KR20100131509A - Ｒｎａ 간섭 효과가 높은 2본쇄 지질 수식 ｒｎａ - Google Patents

Ｒｎａ 간섭 효과가 높은 2본쇄 지질 수식 ｒｎａ Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 뉴클레아제 내성 및 세포 내 도입률이 높고, 우수한 RNA 간섭 효과를 발휘할 수 있는 신규 2본쇄 RNA를 제공하는 것이다.　
본 발명은 표적 유전자 중의 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 센스쇄 RNA, 및 상기 센스쇄 RNA에 상보적인 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄 RNA를 갖고, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 2본쇄 RNA에서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드의 적어도 1개에 직접 또는 링커를 통해 2본쇄 지질을 결합시킨 2본쇄 지질 수식 RNA를 제공한다.

Description

ＲＮＡ 간섭 효과가 높은 2본쇄 지질 수식 ＲＮＡ{DOUBLE-STRANDED LIPID-MODIFIED RNA HAVING HIGH RNA INTERFERENCE EFFECT}
본 발명은 표적 유전자의 발현을 효율적으로 억제할 수 있는 2본쇄 지질 수식 RNA에 관한 것이다.　 보다 구체적으로는, 뉴클레아제 내성 및 세포 내 도입률이 높고, 우수한 RNA 간섭 효과를 발휘할 수 있는 2본쇄 지질 수식 RNA에 관한 것이다.　 또한, 본 발명은 상기 2본쇄 지질 수식 RNA를 이용한 의약 조성물, 및 표적 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다.　
암이나 에이즈 등의 난치병을 효율적으로 치료하는 의약의 개발은 생명과학 분야에서의 하나의 큰 과제이다.　 이 과제를 극복할 수 있을 가능성이 있는 유력한 방법의 하나로서, 특정한 유전자에게만 작용하는 유전자 의약이 있다.　 이 유전자 의약 중에서도 특히 최근 21 염기가 짧은 2본쇄 RNA(small interfering RNA: siRNA)를 이용하는 RNA 간섭(RNA interference: RNAi)법이 주목받고 있다.　 이 RNAi법은 1998년에 Fire 등에 의해 처음으로 보고되었다(비특허문헌 1 참조).　 Fire 등의 보고에 따르면, 기능을 저해하고자 하는 유전자의 특정 영역과 상동인 100 염기쌍 정도의 2본쇄 RNA를 세포 내에 도입시킴으로써 세포질 내에서 Dicer의 작용에 의해 20 내지 25 염기쌍 정도의 2본쇄 RNA로 분해되고, 그 후 복수의 단백질과 RNA/단백질 복합체를 형성하고(이 복합체를 RICS: RNA-induced silencing complex라고 부름), 표적 유전자로부터 산출된 mRNA의 상동 부위와 결합하여 강력하게 유전자 발현을 억제한다고 하는 것이다.　 그러나, 포유 세포에서는, 약 30 염기쌍 이상의 긴 2본쇄 RNA를 도입시키면, 바이러스 응답 반응인 인터페론 반응이 유도되어 결과적으로 세포가 죽어 버리는 현상이 보고되어, 포유 동물 세포계에서는 RNAi법은 적용하기 어렵다고 생각되었다.　 따라서 Tuschl 등은, 2본쇄 RNA의 양 3' 말단에 댕글링 엔드(dangling end)를 갖는 21 염기 길이의 2본쇄 RNA를 화학적으로 합성하고, 포유 동물 세포에 직접 도입시킴으로써 인터페론 응답을 회피하여 서열 특이적으로 높은 유전자 발현 억제능을 나타내는 것을 보고하였다(비특허문헌 2 참조).　 또한 그들은 2본쇄 영역이 19 염기쌍이고, 3' 말단 또는 5' 말단에 다양한 길이의 댕글링 엔드쇄를 갖는 짧은 2본쇄 RNA를 합성하여 RNA 간섭 효과를 검토하였다.　 그 결과, 양 3' 말단에 2 염기의 댕글링 엔드를 갖는 21 염기 길이의 siRNA는 매우 높은 RNA 간섭 효과가 관측되었지만, 그것 이외의 모든 타입의 짧은 2 본쇄 RNA에서는 현저한 RNA 간섭 효과가 관측되지 않았다.　 이 보고에 의해, 오늘날에는 21 염기 길이이고, 양 3' 말단에 2 염기의 댕글링 엔드를 갖는 2본쇄 RNA를 이용한 RNA 간섭법이 일반적으로 되어 있다.　 여기서는 21 염기 길이의 짧은 2본쇄 RNA를 이용하여 표적 유전자 발현을 저해하는 방법을 RNAi법과 구별하여 siRNA법이라고 부른다.　
이 siRNA법은 합성 RNA를 이용하기 때문에 샘플 조정도 비교적 용이하고, 취급 조작도 간편하고, 또한 매우 강력한 효과를 나타내기 때문에, 생명과학 분야뿐만아니라 바이오 비즈니스 분야에서도 큰 주목을 받고 있다.　
그러나, 이 우수한 siRNA법에도 해결해야만 하는 문제점이 있다.　 상기한 바와 같이, siRNA는 RNA 분자로 구성되어 있고, 세포 내 및 배지 중에 포함되는 뉴클레아제의 작용에 의해 빠르게 분해된다.　 또한 2본쇄 RNA 영역은 1본쇄 RNA에 비하여 비교적 높은 뉴클레아제 내성을 나타내지만, 19 염기쌍으로 이루어지는 2본쇄 RNA는 거의 종래의 RNA 간섭 효과를 나타내지 않는다.　 그 때문에 합성 siRNA는 표적 유전자 서열을 갖는 세포에의 도입 후, 2일 내지 4일간 정도까지는 높은 유전자 발현 억제 효과를 나타내지만, 그 후에는 RNA 간섭 효과가 급격히 약해져, 7일 정도에서 RNA 간섭 효과가 거의 없어진다고 보고되어 있다.　
최근 들어, 합성 siRNA에서 세포 도입성이 우수하여 장시간 고활성의 RNA 간섭 효과를 획득하기 위해서 여러가지 화학 수식형 siRNA가 보고되어 있다.　 예를 들면, 엑소뉴클레아제로부터의 분해 내성을 획득하기 위하여, siRNA의 말단을 아미노기나 티올기, 어베이식(abasic) 등으로 수식한 siRNA가 합성되어 있다.　 그러나, 말단을 수식한 21 염기 길이의 siRNA의 대부분의 경우에서, RNA 간섭 효과가 현저하게 감소한다고 이미 보고되어 있다.　
한편, 최근 들어, J. Rossi 등의 보고에 의해, 27 염기쌍으로 이루어지는 2본쇄 RNA가 21 염기 길이로 이루어지는 siRNA에 비하여 100배 정도 높은 RNA 간섭 효과를 나타내는 것이 분명해졌다(비특허문헌 3 참조).　 이것은, 27 염기쌍으로 이루어지는 RNA가 RNase III 타입의 효소인 Dicer에 의해서 21 염기 길이의 siRNA로 절단된 후, 단백질 복합체인 RISC에 그대로 인식되고, 고효율로 siRNA 효과를 발휘할 수 있기 때문이라고 생각되고 있다.　
이와 같이, 27 염기 길이의 RNA는 우수한 RNA 간섭 효과를 발휘할 수 있기 때문에, 금후, 유전자 의약으로서의 응용이 점점 기대되고 있다.　 그러나, 27 염기 길이의 RNA에 의한 RNA 간섭 효과를 보다 증강시키기 위해서는, 어떠한 기술적 수단이 유효할지에 대해서는 일체 알려져 있지 않다.　 또한, RNA 간섭 효과를 발휘하는 2본쇄 RNA에 대해서, 27 염기 길이의 RNA뿐만 아니라, 다른 염기 길이의 RNA에 대해서도 RNA 간섭 효과를 높이기 위한 기술적 수단에 대해서는 분명하게 되어 있지 않다.　
또한, RNA 간섭 효과를 발휘하는 2본쇄 RNA에서는, 말단에 댕글링 엔드를 갖는 구조가 일반적으로 채용되고 있지만, 말단에 댕글링 엔드를 갖고 있지 않은 구조(즉, 평활 말단을 갖는 구조)에 대해서도, RNA 간섭 효과의 검토가 행하여지고 있다.　 그러나, 센스쇄 RNA의 5' 말단측을 평활 말단으로 한 구조에서는, 센스쇄 RNA의 5' 말단측에 댕글링 엔드가 있는 경우에 비하여, RNA 간섭 효과가 거의 변하지 않는, 또는 RNA 간섭 효과가 감소하는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 4 참조).　
한편, 지질은 세포막에 대한 친화성 및 투과성이 높아, 세포 내에 약물을 송달하는 데 유용한 것을 알고 있다.　 이러한 지질을 RNA 간섭 효과를 발휘하는 2본쇄 RNA에 결합시킴으로써, 세포 내 도입률을 높여, RNA 간섭 효과를 보다 한층 유효하게 발휘하게 할 것이 기대된다.　 그러나, RNA 간섭 효과를 발휘하는 2본쇄 RNA에 단순히 지질을 결합시키면, RNA 간섭 효과의 현저한 감소·약화를 초래하는 것을 알고 있고, 종래 기술에서는, 우수한 RNA 간섭 효과와 지질에 기초하는 유용 효과를 겸비한 지질 수식 RNA를 구축할 수 없는 것이 현실이다.　
Fire et. al., Nature, 391, 806-811 (1998) Tuschl et. al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001) J. Rossi et. al., Nature Biotech., 23, 222-226 (2005) J. T. Marques et. al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2006)
본 발명은 뉴클레아제 내성 및 세포 내 도입률이 높고, 또한 우수한 RNA 간섭 효과를 발휘할 수 있는 신규 2본쇄 RNA를 제공하는 것을 목적으로 한다.　 또한, 본 발명은 상기 신규 2본쇄 RNA를 이용한 의약 조성물, 및 표적 유전자의 발현 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.　
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 바, 표적 유전자 중의 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 센스쇄 RNA, 및 상기 센스쇄 RNA에 상보적인 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄 RNA를 갖고, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 2본쇄 RNA에서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드의 1개 이상에 직접 또는 링커를 통해 2본쇄의 지질을 결합시킴으로써 뉴클레아제 내성, 세포 내 도입률, 및 RNA 간섭 효과를 현저하게 향상시킨 RNA를 구축할 수 있는 것을 발견하였다.　 본 발명은 이러한 지견에 기초하여, 더욱 개량을 거듭함으로써 완성한 것이다.　
즉, 본 발명은 하기에 게시한 2본쇄 지질 수식 RNA, 의약 조성물, 사용, 및 표적 유전자의 발현 억제 방법을 제공한다.　
항 1. 표적 유전자 중의 표적 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 센스쇄 RNA, 및 상기 센스쇄 RNA에 상보적인 염기 서열을 갖는 안티센스쇄 RNA를 갖고, 또한 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 2본쇄 RNA로서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드의 1개 이상에 직접 또는 링커를 통해 2본쇄 지질이 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 2. 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 평활 말단이고, 또한 상기 센스쇄 RNA의 3' 말단측이 평활 말단 또는 댕글링 엔드를 갖고 있는, 항 1에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 3. 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 댕글링 엔드를 갖고 있는, 항 1에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 4. 상기 센스쇄 RNA를 구성하는 뉴클레오티드의 수가 21 내지 27인, 항 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 5. 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄가 각각 27개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는, 항 2에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 6. 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄가 각각 23개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는, 항 2에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 7. 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA가 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 또한 상기 안티센스쇄가 23개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는, 항 2에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 8. 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄가 각각 21개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는, 항 3에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 9. 상기 2본쇄 지질을 구성하는 2개의 소수기가 동일 또는 상이하고, 탄소수 6 내지 50의 포화 지방산 잔기 또는 불포화 지방산 잔기인, 항 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 10. 상기 2본쇄 지질이 글리세로인지질, 글리세로당지질, 디아실글리세롤, 또는 세라마이드인, 항 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 11. 상기 2본쇄 지질이 글리세로인지질인, 항 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 12. 상기 2본쇄 지질이 포스파티딜에탄올아민인, 항 11에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 13. 상기 2본쇄 지질이 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜에탄올아민, 및 디올레일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 항 12에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
항 14. 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드의 1개 이상에, 하기 화학식 (L-27)로 표시되는 구조의 링커를 통해 지질이 결합하고 있는, 항 1 내지 13 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA.
Figure pct00001
[식 중, n3 및 n4는 동일 또는 상이하고, 1 내지 20의 정수를 나타냄]
항 15. 항 1 내지 14 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA와, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
항 16. 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 의약을 제조하기 위한, 항 1 내지 14 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA의 사용.
항 17. 항 1 내지 14 중 어느 하나에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA를 세포 내로 도입하는 공정을 포함하는, 표적 유전자의 발현 억제 방법.
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 2본쇄 지질로 수식되어 있고, 이것에 의해서 비약적으로 RNA 간섭 효과가 향상하고 있다.　 특히, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 특정한 부위에 대하여 2본쇄 지질이 결합함으로써, Dicer에 의한 프로세싱이나 RISC와의 복합체 형성능을 방해하지 않고, 더구나 뉴클레아제 내성 및 RNA 간섭 효과가 현저하게 향상하고 있기 때문에, 의약 용도에의 응용에 크게 공헌할 수 있다.　
또한, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 단독으로도 현저하게 우수한 세포 내 이행능을 나타내기 때문에, 종래의 유전자 도입 시약을 별도 이용하지 않고서, 또는 종래의 유전자 도입 시약의 사용량을 감소시켜서 세포 내에 도입하는 것도 가능하다.　 따라서, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 종래의 유전자 도입 시약의 사용에 의해서 염려되는 세포 독성의 발현을 억제할 수 있어, 임상적인 응용에 있어서 높은 안전성을 확보할 수 있다.　
이 때문에, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 이용한 의약 조성물 또는 표적 유전자의 발현 억제 방법에 따르면, 보다 효과적으로 표적 유전자의 발현을 억제 또는 저해하는 것이 임상상 가능하게 된다.　
도 1은 실시예 1에 있어서, 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA를 HPLC 해석한 결과를 도시한 도면이다.　
도 2는 실시예 1에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 2본쇄 RNA의 형성을 확인한 결과를 도시한 도면이다.　 도 2의 A 중, (1)은 21nt siRNA, (2)는 DPPE L21A/L21B의 RNA, (3)는 POPE L21A/L21B의 RNA, (4)는 DOPE L21A/L21B의 RNA, (5)는 DMPE L21A/L21B의 RNA의 결과를 나타낸다.　 도 2의 B 중, (1)은 27nt dsRNA, (2)는 DPPE L27A/L27B의 RNA, (3)는 POPE L27A/L27B의 RNA, (4)는 DOPE L27A/L27B의 RNA, (5)는 DMPE L27A/L27B의 RNA의 결과를 나타낸다.　
도 3은 실시예 1에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 뉴클레아제 내성 결과를 도시한 도면이다.　
도 4는 실시예 1에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 Dicer에 의한 프로세싱을 검토한 결과를 도시한 도면이다.　
도 5는 실시예 1에 있어서, 2 nM 농도 시의 2본쇄 지질 수식 27nt dsRNA의 RNA 간섭 효과의 결과를 도시한 도면이다.　
도 6은 실시예 2에 있어서, 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA의 HPLC 해석 결과를 도시한 도면이다.　
도 7은 실시예 2에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 2본쇄 형성을 확인한 결과를 도시한 도면이다.　 도 7의 A 중, A-1의 (1)은 21nt siRNA, (2)는 DPPE v21A/v21B의 RNA의 결과를 나타내고, A-2의 (1)은 21nt siRNA, (2)는 POPE v27A/v27B의 RNA, (3)는 DOPE v27A/v27B의 RNA, (4)는 DMPE v27A/v27B의 RNA의 결과를 나타낸다.　 도 7의 B 중, (1)은 27nt dsRNA, (2)는 DPPE v27A/v27B의 RNA, (3)는 POPE v27A/v27B의 RNA, (4)는 DOPE v27A/v27B의 RNA, (5)는 DMPE v27A/v27B의 RNA의 결과를 나타낸다.　
도 8은 실시예 2에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 뉴클레아제 내성 결과를 도시한 도면이다.　
도 9는 실시예 2에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 Dicer에 의한 프로세싱을 검토한 결과를 도시한 도면이다.　
도 10은 실시예 2에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 HeLa, A549 세포 중 VEGF 유전자에 대한 RNA 간섭 효과의 결과를 도시한 도면이다.　
도 11a은 실시예 2에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 HeLa 세포 중 VEGF 유전자에 대한 세포 도입성의 결과를 도시한 도면이다.　 도면 중, FL에는 형광 현미경으로 촬영한 상, trans는 상기 FL과 동일 시야를 위상차 현미경으로 촬영한 상, merge는 상기 FL과 trans를 중첩시킨 상을 나타낸다.　
도 11b는 실시예 2에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 A549 세포 중 VEGF 유전자에 대한 세포 도입성의 결과를 도시한 도면이다.　 도면 중, FL에는 형광 현미경으로 촬영한 상, trans는 상기 FL과 동일 시야를 위상차 현미경으로 촬영한 상, merge는 상기 FL과 trans를 중첩시킨 상을 나타낸다.　
도 12는 실시예 3에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA를 HPLC 해석한 결과를 도시한 도면이다.　
도 13은 실시예 3에 있어서, 2본쇄 지질 수식 RNA의 합성을 확인한 결과를 도시한 도면이다.　
본 명세서에 있어서, 「평활 말단」이란 2본쇄 RNA의 말단 부분에서 센스쇄의 말단 영역과 그것에 대합하는 안티센스쇄의 말단 영역이 1본쇄 부분을 형성하지 않고(즉, 돌출부를 형성하지 않고) 대합하고 있는 구조를 가리킨다.　 또한, 「댕글링 엔드」란 오버행이라고도 칭해지는 구조를 가리키고, 2본쇄 RNA의 말단 부분의 센스쇄의 말단 영역 또는 그것에 대합하는 안티센스쇄의 말단 영역에서, 대합하는 염기가 존재하지 않기 때문에 2본쇄를 형성할 수 없고, 1본쇄가 존재하고 있는 염기 서열 부분(돌출부)를 의미한다.　 또한, 본 명세서에 있어서, 「2본쇄 지질 수식 RNA」란 2본쇄 지질이 결합하고 있는 2본쇄(더블스트랜드)의 RNA 분자를 가리킨다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 표적 유전자 중의 표적 서열에 상보적인 염기 서열인 센스쇄 RNA를 포함한다.　
여기서, 표적 유전자란 RNA 간섭 효과에 의해서 유전자 발현의 억제 대상이 되는 유전자이다.　 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 표적 대상 유전자에 대해서는 특별히 제한되지 않고, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA의 용도에 기초하여 적절하게 선택할 수 있다.　
표적 유전자 중의 표적 서열에 대해서는, RNA 간섭 효과에 의해서 유전자 발현을 억제 가능한 서열인 한 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법으로, 구체적으로는, NCBI의 BLAST 검색 등을 이용하여 적절하게 결정할 수 있다.　 예를 들면, 표적 유전자의 코드 영역(ORF)의 개시 코돈으로부터 50 내지 100 염기 하류의 엑손 부분에 있는 염기 "AA"에 이어지는 19 내지 30 염기로 이루어지는 영역으로서, GC 함유량이 50％ 전후인 영역을 표적 서열로 하면 된다.　 이러한 표적 서열에 대한 상보쇄를 채용함으로써 우수한 RNA 간섭 효과를 획득하는 것이 당업계에서 경험적으로 밝혀져 있다.　 또한, 예를 들면, 상기 표적 서열은 IDT사(Integrated DNA Technologies, INC)의 메뉴얼(Dicer Substrate RNAi Design)에 따라서 설정할 수 있다.　 또한 최근에는 (i) 안티센스쇄 RNA의 5' 말단이 A/U쌍이고, (ii) 센스쇄 RNA의 5' 말단이 G/C쌍이고, (iii) 안티센스쇄 RNA의 5' 말단측에 5개 정도의 A/U쌍이 있고, 또한 (vi) 2본쇄 중에 9개 이상의 G/C쌍이 없는 2본쇄 RNA를 설계함으로써 높은 RNA 간섭 효과를 갖는 2본쇄 RNA를 디자인할 수 있다고 보고되어 있다(Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)).　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 센스쇄에 댕글링 엔드가 존재하지 않는 경우, 상기 센스쇄는 표적 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이다.　 또한, 댕글링 엔드가 센스쇄의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 존재하고 있는 경우, 상기 센스쇄는 표적 서열에 상보적인 염기 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 댕글링 엔드를 구성하는 염기 서열이 연결된 염기 서열로 이루어지는 것이다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 상기 센스쇄 RNA를 구성하는 뉴클레오티드의 수에 대해서는 RNA 간섭 효과를 발휘할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA에 구비시키는 구조 등에 따라서 적절하게 설정되는데, 통상 21 내지 27개, 바람직하게는 21, 23, 25, 또는 27개, 더욱 바람직하게는 21 또는 27개를 들 수 있다.　 또한, 여기서 말하는 센스쇄 RNA를 구성하는 뉴클레오티드의 수란, 상기 센스쇄에 댕글링 엔드가 존재하지 않는 경우에는 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 구성하는 뉴클레오티드의 총수를 의미하여, 상기 센스쇄에 댕글링 엔드가 존재하고 있는 경우에는 상기 댕글링 엔드를 구성하는 뉴클레오티드의 수와 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 구성하는 뉴클레오티드의 수의 총합을 의미한다.　
또한, 2본쇄 지질 수식 RNA는 상기 센스쇄에 상보적인 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄를 갖는다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 안티센스쇄에 댕글링 엔드가 존재하지 않는 경우, 상기 안티센스쇄는 상기 센스쇄의 「표적 서열에 상보적인 염기 서열」의 일부 또는 전부에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이다.　 또한, 댕글링 엔드가 안티센스쇄의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 존재하고 있는 경우, 상기 안티센스쇄는 상기 센스쇄의 「표적 서열에 상보적인 염기 서열」의 일부 또는 전부에 대하여 상보적인 염기 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 댕글링 엔드를 구성하는 염기 서열이 연결된 염기 서열로 이루어지는 것이다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 상기 안티센스쇄 RNA를 구성하는 뉴클레오티드의 수에 대해서는 RNA 간섭 효과를 발휘할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 상기 2본쇄 RNA에 구비시키는 2본쇄 RNA 구조 등에 따라서 적절하게 설정되는데, 통상 21 내지 27개, 바람직하게는 21, 23, 25, 또는 27개, 더욱 바람직하게는 21, 23, 또는 27개를 들 수 있다.　 또한, 여기서 말하는 안티센스쇄 RNA를 구성하는 뉴클레오티드의 수란, 상기 안티센스쇄에 댕글링 엔드가 존재하지 않는 경우에는 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 구성하는 뉴클레오티드의 총수를 의미하여, 상기 안티센스쇄에 댕글링 엔드가 존재하고 있는 경우에는 상기 댕글링 엔드를 구성하는 뉴클레오티드의 수와 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 구성하는 뉴클레오티드의 수의 총합을 의미한다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 상기 센스쇄 RNA와 상기 안티센스쇄 RNA를 구성하는 뉴클레오티드는 기본적으로는 리보뉴클레오티드인데, 분해 효소 내성의 향상을 목적으로 하여 2'-O-메틸 수식형이나 2'-F 수식형, LNA(Locked Nucleic Acid) 등의 각종 화학 수식형 뉴클레오티드, 또는 디옥시리보뉴클레오티드 등을 RNA 서열 중에 포함하고 있을 수도 있다.　 특히, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA가 댕글링 엔드를 갖는 구조인 경우에는, 상기 센스쇄 RNA 및/또는 상기 안티센스쇄 RNA에서의 해당 댕글링 엔드의 구성 부분은 디옥시리보뉴클레오티드로 구성되어 있을 수도 있다.　 이러한 화학 수식형 뉴클레오티드로서는, 구체적으로는, 포스포로티오에이트형, 보라노포스페이트형 DNA/RNA 등의 인산 골격을 수식한 것; 2'-0 Me 수식 RNA, 2'-F 수식 RNA 등의 2' 수식 뉴클레오티드; LNA(Locked Nucleic Acid)나 ENA(2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids) 등의 뉴클레오티드의 당분자를 가교한 수식 뉴클레오티드; PNA(펩티드핵산), 모르폴리노뉴클레오티드 등의 기본 골격이 상이한 수식 뉴클레오티드; 5-플루오로우리딘이나 5-프로필우리딘 등과 같은 염기 수식형 뉴클레오티드 등이 예시된다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 상기 센스쇄 RNA와 상기 안티센스쇄 RNA가 혼성화하여 2본쇄를 형성하고 있는 한 그 구조에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 바람직한 구조로서 (A) 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 평활 말단(블런트 엔드)이고, 또한 상기 센스쇄 RNA의 3' 말단측이 평활 말단 또는 댕글링 엔드(1본쇄 영역, 돌출부)를 갖고 있는 구조, 및 (B) 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측의 쌍방에 댕글링 엔드를 갖고 있는 구조가 예시된다.　 이와 같이, 상기 (A) 또는 (B)의 구조를 취함으로써 2본쇄 지질로 수식되어 있으면서도, RNA 간섭 효과의 감소·약화를 초래하지 않고, 세포 내 도입 효율을 한층 현저하게 향상시키는 것이 가능해진다. 여기서, 센스쇄 RNA의 3' 말단측에 댕글링 엔드를 갖는 구조에는, 센스쇄 RNA의 3' 말단 영역이 댕글링 엔드를 구성하고 있는 경우와, 안티센스쇄 RNA의 5' 말단 영역이 댕글링 엔드를 구성하고 있는 경우의 쌍방의 경우가 포함된다.　 또한, 센스쇄 RNA의 5' 말단측에 댕글링 엔드를 갖는 구조에는, 센스쇄 RNA의 5' 말단 영역이 댕글링 엔드를 구성하고 있는 경우와, 안티센스쇄 RNA의 3' 말단 영역이 댕글링 엔드를 구성하고 있고 있는 경우의 쌍방의 경우가 포함된다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 구성하는 2본쇄 RNA 중, 특히 우수한 RNA 간섭 효과를 발현시킨다는 관점에서, 특히 바람직한 구조로서, 상기 (A)의 구조에 포함되는 것으로서 이하의 (A-1) 내지 (A-3)의 구조가 예시되고, 상기 (B)의 구조에 포함되는 것으로서 이하의 (B-1)의 구조가 예시된다: (A-1) 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄 RNA가 각각 27개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 구조; (A-2) 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄 RNA가 각각 23개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 구조; (A-3) 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA가 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 또한 상기 안티센스쇄 RNA가 23개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 구조; (B-1) 상기 센스쇄 RNA의 3' 말단 및 상기 안티센스쇄 RNA의 3' 말단의 쌍방에 2개의 뉴클레오티드로 이루어지는 댕글링 엔드가 각각 형성되어 있고, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄가 각각 21개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 구조.
즉, 상기 (A-1) 및 (A-2)의 구조는 센스쇄 RNA와 안티센스쇄 RNA가, 양쪽 말단에 댕글링 엔드를 형성시키지 않고, 혼성화하고 있는 구조이다.　 또한, 상기 (A-3)의 구조는 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 평활 말단이고, 또한 센스쇄 RNA의 3' 말단으로부터 1 내지 2번째의 뉴클레오티드가 댕글링 엔드를 형성하도록, 센스쇄 RNA와 안티센스쇄 RNA가 혼성화하고 있는 구조이다.　 또한, 상기 (B-1)의 구조는 센스쇄의 5' 말단으로부터 1 내지 19번째의 뉴클레오티드와 안티센스쇄 RNA의 3' 말단으로부터 3 내지 21번째의 뉴클레오티드가 혼성화하고 있고, 센스쇄 RNA의 3' 말단으로부터 1 내지 2번째의 뉴클레오티드와 안티센스쇄 RNA의 3' 말단으로부터 1 내지 2번째의 뉴클레오티드가 각각 댕글링 엔드를 형성하고 있는 구조이다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드의 1개 이상에 지질이 결합하고 있다.　 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 이외의 부위에는 다른 치환기는 결합하고 있지 않다.　 즉, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 이외의 부분, 및 안티센스쇄 RNA 부분은 다른 치환기에 의해서 치환되어 있지 않고, 뉴클레오티드만으로 구성된다.　 이와 같이, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측에만 2본쇄 지질이 결합하고 있는 것에 의해 세포 내 도입률을 높이고, 또한 현저하게 우수한 RNA 간섭 효과를 발현시키는 것이 가능해진다.　 즉, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서는, 2본쇄 RNA의 구조, 수식하는 지질로서 2본쇄 지질을 선택하는 것, 및 상기 2본쇄 지질의 결합 부위 등의 구조 상의 특징이 일체불가분의 관계가 되어, 높은 세포 내 도입률을 구비하면서, 뉴클레아제 내성을 구비하고, 또한 현저하게 우수한 RNA 간섭 효과도 발휘하게 하는 것이 가능하게 되어 있다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 상기 센스쇄 RNA에 결합하고 있는 2본쇄 지질로서는, 2개의 소수기를 갖는 지질인 한 특별히 제한되지 않지만, 일례로서, 탄소수 6 내지 50의 포화 지방산 잔기 및 불포화 지방산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 소수기를 갖는 지질이 예시된다.　 상기 포화 지방산 잔기 및 불포화 지방산 잔기의 탄소수로서, 바람직하게는 8 내지 30, 더욱 바람직하게는 10 내지 24가 예시된다.　 보다 구체적으로는, 지질을 구성하는 소수기로서, 예를 들면, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 미리스트올레산, 팔미토레산, 올레산, 엘라이드산, 박센산, 에루크산, 가돌레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산 등의 지방산의 잔기가 예시된다.　 상기하는 본 발명의 효과를 한층 현저하게 발휘하게 한다는 관점에서, 본 발명에 사용되는 2본쇄 지질의 2개의 소수기는 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 및 올레산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 지방산의 잔기인 것이 바람직하다.　
본 발명에 사용되는 2본쇄 지질의 구체예로서, 글리세로인지질, 글리세로당지질, 디아실글리세롤, 세라마이드 등이 예시된다.　 이들 중에서도, 뉴클레아제 내성, 세포 내 도입률, 및 RNA 간섭 효과를 한층 향상시킨다는 관점에서, 바람직하게는 글리세로인지질을 들 수 있다.　
본 발명에 사용되는 글리세로인지질로서는, 특별히 제한되지 않고, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨 등을 임의로 사용할 수 있다.　
본 발명에 사용되는 인지질의 구체예로서, 디라우로일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 디올레일포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜에탄올아민, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜에탄올아민, 디엘코일포스파티딜에탄올아민 등의 포스파티딜에탄올아민; 디라우로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레일포스파티딜글리세롤, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜글리세롤, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜글리세롤, 디엘코일포스파티딜글리세롤 등의 포스파티딜글리세롤; 디라우로일포스파티딜세린, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 디스테아로일포스파티딜세린, 디올레일포스파티딜세린, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜세린, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜세린, 디엘코일포스파티딜세린 등의 포스파티딜세린; 디라우로일포스파티딘산, 디미리스토일포스파티딘산, 디팔미토일포스파티딘산, 디스테아로일포스파티딘산, 디올레일포스파티딘산, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딘산, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딘산, 디엘코일포스파티딘산 등의 포스파티딘산; 디라우로일포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜이노시톨, 디팔미토일포스파티딜이노시톨, 디스테아로일포스파티딜세린, 디올레일포스파티딜이노시톨, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜이노시톨, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜이노시톨, 디엘코일포스파티딜이노시톨 등의 포스파티딜이노시톨이 예시된다.　 이들 중에서도, 뉴클레아제 내성, 세포 내 도입률, 및 RNA 간섭 효과를 보다 한층 현저하게 한다는 관점에서, 바람직하게는, 포스파티딜에탄올아민, 더욱 바람직하게는, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜에탄올아민, 및 디올레일포스파티딜에탄올아민을 들 수 있다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 상기 2본쇄 지질과 상기 센스쇄의 결합양식에 대해서는 특별히 제한되지 않고, 이들이 직접 결합하고 있을 수도 있고, 또한 이들이 링커(연결 영역)를 통해 결합하고 있을 수도 있다.　 단, 본 발명에 있어서, 상기 2본쇄 지질과 상기 센스쇄를 연결하는 링커에는, 핵산으로 구성되는 것은 포함되지 않는다.　
여기서, 링커로서는, 상기 지질과 상기 센스쇄가 연결 가능한 한, 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는, 상기 링커로서 하기의 구조의 것이 예시된다.　
Figure pct00002
여기서, 상기 화학식 (L-4) 내지 (L-21)에 있어서, n1은 1 내지 40의 정수, 바람직하게는 2 내지 20의 정수, 더욱 바람직하게는 2 내지 12의 정수를 나타낸다.
또한, 상기 화학식 (L-22) 내지 (L-24)에 있어서, n2는 1 내지 20의 정수, 바람직하게는 1 내지 10의 정수, 더욱 바람직하게는 1 내지 6의 정수를 나타낸다.　
또한, 상기 화학식 (L-25) 내지 (L-27)에 있어서, n3 및 n4는 동일 또는 상이하고, 1 내지 20의 정수, 바람직하게는 1 내지 10의 정수, 더욱 바람직하게는 1 내지 6의 정수를 나타낸다.　
상기 화학식 (L-1) 내지 (L-27)에 나타내는 링커는, 그 우측 또는 좌측 중 어느 한쪽에 1본쇄 DNA가 결합하고 있을 수도 있다.　 바람직하게는, 좌측에 2본쇄 지질이 결합하고 있고, 우측에 상기 2본쇄 RNA의 센스쇄 RNA 5' 말단 영역이 결합하도록 구성되어 있는 것이다.　
또한, 상기 2본쇄 지질에 대한 상기 링커의 결합 부위에 대해서는, 2본쇄 지질의 종류나 링커의 종류에 따라서 적절하게 설정되는데, 2본쇄 지질의 소수기 이외의 부위가 상기 링커와 화학적으로 결합함으로써 연결되어 있으면 된다.　 예를 들면, 포스파티딜에탄올아민을 사용하는 경우이면, 그 아미노기가 상기 링커와 아미드 결합 등을 형성함으로써 연결되어 있으면 된다.　 또한, 포스파티딜글리세롤을 사용하는 경우이면, 그 글리세롤 잔기 중의 수산기가 상기 링커와 에스테르 결합 또는 에테르 결합 등을 형성함으로써 연결되어 있으면 된다.　 또한, 포스파티딜세린을 사용하는 경우이면, 그 세린 잔기 중의 아미노기 또는 카르복실기가 상기 링커와 아미드 결합 또는 에스테르 결합 등을 형성함으로써 연결되어 있으면 된다.　 또한, 포스파티딘산을 사용하는 경우이면, 그 인산 잔기가 상기 링커와 인산에스테르 결합 등을 형성함으로써 연결되어 있으면 된다.　 그리고 또한, 포스파티딜이노시톨을 사용하는 경우이면, 그 이노시톨 잔기 중의 수산기가 상기 링커와 에스테르 결합 또는 에테르 결합 등을 형성함으로써 연결되어 있으면 된다.　
상기 링커는 연결시키는 지질의 종류에 따라서 적절하게 선택되는데, 예를 들면, 2본쇄 지질로서, 아미노기를 갖는 인지질(즉, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 등) 또는 수산기를 갖는 인지질(즉, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 등)을 사용하는 경우이면, 상기 링커로서, 화학식 (L-6), (L-7), (L-9), (L-10), (L-18), (L-26), 및 (L-27)의 링커가 바람직하다.　
또한, 상기 링커 이외에도, 예를 들면, N-숙시니미딜=3-(2-피리딜디티오)프로피네이트, N-4-말레이미드부티르산, S-(2-피리딜디티오)시스테아민, 요오드아세톡시숙신이미드, N-(4-말레이미드부티릴옥시)숙신이미드, N-[5-(3'-말레이미드프로필아미드)-1-카르복시펜틸]이미노디아세틱 아시드, N-(5-아미노펜틸)-이미노디아세틱 아시드 등의 이관능성 링커(관능기를 2개 포함하는 링커)를 사용할 수도 있다.
상기 센스쇄 RNA에서, 2본쇄 지질 또는 2본쇄 지질을 연결하는 링커의 결합 대상이 되는 뉴클레오티드는, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 5' 말단측으로부터 1 내지 4번째의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 5' 말단측으로부터 1 및/또는 2번째의 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 5' 말단(5' 말단측으로부터 1번째)의 뉴클레오티드이다.　
또한, 상기 센스쇄 RNA에서의, 2본쇄 지질 또는 2본쇄 지질을 연결하는 링커의 결합 부위에 대해서는, 특별히 한정되는 것이 아니지만, 2본쇄 지질 또는 2본쇄 지질을 연결한 링커가, 상기 센스쇄 RNA의 소정의 뉴클레오티드의 인산 부분의 수산기를 구성하는 수소 원자와 치환되어 결합하고 있는 것이 바람직하다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA에 결합되어 있는 2본쇄 지질의 수로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 1 내지 3개, 바람직하게는 1 또는 2개, 더욱 바람직하게는 1개가 예시된다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 2본쇄 지질이 연결된 상기 센스쇄 RNA, 및 상기 안티센스쇄 RNA를 각각 합성하고, 이들 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA를 공지된 방법에 따라서 혼성화시킴으로써, 제조된다.　 또한, 2본쇄 지질이 연결된 상기 센스쇄 RNA에 대해서도, 공지된 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있다.　
또한, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄 RNA를 공지된 방법에 따라서 합성하고, 이들을 혼성화시켜 2본쇄 RNA를 제조한 후에, 이 2본쇄 RNA의 센스쇄 RNA의 5' 말단에 2본쇄 지질 공지된 합성 기술을 이용하여 2본쇄 지질을 연결시킴으로써도 제조할 수 있다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 세포 내에 도입됨으로써 표적 유전자의 발현을 억제 또는 저해할 수 있기 때문에, 표적 유전자의 발현 억제를 목적으로 한 의약 또는 유전자 치료용의 의약으로서, 또는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 평가하기 위한 실험 재료로서 사용할 수 있다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA가 도입되는 대상이 되는 세포에 대해서는, 인간, 비인간 포유 동물, 조류, 곤충 등 중 어느 것으로부터 유래되는 것일 수도 있는데, 바람직하게는, 인간 및 비인간 포유 동물 유래의 것을 들 수 있다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA의 세포 내로의 도입 방법에 대해서는, 종래 siRNA의 경우와 마찬가지이고, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA의 유효량을 도입 대상이 되는 세포에 접촉시키면 된다.　 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA의 세포 내로의 도입은 in vivo, in vitro 및 ex vivo의 어느 것으로 실시해도 된다.
예를 들면, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 in vitro로 세포 내에 도입시키는 경우, 상기 세포의 배양 시에 미리 적당량의 상기 2본쇄 지질 수식 RNA를 존재시킨 상태에서 세포를 배양하는 방법이 예시된다.　 또한, 배양 세포, 생체로부터 취출한 세포, 생체로부터 취출한 조직에 대하여, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 in vitro 또는 ex vivo로 도입시키는 경우에는, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA의 존재 하에서, 배양 세포, 생체로부터 취출한 세포, 또는 생체로부터 취출한 조직을 인큐베이트하면 된다.　 또한, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 in vivo로 세포 내에 도입시키는 경우에는, 조직에의 직접 주입; 정맥, 피하, 근육, 복강, 안(眼) 내, 소화 기관 내, 치(齒) 내 등에의 주사; 비강, 구강, 폐 등에의 흡입 투여; 경구 투여; 피부를 통한 경피 투여; 및 구강 점막, 질 점막, 안 점막, 직장 점막, 자궁 점막을 통한 경점막 투여 등에 의해, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 투여하면 된다.
또한, 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 세포 내에 도입하는 경우, 도입 대상이 되는 세포에 대한 상기 2본쇄 지질 수식 RNA의 적용량에 대해서는, 세포 내에 도입하기 위한 유효한 양이면 되는데, 구체적으로는, 세포 1개 당, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA의 적용량이 0.001 내지 10 pmol(피코몰), 바람직하게는 0.001 내지 1 pmol, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 pmol이 되는 범위가 예시된다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 단독으로나 우수한 세포 내 이행능을 나타내기 때문에, siRNA의 세포 내로의 도입에 사용되고 있는 종래의 유전자 도입 시약을 이용하지 않고서, 또는 종래의 유전자 도입 시약의 사용량을 감소하고, 세포 내에 도입하는 것도 가능하다.　
본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA는 세포 내에 도입됨으로써, 표적 유전자의 발현을 억제 또는 저해할 수 있기 때문에, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA는 예를 들면, 의약의 분야에서 상기 표적 유전자의 발현에 기인하는 질환을 예방, 경감 또는 치료하기 위해서 사용할 수 있다.　 본 발명의 2본쇄 지질 수식 RNA를 의약 분야에서 사용하는 경우, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합되어, 의약 조성물로서 제공된다.　
상기 의약 조성물에 사용되는 약학적으로 허용되는 담체로서는, 의약 조성물의 사용 형태에 따라서 적절하게 선택하면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 정제수, 당 수용액, 완충액, 생리 식염수, 고분자 수용액, RNase free수(水) 등의 수성 담체, 부형제 등을 들 수 있다.　
상기 의약 조성물에 있어서의 2본쇄 지질 수식 RNA의 배합 비율에 대해서는, 상술하는 상기 2본쇄 지질 수식 RNA의 적용량을 충족할 수 있도록 적절하게 설정하면 되는데, 예를 들면, 상기 의약 조성물의 총량 당, 상기 2본쇄 지질 수식 RNA가 0.001 내지 50 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 10 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1 중량％가 되는 비율이 예시된다.　
또한, 상기 의약 조성물의 제제 형태에 대해서는, 2본쇄 지질 수식 RNA가 세포 내에 도입 가능한 것을 한도로 하여 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 액제(시럽 등을 포함함), 점적제, 주사제 등의 액상 제제; 동결 건조 제제, 드라이 시럽제, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제(소프트 캡슐을 포함함) 등의 고형상 제제를 들 수 있다.　 또한, 본 발명의 의약 조성물이 고형 제제인 경우에는, 사용 시에 주사용 증류수, 멸균수 등을 가하여, 재차 용해하여 사용할 수도 있다.　
또한, 상기 의약 조성물이 적용되는 질환 또는 증상은 표적 유전자의 발현이 관여하고 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니다.　 표적 유전자와 질환의 관계에 대해서는 해당 기술 분야에서 공지이다.　
또한, 상기 의약 조성물은 인간의 치료를 목적으로 하여 인간 유래 세포에 대하여 사용할 수도 있고, 또한 인간 이외의 동물(특히, 인간 이외의 포유 동물)의 치료 목적으로 사용할 수도 있다.　
[실시예]
이하에, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세히 설명하는데, 본 발명은 이들에 의해서 한정되는 것은 아니다.　
실시예 1 5' 2본쇄 지질 수식 RNA의 루시페라아제 유전자 발현 저해 효과
1. 루시페라아제 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 합성
1-1. 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA의 서열
레닐라-루시페라아제와 상동 서열을 갖고, 레닐라-루시페라아제의 유전자 발현을 억제할 수 있는 21 및 27 염기 길이의 센스쇄 RNA와 21 및 27 염기 길이의 안티센스쇄 RNA의 2본쇄 RNA를 디자인하였다.　 상기 2본쇄 RNA는 21 염기 길이의 안티센스쇄와 센스쇄를 이용한 경우에는 3' 말단에 2 염기의 댕글링 엔드를 갖는 21 염기 길이의 2본쇄 RNA를, 27 염기 길이의 안티센스쇄와 센스쇄를 이용한 경우에는 양쪽 말단이 평활 말단인 27 염기 길이의 2본쇄를 각각 형성할 수 있다.　 사용한 RNA의 서열은 이하와 같다.　
27nt dsRNA 센스쇄 L27A: 5'-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3'(서열 번호 1)
안티센스쇄 L27B: 3'-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5'(서열 번호 2)
21nt siRNA 센스쇄 L21A: 5'-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3'(서열 번호 3)
안티센스쇄 L21B: 3'-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG-5'(서열 번호 4)
이들 상기 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄를 이용하여 2본쇄 RNA를 제조하였다.　 2본쇄 RNA의 제조는 universal buffer(하야시 가세이 가부시끼가이샤) 중, 동몰의 센스쇄 및 안티센스쇄 1본쇄 RNA를 혼합하고, 92℃에서 2분간 가열한 후, 4℃까지 서서히 온도를 낮춤으로써 제조하였다.　 합성한 각종 2본쇄 RNA는 20％ 폴리아크릴아미드겔을 이용하여, 250 V의 조건화에서 60분간 전기 영동하고, 그 후, 은 염색 키트(GE 헬스케어 바이오사이언스)로 2본쇄 RNA를 염색함으로써 확인하였다.　
상기 2본쇄 RNA에서, 3' 말단에 2 염기의 댕글링 엔드를 갖는 21 염기 길이의 2본쇄 RNA를 si L21A/L21B, 평활 말단인 27 염기 길이의 2본쇄 RNA를 Ds L27A/L27B로 하였다.　
1-2. 루시페라아제 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 합성
루시페라아제 유전자의 발현을 억제할 수 있는 2본쇄 RNA의 센스쇄의 5' 말단에 2본쇄 지질을 결합시킨 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA를 합성하였다.　 해당 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA에서, 2본쇄 지질은 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단에 연결되어 있는 아미노알킬기(Amino Modifier C6; Glen Research)을 통해 공유 결합으로 결합하고 있다.　 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA는 활성 에스테르기를 갖는 지질 화합물(이하, 활성 에스테르화 지질 화합물이라고 표기함)와 5' 말단을 아미노화 수식한 센스쇄 RNA를 액상 중에서 반응시킴으로써 합성하였다(하기 반응식 1).　
Figure pct00003
R1 및 R2는 동일 또는 상이하고 지방산 잔기를 나타낸다.　
구체적인 합성법을 이하에 나타내었다.　 RNA의 5' 말단을 아미노화하기 위해서, RNA 고상 합성 상에서 5'-Amino-Modifier C6(Glen Research)을 이용하여 통상의 방법(포스포르아미다이트 합성법)에 의해 5' 말단 아미노알킬기 수식 센스쇄 RNA를 합성하였다.　 또한, 상기 5' 말단 아미노알킬기 센스쇄 RNA는 HPLC 정제, MALDI-TOF MS 해석 완료의 것을 하야시 가세이 가부시끼가이샤로부터 구입하였다.　 합성된 5' 말단 아미노알킬기 센스쇄 RNA는 상기 말단(5' 말단측으로부터 1번째의 뉴클레오티드의 인산 잔기)에 -(CH2)6-NH2가 결합되어 있다.　 합성한 1본쇄 RNA는 UV 스펙트럼 검출기를 이용하여, 260 nm의 흡광도를 측정함으로써 농도를 산출하였다.　 이 아미노알킬기 수식 1본쇄 RNA와, 클로로포름에 용해한 활성 에스테르화 2본쇄 지질 유도체[DPPE-NHS(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dipalmitoyl), POPE-NHS(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2oleoyl), DOPE-NHS(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dioleoyl), DMPE-NHS(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dimyristoyl); (닛본 유시사 제조)]와, 축합 반응 조건 하에서 혼합하여 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA를 합성하였다.　 반응 후, 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA가 포함되는 반응액 중의 불필요한 시약을 제거하기 위해서 반응액을 HPLC로 정제하였다.　 HPLC 정제는 완충액으로서 A: 100％ 20 mM TEAA(pH7.0), B: 80％ CH3CN/20 mM TEAA (pH7.0)를 이용하여, 10％ B 완충액으로부터 100％ B 완충액을 50분의 선형 구배가 되도록 설정하여 정제를 행하였다.　 또한, 정제용 칼럼은 CAP CELL(4.6 x 150 mm, 5 μm; SHISEIDO)을 사용하였다.　 HPLC 해석 결과의 일례를 도 1에 도시하였다.　 HPLC로 정제된 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA는 동결 건조하고, 정제수에 용해시킨 후, UV 스펙트럼 해석에 의해 농도 및 합성 수율을 산출하였다.　
이하에, 합성한 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA의 구조 및 수율을 나타낸다.　
Figure pct00004
합성한 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA는 안티센스 RNA와 2본쇄를 형성시켜 2본쇄 지질 수식 RNA를 얻었다.　 RNA의 2본쇄의 형성은 상기와 동일한 방법으로 행하여, 20％ 폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해 확인하였다(도 2 참조).　
2. 2본쇄 지질 수식 RNA의 분해 효소 내성
2본쇄 지질 수식 si L21A/L21B 및 Ds L27A/L27B의 뉴클레아제 내성을 검토하였다.　 실험은 최종 농도가 2 μM이 되도록 조정한 센스쇄 5'- 말단 2본쇄 지질 수식 RNA(si L21A/L21B 및 Ds L27A/L27B)을 10％ FBS(산코 쥰야꾸 가부시끼가이샤)를 포함하는 RPMI-1640 배지(인비트로젠) 중(최종량 110 ㎕), 37℃에서 인큐베이션하고, 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h 후에 각각 10 ㎕ 취하고, 2 ㎕의 로딩다이를 포함하는 샘플 튜브에 첨가하였다.　 분해 반응을 정지시키기 위해서 샘플 채취 후 신속하게 액체 질소 중에서 동결하고, -20℃에서 보존하였다.　 얻어진 산물을 20％ 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 250 V에서 70분간 샘플을 전기 영동하였다.　 그 후, 은 염색 키트(GE 헬스케어 바이오사이언스)로 산물을 염색하고(염색 조건은 제품 메뉴얼 참조), ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)로 겔 해석을 행하였다.　 또 비교로서 미수식의 si L21A/L21B 및 Ds L27A/L27B의 뉴클레아제 내성 결과도 마찬가지로 평가하였다.　 겔 전기 영동의 결과를 도 3에 도시하였다.　
그 결과, 미수식의 si L21A/L21B는 혈청을 포함하는 배지 중에서 빠르게 분해되고 있어, 1 내지 2시간 정도로 샘플 RNA의 소실이 확인되었다.　 한편, 2본쇄 지질 수식 si L21A/L21B(si DPPE-L21A/L21B)는, si L21A/L21B에 비하여 매우 높은 뉴클레아제 내성을 나타내고, 48시간 후에 있어서도 RNA는 생존하고 있었다.　 또한, 미수식의 Ds L27A/L27B도 높은 뉴클레아제 내성을 나타내었지만, 2본쇄 지질 수식 Ds L27A/L27B (Ds DPPE-L27A/L27B)쪽이 보다 높은 뉴클레아제 내성을 나타내었다.　 또한, 2본쇄 지질 수식 RNA는 혈청 중 단백질과 결합하여, RNA의 분해 효소 내성을 향상시키고 있다는 지견도 얻어졌다.　
이들 결과로부터, 2본쇄 지질 수식 RNA는 일반적으로 널리 사용되고 있는 21 siRNA에 비하여 현저하게 높은 생체 내 안정성을 보유하고 있다는 새로운 지견이 얻어졌다.　
3. 루시페라아제 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 Dicer에 의한 프로세싱
합성한 RNA 및 2본쇄 지질 수식 RNA의 리콤비넌트 Dicer에 의한 프로세싱을 검토하였다.　 Dicer에 의한 절단 실험은 20 mM Tris-HCl(pH8.0), 15 mM NaCl, 2.5 mM Mg2Cl 용액 중에서, 0.5 U의 리콤비넌트 Dicer(Gene Therapy Systems)와 최종 농도 2 μM이 되도록 조정한 미수식 RNA 및 2본쇄 지질 수식 RNA를 샘플 튜브에 10 ㎕ 준비하고, 37℃로 설정한 인큐베이터 중에서, 12시간 인큐베이션하였다.　 그 후, Dicer에 의한 절단 반응을 정지시키기 위하여, 2 ㎕의 Dicer Stop Solution(Gene Therapy Systems)를 반응 용액에 가하고, 또한 2 ㎕의 로딩다이를 가하였다.　 얻어진 산물을 20％ 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 250 V에서 70분간 샘플을 전기 영동하였다.　 그 후, 은 염색 키트(GE 헬스케어 바이오사이언스)로 산물을 염색하고(염색 조건은 제품 메뉴얼 참조), ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)로 겔 해석을 행하였다.　 또한, 컨트롤로서 미수식의 21 siRNA도 겔 전기 영동으로 해석하였다.　 그 결과를 도 4에 도시하였다.　
얻어진 결과로부터, 미수식의 Ds L27A/L27B는 Dicer의 작용에 의해 21 염기 길이의 RNA로 프로세싱되어 있는 것을 알 수 있고, 또한 27 염기 길이의 2본쇄 지질 수식 RNA(Ds Lipid-L27A/L27B)도 Dicer의 작용에 의해, 21 염기 길이의 RNA 및 그 밖의 RNA로 프로세싱되어 있는 것이 분명해졌다.　 이 결과로부터, 27 염기 길이의 RNA는 지질이 결합하고 있더라도 Dicer에 의해 인식되어, 프로세싱을 받는 것을 알 수 있었다.　
한편, 미수식의 si L21A/L21B는 Dicer에 의한 프로세싱을 받고 있지 않고, 21 염기 길이의 RNA에 2본쇄 지질을 수식한 2본쇄 RNA(si Lipid-L21A/L21B도 Dicer에 의한 프로세싱을 받고 있지 않은 것을 알 수 있었다.　 또한, Dicer 단백질과 공존시킨 2본쇄 지질 수식 si L21A/L21B에서는, 분자량의 증대가 인정되었기 때문에, 2본쇄 지질 수식 si L21A/L21B는 Dicer 단백질과의 사이에서 복합체를 형성하고 있는 것도 확인되었다.　
4. 2본쇄 RNA 지질 수식 RNA의 루시페라아제 유전자 발현 억제
합성한 미수식 RNA 및 2본쇄 지질 수식 RNA의 RNA 간섭 효과를 레닐라-루시페라아제를 타겟으로 하여 평가하였다.　 실험 전에 1 x 105 cell/ml로 조정한 HeLa 세포(인간 자궁경부암세포, 도호꾸 다이가꾸 가레이 이가꾸 겐뀨쇼)를 96 well 플레이트 상에 각각 100 ㎕ 뿌리고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.　 다음날, 웰 상의 오래된 배지를 제거하고, 항생 물질을 포함하지 않은 새로운 배지를 웰에 각각 80 ㎕ 가하고, 파이어플라이 및 레닐라-루시페라아제를 발현하는 벡터(psiCHECK™-2 Vector: 프로메가)와 Lipofectamine™ 2000(상품명, 인비트로젠)의 복합 용액을 10 ㎕ 씩 HeLa 세포가 들어간 각각의 웰에 가하였다.　 여기서 발현 벡터는 1웰당 0.02μg이 되도록, 또한 Lipofectamine™ 2000은 1웰당 0.2 ㎕가 되도록 설정하고, OptiMem(인비트로젠)으로 필요량을 조정하였다.　 또한, 복합체를 형성시키기 위하여, 발현 벡터와 Lipofectamine™ 2000을 OptiMem을 이용하여 혼합한 후, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다.　 복합 용액을 가한 후, 세포를 5％ CO2 존재 하, 37℃에서 4시간 인큐베이션하였다.　 그 후, 레닐라-루시페라아제의 유전 서열과 상동적인 안티센스 서열을 포함하는 미수식의 2본쇄 RNA 및 말단 2본쇄 지질 수식 RNA를 최종 농도가 0 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM이 되도록 Lipofectamine™ 2000(인비트로젠)과 복합체를 형성시키고, 10 ㎕의 복합체 용액을 발현 벡터를 도입한 HeLa 세포에 가하였다.　 여기서, 1웰당의 최종량은 100 ㎕가 된다.　 RNA와 Lipofectamine™ 2000의 복합 용액은 1웰당 5 ㎕의 RNA 수용액과 5 ㎕의 Lipofectamine™ 2000(0.2 ㎕) OptiMem 용액을 혼합하고, 30분간 실온에서 인큐베이션함으로써 제조하였다.　 RNA를 도입시킨 후, 48시간 인큐베이션하고 Dula-GloTM Luciferase Assay System(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 및 레닐라-루시페라아제의 발현량을 루미노미터(MicroLumat LB96p: BERTHOLD)로 측정하고, 파이어플라이-루시페라아제의 발현량을 컨트롤로 하여 레닐라-루시페라아제의 발현 억제 효과를 산출하였다.　
결과를 도 5에 도시하였다.　 도 5에 있어서 「A」는 2본쇄 지질 수식 21nt siRNA, 「B」는 2본쇄 지질 수식 27nt dsRNA를 이용했을 때의 루시페라아제 유전자 발현 억제의 결과이다.　 또한, 미수식의 21nt siRNA 및 27nt dsRNA도 동시에 평가하였다.　 그 결과, 2본쇄 지질을 결합시킨 21nt siRNA 및 27nt dsRNA는 미수식의 21nt siRNA 및 27nt dsRNA보다도 현저하게 높은 RNA 간섭 효과를 발휘하는 것이 확인되었다.　
실시예 2 5' 2본쇄 지질 수식 RNA에 의한 VEGF 유전자 발현 저해 효과
1. VEGF 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 합성
1-1. 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA의 서열
VEGF(vascular endothelial growth factor: 혈관 내피 성장 인자)와 상동 서열을 갖고, VEGF의 유전자 발현을 억제할 수 있는 27 및 21 염기 길이의 센스쇄 RNA와 27 및 21 염기 길이의 안티센스쇄 RNA의 2본쇄 RNA를 디자인하였다.　 이들 2본쇄 RNA를 이용하여 이하의 실험을 행하였다.　 또한, 21 siRNA는 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA의 쌍방의 3' 말단에 2 염기의 댕글링 엔드를 갖는 2본쇄 RNA이고, 27nt dsRNA는 댕글링 엔드(1본쇄 영역)을 갖지 않는 완전 2본쇄 RNA(센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 평활 말단인 2본쇄 RNA)이다.　 사용한 27nt dsRNA 및 21 siRNA의 서열은 이하와 같다.　
27nt dsRNA 센스쇄 v27A: 5'- CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3'(서열 번호 5)
안티센스쇄 v27B: 3'- GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5'(서열 번호 6)
21nt siRNA 센스쇄 v21A: 5'-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3'(서열 번호 7)
안티센스쇄 v21B: 3'-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5'(서열 번호 8)
이들 상기 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 어닐링하여 2본쇄를 형성시켜 2본쇄 지질 미수식 RNA를 얻었다.　 2본쇄 형성 확인은 실시예 1과 동일한 방법으로 20％ 아크릴아미드겔 전기 영동으로 확인하였다.
1-2. VEGF 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 합성
VEGF 유전자의 발현을 억제할 수 있는 상기 2본쇄 RNA의 센스쇄의 5' 말단에 지질을 결합시킨 2본쇄 지질 수식 RNA를 합성하였다.　 해당 2본쇄 지질 수식 RNA에서, 2본쇄 지질은 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단에 수식된 아미노알킬기(Amino Modifier C6; Glen Research)을 통해 공유 결합으로 결합하고 있다.　 2본쇄 지질 수식의 1본쇄 RNA(센스쇄)는 실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였다.　 합성한 2본쇄 지질 수식의 센스쇄 RNA의 HPLC 결과를 도 6에 도시하였다.　 또한, VEGF 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식의 센스쇄 RNA에서도, 실시예 1과 거의 동일한 용출 시간이었다.　
또한, 이하에 VEGF 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 구조 모델 및 수율을 나타낸다.　
Figure pct00005
합성한 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA는 안티센스쇄 RNA와 2본쇄를 형성시킴으로써 2본쇄 지질 수식 RNA를 얻었다.　 RNA의 2본쇄의 형성은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하여 20％ 폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해 확인하였다(도 7 참조).
2. 2본쇄 지질 수식 RNA의 분해 효소 내성
2본쇄 지질 수식 si v21A/v21B 및 Ds v27A/v27B의 뉴클레아제 내성을 검토하였다.　 또 비교로서 미수식의 si L21A/L21B 및 Ds L27A/L27B의 뉴클레아제 내성 결과도 평가하였다.　 실험은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.　 겔 전기 영동의 결과를 도 8에 도시하였다.　
그 결과, 미수식의 si v21A/v21B는 혈청을 포함하는 배지 중에서 빠르게 분해되고 있고, 1 내지 2시간 정도에서 샘플 RNA의 소실이 확인되었다.　 한편, 2본쇄 지질 수식 si v21A/v21B(si DPPE-v21A/v21B)는, si v21A/v21B에 비하여 매우 높은 뉴클레아제 내성을 나타내고, 48시간 후에 있어서도 RNA는 생존하고 있었다.　 또한, 미수식의 Ds v27A/v27B도 높은 뉴클레아제 내성을 나타내었지만, 2본쇄 지질 수식 Ds v27A/v27B (Ds DPPE-v27A/v27B)쪽이 보다 높은 뉴클레아제 내성을 나타내었다.　 또한, 2본쇄 지질 수식 RNA는 혈청 중 단백질과 결합하여, RNA의 분해 효소 내성을 향상시키고 있다는 지견도 얻어졌다.　
이들 결과로부터도, 2본쇄 지질 수식 RNA는 일반적으로 널리 사용되고 있는 21 siRNA에 비하여 현저하게 높은 생체내 안정성을 보유하고 있는 것이 분명해졌다.
3. VEGF 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 Dicer에 의한 프로세싱
합성한 2본쇄 지질 미수식 RNA 및 2본쇄 지질 수식 RNA의 리콤비넌트 Dicer에 의한 프로세싱을 검토하였다.　 Dicer에 의한 절단 실험은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다.　 그 결과를 도 9에 도시하였다.　
얻어진 결과로부터, 미수식의 Ds v27A/v27B는 Dicer의 작용에 의해 21 염기 길이의 2본쇄 RNA로 프로세싱되어 있는 것을 알 수 있고, 또한 27 염기 길이의 2본쇄 지질 수식 RNA(Lipid-Ds v27A/v27B)도 Dicer의 작용에 의해, 21 염기 길이의 RNA 및 그의 밖의 RNA로 프로세싱되어 있는 것이 분명해졌다.　 이 결과로부터, 27 염기 길이의 RNA는 지질이 결합하고 있더라도 Dicer에 의해 인식되고, 프로세싱을 받는 것을 알 수 있었다.　
한편, 미수식의 si v21A/v21B는 Dicer에 의한 프로세싱을 받고 있지 않고, 21 염기 길이의 2본쇄 RNA에 2본쇄 지질을 수식한 RNA도 Dicer에 의한 프로세싱을 받고 있지 않은 것을 알 수 있었다.　 또한, Dicer 단백질과 공존시킨 2본쇄 지질 수식 si v21A/v21B에서는, 분자량의 증대가 인정되었기 때문에, 2본쇄 지질 수식 si v21A/v21B는 Dicer 단백질과의 사이에서 복합체를 형성하고 있는 것도 확인되었다.
4. 2본쇄 지질 수식 RNA의 VEGF 유전자 발현 억제
말단을 수식하지 않은 si v21A/v21B, 말단을 수식하지 않은 Ds v27A/v27B, 센스쇄 RNA의 5' 말단을 2본쇄 지질 수식한 si v21A/v21B(si Lipid-v21A/v21B) 및 센스쇄 RNA의 5' 말단을 2본쇄 지질 수식한 Ds v27A/v27B(Ds Lipid-v27A/v27B)의 VEGF 유전자 발현 저해 효과를 HeLa 세포(인간 자궁경부암세포, 도호꾸 다이가꾸 가레이 이가꾸 겐뀨쇼), A549 세포(인간 폐암세포, 도호꾸 다이가꾸 가레이 이가꾸 겐뀨쇼)를 이용하여 평가하였다.　 또한, VEGF 유전자와 상동인 유전자 서열을 갖지 않는 RNA(27nt dsRNA(Random), 21nt siRNA(Random))에 대해서도 동일한 평가를 행하였다.　
실험은 이하의 조작으로 행하였다.　 실험 전에 1 x 105 cell/ml로 조정한 HeLa 세포, A549 세포를 24 well 플레이트 상에 각각 500 ㎕ 뿌리고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.　 다음날, 웰 상의 오래된 배지를 제거하여, 항생 물질을 포함하지 않은 새로운 배지를 웰에 각각 450 ㎕ 가하였다.　 여기서, HeLa 세포는 MEM 배지, 그 밖의 세포는 PRMI-1640 배지를 이용하였다.　 VEGF의 유전 서열과 상동적인 안티센스 서열을 포함하는 미수식 또는 2본쇄 지질 수식 RNA(25 ㎕)과 Lipofectamine™ 2000(인비트로젠) 용액(25 ㎕)과의 복합체를 형성시키고, 50 ㎕의 RNA 용액을 450 ㎕의 상기 세포에 가하였다.　 여기서, 1웰당의 최종량은 500 ㎕가 된다.　 RNA와 Lipofectamine™ 2000의 복합 용액은, 1웰당 25 ㎕의 RNA 수용액과 25 ㎕의 Lipofectamine™ 2000(2 ㎕) OptiMem 용액을 혼합하고, 30분간 실온에서 인큐베이션함으로써 제조하였다.　 RNA를 도입시킨 후, 37℃에서 48시간, 5％ CO2 존재 하에서 인큐베이션하였다.　 인큐베이션 후, 세포를 PBS(-)로 3회 세정하고, RNeasy Plus Mini Kit(퀴아겐)로 세포 중의 Total-RNA를 추출하였다.　 그 후, VEGF의 mRNA 양을 측정하기 위해서 RT-PCR 반응을 행하였다.　 RT-PCR 반응용으로서 Qiagen OneStep RT-PCR Kit(퀴아겐)를 이용하여 행하고, VEGF용 PCR 프라이머로서, 5'-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3'(서열 번호 9) 및 5'-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3'(서열 번호 10)를 이용하였다.　 또한 컨트롤로서 GAPDH 유전자를 동일한 방법으로 측정하였다.　 GAPDH용 프라이머로서 5'-GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3'(서열 번호 11) 및 5'-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3'(서열 번호 12)를 이용하였다.　 RT-PCR 반응은, 50℃에서 30분간 RT(Reverse Transcriptase 반응을 행하고, PCR 반응으로서 92℃에서 30초간 2본쇄 해리 반응, 55℃에서 30초간 어닐링 반응, 68℃에서 45초간 신장 반응을 25회 내지 28회(사용하는 세포에 따라 상이함) 반복하여 행하고, 마지막으로 68℃에서 10분간 인큐베이션하고, 4℃까지 온도를 낮추어 반응을 종료하였다.　 RT-PCR에 이용한 시약, Total-RNA, 프라이머 등은 Qiagen OneStep RT-PCR Kit(퀴아겐)의 반응 조건에 따라서 제조하였다.　 RT-PCR 반응 후, 로딩다이를 2 ㎕ 가하고, 2％ 아가로스겔로 VEGF 및 GAPDH의 mRNA로부터의 RT-PCR 산물을 확인하였다.　 유전자 발현 억제 효과의 평가는 컨트롤 세포(2본쇄 RNA를 도입하지 않은 세포)의 VEGF 유전자 발현량을 100％로 했을 때의, RNA(미수식, 2본쇄 지질 수식을 포함함)를 도입한 세포의 VEGF 발현량을 측정함으로써 행하였다.　 또한, 각 세포 사이의 발현량의 오차는 컨트롤 유전자(GAPDH)의 유전자 발현량으로 보정하였다.　
도 10에, VEGF를 타겟으로 하고, RNA 농도가 50 nM인 때의 미수식 RNA 및 2본쇄 지질 수식 RNA의 RNA 간섭 효과의 결과를 나타낸다.　 도 10 중, A 및 B는 HeLa 세포, C 및 D는 A549 세포에 대한 미수식 RNA 및 2본쇄 지질 수식 RNA의 VEGF 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프로서, A 및 C은 21 염기 길이의 2본쇄 RNA를 이용한 경우, B 및 D는 27 염기 길이의 2본쇄 RNA를 이용한 경우이다.　
그 결과, 2본쇄 지질 수식 si v21A/v21B를 이용하여 HeLa 세포에 대한 유전자 발현 억제능을 관찰한 경우(A), 모든 2본쇄 지질 수식 RNA에서 미수식 RNA보다도 높은 유전자 발현 억제능이 관찰되었다.　 특히 si DPPE-v21A/v21B에서 매우 높은 유전자 발현 억제능이 관측되었다.　 또한, 2본쇄 지질 수식 Ds v27A/v27을 이용하여 HeLa 세포에 대한 유전자 발현 억제능을 관찰한 경우(B)에 있어서도, 모든 2본쇄 지질 수식 RNA에서 미수식 RNA보다도 우수한 유전자 발현 억제능이 관측되었다.　 또한 Ds DPPE-v27A/v27B에서 매우 우수한 유전자 발현 억제능이 확인되었다.　
A549 세포에 대한 VEGF 유전자 발현 억제능을 관찰한 경우에 있어서, 지질 수식 si v21A/v21B를 이용한 경우(C), 모든 2본쇄 지질 수식 RNA에서 미수식 RNA보다도 높은 유전자 발현 억제능이 관찰되었다.　 특히 si DPPE-v21A/v21B에서, 매우 높은 유전자 발현 억제능이 관측되었다.　 또한, 2본쇄 지질 수식 Ds v27A/v27을 이용하여 A549 세포에 대한 유전자 발현 억제능을 관찰한 경우(D), DPPE나 DMPE를 결합시킨 RNA에서, 미수식 RNA보다도 높은 유전자 발현 억제능이 관측되었다.　
이들 결과로부터, 2본쇄의 RNA의 센스쇄 RNA의 5' 말단에 2본쇄 지질을 공유 결합시킨 21 염기 길이 및 27 염기 길이의 siRNA 및 dsRNA는 미수식의 각 2본쇄 RNA에 비하여 높은 유전자 발현 억제능을 나타내고 있는 것이 분명해졌다.　 특히, DPPE를 결합시킨 2본쇄 RNA에서 매우 우수한 유전자 발현 억제능을 확인할 수 있었다.　 또한, DMPE 또는 DOPE를 결합시킨 RNA에서도, 미수식 RNA에 비하여 높은 유전자 발현 억제능이 관측되었다.　
이번에 사용한 VEGF를 타겟으로 한 2본쇄의 RNA는 서열 특이성 높아 표적 유전자의 발현을 억제하고 있는 것이 분명해졌다.　 또한, 본 시험 결과로부터, 2본쇄의 RNA에 2본쇄 지질을 결합시킴으로써 세포에 대한 부작용도 감소되어 있는 것도 시사되었다.　
5. 2본쇄 지질 수식 RNA의 세포 도입성의 검토
실험 전에 1 x 105 cell/ml로 조정한 HeLa 세포(인간 자궁경부암세포, 도호꾸 다이가꾸 가레이 이가꾸 겐뀨쇼), A549 세포(인간 폐암세포, 도호꾸 다이가꾸 가레이 이가꾸 겐뀨쇼)를 24웰 플레이트에 각각 1 ml 뿌리고 10 ％ 소태아혈청(FBS: 산코 쥰야꾸 가부시끼가이샤 제조) 및 항생 물질 포함하는 배지 중, 5 ％ CO2 존재 하, 37 ℃에서 배양하였다.　 여기서 이용한 항생 물질 및 배지는, HeLa 세포는 MEM 배지(인비트로젠사)를, 그 밖의 세포는 RPMI-1640(인비트로젠사)를 배지로서 이용하였다.　 형광 라벨화 2본쇄 지질 수식 RNA 도입 전에, 항생 물질을 포함하지 않는 배지(450 ㎕)로 교환하였다.　 형광 라벨화 2본쇄 지질 수식 RNA는 21 nt 및 27 nt 안티센스쇄 RNA의 5' 말단을 6-FAM 라벨화한 것을 사용하여, 미수식의 21 nt 및 27 nt 센스쇄 RNA 및 5' 말단을 2본쇄 지질로 수식한 21 nt 및 27 nt 센스쇄 RNA와 2본쇄를 형성시켰다.　 세포 도입 실험은 형광 라벨화 2본쇄 지질 수식 RNA와 Lipofectamine™ 2000(인비트로젠사 제조)와 복합체를 형성시키기 위하여, 10 μM의 형광 라벨화 올리고뉴클레오티드 수용액 10 ㎕와 OptiMem 용액 15 ㎕의 혼합 용액 25 ㎕와, Lipofectamine™ 2000(인비트로젠사 제조) 용액 2 ㎕와 OptiMem 용액 23 ㎕의 혼합 용액 25 ㎕ 각각 혼합한 50 ㎕의 혼합 용액을 실온에서 30분간 인큐베이션하였다.　 조정한 50 ㎕의 형광 라벨화 올리고뉴클레오티드 복합체는 상기에서 준비한 450 ㎕의 세포에 첨가하고(2본쇄 RNA의 최종농도: 200 nM), 5 ％ CO2 존재 하, 37 ℃에서 4시간 인큐베이션하였다.　 그 후, 세포를 PBS(-) 또는 배지로 3회 세정하고, 공초점 형광 레이저 현미경, 및 유세포 분석기로 세포 도입을 평가하였다.
공초점 형광 레이저 현미경은 Radiance 2000 시스템(Bio Rad사)을 이용하고, 아르곤 레이저를 이용하여 형광을 관찰하였다.　 유세포 분석기는 coulter EPICS XL cytometer(Beckman coulter)를 이용하여, 세포 10000 카운트당의 세포 도입성에 대해서 측정하였다.　 유세포 분석기 해석은 XL EXPO32™ software(Beckman coulter)를 이용하였다.　
결과를 도 11에 도시하였다.　 도 11a 중의 A 및 B는 형광 라벨한 21 염기 길이(si v21A/v21B) 및 27 염기 길이의 RNA((si v21A/v21B 및 si v27A/v27B), 및 센스쇄의 5' 말단을 2본쇄 지질 수식한 RNA를 Lipofectamine™ 2000을 도입제로서 사용한 경우의 HaLa 세포에 대한 세포 도입성의 결과이다.　 또한, 도 11b 중의 C 및 D는 형광 라벨한 21 염기 길이(si v21A/v21B) 및 27 염기 길이의 RNA((si v21A/v21B 및 si v27A/v27B), 및 센스쇄의 5' 말단을 2본쇄 지질 수식한 RNA를 Lipofectamine™ 2000을 도입제로서 사용한 경우의 A549 세포에 대한 세포 도입성의 결과이다.　
그 결과, Lipofectamine™ 2000 존재 하에서 미수식 RNA 및 2본쇄 지질 수식 RNA는 모든 세포(HeLa 세포, A549 세포)로의 도입이 확인되었다.　 특히 2본쇄 지질을 센스쇄의 5' 말단에 수식한 27 염기 길이의 RNA는 미수식의 RNA에 비하여 매우 높은 세포 도입성이 공초점 형광 현미경 및 유세포 분석기에서 관측되었다.　 또한, 이 2본쇄 지질 수식 RNA는 세포 내에서 적극적으로 세포질에 국재화하고 있는 것이 공초점 형광 현미경 관찰에 의해 시사되었다.　 특히 2본쇄 지질로서 DPPE나 DMPE를 결합시킨 27 염기 길이의 2본쇄 RNA에서 우수한 세포 도입성이 관측되었다.　
또한, 21 염기 길이의 RNA에 2본쇄 지질을 결합시킨 2본쇄 지질 수식 RNA도 Lipofectamine™ 2000 존재 하에서 높은 세포 도입성이 확인되었다.　 특히, 2본쇄 지질로서 DMPE를 결합시킨 21 염기 길이의 RNA에 있어서 우수한 세포 도입성이 확인되었다.　
이 결과로부터, 2본쇄의 RNA의 센스쇄 RNA의 5' 말단에 지질을 공유 결합시킴으로써 비약적으로 세포 도입성을 향상시키고, 또한 세포 내에서 세포질에 국재화시키는 것이 가능하다는 지견이 얻어졌다.　
실시예 3 WT1 유전자를 타겟으로 한 2본쇄 지질 수식 RNA의 합성
상기 실시예 1 및 2과는 다른 수법을 이용하여, WT1 유전자의 발현을 억제할 수 있는 2본쇄 RNA의 센스쇄 RNA의 5' 말단에 2본쇄 지질을 결합시킨 2본쇄 지질 수식 센스쇄 RNA를 합성하였다.　
우선, 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA를 각각 공지된 방법에 따라서 합성하였다.　 이어서, 센스쇄 RNA의 5' 말단에 대한 아미노알킬화를, 5'-Amino-Modifier C6(Glen Research)을 이용하여 통상의 방법(포스포르아미다이트 합성법)에 의해 행하여 5' 말단 아미노알킬 수식 센스쇄 RNA를 합성하였다.　 합성된 5' 말단 아미노알킬 수식 센스쇄 RNA는 5' 말단측으로부터 1번째의 뉴클레오티드의 인산 잔기에 산소 원자를 통해 -(CH2)6-NH2가 결합되어 있다.　 합성된 5' 말단 아미노알킬 수식 센스쇄 RNA는 안티센스쇄 RNA와 2본쇄를 형성시켜, 2본쇄 RNA(이하, 아미노알킬 수식 2본쇄 RNA로 표기함)를 얻었다.　 또한, RNA의 2본쇄의 형성은 상기와 동일한 방법으로 행하였다.　 이렇게 하여 얻어진 아미노알킬 수식 2본쇄 RNA와, 클로로포름에 용해한 활성 에스테르화 2본쇄 지질 유도체[DPPE-NHS(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-·-Phosphatidylethanolamine, Dipalmitoyl), (닛본 유시사 제조)]를, 축합 반응 조건 하에서 혼합하고, 2본쇄 지질 수식 RNA(DPPE 수식 2본쇄 RNA)를 합성하였다.　 반응 후, 2본쇄 지질 수식 RNA가 포함되는 반응액 중의 불필요한 시약을 제거하기 위해서, 반응액을 HPLC로 정제하였다.　 HPLC 정제는 완충액으로서 A: 100％ 20 mM TEAA(pH7.0), B: 80％ CH3CN/20 mM TEAA (pH7.0)를 이용하여, 10％ B 완충액으로부터 100％ B 완충액을 50분의 선형 구배가 되도록 설정하고 정제를 행하였다.　 또한, 정제용 칼럼은 CAP CELL(4.6 x 150 mm, 5 μm; SHISEIDO)을 사용하였다.　 HPLC 해석 결과의 일례를 도 12에 도시하였다. HPLC로 정제된 2본쇄 지질 수식 RNA는 동결 건조하고, 정제수에 용해시킨 후, UV 스펙트럼 해석에 의해 농도 및 합성 수율을 산출하였다.　 2본쇄 지질 수식 RNA는 20％ 폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해 확인하였다(도 13).　
이하에, 합성한 2본쇄 RNA의 구조 및 수율을 나타낸다.　
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <110> HAYASHI KASEI CO., LTD. <120> RNA modified with two-tailed lipid having high RNA interference effect <130> 2009000475 <150> JP 2008-094154 <151> 2008-3-31 <160> 12 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> L27A, Sense strand of 27nt dsRNA <400> 1 cuggccuuuc acuacuccua cgagcac 27 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> L27B, Antisense strand of 27nt dsRNA <400> 2 gugcucguag gagugaugaa aggccag 27 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> L21A, Sense strand of 21nt siRNA <400> 3 ggccuuucac uacuccuacg a 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> L21B, Antisense strand of 21nt siRNA <400> 4 guaggaguag ugaaaggcca g 21 <210> 5 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> v27A, Sense strand of 27nt dsRNA <400> 5 cuuccuacag cacaacaaau gugaaug 27 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> v27B, Antisense strand of 27nt dsRNA <400> 6 cauucacauu uguugugcug uaggaag 27 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> v21A, Sense strand of 21nt siRNA <400> 7 uccuacagca caacaaaugu g 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> v21B, Antisense strand of 21nt siRNA <400> 8 cauuuguugu gcuguaggaa g 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for VEGF <400> 9 ccctgatgag atcgagtaca tctt 24 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for VEGF <400> 10 accgcctcgg cttgtcac 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for GAPDH <400> 11 ggaaagctgt ggcgtgatg 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for GAPDH <400> 12 ctgttgctgt agccgtattc 20

Claims (17)

  1. 표적 유전자 중의 표적 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 센스쇄 RNA, 및 상기 센스쇄 RNA에 상보적인 염기 서열을 갖는 안티센스쇄 RNA를 갖고, 또한 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 2본쇄 RNA로서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드의 적어도 1개에 직접 또는 링커를 통해 2본쇄 지질이 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 2본쇄 지질 수식 RNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 평활 말단이고, 또한 상기 센스쇄 RNA의 3' 말단측이 평활 말단 또는 댕글링 엔드를 갖고 있는 2본쇄 지질 수식 RNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 댕글링 엔드를 갖고 있는 2본쇄 지질 수식 RNA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA를 구성하는 뉴클레오티드의 수가 21 내지 27인 2본쇄 지질 수식 RNA.
  5. 제2항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄가 각각 27개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 2본쇄 지질 수식 RNA.
  6. 제2항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측 및 3' 말단측이 모두 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄가 각각 23개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 2본쇄 지질 수식 RNA.
  7. 제2항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단측이 평활 말단이고, 상기 센스쇄 RNA가 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 또한 상기 안티센스쇄가 23개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 2본쇄 지질 수식 RNA.
  8. 제3항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA 및 상기 안티센스쇄가 각각 21개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 2본쇄 지질 수식 RNA.
  9. 제1항에 있어서, 상기 2본쇄 지질을 구성하는 2개의 소수기가 동일 또는 상이하고, 탄소수 6 내지 50의 포화 지방산 잔기 또는 불포화 지방산 잔기인 2본쇄 지질 수식 RNA.
  10. 제1항에 있어서, 상기 2본쇄 지질이 글리세로인지질, 글리세로당지질, 디아실글리세롤, 또는 세라마이드인 2본쇄 지질 수식 RNA.
  11. 제1항에 있어서, 상기 2본쇄 지질이 글리세로인지질인 2본쇄 지질 수식 RNA.
  12. 제11항에 있어서, 상기 2본쇄 지질이 포스파티딜에탄올아민인 2본쇄 지질 수식 RNA.
  13. 제12항에 있어서, 상기 2본쇄 지질이 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜에탄올아민, 및 디올레일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 2본쇄 지질 수식 RNA.
  14. 제1항에 있어서, 상기 센스쇄 RNA의 5' 말단으로부터 1 내지 6번째의 뉴클레오티드의 적어도 1개에 하기 화학식 (L-27)로 표시되는 구조의 링커를 통해 지질이 결합하고 있는 2본쇄 지질 수식 RNA.
    Figure pct00007

    [식 중, n3 및 n4는 동일 또는 상이하고, 1 내지 20의 정수를 나타냄]
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA와, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
  16. 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA의 사용.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 2본쇄 지질 수식 RNA를 세포 내에 도입하는 공정을 포함하는 표적 유전자의 발현 억제 방법.
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