JP4605799B2 - Ｒｎａ干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド - Google Patents

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Description

（発明の分野）
本発明は修飾ポリヌクレオチドに関する。
（背景）
哺乳類細胞でのＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシング（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）は、現在のところ、最低でも３通りの異なる制御レベルが関係していると考えられている。すなわち、（ｉ）転写不活性化（ｓｉＲＮＡ誘導ＤＮＡおよびヒストン・メチル化）、（ｉｉ）小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって誘導されたｍＲＮＡの分解、ならびに（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ誘導転写減衰である。ｓｉＲＮＡによって発生するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、長時間にわたって効果があり、細胞分裂が多数繰り返されても効果を示すことができる。したがって、ｓｉＲＮＡ媒介方法を介して遺伝子機能にアクセスする能力は、過剰発現遺伝子に対する治療法を開発するのと同様に、遺伝子機能分析、薬物標的の確証（バリデーション）、および広範囲にわたるゲノム研究を促す刺激的かつ有益なツールを意味する。さらに、ＲＮＡｉは治療的なツールとして幅広い可能性がある。
ＲＮＡ代謝に関する分野での比較的最近の発見によって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の取り込みがＲＮＡｉを誘導し得ることが明らかになった。
これらの状況下では、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＩＩＩ型ＲＮアーゼは、長いｄｓＲＮＡを処理してｓｉＲＮＡにするもので、該ｓｉＲＮＡはその後ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と協力して配列特異的に標的転写産物の分解をもたらす。この現象は、多種多様な生物体で見られた。残念なことに、哺乳動物細胞では、長いｄｓＲＮＡを用いたＲＮＡｉの誘導は、ある程度の成功が得られたに過ぎなかった。主に、このような無効性は、インターフェロン反応の誘導によるものであり、該反応は、標的化されたものとは対照的に、一般的なタンパク質合成の阻害をもたらす。
最近では、培養液中で哺乳動物細胞に合成ｓｉＲＮＡを導入する場合、標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害を、インターフェロン反応の誘導を伴うことなく、実現することができる。これらの短い二本鎖は、モル濃度以下（ｓｕｂ−ｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）で触媒的に作用して、９５％を越える細胞内標的ｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡ活性のメカニズム、ならびにその用途のいくつかについては、Ｐｒｏｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｃｅｒ，Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．，２００２ Ｎｏｖ．，１，２１（２１）：５８６４−５８７４；Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＤＥ−４ Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＲＤＥ−１，ＤＣＲ−１ ａｎｄ ａ ＤｅｘＨ−ｂｏｘ Ｈｅｌｉｃａｓｅ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡｉ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，Ｃｅｌｌ．２００２，Ｊｕｎｅ ２８，１０９（７）：８６１−７１；Ｋｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｉｍｉｎｇ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ；およびＭａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡｓ Ｇｕｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ＲＮＡｉ，Ｃｅｌｌ ２００２，Ｓｅｐｔ．６，１１０（５）：５６３に記載されている。
ｓｉＲＮＡを用いて作業をおこなう場合、解決しなければならない主要な問題が４つある。すなわち、（ｉ）機能性、（ｉｉ）特異性、（ｉｉｉ）送達方法、および（ｉｖ）安定性である。機能性とは、特定のｓｉＲＮＡが所望の標的をサイレンシングする能力のことをいう。機能性を改善するための方法は、例えば、例えば、米国特許出願第１０／７１４，３３３号の主題である。特異性とは、特定のｓｉＲＮＡが、所望の標的、しかもその標的のみをサイレンシングする能力のことをいう。したがって、特異性は、オフ・ターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ）を最小限化することを意味する。送達方法は、ユーザが特定のｓｉＲＮＡを細胞に導入する手段であり、例えばベクターまたはｓｉＲＮＡそれ自体の修飾を用いることを含むものであってもよい。安定性とは、細胞内または細胞外環境に存在する酵素または他の有害な物質による分解を抑えるｓｉＲＮＡの能力のことをいう。例えば、裸ｓｉＲＮＡ分子を血液、血清、または血清含有培地に導入する場合、裸ｓｉＲＮＡ分子は安定ではなく、ほとんどが素早く分解されて裸ｓｉＲＮＡ分子の効力が減少または除去される。
本発明は、特異性を増加または減少させること、および／または安定性を増加させることができるｓｉＲＮＡに対する修飾をおこなうことで、第２および第４の問題（すなわち、特異性および安定性）を解決する。
（発明の要旨）
本発明は、ＲＮＡ干渉を実施するための組成物および方法に関する。一般に、本明細書に記載されたｓｉＲＮＡ化学修飾は、それが結合した分子の２つの重大な性質、すなわち安定性と特異性とに影響を及ぼす。安定性に影響を及ぼすそのような修飾は、核酸を分解させる傾向があるヌクレアーゼまたは他の因子を含む血液、血清、血清含有培地、および他の生物物質への曝露を必要とする応用での使用にとって、特に有利である。特定の標的に向けられるｓｉＲＮＡによって誘導されたオフ・ターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ）の度合いを減少させる修飾は、研究および治療的な設定にとって特に有益である。実質的にＲＮＡｉ適用を改善する修飾の多数の異なる組み合わせが開示されており、またこれらの組み合わせは最適サイレンシング試薬、形質移入制御、およびエクサエクオ（ｅｘａｅｑｕｏ）試薬の設計に適用可能である。
第１の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド単位から構成されるポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを有するｓｉＲＮＡを提供する。
第２の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド単位から構成されるポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するｓｉＲＮＡを提供する。
第３の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖と、アンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するｓｉＲＮＡを提供する。
第４の実施形態によれば、本発明は、センス鎖と、アンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するｓｉＲＮＡを提供し、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを有する。
第５の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖と、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミン修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、および２’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるコンジュゲートとを有し、ポリリボヌクレオチドが１８個と３０個との間のヌクレオチド塩基対を含むｓｉＲＮＡを提供する。
第６の実施形態によれば、本発明は以下の構造の一つを含む。
Figure 0004605799
 式中、Ｂ１およびＢ２の各々は、窒素塩基、複素環、または炭素環式化合物であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ、およびＮからなる群から選択され、Ｗは、ＯＨ、リン酸塩、リン酸エステル、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、修飾ヌクレオチド間連結、コンジュゲート、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、Ｒ１は、オルトエステルであり、Ｒ２は、２’−Ｏ−アルキル基、アルキル基、アミン、ハロゲンからなる群から選択され、ならびにＹはヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。Ｂ１とＢ２とのあいだの破線は、窒素含有塩基間の水素結合による相互作用を示す。
第７の実施形態によれば、本発明はＲＮＡ干渉を実施する方法を提供する。この方法は、ｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことを含み、このｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも１つが、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含む。
第８の実施形態によれば、本発明はＲＮＡ干渉を実施する別の方法を提供する。この方法は、ｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことを含み、このｓｉＲＮＡはセンス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成される。この実施形態によれば、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが２’修飾ヌクレオチドから構成される。
本発明の第１〜第８の実施形態の組成物は、ヌクレアーゼ分解に対して耐性を示すｓｉＲＮＡを与えることができ、その一方で生物学的機能性を保つ。例えば、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを持つｓｉＲＮＡ（例えば、センス鎖上のもの）と少なくとも１つの他の修飾（例えば、アンチセンス鎖上の適当な位置にあるもの）とを用いることで、ＲＮＡ干渉用途での機能性を保ちながら安定性を高めることができる。さらに、ＲＮＡ干渉用途で、コンジュゲートと共に、１種類以上の２’修飾を持つｓｉＲＮＡおよび／または修飾ヌクレオチド間連結を用いることによっても、各々の鎖上にオルトエステル修飾が存在しない場合でも、機能性を保ちながら安定性を高めることができる。
第９の実施形態によれば、本発明はＲＮＡ干渉を実施する方法を提供するもので、該方法は、ｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことを含み、このｓｉＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらにセンス鎖が実質的に非機能的である。
第１０の実施形態によれば、本発明はＲＮＡ干渉を実施する方法を提供するもので、該方法は、ｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことを含み、このｓｉＲＮＡが、（ａ）コンジュゲートと、（ｂ）少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、実質的に非機能的であるセンス鎖と、（ｃ）少なくとも１つの２’−フッ素修飾を含むアンチセンス鎖とを含み、センス鎖とアンチセンス鎖とが１８〜３０塩基対の二本鎖を形成する。
第１１の実施形態によれば、本発明は、
（ａ）（ｉ）第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドであって、第１の２’−Ｏ−アルキル・センス修飾を含む第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の２’−Ｏ−アルキル・センス修飾を含む第２の５’末端センス・ヌクレオチドである、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドと、
（ｉｉ）少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、から構成されるセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの２’ハロゲン修飾ピリミジン・ヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、５’炭素位がリン酸化された第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖と、
から構成され、
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、１８と３０との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、ｓｉＲＮＡを提供する。
第１１の実施形態の分子を、標的のサイレンシングに用いること、および／あるいは対照として用いることも可能である。これらの分子は、蛍光標識等の標識、および／または第３の２’−Ｏ−アルキル／センス修飾を含む第３の５’末端センス・ヌクレオチドを、さらに含むものであってもよい。
第１２の実施形態によれば、本発明は、
（ａ）（ｉ）第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドであって、第１の２’−Ｏ−アルキル・センス修飾を含む第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の２’−Ｏ−アルキル・センス修飾を含む第２の５’末端センス・ヌクレオチドである、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドと、
（ｉｉ）少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、
から構成されるセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、第１の２’−Ｏ−アルキル・アンチセンス修飾を含む第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第２の２’−Ｏ−アルキル・アンチセンス修飾を含む第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドである、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと、
（ｉｉ）少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドであって、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび上記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドと、
から構成されるアンチセンス鎖と、
から構成され、
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、１６と２８との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、ｓｉＲＮＡを提供する。
好ましくは、第１２の実施形態の分子もまた、例えば蛍光色素であってもよい標識を含み、ならびに／または第３の２’−Ｏ−アルキル・センス修飾を含む第３の５’末端センス・ヌクレオチドおよび／もしくは第３の２’−Ｏ−アルキル・アンチセンス修飾を含む第３の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドを含む。第１２の実施形態の分子は、例えば１９〜２５塩基対、または例えば１９〜２８塩基対の二本鎖を形成することができる。
第１３の実施形態によれば、本発明は、
（ａ）第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖であって、この第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第1の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されてる、アンチセンス鎖と、
（ｂ）第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成されるセンス鎖であって、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を有し、また上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を有する、センス鎖と、
を含む、ｓｉＲＮＡを提供する。
好ましくは、上記２’−修飾が’２’−Ｏ−アルキル修飾である。この実施形態によれば、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、少なくとも実質的に相補的である１８〜３０塩基対を、好ましくは含む。
第１４の実施形態によれば、本発明は、ヘアピンｓｉＲＮＡを形成することができる単分子のｓｉＲＮＡに関する。この単分子ｓｉＲＮＡは、
（ａ）アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化される、アンチセンス領域と、
（ｂ）センス領域であって、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を有し、第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を有する、センス領域と、
（ｃ）上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域と、
を含む。
この第１４の実施形態によれば、センス領域およびアンチセンス領域が少なくとも実質的に相補的であり、安定な二本鎖を形成することが可能である。第１３の実施形態と同様に、この第１４の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域が、好ましくは１８〜３０塩基対を含む二本鎖を形成する。好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流である。
第１５の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ｓｉＲＮＡをさらすことを含むもので、上記ｓｉＲＮＡがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、
（ａ）上記センス鎖が、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を有し、第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を有し、ならびに
（ｂ）上記アンチセンス鎖が、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されている。
第１６の実施形態によれば、オフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ヘアピンを形成することができる修飾された単分子のｓｉＲＮＡをさらすことを含み、上記単分子ｓｉＲＮＡが、アンチセンス領域とセンス領域とから構成され、
（ａ）上記センス鎖が、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を有し、第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を有し、
（ｂ）上記アンチセンス鎖が、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されおり、さらに、
（ｃ）上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域を含む。
好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流に位置している。
第１７の実施形態によれば、本発明はｓｉＲＮＡに関するもので、該ｓｉＲＮＡは、
（ａ）アンチセンス鎖であって、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第１の２’炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第２の２’炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第１の５’末端のアンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位で上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
（ｂ）センス鎖であって、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を有し、第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を有する、センス鎖と、
を含む。
好ましくは、上記２’炭素修飾が２’−Ｏ−アルキル修飾である。この第１７の実施形態によれば、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、好ましくは、少なくとも実質的に相補的である１８〜３０塩基対を含む。
第１８の実施形態によれば、本発明はヘアピンｓｉＲＮＡを形成することができる単分子ｓｉＲＮＡに関するもので、該単分子ｓｉＲＮＡは、
（ａ）アンチセンス領域であって、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、
第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第１の２’炭素アンチセンス修飾を含み、第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第２の２’炭素アンチセンス修飾を含み、さらに上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位で上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化化されている、アンチセンス領域と、
（ｂ）センス領域であって、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
（ｃ）上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置するループ領域と、
を含む。
この第１８の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域が実質的に相補的であり、安定な二本鎖を形成することが可能である。第１４の実施形態に類似して、この第１８の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域は、好ましくは、少なくとも実質的に相補的である１８〜３０塩基対を含む二本鎖を形成する。好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流に位置している。
第１９の実施形態によれば、本発明は、オフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または該標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ｓｉＲＮＡをさらすことを含み、該ｓｉＲＮＡがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、
（ａ）上記センス鎖が、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を有し、第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を有し、
（ｂ）上記アンチセンス鎖が、第１の２’炭素アンチセンス修飾を有する第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第２の２’炭素アンチセンス修飾を有する第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、該第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位で第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている。
第２０の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は標的核酸に対して、または該標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ヘアピンｓｉＲＮＡを形成することができる単分子のｓｉＲＮＡをさらすことを含み、上記単分子ｓｉＲＮＡが、アンチセンス領域およびセンス領域を含み、
（ａ）上記センス領域が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を有し、また上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を有し、
（ｂ）上記アンチセンス領域が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第１の２’炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第２の２’炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第１の５’アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位で、上記第１の５’アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されており、
（ｃ）ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している。
好ましくは、上記ループ領域が上記アンチセンス領域の下流にある。
本発明は、ｓｉＲＮＡ適用のための制御、トラッキング剤、およびエクサエクオ（ｅｘａｅｑｕｏ）剤も提供する。これらの薬剤は、リン酸化５’末端アンチセンス・ヌクレオチドを含まないという点を除いて、第１７および第１８の実施形態の分子を含む。したがって、これらの薬剤は、（ｉ）各々が２’炭素アンチセンス修飾、好ましくは２‘−Ｏ−アルキル修飾、より好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を含む第１および第２（または第１、第２、および第３）の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと、（ｉｉ）各々が２’炭素センス修飾、好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾、より好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を含む第１および第２（または第１、第２、および第３）の５’末端センス・ヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、例えば蛍光標識であり、また第１の５’末端センス・ヌクレオチド上に位置している標識以外の他のヌクレオチドが、いずれも修飾を受けていない。また、２’−Ｏ−アルキル基による１つ以上のセンス・ピリミジンの修飾、および／または２’−ハロゲン基による１つ以上のアンチセンス・ピリミジンの修飾の修飾、あるいは／またはセンスおよび／もしくはアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’炭素上にあるブロック基があってもよい。
本発明の他の利点および実施形態ならびにさらなる利点および実施形態をより良く理解するために、実施例と関連した以下の説明について言及するもので、その範囲は添付した特許請求の範囲に記述されている。
本発明の好ましい実施形態は、いかなる形であれ本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、例証および記述を目的として選択されている。本発明のいくつかの態様の好ましい実施形態の利点は、添付の図面に示される。
（詳細な説明）
ここで、本発明を好ましい実施形態と関連させて説明する。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提示されており、いかなる形であれ、本発明を制限することを意図したものではなく、またそのように解釈されてはならない。この開示を読むことで当業者にとって容易に理解されうる全ての代替、修飾、および等価物は、本発明の精神および範囲のなかに包含される。
この開示は、ＲＮＡ干渉を実行するための組成物および方法についてのプライマーではない。当業者に知られている基礎概念については、詳しくは説明しなかった。
本発明は、ｓｉＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングを含むＲＮＡ干渉を実施するための組成物および方法に関する。本発明、修飾ポリヌクレオチド、およびその誘導体を用いることで、ＲＮＡ干渉用途の効率を改善することが可能である。
特に明記しない限り、以下の用語および表現は、以下で規定される意味を持つ。
（アルキル）
用語「アルキル（ａｌｋｙｌ）」とは、飽和または不飽和、さらに置換または非置換型であるヒドロカルビル部分のことをいう。それは、直鎖状、分岐状、環状、および／または複素環状であり、かつエーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸塩等の官能基を含む部分から構成されるものであってもよい。
典型的なアルキル基として、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、およびより大きい炭素数のアルキル基、同様に２−メチルプロピル、２−メチルー４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロイル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチロクチル、６−プロピル−６−ブチロクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、および２−エチルヘキシルが挙げられる。上記用語アルキルはまた、アルケニル基、例えばビニル、アリル、アラルキル、およびアルキニル基も包含する。
アルキル基内での置換として、任意の原子または基を含むことができる。そのことはアルキル部分で許容され、限定されるものではないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、ならびに酸素が挙げられる。一例として、アルキル基は、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ、ニトロソまたはニトリル基等の修飾と、イミダゾール、ヒドラジノまたはヒドロキシルアミノ基等のヘテロ環、イソシアネートまたはシアネート基、スルホキシド、スルホン、ジスルフィド等の硫黄含有基を、含むこともできる。
さらに、アルキル基はまた、ヘテロ置換を含むものであってもよく、このような置換では、炭素原子が、例えば窒素、酸素、もしくは硫黄によって置換される。複素環置換は、１つ以上のヘテロ原子を持つアルキル環のことをいう。ヘテロ環部分の例として、限定されるものではないが、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリドンが挙げられる。
（２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド）
「２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド（２’−Ｏ−ａｌｋｙｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という成句は、ヌクレオチド単位のことをいい、該ヌクレオチド単位は糖部分、例えば、該糖の２’位に位置した炭素原子とアルキル基との両方に酸素原子が結合するようにして２’位で修飾されるデオキシリボシル部分を持つ。
（アミンおよび２‘アミン修飾ヌクレオチド）
用語「アミン（ａｍｉｎｅ）」とは、例えば、１、２、または３つの水素原子を他の基（例えば、アルキル基）で置き換えることで、アンモニアから直接または間接的に誘導されることをいう。一級アミンは、一般構造ＲＮＨ２を有し、二級アミンは一般の構造Ｒ２ＮＨを有する。成句「２’アミン修飾ヌクレオチド」とは、糖の２’位に付着したアミンまたは窒素含有基によって修飾される糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。
アミンという用語として、限定されるものではないが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、多環式アミン、ヘテロ原子置換アリールおよびアルキルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルフォリン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、２，６−ジメチルピペリジン、ピペラジン、ならびにヘテロ原子置換アルキルもしくはアリール二級アミンが挙げられる。
（アンチセンス鎖）
本明細書で用いられるフレーズ「アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）」とは、目的とするところの標的核酸に対して、実質的または１００％相補的であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一領域のことをいう。アンチセンス鎖は、ポリヌクレオチド領域（すなわちＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＲＮＡ／ＤＮＡ）から構成可能である。例えば、アンチセンス鎖は、一分子の伝令ＲＮＡ、ｍＲＮＡではないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡ）、あるいはコードまたは非コードのＤＮＡ配列に対して全体的または部分的に相補的であってもよい。フレーズ「アンチセンス鎖」として、２本の異なる鎖から形成される両方のポリヌクレオチドのアンチセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子のｓｉＲＮＡとが挙げられる。フレーズ「アンチセンス鎖」および「アンチセンス領域（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。アンチセンス鎖を、低分子および／またはコンジュゲートの多様な群によって修飾させることができる。
（２’炭素修飾）
フレーズ「２’炭素修飾（２’ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、糖部分（例えば２’位で修飾されるデオキシリボシル部分）を持つヌクレオチド単位のことをいう。この位置で、糖の２’位に位置した炭素原子と、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロピル、２’−Ｏ−ブチル、２’−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、および２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）等のアルキル基との両方に、酸素原子が付着するようにして、「２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド」が修飾を受ける。「２’炭素センス修飾」とは、センス鎖上またはポリヌクレオチドのセンス領域内にあるヌクレオチドの２’炭素位における修飾のことをいう。「２’炭素アンチセンス修飾」とはアンチセンス鎖上またはポリヌクレオチドのアンチセンス領域内にあるヌクレオチドの２’炭素位における修飾のことをいう。
（相補性）
用語「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力のことをいう。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって、概ね形成される。相補性ポリヌクレオチド鎖または領域は、ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）方式（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）で塩基対を形成することができ、あるいは安定な二本鎖を形成することを可能とする他の任意の方法で塩基対を形成することができる。
完全な相補性または１００％相補性は、一方のポリヌクレオチド鎖または領域の各々のヌクレオチド単位が他方のポリヌクレオチド鎖または領域の各のヌクレオチドと水素結合を形成することができる状況のことをいう。完全な相補性に満たないことは、２本の鎖または２つの領域の、すべてではないがいくつかのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができることをいう。例えば、２つの２０量体に関して、もし各鎖上の２つの塩基対のみが互いに水素結合することができる場合、それらのポリヌクレオチド鎖または領域の相補性が１０％であることを示している。同じ例で、各鎖または各領域上の１８塩基対が互いに水素結合することができる場合、ポリヌクレオチド鎖は９０％相補性を示す。実質的な相補性とは、９０％以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖または領域のことをいう。
（コンジュゲートおよび末端コンジュゲート）
用語「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、安定性の増加および／またはそれ自体によるｓｉＲＮＡの取り込みの促進をおこなう等、ｓｉＲＮＡの物性を変える分子または部分（ｍｏｉｅｔｙ）のことをいう。「末端コンジュゲート（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、ｓｉＲＮＡの３’および／または５’末端に直接またはリンカーを介して付着することが可能である。内部コンジュゲートは、直接またはリンカーを介して間接的に、塩基、リボースの２’位、または他の適当な１つの位置または複数の位置、例えば５−アミノアリル・ウリジンに付着することが可能である。
互いに付着しない異なる２本の鎖を持つｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡが単分子またはヘアピンｓｉＲＮＡではない）では、該鎖の一方または両方の５’末端がコンジュゲートを持つことができ、さらに／またはｓｉＲＮＡを含む該鎖の一方または両方の３’末端がコンジュゲートを持つことができる。
コンジュゲートは、例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、炭水化物、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール）、さらにまたこれらの物質類の全ての類似体または誘導体であってもよい。コンジュゲートのさらなる例として、ステロイド（例えば、コレステロール）、リン脂質、ジおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、不飽和または置換を含む、もしくは含まない炭水化物、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類も挙げられる。さらに他の例として、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール等のチオエーテル、チオコレステロール、ドデカンジオールまたはウンデシル基等のアシル鎖、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、トリエチルアンモニウム、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン部分、ヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール、ファルネシル、ゲラニル、およびゲラニルゲラニル部分が挙げられる。
コンジュゲートもまた、検出可能な標識であってもよい。例えば、コンジュゲートをフルオロフォアとすることができる。コンジュゲートとして、ＴＡＭＲＡ等のフルオロフォア、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン誘導体（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ））、フルオロセイン、または公知の他の適当なフルオロフォアが挙げられる。
コンジュゲートを、都合がよく、かつそれを持つｓｉＲＮＡの所望の活性と実質的に干渉しない末端ヌクレオチド上の任意の位置（例えば、リボシル糖の３’または５’位に付着させてもよい。コンジュゲートは、ＲＮＡ干渉の媒介となるｓｉＲＮＡの能力が、形質移入後２４時間で機能性が測定される培養細胞を用いた生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイで８０％を上回る減少となるような、その機能性への悪影響を及ぼす場合、実質的にｓｉＲＮＡの所望の活性と干渉する。
（デオキシヌクレオチド）
用語「デオキシヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、２’および／または３’炭素に結合した水素を持つ代わりに、適当な結合および／または２’、３’末端ジデオキシを持つ糖部分の２’または３’位で、ＯＨ基を欠いているヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
（デオキシリボヌクレオチド）
用語「デオキシリボヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｒｅｏｔｉｄｅ）および「ＤＮＡ」は、リボシル部分の２’位にＨを持つ少なくとも１つのリボシル部分を含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
（下流）
ヌクレオチドからなる１本の鎖の１つの領域は、もし該第１の領域の５’側最末端部分（ｍｏｓｔ ｐｏｒｔｉｏｎ）が第２の領域の３’末端に対してその領域の最も近接した部分である場合、第２の領域の下流であると見なされる。
（エクサエクオ剤）
フレーズ「エクサエクオ剤（ｅｘａｅｑｕｏ ａｇｅｎｔ）」とは、ＲＮＡｉ経路への参加見込み、またはＲＮＡｉ経路へ参加する能力について他の核酸と競合する能力という観点から、不活性または半不活性である核酸のことをいう。分子をエクサエクオ剤として用いることができ、エクサエクオ剤は溶液中の核酸の総量を均一または同等にするために使用される。
（第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド）
フレーズ「第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、センス鎖または領域上に対応の相補的塩基を持つアンチセンス鎖または領域の塩基に関して、その鎖の５’側最末端位置（ｍｏｓｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に位置しているアンチセンス鎖または領域のヌクレオチドのことをいう。したがって、２本の異なる鎖から構成されるｓｉＲＮＡ（すなわち、単分子またはヘアピンｓｉＲＮＡではない）において、アンチセンス鎖上の任意の５’オーバーハングの一部である塩基とは異なる５’側最末端塩基（ｍｏｓｔ ｂａｓｅ）と呼ぶ。第１の５’末端アンチセンスセンス・ヌクレオチドがヘアピン分子の一部である場合、用語「末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）」はアンチセンス領域内にある相対的に５’側の最末端位置のことをいい、したがってアンチセンス領域の５’側最末端ヌクレオチドである。
（第１の５’末端センス・ヌクレオチド）
フレーズ「第１の５’末端センス・ヌクレオチド」は、アンチセンス・ヌクレオチドに関して定義される。２本の異なる鎖から構成される分子（すなわち、単分子またはヘアピンｓｉＲＮＡではない）では、アンチセンス鎖上の対応の相補的塩基を持つセンス鎖の塩基に関して、その鎖の５’最末端位置に位置しているセンス鎖のヌクレオチドのことをいう。したがって、２本の異なる鎖（すなわち、単分子またはヘアピンｓｉＲＮＡではない）から構成されるｓｉＲＮＡでは、センス鎖または領域上の任意の５’オーバーハングの一部である塩基以外の５’最末端塩基である。第１の５’末端センス・ヌクレオチドが、ヘアピンを形成することができる単分子ｓｉＲＮＡ分子の一部分である場合、用語「末端」は、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補性を持つ塩基からの距離で測定されるセンス鎖または領域内の相対的位置のことをいう。
（機能性）
ｓｉＲＮＡを、培養細胞系で誘導されるサイレンシングのレベルまたは度合いに基づいて、５つのグループ（非機能性、半機能性、機能性、高機能性、および超機能性）に分けることが可能である。本明細書に用いられるように、これらの違いは、一組の条件に基づいていおり、該条件とは、ｓｉＲＮＡが１００ｎＭの濃度で上記細胞系に形質移入されること、サイレンシングのレベルが形質移入後おおよそ２４時間（しかし形質移入後７２時間を超えてはならない）に調べられることである。この文脈のなかで、「非機能性ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ）」は、誘導される標的サイレンシングが５０％未満（＜５０％）であるｓｉＲＮＡとして定義される。「半機能性ｓｉＲＮＡ（ｓｅｍｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ）」は、５０〜７９％標的サイレンシングを誘導する。「機能性ｓｉＲＮＡ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ）」は、８０〜９５％遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「高機能性ｓｉＲＮＡ（ｈｉｇｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ）は、９５％を上回る遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「超機能性ｓｉＲＮＡ（ｈｙｐｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ）」は、特別な分子種である。この文書の目的のために、超機能性ｓｉＲＮＡは、（１）サブナノモル未満の濃度（すなわち、１ナノモル未満）で形質移入した場合に特異的標的のサイレンシングを９５％を上回る率で誘導し、さらに／または（２）９６時間を上回る時間にわたってサイレンシングの機能的（または良好な）レベルを誘導する分子として定義される。これらの相対的機能性（絶対的であることを意図していない）は、機能的ゲノム解析、標的同定、および薬物療法等の用途に対する特定の標的とｓｉＲＮＡとを比較するのに用いられる。
（機能的用量）
「機能的用量（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｓｅ）」とは、投与後２４、４８、７２、および９６時間で１００ｎＭ濃度のｍＲＮＡを９５％以上減少させるという効果を示すｓｉＲＮＡの用量のことをいう。一方、ｓｉＲＮＡの「僅かに機能的用量（ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｓｅ）」は投与後２４時間で１００ｎＭ濃度のｍＲＮＡを５０％以上減少させる効果を示し、さらにＲＮＡの「非機能的用量（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｓｅ）」は投与後２４時間で１００ｎＭ濃度のｍＲＮＡの減少を５０％未満とする効果を示す。
（ハロゲン）
用語「ハロゲン（ｈａｌｏｇｅｎ）」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、またはアスタチンのいずれかの原子のことをいう。フレーズ「２’ハロゲン修飾ヌクレオチド（２’ｈａｌｏｇｅｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、２’炭素に直接付着した２’位にあるハロゲンにより修飾された糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。
（２’ハロゲン修飾ピリミジン）
フレーズ「２’ハロゲン修飾ピリミジン（２’ｈａｌｏｇｅｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）」とは、ヌクレオチドの糖の２’炭素に対して付着したハロゲン基を含むピリミジン（例えば、シトシンまたはウラシル）のことをいう。
（ヌクレオチド間連結）
フレーズ「ヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、１つのｓｉＲＮＡ内での２つのヌクレオチド単位間に存在する結合または連結のタイプのことをいうもので、修飾されたもの、または未修飾のものであってもよい。フレーズ「修飾ヌクレオチド間連結」は、現在のところ公知、これから知られる、さらにまたはこの開示を読むことで当業者が推論する、全ての修飾ヌクレオチド間結合を包含する。ヌクレオチド間連結は、関連した対イオンを有するものであってもよく、この用語は、そのような対イオンと、ヌクレオチド間連結で形成され得る任意の配位化合物とを含むことが意図されている。
ヌクレオチド間連結の修飾として、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’−アルキレンホスホネテート、５’−メチルホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、３’−５’連結または２’−５’連結の三フッ化ホウ素、ボラノホスフェートエステル、およびセレノホスフェート、リン酸トリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホン酸塩結合、アルキル・ホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホンチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスフィネート、ホスホルアミダート、３’−アルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、ホスホロピペラジダート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カルボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミダート、リボアセチル基との連結、アミノエチルグリシン、シリルまたはシロキサン連結、ヘテロ原子を含む、ならびに／あるいは飽和もしくは未飽和および／または置換し得る１〜１０の炭素からなるヘテロ原子を有するか、もしくは持たないアルキルまたはシクロアルキル連結、モルホリノ構造との連結、直接または間接的に主鎖のアザ窒素に対して塩基が付着し得るポリアミド、さらにｓｉＲＮＡ内でのそれらの修飾ヌクレオチド間連結の組合わせである。
（リンカー）
「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）は、他の部分（例えばヌクレオチドおよびそのコンジュゲート）と互いに付着する部分である。細胞に取り込まれる分子の安定性および／または能力をコンジュゲートが高める一方で、リンカーは細胞に取り込まれる分子に対してコンジュゲートを単に付着させることから、リンカーとコンジュゲートとを区別することが可能である。
一例として、リンカーは修飾または未修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリマー、糖および他の炭水化物、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアルコール、ポリプロピレン、プロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールとの混合物、ポリアルキルアミン、スペルミジン等のポリアミン、ポリ（エチルアクリレート）等のポリエステル、ポリホスホジエステル、およびアルキレンを含むことができる。コンジュゲートおよびそのリンカーの一例は、コレステロール−ＴＥＧ−ホスホラミダイトであり、コレステロールはコンジュゲートであり、テトラエチレングリコールおよびホスフェートはリンカーとして用いられる。
（ヌクレオチド）
用語「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらの修飾された形態、さらにはそれらの類似体のことをいう。ヌクレオチドとして、プリン、例えばアダニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられ、さらにピリミジンとして、例えばシトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられる。
ヌクレオチド類似体として、塩基、糖、および／またはリン酸塩の化学構造に修飾を持つヌクレオチドが挙げられ、限定されるものではないが、該ヌクレオチドとして、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミン、および５ブロモウラシルの置換；ならびに２’位糖修飾として、限定されるものではないが、糖修飾リボヌクレオチドが挙げられ、ここで該リボヌクレオチドの２’−ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、もしくはＣＮ等によって置換されており、Ｒが本明細書に定義したようにアルキル部分である。ヌクレオチド類似体もまた、塩基（例えば、イノシン、キューオシン、キサンチン）、糖（例えば、２’−メチルリボース）、非天然ホスホジエステル連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート）、ならびにペプチドが含まれることを意図している。
修飾塩基とは、ヌクレオチド塩基のことをいい、該塩基として、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ならびに、１つ以上の原子もしくは基の置換または付加によって修飾されたウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンが挙げられる。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドから構成し得る修飾の種類のいくつかの例として、限定されるものではないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミン化、アミド化、またはアセチル化された種々の組み合わせの塩基が挙げられる。より特異的な修飾塩基として、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジンおよび５位に修飾を持つ他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば２−チオウリジンおよび４−チオウリジン、および２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばＮ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えばアミノフェノールもしくは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇ−クランプ・ヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８−置換アデニン、およびグアニン、５−置換ウラシルおよびチアミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシルアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドもまた、糖部分に関して修飾されたヌクレオチドと、さらにリボシルではない糖または類似体を持つヌクレオチドとが挙げられる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、ならびに他の糖、ヘテロ環、または炭素環が挙げられる。ヌクレオチドという用語もまた、広範な塩基として当業者に知られているものを含むことが意図されている。実施例として、一例として、広範な塩基として、限定されるものではないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、またはネブラリンが挙げられる。
さらに、ヌクレオチドという用語はまた、ヌクレオチドに付着した検出可能な標識（例えば放射活性部分または蛍光部分）または質量標識を有する種を含む。
（ヌクレオチド単位）
フレーズ「ヌクレオチド単位（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｕｎｉｔ）」とは、単一のヌクレオチド残基のことをいい、修飾または未修飾窒素塩基、修飾もしくは未修飾の糖、および２つのヌクレオチドまたはさらなる連結を除外するコンジュゲートの連結を可能にする修飾もしくは未修飾の部分とから構成される。
（オフ・ターゲット）
用語「オフ・ターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）」およびフレーズ「オフ・ターゲット効果」とは、所定の標的に向けられたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、または細胞タンパク質もしくは他の部分と直接あるいは間接的に相互作用することによって、意図されていない効果を生ずる、任意の事象をいう。例えば、「オフ・ターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）」は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンス鎖と他の転写産物との間の部分的相同性または相補性によって、他の転写産物の同時に起こる分解が存在する時に、生ずる可能性がある。
（オルトエステル）
用語「オルトエステル保護（ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）」または「オルトエステル修飾（ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」とは、オルトエステルによるヌクレオチド単位内の糖部分の修飾のことをいう。好ましくは、この糖部分がリボシル部分である。一般に、ＲＣ（ＯＲ’）３構造を持ち、式中Ｒ’は同一または異なるもの、ＲはＨ、さらに下線が引かれたＣはオルトエステルの中心炭素である。本発明のオルトエステルは、ヌクレオチド単位の糖部分の炭素が酸素に結合し、次にオルトエステルの中心炭素に結合しているオルトエステルから構成される。オルトエステルの中心炭素に対して次に結合するものは、２つの酸素原子であり、合計３つの酸素がそのオルトエステルの中心炭素に結合することになる。中心炭素に結合したこれら２つの酸素（いずれも糖部分の炭素には結合しない）は、次に同一または異なる２つの部分を構成する炭素に結合する。例えば、上記酸素の一方はエチル部分に結合することができ、また他方はイソプロピル部分に結合することができる。一例では、ＲをＨ、１つのＲ’をリボシル部分とすることができ、他の２つのＲ’を２つの２−エチル−ヒドロキシル部分とすることができる。オルトエステルを糖部分の任意の位置に置くことができ、例えば、２’、３’、および／または５’位に置くことができる。好ましいオルトエステル、さらにオルトエステル保護ポリヌクレオチドの製造方法については、米国特許第５，８８９，１３６号および第６，００８，４００号に記載されている。
（オーバーハング）
用語「オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）」とは、第１の鎖または領域が二本鎖を形成する相補性鎖の末端を越えて延びる１本の鎖または領域から生ずる、末端の塩基対を形成していない１つまたは複数のヌクレオチドのことをいう。塩基対の水素結合を介して二本鎖を形成することができる２つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域の一方または両方が、２つのポリヌクレオチドまたは領域によって共有された相補性の５’および／または３’末端を越える３’および／または５’末端を有することが可能である。二本鎖の３’および／または５’末端を越えて延びる一本鎖領域を、オーバーハングという。
（医薬的に許容される担体）
フレーズ「医薬的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」として、細胞へのｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの導入を促進させる組成物が挙げられ、また限定されるものではないが、溶媒または分散剤、コーティング剤、抗感染剤、等張剤、および本発明のポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡの吸収時間もしく放出の媒介となる薬剤が挙げられる。
（ポリヌクレオチド）
用語「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、ヌクレオチドのポリマーのことをいい、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが挙げられ、規則的および不規則的に交互になったデオキシリボシル部分およびリボシル部分からなるポリヌクレオチド鎖（すなわち、交互ヌクレオチド単位が、糖部分の２’位で、−ＯＨ、次に−Ｈ、次に−ＯＨ、つぎにＨ、等を持つ）と、種々の構成要素または部分が任意の位置でヌクレオチド単位に付着しているそのような種類のポリヌクレオチドの修飾とが含まれる。特に明記しない限り、または文脈から明らかにならない限り、用語「ポリヌクレオチド」として、単分子ｓｉＲＮＡと２本のことなる鎖から構成されるｓｉＲＮＡとが挙げられる。
（ポリリボヌクレオチド）
用語「ポリリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｔｏｔｉｄｅ）」とは、２つ以上の修飾または未修飾リボヌクレオチドおよび／あるいはそれらの類似体を含むポリヌクレオチドのことをいう。
（リボヌクレオチドおよびリボ核酸）
用語「リボヌクレオチド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」およびフレーズ「リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」（ＲＮＡ）は、少なくとも１つのリボヌクレオチド単位を含む修飾または未修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の１位でのＮ−グリコシド連結に付着した窒素塩基を持つリボシル部分の１’位、さらに別のヌクレオチドに対する連結を可能にするか、もしくは連結を妨げる部分の２’位に対して付着する酸素を含む。
（ＲＮＡ干渉およびＲＮＡｉ）
フレーズ「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」および用語「ＲＮＡｉ」は同義であり、少なくとも１つのリボヌクレオチド単位を含むポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡが生物学的プロセスに対する効果を奏するプロセスのことをいう。このプロセスは、限定されるものではないが、ｍＲＮＡを分解し、翻訳を減衰させ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡによる相互作用を生ずることによって、同様に付加的なタンパク質によってＤＮＡのメチル化をおこなうことによっておこなわれる遺伝子サイレンシングを含む。
（第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド）
フレーズ「第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの３’位に付着したヌクレオチドのことをいう。したがって、それは、対応のセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のアンチセンス鎖または領域の最も５’末端側にある第２のヌクレオチドである。
（第２の５’末端センス・ヌクレオチド）
フレーズ「第２の５’末端センス・ヌクレオチド」とは、第１の５’末端センス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第１の５’末端センス・ヌクレオチドの３’位に付着したヌクレオチドのことをいう。したがって、それは、対応のアンチセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のセンス鎖または領域の最も５’末端側にある第２のヌクレオチドである。
（センス鎖）
フレーズ「センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）」とは、伝令ＲＮＡまたはＤＮＡ配列等の標的核酸として、部分的または全体的に、同一のヌクレオチド配列の持つポリヌクレオチドまたは領域のことをいう。フレーズ「センス鎖」として、２本の異なる鎖から形成されるポリヌクレオチドの両方のセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子ｓｉＲＮＡのセンス領域とが挙げられる。配列が提供される場合、慣例によって、特に明記しない限り、それはセンス鎖（または領域）であり、相補性アンチセンス鎖（または領域）の存在が暗に含まれる。フレーズ「センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）」および「センス領域（ｓｅｎｓｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。
（ｓｉＲＮＡ、すなわち短い干渉ＲＮＡ）
用語「ｓｉＲＮＡ」およびフレーズ「短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」とは、単分子の核酸のことをいい、またＲＮＡｉを実行することが可能であり、かつ１８と３０との間の塩基対長である二本鎖を持つ２本の異なる鎖から構成される核酸のことをいう。また、用語「ｓｉＲＮＡ」およびフレーズ「短い干渉ＲＮＡ」として、リボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が挙げられ、該部分として、限定されるものでないが、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド連結、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、および上記ヌクレオチドの類似体が挙げられる。
ｓｉＲＮＡを二本鎖とすることができ、また短いヘアピンＲＮＡ、４〜２３以上のヌクレオチドほどの長さのループを持つＲＮＡ、ステムループ状の突出持つＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、および短い一過性のＲＮＡが挙げられる。ループまたはヘアピン・ループを持つＲＮＡとして、該ループがフレキシブル・リンカー等のリンカーによって幹部分（ステム）に結合している構造が挙げられる。フレキシブル・リンカーは、多種多様な化学構造から構成せれ、かつステム構成要素の効果的な分子間ハイブリダイゼーションを可能にする十分な長さと材料とからなる。概して、スパンの長さは、少なくとも約１０〜２４原子である。
ｓｉＲＮＡがヘアピンである場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの長い分子の一部分である。
（安定化）
用語「安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）」とは、ｄｓＲＮＡが分解に抗する一方で機能性を保つ該ｄｓＲＮＡの能力のことをいい、その能力は、例えば血清等の生物学的材料の存在下で、半減期として測定される。ｓｉＲＮＡの半減期とは、例えば血清中で、ｓｉＲＮＡが５０％分解するのにかかった時間のことをいう。
（実質的な相補性）
実質的な相補性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）とは、９０％以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖のことをいう。
（トラックアビリティ）
用語「トラックアビリティ」とは、分子が細胞に導入される等の後に、該分子の移動または配置を追跡する能力のことをいう。「トラッカブル（ｔｒａｃｋａｂｌｅ）」である分子は、細胞形質移入手順等の成功および失敗を観察する上で有用である。
（好ましい実施形態）
ここで、好ましい実施形態に関連して本発明を説明する。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提供されており、いかなるかたちであれ、本発明を限定することを意図したものではなく、またそのような意図があると解釈すべきものではない。この開示を読むことによって当業者が理解しうる代替物、修飾、および等価物の全てが本発明の精神および範囲内である。
第１の実施形態によれば、本発明はｓｉＲＮＡを提供する。このｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド単位を含むアンチセンス鎖とを含む。好ましくは、修飾ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはその類似体である。オルトエステルを、糖部分の任意の位置、例えば２’、３’、および／または５’位に、置くことができる。好ましくは、オルトエステル部分は、糖部分の２’位にある。好ましくは、オルトエステル、およびポリヌクレオチドで保護されたオルトエステルの製造方法は、米国特許第５，８８９，１３６号および第６，００８，４００号に記載されている。また、好ましくは、オルトエステルは、リボシル部分の２’位に付着している。好ましくは、オルトエステルは、２つの２−エチル−ヒドロキシル置換基を含む。最も好ましいオルトエステルを以下に示、また本明細書では、２’−ＡＣＥまたは２’−ビス（ヒドロキシエチル）オルトエステル部分と呼ぶ。すなわち、
Figure 0004605799
 センス鎖上のオルトエステル基を含む利点は、図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、および２Ｃを参照することによってわかる。
図１に示すデータの生成は、いくつかの変異体でＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．の登録商標ＡＣＥケミストリーを用いることで合成したｓｉＲＮＡ二本鎖標的ＳＥＡＰ（ヒト分泌アルカリ・ホスファターゼ）を用いて、おこなった。これらの変異体として、裸、または未修飾のＲＮＡ、すなわち各の２’−ＯＨがオルトエステルによる修飾を受けているＡＣＥ保護ＲＮＡと、フッ素が各２’炭素および各ＣおよびＵに結合している２’フルオロ修飾変異体とが挙げられる。
ｓｉＲＮＡの二本鎖を、センス鎖とアンチセンス鎖とから構成することができる。センスおよびアンチセンス鎖の全ての可能な組み合わせからなるアレイが生成された。図１を参照すると、以下の用語が用いられる。
Ｓ − ｓｉＲＮＡ二本鎖内の裸センス鎖。
ＡＳ − ｓｉＲＮＡ二本鎖内の裸アンチセンス鎖。
ｐＳ − ｓｉＲＮＡ二本鎖内の２’ＡＣＥ保護センス鎖。
ｐＡＳ − ｓｉＲＮＡ二本鎖内の２’ＡＣＥ保護アンチセンス鎖。
２ＦＳ − フッ素原子が各Ｃおよび／またはＵ保持ヌクレオチド単位の２’炭素に結合するようにして、全てのＣおよびＵを持つｓｉＲＮＡ内のセンス鎖。
２ＦＡＳ − フッ素原子が２’炭素、または各Ｃおよび／またはＵ保持ヌクレオチド単位に結合するようにして、全てのＣおよびＵを持つｓｉＲＮＡ内のアンチセンス鎖。
Ｓ−ＡＳとは、裸センス鎖および裸アンチセンス鎖から形成された二本鎖ｓｉＲＮＡのことをいう。
ｐＳ−ＡＳとは、ＡＣＥ修飾センス鎖および裸アンチセンス鎖から形成された二本鎖ｓｉＲＮＡのことをいう。
Ｐ２’Ｆ−２’修飾を有する、ＣｓおよびＵｓを除く全てのヌクレオチドの２’−ＡＣＥ修飾。
ｐＡＡＶ６プラスミド（ＳＥＡＰ発現プラスミド）と目的のｓｉＲＮＡとによって、二本鎖を同時形質移入し、あるいは安定にＳＥＡＰを発現するＨＥＫ２９３細胞中にｓｉＲＮＡを形質移入した。両方の条件下で、標準的な形質移入用の手順を用いたが、結果はＨｅｌａ、ＭＤＡ７５、または３ＴＥＬｉ（マウス）細胞系のあいだで変化はなかった。
ｓｉＲＮＡ誘導ＳＥＡＰサイレンシングのレベルは、製造元のプロトコルに従ってＣｌｏｎｔｅｃｈのＳＥＡＰ検出キットを用いて、形質移入後の異なる時点（２４、４８、７２、または１４４時間）で決定した。タンパク質減少レベルは、ｍＲＮＡ減少レベルと良好な一致が見られる（ｍＲＮＡのレベルは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅキット（Ｂａｙｅｒ）を用いて測定した）。ｓｉＲＮＡ誘導毒性は、ＡｌｍａＢｌｕｅ毒性アッセイあるいはハウスキーピング遺伝子（シクロリン）さもなければ両方の発現レベルを用いて測定した。特に明記しない限り、著しい毒性は何ら観察されなかった。
１〜１００ナノモル濃度のあいだ（図１）、および１０ピコモル濃度〜１マイクロモル濃度（図２）のあいだで濃度を変えて、細胞に各の二本鎖を形質移入した（図１）。図１および図２では、裸および２’フルオロ修飾と組み合わせて、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンスおよびアンチセンス鎖に対するＡＣＥ修飾の導入の効果が示されている。
オリゴのアンチセンス鎖に対するＡＣＥ修飾の存在がｓｉＲＮＡ二本鎖の機能性と著しく干渉する。ＡＣＥ修飾センス・オリゴは、裸または２’Ｆ修飾ＡＳオリゴと一緒に使用されているかどうかに関わらずＳＥＡＰサイレンシングで影響を及ぼした。
サイレンシングの程度を２４、４８、または７２時間で比較し、ｓｉＲＮＡサイレンシングでの検出可能な減少を１４４時間後に観察した。
図３および図４は、ＡＳ（図３）およびセンス（図４）鎖を一定に保ち、反対側の鎖に対する種々の修飾を組み合わせてスクリーニングしたｓｉＲＮＡ機能性スクリーニングをまとめたものである。特に、ＡＳ鎖を、（１）裸に、（２）全てのＣおよびＵで２’Ｆ基によって修飾、（３）２、４、６、１４、および１８位（５’側から数える）で２’デオキシ基により修飾、（４）６７〜１０位（鎖の５’側から計算）に位置したものを除く、ＵおよびＣｓの全てでの２’−Ｏ−メチル基による修飾、（５）全ての位置でのホスホロチオエートによる修飾、あるいは（６）１〜６位および１４〜１９位（鎖の５’側から計算）でのホスホロチオエートによる修飾のいずれかをおこなった。これらのＡＳ鎖に対して、（１）裸、（２）全ての位置で２’−ＡＣＥ修飾、（３）全てのＣｓおよびＵｓでの２’Ｆ修飾、（４）全てのＵｓで修飾された２’アミン（ＮＨ２）、（５）全ての奇数のヌクレオチド（例えば、１、３、５、．．．）に対する２’−デオキシ修飾、（６）全てのＣおよびＵでの２’−Ｏ−メチル修飾、あるいは（７）全ての位置でホスホロチエートを担持するセンス鎖との対形成をおこなった。これらの実験の結果は、アンチセンス鎖の記述された２’−Ｏ−メチル修飾が耐容性を示さない一方で、ホスホロチオエート、２’Ｆ、および２’デオキシ修飾を含む他の修飾が、種々のセンス鎖修飾と組み合わさって、この鎖上で可能であることを示している。同様に、図４では、アミン修飾が一般にセンス鎖に対して耐容性を示さない一方で、２’−ＡＣＥ、２’Ｆ、２’デオキシ、２’−Ｏ−メチル、およびホスホロチオエート付加が、種々のＡＳ鎖修飾と組み合わさって、重大な機能性の混乱を招くことなく、可能であることが示されている。
図５、６、７，および８は、使用した修飾の種類に応じてグループ分けしたより詳細なデータを表す。図５では、裸、２’Ｏ−ＡＣＥ修飾、または２’Ｆ修飾センス鎖が、２’Ｆ−８Ｔ ＡＳ ＝ 鎖の各端にある４つのホスホロチオエート、各端の第２のヌクレオチドから開始、それに加えてＣおよびＵにＦ基；８Ｔ ＡＳ ＝ 鎖の各端にある４つのホスホロチオエート、各端の第２のヌクレオチドから開始；４Ｔ−ＡＳ ＝ 各端の第２のヌクレオチドから開始して鎖の各端上に２つのホスホロチオエートのいずれかと、対を形成した。図６では、偶数位置、または１２位（ＡＳ−Ｔｈｉｏ１２、鎖のいずれかの端部上にある６つのホスホロチオエート）でのホスホロチオエート修飾を含むアンチセンス鎖を、裸にした、全ての位置で２’−ＡＣＥ修飾した、または全ての位置でホスホロチオエート修飾した相補的センス鎖と対を形成した。あるいは、全ての位置でホスホロチオエートを持つセンス鎖を、裸にした、全てのＣおよびＵで２’Ｆ基を持つ、全ての位置でホスホロチオエートを持つ、あるいは１２ホスホロチオエートを持つ（各末端での６つのヌクレオチドの修飾）アンチセンス鎖と対を形成した。図７について、２’−Ｏｍｅ ＝ ヌクレオチド７〜１１位のあいだに生ずるものを除いた全てのＵおよびＣ上の２’−Ｏ−メチル修飾と、Ｓ−Ｏｍｅ ＝ センスのＣおよびＵ上の２’−Ｏ−メチル修飾とを担持するアンチセンス鎖は、裸の、Ｓ−２’ＡＣＥ ＝ 全てのヌクレオチド上の２’ＡＣＥ修飾；Ｓ−デオキシ・ハイブリッド ＝ 上記鎖をまたがる全ての奇数ヌクレオチド（１，３，５．．．）上の２’デオキシ修飾；Ｓ−Ｏｍｅ ＝ センス鎖の全てのＣおよびＵの２’−Ｏ−メチル修飾；ＡＳ−２’Ｆ ＝ 上記鎖上の全てのＣおよびＵの２’Ｆ修飾；ＡＳ−デオキシ・ハイブリッド ＝ ヌクレオチド２、４、６、１４、１６、１８の２’デオキシ修飾；あるいはＡｓ−Ｏｍｅ ＝ ヌクレオチド７〜１１位のあいだに生ずるものを除く全てのＵおよびＣの２’−Ｏ−メチル修飾のいずれかと一致した。図８に関して、デオキシ修飾を担持するＡＳ鎖（ＡＳ−デオキシハイブリッド＝ヌクレオチド２、４、６、１４、１６、１８の２’デオキシ修飾）をセンス鎖と組み合わせた。ここでセンス鎖は、裸の、Ｓ−２’ＡＣＥ修飾 ＝ 全てのヌクレオチド上の２’ＡＣＥ修飾；Ｓ−Ｏｍｅ ＝ 全てのＵおよびＣでの２’Ｏ−メチル修飾；または２’デオキシ（１位、３位、５位、．．．その他）であった。同様に、センス−２’デオキシ・ハイブリッド（１位、３位、５位、．．．その他）を、裸の、２’Ｆ修飾（ＣおよびＵ）、２’−Ｏ−メチル（７位〜１１位のあいだにあるものを除いたＵおよびＣ）、ならびに２’デオキシ（２位、３位、６位、１４位、１６位、１８位）であるアンチセンス鎖と対を形成した。
特に、図５は、裸の２’ＡＣＥ修飾および２’Ｆ修飾センス鎖との組み合わせでアンチセンス鎖に置かれた場合、ホスホロチオエート修飾が十分に許容される。
図６は、ホスホロチオエート主鎖修飾が非特異的に誘導された毒性について同様の制限を持つセンスおよびアンチセンス鎖上の両方で許容されることを、さらに示す。
図７は、２’−Ｏ−メチル修飾の存在がｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス上で十分に許容されるが、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖では許容されないことを示している。機能的ｓｉＲＮＡ二本鎖が２’−Ｏ−メチル修飾ＡＳ鎖とセンス鎖のデオキシハイブリッドとの組み合わせによって形成されることについて述べる価値がある。
図８は、ＲＮＡ干渉でのデオキシハイブリッド型の修飾の適合性を示す。デオキシリボハイブリッドは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド・オリゴであり、デオキシおよびリボ構成要素が共に、例えばデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとが交互になった配列中のオリゴに取り込まれる。これらの種類のオリゴの設計で、連続したＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の広がりの大きさを５ヌクレオチドよりも短く保つことで、ＲＮアーゼＨ活性の導入を避けることが重要である。デオキシリボハイブリッドは、２’フルオロおよび２’ＡＣＥ修飾オリゴと組み合わせてセンスおよびアンチセンス鎖の両方で機能的であった。また、デオキシハイブリッド・センス鎖は、アンチセンス鎖が２’−Ｏ−メチルで修飾された場合にｓｉＲＮＡ活性を支持する唯一の修飾（それらの条件下）であった。
図９は、ＡＣＥおよび２’フルオロ修飾ｓｉＲＮＡの効力を改善するためのコレステロールを含むコンジュゲートの有用性を示す。上記センス鎖上でコレステロールを含むコンジュゲートを用いることで、センス鎖に対する修飾による不の効果を軽減するが、アンチセンス鎖に対する修飾による負の効果を改善することはない。
図１０は、センス鎖上のＰＥＧコンジュゲートに関して等価なデータを示す。
図１１は、コレステロールを含むコンジュゲートの存在が修飾ｓｉＲＮＡオリゴの効力を改善することを示す。
図１２は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎの２’−ＡＣＥ ＲＮＡ合成ケミストリーで使用される保護ＲＮＡヌクレオチドの構造を示す。
図１３は、ＲＮＡ合成サイクルを概説する。好ましくは、そのサイクルは、適当な合成装置上で自動化された様式でおこなわれる。ステップ（ｉ）では、取り込まれるホスホラミダイト（ここでは、窒素塩基としてウリジンを持つ）は、示したメチル基のかわりに３’位のホスホラミダイト部分上に任意の許容可能な基を持つことができる。例えば、アルキル基またはシアノエチル基をその位置で用いることができる。このＲＮＡ合成サイクルを、修飾ヌクレオチド間連結を持つポリヌクレオチドを合成する場合、および／または他の修飾（例えば、２’位で）を持つポリヌクレオチドを合成する場合、ある種の変化によって、以下に説明するように、実施することができる。
図１４は、２’脱保護直前の２’−ＡＣＥ保護ＲＮＡ産物の構造を示す。２’位にオルトエステルを保持することが必要な場合、この２’脱保護ステップが実施されない。
３’末端にジ−ｄＴオーバーハングを持つ１９量体二本鎖、すなわちセンス鎖の第２、第５、第７、第９、第１１、および第１９位で２’アミン修飾ヌクレオチド単位を持つＧ２’−Ｎ−ＵＧＡ２’−Ｎ−ＵＧ２’−Ｎ−ＵＡ２’−Ｎ−ＵＧ２’−Ｎ−ＵＣＡＧＡＧＡＧ２’−ＮＵｄＴｄＴについて、アンチセンス鎖が裸であるか、全てのＣおよびＵで２’フルオロ修飾されているか、交互にリボヌクレオチド単位とデオキシリボ単位とを含むデオキシハイブリッドであるか、または２’−Ｏ−メチル修飾を有するか否かに関わらず、機能性の著しい喪失が生じた。好ましくは、センス鎖は、第２、第５、第７、第９、第１１、および第１９位で２’アミノ修飾を含まない。
３’ ジ−ｄＴオーバーハングを持つｓｉＲＮＡ１９量体（配列番号１７１〜３１４を見よ）上で、デオキシリボヌクレオチド単位による任意のリボヌクレオチド単位の置換は、修飾がセンスまたはアンチセンス鎖のいずれにあっても、ＲＮＡｉにおける１９量体の機能性に対して著しい影響を及ぼすことはない（図１５Ａ参照）。同一ｓｉＲＮＡ１９量体上で、相前後した２つのデオキシリボヌクレオチド単位による２つの隣接リボヌクレオチド単位の置換はＲＮＡｉ内での１９量体の機能性に著しい影響を及ぼすものではない。図１５Ｂは、１および２位、３および４位、５および６位等が個々にデオキシリボヌクレオチドに修飾される場合、該修飾がセンス鎖に生じると機能性が著しく影響を受けることはなく、そのような修飾がアンチセンス鎖上に生ずると機能性に対して僅かに負の影響が現れることを、示している。同一のｓｉＲＮＡ１９量体上では、相前後した３つのデオキシリボヌクレオチド単位による３つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、その修飾がアンチセンス上でのものであれば機能性に著しい影響を及ぼすものではないが、修飾された単位がセンス鎖の第１から第３、または第７から第９ヌクレオチドである場合、機能的に著しい影響（場合によっては）を受ける。この実験では、ポリリボヌクレオチドの単位１〜３、４〜６、７〜９等を、個々にデオキシリボヌクレオチド単位によって置換した（図１５Ｃ参照）。
３’ジ−ｄＴオーバーハングを有する同一ｓｉＲＮＡ１９量体ポリリボヌクレオチド上で、２’−Ｏ−メチル部分による任意の個々の単位の修飾は、修飾がセンスまたはアンチセンス鎖にあろうとなかろうと、ＲＮＡｉでの１９量体の機能性に対して著しい影響を与えることはない（図１６Ａ参照）。同一ｓｉＲＮＡ１９量体を用いて、相前後する２つの２’−Ｏ−メチル修飾による２つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、アンチセンス鎖の第１および第２、または第１３および第１４の位置で、あるいはセンス鎖の第１７および第１８の位置で、修飾が起こらない限り、ＲＮＡｉでの１９量体の機能性に著しい影響を与えない（図１６Ｂ参照）。以降の実験によって、アンチセンス鎖の第１３位および第１４位、さらにセンス鎖の第７位および第８位が決定的ではないことが確認された。最も顕著に、機能性の変化を補正する修飾が追加されない場合、機能性を維持するならばアンチセンス鎖の第１および第２位が２’−Ｏ−メチル修飾を持ってはならない。同一のｓｉＲＮＡ１９量体を用いて、相前後する２’−Ｏ−メチル修飾を持つ３つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、第１位〜第３位以外の位置でその修飾がアンチセンス鎖上にある場合、機能性に対して著しい影響を及ぼさない（図１６Ｃ参照）。この実験では、ポリリボヌクレオチドの１〜３位、４〜６位、７〜９位等を２’Ｏ−メチル部分により個々に修飾した。
単一の２’−デオキシ部分または単一の２’−Ｏ−メチル部分のいずれかによる同一ポリリボヌクレオチドの修飾は、機能性に対して著しい影響を及ぼすことはない。タンデムになった２つ以上の２’−Ｏ−メチル部分によるアンチセンス鎖の１および２位、あるいは１、２、および３位の修飾によって、機能性を著しく減少させることができる。センス鎖上の７〜９位およびアンチセンス鎖上の１３〜１５は、タンデムになった２つ以上の２’−Ｏ−メチル修飾に対して感受性を持つ。したがって、好ましくはアンチセンス鎖は、二本鎖内の他の位置に競合する修飾が起こらない限り、第１および第２、第１、第２、および第３、第１３および第１４、ならびに第１３、第１４および第１５位に２’−Ｏ−メチル修飾を含まない。以降の実験は、アンチセンス鎖上の１および２位（または１および２、ならびに３位）の２’−Ｏ−メチル修飾は、二本鎖機能性の鍵である。センス鎖上の７〜９位ならびにアンチセンス鎖上の１３〜１５位はあまり重要ではない。
ヌクレオチドの全てが、選択されたヌクレオチドのみが修飾されるセンス鎖よりも、オルトエステル基で全てのヌクレオチドが修飾されるセンス鎖を合成するほうが、実用上の問題として無駄がない。しかし、理論的には、ある種のヌクレオチドのみが修飾される実用的手段がセンス鎖を合成するために開発されていることから、本発明ではこれらのポリヌクレオチドを用いることができた。
好ましくは、２’修飾ヌクレオチドは、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミン修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、および２’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される。修飾がハロゲンである場合、そのハロゲンは好ましくはフッ素である。上記修飾がフッ素であると、好ましくは、シトシンまたはウラシル塩基部分を含む１つ以上のヌクレオチドにそれが付着する。２’修飾ヌクレオチドが２’アミノ修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくは−ＮＨ２である。この２’修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキル修飾である場合、好ましくは上記修飾が２’−Ｏ−メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはイソブチル部分であり、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル部分である。２’修飾ヌクレオチドが２’−アルキル修飾である場合、好ましくは修飾は２’メチル修飾であり、該メチル部分の炭素が直接、糖部分の２’炭素に付着する。
図２Ｃは、ｓｉＲＮＡ効果が形質移入後１４４時間で次第に消え始めていくことを示している。修飾されたオリゴの用量および効力は、裸ｓｉＲＮＡ二本鎖と同等であった。
第２の実施形態によれば、本発明はセンス鎖を含むｓｉＲＮＡを提供する。ここで、このセンス領域は、第１の実施形態に基づいて提供される少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、第１の実施形態に基づいて提供される少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドと、コンジュゲートとを含む。好ましくは、上記修飾が２’メチル修飾であり、そのメチル部分の炭素が糖部分の２’炭素に直接付着している。
図２Ｃは、ｓｉＲＮＡ効果が形質移入後１４４時間で次第に消え始めていくことを示している。修飾されたオリゴの用量および効力は、裸ｓｉＲＮＡ二本鎖と同等であった。
第２の実施形態によれば、本発明はセンス鎖を含むｓｉＲＮＡを提供する。ここで、このセンス領域は、第１の実施形態に基づいて提供される少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、第１の実施形態にもとづいて提供される少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドと、コンジュゲートとを含む。
この実施形態内のコンジュゲートは、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。より好ましくは、コレステロール、ポリエチレングリコール、抗原、抗体、およびレセプター・リガンドからなる群から選択される。よりいっそう好ましくは、コンジュゲートはコレステロールまたはポリエチレングリコールを含む。もっとも好ましくは、コンジュゲートはコレステロールを含み、５’炭素位でセンス鎖の５’末端ヌクレオチド単位と連結する。
センス鎖の５’末端におけるコレステロール修飾コンジュゲートの導入は、裸または未修飾二本鎖に匹敵する、あるいはそれよりも優れたオルトエステル修飾および２’アンチセンス修飾ｓｉＲＮＡに対する効力の増加をもたらした。図９および１１を見よ。センス鎖の５’末端でのコレステロール含有コンジュゲートの導入は、対応する裸二本鎖に匹敵する、あるいはそれよりも優れたオルトエステル修飾および２’フッ素修飾ｓｉＲＮＡに対する機能的有効量の減少をもたらした。
図９は、ＡＣＥおよび２’フッ素修飾ｓｉＲＮＡの効力を改善するためのコレステロールの有用性を示す。正のコレステロール効果が、主にセンス塩化物上に導入された修飾によって観察された。例えば、配列番号１〜１６のセンス鎖の５’位にある５’末端に対してコレステロール部位が付着することで、形質移入作用因子の不在下でＲＮＡｉが生ずる（図１８参照）。
第３の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチド、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成されるセンス鎖を持つｓｉＲＮＡを提供する。この実施形態では、上記第１の実施形態のオルトエステル修飾を、上記第２の実施形態のコンジュゲートと組み合わせて、用いてもよい。
第４の実施形態によれば、本発明は、センス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートを有し、上記センス鎖および／またはアンチセンス鎖が少なくとも２’修飾ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡを提供する。この実施形態の２’修飾ヌクレオチドは、上記第１の実施形態の２’修飾ヌクレオチドと同様のパラメーターに基づいて、好ましくは選択される。同様に、上記コンジュゲートは、上記第２の実施形態でコンジュゲートが選択された同一のパラメータにもとづいて選択される。
第５の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミン修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、および２’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖と、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるコンジュゲートとを有し、上記ポリヌクレオチドが１８〜３０のヌクレオチド塩基対を含むｓｉＲＮＡを提供する。
この実施形態のオルトエステルは、上記第１の実施形態のオルトエステルを選択するための基準に基づいて選択される。上記２’修飾がハロゲンである場合、好ましくはハロゲンがフッ素であり、アンチセンス鎖の少なくとも１つはＣおよび／またはＵ含有ヌクレオチド単位に付着する。上記２’修飾ヌクレオチドが２’アミノ修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくはＮＨ２である。２’修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキル修飾である場合、好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル、エチル、プロピル、イソプロビル、ブチル、またはイソブチル部分であり、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル部分である。２’修飾ヌクレオチドが２’アルキル修飾である場合、好ましくは、それは２’メチル修飾であり、そのメチル部分の炭素が直接、糖部分の２’炭素に付着している。
第６の実施形態によれば、本発明は以下の構造を含む組成物を包含する。
Figure 0004605799
 式中、Ｂ１およびＢ２の各々が窒素含有塩基、複素環、または炭素環式化合物であり、ＸがＯ、Ｓ、Ｃ、およびＮからなる群からなる群から選択され、ＷがＯＨ、リン酸塩、リン酸エステル、リン酸ジエステル、ホスホトリエステル、修飾ヌクレオチド間連結、コンジュゲート、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、Ｒ１がオルトエステル、Ｒ２が２’−Ｏ−アルキル基、アルキル基、アミン、およびハロゲン、さらにＹがヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。Ｒ２がハロゲンである場合、このハロゲンは好ましくはフッ素である。Ｒ２がフッ素である場合、フッ素は好ましくは１つ以上のＣおよび／またはＵ含有ヌクレオチド単位に付着している。Ｒ２がアミンである場合、このアミンは好ましくは−ＮＨ２である。Ｒ２が２’−Ｏ−アルキル修飾である場合、好ましくは、それは２’−Ｏ−メチル、エチル、プロピル、イソプロビル、ブチル、またはイソブチル部分であり、より好ましくは、２’−Ｏ−メチル部分である。Ｒ２が２’アルキル修飾である場合、好ましくは、それは２’メチル修飾であり、該メチル修飾の炭素が直接、糖部分の２’炭素に付着している。
この実施例のＲ１、オルトエステルは、上記第１の実施形態のオルトエステルを選択するためのパラメータに基づいて選択される。
式中の破線は、窒素含有塩素間の水素結合による相互作用を示す。好ましくは、Ｂ１およびＢ２は、天然の窒素含有塩素、例えばアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、およびクエウオシン、あるいはそれらの類似体である。好ましくは、ＸがＯである。
上記実施形態の各々に関して、ｓｉＲＮＡは任意の長さのものであり、好ましくは１８〜３０ヌクレオチド塩基対、より好ましくは１８〜１９塩基対であり、任意のオーバーハングが除かれる。長さが約３０塩基対未満のｓｉＲＮＡを用いることで、非特異的なプロセス（例えばｓｉＲＮＡ適用の機能性を減少させるインターフェロン関連の反応）を避けることができ、その一方でＲＮＡ干渉適用における機能的反応が保たれる。さらに、好ましくは、上記ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
上記実施形態において、オーバーハングが鎖の一方または両方に存在し得る。好ましくは、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを有する場合、長さが１〜６ヌクレオチド単位、より好ましくは２〜３、さらに最も好ましくは２であり、ｓｉＲＮＡの各々の鎖の３’末端に位置する。しかし、平滑末端を有するｓｉＲＮＡは機能的である。２つのヌクレオチドのオーバーハングが最も好ましい。
上記実施形態での類似性は、ｓｉＲＮＡのいずれか一方の鎖または両方の鎖が、１つ以上の修飾ヌクレオチド間連結を持ち得ることである。好ましくは、修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートとホスホロジチオエートとからなる群から選択される。さらに、好ましくは、上記ポリヌクレオチドが４を上回る数の修飾ヌクレオチド関連結を持つことができる。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドが、８を上回る数の修飾ヌクレオチド間連結を含む。最も好ましくは、約１０個の修飾ヌクレオチド間連結が用いられる。安定性を最も高くするために、完全な修飾が好ましいが、実際に用いることができる修飾連結の数に対して、数多くの因子が影響を及ぼす。このような因子として、連結によって与えられる安定性の度合い、連結が機能性に影響を及ぼす度合い、化学的に連結を導入する能力、さらに連結の毒性が挙げられる。好ましくは、修飾はエクソヌクレアーゼ活性に対する保護のために、３’および５’末端に配置される。
本発明の上記実施形態のポリヌクレオチドは、安定化されている。これらの安定化したｓｉＲＮＡの半減期は、約２０秒から１００時間以上である。好ましくは、本発明の安定化ｓｉＲＮＡの半減期は１時間を超える。より望ましくは、本発明の安定化ｓｉＲＮＡは、１０時間を超える半減期を示す。もっとも好ましくは、本発明の安定化ｓｉＲＮＡは、１００時間を上回る半減期を示す。その上、望ましくは、ｓｉＲＮＡの効果は、少なくとも１世代以上にわたる細胞分裂を存続する。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト血清存在下で高い安定性を示す。好ましくは、例えば、ヒト血清中での本発明の１９量体二本鎖の半減期が数分から２４時間である。より好ましくは、ヒト血清での１９量体二本鎖の半減期が２４時間から３日間である。最も好ましくは、血清中での１９量体二本鎖の半減期は３〜２０日以上である。
第２、第４、第６、第１４、第１６、および第１８位でのデオキシリボ核酸修飾を持つアンチセンス鎖を有する１９量体ポリリボヌクレオチド二本鎖にとって、３７℃で１時間３０分、胎仔牛血清にさらすことで、おそらくは血清ヌクレアーゼによって、第４および第６位が分解から守られた。同様に、第２〜第６、第１２、第１４、第１６および第１７、さらに第１９位にあるアンチセンス鎖上の２’−Ｏ−メチル修飾を含む１９量体ポリリボヌクレオチド二本鎖に関して、血清ヌクレアーゼによる分解からこれらの位置が保護された。ヌクレオチド１〜６および１３〜１９間での１９量体ポリリボヌクレオチド二本鎖に対するアンチセンス鎖内のホスホロチオエート修飾の導入によって、血清ヌクレアーゼ分解に抵抗する修飾ヌクレオチド間結合が与えられる。しかし、アンチセンス鎖の各２’位でＡＣＥオルトエステル部分により修飾された１９量体によっては、ヒト血清に対する安定性が得られなかったが、おそらく血清リボヌクレアーゼのみならず血清ホスホジエステラーゼが原因と考えられる。
ポリヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖における２’位での修飾は、ＣおよびＵヌクレオチド単位で、血清中でのポリリボヌクレオチド二本鎖の安定性を著しく高める。図１７は、センスおよびアンチセンス鎖の両方の２’位での修飾の種類の関数として、２’−Ｏ−メチル（配列番号１３）に関して、２’Ｆ（５’−２’ＧｆＵＧＡｆＵＧｆＵＡｆＵＧｆＵｆＣＡＧＡＧＡＧｆＵｄＴｄＴ−３’）（配列番号１７）、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結（配列番号１０および１１）、さらにＡＣＥ保護（配列番号３および４）に関して、安定性を示す。縦軸は、非分解性ポリヌクレオチドと対照との割合を示す。したがって、対照と比較した安定性率が高くなれば、観察される分解も少なくなる。図１７から、センス鎖を修飾することは、安定性を達成する上で十分である。
２’−Ｏ−メチル部分または２’フルオロ部分のいずれかによる各Ｃおよび各Ｕの修飾は、センスおよびアンチセンス鎖の完全な安定化をもたらす。安定なセンス鎖、例えば２’フルオロまたは２’−Ｏ−メチル修飾を持つものを裸のアンチセンス鎖にアニーリングして、安定性が改善される。
本発明の組成物は、新規の保護基スキームに準拠したＤｈａｒｍａｃｏｎのＲＮＡ合成ケミストリーに基づいて作ることができる。２’−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基（２’−ＡＣＥ）と併用して５’−ヒドロキシル（５’−ＳＩＬ）の保護に、シリルエステル類を用いることができる。このような保護基の組が、続いて標準的なホスホラミダイト固相合成技術で使われる。いくつかの保護および機能化リボヌクレオチド・ホスホラミダイトの構造を図１２に示す。とって代わるものとして、本発明の組成物を任意の他の適当なＲＮＡ合成ケミストリーを用いて作ることができる。
第７の実施形態によれば、本発明はＲＮＡ干渉を実施するための方法を提供する。この方法は、ＲＮＡｉを実施するために、ｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことから構成される。この方法では、ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらに上記センス鎖および上記アンチセンス鎖の少なくとも１つが、少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含む。
好ましくは、目的とする標的核酸に対して、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドが９０％以上の相補性を表す。より好ましくは、本発明のアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、目的とする標的核酸に対して、９９％以上の相補性を示す。最も好ましくは、本発明のポリヌクレオチドが、連続する少なくとも１８〜１９塩基にわたって、目的とする標的核酸に対して完全な相補性を持つ。
好ましくは、上記少なくとも１つのオルトエステル修飾ヌクレオチドがセンス鎖上に位置し、上記オルトエステルの組成物が第１の実施形態について前述されたパラメーターによって定義される。
オルトエステル修飾に加えて、上記した他の修飾のいずれかもまた、この方法で使用する場合に提示可能である。例えば、アンチセンス鎖は、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミン修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、および２’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを、好ましくは含む。修飾ヌクレオチドが２’ハロゲン修飾ヌクレオチドである場合、上記ハロゲンは好ましくはフッ素である。このハロゲンは好ましくはフッ素である。ハロゲンがフッ素である場合、このフッ素は、好ましくは、ＣまたはＵ含有ヌクレオチド単位に付着している。上記２’修飾がアミンである場合、好ましくは、そのアミンは、−ＮＨ２という部分を有する。上記２’修飾が２’−Ｏ−アルキル基である場合、好ましくは、その基は、メソオキシ−ＯＣＨ３という部分を有する。上記２’修飾がアルキル基である場合、好ましくはその修飾がメチル基（−ＣＨ３）である。さらに、好ましくは、これらの修飾のいずれもがヌクレオチド８〜１１で生じず、より好ましくはこれらの修飾のいずれもがアンチセンス鎖の７〜１２位で生じない。
上記方法はまた、ｓｉＲＮＡが５’コンジュゲートを含むかたちで、実施される。このコンジュゲートを、コンジュゲートの選択に関する前述の基準に基づいて、選択することができる。
これらの方法を用いる際、上記ｓｉＲＮＡは任意の数の塩基対ではあるが、好ましくは１８〜３０塩基対、より好ましくは１９塩基対である。さらに好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドのアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
一方または両方の鎖上の３’および／または５’末端ヌクレオチド単位の１つ以上の塩基対のオーバーハングもまた、オーバーハングのための上記パラメータにもとづいて存在する。
第８の実施形態によれば、本発明は、ＲＮＡ干渉を実行するための方法を提供するもので、ｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことを含む。このｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成される。センスまたはアンチセンス鎖のいずれも、２’修飾ヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のこの実施形態のｓｉＲＮＡは、前述の実施形態と同程度の相補性を示す。
この実施形態によれば、アンチセンス鎖は、好ましくは、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、および２’アルキル修飾ヌクレオチドから選択される少なくとも１つのヌクレオチドを含む。上記修飾は、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖に対しておこなうことができる。修飾ヌクレオチドが２’ハロゲン修飾ヌクレオチドである場合、ハロゲンが好ましくはフッ素である。ハロゲンがフッ素である場合、上記フッ素は好ましくは、少なくとも２つのＣまたはＵ含有ヌクレオチドに結合する。好ましい２’アミン修飾は−ＮＨ ２ である。好ましい２’−Ｏ−アルキル修飾は−ＯＣＨ ３ である。好ましくは２’アルキル修飾は、−ＣＨ３である。
上記方法はまた、ｓｉＲＮＡがコンジュゲートを含んで実行することができる。コンジュゲートは、既に述べられたコンジュゲートを選択するためのパラメータに基づいて選択される。ｓｉＲＮＡは、任意の数の塩基対であってもいが、前述の実施形態では、好ましくは１８〜３０塩基対、最も好ましくは１８〜１９塩基対である。同様に、いずれかの、または両方の鎖の３’および／または５’末端ヌクレオチド上の１つ以上の塩基対のオーバーハングを与えることができる。さらに、センスまたはアンチセンスのいずれかが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含むことができ、好ましくはホスホロチオエート連結およびホスホロジエチエート連結から選択される。好ましくは、上記センスおよびアンチセンス鎖は、ポリリボヌクレオチドである。
上述した実施形態の各々は、ポリヌクレオチドが裸ポリヌクレオチドよりもより安定していることから、効果的なＲＮＡｉ干渉を実施することが可能である。裸ポリヌクレオチドとは異なり、本発明のポリヌクレオチドは、血液、血清、および他の生物学的媒体に存在するヌクレアーゼおよび他に物質による分解に対して耐性を示す。
本発明のさらなる驚くべき利点は、「オフ・ターゲット化（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）とも呼ばれる非特異的ＲＮＡ干渉を最小限にすることである。非特異的ＲＮＡ干渉は、標識にされていない遺伝子の機能をセンス鎖がサイレンシングまたは部分的にサイレンシングする場合に生ずる。本明細書に記載するオルトエステル修飾および他の修飾は、単独または互いに組み合わさって、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖で用いられ、そのような非特異的ＲＮＡ干渉の削減または防止をおこなう。
非特異的ＲＮＡ干渉を減少させるために、好ましくはセンス鎖修飾を、５’末端ヌクレオチドを第１番目として、５’末端から第８、第９、第１０、または第１１番目のヌクレオチドで、おこなう。より好ましくは、第８、第９、第１０、および第１１番目のヌクレオチドの全てを２’位で修飾する。最も好ましくは、第８、第９、第１０、および第１１番目のヌクレオチドが全て２’位で修飾され、かつ該修飾がオルトエステルである。
第９の実施形態によれば、本発明は、ｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことを含み、上記ｓｉＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらに前記センス鎖は実質的に非機能的である、ＲＮＡ干渉を実施する方法を提供する。「実質的に非機能的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」によって意味されることは、いっさいの非標的遺伝子の発現を、上記センス鎖が５０％以上阻害することができないということである。したがって、「実質的に非機能的」センス鎖によって阻害される非特異的ｍＲＮＡの発現は５０％未満である。本発明の付加的な利点として、血清含有培地および血清中での安定性が高められる。
この実施形態によれば、上記センス鎖は、少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾、少なくとも１つのシトシン含有ヌクレオチド塩基またはウラシル含有ヌクレオチド塩基を含むことができ、その少なくとも１つのシトシン含有ヌクレオチド塩基またはウラシル含有ヌクレオチド塩基は、２’−Ｏ−メチル修飾を有する。好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル修飾である。より好ましくは、上記２’−Ｏ−アルキル修飾が第１，第２、第１８、および／または第１９ヌクレオチド塩基上の、２’−Ｏ−メチル修飾である。
上記センス鎖は、さらに、コンジュゲートを含み得る。好ましくは、コンジュゲートがコレステロールである。好ましくは、このコレステロールは、センス鎖の５’および／または３’末端に付着している。コレステロールによるｓｉＲＮＡ二本鎖の修飾は、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対する二本鎖の親和性を著しく増加させ、顕著な毒性をいっさい生ずることなく二本鎖の体内分布を変える。
上記センス鎖は、その３’末端にキャップを含み得る。好ましくは、このキャップは逆位のデオキシチミジンまたは末端位置（ヌクレオチド１８および１９）にある２つの連続的な２’−Ｏ−メチル修飾塩基である。
上記アンチセンス鎖は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、この少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’−ハロゲン修飾ヌクレオチドである。最も好ましくは、その修飾ヌクレオチドは２’−フッ素修飾ヌクレオチドである。
前記センス鎖が１つ以上のシトシン含有ヌクレオチド塩基および／またはウラシル含有ヌクレオチド塩基を含む場合、１つ以上のシトシン含有ヌクレオチド塩基および／またはウラシル含有ヌクレオチド塩基は、２’−フッ素修飾されたものである。
第１０の実施形態によれば、本発明は、ＲＮＡ干渉を実施する方法を提供するもので、該方法はｓｉＲＮＡを標的核酸にさらすことを含み、このｓｉＲＮＡは、（ａ）コンジュゲートと、（ｂ）少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、実質的に非機能的であるセンス鎖と、（ｃ）少なくとも１つの２’−フッ素修飾を含むアンチセンス鎖とから構成され、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が１８〜３０塩基対の二本鎖を形成する。好ましくは、上記少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾が、第１、第２、第１８、および／または第１９のヌクレオチド塩基である。好ましくは、上記コンジュゲートがコレステロールである。好ましくは、上記コレステロールは、センス鎖の５’および／または３’末端に付着している。
上記センス鎖は、さらにその３’末端にキャップを含み得る。好ましくは、このキャップは逆位のデオキシチミジン（ｉｄＴ）または末端位置（ヌクレオチド１８および１９）にある２つの連続的な２’−Ｏ−メチル修飾塩基である。
本発明の上記した実施形態の利点は、ＲＩＳＣ複合体アセンブリーの方向性を促進するｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の修飾を可能にし、センス鎖が遺伝子サイレンシングに関わるのを防ぐことである。本発明者は、ｓｉＲＮＡ媒介サイレンシングの効率に対する種々の修飾を持つｓｉＲＮＡを用いる効果を系統的に研究した。本発明者は、２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチル修飾を持つ二本鎖を有するセンスおよびアンチセンス鎖の各々の位置での修飾が、ｓｉＲＮＡ機能と干渉しないことを発見した。２または３つのそのような修飾に対してタンデム（相前後した）阻害を用いる場合、十分に許容された（ｗｅｌｌ−ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）修飾のパターンがセンス鎖とアンチセンス鎖とで異なる。２−Ｏ−メチルで修飾されたセンス鎖の１位および２位を持つｓｉＲＮＡ二本鎖は、完全に機能的であった。しかし、アンチセンス鎖の同様な位置での修飾は、完全に非機能的なｓｉＲＮＡをもたらした。図１９〜３１を参照せよ。５’末端でのアンチセンス鎖のリン酸化は、部分的にアンチセンス鎖機能性を回復させた。
本明細書に記載した修飾は安価であり、信頼性が高く、かつ非毒性であり、センス鎖がアンチセンス鎖としての機能を実質的におこなうことができないようにｓｉＲＮＡ二本鎖を修飾する方法ある。これの実質的な効果は、ｓｉＲＮＡ特異性および効力が増加することである。最近のマイクロアレイ分析によれば、１１個のヌクレオチドの存在が非特異的サイレンシングを誘発するのに十分であることを示唆しており、さらにｓｉＲＮＡ二本鎖と他のｍＲＮＡ転写産物のセンス鎖との間の相同性は、場合によっては、少なくとも非特異的な活性の半分を生み出すことが可能であることも示唆されている（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１，６３５−６３７）。したがって、センス鎖の非特異的活性が阻害されるとすれば、二本鎖特異性が増加する。このこともまた、機能的ＲＩＳＣ形成の方向へ平衡が移る効果を持つと思われ、同様に必要なｓｉＲＮＡ濃度を低下させる。
本発明者は、十分に許容され、かつ血清（例えば、ヒト血清）存在下でｓｉＲＮＡ二本鎖の安定性を高める修飾を提供する。ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖修飾を安定化させることのみで、非修飾または裸のアンチセンス鎖に対してある程度の安定性を与える。２’−Ｏ−アルキル修飾によるセンス鎖のＣまたはＵ毎の修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル部分）は、いくつかの配列の安定性にとってかなり効果的ではあるが、他の配列にとっては効果的ではない。さらに、本発明者は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル修飾が重要であることを発見した。このようなかたちでの修飾もまた、完全に修飾されたｓｉＲＮＡと比較して、非特異的効果の度合いが低いという結果になることが予想される。本明細書のデータが記述しているように、センス鎖の１、２、１８、および１９位での修飾が二本鎖性能と干渉しない。センス鎖修飾によって生ずる二本鎖安定性の一例を図３２に示す。この図は、全てのＵおよびＣに対するＯ−メチル修飾を二本鎖のセンス鎖に施すことで、抗ＳＥＡＰｓｉＲＮＡ２２１７の半減期が１０分から４時間に増加したことを示している。アンチセンス鎖のｉｄＴバージョンは安定性が２倍低いことから、ｄＴｄＴによる３’末端の修飾は重要である。アンチセンス鎖が裸のままであることから、このような修飾モードは任意の配列に適用することができる。
血清中での数時間に及ぶ半減期は、ｓｉＲＮＡの効果的送達を高める上で十分なものでなければならない。なぜなら、細胞内ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体によって安定化されるからである。図３５は、センス鎖のＣおよびＵが２’−Ｏ−メチルで修飾され、ｉｄＴキャップが３’末端に置かれた場合のｓｉＲＮＡ二本鎖の安定性を示す。この種の処方の機能性は配列依存的ではあるが、センス鎖の５’末端上にコレステロールが存在することで、著しく改善される。さらなる修飾（例えば、センス鎖ＣおよびＵの２’−Ｏ−メチル修飾、それに加えてセンス鎖の１位および２位の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖のＣおよびＵの２’Ｆ修飾、さらにアンチセンス鎖の５’末端上のリン酸基、図３７参照）は、サイレンシング機能性を感知できるほどに変えることなしに、そのような分子の血清安定性を５日間、さらに増加させることができる。
コレステロール・コンジュゲートによるｓｉＲＮＡの修飾は、別の予想外の特徴を持つ。コレステロールによって修飾されたｓｉＲＮＡは、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対して、かなり高い親和性を示す。図３３を参照せよ。血清タンパク質親和性は、マウスにおけるアンチセンス生体内分解に関する以前の研究で有用であることが証明された。ホスホチオ修飾の存在は、非特異的アンチセンス結合活性の大部分に関与するが、血清タンパク質に対する高い親和性を持ち、それによって薬物動態学的挙動を変えることから、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）アンチセンス適用にとっては有益であることが証明された。コレステロール修飾ｓｉＲＮＡは、ホスホチオ修飾の非特異性が高まるという欠点なしに血清タンパク質親和性の利点を示す。
第１１の実施形態によれば、本発明はセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成されるｓｉＲＮＡを提供する。このセンス鎖は、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドを有し、それら両方とも２’炭素修飾、好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾を持つ。いくつかの実施形態では、このｓｉＲＮＡは標識も含む。この標識が存在する場合、好ましくはこの標識が第１の５’末端センス・ヌクレオチド上に位置する。さらに、センス鎖上の少なくとも１つのピリミジン（例えば、シトシンまたはウラシル）、好ましくは複数のピリミジンの各々が、２’炭素修飾、好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾を有する。これらの修飾は、ピリミジンであってもよい第１または第２の５’末端センス・ヌクレオチドの任意の修飾に加えて、ｓｉＲＮＡの配列に依存している。
第１１の実施形態のアンチセンス鎖は、少なくとも１つの２’−ハロゲン修飾ピリミジン、好ましくはフッ素修飾ピリミジンと、リン酸化されている第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとを含む。好ましくは、アンチセンス鎖上の全てのピリミジンが２’−フッ素修飾を持つ。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、１８〜３０塩基対、より好ましくは１９〜２５塩基対、さらに最も好ましくは１９〜２３塩基対を持つ（ヘアピンを形成することができる単分子ｓｉＲＮＡ中に存在する場合にオーバーハングまたはループもしくはステム構造を除く）。好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖は、オーバーハング、ループ、またはステム構造を除いて、少なくとも７９％相補性、より好ましくは塩基対の範囲にわたって９０％相補性、さらに最も好ましくはこの範囲にわたって１００％相補性である。同様に、好ましくは、アンチセンス領域は、標的領域に対して、少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも１００％相補性である。好ましくは、上記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’または３’末端のいずれかに、オーバーハングを含むものであってもよい。しかし、２本の異なる鎖から構成されるポリヌクレオチドの場合、任意のオーバーハングが存在するとすれば、該オーバーハングはセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端のみに存在する。また、好ましくは任意のオーバーハングは長さが６塩基長以下、好ましくは２塩基長以下である。最も好ましくは、オーバーハングが存在しないか、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方もしくは両方の３’末端上に２塩基からなるオーバーハングが存在する。第１１の実施形態によれば、アンチセンス鎖の５’末端にオーバーハングを持たないことが好ましい。オーバーハング・ヌクレオチドは、非リン酸５’−ヌクレオチドを残す１種類以上の細胞内酵素プロセスまたはイベントによって頻繁に取り除かれる。したがって、アンチセンス鎖の５’末端にオーバーハングを持たないことが望ましい。
第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化とは、そのヌクレオチドの糖部分の５’炭素に付着した１つ以上のリン酸基が存在することをいう。好ましくは、リン酸基が１つだけ存在する。
２’−Ｏ−アルキル修飾は、どの塩基に該修飾が現れるかに関わらず、好ましくは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロビル、２’−Ｏ−ブチル、２’−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、および２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）からなる群から選択される。最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル部分である。さらに、修飾が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドの各々で同一である必要はない。しかし、本発明の分子を合成することに関して実用上の観点から、全体として同一の修飾を用いることが求められる場合もある。
２’−Ｏ−アルキル・ピリミジン修飾に関して、第１の２つの５’末端センスヌクレオチドにあるピリミジン以外の少なくとも１つのピリミジンが、２’−Ｏ−アルキル基により修飾される。好ましくは、二本鎖形成領域内にある上記センス鎖上の全てのピリミジンが修飾される。さらに、好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル基である。２’−Ｏ−アルキル修飾と同様に、同じアルキル修飾が、２’−Ｏ−アルキル基を有する各々のヌクレオチドの上で、使われる必要はない。オーバーハング、ループまたはステムがある場合、それらの領域のピリミジンは、２’−Ｏ−アルキル基を含んでもよく、あるいは含まなくてもよい。しかし、２’−Ｏ−アルキル基のうちの少なくとも１つは、望ましくはセンス領域である。
２’ハロゲン修飾ヌクレオチドに関して、修飾はアンチセンス鎖のピリミジンの少なくとも１つに生じ、より好ましくはアンチセンス鎖のピリミジンの全てに生ずる。さらに、好ましくは、上記ハロゲンがフッ素である。オーバーハング、ステム、またはループが存在する場合、それらの領域のピリミジンは、ハロゲン基を含んでもよく、あるいは含まなくてもよいが、好ましくはいずれのステムまたはループ構造はこの修飾を含まず、上記少なくとも１つのハロゲン基がセンス領域内にある。本明細書中に記載されるその他の修飾に影響されることなくｓｉＲＮＡの安定性を増加させるために、２’−ハロゲン修飾（２’フルオロ修飾を含む）を用いることが可能であるという点に、留意する必要がある。したがって、それらの修飾をｓｉＲＮＡ用途での他の修飾と共に使用することと同様に、それらを別々に用いることも可能である。
安定性および第１１の実施形態に関連して機能性という本発明の利益を著しく否定するものでなければ、センスおよび／またはアンチセンス鎖のヌクレオチド修飾の他の種類を含めることが可能である。ピリミジン修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、好ましくはフッ素修飾）と追加の２’−Ｏ−アルキル修飾ピリミジンとを持ちいることで、一定レベルのヌクレアーゼ耐性が得られる。
化学修飾に加えて、塩基対ミスマッチまたは隆起（バルジ）をセンスおよび／またはアンチセンス鎖に付加することができ、該付加によって１００％未満の相同性を共有する標的とのＲＩＳＣ媒介付着に関与するそれらの鎖の能力を変える。そのようなミスマッチの例として（限定されるものではないが）プリン−ピリミジン・ミスマッチ（例えば、Ｇ−Ｕ、Ｃ−Ａ）およびプリン−プリンもしくはピリミジン−ピリミジン・ミスマッチ（例えば、Ｇ−Ａ、Ｕ−Ｃ）が挙げられる。これらの種類の修飾を導入することは、前述の修飾と組み合わせてもよく、それらが本発明の利点を損なうことなく機能性の他の属性（例えば、オフ・ターゲット効果）を変えるかどうかを決定するために、評価することができる。
いくつかの用途では、蛍光標識等の標識を使用することが求められる場合もある。標識が蛍光である場合、蛍光標識はＣｙ３（商標）、Ｃｙ５（商標）、またはＡｌｅｘａ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｌｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。これらの標識は、好ましくは、センス鎖の５’末端に加えられ、より好ましくは５’末端センス・ヌクレオチドに加えられる。これらは、形質移入細胞等の中の標識ｓｉＲＮＡの分布をユーザが視覚化することを可能とさせて、ある一定の形質移入の成功を評価することを可能とする。標識ヌクレオチドの使用は、当業者に周知であり、蛍光標識以外の標識として、例えば質量または放射活性標識を、そのような標識が有益であると考えられる用途で、用いることが可能である。
蛍光修飾（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、非形質移入細胞から形質移入細胞を分離するために用いることができる。具体的には、第１１の実施形態の分子を細胞集団に対して形質移入した後、ＦＡＧＳによってソートすることで、形質移入された細胞を非形質移入細胞から分離する。このことによって、より純度の高い集団（混合したものよりも）を得ることができ、その後、遺伝子サイレンシングによって得られる表現型を明確に同定する能力が改善される。
第１１の実施形態の分子は、種々の用途を持ち、例えばその分子を形質移入コントロール試薬または安定的サイレンシング試薬として用いることが可能である。これらの分子が標識を含む場合、該分子を細胞へ形質移入することで、細胞のどの分画に成功裏に形質移入がなされたかをユーザーが視覚化および判断することを可能とする。また、これらの修飾は、ｓｉＲＮＡ機能をこれといって変えないことから、第１１の実施形態の分子は、同時に形質移入制御およびサイレンシング試薬となることができる。さらに、使用しうる配列に対して上記修飾が制限を加えるものではないことから、該修飾を多様なｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ用途で使用することができ、また標的配列依存的ではない。
したがって、上記第１１の実施形態の分子は、その独特な修飾セットを持つことから、機能性を変えることなく、安定性および「トラックアビリティ（ｔｒａｃｋａｂｉｌｉｔｙ）」を提供する。それらの分子を、形質移入された細胞の純粋集団を単離することにも用いることができる。もし２’−Ｏ−アルキル基をアンチセンス鎖の最初の２つまたは最初の３つのヌクレオチドに加えると、オフ・ターゲット効果を減少させる付加的な利益を実現することができる。さらに、２’−Ｏ−アルキル基をセンス鎖の最初の２つまたは３つのヌクレオチドに加えると、それらがセンス鎖オフ・ターゲット効果を減少させる付加的な利益を持つことができる。
第１２の実施形態によれば、本発明はセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される別のｓｉＲＮＡを提供する。このセンス鎖は、第１１の実施形態のセンス鎖のパラメータと同様のパラメータに基づいて決定され、該パラメータとして第１および第２の５’末端センス・ヌクレオチドの２’炭素修飾、好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾と、ピリミジンの少なくとも１つの２’炭素修飾、好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾とが挙げられる。しかし、アンチセンス鎖に対する上記修飾の代わりに、第１２の実施形態のアンチセンスは、第１および第２、あるいは第１、第２，および第３の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、該ヌクレオチドの各々が２’−Ｏ−アルキル修飾を持つ。さらに、第１および第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド以外に、アンチセンス鎖上に、少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾ピリミジンが存在する。さらにまた、好ましくは、２’Ｆｌ修飾が存在せず、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化が存在しない。リン酸化の欠如は、対応する機能的ポリヌクレオチドと比較して、限定された機能性の分子を与える。上記説明に対する別のバリエーションとして、第１２の実施形態の分子は、上記の属性全てに加えて、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に５’ブロック基を含む。そのようなブロック基は、さらに、この分子がリン酸化されてＲＩＳＣに入ることを除外するもので、５’−アルキル、５’−Ｏ−アルキル、アジド（Ｎ３）、アミン類、および他の部分からなる。
サイズ、オーバーハング、および他の修飾に関する他の好ましいパラメータは、第１１の実施形態に対するものと同じである。しかし、これらの組成物が遺伝子のサイレンシングに用いられないことから、それらは長さが１６〜２８塩基対とすることができ、好ましくは１８〜３０塩基対長であると考えられる。
第１２の実施形態の分子は、形質移入制御に加えて、潜在的な「フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）」またはエクサエクオ剤として作用することも可能であり、これは用量実験で、またはマイクロアッセイ研究の負の対照として、特に有用である。多くの実験が、異なる濃度（例えば、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、および１ｎＭ）での所定のｓｉＲＮＡの効果を試験する。必要に応じて、形質移入実験を実施した場合、異なる核酸レベルでの形質移入の結果として生ずるいかなる例外も回避するために、一定濃度の「全ｓｉＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ｓｉＲＮＡ）」を持つことが望まれる。残念なことに、任意の未修飾対照ｓｉＲＮＡ（例えば、非特異的対照）を加えることは、ＲＩＳＣとの相互作用に関する研究のもとで、ｓｉＲＮＡと競争する潜在的な下落傾向を有する。第１２の実施形態の分子は、この問題を軽減する。両方のセンスおよびアンチセンス鎖の１および２位（または１、２、および３位）上の２’−Ｏ−メチル修飾の追加は、リン酸化５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがない場合、それは、ＲＩＳＣとの相互作用に対するこの分子の能力を制限する。したがって、この分子は形質移入することができるが、ＲＩＳＣに関して他のｓｉＲＮＡと競争することはできない。第１１の実施形態の分子の場合と同様に、ピリミジン（ＣおよびＵ）に対する２’−Ｏ−メチル基の付加は、ヌクレアーゼ消化の可能性を最小限にする。
第１２の実施形態の分子は、他の「非特異的（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）配列または対照群とは異なり、ＲＩＳＣと十分な相互作用をおこなうことはない。このように、これらの分子は限られたオフ・ターゲット化副作用のみを生ずるはずなので、ＲＩＳＣ上の部位を争うことのないトラッカブルである能力を有する。
上記した実施形態（第１１および第１２の両方）を、隣接したセンスおよびアンチセンス鎖（すなわち、２本の別々の鎖）を持たないｓｉＲＮＡ、さらにはヘアピンを形成することができる単分子ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）に適用することが可能ある。用語「ｓｉＲＮＡ」として、両方のタイプのＲＮＡが挙げられる。例えば、ヘアピンは、ループ構造（好ましくは４〜１０塩基対を含み得る）と、センス領域とを含み、センス領域とアンチセンス領域とが個々に１９〜２３塩基対長であり、実質的に互いに相補的である。ループ構造の好ましい配列が、例えば、５’−ＵＵＣＧ（配列番号３１９）、５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ（配列番号３２０）、および５’−ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号３２１）である。
ヘアピンは、アンチセンス領域の下流にあるループ流域とともに望ましくは構築される。この構成は、第１１の実施形態にとっては特に望ましい。なぜならば、末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化するのがより容易であるからである。このように、単分子ｓｉＲＮＡｓを設計する際、オーバーハングが５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの上流にないことが好ましい。
本発明にもとづいて、単分子ｓｉＲＮＡ、特に左回りの（ｌｅｆｔ−ｈａｎｄｅｄ）単分子構造（例えば、５’−ＡＳ−Ｌｏｏｐ−Ｓ）を設計する場合、好ましくは、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補的である塩基から数えて（すなわち、センス領域の３’末端から数えて）、センス領域の第１８、第１９、または第２０の塩基であるヌクレオチドとして定義される。第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、このように定義される。なぜなら、ヘアピンを形成することができる単分子ｓｉＲＮＡが細胞に入る場合、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）が、２本の異なる鎖（ｓｉＲＮＡ）から構成されるヘアピンｓｉＲＮＡを約１８〜２０塩基対から構成されるヘアピンｓｉＲＮＡ分子に処理し、これらの分子がこの処理された分子の末端にセンス鎖修飾を持つことが要求されるからである。最も好ましくは、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、センス領域の３’末端からセンス領域の１９番目の塩基であるヌクレオチドとして定義される。さらに、好ましくは、ポリヌクレオチドは、左回りのヘアピンを形成することができる。
ｓｈＲＮＡは、さらに、ステム領域を含むことができ、該ステム領域は、ループ構造の第５’末端および第３’末端に直接隣接した１つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み、さらに該ステム領域の１つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが標的特異的もしくは非標的特異的である。好ましくは、その単分子ｓｉＲＮＡの全長は、１００塩基対未満であり、より好ましくは８５塩基対未満である。
本発明の単分子ｓｉＲＮＡは、最終的には細胞の機能（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ）によって２本の異なる鎖に変換されるように処理される。あるいは、この分子をＲＮＡｉ経路の１つ以上のステップ（例えば、ダイサーによる処理）にかけ、ＲＩＳＣに単分子状ヘアピン分子として入れることも可能である。さらに、これらの単分子ｓｉＲＮＡを、全ての修飾よりも少ないもので細胞に導入してもよく、また導入された天然のプロセスまたはプロセッシング用分子を用いて、細胞自体の中で修飾することも可能である（例えば、第１１の実施形態に関して、天然キナーゼによる細胞内でのリン酸化）。しかし、好ましくは、上記ポリヌクレオチドに対して、既に存在している全ての修飾が導入される（同様に、ｓｉＲＮＡが２つの異なる鎖から構成される場合、好ましくは、それらの鎖が、細胞に導入された場合に全ての修飾を含む。アンチセンス鎖が、例えば、導入後にリン酸化の基によって修飾され得るにもかかわらず）。
上記実施形態（第１１および第１２）が安定性増加を目的としているにもかかわらず、それらのタイプまたは他のタイプの修飾が他のパラメータ、例えば特異性に対しても影響を及ぼすという点に注意することが重要である。
さらに、これらの安定性および機能性修飾を組み合わせてもよい（例えば、少なくとも１つのセンス・ピリミジンを持つ追加の２’炭素修飾（好ましくは、−Ｏ−メチル修飾）と、２’炭素修飾（好ましくは、−Ｏ−メチル修飾）を持つ第１の２（または３）以外の好ましくは全てのセンス・ピリミジンと、２’炭素修飾（好ましくは、−Ｏ−メチル修飾）を持つ第１の２（または３）以外の、少なくとも１つの、好ましくは全ての、アンチセンス・ピリミジンの２’Ｆｌ修飾と、５’アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化とを併用した、第１および第２の（または第１、第２、および第３の）５’末端センスおよびアンチセンス・ヌクレオチド２’炭素修飾（好ましくは、−Ｏ−メチル修飾））。さらに、本発明の上記修飾は、無作為に選択される、または、例えば、米国特許出願第１０／７１４，３３３号に記載されているような論理的設計に基づいて、選択された配列を含むｓｉＲＮＡと組み合わせてもよい。
リン酸主鎖に対する安定化修飾は、本発明のいくつかの用途のためにポリヌクレオチド内に含めることが可能である。例えば、少なくとも１つのホスホロチオエートおよび／またはメチルホスホネートを、オリゴヌクレオチド主鎖のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖にある、同様に存在しうる任意のオーバーハング、ループ構造、またはステム構造にある、任意の、または全てのピリミジンのいくつかの、または全ての３’位にあるリン酸基と置換してもよい。ホスホロチオエート（およびメチルホスホネート）類似体は、オリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基の修飾から生ずる。ホスホロチオエート内では、リン酸塩Ｏが硫黄原子に置き換わる。メチルホスホネートでは、酸素がメチル基によって置き換わる。一実施形態では、ホスホロチオエート修飾またはメチルホスホネートは、２’フッ素（または他のハロゲン）修飾ヌクレオチドも含む全てのアンチセンス鎖ヌクレオチドの３’位に置かれている。さらに、ホスホロチオエート３’修飾を、２’フッ素置換の代わりに、および独立して用い、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を高めることが可能である。これらの修飾は、ｓｉＲＮＡ用途において、本明細書に記載された他の修飾と併用して、あるいはそれらの修飾とは別個に、用いることが可能である。
ヌクレアーゼは、一般に、リン酸塩部分およびリボース環の２’ＯＨ位にある酸素基の両方を用いてＲＮＡに対する攻撃を媒介する。複数の酸素の１つに対する硫黄基の置換によって、この反応に参加するリン酸塩の能力が取り除かれ、ヌクレアーゼ消化に対するこの部位の感度が制限される。しかし、ホスホロチオエートが典型的に有毒な点に留意する必要があることから、いかなる毒作用も否定される場合に主に有益であり、例えば、他のヌクレオチド毎、第３のヌクレオチド毎、または第４のヌくレオチド毎にこの修飾を用いることを制限することによって、達成しうると考えることができる。
第１２の実施形態の分子は、限定された機能のものではあるが、上記したように、負の対照研究で使用可能であり、またエクサエクオ剤として用いることができる。複数の分子に関連する上記修飾セットは、該分子を、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に対して必須のリン酸基を付加する細胞内キナーゼにとって劣った基質とする。修飾がリン酸化を著しく阻害する一方で、これらの修飾を担持する分子のいくつかの小分画が、いまだに５’アンチセンス位置のＣ５でリン酸化を受けて小量のサイレンシングを生成することも考えられる。そのような場合、それらの分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖の５’末端の５’炭素位を、キナーゼリン酸化を防ぐブロック基によって、修飾することが求められる可能性がある。ブロック基は、例えば、末端ヌクレシドの５’炭素位のリン酸化を防ぐ任意の基であってもよく、限定されるものではないが、５’−アルキル、５’−Ｏ−メチル、および５’−アミン基が挙げられる。
対照またはエクサエクオ剤の別の例は、以下の２’炭素修飾のみを含む。すなわち、（ｉ）各々が２’修飾、例えば上記した２’修飾（例として、２’−Ｏ−メチル修飾）を含む第１および第２、または第１、第２、および第３の５’末端センス・ヌクレオチドと、（ｉｉ）各々が２’修飾、例えば上記した２’修飾（例として、２’−Ｏ−メチル修飾）を含む第１および第２、または第１、第２、および第３の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとを含み、ならびに５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されていない。
本発明のポリヌクレオチドは、現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法が、本発明の分子を合成する上で有用である。特定の修飾を含むｓｉＲＮＡ二本鎖は、Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．（２０００）”Ａｄｖａｎｃｅｄ ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｔｅｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１７，３−１８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．（２００１）”ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ５’−ｓｉｌｙｌ−２’− ｏｒｔｈｏｅｔｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，２０６−２１７；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．（１９９９）米国特許第５，８８９，１３６号；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．（１９９９）米国特許第６，００８，４００号；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．（２０００）米国特許第６１１１０８６号；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．（２００３）米国特許第６，５９０，０９３号に記載されている事項および方法を用いて、化学的に合成することが可能である。上記合成方法は、ヌクレオシド塩基保護５’−Ｏ−シリル−２’−Ｏ−オルトエステル−３’−Ｏ−ホスホラミダイトを用いて、３’から５’方向に固体担体上に所望の未修飾ｓｉＲＮＡ配列をアセンブルする。手短に言うと、必須のホスホラミダイトの合成は、標準塩基保護リボヌクレオシド（ウリジン、Ｎ４−アセルエチジン、Ｎ２−イソブチリルグアノシン、およびＮ６−イソブチリルアデノシン）から始まる。５’−Ｏ−シリルおよび２’−Ｏ−オルトエステル保護基の導入、ならびに反応性３’−Ｏ−ホスホラミダイト部分が次に４つのステップによって達成される。すなわち、
１．Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ試薬によるヌクレオシド糖の５’−および３’−ヒドロキシル基の同時かつ一時的なブロッキング（１，３−ジクロロ−１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン［ＴＩＰＳ−Ｃｌ２］含有ピリジン溶液｛Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ，Ｗ．Ｔ．（１９７９）（１９７９）”Ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｄｉｓｉｌｏｘａｎｅ−１，３−ｄｉｙｌ，ａ Ｇｒｏｕｐ ｆｏｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ３’− ａｎｄ ５’−Ｈｙｄｒｏｘｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ），２４−２５｝をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製；
２．触媒としてピリジニウムｐ−トルエンスルホネートを用いてトリス（アセトキシエチル）−オルトフォルメート含有ジクロロメタンを用い、ＴＩＰＳ−ヌクレオシド糖の２’−ヒドロキシルをビス（アセトキシエチル）オルトエステル［ＡＣＥ誘導体］に位置特異的変換した後、クロマトグラフィーによる精製；
３．フッ化水素およびＮ，Ｎ，Ｎ”Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン含有アセトニトリルを用いてＴＩＰ保護基の特異的除去によるヌクレオシド糖の５’−および３’−ヒドロキシル基の放出をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製；
４．ベンズヒドロキシル−ビス（トリメチルシリロキシル）クロリド［ＢｚＨ−Ｃｌ］含有ジクロロメタンを用いて５’−Ｏ−シリルエタノールとして５’−ヒドロキシルの保護を行った後、クロマトグラフィーによる精製；ならびに
５．ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィンおよび５−メチルチオ−１Ｈ−テトラゾール含有ジクロロメタン／アセトニトリルを用いて３’−Ｏ−ホスホラミダイトへの変換を行った後、クロマトグラフィーによる精製。
ホスホラミダイト誘導体は、一般に厚く、無色から薄黄色のシロップである。自動ＲＮＡ合成装置に適合させるために、生成物の各々を予め定めた量の無水アセトニトリルに溶解し、この溶液を適当な数の血清バイアルに等分にして加え、各バイアル内のホスホラミダイトが１．０ｍｍｏｌｅ量とする。次に、これらのバイアルを適当な真空デシケーターに置いて、高真空に一晩置くことで溶媒の除去をおこなう。次に、雰囲気を乾燥アルゴンに置き換えて、バイアルをゴム製のセプタムでキャップし、密閉されたホスホラミダイトを、必要とする時まで−２０℃に保存する。合成装置に投入する前に、各ホスホラミダイトを十分な無水アセトニトリルで溶解して所望の濃度にする。
所望のオリゴリボヌクレオチドの合成は、自動合成装置を使用して行われる。それは、３’−ヒドロキシルを介して固体ビーズ状ポリスチレン担体に、切断可能な連結を介して、３’−末端ヌクレオシドの共有結合から始まる。所望の合成スケールにとって適当な量の担体を測定して反応用カートリッジに入れ、それを次に合成装置に固定する。結合したヌクレオシドを５’−Ｏ−ジメトキシトリチル部分で保護し、鎖アセンブリのための５’−ヒドロキシルを遊離させるために、その部分を無水酸（３％［ｖ／ｖ］ジクロロ酢酸含有ジクロロメタン）で除去する。
アセンブルされる配列のそれ以降のヌクレオシドを、以下の一般的な反応からなる４ステップ・サイクルを用いて、固体担体上で成長する鎖に対して、順次加える。
１．カップリング：適当なホスホラミダイトを５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールで活性化させ、担体結合ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの遊離５’ヒドロキシルと反応させる。これら２種類の試薬の濃度の最適化とモル過剰、さらにはその反応時間が、一般にサイクルあたり９８％を上回るカップリング収率が得られる。
２．酸化：カップリング・ステップで形成した分子間連結は、リン原子をそのＰ（ＩＩＩ）［亜リン酸塩］酸化状態に残す。生物学的に関連した酸化状態は、Ｐ（Ｖ）［リン酸塩］である。したがって、亜リン酸はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド含有トルエン溶液を用いて、Ｐ（ＩＩＩ）からＰ（Ｖ）に酸化する。
３．キャッピング：小量の残留未反応５’−ヒドロキシル基は、欠失を含む配列の形成を防ぐために、以降の結合サイクルへの参加かがブロックされなければならない。このことは、過剰の無水酢酸と１−メチルイミダゾールとを含むアセトニトリルで担体を処置することによって達成され、酢酸エステルとして効率的に残留５’−ヒドロキシル基がブロックされる。
４．脱シリル化：シリル保護された５’−ヒドロキシルは、次の共役反応の前に脱保護されなければならない。このことは、トリエチルアミン・トリヒドロゲンフルオリド含有Ｎ，Ｎ−ジメチホルムアミドによる処理を介して達成され、他の保護基（２’−Ｏ−ＡＣＥ、Ｎ−アシル塩基保護基またはメチルホスホネート）が同時に取り除かれることなしに、素早く、かつ特異的に５’−ヒドロキシルを放出する。
上記４つの反応ステップの間で、アセトニトリルによるいくつかの洗浄がある点に留意する必要があり、洗浄を用いることで、次の反応ステップに先立って過剰な試薬および溶媒が取り除かれる。上記サイクルは、オリゴリボヌクレオチドの未修飾部分がアセンブルされるまでの必要な回数が繰り返される。上記合成方法は、例示のみであり、分子が作られる手段を限定するものとして構成されるものではない。ｓｉＲＮＡを合成するために現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法も、用いることが可能である。
第１１および第１２の実施形態のいくつかの実施形態のｓｉＲＮＡは、２つの修飾ヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−メチル誘導体）を各々の鎖の５’末端に含む。これらの修飾ヌクレオシドで５’−Ｏ−シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイト誘導体は、既に記載したものと同様の手順（上記ステップ４および５）を用いて調製され、塩基保護２’−Ｏ−メチルヌクレオシド（２’−Ｏ−メチル−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−Ｎ４−アセチルシチジン、２’−Ｏ−メチル−Ｎ２−イソブチリルグアノシン、および２’−Ｏ−メチル−Ｎ６−イソブチリルアデノシン）から開始される。これらの修飾ヌクレオシドに２’−ヒドロキシルが存在しないことで、これらの化合物のＡＣＥ保護の必要性がなくなる。このように、５’−Ｏ−シリルおよび反応性３’−Ｏ−ホスホラミダイト部分の誘導は、以下の２つのステップによって達成される。
１．ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリルクロリド（ＢｚＨ−Ｃｌ）含有Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて、５’−Ｏ−シリルエーテルとして５’−ヒドロキシルの保護をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製、および
２．ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィンおよび５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール含有ジクロロメタン／アセトニトリルを用いて３’−Ｏ−ホスホラミダイトの変換をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製。
ホスホラミダイトの精製後パッケージングを、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された手順を用いて実施する。同様に、２つの５’−Ｏ−シリル−２’−Ｏ−メチル ヌクレオシドのホスホラミダイト誘導体を介しておこなわれる該５’−Ｏ−シリル−２’−Ｏ−メチル ヌクレオシドの取り込みは、標準的なヌクレオシド ホスホラミダイトに介して既に記載された同一の４ステップ／サイクルを２回適用することによって、達成される。
この発明の第１１の実施形態のいくつかの実施形態のｓｉＲＮＡ二本鎖は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸塩部分を含む。このリン酸塩は、アンチセンス鎖に対する最終カップリングとして化学的に導入される。所望のホスホラミダイト誘導体（ビス（シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイト）は、要するに以下のようにして合成される。すなわち、三塩化リンを１当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンを含む無水テトラヒドロフランで、過剰のトリエチルアミンの存在下で反応させる。次に、２当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルを添加して完全に反応させる。最後に、生成物をクロマトグラフィーによって精製する。ホスホラミダイトの精製後パッケージングは、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された手順を用いて実施される。同様に、アンチセンス鎖の５’末端でのホスホラミダイトの取り込みは、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された同一の４ステップ・サイクルを適用することによって、達成される。
修飾かつ保護されたオリゴヌクレオチドは、鎖アセンブリーの最後で固体担体に連結したままである。二段階の迅速な切断／脱保護手順を用いてメチルホスホネート保護基を取り除き、オリゴヌクレオチドを固体担体から切り離し、Ｎ−アシル塩基保護基を除去する。この手順がシアノエチル保護基をアンチセンス鎖上の５’−リン酸塩から取り除くという点に留意する必要がある。さらに、この手順はＡＣＥオルトエステルからアシル機能性を取り除き、２’−Ｏ−ＡＣＥ保護基をビス（２−ヒドロキシエチル）オルトエステルに変換する。この新規のオルトエステルは弱酸に対して著しく不安定であり、同様に親ＡＣＥ基よりも親水性が高い。二段階の手順を以下に手短に示す。
１．担体結合オリゴリボヌクレオチドを、二ナトリウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートトリヒドレート含有Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで処理する。この試薬は、素早くかつ能率的に、ヌクレオチド間リン酸連結からメチル保護基を取り除く。この際、固体担体からオリゴヌクレオチドを切り離すことはない。次に、担体を水で洗浄し、過剰のジチオレートを除去する。
２．オリゴリボヌクレオチドを、室温で、４０％（ｗ／ｖ）水溶性メチルアミンを用いて固体担体から切り離す。粗オリゴリボヌクレオチド含有メチルアミン溶液を次に５５℃まで加熱して保護基をヌクレオシド塩基から取り除く。粗オルトエステル保護オリゴヌクレオチドを以下の溶媒から真空中で得る。
２’−オルトエステルの除去は、合成プロセスの最終ステップである。このことは、粗オリゴヌクレオチドを、酢酸およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液、ｐＨ３．８、５５℃で、３５分間にわたって処理することで達成される。完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、次に、エタノール沈殿によって脱塩し、さらに遠心によって単離する。
また、ポリヌクレオチドの５’末端での蛍光標識の取り込みは、当業者にとって一般的であり、かつ周知の操作である。一般に、この取り込みを達成するために用いられる方法が２つあり、必要な材料はいくつかの市販元（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ；ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；およびその他）から入手可能である。第１の方法は、蛍光分子を利用するもので、該蛍光分子は、既に述べたヌクレオシドのホスホラミダイト誘導体に類似したホスホラミダイト部分で誘導体化された。そのような場合、この蛍光色素は、鎖アセンブリの最終サイクルで担体結合ポリヌクレオチドに追加される。フルオロフォア修飾ポリヌクレオチドを次に、固体担体から切り離し、前述の標準的手順を用いて脱保護した。この方法を「直接標識（ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ）」と呼ぶ。あるいは、上記第２の方法は、ホスホラミダイト部分により誘導体化されるリンカー分子を利用する。その部分は、保護された反応性官能基（例えばアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、その他）を含む。このリンカー分子は、鎖アセンブリの最後のサイクルに、担体結合したポリヌクレオチドに追加される。リンカー修飾ポリヌクレオチドは、それから固体担体から切り離されて、上述の標準的な手順を使用して脱保護される。リンカーの官能基も、標準的な脱保護手順を実施している間、またはそれ以降の基特異的処置を利用することによって脱保護される。粗リンカー修飾ポリヌクレオチドが次にフルオロフォア誘導体で反応を起こす。誘導体は、フルオロフォアの部位とリンカーの官能基との間で共有結合の形成をもたらす。この方法は「間接的標識化（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ）」と呼ばれている。
一旦合成されるならば、本発明のポリヌクレオチドを直ちに使用してもよく、あるいは将来の使用のために保存してもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを適当な緩衝液中に二本鎖として保存する。多くの緩衝液がｓｉＲＮＡを保存するのに適していることが当技術分野で知られている。例えば、緩衝液は１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ｐＨ ７．５、および１ｍＭ ＭｇＣ１２を含むものであってもよい。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、４℃で１年間そのような緩衝液中で保存された場合、その活性の３０％〜１００％を保持する。より好ましくは、そのような緩衝液に４℃で１年間保存した場合に、本発明のｓｉＲＮＡが生物学的活性を８０〜１００％保持する。あるいは、上記組成物は、そのような緩衝液に−２０℃で少なくとも１年以上保存することができる。好ましくは、−２０℃での１年以上の保存は、生物学的活性の５０％未満の減少を生じる。好ましくは、−２０℃での保存による生物学的活性の減少が１年以上後に２０％未満である。最も好ましくは、−２０℃での１年以上の保存による生物学的活性の減少が１０％未満である。
使用前にｓｉＲＮＡプールの安定性を確実にするために、それらが使用の準備が整うまで、−２０℃で乾燥した状態に保つことが可能である。使用前に、再懸濁しなければならないが、一旦再懸濁すると、例えば上述した緩衝液で、使用するまで−２０℃に保たなければならない。上述した緩衝液を、使用前に、ほぼ４℃または室温で保存してもよい。形質移入を実施する実効温度は、当業者によく知られており、例えば、室温が挙げられる。
本発明を開発する際に、二種類以上の修飾を、安定性を増加させるために二本鎖に加えた。出願人は、安定性を改善する際の手助けになる他の修飾との組合せが、将来、発見可能であることを理解している。その上、本発明の修飾は、他の目的のために所望である修飾と結合されることができた。例えば、いくつかの例で、１つの修飾は、特定の１組の条件（例えば１種類のヌクレアーゼ）に対して、分子を安定化させることができ、その一方で第２の修飾が条件（例えばヌクレアーゼの異なるファミリー）の第２の組に対して分子を安定化させることができる。あるいは、２つの別々の修飾が、ある種の条件セットの方へ分子を安定させるために、相加的にまたは相乗的に作用することができた。さらに他の例において、１つの修飾は、分子を安定させることができた、しかし、それは他の所望の性質（例えばｓｉＲＮＡの効力または毒性）上、有害な結果を有する。これらのようなケースにおいて、分子の機能性のこれらの態様を修復する付加的な修飾を加えることができた。
種々のアプローチを、安定性を強化するために必要とされる分子のタイプとキー・ポジションとを同定するのに用いることができる。１つの非限定的な実施例において、修飾−機能ウォークが実行される。この手順では、一つの種類の修飾が、センスおよび／またはアンチセンス鎖をまたがって１つ以上のヌクレオチドに対して加えられる。実質的に、修飾および未修飾を、いくつかの方法の１つによって、（１）機能性および（２）安定性について試験した。したがって、例えば、センスおよび／またはアンチセンス鎖の１および２位、３および４位、５および６位、７および８位、９および１０位、１１および１２位、１３および１４位、１５および１６位、１７よび１８位、または１８および１９位に対して、２’−Ｏ−Ｍｅ基を付加することができ、さらに機能性（例えば、特異的標的をサイレンシングするそれらの分子の能力）について試験し、作用（例えばヌクレアーゼによる）対して分子を安定化させる。安定性を強化するキーポジションが同定されるが、二本鎖機能性の損失を招く場合、続いて修飾ウォークの第２のラウンドとなることで、二本鎖機能性を高めると思われるミスマッチまたは隆起が起こる付加的な化学基（例えば、アンチセンス鎖上の５’末端の５’リン酸塩）が、安定性を高める修飾を既に含む分子に付加される。
本発明の第１３の実施形態は、ｓｉＲＮＡに関するもので、該ｓｉＲＮＡは、
（ａ）アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖は第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、その第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
（ｂ）センス鎖であって、該センス鎖は第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の２’炭素センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドは第２の２’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、を有する。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、オーバーハングを除いて、１８〜３０塩基対、より好ましくは１９〜２５塩基対、最も好ましくは１９〜２３塩基対含む。好ましくは、上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、塩基対の範囲にわたって少なくとも実質的に相補的であり、より好ましくはこの範囲にわたって１００％相補性を持つ。好ましくは、ポリヌクレオチドがＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’または３’末端のいずれかにオーバーハングを有するものであってもよい。しかし、好ましくは、任意のオーバーハングが存在する場合、該オーバーハングはセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端にある。さらに、好ましくは任意のオーバーハングが６以下の塩基長、より好ましくは２以下の塩基長である。最も好ましくは、オーバーハング無し、または３’末端でセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方にある２つの塩基のオーバーハングが存在する。オーバーハングしているヌクレオチドは、１種類以上の細胞内酵素プロセスまたはイベントによって頻繁に除去されることから、非リン酸化５’−ヌクレオチドが残り、アンチセンス鎖の５’末端上にオーバーハングを持たないことが好ましい。
第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化は、ヌクレオチドの糖部分の５’炭素に付着した１つ以上のリン酸基の存在に言及するものである。好ましくは、１つのリン酸基のみが存在する。
２’炭素修飾とは、ヌクレオチドの糖部分の２’炭素上にある修飾のことをいう。「第１の２’炭素センス修飾」とは、第１の５’末端センス・ヌクレオチド上にある修飾のことをいう。「第２の２’炭素センス修飾」とは、第２の５’末端センス・ヌクレオチド上にある修飾のことをいう。
化学修飾のＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、またはＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に沿ったキーポジションへの追加がこれらの分子の化学的かつ機能的な特性を有意に変えることができることが、知られている。出願人は、修飾をｓｉＲＮＡのセンス鎖に付加することで、該鎖がＲＩＳＣに入るのを防ぎ、センス鎖特異的オフ・ターゲット効果を誘導することができることを、理解する。そのような修飾として、任意の数の化学部分を付加することが含まれる。好ましくは、その部分はヌクレオチドのリボース環の２’位（すなわち、２’炭素）に付着される。本発明によれば、好ましくは、上記修飾が２’−Ｏ−アルキル基である。しかし、本発明の文脈のなかで使用された場合に、他の修飾がこの鎖によってオフ・ターゲット効果を最小限にする。そのような修飾がオフ・ターゲット効果を最小化する条件の下で含まれる場合、例えば、２’修飾ヌクレオチドを、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミン修飾ヌクレオチド、および２’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択してもよい。修飾がハロゲンの場合、このハロゲンは好ましくはフッ素である。２’修飾ヌクレオチドが２’アミン修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくは−ＮＨ２である。この２’修飾ヌクレオチドが２’−アルキル修飾である場合、好ましくは、その修飾は２’メチル修飾であり、該メチル部分の炭素は糖部分の２’炭素に直接付着する。
上記したように、好ましくは、修飾は２’−Ｏ−アルキル基である。より好ましくは、修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロビル、２’−Ｏ−ブチル、２’−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−メチル−Ｏ−メチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、および２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）からなる群から選択される。最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル部分である。さらに、修飾が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドの各々で同一である必要はない。しかし、本発明の分子を合成することに関して実用上の観点から、全体として同一の修飾を用いることが求められる場合もある。
上記の修飾は、他のいかなる部分も修飾されないことを示唆していると解釈してはならない。オフ・ターゲット効果を増加させない限り、他の種類の修飾が許される。例えば、いくつかの実施形態で、付加的な修飾を、センス鎖の１、２、３、またはそれ以上の連続的なヌクレオチドまたは１つ置きのヌクレオチドに加えることができる。あるいは、付加的な修飾を、ＲＩＳＣ複合体へセンス鎖を入れるためのキーとして同定される特異的な位置に限定することができる。さらに、付加的な２’−Ｏ−メチル基（または他の２’修飾）は、センス鎖の一つ以上、好ましくは全てのピリミジン（例えば、Ｃおよび／またはＵヌクレオチド）に加えられることができ、さらに／あるいは２’Ｆｌ修飾（または他のハロゲン修飾）をアンチセンス鎖の１つ以上、好ましくは全てのピリミジン（例えば、Ｃおよび／またはＵヌクレオチド）に加えることができる（もし、ハロゲン修飾を以下の第１６および第１７の実施形態と併用して用いるならば、好ましくは、最初の２つの５’末端アンチセンス・ヌクレオチドに入るもの以外の全てのピリミジンが、ハロゲン修飾であり、あるいは最初の３つが他の修飾を含むならば、最初の３つの５’末端アンチセンス・ヌクレオチド）。
化学修飾に加えて、１００％未満の相同性を共有する標的とのＲＩＳＣ媒介結合に関与するこれらの鎖の能力を変える塩基対のミスマッチまたは隆起（バルジ）をセンスおよび／またはアンチセンス鎖に加えることができると仮定される。そのようなミスマッチの例として（限定されるものではないが）、プリン−ピリミジン・ミスマッチ（例えばＧ−Ｕ，Ｃ−Ａ）とプリン−プリンまたはピリミジン−ピリミジン・ミスマッチ（例えばＧ−Ａ、Ｕ−Ｃ）が挙げられる。この種の修飾の導入は、上記の修飾と組み合わせることが可能であり、さらにオフ・ターゲット効果を減らすかどうか決定するために、それらを評価すること可能である。
どんな修飾が許されるかについて決定するために、いくつかの非制限アッセイを、オフ・ターゲット効果を制限する修飾を同定するために実行することができる。１つの非限定的例において、センス鎖（試験されている修飾を担持する）を、多くの標識ヌクレオチドのうちの１つで標識さすることができる。その後、結合アッセイを実施して、修飾センス鎖に対するＲＩＳＣの親和性を未修飾形状のそれと比較することができる。
第１４の実施形態によれば、本発明は、ヘアピンをｓｉＲＮＡを形成することができる単分子のｓｉＲＮＡに関するもので、該単分子ｓｉＲＮＡは、
（ａ）アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
（ｂ）センス領域であって、該センス鎖は第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の２’炭素センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドは第２の２’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
（ｃ）ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
を含む。
この実施形態によれば、修飾の範囲は第１３の実施形態のものと同一である。しかし、ポリヌクレオチドが単分子であり、かつヘアピンを形成することができるが、２本の異なる鎖ではないことから、センス領域とアンチセンス領域との両方を含む連続した１本の分子が存在する。好ましくは、上記センス領域およびアンチセンス領域が少なくとも実質的に相補的であり、より好ましくは１００％の相補性を有する。第１３の実施形態と同様に、好ましくは、上記センス領域およびアンチセンス領域は１８〜３０の塩基対、より好ましくは１９〜２５塩基対、さらに好ましくは１９〜２５塩基対を含み、最も好ましくは１９〜２３塩基対を含む。好ましくは、上記ヌクレオチドがＲＮＡである。
本発明にもとづいて、単分子ｓｉＲＮＡ、特に左回りの（ｌｅｆｔ−ｈａｎｄｅｄ）単分子構造（例えば、５’−ＡＳ−Ｌｏｏｐ−Ｓ）を設計する場合、好ましくは、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補的である塩基から数えて（すなわち、センス領域の３’末端から数えて）、センス領域の第１８、第１９、または第２０の塩基であるヌクレオチドとして定義される。第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、このように定義される。なぜなら、ヘアピンを形成することができる単分子ｓｉＲＮＡが細胞に入る場合、典型的には、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）が、約１８〜２０塩基対の２本の異なる鎖（ｓｉＲＮＡ）から構成される分子に、長い二本鎖領域を含む絵ヘアピンｓｉＲＮＡのなかに処理し、この処理された分子の５’末端に結合したセンス鎖修飾をそれらの分子が保持することが求められるからである。最も好ましくは、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、センス領域の３’末端からセンス領域の１９番目の塩基であるヌクレオチドとして定義される。さらに、好ましくは、ポリヌクレオチドは、左回りのヘアピンを形成することができる。
上記ヘアピンは、４〜１０塩基から構成されるループ構造と、センス領域とを含み、センス領域およびアンチセンス領域は個々に１９〜２３塩基対長であり、互いに実質的に相補的である。ループ構造の好ましい配列として、例えば、５’−ＵＵＣＧ（配列番号３２３）、５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ（配列番号３２４）、および ５’−ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号３２５）が挙げられる。
ヘアピンは、好ましくは、アンチセンス領域の下流にあるループ領域によって構築される。この構成は、末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化することがより容易なので、この構造が望ましい。このように、単分子ｓｉＲＮＡを設計する際、オーバーハングが５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの上流にないことが好ましい。いくつかの実施形態のセンス領域３’末端で、例えば、１、２、または３ヌクレオチドのオーバーハングを有することが望ましい場合もある。さらに、好ましくは、単分子ｓｉＲＮＡは左回りのヘアピンを形成することができる。
ｓｈＲＮＡは、さらに、ステム領域を含むことができ、該ステム領域は、ループ構造の第５’末端および第３’末端に直接隣接した１つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み、さらに該ステム領域の１つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが標的特異的（もしくは非標的特異的）である。好ましくは、その単分子ｓｉＲＮＡの全長は、１００塩基対未満であり、より好ましくは８５塩基対未満である。
本発明の単分子ｓｉＲＮＡは、最終的には細胞の機能（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ）によって２本の異なる鎖に変換されるように処理される。さらに、これらの単分子ｓｉＲＮＡを、全ての修飾よりも少ないもので細胞に導入してもよく、また導入された天然のプロセスまたはプロセッシング用分子を用いて、細胞自体の中で修飾することも可能である（例えば、細胞内でのリン酸化）。しかし、好ましくは、上記ｓｉＲＮＡに対して、既に存在している全ての修飾が導入される（同様に、ｓｉＲＮＡが２つの異なる鎖から構成される場合、第１の実施形態の鎖が好ましくは全ての修飾を持つ細胞に導入される。例えば、導入後にリン酸化の基によって修飾され得るにもかかわらず）。
第１５の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化するための方法に関し、該方法は、修飾ｓｉＲＮＡを標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、さらすことを含み、上記ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを有し、
（ａ）上記センス鎖が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の２’炭素センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドは第２の２’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
（ｂ）上記アンチセンス鎖が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
を含む。
第１５の実施形態の修飾ｓｉＲＮＡは、好ましくは第１３の実施形態のｓｉＲＮＡである。
第１６の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化するための方法に関し、上記方法は、修飾ｓｉＲＮＡを標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、ヘアピンを形成することができる単一ｓｉＲＮＡをさらすことを含み、上記ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを有し、
（ａ）該センス領域は第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の２’炭素センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドは第２の２’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
（ｂ）上記アンチセンス領域が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
（ｃ）ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
を含む。
第１６の実施形態の修飾ｓｉＲＮＡは、好ましくは第１４の実施形態のｓｉＲＮＡである。
他の実施形態では、修飾の組み合わせが以下のように記載されるように、なおも追加の修飾が存在し得る。すなわち、（１）２’修飾基（リボース上の炭素２）によって修飾される鎖の５’から数えて、センス領域（またはｓｈＲＮＡのセンス領域）の１および２位（または１、２、および３位）、（２）２’修飾基（リボース上の炭素２）によって修飾される鎖の５’末端から数えて、センス領域（またはｓｈＲＮＡのアンチセンス領域）の１および２位（または１、２、および３位）、および（３）アンチセンス鎖の５’末端がリン酸化されている（リボースの炭素５）。３種類の修飾全ての組み合わせは、実質的に、センスおよびアンチセンス鎖によって誘導されたオフ・ターゲット効果を減少させる点で有益であると思われる。
第１７の実施形態によよれば、本発明はｓｉＲＮＡを提供するもので、該ｓｉＲＮＡは、
（ａ）アンチセンス鎖であって、上記アンチセンス鎖が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第１の２’炭素アンチセンス修飾を含み、上記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第２の２’炭素アンチセンス修飾を含み、該第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
（ｂ）センス鎖であって、上記センス鎖が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
を含む。
この第１７の実施形態によれば、上記修飾は、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドに２’炭素修飾の付加することで第１３の実施形態のものと同様に定義される。あるいは、第２の末端アンチセンス・ヌクレオチド上の２’炭素修飾の付加によって、上記修飾は第１３の実施形態のものと同様に定義される。これらの２’炭素修飾は、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドに対する修飾と同じように定義される。さらに、第３の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド上にさらなる２’炭素修飾が存在してもよい。
第１８の実施形態によれば、本発明はヘアピンを形成することができる単分子のｓｉＲＮＡ分子を提供する。このｓｉＲＮＡは、
（ａ）アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第１の２’炭素アンチセンス修飾を含み、上記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第２の２’炭素アンチセンス修飾を含み、さらに第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの５’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
（ｂ）センス領域であって、該センス鎖は第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、前記第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を含み、前記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
（ｃ）ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
から構成される。
この１８の実施形態によれば、上記修飾は、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドに２’炭素修飾の付加することで第１７の実施形態のものと同様に定義される。これらの２’炭素修飾は、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドに対する修飾と同じように定義される。さらに、第３の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド上にさらなる２’炭素修飾が存在してもよい。
第１９の実施形態によれば、本発明は、遺伝子サイレンシングの過程でオフ・ターゲット効果を減少させるための方法を提供する。この方法は、第１７の実施形態のｓｉＲＮＡを、標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、投与することを含む。
第２０の実施形態によれば、本発明は、遺伝子サイレンシングの過程でオフ・ターゲット効果を減少させるための方法を提供する。この方法は、第１８の実施形態のｓｉＲＮＡを、標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、投与することを含む。
上記の実施形態が増加した特異性を目的とするにもかかわらず、他のパラメータ（例えば、安定性に影響を及ぼす上述のもの）に影響を及ぼすように設計可能である修飾の他の種類やそれらの組合せによって、ｓｉＲＮＡが修正される点に注意することは重要である。
しかし、いくつかの安定性指向の修飾は、機能性が制限されたｓｉＲＮＡを与え、例えば対照またはエクサエクオ剤として使用する以外は使用されない（例えば、センス鎖であって、上記センス鎖が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’−Ｏ−アルキル（好ましくはメチル）センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’−Ｏ−アルキル（好ましくは、メチル）センス修飾を含む；少なくとも１つの（好ましくは、全ての）２’−Ｏ−アルキル（好ましくはメチル）ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記少なくとも１つの、好ましくは全ての２’−Ｏ−アルキル（好ましくはメチル）ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドが、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第２の５’末端センス・ヌクレオチド以外のヌクレオチドである；アンチセンス鎖であって、上記アンチセンス鎖が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第１の２’−Ｏ−アルキル（好ましくはメチル）アンチセンス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’−Ｏ−アルキル（好ましくはメチル）アンチセンス修飾を含む；上記アンチセンス鎖上の２’標識ピリミジン、好ましくは少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル（好ましくはメチル）ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドであって、上記少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル（好ましくはメチル）ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドが、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドまたは上記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、さらに必要に応じて、蛍光標識等の標識を上記５’末端センス・ヌクレオチドに有する）。
さらに、修飾のいくつかの他の関連した組み合わせを用いて、対照群またはエクサエクオ剤として用いることができるｓｉＲＮＡを開発することができる。例えば、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化することなく、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをこの開示で記載される第１７および第１８の実施形態と同様で開発することができる。したがって、一実施形態下で、（ｉ）各々が２’修飾、例えば上記した２’修飾（例として２’−Ｏ−メチル修飾）を各々が含む第１および第２、または第１、第２、および第３の５’炭素末端センス・ヌクレオチドと、（ｉｉ）各々が２’修飾、例えば上記した２’修飾（例として２’−Ｏ−メチル修飾）を各々が含む第１および第２、または第１、第２、および第３の５’炭素末端アンチセンス・ヌクレオチドとに制限される２’修飾がある。
エクサエクオ（ｅｘａｅｑｕｏ）剤または対照群を用いる場合、ブロック基によりセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端の５’炭素位を修飾することが求められる場合もある。このブロック基は、例えば、アルキル基または他のいずれかの基であってもよく、ヌクレオチドの５’炭素位のリン酸化を防ぐ。リン酸化は、細胞内に存在するキナーゼの働きによって細胞内で生ずると思われる。典型的なブロック基として、限定されるものではないが、メチル、Ｏ−メチル、およびアミン基が挙げられる。
これらの分子は、機能的ではないが、負の対照研究で使用され、またエクサエクオ剤として使用することが可能である。さらに、もし上記した標識等の方式が用いられる場合、これらの薬剤はトラッキング剤として有用であり、形質移入の検出を助けると思われ、さらに細胞内で分子がどこに存在するかの検出も助けるものと思われる。これらの薬剤は、サイレンシングのために用いられないことから、好ましくは１８〜３０塩基対ではあるが、それらは１６〜２８塩基対を含むことができる。
さらに、リン酸主鎖に対する安定化修飾は、本発明のいくつかの用途のためにｓｉＲＮＡ内に含めることが可能である。例えば、少なくとも１つのホスホロチオエートおよび／またはメチルホスホネートを、オリゴヌクレオチド主鎖のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖にある、同様に存在しうる任意のオーバーハング、ループ構造、またはステム構造にある、任意の、または全てのピリミジンのいくつかの、または全ての３’位にあるリン酸基と置換してもよい。ホスホロチオエート（およびメチルホスホネート）類似体は、オリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基の修飾から生ずる。ホスホロチオエート内では、リン酸塩Ｏ − が硫黄原子に置き換わる。メチルホスホネートでは、酸素がメチル基によって置き換わる。一実施形態では、ホスホロチオエート修飾またはメチルホスホネートは、２’フッ素（または他のハロゲン）修飾ヌクレオチドも含む全てのアンチセンス鎖ヌクレオチドの３’位に置かれている。さらに、ホスホロチオエート３’修飾を、２’フッ素置換の代わりに、および独立して用い、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を高めることが可能である。これらの修飾は、ｓｉＲＮＡ用途において、本明細書に記載された他の修飾と併用して、あるいはそれらの修飾とは別個に、用いることが可能である。
ヌクレアーゼは、一般に、リン酸塩部分およびリボース環の２’ＯＨ位にある酸素基の両方を用いてＲＮＡに対する攻撃を媒介する。複数の酸素の１つに対する硫黄基の置換によって、この反応に参加するリン酸塩の能力が取り除かれ、ヌクレアーゼ消化に対するこの部位の感度が制限される。しかし、ホスホロチオエートが典型的に有毒な点に留意する必要があることから、いかなる毒作用も否定される場合に主に有益であり、例えば、他のヌクレオチド毎、第３のヌクレオチド毎、または第４ののくレオチド毎にこの修飾を用いることを制限することによって、達成しうると考えることができる。
さらに、いくつかの用途では、本発明のヌクレオチドに標識（例えば、蛍光標識、放射性標識、または質量標識）を取り込むことが望ましい場合もある。
本発明の上記修飾は、ｓｉＲＮＡと組み合わせてもよく、このｓｉＲＮＡは、無作為に選択、または、例えば、米国特許出願第１０／７１４，３３３号に記載されているような論理的設計に基づいて、選択された配列を含む。さらに、細胞の機能（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）による処理を促進し得る全体的または部分的な内部熱安定性に基づいて、配列を選択することが望ましい場合もある。
本発明の第１３〜２０の実施形態を開発する際に、２種類以上の修飾を二本鎖に加えてオフ・ターゲット効果を最小化させた。上記したように、出願人は、オフ・ターゲット効果を最小化する際の手助けになる他の修飾および組合せが、将来、発見可能であることを理解している。その上、本発明の修飾を、他の目的のために望まれる修飾と結合することができた。例えば、いくつかの例で、１つの修飾は、オフ・ターゲット・サイレンシング（例えば、ＲＩＳＣに結合したセンス鎖）の１つの特定のステップに影響を及ぼすことができ、その一方で第２の修飾は、例えば相同性が１００％未満である標的と結合するセンス／アンチセンス鎖の能力を変えることなく、異なるステップに完全に影響を及ぼすことができた。あるいは、２つの別々の修飾が同一のステップに影響を及ぼすことができた。いくつかの例では、２つ以上の修飾が、１つ以上のステップでの不要な相互作用またはプロセスを最小化することで、相加的または相乗的に作用して、オフ・ターゲット効果を制限した。さらに他の例において、１つの修飾は、オフターゲット効果を除去することができたが、それは他の所望の性質（例えばｓｉＲＮＡの効力または安定性）上、有害な結果を有する。これらのようなケースにおいて、分子の機能性のこれらの態様を修復する付加的な修飾を加えることができた。
種々のアプローチを、センスおよび／またはアンチセンス鎖オフ・ターゲット化効果を除去するために必要とされる分子のタイプとキー・ポジションとを同定するのに用いることができる。１つの非限定的な実施例において、修飾−機能ウォークが実行される。この手順では、一つの種類の修飾が、センスおよび／またはアンチセンス鎖をまたがって１つ以上のヌクレオチドに対して加えられる。実質的に、修飾および未修飾を、いくつかの方法の１つによって、（１）機能性および（２）オフ・ターゲット効果について試験した。したがって、例えば、センスおよび／またはアンチセンス鎖の１および２位、３および４位、５および６位、７および８位、９および１０位、１１および１２位、１３および１４位、１５および１６位、１７よび１８位、または１８および１９位に対して、２’−Ｏ−Ｍｅ基を付加することができ、さらに機能性（例えば、特異的標的をサイレンシングするそれらの分子の能力）とオフ／ターゲット効果（例えば、マイクロアレイ分析による）について試験する。いくつかの、または全てのオフ・ターゲット効果を取り除くキーポジションが同定されるが、二本鎖機能性の損失を招く場合、続いて修飾ウォークの第２のラウンドとなることで、二本鎖機能性を高めると思われるミスマッチまたは隆起が起こる付加的な化学基（例えば、アンチセンス鎖上の５’末端の５’リン酸塩）が、オフ・ターゲット効果を取り除く修飾を既に含む分子に付加される。
本発明の第１３〜第２０の実施形態の修飾が、用いるｓｉＲＮＡの機能性に依存して、異なる効果を有することが可能である点に留意する必要がある。このように、高機能的ｓｉＲＮＡでは、本発明の修飾は、分子が一定郎の機能性を失う原因になり得るが、それにもかかわらずオフ・ターゲット効果が減少することから望ましい。対照的に、適度または不十分に機能的なｓｉＲＮＡが使用される場合、機能性の減少はわずかであり、いくつかの例では、機能性を高めることができる。
機能性を保持し、かつ分解に抵抗する本発明のｄｓＲＮＡの安定性が塩基配列、細胞種、または導入される種に依存することがないことから、本発明は広範囲に及ぶ生物に適用可能であり、該生物として、限定されるものではないが、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス、および菌類が挙げられる。本発明は、牛、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、犬歯、齧歯動物（例えばハムスター）、マウス、およびラット、さらに霊長類（例えばゴリラ、チンパンジー、およびヒト）等の哺乳類での使用にとって特に有利である。
本発明を、多様な細胞型（例えば、限定されるものではないが、一次細胞、生殖細胞系列、および体細胞）で、有利に使うことが可能である。細胞は、例えば、幹細胞または分化した細胞である。例えば、細胞型として、胚細胞、卵母細胞、精細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球（ケラチノサイト）、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、さらに内分泌物または外分泌腺の細胞が挙げられる。
本発明は、幅広い範囲の遺伝子に対するＲＮＡ干渉を用いる（および／または対照として用いる）用途に適用可能であり、該遺伝子として、限定されるものではないが、糖尿病、アルツハイマーおよび癌等の疾患に関係するヒトゲノムの４５，０００遺伝子、さらにヒト、マウス、ハムスター、チンパンジー、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ブタ、イヌ、ネコ、線形動物（例えば線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ハエ（例えばキイロショウジョウバエＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、さらに他の脊椎動物および無脊椎動物のゲノムに含まれる全ての遺伝子が挙げられる。
本発明のｓｉＲＮＡは、任意の方法によって細胞に投与することが可能であり、該方法は、現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法である。例えば、ｓｉＲＮＡを受動的に細胞へ送達することが可能である。
修飾ｓｉＲＮＡの受動的な取り込みは、例えば、コンジュゲート、例えばセンス鎖の５’末端にあるポリエチレングリコール部分またはコレステロール部分、および／または、適当な状況下で、医薬的に許容される担体の存在によって、調整することができる。
送達のための他の方法として、限定されるものではないが、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム、陽イオン性脂質／リポソーム、マイクロインジェクション、電気穿孔法、免疫沈降法、およびｓｉＲＮＡと特定のコンジュゲートまたはリガンド（例えば抗体、抗原、もしくは受容体）とのカップリングが挙げられる。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、投与される際に二本鎖を含む。
さらに、遺伝子サイレンシングのレベルを評価する方法は制限されない。したがって、任意の所定のｓｉＲＮＡのサイレンシング能力は、ノーザン分析、ウェスタン分析、ＰＴＰＣＲ、発現プロファイリング、その他を含むがこれらの限定されない任意の多数の当該分野で試験された手順のうちの１つによって、研究され得る。
さらに、本発明のｓｉＲＮＡは、多様な用途の組み合わせに使用することが可能であり、限定されるものではないが、該用途として、基礎研究、創薬および開発、診断、ならびに薬物療法が挙げられる。例えば、本発明を、遺伝子産物が創薬または開発のための標的であるかどうかを確認するのに用いることができる。このような用途では、目的とするところの標的核酸配列に対応するｍＲＮＡは、標的にされた分解に関して同定される。特定の遺伝子を標的することに特異的である本発明のｓｉＲＮＡを細胞または器官、好ましくは二本鎖の形態に導入する。細胞または生体を、標的ｍＲＮＡの分解を可能とする条件下に保つことで、遺伝子の活性または発現が減少する。遺伝子の発現または活性の減少の程度を測定し、そのような減少発現または活性の効果とともに、測定は、もし発現または活性が減少した場合、目的とする核酸配列が創薬または開発のための作用因子である。このように、表現型的に望ましい効果は、目的とするところの特定の標的核酸のＲＮＡ干渉を伴うことがありえ、適当な例では、毒性および薬物動態研究は行わうことができる、治療製剤が開発される。
本発明は、例えば、目的とする疾患または障害の原因または因子と考えられる目的とする標的核酸の活性を減衰させることによって、生体での疾患または障害の一時的または永続的な状態を誘発するＲＮＡ干渉の用途にも用いることが可能である。目的とする標的核酸の活動亢進は、疾患または障害をより悪化させ、あるいは場合によっては、目的とするところの疾患または障害を改善するか、治療する傾向がある。同様に、目的とする標的核酸の活性減少によって、疾患または障害が生ずる場合もあり、それによってより悪化したり、場合によっては、改善または治癒する傾向がある。目的とする標的核酸は、ゲノムもしくは染色体核酸または染色体外核酸（例えばウィルス核酸）を含むことができる。
さらに、本発明は、目的とする標的核酸または標的核酸配列の機能を判断するＲＮＡ干渉用途で使用することが可能である。例えば、目的とする一定の標的核酸の活動を除外または減少させるノックダウン実験である。このことは、目的とする特定の標的核酸を標的化する１種類以上のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉を実行することで、達成することができる。そのようなノックダウンの効果を観察することは、目的とする標的核酸の機能に関する推論を導くことができる。ＲＮＡ干渉は、対立遺伝子のどちらか一方を有している目的とする標的核酸の活性を弱毒化させ、生体または系に対する効果を観察することで、多形性の効果（例えば双対立形質の多形性）を検討するのに用いられることもできる。治療的に、対立遺伝子の一方または他方、あるいは両方を、選択的な対立遺伝子サイレンシングが望ましいＲＮＡ干渉を使用して選択的に対立遺伝子サイレンシングことができる。
さらに、本発明が、疾患の治療、または標的の過剰または過小発現における動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの医薬製造での組成物の使用を含む、診断、予防、および治療等のＲＮＡ干渉用途で使用可能である。好ましくは、上記疾患または障害は、１種類以上のタンパク質の機能異常に起因するものであり、その疾患または障害は１種類以上のタンパク質からなる遺伝子産物の発現に関係している。例えば、特定のヒト胸部ガンが一般に「ｂｃｌ−２」遺伝子として知られている遺伝子から発現されるタンパク質の機能障害に関連があると広く認められる。ｂｃｌ−２遺伝子に対する１種類以上のｓｉＲＮＡを使用し、また必要に応じて、薬物が乳癌の処置のために使われる医薬的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバント組み合わせて、薬物を、本発明の組成物および教示に従って製造することができる。出願人は、細胞モデルで方法および組成物の有用性を確立した。ヒトを含む動物の細胞に対するポリヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）の送達の方法は、周知である。当技術分野で現在知られている、または知られるであろういっさいの送達ビヒクルであって、ｓｉＲＮＡ等のポリヌクレオチドをヒト等の動物に導入するための有用性を有する送達ビヒクルは、本発明に従って製造された組成物中に存在しうる任意の修飾にこの送達ヒビクルが不適合でない限り、本発明に従う医薬の製造において有用であることが予測される。本発明によって作られる組成物に適合しない送達ビヒクルは、細胞培養での有効性に対して測定される場合に９５％を超えて組成物の有効性を減らすものである。
動物モデルは、例えば、癌、脈管系、先天異常または代謝の疾患を含む多くの、多くの疾患に対して存在する。哺乳類（例えばマウス、ラットまたはヒト以外の霊長類）のような動物で、特定の疾患または障害のために最適投薬計画に到達するための投薬計画で、動物に核酸を投与することは、当業者に周知である。一旦有効性が当業者により、単調な実験によって哺乳類で確立されるならば、ヒト治験の開始の間の投薬計画はそのような研究で達されるデータに基づいて達成することができる。
本発明にもとづいて製造される薬物の投薬量は、被検体のキログラムあたり数マイクログラムから数ミリグラムまで変化する。当技術分野で知られていているように、投薬は投与を受けた哺乳類の質量、用量の投与を受けた哺乳類の性質、疾患または疾患の重症度、さらに、当業者に知られている他のファクターの中で、被験体の血清の薬物の安定性によって変化する。
これらの用途に関して、疾患を有することが疑われる生体または特定の目的とする標的核酸の操作による変調に従う疾患は、ｓｉＲＮＡを投与することによって処置される。ｓｉＲＮＡ処置による結果として、寛解性、一時的な軽減、予防、および／または特定の疾患に対する診断が得られる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは医薬的に許容される担体または希釈剤で医薬的に許容可能な方法で投与される。
本発明の治療上の適用は、種々の治療組成物および投薬方法によって、実行することができる。医薬的に許容される担体および希釈剤は、当業者に良く知られいる。細胞および生体に対する投与の方法もまた、当業者に周知である。投与計画が、例えば、治療を受ける疾患または障害の反応の重症度および程度次第であることが、知られており、治療の過程は数日から数ヶ月にまで及ぶか、または障害または疾患状態に対して所望の効果が達成されるまでである。ｓｉＲＮＡの慢性投与は、いくつかの疾患または障害で持続する所望効果のために必要であることができる。例えば、適当な投与計画は、医薬的に許容可能な送達ルート近傍で、医薬的に許容される担体または希釈剤で１種類以上のｓｉＲＮＡの変更量を投与することによって決定することができ、レシピエント生体の体内薬物累積値の量は投与の後で種々の時間で測定することができる。同様に、所期の効果（例えば、遺伝子産物または遺伝子活性の発現の抑制の程度）をｓｉＲＮＡの投与の後で種々の時間に測定することができる、また、このデータは他の薬物動態学的なデータ（例えば生体または器官での蓄積）と相関していることができる。当業者は、最適な投薬量、投与計画、その他を決定することができる。当業者は、ヒトに関する研究ガイド通りに生体内および生体外からＥＣ５０を用いることが可能である。
またさらに、本発明をＲＮＡ干渉用途（例えば診断法、予防薬、および薬物療法学）で用いることが可能である。これらの用途のために、特定の目的とする標的核酸の操作による変調に従う疾患または障害を有すると疑われる生体が、ｓｉＲＮＡを投与することで処置される。ｓｉＲＮＡ処置の結果は寛解性を示し、一時的軽減、予防的であり、さらに／または特定の疾患もしくは障害の診断となる。好ましくは、ｓｉＲＮＡを医薬的に許容される担体または希釈剤で、医薬的に許容される方法で、ｓｉＲＮＡが投与される。
さらに、上記ｓｉＲＮＡは、局所的にクリームまたは軟膏、経口製剤（例えばカプセルまたは錠剤または懸濁液または溶液など）として適用することがでる。投与経路として、静脈内、筋肉内、経皮、真皮、皮膚、皮下、鼻腔内、経口、直腸、点眼、さらには有利な場所、例えば器官または組織に近い場所、標的となる目的の核酸を持つ細胞種にｓｉＲＮＡを放出するための装置を組織移植することによってもよい。
別の実施形態によれば、本発明は、ｓｉＲＮＡ，センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が少なくとも１つのオルトエステル修飾を２’位に有する。
本発明の別の態様にれば、本発明は、ｓｉＲＮＡであって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、該アンチセンス鎖が少なくとも１つのオルトエステル修飾および／または２’−ハロゲン修飾、２’−アルキル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−アミン修飾、および２’−デオキシ修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む。
別の実施形態によれば、本発明はｓｉＲＮＡを含み、該ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖および／またはアンチセンス鎖が、少なくとも１つのオルトエステル修飾を含み、さらに塩基センス鎖および／またはアンチセンス鎖が、２’−ハロゲン修飾、２’−アルキル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−アミン修飾、および２’−デオキシ修飾からなる群から選択される少なくとも１つの２’修飾を含む。
さらに別の実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡを含み、該ｓｉＲＮＡは、（ａ）センス鎖であって、上記センス鎖が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の２’炭素センス修飾を含み、上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドは第２の２’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、（ｂ）アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖が第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第１の２’炭素アンチセンス修飾および５’修飾を含み、さらに前記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第２の２’炭素アンチセンス修飾を含む、アンチセンス鎖と、を含む。
さらに別の実施形態では、本発明はｓｉＲＮＡを含み、該ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、上記アンチセンス鎖は、少なくとも１つの２’−オルトエステル修飾を含み、また上記アンチセンス鎖は、少なくとも１つの２’−オルトエステル修飾を含み、上記アンチセンス鎖は、さらに、２’−オルトエステル修飾、２’−アルキル修飾、２’−ハロゲン修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−アミン修飾、および２’−デオキシ修飾からなる群から選択される１つ以上の修飾によって修飾され、上記２’−アルキル修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、および２’−ハロゲン修飾がアンチセンス鎖の１つ以上のピリミジン上にあり、さらにｓｉＲＮＡは、３’キャップを含む。この２’炭素修飾は、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾等の２’−Ｏ−アルキル修飾である。上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび／または第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、５’ブロック基によってさらに修飾される。この５’ブロック基は、５’−メチル修飾、５’−Ｏ−メチル修飾、および５’−アジド修飾からなる群から選択することができる。
別の実施形態では、上記５’末端センス・ヌクレオチドおよび／または５’末端アンチセンス・ヌクレオチドの第１および第２の２’−Ｏ−アルキル修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾であり、さらに上記第１の５’末端センスおよび／またはアンチセンス・ヌクレオチドは、さらに、５’ブロック基を含むことができる。この５’ブロック基は、５’−メチル修飾、５’−Ｏ−メチル修飾、または５’アジド修飾からなる群から選択される。別の実施形態では、本発明は、アンチセンス鎖およびセンス鎖からなるｓｉＲＮＡを提供するもので、該センス鎖は、第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドは、第１の２’炭素センス修飾を含み、また第２の５’末端センス・ヌクレオチドは第２の２’炭素センス修飾を含む。
他の実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡを提供するもので、該ｓｉＲＮＡは、（ａ）センス鎖であって、該センス鎖が第１の５’末端センス・ヌクレオチドおよび第２の５’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第１の５’末端センス・ヌクレオチドが第１の２’炭素センス修飾を含み、また上記第２の５’末端センス・ヌクレオチドが第２の２’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、（ｂ）アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖は、第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第１の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドは５’リン酸塩修飾を含み、また上記第２の５’末端アンチセンス・ヌクレオチドは２’炭素アンチセンス修飾を含む、アンチセンス鎖と、を含む。
他の実施形態では、本発明の組成物のいずれかが、さらに３’キャップを含む。この３’キャップは、例えば、逆位のデオキシチミジンである。
他の実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも１つの２’−デオキシ修飾および／またはメチルホスホネート・ヌクレオチド間連結を含むことができる。本発明の組成物はまた、１つ以上のピリミジン上に、２’−アルキル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、および２’−ハロゲン修飾から選択される修飾を含む。上記２’−アルキル修飾を２’−メチル修飾、例えば２’−Ｏ−メチル修飾とすることができる。上記２’−ハロゲン修飾を、例えば２’−フッ素修飾とすることができる。
他の実施形態では、本発明の上記組成物は、少なくとも１つの２’−アミン修飾および／または２’−ハロゲン修飾を含むことができる。この２’−アミン修飾は、例えば、２’−ＮＨ２修飾である。２’−ハロゲン修飾は、例えば、２’−フッ素修飾である。本発明の組成物は、１つ以上の修飾ヌクレオチド間連結を含むことができ、例えば、１つ以上のホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、メチルホスホネート連結、さらにそれらの組み合わせを含むことができる。
本発明の他の実施形態では、上記組成物のいずれかも、コンジュゲートを含むことができる。このコンジュゲートは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。コンジュゲートは、コレステロールまたはＰＥＧであってもよい。コンジュゲートは、さらに、蛍光標識等の標識を含む。この蛍光標識は、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオロセイン、およびＤａｂｓｙｌからなる群から選択される。あるいは、上記蛍光標識は、当技術分野で公知のいずれかの蛍光標識を用いてもよい。
他の実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも１つの２’−オルトエステル修飾を含み、この２’−オルトエステル修飾が、好ましくは２’−ビス（ヒドロキシエチル）オルトエステル修飾である。
他の実施形態では、本発明の組成物のいずれかがＲＮＡ干渉を実施する方法で用いることができ、該方法は、本発明の１種類以上の組成物を細胞に投与することを含む。好ましくは、オルトエステル修飾がｓｉＲＮＡに存在し、オルトエステル修飾が２’−ビス（ヒドロキシエチル）オルトエステルである。
ある程度の具体性をもって本発明を記載するために、ここで実施例が提供される。これらの実施例は、いかなる形であれ特許請求の範囲の範囲を制限することを意図したものでも制限を加えるものでもない。本発明は以下の実施例への言及を通して容易に理解されるにもかかわらず、それらは本発明を説明するための手段で、特に言及しない限り、本発明を制限することを意図したものではない。
（実施例１）
（ｓｉＲＮＡの合成）
ＲＮＡオリゴ・ヌクレオチドは、図１３に例示したヌクレオチド添加反応サイクルを使用する段階的な方式で合成した。合成は、好ましくは、適切な機械上での自動化プロセスとして行う。いくつかのこのような合成機械は、当業者に周知である。各ヌクレオチドは、固体担体に結合したオリゴ・ヌクレオチドに連続的に加える（３’方位から５’方位）。ポリスチレン担体が好ましいが、いかなる適切な担体を使用してもよい。鎖の３’位末端での第１のヌクレオシドは、固体担体に共有結合的に付着される（固体担体に対する付着）。ヌクレオチド前駆体、ホスホラミダイトやＨ−ホスホン酸塩などの活性化リボ・ヌクレオチド、およびテトラゾール、たとえば、Ｓエチル・テトラゾール（他のいかなる適切な活性化因子を使用してもよいが）などの活性化因子を加え（図１３のステップｉ）て、第１のヌクレオシドの５’位末端上へ第２の塩基をカップリングさせる。担体を洗浄し、いかなる未反応の５’ヒドロキシル基も、それだけには限定されないが、例えば無水酢酸やフェノキシ無水酢酸などのアセチル化剤でキャップして未反応５’アセチル部位（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を得る（ステップｉｉ）。次いで、たとえば、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドやヨウ素などの適切な酸化剤、および水を用いて、Ｐ（ＩＩＩ）結合を、より安定で最終的に所望のＰ（Ｖ）結合に酸化する（ステップｉｉｉ）。ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、５’シリル基を、フッ化物イオン（たとえば、フッ化トリエチルアンモニウムまたはフッ化ｔ−ブチルアンモニウム）を用いて切断する（ステップｉｖ）。このサイクルを、後続のヌクレオチドそれぞれに対して繰り返す。図１３にはメチル保護基を有するホスホラミダイトを例示するが、ホスホラミダイト部分（ｍｏｉｅｔｙ）の酸素を保護または置換するために他のいかなる適切な基を用いてもよいことを強調すべきである。たとえば、アルキル基、シアノエチル基、またはチオ誘導体をこの位置で使用してもよい。さらに、ステップ（ｉ）に入る活性化ヌクレオシドは、異なる種類の活性化のヌクレオシド（例えばＨ−ホスホン酸塩、メチルホスホラミダイト、またはチオホスホラミダイト）であってもよい。担体に取り付けた初期または３’位のヌクレオシドは、シリル基よりむしろジメトキシトリチル基などの異なる５’位保護基を有することができることに留意すべきである。標準のＤＮＡ合成化学に使用されるとき、ジメトキシトリチル基の切断は酸水解を必要とする。すなわち、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）やトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）などの酸は、このステップのために単独で使用される。ＤＣＡ切断ステップとは別に、このサイクルを、所望のポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数繰り返す。
合成の後に、リン酸塩上の保護基（図１３ではメチル基として示したが、必ずしもメチル基に限定されない）を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中１モル濃度の二ナトリウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート三水和物（ジチオラート）を用いて３０分で切断する。この脱保護溶液は、水を使用している固体担体に結合したオリゴ・ヌクレオチドで洗浄する。次いで、担体を、５５℃で２０分間４０％のメチルアミンで処置する。これによって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを溶液中に放出し、環外アミンを脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ）し、かつ、２’ＡＣＥ基上のアセチル保護を除去する。オリゴヌクレオチドは、この段階で陰イオン交換型ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）によって分析することができる。
除去が所望される場合、２’オルトエステル基は、除去される最後の保護基である。２’脱保護の直前の２’ＡＣＥで保護されたＲＮＡの構造は、図１４に示すとおりである。
自動化処理の場合、最初のヌクレオシドを有する固体担体を、合成装置に取り付ける。この装置は、合成のために必要とされる全ての必要な補助剤と単量体を含む。試薬は不活性ガス下に維持する。というのは、不活性ガス下に維持しない場合、いくつかの単量体は加水分解するおそれがあるからである。全てのラインを試薬で充填するように装置を準備する。合成サイクルに従って正しい順序の試薬の分配を規定する合成サイクルを設計して、図１３で指定される順序で試薬を分配する。サイクルが一旦規定されると、加えるべき各試薬の量が規定され、ステップ間の時間が規定され、かつ洗浄ステップが規定され、また、最初のヌクレオシドを有する固体担体が一旦加えられると合成が進行する準備ができる。
本明細書に記載されたＲＮＡ類似体に関して、修飾は、３つの異なる一般的な方法で実施される。第１は、炭水化物および塩基修飾に関して実施されるもので、同様にある種のリンカーおよびコンジュゲートの導入に対しても実施され、修飾が既に存在する修飾ホスホラミダイトを用いる。このような修飾の例は、炭水化物２’位の修飾種（２’−Ｆ、２’−ＮＨ２、２’−Ｏ−アルキル、等）であり、２’位のオルトエステルが、所望の修飾で置換されている。フルオロセイン誘導体、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）、コレステロール、シアニン誘導体、またはポリエチレン・グリコールなどの３’位または５’位末端修飾もまた、導入することができる。特定のヌクレオチド間結合修飾もまた、入って来る反応性ヌクレオシド介在物を介して導入される。得られるヌクレオチド間結合修飾の例は、限定されるものではないがメチルホスホン酸塩、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートを含む。
同じまたは類似のサイクルを用いて、多くの修飾因子を、使用することができる。このクラスの例は、たとえば、２‐アミノプリン、５−メチルシチジン、５−アミノアリルウリジン、ジアミノプリン、２−Ｏ−アルキル、マルチ原子スペーサー類、単一の単量体スペーサー、２’アミノヌクレオシド、２’フッ化ヌクレオシド、５−ヨードウリジン、４−チオウリジン、アクリジン、５−ブロモウリジン、５−フルオロシチジン、５−フルオロウリジン、５−ヨードウリジン、５−ヨードシチジン、５−ビオチンチミジン、５−フルオロセインチミジン、イノシン、プソイドウリジン、脱塩基単量体、ネブラリン（ｎｅｂｕｌａｒａｎｅ）、デアザヌクレオシド、ピレンヌクレオシド、アザヌクレオシド等を含む。しばしば、合成における残りのステップは、標準の脱保護条件になりやすい置換基を導入する修飾を除き同じままである。ここでは、修飾条件は、置換基に影響を及ぼさないものが使用される。第２の、特定のヌクレオチド間結合修飾は、それらの導入を可能にする酸化ステップの変更を要求する。このクラスの例は、元素硫黄または別の適切な硫黄移動剤による酸化剤が必要であるホスホロチオエート類とホスホロジチオエート類を含む。第３の、特定のコンジュゲートと修飾は、「後合成工程」により導入され、そこで、固相合成が完了した後、所望の分子が生体高分子に加えられる。これの例は、ポリエチレングリコールを、炭化水素リンカーに付着した一級アミンを含む予備合成されたオリゴヌクレオチドに添加することである。この場合の取付けは、溶液相反応でポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシサクシニミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）エステルを用いて、実現することができる。
ここで、合成ＲＮＡとその類似体の合成のための最も好ましい方法を概説してきたが、これらの分子をアセンブルすることができるいかなる核酸合成法もそれらのアセンブリに使用することができるはずである。代替方法の例には、５’ＤＭＴ−２’ＴＢＤＭＳおよび５’ＤＭＴ−２’ＴＯＭの合成手法を含む。いくつかの２’−Ｏ−メチル、２’−Ｆ、および主鎖修飾は、たとえば、修飾型および野生型Ｔ７、ならびにＳＰ６ポリメラーゼを用いる転写反応に導入することができる。
（修飾ＲＮＡを合成すること）
以下のガイドラインは、修飾ＲＮＡの合成のために提供し、当技術分野で知られているいかなる自動合成器にも容易に適合することができる。
（３’位末端修飾）
３’位修飾を組み込むためのいくつかの方法がある。３’位修飾は、当技術分野で周知の方法を用いて、選択された固体担体上へ固着または「搭載（ｌｏａｄ）」することができる。代替として、３’位修飾を、ホスホラミダイトとして使用することができる。このホスホラミダイトは、標準の合成方法を用いて一般的な担体にカップリングさせ、この一般的な担体は、所望の末端修飾の活性化ホスホラミダイトを導入することによって３’位末端修飾が生成されるヒドロキシルを提供する。代替として、ポリヌクレオチドが固体担体から除去された後、後合成的に３’位修飾を導入することもできる。遊離ポリヌクレオチドは、最初は、選択された修飾の適切に活性化された形態と反応する３’位末端のヒドロキシルアミノ、チオール、またはハロゲンを有する。例は、それだけには限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、チオエーテル、ジスルフィド、マレイミド（ｍａｌｉｅｍｉｄｏ）またはハロアルキルの反応を含む。この修飾は、今や、ポリヌクレオチドの３’位末端になる。後合成的にコンジュゲート化することができる修飾の例は、それだけには限定されないが、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）類、アクリジン類、ＴＡＭＲＡ、ダブシル（ｄａｂｓｙｌ）、コレステロール、ポリエチレングリコール類、マルチ原子スペーサー類（ｍｕｌｔｉ−ａｔｏｍ ｓｐａｃｅｒ）、シアニン類、脂質類、炭水化物類、脂肪酸類、ステロイド類、ペプチド類、またはポリペプチド類であってもよい。
（５’位末端修飾）
５’位修飾をポリヌクレオチド内に導入するいくつかの方法がある。例えば、５’修飾を有するヌクレオチドは購入することができ、そしてその後ホスホラミダイトで活性化することができる。５’位修飾を有するこのホスホラミダイトも、商業的に入手可能である。次いで、５’位修飾を有する活性化ヌクレオシドを、他のいかなる活性化ヌクレオシドも使用できるのと同様にサイクルに使用する。しかし、全ての５’位修飾が、ホスホラミダイトとして使われる訳ではない。このような場合には、５’位修飾は、３’位修飾の場合に上記で記載した類似の方法で導入することができる。
（チオエート）
ホスホロチエート結合などの１つまたは複数のチオエート部分を有するポリヌクレオチドを、上記で説明しかつ図１３に例示した合成サイクルに従って作製した。しかし、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドの酸化ステップの代わりに、元素硫黄または別の硫化剤を使用した。
（５’位チオ修飾）
５’位チオールを有する単量体は、グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などの商業的な供給元から、ホスホラミダイトとして購入することができる。これらの５’位チオール修飾単量体は、一般的に、トリチル保護基を担持する。合成の後に、このトリチル基は当技術分野で周知のいかなる方法によっても除去することができる。
（他の修飾）
特定の修飾のために、この合成サイクルの諸ステップは、いくらか変わる。たとえば、３’の末端が逆位のチミジン（ｄＴ）を有する場合（第１の塩基が５’水酸基によって固体担体に付着され、第１のカップリングが３’−３’結合である）では、脱トリチル化およびカップリングがより緩やかに生じるので、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）などの過剰な脱トリチル化剤を用いるべきであり、カップリング時間を３００秒まで増加させるべきである。いくらかの５’修飾は、長いカップリング時間を必要とすることある。例は、コレステロールと、Ｃｙ３またはＣｙ５ビオチンのようなフルオロフォア、ダブシル（ｄａｂｓｙｌ）、アミノリンカー類、チオリンカー類、スペーサー類、ポリエチレングリコール、リン酸化剤、ＢＯＤＩＰＹまたは光切断可能なリンカーなどを含む。
ポリヌクレオチドが一つの修飾だけを有する場合、この修飾は、部分的に構築されたポリヌクレオチドをその上に有した担体を取り出し、修飾を有する単量体を手動でカップリングし、次いで自動合成器中に担体を再び配置し、そして自動合成を再開することによって、手動で最も効率的に実施することができることに留意すべきである。
（実施例２）
（担体からの合成オリゴの脱保護および切断）
切断は、手動で、または機械上で自動化したプロセスで行った。ヌクレオチド間連結からの保護部分、例えばメチル基、の切断は、当技術分野で知られているいかなる適当な切断試薬、例えばジチオレートまたはチオフェノール、を使用することによって達成することができる。ＤＭＦ中１モルのジチオレートを室温で１０〜２０分間にわたって固体担体に加える。次いで担体を、例えばＤＭＦで、それから水、そしてアセトニトリルで完全に洗浄する。別法として、水での洗浄、それに引く完全なアセトニトリルでの洗浄は、いかなる残留ジチオレートを除去するのにも十分である。
担体からのポリヌクレオチドの切断および環外塩基保護の除去は、４０％のＮ−メチルアミン（ＮＭＡ）水溶液を用いて、引き続き２０分間にわたって５５℃まで加熱することによって行うことができる。一旦、ポリヌクレオチドが溶液中に存在したら、固体担体からＮＭＡを慎重に除去する。次いで、ポリヌクレオチドを含有する溶液を、真空下でＮＭＡを除去するまで乾燥させる。二本鎖化（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、脱塩、ゲル精製、品質制御などを含むさらなる加工処理は、当技術分野で知られているいかなる方法によっても実施することができる。
いくつかの修飾のために、ＮＭＡステップを変更してもよい。例えば、３’アミノ修飾については、ＮＭＡでの処理は５５℃で４０分間にしなければならない。ピューロマイシン、５’末端アミノ結合修飾、および２’アミノヌクレオシド修飾は、４０％のＮＭＡを追加した後、１時間にわたって加熱する。Ｃｙ５で修飾したオリゴヌクレオチドは、遮光しながら、２４時間にわたって水酸化アンモニウムで処理する。
（切断試薬の調製）
ＨＰＬＣ等級の水および合成等級のアセトニトリルを使用する。ジチオレートは、結晶として予め調製されたものである。４．５グラムのジチオレート結晶を９０ｍＬのＤＭＦに添加する。４０パーセントのＮＭＡは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社などの供給元から、購入することができ、使用の準備ができている。
（一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリング）
一本鎖（Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ）ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られているいかなる方法によって、いかなる適当な緩衝液を使用してもアニールすることができる。例えば、等しい量の各々の鎖を、適当な緩衝液、例えば、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、に混合することができる。混合物を１分間にわたって９０℃で加熱し、室温まで冷却する。他の例では、それぞれ５０ミクロモル濃度となるように、各ポリヌクレオチドを別々に調製する。次いで、３０ミクロリットルの各々のポリヌクレオチド溶液を、１５マイクロリットルのアニーリング緩衝液（×５）と一緒に管に加える。ここで、アニーリング緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭの塩化カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、および２ｍＭの塩化マグネシウムである。最終的な体積は７５ミクロリットルである。次いで溶液を、９０℃で１分間にわたってインキュベートし、１５秒間にわたって遠心機で回転させ、１時間にわたって３７℃でインキュベートした後に、室温に戻す。次いで溶液を、マイナス２０℃で冷凍貯蔵し、５回まで凍結融解させることができる。二本鎖の最終濃度は、２０マイクロモルである。ポリヌクレオチド貯蔵のための適当な緩衝液の例は、２０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．２ｍＭのＭｇＣｌ ２である。使用される全ての緩衝液は、ＲＮａｓｅを含まないものでなければならない。
（オルトエステル部分の除去）
所望する場合、オルトエステル部分またはその複数部分は、当技術分野で知られているいかなる適当な方法によっても、ポリヌクレオチドから除去することができる。そのような方法は、揮発性の酢酸テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）ｐＨ３．８緩衝系を使用する。その緩衝系はオルトエステル部分またはその複数部分の除去後に凍結乾燥によって除去することができる。３．０を超えるｐＨでの脱保護は、リン酸ジエステル主鎖の酸触媒による切断の可能性を最小にする助けとなる。例えば、脱保護は、オルトエステルで保護されているポリヌクレオチドを懸濁させ、６０℃で３０分間にわたってインキュベートすることによって、ＴＥＭＥＤでｐＨを３．８に調節した１００ｍＭの酢酸を使用して達成することができる。溶液を次いで、凍結乾燥させるか、使用前に乾燥させるために素早く真空下（ＳｐｅｅｄＶａｃ）におく。必要に応じて、脱保護後の脱塩は、当技術分野で知られているいかなる方法、例えば逆相カートリッジのエタノール沈殿または脱塩、によって実施することができる。
（実施例３）
（ＲＮＡ干渉での使用に向けて合成したｓｉＲＮＡ）
以下は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社の登録商標のＡＣＥ試薬を使用して合成され、設計され、ここに記載される本発明に従って使用される、ジｄＴオーバーハングを有する１９量体のｓｉＲＮＡのリストである。「ＳＥＡＰ」は、人間の分泌されたアルカリホスファターゼを意味する。「ヒト・シクロ」は、ヒト・シクロフィリンを意味する。ヌクレオチド単位間の星印は、ホスホロチオエート結合である修飾ヌクレオチド間連結を意味する。構造２’−Ｆ−Ｃまたは２’−Ｆ−Ｕは、リボシル部分の２’炭素に付着したフッ素を有するヌクレオチド単位を意味する。構造２’−Ｎ−Ｃまたは２’−Ｎ−Ｕは、リボシル部分の２’炭素に付着した−ＮＨ２基を有するヌクレオチド単位を意味する。構造２’−ＯＭＥ−Ｃまたは２’−ＯＭＥ−Ｕは、ＣｓまたはＵｓのいずれかのリボシル部分の２’炭素で、それぞれ２’−Ｏ−メチル修飾がむき出しになった（ｂａｒｉｎｇ）ヌクレオチド単位を意味する。ｄＧ、ｄＵ、ｄＡ、ｄＣ、およびｄＴは、２’位に関してデオキシであり、代わりにリボシル部分の２’炭素に付着した水素を有するヌクレオチド単位を意味する。特に記載されない限り、以下のリストにある全てのヌクレオチド単位は、２’炭素に−ＯＨを有するリボシルである。
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 （実施例４）
（ＲＮＡ干渉の実施）
（形質移入）
ｓｉＲＮＡ二本鎖を、標準の緩衝液（５０ミリモルのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ミリモルのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）を使用してアニールした。形質移入は、後述する標準プロトコルに従って行う。
（９６穴プレートおよび６穴プレートのための標準形質移入プロトコル：ｓｉＲＮＡ）
１．２９３およびＣａｌｕ６のためのプロトコル、ＨｅＬａ、ＭＤＡ ７５は同一である。
２．細胞は、形質移入の日に９５％の集密的であるように平板培養される。
３．ＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ）が、ＲＮＡｓｅｓに対する防御のために形質移入混合物に加えられる。
４．全ての溶液と取扱いは、ＲＮＡｓｅを含まない条件下で実施しなければならない。
プレート１ 小さなフラスコにおいて２５ｍｌ媒体の０．５〜１ｍｌ、または大きいフラスコにおいて５０ｍｌ媒体の１ｍｌ。
（９６穴プレート）
１．３ｍｌの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを培養フラスコ（６インチ大）に添加して５分間、３７℃でインキュベート。
２．７ｍｌ（１４ｍｌ大）の通常培地の添加およびピペッティング１０回繰り返して、細胞を再懸濁。
３．ステップ２から細胞懸濁液を２５マイクロリットル採取し、７５マイクロリットルのトリパンブルー染色（１：４）および細胞カウンターに１０マイクロリットル入れる。
４．標準血球計算板で細胞数を計数。
５．細胞平均数ｘ４ｘ１００００は、１ｍｌあたりの細胞数。
６．通常培地で希釈して３５００００／ｍｌにする。
７．１００マイクロリットル（ＨＥＫ２９３では３５，０００細胞）を９６穴プレートにプレーティング。
（２×９６穴プレート（６０穴フォーマット）に対する形質移入）
１．ＯＰＴＩ−ＭＥＭ ２ ｍｌ ＋ ８０マイクロリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（１：２５）＋ １５マイクロリットルのＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（ＡＭＢＩＯＮ）。
２．等分量（アリコート）のｓｉＲＮＡ（スクリーニング用１００マイクロモル、０．８マイクロリットル（全希釈比は、１：７５０、０．８マイクロリットルの１００マイクロモル溶液で最終濃度１００ナノモルを得る）を所望のオーダーで深皿に移す（通常、６０穴フォーマットに対して３カラムｘ６、または９６穴に対して４カラムｘ８）。
３．１００マイクロリットルのＯＰＴ１−ＭＥＭを移す。
４．Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００およびＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎとともに１００マイクロリットルのＯＰＴ１−ＭＥＭを各ウエルに移す。
５．室温（ＲＴ）に２０〜３０分放置。
６．各ウエルに０．５５ｍｌの通常培地を添加。プレートをフィルムで覆って混合。
７．１００ｘ３ｘ２を直接、細胞に対してアレイ・アウト（２枚のプレートに十分）。
（２×６穴プレートに対する形質移入）
８．８ｍｌ ＯＰＴＩ−ＭＥＭ ＋１６０マイクロリットル Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（１：２５）、３０マイクロリットルのＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（ＡＭＢＩＯＮ）。
９．等分量のｓｉＲＮＡ（全希釈比は、１：７５０、５マイクロリットルの１００マイクロモル溶液によって最終濃度１００ナノモルを得る）をポリスチレン管に移す。
１０． Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００およびＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（ＡＭＢＩＯＮ）とともに１，３００マイクロリットルのＯＰＴ１−ＭＥＭを移す。
１１．室温（ＲＴ）で２０〜３０分間放置。
１２．各ウエルに０．５５ｍｌの通常培地を添加。プレートをフィルムで覆って混合。
１３．２ｍｌを各ウェルに移す（２ウエルにとって十分）。
ｍＲＮＡまたはタンパク質濃度を、標準キットまたはＣｕｓｔｏｍ Ｂ−ＤＮＡセットおよびＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ キット（Ｂａｙｅｒ）を用いて、形質移入後２４、４８、７２、および９６時間で測定する。
（実施例５）
（活性の測定／検出）
ｓｉＲＮＡ誘導ＲＮＡ干渉のレベル、または遺伝子サイレンシングを、標的ｍＲＮＡレベルまたは対応のタンパク質レベルによって評価した。ｍＲＮＡレベルのアッセイは、Ｂ−ＤＮＡ（商標）技術（Ｑｕａｎｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．）を用いて実施した。ｆＬＵＣおよびｒＬＵＣに対するタンパク質レベルは、ＳＴＥＡＤＹ ＧＬＯ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）によってアッセイした。ヒトアルカリホスファターゼレベルは、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅ ＳＥＡＰ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（＃Ｋ２０４３−１）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．を用いてアッセイした。
（実施例６）
（２’−デオキシ修飾／ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子）
センス鎖およびアンチセンス鎖にある２つのタンデム２’−デオキシ修飾を持つｓｉＲＮＡの機能的効果を、１９量体領域の相補性とジｄＴオーバーハングを二本鎖の３’末端に有する２１量体ｓｉＲＮＡに導入することで、系統的に試験した。ｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞に導入したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ｆＬＵＣ５）に向けられた。ｓｉＲＮＡ機能性を上記したようにして測定した。毒性は、ＡＬＭＡＲブルーで測定したところ、影響を受けていないように見えた。機能性は、３通りの濃度で評価した。すなわち、１、１０、および１００ｎＭ最終。使用したｓｉＲＮＡの配列、および２’−デオキシ修飾の置換を、表１に示す。これらの実験の結果を図１９−２３に示す。
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 （実施例７）
（２’−Ｏ−メチル修飾／ホタルルシフェラーゼ遺伝子）
センス鎖およびアンチセンス鎖に単一２’−Ｏ−メチル修飾、２つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾、および３つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾を持つｓｉＲＮＡの機能的効果を、１９量体領域の相補性とジｄＴオーバーハングを二本鎖の３’末端に有する２１量体ｓｉＲＮＡに導入することで、系統的に試験した。ｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入されたホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ｆＬＵＣ５）に向けられた。ｓｉＲＮＡ機能性は、以下のように測定した。機能性は、３通りの濃度で評価した。すなわち、１、１０、および１００ｎＭ最終。毒性は、ＡＬＭＡＲブルーで測定したところ、影響を受けていないように見えた。使用したｓｉＲＮＡの配列および２’−Ｏ−メチル修飾の配置は、表５に示す。これらの実験の結果を図２４〜２８に示す。
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（実施例８）
（２’−デオキシおよび２’−Ｏ−メチル修飾／センス対アンチセンス鎖）
１５の二本鎖（そのうち５つがヒト・シクロフィリン遺伝子に向けられ、１０がホタル／ルシフェラーゼに向けられている）を種々の修飾により試験した（図２９〜３１参照）。ヒトのシクロフィリンＢについて、試験した二本鎖は、（１）未修飾、（２）センス鎖の第１および第２の位置に２’−Ｏ−メチル修飾、および（３）アンチセンス鎖の第１および第２の位置に２’−Ｏ−メチル修飾、さらに（４）センス鎖およびアンチセンス鎖上に２’−Ｏ−メチル修飾を含む。ルシフェラーゼに関して、ヒト／シクロフィリンＢについて記載された修飾の全てに加えて、（１）ＡＳ鎖の５’リン酸化と併用したＡＳ鎖上の２’−Ｏ−メチル修飾と、（２）アンチセンス鎖の５’リン酸化と併用したセンスおよびアンチセンス鎖の２’−Ｏ−メチル修飾を、試験した。全ての１５の二本鎖について、２’−Ｏ−メチル部分を持つセンス鎖の位置１および２での修飾は、機能性と干渉しなかった。アンチセンス鎖の同一の修飾は、二本鎖の機能性を制限した。この機能性の減少は、アンチセンス鎖がその５’末端でリン酸化された場合に、部分的に少なくなった（図３０および３１）。上記のデータを考え合わせると、アンチセンス鎖の５’リン酸化と併用したセンス鎖の１位および２位の２’−Ｏ−メチル化は、二本鎖の機能性を変えることなくセンス鎖オフ・ターゲット化を制限するようにｓｉＲＮＡ二本鎖を修飾する、安価で信頼性があり、さらに非毒性である方法である。この情報は、商業的価値がある。なぜなら、それによってｓｉＲＮＡの特異性と効力とが高められるからである。最近のマイクロアレイ・データによれば、丁度１１ヌクレオチドの存在で非特異的なサイレンシングの誘導が十分なされることを示している。ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖内に存在する相同性は、概ね、少なくとも半分の非特異的機能性を構成する。固有の非特異性がブロックされる場合、センス鎖はオフ・ターゲット化に貢献することができず、ｓｉＲＮＡの特異性は増加するはずである。機能的ＲＩＳＣアンチセンス鎖複合体への平衡の移動もまた、ｓｉＲＮＡの有効濃度を下げる。
（実施例９）
（５’コンジュゲートによる修飾ｓｉＲＮＡ）
二本鎖安定性、機能性、および受動的取り込みに対する種々の修飾の効果をアッセイした。図３３は、二本鎖安定性に対するコレステロール・コンジュゲーションおよび（センスおよびアンチセンス鎖の１位および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、プラス、センス鎖の全てのＣおよびＵの２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全てのＣおよびＵの２’Ｆ修飾、プラス、アンチセンス鎖の５’リン酸化）の効果を示す。裸のｓｉＲＮＡまたは修飾ｓｉＲＮＡは３２Ｐ標識（ＡＳ鎖、Ｔ４キナーゼ、プロメガ）し、血清（または血清アルブミン）とともにインキュベートし、さらにゲル・シフト・クロマトグラフィー（変性、１５％ＰＡＧＥ）で走らせた。これらの実験の結果は、未修飾二本鎖が素早く分解した一方で、コレステロールおよび既に説明した修飾を持つｓｉＲＮＡは、血清または血清アルブミン存在下で安定であることを示す。同様に、３’ｉｄＴキャッピングおよびＣＨＯ（５’センス）コンジュゲーションと併用したＣおよびＵの２’−Ｏ−メチル修飾を担持するｓｉＲＮＡについてもまた、安定性の増大が示される（図３５）。
同様に修飾した分子に対する研究（例えば、センス鎖の２’Ｆｌ修飾と併用してセンス鎖の５’末端のコレステロール修飾）は、そのような修飾が機能性（図３４）および受動的取り込み（図３６、修飾＝コレステロールを有するセンスおよびアンチセンスの両方のＣおよびＵに対する２’Ｆ）が高めることを明らかにする。
（実施例１０）
（ＳＥＡＰ２２１７標的上での２’でのデオキシおよび２’−Ｏ−メチル修飾ウオーク）
ＳＥＡＰコンストラクトを標的にしたｓｉＲＮＡを用いた２’−デオキシおよび２’−Ｏ−メチル・ウオークに使用するコンストラクト（図３１および図３２参照）を表６に示す。
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 （実施例１１）
（分子１修飾および安定性）
実施例１１〜１８の目的のために、用語「分子１修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」とは、センス鎖上の１および２位に２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖上の全てのＣおよびＵ上に２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖上の全てのＣおよびＵの２’−フッ素（Ｆｌ）修飾、およびアンチセンス鎖の５’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。同様に、用語「分子２修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ ２ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、センス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の５’末端上のＣｙ３標識、アンチセンス鎖の全てのＣおよびＵ上の２’−フッ素（Ｆｌ）修飾、ならびにアンチセンス鎖の５’末端上のリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。
ｓｉＲＮＡ安定性に対する分子１修飾の効果を評価するために、４種類のユニークなｓｉＲＮＡを、修飾および未修飾形態で合成した。続いて、これらの分子を時間を変えて３７℃で１００％血清中でインキュベートし、ＰＡＧＥで分析することで二本鎖の未分解性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）を評価した。配列の視覚化は、エチジウム・ブロマイド染色によっておこなった。
図３７に示されるこれらの実験結果は、分子１修飾を持つ二本鎖が、未修飾の等価物と比べて著しく安定性が高いことを示す。未修飾分子は、室温で血清にさらしたところ、２分以内に５０％以上分解した。それに比べて、分子１修飾を持つ配列の半減期は、概ね１２５〜１３５時間であった。したがって、分子１修飾は、安定性を約５００倍、著しく高めた。
（実施例１２）
（分子１修飾およびｓｉＲＮＡサイレンシング抗力）
ｓｉＲＮＡ抗力に対する分子１修飾の効果を評価するために、ヒト・シクロフィリンＢ（Ｕ１およびＵ２）に向けられた２種類のユニークなｓｉＲＮＡを、２’−Ｏ−ＡＣＥケミストリーを用いて、修飾および未修飾形態で合成し、その機能性について、全細胞アッセイで調べた。手短に言えば、濃度０．０１〜２００ｎＭで、修飾および未修飾ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞（１０，０００細胞／ウエル、９６穴プレート）に形質移入（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）し、２４〜４８時間培養した。続いて、指定された標的の発現レベルを、分岐ＤＮＡアッセイを用いて評価した（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ、Ｆｅｍｏｎｔ、ＣＡ）。
これらの実験結果を図３８に示す。また、これらの実験結果は分子１修飾を持つ二本鎖が、試験した全ての濃度で、未修飾ｓｉＲＮＡと同等に機能することを示す。したがって、分子１修飾は、ｓｉＲＮＡの抗力を変えるようには見えない。
（実施例１３）
（分子１修飾およびサイレンシング寿命）
ｓｉＲＮＡのサイレンシング寿命（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）に対する分子１修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンＢ遺伝子を対象とするｓｉＲＮＡを修飾および未修飾形態で合成し、前述のごとくＨｅＬａ細胞（１００ｎＭ）に形質移入した。続いて、サイレンシングのレベルを分岐ＤＮＡアッセイを用いて、７日間にわたってモニターした。
図３９に示すこれらの実験の結果の一例は、未修飾分子によって誘導されるサイレンシングのレベルが７日間にわたって約７０％から０％に低下することが示され、修飾二本鎖が実験の過程全体を通して＞８０％機能性を誘導することを実証する。したがって、分子１修飾にって修飾されたｓｉＲＮＡは、これらの二本鎖によって誘導されたサイレンシングの寿命を高める。
（実施例１４）
（分子１修飾および毒性）
ｓｉＲＮＡ毒性に対する分子１修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンＢを対象とする４種類のｓｉＲＮＡ（Ｕ１〜Ｕ４）を修飾および未修飾形態で合成し、０．０１〜２００ｎＭの濃度範囲で、ＨｅＬａ細胞に形質移入した。形質移入後ｔ＝４８時間の時点で、Ａｌａｍｅｒ Ｂｌｕｅ生存度アッセイを実施して細胞個体群内での細胞死のレベルを評価した。修飾二本鎖と未修飾二本鎖との並列比較では、試験した濃度のいずれかで誘導される細胞死のレベルに違いは無かった（図４０）。
（実施例１５）
（分子１修飾およびオフ・ターゲット効果）
オフ・ターゲット効果に対する分子１修飾の効果を評価するために、４種類のｓｉＲＮＡ標的ヒト・シクロフィリンＢ（Ｕ１〜Ｕ４）を修飾および未修飾形態で合成し、１００ｎＭの濃度でＨｅＬａ細胞に形質移入した。続いて、（１）偽形質移入、（２）形質移入（未修飾）、および（３）形質移入（修飾）細胞から得た全ＲＮＡを精製（Ｑｉａｇｅｎ）し、ｃＤＮＡに変換し、さらにＡｇｉｌｅｎｔ’ｓ Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐ Ｋｉｔを用いて、 Ｃｙ３（偽形質移入）またはＣｙ５（形質移入−未修飾、形質移入−修飾）による標識をおこなった。偽形質移入および非形質移入細胞から得た標識ｃＤＮＡを混合し、２１，０００を上回る数のプローブが含まれるＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ１Ａ（Ｖ２）Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにハイブリダイズさせた。修飾および未修飾試料と結合したオフ・ターゲットの数を、ソフトウェア（Ａｇｌｉｌｅｎｔ’ｓ Ｆｅａｔａｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｓｐｔｆｉｒｅ，およびＳｐｔｆｉｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）（それぞれバージョン７．２、７，２、および７．１）を用いて、評価した。
これらのオフ・ターゲット研究のまとめを図４１に示す。また、このまとめによれば、修飾および未修飾ｓｉＲＮＡは、オフ・ターゲットされた遺伝子の数に関して、類似した機能を示した。具体的には、オフ・ターゲット遺伝子を誘導または抑制のレベル（野生型遺伝子発現と比較）に基づいて分離した場合、修飾ｓｉＲＮＡは未修飾のものと類似して（またはそれよりも良好に）機能した。
（実施例１６）
（分子２修飾およびサイレンシング効力）
分子２修飾を含むｓｉＲＮＡの機能性を試験するために、ヒト・シクロフィリンＢを対象とするｓｉＲＮＡであるシクロ１４（５’ＧＯＣＣＴＴＡＧＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＧ、センス鎖 配列番号３２２）を、分子２修飾により合成し、さらに指定した標的をサイレンシングする能力について試験した。手短に言えば、ｃｙｃｌｏ１４を、２’−Ｏ−ＡＣＥケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。続いて、Ｔ４８２ＨｅＬａ細胞（１０，０００細胞／ウエル、９６穴プレート）をプレーティングして一晩培養し、さらに１００ｎＭ濃度でｃｙｃｌｏ１４二本鎖による形質移入（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）をおこなった。形質移入後３日、ｍＲＮＡサイレンシングのレベルを分岐ＤＮＡアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を用いて評価した。
これらの研究の結果を図４２に示す。未修飾ｃｙｃｌｏ１４二本鎖は概ね８０〜９５％サイレンシングを誘導する。Ｃｙ３標識単独で修飾されたｃｙｃｌｏ１４二本鎖は、約７０〜８０％サイレンシングを誘導、また分子２修飾を持つｃｙｃｌｏ１４ｓｉＲＮＡは８０％またはそれよりも良好なサイレンシングを誘導し、分子２修飾の付加は二本鎖の機能性に対してほとんど影響がない。
（実施例１７）
（トラックアビリティに対する分子２修飾の効果）
分子２修飾の有用性を試験するために、形質移入効率を評価する手段として、ｃｙｃｌｏ１４ｓｉＲＮＡを前述の修飾により調製し、蛍光顕微鏡で視覚化をおこなった。具体的には、ｃｙｃｌｏ１４を、２’−Ｏ−ＡＣＥケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。続いて、Ｔ４８２ＨｅＬａ細胞（１０，０００細胞／ウエル、９６穴プレート）をプレーティングして一晩培養し、さらに１００ｎＭ濃度で適当な二本鎖による形質移入（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）をおこなった。形質移入後４８時間で、培地をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（２μｇ／ｍｌ、２０分、３７℃）でインキュベートし、次にＤａｐｉおよびＲｈｏｄａｍｉｎｅフィルターを用いてＬｅｉｃａ ＤＭＩＬ蛍光顕微鏡による視覚化をおこなった。
分子２修飾を持つｃｙｃｌｏ１４ ｓｉＲＮＡによる形質移入がなされたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡写真（添付図面なし）は、強く染色された核およびその周囲を示している。未修飾ｃｙｃｌｏ１４ｓｉＲＮＡにより形質移入された細胞では、同等の染色が見られないことから（データ不図示）、分子２修飾が所定のｓｉＲＮＡの細胞内位置および形質移入の成功を評価する優れた手段であることがわかる。
（実施例１８）
（安定性に対する分子２修飾の効果）
分子２修飾が二本鎖の細胞内安定を高めたかどうかを試験するために、分子２修飾を持つｃｙｃｌｏ１４ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に形質移入し、Ｃｙ３標識Ｃｙｃｌｏ１４形質移入細胞と７日間にわたって比較した。前述の修飾の付加によってＣｙ３単独による修飾を受けた二本鎖を上回る著しく強化されたｓｉＲＮＡ安定性を示す。両方の試料が第２日目（Ｄａｙ２）に強い染色パターンを示す一方で、Ｃｙ３−Ｃｙｃｌｏ１４形質移入細胞は、第７日目（Ｄａｙ７）までに失う。対照的に、分子２修飾を持つｃｙｃｌｏ１４ｓｉＲＮＡを含む細胞は、第７日（Ｄａｙ７）に強い染色パターンを保持している。さらに、Ｃｙ３標識二本鎖とは異なり、分子２修飾を持つｓｉＲＮＡはまた、二本鎖への核アクセス（ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｃｅｓｓ）を促進する。
（実施例１９）
（サイレンシング活性を修飾する化学修飾の同定）
ＲＮＡ合成のためのプラットホームとして２’−Ｏ−ＡＣＥケミストリーを用いて、センス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）鎖に１、２、または３つの連続的（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙ）に修飾したヌクレオチドからなる修飾ウォークをＳＥＡＰ−２２１７、ヒト分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ、ＳＥＡＰ−２２１７−センス鎖５’−Ｇ Ｕ Ｇ Ａ Ｕ Ｇ Ｕ Ａ Ｕ Ｇ Ｕ Ｃ Ａ Ｇ Ａ ＧＡＧ Ｕ ｄＴ ｄＴ（配列番号３２６））上で実行した。続いて、これらの修飾ｓｉＲＮＡのサイレンシング効率を、ＳＥＡＰ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を持つ各二本鎖をＨＥＫ２９３細胞（１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ、５０ｎｇ／ウエルＳＥＰ発現ベクター、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）に同時形質移入し、形質移入後２４時間での標的タンパク質活性の減少をアッセイすることによって、評価した。図４３Ａおよび図４３Ｂは、２’−Ｏ−メチル化ＳＥＡＰ−２２１７ｓｉＲＮＡに対する修飾と機能とのあいだの相互関係を示す。ＳＥＡＰを標的とする未修飾二本鎖は、ＳＥＡＰ遺伝子のサイレンシングを＞９０％誘導する。ＳおよびＡＳ鎖の単一塩基修飾は、ｓｉＲＮＡ活性に対する効果をほとんど誘導しなかった。このことは、ＲＮＡｉで必須の役割を演ずるような単一の２’−ヒドロシル基がいずれの鎖にもないことを示唆している。それとは対照的に、二重の並列した修飾のウオークは、修飾塩基の導入がサイレンシング活性にって著しく干渉したいくつかのキー・ポジションを同定した。
機能との最も顕著な干渉は、ＡＳ鎖の５’末端の２つの連続的な塩基（１および２位）または３つの連続的な塩基（１、２、および３位）を修飾した場合に観察されるので、隣接する修飾基間の連携効果が暗示される。Ｓ鎖の同様な修飾は、二本鎖機能性を変えるのに失敗したことから、対を形成した２’−Ｏ−メチル修飾塩基はＳ鎖とＡＳ鎖との区別を可能にする。
実験の同一セットを２’−デオキシ修飾を用いて実行した。図４４Ａおよび図４４Ｂに示す研究は、二本鎖のいずれかの鎖上に異なる位置（例えば、１＋２＋３、４＋５＋６、その他．．．）で３つの連続的な２’−デオキシ基を付加することは、二本鎖サイレンシングに対してなんら効果がないことを示している。同様の結果は、２および１の連続的な２’−デオキシ基（データ不図示）の効果試験するウオークについて観察された。
二本鎖機能性に対する２’−Ｏ−メチル修飾の効果をさらに試験するために、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ ８、１８、５６、５８、６３、および８１）を対象とする一連のｓｉＲＮＡを、２’−Ｏ−ＡＣＥケミストリーを用いて合成してリボース環の２’位にＯ−メチル基を含むように修飾する。
Ｌｕｃ ８ ５’−ＧＡＡＡＡＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＵＣＣＵ（配列番号３２７）
Ｌｕｃ １８ ５’−ＵＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＵＣＧＡＣＧＣＡ（配列番号３２８）
Ｌｕｃ ５６ ５’−ＡＣＧＵＣＧＣＣＡＧＵＣＡＡＧＵＡＡＣ（配列番号３２９）
Ｌｕｃ ５８ ５’−ＧＡＵＵＡＣＧＵＣＧＣＣＡＧＵＣＡＡＧ（配列番号３３０）
Ｌｕｃ ６３ ５’−ＡＧＡＧＡＬＴＣＧＵＧＧＡＬＩＪＡＣＧＵＣ（配列番号３３１）
Ｌｕｃ ８１ ５’−ＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＧＡＧＣＡＣＧＧＡ（配列番号３３２）
（上に列挙した配列はセンス鎖である）。
具体的には、（１）センス鎖、（２）アンチセンス鎖、または（３）これら両方の鎖の２つの５’最端ヌクレオチド上に２’−Ｏ−メチル修飾を含むｓｉＲＮＡを、Ｌｕｃ−発現プラスミド（ｐＣＭＶＬｕｃ，５０ｎｇ／ウエル）を介して、ＨＥＫ２８３細胞に形質移入する。続いて、各二本鎖のサイレンシング能力の並列比較を実行して、標的転写分解に対するこの修飾の効果を判断した。
これらの研究の結果は、ＡＳ鎖への２’−Ｏ−メチル基の付加のみが、標的ｍＲＮＡをサイレンシングするための二本鎖の能力を著しく削減することを示した（図４５Ａ〜Ｆ参照）。対照的に、センス鎖上にこの修飾を持つ二本鎖は、同等物である未修飾ｓｉＲＮＡよりも十分に（ｌｕｃ ５８、６３、８１）、あるいは良好に（ｌｕｃ ５６、８、１８）機能した。このことは、センス鎖の修飾がＲＩＳＣによる鎖選択を偏らせ、（いくつかの例では）有効なアンチセンス鎖濃度を高めたことを示唆している。強化されたサイレンシングは、分子の５’センス末端に対するＲＩＳＣの結合親和性の減少（そのため、対向端に結合するための遊離のＲＩＳＣの可用性が増加）、センス鎖をリン酸化するための天然キナーゼの能力減少（したがって、ＲＩＳＣへのアクセスに対するセンス鎖とアンチセンス鎖の競合の減少）、あるいは５’センス末端からの二本鎖の解き放しをおこなうＲＩＳＣの能力の減少の結果であり得る。両方の鎖に２’−Ｏ−メチル修飾を含むｓｉＲＮＡは、いずれかの単一鎖上に修飾を含んだ分子に対して観察された値間にある減少したサイレンシング能力を示した。これらの結果に対する１つの解釈は、修飾鎖に関して２’−Ｏ−メチル修飾の結合親和性がＲＩＳＣのものよりも低いということである。両方の鎖が修飾された場合では、どちらの鎖もその相補体を越える利益を得ることはく、両方の修飾分子の機能性の平均を表す新しい平衡が確立される。
２’−Ｏ−メチル化Ｓ／ＡＳｓｉＲＮＡを含む細胞内で観察されたサイレンシングの減少レベルは、二本鎖をリン酸化するための細胞キナーゼの弱体化した能力の結果であるかどうかを試験するために、２’−Ｏ−メチル修飾を持つｓｉＲＮＡを、ＡＳ鎖の５’末端上にリン酸基を持つように修飾した。具体的には、（１）アンチセンス鎖の５’末端の位置１および２、または（２）アンチ鎖およびセンス鎖の両方の５’末端の位置１および２、のいずれかにおいて２’−Ｏ−メチル基を有するＬｕｃ ｓｉＲＮＡを、合成の過程でＡＳ鎖上で５’−リン酸化した。次に、これらの二本鎖を、既に記載した手順を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に導入し、所望の標的をサイレンシングする能力について試験した。結果は、試験した例の８３％（１０／１２）で、アンチセンス鎖の５’リン酸化が、等価物である非リン酸化分子を超えて二本鎖のサイレンシング効率を改善したことを示した（図４５Ａ〜Ｆ）。残りの２つの例では、サイレンシングが未変化のままであり、あるいは僅かに改善されただけである。
用量応答曲線を用いたサイレンシングに対する化学修飾の効果についてのより詳しい実験は、以前のデータを支持している。ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ ８、５６、５８，６３、および８１）を対象とする５つの異なるｓｉＲＮＡを、２’−Ｏ−メチル修飾および未修飾形態で、２−Ｏ−ＡＣＥケミストリーを用いて合成した。次に、これらの二本鎖を、濃度を０．０１〜２００ｎＭのあいだで変えながら、ＨｅＬａ細胞（ルシフェラーゼ発現ベクターと共に）に形質移入し、ルシフェラーゼタンパク質のサイレンシングのレベルについて、アッセイした（ｔ＝２４〜４８）。これらの実験結果を図４６にまとめて以下のような結論を導いた。すなわち、（１）アンチセンス鎖の５’末端の１位および２位への２’−Ｏ−メチル基の付加によって、サイレンシング活性が一貫して崩壊する。（２）ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端の１位および２位への２’−Ｏ−メチル基の付加によって、標的特異的サイレンシングの効果が改善されるか、または該サイレンシングに対してほとんど効果ないかのいずれかである。（３）両鎖（センスおよびアンチセンス）の５’末端の１および２位に対する２’−Ｏ−メチル基の付加によって、アンチセンス鎖の５’末端上にある未修飾二本鎖と、２’−Ｏ−メチル修飾を持つ二本鎖とにより観察されたもののあいだにある中間のサイレンシング効果が生ずる。（４）センスおよびアンチセンス鎖の両方の５’末端の１および２位に２’−Ｏ−メチル修飾を持つ分子のアンチセンス鎖の５’末端に対してリン酸基を付加することで、両方の鎖の５’末端上に２’−Ｏ−メチル修飾を有する二本鎖を超えて分子のサイレンシング機能が改善される。
これらの結果は、アンチセンス鎖の第１の末端ヌクレオチドの５’リン酸化に加えて、ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の１位および２位置の２’−Ｏ−メチル修飾の付加が、種々の濃度での二本鎖の効力を高めることを示唆する。さらに、種々の修飾の効果は、以下の結論を導く。すなわち、（１）センスまたはアンチセンス鎖の５’末端への２’−Ｏ−メチル基の付加は、その鎖によるサイレンシングの著しい減少をもたらす。（２）５’リン酸基の付加は、２’−Ｏ−メチル基の存在下であっても、ほぼ完全に、サイレンシングを回復する。したがって、Ａｓ−２’−Ｏ−メチル化の阻害効果のいくつかのフラクションがおそらく二本鎖リン酸化の阻害の結果であると思われる一方で、効果のいくつかの部分が、ＲＮＡｉ経路の他のステップ（例えば、ＲＩＳＣ結合、ｓｉＲＮ巻き戻し、ＲＩＳＣ媒介ｓｉＲＮＡ標的結合、またはＲＩＳＣ媒介標的切断）についてのこの形態の修飾の効果によるものであるとかなりの蓋然性で思われる。重要なことに、これらの他のステップでの２’−Ｏ−メチル化の潜在的効果は、著者らに、上記修飾が、アンチセンス鎖との１００％相同性を有する意図された標的と、相同性が劣るオフ・ターゲットとの間を区別するＲＩＳＣの能力をも変えるかもしれない可能性があることを考えさせた。
（実施例２０）
（オフ・ターゲッティングに対する２’−Ｏ−メチル化および５’リン酸化の効果）
アンチセンス鎖の２’−Ｏ−メチル化がサイレンシングを中断させ、一方で等価なセンス鎖標識が標的特異的サイレンシングに対してなんら効果を持たないという観察によって、センス鎖によって生ずるオフ・ターゲット・サイレンシングを排除するための戦略を示唆する。さらに、二本鎖リン酸化の下流にあるステップが２’−Ｏ−メチル化によって影響を及ぼされる可能性があるという観察は、この組み合わせ（センスおよびアンチセンス鎖の５’の位置１および２の２’−Ｏ−メチル化、プラス、ＡＳ鎖の５’末端のリン酸化）の修飾を含むｓｉＲＮＡが、高効力および／または低センス／アンチセンス・オフ・ターゲッティング効果を有するものである可能性を導く。
（１）センス鎖、（２）アンチセンス鎖、および（３）センスおよびアンチセンス鎖の２’−Ｏ−メチル化と組み合わさったアンチセンス鎖の５’−リン酸化の、オフ・ターゲット化に対する効果を試験するために、４種類の異なる遺伝子を対象とする２つのｓｉＲＮＡ（トータル８つのｓｉＲＮＡ；ＭＡＰＫ１４−１９３ および −１５３、ＭＰＨＯＳＰＨ１−２０２ および −２０３、ＩＧＦ１Ｒ−７３、ならびに−７４、およびＰＴＥＮ−２１３、さらに−２１４）を、２’−Ｏ−ＡＣＥケミストリーを用いて合成し、さらに適当な部位で修飾した。ＭＡＰＫ１４−１５３がアンチセンス鎖の５’末端上にリン酸基のみを含む条件下で、実験を実施した場合、広範囲のオフ・ターゲット化が観察される。上記センス鎖がさらに１および２位で２’−Ｏ−メチル基により、さらに修飾される場合、その鎖によるオフターゲット化が取り除かれる。しかし、アンチセンス鎖オフセット・ターゲットの新規セットが生ずる。アンチセンス鎖オフ・ターゲット化の増大は、センス鎖による競合の非存在下での、ＡＳ鎖−ＲＩＳＣ相互作用の増加に起因すると思われる。上記アンチセンス鎖が５’末端上にリン酸基を有し、位置１および２で２’−Ｏ−メチル基により修飾されている場合、アンチセンス鎖によるオフ・ターゲットが喪失するが、センス鎖オフ・ターゲットが再び観察される。最後に、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、２’−Ｏ−メチル基（各々の鎖の１および２位上）によって修飾され、かつアンチセンス鎖の５’末端上にリン酸基が結合する場合、両方の鎖によるオフターゲット化の度合いが急激に減少する。
上記したものと同様の結果が、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＴＥＮ、ＭＡＰＫ１、およびＭＰＨＯＳＰＨＩに対応する残りの７種類のｓｉＲＮＡについて得られた。したがって、それらの実験から、以下を結論付けることが可能である（１）同一ターゲットを対象とする別のｓｉＲＮＡは、変化するレベルのオフ・ターゲット効果を誘導する。（２）アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’−リン酸化と組み合わせて）の５’末端の１および２位の２’−Ｏ−メチル修飾は、その鎖によるオフ・ターゲット効果を取り除くが、しかし多くの場合、付加的なセンス鎖オフターゲットをもたらす。（３）センス鎖の５’末端の１および２位の２’−Ｏ−メチル修飾（アンチセンス鎖の５’−リン酸化と組み合わせて）が、その鎖に基づいてオフターゲット効果を取り除くが、しばしば付加的なアンチセンス鎖オフターゲットをもたらす。（４）センスおよびアンチセンス鎖の両方の１および２位の２’−Ｏ−メチル修飾（アンチセンス鎖の５’リン酸化との組み合わせ）は、両方の鎖から標的効果を劇的に取り除く。したがって、３通りの修飾の組み合わせ（アンチセンス鎖の５’−リン酸化、センス鎖の１および２位の２’−Ｏ−メチル化、およびアンチセンス鎖の１および２の２’−Ｏ−メチル化）が、両方の鎖によって一般に生ずるオフ・ターゲット効果での急激な減少に到る。さらに、特異的サイレンシング活性が試験された３つのケース（ＭＡＰＫ１４、ＰＴＥＮ、およびＭＰＨＯＳＰＨ１）では、最小オフ・ターゲット効果を有する完全に修飾された分子（例えば、アンチセンス鎖上に５’リン酸塩、センス鎖の１位および２位の２’−Ｏ−メチル化、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位の２’−Ｏ−メチル化）が、アンチセンス鎖の５’末端上の５’リン酸基のみを含むｓｉＲＮＡと同等かそれ以上に所定の標的をサイレンシングした。
（２’−Ｏ−メチル化の効果）
上記したデータは、ＡＳ鎖の５’末端の１位および２位に対して２’−Ｏ−メチル基を付加することで、ｓｉＲＮＡ活性が中断することを明瞭に示している。この修飾が二本鎖機能を中断させる方法は、ＲＮＡｉ経路で２つの異なるステップに分解することができる。第１のステップでは、２’−Ｏ−メチル化が、二本鎖をリン酸化する常在キナーゼの活性を明確に中断させる。５’リン酸基を添加することで、細胞酵素の必要性を総合的に軽減することで、この機能を満たし、さらに二本鎖機能性を改善する。したがって、この化学的修飾の効果の１つが十分に定義される。両方の鎖の１位および２位のヌクレオチドで２’−Ｏ−メチル基によって修飾されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に、リン酸基を合成付加することで活性を増加させる一方で、完全な機能性は回復しない。この結果は、リン酸化イベントの下流にあるステップ（例えば、ＲＩＳＣ結合、ＲＩＳＣ媒介ｓｉＲＮＡ標的／オフ・ターゲット相互作用、ならびに／またはＲＩＳＣ媒介ｓｉＲＮＡ標的／オフ・ターゲット切断）もまた、２’−Ｏ−メチル化によって影響を受けることを示唆している。
（２’−Ｏ−メチル化および強化された二本鎖機能性）
機能性に関する重要なパラメータとして、ＲＩＳＣに対するｓｉＲＮＡ結合と、それに続く二本鎖巻き戻し（アンワインディング）である。ここに提示される研究は、場合によっては、その分子の本来の機能性に対して反比例する様式で、センス鎖の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾が用量応答曲線を変える。これらの知見の１つの解釈は、センスおよびアンチセンス鎖とＲＩＳＣとの連携が平衡した状態で存在しており、該平衡は「オン（ｏｎ）」および「オフ（ｏｆｆ）」の係数（例えば、ｋ１、ｋ１’、ｋ２、およびｋ ２’ 、図４７）によって定義されるということである。高機能分子は、Ｋｏｖｅｒａｌｌ（ｋ１ｋ２／ｋ１’ｋ２’）を示し、アンチセンス鎖（例えば、Ｋｏｖｅｒａｌｌ＝１００）と結合する方向への傾きを反映している。対照的に、非機能性または半機能性分子（＜Ｆ７０）は、よりいっそう偏りがなくバランスのとれた鎖相互作用を示すＫｏｖｅｒａｌｌを表す（例えば、＜７０ｓｉＲＮＡについては、Ｋｏｖｅｒａｌｌ は約１である）。非機能性分子または半機能性分子のセンス鎖の化学修飾は、ＲＩＳＣ−ＡＳ相互作用に対する平衡状態を駆動するので、ＲＩＳＣ−ＡＳ：ＲＩＳＣ−Ｓ（Ｋｏｖｅｒａｌｌ は約５）および全体の二重機能性を大幅に変化させる。対照的に、高機能性分子の場合、ＲＩＳＣ−ＡＳ相互作用は既に好ましく、そのため化学修飾は、ＲＩＳＣ−ＡＳ関連と機能性とをさらに強化することがより少なくなる。
（２’−Ｏ−メチル化およびオフ・ターゲット・サイレンシング）
両方の鎖の第１位および第２位にある２’−Ｏ−メチル修飾を含む二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に対するリン酸基の合成的付加によって、サイレンシング表現型の部分的レスキューに到る一方で、完全回復に欠けていることから、この修飾が二本鎖リン酸化の下流である付加的なステップ（例えば、ＲＩＳＣ結合、ＲＩＳＣ媒介ｓｉＲＮＡ標的／オフ・ターゲット相互作用、ならびに／またはＲＩＳＣ媒介ｓｉＲＮＡ標的／オフ・ターゲット切断）に影響を及ぼすことが示唆される。この事実は、これらの同一の修飾が、サイレンシングにとって必要なｓｉＲＮＡ−標的相補性の度合いに対してより大きな要求がなされるかもしれない可能性を拡げる。２’−Ｏ−メチルの位置がオフ・ターゲットと所定のｓｉＲＮＡ（センスまたはアンチセンス鎖）との相同性の部分と重なる場合には、化学修飾の付加は、ｓｉＲＮＡオフ標的相互作用を脱安定化させることで、ＲＮＡｉ媒介ダウン・レギュレーションでの重要なステップを抑制する可能性がある。あるいは、２’−Ｏ−メチル基の位置がオフターゲットと所定のｓｉＲＮＡとのあいだの相同性の部分と重なり合う場合、付加的な化学修飾がその領域で二本鎖の可撓性をかえ、それによって標的分子を分解するＲＩＳＣの能力を阻害し得る。さらに別のシナリオでは、２’−Ｏ−メチル修飾の部位がオフ・ターゲットとの相同性の場所とは重なり得ない。この場合には、修飾の脱安定化効果がその分子の下流へ移され、それによってｓｉＲＮＡに１００％未満の相同性を有する標的と対を形成し、そして／または分解するＲＩＳＣの能力を除去するという可能性がある。そのため、ＳまたはＡＳ鎖の５’末端以外の位置にある２’−Ｏ−メチル修飾がオフ・ターゲット効果を取り除くために使用することが可能である。
（実施例２１）
（エクサエクオ剤としての修飾二本鎖）
ｓｉＲＮＡによる継続的投薬またはマイクロアレイ実験の最中に、形質移入の間、全ｓｉＲＮＡ濃度を一定に保つことが所望される。残念なことに、第２のｓｉＲＮＡの付加（例え非特異的であっても）が、標的特異的ｓｉＲＮＡによって誘導されたサイレンシングの度合いを少なくすることができ、このことは、おそらくＲＩＳＣへのアクセスのための２本の配列のあいだの競合による。そのような理由から、遺伝子標的化を中断させることがないエクサエクオ（ｅｘａｅｑｕｏ）剤として作用し得る二本鎖の開発が重要である。
例えば用量実験などにおける非競合的エクサクオ（ｅｘａｅｑｕｏ）剤として作用する修飾二本鎖の能力を評価するために、修飾および非修飾の、非特異的ｓｉＲＮＡの特異的ｓｉＲＮＡサイレンシングに対する効果を調べた。このことを達成するために、ヒト・シクロフィリンＢ遺伝子（例えば、ｃｙｃｌｏ４）を対象とするｓｉＲＮＡ二本鎖を最初に、種々の濃度（例えば、用量応答）で細胞に形質移入した。ｃｙｃｌｏ４単独で誘導された標的特異的サイレンシングを次に、（ａ）非修飾かつ非特異的配列＃４（ＮＳ４）または（ｂ）修飾ＮＳ４、の存在下で、この分子によって誘導したサイレンシングと比較した。この場合、ＮＳ４の修飾バージョンは、１９または１７塩基対長のいずれかであり（それぞれ、配列番号３３３：ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡおよび配列番号３３４：ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣ）、センスおよびアンチセンス鎖上の１位および２位にある−Ｏ−メチル基を含み、またＣおよびＵ上の２’−Ｏ−メチル基２’−Ｏ−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のＣおよびＵ上の２’Ｆｌを含んだ。センスおよびアンチセンス鎖の５’末端には、リン酸基は結合していない。
具体的には、ＨｅＬａ細胞を９６穴プレートにプレーティングし、一晩置いて接着させた。続いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ を用いて、以下のものの１つを細胞に形質移入した。すなわち、
ａ）ｃｙｃｌｏ４ ｓｉＲＮＡ（１−１００ｎＭ）、（配列番号３１８：ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＣＵ ＧＵＵ ＣＣＡ ＡＡＡ Ａ）
ｂ）ｃｙｃｌｏ４ ｓｉＲＮＡ（１−１００ｎＭ）、プラス、ＮＳ４（１９塩基対）、
ｃ）ｃｙｃｌｏ４ ｓｉＲＮＡ（Ｉ−１００ｎＭ）、プラス、修飾ＮＳ４（１７または１９塩基対）、
ｄ）センス鎖の５’末端上にＣｙ３標識も含むｃｙｃｌｏ４ ｓｉＲＮＡ（１−１００ｎＭ）プラス、修飾ＮＳ４（１７または１９塩基対）。第２のｓｉＲＮＡの濃度は、形質移入の最中に全ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭに保たれるように、ｃｙｃｌｏ４の濃度に第２のｓｉＲＮＡ濃度を一致させた。次に、分岐ＤＮＡアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を用いて、標的特異的サイレンシングを測定した（ｔ＝２４時間）。
これらの実験の結果を図４３に示し、かつ以下に説明した。
１．ｃｙｃｌｏ４は、有力な二本鎖である。ｃｙｃｌｏ４の濃度を１００ｎＭから１ｎＭに減少させても、この二本鎖のサイレンシング能は、かえられない（Ｆ９５、図４８Ａ−Ｉ参照）。
２．１９塩基対未修飾ＮＳ４ｓｉＲＮＡをｃｙｃｌｏ４に加えることで、ｃｙｃｌｏ４誘導遺伝子サイレンシングに対して好適な濃度依存的減少をもたし、ＮＳ４が例えばＲＩＳＣ複合体へのアクセスについてｃｙｃｌｏ４と競合していることを示唆している（図４８Ｂ−Ｉ参照）。
３．センスおよびアンチセンス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル基と、センス鎖のＣおよびＵ上の２’−Ｏ−メチル基と、アンチセンス鎖のＣおよびＵ上の２’Ｆｌ基とを含むＮＳ４二本鎖（１７または１９塩基対）は、ｃｙｃｌｏ４による標的特異的サイレンシングを減少させず、それらの二本鎖は例えばＲＩＳＣに対してｃｙｃｌｏ４と競合しないことが示唆される（図４３ＢＩＩおよびＢＩＩＩ参照）。
４．センスおよびアンチセンス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル基と、センス鎖のＣおよびＵ上の２’−Ｏ−メチル基と、アンチセンス鎖のＣおよびＵ上の２’Ｆｌ基と、センス鎖の５’末端上のＣｙ３とを含むＮＳ４二本鎖（１７または１９塩基対）は、ｃｙｃｌｏ４による標的特異的サイレンシングを減少させず、それらの二本鎖は例えばＲＩＳＣに対してｃｙｃｌｏ４と競合しないことが示唆される（図４８ＡＩＩおよびＡＩＩＩ参照）。
これらの結果は、上記の修飾を含むｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡと競合せず、マイクロアレイ研究等のｓｉＲＮＡ研究でエクサエクオ（ｅｘａｅｑｕｏ）剤として使用することができることを、示している。
上記修飾を持つｓｉＲＮＡが、標的特異的ｓｉＲＮＡと競合しない理由は、修飾二本鎖が細胞へ入ることができないからであると、考えられる。これを試験するために、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基と、センス鎖のＣおよびＵ上の２’−Ｏ−メチル基と、アンチセンス鎖のＣおよびＵ上の２’Ｆｌ基（アンチセンス鎖上には５’リン酸基がない）とをを担持するｓｉＲＮＡを、センス鎖の５’末端上でＣｙ３部分で標識し、ＨｅＬａ細胞に形質移入した。形質移入後４８時間、細胞を蛍光顕微鏡で分析した。これらの実験の結果は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００形質移入によって、細胞内に入るそれらの二本鎖の能力に上記修飾が変更を加えることはないことを示す。（Ａ）センスおよびアンチセンス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣおよびＵ上の２’−Ｏ−メチル基、アンチセンス鎖のＣおよびＵに付加された２’Ｆｌ基、ならびにセンス鎖の５’末端上のＣｙ３基、によって修飾されたｃｙｃｌｏ１４ ｓｉＲＮＡ 二本鎖によって染色されたＨｅＬａ細胞と、（Ｂ）（Ａ）と同様に染色され、かつ核の位置を同定するためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２による対比染色されたものとの顕微鏡写真（本明細書では複製せず）によって、これらの修飾を含むｓｉＲＮＡの核および核周囲を示した。
センスおよびアンチセンス鎖の１および２位上への２’−Ｏ−メチル基の付加が他の同時形質移入されたｓｉＲＮＡと競合する二本鎖の能力を取り除くのに十分であるかどうかを試験するために、ＧＡＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ４）を対象とするｓｉＲＮＡを、（１）非特異的対照＃２（ＮＳ２−配列番号３３４：ＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＡＧＡＵＡＣ）、（２）センスおよびアンチセンス鎖の両方の１位および２位に２’−Ｏ−メチル修飾を担持する非特異的対照＃２、あるいは（３）ｃｙｃｌｏ１４（配列番号３３５：ＧＧＣＣＵＵＡＧＣＵＡＣＡＧＧＡＧＡＧ、ＧＡＰＤＨ４と競合しないシクロフィリンｓｉＲＮＡ）とともに、様々な濃度（０．７８１〜１００ｎＭ）でＨｅＬａ細胞に形質移入した。第２のｓｉＲＮＡの濃度を、形質移入中の全ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭとなるように、ＧＡＰＤＨ４の濃度と一致させた。次に、ＧＡＰＤＨ転写産物のレベルを評価するために分岐ＤＮＡアッセイを実施する前に、細胞をさらに２４時間培養した。これらの実験の結果を図４９で説明するとともに、以下に示す。
１．ＧＡＰＤＨ４が、Ｃｙｃｌｏ１４の存在下で（またはそれ自体で、データ不図示）、野生型転写産物の約９０％サイレンシングを誘導する。
２．未修飾ＮＳ２の付加によってＧＡＰＤＨサイレンシングでの劇的な減少がもたらされた。
３．センスおよびアンチセンス鎖の両方の１および２位で２’−Ｏ−メチル基によるＮＳ２の修飾が、未修飾分子によって観察された干渉効果を除去した。
これらの結果は、既に述べた修飾を含むｓｉＲＮＡは、機能的ｓｉＲＮＡと競合することがなく、マイクロアレイ研究を含む種々のｓｉＲＮＡ適用で、エクサエクオ剤として用いられることを実証する。
本発明を、いくつかの具体的または好ましい独創的な実施形態と組み合わせて説明および例証したが、本発明が多くのさらなる修飾をおこなうことができることは、当業者に理解される。本願は、一般に本発明の原理に従うありとあらゆる変形例、使用、または適用に及ぶもので、添付した請求の範囲の適用および範囲に記載された必須の特徴に適用しうるものとして、当技術分野で既知または慣習にともなう開示からの逸脱を含む。
図１Ａは、トランスフェクションの２４時間後に測定されるセンスおよび／またはアンチセンス鎖に対するオルトエステル修飾の機能性を説明する。修飾二本鎖の説明については「好ましい実施形態」を参照せよ。ｓｉＲＮＡ＋ＳＥＡＰ発現プラスミドによって同時にトランスフェクトされた細胞でのＳＥＡＰ発現レベルを、ＳＥＡＰ発現プラスミド単独によってトランスフェクトされた細胞と比較することで、各ｓｉＲＮＡによって誘導されたＳＥＡＰサイレンシングの度合いを決定した。 図１Ｂは、トランスフェクションの４８時間後に測定されるオルトエステル修飾（センスおよび／またはアンチセンス鎖上）の機能性を示す。 図２Ａは、トランスフェクションの２４時間後に測定される、他の修飾とともにオルトエステル修飾（センスおよび／またはアンチセンス鎖上）の機能性を示す。 図２Ｂは、トランスフェクションの７２時間後に測定される、他の修飾とともにセンスおよび／またはアンチセンス鎖上のオルトエステル修飾の機能性を示す。 図２Ｃは、トランスフェクションの１４４時間後に測定される、他の修飾とともにセンスおよび／またはアンチセンス鎖上のオルトエステル修飾の機能性を示す。 図３は、ｓｉＲＮＡ機能性に対するセンスおよびアンチセンス鎖修飾の効果を示す。 図４は、ｓｉＲＮＡ機能性に対するセンスおよびアンチセンス鎖修飾の効果を説明する。 図５は、センス鎖上の種々の修飾と併用したアンチセンス鎖のチオ系修飾の効果を示す。 図６は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方でのホスホロチオエート修飾の効果を示す。 図７は、他の多様な修飾と併用した２’−Ｏ−メチル修飾（センスおよびアンチセンス鎖の両方で）の効果を示す。 図８は、他の化学修飾と併用した２’−デオキシ−ＲＮＡハイブリッド（どちらか一方の鎖）であるｓｉＲＮＡの効果を示す。 図９は、他の化学修飾と併用したセンス鎖５’末端でのコレステロール・コンジュゲートの５’末端の機能性を示す。 図１０は、他の化学修飾と併用したセンス鎖５’末端でのＰＥＧコンジュゲートの機能性を示す。 図１１は、センス鎖５’末端でのコレステロール・コンジュゲートを持つ修飾ｓｉＲＮＡの効力増加を示す。 図１２は、ダルマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）２’−ＡＣＥ・ＲＮＡ合成化学に用い得る保護ＲＮＡヌクレオチド・ホスホラミダイトを示す。 図１３は、ダルマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）ＲＮＡ合成サイクルの概略を示す。 図１４は、好ましい２’−ＡＣＥ保護ＲＮＡの構造を示す。 図１５Ａは、他の裸ｓｉＲＮＡ上の単一２’−デオキシ修飾（センスまたはアンチセンス鎖）の機能的な影響（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を示す。 図１５Ｂは、他の裸ｓｉＲＮＡ上の２つのタンデム２’−デオキシ修飾（センスまたはアンチセンス鎖）の機能的な影響を示す。 図１５Ｃは、他の裸ｓｉＲＮＡ上の３つのタンデム２’−デオキシ修飾（センスまたはアンチセンス鎖）の機能的な影響を示す。 図１６Ａは、他の裸ｓｉＲＮＡ上の単一２’−Ｏ−メチル修飾（センスまたはアンチセンス鎖）の機能性影響（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を示す。 図１６Ｂは、他の裸ｓｉＲＮＡ上の２つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾（センスまたはアンチセンス鎖）の機能性影響を示す。 図１６Ｃは、他の裸ｓｉＲＮＡ上の３つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾（センスまたはアンチセンス鎖）の機能性影響を示す。 図１７は、二本鎖安定性に対するセンスおよびアンチセンス鎖での修飾の影響を示す。 図１８は、裸および修飾ｓｉＲＮＡの受動的な取り込みに対する５’コレステロール部分を含むコンジュゲートの効果を示す。 図１９は、センス鎖内の種々の位置における２つのタンデム２’−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 図２０は、センス鎖内の種々の位置における３つのタンデム２’−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 図２１は、アンチセンス鎖内の種々の位置における単一２’−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 図２２は、アンチセンス鎖内の種々の位置における２つのタンデム２’−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 図２３は、アンチセンス鎖内の種々の位置における３つのタンデム２’−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 図２４は、センス鎖内での種々の位置における２つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。 図２５は、センス鎖内での種々の位置における３つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。 図２６は、アンチセンス鎖での種々の位置における単一２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。 図２７は、アンチセンス鎖での種々の位置における２つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。 図２８は、アンチセンス鎖での種々の位置における３つのタンデム２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。 図２９は、ヒト・シクロフィリン遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた（１）５’センス、（２）５’アンチセンス、または（３）５’センスおよびアンチセンス鎖の位置１および２上での２つの２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。 図３０は、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた（１）５’センス、（２）５’アンチセンス、または（３）５’センスおよびアンチセンス鎖の位置１および２上での２つの２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。注記：この図では、アンチセンス鎖の５’末端のリン酸化を「Ｐ」で表す。 図３１は、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた（１）５’センス、（２）５’アンチセンス、または（３）５’センスおよびアンチセンス鎖の位置１および２上での２つの２’−Ｏ−メチル修飾の機能的な影響を示す。注記：この図では、アンチセンス鎖の５’末端のリン酸化を「Ｐ」で表す。 図３２は、ヒト血清での修飾ｓｉＲＮＡの安定性を示す。修飾”ａ”＝センス鎖での全ＣｓおよびＵｓの２’−Ｏ−メチル修飾（３’ｉｄＴキャッピングと組み合わさっている）。修飾”ｂ”＝センス鎖での全ＣｓおよびＵｓの２’Ｆ修飾（３’ｉｄＴキャッピングと組み合わさっている）。 図３３は、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対する修飾ｓｉＲＮＡ−コレステロール・コンジュゲートの親和性を示す。 図３４は、小分子コンジュゲートがｓｉＲＮＡ効力について有する効果を示す。 図３５は、ヒト血清でのｓｉＲＮＡコンジュゲートの安定性を示す。ｓｉＲＮＡは、センス鎖上に、（１）全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル基と、（２）３’ｉｄＴキャップとを運び、ｓｉＲＮＡａ−コンジュゲートは、センス鎖上に、（１）全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル基、（２）３’ｉｄＴキャップ、および（３）５’コレステロール・コンジュケートを担持する。 図３６は、コレステロール・コンジュゲートが受動的なｓｉＲＮＡ取り込みについて有する効果を示す。 図３７Ａは、血清にさらされたｓｉＲＮＡを含むエチジウム・ブロミド染色ゲルを示す、典型的な血清安定性試験から得られた結果を表す（上側が未修飾、下側が「分子１修飾」による修飾）。この図の目的にとって、用語「分子１修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」とは、センス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−フルオロ（Ｆｌ）修飾、およびアンチセンス鎖の５’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。図３７Ｂは、修飾および未修飾形態である４種類のヒト・シクロフィリンＢ・ｓｉＲＮＡの相対的安定性をプロットする一組の折れ線グラフである（Ｕ １ ＝ ５’ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＣＡ ＵＣＵ ＡＣＧ ＧＵＧ Ａ（配列番号３１５）、Ｕ２ ＝ ５’ＧＡＡ ＡＧＧ ＡＵＵ ＵＧＧ ＣＵＡ ＣＡＡ Ａ（配列番号３１６）、Ｕ３ ＝ ５’ＡＣＡ ＧＣＡ ＡＡＵ ＵＣＣ ＡＵＣ ＧＵＧ Ｕ（配列番号３１７）、およびＵ４ ＝ ５’ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＣＵ ＧＵＵ ＣＣＡ ＡＡＡ Ａ、（配列番号３１８）、センス鎖）。Ｘ軸は、時間（ｈｒ）を表す。Ｙ軸は元のままの状態を保つ二本鎖が占める割合を表す。黒四角は、未修飾配列を示す。白四角は、修飾配列を示す。 図３８は、種々の濃度で所定の標的をサイレンシングするために、裸、または修飾（分子１修飾）されているｓｉＲＮＡ（Ｕ１およびＵ３）の能力を比較する。Ｙ軸は、対照群（形質移入されていない細胞）と比較した発現の度合いを表す。Ｘ軸は形質移入の手順を進めている最中のｓｉＲＮＡの濃度を表す。黒棒は、未修飾配列を表す。白棒は修飾配列を表す。この図の目的にとって、用語「分子１修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」とは、センス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−フルオロ（Ｆｌ）修飾、およびアンチセンス鎖の５’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 図３９は、修飾ｓｉＲＮＡ（「分子１修飾」を持つ）および未修飾ｓｉＲＮＡによって、７日間にわたり誘導されたサイレンシングの度合いを評価する。Ｙ軸は、対照群（形質移入されていない細胞）と比較した場合の遺伝子発現の度合いを表す。Ｘ軸は、形質移入後の日数を表す。黒棒は、未修飾配列を表す。白棒は、修飾配列を表す。この図の目的にとって、用語「分子１修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」とは、センス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−フルオロ（Ｆｌ）修飾、およびアンチセンス鎖の５’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 図４０は、種々の濃度で細胞に形質移入された４通りの個々の修飾ｓｉＲＮＡ（分子１修飾にもとづく）および未修飾ｓｉＲＮＡによって誘導された細胞死の度合いを比較する。Ｙ軸は、細胞の相対的生存度（非形質移入細胞にもとづく）を表す。Ｘ軸は、形質移入の手順を実施している際のｓｉＲＮＡの濃度を表す。培養物を、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）アッセイを用いた形質移入の２４〜４８時間後に試験した。黒棒は未修飾配列を表す。白棒は、修飾配列を表す。この図の目的にとって、用語「分子１修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」とは、センス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−フルオロ（Ｆｌ）修飾、およびアンチセンス鎖の５’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 図４１は、修飾形態（分子１修飾にもとづく）および未修飾形態である４通りの個々のヒト・シクロフィリンＢ・ｓｉＲＮＡによるオフ・ターゲット化の度合いを比較する。データを６つの異なる群にわけた。すなわち、４倍（４ｘ）を上回る発現減少が見られる標的の数、３〜４倍（３〜４ｘ）の発現減少が見られる標的の数、２．５〜３倍（２．５〜３ｘ）の発現減少が見られる標的の数、４倍（＞４ｘ）を上回る発現増加が見られる標的の数、３〜４倍（３〜４ｘ）の発現増加が見られる標的の数、さらに２．５〜３倍（２．５〜３ｘ）の発現増加が見られる標的の数である。黒棒は、未修飾配列を表す。白棒は、修飾配列を表す。この図の目的にとって、用語「分子１修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」とは、センス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−フルオロ（Ｆｌ）修飾、 およびアンチセンス鎖の５’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 図４２は、（１）分子２修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ ２ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、（２）Ｃｙ３による裸分子修飾、および（３）Ｃｙ３により修飾された裸ＮＳＣ９分子を含むｃｙｃｌｏ１４ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能力を比較するヒストグラムを示す。Ｙ軸は、対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）と比較したヒト・シクロフィリンＢ発現の度合いを示す。「脂質（ｌｉｐｉｄ）」は、形質移入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によって処置された対照細胞を表す。「対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、未処理の細胞のことをいう。ＮＳ９は、非特異的配列＃９である。この図の目的にとって、用語「分子２修飾（ｍｏｌｅｃｕｌｅ ２ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」とは、センス鎖の１および２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス鎖の全ＣｓおよびＵｓ上の２’−Ｏ−メチル修飾、センス領域の５’末端にあるＣｙｓ３標識、アンチセンス鎖の全ＣおよびＵ上の２’−フルオロ（Ｆｌ）修飾、およびアンチセンス鎖の５’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 図４３ＡおよびＢは、２’−Ｏ−メチル化ＳＥＡＰ−２２１７ｓｉＲＮＡに関する機能と修飾との関係を示す。これらの図は、ＳＥＡＰ−２２１７のセンス鎖（図４３Ａ）およびアンチセンス鎖（図４３Ｂ）の単一鎖２’−Ｏ−メチル修飾（黒棒）および対形成２’−Ｏ−メチル修飾（灰）の遺伝子サイレンシングの効果を示す。Ｘ軸は、ｓｉＲＮＡ（５’→３’）に沿った修飾の相対的位置を表す。Ｙ軸は、対照群に対する発現比を表す。 図４４Ａおよび図４４Ｂは、ＳＥＡＰ２２１７機能に対する２’−デオキシ基の付加の効果を示す。特に、２’−デオキシ基によって３つの連続的なヌクレオチド（例えば、位置１、２、および３）が修飾される。識別番号が各基に対応づけられている（例えば、Ｓ３Ｄ−１６は以下のようにデコードされる。すなわち、「Ｓ」＝センス鎖修飾、「３」＝連続的に修飾されるヌクレオチドの数、「”Ｄ”＝２’デオキシ修飾、「１６」＝修飾の第1の位置）。図４４Ａは、センス鎖修飾を示す。図４４Ｂは、アンチセンス鎖修飾を示す。対照群として、ｓｉＲＮＡなしおよび非特異的（ｎｓ）ＲＮＡを含む。 図４５Ａ〜図４５Ｆは、６種類のルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ８、１８、５６、５８、６３、および８１）のアンチセンス鎖に対する、５’リン酸化を持つまたは持たない２’−Ｏ−メチル化の効果を示す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「＊」は、指定鎖の１および２位での２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は、指定された鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（非形質移入）細胞の発現率（％）を示す。「対照」＝偽形質移入細胞である。 図４６Ａ〜Ｅは、本発明の一実施形態にもとづいて生産された５つのルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ８、５６、５８、６３、８１）の用量依存を表す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「Ｍ」は、指定の鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は、指定の鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（形質移入されていない）細胞の発現率を表す。Ｘ軸は、１＝２００ｍＭ、２＝１００ｎＭ、３＝１０ｎＭ、４＝１ｎＭ、５＝０．１ｎＭ、および６＝０．０１ｎＭによる形質移入の過程でのｓｉＲＮＡの濃度を表す。 図４７は、センスおよびアンチセンス鎖−ＲＩＳＣ相互作用の予想反応速度と、（１）２’−Ｏ−メチル化（＊）および（２）該分子の相対的機能性に対するその相互作用の感受性とを表す。高度に機能的な分子（例えば、＞Ｆ９０、９０％を上回る機能性）では、ＲＩＳＣがアンチセンス鎖（Ｋｏｖｅｒａｌｌ＝１００）に対して選択性が高い。ヌクレオチド１および２位での２’−Ｏ−メチル基によるセンス鎖の修飾は、さらに、ＡＳ鎖選択に傾くが、相対的な増減率は軽度である。乏しい機能性または適度な機能性の二本鎖に由来するセンスおよびアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣとのより良く均整のとれた平衡（Ｋ ｏｖｅｒａｌｌ 約１）を示す。これらの場合、Ｓの修飾は、ＲＩＳＣに結合する能力を本質的に取り除き、ＲＩＳＣ−ＡＳ相互作用への選択性を強く傾ける。 図４８Ａおよび４８Ｂは、ｃｙｃｌｏ４ｓｉＲＮＡとＮＳ４ｓｉＲＮＡとのあいだの競合についての研究を示す。Ａ−Ｉ：ｃｙｃｌｏ４ｓｉＲＮＡを種々の濃度で細胞に形質移入した。Ａ−ＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、アンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’Ｆ１基、ならびにセンス鎖の５’末端にあるＣｙ３基により修飾された、Ｃｙ３コンジュゲート１９ｂｐＮＳ４二本鎖。Ａ−ＩＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓに結合された２’Ｆ１基によって修飾されたＣｙｓ３コンジュゲート１７ｂｐＮＳ４二本鎖。Ｂ−Ｉ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、１９ｂｐＮＳ４二本鎖。Ｂ−ＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’Ｆ１基により修飾された１９ｂｐＮＳ４二本鎖。Ｂ−ＩＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’Ｆｌ基により修飾された１７ｂｐＮＳ４二本鎖。注：全ての形質移入を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｈｏｆｅｃｔａｍｉｎ）２０００（製造元の指示）および１００ｎＭの核酸濃度を用いて実施した。データを内部ＧＡＰＤＨレベルを正規化した。 図４８Ａおよび４８Ｂは、ｃｙｃｌｏ４ｓｉＲＮＡとＮＳ４ｓｉＲＮＡとのあいだの競合についての研究を示す。Ａ−Ｉ：ｃｙｃｌｏ４ｓｉＲＮＡを種々の濃度で細胞に形質移入した。Ａ−ＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、アンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’Ｆ１基、ならびにセンス鎖の５’末端にあるＣｙ３基により修飾された、Ｃｙ３コンジュゲート１９ｂｐＮＳ４二本鎖。Ａ−ＩＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓに結合された２’Ｆ１基によって修飾されたＣｙｓ３コンジュゲート１７ｂｐＮＳ４二本鎖。Ｂ−Ｉ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、１９ｂｐＮＳ４二本鎖。Ｂ−ＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’Ｆ１基により修飾された１９ｂｐＮＳ４二本鎖。Ｂ−ＩＩＩ：ｃｙｃｌｏ４（種々の濃度で）と、センスおよびアンチセンス鎖の１および２位にある２’−Ｏ−メチル基、センス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’−Ｏ−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のＣｓおよびＵｓにある２’Ｆｌ基により修飾された１７ｂｐＮＳ４二本鎖。注：全ての形質移入を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｈｏｆｅｃｔａｍｉｎ）２０００（製造元の指示）および１００ｎＭの核酸濃度を用いて実施した。データを内部ＧＡＰＤＨレベルを正規化した。 図４９は、ＧＡＰＤＨと非特異的対照＃２との競合実験を示す。（１）非競合ｓｉＲＮＡであるｃｙｃｌｏ１４、（２）競合ｓｉＲＮＡ（非特異的配列＃２）、もしくは（３）センスおよびアンチセンス鎖の両方の１および２位で２‘−Ｏ−メチル基によって標識された競合ｓｉＲＮＡとともに、ＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡを、種々の濃度（０．７８１〜１００ｎＭ）でＨｅＬａ細胞に導入した。

Claims (8)

  1. ｓｉＲＮＡであって、
    （ａ）センス鎖と、
    （ｂ）アンチセンス鎖と、
    （ｃ）コンジュゲートと、
    を含み、前記センス鎖および／またはアンチセンス鎖が少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを含み、前記２’修飾ヌクレオチドが、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミン修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、および２’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択され、前記コンジュゲートがコレステロールである、ｓｉＲＮＡ。
  2. 前記２’修飾ヌクレオチドが２’ハロゲン修飾ヌクレオチドであり、前記ハロゲンがフッ素である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  3. 前記ｓｉＲＮＡが１８〜３０ヌクレオチド塩基対から構成される、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  4. 前記ｓｉＲＮＡが１９ヌクレオチド塩基対から構成される、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  5. さらに、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも１つが、少なくとも１つのヌクレオチド・ユニットのオーバーハングを含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  6. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも１つが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  7. 前記修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート結合とホスホロジチオエート結合とからなる群から選択される、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
  8. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも１つが、ポリリボヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
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