CN101981185A - Rna干涉效果强的双链脂质修饰rna - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种核酸酶抗性及细胞内导入率高、并且能够产生优异的RNA干涉效果的新型双链RNA。本发明提供了一种双链脂质修饰RNA，该双链脂质修饰RNA包含具有与靶基因中的靶序列互补的碱基序列的有义链RNA，及具有与该有义链RNA互补的碱基序列的反义链RNA，能够抑制靶基因表达，其中，双链脂质直接或通过连接体连接到该有义链RNA的从5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个核苷酸上。

Description

RNA干涉效果强的双链脂质修饰RNA
技术领域
本发明涉及一种能够有效地抑制靶基因表达的双链脂质修饰RNA。更具体而言，本发明涉及一种核酸酶抗性及细胞内导入率高、并且能够产生优异的RNA干涉效果的双链脂质修饰RNA。并且，本发明涉及利用该双链脂质修饰RNA的药物组合物及抑制靶基因表达的方法。
背景技术
有效地治疗癌症和AIDS等难治疾病的药物开发是生命科学领域中的一个重大课题。作为能够攻克上述课题的一种有效的方法，是使用只作用于特定基因的基因药物。上述基因药物中，特别是利用21个碱基的短双链RNA(small interfering RNA：siRNA)的RNA干涉(RNAinterference：RNAi)法最近受到关注。上述RNAi法在1998年由Fire等人首次报道(参见非专利文献1)。根据Fire等人的报道，通过将与欲抑制功能的基因的特定区域同源的100个碱基对左右的双链RNA导入细胞内，在细胞质内通过切酶(Dicer)的作用被分解成20～25个碱基对左右的双链RNA，之后与多种蛋白质复合，形成RNA/蛋白质复合体(该复合体称作RICS:RNA诱导沉默复合体)，所述的复合物与由靶基因产生的mRNA的同源位点结合，从而强力地抑制基因表达。但是，据报道：当将约30个碱基对以上的长双链RNA导入哺乳细胞中时，作为抗病毒应答反应的干扰素应答被诱导，结果导致细胞凋亡的现象。认为RNA法难以适用于哺乳动物细胞系。因此，Tuschl等人化学合成了在双链RNA的两个3’末端具有悬端(dangling end)的21个碱基长度的双链RNA，并且报道当将上述双链RNA直接导入哺乳动物细胞内时，该双链RNA能够避免干扰素应答，显示出序列特异性地强的基因表达抑制能力(参见非专利文献2)。另外，Tuschl等人合成了双链区域为19个碱基对、在3’末端或5’末端具有各种长度的悬端链的短双链RNA，并且研究了它们的RNA干涉效果。结果观察到在两个3’末端具有2个碱基的悬端的21个碱基长度的siRNA显示出非常高的RNA干涉效果，而在除此之外的所有类型的短双链RNA中，没有观察到显著的RNA干涉效果。根据上述报道，目前通常采用下述RNA干涉法，其使用21个碱基长度、在两个3’末端具有2个碱基悬端的双链RNA。此处为了与RNAi法相区别，将使用21个碱基长度的短双链RNA来抑制靶基因表达的方法称作“siRNA法”。
由于上述siRNA法使用合成的RNA，所以也比较容易制备样品，处理操作也简单，并且能够显示非常强的效果，因此，siRNA法不仅在生命科学领域，在生物技术商业领域也广泛受到关注。
但是，上述优异的siRNA法也存在必须要解决的问题。如上所述，siRNA由RNA分子构成，因细胞内及培养基中含有的核酸酶的作用而被迅速地分解。另外，双链RNA区域与单链RNA相比，显示出比较高的核酸酶抗性，但由19个碱基对组成的双链RNA几乎不显示已知的RNA干涉效果。因此，有报道称，当被导入含有靶基因序列的细胞内后，虽然合成的siRNA在大约2天～4天的时间里显示强基因表达抑制效果，但之后其RNA干涉效果急剧减弱，到7天左右RNA干涉效果几乎完全消失。
最近，为了使合成的siRNA中获得优异的细胞导入率和长时间高活性的RNA干涉效果，报道了各种化学修饰型siRNA。例如，为了获得对核酸外切酶消化的抗性，合成了siRNA的末端用氨基、巯基或脱碱基位点等修饰的siRNA。但是，已经有报道称，大部分修饰了末端的21个碱基长度的siRNA具有显著减弱的RNA干涉效果。
另一方面，近年来根据J.Rossi等人的报道，可知27个碱基对组成的双链RNA与21个碱基长度的siRNA相比显示出高100倍左右的RNA干涉效果(参见非专利文献3)。一般认为这是由于由27个碱基对组成的RNA被RNase III样酶的切酶切割成21个碱长度的siRNA后，被蛋白质复合体RISC直接识别，可以高效地发挥siRNA效果。
如上所述，由于27个碱基长度的RNA可以产生优异的RNA干涉效果，所以今后更加期待其作为基因药物的应用。但是，完全不清楚何种技术方法对进一步增强27个碱基长度的RNA产生的RNA干涉效果有效。此外，也不清楚何种技术方法可提高具有RNA干涉效果的27个碱基长度的RNA或其他碱基长度的RNA的RNA干涉效果。
另外，具有RNA干涉效果的双链RNA，通常采用末端具有悬端的结构，对末端不具有悬端的结构(即，具有平滑末端的结构)也进行了RNA干涉效果的研究。但是结果表明，在有义链RNA的5’末端侧为平滑末端的结构与在有义链RNA的5’末端侧具有悬端的结构相比，RNA干涉效果几乎没有变化或RNA干涉效果较低(参见非专利文献4)。
另一方面，已知脂质对细胞膜的亲和性及透过性高，对向细胞内转运药物有用。期待通过将此脂质与具有RNA干涉效果的双链RNA连接，可提高细胞内导入率，更有效地产生RNA干涉效果。但是，已知具有RNA干涉效果的双链RNA与脂质简单地连接时，会导致RNA干涉效果的显著减弱。目前的现状是，在现有技术中尚未构建兼有优异的RNA干涉效果与基于脂质的有用效果的脂质修饰的RNA。
非专利文献1：Fire et al.，Nature，391，806-811(1998)
非专利文献2：Tuschl et al.，EMBO Journal，20，6877-6888(2001)
非专利文献3：J.Rossi et al.Nature Biotech.，23，222-226(2005)
非专利文献4：J.T.Marques.et al.，Nature Biotech.，24，559-565(2006)
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸酶抗性及细胞内导入率高、并且能够产生优异的RNA干涉效果的新型双链RNA。本发明的另一个目的在于提供利用该新型双链RNA的药物组合物及抑制靶基因表达的方法。
本发明人等为了解决上述课题，进行了深入研究，结果发现，通过在双链RNA中使双链脂质直接或通过连接体连接到有义链RNA的从5’末端侧起第1～6个核苷酸的至少一个上，能够构建显著提高核酸酶抗性、细胞内导入率及RNA干涉效果的RNA，所述双链RNA包含具有与靶基因中的靶序列互补的碱基序列的有义链RNA及具有与该有义链RNA互补的碱基序列的反义链RNA，且能够抑制靶基因的表达。本发明是基于上述发现，通过进一步反复改良而完成的。
即，本发明提供下述给出的双链脂质修饰RNA、药物组合物、应用及抑制靶基因表达的方法。
项1.一种双链脂质修饰RNA，其特征在于，所述双链脂质修饰RNA为双链RNA，包含具有与靶基因中的靶序列互补的碱基序列的有义链RNA及具有与该有义链RNA互补的碱基序列的反义链RNA，并且能够抑制上述靶基因的表达，双链脂质直接或通过连接体连接到该有义链RNA的从5’末端起第1～6个核苷酸的至少一个上。
项2.如项1所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述有义链RNA的5’末端侧为平滑末端，并且上述有义链RNA的3’末端侧具有平滑末端或悬端。
项3.如项1所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均具有悬端。
项4.如项1～3中任一项所述的双链脂质修饰RNA，其中，构成上述有义链RNA的核苷酸的数量为21～27个。
项5.如项2所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均为平滑末端，上述有义链RNA及上述反义链分别由27个核苷酸构成。
项6.如项2所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均为平滑末端，上述有义链RNA及上述反义链分别由23个核苷酸构成。
项7.如项2所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述有义链RNA的5’末端侧为平滑末端，上述有义链RNA由25个核苷酸构成，并且上述反义链由23个核苷酸构成。
项8.如项3所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述有义链RNA及上述反义链分别由21个核苷酸构成。
项9.如项1～8中任一项所述的双链脂质修饰RNA，其中，构成上述双链脂质的2个疏水基相同或者不同，为碳原子数为6～50的饱和脂肪酸残基或不饱和脂肪酸残基。
项10.如项1～9中任一项所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述双链脂质为甘油磷脂(Glycerophospholipid)、甘油糖脂(Glyceroglycolipid)、二酰基甘油或神经酰胺。
项11.如项1～9中任一项所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述双链脂质为甘油磷脂。
项12.如项11所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述双链脂质为磷脂酰乙醇胺。
项13.如项12所述的双链脂质修饰RNA，其中，上述双链脂质为选自二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油基-磷脂酰乙醇胺及二油酰基磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
项14.如项1～13中任一项所述的双链脂质修饰RNA，其中，脂质通过连接体与上述有义链RNA的从5’末端起第1～6个核苷酸的至少一个连接，所述连接体的结构由下述通式(L-27)表示。
-CO-(CH2)n3-CO-NH-(CH2)n4-(L-27)
[式中，n3及n4相同或者不同，表示1～20的整数。]
项15.一种药物组合物，含有项1～14中任一项所述的双链脂质修饰RNA和药学上允许的载体。
项16.项1～14中任一项所述的双链脂质修饰RNA在制备用于抑制靶基因表达的药物中的应用。
项17.一种抑制靶基因表达的方法，包括将项1～14中任一项所述的双链脂质修饰RNA导入细胞内的步骤。
本发明的双链脂质修饰RNA的有义链RNA的5’末端侧被双链脂质修饰，由此显著提高了RNA干涉效果。特别是本发明的双链脂质修RNA，通过在特定位点连接双链脂质，核酸酶抗性及RNA干涉效果显著提高，且不妨碍切酶的加工或与RISC形成复合体的能力，因此对药物用途的应用有很大的贡献。
进而，本发明的双链脂质修饰RNA即使单独使用也显示出优异的细胞内递送能力，因此不另外使用已知的基因导入试剂，或者减少已知的基因导入试剂的使用量，也可以将双链脂质修饰RNA导入细胞内。因此，本发明的双链脂质修饰RNA可以抑制因使用已知的基因导入试剂所导致的细胞毒性的表达，可以确保临床应用中高度的安全性。
因此，通过利用本发明的双链脂质修饰RNA的药物组合物或抑制靶基因表达的方法，可以在临床上更有效地抑制或阻碍靶基因的表达。
附图说明
[图1]为表示实施例1中对双链脂质修饰的有义链RNA进行HPLC分析的结果的图。
[图2]为表示实施例1中，确认双链脂质修饰RNA的双链RNA形成的结果的图。图2的A中，(1)表示21nt siRNA的结果、(2)表示DPPE L21A/L21B的RNA的结果、(3)表示POPE L21A/L21B的RNA的结果、(4)表示DOPE L21A/L21B的RNA的结果、(5)表示DMPE L21A/L21B的RNA的结果。图2的B中，(1)表示27nt dsRNA的结果、(2)表示DPPE L27A/L27B的RNA的结果、(3)表示POPE L27A/L27B的RNA的结果、(4)表示DOPE L27A/L27B的RNA的结果、(5)表示DMPE L27A/L27B的RNA的结果。
[图3]为表示实施例1中双链脂质修饰RNA的核酸酶抗性结果的图。
[图4]为表示实施例1中研究双链脂质修饰RNA使用切酶加工的结果的图。
[图5]为表示实施例1中浓度为2nM时的双链脂质修饰27ntdsRNA的RNA干涉效果的结果的图。
[图6]为表示实施例2中对双链脂质修饰有义链RNA进行HPLC分析的结果的图。
[图7]为表示实施例2中确认双链脂质修饰RNA的双链形成的结果的图。图7的A中，A-1中(1)表示21nt siRNA的结果、(2)表示DPPE v21A/v21B的RNA的结果，A-2中(1)表示21ntsiRNA的结果、(2)表示POPE v27A/v27B的RNA的结果、(3)表示DOPE v27A/v27B的RNA的结果、(4)表示DMPE v27A/v27B的RNA的结果。图7的B中，(1)表示27nt dsRNA的结果、(2)表示DPPE v27A/v27B的RNA的结果、(3)表示POPE v27A/v27B的RNA的结果、(4)表示DOPE v27A/v27B的RNA的结果、(5)表示DMPE v27A/v27B的RNA结果。
[图8]为表示实施例2中双链脂质修饰RNA的核酸酶抗性结果的图。
[图9]为表示实施例2中研究双链脂质修饰RNA使用切酶加工的结果的图。
[图10]为表示实施例2中双链脂质修饰RNA对HeLa、A549细胞中VEGF基因的RNA干涉效果的结果的图。
[图11-1]为表示实施例2中双链脂质修饰RNA对HeLa细胞中VEGF基因的细胞导入率的结果的图。图中，FL表示用荧光显微镜拍摄的图像，trans表示用相差显微镜拍摄的与上述FL同一视野的图像，merge表示重叠上述FL图像与trans图像得到的图像。
[图11-2]为表示实施例2中双链脂质修饰RNA对A549细胞中VEGF基因的细胞导入率的结果的图。图中，FL表示用荧光显微镜拍摄的图像，trans表示用相差显微镜拍摄的与上述FL同一视野的图像，merge表示重叠上述FL图像与trans图像得到的图像。
[图12]为表示实施例3中，用HPLC分析双链脂质修饰RNA的结果图。
[图13]为实施例3中确认双链脂质修饰RNA合成的结果的图。
具体实施方式
本说明书中，所谓“平滑末端”，是指在双链RNA的末端部分，有义链的末端区域及与其配对的反义链的末端区域配对的结构，不形成单链部分(即，不形成突出部)。另外，所谓“悬端”，是指也称作突出端的结构，表示下述碱基序列(突出部)，即在双链RNA末端部分的有义链的末端区域或与其配对的反义链的末端区域中，因不存在配对的碱基，所以不能形成双链，故存在单链。另外，本说明书中，所谓“双链脂质修饰RNA”，是指连接有双链脂质的双链(double strand)RNA分子。
本发明的双链脂质修饰RNA包含与靶基因中的靶序列互补的碱基序列即有义链RNA。
此处，所谓“靶基因”，是指RNA干涉效果抑制其表达的基因。本发明的双链脂质修饰RNA中，对靶对象基因没有特殊的限制，可以基于该双链脂质修饰RNA的用途适当选择。
对靶基因中的靶序列没有特别的限制，只要该基因的表达可以被RNA干涉效果抑制即可。可以采用公知的方法，具体而言，使用NCBI的BLAST搜索等适当确定。例如靶序列可以是由19～30个碱基组成的区域，所述碱基在位于靶基因编码区(ORF)起始密码子50～100个碱基下游的外显子部分中的碱基”AA”之后，是GC含量约为50％的区域。本领域技术人员根据经验可知，通过采用与上述靶序列互补的链，可以获得优异的RNA干涉效果。另外，例如上述靶序列可以按照IDT公司(Integrated DNA Technologies，INC)的说明(Dicer Substrate RNAi Design)来确定。另外，最近有报道指出通过构建如下双链RNA可以产生具有高RNA干涉效果的双链RNA，所述双链RNA(i)在反义链RNA的5’末端为A/U对；(ii)在有义链RNA的5’末端为G/C对；(iii)在反义链RNA的5’末端侧具有5个左右的A/U对；且(vi)在双链中不存在9个以上的G/C对。(Ui-Tei et al.，Nucleic Acids Res.，32，936-948(2004))。
本发明的双链脂质修饰RNA的有义链中不存在悬端时，该有义链由与靶序列互补的碱基序列组成。另外，有义链在5’末端及/或3’末端存在悬端时，该有义链由下述碱基序列构成，所述碱基序列在与靶序列互补的碱基序列的5’末端及/或3’末端上连接有构成悬端的碱基序列。
本发明的双链脂质修饰RNA中，对构成上述有义链RNA的核苷酸数量，没有特别的限制，只要可以发挥RNA干涉效果即可，可以根据该双链脂质修饰RNA具备的结构等适当地确定，可以举出通常为21～27个，优选为21个、23个、25个或27个，更优选为21个或27个。需要说明的是，此处所谓构成有义链RNA的核苷酸的数量，是指在该有义链中不存在悬端时，构成与靶序列互补的碱基序列的核苷酸的总数，在该有义链中存在悬端时，是指构成该悬端的核苷酸的数量和构成与靶序列互补的碱基序列的核苷酸的数量的总和。
另外，双链脂质修饰RNA具有包含与上述有义链互补的碱基序列的反义链。
本发明的双链脂质修饰RNA中，在反义链中不存在悬端时，该反义链由与上述有义链的“与靶序列互补的碱基序列”的一部分或全部互补的碱基序列组成。另外，在反义链的5’末端及/或3’末端存在悬端时，该反义链由下述碱基序列组成，所述碱基序列在与上述有义链的“与靶序列互补的碱基序列”的一部分或全部互补的碱基序列的5’末端及/或3’末端上连接有构成悬端的碱基序列。
本发明的双链脂质修饰RNA中，对于构成上述反义链RNA的核苷酸数量没有特别的限制，只要可以发挥RNA干涉效果即可，可以根据该双链RNA具备的双链RNA结构等适当确定，可以举出通常为21～27个，优选为21个、23个、25个或27个，更优选为21个、23个或27个。另外，此处所谓构成反义链RNA的核苷酸的数量，在该反义链不存在悬端时，是指构成与靶序列互补的碱基序列的核苷酸的总数，在该反义链存在悬端时，是指构成该悬端的核苷酸数量和构成与靶序列互补的碱基序列的核苷酸数量的总和。
本发明的双链脂质修饰RNA中，构成上述有义链RNA和上述反义链RNA的核苷酸基本为核糖核苷酸，为了提高分解酶抗性，RNA序列中也可以包含2’-O-甲基修饰型、2’-F修饰型、LNA(锁定核酸(Locked Nucleic Acid))等各种化学修饰型核苷酸或脱氧核糖核苷酸等。特别是，本发明的双链脂质修饰RNA具有悬端结构时，上述有义链RNA及/或上述反义链RNA中的该悬端的构成部分也可以由脱氧核糖核苷酸组成。作为上述化学修饰型核苷酸，具体而言，可以举出硫代磷酸型DNA/RNA、硼磷酸型DNA/RNA等磷酸骨架修饰的核苷酸等；2’-OMe修饰RNA、2’-F修饰RNA等2’修饰核苷酸；LNA(锁定核酸)和ENA(2’-O，4’-C-亚乙基-桥联核酸)等将核苷酸的糖分子交联得到的修饰核苷酸；PNA(肽核酸)、吗啉核苷酸等基本骨架不同的修饰核苷酸；5-氟尿苷和5-丙基尿苷等碱基修饰型核苷酸；等。
本发明的双链脂质修饰RNA在结构上没有特别的限制，只要上述有义链RNA与上述反义链RNA杂交形成双链即可。作为优选的结构，可以举出(A)上述有义链RNA的5’末端侧为平滑末端(bland end)、且上述有义链RNA的3’末端侧为平滑末端或具有悬端(单链区域，突出部)的结构，以及(B)上述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均具有悬端的结构。如上所述，通过形成上述结构(A)或(B)，虽然用双链脂质修饰，但也不会导致RNA干涉效果的减弱，可以进一步显著地提高细胞内导入效率。此处，有义链RNA的3’末端侧具有悬端的结构包括下述情况：有义链RNA的3’末端区域构成悬端的情况，和反义链RNA的5’末端区域构成悬端的情况。另外，有义链RNA的5’末端侧具有悬端的结构包括下述情况：有义链RNA的5’末端区域构成悬端的情况，和反义链RNA的3’末端区域构成悬端的情况。
构成本发明的双链脂质修饰RNA的双链RNA中，特别是从为了表达优异的RNA干涉效果的观点考虑，作为特别优选的结构，可以举出下述结构(A-1)～(A-3)作为上述结构(A)中包含的结构，可以举出下述结构(B-1)作为上述结构(B)中包含的结构：结构(A-1)为上述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均为平滑末端，该有义链RNA及该反义链RNA分别由27个核苷酸构成的结构；结构(A-2)为上述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均为平滑末端，该有义链RNA及该反义链RNA分别由23个核苷酸构成的结构；结构(A-3)为上述有义链RNA的5’末端侧为平滑末端，该有义链RNA由25个核苷酸构成，并且上述反义链RNA由23个核苷酸构成的结构；结构(B-1)为在上述有义链RNA的3’末端及上述反义链RNA的3’末端分别形成由2个核苷酸组成的悬端，该有义链RNA及该反义链分别由21个核苷酸构成的结构。
即，上述结构(A-1)及(A-2)，是有义链RNA及反义链RNA在两末端不形成悬端而形成为杂交的结构。另外，上述结构(A-3)为有义链RNA及反义链RNA杂交使有义链RNA的5’末端侧为平滑末端、且从有义链RNA 3’末端起第1～2个核苷酸形成悬端的结构。另外，上述结构(B-1)为如下结构，有义链的从5’末端起第1～19个核苷酸与反义链RNA的从3’末端起第3～21个核苷酸杂交，有义链RNA的从3’末端起第1～2个核苷酸和反义链RNA的从3’末端起第1～2个核苷酸分别形成悬端。
本发明的双链脂质修饰RNA，脂质连接到上述有义链RNA的从5’末端侧起第1～6个核苷酸的至少一个上。本发明的双链脂质修饰RNA在除上述有义链RNA的5’末端侧之外的部分没有连接其他取代基。即，除上述有义链RNA的5’末端侧之外的部分及反义链RNA部分没有被其他取代基取代，仅由核苷酸构成。如上所述，通过仅双链脂质与上述有义链RNA的5’末端侧连接，可以提高细胞内导入率，并且可以发挥非常优异的RNA干涉效果。即，本发明的双链脂质修饰RNA中，双链RNA的结构、选择双链脂质作为修饰脂质，及该双链脂质的连接部位等结构上的特征为不可分割的关系，使其具备高细胞内导入率的同时，具备核酸酶抗性，并且也可以发挥非常优异的RNA干涉效果。
本发明的双链脂质修饰RNA中，作为与上述有义链RNA连接的双链脂质没有特别的限制，只要是具有2个疏水基的脂质即可，作为一个例子，可以举出具有选自碳原子数6～50的饱和脂肪酸残基及不饱和脂肪酸残基中的至少2个疏水基的脂质。作为上述饱和脂肪酸残基及不饱和脂肪酸残基的碳原子数，可以举出优选为8～30，更优选为10～24。更具体而言，作为构成脂质的疏水基，例如可以举出癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、木蜡酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、油酸、反油酸、1-十八碳烯酸、芥子酸、二十碳-9-烯酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等的脂肪酸残基。从进一步显著地发挥上述本发明的效果的观点考虑，本发明中使用的双链脂质的2个疏水基优选为选自肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸及油酸中的至少1种的脂肪酸残基。
作为本发明中使用的双链脂质的具体例，可以举出甘油磷脂、甘油糖脂、二酰基甘油、神经酰胺等。其中，从进一步提高核酸酶抗性、细胞内导入率及RNA干涉效果的观点考虑，可以举出优选甘油磷脂。
作为本发明中使用的甘油磷脂，没有特别的限制，可以任意地使用磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇等。
作为本发明中使用的磷脂的具体例子，可以举出二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油基-磷脂酰乙醇胺、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、二芥酸酰基磷脂酰乙醇胺等磷脂酰乙醇胺；二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油基-磷脂酰甘油、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油、二芥酸酰基磷脂酰甘油等磷脂酰甘油；二月桂酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油基-磷脂酰丝氨酸、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、二芥酸酰基磷脂酰丝氨酸等磷脂酰丝氨酸；二月桂酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、二油酰基磷脂酸、1-棕榈酰基-2-油基-磷脂酸、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酸、二芥酸酰基磷脂酸等磷脂酸；二月桂酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇、二棕榈酰基磷脂酰肌醇、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰肌醇、1-棕榈酰基-2-油基-磷脂酰肌醇、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酰肌醇、二芥酸酰基磷脂酰肌醇等磷脂酰肌醇。其中，从进一步显著提高核酸酶耐性、细胞内导入率及RNA干涉效果的观点考虑，可以优选举出磷脂酰乙醇胺、更优选为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油基-磷脂酰乙醇胺、及二油酰基磷脂酰乙醇胺。
本发明的双链脂质修饰RNA中，对上述双链脂质与上述有义链的连接方式没有特别的限制，上述脂质双链可以与其直接连接，或者也可以通过连接体(连接区域)与其连接。但是，本发明中，连接上述双链脂质与上述有义链的连接体中不包含由核酸构成的物质。
此处，作为连接体，只要可以连接上述脂质与上述有义链即可，没有特别的限制，具体而言，作为上述连接体，可以举出下述结构。
-O-CO-O-                         (L-1)
-NH-CO-O-                        (L-2)
-NH-CO-NH-                       (L-3)
-NH-(CH2)n1-                     (L-4)
-S-(CH2)n1-                      (L-5)
-CO-(CH2)n1-CO-                  (L-6)
-CO-(CH2)n1-NH-                  (L-7)
-NH-(CH2)n1-NH-                  (L-8)
-CO-NH-(CH2)n1-NH-CO-            (L-9)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-NH-CO-        (L-10)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-NH-C(＝S)-    (L-11)
-CO-O-(CH2)n1-O-CO-              (L-12)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-O-CO-          (L-13)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-O-C(＝S)-      (L-14)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO-             (L-15)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-CO-         (L-16)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-C(＝S)-     (L-17)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO-             (L-18)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-CO-         (L-19)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-NH-CO-         (L-20)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-C(＝S)-     (L-21)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH(CH2OH)-       (L-22)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH2-             (L-23)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH2-CO-          (L-24)
-O-(CH2)n3-S-S-(CH2)n4-O-P(＝O)2-(L-25)
-CO-(CH2)n3-O-CO-NH-(CH2)n4-     (L-26)
-CO-(CH2)n3-CO-NH-(CH2)n4-       (L-27)
此处，上述通式(L-4)～(L-21)中，n1表示为1～40的整数，优选为2～20的整数，更优选为2～12的整数。
另外，上述通式(L-22)～(L-24)中，n2表示1～20的整数，优选为1～10的整数，更优选为1～6的整数。
另外，上述通式(L-25)～(L-27)中，n3及n4相同或不同，表示1～20的整数，优选为1～10的整数，更优选为1～6的整数。
上述通式(L-1)～(L-27)表示的连接体可以在其右侧或左侧的任一侧连接单链DNA。优选如下构成：在左侧连接双链脂质，在右侧连接上述双链RNA的有义链RNA5’末端区域。
另外，对上述连接体与上述双链脂质的的连接部位，根据双链脂质的种类和连接体的种类适当地设定，也可以将除双链脂质的疏水基之外的部位与上述连接体通过化学键进行连接。例如，如果使用磷脂酰乙醇胺时，则其氨基可以通过与上述连接体形成酰胺键等进行连接。另外，如果使用磷脂酰甘油时，则其甘油残基中的羟基可以通过与上述连接体形成酯键或醚键等进行连接。另外，如果使用磷脂酰丝氨酸时，则其丝氨酸残基中的氨基或羧基可以通过与上述连接体形成酰胺键或酯键等进行连接。进而，如果使用磷脂酸时，则其磷酸残基可以通过与上述连接体形成磷酸酯键等进行连接。进而，如果使用磷脂酰肌醇时，则其肌醇残基中的羟基可以通过与上述连接体形成酯键或醚键等进行连接。
上述连接体根据所连接的脂质的种类适当地选择，例如，使用具有氨基的磷脂(即，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等)或具有羟基的磷脂(即，磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等)作为双链脂质时，作为上述连接体，优选为通式(L-6)、(L-7)、(L-9)、(L-10)、(L-18)、(L-26)及(L-27)的连接体。
另外，除上述连接体之外，例如也可以使用N-琥珀酰亚胺基＝3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯、N-4-马来酰亚胺丁酸、S-(2-吡啶基二硫基)巯基乙胺、碘代乙酸琥珀酰亚胺酯、N-(4-马来酰亚胺丁氧基)琥珀酰亚胺、N-[5-(3’-马来酰亚胺丙酰胺)-1-羧基戊基]亚氨基二乙酸、N-(5-氨基戊基)-亚氨基二乙酸等双官能连接体(含有2个官能基的连接体)。
上述有义链RNA中，作为双链脂质或连接双链脂质的连接体的连接对象即核苷酸，只要是从上述有义链RNA的5’末端侧起第1～6个核苷酸即可，没有特别的限制，优选为从5’末端侧起第1～4个核苷酸，更优选为从5’末端侧起第1及/或第2个核苷酸，特别优选为在5’末端(从5’末端侧起第1个)的核苷酸。
另外，上述有义链RNA中，对双链脂质或连接双链脂质的连接体的连接部位，没有特别的限制，双链脂质或连接双链脂质的连接体，优选通过取代构成羟基的氢原子进行连接，所述羟基是上述有义链RNA的规定的核苷酸中的磷酸部分的羟基。
作为与本发明的双链脂质修饰RNA连接的双链脂质的数量，没有特别的限制，例如可以举出1～3个，优选为1个或2个，更优选为1个。
本发明的双链脂质修饰RNA可以如下制备：分别合成连接有双链脂质的上述有义链RNA及上述反义链RNA，按照公知的方法使上述有义链RNA及反义链RNA杂交，由此制备。需要说明的是，连接有双链脂质的上述有义链RNA，也可以采用公知的合成技术进行制备。
进而，本发明的双链脂质修饰RNA，可以通过如下方法制备：按照公知的方法合成上述有义链RNA及上述反义链RNA、使两者杂交制备双链RNA后，采用双链脂质公知的合成技术将双链脂质连接在该双链RNA的有义链RNA的5’末端。
本发明的双链脂质修饰RNA，通过导入细胞内，可以抑制或阻碍靶基因的表达，因此可以用作以抑制靶基因的表达为目的的药物或基因治疗用的药物，或用于评价抑制靶基因表达的效果的实验材料。
对成为本发明双链脂质修饰RNA导入对象的细胞，可以为来自人、非人哺乳动物、鸟类、昆虫等任一种动物中的细胞，优选可以举出来自人及非人哺乳动物的细胞。
对本发明的双链脂质修饰RNA向细胞内的导入方法，与现有siRNA的情况相同，只要使有效量的该双链脂质修饰RNA与成为导入对象的细胞接触即可。本发明的双链脂质修饰RNA向细胞内的导入，可以在体内、体外进行。
例如在体外将本发明的双链脂质修饰RNA导入细胞内时，可以举出下述方法：在该细胞的培养时在预先使适当量的该双链脂质修饰RNA存在的状态下培养细胞。另外，在体外或体内向培养细胞、从生物体提取的细胞、从生物体提取的组织中导入本发明的双链脂质修饰RNA时，在该双链脂质修饰RNA的存在下，也可以培养培养细胞、从生物体提取的细胞或从生物体提取的组织。进而，在体内将本发明的双链脂质修饰RNA导入细胞内时，可以通过以下方法给与本发明的双链脂质修饰RNA，所述方法包括直接注射到组织内；向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、牙齿内等注射；向鼻腔、口腔、肺等吸入给与；口服给与；通过皮肤的经皮给与；及通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给与等。
另外，将本发明的双链脂质修饰RNA导入细胞内时，对该双链脂质修饰RNA相对于导入对象的细胞的适用量，只要是用于导入细胞内的有效量即可，具体而言，可以举出相对于每1个细胞，该双链脂质修饰RNA的适用量在0.001～10pmol(pM)的范围内，优选在0.001～1pmol的范围内，更优选在0.01～0.1pmol的范围内。
本发明的双链脂质修饰RNA，即使单独给与也能显示出优异的细胞内递送能力，所以导入细胞内时可以不使用用于向细胞内导入siRNA的现有基因导入试剂，或者也可以降低现有基因导入试剂的使用量。
本发明的双链脂质修饰RNA，通过被导入细胞内，可以抑制或阻碍靶基因的表达，因此该双链脂质修饰RNA，例如，在药物领域中，可以用于预防、减轻或治疗由该靶基因的表达引起的疾病。在药物领域中使用本发明的双链脂质修饰RNA时，该双链脂质修饰RNA与药学上允许的载体共同配合，以药物组合物的形式提供。
作为该药物组合物中使用的药学上允许的载体，可以根据药物组合物的使用形态适当选择，没有特别的限制，例如，可以举出精制水、糖水溶液、缓冲液、生理盐水、聚合物水溶液、不含RNase的水等水性载体、赋形剂等。
对该药物组合物中的双链脂质修饰RNA的配合比例，只要适当设定使其能够满足上述该双链脂质修饰RNA的适用量即可。例如可以举出相对于该药物组合物的总量，该双链脂质修饰RNA为0.001～50重量％，优选为0.01～10重量％，更优选为0.1～1重量％的比例。
另外，对该药物组合物的制剂形态，只要能够将双链脂质修饰RNA导入细胞内即可，没有特别的限制，例如可以举出溶液剂(包括糖浆等)、滴剂、注射剂等液体制剂；冻干制剂、干糖浆剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊)等固体制剂。另外，本发明的药物组合物为固体制剂时，可以在使用时加入注射用蒸馏水、无菌水等，再次溶解后使用。
另外，该药物组合物适用的疾病或症状，只要与靶基因的表达有关即可，没有特别的限制。对于靶基因与疾病的关系在该技术领域中是公知的。
另外，该药物组合物为了治疗人的疾病，可以用于来自人的细胞，另外，还可以用于治疗除人之外的动物(特别是除人之外的哺乳动物)。
实施例
以下，基于实施例详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1 5’双链脂质修饰RNA对荧光素酶基因表达的抑制效果
1.针对荧光素酶基因的双链脂质修饰RNA的合成
1-1.有义链RNA及反义链RNA的序列
设计含有21个及27个碱基长度的有义链RNA和21个及27个碱基长度的反义链RNA的双链RNA，所述双链RNA具有与海肾(renilla)荧光素酶相同的序列，且能够抑制海肾荧光素酶的基因表达。该双链RNA使用21个碱基长度的反义链和有义链时，可以形成在3’末端具有2个碱基的悬端的21个碱基长度的双链RNA，该双链RNA使用27个碱基长度的反义链和有义链时，可以形成两末端为平滑末端的27个碱基长度的双链RNA。使用的RNA的序列如下所述。
27nt dsRNA有义链L27A：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’(序列号1)
反义链L27B：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5’(序列号2)
21nt siRNA有义链L21A：5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’(序列号3)
反义链L21B：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG-5’(序列号4)
使用上述有义链RNA及反义链制作双链RNA。即，在universal buffer(林化成株式会社)中混合等摩尔的有义链及反义链单链RNA、在92℃下加热2分钟后，缓慢降低温度至4℃，由此制作双链RNA。合成的各种双链RNA如下进行确认：使用20％聚丙烯酰胺凝胶，在250V的条件下进行电泳60分钟，之后，用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience)对双链RNA进行染色，由此确认。
该双链RNA中，将在3’末端具有2个碱基的悬端的21个碱基长度的双链RNA作为si L21A/L21B，将作为平滑末端的27个碱基长度的双链RNA作为Ds L27A/L27B。
1-2.针对荧光素酶基因的双链脂质修饰RNA的合成
合成能够抑制荧光素酶基因表达的、在双链RNA的有义链的5’末端键合双链脂质的双链脂质修饰有义链RNA。在该双链脂质修饰有义链RNA中，双链脂质通过连接在上述有义链RNA5’末端的氨烷基(氨基修饰剂C6(Amino Modifier C6)；Glen Research)以共价键连接。通过在液相中使具有活性酯基的脂质化合物(以下称作“活性酯化的脂质化合物”)与对5’末端进行氨基化修饰的有义链RNA进行反应，合成双链脂质修饰有义链RNA(下述反应式1)。
反应式1
Figure BPA00001232850100201
R1及R2表示相同或不同的脂肪酸残基。
具体的合成法如下所述。为了将RNA的5’末端氨基化，可以在RNA固相合成上使用5’-氨基修饰剂C6(Glen Research)，按照常规方法(亚磷酰胺合成法)合成5’末端氨烷基修饰的有义链RNA。需要说明的是，经HPLC纯化、并经MALDI-TOF MS分析的上述5’末端氨烷基有义链RNA购自林化成株式会社。合成的5’末端氨烷基有义链RNA，在该末端(从5’末端侧起第1个核苷酸的磷酸残基)连接有-(CH2)6-NH2。通过使用UV分光光度计测定260nm处的吸光度算出合成的单链RNA的浓度。在缩合反应条件下，将该氨烷基修饰单链RNA与溶解在氯仿中的活性酯化双链脂质衍生物[DPPE-NHS(二棕榈酰基N-(琥珀酰亚胺基-戊二酰基)-L-α-磷脂酰乙醇胺(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine，Dipalmitoyl))、POPE-NHS(1-棕榈酰基-2-二油酰基N-(琥珀酰亚胺基-戊二酰基)-L-α-磷脂酰乙醇胺，(N-(succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine，1-Palmitoyl-2oleoyl))、DOPE-NHS(二油酰基N-(琥珀酰亚胺基-戊二酰基)-L-α-磷脂酰乙醇胺，(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine，Dioleoyl))、DMPE-NHS(二肉豆蔻酰基N-(琥珀酰亚胺基-戊二酰基)-L-α-磷脂酰乙醇胺(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine，Dimyristoyl))；(日本油脂公司制)]混合，合成双链脂质修饰有义链RNA。反应后，为了除去含有双链脂质修饰有义链RNA的反应液中的不需要的试剂，通过HPLC纯化反应液。HPLC纯化如下进行：使用A：100％20mM TEAA(pH7.0)、B：80％CH3CN/20mM TEAA(pH7.0)作为缓冲液，设定50分钟的线性梯度使10％缓冲液B变为100％缓冲液B，进行纯化。另外，纯化用柱使用CAP CELL(4.6×150mm，5μm；SHISEIDO)。HPLC分析结果的一个例子示于图1。将经HPLC纯化的双链脂质修饰有义链RNA冻干，使其溶解在纯水中后，通过UV光谱分析算出浓度及合成收率。
以下表示合成的双链脂质修饰有义链RNA的结构及收率。
Figure BPA00001232850100211
合成的双链脂质修饰有义链RNA，与反义链RNA形成双链，得到双链脂质修饰RNA。采用与上述同样的方法形成RNA的双链，通过20％聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(参见图2)。
2.双链脂质修饰RNA的降解酶抗性
研究了双链脂质修饰si L21A/L21B及Ds L27A/L27B的核酸酶抗性。进行如下实验：在37℃下，在含有10％FBS(三光纯药株式会社)的RPMI-1640培养基(Invitrogen)(最终量110μl)中，温育经调节使最终浓度为2μM的有义链5’-末端双链脂质修饰RNA(si L21A/L21B及Ds L27A/L27B)。在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h后分别取出10μl，将其添加到含有2μl加样染料(loading dye)的样品管中。为了终止分解反应，样品采集后迅速在液氮中冻干，在-20℃下保存。将得到的产物在250V下使用20％聚丙烯酰胺凝胶电泳70分钟。之后，用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience)对产物进行染色(染色条件参见产品手册)、用ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)进行凝胶分析。另外，作为对照，也同样评价了未修饰的si L21A/L21B及Ds L27A/L27B的核酸酶抗性结果。凝胶电泳的结果示于图3。
结果，未修饰的si L21A/L21B在含有血清的培养基中迅速地分解，可确认经1～2小时左右样品RNA消失。另一方面，脂质修饰双链si L21A/L21B(si DPPE-L21A/L21B)与si L21A/L21B相比显示出非常高的核酸酶抗性，即使在48小时后RNA仍然存在。另外，未修饰的Ds L27A/L27B也显示出高的核酸酶抗性，但是双链脂质修饰Ds L27A/L27B(Ds DPPE-L27A/L27B)显示出更高的核酸酶抗性。进而，还发现双链脂质修饰RNA与血清中蛋白质结合，提高RNA的分解酶抗性。
由上述结果首次发现：双链脂质修饰RNA与通常广泛使用的21siRNA相比具有明显更高的生物体内稳定性。
3.利用切酶对针对荧光素酶基因的双链脂质修饰RNA的加工
对合成的RNA及双链脂质修饰RNA在重组切酶作用下的加工进行了研究。切酶的切断实验如下进行：在20mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM NaCl及2.5mM MgCl2溶液中，准备10μl 0.5U重组切酶(GeneTherapy Systems)及将最终浓度调节至2μM的未修饰RNA及双链脂质修饰RNA置于样品管中，在设定为37℃的恒温箱中，温育12小时。之后，为了终止切酶的切断反应，向反应溶液中加入2μl切酶终止溶液(Gene Therapy Systems)，再加入2μl加样染料。将所得产物在250V下使用20％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳70分钟。之后，用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience)对产物进行染色(染色条件参见产品手册)，用ChemiImager 4000(Alpha Innotech公司)进行凝胶分析。另外，作为对照，对未修饰的21si RNA也进行电泳分析。其结果示于图4。
由得到的结果可知，未修饰的Ds L27A/L27B通过切酶的作用被加工成21个碱基长度的RNA，另外，可知27个碱基长度的双链脂质修饰RNA(Ds Lipid-L27A/L27B)也通过切酶的作用被加工成21个碱基长度的RNA及其他RNA。由上述结果可知，27个碱基长度的RNA即使与脂质结合，也会被切酶识别，受到加工。
另一方面，可知未修饰的si L21A/L21B没有被切酶加工，21个碱基长度的RNA中修饰了双链脂质的双链RNA(si Lipid-L21A/L21B)也没有被切酶加工。另外，与切酶蛋白共存的脂质修饰的双链si L21A/L21B，确认到分子量增大，由此也可以确认双链脂质修饰si L21A/L21B与切酶蛋白之间形成了复合体。
4.双链脂质修饰RNA对荧光素酶基因表达的抑制
以海肾荧光素酶为靶标，评价了合成的未修饰RNA及双链脂质修饰RNA的RNA干涉效果。将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞(人子宫颈癌细胞，东北大学老年医学研究所)分别接种在96孔板上，每孔为100μl，在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，向每孔中分别加入80μl不含有抗生素的新培养基，将表达萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的载体(psiCHECKTM-2Vector：Promega)和LipofectamineTM2000(商品名；Invitrogen)的复合溶液各10μl分别加入含有HeLa细胞的孔中。此处调节表达载体为每个孔0.02μg，另外，调节Lipofectamine TM 2000为每个孔0.2μl，用OptiMem(Invitrogen)调节至所需量。另外，为了形成复合体，使用OptiMem将表达载体与LipofectamineTM 2000混合后，在室温下温育30分钟。加入复合溶液后，在5％CO2存在下、于37℃培养细胞4小时。之后，含有与海肾荧光素酶的基因序列相同的反义序列的未修饰双链RNA及末端用双链脂质修饰RNA与LipofectamineTM 2000(Invitrogen)形成复合体，使最终浓度为0nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM，将10μl复合体溶液加入导入了表达载体的HeLa细胞中。此处，使每个孔的最终量为100μl。RNA与LipofectamineTM2000的复合溶液如下制备：每个孔中混合5μl的RNA水溶液与5μl的LipofectamineTM2000(0.2μl)OptiMem溶液，在室温下温育30分钟，由此制成。导入RNA后，培养48小时，使用Dula-GloTM荧光素酶分析系统(Promega)，利用发光计(MicroLumat LB96p：BERTHOLD)测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的表达量，并以萤火虫荧光素酶的表达量为对照，算出海肾荧光素酶的表达抑制效果。
结果示于图5。图5中“A”为使用双链脂质修饰21nt siRNA时的荧光素酶基因表达抑制的结果，B”为使用双链脂质修饰27nt dsRNA时的荧光素酶基因表达抑制的结果。另外，还同时评价了未修饰的21nt siRNA及27nt dsRNA。结果，确认了连接有双链脂质的21ntsiRNA及27nt dsRNA比未修饰的21nt siRNA及27nt dsRNA发挥更高的RNA干涉效果。
实施例2 5’双链脂质修饰RNA对VEGF基因表达的抑制效果
1.针对VEGF基因的双链脂质修饰RNA的合成
1-1.有义链RNA及反义链RNA的序列
设计含有27个及21个碱基长度的有义链RNA和27个及21个碱基长度的反义链RNA的双链RNA，所述双链RNA具有与VEGF(vascular endothelial growth factor：血管内皮生长因子)相同的序列、且能够抑制VEGF的基因表达。使用上述双链RNA，进行以下实验。需要说明的是，21siRNA为在有义链RNA及反义链RNA两者的3’末端具有2个碱基的悬端的双链RNA，27nt dsRNA为不具有悬端(单链区域)的完全双链RNA(有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均为平滑末端的双链RNA)。使用的27nt dsRNA及21si RNA的序列如下所述。
27nt dsRNA有义链v27A：5’-CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3’(序列号5)
反义链v27B：3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5’(序列号6)
21nt siRNA有义链v21A：5’-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3’(序列号7)
反义链v21B：3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5’(序列号8)
使用上述有义链RNA及反义链采用与实施例1同样的方法进行退火，形成双链，得到双链脂质未修饰RNA。通过采用与实施例1同样的方法使用20％丙烯酰胺凝胶电泳，确认双链形成。
1-2.针对VEGF基因的双链脂质修饰RNA的合成
合成了双链脂质修饰RNA，所述双链RNA在该双链RNA的有义链的5’末端连接有脂质，能够抑制VEGF基因表达。在该双链脂质修饰RNA中，双链脂质通过修饰上述有义链RNA的5’末端的氨烷基(氨基修饰剂C6；Glen Research)以共价键连接。双链脂质修饰的单链RNA(有义链)采用与实施例1相同的方法合成。合成的双链脂质修饰的有义链RNA的HPLC结果示于图6。需要说明的是，针对VEGF基因的双链脂质修饰的有义链RNA中，洗脱时间也与实施例1基本相同。
另外，以下表示针对VEGF基因的双链脂质修饰RNA的结构模型及收率。
合成的双链脂质修饰有义链RNA通过与反义链RNA形成双链，得到双链脂质修饰RNA。采用与实施例1同样的方法进行，通过20％聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认RNA双链的形成(参见图7)。
2.双链脂质修饰RNA的降解酶抗性
研究了双链脂质修饰si v21A/v21B及Ds v27A/v27B的核酸酶抗性。另外，作为对照还评价了未修饰的si L21A/L21B及DsL27A/L27B的核酸酶抗性结果。实验按照与上述实施例1同样的方法进行。凝胶电泳的结果示于图8。
结果，确认了未修饰的si v21A/v21B在含有血清的培养基中迅速地被分解，在1～2小时左右样品RNA消失。另一方面，双链脂质修饰si v21A/v21B(si DPPE-v21A/v21B)与si v21A/v21B相比显示出非常高的核酸酶抗性，即使在48小时后RNA仍然存活。另外，未修饰的Ds v27A/v27B也显示出高核酸酶抗性，但双链脂质修饰Ds v27A/v27B(Ds DPPE-v27A/v27B)显示出更高的核酸酶抗性。进而，还发现双链脂质修饰RNA与血清中的蛋白质结合，提高RNA的降解酶抗性。
由上述结果可知，双链脂质修饰RNA与通常广泛使用的21siRNA相比具有非常高的生物体内稳定性。
3.利用切酶对针对VEGF基因的双链脂质修饰RNA的加工
研究了利用重组切酶对合成的双链脂质未修饰RNA及双链脂质修饰RNA的加工。切酶的切断实验采用与实施例1同样的方法进行。其结果如示于图9。
由得到的结果可知，未修饰的Ds v27A/v27B通过切酶的作用被加工成21个碱基长度的双链RNA，另外，可知27个碱基长度的双链脂质修饰RNA(Lipid-Ds v27A/v27B)也通过切酶的作用被加工成21个碱基长度的RNA及其他RNA。由上述结果可知，27个碱基长度的RNA即使与脂质结合，也能被切酶识别而受到加工。
另一方面，可知未修饰的si v21A/v21B没有被切酶加工，21个碱基长度的双链RNA中用双链脂质进行修饰的RNA也没有被切酶加工。另外，与切酶蛋白共存的双链脂质修饰si v21A/v21B中，确认到了分子量增大，由此也可以确认脂质修饰的双链si v21A/v21B与切酶蛋白质之间形成了复合体。
4.双链脂质修饰RNA对VEGF基因表达的抑制
使用HeLa细胞(人子宫颈癌细胞，东北大学老年医学研究所)、A549细胞(人肺癌细胞，东北大学老年医学研究所)评价未修饰末端的si v21A/v21B、未修饰末端的Ds v27A/v27B、将有义链RNA的5’末端用双链脂质修饰的si v21A/v21B(si Lipid-v21A/v21B)及将有义链RNA的5’末端用双链脂质修饰的Ds v27A/v27B(DsLipid-v27A/v27B)对VEGF基因表达的抑制效果。另外，对不具有与VEGF基因相同的基因序列的RNA(27nt dsRNA(随机)，21ntsiRNA(随机))也同样地进行了评价。
按照以下操作进行实验。将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞、A549细胞接种到24孔板上，每孔500μl，在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，向孔中分别加入450μl不含抗生素的新培养基。此处，HeLa细胞使用MEM培养基，其他细胞使用PRMI-1640培养基。使含有与VEGF基因序列相同的反义序列的未修饰或双链脂质修饰RNA(25μl)与LipofectamineTM 2000(Invitrogen)溶液(25μl)形成复合体，将50μlRNA溶液加入到450μl上述细胞中。此处，每个孔的最终量为500μl。RNA与LipofectamineTM2000的复合溶液如下制备：每个孔内混合25μl的RNA水溶液与25μl的LipofectamineTM 2000(2μl)OptiMem溶液，在室温下温育30分钟。导入RNA后，在37℃、5％CO2存在下温育48小时。培养后，将细胞用PBS(-)清洗3次，使用RNeasy Plus Mini kit(Qiagen)提取细胞中的总RNA。之后，为了测定VEGF的mRNA量进行RT-PCR反应。使用Qiagen OneStep RT-PCR Kit(Qiagen)进行RT-PCR反应，使用5’-CCC TGA TGA GAT CGAGTA CAT CTT-3’(序列号9)及5’-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3’(序列号10)作为VEGF用PCR引物。另外作为对照，用同样的方法测定GAPDH基因。使用5’-GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3’(序列号11)及5’-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3’(序列号12)作为GAPDH用引物。RT-PCR反应如下进行，在50℃下进行RT(逆转录)反应30分钟，作为PCR反应将在92℃下进行30秒双链分离反应、在55℃下进行30秒退火反应、在68℃下进行45秒延伸反应，反复进行25～28次(因使用的细胞而不同)，最后在68℃下温育10分钟，降低温度至4℃，结束反应。按照Qiagen OneStep RT-PCR Kit(Qiagen)的反应条件制备用于RT-PCR的试剂、Total-RNA、引物等。RT-PCR反应后，加入2μl加样染料，使用2％琼脂糖凝胶确认由VEGF及GAPDH的mRNA产生的RT-PCR产物。基因表达抑制效果的评价如下进行：假定对照细胞(未导入双链RNA的细胞)的VEGF基因表达量为100％时，测定导入了RNA(包括未修饰、双链脂质修饰)的细胞的VEGF表达量。另外，各细胞间的表达量的误差根据对照基因(GAPDH)的基因表达量进行修正。
图10表示以VEGF为靶标并且RNA浓度为50nM时，未修饰的RNA及双链脂质修饰RNA的RNA干涉效果的结果。图10中，A及B为表示未修饰RNA及双链脂质修饰RNA对HeLa细胞的VEGF基因表达抑制效果的图，C及D为表示未修饰RNA及双链脂质修饰RNA对A549细胞的VEGF基因表达抑制效果的图，A及C为使用21个碱基长度的双链RNA的情况，B及D为使用27个碱基长度的双链RNA的情况。
结果，使用双链脂质修饰si v21A/v21B，观察对HeLa细胞的基因表达抑制能力时(A)，在所有双链脂质修饰RNA中均显示出比未修饰RNA更高的基因表达抑制能力。特别是在si DPPE-v21A/v21B中显示出非常高的基因表达抑制能力。另外，即使在使用双链脂质修饰Ds v27A/v27观察到对HeLa细胞的基因表达抑制能力时(B)，在所有双链脂质修饰RNA中均显示出比未修饰RNA更优异的基因表达抑制能力。另外在Ds DPPE-v27A/v27B中确认到非常优异的基因表达抑制能力。
在观察到对A549细胞的VEGF基因表达抑制能力的情况下，使用脂质修饰si v21A/v21B时(C)，在所有双链脂质修饰RNA中均显示出比未修饰RNA更高的基因表达抑制能力。特别在si DPPE-v21A/v21B中显示出非常高的基因表达抑制能力。另外，使用双链脂质修饰Ds v27A/v27观察对A549细胞的基因表达抑制能力时(D)，结合有DPPE或DMPE的RNA中均显示出比未修饰RNA更高的基因表达抑制能力。
由上述结果可知，在双链RNA的有义链RNA的5’末端上共价键合双链脂质的、21个碱基长度及27个碱基长度的siRNA及dsRNA，与未修饰的各双链RNA相比，显示出更高的基因表达抑制能力。特别是可以确认结合有DPPE的双链RNA具有非常优异的基因表达抑制能力。另外，在结合有DMPE或DOPE的RNA中，也显示出比未修饰RNA更高的基因表达抑制能力。
由此可知，以此次使用的VEGF为靶标的双链RNA的序列特异性高，抑制靶基因的表达。另外，该实验结果也暗示，通过在双链RNA上结合双链脂质，可以降低对细胞的副作用。
5.双链脂质修饰RNA的细胞导入率的研究
将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞(人子宫颈癌细胞，东北大学老年医学研究所)、A549细胞(人肺癌细胞，东北大学老年医学研究所)接种到24孔板中，每孔1ml，在含有10％胎牛血清(FBS：三光纯药株式会社制)及抗生素的培养基中，在5％CO2存在下，于37℃进行培养。此处使用的抗生素及培养基为：HeLa细胞使用MEM培养基(Invitrogen公司)作为培养基，其他细胞使用RPMI-1640(Invitrogen公司)作为培养基。在荧光标记化的双链脂质修饰RNA导入前，将上述培养基更换成不含抗生素的培养基(450μl)。荧光标记化的双链脂质修饰RNA使用将21nt及27nt反义链RNA的5’末端进行6-FAM标记化的RNA，使未修饰的21nt及27nt有义链RNA与5’末端用双链脂质修饰的21nt及27nt有义链RNA形成双链。细胞导入实验中，为了使荧光标记化双链脂质修饰RNA与LipofectamineTM2000(Invitrogen公司制)形成复合体，分别混合10μl10μM的荧光标记化寡核苷酸水溶液与15μl OptiMem溶液的混合溶液25μl，2μl Lipofectamine TM 2000(Invitrogen公司制)溶液与23μlOptiMem溶液的混合溶液25μl，将所得50μl的混合溶液在室温下温育30分钟。将经调节的50μl的荧光标记化寡核苷酸复合体添加到上述准备的450μl细胞(双链RNA的最终浓度：200nM)中，在5％CO2存在下、于37℃培养4小时。之后，用PBS(-)或培养基清洗细胞3次，使用共聚焦激光荧光显微镜及流式细胞术评价细胞导入。
共聚焦激光荧光显微镜使用Radiance 2000系统(Bio Rad公司)，使用氩激光观察荧光。流式细胞术使用coulter EPICS XL细胞计数器(Beckman coulter)，测定每10,000个细胞的细胞导入率。在流式细胞仪分析中使用XL EXPO32TM软件(Beckman coulter)。
结果示于图11。图11-1中的A及B为以LipofectamineTM 2000作为导入剂、使用荧光标记的21个碱基长度(si v21A/v21B)及27个碱基长度的RNA(si v21A/v21B及si v27A/v27B)、及有义链的5’末端用双链脂质修饰的RNA时对HaLa细胞的细胞导入率的结果。另外，图11-2中的C及D为以LipofectamineTM 2000作为导入剂、使用荧光标记的21个碱基长度(si v21A/v21B)及27个碱基长度的RNA(si v21A/v21B及si v27A/v27B)、及有义链的5’末端用双链脂质修饰RNA时对A549细胞的细胞导入率的结果。
结果，确认了在LipofectamineTM 2000存在下，未修饰RNA及双链脂质修饰RNA全部导入到细胞(HeLa细胞、A549细胞)中。特别是有义链的5’末端用双链脂质修饰的27个碱基长度的RNA与未修饰的RNA相比，使用共聚焦荧光显微镜及流式细胞术观测到非常高的细胞导入率。另外，通过共聚焦荧光显微镜观察，暗示了该双链脂质修饰RNA在细胞内活跃地局部化到细胞质中。特别在作为双链脂质结合有DPPE或DMPE的27个碱基长度的双链RNA中，观测到优异的细胞导入率。
另外，确认了在21个碱基长度的RNA上结合有双链脂质的双链脂质修饰RNA在LipofectamineTM 2000存在下也具有高的细胞导入率。特别是确认了作为双链脂质结合有DMPE的21个碱基长度的RNA具有优异的细胞导入率。
由上述结果发现：通过在双链RNA的有义链RNA的5’末端上共价键合脂质，可以显著地提高了细胞导入率，并且可以在细胞内局部化到细胞质中。
实施例3 针对WT1基因的双链脂质修饰RNA的合成
使用与上述实施例1及2不同的方法，合成了能够抑制WT1基因表达的、在双链RNA的有义链RNA的5’末端上键合有双链脂质的双链脂质修饰有义链RNA。
首先，分别按照公知的方法合成有义链RNA及反义链RNA。接着，使用5’-氨基修饰剂C6(Glen Research)按照通常的方法(亚磷酰胺合成法)对有义链RNA的5’末端进行氨烷基化，合成5’末端氨烷基修饰有义链RNA。合成的5’末端氨烷基修饰有义链RNA，从5’末端侧起第1个核苷酸的磷酸残基通过氧原子与-(CH2)6-NH2键合。合成的5’末端氨烷基修饰有义链RNA与反义链RNA形成双链，得到双链RNA(以下，记作为氨烷基修饰的双链RNA)。需要说明的是，采用与上述同样的方法形成RNA双链。在缩合反应条件下，将如上所述得到的氨烷基修饰的双链RNA与溶解在氯仿中的活性酯化双链脂质衍生物[DPPE-NHS(二棕榈酰基N-(琥珀酰亚胺基-戊二酰基)-L-·-磷脂酰乙醇胺，(N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-·-Phosphatidylethanolamine，Dipalmitoyl))，(日本油脂社制)]，混合，合成双链脂质修饰RNA(DPPE修饰的双链RNA)。反应后，为了除去含有双链脂质修饰RNA的反应液中的不需要的试剂，将反应液通过HPLC纯化。HPLC纯化如下进行：使用A：100％20mM TEAA(pH7.0)，B：80％CH3CN/20mM TEAA(pH7.0)作为缓冲液，设定50分钟的线性梯度使10％B缓冲液变为100％B缓冲液。另外，纯化用柱使用CAP CELL(4.6×150mm，5μm；SHISEIDO)。HPLC分析结果的一个例子示于图12。将经HPLC纯化的双链脂质修饰RNA冻干，使溶解在纯水中后，通过V光谱分析算出浓度及合成收率。双链脂质修饰RNA通过20％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行确认(图13)。
以下表示合成的双链RNA的结构及收率。
Figure BPA00001232850100321
Figure IPA00001232849600021
Figure IPA00001232849600031

Claims (17)

1.一种双链脂质修饰RNA，其特征在于，所述双链脂质修饰RNA为双链RNA，包含具有与靶基因中的靶序列互补的碱基序列的有义链RNA及具有与所述有义链RNA互补的碱基序列的反义链RNA，并且能够抑制所述靶基因的表达，双链脂质直接或通过连接体连接到所述有义链RNA的从5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个核苷酸上。
2.如权利要求1所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述有义链RNA的5’末端侧为平滑末端，并且所述有义链RNA的3’末端侧具有平滑末端或悬端。
3.如权利要求1所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均具有悬端。
4.如权利要求1～3中任一项所述的双链脂质修饰RNA，其中，构成所述有义链RNA的核苷酸的数量为21～27个。
5.如权利要求2所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均为平滑末端，所述有义链RNA及所述反义链分别由27个核苷酸构成。
6.如权利要求2所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述有义链RNA的5’末端侧及3’末端侧均为平滑末端，所述有义链RNA及所述反义链分别由23个核苷酸构成。
7.如权利要求2所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述有义链RNA的5’末端侧为平滑末端，所述有义链RNA由25个核苷酸构成，并且所述反义链由23个核苷酸构成。
8.如权利要求3所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述有义链RNA及所述反义链分别由21个核苷酸构成。
9.如权利要求1所述的双链脂质修饰RNA，其中，构成所述双链脂质的2个疏水基相同或者不同，为碳原子数为6～50的饱和脂肪酸残基或不饱和脂肪酸残基。
10.如权利要求1所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述双链脂质为甘油磷脂、甘油糖脂、二酰基甘油、或神经酰胺。
11.如权利要求1所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述双链脂质为甘油磷脂。
12.如权利要求11所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述双链脂质为磷脂酰乙醇胺。
13.如权利要求12所述的双链脂质修饰RNA，其中，所述双链脂质为选自二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油基-磷脂酰乙醇胺及二油酰基磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
14.如权利要求1所述的双链脂质修饰RNA，其中，脂质通过连接体连接到所述有义链RNA的从5’末端起第1～6个核苷酸的至少一个核苷酸上，所述连接体的结构由下述通式(L-27)表示，
-CO-(CH2)n3-CO-NH-(CH2)n4-(L-27)
式中，n3及n4相同或者不同，表示1～20的整数。
15.一种药物组合物，含有权利要求1～14中任一项所述的双链脂质修饰RNA和药学上允许的载体。
16.权利要求1～14中任一项所述的双链脂质修饰RNA在制备用于抑制靶基因表达的药物中的应用。
17.一种抑制靶基因表达的方法，包括将权利要求1～14中任一项所述的双链脂质修饰RNA导入细胞内的步骤。
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