WO2009123185A1 - Rna干渉効果が高い2本鎖脂質修飾rna - Google Patents

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英樹 大庭
秀一 豊福
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大塚製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a double-stranded lipid-modified RNA that can efficiently suppress the expression of a target gene. More specifically, the present invention relates to a double-stranded lipid-modified RNA that has a high nuclease resistance and a high intracellular introduction rate and can exhibit an excellent RNA interference effect. Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition using the double-stranded lipid-modified RNA, and a target gene expression suppression method.
  • RNA interference (RNAi) method using 21-base short double-stranded RNA has recently attracted attention.
  • This RNAi method was first reported by Fire et al. In 1998 (see Non-Patent Document 1). According to the report of Fire et al., By introducing a double-stranded RNA of about 100 base pairs homologous to a specific region of the gene whose function is to be inhibited into the cell, Dicer acts in the cytoplasm to produce 2 of about 20-25 base pairs.
  • RNA-induced silencing complex RNA-induced silencing complex
  • RICS RNA-induced silencing
  • siRNA method as distinguished from RNAi method.
  • siRNA method uses synthetic RNA, sample preparation is relatively easy, the handling operation is simple, and it has a very powerful effect, so it attracts great attention not only in the life science field but also in the biobusiness field. ing.
  • siRNA is composed of RNA molecules, and is rapidly degraded by the action of nucleases contained in cells and in the medium.
  • the double-stranded RNA region shows relatively high nuclease resistance compared to single-stranded RNA, but double-stranded RNA consisting of 19 base pairs hardly shows the conventional RNA interference effect. Therefore, the synthetic siRNA shows a high gene expression suppression effect for about 2 days to 4 days after introduction into a cell having the target gene sequence, but after that, the RNA interference effect declines rapidly, and the RNA interference effect is observed after about 7 days. Has been reported to almost disappear.
  • siRNA in which the end of siRNA is modified with an amino group, a thiol group, or basic is synthesized.
  • the RNA interference effect is significantly reduced in most cases of 21-base siRNA modified at the ends.
  • RNA consisting of 27 base pairs exhibits an RNA interference effect about 100 times higher than siRNA consisting of 21 bases (Non-Patent Document 3). reference). This is because RNA consisting of 27 base pairs is cleaved into 21-base siRNA by Dicer, an RNase III-like enzyme, and then directly recognized by RISC, a protein complex, so that siRNA effect can be exhibited with high efficiency. It is thought that.
  • 27-base RNA can have an excellent RNA interference effect, its application as a gene medicine is expected more and more in the future.
  • technical means for enhancing the RNA interference effect is not clarified not only for the 27-base-length RNA but also for other base-length RNAs.
  • double-stranded RNA that exhibits an RNA interference effect generally employs a structure having a dangling end at the end, but does not have a dangling end at the end (that is, a structure having a blunt end). ) Is also being studied for RNA interference effects. However, in the structure where the 5 ′ end of the sense strand RNA is a blunt end, the RNA interference effect is almost the same as when the dangling end is on the 5 ′ end side of the sense strand RNA, or the RNA interference effect Is suggested to be reduced (see Non-Patent Document 4).
  • lipids have high affinity and permeability to cell membranes and have been found to be useful for delivering drugs into cells.
  • a lipid By binding such a lipid to a double-stranded RNA that exhibits an RNA interference effect, it is expected that the rate of intracellular introduction is increased and the RNA interference effect is more effectively exhibited.
  • simply binding a lipid to a double-stranded RNA that exhibits an RNA interference effect leads to a significant attenuation of the RNA interference effect.
  • the current situation is that lipid-modified RNA having both effects cannot be constructed. Fire et.al, Nature, 391, 806-811 (1998) Tuschl et.al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001) J. Rossi et.al. Nature Biotech., 23, 222-226 (2005) J. T. Marques et.al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2006)
  • An object of the present invention is to provide a novel double-stranded RNA having a high nuclease resistance and a high introduction rate into cells and capable of exhibiting an excellent RNA interference effect. Furthermore, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition using the novel double-stranded RNA and a method for suppressing the expression of a target gene.
  • the present inventors have made extensive studies to solve the above-mentioned problems.
  • the present inventors include a sense strand RNA containing a base sequence complementary to the target sequence in the target gene, and a base sequence complementary to the sense strand RNA.
  • a double-stranded RNA having an antisense strand RNA and capable of suppressing the expression of a target gene, either directly or via a linker at least one of the 1st to 6th nucleotides from the 5 ′ end of the sense strand RNA It has been found that RNA with significantly improved nuclease resistance, intracellular introduction rate, and RNA interference effect can be constructed by combining chain lipids.
  • the present invention has been completed by making further improvements based on such findings.
  • the present invention provides the following double-stranded lipid-modified RNA, pharmaceutical composition, use, and target gene expression suppression method.
  • Item 1 Two having a sense strand RNA consisting of a base sequence complementary to the target sequence in the target gene, and an antisense strand RNA having a base sequence complementary to the sense strand RNA, and can suppress the expression of the target gene A double stranded RNA, characterized in that a double stranded lipid is bound to at least one of the first to sixth nucleotides from the 5 'end of the sense strand RNA directly or via a linker Lipid modified RNA.
  • Item 2. Item 2.
  • the double-stranded lipid-modified RNA according to Item 1 wherein the 5 ′ end side of the sense strand RNA is a blunt end, and the 3 ′ end side of the sense strand RNA has a blunt end or a dangling end.
  • Item 3. Item 2. The double-stranded lipid-modified RNA according to Item 1, wherein both the 5 ′ end side and the 3 ′ end side of the sense strand RNA have dangling ends.
  • the double-stranded lipid according to Item 2 wherein both the 5 'end side and the 3' end side of the sense strand RNA are blunt ends, and the sense strand RNA and the antisense strand are each composed of 27 nucleotides. Modified RNA.
  • Item 6. Item 5. The double-stranded lipid according to Item 2, wherein both the 5 ′ end side and the 3 ′ end side of the sense strand RNA are blunt ends, and the sense strand RNA and the antisense strand are each composed of 23 nucleotides. Modified RNA.
  • the two strands according to Item 2 wherein the 5 ′ end side of the sense strand RNA is a blunt end, the sense strand RNA is composed of 25 nucleotides, and the antisense strand is composed of 23 nucleotides.
  • Item 8. Item 4. The double-stranded lipid-modified RNA according to item 3, wherein the sense strand RNA and the antisense strand are each composed of 21 nucleotides.
  • Item 10. The double-stranded lipid-modified RNA according to any one of Items 1 to 9, wherein the double-stranded lipid is glycerophospholipid, glyceroglycolipid, diacylglycerol, or ceramide.
  • Item 11. Item 10. The double-stranded lipid-modified RNA according to any one of Items 1 to 9, wherein the double-stranded lipid is glycerophospholipid.
  • Item 12. Item 12. The double-stranded lipid-modified RNA according to Item 11, wherein the double-stranded lipid is phosphatidylethanolamine.
  • the double-chain lipid is at least one selected from the group consisting of dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleyl-phosphatidylethanolamine, and dioleyl phosphatidylethanolamine;
  • Item 13 The double-stranded lipid-modified RNA according to Item 12.
  • Item 14. Item 1 to 13 wherein a lipid is bonded to at least one of the first to sixth nucleotides from the 5 ′ end of the sense strand RNA through a linker having a structure represented by the following general formula (L-27).
  • L-27 linker having a structure represented by the following general formula
  • Item 15 A pharmaceutical composition comprising the double-stranded lipid-modified RNA according to any one of Items 1 to 14 and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Item 16. Item 15. Use of the double-stranded lipid-modified RNA according to any one of Items 1 to 14 for producing a medicament for suppressing expression of a target gene.
  • Item 17. Item 15. A method for suppressing the expression of a target gene, comprising a step of introducing the double-stranded lipid-modified RNA according to any one of Items 1 to 14 into a cell.
  • the 5 ′ end side of the sense strand RNA is modified with a double-stranded lipid, which greatly improves the RNA interference effect.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention binds to a specific site with a double-stranded lipid, so that it does not interfere with the processing by Dicer or the ability to form a complex with RISC, and also has nuclease resistance and RNA Since the interference effect is remarkably improved, it can greatly contribute to the application to medical use.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention alone has a significantly superior ability to translocate into the cell, the conventional gene introduction reagent is not used separately or the amount of the conventional gene introduction reagent is reduced. It can also be introduced into cells. Therefore, the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention can suppress the expression of cytotoxicity which is a concern due to the use of conventional gene transfer reagents, and can ensure high safety in clinical applications.
  • the pharmaceutical composition or the target gene expression suppression method using the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention it is clinically possible to suppress or inhibit the expression of the target gene more effectively.
  • Example 1 it is a figure which shows the result of having analyzed the double-stranded lipid modification sense strand RNA by HPLC. In Example 1, it is a figure which shows the result of having confirmed formation of double strand RNA of double strand lipid modification RNA.
  • Fig. 2A (1) is 21nt siRNA, (2) is DPPE L21A / L21B RNA, (3) is POPE L21A / L21B RNA, (4) is DOPE L21A / L21B RNA, (5) is The result of DMPE DML21A / L21B RNA is shown.
  • Fig. 2A (1) is 21nt siRNA
  • (2) is DPPE L21A / L21B RNA
  • (3) is POPE L21A / L21B RNA
  • (4) is DOPE L21A / L21B RNA
  • (5) is The result of DMPE DML21A / L21B RNA is shown.
  • Example 2B (1) is 27nt dsRNA, (2) is DPPE L27A / L27B RNA, (3) is POPE L27A / L27B RNA, (4) is DOPE L27A / L27B RNA, (5) is The result of RNA of DMPE L27A / L27B is shown.
  • Example 1 it is a figure which shows the nuclease resistance result of double strand lipid modification RNA.
  • Example 1 it is a figure which shows the result of having examined processing by the dicer of double stranded lipid modification RNA.
  • Example 1 it is a figure which shows the result of the RNA interference effect of double stranded lipid modification 27nt * dsRNA in the case of a 2 * nM density
  • Example 2 it is a figure which shows the HPLC analysis result of double stranded lipid modification sense strand RNA.
  • Example 2 it is a figure which shows the result which confirmed the double strand formation of double strand lipid modification RNA.
  • A-1 (1) shows the results of 21nt siRNA, (2) shows the results of DPPE v21A / v21B RNA, A-2 (1) shows 21nt siRNA, (2) shows POPE v27A / v27B RNA, (3) shows the results for DOPE v27A / v27B RNA, and (4) shows the results for DMPE 27A / v27B RNA.
  • A-2 (1) shows 21nt siRNA
  • (2) shows POPE v27A / v27B RNA
  • DOPE v27A / v27B RNA shows the results for DOPE v27A / v27B RNA
  • (4) shows the results for DMPE 27A / v27B RNA.
  • Example 7B (1) is 27nt dsRNA, (2) is DPPE v27A / v27B RNA, (3) is POPE v27A / v27B RNA, (4) is DOPE v27A / v27B RNA, (5) is The result of DMPE DMv27A / v27B RNA is shown.
  • Example 2 it is a figure which shows the nuclease resistance result of double strand lipid modification RNA.
  • Example 2 it is a figure which shows the result of having examined processing by the dicer of double stranded lipid modification RNA.
  • Example 2 it is a figure which shows the result of the RNA interference effect with respect to the VEGF gene in HeLa and the A549 cell of double strand lipid modification RNA.
  • Example 2 it is a figure which shows the result of the cell transduction property with respect to the VEGF gene in a HeLa cell of a double strand lipid modification RNA.
  • FL represents an image taken with a fluorescence microscope
  • trans represents an image obtained by photographing the same field of view as the FL with a phase contrast microscope
  • merge represents an image obtained by superimposing the FL and trans.
  • Example 3 shows the result of having analyzed the double stranded lipid modification RNA by HPLC. In Example 3, it is a figure which shows the result of having confirmed the synthesis
  • the term “blunt end” means that the terminal region of the sense strand and the terminal region of the antisense strand that is paired with the terminal region of the double-stranded RNA do not form a single-stranded part (that is, (Without the formation of protrusions).
  • the “dangling end” refers to a structure that is also called an overhang.
  • the base paired in the end region of the sense strand or the end region of the antisense strand paired therewith This means a base sequence portion (protrusion) where a single strand cannot be formed because a double strand cannot be formed.
  • double-stranded lipid-modified RNA refers to a double-stranded RNA molecule to which a double-stranded lipid is bound.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention includes a sense strand RNA that is a base sequence complementary to the target sequence in the target gene.
  • the target gene is a gene whose gene expression is to be suppressed due to the RNA interference effect.
  • the target gene is not particularly limited, and can be appropriately selected based on the use of the double-stranded lipid-modified RNA.
  • the target sequence in the target gene is not particularly limited as long as it is a sequence capable of suppressing gene expression due to RNA interference effect, and is appropriately determined by a known method, specifically using NCBI BLAST search or the like. Can do. For example, a region consisting of 19 to 30 bases following the base “AA” in the exon portion 50 to 100 bases downstream from the start codon of the target gene coding region (ORF) and having a GC content of around 50% May be the target sequence. Employing such a complementary strand to the target sequence has empirically revealed in the art that an excellent RNA interference effect can be obtained.
  • the target sequence can be set according to the manual (Dicer Substrate RNAi Design) of IDT (Integrated DNA Technologies, INC).
  • the 5 ′ end of the antisense strand RNA is an A / U pair
  • the 5 ′ end of the sense strand RNA is a G / C pair
  • the antisense strand RNA 5 'It has a high RNA interference effect by designing double-stranded RNA that has about 5 A / U pairs on the end side and (vi) no more than 9 G / C pairs in the double strand 2 It has been reported that single-stranded RNA can be designed (Ui-Tei et. Al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)).
  • the sense strand when there is no dangling end in the sense strand, the sense strand consists of a base sequence complementary to the target sequence.
  • the sense strand is at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the base sequence complementary to the target sequence, It consists of a base sequence in which base sequences constituting the dangling end are linked.
  • the number of nucleotides constituting the sense-strand RNA is not particularly limited as long as an RNA interference effect can be achieved, depending on the structure etc. provided for the double-stranded lipid-modified RNA. Although appropriately set, it is usually 21 to 27, preferably 21, 23, 25, or 27, more preferably 21 or 27.
  • the number of nucleotides constituting the sense strand RNA here means the total number of nucleotides constituting the base sequence complementary to the target sequence when no dangling end exists in the sense strand, When a dangling end is present in the sense strand, it means the sum of the number of nucleotides constituting the dangling end and the number of nucleotides constituting a base sequence complementary to the target sequence.
  • the double-stranded lipid-modified RNA has an antisense strand containing a base sequence complementary to the sense strand.
  • the antisense strand when there is no dangling end in the antisense strand, the antisense strand is a part or all of the “base sequence complementary to the target sequence” of the sense strand.
  • Complementary nucleotide sequences when the dangling end is present at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the antisense strand, the antisense strand is a part of the “base sequence complementary to the target sequence” of the sense strand or It consists of a base sequence in which the base sequence constituting the dangling end is linked to the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the base sequence that is complementary to the whole.
  • the number of nucleotides constituting the antisense strand RNA is not particularly limited as long as an RNA interference effect can be exerted, and a double-stranded RNA structure provided in the double-stranded RNA, etc. Depending on the above, it is appropriately set, and usually 21 to 27, preferably 21, 23, 25, or 27, more preferably 21, 23, or 27.
  • the number of nucleotides constituting the antisense strand RNA means the total number of nucleotides constituting the base sequence complementary to the target sequence when no dangling end exists in the antisense strand. When a dangling end is present in the antisense strand, it means the sum of the number of nucleotides constituting the dangling end and the number of nucleotides constituting a base sequence complementary to the target sequence.
  • the nucleotides constituting the sense strand RNA and the antisense strand RNA are basically ribonucleotides, but for the purpose of improving resistance to degrading enzymes, 2′-O—
  • the RNA sequence may contain various chemically modified nucleotides such as methyl-modified, 2′-F-modified, LNA (Locked Nucleic Acid), or deoxyribonucleotides.
  • the constituent part of the dangling end in the sense strand RNA and / or the antisense strand RNA is composed of deoxyribonucleotides. It may be.
  • chemically modified nucleotides include phosphorothioate-type and boranophosphate-type DNA / RNA-modified phosphate backbones; 2′-0Me-modified RNA, 2′-F-modified RNA, etc.
  • Modified nucleotides such as LNA (Locked Nucleic Acid) and ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids), etc .; Examples include modified nucleotides having different basic skeletons such as forinonucleotides; base-modified nucleotides such as 5-fluorouridine and 5-propyluridine.
  • the structure thereof is not particularly limited.
  • the 5 ′ end side of the sense strand RNA is a blunt end (brand end), and the 3 ′ end side of the sense strand RNA has a blunt end or dangling end (single stranded region, overhang).
  • Examples of the structure and (B) a structure having dangling ends on both the 5 ′ end side and the 3 ′ end side of the sense strand RNA are given.
  • the intracellular introduction efficiency is further significantly improved without causing attenuation of the RNA interference effect while being modified with a double-stranded lipid. It becomes possible to make it.
  • the case where the 3 ′ end region of the sense strand RNA forms the dangling end and the 5 ′ end region of the antisense strand RNA This includes both cases where a dangling end is configured.
  • the 5 ′ end region of the sense strand RNA constitutes the dangling end and the 3 ′ end region of the antisense strand RNA This includes both cases where a dangling end is configured.
  • the structures (A-1) to (A-3) include the following structures (B-1) as included in the structure (B):
  • (A-1) The sense strand A structure in which the 5 ′ end side and the 3 ′ end side of RNA are both blunt ends, and the sense strand RNA and the antisense strand RNA are each composed of 27 nucleotides;
  • (A-2) A structure in which both the 5 ′ end side and the 3 ′ end side are blunt ends, and the sense strand RNA and the antisense strand RNA are each composed of 23 nucleotides;
  • the structures (A-1) and (A-2) above are structures in which the sense strand RNA and the antisense strand RNA are hybridized without forming dangling ends at both ends.
  • the structure of (A-3) is such that the 5 ′ end of the sense strand RNA is a blunt end, and the first to second nucleotides from the 3 ′ end of the sense strand RNA form a dangling end.
  • This is a structure in which a sense strand RNA and an antisense strand RNA are hybridized.
  • the structure of (B-1) is such that the 1st to 19th nucleotides from the 5 ′ end of the sense strand and the 3rd to 21st nucleotides from the 3 ′ end of the antisense strand RNA are hybridized, and the sense strand RNA
  • the first and second nucleotides from the 3 ′ end and the first and second nucleotides from the 3 ′ end of the antisense strand RNA each form a dangling end.
  • lipid is bound to at least one of the first to sixth nucleotides from the 5 ′ end side of the sense strand RNA.
  • no other substituent is bonded to a site other than the 5 ′ end side of the sense strand RNA. That is, the portion other than the 5 ′ end side of the sense strand RNA and the antisense strand RNA portion are not substituted with other substituents, and are composed only of nucleotides.
  • the double-stranded lipid is bound only to the 5 ′ end side of the sense strand RNA, it is possible to increase the introduction rate into the cell and to express a significantly superior RNA interference effect. . That is, in the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention, structural features such as the structure of the double-stranded RNA, the selection of the double-stranded lipid as the lipid to be modified, and the binding site of the double-stranded lipid are integrated. As an inseparable relationship, it is possible to have a high intracellular introduction rate, have nuclease resistance, and have a much superior RNA interference effect.
  • the double-stranded lipid bound to the sense strand RNA is not particularly limited as long as it is a lipid having two hydrophobic groups.
  • examples include lipids having at least two hydrophobic groups selected from the group consisting of 50 saturated fatty acid residues and unsaturated fatty acid residues.
  • the carbon number of the saturated fatty acid residue and unsaturated fatty acid residue is preferably 8 to 30, more preferably 10 to 24.
  • hydrophobic group constituting the lipid for example, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid, lignoceric acid, myristoleic acid, palmitoleic acid, oleic acid,
  • examples include fatty acid residues such as elaidic acid, vaccenic acid, erucic acid, gadoleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid.
  • the two hydrophobic groups of the double-chain lipid used in the present invention are selected from the group consisting of myristic acid, palmitic acid, stearic acid, and oleic acid. Desirably, it is a residue of at least one fatty acid.
  • the double-chain lipid used in the present invention include glycerophospholipid, glyceroglycolipid, diacylglycerol, ceramide and the like.
  • glycerophospholipid is preferable from the viewpoint of further improving nuclease resistance, intracellular introduction rate, and RNA interference effect.
  • the glycerophospholipid used in the present invention is not particularly limited, and phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol and the like can be arbitrarily used.
  • phospholipids used in the present invention include dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, distearoyl phosphatidylethanolamine, dioleyl phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleyl Phosphatidylethanolamines such as phosphatidylethanolamine, 1-oleyl-2-palmitoyl-phosphatidylethanolamine, dielcoyl phosphatidylethanolamine; dilauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol, dioleyl Phosphatidylg Phosphatidylglycerols such as serol, 1-palmitoyl-2-oleyl
  • phosphatidylethanolamine more preferably dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 1 is preferable from the viewpoint of making nuclease resistance, intracellular introduction rate, and RNA interference effect more remarkable.
  • -Palmitoyl-2-oleyl-phosphatidylethanolamine, and dioleylphosphatidylethanolamine are preferable from the viewpoint of making nuclease resistance, intracellular introduction rate, and RNA interference effect more remarkable.
  • the binding mode of the double-stranded lipid and the sense strand is not particularly limited, and these may be directly bonded, and these may be linked via a linker (linkage region). May be combined.
  • the linker that links the double-stranded lipid and the sense strand does not include those composed of nucleic acids.
  • the linker is not particularly limited as long as it can link the lipid and the sense strand.
  • the linker has the following structure.
  • n1 represents an integer of 1 to 40, preferably an integer of 2 to 20, and more preferably an integer of 2 to 12.
  • n2 represents an integer of 1 to 20, preferably an integer of 1 to 10, and more preferably an integer of 1 to 6.
  • n3 and n4 are the same or different and are an integer of 1 to 20, preferably an integer of 1 to 10, more preferably an integer of 1 to 6. Indicates.
  • single-stranded DNA may be bound to either the right side or the left side.
  • a double-stranded lipid is bound on the left side and the sense strand RNA 5 'terminal region of the double-stranded RNA is bound on the right side.
  • the binding site of the linker to the double-chain lipid is appropriately set according to the type of the double-chain lipid and the type of the linker, but the site other than the hydrophobic group of the double-chain lipid is chemically linked with the linker. It is only necessary to be connected by combining them.
  • the amino group may be linked to the linker by forming an amide bond or the like.
  • phosphatidylglycerol is used, the hydroxyl group in the glycerol residue may be linked to the linker by forming an ester bond or an ether bond.
  • the amino group or carboxyl group in the serine residue should just be connected by forming the amide bond or ester bond etc. with the said linker.
  • the phosphate residue may be linked by forming a phosphate ester bond or the like with the linker.
  • the hydroxyl group in the inositol residue may be linked to the linker by forming an ester bond or an ether bond.
  • the linker is appropriately selected according to the type of lipid to be linked.
  • an amino group-containing phospholipid that is, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, etc.
  • a hydroxyl group-containing phospholipid That is, in the case of using phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, etc.
  • the linker the general formulas (L-6), (L-7), (L-9), (L-10), (L- The linkers 18), (L-26), and (L-27) are preferred.
  • N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propinate, N-4-maleimidobutyric acid, S- (2-pyridyldithio) cysteamine, iodoacetoxysuccinimide, N- (4- Bifunctionality such as maleimidobutyryloxy) succinimide, N- [5- (3′-maleimidopropylamido) -1-carboxypentyl] iminodiacetic acid, N- (5-aminopentyl) -iminodiacetic acid
  • a linker (linker containing two functional groups) can also be used.
  • the nucleotide to be bound by the double-stranded lipid or the linker linking the double-stranded lipid is not particularly limited as long as it is the first to sixth nucleotides from the 5 ′ end side of the sense strand RNA.
  • the 1st to 4th nucleotides from the 5 ′ end more preferably the 1st and / or 2nd nucleotides from the 5 ′ end, particularly preferably the 5 ′ end (first from the 5 ′ end) nucleotide is there.
  • the binding site of the linker for linking the double-stranded lipid or the double-stranded lipid in the sense strand RNA is not particularly limited, but the linker connecting the double-stranded lipid or the double-stranded lipid is not limited. It is preferable that the sense strand RNA is substituted and bonded to a hydrogen atom constituting a hydroxyl group of a phosphate portion of a predetermined nucleotide of the sense strand RNA.
  • the number of double-stranded lipids bound to the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention is not particularly limited, but for example, 1 to 3, preferably 1 or 2, more preferably 1 is exemplified. .
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention synthesizes the sense strand RNA and the antisense strand RNA to which double-stranded lipids are linked, respectively, and these sense strand RNA and antisense strand RNA are prepared according to known methods. Manufactured by hybridization. The sense strand RNA to which double-stranded lipids are linked can also be produced using a known synthesis technique.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention is prepared by synthesizing the sense strand RNA and the antisense strand RNA according to a known method and hybridizing them to prepare a double-stranded RNA. It can also be produced by linking a double-stranded lipid to the 5 ′ end of the sense RNA of the double-stranded RNA using a known synthesis technique of a double-stranded lipid.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention can suppress or inhibit the expression of the target gene by being introduced into the cell, so that it is a drug for suppressing the expression of the target gene or a drug for gene therapy Or as an experimental material for evaluating the effect of suppressing the expression of a target gene.
  • the cells into which the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention is to be introduced may be derived from any of humans, non-human mammals, birds, insects, etc., but preferably humans and non-humans. The thing derived from a human mammal is mentioned.
  • the method for introducing the double-stranded lipid-modified RNA into the cell of the present invention is the same as in the case of conventional siRNA, and an effective amount of the double-stranded lipid-modified RNA may be brought into contact with the cell to be introduced. .
  • Introduction of the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention into a cell may be performed in any of in vivo, in vitro, and ex vivo.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention when introduced into cells in vitro, there is a method of culturing cells in the presence of an appropriate amount of the double-stranded lipid-modified RNA in advance when the cells are cultured. Illustrated.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention when introduced in vitro or ex-vivo into cultured cells, cells removed from the living body, or tissues removed from the living body, the double-stranded lipid-modified RNA In the presence, cultured cells, cells removed from the living body, or tissues removed from the living body may be incubated.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention when introduced into cells in vivo, direct injection into tissues; intravenous, subcutaneous, muscle, abdominal, intraocular, digestive organ, intradental, etc. Injection; inhalation administration to nasal cavity, oral cavity, lung, etc .; oral administration; transdermal administration via skin; and transmucosal administration via oral mucosa, vaginal mucosa, ocular mucosa, rectal mucosa, uterine mucosa, etc.
  • the double-stranded lipid-modified RNA may be administered.
  • the amount of the double-stranded lipid-modified RNA applied to the cell to be introduced should be an effective amount for introduction into the cell.
  • a range in which the application amount of the double-stranded lipid-modified RNA per cell is 0.001 to 10 pmol (picomoles), preferably 0.001 to 1 pmol, more preferably 0.01 to 0.1 pmol is exemplified. Is done.
  • the conventional gene introduction reagent can be used without using the conventional gene introduction reagent used for introduction of siRNA into cells. It is also possible to reduce the amount of reagent used and introduce it into the cell.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention can be suppressed or inhibited by introducing into a cell
  • the double-stranded lipid-modified RNA is used, for example, in the field of medicine. It can be used for preventing, reducing or treating a disease caused by expression of the target gene.
  • the double-stranded lipid-modified RNA of the present invention is used in the pharmaceutical field
  • the double-stranded lipid-modified RNA is formulated with a pharmaceutically acceptable carrier and provided as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier used in the pharmaceutical composition may be appropriately selected according to the usage form of the pharmaceutical composition, and is not particularly limited.
  • purified water aqueous sugar solution
  • aqueous carriers such as buffers, physiological saline, polymer aqueous solutions, and RNase-free water, excipients, and the like.
  • the blending ratio of the double-stranded lipid-modified RNA in the pharmaceutical composition may be appropriately set so that the application amount of the double-stranded lipid-modified RNA described above can be satisfied, for example, per total amount of the pharmaceutical composition
  • Examples of the double-stranded lipid-modified RNA are 0.001 to 50% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight, and more preferably 0.1 to 1% by weight.
  • the formulation form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as the double-stranded lipid-modified RNA can be introduced into the cell.
  • liquid preparations including syrups), infusions, etc.
  • Liquid preparations such as pharmaceuticals and injections
  • solid preparations such as freeze-dried preparations, dry syrup preparations, tablets, pills, powders, granules, capsules (including soft capsules) and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a solid preparation, it may be used by dissolving it again by adding distilled water for injection, sterilized water or the like at the time of use.
  • the disease or symptom to which the pharmaceutical composition is applied is not particularly limited as long as the expression of the target gene is involved.
  • the relationship between the target gene and the disease is known in the art.
  • the pharmaceutical composition may be used for human-derived cells for the purpose of human treatment, or for the treatment of animals other than humans (particularly mammals other than humans). Good.
  • Example 1 Inhibitory effect of 5 'double-stranded lipid-modified RNA on luciferase gene expression 1.
  • the double-stranded RNA is a 21-base double-stranded RNA having a 2-base dangling end at the 3 'end, and a 27-base antisense strand.
  • the sense strand is used, a 27-base long double strand having both ends blunted can be formed.
  • the sequence of RNA used is as follows.
  • Double-stranded RNA was prepared using these sense strand RNA and antisense strand.
  • Double-stranded RNA is prepared by mixing the same mole of sense and antisense single-stranded RNA in universal buffer (Hayashi Kasei Co., Ltd.), heating at 92 ° C for 2 minutes, and gradually increasing the temperature to 4 ° C. Created by lowering.
  • Each synthesized double-stranded RNA is electrophoresed for 60 minutes under a 250% condition using a 20% polyacrylamide gel, and then stained with a silver staining kit (GE Healthcare Bioscience). confirmed.
  • si L21A / L21B is a 21-base long double-stranded RNA with a 2-base dangling end at the 3 'end
  • Ds L27A / L27B is a 27-base long double-stranded RNA with a blunt end. It was.
  • Double-stranded lipid-modified sense strand RNA in which double-stranded lipid is bound to the 5 'end of the sense strand of double-stranded RNA that can suppress the expression of luciferase gene was synthesized.
  • the double-stranded lipid-modified sense strand RNA the double-stranded lipid is covalently bound via an aminoalkyl group (Amino Modifier C6; Glen Research) linked to the 5 ′ end of the sense strand RNA. Yes.
  • Double-stranded lipid-modified sense strand RNA is obtained by reacting a lipid compound having an active ester group (hereinafter referred to as an active esterified lipid compound) with a sense strand RNA that is aminated at the 5 'end in a liquid phase. Synthesized (Scheme 1 below).
  • R1 and R2 are the same or different and represent a fatty acid residue.
  • RNA solid phase synthesis Sense strand RNA was synthesized.
  • the 5 ′ terminal aminoalkyl group sense strand RNA was purchased from Hayashi Kasei Co., Ltd. after HPLC purification and MALDI-TOF MS analysis.
  • the synthesized 5 ′ terminal aminoalkyl group sense strand RNA has — (CH 2 ) 6 —NH 2 bonded to the terminal (the phosphate residue of the first nucleotide from the 5 ′ terminal side).
  • the concentration of the synthesized single-stranded RNA was calculated by measuring the absorbance at 260 nm using a UV spectrum detector.
  • This aminoalkyl group-modified single-stranded RNA and an active esterified double-stranded lipid derivative [DPPE-NHS (N- (Succinimidyl-glutaryl) -L- ⁇ -Phosphatidylethanolamine, Dipalmitoyl), POPE-NHS (N -(Succinimidyl-glutaryl) -L- ⁇ -Phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2oleoyl), DOPE-NHS (N- (Succinimidyl-glutaryl) -L- ⁇ -Phosphatidylethanolamine, Dioleoyl), DMPE-NHS (N- (Succinimidyl- glutaryl) -L- ⁇ -Phosphatidylethanolamine, Dimyristoyl
  • the reaction solution was purified by HPLC in order to remove unnecessary reagents in the reaction solution containing the double-stranded lipid-modified sense strand RNA.
  • HPLC purification A: 100% 20 mM TEAA (pH 7.0) and B: 80% CH 3 CN / 20 mM TEAA (pH 7.0) were used as buffers, and 10% B buffer to 100% B buffer were used for 50 minutes. Purification was carried out with a linear gradient. Further, CAP CELL (4.6 ⁇ 150 mm, 5 ⁇ m; SHISEIDO) was used as a purification column.
  • An example of the HPLC analysis result is shown in FIG. Double-stranded lipid-modified sense strand RNA purified by HPLC was lyophilized and dissolved in purified water, and then the concentration and synthesis yield were calculated by UV spectrum analysis.
  • RNA double-stranded lipid-modified sense strand RNA was allowed to form a double strand with antisense RNA to obtain double-stranded lipid-modified RNA. Formation of RNA double strands was carried out in the same manner as described above, and was confirmed by 20% polyacrylamide gel electrophoresis (see FIG. 2).
  • RNA targeting luciferase gene by Dicer Processing of double-stranded lipid-modified RNA targeting luciferase gene by Dicer and processing of double-stranded lipid-modified RNA by recombinant Dicer were investigated. Dicer cleavage experiments were performed with unmodified RNA adjusted to a final concentration of 2 ⁇ M with 0.5 U recombinant Dicer (Gene Therapy Systems) in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5 mM Mg 2 Cl solution. And 10 ⁇ l of double-stranded lipid-modified RNA was prepared in a sample tube and incubated in an incubator set at 37 ° C. for 12 hours.
  • Dicer Stop Solution (Gene Therapy Systems) was added to the reaction solution, and further 2 ⁇ l of loading dye was added.
  • the obtained product was subjected to electrophoresis using a 20% polyacrylamide gel at 250 V for 70 minutes. Thereafter, the product was stained with a silver staining kit (GE Healthcare Bioscience) (see the product manual for staining conditions), and gel analysis was performed with ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). As a control, unmodified 21siRN was also analyzed by gel electrophoresis. The result is shown in FIG.
  • unmodified si L21A / L21B is not processed by Dicer, and double-stranded RNA in which double-stranded lipids are modified by 21-base RNA (si Lipid-L21A / L21B is also processed by Dicer.
  • si Lipid-L21A / L21B is also processed by Dicer.
  • the molecular weight of the double-chain lipid modified si ⁇ L21A / L21B coexisted with the Dicer protein was increased, the double-chain lipid modified si L21A / L21B It was also confirmed that a complex was formed.
  • RNA interference effect of synthesized unmodified RNA and double-stranded lipid-modified RNA was evaluated using Renilla luciferase as a target.
  • HeLa cells human cervical cancer cells, Tohoku University Institute for Aging Medicine
  • 1 ⁇ 10 5 cells / ml were plated on a 96-well plate, and incubated at 37 ° C. overnight.
  • RNA and terminal double-stranded lipid-modified RNA containing an antisense sequence homologous to the genetic sequence of Renilla luciferase are final concentrations of 0 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM,
  • a complex was formed with Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) to 10 nM, and 10 ⁇ l of the complex solution was added to HeLa cells into which the expression vector was introduced.
  • the final volume per well is 100 ⁇ l.
  • RNA and Lipofectamine TM 2000 were prepared by mixing 5 ⁇ l of RNA aqueous solution and 5 ⁇ l of Lipofectamine TM 2000 (0.2 ⁇ l) OptiMem solution per well and incubating at room temperature for 30 minutes. After introducing RNA, incubate for 48 hours, measure the expression level of firefly and Renilla luciferase using Dula-Glo TM Luciferase Assay System (Promega) with a luminometer (MicroLumat LB96p: BERTHOLD), and determine the expression level of firefly luciferase As a control, the effect of inhibiting the expression of Renilla luciferase was calculated.
  • FIG. 5 The results are shown in FIG. In FIG. 5, “A” is the result of suppression of luciferase gene expression when a double-stranded lipid-modified 21 nt siRNA is used, and “B” is a double-stranded lipid-modified 27 nt dsRNA. Unmodified 21nt siRNA and 27nt dsRNA were also evaluated simultaneously. As a result, it was confirmed that 21nt siRNA and 27nt dsRNA to which double-stranded lipids were bound exhibited a much higher RNA interference effect than unmodified 21nt siRNA and 27nt dsRNA.
  • Example 2 Inhibition of VEGF gene expression by 5 'double-stranded lipid-modified RNA 1.
  • Sense RNA and antisense strand RNA sequence VEGF (vascular endothelial growth factor) homologous sequence and 27 and 21 base length sense strand RNA and 27 and 21 base length that can suppress VEGF gene expression We designed double-stranded RNA of the antisense strand RNA. The following experiment was performed using these double-stranded RNAs.
  • 21siRNA is a double-stranded RNA having a 2-base dangling end at the 3 ′ end of both the sense strand RNA and the antisense strand RNA, and 27nt dsRNA does not have a dangling end (single-stranded region). It is a complete double-stranded RNA (a double-stranded RNA in which both the 5 ′ end side and 3 ′ end side of the sense strand RNA are blunt ends).
  • the sequences of 27nt dsRNA and 21siRNA used are as follows.
  • Example 2 These sense strand RNAs and antisense strands were annealed in the same manner as in Example 1 to form double strands to obtain double strand lipid-unmodified RNA. Double strand formation was confirmed by 20% acrylamide gel electrophoresis in the same manner as in Example 1.
  • Double-stranded lipid-modified RNA targeting VEGF gene Double-stranded lipid-modified RNA in which a lipid was bound to the 5 'end of the sense strand of the above-mentioned double-stranded RNA capable of suppressing the expression of VEGF gene was synthesized.
  • the double-stranded lipid-modified RNA the double-stranded lipid is covalently bound via an aminoalkyl group (Amino Modifier C6; Glen Research) modified at the 5 ′ end of the sense strand RNA.
  • Double-stranded lipid-modified single-stranded RNA (sense strand) was synthesized in the same manner as in Example 1.
  • the HPLC result of the synthesized double-stranded lipid-modified sense strand RNA is shown in FIG.
  • the double-stranded lipid-modified sense strand RNA targeting the VEGF gene also had the same elution time as in Example 1.
  • the synthesized double-stranded lipid-modified sense strand RNA was formed into a double strand with the antisense strand RNA to obtain double-stranded lipid-modified RNA.
  • the formation of double strands of RNA was performed in the same manner as in Example 1, and was confirmed by 20% polyacrylamide gel electrophoresis (see FIG. 7).
  • si v21A / v21B was rapidly degraded in the medium containing serum, and the disappearance of the sample RNA was confirmed in about 1 to 2 hours.
  • double-stranded lipid-modified si v21A / v21B si DPPE-v21A / v21B
  • si DPPE-v21A / v21B showed much higher nuclease resistance than si v21A / v21B, and RNA survived even after 48 hours.
  • Unmodified Ds ⁇ v27A / v27B also showed higher nuclease resistance, but double-stranded lipid-modified Ds v27A / v27B (Ds DPPE-v27A / v27B) showed higher nuclease resistance. Furthermore, it was found that double-stranded lipid-modified RNA binds to serum proteins and improves the resistance of RNA to degrading enzymes.
  • the experiment was performed as follows. Before the experiment, 500 ⁇ l of HeLa cells and A549 cells adjusted to 1 ⁇ 10 5 cells / ml were spread on a 24-well plate and incubated overnight at 37 ° C. The next day, the old medium in the wells was removed and 450 ⁇ l each of fresh medium without antibiotics was added to the wells. Here, MEM medium was used for HeLa cells, and PRMI-1640 medium was used for other cells.
  • a complex of unmodified or double-stranded lipid-modified RNA (25 ⁇ l) containing an antisense sequence homologous to the genetic sequence of VEGF and Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) solution (25 ⁇ l) is formed, and 450 ⁇ l of 50 ⁇ l RNA solution is formed Of the above cells.
  • the final volume per well is 500 ⁇ l.
  • a complex solution of RNA and Lipofectamine TM 2000 was prepared by mixing 25 ⁇ l of RNA solution per well and 25 ⁇ l of Lipofectamine TM 2000 (2 ⁇ l) OptiMem solution and incubating at room temperature for 30 minutes. After introducing the RNA, it was incubated at 37 ° C.
  • RNA in the cells was extracted with RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen). Then, RT-PCR reaction was performed in order to measure the amount of mRNA of VEGF.
  • Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) was used for RT-PCR reaction, and 5'-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3 '(SEQ ID NO: 9) and 5'-ACC GCC were used as PCR primers for VEGF.
  • TCG GCT TGT CAC-3 ′ (SEQ ID NO: 10) was used.
  • RT-PCR reaction is RT (Reverse Transcripratase) reaction at 50 ° C for 30 minutes
  • PCR reaction is 92 ° C for 30 seconds double strand dissociation
  • 55 ° C for 30 seconds annealing reaction 55 ° C for 30 seconds annealing reaction
  • 68 ° C for 45 seconds extension reaction This was repeated 25 to 28 times (depending on the cells used), and finally incubated at 68 ° C. for 10 minutes, and the temperature was lowered to 4 ° C.
  • RNA including unmodified and double-stranded lipid modifications
  • GAPDH gene expression level
  • FIG. 10 shows the results of the RNA interference effect of unmodified RNA and double-stranded lipid-modified RNA when VEGF is the target and the RNA concentration is 50 nM.
  • a and B are HeLa cells
  • C and D are graphs showing the VEGF gene expression-suppressing effect of unmodified RNA and double-stranded lipid-modified RNA on A549 cells
  • a and C are 21-base double-stranded.
  • B and D are when 27-base double-stranded RNA is used.
  • RNA with DPPE or DMPE bound to it has higher gene expression suppression ability than unmodified RNA. Observed.
  • the 21-base and 27-base siRNAs and dsRNAs in which double-stranded lipids are covalently bonded to the 5 ′ end of the double-stranded sense strand RNA are converted into unmodified double-stranded RNAs. It was revealed that the gene expression suppression ability was higher than that. In particular, it was confirmed that the double-stranded RNA combined with DPPE had a very excellent ability to suppress gene expression. In addition, in the RNA to which DMPE or DOPE was bound, higher gene expression suppression ability was observed as compared with unmodified RNA.
  • RNA HeLa cells human cervical cancer cells, Institute of Aging Medicine, Tohoku University
  • A549 cells human lung cancer cells adjusted to 1x10 5 cell / ml before the experiment , Tohoku University aging medical Research Institute
  • the 24-well plates seeded 1ml each 10% fetal bovine serum (FBS: in media Sanko Junyaku included) and antibiotics, Ltd., 5% CO 2 presence at 37 ° C. Cultured.
  • the antibiotics and medium used here were MEM medium (Invitrogen) for HeLa cells and RPMI-1640 (Invitrogen) for other cells.
  • Fluorescence-labeled double-stranded lipid-modified RNA Prior to introduction of the fluorescence-labeled double-stranded lipid-modified RNA, the medium was replaced with an antibiotic-free medium (450 ⁇ l). Fluorescence-labeled double-stranded lipid-modified RNA uses 21nt and 27nt antisense strand RNAs that are 6-FAM labeled, and unmodified 21nt and 27nt sense strand RNAs and two 5'ends Double strands were formed with 21 nt and 27 nt sense strand RNA modified with chain lipids.
  • RNA and Lipofectamine TM 2000 Invitrogen, a cell transfer experiment was performed using 25 ⁇ l of a mixed solution of 10 ⁇ l of 10 ⁇ M fluorescently labeled oligonucleotide solution and 15 ⁇ l of OptiMem solution. 50 ⁇ l of a mixed solution of 2 ⁇ l of Lipofectamine TM 2000 (manufactured by Invitrogen) and 25 ⁇ l of a mixed solution of 23 ⁇ l of OptiMem solution was incubated at room temperature for 30 minutes.
  • the confocal fluorescence laser microscope used a Radiance 2000 system (Bio Rad), and observed fluorescence using an argon laser.
  • a coulter EPICS XL cytometer (Beckman coulter) was used to measure the cell transferability per 10,000 counts of cells.
  • XL EXPO32 TM software (Beckman coulter) was used.
  • FIG. A and B in FIG. 11-1 are the fluorescence-labeled 21 base length (si v21A / v21B) and 27 base length RNA ((si v21A / v21B and si v27A / v27B), and the 5 ′ end of the sense strand.
  • FIG. 11B shows the result of cell introduction into HaLa cells when double-stranded lipid-modified RNA is used as an introduction agent for Lipofectamine TM 2000.
  • si v21A / v21B and 27 base RNA ((si v21A / v21B and si v27A / v27B), and RNA with double-stranded lipid modification at the 5 'end of the sense strand, using Lipofectamine TM 2000 as an introduction agent It is a result of the cell transduction property to A549 cells.
  • RNA and double-stranded lipid-modified RNA were confirmed in the presence of Lipofectamine TM 2000.
  • a 27-base long RNA in which a double-stranded lipid was modified at the 5 ′ end of the sense strand was observed to have a much higher cell introduction property in confocal fluorescence microscopy and flow cytometry than unmodified RNA.
  • confocal fluorescence microscopy suggested that this double-stranded lipid-modified RNA was actively localized to the cytoplasm in the cell.
  • excellent cell transduction properties were observed in 27-base long double-stranded RNA to which DPPE or DMPE was bound as a double-stranded lipid.
  • a double-stranded lipid-modified RNA obtained by binding a double-stranded lipid to a 21-base long RNA was also confirmed to have a high cell introduction property in the presence of Lipofectamine TM 2000.
  • excellent cell transduction properties were confirmed for 21-base RNAs that were combined with DMPE as a double-stranded lipid.
  • Example 3 Synthesis of double-stranded lipid-modified RNA targeting the WT1 gene Using a technique different from those in Examples 1 and 2 above, the 5 ′ end of the sense strand RNA of a double-stranded RNA capable of suppressing the expression of the WT1 gene In addition, a double-stranded lipid-modified sense strand RNA was synthesized in which double-stranded lipids were bound.
  • sense strand RNA and antisense strand RNA were respectively synthesized according to known methods.
  • aminoalkylation of the 5 ′ end of the sense strand RNA was performed by a conventional method (phosphoramidite synthesis method) using 5′-Amino-Modifier C6 (Glen Research), and the 5 ′ end aminoalkyl modified sense was detected.
  • Strand RNA was synthesized. In the synthesized 5 ′ terminal aminoalkyl-modified sense strand RNA, — (CH 2 ) 6 —NH 2 is bonded to the phosphate residue of the first nucleotide from the 5 ′ terminal side through an oxygen atom.
  • the synthesized 5 ′ terminal aminoalkyl-modified sense strand RNA was allowed to form a double strand with the antisense strand RNA to obtain a double-stranded RNA (hereinafter referred to as aminoalkyl-modified double-stranded RNA).
  • formation of the double strand of RNA was performed by the method similar to the above.

Abstract

　本発明の目的は、ヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入率が高く、優れたRNA干渉効果を奏し得る新規な2本鎖RNAを提供することである。 　標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖RNAを有し、標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAにおいて、該センス鎖RNAの５’末端側から１～６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに直接又はリンカーを介して2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾RNAを提供する。

Description

RNA干渉効果が高い2本鎖脂質修飾RNA
　本発明は、標的遺伝子の発現を効率的に抑制できる2本鎖脂質修飾RNAに関する。より具体的には、ヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入率が高く、優れたRNA干渉効果を奏することができる2本鎖脂質修飾RNAに関する。更に、本発明は、該2本鎖脂質修飾RNAを利用した医薬組成物、及び標的遺伝子の発現抑制方法に関する。
　ガンやエイズなどの難病を効率的に治療する医薬の開発は、ライフサイエンス分野における大きな一つの課題である。この課題を克服できる可能性がある有力な方法の一つとして、特定の遺伝子にのみ作用する遺伝子医薬がある。この遺伝子医薬の中でも特に最近21塩基の短い2本鎖RNA (small interfering RNA：siRNA )を利用するRNA干渉(RNA interference：RNAi)法が注目されている。このRNAi法は、1998年にFireらにより初めて報告された（非特許文献１参照）。Fireらの報告によると、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同な100塩基対程度の2本鎖ＲＮＡを細胞内へ導入させることにより、細胞質内でDicerの働きにより20～25塩基対程度の2本鎖RNAへと分解され、その後複数のタンパク質とRNA/タンパク質複合体を形成し（この複合体をRICS:RNA-induced silencing complexと呼ぶ）、標的遺伝子から産出されたmRNAの相同部位と結合し強力に遺伝子発現を抑制するというものである。しかしながら、哺乳細胞では、約30塩基対以上の長い2本鎖RNAを導入させると、ウィルス応答反応であるインターフェロン反応が誘導され結果的に細胞が死んでしまうという現象が報告され、哺乳動物細胞系ではRNAi法は適用し難いと考えられた。そこでTuschlらは、2本鎖RNAの両3’末端にダングリングエンドをもつ21塩基長の2本鎖RNAを化学的に合成し、哺乳動物細胞へ直接導入させることにより、インターフェロン応答を回避し配列特異的に高い遺伝子発現抑制能を示すことを報告した（非特許文献２参照）。また彼らは、2本鎖領域が19塩基対で、3’末端又は5’末端に様々な長さのダングリングエンド鎖をもつ短い2本鎖RNAを合成しRNA干渉効果を検討した。その結果、両3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ21塩基長のsiRNAは非常に高いRNA干渉効果が観測されたが、それ以外のあらゆるタイプの短い2 本鎖RNAにおいては顕著なRNA干渉効果が観測されなかった。この報告により、今日では21塩基長であり、両3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ2本鎖RNAを用いたRNA干渉法が一般的となっている。ここでは21塩基長の短い2本鎖RNAを用いて標的遺伝子発現を阻害する方法を、RNAi法と区別してsiRNA法と呼ぶ。
　このsiRNA法は合成RNAを用いるのでサンプル調整も比較的容易であり、取り扱い操作も簡便で、かつ、非常に強力な効果を示す為、ライフサイエンス分野のみならずバイオビジネス分野においても大きな注目を浴びている。
　しかしながら、この優れたsiRNA法にも解決しなければならない問題点がある。上記したようにsiRNAはRNA分子から構成されており、細胞内および培地中に含まれるヌクレアーゼの働きにより速やかに分解される。また2本鎖RNA領域は1本鎖RNAに比べ比較的高いヌクレアーゼ耐性を示すが、19塩基対からなる2本鎖RNAは殆ど従来のRNA干渉効果を示さない。そのため合成siRNAは、標的遺伝子配列をもつ細胞への導入後、2日～4日間程度までは高い遺伝子発現抑制効果を示すが、その後はRNA干渉効果が急激に弱まり、7日程度でRNA干渉効果が殆ど無くなると報告されている。
　最近、合成siRNAにおいて細胞導入性に優れ長時間高活性なRNA干渉効果を獲得するために、様々な化学修飾型siRNAが報告されている。例えば、エキソヌクレアーゼからの分解耐性を獲得する為に、siRNAの末端をアミノ基やチオール基、アベーシックなどに修飾したsiRNAが合成されている。しかしながら、末端を修飾した21塩基長のsiRNAのほとんどの場合で、RNA干渉効果が著しく減少すると既に報告されている。
　一方、近年、J. Rossiらの報告により、27塩基対からなる2本鎖RNAが21塩基長からなるsiRNAに比べ100倍程度高いRNA干渉効果を示すことが明らかとなった（非特許文献３参照）。これは、27塩基対からなるRNAがRNase III様の酵素であるDicerによって21塩基長のsiRNAに切断された後、タンパク複合体であるRISCにそのまま認識され、高効率にsiRNA効果を発揮できる為だと考えられている。
　このように、27塩基長のRNAは、優れたRNA干渉効果を奏し得るため、今後、遺伝子医薬としての応用が益々期待されている。しかしながら、27塩基長のRNAによるRNA干渉効果をより増強させるためには、どのような技術的手段が有効であるかについては一切分かっていない。更に、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAに関して、27塩基長のRNAのみならず、他の塩基長のRNAについても、RNA干渉効果を高めるための技術的手段については明らかにされていない。
　また、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAでは、末端にダングリングエンドを有する構造が一般的に採用されているが、末端にダングリングエンドを有していない構造（即ち、平滑末端を有する構造）についても、RNA干渉効果の検討が行われている。しかしながら、センス鎖RNAの５’末端側を平滑末端にした構造では、センス鎖RNAの５’末端側にダングリングエンドがある場合に比して、RNA干渉効果が殆ど変わらない、或いはRNA干渉効果が低減することが示唆されている（非特許文献４参照）。
　一方、脂質は、細胞膜に対する親和性および透過性が高く、細胞内に薬物を送達するのに有用であることが分かっている。このような脂質を、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAに結合させることによって、細胞内導入率を高めて、RNA干渉効果をより一層有効に奏させることが期待される。しかしながら、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAに、単に脂質を結合させると、RNA干渉効果の顕著な減弱化を招くことが分かっており、従来技術では、優れたRNA干渉効果と脂質に基づく有用効果とを兼ね備えた脂質修飾RNAを構築できていないのが現状である。
Fire et. al, Nature, 391, 806-811 (1998) Tuschl et. al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001) J. Rossi et. al. Nature Biotech., 23, 222-226 (2005) J. T. Marques et. al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2006)
　本発明は、ヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入率が高く、且つ優れたRNA干渉効果を奏し得る新規な二本鎖RNAを提供することを目的とする。更に、本発明は、該新規な2本鎖RNAを利用した医薬組成物、及び標的遺伝子の発現抑制方法を提供することを目的とする。
　本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖RNAを有し、標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAにおいて、該センス鎖RNAの５’末端側から１～６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに直接又はリンカーを介して２本鎖の脂質を結合させることによって、ヌクレアーゼ耐性、細胞内導入率、及びRNA干渉効果を格段に向上させたRNAを構築できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる2本鎖脂質修飾RNA、医薬組成物、使用、及び標的遺伝子の発現抑制方法を提供する。
項１．　標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAであって、該センス鎖RNAの５’末端から１～６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに直接又はリンカーを介して2本鎖脂質が結合していることを特徴とする、2本鎖脂質修飾RNA。
項２．　前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、且つ前記センス鎖RNAの３’末端側が平滑末端又はダングリングエンドを有している、項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項３．　前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共にダングリングエンドを有している、項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項４．　前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数が２１～２７である、項１乃至３のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項５．　前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２７個のヌクレオチドから構成されている、項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項６．　前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２３個のヌクレオチドから構成されている、項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項７．　前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、前記センス鎖RNAが２５個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されている、項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項８．　前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２１個のヌクレオチドから構成されている、項３に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項９．　前記2本鎖脂質を構成する２つの疎水基が、同一又は異なって、炭素数6～50の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基である、項１乃至８のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１０．　前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、ジアシルグリセロール、又はセラミドである、項１乃至９のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１１．　前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質である、項１乃至９のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１２．　前記2本鎖脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、項１１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１３．　前記2本鎖脂質が、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１４．　前記センス鎖RNAの５’末端から１～６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに、下記一般式（L-27）で表される構造のリンカーを介して脂質が結合している、項１乃至１３のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［式中、n3及びn4は、同一又は異なって、１～20の整数を示す。］
項１５．　項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAと、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
項１６．　標的遺伝子の発現を抑制するための医薬を製造するための、項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAの使用。
項１７．　項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、センス鎖RNAの5’末端側が2本鎖脂質で修飾されており、これによって飛躍的にRNA干渉効果が向上している。特に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、特定の部位に対して2本鎖脂質が結合することにより、DicerによるプロセシングやRISCとの複合体形成能を妨げることなく、しかもヌクレアーゼ耐性及びRNA干渉効果が格段顕著に向上しているので、医薬用途への応用に大きく貢献できる。
　更に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、単独でも格段に優れた細胞内移行能を示すので、従来の遺伝子導入試薬を別途用いずに、或いは従来の遺伝子導入試薬の使用量を低減して、細胞内に導入することも可能である。故に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、従来の遺伝子導入試薬の使用によって懸念される細胞毒性の発現を抑制でき、臨床的な応用において高い安全性が確保できる。
　このため、本発明の2本鎖脂質修飾RNAを利用した医薬組成物又は標的遺伝子の発現抑制方法によれば、より効果的に標的遺伝子の発現を抑制又は阻害することが臨床上可能になる。
実施例１において、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAをＨＰＬＣ解析した結果を示す図である。 実施例１において、2本鎖脂質修飾RNAの２本鎖RNAの形成を確認した結果を示す図である。図２のＡ中、(1)は21nt siRNA、(2)はDPPE L21A/L21BのRNA、(3)はPOPE L21A/L21BのRNA、(4)はDOPE L21A/L21BのRNA、(5)はDMPE L21A/L21BのRNAの結果を示す。図２のＢ中、(1)は27nt dsRNA、(2)はDPPE L27A/L27BのRNA、(3)はPOPE L27A/L27BのRNA、(4)はDOPE L27A/L27BのRNA、(5)はDMPE L27A/L27BのRNAの結果を示す。 実施例１において、2本鎖脂質修飾RNAのヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。 実施例１において、2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。 実施例１において、2 nM濃度のときの2本鎖脂質修飾27nt dsRNAのRNA干渉効果の結果を示す図である。 実施例２において、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAのＨＰＬＣ解析結果を示す図である。 実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAの２本鎖形成を確認した結果を示す図である。図７のＡ中、A-1の(1)は21nt siRNA、(2)はDPPE v21A/v21BのRNAの結果を示し、A-2の(1)は21nt siRNA、(2)はPOPE v27A/v27BのRNA、(3)はDOPE v27A/v27BのRNA、(4)はDMPE v27A/v27BのRNAの結果を示す。図７のＢ中、(1)は27nt dsRNA、(2)はDPPE v27A/v27BのRNA、(3)はPOPE v27A/v27BのRNA、(4)はDOPE v27A/v27BのRNA、(5)はDMPE v27A/v27BのRNAの結果を示す。 実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。 実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。 実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのHeLa, A549細胞中VEGF遺伝子に対するRNA干渉効果の結果を示す図である。 実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのHeLa細胞中VEGF遺伝子に対する細胞導入性の結果を示す図である。図中、FLには蛍光顕微鏡にて撮影した像、transは、上記FLと同一視野を位相差顕微鏡にて撮影した像、mergeは上記FLとtransを重ね合わせた像を示す。 実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのA549細胞中VEGF遺伝子に対する細胞導入性の結果を示す図である。図中、FLには蛍光顕微鏡にて撮影した像、transは、上記FLと同一視野を位相差顕微鏡にて撮影した像、mergeは上記FLとtransを重ね合わせた像を示す。 実施例３において、2本鎖脂質修飾RNAをＨＰＬＣ解析した結果を示す図である。 実施例３において、2本鎖脂質修飾RNAの合成を確認した結果を示す図である。
　本明細書において、「平滑末端」とは、2本鎖RNAの末端部分において、センス鎖の末端領域とそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域が、1本鎖部分を形成することなく（即ち、突出部を形成することなく）対合している構造のことである。また、「ダングリングエンド」とは、オーバーハングとも称される構造を指し、2本鎖RNAの末端部分のセンス鎖の末端領域又はそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域において、対合する塩基が存在しないために2本鎖を形成できず、一本鎖が存在している塩基配列部分（突出部）を意味する。また、本明細書において、「2本鎖脂質修飾RNA」とは、２本鎖脂質が結合している2本鎖（ダブルストランド）のRNA分子を指す。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列であるセンス鎖RNAを含む。
　ここで、標的遺伝子とは、RNA干渉効果によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子である。本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、標的対象遺伝子については、特に制限されず、該2本鎖脂質修飾RNAの用途に基づいて適宜選択することができる。
　標的遺伝子中の標的配列については、RNA干渉効果によって遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知の方法で、具体的には、NCBIのBLASTサーチ等を用いて適宜決定することができる。例えば、標的遺伝子のコード領域(ORF)の開始コドンから５０～１００塩基下流のエキソン部分にある塩基"AA"に続く１９～３０塩基からなる領域であって、GC含有量が50%前後の領域を標的配列とすればよい。このような標的配列に対する相補鎖を採用することで、優れたRNA干渉効果を獲得することが、当業界で経験的に明らかにされている。また、例えば、上記標的配列は、IDT社（Integrated DNA Technologies, INC）のマニュアル（Dicer Substrate RNAi Design）に従って設定することが出来る。また最近では、（i）アンチセンス鎖RNAの5’末端がA/Uペアであり、（ii）センス鎖RNAの5’末端がG/Cペアであり、（iii）アンチセンス鎖RNAの5’末端側に5つ程度のA/Uペアがあり、且つ（vi）2本鎖中に9つ以上のG/Cペアが無い2本鎖RNAを設計することで高いRNA干渉効果をもつ2本鎖RNAをデザインできると報告されている（Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)）。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、センス鎖にダングリングエンドが存在しない場合、該センス鎖は標的配列に相補的な塩基配列からなるものである。また、ダングリングエンドがセンス鎖の5'末端及び／又は3'末端に存在している場合、該センス鎖は、標的配列に相補的な塩基配列の5'末端及び／又は3'末端に、ダングリングエンドを構成する塩基配列が連結した塩基配列からなるものである。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数についてはRNA干渉効果を奏し得る限り特に制限されず、該2本鎖脂質修飾RNAに備えさせる構造等に応じて適宜設定されるが、通常２１～２７個、好ましくは２１、２３、２５、又は２７個、更に好ましくは２１又は２７個が挙げられる。なお、ここでいうセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数とは、該センス鎖にダングリングエンドが存在していない場合には標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの総数を意味し、該センス鎖にダングリングエンドが存在している場合には該ダングリングエンドを構成するヌクレオチドの数と標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数の総和を意味する。
　また、2本鎖脂質修飾RNAは、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有する。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、アンチセンス鎖にダングリングエンドが存在しない場合、該アンチセンス鎖は、前記センス鎖の「標的配列に相補的な塩基配列」の一部又は全部に対して相補的である塩基配列からなるものである。また、ダングリングエンドがアンチセンス鎖の5'末端及び／又は3'末端に存在している場合、該アンチセンス鎖は、前記センス鎖の「標的配列に相補的な塩基配列」の一部又は全部に対して相補的である塩基配列の5'末端及び／又は3'末端に、ダングリングエンドを構成する塩基配列が連結した塩基配列からなるものである。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記アンチセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数についてはRNA干渉効果を奏し得る限り特に制限されず、該2本鎖RNAに備えさせる2本鎖RNA構造等に応じて適宜設定されるが、通常２１～２７個、好ましくは２１、２３、２５、又は２７個、更に好ましくは２１、２３、又は２７個が挙げられる。なお、ここでいうアンチセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数とは、該アンチセンス鎖にダングリングエンドが存在していない場合には標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの総数を意味し、該アンチセンス鎖にダングリングエンドが存在している場合には該ダングリングエンドを構成するヌクレオチドの数と標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数の総和を意味する。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記センス鎖RNAと前記アンチセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドは、基本的にはリボヌクレオチドであるが、分解酵素耐性の向上を目的として2’－O－メチル修飾型や2’－F修飾型、LNA（Locked Nucleic Acid）等の各種化学修飾型ヌクレオチド、或いはデオキシリボヌクレオチド等をRNA配列中に含んでいてもよい。特に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAがダングリングエンドを有する構造の場合には、前記センス鎖RNA及び／又は前記アンチセンス鎖RNAにおける当該ダングリングエンドの構成部分は、デオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよい。このような化学修飾型ヌクレオチドとしては、具体的には、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型DNA/RNA等のリン酸骨格を修飾したもの；2’－0Me修飾RNA、2’－F修飾RNA等の2’修飾ヌクレオチド；LNA（Locked Nucleic Acid）やENA（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；PNA（ペプチド核酸）、モリフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオチド；５－フルオロウリジンや５－プロピルウリジンなどといった塩基修飾型ヌクレオチド等が例示される。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記センス鎖RNAと前記アンチセンス鎖RNAがハイブリダイズして2本鎖を形成している限り、その構造については特に制限されないが、好ましい構造として、(A)前記センス鎖RNAの5'末端側が平滑末端（ブランドエンド）であり、且つ前記センス鎖RNAの3'末端側が平滑末端又はダングリングエンド（一本鎖領域、突出部）を有している構造、並びに(B)前記センス鎖RNAの5'末端側及び3'末端側の双方にダングリングエンドを有している構造が例示される。このように、上記(A)又は(B)の構造をとることによって、2本鎖脂質で修飾していながらも、RNA干渉効果の減弱化を招くことなく、細胞内導入効率を一層顕著に向上させることが可能になる。ここで、センス鎖RNAの3'末端側にダングリングエンドを有する構造には、センス鎖RNAの3'末端領域がダングリングエンドを構成している場合と、アンチセンス鎖RNAの5'末端領域がダングリングエンドを構成している場合の双方の場合が含まれる。また、センス鎖RNAの5'末端側にダングリングエンドを有する構造には、センス鎖RNAの5'末端領域がダングリングエンドを構成している場合と、アンチセンス鎖RNAの3'末端領域がダングリングエンドを構成していている場合の双方の場合が含まれる。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAを構成する2本鎖RNAの内、特に優れたRNA干渉効果を発現させるという観点から、特に好ましい構造として、上記(A)の構造に含まれるものとして以下の(A-1)～(A-3)の構造が例示され、上記(B)の構造に含まれるものとして以下の(B-1)の構造が例示される：（A-1）前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、該センス鎖RNA及び該アンチセンス鎖RNAがそれぞれ２７個のヌクレオチドから構成されている構造；(A-2)前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、該センス鎖RNA及び該アンチセンス鎖RNAがそれぞれ２３個のヌクレオチドから構成されている構造；(A-3)前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、該センス鎖RNAが２５個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが２３個のヌクレオチドから構成されている構造；(B-1)前記センス鎖RNAの3'末端及び前記アンチセンス鎖RNAの3'末端の双方に２個のヌクレオチドからなるダングリングエンドがそれぞれ形成されており、該センス鎖RNA及び該アンチセンス鎖がそれぞれ２１個のヌクレオチドから構成されている構造。
　即ち、上記(A-1)及び(A-2)の構造は、センス鎖RNAとアンチセンス鎖RNAが、両末端にダングリングエンドを形成させることなく、ハイブリダイズしている構造である。また、上記(A-3)の構造は、センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、且つセンス鎖RNAの3’末端から１～２番目のヌクレオチドがダングリングエンドを形成するように、センス鎖RNAとアンチセンス鎖RNAがハイブリダイズしている構造である。また、上記(B-1)の構造は、センス鎖の5'末端から１～１９番目のヌクレオチドとアンチセンス鎖RNAの3'末端から３～２１番目のヌクレオチドがハイブチダイズしており、センス鎖RNAの3'末端から１～２番目のヌクレオチドとアンチセンス鎖RNAの3'末端から１～２番目のヌクレオチドがぞれぞれダングリングエンドを形成している構造である。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、上記センス鎖RNAの5'末端側から１～６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに脂質が結合している。本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、上記センス鎖RNAの5'末端側以外の部位には、他の置換基は結合していない。即ち、上記センス鎖RNAの5'末端側以外の部分、及びアンチセンス鎖RNA部分は他の置換基によって置換されておらず、ヌクレオチドのみから構成される。このように、上記センス鎖RNAの5'末端側にのみ2本鎖脂質が結合していることによって、細胞内導入率を高め、且つ格段に優れたRNA干渉効果を発現させることが可能になる。即ち、本発明の2本鎖脂質修飾RNAでは、2本鎖RNAの構造、修飾する脂質として2本鎖脂質を選択すること、及び該2本鎖脂質の結合部位等の構造上の特徴が一体不可分の関係となって、高い細胞内導入率を備えさせつつ、ヌクレアーゼ耐性を備え、更には格段に優れたRNA干渉効果をも奏させることが可能になっている。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、上記センス鎖RNAに結合している2本鎖脂質としては、２つの疎水基を有する脂質である限り、特に制限されないが、一例として、炭素数6～50の飽和脂肪酸残基及び不飽和脂肪酸残基よりなる群から選択される少なくとも２つの疎水基を有する脂質が例示される。上記飽和脂肪酸残基及び不飽和脂肪酸残基の炭素数として、好ましくは8～30、更に好ましくは10～24が例示される。より具体的には、脂質を構成する疎水基として、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ガドレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の脂肪酸の残基が例示される。前記する本発明の効果を一層顕著に奏させるという観点から、本発明に使用される2本鎖脂質の２つの疎水基は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びオレイン酸よりなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸の残基であることが望ましい。
　本発明に使用される2本鎖脂質の具体例として、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、ジアシルグリセロール、セラミド等が例示される。これらの中でも、ヌクレアーゼ耐性、細胞内導入率、及びRNA干渉効果を一層向上させるという観点から、好ましくはグリセロリン脂質が挙げられる。
　本発明に使用されるグリセロリン脂質としては、特に制限されず、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を任意に使用できる。
　本発明に使用されるリン脂質の具体例として、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレイルホスファチジルグリセロール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルグリセロール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルグリセロール、ジエルコイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレイルホスファチジルセリン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルセリン、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルセリン、ジエルコイルホスファチジルセリン等のホスファチジルセリン；ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレイルホスファチジン酸、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジン酸、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジン酸、ジエルコイルホスファチジン酸等のホスファチジン酸；ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレイルホスファチジルイノシトール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルイノシトール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルイノシトール、ジエルコイルホスファチジルイノシトール等のホスファチジルイノシトールが例示される。これらの中でも、ヌクレアーゼ耐性、細胞内導入率、及びRNA干渉効果をより一層顕著ならしめるという観点から、好ましくは、ホスファチジルエタノールアミン、更に好ましくは、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、上記2本鎖脂質と上記センス鎖の結合様式については特に制限されず、これらが直接結合していてもよく、またこれらがリンカー（連結領域）を介して結合していてもよい。但し、本発明において、上記2本鎖脂質と上記センス鎖とを連結するリンカーには、核酸から構成されるものは含まれない。
　ここで、リンカーとしては、上記脂質と上記センス鎖とを連結可能な限り、特に制限されないが、具体的には、上記リンカーとして、下記の構造のものが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ここで、前記一般式(L-4)～（L-21）において、ｎ１は、１～40の整数、好ましくは2～20の整数、更に好ましくは2～12の整数を示す。
　また、前記一般式（L-22）～(L-24)において、ｎ２は、１～20の整数、好ましくは１～10の整数、更に好ましくは1～6の整数を示す。
　また、前記一般式（L-25）～(L-27)において、ｎ３及びｎ４は、同一又は異なって、１～20の整数、好ましくは１～10の整数、更に好ましくは1～6の整数を示す。
　前記一般式(L-1)～（L-27）に示すリンカーは、その右側又は左側のいずれに１本鎖DNAが結合していてもよい。好ましくは、左側に2本鎖脂質が結合しており、右側に前記２本鎖RNAのセンス鎖RNA5’末端領域が結合するように構成されているものである。
　また、上記2本鎖脂質に対する上記リンカーの結合部位については、2本鎖脂質の種類やリンカーの種類に応じて適宜設定されるが、2本鎖脂質の疎水基以外の部位が上記リンカーと化学的に結合することによって連結されていればよい。例えば、ホスファチジルエタノールアミンを使用する場合であれば、そのアミノ基が、上記リンカーとアミド結合等を形成することによって連結されていればよい。また、ホスファチジルグリセロールを使用する場合であれば、そのグリセロール残基中の水酸基が、上記リンカーとエステル結合又はエーテル結合等を形成することによって連結されていればよい。また、ホスファチジルセリンを使用する場合であれば、そのセリン残基中のアミノ基又はカルボキシル基が、上記リンカーとアミド結合又はエステル結合等を形成することによって連結されていればよい。更に、ホスファチジン酸を使用する場合であれば、そのリン酸残基が、上記リンカーとリン酸エステル結合等を形成することによって連結されていればよい。そして更に、ホスファチジルイノシトールを使用する場合であれば、そのイノシトール残基中の水酸基が、上記リンカーとエステル結合又はエーテル結合等を形成することによって連結されていればよい。
　上記リンカーは、連結させる脂質の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、２本鎖脂質として、アミノ基を有するリン脂質（即ち、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等）又は水酸基を有するリン脂質（即ち、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール等）を使用する場合であれば、上記リンカーとして、一般式(L-6)、(L-7)、(L-9)、(L-10)、(L-18)、(L-26)、及び(L-27)のリンカーが好適である。
　また、上記リンカー以外にも、例えば、N-スクシニミジル＝3-(2-ピリジルジチオ)プロピナート、N-4-マレイミド酪酸、S-(2-ピリジルジチオ)システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N-[5-(3’-マレイミドプロピルアミド)－１－カルボキシペンチル]イミノジアセティクアシッド、N-(5-アミノペンチル)-イミノジアセテックアシッド等の二官能性リンカー（官能基を２つ含むリンカー）を使用することもできる。
　上記センス鎖RNAにおいて、２本鎖脂質又は２本鎖脂質を連結するリンカーの結合対象となるヌクレオチドは、上記センス鎖RNAの5'末端側から１～６番目のヌクレオチドであれば特に制限されないが、好ましくは5'末端側から１～４番目のヌクレオチド、更に好ましくは5'末端側から１及び/又は２番目のヌクレオチド、特に好ましくは5'末端（5'末端側から１番目）のヌクレオチドである。
　また、上記センス鎖RNAにおける、2本鎖脂質又は2本鎖脂質を連結するリンカーの結合部位については、特に限定されるものではないが、2本鎖脂質又は2本鎖脂質を連結したリンカーが、上記センス鎖RNAの所定のヌクレオチドのリン酸部分の水酸基を構成する水素原子と置換されて結合していることが好ましい。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAに結合されている2本鎖脂質の数としては、特に制限されないが、例えば１～３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が例示される。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、2本鎖脂質が連結された上記センス鎖RNA、及び上記アンチセンス鎖RNAをそれぞれ合成し、これらのセンス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAを公知の方法に従ってハイブリダイズさせることにより、製造される。なお、2本鎖脂質が連結された上記センス鎖RNAについても、公知の合成技術を用いて製造することができる。
　更に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、上記センス鎖RNA及び上記アンチセンス鎖RNAを公知の方法に従って合成して、これらをハイブリダイズさせて2本鎖RNAを作成した後に、この2本鎖RNAのセンス鎖RNAの５’末端に2本鎖脂質公知の合成技術を用いて2本鎖脂質を連結させることによっても、製造することができる。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、細胞内に導入されることにより、標的遺伝子の発現を抑制又は阻害することができるので、標的遺伝子の発現抑制を目的とした医薬又は遺伝子治療用の医薬として、或いは標的遺伝子の発現抑制効果を評価するための実験材料として使用できる。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAが導入される対象となる細胞については、ヒト、非ヒト哺乳動物、鳥類、昆虫等のいずれに由来するものであってもよいが、好ましくは、ヒト及び非ヒト哺乳動物由来のものが挙げられる。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAの細胞内への導入方法については、従来siRNAの場合と同様であり、該2本鎖脂質修飾RNAの有効量を導入対象となる細胞に接触させればよい。本発明の2本鎖脂質修飾RNAの細胞内への導入は、in vivo、in vitro及びex vivoのいずれで実施してもよい。
　例えば、本発明の2本鎖脂質修飾RNAをin vitroで細胞内に導入させる場合、該細胞の培養時にあらかじめ適当量の該2本鎖脂質修飾RNAを存在させた状態で細胞を培養する方法が例示される。また、培養細胞、生体から取り出した細胞、生体から取り出した組織に対して、本発明の2本鎖脂質修飾RNAをin vitro又はex vivoで導入させる場合には、該2本鎖脂質修飾RNAの存在下で、培養細胞、生体から取り出した細胞、又は生体から取り出した組織をインキュベートすればよい。更に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAをin vivoで細胞内に導入させる場合には、組織への直接注入；静脈、皮下、筋肉、腹腔、眼内、消化器官内、歯内等への注射；鼻腔、口腔、肺等への吸入投与；経口投与；皮膚を介した経皮投与；及び口腔粘膜、膣粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜を介した経粘膜投与等により、本発明の2本鎖脂質修飾RNAを投与すればよい。
　また、本発明の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する場合、導入対象となる細胞に対する該2本鎖脂質修飾RNAの適用量については、細胞内に導入するための有効な量であればよいが、具体的には、細胞１個当たり、該2本鎖脂質修飾RNAの適用量が0.001～10pmol（ピコモル）、好ましくは0.001～1pmol、更に好ましくは0.01～0.1pmolとなる範囲が例示される。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、単独でも優れた細胞内移行能を示すので、siRNAの細胞内への導入に使用されている従来の遺伝子導入試薬を用いずに、或いは従来の遺伝子導入試薬の使用量を低減して、細胞内に導入することも可能である。
　本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、細胞内に導入されることによって、標的遺伝子の発現を抑制又は阻害することができるので、該2本鎖脂質修飾RNAは、例えば、医薬の分野において、該標的遺伝子の発現に起因する疾患を予防、軽減又は治療するために使用することができる。本発明の2本鎖脂質修飾RNAを医薬分野で使用する場合、該2本鎖脂質修飾RNAは、薬学的に許容される担体と共に配合され、医薬組成物として提供される。
　該医薬組成物に使用される薬学的に許容される担体としては、医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、精製水、糖水溶液、緩衝液、生理食塩水、高分子水溶液、RNase free水等の水性担体、賦形剤等が挙げられる。
　該医薬組成物における2本鎖脂質修飾RNAの配合割合については、前述する該2本鎖脂質修飾RNAの適用量を充足できるように適宜設定すればよいが、例えば、該医薬組成物の総量当たり、該2本鎖脂質修飾RNAが0.001～50重量％、好ましくは0.01～10重量％、更に好ましくは0.1～１重量％となる割合が例示される。
　また、該医薬組成物の製剤形態については、2本鎖脂質修飾RNAが細胞内に導入可能であることを限度として特に制限されるものではないが、例えば、液剤（シロップ等を含む）、点滴剤、注射剤等の液状製剤；凍結乾燥製剤、ドライシロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）等の固形状製剤が挙げられる。また、本発明の医薬組成物が固形製剤である場合は、使用時に注射用蒸留水、滅菌水等を加え、再度溶解して使用してもよい。
　また、該医薬組成物が適用される疾患又は症状は、標的遺伝子の発現が関与しているものである限り、特に制限されるものではない。標的遺伝子と疾患の関係については当該技術分野において公知である。
　また、該医薬組成物は、ヒトの治療を目的として、ヒト由来細胞に対して使用してもよく、また、ヒト以外の動物（特に、ヒト以外の哺乳動物）の治療目的で使用してもよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　実施例１　5’2本鎖脂質修飾RNAのルシフェラーゼ遺伝子発現阻害効果
１．ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
１－１．センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの配列
　ウミシイタケルシフェラーゼと相同配列を持ち、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子発現を抑制できる21及び27塩基長のセンス鎖RNAと21及び27塩基長のアンチセンス鎖RNAの2本鎖RNAをデザインした。該2本鎖RNAは21塩基長のアンチセンス鎖とセンス鎖を用いた場合は3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ21塩基長の2本鎖RNAを、27塩基長のアンチセンス鎖とセンス鎖を用いた場合は両末端が平滑末端である27塩基長の2本鎖をそれぞれ形成できる。使用したRNAの配列は、以下の通りである。
27nt dsRNA　センス鎖　　　L27A：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’（配列番号１）
　　　　　 アンチセンス鎖 L27B：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5’（配列番号２）
21nt siRNA　センス鎖　　　 L21A：5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’（配列番号３）
　　　　　　アンチセンス鎖 L21B：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG－5’（配列番号４）
　これら上記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖を用いて2本鎖RNAを作成した。2本鎖RNAの作成は、universal buffer（林化成株式会社）中、同モルのセンス鎖およびアンチセンス鎖１本鎖RNAを混合し、92℃で２分間加熱した後、4℃まで徐々に温度を下げることで作成した。合成した各種2本鎖RNAは、20％ ポリアクリルアミドゲルを用い、250Vの条件化で60分間電気泳動し、その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で2本鎖RNAを染色することにより確認した。
　該2本鎖RNAにおいて、3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ21塩基長の2本鎖RNAをsi L21A/L21B、平滑末端である27塩基長の2本鎖RNAをDs L27A/L27Bとした。
　１－２．ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
　ルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAのセンス鎖の5’末端に、2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。当該2本鎖脂質修飾センス鎖RNAにおいて、2本鎖脂質は、上記センス鎖RNAの5’末端に連結されているアミノアルキル基（Amino Modifier C6; Glen Research）を介して共有結合で結合している。2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは、活性エステル基もつ脂質化合物（以下、活性エステル化脂質化合物と表記する）と5’末端をアミノ化修飾したセンス鎖RNAとを液相中で反応させることで合成した（下記反応式１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
R1及びR2は、同一又は異なって脂肪酸残基を示す。
　具体的な合成法を以下に示す。RNAの5’末端をアミノ化するために、RNA固相合成上で5’-Amino-Modifier C6 (Glen Research)を用いて通常の方法(ホスホロアミダイト合成法)により5’末端アミノアルキル基修飾センス鎖RNAを合成した。なお、上記5’末端アミノアルキル基センス鎖RNAはHPLC精製、MALDI-TOF MS解析済みのものを林化成株式会社より購入した。合成された5’末端アミノアルキル基センス鎖RNAは、該末端（５’末端側から１番目のヌクレオチドのリン酸残基）に－(CH2)6－NH2が結合されている。合成した1本鎖RNAは、UVスペクトル検出器を用い、260nmの吸光度を測定することにより濃度を算出した。このアミノアルキル基修飾１本鎖RNAと、クロロホルムに溶解した活性エステル化2本鎖脂質誘導体［DPPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dipalmitoyl), POPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2oleoyl), DOPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dioleoyl), DMPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dimyristoyl)； (日本油脂社製)］と、縮合反応条件下で混合して、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。反応後、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAが含まれる反応液中の不要な試薬を取り除くため、反応液をＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ精製は、緩衝液としてＡ：100% 20mM TEAA(pH 7.0), Ｂ：80% CH3CN/20mM TEAA (pH 7.0)を用い、10％ Ｂ緩衝液から100％ Ｂ緩衝液を50分のリニアーグラジェントになるよう設定し精製を行った。また、精製用カラムはCAP CELL (4.6 x 150 mm, 5μｍ；SHISEIDO)を使用した。HPLC解析結果の一例を図１に示す。ＨＰＬＣにおいて精製された2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは凍結乾燥し、精製水に溶解させた後、ＵＶスペクトル解析により濃度及び合成収率を算出した。
　以下に、合成した2本鎖脂質修飾センス鎖RNAの構造及び収率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　合成した2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは、アンチセンスRNAと2本鎖を形成させ、2本鎖脂質修飾RNAを得た。RNAの２本鎖の形成は、上記と同様の方法で行い、20％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（図２参照）。
　２．2本鎖脂質修飾RNAの分解酵素耐性
　2本鎖脂質修飾si L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、最終濃度が2 μMになるよう調整したセンス鎖5’-末端2本鎖脂質修飾RNA(si L21A/L21B及びDs L27A/L27B)を10％FBS（三光純薬株式会社）を含むRPMI-1640培地（インビトロジェン）中 (最終量110μl)、37℃でインキュベートし、0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h後にそれぞれ10μl取り、2μlのローディングダイを含むサンプルチューブに添加した。分解反応を停止させる為、サンプル採取後すばやく液体窒素中にて凍結し、－20℃にて保存した。得られた産物を20％ ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。また比較として未修飾のsi L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性結果も同様に評価した。ゲル電気泳動の結果を図３に示す。
　その結果、未修飾のsi L21A/L21Bは血清を含む培地中において速やかに分解されており、１～２時間程度でサンプルRNAの消失が確認された。一方、2本鎖脂質修飾si L21A/L21B(si DPPE-L21A/L21B)は、si L21A/L21Bに比べ非常に高いヌクレアーゼ耐性を示し、48時間後においてもRNAは生存していた。また、未修飾のDs L27A/L27Bも高いヌクレアーゼ耐性を示したが、2本鎖脂質修飾Ds L27A/L27B (Ds DPPE-L27A/L27B)の方がより高いヌクレアーゼ耐性を示した。さらに、2本鎖脂質修飾RNAは血清中タンパク質と結合し、RNAの分解酵素耐性を向上させている知見も得られた。
　これらの結果から、2本鎖脂質修飾RNAは一般に広く使用されている21siRNAに比べ格段に高い生体内安定性を保有しているという新たな知見が得られた。
　３．ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシング
　合成したRNA及び2本鎖脂質修飾RNAのリコンビナントDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、20mM Tris-HCl(pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5mM Mg2Cl溶液中、0.5 UのリコンビナントDicer（Gene Therapy Systems）と最終濃度2 μMになるよう調整した未修飾RNAおよび2本鎖脂質修飾RNAをサンプルチューブに10μl準備し、37℃に設定したインキュベーター中、12時間インキュベートした。その後、Dicerによる切断反応を停止させる為に、2μlのDicer Stop Solution (Gene Therapy Systems)を反応溶液に加え、更に2μlのローディングダイを加えた。得られた産物を20％ ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。また、コントロールとして未修飾の21siRNもゲル電気泳動にて解析した。その結果を図４に示す。
　得られた結果から、未修飾のDs L27A/L27BはDicerの働きにより21塩基長のRNAにプロセシングされていることが分かり、また、27塩基長の2本鎖脂質修飾RNA (Ds Lipid-L27A/L27B)もDicerの働きにより、21塩基長のRNA及びその他のRNAにプロセシングされていることが明らかとなった。この結果より、27塩基長のRNAは脂質が結合していてもDicerにより認識され、プロセシングを受けることが分かった。
　一方、未修飾のsi L21A/L21BはDicerによるプロセシングを受けておらず、21塩基長のRNAに2本鎖脂質を修飾した2本鎖RNA(si Lipid-L21A/L21BもDicerによるプロセシングを受けていないことが分かった。また、Dicerタンパクと共存させた2本鎖脂質修飾si L21A/L21Bでは、分子量の増大が認められたことから、2本鎖脂質修飾si L21A/L21BはDicerタンパクとの間で複合体を形成していることも確認された。
　４．2本鎖RNA脂質修飾RNAのルシフェラーゼ遺伝子発現抑制
　合成した未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAのRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験前に1x105cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を９６wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ80 μl加え、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ)とLipofectamineTM　2000 (商品名、インビトロジェン)の複合溶液を10μlずつHeLa細胞が入ったそれぞれのウェルに加えた。ここで発現ベクターは１ウェルあたり0.02μgになるように、またLipofectamineTM　2000は１ウェルあたり0.2μlになるよう設定し、OptiMem(インビトロジェン)で必要量を調整した。また、複合体を形成させる為に、発現ベクターとLipofectamineTM　2000をOptiMemを用いて混合した後、室温で30分間インキュベートした。複合溶液を加えた後、細胞を5％ CO2 存在下、37℃で4時間インキュベートした。その後、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝配列と相同的なアンチセンス配列を含む未修飾の2本鎖RNA及び末端2本鎖脂質修飾RNAを最終濃度が0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nMになるようLipofectamineTM　2000 (インビトロジェン)と複合体を形成させ、10μlの複合体溶液を発現ベクターを導入したHeLa細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は100 μlとなる。RNAとLipofectamineTM　2000の複合溶液は、1ウェルあたり5 μlのRNA水溶液と5 μlのLipofectamineTM　2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。RNAを導入させた後、48時間インキュベートしDula-GloTM　Luciferase Assay System（プロメガ）を用いてホタ及びウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータ（MicroLumat LB96p: BERTHOLD）で測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼの発現抑制効果を算出した。
　結果を図５に示す。図５において「A」は2本鎖脂質修飾21nt siRNA、「B」は2本鎖脂質修飾27nt dsRNAを用いたときのルシフェラーゼ遺伝子発現抑制の結果である。また、未修飾の21nt siRNA及び27nt dsRNAも同時に評価した。その結果、2本鎖脂質を結合させた21nt siRNA及び27nt dsRNAは未修飾の21nt siRNA及び27nt dsRNAよりも、格段に高いRNA干渉効果を奏することが確認された。
　実施例２　5’2本鎖脂質修飾RNAによるVEGF遺伝子発現阻害効果
１．VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
１－１．センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの配列
　VEGF(vascular endothelial growth factor: 血管内皮成長因子)と相同配列を持ち、VEGFの遺伝子発現を抑制できる27及び21塩基長のセンス鎖RNAと27及び21塩基長のアンチセンス鎖RNAの2本鎖RNAをデザインした。これらの2本鎖RNAを用いて、以下の実験を行った。なお、21siRNAはセンス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの双方の3’末端に２塩基のダングリングエンドを持つ２本鎖RNAであり、27nt dsRNAは、ダングリングエンド（１本鎖領域）を持たない完全２本鎖RNA（センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端である2本鎖RNA）である。使用した27nt dsRNA及び21siRNAの配列は、以下の通りである。
27nt dsRNA　センス鎖　　 v27A：5’- CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3’（配列番号５）
　　　　　 アンチセンス鎖 v27B：3’- GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5’（配列番号６）
21nt siRNA　センス鎖　　　v21A：5’-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3’（配列番号７）
　　　　　アンチセンス鎖  v21B：3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5’（配列番号８）
　これら上記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖用いて実施例１と同様の方法でアニーリングし2本鎖を形成させ、2本鎖脂質未修飾RNAを得た。２本鎖形成確認は実施例１の同様の方法で20% アクリルアミドゲル電気泳動で確認した。
　１－２．VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
　VEGF遺伝子の発現を抑制できる上記２本鎖RNAのセンス鎖の5’末端に脂質を結合させた2本鎖脂質修飾RNAを合成した。当該2本鎖脂質修飾RNAにおいて、2本鎖脂質は上記センス鎖RNAの5’末端に修飾されたアミノアルキル基（Amino Modifier C6; Glen Research）を介して共有結合で結合している。2本鎖脂質修飾の１本鎖RNA（センス鎖）は、実施例１と同様の方法で合成した。合成した2本鎖脂質修飾のセンス鎖RNAのHPLC結果を図６に示す。なお、VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾のセンス鎖RNAにおいても、実施例１とほぼ同様の溶出時間であった。
　また、以下にVEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの構造モデル及び収率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　合成した2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは、アンチセンス鎖RNAと2本鎖を形成させることにより、2本鎖脂質修飾RNAを得た。RNAの２本鎖の形成は、実施例１と同様の方法で行い、20％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（図７参照）。
　２．2本鎖脂質修飾RNAの分解酵素耐性
　2本鎖脂質修飾si v21A/v21B及びDs v27A/v27Bのヌクレアーゼ耐性を検討した。また比較として未修飾のsi L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性結果も評価した。実験は、上記実施例１と同様の方法で実施した。ゲル電気泳動の結果を図８に示す。
　その結果、未修飾のsi v21A/v21Bは血清を含む培地中において速やかに分解されており、１～２時間程度でサンプルRNAの消失が確認された。一方、2本鎖脂質修飾si v21A/v21B(si DPPE-v21A/v21B)は、si v21A/v21Bに比べ非常に高いヌクレアーゼ耐性を示し、48時間後においてもRNAは生存していた。また、未修飾のDs v27A/v27Bも高いヌクレアーゼ耐性を示したが、2本鎖脂質修飾Ds v27A/v27B (Ds DPPE-v27A/v27B)の方がより高いヌクレアーゼ耐性を示した。さらに、2本鎖脂質修飾RNAは血清中タンパク質と結合し、RNAの分解酵素耐性を向上させている知見も得られた。
　これらの結果からも、2本鎖脂質修飾RNAは一般に広く使用されている21siRNAに比べ格段に高い生体内安定性を保有していることが明らかとなった。
　３．VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシング
　合成した2本鎖脂質未修飾RNAおよび2本鎖脂質修飾RNAのリコンビナントDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、実施例１と同様の方法で行った。その結果を図９に示す。
　得られた結果から、未修飾のDs v27A/v27BはDicerの働きにより21塩基長の2本鎖RNAにプロセシングされていることが分かり、また、27塩基長の2本鎖脂質修飾RNA(Lipid-Ds v27A/v27B)もDicerの働きにより、21塩基長のRNA及びその他のRNAにプロセシングされていることが明らかとなった。この結果より、27塩基長のRNAは脂質が結合していてもDicerにより認識され、プロセシングを受けることが分かった。
　一方、未修飾のsi v21A/v21BはDicerによるプロセシングを受けておらず、21塩基長の2本鎖RNAに2本鎖脂質を修飾したRNAもDicerによるプロセシングを受けていないことが分かった。また、Dicerタンパクと共存させた2本鎖脂質修飾si v21A/v21Bでは、分子量の増大が認められたことから、2本鎖脂質修飾si v21A/v21BはDicerタンパクとの間で複合体を形成していることも確認された。
　４．2本鎖脂質修飾RNAのVEGF遺伝子発現抑制
　末端を修飾していないsi v21A/v21B、末端を修飾していないDs v27A/v27B、センス鎖RNAの5’末端を2本鎖脂質修飾したsi v21A/v21B（si Lipid-v21A/v21B）及びセンス鎖RNAの5’末端を2本鎖脂質修飾したDs v27A/v27B（Ds Lipid-v27A/v27B）のVEGF遺伝子発現阻害効果をHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）、A549細胞（ヒト肺ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を用いて評価した。また、VEGF遺伝子と相同な遺伝子配列を持たないRNA(27nt dsRNA(Random)、21nt siRNA(Random))についても同様の評価を行った。
　実験は以下の操作で行った。実験前に1x105 cell/mlに調整したHeLa細胞、A549細胞を24wellプレート上にそれぞれ500μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ450 μl加えた。ここで、HeLa細胞はMEM培地、その他の細胞はPRMI-1640培地を用いた。VEGFの遺伝配列と相同的なアンチセンス配列を含む未修飾又は2本鎖脂質修飾RNA(25μl)とLipofectamineTM　2000 (インビトロジェン)溶液(25μl)との複合体を形成させ、50μlのRNA溶液を450μlの上記細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は500 μlとなる。RNAとLipofectamineTM　2000の複合溶液は、1ウェルあたり25 μlのRNA水溶液と25 μlのLipofectamineTM　2000 (2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。RNAを導入させた後、37℃で48時間、５％CO2存在下インキュベートした。インキュベート後、細胞をPBS(-)で３回洗浄し、RNeasy Plus Mini Kit （キアゲン）で細胞中のTotal-RNAを抽出した。その後、VEGFのmRNA量を測定するためにRT-PCR反応を行った。RT-PCR反応用としてQiagen OneStep RT-PCR Kit (キアゲン)を用い行い、VEGF用PCRプライマーとして、5’-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3’（配列番号９）及び5’-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3’ （配列番号１０）を用いた。またコントロールとしてGAPDH遺伝子を同様の方法で測定した。GAPDH用プライマーとして5’-GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3’（配列番号１１）及び5’-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3’（配列番号１２）を用いた。RT-PCR反応は、50℃で30分間RT（Reverse Transcripratase）反応を行い、PCR反応として92℃で30秒間2本鎖解離反応、55℃で30秒間アニーリング反応、68℃で45秒間伸長反応を25回～28回（使用する細胞により異なる）繰り返し行い、最後に68℃で10分間インキュベートし、4℃まで温度を下げ反応を終了した。RT-PCRに用いた試薬、Total-RNA、プライマー等はQiagen OneStep RT-PCR Kit (キアゲン)の反応条件に従い作成した。RT-PCR反応後、ローディングダイを2μl加え、２％アガロースゲルでVEGF及びGAPDHのmRNAからのRT-PCR産物を確認した。遺伝子発現抑制効果の評価は、コントロール細胞（2本鎖RNAを導入していない細胞）のVEGF遺伝子発現量を100％としたときの、RNA（未修飾、2本鎖脂質修飾を含む）を導入した細胞のVEGF発現量を測定することにより行った。また、各細胞間の発現量の誤差はコントロール遺伝子（GAPDH）の遺伝子発現量で補正した。
　図１０に、VEGFをターゲットとし、RNA濃度が50nMの際の未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAのRNA干渉効果の結果を示す。図１０中、A及びBはHeLa細胞、C及びDはA549細胞に対する未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAのVEGF遺伝子発現抑制効果を示すグラフで、A及びCは21塩基長の2本鎖RNAを用いた場合、B及びDは27塩基長の2本鎖RNAを用いた場合である。
　その結果、2本鎖脂質修飾si v21A/v21Bを用いてHeLa細胞に対する遺伝子発現抑制能を観察した場合（A）、全ての2本鎖脂質修飾RNAにおいて未修飾RNAよりも高い遺伝子発現抑制能が観察された。特にsi DPPE-v21A/v21Bにおいて非常に高い遺伝子発現抑制能が観測された。また、2本鎖脂質修飾Ds v27A/v27を用いてHeLa細胞に対する遺伝子発現抑制能を観察した場合（B）においても、全ての2本鎖脂質修飾RNAにおいて未修飾RNAよりも優れた遺伝子発現抑制能が観測された。またDs DPPE-v27A/v27Bにおいて非常に優れた遺伝子発現抑制能が確認された。
　A549細胞に対するVEGF遺伝子発現抑制能を観察した場合において、脂質修飾si v21A/v21Bを用いて場合(C)、全ての2本鎖脂質修飾RNAにおいて未修飾RNAよりも高い遺伝子発現抑制能が観察された。特にsi DPPE-v21A/v21Bにおいて、非常に高い遺伝子発現抑制能が観測された。また、2本鎖脂質修飾Ds v27A/v27を用いてA549細胞に対する遺伝子発現抑制能を観察した場合（D）、DPPEやDMPEを結合させたRNAにおいて、未修飾RNAよりも高い遺伝子発現抑制能が観測された。
　これらの結果より、2本鎖のRNAのセンス鎖RNAの5’末端に2本鎖脂質を共有結合させた21塩基長及び27塩基長のsiRNA及びdsRNAは、未修飾の各2本鎖RNAに比べ高い遺伝子発現抑制能を示していることが明らかとなった。特に、DPPEを結合させた2本鎖RNAにおいて非常に優れた遺伝子発現抑制能が確認できた。また、DMPE又はDOPEを結合させたRNAにおいても、未修飾RNAに比して高い遺伝子発現抑制能が観測された。
　今回使用したVEGFをターゲットとした2本鎖のRNAは配列特異性高く標的遺伝子の発現を抑制していることが明らかとなった。また、本試験結果から、2本鎖のRNAに2本鎖脂質を結合させることによって細胞に対する副作用をも低減されていることも示唆された。
　５．2本鎖脂質修飾RNAの細胞導入性の検討
　実験前に1x105 cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）、A549細胞（ヒト肺ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）、を24ウェルプレートにそれぞれ1ml撒き10 ％ ウシ胎児血清 (FBS：三光純薬株式会社製)及び抗生物質含む培地中、5 ％ CO2存在下、37 ℃で培養した。ここで用いた抗生物質および培地は、HeLa細胞はMEM培地（インビトロジェン社）を、その他の細胞はRPMI-1640（インビトロジェン社）を培地として用いた。蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNA導入前に、抗生物質を含まない培地(450μl)へ交換した。蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNAは、21nt 及び27nt アンチセンス鎖RNAの5’末端を6-FAMラベル化したものを使用し、未修飾の21nt 及び27nt センス鎖RNA及び5’末端を2本鎖脂質で修飾した21nt 及び27ntセンス鎖RNAと2本鎖を形成させた。細胞導入実験は、蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNAとLipofectamineTM　2000 (インビトロジェン社製)と複合体を形成させる為に、10μM の蛍光ラベル化オリゴヌクレオチド水溶液10μlとOptiMem溶液15μlの混合溶液25μlと、LipofectamineTM　2000 (インビトロジェン社製)溶液2μlとOptiMem溶液23μlの混合溶液25μlそれぞれ混ぜ合わせた50μlの混合溶液を室温で30分間インキュベートした。調整した50μlの蛍光ラベル化オリゴヌクレオチド複合体は、上記で準備した450μlの細胞へ添加し(2本鎖RNAの終濃度：200 nM)、5 ％ CO2存在下、37 ℃で4時間インキュベートした。その後、細胞をPBS(-)又は培地で3回洗浄し、共焦点蛍光レーザー顕微鏡、及びフローサイトメトリーにて細胞導入を評価した。
　共焦点蛍光レーザー顕微鏡は、Radiance 2000システム(Bio Rad社)を用い、アルゴンレーザーを用いて蛍光を観察した。フローサイトメトリーは、coulter EPICS XL cytometer(Beckman coulter) を用い、細胞10000カウントあたりの細胞導入性について測定した。フローサイトメトリー解析はXL EXPO32TM software (Beckman coulter) を用いた。
　結果を図１１に示す。図１１－１中のA及びBは、蛍光ラベルした21塩基長(si v21A/v21B)及び27塩基長のRNA((si v21A/v21B及びsi v27A/v27B)、及びセンス鎖の5’末端を2本鎖脂質修飾したRNAをLipofectamineTM　2000を導入剤として使用した場合のHaLa細胞に対する細胞導入性の結果である。また、図１１－２中のC及びDは、蛍光ラベルした21塩基長(si v21A/v21B)及び27塩基長のRNA((si v21A/v21B及びsi v27A/v27B)、及びセンス鎖の5’末端を2本鎖脂質修飾したRNAをLipofectamineTM　2000を導入剤として使用した場合のA549細胞に対する細胞導入性の結果である。
　その結果、LipofectamineTM　2000存在下において未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAは、全ての細胞（HeLa細胞、A549細胞）への導入が確認された。特に2本鎖脂質をセンス鎖の5’末端に修飾した27塩基長のRNAは未修飾のRNAに比べ、非常に高い細胞導入性が共焦点蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーにおいて観測された。また、この2本鎖脂質修飾RNAは細胞内において積極的に細胞質へ局在化していることが共焦点蛍光顕微鏡観察により示唆された。特に2本鎖脂質としてDPPEやDMPEを結合させた27塩基長の2本鎖RNAにおいて優れた細胞導入性が観測された。
　また、21塩基長のRNAに2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾RNAもLipofectamineTM　2000存在下において高い細胞導入性が確認された。特に、2本鎖脂質としてDMPEを結合させた21塩基長のRNAおいて優れた細胞導入性が確認された。
　この結果より、2本鎖のRNAのセンス鎖RNAの5’末端に脂質を共有結合させることにより飛躍的に細胞導入性を向上させ、且つ、細胞内において細胞質へ局在化させることが可能であるという知見が得られた。
　実施例３　WT1遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
　上記実施例１及び２とは異なる手法を用いて、WT1遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAのセンス鎖RNAの5’末端に、2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。
　先ず、センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAをそれぞれ公知の方法に従って合成した。次いで、センス鎖RNAの5’末端に対するアミノアルキル化を、5’-Amino-Modifier C6 (Glen Research)を用いて通常の方法(ホスホロアミダイト合成法)により行って、5’末端アミノアルキル修飾センス鎖RNAを合成した。合成された5’末端アミノアルキル修飾センス鎖RNAは、５’末端側から１番目のヌクレオチドのリン酸残基に酸素原子を介して－(CH2)6－NH2が結合されている。合成された5’末端アミノアルキル修飾センス鎖RNAは、アンチセンス鎖RNAと2本鎖を形成させ、2本鎖RNA（以下、アミノアルキル修飾２本鎖RNAと表記する）を得た。なお、RNAの２本鎖の形成は、上記と同様の方法で行った。斯くして得られたアミノアルキル修飾２本鎖RNAと、クロロホルムに溶解した活性エステル化2本鎖脂質誘導体［DPPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-・-Phosphatidylethanolamine, Dipalmitoyl), (日本油脂社製)］とを、縮合反応条件下で混合して、2本鎖脂質修飾RNA（DPPE修飾2本鎖RNA）を合成した。反応後、2本鎖脂質修飾RNAが含まれる反応液中の不要な試薬を取り除くため、反応液をHPLCで精製した。HPLC精製は、緩衝液としてＡ：100% 20mM TEAA(pH 7.0), Ｂ：80% CH3CN/20mM TEAA (pH 7.0)を用い、10％ Ｂ緩衝液から100％ Ｂ緩衝液を50分のリニアーグラジェントになるよう設定し精製を行った。また、精製用カラムはCAP CELL (4.6 x 150 mm, 5μｍ；SHISEIDO)を使用した。HPLC解析結果の一例を図１２に示す。HPLCにおいて精製された2本鎖脂質修飾RNAは凍結乾燥し、精製水に溶解させた後、ＵＶスペクトル解析により濃度及び合成収率を算出した。2本鎖脂質修飾RNAは、20％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（図１３）。
　以下に、合成した2本鎖RNAの構造及び収率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007

Claims (17)

  1. 　標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAであって、該センス鎖RNAの５’末端から１～６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに直接又はリンカーを介して2本鎖脂質が結合していることを特徴とする、2本鎖脂質修飾RNA。
  2. 　前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、且つ前記センス鎖RNAの３’末端側が平滑末端又はダングリングエンドを有している、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  3. 　前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共にダングリングエンドを有している、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  4. 　前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数が２１～２７である、請求項１乃至３のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  5. 　前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２７個のヌクレオチドから構成されている、請求項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  6. 　前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２３個のヌクレオチドから構成されている、請求項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  7. 　前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、前記センス鎖RNAが２５個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されている、請求項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  8. 　前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２１個のヌクレオチドから構成されている、請求項３に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  9. 　前記2本鎖脂質を構成する２つの疎水基が、同一又は異なって、炭素数6～50の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基である、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  10. 　前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、ジアシルグリセロール、又はセラミドである、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  11. 　前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質である、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  12. 　前記2本鎖脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  13. 　前記2本鎖脂質が、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
  14. 　前記センス鎖RNAの５’末端から１～６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに、下記一般式（L-27）で表される構造のリンカーを介して脂質が結合している、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、n3及びn4は、同一又は異なって、１～20の整数を示す。］
  15. 　請求項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAと、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  16. 　標的遺伝子の発現を抑制するための医薬を製造するための、請求項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAの使用。
  17. 　請求項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050181A1 (ja) 2010-10-14 2012-04-19 国立大学法人三重大学 線維症予防又は治療剤
WO2018181428A1 (ja) 2017-03-29 2018-10-04 塩野義製薬株式会社 核酸医薬及び多分岐脂質の複合体
WO2019177061A1 (ja) * 2018-03-14 2019-09-19 国立大学法人東京医科歯科大学 核酸複合体
WO2021020412A1 (ja) 2019-07-30 2021-02-04 塩野義製薬株式会社 Ｍｕｒｆ１を標的とする核酸医薬

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9663784B2 (en) 2012-05-26 2017-05-30 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for regulating expression of gene having delivering function
CN104540525A (zh) 2012-07-10 2015-04-22 贝瑟克里科有限公司 大麻素修饰的核酸分子
WO2015099122A1 (ja) 2013-12-26 2015-07-02 学校法人東京医科大学 遺伝子発現制御のための人工ミミックｍｉＲＮＡおよびその用途
RU2697094C2 (ru) 2013-12-27 2019-08-12 Бонак Корпорейшн ИСКУССТВЕННАЯ мкРНК С СООТВЕТСТВИЕМ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
KR20170098914A (ko) 2014-12-27 2017-08-30 가부시키가이샤 보낙 유전자 발현 제어를 위한 천연형 miRNA 및 그의 용도
WO2016158809A1 (ja) 2015-03-27 2016-10-06 株式会社ボナック デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子
CA3043768A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
EP3762497A4 (en) * 2018-05-14 2022-08-03 Murdoch University METHODS OF TREATMENT OF VEGF-ASSOCIATED DISEASES

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008154523A (ja) * 2006-12-25 2008-07-10 National Institute Of Advanced Industrial & Technology ヌクレアーゼ耐性及びｒｎａ干渉効果に優れた修飾型二本鎖ｒｎａ
JP2008167739A (ja) * 2006-06-14 2008-07-24 National Institute Of Advanced Industrial & Technology Ｒｎａ干渉効果が高い修飾型二本鎖ｒｎａ

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7491805B2 (en) * 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
TR200401292T3 (tr) * 2000-12-01 2004-07-21 Max@Planck@Gesellschaft�Zur�F�Rderung�Der�Wissenschaften RNAÁgirişimineÁyolÁaçanÁküçükÁRNAÁmolekülleri
EP1432724A4 (en) * 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
JP2006507841A (ja) * 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
DE10302421A1 (de) * 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
EP1608733B1 (en) * 2003-04-02 2011-12-07 Dharmacon, Inc. Modified polynucleotides for use in rna interference
KR101147147B1 (ko) * 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
MXPA06012076A (es) * 2004-04-20 2007-01-25 Nastech Pharm Co Metodos y composiciones para mejorar el suministro de arn bicatenario o un acido nucleico hibrido bicatenario para regular la expresion genetica en celulas de mamifero.
ATE536418T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Lipidverkapselte interferenz-rna
WO2006113679A2 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Delivery of sirna by neutral lipid compositions
WO2007022470A2 (en) * 2005-08-18 2007-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating neurological disease
EP1934359A2 (en) 2005-09-08 2008-06-25 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Pharmaceutical compositions for delivery of ribonucleic acid to a cell
EP1948674A4 (en) * 2005-11-02 2009-02-04 Protiva Biotherapeutics Inc MODIFIED SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
WO2007056861A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of influenza virus gene expression
CA2681795A1 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Gencia Corporation Synthetic lipid rafts and methods of use
TW200927177A (en) 2007-10-24 2009-07-01 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Lipid-modified double-stranded RNA having potent RNA interference effect

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008167739A (ja) * 2006-06-14 2008-07-24 National Institute Of Advanced Industrial & Technology Ｒｎａ干渉効果が高い修飾型二本鎖ｒｎａ
JP2008154523A (ja) * 2006-12-25 2008-07-10 National Institute Of Advanced Industrial & Technology ヌクレアーゼ耐性及びｒｎａ干渉効果に優れた修飾型二本鎖ｒｎａ

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Idenshi Delivery Kenkyukai Dai 7 Kai Symposium Yoshishu", 18 May 2007, article TAKANORI KUBO ET AL.: "Idenshi Yokuseino ga Takai Shushokugata 27nt dsRNA", pages: 49, XP008145937 *
FIRE ET AL., NATURE, vol. 391, 1998, pages 806 - 811
J. ROSSI ET AL., NATURE BIOTECH., vol. 23, 2005, pages 222 - 226
J. T. MARQUES ET AL., NATURE BIOTECH., vol. 24, 2006, pages 559 - 565
KUBO T. ET AL.: "Chemically modified symmetric and asymmetric duplex RNAs: an enhanced stability to nuclease degradation and gene silencing effect", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 365, no. 1, 4 January 2008 (2008-01-04), pages 54 - 61, XP022680920 *
KUBO T. ET AL.: "Modified 27-nt dsRNAs with dramatically enhanced stability in serum and long-term RNAi activity", OLIGONUCLEOTIDES, vol. 17, 2007, pages 445 - 464, XP002537984 *
LORENZ C. ET AL.: "Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells", BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 14, 2004, pages 4975 - 7, XP008143371 *
See also references of EP2264167A4
TAKANORI KUBO ET AL.: "Cholesterol Shushokugata 2-honsa RNA no Seikagakuteki Tokusei to RNA Kansho Koka", 2007 NEN NIPPON KAGAKUKAI NISHI NIPPON TAIKAI KOEN YOSHISHU, 10 November 2007 (2007-11-10), pages 267 *
TUSCHL ET AL., EMBO JOURNAL, vol. 20, 2001, pages 6877 - 6888
UI-TEI ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 32, 2004, pages 936 - 948

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050181A1 (ja) 2010-10-14 2012-04-19 国立大学法人三重大学 線維症予防又は治療剤
EP3517614A1 (en) 2010-10-14 2019-07-31 Mie University Preventive or therapeutic agent for fibrosis
WO2018181428A1 (ja) 2017-03-29 2018-10-04 塩野義製薬株式会社 核酸医薬及び多分岐脂質の複合体
WO2019177061A1 (ja) * 2018-03-14 2019-09-19 国立大学法人東京医科歯科大学 核酸複合体
JPWO2019177061A1 (ja) * 2018-03-14 2021-03-11 国立大学法人 東京医科歯科大学 核酸複合体
US11597928B2 (en) 2018-03-14 2023-03-07 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Nucleic acid complex
JP7394392B2 (ja) 2018-03-14 2023-12-08 国立大学法人 東京医科歯科大学 核酸複合体
WO2021020412A1 (ja) 2019-07-30 2021-02-04 塩野義製薬株式会社 Ｍｕｒｆ１を標的とする核酸医薬

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