JP5906508B2 - Rna干渉効果が高い2本鎖脂質修飾rna - Google Patents
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Description
Fire et. al, Nature, 391, 806-811 (1998) Tuschl et. al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001) J. Rossi et. al. Nature Biotech., 23, 222-226 (2005) J. T. Marques et. al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2006)
項1. 標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖RNA、及び該アンチセンス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAであって、該センス鎖RNAの5’末端から1〜6番目のヌクレオチドの少なくとも1つに直接又はリンカーを介して2本鎖脂質が結合していることを特徴とする、2本鎖脂質修飾RNA。
項2. 前記センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、且つ前記センス鎖RNAの3’末端側が平滑末端又はダングリングエンドを有している、項1に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項3. 前記センス鎖RNAの5’末端側及び3’末端側が共にダングリングエンドを有している、項1に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項4. 前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数が21〜27である、項1乃至3のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項5. 前記センス鎖RNAの5’末端側及び3’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ27個のヌクレオチドから構成されている、項2に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項6. 前記センス鎖RNAの5’末端側及び3’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ23個のヌクレオチドから構成されている、項2に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項7. 前記センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、前記センス鎖RNAが25個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖が23個のヌクレオチドから構成されている、項2に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項8. 前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ21個のヌクレオチドから構成されている、項3に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項9. 前記2本鎖脂質を構成する2つの疎水基が、同一又は異なって、炭素数6〜50の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基である、項1乃至8のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項10. 前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、ジアシルグリセロール、又はセラミドである、項1乃至9のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項11. 前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質である、項1乃至9のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項12. 前記2本鎖脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、項11に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項13. 前記2本鎖脂質が、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、1−パルミトイル−2−オレイル−ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される少なくとも1種である、項12に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項14. 前記センス鎖RNAの5’末端から1〜6番目のヌクレオチドの少なくとも1つに、下記一般式(L-27)で表される構造のリンカーを介して脂質が結合している、項1乃至13のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項15. 項1乃至14のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAと、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
項16. 標的遺伝子の発現を抑制するための医薬を製造するための、項1乃至14のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAの使用。
項17. 項1乃至14のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法。
1.ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
1−1.センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの配列
ウミシイタケルシフェラーゼと相同配列を持ち、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子発現を抑制できる21及び27塩基長のセンス鎖RNAと21及び27塩基長のアンチセンス鎖RNAの2本鎖RNAをデザインした。該2本鎖RNAは21塩基長のアンチセンス鎖とセンス鎖を用いた場合は3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ21塩基長の2本鎖RNAを、27塩基長のアンチセンス鎖とセンス鎖を用いた場合は両末端が平滑末端である27塩基長の2本鎖をそれぞれ形成できる。使用したRNAの配列は、以下の通りである。
27nt dsRNA センス鎖 L27A:5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’(配列番号1)
アンチセンス鎖 L27B:3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5’(配列番号2)
21nt siRNA センス鎖 L21A:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’(配列番号3)
アンチセンス鎖 L21B:3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG−5’(配列番号4)
ルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAのセンス鎖の5’末端に、2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。当該2本鎖脂質修飾センス鎖RNAにおいて、2本鎖脂質は、上記センス鎖RNAの5’末端に連結されているアミノアルキル基(Amino Modifier C6; Glen Research)を介して共有結合で結合している。2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは、活性エステル基もつ脂質化合物(以下、活性エステル化脂質化合物と表記する)と5’末端をアミノ化修飾したセンス鎖RNAとを液相中で反応させることで合成した(下記反応式1)。
2本鎖脂質修飾si L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、最終濃度が2 μMになるよう調整したセンス鎖5’-末端2本鎖脂質修飾RNA(si L21A/L21B及びDs L27A/L27B)を10%FBS(三光純薬株式会社)を含むRPMI-1640培地(インビトロジェン)中 (最終量110μl)、37℃でインキュベートし、0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h後にそれぞれ10μl取り、2μlのローディングダイを含むサンプルチューブに添加した。分解反応を停止させる為、サンプル採取後すばやく液体窒素中にて凍結し、−20℃にて保存した。得られた産物を20% ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット(GEヘルスケア バイオサイエンス)で産物を染色し(染色条件は製品マニュアル参照)、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。また比較として未修飾のsi L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性結果も同様に評価した。ゲル電気泳動の結果を図3に示す。
合成したRNA及び2本鎖脂質修飾RNAのリコンビナントDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、20mM Tris-HCl(pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5mM Mg2Cl溶液中、0.5 UのリコンビナントDicer(Gene Therapy Systems)と最終濃度2 μMになるよう調整した未修飾RNAおよび2本鎖脂質修飾RNAをサンプルチューブに10μl準備し、37℃に設定したインキュベーター中、12時間インキュベートした。その後、Dicerによる切断反応を停止させる為に、2μlのDicer Stop Solution (Gene Therapy Systems)を反応溶液に加え、更に2μlのローディングダイを加えた。得られた産物を20% ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット(GEヘルスケア バイオサイエンス)で産物を染色し(染色条件は製品マニュアル参照)、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。また、コントロールとして未修飾の21siRNもゲル電気泳動にて解析した。その結果を図4に示す。
合成した未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAのRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験前に1x105cell/mlに調整したHeLa細胞(ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所)を96wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ80 μl加え、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ)とLipofectamineTM 2000 (商品名、インビトロジェン)の複合溶液を10μlずつHeLa細胞が入ったそれぞれのウェルに加えた。ここで発現ベクターは1ウェルあたり0.02μgになるように、またLipofectamineTM 2000は1ウェルあたり0.2μlになるよう設定し、OptiMem(インビトロジェン)で必要量を調整した。また、複合体を形成させる為に、発現ベクターとLipofectamineTM 2000をOptiMemを用いて混合した後、室温で30分間インキュベートした。複合溶液を加えた後、細胞を5% CO2 存在下、37℃で4時間インキュベートした。その後、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝配列と相同的なアンチセンス配列を含む未修飾の2本鎖RNA及び末端2本鎖脂質修飾RNAを最終濃度が0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nMになるようLipofectamineTM 2000 (インビトロジェン)と複合体を形成させ、10μlの複合体溶液を発現ベクターを導入したHeLa細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は100 μlとなる。RNAとLipofectamineTM 2000の複合溶液は、1ウェルあたり5 μlのRNA水溶液と5 μlのLipofectamineTM 2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。RNAを導入させた後、48時間インキュベートしDula-GloTM Luciferase Assay System(プロメガ)を用いてホタ及びウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータ(MicroLumat LB96p: BERTHOLD)で測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼの発現抑制効果を算出した。
1.VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
1−1.センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの配列
VEGF(vascular endothelial growth factor: 血管内皮成長因子)と相同配列を持ち、VEGFの遺伝子発現を抑制できる27及び21塩基長のセンス鎖RNAと27及び21塩基長のアンチセンス鎖RNAの2本鎖RNAをデザインした。これらの2本鎖RNAを用いて、以下の実験を行った。なお、21siRNAはセンス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの双方の3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ2本鎖RNAであり、27nt dsRNAは、ダングリングエンド(1本鎖領域)を持たない完全2本鎖RNA(センス鎖RNAの5’末端側及び3’末端側が共に平滑末端である2本鎖RNA)である。使用した27nt dsRNA及び21siRNAの配列は、以下の通りである。
27nt dsRNA センス鎖 v27A:5’- CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3’(配列番号5)
アンチセンス鎖 v27B:3’- GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5’(配列番号6)
21nt siRNA センス鎖 v21A:5’-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3’(配列番号7)
アンチセンス鎖 v21B:3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5’(配列番号8)
VEGF遺伝子の発現を抑制できる上記2本鎖RNAのセンス鎖の5’末端に脂質を結合させた2本鎖脂質修飾RNAを合成した。当該2本鎖脂質修飾RNAにおいて、2本鎖脂質は上記センス鎖RNAの5’末端に修飾されたアミノアルキル基(Amino Modifier C6; Glen Research)を介して共有結合で結合している。2本鎖脂質修飾の1本鎖RNA(センス鎖)は、実施例1と同様の方法で合成した。合成した2本鎖脂質修飾のセンス鎖RNAのHPLC結果を図6に示す。なお、VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾のセンス鎖RNAにおいても、実施例1とほぼ同様の溶出時間であった。
2本鎖脂質修飾si v21A/v21B及びDs v27A/v27Bのヌクレアーゼ耐性を検討した。また比較として未修飾のsi L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性結果も評価した。実験は、上記実施例1と同様の方法で実施した。ゲル電気泳動の結果を図8に示す。
合成した2本鎖脂質未修飾RNAおよび2本鎖脂質修飾RNAのリコンビナントDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、実施例1と同様の方法で行った。その結果を図9に示す。
末端を修飾していないsi v21A/v21B、末端を修飾していないDs v27A/v27B、センス鎖RNAの5’末端を2本鎖脂質修飾したsi v21A/v21B(si Lipid-v21A/v21B)及びセンス鎖RNAの5’末端を2本鎖脂質修飾したDs v27A/v27B(Ds Lipid-v27A/v27B)のVEGF遺伝子発現阻害効果をHeLa細胞(ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所)、A549細胞(ヒト肺ガン細胞、東北大学加齢医学研究所)を用いて評価した。また、VEGF遺伝子と相同な遺伝子配列を持たないRNA(27nt dsRNA(Random)、21nt siRNA(Random))についても同様の評価を行った。
実験前に1x105 cell/mlに調整したHeLa細胞(ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所)、A549細胞(ヒト肺ガン細胞、東北大学加齢医学研究所)、を24ウェルプレートにそれぞれ1ml撒き10 % ウシ胎児血清 (FBS:三光純薬株式会社製)及び抗生物質含む培地中、5 % CO2存在下、37 ℃で培養した。ここで用いた抗生物質および培地は、HeLa細胞はMEM培地(インビトロジェン社)を、その他の細胞はRPMI-1640(インビトロジェン社)を培地として用いた。蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNA導入前に、抗生物質を含まない培地(450μl)へ交換した。蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNAは、21nt 及び27nt アンチセンス鎖RNAの5’末端を6-FAMラベル化したものを使用し、未修飾の21nt 及び27nt センス鎖RNA及び5’末端を2本鎖脂質で修飾した21nt 及び27ntセンス鎖RNAと2本鎖を形成させた。細胞導入実験は、蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNAとLipofectamineTM 2000 (インビトロジェン社製)と複合体を形成させる為に、10μM の蛍光ラベル化オリゴヌクレオチド水溶液10μlとOptiMem溶液15μlの混合溶液25μlと、LipofectamineTM 2000 (インビトロジェン社製)溶液2μlとOptiMem溶液23μlの混合溶液25μlそれぞれ混ぜ合わせた50μlの混合溶液を室温で30分間インキュベートした。調整した50μlの蛍光ラベル化オリゴヌクレオチド複合体は、上記で準備した450μlの細胞へ添加し(2本鎖RNAの終濃度:200 nM)、5 % CO2存在下、37 ℃で4時間インキュベートした。その後、細胞をPBS(-)又は培地で3回洗浄し、共焦点蛍光レーザー顕微鏡、及びフローサイトメトリーにて細胞導入を評価した。
上記実施例1及び2とは異なる手法を用いて、WT1遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAのセンス鎖RNAの5’末端に、2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。
Claims (14)
- 標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖RNA、及び該アンチセンス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAであって、該センス鎖RNAの5’末端から1〜6番目のヌクレオチドの少なくとも1つに直接又はリンカーを介して2本鎖脂質が結合しており、該2本鎖脂質がホスファチジルエタノールアミンであることを特徴とする、2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、且つ前記センス鎖RNAの3’末端側が平滑末端又はダングリングエンドを有している、請求項1に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記センス鎖RNAの5’末端側及び3’末端側が共にダングリングエンドを有している、請求項1に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数が21〜27である、請求項1乃至3のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記センス鎖RNAの5’末端側及び3’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ27個のヌクレオチドから構成されている、請求項2に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記センス鎖RNAの5’末端側及び3’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ23個のヌクレオチドから構成されている、請求項2に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、前記センス鎖RNAが25個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖が23個のヌクレオチドから構成されている、請求項2に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ21個のヌクレオチドから構成されている、請求項3に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記2本鎖脂質を構成する2つの疎水基が、同一又は異なって、炭素数6〜50の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基である、請求項1乃至8のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 前記2本鎖脂質が、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、1−パルミトイル−2−オレイル−ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1乃至9のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
- 請求項1乃至11のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAと、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 標的遺伝子の発現を抑制するための医薬を製造するための、請求項1乃至11のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAの使用。
- 請求項1乃至11のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法(但し、ヒトに対する医療行為を除く)。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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