u a g g u u g u a u a g u u
CU-U+UC UCAUCy*AACAUAUC
iric
En la secuencia antes mencionada, un asterisco representa una base no complementaria a la cadena guía correspondiente.
En las siguientes secuencias, la parte subrayada representa la secuencia de la cadena guía antes mencionada, y las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada.
NM-0003 (SEQ ID NO: 22)
5'-
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAAcuauacaaucua
cugucuuuc-3'
NI-0205 (SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'/5'-cuauacaaucuacugucuuuc-3'
Como se representa a continuación, se sintetizaron varios let-7a de tipo natural en los que la región X compuesta por la cadena guía antes mencionada (SEQ ID NO: 3) y una secuencia adicional (longitud de 0, 3 bases), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena pasajera antes mencionada, una región saliente de la cadena guía antes mencionada y una secuencia completamente complementaria a la secuencia adicional antes mencionada, se unen a través de un conector del derivado de prolina ([P]) , del derivado de lisina ([K]), del derivado de glicina ([Gly]), del derivado de glicilglicina ([GlyGly]) o del derivado de ácido tereftálico ([TP]) antes mencionado. En la síntesis antes mencionada del miARN de tipo natural, cada estructura no nucleotídica se introdujo de la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2.
PH-0011 u g a g g u a g u a g g u u g u a u a g u u n XH-0004 u g a g g u a g u a g g u u g u a u a g u u „ AA A A G'yGly U GU KH-0003 ü g a g g u a g u a g g u u g u a u a g u u XH-0006 GAG AGUAGGUUGUAUAGUU __ a a k a a t p
XH-0002
Figure imgf000030_0001
PH-0014 u g a g g u a g u a g g u u g u a u a g u u ü c c
espadador AAAGGP En la secuencia antes mencionada, el "espaciador" representa que la región X antes mencionada contiene una secuencia adicional.
En la siguiente secuencia, [P] representa la estructura no nucleotídica del derivado de prolina antes mencionado, [K] representa la estructura no nucleotídica del derivado de lisina antes mencionado, [Gly] representa la estructura no nucleotídica del derivado de glicina antes mencionado, [GlyGly] representa la estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina antes mencionado, y [TP] representa la estructura no nucleotídica del ácido tereftálico antes mencionado. En las siguientes secuencias, la región en el lado 5' de cada conector es la región X, y en la región X antes mencionada, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, y el resto es la secuencia adicional antes mencionada, y la región en el lado 3' de cada conector es la región Y, y en la región Y antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada.
PH-0011 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
KH-0003 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0002 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc
3'
XH-0004 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0006 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
PH-0014 (SEQ ID NO: 24)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
(2) Medición del nivel de expresión del gen HMGA2
Cada uno de los ARN mencionados anteriormente se disolvió en agua destilada para inyección (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) a 0,2 pmol/L, con lo que se preparó una solución de ARN.
Como células, se utilizaron células A549 (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Como medio, se utilizó un DMEM (Life Technologies) que contenía FBS al 10%. Las condiciones de cultivo se ajustaron a 37°C y 5% CO2.
Primero, las células se cultivaron en el medio antes mencionado, y la solución cultivada se dispensó a una placa de 24 pocillos de modo que cada pocillo contenía 400 pL de la solución cultivada para lograr una densidad de 4 x 104 células/pocillo. Las células se transfectaron con el ARN antes mencionado usando (A) reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo adjunto al reactivo de transfección antes mencionado. Específicamente, la transfección se llevó a cabo ajustando la composición por pocillo de la siguiente manera. En la siguiente composición, (B) es Opti-MEM (Life Technologies), y (C) es 0,2 pmol/L de la solución de ARN antes mencionada y se añadieron 98,5 pL en total. La concentración final del ARN antes mencionado en el pocilio antes mencionado se ajustó a 0,1 nmol/L.
Tabla 2
(composición por pocillo: pL)
solución cultivada 400
reactivo de transfección 1.5
(B) (C) 98.5 *3
total 500
Después de la transfección, las células de los pocillos antes mencionados se cultivaron durante 24 horas y, a continuación, se recogió el ARN usando un kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Países Bajos) de acuerdo con el protocolo suministrado con el mismo. Posteriormente, se sintetizó el ADNc a partir del ARN antes mencionado usando el kit Transcriptor First Strand ADNc Synthesis Kit (Roche) de acuerdo con el protocolo suministrado con el mismo. A continuación, como se representa a continuación, se llevó a cabo la PCR utilizando el ADNc sintetizado, antes mencionado, como plantilla, y se midieron el nivel de expresión del gen HMGA2 y el del gen GAPDH como patrón interno. El nivel de expresión antes mencionado del gen HMGA2 se normalizó con referencia al del gen GAPDH antes mencionado.
La PCR antes mencionada se llevó a cabo utilizando LightCycler 480 SYBR Green I Master (nombre comercial, Roche) como reactivo y LightCycler 480 Instrument II (nombre comercial, Roche) como instrumento (en adelante, el mismo). Los genes HMGA2 y GAPDH antes mencionados se amplificaron usando los siguientes conjuntos de cebadores, respectivamente.
Conjunto de cebadores de PCR para el gen HMGA2
(SEQ ID NO: 25) 5'-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3'
(SEQ ID NO: 26) 5'-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3'
conjunto de cebadores para el gen GAPDH
(SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(SEQ ID NO: 21) 5' -GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
Como control 1, con respecto a las células a las que se habían añadido 100 pL de la solución (B) antes mencionada sola a la solución cultivada antes mencionada, también se midieron los niveles de expresión de los genes (-). Además, como control 2, con respecto a las células sometidas a los mismos procedimientos de transfección que el anterior excepto que no se añadió la solución de ARN antes mencionada y que se añadió el (B) antes mencionado y 1.5 pL del (A) antes mencionado para que la cantidad total de (A) y (B) fuera 100 pL, también se midió (simulacro) el nivel de expresión del gen.
En cuanto al nivel de expresión del gen HMGA2 normalizado, el valor relativo del nivel de expresión en la célula introducida con cada ARN se determinó en base al nivel de expresión en las células del control (-) como 1.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 5, el let-7a de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión de ARNm de HMGA2 al mismo nivel que el de la variante let-7a madura y pre-let-7a de control positivo. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de HMGA2 incluso cuando se alteró la estructura no nucleotídica del conector o se introdujo la secuencia adicional en la región X.
Ejemplo 5
En base a la información de secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera de miR-29b maduro (núm. de acceso en miRBase MI0000105), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una estructura no nucleotídica diferente en la región conectora, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de COL1A1 del gen diana. Cuando el miARN de tipo natural usa un conector que tiene una estructura no nucleotídica de un derivado de prolina, también se sintetizó uno que tiene una secuencia adicional introducida en la región X.
(1) Síntesis de miARN
Un miR-29b maduro humano bicatenario (NI-0210) compuesto por la cadena guía (SEQ ID NO: 9) y la cadena pasajera (SEQ ID NO: 10) que se representan a continuación se sintetizó como un miARN de control positivo, y un miR-29b de tipo natural monocatenario (NM-0005) en el que se sintetizó la cadena guía antes mencionada con la cadena pasajera antes mencionada a través de la secuencia de una región de bucle de pre-miR-29b.
Además, como control negativo, se utilizó el NI-0000 antes mencionado.
N M -0005 (64 meros)
* * U GU* *UUAAA
-GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAU ü
A
UU UGACUAAAGU UACCAC— GAUCUG______G
G ü UUAGU
NI-0210 (24/23 meros)
*
* * GU*
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGA UUGUGACUAAAGUrjUACCAC— GAU
En la secuencia antes mencionada, un asterisco representa una base no complementaria a la cadena guía correspondiente.
En la siguiente secuencia, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada.
NM-0005 (SEQ ID NO: 27)
5'-
gcugguuucauauggugguuuagaUUUAAAUAGUGAUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGU
U-3'
NI-0210 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 9)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-3' /5'-
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
Como se representa a continuación, se sintetizaron varios miR-29b de tipo natural en los que la región X está compuesta por la cadena pasajera antes mencionada (SEQ ID NO: 10) y una secuencia adicional (longitud de 0, 3 bases), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena guía antes mencionada, una región saliente de la cadena pasajera antes mencionada y una secuencia completamente complementaria a la secuencia adicional antes mencionada, se unen a través de un conector del derivado de prolina ([P]), derivado de lisina ([K]), derivado de glicina ([Gly]), derivado de glicilglicina ([GlyGly]) o derivado de ácido tereftálico ([TP]) antes mencionado. En la síntesis antes mencionada del miARN de tipo natural, cada estructura no nucleotídica se introdujo de la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2.
PH-0040 u
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGA XH-0019GCUGGUUUCA AUGGUG GU UUAGA UUGUGACUAAAGUrjUACCAC— £AUCU ? UUGyGACyAAAGUyUACCAC— §AUCU G'V 'V
KH-0008 GU
G XH GUCUGGUUUCA AUGGUG UUAGA -0021 GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGA UUGyGACyAAAGURjUACCAC— §AUCU K UUGyGACyAAAGURjUACCAC— gAUCU Tf>
XH-0017 GU PH GU
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGA. -0042
rrssm gcug gu uuca auggug uuagaucc
Gly UUGyGACyAAAGUjjUACCAC- - §AUCU c/Tdor UUGVGACVAAAGUuUACCAC" “ §AUCÜAGG P
En la secuencia antes mencionada, un asterisco representa una base no complementaria a la cadena guía correspondiente. El "espaciador" representa que la región X antes mencionada contiene una secuencia adicional.
En la siguiente secuencia, [P] representa la estructura no nucleotídica del derivado de prolina antes mencionado, [K] representa la estructura no nucleotídica del derivado de lisina antes mencionado, [Gly] representa la estructura no nucleotídica del derivado de glicina antes mencionado, [GlyGly] representa la estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina antes mencionado, y [TP] representa la estructura no nucleotídica del ácido tereftálico antes mencionado. En las siguientes secuencias, la región del lado 5' de cada conector es la región X, y en la región X antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada, el resto es la secuencia adicional antes mencionada, la región del lado 3' de cada conector es la región Y y, en la región Y antes mencionada, la parte subrayada representa la secuencia de la cadena guía antes mencionada.
PH-0040 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
KH-0008 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0017 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0019 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0021 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]—
UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0042 (SEQ ID NO: 29)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
Como control negativo, se usó NI-0000 sintetizado en el Ejemplo 1.
(2) Medición del nivel de expresión del gen COL1A1
Cada uno de los ARN mencionados anteriormente se disolvió en agua destilada para inyección (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) a 2 pmol/L, con lo que se preparó una solución de ARN.
Se utilizaron células A549 (DS PHARMA BIOMEDICAL) como células. Como medio, se utilizó DMEM (Life Technologies) que contenía FBS al 10%. Las condiciones de cultivo se ajustaron a 37°C, 5% CO2.
Primero, las células se cultivaron en el medio antes mencionado, y la solución cultivada se dispensó a una placa de 24 pocillos de modo que cada pocillo contenía 400 pL de la solución cultivada para lograr una densidad de 4 x 104 células/pocillo. Las células se transfectaron con el ARN antes mencionado usando (A) reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo adjunto al reactivo de transfección antes mencionado. Específicamente, la transfección se llevó a cabo ajustando la composición por pocillo de la siguiente manera. En la siguiente composición, (B) es Opti-MEM (Life Technologies), (C) es la solución de ARN de 2 pmol/L antes mencionada, se agregaron 98,5 pL de ellos en total. La concentración final del ARN antes mencionado en el pocillo antes mencionado se ajustó a 1 nmol/L.
Tabla 3
(composición por pocillo: pL)
solución cultivada 400
reactivo de transfección 1.5
(B) (C) 98.5
total 500
Después de la transfección, las células de los pocilios antes mencionados se cultivaron durante 24 horas y, a continuación, se recogió el ARN usando un kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Países Bajos) de acuerdo con el protocolo suministrado con el mismo. Posteriormente, se sintetizó el ADNc a partir del RNA antes mencionado usando el kit Transcriptor First Strand ADNc Synthesis Kit (Roche) de acuerdo con el protocolo suministrado con el mismo. A continuación, como se representa a continuación, se llevó a cabo la PCR utilizando el ADNc sintetizado antes mencionado como molde, y se midieron el nivel de expresión del gen COL1A1 y el del gen GAPDH como patrón interno. El nivel de expresión antes mencionado del gen COL1A1 se normalizó con referencia al del gen GAPDH antes mencionado.
La PCR antes mencionada se llevó a cabo utilizando LightCycler 480 SYBR Green I Master (nombre comercial, Roche) como reactivo y LightCycler 480 Instrument II (nombre comercial, Roche) como instrumento (en adelante, el mismo). Los genes COL1A1 y GAPDH antes mencionados se amplificaron usando los siguientes conjuntos de cebadores, respectivamente.
Conjunto de cebadores de PCR para el gen COL1A1
(SEQ ID NO: 30) 5 ' -CCCAAGGACAAGAGGCATGT-3'
(SEQ ID NO: 31) 5'-CCGCCATACTCGAACTGGAA-3'
conjunto de imprimaciones para el gen GAPDH
(SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(SEQ ID NO: 21) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
Como control 1, con respecto a las células a las que se habían añadido 100 pL de la solución (B) antes mencionada sola a la solución cultivada antes mencionada, también se midieron los niveles de expresión de los genes (-). Además, como control 2, con respecto a las células sometidas a los mismos procedimientos de transfección que antes excepto que no se añadió la solución de ARN antes mencionada y que se añadió el (B) antes mencionado y 1.5 pL del (A) antes mencionado para que el total de la cantidad de (A) y (B) fuera 100 pL, también se midió (simulacro) el nivel de expresión del gen.
En cuanto al nivel de expresión del gen COL1A1 normalizado, se determinó el valor relativo en la célula con cada ARN introducido en base al nivel de expresión en las células del control (-) como 1.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 6, el miR-29b de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión de ARNm de COL1A1 al mismo nivel que el del control positivo miR-29b maduro y la variante pre-miR-29b. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de COL1A1 incluso cuando se alteró la estructura no nucleotídica del conector o se introdujo la secuencia adicional en la región X.
Ejemplo 6
Según la información de secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera del miR-34a maduro (número de acceso en miRBase MI0000268), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una estructura no nucleotídica diferente en la región conectora y una longitud diferente de bases de la secuencia adicional en la región X, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de AXL del gen diana.
(1) Síntesis de miARN
Por un método similar al del Ejemplo 1, se sintetizó un miR-34a de tipo natural (PH-0036, PH-0038, PH-0066 y PH-0068) en el que la región X está compuesta por la cadena guía (SEQ ID NO: 1) y una secuencia adicional (longitud de 0, 3, 5 o 7 bases), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena pasajera, una región saliente de la cadena guía antes mencionada y una secuencia completamente complementaria a la secuencia adicional antes mencionada, se conectan a través de una estructura no nucleotídica de un derivado de prolina.
Además, del tipo natural miR-34a antes mencionado, se sintetizó el miR-34a de tipo natural (PH-0036, PH-0038 o PH-0066) que tiene una secuencia adicional con una longitud de 0, 3 o 5 bases, en el que la estructura no nucleotídica de la región conectora se modifica por un método similar al del Ejemplo 2.
KH-0006 XH-0015
Figure imgf000035_0001
KH-0018 XH-0024
UGGCAGUGU- CUUAGCUGGUUGÜUCC UGGCAGUGU- COÜAGCUGGUUGOUCC
ocCCGOCAÜA0 GAA-CGACUAACAAGGK , „CCGUCAUA GAA-CGACÜAACAAGG T
OC O
KH-0019 XH-0042
UGGCAGUGÜ- CUUAGCUGGUUGUUCCGGk UGGCAGOGU- CUÜAGCUGGUUGOUCCGGTp
o __cCCGOCAUA o GAA-CGACUAACAAGGCc ^CCGUCAUAyGAA-CGACOAACAAGGCC
XH-0011 XH-0013
UGGCAGÜGÜ-CUUAGCUGGUUGU UGGCAGUGU- CUUAGCUGGUUGU„ .
GlyGly
0 c CCG0CA0A0 GAA-CGAC0AACAOly u c CCGUCA0Ao GAA-CGACüAACA 7 7
XH-0043 XH-0045
UGGCAGUGU-CUUAGCUGGOOGUUCC u g g cag ug u - c u u a g c u g g u u g u uc c . _
GlyGly
^CCGUCAUA^GAA- CGACOAACAAGG ^ o c CCGUCAUA0 GAA-CGACOAACAAGG 7 7
XH-0044 XH-0046
UGGCAGOGU-CUUAGCOGGÜUGUUCCGG„,
Gly u g g c ag u g u - c u u a g co g g uug o uccg g^G 1lyGly
CCCTCAUAGAA-CGACÜAACAAGGCC CCGOCAUA GAA-CGACUAACAAGGCC 7 7
En la siguiente secuencia, [K] representa una estructura no nucleotídica del derivado de lisina, [TP] representa una estructura no nucleotídica del derivado del ácido tereftálico, [Gly] representa una estructura no nucleotídica del derivado de glicina y [GlyGly] representa una estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina. En las siguientes secuencias, la región del lado 5' de cada conector es la región X, y en la región X antes mencionada, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía, el resto es la secuencia adicional antes mencionada, y la región del lado 3' de cada conector es la región Y, y, en la región Y antes mencionada, las letras minúsculas representan una secuencia de cadena pasajera.
KH-0006 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
KH-0018 (SEQ ID NO: 15)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[K]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
KH-0019 (SEQ ID NO: 16)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[K]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0015 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0024 (SEQ ID NO: 15)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0042 (SEQ ID NO: 16)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[TP]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0011 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0043 (SEQ ID NO: 15)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[Gly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0044 (SEQ ID NO: 16)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[Gly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0013 (SEQ ID NO: 14)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0045 (SEQ ID NO: 15)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[GlyGly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0046 (SEQ ID NO: 16)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[GlyGly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
Como control positivo, se usó NI-0208 del Ejemplo 1.
(2) Medición del nivel de expresión del gen AXL
Por un método similar al del Ejemplo 1, excepto que la concentración final de cada ARN antes mencionado fue de 2 nmol/L, se determinó el nivel de expresión del gen AXL.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 7, el miR-34a de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión de ARNm de AXL al mismo nivel que el de la variante de miR-34a de control positivo. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de AXL incluso cuando se alteró la estructura no nucleotídica del conector o se introdujo la secuencia adicional en la región X.
Ejemplo 7
En base a la información de secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera de let-7a maduro (número de acceso miRBase MI0000060), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una estructura no nucleotídica diferente en la región conectora y una de longitud de bases diferente en la secuencia adicional en la región X, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de HMGA2 del gen diana.
(1) Síntesis de miARN
Por un método similar al del Ejemplo 4, se sintetizaron varios let-7a de tipo natural en los que la región X está compuesta por la cadena guía (SEQ ID NO: 3) y una secuencia adicional (longitud de 0, 3 o 5 bases), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena pasajera, una región saliente de la cadena guía antes mencionada y una secuencia completamente complementaria a la secuencia adicional antes mencionada, están unidas a través de un conector de derivado de prolina ([P]), derivado de lisina ([K] ), derivado del ácido tereftálico ([TP]), derivado de glicina ([Gly]) o derivado de glicilglicina ([GlyGly]). En la síntesis antes mencionada del miARN de tipo natural, cada estructura no nucleotídica se introdujo de la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2.
PH-0011
U GU GAG AGUAGGUUGUAUAGUU CU-UUC UCAUCVAnCAUAt Aa ”UG
PH-0014
O GUGAG AGUAGGUUGUAUAGUUUCC p
VUC LT.AUCUAACAUAI AAAGGP UG
PH-0107
UGAG GU AGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG
c j - v u c UG ucaucvaacauai a a a g g c c p
KH-0003 XH-0006
° gaggoaguagguuguauaguu UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU tp
CU-UUC UG UCAUCUAACAUAUCAA CU-UUC UCAUCUAACAUAU:Aa '
KH-0020 XH-0047
ügaggoaguagguuguauaguuucc ugaggüaguagguuguauaguuucc
CU-UÜC..,.UCAUCUAACAUAUCAAAGG CU-UUC UCAUCUAACAUAUCAAAGGUG
KH-0021 XH-0048
ugaggüaguagguuguauaguuuccgg u gaggüaguagguuguauaguuuccgg Tp
CU-UUC UG UCAUCUAACAUAU AAAGGCC* CU-UUC UCAUCÜAACAUAI AAAGGCC ‘
XH-0002 XH-0004
ugaggoaguagguuguauaguu ugagguaguagguuguauaguu _ ,
GlyGly
CU-UUC UCAUCUAACAUAU A A ° V CU-UUC UCAUCUAACAUAUCAX 'UG
XH-0049 XH-0051
° gagguaguagguuguauaguuucc ugaggüaguagguuguauagüuucc GlyGly
CU-’JUC UCAUCÜAACAUAI AAAGG ° Y ■OUC UCAUCUAACAUAUCJÜUkGG
XH-0050 XH-0052
ügaggoaguagguuguauaguuuccgg ugagguaguagguuguauaguuuccgg GlyGly
CU-UUC UCAUCUAACAUAl AAAGGCCGV CU-UUC UCAUCOA- AAAGGCCUG
En la siguiente secuencia, [P] representa una estructura no nucleotídica del derivado de prolina, [K] representa una estructura no nucleotídica del derivado de lisina, [TP] representa una estructura no nucleotídica del derivado del ácido tereftálico, [Gly] representa una estructura no nucleotídica del derivado de glicina y [GlyGly] representa una estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina. En las siguientes secuencias, la región del lado 5' de cada conector es la región X, y en la región X antes mencionada, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, el resto es la secuencia adicional antes mencionada y la región del lado 3' de cada conector es la región Y, y en la región Y antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de cadena pasajera antes mencionada.
PH-0011 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
P H -0014 (SEQ ID NO: 24 )
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P] -GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
PH-0107 (SEQ ID NO: 32)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[P]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
KH-0003 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3' KH-0020 (SEQ ID NO: 24)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[K]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
KH-0021 (SEQ ID NO: 32)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[K]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0006 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3' XH-0047 (SEQ ID NO: 24)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[TP]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0048 (SEQ ID NO: 32)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[TP]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0002 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0049 (SEQ ID NO: 24)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[Gly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0050 (SEQ ID NO: 32)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[Gly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0004 (SEQ ID NO: 23)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0051 (SEQ ID NO: 24)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[GlyGly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0052 (SEQ ID NO: 32)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[GlyGly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
Como control positivo, se usó NI-0205 del Ejemplo 4.
(2) Medición del nivel de expresión del gen HMGA2
Por un método similar al del Ejemplo 4, excepto que la célula en la que se introduce cada ARN antes mencionado es HepG2 (ATCC), y la concentración final de cada ARN antes mencionado fue de 0,2 nmol/L, se determinó el nivel de expresión del gen HMGA2.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 8, el let-7a de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión de ARNm de HMGA2 al mismo nivel que el de la variante de control positivo pre-let-7a. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de HMGA2 incluso cuando se alteró la estructura no nucleotídica del conector o se introdujo la secuencia adicional en la región X.
Ejemplo 8
En base a la información de secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera de miR-29b maduro (núm. de acceso en miRBase MI0000105), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una estructura no nucleotídica diferente en la región conectora y una longitud diferente de bases en la secuencia adicional en la región X, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de COL1A1 del gen diana.
(1) Síntesis de miARN
Por un método similar al del Ejemplo 5, se sintetizaron varios miR-29b de tipo natural en los que la región X está compuesta por la cadena pasajera (SEQ ID NO: 10) y una secuencia adicional (longitud de 0, 3 o 5 bases), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena guía, una región saliente de la cadena pasajera antes mencionada y una secuencia completamente complementaria a la secuencia adicional antes mencionada, están unidas a través de un conector de derivado de prolina ([P]), derivado de lisina ([K] ), derivado del ácido tereftálico ([TP]), derivado de glicina ([Gly]) o derivado de glicilglicina ([GlyGly]). En la síntesis antes mencionada del miARN de tipo natural, cada estructura no nucleotídica se introdujo de la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2.
PH-0040
GCUGGUUUCA U AUGGUG Gü UUAGA
UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUP
PH-0042
gcugguuvcaüauggugg j uuagj.ucc
UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAGG F
PH-0108
GCOGGUUUCA AÜGGÜGGÜUUAGÍUCCGG UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAGGCCP
KH-0008 XH-0021
GCUGGUUUCA AUGGUG'vJUAGA k gcugguuuca auggugguuuaga
UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCU* UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCU
KH-0022 XH-0053
rj £T*
GCUGGUUUCA0AUGGUGWJUVAGAUCC GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAUCC
UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAGG K UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAGGTP
KH-0023 XH-0054
GCUGGUUUCA U AUGGUG 3U UDAGAUCCGG GCUGGUUUCA U AUGGUG GU UUAG UCCGG ^^
UUGUGACUAAAGU0UACCAC--GAUCUAGGCC K UUGUGACUAAAGUUACCAC--GAUCUAGGCC'
XH-0017 XH-0019
GCUGGC7I UGÍ GCUGGUUUCA AUGGUG° ""üUAGA
Gly GlyGly
UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCÜ UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCU
XH-0055 XH-0057
GCU< UCC GCUGGUI UCC
Gly GlyGly
UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAGG UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAGG
XH-0056 XH-0058
GGUGGU! JUCA AUGGUG UUAGAOCOGG UUl UCCGG
Gly GG
UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAGGCC UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAGGCC
En la siguiente secuencia, [P] representa una estructura no nucleotídica del derivado de prolina, [K] representa una estructura no nucleotídica del derivado de lisina, [TP] representa una estructura no nucleotídica del derivado del ácido tereftálico, [Gly] representa una estructura no nucleotídica del derivado de glicina y [GlyGly] representa una estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina. En las siguientes secuencias, la región del lado 5' de cada conector es la región X, y en la región X antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada, el resto es la secuencia adicional antes mencionada, y el 3'- la región lateral de cada conector es la región Y, y en la región Y antes mencionada, la parte subrayada es la secuencia de cadena guía antes mencionada. PH-0040 (SEQ ID N.°: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[P] -UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 ’
PH-0042 (SEQ ID NO: 29)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]
GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0108 (SEQ ID NO: 33)
5' -gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]
CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
KH-0008 (SEQ ID N.°: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]
UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
KH-0022 (SEQ ID N.° 29)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[K]
GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
KH-0023 (SEQ ID N.° 33)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[K]
CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0021 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]—
UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
XH-0053 (SEQ ID NO: 29)
5' -gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[TP]
GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
XH-0054 (SEQ ID N.° 33)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[TP]
CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0017 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0055 (SEQ ID NO: 29)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[Gly]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0056 (SEQ ID N.° 33)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[Gly]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
XH-0019 (SEQ ID NO: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly] -UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
XH-0057 (SEQ ID NO: 29)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[GlyGly]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
XH-0058 (SEQ ID N.° 33)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[GlyGly] CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
Como control positivo, se usó NI-0210 del Ejemplo 5.
(2) Medición del nivel de expresión del gen COL1A1
Por un método similar al del Ejemplo 5, excepto que la concentración final de cada ARN antes mencionado fue de 0,5 nmol/L, se determinó el nivel de expresión del gen COL1A1.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 9, el miR-29b de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión de ARNm de COL1A1 al mismo nivel que el de la variante pre-miR-29b de control positivo. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de COL1A1 incluso cuando se alteró la estructura no nucleotídica del conector o se introdujo la secuencia adicional en la región X.
Ejemplo 9
En base a la información de secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera del miR-34a maduro (número de acceso en miRBase MI0000268), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una secuencia de bases diferente de la secuencia adicional (0, 3, 5 o 7 bases de longitud) en la región X, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de AXL del gen diana.
(1) Síntesis de miARN
Por un método similar al del Ejemplo 1, se sintetizó un miR-34a de tipo natural en el que la región X está compuesta por la cadena guía (SEQ ID NO: 1) y una secuencia adicional (longitud de 0, 3, 5 o 7 bases), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena pasajera, una región saliente de la cadena guía antes mencionada y una secuencia complementaria (secuencia completamente complementaria o parcialmente complementaria) a la secuencia adicional antes mencionada, se unen a través de una estructura no nucleotídica de un derivado de prolina.
PH-0036 -dggcagugu- cuua gcugguugu^
F
* * A
espaciador 3
PH-0038 PH-0062
ug g c a g u g u - cuua g c u g g u u g u u c c , üGGCAGUGU - cuua g c u g g u u g u c g g ,
Figure imgf000042_0001
AGUU
PH-0058 PH-0063
UGGCAGUGU-aJUAGCÜGGÜUGUUAA uGGCAGUGU-CUU GCUGGUUGUUGG,
CCGUCAUA GAA-CGACUAACAAÜU AGCC
PH-0059 PH-0064
U UGGCAGUGU-CUUAGCUGGUUGUUGG GGCAGUGU-CUU GCUGGUUGUUAA,
CCGUCAUA GAA-CGACyAACAAUÜ AGUU
W é
PH-0060 PH-0065
ug g c a g u g u - cuua gcug gu ugu cg g UGGCAGUGU -CUUA GCUGGUUGUUGG
CCGUCAUA GAA-CGACUAACAGCC '4 AGUU
PH-0061
üg g ca g u g u - cuuag c ug gu ugu ca a
CCGUCAyA GAA-CGACJJAACJUWO
Figure imgf000042_0002
En la secuencia antes mencionada, un asterisco representa una base no complementaria a la cadena guía correspondiente. El número después del "espaciador" representa la longitud de bases de la secuencia adicional de la región X antes mencionada.
En la siguiente secuencia, la parte subrayada es la secuencia de la cadena guía antes mencionada, y las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada. [P] representa una estructura no nucleotídica del derivado de prolina antes mencionado.10
PH-0036 (SEQ ID NO: 14)
PH-0038 (SEQ ID NO: 15)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]
GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
PH-0058 (SEQ ID NO: 34)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAA-[P] UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0059 (SEQ ID NO: 35)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P] UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
PH-0060 (SEQ ID NO: 36)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCGG-[P] CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0061 (SEQ ID NO: 37)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCAA-[P] UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
PH-0062 (SEQ ID NO: 38)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCGG-[P] UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
PH-0063 (SEQ ID NO: 39)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P] CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0064 (SEQ ID NO: 40)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAA-[P] UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
PH-0065 (SEQ ID NO: 41)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P] UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0066 (SEQ ID NO: 16)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0067 (SEQ ID NO: 42)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAAUU-[P]-AAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0068 (SEQ ID NO: 17)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGGCC-[P] GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0069 (SEQ ID NO: 43)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAAUUAA-[P] UUAAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
Como control positivo, se usó NI-0208 del Ejemplo 1.
(2) Medición del nivel de expresión del gen AXL
Por un método similar al del Ejemplo 1, se determinó el nivel de expresión del gen AXL.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 10, el miR-34a de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión de ARNm de AXL al mismo nivel que el de la variante pre-miR-34a de control positivo. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de AXL incluso cuando la secuencia de bases de la secuencia adicional (longitud de 3, 5 o 7 bases) en la región X es diferente.
Ejemplo 10
En base a la información de secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera del miR-29b maduro (número de acceso en miRBase MI0000105), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una secuencia de bases diferente en la secuencia adicional (0, 3, 5 o 7 bases de longitud) en la región X, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de COL1A1 del gen diana. (1) Síntesis de miARN
Por un método similar al del Ejemplo 5, se sintetizaron varios miR-29b de tipo natural en los que la región X compuesta por la cadena pasajera (SEQ ID NO: 10) y una secuencia adicional (bases de longitud 0, 3, 5 o 7), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena guía, una región saliente de la cadena pasajera antes mencionada y una secuencia complementaria (secuencia completamente complementaria o parcialmente complementaria) a la secuencia adicional antes mencionada, se unen a través de una estructura no nucleotídica de un derivado de prolina.
PH-0040
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGA P UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCU
espaciador3
PH-0042 PH-0113
U Gü
GCUGGUVUCA AUGGUG UUAGAUCC- GCUGGÜUÜCA AUGGUG^UUAGACOG UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAGG P UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCOGUU P
PH-0109 PH-0114
GU U GU
GCUGGUUUCA U AUGGUG UUAGAOAA- GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAU06-UUGUGACUAAAGUyUACCAC— GAUCOAUU P UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUGCC P
PH-0110 PH-0115
U GU U GU GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGA0GG GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAUAA_
UUGUGACUAAAGU^UACCAC--GAUCUAUUP UUGUGACUAAAGUyUACCAC- - GAUCUGUU P
PH-0111 PH-0116
UGCUGGUUUCA AUGGUG GU UUAGíCGGp GCUGGUUUCAy AUGGUC^UUUAG;UGGp UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUGCC P UUGUGACUAAAGUyUACCAC- - GAUCUGUU P
PH-0112
GCUGGUUUC U GUA AUGGUG UUAGfCAAp
UUGUGACUAAAGUyUACCAC— GAUCUGUUP
espaciador 5 espaciador 7
PH-0108 PH-0118
GCUGGíUUUCh AUGGUG UUAGAÜCCGGp OC -JGGUUUCAUAUGGOGGOUU AGAOCCGGCC
UUGUGACUAAAGUyÜACCAC- -GAUCUAGGCCP UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAOCDAGGCCGG
PH-0117 PH-0119
gcugguuucauaugguggüuuagaoaauu GCUGGWUCAUAüGGUGGUUUAGAOAA!TOAA
UUGUGACÜAAAGÜyUACCAC- -GAUCÜAUUAA ÜUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCOAUUAAUU
En la secuencia antes mencionada, el número después del "espaciador" representa la longitud de bases de la secuencia adicional de la región X antes mencionada.
En la siguiente secuencia, la región del lado 5' del conector es la región X, en la región X antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada, el resto es la secuencia adicional antes mencionada, y la región del lado 3' del conector es la región Y, y en la región Y antes mencionada, la parte subrayada es la secuencia de cadena guía antes mencionada. [P] representa una estructura no nucleotídica del derivado de prolina antes mencionado.
PH-0040 (SEQ ID N.°: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[P] -UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
PH-0042 (SEQ ID NO: 29)
5' -gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]
GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0109 (SEQ ID NO: 44)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]
UUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0110 (SEQ ID N.°: 45)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]
UUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0111 (SEQ ID NO: 46)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]
CCGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0112 (SEQ ID NO: 47)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCAA-[P]
UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0113 (SEQ ID NO: 48)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]
UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0114 (SEQ ID NO: 49)
PH-0115 (SEQ ID NO: 50)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
PH-0116 (SEQ ID N.°: 51)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0108 (SEQ ID NO: 33)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]— CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0117 (SEQ ID NO: 52)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]— AAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
PH-0118 (SEQ ID NO: 53)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGGCC-[P] GGCCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0119 (SEQ ID NO: 54)
Figure imgf000046_0001
Como control positivo, se usó NI-0210 del Ejemplo 5.
(2) Medición del nivel de expresión del gen COL1A1
Por un método similar al del Ejemplo 5, excepto que la concentración final de cada ARN antes mencionado fue de 0,5 nmol/L, se determinó el nivel de expresión del gen COL1A1.
(3) Resultados
Como se representa en la Fig. 11, el miR-29b de tipo natural del Ejemplo inhibió la expresión del ARNm de COL1A1 al mismo nivel que el de la variante pre-miR-29b de control positivo. Además, se mantuvo un efecto inhibidor sobre la expresión de ARNm de COL1A1 incluso cuando la secuencia de bases de la secuencia adicional (longitud de 3, 5 o 7 bases) en la región X es diferente.
Ejemplo 11
En base a la información de la secuencia de la cadena guía y la cadena pasajera de miR-29b maduro (miRBase No. de acceso MI0000105), se sintetizaron varios miARN de tipo natural de la presente invención que tienen una estructura no nucleotídica diferente en la región conectora y una secuencia de bases diferente en la secuencia adicional (longitud de 0, 4 o 5 bases) en la región X, se introdujeron en células cultivadas y se examinó un efecto inhibidor sobre la expresión del ARNm de COL1A1 del gen diana.
(1) Síntesis de miARN
Por un método similar al del Ejemplo 5, se sintetizaron varios miR-29b de tipo natural en los que la región X está compuesta por la cadena pasajera (SEQ ID NO: 10) y una secuencia adicional (bases de longitud 0, 4 o 5), y la región Y que tiene, en el extremo 5' de la cadena guía, una región saliente de la cadena pasajera antes mencionada y una secuencia complementaria (secuencia completamente complementaria o parcialmente complementaria) a la secuencia adicional antes mencionada, están unidas a través de un conector del derivado de prolina ([P]) o derivado de glicilglicina ([GlyGly]). En la síntesis antes mencionada del miARN de tipo natural, cada estructura no nucleotídica se introdujo de la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2.
PH-0040
PH-0128 GCUGaUUUCAUArJGGÜGGUUUAGA U GU GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAOTJAAU UUGUGACüAAAGUyUACCAC--GAUCUP UUGUGACUAAAGUyUACCAC— GAUCUAAUUA P
PH-0117 PH-0129
g cu g g u u u ca uau g g u g g ü uuag u a u a u p g cu g g u u u ca uau ggu gg u uuag^ UAAUU
UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAUAUA P UUGUGACOAAAGUyUACCAC— GAUCUAUUAAP
PH-0130
PH-0120 U GU
U GU GCUGGUUUCA AUGGUG UUAG.-.ÜUAAAp GCUGGUUUCA AUGGUG UUAG UUUUUp
UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAAUUUP UUGUGACUAAAGUyUACCAC- - GAUCUAAAAA
PH-0131
PH-0121 U GU
U GU GCUGGUUUCA AUGGUG UUAG^UAUAAp GCUGGUUUCA AUGG'JS UUAG UUUUAp
UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAUAUU P UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAAAU P
PH-0132
PH-0122
g cu g g u u u ca uau g g u g g u u u ag a u aau a GCUGGUÜUCAUAUGGUSGUUUAG' UUUAU
UUGUGACUAAAGUyUACCAC— GAUCÜAUUAUP UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAAUAP
PH-0133
PH-0123 U SU
U Gü GCUGGUUUCA AUGGUG ÜUAGAUAAAU p GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAOQAOD UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAUUUA P UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAUAA P
PH-0124 PH-0134
U GU GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAUAÜUU _ g cu g g u u u ca u au g g u g g c u u a g a u a a a a _ UUGUGACUAAAGUyUACCAC- - GAUCUAUAAA K UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAUUUU
PH-0125 PH-0135
U GU GCUGGUUUCA°AUGGUGGUUUAG UUUAAp GCUGGUUUCA AUGGUG UJAGAUUUGG_ UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAAUU P UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAAUU P
PH-0126 PH-0136
U GU GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAUQAUA GCUGGUUUCAUAUGGUGGuUUAG UUUUUp UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAUAU P UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAAUU P
PH-0127 PH-0137
U GU U GU
GCUCGUUUCA AUGGUG UUAGAOAUUA UUAG AUUAAp UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAUAAU P UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUUAAUUP PH-0138 XH-0059
U GU _
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAJKJUÜÜ. GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAUUUAX
GlyGIy ÜUGÜGACÜAAAGUyUACCAC- - GAUOJUAAAA UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAAUU
PH-0139 PH-0143
U Gü U GU
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGACUUJUt. GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAUAAU^ UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUGAAUU UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAUUA
PH-0140 PH-0144
GU
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGACUUUU. GCUGGUUUCA AUGGUG UU/\G AOUAA ^
UUGUGACUAAAGUyUACCAC— GAUCUGAAAA UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUAAUU
PH-0141 PH-0145
U GU
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAGüUAA( GCUGGUUUCA AUGGUG^UUAGAUUGG
UUGUGACUAAAGUyUACCAC--GAUCUCAAUU UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAAUU
PH-0142 PH-0146
U GU GU
GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAGUUtJO. GCUGGUUUCA AUGGUG UUAGAUUUU UUGUGACUAAAGUyUACCAC— GAUCUCAAAA UUGUGACUAAAGUyUACCAC- -GAUCUAUUU
En la siguiente secuencia, [P] representa una estructura no nucleotídica del derivado de prolina y [GlyGly] representa una estructura no nucleotídica del derivado de glicilglicina. En las siguientes secuencias, la región del lado 5' de cada conector es la región X, en la región X antes mencionada, las letras minúsculas representan la secuencia de la cadena pasajera antes mencionada, el resto es la secuencia adicional antes mencionada, la región del lado 3' de cada conector es la región Y, y en la región Y antes mencionada, la parte subrayada es la secuencia de cadena guía antes mencionada.
PH-0040 (SEQ ID N.°: 28)
5'-gcugguuucauauggugguuuaga- [P]
UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0117 (SEQ ID NO: 52)
5' -gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]
AAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0120 (SEQ ID NO: 55)
5 ' -gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]
AAAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0121 (SEQ ID NO: 56)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUA-[P]-UAAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0122 (SEQ ID NO: 57)
5 ' -gcugguuucauauggugguuuagaUUUAU-[P]
AUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0123 (SEQ ID NO: 58)
5 ' -gcugguuucauauggugguuuagaUUAUU-[P]
AAUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0124 (SEQ ID NO: 59)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUU-[P]-AAAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0125 (SEQ ID NO: 60)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0126 (SEQ ID N.°: 61)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAUA-[P]-UAUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU- 3'
PH-0127 (SEQ ID NO: 62)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUA-[P]— UAAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU- 3'
PH-0128 (SEQ ID N.°: 63)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAU-[P]— AUUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0129 (SEQ ID N.°: 64)
5 ' -gcugguuucauauggugguuuagaUAUAU-[P]-AUAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU- 3'
PH-0130 (SEQ ID N.°: 65)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAA-[P]— UUUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0131 (SEQ ID NO: 66)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAUAA-[P]-UUAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0132 (SEQ ID NO: 67)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUA-[P]— UAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU- 3'
PH-0133 (SEQ ID NO: 68)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAU-[P]-AUUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0134 (SEQ ID NO: 69)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAA-[P]-UUUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0135 (SEQ ID NO: 70)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUGG-[P] -UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0136 (SEQ ID N.°: 71)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
PH-0137 (SEQ ID NO: 72)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaAUUAA-[P]— UUAAUUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
PH-0138 (SEQ ID N.°: 73)
5f-gcugguuucauauggugguuuagaAUUUU-[P]-AAAAUUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU- 3 '
PH-0139 (SEQ ID NO: 74)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCUUAA-[P]— UUAAGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
PH-0140 (SEQ ID NO: 75)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCUUUU-[P]-AAAAGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU- 3'
PH-0141 (SEQ ID N.°: 76)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaGUUAA-[P]-UUAACUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0142 (SEQ ID N.°: 77)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaGUUUU-[P]— AAAACUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU- 3'
PH-0143 (SEQ ID NO: 78)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAU-[P]-AUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0144 (SEQ ID NO: 79)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAA-[P]— UUAAU CUAGCAC CAUUUGAAAUCAGUGUU- 3'
PH-0145 (SEQ ID N.°: 80)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUGG-[P]-UUAAU CUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
PH-0146 (SEQ ID N.°: 81)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUU-[P]— UUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
XH-0059 (SEQ ID NO: 60)
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[GlyGly]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3 '
Como control positivo, se usó NI-0210 del Ejemplo 5.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un miARN de tipo natural, que es un ácido nucleico monocatenario que comprende la región X y la región Y, en el que el extremo 3' de dicha región X y el extremo 5' de dicha región Y están unidos mediante una región conectora de una estructura no nucleotídica,
dicha región X comprende (a) una secuencia de cadena guía o (b) una secuencia de cadena pasajera de un miARN maduro,
cuando la región X comprende (a), dicha región Y comprende una secuencia de cadena pasajera de dicho miARN maduro,
cuando la región X comprende (b), dicha región Y comprende una secuencia de cadena guía de dicho miARN maduro, dicha región X comprende además una secuencia adicional, en la que la longitud de dicha secuencia adicional es de 3 a 5 bases, y
dicha secuencia de la cadena guía y dicha secuencia de cadenas pasajeras forman una estructura de doble cadena.
2. El miARN de tipo natural según la reivindicación 1, en el que cuando dicha región Y y dicha región X están alineadas, dicha región Y tiene un saliente en el extremo 3 ', opcionalmente en el que dicho saliente tiene una bases de longitud de 0 a 4.
3. El miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que:
(a) dicha secuencia adicional está conectada al extremo 3' de dicha secuencia de cadena guía o cadena pasajera, opcionalmente
en el que dicha región X tiene una longitud de 19 a 35 bases; y/o
(b) dicha región Y tiene una longitud de 21 a 37 bases; y/o
(c) una longitud total es una longitud de 40 a 68 bases; y/o
(d) dicha región conectora comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste en un resto de aminoácido, un resto de poliamina y un resto de ácido policarboxílico.
4. El miARN de tipo natural según la reivindicación 3 (d), en el que:
(a) dicha región conectora comprende un resto de ácido policarboxílico, opcionalmente un resto de ácido tereftálico; o (b) dicha región conectora comprende un resto de aminoácido, en el que opcionalmente dicho resto de aminoácido es un resto de glicina, un resto de amida de ácido tereftálico, un resto de prolina o un resto de lisina.
5. El miARN de tipo natural según la reivindicación 4 (b), en el que dicho resto de aminoácido comprende una pluralidad de restos de aminoácido conectados entre sí, en el que opcionalmente dicha pluralidad de restos de aminoácido se conectan para formar un resto de un dímero o trímero de glicina.6
6. El miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho resto conector está representado por la siguiente fórmula química (I-0):
Figure imgf000065_0001
( I - o )
en dicha fórmula química (I-0),
Q11 y Q12 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2 (un grupo metileno), NH (un grupo imino), C=O (un grupo carbonilo), C=S (un grupo tiocarbonilo), C=NH (un grupo iminometileno), O, o S,
Q1 y Q2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2 (un grupo metileno), NH (un grupo imino), C=O (un grupo carbonilo), C=S (un grupo tiocarbonilo), C=NH (un grupo iminometileno), O, o S,
Y1 y Y2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2, NH, O, o S;
L1 es un enlace sencillo o una cadena de alquileno que tiene n átomos de carbono, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido por OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH o SRa, o L1 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en dicha cadena de alquileno por un átomo de oxígeno,
siempre que: cuando Y1 es NH, O o S, un átomo unido a Y1 en L1 es carbono, un átomo unido a OR1 en L1 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
L2 es un enlace sencillo o una cadena de alquileno que tiene m átomos de carbono, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido por OH, Oc, NH2, NHRc, NRcRd, SH o SRc, o
L2 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en dicha cadena de alquileno por un átomo de oxígeno,
siempre que: cuando Y2 es NH, O o S, un átomo unido a Y2 en L2 es carbono, un átomo unido a OR2 en L2 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
Ra, Rb, Rc y Rd son cada uno independientemente un sustituyente o un grupo protector;
m es un número entero en el intervalo de 1 a 30;
n es un número entero en el intervalo de 1 a 30;
dichas regiones X e Y están unidas cada una a dicho resto conector a través de -OR1- o OR2-,
donde R1 y R2 pueden estar presentes o no, y cuando están presentes, R1 y R2 son cada uno independientemente un resto de nucleótido o dicha estructura (I-0); y
A es cualquier grupo atómico.
7. El miARN de tipo natural según la reivindicación 6, en el que:
(a) Q11 y Q12 en dicha fórmula química (I-0) son cada uno un grupo carbonilo, opcionalmente
donde:
(i) Q1 y Q2 en dicha fórmula química (I-0) son cada uno un grupo imino; o
(ii) donde la siguiente fórmula química (Ia) tiene una estructura representada por la siguiente fórmula química (Ia2):
Figure imgf000066_0001
en dicha fórmula química (Ia2),
R100 es cualquier sustituyente, que puede estar presente o no, cuando está presente, puede estar presente individualmente o en pluralidad, y cuando está presente en pluralidad, pueden ser iguales o diferentes entre sí; o (b) dicha fórmula química (Ia2) tiene una estructura representada por la siguiente fórmula química (Ia3):
Figure imgf000066_0002
o
(c) donde Q9 *11 y Q12 en dicha fórmula química (I-0) son cada uno un grupo imino, opcionalmente donde Q1 y Q2 en dicha fórmula química (I-0) son cada uno un grupo carbonilo.
8. El miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1,2 y 3 (b) a 4 (a), en el que:
(a) dicha región conectora comprende un resto de aminoácido, y dicho resto de aminoácido está representado por la siguiente fórmula química (I):
Figure imgf000067_0001
( I )
en dicha fórmula química (I),
X1 y X2 son cada uno independientemente H2, O, S o NH;
Y1 y Y2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2, NH, O o S;
L1 es una cadena de alquileno que tiene n átomos de carbono, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido por OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH o SRa, o L1 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en dicha cadena de alquileno por un átomo de oxígeno, siempre que: cuando Y1 es NH, O, o S, un átomo unido a Y1 en L1 es carbono, un átomo unido a OR1 en L1 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
L2 es una cadena de alquileno que tiene m átomos de carbono, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido por OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH, o SRc, o L2 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en dicha cadena de alquileno por un átomo de oxígeno, siempre que: cuando Y2 es NH, O, o S, un átomo unido a Y2 en L2 es carbono, un átomo unido a OR2 en L2 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
Ra, Rb, Rc y Rd son cada uno independientemente un sustituyente o un grupo protector;
m es un número entero en el intervalo de 0 a 30;
n es un número entero en el intervalo de 0 a 30;
dichas regiones X e Y están unidas cada una a dicho resto de aminoácido a través de -OR1- u OR2-,
donde R1 y R2 pueden estar presentes o no, y cuando están presentes, R1 y R2 son cada uno independientemente un resto de nucleótido o dicha estructura (I); y
A es cualquier grupo atómico, siempre que la siguiente fórmula química (Ia) sea un aminoácido o péptido:
Figure imgf000067_0002
y/o
(b) dicho aminoácido en dicho resto de aminoácido es al menos uno de un aminoácido natural y un aminoácido artificial, en el que opcionalmente dicho aminoácido natural es un aminoácido que constituye una proteína.
9. El miARN de tipo natural de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 4 (b) a 5, y 8, en el que dicho aminoácido en dicho resto de aminoácido es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en glicina, aalanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, glutamina, ácido glutámico, histidina, isoleucina, leucina, lisina, hidroxilisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, valina, prolina, 4-hidroxiprolina, triptófano, p-alanina, 1-amino-2-carboxiciclopentano, ácido aminobenzoico, ácido aminopiridincarboxílico y aminoácido representado por la siguiente fórmula química (Ia2), y opcionalmente además tiene un sustituyente o un grupo protector:
Figure imgf000068_0001
en dicha fórmula química (Ia2),
R100 es cualquier sustituyente, que puede o no estar presente, cuando está presente, puede estar presente individualmente o en pluralidad, y cuando está presente en pluralidad, pueden ser iguales o diferentes entre sí, opcionalmente en donde dicha fórmula química (Ia2) tiene una estructura representada por la siguiente fórmula química (Ia3):
Figure imgf000068_0002
10. El miARN de tipo natural según la reivindicación 6 u 8a, en el que dicha fórmula química (I-0) o (I) tiene una estructura de las siguientes fórmulas químicas (I-1) -(I-7) y, en las siguientes fórmulas químicas (I-1) -(I-7), n es un número entero de 0 a 30 y m es un número entero de 0 a 30:
Figure imgf000069_0001
opcionalmente donde:
(a) en dicha fórmula química (I-1), n=11 y m=12, o n=5 y m=4, o
(b) en dicha fórmula química (I-4), n=5 y m=4; o
(c) en dicha fórmula química (I-6), n=4 y m=4; o
(d) en dicha fórmula química (I-7), n=5 y m=4.
11. El miARN de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 4 (b), en el que una estructura no nucleotídica de dicha región conectora comprende al menos uno de un esqueleto de pirrolidina y un esqueleto de piperidina.
12. El miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 (d), en el que dicha estructura no nucleotídica está representada por la siguiente fórmula (II):
Figure imgf000069_0002
donde,
X1 y X2 son cada uno independientemente H2, O, S o NH;
Y1 y Y2 son cada uno independientemente un enlace sencillo, CH2, NH, O o S;
R3 es un átomo de hidrógeno o un sustituyente que está unido a C-3, C-4, C-5 o C-6 en el anillo A,
L1 es una cadena de alquileno que tiene n átomos, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido por OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, o SRa, o L1 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en dicha cadena de alquileno con un átomo de oxígeno,
siempre que: cuando Y1 es NH, O o S, un átomo unido a Y1 en L1 es carbono, un átomo unido a OR1 en L1 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
L2 es una cadena de alquileno que tiene m átomos, y un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono de alquileno puede o no estar sustituido con OH, Oc, NH2, NHRc, NRcRd, SH o SRc, o L2 es una cadena de poliéter obtenida sustituyendo al menos un átomo de carbono en dicha cadena de alquileno por un átomo de oxígeno,
siempre que: cuando Y2 es NH, O, o S, un átomo unido a Y2 en L2 es carbono, un átomo unido a OR2 en L2 es carbono y los átomos de oxígeno no son adyacentes entre sí;
Ra, Rb, RCy RD son cada uno independientemente un sustituyente o un grupo protector;
l es 1 o 2;
m es un número entero en el intervalo de 0 a 30;
n es un número entero en el intervalo de 0 a 30; y
en el anillo A, un átomo de carbono distinto de dicho C-2 en el anillo A puede estar sustituido por nitrógeno, oxígeno 0 azufre, y puede contener, en dicho anillo A, un doble enlace carbono-carbono o un doble enlace carbono-nitrógeno, dichas regiones (X) e (Y) están unidas cada una a dicha estructura no nucleotídica a través de -OR1- u OR2-, donde R1 y R2 pueden estar presentes o no, y cuando están presentes, R1 y R2 son cada uno independientemente un resto de nucleótido o dicha estructura (I).
13. El miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que:
(a) dicha región X comprende una secuencia de cadena guía de un miARN maduro seleccionado del grupo que consiste en hsa-miR-34 o hsa-let-7, opcionalmente
(i) en el que dicho miARN maduro es hsa-miR-34a, preferiblemente en el que la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 - 17, o SEQ ID NO: 34 - 43; o (ii) en el que dicho miARN maduro es hsa-let-7a, preferiblemente en el que la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 o 24 o SeQ ID NO: 32; o
(b) dicha región X comprende una secuencia de cadena pasajera de un miARN maduro de hsa-miR-29b, en el que opcionalmente la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28 o 29 o SEQ ID NO: 33 y 44-81.
14. Una composición para uso en la inhibición de la expresión de un gen diana, que comprende el miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que opcionalmente dicho miARN de tipo natural se administra a un animal no humano.
15. Una composición farmacéutica que comprende el miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. Un método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana, que comprende usar el miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende opcionalmente una etapa de administrar dicho miARN de tipo natural a una célula, un tejido u órgano.
17. Un ácido nucleico monocatenario para su uso en el tratamiento de una enfermedad, que es el miARN de tipo natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha secuencia de cadena guía de dicho miARN de tipo natural es una secuencia de cadena guía de un miARN maduro que inhibe la expresión de un gen implicado en dicha enfermedad.
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