JP2007525169A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007525169A5 JP2007525169A5 JP2006509678A JP2006509678A JP2007525169A5 JP 2007525169 A5 JP2007525169 A5 JP 2007525169A5 JP 2006509678 A JP2006509678 A JP 2006509678A JP 2006509678 A JP2006509678 A JP 2006509678A JP 2007525169 A5 JP2007525169 A5 JP 2007525169A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sirna
- sense
- modification
- nucleotide
- antisense
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 claims description 549
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 506
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 claims description 467
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 457
- 229920000972 Sense strand Polymers 0.000 claims description 252
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims description 117
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 104
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 79
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N (3β)-Cholest-5-en-3-ol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 72
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 52
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 45
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 38
- 229940107161 Cholesterol Drugs 0.000 claims description 36
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 36
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 36
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 26
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims description 15
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 11
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 11
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 705
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 704
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 419
- 229920001985 Small interfering RNA Polymers 0.000 description 417
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 178
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 142
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 135
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 108
- 230000001743 silencing Effects 0.000 description 73
- 230000025458 RNA interference Effects 0.000 description 61
- -1 halogen modified pyrimidine nucleotide Chemical class 0.000 description 61
- 230000002987 rna-interference Effects 0.000 description 61
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 59
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 56
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 53
- 150000002905 orthoesters Chemical class 0.000 description 51
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 47
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 41
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 41
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 39
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 39
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 37
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 37
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 36
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 34
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 32
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 32
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 28
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 27
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 27
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 26
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 25
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 23
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 23
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 23
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 23
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 22
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 22
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 20
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 20
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 20
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 19
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 19
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 18
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 18
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 17
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 17
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 17
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 150000008300 phosphoramidites Chemical group 0.000 description 16
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 15
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 15
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 15
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 14
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 14
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 14
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 289-95-2 Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 125000002092 orthoester group Chemical group 0.000 description 12
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 11
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N DEOXYTHYMIDINE Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 11
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 11
- LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidite Chemical compound NP([O-])[O-] LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000001808 coupling Effects 0.000 description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 11
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 11
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 11
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 11
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 11
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 11
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 10
- 102100010818 PPIB Human genes 0.000 description 10
- 229940035893 Uracil Drugs 0.000 description 10
- 108010048032 cyclophilin B Proteins 0.000 description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 10
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 9
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 9
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 9
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 9
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 description 8
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 8
- 102000030951 Phosphotransferases Human genes 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 8
- 229920001891 Small hairpin RNA Polymers 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 8
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 7
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- DKAXSGWOJGVZGP-UHFFFAOYSA-M 3H-dithiole-3-carboxylate Chemical compound [O-]C(=O)C1SSC=C1 DKAXSGWOJGVZGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N Dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N Xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001383 5S-rRNA precursor Polymers 0.000 description 5
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 5
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 5
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 5
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 5
- 125000003808 silyl group Chemical group [H][Si]([H])([H])[*] 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N Spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-UCVXFZOQSA-N Uridine Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UCVXFZOQSA-N 0.000 description 4
- 229940045145 Uridine Drugs 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005842 heteroatoms Chemical group 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 4
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 3
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N Diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 3
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 3
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 3
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 3
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N Inosine Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 3
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 235000017168 chlorine Nutrition 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 3
- 125000004430 oxygen atoms Chemical group O* 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 3
- RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 2,6-Diaminopurine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 2
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2H-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMVDTXSRLFAIKI-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound C1=NC=C2NC=NC2=N1.C1=NC=C2NC=NC2=N1 YMVDTXSRLFAIKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZVCGJBESNRLEQ-UHFFFAOYSA-N 7H-purine;pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1.C1=NC=C2NC=NC2=N1 CZVCGJBESNRLEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 102100013894 BCL2 Human genes 0.000 description 2
- 108060000885 BCL2 Proteins 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N Bisbenzimide Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 description 2
- WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N Boron trifluoride Chemical compound FB(F)F WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- YMXFJTUQQVLJEN-UHFFFAOYSA-N C1=CN=CN=C1.C1=CN=CN=C1 Chemical compound C1=CN=CN=C1.C1=CN=CN=C1 YMXFJTUQQVLJEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M CHEMBL593252 Chemical class [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- RDFLLVCQYHQOBU-GPGGJFNDSA-O Cyanin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(-c2cc(O)c(O)cc2)[o+]c2c(c(O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)cc(O)c2)c1 RDFLLVCQYHQOBU-GPGGJFNDSA-O 0.000 description 2
- PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylamine Chemical compound NC1CCCCC1 PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-XVFCMESISA-N Cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- YFYBXOIQXOOUCI-UHFFFAOYSA-N N-[[di(propan-2-yl)amino]-methoxyphosphanyl]-N-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(OC)N(C(C)C)C(C)C YFYBXOIQXOOUCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100017340 NKD2 Human genes 0.000 description 2
- 101700042444 NKD2 Proteins 0.000 description 2
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene (PE) Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 230000036141 SERUM STABILITY Effects 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N Thiophenol Chemical compound SC1=CC=CC=C1 RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104230 Thymidine Drugs 0.000 description 2
- 229920001949 Transfer RNA Polymers 0.000 description 2
- 229960004319 Trichloroacetic Acid Drugs 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N Trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000477 aza group Chemical group 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000001717 carbocyclic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental Effects 0.000 description 2
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N ethyl amine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atoms Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N oxygen atom Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 230000000275 pharmacokinetic Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920002973 ribosomal RNA Polymers 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K selenophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=[Se] JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atoms Chemical group 0.000 description 2
- 125000004354 sulfur functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tBuOOH Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 2
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- CCSBNBKMACZDGN-UHFFFAOYSA-N (2-phenoxyacetyl) 2-phenoxyacetate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OCC(=O)OC(=O)COC1=CC=CC=C1 CCSBNBKMACZDGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-GHCJXIJMSA-N (2S,3R,4S,5S)-2-(hydroxymethyl)-5-purin-9-yloxolane-3,4-diol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3-thiol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](S)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- LKUDPHPHKOZXCD-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(OC)=C1 LKUDPHPHKOZXCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-Methylimidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1N(C)C(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- NEOJKYRRLHDYII-TURQNECASA-N 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-(2-oxopropyl)pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC(=O)C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NEOJKYRRLHDYII-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- SGKGZYGMLGVQHP-ZOQUXTDFSA-N 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC1=CC(=O)NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SGKGZYGMLGVQHP-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- GHNVVFLYSKCSLI-NKNIEXMISA-N 1-[(2S,3R,4S,5R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-methylpropan-1-one Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@]1(C(=O)C(C)C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GHNVVFLYSKCSLI-NKNIEXMISA-N 0.000 description 1
- GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 1-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(=N)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methyluridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- AOTQGWFNFTVXNQ-UHFFFAOYSA-N 2-(1-adamantyl)acetic acid Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(CC(=O)O)C3 AOTQGWFNFTVXNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical compound NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminophenol Chemical group NC1=CC=CC=C1O CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 2-Pyrrolidone Chemical group O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJRSGWRVRYHUBT-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-acetyloxyethoxy)methoxy]ethyl acetate Chemical compound CC(=O)OCCOC(OCCOC(C)=O)OCCOC(C)=O SJRSGWRVRYHUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-propyl-1H-purin-6-one Chemical compound CCCC1(N)NC(=O)C2=NC=NC2=N1 HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 2-methyladenosine Chemical compound C12=NC(C)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- 125000004493 2-methylbut-1-yl group Chemical group CC(C*)CC 0.000 description 1
- 125000005916 2-methylpentyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 2-propyl-7H-purin-6-amine Chemical compound CCCC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 2-thiocytidine Chemical compound S=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- RYSMHWILUNYBFW-GRIPGOBMSA-N 3'-amino-3'-deoxy-N(6),N(6)-dimethyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(N(C)C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N)[C@H]1O RYSMHWILUNYBFW-GRIPGOBMSA-N 0.000 description 1
- WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropanenitrile Chemical compound OCCC#N WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RDPUKVRQKWBSPK-ZOQUXTDFSA-N 3-methylcytidine Chemical compound O=C1N(C)C(=N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RDPUKVRQKWBSPK-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- 125000005917 3-methylpentyl group Chemical group 0.000 description 1
- MPOYBFYHRQBZPM-UHFFFAOYSA-N 3H-pyridin-4-one Chemical compound O=C1CC=NC=C1 MPOYBFYHRQBZPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IECMOFZIMWVOAS-UHFFFAOYSA-N 4,4-dimethylpiperidine Chemical compound CC1(C)CCNCC1 IECMOFZIMWVOAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NAROVGXVMKGQLH-UHFFFAOYSA-N 4-(1H-imidazol-2-yl)morpholine Chemical group C1COCCN1C1=NC=CN1 NAROVGXVMKGQLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 4-acetylcytidine Chemical compound C1=CC(C(=O)C)(N)NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 0.000 description 1
- XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 4-amino-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-Bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-Bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-Methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 5-Methyluridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- KYRMPMCAOPMOIR-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-2H-tetrazole Chemical compound CCC=1N=NNN=1 KYRMPMCAOPMOIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STRZQWQNZQMHQR-UAKXSSHOSA-N 5-fluorocytidine Chemical compound C1=C(F)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 STRZQWQNZQMHQR-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 5-fluorouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 5-methyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- ZBXNFTFKKOSPLD-UHFFFAOYSA-N 5-methylsulfanyl-2H-tetrazole Chemical compound CSC1=NN=NN1 ZBXNFTFKKOSPLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1H-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methylaminopurine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-Methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 1
- 101700002069 ARPD Proteins 0.000 description 1
- 101710036216 ATEG_03556 Proteins 0.000 description 1
- 230000035533 AUC Effects 0.000 description 1
- 206010049460 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 230000035928 Absorption time Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N Acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940059260 Amidate Drugs 0.000 description 1
- 229920001262 Aminoallyl nucleotide Polymers 0.000 description 1
- LDDQLRUQCUTJBB-UHFFFAOYSA-N Ammonium fluoride Chemical compound [NH4+].[F-] LDDQLRUQCUTJBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920000195 Bacterial small RNA Polymers 0.000 description 1
- 210000003651 Basophils Anatomy 0.000 description 1
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N Benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037177 Biodistribution Effects 0.000 description 1
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 1
- RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(OC(=O)NCCCCCC)[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(OC(=O)NCCCCCC)[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N 0.000 description 1
- XRQVYHRZFZGHKS-KEHBJSKDSA-N C1N=C2C(C(=O)C(C)C)(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O Chemical compound C1N=C2C(C(=O)C(C)C)(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O XRQVYHRZFZGHKS-KEHBJSKDSA-N 0.000 description 1
- 108060001066 CACNA1B Proteins 0.000 description 1
- 102100004924 CACNA1B Human genes 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O CC[NH+](CC)CC Chemical compound CC[NH+](CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-M COP([O-])=O Chemical class COP([O-])=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate dianion Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002168 Chimeric RNA Polymers 0.000 description 1
- KOPOQZFJUQMUML-UHFFFAOYSA-N Chlorosilane Chemical compound Cl[SiH3] KOPOQZFJUQMUML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001612 Chondrocytes Anatomy 0.000 description 1
- 208000001590 Congenital Abnormality Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- JQVDAXLFBXTEQA-UHFFFAOYSA-N Dibutylamine Chemical compound CCCCNCCCC JQVDAXLFBXTEQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N Diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N Dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 101710003775 ERVK-10 Proteins 0.000 description 1
- 101710037030 ERVK-11 Proteins 0.000 description 1
- 101710009283 ERVK-18 Proteins 0.000 description 1
- 101710009286 ERVK-19 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 101710035700 ERVK-25 Proteins 0.000 description 1
- 101710038044 ERVK-6 Proteins 0.000 description 1
- 101710014468 ERVK-7 Proteins 0.000 description 1
- 101710014482 ERVK-8 Proteins 0.000 description 1
- 101700008821 EXO Proteins 0.000 description 1
- 101700083023 EXRN Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 210000003372 Endocrine Glands Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000003979 Eosinophils Anatomy 0.000 description 1
- 210000003499 Exocrine Glands Anatomy 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101700003275 GID8 Proteins 0.000 description 1
- 229960003082 Galactose Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 210000003714 Granulocytes Anatomy 0.000 description 1
- 101710043924 HERVK_113 Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N HF Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003494 Hepatocytes Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 102100014263 IGF1R Human genes 0.000 description 1
- 101700025802 IGF1R Proteins 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N Isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710038209 KIF20B Proteins 0.000 description 1
- 102100007842 KIF20B Human genes 0.000 description 1
- 210000002510 Keratinocytes Anatomy 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102100016823 MAPK1 Human genes 0.000 description 1
- 101700083887 MAPK1 Proteins 0.000 description 1
- 101700054083 MMEL1 Proteins 0.000 description 1
- 101700072814 MPK12 Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 1
- 210000000138 Mast Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000003593 Megakaryocytes Anatomy 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 208000008466 Metabolic Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 102000003841 Mitogen-Activated Protein Kinase 14 Human genes 0.000 description 1
- 108090000139 Mitogen-Activated Protein Kinase 14 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000004413 Myocytes, Cardiac Anatomy 0.000 description 1
- RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N N(2),N(2)-dimethylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N(C)C)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N N(2)-methylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(NC)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N N(6),N(6)-dimethyladenine Chemical compound CN(C)C1=NC=NC2=C1N=CN2 BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBVWMGCJNPPAAR-UHFFFAOYSA-N N-(5-methylheptan-3-ylidene)hydroxylamine Chemical compound CCC(C)CC(CC)=NO CBVWMGCJNPPAAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDFBLGNJUNSCC-QCNRFFRDSA-N N-[1-[(2R,3R,4R,5R)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]acetamide Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NC(C)=O)C=C1 CYDFBLGNJUNSCC-QCNRFFRDSA-N 0.000 description 1
- RPULCYXEYODQOG-AKAIJSEGSA-N N-[9-[(2R,3R,4R,5R)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolan-2-yl]-6-oxo-3H-purin-2-yl]-2-methylpropanamide Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(NC(=O)C(C)C)=NC2=O)=C2N=C1 RPULCYXEYODQOG-AKAIJSEGSA-N 0.000 description 1
- OXTYJSXVUGJSGM-HTVVRFAVSA-N N-[9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-oxo-3H-purin-2-yl]-2-methylpropanamide Chemical compound C1=2NC(NC(=O)C(C)C)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OXTYJSXVUGJSGM-HTVVRFAVSA-N 0.000 description 1
- VXXLEXCQCSPKFI-UHFFFAOYSA-N N-butylcyclohexanamine Chemical compound CCCCNC1CCCCC1 VXXLEXCQCSPKFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGVKXDPPPSLISR-UHFFFAOYSA-N N-ethylcyclohexanamine Chemical compound CCNC1CCCCC1 AGVKXDPPPSLISR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N N-methyl-1-phenylmethanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1 RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEBLEROFGPOMPB-UHFFFAOYSA-N N-methylcyclopropanamine Chemical compound CNC1CC1 VEBLEROFGPOMPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJINZNWPEQMMBV-UHFFFAOYSA-N N-methylhexan-1-amine Chemical compound CCCCCCNC XJINZNWPEQMMBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVWISOJSERXQBM-UHFFFAOYSA-N N-methylpropan-1-amine Chemical compound CCCNC GVWISOJSERXQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N6-Methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- YOTSYCRZQVLFQU-UHFFFAOYSA-N NP([O-])ON(C(C)C)C(C)(CCC#N)CCCC#N Chemical compound NP([O-])ON(C(C)C)C(C)(CCC#N)CCCC#N YOTSYCRZQVLFQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000475481 Nebula Species 0.000 description 1
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 1
- 229920002332 Noncoding DNA Polymers 0.000 description 1
- 101710003000 ORF1/ORF2 Proteins 0.000 description 1
- 229940049964 Oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000002997 Osteoclasts Anatomy 0.000 description 1
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N PUROMYCIN Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 1
- 229950010131 PUROMYCIN Drugs 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N Phosphite Chemical compound [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067631 Phospholipids Drugs 0.000 description 1
- FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus trichloride Chemical compound ClP(Cl)Cl FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700030467 Pol Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920001451 Polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241001296096 Probles Species 0.000 description 1
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N Propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N Pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N Putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N Pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N Pyridinium p-toluenesulfonate Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1.CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710006375 RNASEH1 Proteins 0.000 description 1
- 101700078434 RT67 Proteins 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N Rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N Sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRNULMACUQOKMR-UHFFFAOYSA-N Thiomorpholine Chemical compound C1CSCCN1 BRNULMACUQOKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-LITAXDCLSA-N Tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-LITAXDCLSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 1
- 241001135917 Vitellaria paradoxa Species 0.000 description 1
- ASCUXPQGEXGEMJ-GPLGTHOPSA-N [(2R,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-triacetyloxy-6-[[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetyloxy-6-(4-methylanilino)oxan-2-yl]methoxy]oxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)O[C@@H]1[C@@H](OC(C)=O)[C@@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(=O)C)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](OC(C)=O)[C@H](NC=2C=CC(C)=CC=2)O1 ASCUXPQGEXGEMJ-GPLGTHOPSA-N 0.000 description 1
- PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([Se-])=[Se] Chemical compound [O-]P([O-])([Se-])=[Se] PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012345 acetylating agent Substances 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002730 additional Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000003349 alamar blue assay Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004448 alkyl carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000089 arabinosyl group Chemical class C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 125000001204 arachidyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052789 astatine Inorganic materials 0.000 description 1
- RYXHOMYVWAEKHL-UHFFFAOYSA-N astatine(.) Chemical compound [At] RYXHOMYVWAEKHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 125000000751 azo group Chemical group [*]N=N[*] 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000746 body regions Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 210000002317 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KQIADDMXRMTWHZ-UHFFFAOYSA-N chloro-tri(propan-2-yl)silane Chemical compound CC(C)[Si](Cl)(C(C)C)C(C)C KQIADDMXRMTWHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate group Chemical group [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000005828 desilylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical group 0.000 description 1
- GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,1-diol Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)O GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000001094 effect on targets Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N etomidate Chemical compound CCOC(=O)C1=CN=CN1[C@H](C)C1=CC=CC=C1 NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- 229960001690 etomidate Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 125000002350 geranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002686 geranylgeranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000008079 hexane Substances 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000000717 hydrazino group Chemical group [H]N([*])N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N isocyanate group Chemical group [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 125000002960 margaryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical class OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113083 morpholine Drugs 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004255 neuroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 1
- 125000002560 nitrile group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 150000002829 nitrogen Chemical class 0.000 description 1
- 125000000018 nitroso group Chemical group N(=O)* 0.000 description 1
- 125000001196 nonadecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive Effects 0.000 description 1
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000790 osteoblast Effects 0.000 description 1
- 230000002148 osteoclast Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 101710031992 pRL90232 Proteins 0.000 description 1
- 125000002958 pentadecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N pentatriacontane-17,18,19-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCC ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M phosphinate Chemical compound [O-][PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atoms Chemical group 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710035540 plaa2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011528 polyamide (building material) Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000120 polyethyl acrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920001098 polystyrene-block-poly(ethylene/propylene) Polymers 0.000 description 1
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003334 potential Effects 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-ol Chemical compound OC1=CC=CC=N1 UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- QQXQGKSPIMGUIZ-AEZJAUAXSA-N queuosine Chemical compound C1=2C(=O)NC(N)=NC=2N([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C=C1CN[C@H]1C=C[C@H](O)[C@@H]1O QQXQGKSPIMGUIZ-AEZJAUAXSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000036159 relative stability Effects 0.000 description 1
- 101710004466 rgy Proteins 0.000 description 1
- 101710030364 rgy1 Proteins 0.000 description 1
- 101710030359 rgy2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 101700086982 rnh Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010530 solution phase reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N stearylamine Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229960001663 sulfanilamide Drugs 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004001 thioalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 125000002889 tridecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- VBAGDEPJJPOWOR-UHFFFAOYSA-N trimethylsilyl hypochlorite Chemical compound C[Si](C)(C)OCl VBAGDEPJJPOWOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVCNQQGZJWVLIP-VPCXQMTMSA-N uridin-5-yloxyacetic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(OCC(O)=O)=C1 RVCNQQGZJWVLIP-VPCXQMTMSA-N 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
Description
(発明の分野)
本発明は修飾ポリヌクレオチドに関する。
本発明は修飾ポリヌクレオチドに関する。
(背景)
哺乳類細胞でのRNA誘導遺伝子サイレンシング(RNA−induced gene silencing)は、現在のところ、最低でも3通りの異なる制御レベルが関係していると考えられている。すなわち、(i)転写不活性化(siRNA誘導DNAおよびヒストン・メチル化)、(ii)小さな干渉RNA(siRNA)によって誘導されたmRNAの分解、ならびに(iii)mRNA誘導転写減衰である。siRNAによって発生するRNA干渉(RNAi)は、長時間にわたって効果があり、細胞分裂が多数繰り返されても効果を示すことができる。したがって、siRNA媒介方法を介して遺伝子機能にアクセスする能力は、過剰発現遺伝子に対する治療法を開発するのと同様に、遺伝子機能分析、薬物標的の確証(バリデーション)、および広範囲にわたるゲノム研究を促す刺激的かつ有益なツールを意味する。さらに、RNAiは治療的なツールとして幅広い可能性がある。
哺乳類細胞でのRNA誘導遺伝子サイレンシング(RNA−induced gene silencing)は、現在のところ、最低でも3通りの異なる制御レベルが関係していると考えられている。すなわち、(i)転写不活性化(siRNA誘導DNAおよびヒストン・メチル化)、(ii)小さな干渉RNA(siRNA)によって誘導されたmRNAの分解、ならびに(iii)mRNA誘導転写減衰である。siRNAによって発生するRNA干渉(RNAi)は、長時間にわたって効果があり、細胞分裂が多数繰り返されても効果を示すことができる。したがって、siRNA媒介方法を介して遺伝子機能にアクセスする能力は、過剰発現遺伝子に対する治療法を開発するのと同様に、遺伝子機能分析、薬物標的の確証(バリデーション)、および広範囲にわたるゲノム研究を促す刺激的かつ有益なツールを意味する。さらに、RNAiは治療的なツールとして幅広い可能性がある。
RNA代謝に関する分野での比較的最近の発見によって、二本鎖RNA(dsRNA)の取り込みがRNAiを誘導し得ることが明らかになった。
これらの状況下では、ダイサー(Dicer)と呼ばれるIII型RNアーゼは、長いdsRNAを処理してsiRNAにするもので、該siRNAはその後RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と協力して配列特異的に標的転写産物の分解をもたらす。この現象は、多種多様な生物体で見られた。残念なことに、哺乳動物細胞では、長いdsRNAを用いたRNAiの誘導は、ある程度の成功が得られたに過ぎなかった。主に、このような無効性は、インターフェロン反応の誘導によるものであり、該反応は、標的化されたものとは対照的に、一般的なタンパク質合成の阻害をもたらす。
最近では、培養液中で哺乳動物細胞に合成siRNAを導入する場合、標的mRNAの配列特異的阻害を、インターフェロン反応の誘導を伴うことなく、実現することができる。これらの短い二本鎖は、モル濃度以下(sub−molar concentrations)で触媒的に作用して、95%を越える細胞内標的mRNAを切断する。siRNA活性のメカニズム、ならびにその用途のいくつかについては、Provost et al.,Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer,E.M.B.O.J.,2002 Nov.,1,21(21):5864−5874;Tabara et al.,The dsRNA Binding Protein RDE−4 Interacts with RDE−1,DCR−1 and a DexH−box Helicase to Direct RNAi in C.elegans,Cell.2002,June 28,109(7):861−71;Ketting et al.,Dicer Functions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involved in Developmental Timing in C.elegans;およびMartinez et al.,Single−Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi,Cell 2002,Sept.6,110(5):563に記載されている。
siRNAを用いて作業をおこなう場合、解決しなければならない主要な問題が4つある。すなわち、(i)機能性、(ii)特異性、(iii)送達方法、および(iv)安定性である。機能性とは、特定のsiRNAが所望の標的をサイレンシングする能力のことをいう。機能性を改善するための方法は、例えば、例えば、米国特許出願第10/714,333号の主題である。特異性とは、特定のsiRNAが、所望の標的、しかもその標的のみをサイレンシングする能力のことをいう。したがって、特異性は、オフ・ターゲット効果(off−target effects)を最小限化することを意味する。送達方法は、ユーザが特定のsiRNAを細胞に導入する手段であり、例えばベクターまたはsiRNAそれ自体の修飾を用いることを含むものであってもよい。安定性とは、細胞内または細胞外環境に存在する酵素または他の有害な物質による分解を抑えるsiRNAの能力のことをいう。例えば、裸siRNA分子を血液、血清、または血清含有培地に導入する場合、裸siRNA分子は安定ではなく、ほとんどが素早く分解されて裸siRNA分子の効力が減少または除去される。
本発明は、特異性を増加または減少させること、および/または安定性を増加させることができるsiRNAに対する修飾をおこなうことで、第2および第4の問題(すなわち、特異性および安定性)を解決する。
(発明の要旨)
本発明は、RNA干渉を実施するための組成物および方法に関する。一般に、本明細書に記載されたsiRNA化学修飾は、それが結合した分子の2つの重大な性質、すなわち安定性と特異性とに影響を及ぼす。安定性に影響を及ぼすそのような修飾は、核酸を分解させる傾向があるヌクレアーゼまたは他の因子を含む血液、血清、血清含有培地、および他の生物物質への曝露を必要とする応用での使用にとって、特に有利である。特定の標的に向けられるsiRNAによって誘導されたオフ・ターゲット効果(off−target effects)の度合いを減少させる修飾は、研究および治療的な設定にとって特に有益である。実質的にRNAi適用を改善する修飾の多数の異なる組み合わせが開示されており、またこれらの組み合わせは最適サイレンシング試薬、形質移入制御、およびエクサエクオ(exaequo)試薬の設計に適用可能である。
本発明は、RNA干渉を実施するための組成物および方法に関する。一般に、本明細書に記載されたsiRNA化学修飾は、それが結合した分子の2つの重大な性質、すなわち安定性と特異性とに影響を及ぼす。安定性に影響を及ぼすそのような修飾は、核酸を分解させる傾向があるヌクレアーゼまたは他の因子を含む血液、血清、血清含有培地、および他の生物物質への曝露を必要とする応用での使用にとって、特に有利である。特定の標的に向けられるsiRNAによって誘導されたオフ・ターゲット効果(off−target effects)の度合いを減少させる修飾は、研究および治療的な設定にとって特に有益である。実質的にRNAi適用を改善する修飾の多数の異なる組み合わせが開示されており、またこれらの組み合わせは最適サイレンシング試薬、形質移入制御、およびエクサエクオ(exaequo)試薬の設計に適用可能である。
第1の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチド単位から構成されるポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを有するsiRNAを提供する。
第2の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチド単位から構成されるポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するsiRNAを提供する。
第3の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖と、アンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するsiRNAを提供する。
第4の実施形態によれば、本発明は、センス鎖と、アンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するsiRNAを提供し、センス鎖および/またはアンチセンス鎖が少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチドを有する。
第5の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖と、2’ハロゲン修飾ヌクレオチド、2’アミン修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるコンジュゲートとを有し、ポリリボヌクレオチドが18個と30個との間のヌクレオチド塩基対を含むsiRNAを提供する。
第6の実施形態によれば、本発明は以下の構造の一つを含む。
第7の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施する方法を提供する。この方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含む。
第8の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施する別の方法を提供する。この方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAはセンス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成される。この実施形態によれば、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが2’修飾ヌクレオチドから構成される。
本発明の第1〜第8の実施形態の組成物は、ヌクレアーゼ分解に対して耐性を示すsiRNAを与えることができ、その一方で生物学的機能性を保つ。例えば、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを持つsiRNA(例えば、センス鎖上のもの)と少なくとも1つの他の修飾(例えば、アンチセンス鎖上の適当な位置にあるもの)とを用いることで、RNA干渉用途での機能性を保ちながら安定性を高めることができる。さらに、RNA干渉用途で、コンジュゲートと共に、1種類以上の2’修飾を持つsiRNAおよび/または修飾ヌクレオチド間連結を用いることによっても、各々の鎖上にオルトエステル修飾が存在しない場合でも、機能性を保ちながら安定性を高めることができる。
第9の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施する方法を提供するもので、該方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらにセンス鎖が実質的に非機能的である。
第10の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施する方法を提供するもので、該方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAが、(a)コンジュゲートと、(b)少なくとも1つの2’−O−アルキル修飾を含み、実質的に非機能的であるセンス鎖と、(c)少なくとも1つの2’−フッ素修飾を含むアンチセンス鎖とを含み、センス鎖とアンチセンス鎖とが18〜30塩基対の二本鎖を形成する。
第11の実施形態によれば、本発明は、
(a)(i)第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドであって、第1の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第2の5’末端センス・ヌクレオチドである、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、から構成されるセンス鎖と、
(b)(i)少なくとも1つの2’ハロゲン修飾ピリミジン・ヌクレオチド、ならびに
(ii)第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、5’炭素位がリン酸化された第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖と、
から構成され、
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、18と30との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、siRNAを提供する。
(a)(i)第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドであって、第1の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第2の5’末端センス・ヌクレオチドである、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、から構成されるセンス鎖と、
(b)(i)少なくとも1つの2’ハロゲン修飾ピリミジン・ヌクレオチド、ならびに
(ii)第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、5’炭素位がリン酸化された第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖と、
から構成され、
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、18と30との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、siRNAを提供する。
第11の実施形態の分子を、標的のサイレンシングに用いること、および/あるいは対照として用いることも可能である。これらの分子は、蛍光標識等の標識、および/または第3の2’−O−アルキル/センス修飾を含む第3の5’末端センス・ヌクレオチドを、さらに含むものであってもよい。
第12の実施形態によれば、本発明は、
(a)(i)第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドであって、第1の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第2の5’末端センス・ヌクレオチドである、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、
から構成されるセンス鎖と、
(b)(i)第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、第1の2’−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の2’−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドである、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドであって、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドと、
から構成されるアンチセンス鎖と、
から構成され、
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、16と28との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、siRNAを提供する。
(a)(i)第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドであって、第1の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第2の5’末端センス・ヌクレオチドである、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、
から構成されるセンス鎖と、
(b)(i)第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、第1の2’−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の2’−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドである、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドであって、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2’−O−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドと、
から構成されるアンチセンス鎖と、
から構成され、
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、16と28との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、siRNAを提供する。
好ましくは、第12の実施形態の分子もまた、例えば蛍光色素であってもよい標識を含み、ならびに/または第3の2’−O−アルキル・センス修飾を含む第3の5’末端センス・ヌクレオチドおよび/もしくは第3の2’−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第3の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドを含む。第12の実施形態の分子は、例えば19〜25塩基対、または例えば19〜28塩基対の二本鎖を形成することができる。
第13の実施形態によれば、本発明は、
(a)第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖であって、この第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されてる、アンチセンス鎖と、
(b)第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成されるセンス鎖であって、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、また上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有する、センス鎖と、
を含む、siRNAを提供する。
(a)第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖であって、この第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されてる、アンチセンス鎖と、
(b)第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成されるセンス鎖であって、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、また上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有する、センス鎖と、
を含む、siRNAを提供する。
好ましくは、上記2’−修飾が’2’−O−アルキル修飾である。この実施形態によれば、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、少なくとも実質的に相補的である18〜30塩基対を、好ましくは含む。
第14の実施形態によれば、本発明は、ヘアピンsiRNAを形成することができる単分子のsiRNAに関する。この単分子siRNAは、
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化される、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有する、センス領域と、
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域と、
を含む。
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化される、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有する、センス領域と、
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域と、
を含む。
この第14の実施形態によれば、センス領域およびアンチセンス領域が少なくとも実質的に相補的であり、安定な二本鎖を形成することが可能である。第13の実施形態と同様に、この第14の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域が、好ましくは18〜30塩基対を含む二本鎖を形成する。好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流である。
第15の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、siRNAをさらすことを含むもので、上記siRNAがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、
(a)上記センス鎖が、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、ならびに
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている。
(a)上記センス鎖が、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、ならびに
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている。
第16の実施形態によれば、オフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ヘアピンを形成することができる修飾された単分子のsiRNAをさらすことを含み、上記単分子siRNAが、アンチセンス領域とセンス領域とから構成され、
(a)上記センス鎖が、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されおり、さらに、
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域を含む。
(a)上記センス鎖が、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されおり、さらに、
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域を含む。
好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流に位置している。
第17の実施形態によれば、本発明はsiRNAに関するもので、該siRNAは、
(a)アンチセンス鎖であって、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第1の5’末端のアンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
(b)センス鎖であって、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有する、センス鎖と、
を含む。
(a)アンチセンス鎖であって、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第1の5’末端のアンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
(b)センス鎖であって、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有する、センス鎖と、
を含む。
好ましくは、上記2’炭素修飾が2’−O−アルキル修飾である。この第17の実施形態によれば、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、好ましくは、少なくとも実質的に相補的である18〜30塩基対を含む。
第18の実施形態によれば、本発明はヘアピンsiRNAを形成することができる単分子siRNAに関するもので、該単分子siRNAは、
(a)アンチセンス領域であって、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、
第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を含み、第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を含み、さらに上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化化されている、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置するループ領域と、
を含む。
(a)アンチセンス領域であって、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、
第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を含み、第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を含み、さらに上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化化されている、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置するループ領域と、
を含む。
この第18の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域が実質的に相補的であり、安定な二本鎖を形成することが可能である。第14の実施形態に類似して、この第18の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域は、好ましくは、少なくとも実質的に相補的である18〜30塩基対を含む二本鎖を形成する。好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流に位置している。
第19の実施形態によれば、本発明は、オフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または該標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、siRNAをさらすことを含み、該siRNAがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、
(a)上記センス鎖が、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の2’炭素アンチセンス修飾を有する第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の2’炭素アンチセンス修飾を有する第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、該第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている。
(a)上記センス鎖が、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の2’炭素アンチセンス修飾を有する第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の2’炭素アンチセンス修飾を有する第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、該第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている。
第20の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は標的核酸に対して、または該標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ヘアピンsiRNAを形成することができる単分子のsiRNAをさらすことを含み、上記単分子siRNAが、アンチセンス領域およびセンス領域を含み、
(a)上記センス領域が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、また上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、
(b)上記アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第1の5’アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で、上記第1の5’アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されており、
(c)ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している。
(a)上記センス領域が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を有し、また上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を有し、
(b)上記アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第1の5’アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位で、上記第1の5’アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されており、
(c)ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している。
好ましくは、上記ループ領域が上記アンチセンス領域の下流にある。
本発明は、siRNA適用のための制御、トラッキング剤、およびエクサエクオ(exaequo)剤も提供する。これらの薬剤は、リン酸化5’末端アンチセンス・ヌクレオチドを含まないという点を除いて、第17および第18の実施形態の分子を含む。したがって、これらの薬剤は、(i)各々が2’炭素アンチセンス修飾、好ましくは2‘−O−アルキル修飾、より好ましくは2’−O−メチル修飾を含む第1および第2(または第1、第2、および第3)の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと、(ii)各々が2’炭素センス修飾、好ましくは2’−O−アルキル修飾、より好ましくは2’−O−メチル修飾を含む第1および第2(または第1、第2、および第3)の5’末端センス・ヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、例えば蛍光標識であり、また第1の5’末端センス・ヌクレオチド上に位置している標識以外の他のヌクレオチドが、いずれも修飾を受けていない。また、2’−O−アルキル基による1つ以上のセンス・ピリミジンの修飾、および/または2’−ハロゲン基による1つ以上のアンチセンス・ピリミジンの修飾の修飾、あるいは/またはセンスおよび/もしくはアンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドの5’炭素上にあるブロック基があってもよい。
本発明の他の利点および実施形態ならびにさらなる利点および実施形態をより良く理解するために、実施例と関連した以下の説明について言及するもので、その範囲は添付した特許請求の範囲に記述されている。
本発明の好ましい実施形態は、いかなる形であれ本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、例証および記述を目的として選択されている。本発明のいくつかの態様の好ましい実施形態の利点は、添付の図面に示される。
(詳細な説明)
ここで、本発明を好ましい実施形態と関連させて説明する。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提示されており、いかなる形であれ、本発明を制限することを意図したものではなく、またそのように解釈されてはならない。この開示を読むことで当業者にとって容易に理解されうる全ての代替、修飾、および等価物は、本発明の精神および範囲のなかに包含される。
ここで、本発明を好ましい実施形態と関連させて説明する。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提示されており、いかなる形であれ、本発明を制限することを意図したものではなく、またそのように解釈されてはならない。この開示を読むことで当業者にとって容易に理解されうる全ての代替、修飾、および等価物は、本発明の精神および範囲のなかに包含される。
この開示は、RNA干渉を実行するための組成物および方法についてのプライマーではない。当業者に知られている基礎概念については、詳しくは説明しなかった。
本発明は、siRNA誘導遺伝子サイレンシングを含むRNA干渉を実施するための組成物および方法に関する。本発明、修飾ポリヌクレオチド、およびその誘導体を用いることで、RNA干渉用途の効率を改善することが可能である。
特に明記しない限り、以下の用語および表現は、以下で規定される意味を持つ。
(アルキル)
用語「アルキル(alkyl)」とは、飽和または不飽和、さらに置換または非置換型であるヒドロカルビル部分のことをいう。それは、直鎖状、分岐状、環状、および/または複素環状であり、かつエーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸塩等の官能基を含む部分から構成されるものであってもよい。
用語「アルキル(alkyl)」とは、飽和または不飽和、さらに置換または非置換型であるヒドロカルビル部分のことをいう。それは、直鎖状、分岐状、環状、および/または複素環状であり、かつエーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸塩等の官能基を含む部分から構成されるものであってもよい。
典型的なアルキル基として、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、およびより大きい炭素数のアルキル基、同様に2−メチルプロピル、2−メチルー4−エチルブチル、2,4−ジエチルプロイル、3−プロピルブチル、2,8−ジブチルデシル、6,6−ジメチロクチル、6−プロピル−6−ブチロクチル、2−メチルブチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、および2−エチルヘキシルが挙げられる。上記用語アルキルはまた、アルケニル基、例えばビニル、アリル、アラルキル、およびアルキニル基も包含する。
アルキル基内での置換として、任意の原子または基を含むことができる。そのことはアルキル部分で許容され、限定されるものではないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン(一級、二級、または三級)、アミド、エーテル、エステル、アルコール、ならびに酸素が挙げられる。一例として、アルキル基は、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ、ニトロソまたはニトリル基等の修飾と、イミダゾール、ヒドラジノまたはヒドロキシルアミノ基等のヘテロ環、イソシアネートまたはシアネート基、スルホキシド、スルホン、ジスルフィド等の硫黄含有基を、含むこともできる。
さらに、アルキル基はまた、ヘテロ置換を含むものであってもよく、このような置換では、炭素原子が、例えば窒素、酸素、もしくは硫黄によって置換される。複素環置換は、1つ以上のヘテロ原子を持つアルキル環のことをいう。ヘテロ環部分の例として、限定されるものではないが、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリドンが挙げられる。
(2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド)
「2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド(2’−O−alkyl modified nucleotide)」という成句は、ヌクレオチド単位のことをいい、該ヌクレオチド単位は糖部分、例えば、該糖の2’位に位置した炭素原子とアルキル基との両方に酸素原子が結合するようにして2’位で修飾されるデオキシリボシル部分を持つ。
「2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド(2’−O−alkyl modified nucleotide)」という成句は、ヌクレオチド単位のことをいい、該ヌクレオチド単位は糖部分、例えば、該糖の2’位に位置した炭素原子とアルキル基との両方に酸素原子が結合するようにして2’位で修飾されるデオキシリボシル部分を持つ。
(アミンおよび2‘アミン修飾ヌクレオチド)
用語「アミン(amine)」とは、例えば、1、2、または3つの水素原子を他の基(例えば、アルキル基)で置き換えることで、アンモニアから直接または間接的に誘導されることをいう。一級アミンは、一般構造RNH2を有し、二級アミンは一般の構造R2NHを有する。成句「2’アミン修飾ヌクレオチド」とは、糖の2’位に付着したアミンまたは窒素含有基によって修飾される糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。
用語「アミン(amine)」とは、例えば、1、2、または3つの水素原子を他の基(例えば、アルキル基)で置き換えることで、アンモニアから直接または間接的に誘導されることをいう。一級アミンは、一般構造RNH2を有し、二級アミンは一般の構造R2NHを有する。成句「2’アミン修飾ヌクレオチド」とは、糖の2’位に付着したアミンまたは窒素含有基によって修飾される糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。
アミンという用語として、限定されるものではないが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、多環式アミン、ヘテロ原子置換アリールおよびアルキルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルフォリン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、2,6−ジメチルピペリジン、ピペラジン、ならびにヘテロ原子置換アルキルもしくはアリール二級アミンが挙げられる。
(アンチセンス鎖)
本明細書で用いられるフレーズ「アンチセンス鎖(antisense strand)」とは、目的とするところの標的核酸に対して、実質的または100%相補的であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一領域のことをいう。アンチセンス鎖は、ポリヌクレオチド領域(すなわちRNA、DNA、またはキメラRNA/DNA)から構成可能である。例えば、アンチセンス鎖は、一分子の伝令RNA、mRNAではないRNA(例えば、tRNA、rRNA、およびhnRNA)、あるいはコードまたは非コードのDNA配列に対して全体的または部分的に相補的であってもよい。フレーズ「アンチセンス鎖」として、2本の異なる鎖から形成される両方のポリヌクレオチドのアンチセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子のsiRNAとが挙げられる。フレーズ「アンチセンス鎖」および「アンチセンス領域(antisense region)」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。アンチセンス鎖を、低分子および/またはコンジュゲートの多様な群によって修飾させることができる。
本明細書で用いられるフレーズ「アンチセンス鎖(antisense strand)」とは、目的とするところの標的核酸に対して、実質的または100%相補的であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一領域のことをいう。アンチセンス鎖は、ポリヌクレオチド領域(すなわちRNA、DNA、またはキメラRNA/DNA)から構成可能である。例えば、アンチセンス鎖は、一分子の伝令RNA、mRNAではないRNA(例えば、tRNA、rRNA、およびhnRNA)、あるいはコードまたは非コードのDNA配列に対して全体的または部分的に相補的であってもよい。フレーズ「アンチセンス鎖」として、2本の異なる鎖から形成される両方のポリヌクレオチドのアンチセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子のsiRNAとが挙げられる。フレーズ「アンチセンス鎖」および「アンチセンス領域(antisense region)」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。アンチセンス鎖を、低分子および/またはコンジュゲートの多様な群によって修飾させることができる。
(2’炭素修飾)
フレーズ「2’炭素修飾(2’ carbon modification)」とは、糖部分(例えば2’位で修飾されるデオキシリボシル部分)を持つヌクレオチド単位のことをいう。この位置で、糖の2’位に位置した炭素原子と、2’−O−メチル、2’−O−エチル、2’−O−プロピル、2’−O−イソプロピル、2’−O−ブチル、2’−O−イソブチル、2’−O−エチル−O−メチル(−OCH2CH2OCH3)、および2’−O−エチル−OH(−OCH2CH2OH)等のアルキル基との両方に、酸素原子が付着するようにして、「2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド」が修飾を受ける。「2’炭素センス修飾」とは、センス鎖上またはポリヌクレオチドのセンス領域内にあるヌクレオチドの2’炭素位における修飾のことをいう。「2’炭素アンチセンス修飾」とはアンチセンス鎖上またはポリヌクレオチドのアンチセンス領域内にあるヌクレオチドの2’炭素位における修飾のことをいう。
フレーズ「2’炭素修飾(2’ carbon modification)」とは、糖部分(例えば2’位で修飾されるデオキシリボシル部分)を持つヌクレオチド単位のことをいう。この位置で、糖の2’位に位置した炭素原子と、2’−O−メチル、2’−O−エチル、2’−O−プロピル、2’−O−イソプロピル、2’−O−ブチル、2’−O−イソブチル、2’−O−エチル−O−メチル(−OCH2CH2OCH3)、および2’−O−エチル−OH(−OCH2CH2OH)等のアルキル基との両方に、酸素原子が付着するようにして、「2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド」が修飾を受ける。「2’炭素センス修飾」とは、センス鎖上またはポリヌクレオチドのセンス領域内にあるヌクレオチドの2’炭素位における修飾のことをいう。「2’炭素アンチセンス修飾」とはアンチセンス鎖上またはポリヌクレオチドのアンチセンス領域内にあるヌクレオチドの2’炭素位における修飾のことをいう。
(相補性)
用語「相補性(complementary)」とは、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力のことをいう。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって、概ね形成される。相補性ポリヌクレオチド鎖または領域は、ワトソン・クリック(Watson−Crick)方式(例えば、AとT、AとU、CとG)で塩基対を形成することができ、あるいは安定な二本鎖を形成することを可能とする他の任意の方法で塩基対を形成することができる。
用語「相補性(complementary)」とは、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力のことをいう。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって、概ね形成される。相補性ポリヌクレオチド鎖または領域は、ワトソン・クリック(Watson−Crick)方式(例えば、AとT、AとU、CとG)で塩基対を形成することができ、あるいは安定な二本鎖を形成することを可能とする他の任意の方法で塩基対を形成することができる。
完全な相補性または100%相補性は、一方のポリヌクレオチド鎖または領域の各々のヌクレオチド単位が他方のポリヌクレオチド鎖または領域の各のヌクレオチドと水素結合を形成することができる状況のことをいう。完全な相補性に満たないことは、2本の鎖または2つの領域の、すべてではないがいくつかのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができることをいう。例えば、2つの20量体に関して、もし各鎖上の2つの塩基対のみが互いに水素結合することができる場合、それらのポリヌクレオチド鎖または領域の相補性が10%であることを示している。同じ例で、各鎖または各領域上の18塩基対が互いに水素結合することができる場合、ポリヌクレオチド鎖は90%相補性を示す。実質的な相補性とは、90%以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖または領域のことをいう。
(コンジュゲートおよび末端コンジュゲート)
用語「コンジュゲート(conjugate)」とは、安定性の増加および/またはそれ自体によるsiRNAの取り込みの促進をおこなう等、siRNAの物性を変える分子または部分(moiety)のことをいう。「末端コンジュゲート(terminal conjugate)は、siRNAの3’および/または5’末端に直接またはリンカーを介して付着することが可能である。内部コンジュゲートは、直接またはリンカーを介して間接的に、塩基、リボースの2’位、または他の適当な1つの位置または複数の位置、例えば5−アミノアリル・ウリジンに付着することが可能である。
用語「コンジュゲート(conjugate)」とは、安定性の増加および/またはそれ自体によるsiRNAの取り込みの促進をおこなう等、siRNAの物性を変える分子または部分(moiety)のことをいう。「末端コンジュゲート(terminal conjugate)は、siRNAの3’および/または5’末端に直接またはリンカーを介して付着することが可能である。内部コンジュゲートは、直接またはリンカーを介して間接的に、塩基、リボースの2’位、または他の適当な1つの位置または複数の位置、例えば5−アミノアリル・ウリジンに付着することが可能である。
互いに付着しない異なる2本の鎖を持つsiRNA(すなわち、siRNAが単分子またはヘアピンsiRNAではない)では、該鎖の一方または両方の5’末端がコンジュゲートを持つことができ、さらに/またはsiRNAを含む該鎖の一方または両方の3’末端がコンジュゲートを持つことができる。
コンジュゲートは、例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、炭水化物、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール)、さらにまたこれらの物質類の全ての類似体または誘導体であってもよい。コンジュゲートのさらなる例として、ステロイド(例えば、コレステロール)、リン脂質、ジおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、不飽和または置換を含む、もしくは含まない炭水化物、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類も挙げられる。さらに他の例として、ヘキシル−S−トリチルチオール等のチオエーテル、チオコレステロール、ドデカンジオールまたはウンデシル基等のアシル鎖、ジヘキサデシル−rac−グリセロール、トリエチルアンモニウム、1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン部分、ヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール、ファルネシル、ゲラニル、およびゲラニルゲラニル部分が挙げられる。
コンジュゲートもまた、検出可能な標識であってもよい。例えば、コンジュゲートをフルオロフォアとすることができる。コンジュゲートとして、TAMRA等のフルオロフォア、BODIPY、シアニン誘導体(例えば、Cy3またはCy5ダブシル(Dabsyl))、フルオロセイン、または公知の他の適当なフルオロフォアが挙げられる。
コンジュゲートを、都合がよく、かつそれを持つsiRNAの所望の活性と実質的に干渉しない末端ヌクレオチド上の任意の位置(例えば、リボシル糖の3’または5’位に付着させてもよい。コンジュゲートは、RNA干渉の媒介となるsiRNAの能力が、形質移入後24時間で機能性が測定される培養細胞を用いた生体外(in vitro)アッセイで80%を上回る減少となるような、その機能性への悪影響を及ぼす場合、実質的にsiRNAの所望の活性と干渉する。
(デオキシヌクレオチド)
用語「デオキシヌクレオチド(deoxynucleotide)」とは、2’および/または3’炭素に結合した水素を持つ代わりに、適当な結合および/または2’、3’末端ジデオキシを持つ糖部分の2’または3’位で、OH基を欠いているヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
用語「デオキシヌクレオチド(deoxynucleotide)」とは、2’および/または3’炭素に結合した水素を持つ代わりに、適当な結合および/または2’、3’末端ジデオキシを持つ糖部分の2’または3’位で、OH基を欠いているヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
(デオキシリボヌクレオチド)
用語「デオキシリボヌクレオチド(deoxyribonulreotide)および「DNA」は、リボシル部分の2’位にHを持つ少なくとも1つのリボシル部分を含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
用語「デオキシリボヌクレオチド(deoxyribonulreotide)および「DNA」は、リボシル部分の2’位にHを持つ少なくとも1つのリボシル部分を含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
(下流)
ヌクレオチドからなる1本の鎖の1つの領域は、もし該第1の領域の5’側最末端部分(most portion)が第2の領域の3’末端に対してその領域の最も近接した部分である場合、第2の領域の下流であると見なされる。
ヌクレオチドからなる1本の鎖の1つの領域は、もし該第1の領域の5’側最末端部分(most portion)が第2の領域の3’末端に対してその領域の最も近接した部分である場合、第2の領域の下流であると見なされる。
(エクサエクオ剤)
フレーズ「エクサエクオ剤(exaequo agent)」とは、RNAi経路への参加見込み、またはRNAi経路へ参加する能力について他の核酸と競合する能力という観点から、不活性または半不活性である核酸のことをいう。分子をエクサエクオ剤として用いることができ、エクサエクオ剤は溶液中の核酸の総量を均一または同等にするために使用される。
フレーズ「エクサエクオ剤(exaequo agent)」とは、RNAi経路への参加見込み、またはRNAi経路へ参加する能力について他の核酸と競合する能力という観点から、不活性または半不活性である核酸のことをいう。分子をエクサエクオ剤として用いることができ、エクサエクオ剤は溶液中の核酸の総量を均一または同等にするために使用される。
(第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド)
フレーズ「第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、センス鎖または領域上に対応の相補的塩基を持つアンチセンス鎖または領域の塩基に関して、その鎖の5’側最末端位置(most position)に位置しているアンチセンス鎖または領域のヌクレオチドのことをいう。したがって、2本の異なる鎖から構成されるsiRNA(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)において、アンチセンス鎖上の任意の5’オーバーハングの一部である塩基とは異なる5’側最末端塩基(most base)と呼ぶ。第1の5’末端アンチセンスセンス・ヌクレオチドがヘアピン分子の一部である場合、用語「末端(terminal)」はアンチセンス領域内にある相対的に5’側の最末端位置のことをいい、したがってアンチセンス領域の5’側最末端ヌクレオチドである。
フレーズ「第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、センス鎖または領域上に対応の相補的塩基を持つアンチセンス鎖または領域の塩基に関して、その鎖の5’側最末端位置(most position)に位置しているアンチセンス鎖または領域のヌクレオチドのことをいう。したがって、2本の異なる鎖から構成されるsiRNA(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)において、アンチセンス鎖上の任意の5’オーバーハングの一部である塩基とは異なる5’側最末端塩基(most base)と呼ぶ。第1の5’末端アンチセンスセンス・ヌクレオチドがヘアピン分子の一部である場合、用語「末端(terminal)」はアンチセンス領域内にある相対的に5’側の最末端位置のことをいい、したがってアンチセンス領域の5’側最末端ヌクレオチドである。
(第1の5’末端センス・ヌクレオチド)
フレーズ「第1の5’末端センス・ヌクレオチド」は、アンチセンス・ヌクレオチドに関して定義される。2本の異なる鎖から構成される分子(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)では、アンチセンス鎖上の対応の相補的塩基を持つセンス鎖の塩基に関して、その鎖の5’最末端位置に位置しているセンス鎖のヌクレオチドのことをいう。したがって、2本の異なる鎖(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)から構成されるsiRNAでは、センス鎖または領域上の任意の5’オーバーハングの一部である塩基以外の5’最末端塩基である。第1の5’末端センス・ヌクレオチドが、ヘアピンを形成することができる単分子siRNA分子の一部分である場合、用語「末端」は、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補性を持つ塩基からの距離で測定されるセンス鎖または領域内の相対的位置のことをいう。
フレーズ「第1の5’末端センス・ヌクレオチド」は、アンチセンス・ヌクレオチドに関して定義される。2本の異なる鎖から構成される分子(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)では、アンチセンス鎖上の対応の相補的塩基を持つセンス鎖の塩基に関して、その鎖の5’最末端位置に位置しているセンス鎖のヌクレオチドのことをいう。したがって、2本の異なる鎖(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)から構成されるsiRNAでは、センス鎖または領域上の任意の5’オーバーハングの一部である塩基以外の5’最末端塩基である。第1の5’末端センス・ヌクレオチドが、ヘアピンを形成することができる単分子siRNA分子の一部分である場合、用語「末端」は、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補性を持つ塩基からの距離で測定されるセンス鎖または領域内の相対的位置のことをいう。
(機能性)
siRNAを、培養細胞系で誘導されるサイレンシングのレベルまたは度合いに基づいて、5つのグループ(非機能性、半機能性、機能性、高機能性、および超機能性)に分けることが可能である。本明細書に用いられるように、これらの違いは、一組の条件に基づいていおり、該条件とは、siRNAが100nMの濃度で上記細胞系に形質移入されること、サイレンシングのレベルが形質移入後おおよそ24時間(しかし形質移入後72時間を超えてはならない)に調べられることである。この文脈のなかで、「非機能性siRNA(non−functional siRNA)」は、誘導される標的サイレンシングが50%未満(<50%)であるsiRNAとして定義される。「半機能性siRNA(semi−functional siRNA)」は、50〜79%標的サイレンシングを誘導する。「機能性siRNA(functional siRNA)」は、80〜95%遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「高機能性siRNA(high functional siRNA)は、95%を上回る遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「超機能性siRNA(hyperfunctional siRNA)」は、特別な分子種である。この文書の目的のために、超機能性siRNAは、(1)サブナノモル未満の濃度(すなわち、1ナノモル未満)で形質移入した場合に特異的標的のサイレンシングを95%を上回る率で誘導し、さらに/または(2)96時間を上回る時間にわたってサイレンシングの機能的(または良好な)レベルを誘導する分子として定義される。これらの相対的機能性(絶対的であることを意図していない)は、機能的ゲノム解析、標的同定、および薬物療法等の用途に対する特定の標的とsiRNAとを比較するのに用いられる。
siRNAを、培養細胞系で誘導されるサイレンシングのレベルまたは度合いに基づいて、5つのグループ(非機能性、半機能性、機能性、高機能性、および超機能性)に分けることが可能である。本明細書に用いられるように、これらの違いは、一組の条件に基づいていおり、該条件とは、siRNAが100nMの濃度で上記細胞系に形質移入されること、サイレンシングのレベルが形質移入後おおよそ24時間(しかし形質移入後72時間を超えてはならない)に調べられることである。この文脈のなかで、「非機能性siRNA(non−functional siRNA)」は、誘導される標的サイレンシングが50%未満(<50%)であるsiRNAとして定義される。「半機能性siRNA(semi−functional siRNA)」は、50〜79%標的サイレンシングを誘導する。「機能性siRNA(functional siRNA)」は、80〜95%遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「高機能性siRNA(high functional siRNA)は、95%を上回る遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「超機能性siRNA(hyperfunctional siRNA)」は、特別な分子種である。この文書の目的のために、超機能性siRNAは、(1)サブナノモル未満の濃度(すなわち、1ナノモル未満)で形質移入した場合に特異的標的のサイレンシングを95%を上回る率で誘導し、さらに/または(2)96時間を上回る時間にわたってサイレンシングの機能的(または良好な)レベルを誘導する分子として定義される。これらの相対的機能性(絶対的であることを意図していない)は、機能的ゲノム解析、標的同定、および薬物療法等の用途に対する特定の標的とsiRNAとを比較するのに用いられる。
(機能的用量)
「機能的用量(functional dose)」とは、投与後24、48、72、および96時間で100nM濃度のmRNAを95%以上減少させるという効果を示すsiRNAの用量のことをいう。一方、siRNAの「僅かに機能的用量(marginally functional dose)」は投与後24時間で100nM濃度のmRNAを50%以上減少させる効果を示し、さらにRNAの「非機能的用量(non−functional dose)」は投与後24時間で100nM濃度のmRNAの減少を50%未満とする効果を示す。
「機能的用量(functional dose)」とは、投与後24、48、72、および96時間で100nM濃度のmRNAを95%以上減少させるという効果を示すsiRNAの用量のことをいう。一方、siRNAの「僅かに機能的用量(marginally functional dose)」は投与後24時間で100nM濃度のmRNAを50%以上減少させる効果を示し、さらにRNAの「非機能的用量(non−functional dose)」は投与後24時間で100nM濃度のmRNAの減少を50%未満とする効果を示す。
(ハロゲン)
用語「ハロゲン(halogen)」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、またはアスタチンのいずれかの原子のことをいう。フレーズ「2’ハロゲン修飾ヌクレオチド(2’halogen modified nucleotide)」とは、2’炭素に直接付着した2’位にあるハロゲンにより修飾された糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。
用語「ハロゲン(halogen)」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、またはアスタチンのいずれかの原子のことをいう。フレーズ「2’ハロゲン修飾ヌクレオチド(2’halogen modified nucleotide)」とは、2’炭素に直接付着した2’位にあるハロゲンにより修飾された糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。
(2’ハロゲン修飾ピリミジン)
フレーズ「2’ハロゲン修飾ピリミジン(2’halogen modified pyrimidine)」とは、ヌクレオチドの糖の2’炭素に対して付着したハロゲン基を含むピリミジン(例えば、シトシンまたはウラシル)のことをいう。
フレーズ「2’ハロゲン修飾ピリミジン(2’halogen modified pyrimidine)」とは、ヌクレオチドの糖の2’炭素に対して付着したハロゲン基を含むピリミジン(例えば、シトシンまたはウラシル)のことをいう。
(ヌクレオチド間連結)
フレーズ「ヌクレオチド間連結(internucleotide linkage)」とは、1つのsiRNA内での2つのヌクレオチド単位間に存在する結合または連結のタイプのことをいうもので、修飾されたもの、または未修飾のものであってもよい。フレーズ「修飾ヌクレオチド間連結」は、現在のところ公知、これから知られる、さらにまたはこの開示を読むことで当業者が推論する、全ての修飾ヌクレオチド間結合を包含する。ヌクレオチド間連結は、関連した対イオンを有するものであってもよく、この用語は、そのような対イオンと、ヌクレオチド間連結で形成され得る任意の配位化合物とを含むことが意図されている。
フレーズ「ヌクレオチド間連結(internucleotide linkage)」とは、1つのsiRNA内での2つのヌクレオチド単位間に存在する結合または連結のタイプのことをいうもので、修飾されたもの、または未修飾のものであってもよい。フレーズ「修飾ヌクレオチド間連結」は、現在のところ公知、これから知られる、さらにまたはこの開示を読むことで当業者が推論する、全ての修飾ヌクレオチド間結合を包含する。ヌクレオチド間連結は、関連した対イオンを有するものであってもよく、この用語は、そのような対イオンと、ヌクレオチド間連結で形成され得る任意の配位化合物とを含むことが意図されている。
ヌクレオチド間連結の修飾として、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、5’−アルキレンホスホネテート、5’−メチルホスホネート、3’−アルキレンホスホネート、3’−5’連結または2’−5’連結の三フッ化ホウ素、ボラノホスフェートエステル、およびセレノホスフェート、リン酸トリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホン酸塩結合、アルキル・ホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホンチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスフィネート、ホスホルアミダート、3’−アルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、ホスホロピペラジダート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カルボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミダート、リボアセチル基との連結、アミノエチルグリシン、シリルまたはシロキサン連結、ヘテロ原子を含む、ならびに/あるいは飽和もしくは未飽和および/または置換し得る1〜10の炭素からなるヘテロ原子を有するか、もしくは持たないアルキルまたはシクロアルキル連結、モルホリノ構造との連結、直接または間接的に主鎖のアザ窒素に対して塩基が付着し得るポリアミド、さらにsiRNA内でのそれらの修飾ヌクレオチド間連結の組合わせである。
(リンカー)
「リンカー(linker)は、他の部分(例えばヌクレオチドおよびそのコンジュゲート)と互いに付着する部分である。細胞に取り込まれる分子の安定性および/または能力をコンジュゲートが高める一方で、リンカーは細胞に取り込まれる分子に対してコンジュゲートを単に付着させることから、リンカーとコンジュゲートとを区別することが可能である。
「リンカー(linker)は、他の部分(例えばヌクレオチドおよびそのコンジュゲート)と互いに付着する部分である。細胞に取り込まれる分子の安定性および/または能力をコンジュゲートが高める一方で、リンカーは細胞に取り込まれる分子に対してコンジュゲートを単に付着させることから、リンカーとコンジュゲートとを区別することが可能である。
一例として、リンカーは修飾または未修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリマー、糖および他の炭水化物、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアルコール、ポリプロピレン、プロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールとの混合物、ポリアルキルアミン、スペルミジン等のポリアミン、ポリ(エチルアクリレート)等のポリエステル、ポリホスホジエステル、およびアルキレンを含むことができる。コンジュゲートおよびそのリンカーの一例は、コレステロール−TEG−ホスホラミダイトであり、コレステロールはコンジュゲートであり、テトラエチレングリコールおよびホスフェートはリンカーとして用いられる。
(ヌクレオチド)
用語「ヌクレオチド(nucleotide)」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらの修飾された形態、さらにはそれらの類似体のことをいう。ヌクレオチドとして、プリン、例えばアダニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられ、さらにピリミジンとして、例えばシトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられる。
用語「ヌクレオチド(nucleotide)」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらの修飾された形態、さらにはそれらの類似体のことをいう。ヌクレオチドとして、プリン、例えばアダニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられ、さらにピリミジンとして、例えばシトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられる。
ヌクレオチド類似体として、塩基、糖、および/またはリン酸塩の化学構造に修飾を持つヌクレオチドが挙げられ、限定されるものではないが、該ヌクレオチドとして、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、シトシン環外アミン、および5ブロモウラシルの置換;ならびに2’位糖修飾として、限定されるものではないが、糖修飾リボヌクレオチドが挙げられ、ここで該リボヌクレオチドの2’−OHがH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、もしくはCN等によって置換されており、Rが本明細書に定義したようにアルキル部分である。ヌクレオチド類似体もまた、塩基(例えば、イノシン、キューオシン、キサンチン)、糖(例えば、2’−メチルリボース)、非天然ホスホジエステル連結(例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート)、ならびにペプチドが含まれることを意図している。
修飾塩基とは、ヌクレオチド塩基のことをいい、該塩基として、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ならびに、1つ以上の原子もしくは基の置換または付加によって修飾されたウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンが挙げられる。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドから構成し得る修飾の種類のいくつかの例として、限定されるものではないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミン化、アミド化、またはアセチル化された種々の組み合わせの塩基が挙げられる。より特異的な修飾塩基として、例えば、5−プロピニルウリジン、5−プロピニルシチジン、6−メチルアデニン、6−メチルグアニン、N,N−ジメチルアデニン、2−プロピルアデニン、2−プロピルグアニン、2−アミノアデニン、1−メチルイノシン、3−メチルウリジン、5−メチルシチジン、5−メチルウリジンおよび5位に修飾を持つ他のヌクレオチド、5−(2−アミノ)プロピルウリジン、5−ハロシチジン、5−ハロウリジン、4−アセチルシチジン、1−メチルアデノシン、2−メチルアデノシン、3−メチルシチジン、6−メチルウリジン、2−メチルグアノシン、7−メチルグアノシン、2,2−ジメチルグアノシン、5−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば7−デアザ−アデノシン、6−アゾウリジン、6−アゾシチジン、6−アゾチミジン、5−メチル−2−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば2−チオウリジンおよび4−チオウリジン、および2−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のO−およびN−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばN6−メチルアデノシン、5−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン5−オキシ酢酸、ピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えばアミノフェノールもしくは2,4,6−トリメトキシベンゼン、G−クランプ・ヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、8−置換アデニン、およびグアニン、5−置換ウラシルおよびチアミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシルアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドもまた、糖部分に関して修飾されたヌクレオチドと、さらにリボシルではない糖または類似体を持つヌクレオチドとが挙げられる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、4’−チオリボース、ならびに他の糖、ヘテロ環、または炭素環が挙げられる。ヌクレオチドという用語もまた、広範な塩基として当業者に知られているものを含むことが意図されている。実施例として、一例として、広範な塩基として、限定されるものではないが、3−ニトロピロール、5−ニトロインドール、またはネブラリンが挙げられる。
修飾塩基とは、ヌクレオチド塩基のことをいい、該塩基として、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ならびに、1つ以上の原子もしくは基の置換または付加によって修飾されたウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンが挙げられる。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドから構成し得る修飾の種類のいくつかの例として、限定されるものではないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミン化、アミド化、またはアセチル化された種々の組み合わせの塩基が挙げられる。より特異的な修飾塩基として、例えば、5−プロピニルウリジン、5−プロピニルシチジン、6−メチルアデニン、6−メチルグアニン、N,N−ジメチルアデニン、2−プロピルアデニン、2−プロピルグアニン、2−アミノアデニン、1−メチルイノシン、3−メチルウリジン、5−メチルシチジン、5−メチルウリジンおよび5位に修飾を持つ他のヌクレオチド、5−(2−アミノ)プロピルウリジン、5−ハロシチジン、5−ハロウリジン、4−アセチルシチジン、1−メチルアデノシン、2−メチルアデノシン、3−メチルシチジン、6−メチルウリジン、2−メチルグアノシン、7−メチルグアノシン、2,2−ジメチルグアノシン、5−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば7−デアザ−アデノシン、6−アゾウリジン、6−アゾシチジン、6−アゾチミジン、5−メチル−2−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば2−チオウリジンおよび4−チオウリジン、および2−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のO−およびN−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばN6−メチルアデノシン、5−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン5−オキシ酢酸、ピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えばアミノフェノールもしくは2,4,6−トリメトキシベンゼン、G−クランプ・ヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、8−置換アデニン、およびグアニン、5−置換ウラシルおよびチアミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシルアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドもまた、糖部分に関して修飾されたヌクレオチドと、さらにリボシルではない糖または類似体を持つヌクレオチドとが挙げられる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、4’−チオリボース、ならびに他の糖、ヘテロ環、または炭素環が挙げられる。ヌクレオチドという用語もまた、広範な塩基として当業者に知られているものを含むことが意図されている。実施例として、一例として、広範な塩基として、限定されるものではないが、3−ニトロピロール、5−ニトロインドール、またはネブラリンが挙げられる。
さらに、ヌクレオチドという用語はまた、ヌクレオチドに付着した検出可能な標識(例えば放射活性部分または蛍光部分)または質量標識を有する種を含む。
(ヌクレオチド単位)
フレーズ「ヌクレオチド単位(nucleotide unit)」とは、単一のヌクレオチド残基のことをいい、修飾または未修飾窒素塩基、修飾もしくは未修飾の糖、および2つのヌクレオチドまたはさらなる連結を除外するコンジュゲートの連結を可能にする修飾もしくは未修飾の部分とから構成される。
フレーズ「ヌクレオチド単位(nucleotide unit)」とは、単一のヌクレオチド残基のことをいい、修飾または未修飾窒素塩基、修飾もしくは未修飾の糖、および2つのヌクレオチドまたはさらなる連結を除外するコンジュゲートの連結を可能にする修飾もしくは未修飾の部分とから構成される。
(オフ・ターゲット)
用語「オフ・ターゲット(off−target)」およびフレーズ「オフ・ターゲット効果」とは、所定の標的に向けられたsiRNAまたはshRNAが、別のmRNA配列、DNA配列、または細胞タンパク質もしくは他の部分と直接あるいは間接的に相互作用することによって、意図されていない効果を生ずる、任意の事象をいう。例えば、「オフ・ターゲット効果(off−target effect)」は、siRNAまたはshRNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖と他の転写産物との間の部分的相同性または相補性によって、他の転写産物の同時に起こる分解が存在する時に、生ずる可能性がある。
用語「オフ・ターゲット(off−target)」およびフレーズ「オフ・ターゲット効果」とは、所定の標的に向けられたsiRNAまたはshRNAが、別のmRNA配列、DNA配列、または細胞タンパク質もしくは他の部分と直接あるいは間接的に相互作用することによって、意図されていない効果を生ずる、任意の事象をいう。例えば、「オフ・ターゲット効果(off−target effect)」は、siRNAまたはshRNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖と他の転写産物との間の部分的相同性または相補性によって、他の転写産物の同時に起こる分解が存在する時に、生ずる可能性がある。
(オルトエステル)
用語「オルトエステル保護(orthoester protected)」または「オルトエステル修飾(orthoester modified)」とは、オルトエステルによるヌクレオチド単位内の糖部分の修飾のことをいう。好ましくは、この糖部分がリボシル部分である。一般に、RC(OR’)3構造を持ち、式中R’は同一または異なるもの、RはH、さらに下線が引かれたCはオルトエステルの中心炭素である。本発明のオルトエステルは、ヌクレオチド単位の糖部分の炭素が酸素に結合し、次にオルトエステルの中心炭素に結合しているオルトエステルから構成される。オルトエステルの中心炭素に対して次に結合するものは、2つの酸素原子であり、合計3つの酸素がそのオルトエステルの中心炭素に結合することになる。中心炭素に結合したこれら2つの酸素(いずれも糖部分の炭素には結合しない)は、次に同一または異なる2つの部分を構成する炭素に結合する。例えば、上記酸素の一方はエチル部分に結合することができ、また他方はイソプロピル部分に結合することができる。一例では、RをH、1つのR’をリボシル部分とすることができ、他の2つのR’を2つの2−エチル−ヒドロキシル部分とすることができる。オルトエステルを糖部分の任意の位置に置くことができ、例えば、2’、3’、および/または5’位に置くことができる。好ましいオルトエステル、さらにオルトエステル保護ポリヌクレオチドの製造方法については、米国特許第5,889,136号および第6,008,400号に記載されている。
用語「オルトエステル保護(orthoester protected)」または「オルトエステル修飾(orthoester modified)」とは、オルトエステルによるヌクレオチド単位内の糖部分の修飾のことをいう。好ましくは、この糖部分がリボシル部分である。一般に、RC(OR’)3構造を持ち、式中R’は同一または異なるもの、RはH、さらに下線が引かれたCはオルトエステルの中心炭素である。本発明のオルトエステルは、ヌクレオチド単位の糖部分の炭素が酸素に結合し、次にオルトエステルの中心炭素に結合しているオルトエステルから構成される。オルトエステルの中心炭素に対して次に結合するものは、2つの酸素原子であり、合計3つの酸素がそのオルトエステルの中心炭素に結合することになる。中心炭素に結合したこれら2つの酸素(いずれも糖部分の炭素には結合しない)は、次に同一または異なる2つの部分を構成する炭素に結合する。例えば、上記酸素の一方はエチル部分に結合することができ、また他方はイソプロピル部分に結合することができる。一例では、RをH、1つのR’をリボシル部分とすることができ、他の2つのR’を2つの2−エチル−ヒドロキシル部分とすることができる。オルトエステルを糖部分の任意の位置に置くことができ、例えば、2’、3’、および/または5’位に置くことができる。好ましいオルトエステル、さらにオルトエステル保護ポリヌクレオチドの製造方法については、米国特許第5,889,136号および第6,008,400号に記載されている。
(オーバーハング)
用語「オーバーハング(overhang)」とは、第1の鎖または領域が二本鎖を形成する相補性鎖の末端を越えて延びる1本の鎖または領域から生ずる、末端の塩基対を形成していない1つまたは複数のヌクレオチドのことをいう。塩基対の水素結合を介して二本鎖を形成することができる2つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域の一方または両方が、2つのポリヌクレオチドまたは領域によって共有された相補性の5’および/または3’末端を越える3’および/または5’末端を有することが可能である。二本鎖の3’および/または5’末端を越えて延びる一本鎖領域を、オーバーハングという。
用語「オーバーハング(overhang)」とは、第1の鎖または領域が二本鎖を形成する相補性鎖の末端を越えて延びる1本の鎖または領域から生ずる、末端の塩基対を形成していない1つまたは複数のヌクレオチドのことをいう。塩基対の水素結合を介して二本鎖を形成することができる2つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域の一方または両方が、2つのポリヌクレオチドまたは領域によって共有された相補性の5’および/または3’末端を越える3’および/または5’末端を有することが可能である。二本鎖の3’および/または5’末端を越えて延びる一本鎖領域を、オーバーハングという。
(医薬的に許容される担体)
フレーズ「医薬的に許容される担体(pharmaceutically acceptable carrier)」として、細胞へのdsRNA、dsDNA、またはdsRNA/DNAハイブリッドの導入を促進させる組成物が挙げられ、また限定されるものではないが、溶媒または分散剤、コーティング剤、抗感染剤、等張剤、および本発明のポリヌクレオチドおよびsiRNAの吸収時間もしく放出の媒介となる薬剤が挙げられる。
フレーズ「医薬的に許容される担体(pharmaceutically acceptable carrier)」として、細胞へのdsRNA、dsDNA、またはdsRNA/DNAハイブリッドの導入を促進させる組成物が挙げられ、また限定されるものではないが、溶媒または分散剤、コーティング剤、抗感染剤、等張剤、および本発明のポリヌクレオチドおよびsiRNAの吸収時間もしく放出の媒介となる薬剤が挙げられる。
(ポリヌクレオチド)
用語「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」とは、ヌクレオチドのポリマーのことをいい、限定されるものではないが、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドが挙げられ、規則的および不規則的に交互になったデオキシリボシル部分およびリボシル部分からなるポリヌクレオチド鎖(すなわち、交互ヌクレオチド単位が、糖部分の2’位で、−OH、次に−H、次に−OH、つぎにH、等を持つ)と、種々の構成要素または部分が任意の位置でヌクレオチド単位に付着しているそのような種類のポリヌクレオチドの修飾とが含まれる。特に明記しない限り、または文脈から明らかにならない限り、用語「ポリヌクレオチド」として、単分子siRNAと2本のことなる鎖から構成されるsiRNAとが挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」とは、ヌクレオチドのポリマーのことをいい、限定されるものではないが、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドが挙げられ、規則的および不規則的に交互になったデオキシリボシル部分およびリボシル部分からなるポリヌクレオチド鎖(すなわち、交互ヌクレオチド単位が、糖部分の2’位で、−OH、次に−H、次に−OH、つぎにH、等を持つ)と、種々の構成要素または部分が任意の位置でヌクレオチド単位に付着しているそのような種類のポリヌクレオチドの修飾とが含まれる。特に明記しない限り、または文脈から明らかにならない限り、用語「ポリヌクレオチド」として、単分子siRNAと2本のことなる鎖から構成されるsiRNAとが挙げられる。
(ポリリボヌクレオチド)
用語「ポリリボヌクレオチド(polyribonucletotide)」とは、2つ以上の修飾または未修飾リボヌクレオチドおよび/あるいはそれらの類似体を含むポリヌクレオチドのことをいう。
用語「ポリリボヌクレオチド(polyribonucletotide)」とは、2つ以上の修飾または未修飾リボヌクレオチドおよび/あるいはそれらの類似体を含むポリヌクレオチドのことをいう。
(リボヌクレオチドおよびリボ核酸)
用語「リボヌクレオチド(ribonucleotide)」およびフレーズ「リボ核酸(ribonucleic acid)」(RNA)は、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含む修飾または未修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の1位でのN−グリコシド連結に付着した窒素塩基を持つリボシル部分の1’位、さらに別のヌクレオチドに対する連結を可能にするか、もしくは連結を妨げる部分の2’位に対して付着する酸素を含む。
用語「リボヌクレオチド(ribonucleotide)」およびフレーズ「リボ核酸(ribonucleic acid)」(RNA)は、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含む修飾または未修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の1位でのN−グリコシド連結に付着した窒素塩基を持つリボシル部分の1’位、さらに別のヌクレオチドに対する連結を可能にするか、もしくは連結を妨げる部分の2’位に対して付着する酸素を含む。
(RNA干渉およびRNAi)
フレーズ「RNA干渉(RNA interference)」および用語「RNAi」は同義であり、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含むポリヌクレオチドまたはsiRNAが生物学的プロセスに対する効果を奏するプロセスのことをいう。このプロセスは、限定されるものではないが、mRNAを分解し、翻訳を減衰させ、tRNA、rRNA、hnRNA、cDNA、およびゲノムDNAによる相互作用を生ずることによって、同様に付加的なタンパク質によってDNAのメチル化をおこなうことによっておこなわれる遺伝子サイレンシングを含む。
フレーズ「RNA干渉(RNA interference)」および用語「RNAi」は同義であり、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含むポリヌクレオチドまたはsiRNAが生物学的プロセスに対する効果を奏するプロセスのことをいう。このプロセスは、限定されるものではないが、mRNAを分解し、翻訳を減衰させ、tRNA、rRNA、hnRNA、cDNA、およびゲノムDNAによる相互作用を生ずることによって、同様に付加的なタンパク質によってDNAのメチル化をおこなうことによっておこなわれる遺伝子サイレンシングを含む。
(第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド)
フレーズ「第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの3’位に付着したヌクレオチドのことをいう。したがって、それは、対応のセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のアンチセンス鎖または領域の最も5’末端側にある第2のヌクレオチドである。
フレーズ「第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの3’位に付着したヌクレオチドのことをいう。したがって、それは、対応のセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のアンチセンス鎖または領域の最も5’末端側にある第2のヌクレオチドである。
(第2の5’末端センス・ヌクレオチド)
フレーズ「第2の5’末端センス・ヌクレオチド」とは、第1の5’末端センス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第1の5’末端センス・ヌクレオチドの3’位に付着したヌクレオチドのことをいう。したがって、それは、対応のアンチセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のセンス鎖または領域の最も5’末端側にある第2のヌクレオチドである。
フレーズ「第2の5’末端センス・ヌクレオチド」とは、第1の5’末端センス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第1の5’末端センス・ヌクレオチドの3’位に付着したヌクレオチドのことをいう。したがって、それは、対応のアンチセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のセンス鎖または領域の最も5’末端側にある第2のヌクレオチドである。
(センス鎖)
フレーズ「センス鎖(sense strand)」とは、伝令RNAまたはDNA配列等の標的核酸として、部分的または全体的に、同一のヌクレオチド配列の持つポリヌクレオチドまたは領域のことをいう。フレーズ「センス鎖」として、2本の異なる鎖から形成されるポリヌクレオチドの両方のセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子siRNAのセンス領域とが挙げられる。配列が提供される場合、慣例によって、特に明記しない限り、それはセンス鎖(または領域)であり、相補性アンチセンス鎖(または領域)の存在が暗に含まれる。フレーズ「センス鎖(sense strand)」および「センス領域(sense region)」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。
フレーズ「センス鎖(sense strand)」とは、伝令RNAまたはDNA配列等の標的核酸として、部分的または全体的に、同一のヌクレオチド配列の持つポリヌクレオチドまたは領域のことをいう。フレーズ「センス鎖」として、2本の異なる鎖から形成されるポリヌクレオチドの両方のセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子siRNAのセンス領域とが挙げられる。配列が提供される場合、慣例によって、特に明記しない限り、それはセンス鎖(または領域)であり、相補性アンチセンス鎖(または領域)の存在が暗に含まれる。フレーズ「センス鎖(sense strand)」および「センス領域(sense region)」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。
(siRNA、すなわち短い干渉RNA)
用語「siRNA」およびフレーズ「短い干渉RNA(short interfering RNA)」とは、単分子の核酸のことをいい、またRNAiを実行することが可能であり、かつ18と30との間の塩基対長である二本鎖を持つ2本の異なる鎖から構成される核酸のことをいう。また、用語「siRNA」およびフレーズ「短い干渉RNA」として、リボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が挙げられ、該部分として、限定されるものでないが、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド連結、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、および上記ヌクレオチドの類似体が挙げられる。
用語「siRNA」およびフレーズ「短い干渉RNA(short interfering RNA)」とは、単分子の核酸のことをいい、またRNAiを実行することが可能であり、かつ18と30との間の塩基対長である二本鎖を持つ2本の異なる鎖から構成される核酸のことをいう。また、用語「siRNA」およびフレーズ「短い干渉RNA」として、リボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が挙げられ、該部分として、限定されるものでないが、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド連結、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、および上記ヌクレオチドの類似体が挙げられる。
siRNAを二本鎖とすることができ、また短いヘアピンRNA、4〜23以上のヌクレオチドほどの長さのループを持つRNA、ステムループ状の突出持つRNA、ミクロRNA、および短い一過性のRNAが挙げられる。ループまたはヘアピン・ループを持つRNAとして、該ループがフレキシブル・リンカー等のリンカーによって幹部分(ステム)に結合している構造が挙げられる。フレキシブル・リンカーは、多種多様な化学構造から構成せれ、かつステム構成要素の効果的な分子間ハイブリダイゼーションを可能にする十分な長さと材料とからなる。概して、スパンの長さは、少なくとも約10〜24原子である。
siRNAがヘアピンである場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、1つの長い分子の一部分である。
(安定化)
用語「安定化(stabilized)」とは、dsRNAが分解に抗する一方で機能性を保つ該dsRNAの能力のことをいい、その能力は、例えば血清等の生物学的材料の存在下で、半減期として測定される。siRNAの半減期とは、例えば血清中で、siRNAが50%分解するのにかかった時間のことをいう。
用語「安定化(stabilized)」とは、dsRNAが分解に抗する一方で機能性を保つ該dsRNAの能力のことをいい、その能力は、例えば血清等の生物学的材料の存在下で、半減期として測定される。siRNAの半減期とは、例えば血清中で、siRNAが50%分解するのにかかった時間のことをいう。
(実質的な相補性)
実質的な相補性(substantial complementarity)とは、90%以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖のことをいう。
実質的な相補性(substantial complementarity)とは、90%以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖のことをいう。
(トラックアビリティ)
用語「トラックアビリティ」とは、分子が細胞に導入される等の後に、該分子の移動または配置を追跡する能力のことをいう。「トラッカブル(trackable)」である分子は、細胞形質移入手順等の成功および失敗を観察する上で有用である。
用語「トラックアビリティ」とは、分子が細胞に導入される等の後に、該分子の移動または配置を追跡する能力のことをいう。「トラッカブル(trackable)」である分子は、細胞形質移入手順等の成功および失敗を観察する上で有用である。
(好ましい実施形態)
ここで、好ましい実施形態に関連して本発明を説明する。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提供されており、いかなるかたちであれ、本発明を限定することを意図したものではなく、またそのような意図があると解釈すべきものではない。この開示を読むことによって当業者が理解しうる代替物、修飾、および等価物の全てが本発明の精神および範囲内である。
ここで、好ましい実施形態に関連して本発明を説明する。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提供されており、いかなるかたちであれ、本発明を限定することを意図したものではなく、またそのような意図があると解釈すべきものではない。この開示を読むことによって当業者が理解しうる代替物、修飾、および等価物の全てが本発明の精神および範囲内である。
第1の実施形態によれば、本発明はsiRNAを提供する。このsiRNAは、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチド単位を含むアンチセンス鎖とを含む。好ましくは、修飾ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはその類似体である。オルトエステルを、糖部分の任意の位置、例えば2’、3’、および/または5’位に、置くことができる。好ましくは、オルトエステル部分は、糖部分の2’位にある。好ましくは、オルトエステル、およびポリヌクレオチドで保護されたオルトエステルの製造方法は、米国特許第5,889,136号および第6,008,400号に記載されている。また、好ましくは、オルトエステルは、リボシル部分の2’位に付着している。好ましくは、オルトエステルは、2つの2−エチル−ヒドロキシル置換基を含む。最も好ましいオルトエステルを以下に示、また本明細書では、2’−ACEまたは2’−ビス(ヒドロキシエチル)オルトエステル部分と呼ぶ。すなわち、
図1に示すデータの生成は、いくつかの変異体でDharmacon Inc.の登録商標ACEケミストリーを用いることで合成したsiRNA二本鎖標的SEAP(ヒト分泌アルカリ・ホスファターゼ)を用いて、おこなった。これらの変異体として、裸、または未修飾のRNA、すなわち各の2’−OHがオルトエステルによる修飾を受けているACE保護RNAと、フッ素が各2’炭素および各CおよびUに結合している2’フルオロ修飾変異体とが挙げられる。
siRNAの二本鎖を、センス鎖とアンチセンス鎖とから構成することができる。センスおよびアンチセンス鎖の全ての可能な組み合わせからなるアレイが生成された。図1を参照すると、以下の用語が用いられる。
S − siRNA二本鎖内の裸センス鎖。
AS − siRNA二本鎖内の裸アンチセンス鎖。
pS − siRNA二本鎖内の2’ACE保護センス鎖。
pAS − siRNA二本鎖内の2’ACE保護アンチセンス鎖。
2FS − フッ素原子が各Cおよび/またはU保持ヌクレオチド単位の2’炭素に結合するようにして、全てのCおよびUを持つsiRNA内のセンス鎖。
2FAS − フッ素原子が2’炭素、または各Cおよび/またはU保持ヌクレオチド単位に結合するようにして、全てのCおよびUを持つsiRNA内のアンチセンス鎖。
S−ASとは、裸センス鎖および裸アンチセンス鎖から形成された二本鎖siRNAのことをいう。
pS−ASとは、ACE修飾センス鎖および裸アンチセンス鎖から形成された二本鎖siRNAのことをいう。
P2’F−2’修飾を有する、CsおよびUsを除く全てのヌクレオチドの2’−ACE修飾。
pAAV6プラスミド(SEAP発現プラスミド)と目的のsiRNAとによって、二本鎖を同時形質移入し、あるいは安定にSEAPを発現するHEK293細胞中にsiRNAを形質移入した。両方の条件下で、標準的な形質移入用の手順を用いたが、結果はHela、MDA75、または3TELi(マウス)細胞系のあいだで変化はなかった。
siRNA誘導SEAPサイレンシングのレベルは、製造元のプロトコルに従ってClontechのSEAP検出キットを用いて、形質移入後の異なる時点(24、48、72、または144時間)で決定した。タンパク質減少レベルは、mRNA減少レベルと良好な一致が見られる(mRNAのレベルは、QuantiGeneキット(Bayer)を用いて測定した)。siRNA誘導毒性は、AlmaBlue毒性アッセイあるいはハウスキーピング遺伝子(シクロリン)さもなければ両方の発現レベルを用いて測定した。特に明記しない限り、著しい毒性は何ら観察されなかった。
1〜100ナノモル濃度のあいだ(図1)、および10ピコモル濃度〜1マイクロモル濃度(図2)のあいだで濃度を変えて、細胞に各の二本鎖を形質移入した(図1)。図1および図2では、裸および2’フルオロ修飾と組み合わせて、siRNA二本鎖のセンスおよびアンチセンス鎖に対するACE修飾の導入の効果が示されている。
オリゴのアンチセンス鎖に対するACE修飾の存在がsiRNA二本鎖の機能性と著しく干渉する。ACE修飾センス・オリゴは、裸または2’F修飾ASオリゴと一緒に使用されているかどうかに関わらずSEAPサイレンシングで影響を及ぼした。
サイレンシングの程度を24、48、または72時間で比較し、siRNAサイレンシングでの検出可能な減少を144時間後に観察した。
図3および図4は、AS(図3)およびセンス(図4)鎖を一定に保ち、反対側の鎖に対する種々の修飾を組み合わせてスクリーニングしたsiRNA機能性スクリーニングをまとめたものである。特に、AS鎖を、(1)裸に、(2)全てのCおよびUで2’F基によって修飾、(3)2、4、6、14、および18位(5’側から数える)で2’デオキシ基により修飾、(4)67〜10位(鎖の5’側から計算)に位置したものを除く、UおよびCsの全てでの2’−O−メチル基による修飾、(5)全ての位置でのホスホロチオエートによる修飾、あるいは(6)1〜6位および14〜19位(鎖の5’側から計算)でのホスホロチオエートによる修飾のいずれかをおこなった。これらのAS鎖に対して、(1)裸、(2)全ての位置で2’−ACE修飾、(3)全てのCsおよびUsでの2’F修飾、(4)全てのUsで修飾された2’アミン(NH2)、(5)全ての奇数のヌクレオチド(例えば、1、3、5、...)に対する2’−デオキシ修飾、(6)全てのCおよびUでの2’−O−メチル修飾、あるいは(7)全ての位置でホスホロチエートを担持するセンス鎖との対形成をおこなった。これらの実験の結果は、アンチセンス鎖の記述された2’−O−メチル修飾が耐容性を示さない一方で、ホスホロチオエート、2’F、および2’デオキシ修飾を含む他の修飾が、種々のセンス鎖修飾と組み合わさって、この鎖上で可能であることを示している。同様に、図4では、アミン修飾が一般にセンス鎖に対して耐容性を示さない一方で、2’−ACE、2’F、2’デオキシ、2’−O−メチル、およびホスホロチオエート付加が、種々のAS鎖修飾と組み合わさって、重大な機能性の混乱を招くことなく、可能であることが示されている。
図5、6、7,および8は、使用した修飾の種類に応じてグループ分けしたより詳細なデータを表す。図5では、裸、2’O−ACE修飾、または2’F修飾センス鎖が、2’F−8T AS = 鎖の各端にある4つのホスホロチオエート、各端の第2のヌクレオチドから開始、それに加えてCおよびUにF基;8T AS = 鎖の各端にある4つのホスホロチオエート、各端の第2のヌクレオチドから開始;4T−AS = 各端の第2のヌクレオチドから開始して鎖の各端上に2つのホスホロチオエートのいずれかと、対を形成した。図6では、偶数位置、または12位(AS−Thio12、鎖のいずれかの端部上にある6つのホスホロチオエート)でのホスホロチオエート修飾を含むアンチセンス鎖を、裸にした、全ての位置で2’−ACE修飾した、または全ての位置でホスホロチオエート修飾した相補的センス鎖と対を形成した。あるいは、全ての位置でホスホロチオエートを持つセンス鎖を、裸にした、全てのCおよびUで2’F基を持つ、全ての位置でホスホロチオエートを持つ、あるいは12ホスホロチオエートを持つ(各末端での6つのヌクレオチドの修飾)アンチセンス鎖と対を形成した。図7について、2’−Ome = ヌクレオチド7〜11位のあいだに生ずるものを除いた全てのUおよびC上の2’−O−メチル修飾と、S−Ome = センスのCおよびU上の2’−O−メチル修飾とを担持するアンチセンス鎖は、裸の、S−2’ACE = 全てのヌクレオチド上の2’ACE修飾;S−デオキシ・ハイブリッド = 上記鎖をまたがる全ての奇数ヌクレオチド(1,3,5...)上の2’デオキシ修飾;S−Ome = センス鎖の全てのCおよびUの2’−O−メチル修飾;AS−2’F = 上記鎖上の全てのCおよびUの2’F修飾;AS−デオキシ・ハイブリッド = ヌクレオチド2、4、6、14、16、18の2’デオキシ修飾;あるいはAs−Ome = ヌクレオチド7〜11位のあいだに生ずるものを除く全てのUおよびCの2’−O−メチル修飾のいずれかと一致した。図8に関して、デオキシ修飾を担持するAS鎖(AS−デオキシハイブリッド=ヌクレオチド2、4、6、14、16、18の2’デオキシ修飾)をセンス鎖と組み合わせた。ここでセンス鎖は、裸の、S−2’ACE修飾 = 全てのヌクレオチド上の2’ACE修飾;S−Ome = 全てのUおよびCでの2’O−メチル修飾;または2’デオキシ(1位、3位、5位、...その他)であった。同様に、センス−2’デオキシ・ハイブリッド(1位、3位、5位、...その他)を、裸の、2’F修飾(CおよびU)、2’−O−メチル(7位〜11位のあいだにあるものを除いたUおよびC)、ならびに2’デオキシ(2位、3位、6位、14位、16位、18位)であるアンチセンス鎖と対を形成した。
特に、図5は、裸の2’ACE修飾および2’F修飾センス鎖との組み合わせでアンチセンス鎖に置かれた場合、ホスホロチオエート修飾が十分に許容される。
図6は、ホスホロチオエート主鎖修飾が非特異的に誘導された毒性について同様の制限を持つセンスおよびアンチセンス鎖上の両方で許容されることを、さらに示す。
図7は、2’−O−メチル修飾の存在がsiRNA二本鎖のセンス上で十分に許容されるが、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖では許容されないことを示している。機能的siRNA二本鎖が2’−O−メチル修飾AS鎖とセンス鎖のデオキシハイブリッドとの組み合わせによって形成されることについて述べる価値がある。
図8は、RNA干渉でのデオキシハイブリッド型の修飾の適合性を示す。デオキシリボハイブリッドは、RNA/DNAハイブリッド・オリゴであり、デオキシおよびリボ構成要素が共に、例えばデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとが交互になった配列中のオリゴに取り込まれる。これらの種類のオリゴの設計で、連続したDNA/RNA二本鎖の広がりの大きさを5ヌクレオチドよりも短く保つことで、RNアーゼH活性の導入を避けることが重要である。デオキシリボハイブリッドは、2’フルオロおよび2’ACE修飾オリゴと組み合わせてセンスおよびアンチセンス鎖の両方で機能的であった。また、デオキシハイブリッド・センス鎖は、アンチセンス鎖が2’−O−メチルで修飾された場合にsiRNA活性を支持する唯一の修飾(それらの条件下)であった。
図9は、ACEおよび2’フルオロ修飾siRNAの効力を改善するためのコレステロールを含むコンジュゲートの有用性を示す。上記センス鎖上でコレステロールを含むコンジュゲートを用いることで、センス鎖に対する修飾による不の効果を軽減するが、アンチセンス鎖に対する修飾による負の効果を改善することはない。
図10は、センス鎖上のPEGコンジュゲートに関して等価なデータを示す。
図11は、コレステロールを含むコンジュゲートの存在が修飾siRNAオリゴの効力を改善することを示す。
図12は、Dharmaconの2’−ACE RNA合成ケミストリーで使用される保護RNAヌクレオチドの構造を示す。
図13は、RNA合成サイクルを概説する。好ましくは、そのサイクルは、適当な合成装置上で自動化された様式でおこなわれる。ステップ(i)では、取り込まれるホスホラミダイト(ここでは、窒素塩基としてウリジンを持つ)は、示したメチル基のかわりに3’位のホスホラミダイト部分上に任意の許容可能な基を持つことができる。例えば、アルキル基またはシアノエチル基をその位置で用いることができる。このRNA合成サイクルを、修飾ヌクレオチド間連結を持つポリヌクレオチドを合成する場合、および/または他の修飾(例えば、2’位で)を持つポリヌクレオチドを合成する場合、ある種の変化によって、以下に説明するように、実施することができる。
図14は、2’脱保護直前の2’−ACE保護RNA産物の構造を示す。2’位にオルトエステルを保持することが必要な場合、この2’脱保護ステップが実施されない。
3’末端にジ−dTオーバーハングを持つ19量体二本鎖、すなわちセンス鎖の第2、第5、第7、第9、第11、および第19位で2’アミン修飾ヌクレオチド単位を持つG2’−N−UGA2’−N−UG2’−N−UA2’−N−UG2’−N−UCAGAGAG2’−NUdTdTについて、アンチセンス鎖が裸であるか、全てのCおよびUで2’フルオロ修飾されているか、交互にリボヌクレオチド単位とデオキシリボ単位とを含むデオキシハイブリッドであるか、または2’−O−メチル修飾を有するか否かに関わらず、機能性の著しい喪失が生じた。好ましくは、センス鎖は、第2、第5、第7、第9、第11、および第19位で2’アミノ修飾を含まない。
3’ ジ−dTオーバーハングを持つsiRNA19量体(配列番号171〜314を見よ)上で、デオキシリボヌクレオチド単位による任意のリボヌクレオチド単位の置換は、修飾がセンスまたはアンチセンス鎖のいずれにあっても、RNAiにおける19量体の機能性に対して著しい影響を及ぼすことはない(図15A参照)。同一siRNA19量体上で、相前後した2つのデオキシリボヌクレオチド単位による2つの隣接リボヌクレオチド単位の置換はRNAi内での19量体の機能性に著しい影響を及ぼすものではない。図15Bは、1および2位、3および4位、5および6位等が個々にデオキシリボヌクレオチドに修飾される場合、該修飾がセンス鎖に生じると機能性が著しく影響を受けることはなく、そのような修飾がアンチセンス鎖上に生ずると機能性に対して僅かに負の影響が現れることを、示している。同一のsiRNA19量体上では、相前後した3つのデオキシリボヌクレオチド単位による3つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、その修飾がアンチセンス上でのものであれば機能性に著しい影響を及ぼすものではないが、修飾された単位がセンス鎖の第1から第3、または第7から第9ヌクレオチドである場合、機能的に著しい影響(場合によっては)を受ける。この実験では、ポリリボヌクレオチドの単位1〜3、4〜6、7〜9等を、個々にデオキシリボヌクレオチド単位によって置換した(図15C参照)。
3’ジ−dTオーバーハングを有する同一siRNA19量体ポリリボヌクレオチド上で、2’−O−メチル部分による任意の個々の単位の修飾は、修飾がセンスまたはアンチセンス鎖にあろうとなかろうと、RNAiでの19量体の機能性に対して著しい影響を与えることはない(図16A参照)。同一siRNA19量体を用いて、相前後する2つの2’−O−メチル修飾による2つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、アンチセンス鎖の第1および第2、または第13および第14の位置で、あるいはセンス鎖の第17および第18の位置で、修飾が起こらない限り、RNAiでの19量体の機能性に著しい影響を与えない(図16B参照)。以降の実験によって、アンチセンス鎖の第13位および第14位、さらにセンス鎖の第7位および第8位が決定的ではないことが確認された。最も顕著に、機能性の変化を補正する修飾が追加されない場合、機能性を維持するならばアンチセンス鎖の第1および第2位が2’−O−メチル修飾を持ってはならない。同一のsiRNA19量体を用いて、相前後する2’−O−メチル修飾を持つ3つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、第1位〜第3位以外の位置でその修飾がアンチセンス鎖上にある場合、機能性に対して著しい影響を及ぼさない(図16C参照)。この実験では、ポリリボヌクレオチドの1〜3位、4〜6位、7〜9位等を2’O−メチル部分により個々に修飾した。
単一の2’−デオキシ部分または単一の2’−O−メチル部分のいずれかによる同一ポリリボヌクレオチドの修飾は、機能性に対して著しい影響を及ぼすことはない。タンデムになった2つ以上の2’−O−メチル部分によるアンチセンス鎖の1および2位、あるいは1、2、および3位の修飾によって、機能性を著しく減少させることができる。センス鎖上の7〜9位およびアンチセンス鎖上の13〜15は、タンデムになった2つ以上の2’−O−メチル修飾に対して感受性を持つ。したがって、好ましくはアンチセンス鎖は、二本鎖内の他の位置に競合する修飾が起こらない限り、第1および第2、第1、第2、および第3、第13および第14、ならびに第13、第14および第15位に2’−O−メチル修飾を含まない。以降の実験は、アンチセンス鎖上の1および2位(または1および2、ならびに3位)の2’−O−メチル修飾は、二本鎖機能性の鍵である。センス鎖上の7〜9位ならびにアンチセンス鎖上の13〜15位はあまり重要ではない。
ヌクレオチドの全てが、選択されたヌクレオチドのみが修飾されるセンス鎖よりも、オルトエステル基で全てのヌクレオチドが修飾されるセンス鎖を合成するほうが、実用上の問題として無駄がない。しかし、理論的には、ある種のヌクレオチドのみが修飾される実用的手段がセンス鎖を合成するために開発されていることから、本発明ではこれらのポリヌクレオチドを用いることができた。
好ましくは、2’修飾ヌクレオチドは、2’ハロゲン修飾ヌクレオチド、2’アミン修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される。修飾がハロゲンである場合、そのハロゲンは好ましくはフッ素である。上記修飾がフッ素であると、好ましくは、シトシンまたはウラシル塩基部分を含む1つ以上のヌクレオチドにそれが付着する。2’修飾ヌクレオチドが2’アミノ修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくは−NH2である。この2’修飾ヌクレオチドが2’−O−アルキル修飾である場合、好ましくは上記修飾が2’−O−メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはイソブチル部分であり、最も好ましくは、2’−O−アルキル修飾が2’−O−メチル部分である。2’修飾ヌクレオチドが2’−アルキル修飾である場合、好ましくは修飾は2’メチル修飾であり、該メチル部分の炭素が直接、糖部分の2’炭素に付着する。
図2Cは、siRNA効果が形質移入後144時間で次第に消え始めていくことを示している。修飾されたオリゴの用量および効力は、裸siRNA二本鎖と同等であった。
第2の実施形態によれば、本発明はセンス鎖を含むsiRNAを提供する。ここで、このセンス領域は、第1の実施形態に基づいて提供される少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、第1の実施形態に基づいて提供される少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチドと、コンジュゲートとを含む。好ましくは、上記修飾が2’メチル修飾であり、そのメチル部分の炭素が糖部分の2’炭素に直接付着している。
図2Cは、siRNA効果が形質移入後144時間で次第に消え始めていくことを示している。修飾されたオリゴの用量および効力は、裸siRNA二本鎖と同等であった。
第2の実施形態によれば、本発明はセンス鎖を含むsiRNAを提供する。ここで、このセンス領域は、第1の実施形態に基づいて提供される少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、第1の実施形態にもとづいて提供される少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチドと、コンジュゲートとを含む。
この実施形態内のコンジュゲートは、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。より好ましくは、コレステロール、ポリエチレングリコール、抗原、抗体、およびレセプター・リガンドからなる群から選択される。よりいっそう好ましくは、コンジュゲートはコレステロールまたはポリエチレングリコールを含む。もっとも好ましくは、コンジュゲートはコレステロールを含み、5’炭素位でセンス鎖の5’末端ヌクレオチド単位と連結する。
センス鎖の5’末端におけるコレステロール修飾コンジュゲートの導入は、裸または未修飾二本鎖に匹敵する、あるいはそれよりも優れたオルトエステル修飾および2’アンチセンス修飾siRNAに対する効力の増加をもたらした。図9および11を見よ。センス鎖の5’末端でのコレステロール含有コンジュゲートの導入は、対応する裸二本鎖に匹敵する、あるいはそれよりも優れたオルトエステル修飾および2’フッ素修飾siRNAに対する機能的有効量の減少をもたらした。
図9は、ACEおよび2’フッ素修飾siRNAの効力を改善するためのコレステロールの有用性を示す。正のコレステロール効果が、主にセンス塩化物上に導入された修飾によって観察された。例えば、配列番号1〜16のセンス鎖の5’位にある5’末端に対してコレステロール部位が付着することで、形質移入作用因子の不在下でRNAiが生ずる(図18参照)。
第3の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチド、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成されるセンス鎖を持つsiRNAを提供する。この実施形態では、上記第1の実施形態のオルトエステル修飾を、上記第2の実施形態のコンジュゲートと組み合わせて、用いてもよい。
第4の実施形態によれば、本発明は、センス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートを有し、上記センス鎖および/またはアンチセンス鎖が少なくとも2’修飾ヌクレオチドを有するsiRNAを提供する。この実施形態の2’修飾ヌクレオチドは、上記第1の実施形態の2’修飾ヌクレオチドと同様のパラメーターに基づいて、好ましくは選択される。同様に、上記コンジュゲートは、上記第2の実施形態でコンジュゲートが選択された同一のパラメータにもとづいて選択される。
第5の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、2’ハロゲン修飾ヌクレオチド、2’アミン修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖と、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるコンジュゲートとを有し、上記ポリヌクレオチドが18〜30のヌクレオチド塩基対を含むsiRNAを提供する。
この実施形態のオルトエステルは、上記第1の実施形態のオルトエステルを選択するための基準に基づいて選択される。上記2’修飾がハロゲンである場合、好ましくはハロゲンがフッ素であり、アンチセンス鎖の少なくとも1つはCおよび/またはU含有ヌクレオチド単位に付着する。上記2’修飾ヌクレオチドが2’アミノ修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくはNH2である。2’修飾ヌクレオチドが2’−O−アルキル修飾である場合、好ましくは2’−O−アルキル修飾が2’−O−メチル、エチル、プロピル、イソプロビル、ブチル、またはイソブチル部分であり、最も好ましくは2’−O−アルキル修飾が2’−O−メチル部分である。2’修飾ヌクレオチドが2’アルキル修飾である場合、好ましくは、それは2’メチル修飾であり、そのメチル部分の炭素が直接、糖部分の2’炭素に付着している。
第6の実施形態によれば、本発明は以下の構造を含む組成物を包含する。
この実施例のR1、オルトエステルは、上記第1の実施形態のオルトエステルを選択するためのパラメータに基づいて選択される。
式中の破線は、窒素含有塩素間の水素結合による相互作用を示す。好ましくは、B1およびB2は、天然の窒素含有塩素、例えばアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、およびクエウオシン、あるいはそれらの類似体である。好ましくは、XがOである。
上記実施形態の各々に関して、siRNAは任意の長さのものであり、好ましくは18〜30ヌクレオチド塩基対、より好ましくは18〜19塩基対であり、任意のオーバーハングが除かれる。長さが約30塩基対未満のsiRNAを用いることで、非特異的なプロセス(例えばsiRNA適用の機能性を減少させるインターフェロン関連の反応)を避けることができ、その一方でRNA干渉適用における機能的反応が保たれる。さらに、好ましくは、上記ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
上記実施形態において、オーバーハングが鎖の一方または両方に存在し得る。好ましくは、siRNAがオーバーハングを有する場合、長さが1〜6ヌクレオチド単位、より好ましくは2〜3、さらに最も好ましくは2であり、siRNAの各々の鎖の3’末端に位置する。しかし、平滑末端を有するsiRNAは機能的である。2つのヌクレオチドのオーバーハングが最も好ましい。
上記実施形態での類似性は、siRNAのいずれか一方の鎖または両方の鎖が、1つ以上の修飾ヌクレオチド間連結を持ち得ることである。好ましくは、修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートとホスホロジチオエートとからなる群から選択される。さらに、好ましくは、上記ポリヌクレオチドが4を上回る数の修飾ヌクレオチド関連結を持つことができる。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドが、8を上回る数の修飾ヌクレオチド間連結を含む。最も好ましくは、約10個の修飾ヌクレオチド間連結が用いられる。安定性を最も高くするために、完全な修飾が好ましいが、実際に用いることができる修飾連結の数に対して、数多くの因子が影響を及ぼす。このような因子として、連結によって与えられる安定性の度合い、連結が機能性に影響を及ぼす度合い、化学的に連結を導入する能力、さらに連結の毒性が挙げられる。好ましくは、修飾はエクソヌクレアーゼ活性に対する保護のために、3’および5’末端に配置される。
本発明の上記実施形態のポリヌクレオチドは、安定化されている。これらの安定化したsiRNAの半減期は、約20秒から100時間以上である。好ましくは、本発明の安定化siRNAの半減期は1時間を超える。より望ましくは、本発明の安定化siRNAは、10時間を超える半減期を示す。もっとも好ましくは、本発明の安定化siRNAは、100時間を上回る半減期を示す。その上、望ましくは、siRNAの効果は、少なくとも1世代以上にわたる細胞分裂を存続する。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト血清存在下で高い安定性を示す。好ましくは、例えば、ヒト血清中での本発明の19量体二本鎖の半減期が数分から24時間である。より好ましくは、ヒト血清での19量体二本鎖の半減期が24時間から3日間である。最も好ましくは、血清中での19量体二本鎖の半減期は3〜20日以上である。
第2、第4、第6、第14、第16、および第18位でのデオキシリボ核酸修飾を持つアンチセンス鎖を有する19量体ポリリボヌクレオチド二本鎖にとって、37℃で1時間30分、胎仔牛血清にさらすことで、おそらくは血清ヌクレアーゼによって、第4および第6位が分解から守られた。同様に、第2〜第6、第12、第14、第16および第17、さらに第19位にあるアンチセンス鎖上の2’−O−メチル修飾を含む19量体ポリリボヌクレオチド二本鎖に関して、血清ヌクレアーゼによる分解からこれらの位置が保護された。ヌクレオチド1〜6および13〜19間での19量体ポリリボヌクレオチド二本鎖に対するアンチセンス鎖内のホスホロチオエート修飾の導入によって、血清ヌクレアーゼ分解に抵抗する修飾ヌクレオチド間結合が与えられる。しかし、アンチセンス鎖の各2’位でACEオルトエステル部分により修飾された19量体によっては、ヒト血清に対する安定性が得られなかったが、おそらく血清リボヌクレアーゼのみならず血清ホスホジエステラーゼが原因と考えられる。
ポリヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖における2’位での修飾は、CおよびUヌクレオチド単位で、血清中でのポリリボヌクレオチド二本鎖の安定性を著しく高める。図17は、センスおよびアンチセンス鎖の両方の2’位での修飾の種類の関数として、2’−O−メチル(配列番号13)に関して、2’F(5’−2’GfUGAfUGfUAfUGfUfCAGAGAGfUdTdT−3’)(配列番号17)、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結(配列番号10および11)、さらにACE保護(配列番号3および4)に関して、安定性を示す。縦軸は、非分解性ポリヌクレオチドと対照との割合を示す。したがって、対照と比較した安定性率が高くなれば、観察される分解も少なくなる。図17から、センス鎖を修飾することは、安定性を達成する上で十分である。
2’−O−メチル部分または2’フルオロ部分のいずれかによる各Cおよび各Uの修飾は、センスおよびアンチセンス鎖の完全な安定化をもたらす。安定なセンス鎖、例えば2’フルオロまたは2’−O−メチル修飾を持つものを裸のアンチセンス鎖にアニーリングして、安定性が改善される。
本発明の組成物は、新規の保護基スキームに準拠したDharmaconのRNA合成ケミストリーに基づいて作ることができる。2’−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基(2’−ACE)と併用して5’−ヒドロキシル(5’−SIL)の保護に、シリルエステル類を用いることができる。このような保護基の組が、続いて標準的なホスホラミダイト固相合成技術で使われる。いくつかの保護および機能化リボヌクレオチド・ホスホラミダイトの構造を図12に示す。とって代わるものとして、本発明の組成物を任意の他の適当なRNA合成ケミストリーを用いて作ることができる。
第7の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施するための方法を提供する。この方法は、RNAiを実施するために、siRNAを標的核酸にさらすことから構成される。この方法では、siRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらに上記センス鎖および上記アンチセンス鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含む。
好ましくは、目的とする標的核酸に対して、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドが90%以上の相補性を表す。より好ましくは、本発明のアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、目的とする標的核酸に対して、99%以上の相補性を示す。最も好ましくは、本発明のポリヌクレオチドが、連続する少なくとも18〜19塩基にわたって、目的とする標的核酸に対して完全な相補性を持つ。
好ましくは、上記少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドがセンス鎖上に位置し、上記オルトエステルの組成物が第1の実施形態について前述されたパラメーターによって定義される。
オルトエステル修飾に加えて、上記した他の修飾のいずれかもまた、この方法で使用する場合に提示可能である。例えば、アンチセンス鎖は、2’ハロゲン修飾ヌクレオチド、2’アミン修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを、好ましくは含む。修飾ヌクレオチドが2’ハロゲン修飾ヌクレオチドである場合、上記ハロゲンは好ましくはフッ素である。このハロゲンは好ましくはフッ素である。ハロゲンがフッ素である場合、このフッ素は、好ましくは、CまたはU含有ヌクレオチド単位に付着している。上記2’修飾がアミンである場合、好ましくは、そのアミンは、−NH2という部分を有する。上記2’修飾が2’−O−アルキル基である場合、好ましくは、その基は、メソオキシ−OCH3という部分を有する。上記2’修飾がアルキル基である場合、好ましくはその修飾がメチル基(−CH3)である。さらに、好ましくは、これらの修飾のいずれもがヌクレオチド8〜11で生じず、より好ましくはこれらの修飾のいずれもがアンチセンス鎖の7〜12位で生じない。
上記方法はまた、siRNAが5’コンジュゲートを含むかたちで、実施される。このコンジュゲートを、コンジュゲートの選択に関する前述の基準に基づいて、選択することができる。
これらの方法を用いる際、上記siRNAは任意の数の塩基対ではあるが、好ましくは18〜30塩基対、より好ましくは19塩基対である。さらに好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドのアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
一方または両方の鎖上の3’および/または5’末端ヌクレオチド単位の1つ以上の塩基対のオーバーハングもまた、オーバーハングのための上記パラメータにもとづいて存在する。
第8の実施形態によれば、本発明は、RNA干渉を実行するための方法を提供するもので、siRNAを標的核酸にさらすことを含む。このsiRNAは、センス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成される。センスまたはアンチセンス鎖のいずれも、2’修飾ヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のこの実施形態のsiRNAは、前述の実施形態と同程度の相補性を示す。
この実施形態によれば、アンチセンス鎖は、好ましくは、2’ハロゲン修飾ヌクレオチド、2’アミノ修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2’アルキル修飾ヌクレオチドから選択される少なくとも1つのヌクレオチドを含む。上記修飾は、アンチセンス鎖および/またはセンス鎖に対しておこなうことができる。修飾ヌクレオチドが2’ハロゲン修飾ヌクレオチドである場合、ハロゲンが好ましくはフッ素である。ハロゲンがフッ素である場合、上記フッ素は好ましくは、少なくとも2つのCまたはU含有ヌクレオチドに結合する。好ましい2’アミン修飾は−NH 2 である。好ましい2’−O−アルキル修飾は−OCH 3 である。好ましくは2’アルキル修飾は、−CH3である。
上記方法はまた、siRNAがコンジュゲートを含んで実行することができる。コンジュゲートは、既に述べられたコンジュゲートを選択するためのパラメータに基づいて選択される。siRNAは、任意の数の塩基対であってもいが、前述の実施形態では、好ましくは18〜30塩基対、最も好ましくは18〜19塩基対である。同様に、いずれかの、または両方の鎖の3’および/または5’末端ヌクレオチド上の1つ以上の塩基対のオーバーハングを与えることができる。さらに、センスまたはアンチセンスのいずれかが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含むことができ、好ましくはホスホロチオエート連結およびホスホロジエチエート連結から選択される。好ましくは、上記センスおよびアンチセンス鎖は、ポリリボヌクレオチドである。
上述した実施形態の各々は、ポリヌクレオチドが裸ポリヌクレオチドよりもより安定していることから、効果的なRNAi干渉を実施することが可能である。裸ポリヌクレオチドとは異なり、本発明のポリヌクレオチドは、血液、血清、および他の生物学的媒体に存在するヌクレアーゼおよび他に物質による分解に対して耐性を示す。
本発明のさらなる驚くべき利点は、「オフ・ターゲット化(off−targeting)とも呼ばれる非特異的RNA干渉を最小限にすることである。非特異的RNA干渉は、標識にされていない遺伝子の機能をセンス鎖がサイレンシングまたは部分的にサイレンシングする場合に生ずる。本明細書に記載するオルトエステル修飾および他の修飾は、単独または互いに組み合わさって、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖で用いられ、そのような非特異的RNA干渉の削減または防止をおこなう。
非特異的RNA干渉を減少させるために、好ましくはセンス鎖修飾を、5’末端ヌクレオチドを第1番目として、5’末端から第8、第9、第10、または第11番目のヌクレオチドで、おこなう。より好ましくは、第8、第9、第10、および第11番目のヌクレオチドの全てを2’位で修飾する。最も好ましくは、第8、第9、第10、および第11番目のヌクレオチドが全て2’位で修飾され、かつ該修飾がオルトエステルである。
第9の実施形態によれば、本発明は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、上記siRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらに前記センス鎖は実質的に非機能的である、RNA干渉を実施する方法を提供する。「実質的に非機能的(substantially nonfunctional)」によって意味されることは、いっさいの非標的遺伝子の発現を、上記センス鎖が50%以上阻害することができないということである。したがって、「実質的に非機能的」センス鎖によって阻害される非特異的mRNAの発現は50%未満である。本発明の付加的な利点として、血清含有培地および血清中での安定性が高められる。
この実施形態によれば、上記センス鎖は、少なくとも1つの2’−O−アルキル修飾、少なくとも1つのシトシン含有ヌクレオチド塩基またはウラシル含有ヌクレオチド塩基を含むことができ、その少なくとも1つのシトシン含有ヌクレオチド塩基またはウラシル含有ヌクレオチド塩基は、2’−O−メチル修飾を有する。好ましくは、2’−O−アルキル修飾が2’−O−メチル修飾である。より好ましくは、上記2’−O−アルキル修飾が第1,第2、第18、および/または第19ヌクレオチド塩基上の、2’−O−メチル修飾である。
上記センス鎖は、さらに、コンジュゲートを含み得る。好ましくは、コンジュゲートがコレステロールである。好ましくは、このコレステロールは、センス鎖の5’および/または3’末端に付着している。コレステロールによるsiRNA二本鎖の修飾は、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対する二本鎖の親和性を著しく増加させ、顕著な毒性をいっさい生ずることなく二本鎖の体内分布を変える。
上記センス鎖は、その3’末端にキャップを含み得る。好ましくは、このキャップは逆位のデオキシチミジンまたは末端位置(ヌクレオチド18および19)にある2つの連続的な2’−O−メチル修飾塩基である。
上記アンチセンス鎖は、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、この少なくとも1つの修飾ヌクレオチドは、2’−ハロゲン修飾ヌクレオチドである。最も好ましくは、その修飾ヌクレオチドは2’−フッ素修飾ヌクレオチドである。
前記センス鎖が1つ以上のシトシン含有ヌクレオチド塩基および/またはウラシル含有ヌクレオチド塩基を含む場合、1つ以上のシトシン含有ヌクレオチド塩基および/またはウラシル含有ヌクレオチド塩基は、2’−フッ素修飾されたものである。
第10の実施形態によれば、本発明は、RNA干渉を実施する方法を提供するもので、該方法はsiRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAは、(a)コンジュゲートと、(b)少なくとも1つの2’−O−アルキル修飾を含み、実質的に非機能的であるセンス鎖と、(c)少なくとも1つの2’−フッ素修飾を含むアンチセンス鎖とから構成され、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が18〜30塩基対の二本鎖を形成する。好ましくは、上記少なくとも1つの2’−O−アルキル修飾が、第1、第2、第18、および/または第19のヌクレオチド塩基である。好ましくは、上記コンジュゲートがコレステロールである。好ましくは、上記コレステロールは、センス鎖の5’および/または3’末端に付着している。
上記センス鎖は、さらにその3’末端にキャップを含み得る。好ましくは、このキャップは逆位のデオキシチミジン(idT)または末端位置(ヌクレオチド18および19)にある2つの連続的な2’−O−メチル修飾塩基である。
上記センス鎖は、さらにその3’末端にキャップを含み得る。好ましくは、このキャップは逆位のデオキシチミジン(idT)または末端位置(ヌクレオチド18および19)にある2つの連続的な2’−O−メチル修飾塩基である。
本発明の上記した実施形態の利点は、RISC複合体アセンブリーの方向性を促進するsiRNA二本鎖のセンス鎖の修飾を可能にし、センス鎖が遺伝子サイレンシングに関わるのを防ぐことである。本発明者は、siRNA媒介サイレンシングの効率に対する種々の修飾を持つsiRNAを用いる効果を系統的に研究した。本発明者は、2’−デオキシまたは2’−O−メチル修飾を持つ二本鎖を有するセンスおよびアンチセンス鎖の各々の位置での修飾が、siRNA機能と干渉しないことを発見した。2または3つのそのような修飾に対してタンデム(相前後した)阻害を用いる場合、十分に許容された(well−tolerated)修飾のパターンがセンス鎖とアンチセンス鎖とで異なる。2−O−メチルで修飾されたセンス鎖の1位および2位を持つsiRNA二本鎖は、完全に機能的であった。しかし、アンチセンス鎖の同様な位置での修飾は、完全に非機能的なsiRNAをもたらした。図19〜31を参照せよ。5’末端でのアンチセンス鎖のリン酸化は、部分的にアンチセンス鎖機能性を回復させた。
本明細書に記載した修飾は安価であり、信頼性が高く、かつ非毒性であり、センス鎖がアンチセンス鎖としての機能を実質的におこなうことができないようにsiRNA二本鎖を修飾する方法ある。これの実質的な効果は、siRNA特異性および効力が増加することである。最近のマイクロアレイ分析によれば、11個のヌクレオチドの存在が非特異的サイレンシングを誘発するのに十分であることを示唆しており、さらにsiRNA二本鎖と他のmRNA転写産物のセンス鎖との間の相同性は、場合によっては、少なくとも非特異的な活性の半分を生み出すことが可能であることも示唆されている(Jackson,A.L.,et al.(2003)Expression profiling reveals off−target gene regulation by RNAi.Nature Biotechnology 21,635−637)。したがって、センス鎖の非特異的活性が阻害されるとすれば、二本鎖特異性が増加する。このこともまた、機能的RISC形成の方向へ平衡が移る効果を持つと思われ、同様に必要なsiRNA濃度を低下させる。
本発明者は、十分に許容され、かつ血清(例えば、ヒト血清)存在下でsiRNA二本鎖の安定性を高める修飾を提供する。siRNA二本鎖のセンス鎖修飾を安定化させることのみで、非修飾または裸のアンチセンス鎖に対してある程度の安定性を与える。2’−O−アルキル修飾によるセンス鎖のCまたはU毎の修飾(例えば、2’−O−メチル部分)は、いくつかの配列の安定性にとってかなり効果的ではあるが、他の配列にとっては効果的ではない。さらに、本発明者は、センス鎖の5’末端ヌクレオチドの2’−O−メチル修飾が重要であることを発見した。このようなかたちでの修飾もまた、完全に修飾されたsiRNAと比較して、非特異的効果の度合いが低いという結果になることが予想される。本明細書のデータが記述しているように、センス鎖の1、2、18、および19位での修飾が二本鎖性能と干渉しない。センス鎖修飾によって生ずる二本鎖安定性の一例を図32に示す。この図は、全てのUおよびCに対するO−メチル修飾を二本鎖のセンス鎖に施すことで、抗SEAPsiRNA2217の半減期が10分から4時間に増加したことを示している。アンチセンス鎖のidTバージョンは安定性が2倍低いことから、dTdTによる3’末端の修飾は重要である。アンチセンス鎖が裸のままであることから、このような修飾モードは任意の配列に適用することができる。
血清中での数時間に及ぶ半減期は、siRNAの効果的送達を高める上で十分なものでなければならない。なぜなら、細胞内siRNAはRISC複合体によって安定化されるからである。図35は、センス鎖のCおよびUが2’−O−メチルで修飾され、idTキャップが3’末端に置かれた場合のsiRNA二本鎖の安定性を示す。この種の処方の機能性は配列依存的ではあるが、センス鎖の5’末端上にコレステロールが存在することで、著しく改善される。さらなる修飾(例えば、センス鎖CおよびUの2’−O−メチル修飾、それに加えてセンス鎖の1位および2位の2’−O−メチル修飾、アンチセンス鎖のCおよびUの2’F修飾、さらにアンチセンス鎖の5’末端上のリン酸基、図37参照)は、サイレンシング機能性を感知できるほどに変えることなしに、そのような分子の血清安定性を5日間、さらに増加させることができる。
コレステロール・コンジュゲートによるsiRNAの修飾は、別の予想外の特徴を持つ。コレステロールによって修飾されたsiRNAは、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対して、かなり高い親和性を示す。図33を参照せよ。血清タンパク質親和性は、マウスにおけるアンチセンス生体内分解に関する以前の研究で有用であることが証明された。ホスホチオ修飾の存在は、非特異的アンチセンス結合活性の大部分に関与するが、血清タンパク質に対する高い親和性を持ち、それによって薬物動態学的挙動を変えることから、生体内(in vivo)アンチセンス適用にとっては有益であることが証明された。コレステロール修飾siRNAは、ホスホチオ修飾の非特異性が高まるという欠点なしに血清タンパク質親和性の利点を示す。
第11の実施形態によれば、本発明はセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成されるsiRNAを提供する。このセンス鎖は、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドを有し、それら両方とも2’炭素修飾、好ましくは2’−O−アルキル修飾を持つ。いくつかの実施形態では、このsiRNAは標識も含む。この標識が存在する場合、好ましくはこの標識が第1の5’末端センス・ヌクレオチド上に位置する。さらに、センス鎖上の少なくとも1つのピリミジン(例えば、シトシンまたはウラシル)、好ましくは複数のピリミジンの各々が、2’炭素修飾、好ましくは2’−O−アルキル修飾を有する。これらの修飾は、ピリミジンであってもよい第1または第2の5’末端センス・ヌクレオチドの任意の修飾に加えて、siRNAの配列に依存している。
第11の実施形態のアンチセンス鎖は、少なくとも1つの2’−ハロゲン修飾ピリミジン、好ましくはフッ素修飾ピリミジンと、リン酸化されている第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとを含む。好ましくは、アンチセンス鎖上の全てのピリミジンが2’−フッ素修飾を持つ。
好ましくは、siRNAは、18〜30塩基対、より好ましくは19〜25塩基対、さらに最も好ましくは19〜23塩基対を持つ(ヘアピンを形成することができる単分子siRNA中に存在する場合にオーバーハングまたはループもしくはステム構造を除く)。好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖は、オーバーハング、ループ、またはステム構造を除いて、少なくとも79%相補性、より好ましくは塩基対の範囲にわたって90%相補性、さらに最も好ましくはこの範囲にわたって100%相補性である。同様に、好ましくは、アンチセンス領域は、標的領域に対して、少なくとも79%、より好ましくは少なくとも90%、さらに最も好ましくは少なくとも100%相補性である。好ましくは、上記ポリヌクレオチドはRNAである。
siRNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの5’または3’末端のいずれかに、オーバーハングを含むものであってもよい。しかし、2本の異なる鎖から構成されるポリヌクレオチドの場合、任意のオーバーハングが存在するとすれば、該オーバーハングはセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3’末端のみに存在する。また、好ましくは任意のオーバーハングは長さが6塩基長以下、好ましくは2塩基長以下である。最も好ましくは、オーバーハングが存在しないか、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方もしくは両方の3’末端上に2塩基からなるオーバーハングが存在する。第11の実施形態によれば、アンチセンス鎖の5’末端にオーバーハングを持たないことが好ましい。オーバーハング・ヌクレオチドは、非リン酸5’−ヌクレオチドを残す1種類以上の細胞内酵素プロセスまたはイベントによって頻繁に取り除かれる。したがって、アンチセンス鎖の5’末端にオーバーハングを持たないことが望ましい。
第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化とは、そのヌクレオチドの糖部分の5’炭素に付着した1つ以上のリン酸基が存在することをいう。好ましくは、リン酸基が1つだけ存在する。
2’−O−アルキル修飾は、どの塩基に該修飾が現れるかに関わらず、好ましくは、2’−O−メチル、2’−O−エチル、2’−O−プロピル、2’−O−イソプロビル、2’−O−ブチル、2’−O−イソブチル、2’−O−エチル−O−メチル(−CH2CH2OCH3)、および2’−O−エチル−OH(−OCH2CH2OH)からなる群から選択される。最も好ましくは、2’−O−アルキル修飾が2’−O−メチル部分である。さらに、修飾が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドの各々で同一である必要はない。しかし、本発明の分子を合成することに関して実用上の観点から、全体として同一の修飾を用いることが求められる場合もある。
2’−O−アルキル・ピリミジン修飾に関して、第1の2つの5’末端センスヌクレオチドにあるピリミジン以外の少なくとも1つのピリミジンが、2’−O−アルキル基により修飾される。好ましくは、二本鎖形成領域内にある上記センス鎖上の全てのピリミジンが修飾される。さらに、好ましくは、2’−O−アルキル修飾が2’−O−メチル基である。2’−O−アルキル修飾と同様に、同じアルキル修飾が、2’−O−アルキル基を有する各々のヌクレオチドの上で、使われる必要はない。オーバーハング、ループまたはステムがある場合、それらの領域のピリミジンは、2’−O−アルキル基を含んでもよく、あるいは含まなくてもよい。しかし、2’−O−アルキル基のうちの少なくとも1つは、望ましくはセンス領域である。
2’ハロゲン修飾ヌクレオチドに関して、修飾はアンチセンス鎖のピリミジンの少なくとも1つに生じ、より好ましくはアンチセンス鎖のピリミジンの全てに生ずる。さらに、好ましくは、上記ハロゲンがフッ素である。オーバーハング、ステム、またはループが存在する場合、それらの領域のピリミジンは、ハロゲン基を含んでもよく、あるいは含まなくてもよいが、好ましくはいずれのステムまたはループ構造はこの修飾を含まず、上記少なくとも1つのハロゲン基がセンス領域内にある。本明細書中に記載されるその他の修飾に影響されることなくsiRNAの安定性を増加させるために、2’−ハロゲン修飾(2’フルオロ修飾を含む)を用いることが可能であるという点に、留意する必要がある。したがって、それらの修飾をsiRNA用途での他の修飾と共に使用することと同様に、それらを別々に用いることも可能である。
安定性および第11の実施形態に関連して機能性という本発明の利益を著しく否定するものでなければ、センスおよび/またはアンチセンス鎖のヌクレオチド修飾の他の種類を含めることが可能である。ピリミジン修飾ヌクレオチド(例えば、ハロゲン、好ましくはフッ素修飾)と追加の2’−O−アルキル修飾ピリミジンとを持ちいることで、一定レベルのヌクレアーゼ耐性が得られる。
化学修飾に加えて、塩基対ミスマッチまたは隆起(バルジ)をセンスおよび/またはアンチセンス鎖に付加することができ、該付加によって100%未満の相同性を共有する標的とのRISC媒介付着に関与するそれらの鎖の能力を変える。そのようなミスマッチの例として(限定されるものではないが)プリン−ピリミジン・ミスマッチ(例えば、G−U、C−A)およびプリン−プリンもしくはピリミジン−ピリミジン・ミスマッチ(例えば、G−A、U−C)が挙げられる。これらの種類の修飾を導入することは、前述の修飾と組み合わせてもよく、それらが本発明の利点を損なうことなく機能性の他の属性(例えば、オフ・ターゲット効果)を変えるかどうかを決定するために、評価することができる。
いくつかの用途では、蛍光標識等の標識を使用することが求められる場合もある。標識が蛍光である場合、蛍光標識はCy3(商標)、Cy5(商標)、またはAlexa色素(Molecular Probles,Eugene,OR)である。これらの標識は、好ましくは、センス鎖の5’末端に加えられ、より好ましくは5’末端センス・ヌクレオチドに加えられる。これらは、形質移入細胞等の中の標識siRNAの分布をユーザが視覚化することを可能とさせて、ある一定の形質移入の成功を評価することを可能とする。標識ヌクレオチドの使用は、当業者に周知であり、蛍光標識以外の標識として、例えば質量または放射活性標識を、そのような標識が有益であると考えられる用途で、用いることが可能である。
蛍光修飾(fluorescent modification)は、非形質移入細胞から形質移入細胞を分離するために用いることができる。具体的には、第11の実施形態の分子を細胞集団に対して形質移入した後、FAGSによってソートすることで、形質移入された細胞を非形質移入細胞から分離する。このことによって、より純度の高い集団(混合したものよりも)を得ることができ、その後、遺伝子サイレンシングによって得られる表現型を明確に同定する能力が改善される。
第11の実施形態の分子は、種々の用途を持ち、例えばその分子を形質移入コントロール試薬または安定的サイレンシング試薬として用いることが可能である。これらの分子が標識を含む場合、該分子を細胞へ形質移入することで、細胞のどの分画に成功裏に形質移入がなされたかをユーザーが視覚化および判断することを可能とする。また、これらの修飾は、siRNA機能をこれといって変えないことから、第11の実施形態の分子は、同時に形質移入制御およびサイレンシング試薬となることができる。さらに、使用しうる配列に対して上記修飾が制限を加えるものではないことから、該修飾を多様なsiRNAおよびRNAi用途で使用することができ、また標的配列依存的ではない。
したがって、上記第11の実施形態の分子は、その独特な修飾セットを持つことから、機能性を変えることなく、安定性および「トラックアビリティ(trackability)」を提供する。それらの分子を、形質移入された細胞の純粋集団を単離することにも用いることができる。もし2’−O−アルキル基をアンチセンス鎖の最初の2つまたは最初の3つのヌクレオチドに加えると、オフ・ターゲット効果を減少させる付加的な利益を実現することができる。さらに、2’−O−アルキル基をセンス鎖の最初の2つまたは3つのヌクレオチドに加えると、それらがセンス鎖オフ・ターゲット効果を減少させる付加的な利益を持つことができる。
第12の実施形態によれば、本発明はセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される別のsiRNAを提供する。このセンス鎖は、第11の実施形態のセンス鎖のパラメータと同様のパラメータに基づいて決定され、該パラメータとして第1および第2の5’末端センス・ヌクレオチドの2’炭素修飾、好ましくは2’−O−アルキル修飾と、ピリミジンの少なくとも1つの2’炭素修飾、好ましくは2’−O−アルキル修飾とが挙げられる。しかし、アンチセンス鎖に対する上記修飾の代わりに、第12の実施形態のアンチセンスは、第1および第2、あるいは第1、第2,および第3の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、該ヌクレオチドの各々が2’−O−アルキル修飾を持つ。さらに、第1および第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド以外に、アンチセンス鎖上に、少なくとも1つの2’−O−アルキル修飾ピリミジンが存在する。さらにまた、好ましくは、2’Fl修飾が存在せず、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化が存在しない。リン酸化の欠如は、対応する機能的ポリヌクレオチドと比較して、限定された機能性の分子を与える。上記説明に対する別のバリエーションとして、第12の実施形態の分子は、上記の属性全てに加えて、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に5’ブロック基を含む。そのようなブロック基は、さらに、この分子がリン酸化されてRISCに入ることを除外するもので、5’−アルキル、5’−O−アルキル、アジド(N3)、アミン類、および他の部分からなる。
サイズ、オーバーハング、および他の修飾に関する他の好ましいパラメータは、第11の実施形態に対するものと同じである。しかし、これらの組成物が遺伝子のサイレンシングに用いられないことから、それらは長さが16〜28塩基対とすることができ、好ましくは18〜30塩基対長であると考えられる。
第12の実施形態の分子は、形質移入制御に加えて、潜在的な「フィルター(filter)」またはエクサエクオ剤として作用することも可能であり、これは用量実験で、またはマイクロアッセイ研究の負の対照として、特に有用である。多くの実験が、異なる濃度(例えば、100nM、50nM、25nM、および1nM)での所定のsiRNAの効果を試験する。必要に応じて、形質移入実験を実施した場合、異なる核酸レベルでの形質移入の結果として生ずるいかなる例外も回避するために、一定濃度の「全siRNA(total siRNA)」を持つことが望まれる。残念なことに、任意の未修飾対照siRNA(例えば、非特異的対照)を加えることは、RISCとの相互作用に関する研究のもとで、siRNAと競争する潜在的な下落傾向を有する。第12の実施形態の分子は、この問題を軽減する。両方のセンスおよびアンチセンス鎖の1および2位(または1、2、および3位)上の2’−O−メチル修飾の追加は、リン酸化5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがない場合、それは、RISCとの相互作用に対するこの分子の能力を制限する。したがって、この分子は形質移入することができるが、RISCに関して他のsiRNAと競争することはできない。第11の実施形態の分子の場合と同様に、ピリミジン(CおよびU)に対する2’−O−メチル基の付加は、ヌクレアーゼ消化の可能性を最小限にする。
第12の実施形態の分子は、他の「非特異的(non−specific)配列または対照群とは異なり、RISCと十分な相互作用をおこなうことはない。このように、これらの分子は限られたオフ・ターゲット化副作用のみを生ずるはずなので、RISC上の部位を争うことのないトラッカブルである能力を有する。
上記した実施形態(第11および第12の両方)を、隣接したセンスおよびアンチセンス鎖(すなわち、2本の別々の鎖)を持たないsiRNA、さらにはヘアピンを形成することができる単分子siRNA(shRNA)に適用することが可能ある。用語「siRNA」として、両方のタイプのRNAが挙げられる。例えば、ヘアピンは、ループ構造(好ましくは4〜10塩基対を含み得る)と、センス領域とを含み、センス領域とアンチセンス領域とが個々に19〜23塩基対長であり、実質的に互いに相補的である。ループ構造の好ましい配列が、例えば、5’−UUCG(配列番号319)、5’−UUUGUGUAG(配列番号320)、および5’−CUUCCUGUCA(配列番号321)である。
ヘアピンは、アンチセンス領域の下流にあるループ流域とともに望ましくは構築される。この構成は、第11の実施形態にとっては特に望ましい。なぜならば、末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化するのがより容易であるからである。このように、単分子siRNAsを設計する際、オーバーハングが5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの上流にないことが好ましい。
本発明にもとづいて、単分子siRNA、特に左回りの(left−handed)単分子構造(例えば、5’−AS−Loop−S)を設計する場合、好ましくは、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補的である塩基から数えて(すなわち、センス領域の3’末端から数えて)、センス領域の第18、第19、または第20の塩基であるヌクレオチドとして定義される。第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、このように定義される。なぜなら、ヘアピンを形成することができる単分子siRNAが細胞に入る場合、ダイサー(Dicer)が、2本の異なる鎖(siRNA)から構成されるヘアピンsiRNAを約18〜20塩基対から構成されるヘアピンsiRNA分子に処理し、これらの分子がこの処理された分子の末端にセンス鎖修飾を持つことが要求されるからである。最も好ましくは、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、センス領域の3’末端からセンス領域の19番目の塩基であるヌクレオチドとして定義される。さらに、好ましくは、ポリヌクレオチドは、左回りのヘアピンを形成することができる。
shRNAは、さらに、ステム領域を含むことができ、該ステム領域は、ループ構造の第5’末端および第3’末端に直接隣接した1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み、さらに該ステム領域の1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが標的特異的もしくは非標的特異的である。好ましくは、その単分子siRNAの全長は、100塩基対未満であり、より好ましくは85塩基対未満である。
本発明の単分子siRNAは、最終的には細胞の機能(cellular machinery )によって2本の異なる鎖に変換されるように処理される。あるいは、この分子をRNAi経路の1つ以上のステップ(例えば、ダイサーによる処理)にかけ、RISCに単分子状ヘアピン分子として入れることも可能である。さらに、これらの単分子siRNAを、全ての修飾よりも少ないもので細胞に導入してもよく、また導入された天然のプロセスまたはプロセッシング用分子を用いて、細胞自体の中で修飾することも可能である(例えば、第11の実施形態に関して、天然キナーゼによる細胞内でのリン酸化)。しかし、好ましくは、上記ポリヌクレオチドに対して、既に存在している全ての修飾が導入される(同様に、siRNAが2つの異なる鎖から構成される場合、好ましくは、それらの鎖が、細胞に導入された場合に全ての修飾を含む。アンチセンス鎖が、例えば、導入後にリン酸化の基によって修飾され得るにもかかわらず)。
上記実施形態(第11および第12)が安定性増加を目的としているにもかかわらず、それらのタイプまたは他のタイプの修飾が他のパラメータ、例えば特異性に対しても影響を及ぼすという点に注意することが重要である。
さらに、これらの安定性および機能性修飾を組み合わせてもよい(例えば、少なくとも1つのセンス・ピリミジンを持つ追加の2’炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾)と、2’炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾)を持つ第1の2(または3)以外の好ましくは全てのセンス・ピリミジンと、2’炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾)を持つ第1の2(または3)以外の、少なくとも1つの、好ましくは全ての、アンチセンス・ピリミジンの2’Fl修飾と、5’アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化とを併用した、第1および第2の(または第1、第2、および第3の)5’末端センスおよびアンチセンス・ヌクレオチド2’炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾))。さらに、本発明の上記修飾は、無作為に選択される、または、例えば、米国特許出願第10/714,333号に記載されているような論理的設計に基づいて、選択された配列を含むsiRNAと組み合わせてもよい。
リン酸主鎖に対する安定化修飾は、本発明のいくつかの用途のためにポリヌクレオチド内に含めることが可能である。例えば、少なくとも1つのホスホロチオエートおよび/またはメチルホスホネートを、オリゴヌクレオチド主鎖のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖にある、同様に存在しうる任意のオーバーハング、ループ構造、またはステム構造にある、任意の、または全てのピリミジンのいくつかの、または全ての3’位にあるリン酸基と置換してもよい。ホスホロチオエート(およびメチルホスホネート)類似体は、オリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基の修飾から生ずる。ホスホロチオエート内では、リン酸塩Oが硫黄原子に置き換わる。メチルホスホネートでは、酸素がメチル基によって置き換わる。一実施形態では、ホスホロチオエート修飾またはメチルホスホネートは、2’フッ素(または他のハロゲン)修飾ヌクレオチドも含む全てのアンチセンス鎖ヌクレオチドの3’位に置かれている。さらに、ホスホロチオエート3’修飾を、2’フッ素置換の代わりに、および独立して用い、siRNA分子の安定性を高めることが可能である。これらの修飾は、siRNA用途において、本明細書に記載された他の修飾と併用して、あるいはそれらの修飾とは別個に、用いることが可能である。
ヌクレアーゼは、一般に、リン酸塩部分およびリボース環の2’OH位にある酸素基の両方を用いてRNAに対する攻撃を媒介する。複数の酸素の1つに対する硫黄基の置換によって、この反応に参加するリン酸塩の能力が取り除かれ、ヌクレアーゼ消化に対するこの部位の感度が制限される。しかし、ホスホロチオエートが典型的に有毒な点に留意する必要があることから、いかなる毒作用も否定される場合に主に有益であり、例えば、他のヌクレオチド毎、第3のヌクレオチド毎、または第4のヌくレオチド毎にこの修飾を用いることを制限することによって、達成しうると考えることができる。
第12の実施形態の分子は、限定された機能のものではあるが、上記したように、負の対照研究で使用可能であり、またエクサエクオ剤として用いることができる。複数の分子に関連する上記修飾セットは、該分子を、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端に対して必須のリン酸基を付加する細胞内キナーゼにとって劣った基質とする。修飾がリン酸化を著しく阻害する一方で、これらの修飾を担持する分子のいくつかの小分画が、いまだに5’アンチセンス位置のC5でリン酸化を受けて小量のサイレンシングを生成することも考えられる。そのような場合、それらの分子のセンスおよび/またはアンチセンス鎖の5’末端の5’炭素位を、キナーゼリン酸化を防ぐブロック基によって、修飾することが求められる可能性がある。ブロック基は、例えば、末端ヌクレシドの5’炭素位のリン酸化を防ぐ任意の基であってもよく、限定されるものではないが、5’−アルキル、5’−O−メチル、および5’−アミン基が挙げられる。
対照またはエクサエクオ剤の別の例は、以下の2’炭素修飾のみを含む。すなわち、(i)各々が2’修飾、例えば上記した2’修飾(例として、2’−O−メチル修飾)を含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5’末端センス・ヌクレオチドと、(ii)各々が2’修飾、例えば上記した2’修飾(例として、2’−O−メチル修飾)を含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとを含み、ならびに5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されていない。
本発明のポリヌクレオチドは、現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法が、本発明の分子を合成する上で有用である。特定の修飾を含むsiRNA二本鎖は、Scaringe,S.A.(2000)”Advanced 5’−silyl−2’−orthoeter approach to RNA oligonucleotide synthesis,”Methods Enzymol.317,3−18;Scaringe,S.A.(2001)”RNA oligonucleotide synthesis via 5’−silyl−2’− orthoeter chemistry,”Methods 23,206−217;Scaringe,S.and Caruthers,M.H.(1999)米国特許第5,889,136号;Scaringe,S.and Caruthers,M.H.(1999)米国特許第6,008,400号;Scaringe,S.(2000)米国特許第6111086号;Scaringe,S.(2003)米国特許第6,590,093号に記載されている事項および方法を用いて、化学的に合成することが可能である。上記合成方法は、ヌクレオシド塩基保護5’−O−シリル−2’−O−オルトエステル−3’−O−ホスホラミダイトを用いて、3’から5’方向に固体担体上に所望の未修飾siRNA配列をアセンブルする。手短に言うと、必須のホスホラミダイトの合成は、標準塩基保護リボヌクレオシド(ウリジン、N4−アセルエチジン、N2−イソブチリルグアノシン、およびN6−イソブチリルアデノシン)から始まる。5’−O−シリルおよび2’−O−オルトエステル保護基の導入、ならびに反応性3’−O−ホスホラミダイト部分が次に4つのステップによって達成される。すなわち、
1.Markiewicz試薬によるヌクレオシド糖の5’−および3’−ヒドロキシル基の同時かつ一時的なブロッキング(1,3−ジクロロ−1,1,3,3,−テトライソプロピルジシロキサン[TIPS−Cl2]含有ピリジン溶液{Markiewicz,W.T.(1979)(1979)”Tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl,a Group for Simultaneous Protection of 3’− and 5’−Hydroxy Functions of Nucleoside,”J.Chem.Research(S),24−25}をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製;
2.触媒としてピリジニウムp−トルエンスルホネートを用いてトリス(アセトキシエチル)−オルトフォルメート含有ジクロロメタンを用い、TIPS−ヌクレオシド糖の2’−ヒドロキシルをビス(アセトキシエチル)オルトエステル[ACE誘導体]に位置特異的変換した後、クロマトグラフィーによる精製;
3.フッ化水素およびN,N,N”N’−テトラメチルエチレンジアミン含有アセトニトリルを用いてTIP保護基の特異的除去によるヌクレオシド糖の5’−および3’−ヒドロキシル基の放出をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製;
4.ベンズヒドロキシル−ビス(トリメチルシリロキシル)クロリド[BzH−Cl]含有ジクロロメタンを用いて5’−O−シリルエタノールとして5’−ヒドロキシルの保護を行った後、クロマトグラフィーによる精製;ならびに
5.ビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)メトキシホスフィンおよび5−メチルチオ−1H−テトラゾール含有ジクロロメタン/アセトニトリルを用いて3’−O−ホスホラミダイトへの変換を行った後、クロマトグラフィーによる精製。
1.Markiewicz試薬によるヌクレオシド糖の5’−および3’−ヒドロキシル基の同時かつ一時的なブロッキング(1,3−ジクロロ−1,1,3,3,−テトライソプロピルジシロキサン[TIPS−Cl2]含有ピリジン溶液{Markiewicz,W.T.(1979)(1979)”Tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl,a Group for Simultaneous Protection of 3’− and 5’−Hydroxy Functions of Nucleoside,”J.Chem.Research(S),24−25}をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製;
2.触媒としてピリジニウムp−トルエンスルホネートを用いてトリス(アセトキシエチル)−オルトフォルメート含有ジクロロメタンを用い、TIPS−ヌクレオシド糖の2’−ヒドロキシルをビス(アセトキシエチル)オルトエステル[ACE誘導体]に位置特異的変換した後、クロマトグラフィーによる精製;
3.フッ化水素およびN,N,N”N’−テトラメチルエチレンジアミン含有アセトニトリルを用いてTIP保護基の特異的除去によるヌクレオシド糖の5’−および3’−ヒドロキシル基の放出をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製;
4.ベンズヒドロキシル−ビス(トリメチルシリロキシル)クロリド[BzH−Cl]含有ジクロロメタンを用いて5’−O−シリルエタノールとして5’−ヒドロキシルの保護を行った後、クロマトグラフィーによる精製;ならびに
5.ビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)メトキシホスフィンおよび5−メチルチオ−1H−テトラゾール含有ジクロロメタン/アセトニトリルを用いて3’−O−ホスホラミダイトへの変換を行った後、クロマトグラフィーによる精製。
ホスホラミダイト誘導体は、一般に厚く、無色から薄黄色のシロップである。自動RNA合成装置に適合させるために、生成物の各々を予め定めた量の無水アセトニトリルに溶解し、この溶液を適当な数の血清バイアルに等分にして加え、各バイアル内のホスホラミダイトが1.0mmole量とする。次に、これらのバイアルを適当な真空デシケーターに置いて、高真空に一晩置くことで溶媒の除去をおこなう。次に、雰囲気を乾燥アルゴンに置き換えて、バイアルをゴム製のセプタムでキャップし、密閉されたホスホラミダイトを、必要とする時まで−20℃に保存する。合成装置に投入する前に、各ホスホラミダイトを十分な無水アセトニトリルで溶解して所望の濃度にする。
所望のオリゴリボヌクレオチドの合成は、自動合成装置を使用して行われる。それは、3’−ヒドロキシルを介して固体ビーズ状ポリスチレン担体に、切断可能な連結を介して、3’−末端ヌクレオシドの共有結合から始まる。所望の合成スケールにとって適当な量の担体を測定して反応用カートリッジに入れ、それを次に合成装置に固定する。結合したヌクレオシドを5’−O−ジメトキシトリチル部分で保護し、鎖アセンブリのための5’−ヒドロキシルを遊離させるために、その部分を無水酸(3%[v/v]ジクロロ酢酸含有ジクロロメタン)で除去する。
アセンブルされる配列のそれ以降のヌクレオシドを、以下の一般的な反応からなる4ステップ・サイクルを用いて、固体担体上で成長する鎖に対して、順次加える。
1.カップリング:適当なホスホラミダイトを5−エチルチオ−1H−テトラゾールで活性化させ、担体結合ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの遊離5’ヒドロキシルと反応させる。これら2種類の試薬の濃度の最適化とモル過剰、さらにはその反応時間が、一般にサイクルあたり98%を上回るカップリング収率が得られる。
2.酸化:カップリング・ステップで形成した分子間連結は、リン原子をそのP(III)[亜リン酸塩]酸化状態に残す。生物学的に関連した酸化状態は、P(V)[リン酸塩]である。したがって、亜リン酸はtert−ブチルヒドロペルオキシド含有トルエン溶液を用いて、P(III)からP(V)に酸化する。
3.キャッピング:小量の残留未反応5’−ヒドロキシル基は、欠失を含む配列の形成を防ぐために、以降の結合サイクルへの参加かがブロックされなければならない。このことは、過剰の無水酢酸と1−メチルイミダゾールとを含むアセトニトリルで担体を処置することによって達成され、酢酸エステルとして効率的に残留5’−ヒドロキシル基がブロックされる。
4.脱シリル化:シリル保護された5’−ヒドロキシルは、次の共役反応の前に脱保護されなければならない。このことは、トリエチルアミン・トリヒドロゲンフルオリド含有N,N−ジメチホルムアミドによる処理を介して達成され、他の保護基(2’−O−ACE、N−アシル塩基保護基またはメチルホスホネート)が同時に取り除かれることなしに、素早く、かつ特異的に5’−ヒドロキシルを放出する。
1.カップリング:適当なホスホラミダイトを5−エチルチオ−1H−テトラゾールで活性化させ、担体結合ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの遊離5’ヒドロキシルと反応させる。これら2種類の試薬の濃度の最適化とモル過剰、さらにはその反応時間が、一般にサイクルあたり98%を上回るカップリング収率が得られる。
2.酸化:カップリング・ステップで形成した分子間連結は、リン原子をそのP(III)[亜リン酸塩]酸化状態に残す。生物学的に関連した酸化状態は、P(V)[リン酸塩]である。したがって、亜リン酸はtert−ブチルヒドロペルオキシド含有トルエン溶液を用いて、P(III)からP(V)に酸化する。
3.キャッピング:小量の残留未反応5’−ヒドロキシル基は、欠失を含む配列の形成を防ぐために、以降の結合サイクルへの参加かがブロックされなければならない。このことは、過剰の無水酢酸と1−メチルイミダゾールとを含むアセトニトリルで担体を処置することによって達成され、酢酸エステルとして効率的に残留5’−ヒドロキシル基がブロックされる。
4.脱シリル化:シリル保護された5’−ヒドロキシルは、次の共役反応の前に脱保護されなければならない。このことは、トリエチルアミン・トリヒドロゲンフルオリド含有N,N−ジメチホルムアミドによる処理を介して達成され、他の保護基(2’−O−ACE、N−アシル塩基保護基またはメチルホスホネート)が同時に取り除かれることなしに、素早く、かつ特異的に5’−ヒドロキシルを放出する。
上記4つの反応ステップの間で、アセトニトリルによるいくつかの洗浄がある点に留意する必要があり、洗浄を用いることで、次の反応ステップに先立って過剰な試薬および溶媒が取り除かれる。上記サイクルは、オリゴリボヌクレオチドの未修飾部分がアセンブルされるまでの必要な回数が繰り返される。上記合成方法は、例示のみであり、分子が作られる手段を限定するものとして構成されるものではない。siRNAを合成するために現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法も、用いることが可能である。
第11および第12の実施形態のいくつかの実施形態のsiRNAは、2つの修飾ヌクレオシド(例えば、2’−O−メチル誘導体)を各々の鎖の5’末端に含む。これらの修飾ヌクレオシドで5’−O−シリル−2’−O−メチル−3’−O−ホスホラミダイト誘導体は、既に記載したものと同様の手順(上記ステップ4および5)を用いて調製され、塩基保護2’−O−メチルヌクレオシド(2’−O−メチル−ウリジン、2’−O−メチル−N4−アセチルシチジン、2’−O−メチル−N2−イソブチリルグアノシン、および2’−O−メチル−N6−イソブチリルアデノシン)から開始される。これらの修飾ヌクレオシドに2’−ヒドロキシルが存在しないことで、これらの化合物のACE保護の必要性がなくなる。このように、5’−O−シリルおよび反応性3’−O−ホスホラミダイト部分の誘導は、以下の2つのステップによって達成される。
1.ベンズヒドロキシ−ビス(トリメチルシリルオキシ)シリルクロリド(BzH−Cl)含有N,N−ジメチルホルムアミドを用いて、5’−O−シリルエーテルとして5’−ヒドロキシルの保護をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製、および
2.ビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)メトキシホスフィンおよび5−エチルチオ−1H−テトラゾール含有ジクロロメタン/アセトニトリルを用いて3’−O−ホスホラミダイトの変換をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製。
2.ビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)メトキシホスフィンおよび5−エチルチオ−1H−テトラゾール含有ジクロロメタン/アセトニトリルを用いて3’−O−ホスホラミダイトの変換をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製。
ホスホラミダイトの精製後パッケージングを、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された手順を用いて実施する。同様に、2つの5’−O−シリル−2’−O−メチル ヌクレオシドのホスホラミダイト誘導体を介しておこなわれる該5’−O−シリル−2’−O−メチル ヌクレオシドの取り込みは、標準的なヌクレオシド ホスホラミダイトに介して既に記載された同一の4ステップ/サイクルを2回適用することによって、達成される。
この発明の第11の実施形態のいくつかの実施形態のsiRNA二本鎖は、アンチセンス鎖の5’末端にリン酸塩部分を含む。このリン酸塩は、アンチセンス鎖に対する最終カップリングとして化学的に導入される。所望のホスホラミダイト誘導体(ビス(シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルアミノホスホラミダイト)は、要するに以下のようにして合成される。すなわち、三塩化リンを1当量のN,N−ジイソプロピルアミンを含む無水テトラヒドロフランで、過剰のトリエチルアミンの存在下で反応させる。次に、2当量の3−ヒドロキシプロピオニトリルを添加して完全に反応させる。最後に、生成物をクロマトグラフィーによって精製する。ホスホラミダイトの精製後パッケージングは、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された手順を用いて実施される。同様に、アンチセンス鎖の5’末端でのホスホラミダイトの取り込みは、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された同一の4ステップ・サイクルを適用することによって、達成される。
修飾かつ保護されたオリゴヌクレオチドは、鎖アセンブリーの最後で固体担体に連結したままである。二段階の迅速な切断/脱保護手順を用いてメチルホスホネート保護基を取り除き、オリゴヌクレオチドを固体担体から切り離し、N−アシル塩基保護基を除去する。この手順がシアノエチル保護基をアンチセンス鎖上の5’−リン酸塩から取り除くという点に留意する必要がある。さらに、この手順はACEオルトエステルからアシル機能性を取り除き、2’−O−ACE保護基をビス(2−ヒドロキシエチル)オルトエステルに変換する。この新規のオルトエステルは弱酸に対して著しく不安定であり、同様に親ACE基よりも親水性が高い。二段階の手順を以下に手短に示す。
1.担体結合オリゴリボヌクレオチドを、二ナトリウム−2−カルバモイル−2−シアノエチレン−1,1−ジチオレートトリヒドレート含有N,N−ジメチルホルムアミドで処理する。この試薬は、素早くかつ能率的に、ヌクレオチド間リン酸連結からメチル保護基を取り除く。この際、固体担体からオリゴヌクレオチドを切り離すことはない。次に、担体を水で洗浄し、過剰のジチオレートを除去する。
2.オリゴリボヌクレオチドを、室温で、40%(w/v)水溶性メチルアミンを用いて固体担体から切り離す。粗オリゴリボヌクレオチド含有メチルアミン溶液を次に55℃まで加熱して保護基をヌクレオシド塩基から取り除く。粗オルトエステル保護オリゴヌクレオチドを以下の溶媒から真空中で得る。
1.担体結合オリゴリボヌクレオチドを、二ナトリウム−2−カルバモイル−2−シアノエチレン−1,1−ジチオレートトリヒドレート含有N,N−ジメチルホルムアミドで処理する。この試薬は、素早くかつ能率的に、ヌクレオチド間リン酸連結からメチル保護基を取り除く。この際、固体担体からオリゴヌクレオチドを切り離すことはない。次に、担体を水で洗浄し、過剰のジチオレートを除去する。
2.オリゴリボヌクレオチドを、室温で、40%(w/v)水溶性メチルアミンを用いて固体担体から切り離す。粗オリゴリボヌクレオチド含有メチルアミン溶液を次に55℃まで加熱して保護基をヌクレオシド塩基から取り除く。粗オルトエステル保護オリゴヌクレオチドを以下の溶媒から真空中で得る。
2’−オルトエステルの除去は、合成プロセスの最終ステップである。このことは、粗オリゴヌクレオチドを、酢酸およびN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液、pH3.8、55℃で、35分間にわたって処理することで達成される。完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、次に、エタノール沈殿によって脱塩し、さらに遠心によって単離する。
また、ポリヌクレオチドの5’末端での蛍光標識の取り込みは、当業者にとって一般的であり、かつ周知の操作である。一般に、この取り込みを達成するために用いられる方法が2つあり、必要な材料はいくつかの市販元(例えば、Glen Research Inc.,Sterling,Virginia,USA;Molecular Probes Inc.,Eugene,Oregon,USA;TriLink BioTechnologies Inc.,San Diego,California,USA;およびその他)から入手可能である。第1の方法は、蛍光分子を利用するもので、該蛍光分子は、既に述べたヌクレオシドのホスホラミダイト誘導体に類似したホスホラミダイト部分で誘導体化された。そのような場合、この蛍光色素は、鎖アセンブリの最終サイクルで担体結合ポリヌクレオチドに追加される。フルオロフォア修飾ポリヌクレオチドを次に、固体担体から切り離し、前述の標準的手順を用いて脱保護した。この方法を「直接標識(direct labeling)」と呼ぶ。あるいは、上記第2の方法は、ホスホラミダイト部分により誘導体化されるリンカー分子を利用する。その部分は、保護された反応性官能基(例えばアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、その他)を含む。このリンカー分子は、鎖アセンブリの最後のサイクルに、担体結合したポリヌクレオチドに追加される。リンカー修飾ポリヌクレオチドは、それから固体担体から切り離されて、上述の標準的な手順を使用して脱保護される。リンカーの官能基も、標準的な脱保護手順を実施している間、またはそれ以降の基特異的処置を利用することによって脱保護される。粗リンカー修飾ポリヌクレオチドが次にフルオロフォア誘導体で反応を起こす。誘導体は、フルオロフォアの部位とリンカーの官能基との間で共有結合の形成をもたらす。この方法は「間接的標識化(indirect labeling)」と呼ばれている。
一旦合成されるならば、本発明のポリヌクレオチドを直ちに使用してもよく、あるいは将来の使用のために保存してもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを適当な緩衝液中に二本鎖として保存する。多くの緩衝液がsiRNAを保存するのに適していることが当技術分野で知られている。例えば、緩衝液は100mM KCl、30mM HEPES−pH 7.5、および1mM MgC12を含むものであってもよい。好ましくは、本発明のsiRNAは、4℃で1年間そのような緩衝液中で保存された場合、その活性の30%〜100%を保持する。より好ましくは、そのような緩衝液に4℃で1年間保存した場合に、本発明のsiRNAが生物学的活性を80〜100%保持する。あるいは、上記組成物は、そのような緩衝液に−20℃で少なくとも1年以上保存することができる。好ましくは、−20℃での1年以上の保存は、生物学的活性の50%未満の減少を生じる。好ましくは、−20℃での保存による生物学的活性の減少が1年以上後に20%未満である。最も好ましくは、−20℃での1年以上の保存による生物学的活性の減少が10%未満である。
使用前にsiRNAプールの安定性を確実にするために、それらが使用の準備が整うまで、−20℃で乾燥した状態に保つことが可能である。使用前に、再懸濁しなければならないが、一旦再懸濁すると、例えば上述した緩衝液で、使用するまで−20℃に保たなければならない。上述した緩衝液を、使用前に、ほぼ4℃または室温で保存してもよい。形質移入を実施する実効温度は、当業者によく知られており、例えば、室温が挙げられる。
本発明を開発する際に、二種類以上の修飾を、安定性を増加させるために二本鎖に加えた。出願人は、安定性を改善する際の手助けになる他の修飾との組合せが、将来、発見可能であることを理解している。その上、本発明の修飾は、他の目的のために所望である修飾と結合されることができた。例えば、いくつかの例で、1つの修飾は、特定の1組の条件(例えば1種類のヌクレアーゼ)に対して、分子を安定化させることができ、その一方で第2の修飾が条件(例えばヌクレアーゼの異なるファミリー)の第2の組に対して分子を安定化させることができる。あるいは、2つの別々の修飾が、ある種の条件セットの方へ分子を安定させるために、相加的にまたは相乗的に作用することができた。さらに他の例において、1つの修飾は、分子を安定させることができた、しかし、それは他の所望の性質(例えばsiRNAの効力または毒性)上、有害な結果を有する。これらのようなケースにおいて、分子の機能性のこれらの態様を修復する付加的な修飾を加えることができた。
種々のアプローチを、安定性を強化するために必要とされる分子のタイプとキー・ポジションとを同定するのに用いることができる。1つの非限定的な実施例において、修飾−機能ウォークが実行される。この手順では、一つの種類の修飾が、センスおよび/またはアンチセンス鎖をまたがって1つ以上のヌクレオチドに対して加えられる。実質的に、修飾および未修飾を、いくつかの方法の1つによって、(1)機能性および(2)安定性について試験した。したがって、例えば、センスおよび/またはアンチセンス鎖の1および2位、3および4位、5および6位、7および8位、9および10位、11および12位、13および14位、15および16位、17よび18位、または18および19位に対して、2’−O−Me基を付加することができ、さらに機能性(例えば、特異的標的をサイレンシングするそれらの分子の能力)について試験し、作用(例えばヌクレアーゼによる)対して分子を安定化させる。安定性を強化するキーポジションが同定されるが、二本鎖機能性の損失を招く場合、続いて修飾ウォークの第2のラウンドとなることで、二本鎖機能性を高めると思われるミスマッチまたは隆起が起こる付加的な化学基(例えば、アンチセンス鎖上の5’末端の5’リン酸塩)が、安定性を高める修飾を既に含む分子に付加される。
本発明の第13の実施形態は、siRNAに関するもので、該siRNAは、
(a)アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖は第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、その第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
(b)センス鎖であって、該センス鎖は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、を有する。
(a)アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖は第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、その第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
(b)センス鎖であって、該センス鎖は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、を有する。
好ましくは、siRNAは、オーバーハングを除いて、18〜30塩基対、より好ましくは19〜25塩基対、最も好ましくは19〜23塩基対含む。好ましくは、上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、塩基対の範囲にわたって少なくとも実質的に相補的であり、より好ましくはこの範囲にわたって100%相補性を持つ。好ましくは、ポリヌクレオチドがRNAである。
siRNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの5’または3’末端のいずれかにオーバーハングを有するものであってもよい。しかし、好ましくは、任意のオーバーハングが存在する場合、該オーバーハングはセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3’末端にある。さらに、好ましくは任意のオーバーハングが6以下の塩基長、より好ましくは2以下の塩基長である。最も好ましくは、オーバーハング無し、または3’末端でセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方にある2つの塩基のオーバーハングが存在する。オーバーハングしているヌクレオチドは、1種類以上の細胞内酵素プロセスまたはイベントによって頻繁に除去されることから、非リン酸化5’−ヌクレオチドが残り、アンチセンス鎖の5’末端上にオーバーハングを持たないことが好ましい。
第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化は、ヌクレオチドの糖部分の5’炭素に付着した1つ以上のリン酸基の存在に言及するものである。好ましくは、1つのリン酸基のみが存在する。
2’炭素修飾とは、ヌクレオチドの糖部分の2’炭素上にある修飾のことをいう。「第1の2’炭素センス修飾」とは、第1の5’末端センス・ヌクレオチド上にある修飾のことをいう。「第2の2’炭素センス修飾」とは、第2の5’末端センス・ヌクレオチド上にある修飾のことをいう。
化学修飾のRNA−RNA、RNA−DNA、またはDNA−DNA二本鎖に沿ったキーポジションへの追加がこれらの分子の化学的かつ機能的な特性を有意に変えることができることが、知られている。出願人は、修飾をsiRNAのセンス鎖に付加することで、該鎖がRISCに入るのを防ぎ、センス鎖特異的オフ・ターゲット効果を誘導することができることを、理解する。そのような修飾として、任意の数の化学部分を付加することが含まれる。好ましくは、その部分はヌクレオチドのリボース環の2’位(すなわち、2’炭素)に付着される。本発明によれば、好ましくは、上記修飾が2’−O−アルキル基である。しかし、本発明の文脈のなかで使用された場合に、他の修飾がこの鎖によってオフ・ターゲット効果を最小限にする。そのような修飾がオフ・ターゲット効果を最小化する条件の下で含まれる場合、例えば、2’修飾ヌクレオチドを、2’ハロゲン修飾ヌクレオチド、2’アミン修飾ヌクレオチド、および2’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択してもよい。修飾がハロゲンの場合、このハロゲンは好ましくはフッ素である。2’修飾ヌクレオチドが2’アミン修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくは−NH2である。この2’修飾ヌクレオチドが2’−アルキル修飾である場合、好ましくは、その修飾は2’メチル修飾であり、該メチル部分の炭素は糖部分の2’炭素に直接付着する。
上記したように、好ましくは、修飾は2’−O−アルキル基である。より好ましくは、修飾は、2’−O−メチル、2’−O−エチル、2’−O−プロピル、2’−O−イソプロビル、2’−O−ブチル、2’−O−イソブチル、2’−O−メチル−O−メチル(−CH2CH2OCH3)、および2’−O−エチル−OH(−OCH2CH2OH)からなる群から選択される。最も好ましくは、2’−O−アルキル修飾が2’−O−メチル部分である。さらに、修飾が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドの各々で同一である必要はない。しかし、本発明の分子を合成することに関して実用上の観点から、全体として同一の修飾を用いることが求められる場合もある。
上記の修飾は、他のいかなる部分も修飾されないことを示唆していると解釈してはならない。オフ・ターゲット効果を増加させない限り、他の種類の修飾が許される。例えば、いくつかの実施形態で、付加的な修飾を、センス鎖の1、2、3、またはそれ以上の連続的なヌクレオチドまたは1つ置きのヌクレオチドに加えることができる。あるいは、付加的な修飾を、RISC複合体へセンス鎖を入れるためのキーとして同定される特異的な位置に限定することができる。さらに、付加的な2’−O−メチル基(または他の2’修飾)は、センス鎖の一つ以上、好ましくは全てのピリミジン(例えば、Cおよび/またはUヌクレオチド)に加えられることができ、さらに/あるいは2’Fl修飾(または他のハロゲン修飾)をアンチセンス鎖の1つ以上、好ましくは全てのピリミジン(例えば、Cおよび/またはUヌクレオチド)に加えることができる(もし、ハロゲン修飾を以下の第16および第17の実施形態と併用して用いるならば、好ましくは、最初の2つの5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに入るもの以外の全てのピリミジンが、ハロゲン修飾であり、あるいは最初の3つが他の修飾を含むならば、最初の3つの5’末端アンチセンス・ヌクレオチド)。
化学修飾に加えて、100%未満の相同性を共有する標的とのRISC媒介結合に関与するこれらの鎖の能力を変える塩基対のミスマッチまたは隆起(バルジ)をセンスおよび/またはアンチセンス鎖に加えることができると仮定される。そのようなミスマッチの例として(限定されるものではないが)、プリン−ピリミジン・ミスマッチ(例えばG−U,C−A)とプリン−プリンまたはピリミジン−ピリミジン・ミスマッチ(例えばG−A、U−C)が挙げられる。この種の修飾の導入は、上記の修飾と組み合わせることが可能であり、さらにオフ・ターゲット効果を減らすかどうか決定するために、それらを評価すること可能である。
どんな修飾が許されるかについて決定するために、いくつかの非制限アッセイを、オフ・ターゲット効果を制限する修飾を同定するために実行することができる。1つの非限定的例において、センス鎖(試験されている修飾を担持する)を、多くの標識ヌクレオチドのうちの1つで標識さすることができる。その後、結合アッセイを実施して、修飾センス鎖に対するRISCの親和性を未修飾形状のそれと比較することができる。
第14の実施形態によれば、本発明は、ヘアピンをsiRNAを形成することができる単分子のsiRNAに関するもので、該単分子siRNAは、
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、該センス鎖は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
を含む。
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、該センス鎖は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
を含む。
この実施形態によれば、修飾の範囲は第13の実施形態のものと同一である。しかし、ポリヌクレオチドが単分子であり、かつヘアピンを形成することができるが、2本の異なる鎖ではないことから、センス領域とアンチセンス領域との両方を含む連続した1本の分子が存在する。好ましくは、上記センス領域およびアンチセンス領域が少なくとも実質的に相補的であり、より好ましくは100%の相補性を有する。第13の実施形態と同様に、好ましくは、上記センス領域およびアンチセンス領域は18〜30の塩基対、より好ましくは19〜25塩基対、さらに好ましくは19〜25塩基対を含み、最も好ましくは19〜23塩基対を含む。好ましくは、上記ヌクレオチドがRNAである。
本発明にもとづいて、単分子siRNA、特に左回りの(left−handed)単分子構造(例えば、5’−AS−Loop−S)を設計する場合、好ましくは、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補的である塩基から数えて(すなわち、センス領域の3’末端から数えて)、センス領域の第18、第19、または第20の塩基であるヌクレオチドとして定義される。第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、このように定義される。なぜなら、ヘアピンを形成することができる単分子siRNAが細胞に入る場合、典型的には、ダイサー(Dicer)が、約18〜20塩基対の2本の異なる鎖(siRNA)から構成される分子に、長い二本鎖領域を含む絵ヘアピンsiRNAのなかに処理し、この処理された分子の5’末端に結合したセンス鎖修飾をそれらの分子が保持することが求められるからである。最も好ましくは、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、センス領域の3’末端からセンス領域の19番目の塩基であるヌクレオチドとして定義される。さらに、好ましくは、ポリヌクレオチドは、左回りのヘアピンを形成することができる。
上記ヘアピンは、4〜10塩基から構成されるループ構造と、センス領域とを含み、センス領域およびアンチセンス領域は個々に19〜23塩基対長であり、互いに実質的に相補的である。ループ構造の好ましい配列として、例えば、5’−UUCG(配列番号323)、5’−UUUGUGUAG(配列番号324)、および 5’−CUUCCUGUCA(配列番号325)が挙げられる。
ヘアピンは、好ましくは、アンチセンス領域の下流にあるループ領域によって構築される。この構成は、末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化することがより容易なので、この構造が望ましい。このように、単分子siRNAを設計する際、オーバーハングが5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの上流にないことが好ましい。いくつかの実施形態のセンス領域3’末端で、例えば、1、2、または3ヌクレオチドのオーバーハングを有することが望ましい場合もある。さらに、好ましくは、単分子siRNAは左回りのヘアピンを形成することができる。
shRNAは、さらに、ステム領域を含むことができ、該ステム領域は、ループ構造の第5’末端および第3’末端に直接隣接した1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み、さらに該ステム領域の1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが標的特異的(もしくは非標的特異的)である。好ましくは、その単分子siRNAの全長は、100塩基対未満であり、より好ましくは85塩基対未満である。
本発明の単分子siRNAは、最終的には細胞の機能(cellular machinery )によって2本の異なる鎖に変換されるように処理される。さらに、これらの単分子siRNAを、全ての修飾よりも少ないもので細胞に導入してもよく、また導入された天然のプロセスまたはプロセッシング用分子を用いて、細胞自体の中で修飾することも可能である(例えば、細胞内でのリン酸化)。しかし、好ましくは、上記siRNAに対して、既に存在している全ての修飾が導入される(同様に、siRNAが2つの異なる鎖から構成される場合、第1の実施形態の鎖が好ましくは全ての修飾を持つ細胞に導入される。例えば、導入後にリン酸化の基によって修飾され得るにもかかわらず)。
第15の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化するための方法に関し、該方法は、修飾siRNAを標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、さらすことを含み、上記siRNAは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを有し、
(a)上記センス鎖が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
(b)上記アンチセンス鎖が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
を含む。
(a)上記センス鎖が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
(b)上記アンチセンス鎖が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
を含む。
第15の実施形態の修飾siRNAは、好ましくは第13の実施形態のsiRNAである。
第16の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化するための方法に関し、上記方法は、修飾siRNAを標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、ヘアピンを形成することができる単一siRNAをさらすことを含み、上記siRNAは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを有し、
(a)該センス領域は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
(b)上記アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
を含む。
(a)該センス領域は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
(b)上記アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
を含む。
第16の実施形態の修飾siRNAは、好ましくは第14の実施形態のsiRNAである。
他の実施形態では、修飾の組み合わせが以下のように記載されるように、なおも追加の修飾が存在し得る。すなわち、(1)2’修飾基(リボース上の炭素2)によって修飾される鎖の5’から数えて、センス領域(またはshRNAのセンス領域)の1および2位(または1、2、および3位)、(2)2’修飾基(リボース上の炭素2)によって修飾される鎖の5’末端から数えて、センス領域(またはshRNAのアンチセンス領域)の1および2位(または1、2、および3位)、および(3)アンチセンス鎖の5’末端がリン酸化されている(リボースの炭素5)。3種類の修飾全ての組み合わせは、実質的に、センスおよびアンチセンス鎖によって誘導されたオフ・ターゲット効果を減少させる点で有益であると思われる。
第17の実施形態によよれば、本発明はsiRNAを提供するもので、該siRNAは、
(a)アンチセンス鎖であって、上記アンチセンス鎖が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を含み、上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を含み、該第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
(b)センス鎖であって、上記センス鎖が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
を含む。
(a)アンチセンス鎖であって、上記アンチセンス鎖が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を含み、上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を含み、該第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、
(b)センス鎖であって、上記センス鎖が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、
を含む。
この第17の実施形態によれば、上記修飾は、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに2’炭素修飾の付加することで第13の実施形態のものと同様に定義される。あるいは、第2の末端アンチセンス・ヌクレオチド上の2’炭素修飾の付加によって、上記修飾は第13の実施形態のものと同様に定義される。これらの2’炭素修飾は、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドに対する修飾と同じように定義される。さらに、第3の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド上にさらなる2’炭素修飾が存在してもよい。
第18の実施形態によれば、本発明はヘアピンを形成することができる単分子のsiRNA分子を提供する。このsiRNAは、
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を含み、上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を含み、さらに第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、該センス鎖は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、前記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を含み、前記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
から構成される。
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾を含み、上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を含み、さらに第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの5’炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、
(b)センス領域であって、該センス鎖は第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、前記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を含み、前記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を含む、センス領域と、
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、
から構成される。
この18の実施形態によれば、上記修飾は、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドに2’炭素修飾の付加することで第17の実施形態のものと同様に定義される。これらの2’炭素修飾は、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドに対する修飾と同じように定義される。さらに、第3の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド上にさらなる2’炭素修飾が存在してもよい。
第19の実施形態によれば、本発明は、遺伝子サイレンシングの過程でオフ・ターゲット効果を減少させるための方法を提供する。この方法は、第17の実施形態のsiRNAを、標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、投与することを含む。
第20の実施形態によれば、本発明は、遺伝子サイレンシングの過程でオフ・ターゲット効果を減少させるための方法を提供する。この方法は、第18の実施形態のsiRNAを、標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、投与することを含む。
上記の実施形態が増加した特異性を目的とするにもかかわらず、他のパラメータ(例えば、安定性に影響を及ぼす上述のもの)に影響を及ぼすように設計可能である修飾の他の種類やそれらの組合せによって、siRNAが修正される点に注意することは重要である。
しかし、いくつかの安定性指向の修飾は、機能性が制限されたsiRNAを与え、例えば対照またはエクサエクオ剤として使用する以外は使用されない(例えば、センス鎖であって、上記センス鎖が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’−O−アルキル(好ましくはメチル)センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’−O−アルキル(好ましくは、メチル)センス修飾を含む;少なくとも1つの(好ましくは、全ての)2’−O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記少なくとも1つの、好ましくは全ての2’−O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドが、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5’末端センス・ヌクレオチド以外のヌクレオチドである;アンチセンス鎖であって、上記アンチセンス鎖が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’−O−アルキル(好ましくはメチル)アンチセンス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’−O−アルキル(好ましくはメチル)アンチセンス修飾を含む;上記アンチセンス鎖上の2’標識ピリミジン、好ましくは少なくとも1つの2’−O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドであって、上記少なくとも1つの2’−O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドが、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドまたは上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、さらに必要に応じて、蛍光標識等の標識を上記5’末端センス・ヌクレオチドに有する)。
さらに、修飾のいくつかの他の関連した組み合わせを用いて、対照群またはエクサエクオ剤として用いることができるsiRNAを開発することができる。例えば、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化することなく、siRNAまたはshRNAをこの開示で記載される第17および第18の実施形態と同様で開発することができる。したがって、一実施形態下で、(i)各々が2’修飾、例えば上記した2’修飾(例として2’−O−メチル修飾)を各々が含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5’炭素末端センス・ヌクレオチドと、(ii)各々が2’修飾、例えば上記した2’修飾(例として2’−O−メチル修飾)を各々が含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5’炭素末端アンチセンス・ヌクレオチドとに制限される2’修飾がある。
エクサエクオ(exaequo)剤または対照群を用いる場合、ブロック基によりセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の5’末端の5’炭素位を修飾することが求められる場合もある。このブロック基は、例えば、アルキル基または他のいずれかの基であってもよく、ヌクレオチドの5’炭素位のリン酸化を防ぐ。リン酸化は、細胞内に存在するキナーゼの働きによって細胞内で生ずると思われる。典型的なブロック基として、限定されるものではないが、メチル、O−メチル、およびアミン基が挙げられる。
これらの分子は、機能的ではないが、負の対照研究で使用され、またエクサエクオ剤として使用することが可能である。さらに、もし上記した標識等の方式が用いられる場合、これらの薬剤はトラッキング剤として有用であり、形質移入の検出を助けると思われ、さらに細胞内で分子がどこに存在するかの検出も助けるものと思われる。これらの薬剤は、サイレンシングのために用いられないことから、好ましくは18〜30塩基対ではあるが、それらは16〜28塩基対を含むことができる。
さらに、リン酸主鎖に対する安定化修飾は、本発明のいくつかの用途のためにsiRNA内に含めることが可能である。例えば、少なくとも1つのホスホロチオエートおよび/またはメチルホスホネートを、オリゴヌクレオチド主鎖のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖にある、同様に存在しうる任意のオーバーハング、ループ構造、またはステム構造にある、任意の、または全てのピリミジンのいくつかの、または全ての3’位にあるリン酸基と置換してもよい。ホスホロチオエート(およびメチルホスホネート)類似体は、オリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基の修飾から生ずる。ホスホロチオエート内では、リン酸塩O − が硫黄原子に置き換わる。メチルホスホネートでは、酸素がメチル基によって置き換わる。一実施形態では、ホスホロチオエート修飾またはメチルホスホネートは、2’フッ素(または他のハロゲン)修飾ヌクレオチドも含む全てのアンチセンス鎖ヌクレオチドの3’位に置かれている。さらに、ホスホロチオエート3’修飾を、2’フッ素置換の代わりに、および独立して用い、siRNA分子の安定性を高めることが可能である。これらの修飾は、siRNA用途において、本明細書に記載された他の修飾と併用して、あるいはそれらの修飾とは別個に、用いることが可能である。
ヌクレアーゼは、一般に、リン酸塩部分およびリボース環の2’OH位にある酸素基の両方を用いてRNAに対する攻撃を媒介する。複数の酸素の1つに対する硫黄基の置換によって、この反応に参加するリン酸塩の能力が取り除かれ、ヌクレアーゼ消化に対するこの部位の感度が制限される。しかし、ホスホロチオエートが典型的に有毒な点に留意する必要があることから、いかなる毒作用も否定される場合に主に有益であり、例えば、他のヌクレオチド毎、第3のヌクレオチド毎、または第4ののくレオチド毎にこの修飾を用いることを制限することによって、達成しうると考えることができる。
さらに、いくつかの用途では、本発明のヌクレオチドに標識(例えば、蛍光標識、放射性標識、または質量標識)を取り込むことが望ましい場合もある。
本発明の上記修飾は、siRNAと組み合わせてもよく、このsiRNAは、無作為に選択、または、例えば、米国特許出願第10/714,333号に記載されているような論理的設計に基づいて、選択された配列を含む。さらに、細胞の機能(cellular machinery)による処理を促進し得る全体的または部分的な内部熱安定性に基づいて、配列を選択することが望ましい場合もある。
本発明の第13〜20の実施形態を開発する際に、2種類以上の修飾を二本鎖に加えてオフ・ターゲット効果を最小化させた。上記したように、出願人は、オフ・ターゲット効果を最小化する際の手助けになる他の修飾および組合せが、将来、発見可能であることを理解している。その上、本発明の修飾を、他の目的のために望まれる修飾と結合することができた。例えば、いくつかの例で、1つの修飾は、オフ・ターゲット・サイレンシング(例えば、RISCに結合したセンス鎖)の1つの特定のステップに影響を及ぼすことができ、その一方で第2の修飾は、例えば相同性が100%未満である標的と結合するセンス/アンチセンス鎖の能力を変えることなく、異なるステップに完全に影響を及ぼすことができた。あるいは、2つの別々の修飾が同一のステップに影響を及ぼすことができた。いくつかの例では、2つ以上の修飾が、1つ以上のステップでの不要な相互作用またはプロセスを最小化することで、相加的または相乗的に作用して、オフ・ターゲット効果を制限した。さらに他の例において、1つの修飾は、オフターゲット効果を除去することができたが、それは他の所望の性質(例えばsiRNAの効力または安定性)上、有害な結果を有する。これらのようなケースにおいて、分子の機能性のこれらの態様を修復する付加的な修飾を加えることができた。
種々のアプローチを、センスおよび/またはアンチセンス鎖オフ・ターゲット化効果を除去するために必要とされる分子のタイプとキー・ポジションとを同定するのに用いることができる。1つの非限定的な実施例において、修飾−機能ウォークが実行される。この手順では、一つの種類の修飾が、センスおよび/またはアンチセンス鎖をまたがって1つ以上のヌクレオチドに対して加えられる。実質的に、修飾および未修飾を、いくつかの方法の1つによって、(1)機能性および(2)オフ・ターゲット効果について試験した。したがって、例えば、センスおよび/またはアンチセンス鎖の1および2位、3および4位、5および6位、7および8位、9および10位、11および12位、13および14位、15および16位、17よび18位、または18および19位に対して、2’−O−Me基を付加することができ、さらに機能性(例えば、特異的標的をサイレンシングするそれらの分子の能力)とオフ/ターゲット効果(例えば、マイクロアレイ分析による)について試験する。いくつかの、または全てのオフ・ターゲット効果を取り除くキーポジションが同定されるが、二本鎖機能性の損失を招く場合、続いて修飾ウォークの第2のラウンドとなることで、二本鎖機能性を高めると思われるミスマッチまたは隆起が起こる付加的な化学基(例えば、アンチセンス鎖上の5’末端の5’リン酸塩)が、オフ・ターゲット効果を取り除く修飾を既に含む分子に付加される。
本発明の第13〜第20の実施形態の修飾が、用いるsiRNAの機能性に依存して、異なる効果を有することが可能である点に留意する必要がある。このように、高機能的siRNAでは、本発明の修飾は、分子が一定郎の機能性を失う原因になり得るが、それにもかかわらずオフ・ターゲット効果が減少することから望ましい。対照的に、適度または不十分に機能的なsiRNAが使用される場合、機能性の減少はわずかであり、いくつかの例では、機能性を高めることができる。
機能性を保持し、かつ分解に抵抗する本発明のdsRNAの安定性が塩基配列、細胞種、または導入される種に依存することがないことから、本発明は広範囲に及ぶ生物に適用可能であり、該生物として、限定されるものではないが、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス、および菌類が挙げられる。本発明は、牛、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、犬歯、齧歯動物(例えばハムスター)、マウス、およびラット、さらに霊長類(例えばゴリラ、チンパンジー、およびヒト)等の哺乳類での使用にとって特に有利である。
本発明を、多様な細胞型(例えば、限定されるものではないが、一次細胞、生殖細胞系列、および体細胞)で、有利に使うことが可能である。細胞は、例えば、幹細胞または分化した細胞である。例えば、細胞型として、胚細胞、卵母細胞、精細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球(ケラチノサイト)、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、さらに内分泌物または外分泌腺の細胞が挙げられる。
本発明は、幅広い範囲の遺伝子に対するRNA干渉を用いる(および/または対照として用いる)用途に適用可能であり、該遺伝子として、限定されるものではないが、糖尿病、アルツハイマーおよび癌等の疾患に関係するヒトゲノムの45,000遺伝子、さらにヒト、マウス、ハムスター、チンパンジー、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ブタ、イヌ、ネコ、線形動物(例えば線虫C.elegans)、ハエ(例えばキイロショウジョウバエD.melanogaster)、さらに他の脊椎動物および無脊椎動物のゲノムに含まれる全ての遺伝子が挙げられる。
本発明のsiRNAは、任意の方法によって細胞に投与することが可能であり、該方法は、現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法である。例えば、siRNAを受動的に細胞へ送達することが可能である。
修飾siRNAの受動的な取り込みは、例えば、コンジュゲート、例えばセンス鎖の5’末端にあるポリエチレングリコール部分またはコレステロール部分、および/または、適当な状況下で、医薬的に許容される担体の存在によって、調整することができる。
送達のための他の方法として、限定されるものではないが、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム、陽イオン性脂質/リポソーム、マイクロインジェクション、電気穿孔法、免疫沈降法、およびsiRNAと特定のコンジュゲートまたはリガンド(例えば抗体、抗原、もしくは受容体)とのカップリングが挙げられる。
好ましくは、siRNAは、投与される際に二本鎖を含む。
さらに、遺伝子サイレンシングのレベルを評価する方法は制限されない。したがって、任意の所定のsiRNAのサイレンシング能力は、ノーザン分析、ウェスタン分析、PTPCR、発現プロファイリング、その他を含むがこれらの限定されない任意の多数の当該分野で試験された手順のうちの1つによって、研究され得る。
さらに、本発明のsiRNAは、多様な用途の組み合わせに使用することが可能であり、限定されるものではないが、該用途として、基礎研究、創薬および開発、診断、ならびに薬物療法が挙げられる。例えば、本発明を、遺伝子産物が創薬または開発のための標的であるかどうかを確認するのに用いることができる。このような用途では、目的とするところの標的核酸配列に対応するmRNAは、標的にされた分解に関して同定される。特定の遺伝子を標的することに特異的である本発明のsiRNAを細胞または器官、好ましくは二本鎖の形態に導入する。細胞または生体を、標的mRNAの分解を可能とする条件下に保つことで、遺伝子の活性または発現が減少する。遺伝子の発現または活性の減少の程度を測定し、そのような減少発現または活性の効果とともに、測定は、もし発現または活性が減少した場合、目的とする核酸配列が創薬または開発のための作用因子である。このように、表現型的に望ましい効果は、目的とするところの特定の標的核酸のRNA干渉を伴うことがありえ、適当な例では、毒性および薬物動態研究は行わうことができる、治療製剤が開発される。
本発明は、例えば、目的とする疾患または障害の原因または因子と考えられる目的とする標的核酸の活性を減衰させることによって、生体での疾患または障害の一時的または永続的な状態を誘発するRNA干渉の用途にも用いることが可能である。目的とする標的核酸の活動亢進は、疾患または障害をより悪化させ、あるいは場合によっては、目的とするところの疾患または障害を改善するか、治療する傾向がある。同様に、目的とする標的核酸の活性減少によって、疾患または障害が生ずる場合もあり、それによってより悪化したり、場合によっては、改善または治癒する傾向がある。目的とする標的核酸は、ゲノムもしくは染色体核酸または染色体外核酸(例えばウィルス核酸)を含むことができる。
さらに、本発明は、目的とする標的核酸または標的核酸配列の機能を判断するRNA干渉用途で使用することが可能である。例えば、目的とする一定の標的核酸の活動を除外または減少させるノックダウン実験である。このことは、目的とする特定の標的核酸を標的化する1種類以上のsiRNAによるRNA干渉を実行することで、達成することができる。そのようなノックダウンの効果を観察することは、目的とする標的核酸の機能に関する推論を導くことができる。RNA干渉は、対立遺伝子のどちらか一方を有している目的とする標的核酸の活性を弱毒化させ、生体または系に対する効果を観察することで、多形性の効果(例えば双対立形質の多形性)を検討するのに用いられることもできる。治療的に、対立遺伝子の一方または他方、あるいは両方を、選択的な対立遺伝子サイレンシングが望ましいRNA干渉を使用して選択的に対立遺伝子サイレンシングことができる。
さらに、本発明が、疾患の治療、または標的の過剰または過小発現における動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの医薬製造での組成物の使用を含む、診断、予防、および治療等のRNA干渉用途で使用可能である。好ましくは、上記疾患または障害は、1種類以上のタンパク質の機能異常に起因するものであり、その疾患または障害は1種類以上のタンパク質からなる遺伝子産物の発現に関係している。例えば、特定のヒト胸部ガンが一般に「bcl−2」遺伝子として知られている遺伝子から発現されるタンパク質の機能障害に関連があると広く認められる。bcl−2遺伝子に対する1種類以上のsiRNAを使用し、また必要に応じて、薬物が乳癌の処置のために使われる医薬的に許容される担体、希釈剤および/またはアジュバント組み合わせて、薬物を、本発明の組成物および教示に従って製造することができる。出願人は、細胞モデルで方法および組成物の有用性を確立した。ヒトを含む動物の細胞に対するポリヌクレオチド(例えばsiRNA)の送達の方法は、周知である。当技術分野で現在知られている、または知られるであろういっさいの送達ビヒクルであって、siRNA等のポリヌクレオチドをヒト等の動物に導入するための有用性を有する送達ビヒクルは、本発明に従って製造された組成物中に存在しうる任意の修飾にこの送達ヒビクルが不適合でない限り、本発明に従う医薬の製造において有用であることが予測される。本発明によって作られる組成物に適合しない送達ビヒクルは、細胞培養での有効性に対して測定される場合に95%を超えて組成物の有効性を減らすものである。
動物モデルは、例えば、癌、脈管系、先天異常または代謝の疾患を含む多くの、多くの疾患に対して存在する。哺乳類(例えばマウス、ラットまたはヒト以外の霊長類)のような動物で、特定の疾患または障害のために最適投薬計画に到達するための投薬計画で、動物に核酸を投与することは、当業者に周知である。一旦有効性が当業者により、単調な実験によって哺乳類で確立されるならば、ヒト治験の開始の間の投薬計画はそのような研究で達されるデータに基づいて達成することができる。
本発明にもとづいて製造される薬物の投薬量は、被検体のキログラムあたり数マイクログラムから数ミリグラムまで変化する。当技術分野で知られていているように、投薬は投与を受けた哺乳類の質量、用量の投与を受けた哺乳類の性質、疾患または疾患の重症度、さらに、当業者に知られている他のファクターの中で、被験体の血清の薬物の安定性によって変化する。
これらの用途に関して、疾患を有することが疑われる生体または特定の目的とする標的核酸の操作による変調に従う疾患は、siRNAを投与することによって処置される。siRNA処置による結果として、寛解性、一時的な軽減、予防、および/または特定の疾患に対する診断が得られる。好ましくは、siRNAは医薬的に許容される担体または希釈剤で医薬的に許容可能な方法で投与される。
本発明の治療上の適用は、種々の治療組成物および投薬方法によって、実行することができる。医薬的に許容される担体および希釈剤は、当業者に良く知られいる。細胞および生体に対する投与の方法もまた、当業者に周知である。投与計画が、例えば、治療を受ける疾患または障害の反応の重症度および程度次第であることが、知られており、治療の過程は数日から数ヶ月にまで及ぶか、または障害または疾患状態に対して所望の効果が達成されるまでである。siRNAの慢性投与は、いくつかの疾患または障害で持続する所望効果のために必要であることができる。例えば、適当な投与計画は、医薬的に許容可能な送達ルート近傍で、医薬的に許容される担体または希釈剤で1種類以上のsiRNAの変更量を投与することによって決定することができ、レシピエント生体の体内薬物累積値の量は投与の後で種々の時間で測定することができる。同様に、所期の効果(例えば、遺伝子産物または遺伝子活性の発現の抑制の程度)をsiRNAの投与の後で種々の時間に測定することができる、また、このデータは他の薬物動態学的なデータ(例えば生体または器官での蓄積)と相関していることができる。当業者は、最適な投薬量、投与計画、その他を決定することができる。当業者は、ヒトに関する研究ガイド通りに生体内および生体外からEC50を用いることが可能である。
またさらに、本発明をRNA干渉用途(例えば診断法、予防薬、および薬物療法学)で用いることが可能である。これらの用途のために、特定の目的とする標的核酸の操作による変調に従う疾患または障害を有すると疑われる生体が、siRNAを投与することで処置される。siRNA処置の結果は寛解性を示し、一時的軽減、予防的であり、さらに/または特定の疾患もしくは障害の診断となる。好ましくは、siRNAを医薬的に許容される担体または希釈剤で、医薬的に許容される方法で、siRNAが投与される。
さらに、上記siRNAは、局所的にクリームまたは軟膏、経口製剤(例えばカプセルまたは錠剤または懸濁液または溶液など)として適用することがでる。投与経路として、静脈内、筋肉内、経皮、真皮、皮膚、皮下、鼻腔内、経口、直腸、点眼、さらには有利な場所、例えば器官または組織に近い場所、標的となる目的の核酸を持つ細胞種にsiRNAを放出するための装置を組織移植することによってもよい。
別の実施形態によれば、本発明は、siRNA,センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が少なくとも1つのオルトエステル修飾を2’位に有する。
本発明の別の態様にれば、本発明は、siRNAであって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、該アンチセンス鎖が少なくとも1つのオルトエステル修飾および/または2’−ハロゲン修飾、2’−アルキル修飾、2’−O−アルキル修飾、2’−アミン修飾、および2’−デオキシ修飾からなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含む。
別の実施形態によれば、本発明はsiRNAを含み、該siRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖および/またはアンチセンス鎖が、少なくとも1つのオルトエステル修飾を含み、さらに塩基センス鎖および/またはアンチセンス鎖が、2’−ハロゲン修飾、2’−アルキル修飾、2’−O−アルキル修飾、2’−アミン修飾、および2’−デオキシ修飾からなる群から選択される少なくとも1つの2’修飾を含む。
さらに別の実施形態では、本発明は、siRNAを含み、該siRNAは、(a)センス鎖であって、上記センス鎖が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、(b)アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖が第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2’炭素アンチセンス修飾および5’修飾を含み、さらに前記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2’炭素アンチセンス修飾を含む、アンチセンス鎖と、を含む。
さらに別の実施形態では、本発明はsiRNAを含み、該siRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、上記アンチセンス鎖は、少なくとも1つの2’−オルトエステル修飾を含み、また上記アンチセンス鎖は、少なくとも1つの2’−オルトエステル修飾を含み、上記アンチセンス鎖は、さらに、2’−オルトエステル修飾、2’−アルキル修飾、2’−ハロゲン修飾、2’−O−アルキル修飾、2’−アミン修飾、および2’−デオキシ修飾からなる群から選択される1つ以上の修飾によって修飾され、上記2’−アルキル修飾、2’−O−メチル修飾、および2’−ハロゲン修飾がアンチセンス鎖の1つ以上のピリミジン上にあり、さらにsiRNAは、3’キャップを含む。この2’炭素修飾は、例えば、2’−O−メチル修飾等の2’−O−アルキル修飾である。上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび/または第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドは、5’ブロック基によってさらに修飾される。この5’ブロック基は、5’−メチル修飾、5’−O−メチル修飾、および5’−アジド修飾からなる群から選択することができる。
別の実施形態では、上記5’末端センス・ヌクレオチドおよび/または5’末端アンチセンス・ヌクレオチドの第1および第2の2’−O−アルキル修飾は、2’−O−メチル修飾であり、さらに上記第1の5’末端センスおよび/またはアンチセンス・ヌクレオチドは、さらに、5’ブロック基を含むことができる。この5’ブロック基は、5’−メチル修飾、5’−O−メチル修飾、または5’アジド修飾からなる群から選択される。別の実施形態では、本発明は、アンチセンス鎖およびセンス鎖からなるsiRNAを提供するもので、該センス鎖は、第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドは、第1の2’炭素センス修飾を含み、また第2の5’末端センス・ヌクレオチドは第2の2’炭素センス修飾を含む。
他の実施形態では、本発明は、siRNAを提供するもので、該siRNAは、(a)センス鎖であって、該センス鎖が第1の5’末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5’末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5’末端センス・ヌクレオチドが第1の2’炭素センス修飾を含み、また上記第2の5’末端センス・ヌクレオチドが第2の2’炭素センス修飾を含む、センス鎖と、(b)アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖は、第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドは5’リン酸塩修飾を含み、また上記第2の5’末端アンチセンス・ヌクレオチドは2’炭素アンチセンス修飾を含む、アンチセンス鎖と、を含む。
他の実施形態では、本発明の組成物のいずれかが、さらに3’キャップを含む。この3’キャップは、例えば、逆位のデオキシチミジンである。
他の実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも1つの2’−デオキシ修飾および/またはメチルホスホネート・ヌクレオチド間連結を含むことができる。本発明の組成物はまた、1つ以上のピリミジン上に、2’−アルキル修飾、2’−O−アルキル修飾、および2’−ハロゲン修飾から選択される修飾を含む。上記2’−アルキル修飾を2’−メチル修飾、例えば2’−O−メチル修飾とすることができる。上記2’−ハロゲン修飾を、例えば2’−フッ素修飾とすることができる。
他の実施形態では、本発明の上記組成物は、少なくとも1つの2’−アミン修飾および/または2’−ハロゲン修飾を含むことができる。この2’−アミン修飾は、例えば、2’−NH2修飾である。2’−ハロゲン修飾は、例えば、2’−フッ素修飾である。本発明の組成物は、1つ以上の修飾ヌクレオチド間連結を含むことができ、例えば、1つ以上のホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、メチルホスホネート連結、さらにそれらの組み合わせを含むことができる。
本発明の他の実施形態では、上記組成物のいずれかも、コンジュゲートを含むことができる。このコンジュゲートは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。コンジュゲートは、コレステロールまたはPEGであってもよい。コンジュゲートは、さらに、蛍光標識等の標識を含む。この蛍光標識は、TAMRA、BODIPY、Cy3、Cy5、フルオロセイン、およびDabsylからなる群から選択される。あるいは、上記蛍光標識は、当技術分野で公知のいずれかの蛍光標識を用いてもよい。
他の実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも1つの2’−オルトエステル修飾を含み、この2’−オルトエステル修飾が、好ましくは2’−ビス(ヒドロキシエチル)オルトエステル修飾である。
他の実施形態では、本発明の組成物のいずれかがRNA干渉を実施する方法で用いることができ、該方法は、本発明の1種類以上の組成物を細胞に投与することを含む。好ましくは、オルトエステル修飾がsiRNAに存在し、オルトエステル修飾が2’−ビス(ヒドロキシエチル)オルトエステルである。
ある程度の具体性をもって本発明を記載するために、ここで実施例が提供される。これらの実施例は、いかなる形であれ特許請求の範囲の範囲を制限することを意図したものでも制限を加えるものでもない。本発明は以下の実施例への言及を通して容易に理解されるにもかかわらず、それらは本発明を説明するための手段で、特に言及しない限り、本発明を制限することを意図したものではない。
(実施例1)
(siRNAの合成)
RNAオリゴ・ヌクレオチドは、図13に例示したヌクレオチド添加反応サイクルを使用する段階的な方式で合成した。合成は、好ましくは、適切な機械上での自動化プロセスとして行う。いくつかのこのような合成機械は、当業者に周知である。各ヌクレオチドは、固体担体に結合したオリゴ・ヌクレオチドに連続的に加える(3’方位から5’方位)。ポリスチレン担体が好ましいが、いかなる適切な担体を使用してもよい。鎖の3’位末端での第1のヌクレオシドは、固体担体に共有結合的に付着される(固体担体に対する付着)。ヌクレオチド前駆体、ホスホラミダイトやH−ホスホン酸塩などの活性化リボ・ヌクレオチド、およびテトラゾール、たとえば、Sエチル・テトラゾール(他のいかなる適切な活性化因子を使用してもよいが)などの活性化因子を加え(図13のステップi)て、第1のヌクレオシドの5’位末端上へ第2の塩基をカップリングさせる。担体を洗浄し、いかなる未反応の5’ヒドロキシル基も、それだけには限定されないが、例えば無水酢酸やフェノキシ無水酢酸などのアセチル化剤でキャップして未反応5’アセチル部位(moieties)を得る(ステップii)。次いで、たとえば、t−ブチルヒドロペルオキシドやヨウ素などの適切な酸化剤、および水を用いて、P(III)結合を、より安定で最終的に所望のP(V)結合に酸化する(ステップiii)。ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、5’シリル基を、フッ化物イオン(たとえば、フッ化トリエチルアンモニウムまたはフッ化t−ブチルアンモニウム)を用いて切断する(ステップiv)。このサイクルを、後続のヌクレオチドそれぞれに対して繰り返す。図13にはメチル保護基を有するホスホラミダイトを例示するが、ホスホラミダイト部分(moiety)の酸素を保護または置換するために他のいかなる適切な基を用いてもよいことを強調すべきである。たとえば、アルキル基、シアノエチル基、またはチオ誘導体をこの位置で使用してもよい。さらに、ステップ(i)に入る活性化ヌクレオシドは、異なる種類の活性化のヌクレオシド(例えばH−ホスホン酸塩、メチルホスホラミダイト、またはチオホスホラミダイト)であってもよい。担体に取り付けた初期または3’位のヌクレオシドは、シリル基よりむしろジメトキシトリチル基などの異なる5’位保護基を有することができることに留意すべきである。標準のDNA合成化学に使用されるとき、ジメトキシトリチル基の切断は酸水解を必要とする。すなわち、ジクロロ酢酸(DCA)やトリクロロ酢酸(TCA)などの酸は、このステップのために単独で使用される。DCA切断ステップとは別に、このサイクルを、所望のポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数繰り返す。
(siRNAの合成)
RNAオリゴ・ヌクレオチドは、図13に例示したヌクレオチド添加反応サイクルを使用する段階的な方式で合成した。合成は、好ましくは、適切な機械上での自動化プロセスとして行う。いくつかのこのような合成機械は、当業者に周知である。各ヌクレオチドは、固体担体に結合したオリゴ・ヌクレオチドに連続的に加える(3’方位から5’方位)。ポリスチレン担体が好ましいが、いかなる適切な担体を使用してもよい。鎖の3’位末端での第1のヌクレオシドは、固体担体に共有結合的に付着される(固体担体に対する付着)。ヌクレオチド前駆体、ホスホラミダイトやH−ホスホン酸塩などの活性化リボ・ヌクレオチド、およびテトラゾール、たとえば、Sエチル・テトラゾール(他のいかなる適切な活性化因子を使用してもよいが)などの活性化因子を加え(図13のステップi)て、第1のヌクレオシドの5’位末端上へ第2の塩基をカップリングさせる。担体を洗浄し、いかなる未反応の5’ヒドロキシル基も、それだけには限定されないが、例えば無水酢酸やフェノキシ無水酢酸などのアセチル化剤でキャップして未反応5’アセチル部位(moieties)を得る(ステップii)。次いで、たとえば、t−ブチルヒドロペルオキシドやヨウ素などの適切な酸化剤、および水を用いて、P(III)結合を、より安定で最終的に所望のP(V)結合に酸化する(ステップiii)。ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、5’シリル基を、フッ化物イオン(たとえば、フッ化トリエチルアンモニウムまたはフッ化t−ブチルアンモニウム)を用いて切断する(ステップiv)。このサイクルを、後続のヌクレオチドそれぞれに対して繰り返す。図13にはメチル保護基を有するホスホラミダイトを例示するが、ホスホラミダイト部分(moiety)の酸素を保護または置換するために他のいかなる適切な基を用いてもよいことを強調すべきである。たとえば、アルキル基、シアノエチル基、またはチオ誘導体をこの位置で使用してもよい。さらに、ステップ(i)に入る活性化ヌクレオシドは、異なる種類の活性化のヌクレオシド(例えばH−ホスホン酸塩、メチルホスホラミダイト、またはチオホスホラミダイト)であってもよい。担体に取り付けた初期または3’位のヌクレオシドは、シリル基よりむしろジメトキシトリチル基などの異なる5’位保護基を有することができることに留意すべきである。標準のDNA合成化学に使用されるとき、ジメトキシトリチル基の切断は酸水解を必要とする。すなわち、ジクロロ酢酸(DCA)やトリクロロ酢酸(TCA)などの酸は、このステップのために単独で使用される。DCA切断ステップとは別に、このサイクルを、所望のポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数繰り返す。
合成の後に、リン酸塩上の保護基(図13ではメチル基として示したが、必ずしもメチル基に限定されない)を、DMF(ジメチルホルムアミド)中1モル濃度の二ナトリウム−2−カルバモイル−2−シアノエチレン−1,1−ジチオレート三水和物(ジチオラート)を用いて30分で切断する。この脱保護溶液は、水を使用している固体担体に結合したオリゴ・ヌクレオチドで洗浄する。次いで、担体を、55℃で20分間40%のメチルアミンで処置する。これによって、RNAオリゴヌクレオチドを溶液中に放出し、環外アミンを脱保護(deprotect)し、かつ、2’ACE基上のアセチル保護を除去する。オリゴヌクレオチドは、この段階で陰イオン交換型HPLC(高速液体クロマトグラフィ)によって分析することができる。
除去が所望される場合、2’オルトエステル基は、除去される最後の保護基である。2’脱保護の直前の2’ACEで保護されたRNAの構造は、図14に示すとおりである。
自動化処理の場合、最初のヌクレオシドを有する固体担体を、合成装置に取り付ける。この装置は、合成のために必要とされる全ての必要な補助剤と単量体を含む。試薬は不活性ガス下に維持する。というのは、不活性ガス下に維持しない場合、いくつかの単量体は加水分解するおそれがあるからである。全てのラインを試薬で充填するように装置を準備する。合成サイクルに従って正しい順序の試薬の分配を規定する合成サイクルを設計して、図13で指定される順序で試薬を分配する。サイクルが一旦規定されると、加えるべき各試薬の量が規定され、ステップ間の時間が規定され、かつ洗浄ステップが規定され、また、最初のヌクレオシドを有する固体担体が一旦加えられると合成が進行する準備ができる。
本明細書に記載されたRNA類似体に関して、修飾は、3つの異なる一般的な方法で実施される。第1は、炭水化物および塩基修飾に関して実施されるもので、同様にある種のリンカーおよびコンジュゲートの導入に対しても実施され、修飾が既に存在する修飾ホスホラミダイトを用いる。このような修飾の例は、炭水化物2’位の修飾種(2’−F、2’−NH2、2’−O−アルキル、等)であり、2’位のオルトエステルが、所望の修飾で置換されている。フルオロセイン誘導体、ダブシル(Dabsyl)、コレステロール、シアニン誘導体、またはポリエチレン・グリコールなどの3’位または5’位末端修飾もまた、導入することができる。特定のヌクレオチド間結合修飾もまた、入って来る反応性ヌクレオシド介在物を介して導入される。得られるヌクレオチド間結合修飾の例は、限定されるものではないがメチルホスホン酸塩、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートを含む。
同じまたは類似のサイクルを用いて、多くの修飾因子を、使用することができる。このクラスの例は、たとえば、2‐アミノプリン、5−メチルシチジン、5−アミノアリルウリジン、ジアミノプリン、2−O−アルキル、マルチ原子スペーサー類、単一の単量体スペーサー、2’アミノヌクレオシド、2’フッ化ヌクレオシド、5−ヨードウリジン、4−チオウリジン、アクリジン、5−ブロモウリジン、5−フルオロシチジン、5−フルオロウリジン、5−ヨードウリジン、5−ヨードシチジン、5−ビオチンチミジン、5−フルオロセインチミジン、イノシン、プソイドウリジン、脱塩基単量体、ネブラリン(nebularane)、デアザヌクレオシド、ピレンヌクレオシド、アザヌクレオシド等を含む。しばしば、合成における残りのステップは、標準の脱保護条件になりやすい置換基を導入する修飾を除き同じままである。ここでは、修飾条件は、置換基に影響を及ぼさないものが使用される。第2の、特定のヌクレオチド間結合修飾は、それらの導入を可能にする酸化ステップの変更を要求する。このクラスの例は、元素硫黄または別の適切な硫黄移動剤による酸化剤が必要であるホスホロチオエート類とホスホロジチオエート類を含む。第3の、特定のコンジュゲートと修飾は、「後合成工程」により導入され、そこで、固相合成が完了した後、所望の分子が生体高分子に加えられる。これの例は、ポリエチレングリコールを、炭化水素リンカーに付着した一級アミンを含む予備合成されたオリゴヌクレオチドに添加することである。この場合の取付けは、溶液相反応でポリエチレングリコールのN−ヒドロキシサクシニミジル(succinimidyl)エステルを用いて、実現することができる。
ここで、合成RNAとその類似体の合成のための最も好ましい方法を概説してきたが、これらの分子をアセンブルすることができるいかなる核酸合成法もそれらのアセンブリに使用することができるはずである。代替方法の例には、5’DMT−2’TBDMSおよび5’DMT−2’TOMの合成手法を含む。いくつかの2’−O−メチル、2’−F、および主鎖修飾は、たとえば、修飾型および野生型T7、ならびにSP6ポリメラーゼを用いる転写反応に導入することができる。
(修飾RNAを合成すること)
以下のガイドラインは、修飾RNAの合成のために提供し、当技術分野で知られているいかなる自動合成器にも容易に適合することができる。
以下のガイドラインは、修飾RNAの合成のために提供し、当技術分野で知られているいかなる自動合成器にも容易に適合することができる。
(3’位末端修飾)
3’位修飾を組み込むためのいくつかの方法がある。3’位修飾は、当技術分野で周知の方法を用いて、選択された固体担体上へ固着または「搭載(load)」することができる。代替として、3’位修飾を、ホスホラミダイトとして使用することができる。このホスホラミダイトは、標準の合成方法を用いて一般的な担体にカップリングさせ、この一般的な担体は、所望の末端修飾の活性化ホスホラミダイトを導入することによって3’位末端修飾が生成されるヒドロキシルを提供する。代替として、ポリヌクレオチドが固体担体から除去された後、後合成的に3’位修飾を導入することもできる。遊離ポリヌクレオチドは、最初は、選択された修飾の適切に活性化された形態と反応する3’位末端のヒドロキシルアミノ、チオール、またはハロゲンを有する。例は、それだけには限定されないが、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、チオエーテル、ジスルフィド、マレイミド(maliemido)またはハロアルキルの反応を含む。この修飾は、今や、ポリヌクレオチドの3’位末端になる。後合成的にコンジュゲート化することができる修飾の例は、それだけには限定されないが、フルオロセイン(fluoroscein)類、アクリジン類、TAMRA、ダブシル(dabsyl)、コレステロール、ポリエチレングリコール類、マルチ原子スペーサー類(multi−atom spacer)、シアニン類、脂質類、炭水化物類、脂肪酸類、ステロイド類、ペプチド類、またはポリペプチド類であってもよい。
3’位修飾を組み込むためのいくつかの方法がある。3’位修飾は、当技術分野で周知の方法を用いて、選択された固体担体上へ固着または「搭載(load)」することができる。代替として、3’位修飾を、ホスホラミダイトとして使用することができる。このホスホラミダイトは、標準の合成方法を用いて一般的な担体にカップリングさせ、この一般的な担体は、所望の末端修飾の活性化ホスホラミダイトを導入することによって3’位末端修飾が生成されるヒドロキシルを提供する。代替として、ポリヌクレオチドが固体担体から除去された後、後合成的に3’位修飾を導入することもできる。遊離ポリヌクレオチドは、最初は、選択された修飾の適切に活性化された形態と反応する3’位末端のヒドロキシルアミノ、チオール、またはハロゲンを有する。例は、それだけには限定されないが、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、チオエーテル、ジスルフィド、マレイミド(maliemido)またはハロアルキルの反応を含む。この修飾は、今や、ポリヌクレオチドの3’位末端になる。後合成的にコンジュゲート化することができる修飾の例は、それだけには限定されないが、フルオロセイン(fluoroscein)類、アクリジン類、TAMRA、ダブシル(dabsyl)、コレステロール、ポリエチレングリコール類、マルチ原子スペーサー類(multi−atom spacer)、シアニン類、脂質類、炭水化物類、脂肪酸類、ステロイド類、ペプチド類、またはポリペプチド類であってもよい。
(5’位末端修飾)
5’位修飾をポリヌクレオチド内に導入するいくつかの方法がある。例えば、5’修飾を有するヌクレオチドは購入することができ、そしてその後ホスホラミダイトで活性化することができる。5’位修飾を有するこのホスホラミダイトも、商業的に入手可能である。次いで、5’位修飾を有する活性化ヌクレオシドを、他のいかなる活性化ヌクレオシドも使用できるのと同様にサイクルに使用する。しかし、全ての5’位修飾が、ホスホラミダイトとして使われる訳ではない。このような場合には、5’位修飾は、3’位修飾の場合に上記で記載した類似の方法で導入することができる。
5’位修飾をポリヌクレオチド内に導入するいくつかの方法がある。例えば、5’修飾を有するヌクレオチドは購入することができ、そしてその後ホスホラミダイトで活性化することができる。5’位修飾を有するこのホスホラミダイトも、商業的に入手可能である。次いで、5’位修飾を有する活性化ヌクレオシドを、他のいかなる活性化ヌクレオシドも使用できるのと同様にサイクルに使用する。しかし、全ての5’位修飾が、ホスホラミダイトとして使われる訳ではない。このような場合には、5’位修飾は、3’位修飾の場合に上記で記載した類似の方法で導入することができる。
(チオエート)
ホスホロチエート結合などの1つまたは複数のチオエート部分を有するポリヌクレオチドを、上記で説明しかつ図13に例示した合成サイクルに従って作製した。しかし、t−ブチルヒドロペルオキシドの酸化ステップの代わりに、元素硫黄または別の硫化剤を使用した。
ホスホロチエート結合などの1つまたは複数のチオエート部分を有するポリヌクレオチドを、上記で説明しかつ図13に例示した合成サイクルに従って作製した。しかし、t−ブチルヒドロペルオキシドの酸化ステップの代わりに、元素硫黄または別の硫化剤を使用した。
(5’位チオ修飾)
5’位チオールを有する単量体は、グレン・リサーチ(Glen Research)などの商業的な供給元から、ホスホラミダイトとして購入することができる。これらの5’位チオール修飾単量体は、一般的に、トリチル保護基を担持する。合成の後に、このトリチル基は当技術分野で周知のいかなる方法によっても除去することができる。
5’位チオールを有する単量体は、グレン・リサーチ(Glen Research)などの商業的な供給元から、ホスホラミダイトとして購入することができる。これらの5’位チオール修飾単量体は、一般的に、トリチル保護基を担持する。合成の後に、このトリチル基は当技術分野で周知のいかなる方法によっても除去することができる。
(他の修飾)
特定の修飾のために、この合成サイクルの諸ステップは、いくらか変わる。たとえば、3’の末端が逆位のチミジン(dT)を有する場合(第1の塩基が5’水酸基によって固体担体に付着され、第1のカップリングが3’−3’結合である)では、脱トリチル化およびカップリングがより緩やかに生じるので、ジクロロ酢酸(DCA)などの過剰な脱トリチル化剤を用いるべきであり、カップリング時間を300秒まで増加させるべきである。いくらかの5’修飾は、長いカップリング時間を必要とすることある。例は、コレステロールと、Cy3またはCy5ビオチンのようなフルオロフォア、ダブシル(dabsyl)、アミノリンカー類、チオリンカー類、スペーサー類、ポリエチレングリコール、リン酸化剤、BODIPYまたは光切断可能なリンカーなどを含む。
特定の修飾のために、この合成サイクルの諸ステップは、いくらか変わる。たとえば、3’の末端が逆位のチミジン(dT)を有する場合(第1の塩基が5’水酸基によって固体担体に付着され、第1のカップリングが3’−3’結合である)では、脱トリチル化およびカップリングがより緩やかに生じるので、ジクロロ酢酸(DCA)などの過剰な脱トリチル化剤を用いるべきであり、カップリング時間を300秒まで増加させるべきである。いくらかの5’修飾は、長いカップリング時間を必要とすることある。例は、コレステロールと、Cy3またはCy5ビオチンのようなフルオロフォア、ダブシル(dabsyl)、アミノリンカー類、チオリンカー類、スペーサー類、ポリエチレングリコール、リン酸化剤、BODIPYまたは光切断可能なリンカーなどを含む。
ポリヌクレオチドが一つの修飾だけを有する場合、この修飾は、部分的に構築されたポリヌクレオチドをその上に有した担体を取り出し、修飾を有する単量体を手動でカップリングし、次いで自動合成器中に担体を再び配置し、そして自動合成を再開することによって、手動で最も効率的に実施することができることに留意すべきである。
(実施例2)
(担体からの合成オリゴの脱保護および切断)
切断は、手動で、または機械上で自動化したプロセスで行った。ヌクレオチド間連結からの保護部分、例えばメチル基、の切断は、当技術分野で知られているいかなる適当な切断試薬、例えばジチオレートまたはチオフェノール、を使用することによって達成することができる。DMF中1モルのジチオレートを室温で10〜20分間にわたって固体担体に加える。次いで担体を、例えばDMFで、それから水、そしてアセトニトリルで完全に洗浄する。別法として、水での洗浄、それに引く完全なアセトニトリルでの洗浄は、いかなる残留ジチオレートを除去するのにも十分である。
(担体からの合成オリゴの脱保護および切断)
切断は、手動で、または機械上で自動化したプロセスで行った。ヌクレオチド間連結からの保護部分、例えばメチル基、の切断は、当技術分野で知られているいかなる適当な切断試薬、例えばジチオレートまたはチオフェノール、を使用することによって達成することができる。DMF中1モルのジチオレートを室温で10〜20分間にわたって固体担体に加える。次いで担体を、例えばDMFで、それから水、そしてアセトニトリルで完全に洗浄する。別法として、水での洗浄、それに引く完全なアセトニトリルでの洗浄は、いかなる残留ジチオレートを除去するのにも十分である。
担体からのポリヌクレオチドの切断および環外塩基保護の除去は、40%のN−メチルアミン(NMA)水溶液を用いて、引き続き20分間にわたって55℃まで加熱することによって行うことができる。一旦、ポリヌクレオチドが溶液中に存在したら、固体担体からNMAを慎重に除去する。次いで、ポリヌクレオチドを含有する溶液を、真空下でNMAを除去するまで乾燥させる。二本鎖化(duplexing)、脱塩、ゲル精製、品質制御などを含むさらなる加工処理は、当技術分野で知られているいかなる方法によっても実施することができる。
いくつかの修飾のために、NMAステップを変更してもよい。例えば、3’アミノ修飾については、NMAでの処理は55℃で40分間にしなければならない。ピューロマイシン、5’末端アミノ結合修飾、および2’アミノヌクレオシド修飾は、40%のNMAを追加した後、1時間にわたって加熱する。Cy5で修飾したオリゴヌクレオチドは、遮光しながら、24時間にわたって水酸化アンモニウムで処理する。
(切断試薬の調製)
HPLC等級の水および合成等級のアセトニトリルを使用する。ジチオレートは、結晶として予め調製されたものである。4.5グラムのジチオレート結晶を90mLのDMFに添加する。40パーセントのNMAは、Sigma Aldrich社などの供給元から、購入することができ、使用の準備ができている。
HPLC等級の水および合成等級のアセトニトリルを使用する。ジチオレートは、結晶として予め調製されたものである。4.5グラムのジチオレート結晶を90mLのDMFに添加する。40パーセントのNMAは、Sigma Aldrich社などの供給元から、購入することができ、使用の準備ができている。
(一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリング)
一本鎖(Single stranded)ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られているいかなる方法によって、いかなる適当な緩衝液を使用してもアニールすることができる。例えば、等しい量の各々の鎖を、適当な緩衝液、例えば、50mMのHEPES pH7.5、100mMの塩化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、に混合することができる。混合物を1分間にわたって90℃で加熱し、室温まで冷却する。他の例では、それぞれ50ミクロモル濃度となるように、各ポリヌクレオチドを別々に調製する。次いで、30ミクロリットルの各々のポリヌクレオチド溶液を、15マイクロリットルのアニーリング緩衝液(×5)と一緒に管に加える。ここで、アニーリング緩衝液の最終濃度は、100mMの塩化カリウム、30mMのHEPES−KOH pH7.4、および2mMの塩化マグネシウムである。最終的な体積は75ミクロリットルである。次いで溶液を、90℃で1分間にわたってインキュベートし、15秒間にわたって遠心機で回転させ、1時間にわたって37℃でインキュベートした後に、室温に戻す。次いで溶液を、マイナス20℃で冷凍貯蔵し、5回まで凍結融解させることができる。二本鎖の最終濃度は、20マイクロモルである。ポリヌクレオチド貯蔵のための適当な緩衝液の例は、20mMのKCl、6mMのHEPES pH7.5、0.2mMのMgCl 2である。使用される全ての緩衝液は、RNaseを含まないものでなければならない。
一本鎖(Single stranded)ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られているいかなる方法によって、いかなる適当な緩衝液を使用してもアニールすることができる。例えば、等しい量の各々の鎖を、適当な緩衝液、例えば、50mMのHEPES pH7.5、100mMの塩化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、に混合することができる。混合物を1分間にわたって90℃で加熱し、室温まで冷却する。他の例では、それぞれ50ミクロモル濃度となるように、各ポリヌクレオチドを別々に調製する。次いで、30ミクロリットルの各々のポリヌクレオチド溶液を、15マイクロリットルのアニーリング緩衝液(×5)と一緒に管に加える。ここで、アニーリング緩衝液の最終濃度は、100mMの塩化カリウム、30mMのHEPES−KOH pH7.4、および2mMの塩化マグネシウムである。最終的な体積は75ミクロリットルである。次いで溶液を、90℃で1分間にわたってインキュベートし、15秒間にわたって遠心機で回転させ、1時間にわたって37℃でインキュベートした後に、室温に戻す。次いで溶液を、マイナス20℃で冷凍貯蔵し、5回まで凍結融解させることができる。二本鎖の最終濃度は、20マイクロモルである。ポリヌクレオチド貯蔵のための適当な緩衝液の例は、20mMのKCl、6mMのHEPES pH7.5、0.2mMのMgCl 2である。使用される全ての緩衝液は、RNaseを含まないものでなければならない。
(オルトエステル部分の除去)
所望する場合、オルトエステル部分またはその複数部分は、当技術分野で知られているいかなる適当な方法によっても、ポリヌクレオチドから除去することができる。そのような方法は、揮発性の酢酸テトラメチレンジアミン(TEMED)pH3.8緩衝系を使用する。その緩衝系はオルトエステル部分またはその複数部分の除去後に凍結乾燥によって除去することができる。3.0を超えるpHでの脱保護は、リン酸ジエステル主鎖の酸触媒による切断の可能性を最小にする助けとなる。例えば、脱保護は、オルトエステルで保護されているポリヌクレオチドを懸濁させ、60℃で30分間にわたってインキュベートすることによって、TEMEDでpHを3.8に調節した100mMの酢酸を使用して達成することができる。溶液を次いで、凍結乾燥させるか、使用前に乾燥させるために素早く真空下(SpeedVac)におく。必要に応じて、脱保護後の脱塩は、当技術分野で知られているいかなる方法、例えば逆相カートリッジのエタノール沈殿または脱塩、によって実施することができる。
所望する場合、オルトエステル部分またはその複数部分は、当技術分野で知られているいかなる適当な方法によっても、ポリヌクレオチドから除去することができる。そのような方法は、揮発性の酢酸テトラメチレンジアミン(TEMED)pH3.8緩衝系を使用する。その緩衝系はオルトエステル部分またはその複数部分の除去後に凍結乾燥によって除去することができる。3.0を超えるpHでの脱保護は、リン酸ジエステル主鎖の酸触媒による切断の可能性を最小にする助けとなる。例えば、脱保護は、オルトエステルで保護されているポリヌクレオチドを懸濁させ、60℃で30分間にわたってインキュベートすることによって、TEMEDでpHを3.8に調節した100mMの酢酸を使用して達成することができる。溶液を次いで、凍結乾燥させるか、使用前に乾燥させるために素早く真空下(SpeedVac)におく。必要に応じて、脱保護後の脱塩は、当技術分野で知られているいかなる方法、例えば逆相カートリッジのエタノール沈殿または脱塩、によって実施することができる。
(実施例3)
(RNA干渉での使用に向けて合成したsiRNA)
以下は、Dharmacon社の登録商標のACE試薬を使用して合成され、設計され、ここに記載される本発明に従って使用される、ジdTオーバーハングを有する19量体のsiRNAのリストである。「SEAP」は、人間の分泌されたアルカリホスファターゼを意味する。「ヒト・シクロ」は、ヒト・シクロフィリンを意味する。ヌクレオチド単位間の星印は、ホスホロチオエート結合である修飾ヌクレオチド間連結を意味する。構造2’−F−Cまたは2’−F−Uは、リボシル部分の2’炭素に付着したフッ素を有するヌクレオチド単位を意味する。構造2’−N−Cまたは2’−N−Uは、リボシル部分の2’炭素に付着した−NH2基を有するヌクレオチド単位を意味する。構造2’−OME−Cまたは2’−OME−Uは、CsまたはUsのいずれかのリボシル部分の2’炭素で、それぞれ2’−O−メチル修飾がむき出しになった(baring)ヌクレオチド単位を意味する。dG、dU、dA、dC、およびdTは、2’位に関してデオキシであり、代わりにリボシル部分の2’炭素に付着した水素を有するヌクレオチド単位を意味する。特に記載されない限り、以下のリストにある全てのヌクレオチド単位は、2’炭素に−OHを有するリボシルである。
(RNA干渉での使用に向けて合成したsiRNA)
以下は、Dharmacon社の登録商標のACE試薬を使用して合成され、設計され、ここに記載される本発明に従って使用される、ジdTオーバーハングを有する19量体のsiRNAのリストである。「SEAP」は、人間の分泌されたアルカリホスファターゼを意味する。「ヒト・シクロ」は、ヒト・シクロフィリンを意味する。ヌクレオチド単位間の星印は、ホスホロチオエート結合である修飾ヌクレオチド間連結を意味する。構造2’−F−Cまたは2’−F−Uは、リボシル部分の2’炭素に付着したフッ素を有するヌクレオチド単位を意味する。構造2’−N−Cまたは2’−N−Uは、リボシル部分の2’炭素に付着した−NH2基を有するヌクレオチド単位を意味する。構造2’−OME−Cまたは2’−OME−Uは、CsまたはUsのいずれかのリボシル部分の2’炭素で、それぞれ2’−O−メチル修飾がむき出しになった(baring)ヌクレオチド単位を意味する。dG、dU、dA、dC、およびdTは、2’位に関してデオキシであり、代わりにリボシル部分の2’炭素に付着した水素を有するヌクレオチド単位を意味する。特に記載されない限り、以下のリストにある全てのヌクレオチド単位は、2’炭素に−OHを有するリボシルである。
(RNA干渉の実施)
(形質移入)
siRNA二本鎖を、標準の緩衝液(50ミリモルのHEPES pH7.5、100ミリモルのKCl、1mMのMgCl2)を使用してアニールした。形質移入は、後述する標準プロトコルに従って行う。
(96穴プレートおよび6穴プレートのための標準形質移入プロトコル:siRNA)
1.293およびCalu6のためのプロトコル、HeLa、MDA 75は同一である。
2.細胞は、形質移入の日に95%の集密的であるように平板培養される。
3.SuperRNAsin(Ambion)が、RNAsesに対する防御のために形質移入混合物に加えられる。
4.全ての溶液と取扱いは、RNAseを含まない条件下で実施しなければならない。
プレート1 小さなフラスコにおいて25ml媒体の0.5〜1ml、または大きいフラスコにおいて50ml媒体の1ml。
1.293およびCalu6のためのプロトコル、HeLa、MDA 75は同一である。
2.細胞は、形質移入の日に95%の集密的であるように平板培養される。
3.SuperRNAsin(Ambion)が、RNAsesに対する防御のために形質移入混合物に加えられる。
4.全ての溶液と取扱いは、RNAseを含まない条件下で実施しなければならない。
プレート1 小さなフラスコにおいて25ml媒体の0.5〜1ml、または大きいフラスコにおいて50ml媒体の1ml。
(96穴プレート)
1.3mlの0.05%トリプシン−EDTAを培養フラスコ(6インチ大)に添加して5分間、37℃でインキュベート。
2.7ml(14ml大)の通常培地の添加およびピペッティング10回繰り返して、細胞を再懸濁。
3.ステップ2から細胞懸濁液を25マイクロリットル採取し、75マイクロリットルのトリパンブルー染色(1:4)および細胞カウンターに10マイクロリットル入れる。
4.標準血球計算板で細胞数を計数。
5.細胞平均数x4x10000は、1mlあたりの細胞数。
6.通常培地で希釈して350000/mlにする。
7.100マイクロリットル(HEK293では35,000細胞)を96穴プレートにプレーティング。
1.3mlの0.05%トリプシン−EDTAを培養フラスコ(6インチ大)に添加して5分間、37℃でインキュベート。
2.7ml(14ml大)の通常培地の添加およびピペッティング10回繰り返して、細胞を再懸濁。
3.ステップ2から細胞懸濁液を25マイクロリットル採取し、75マイクロリットルのトリパンブルー染色(1:4)および細胞カウンターに10マイクロリットル入れる。
4.標準血球計算板で細胞数を計数。
5.細胞平均数x4x10000は、1mlあたりの細胞数。
6.通常培地で希釈して350000/mlにする。
7.100マイクロリットル(HEK293では35,000細胞)を96穴プレートにプレーティング。
(2×96穴プレート(60穴フォーマット)に対する形質移入)
1.OPTI−MEM 2 ml + 80マイクロリットルのLipofectamine 2000(1:25)+ 15マイクロリットルのSuperRNAsin(AMBION)。
2.等分量(アリコート)のsiRNA(スクリーニング用100マイクロモル、0.8マイクロリットル(全希釈比は、1:750、0.8マイクロリットルの100マイクロモル溶液で最終濃度100ナノモルを得る)を所望のオーダーで深皿に移す(通常、60穴フォーマットに対して3カラムx6、または96穴に対して4カラムx8)。
3.100マイクロリットルのOPT1−MEMを移す。
4.Lipofectamine 2000およびSuperRNAsinとともに100マイクロリットルのOPT1−MEMを各ウエルに移す。
5.室温(RT)に20〜30分放置。
6.各ウエルに0.55mlの通常培地を添加。プレートをフィルムで覆って混合。
7.100x3x2を直接、細胞に対してアレイ・アウト(2枚のプレートに十分)。
1.OPTI−MEM 2 ml + 80マイクロリットルのLipofectamine 2000(1:25)+ 15マイクロリットルのSuperRNAsin(AMBION)。
2.等分量(アリコート)のsiRNA(スクリーニング用100マイクロモル、0.8マイクロリットル(全希釈比は、1:750、0.8マイクロリットルの100マイクロモル溶液で最終濃度100ナノモルを得る)を所望のオーダーで深皿に移す(通常、60穴フォーマットに対して3カラムx6、または96穴に対して4カラムx8)。
3.100マイクロリットルのOPT1−MEMを移す。
4.Lipofectamine 2000およびSuperRNAsinとともに100マイクロリットルのOPT1−MEMを各ウエルに移す。
5.室温(RT)に20〜30分放置。
6.各ウエルに0.55mlの通常培地を添加。プレートをフィルムで覆って混合。
7.100x3x2を直接、細胞に対してアレイ・アウト(2枚のプレートに十分)。
(2×6穴プレートに対する形質移入)
8.8ml OPTI−MEM +160マイクロリットル Lipofectamine 2000(1:25)、30マイクロリットルのSuperRNAsin(AMBION)。
9.等分量のsiRNA(全希釈比は、1:750、5マイクロリットルの100マイクロモル溶液によって最終濃度100ナノモルを得る)をポリスチレン管に移す。
10. Lipofectamine 2000およびSuperRNAsin(AMBION)とともに1,300マイクロリットルのOPT1−MEMを移す。
11.室温(RT)で20〜30分間放置。
12.各ウエルに0.55mlの通常培地を添加。プレートをフィルムで覆って混合。
13.2mlを各ウェルに移す(2ウエルにとって十分)。
8.8ml OPTI−MEM +160マイクロリットル Lipofectamine 2000(1:25)、30マイクロリットルのSuperRNAsin(AMBION)。
9.等分量のsiRNA(全希釈比は、1:750、5マイクロリットルの100マイクロモル溶液によって最終濃度100ナノモルを得る)をポリスチレン管に移す。
10. Lipofectamine 2000およびSuperRNAsin(AMBION)とともに1,300マイクロリットルのOPT1−MEMを移す。
11.室温(RT)で20〜30分間放置。
12.各ウエルに0.55mlの通常培地を添加。プレートをフィルムで覆って混合。
13.2mlを各ウェルに移す(2ウエルにとって十分)。
mRNAまたはタンパク質濃度を、標準キットまたはCustom B−DNAセットおよびQuantigene キット(Bayer)を用いて、形質移入後24、48、72、および96時間で測定する。
(実施例5)
(活性の測定/検出)
siRNA誘導RNA干渉のレベル、または遺伝子サイレンシングを、標的mRNAレベルまたは対応のタンパク質レベルによって評価した。mRNAレベルのアッセイは、B−DNA(商標)技術(Quantagene Corp.)を用いて実施した。fLUCおよびrLUCに対するタンパク質レベルは、STEADY GLO(商標)キット(Promega Corp.)によってアッセイした。ヒトアルカリホスファターゼレベルは、Great EscAPe SEAP Fluorescence Detection Kits(#K2043−1)、BD Biosciences,Clontech.を用いてアッセイした。
(活性の測定/検出)
siRNA誘導RNA干渉のレベル、または遺伝子サイレンシングを、標的mRNAレベルまたは対応のタンパク質レベルによって評価した。mRNAレベルのアッセイは、B−DNA(商標)技術(Quantagene Corp.)を用いて実施した。fLUCおよびrLUCに対するタンパク質レベルは、STEADY GLO(商標)キット(Promega Corp.)によってアッセイした。ヒトアルカリホスファターゼレベルは、Great EscAPe SEAP Fluorescence Detection Kits(#K2043−1)、BD Biosciences,Clontech.を用いてアッセイした。
(実施例6)
(2’−デオキシ修飾/ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子)
センス鎖およびアンチセンス鎖にある2つのタンデム2’−デオキシ修飾を持つsiRNAの機能的効果を、19量体領域の相補性とジdTオーバーハングを二本鎖の3’末端に有する21量体siRNAに導入することで、系統的に試験した。siRNAは、HEK293細胞に導入したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子(fLUC5)に向けられた。siRNA機能性を上記したようにして測定した。毒性は、ALMARブルーで測定したところ、影響を受けていないように見えた。機能性は、3通りの濃度で評価した。すなわち、1、10、および100nM最終。使用したsiRNAの配列、および2’−デオキシ修飾の置換を、表1に示す。これらの実験の結果を図19−23に示す。
(2’−デオキシ修飾/ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子)
センス鎖およびアンチセンス鎖にある2つのタンデム2’−デオキシ修飾を持つsiRNAの機能的効果を、19量体領域の相補性とジdTオーバーハングを二本鎖の3’末端に有する21量体siRNAに導入することで、系統的に試験した。siRNAは、HEK293細胞に導入したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子(fLUC5)に向けられた。siRNA機能性を上記したようにして測定した。毒性は、ALMARブルーで測定したところ、影響を受けていないように見えた。機能性は、3通りの濃度で評価した。すなわち、1、10、および100nM最終。使用したsiRNAの配列、および2’−デオキシ修飾の置換を、表1に示す。これらの実験の結果を図19−23に示す。
(2’−O−メチル修飾/ホタルルシフェラーゼ遺伝子)
センス鎖およびアンチセンス鎖に単一2’−O−メチル修飾、2つのタンデム2’−O−メチル修飾、および3つのタンデム2’−O−メチル修飾を持つsiRNAの機能的効果を、19量体領域の相補性とジdTオーバーハングを二本鎖の3’末端に有する21量体siRNAに導入することで、系統的に試験した。siRNAは、HEK293細胞に形質移入されたホタル・ルシフェラーゼ遺伝子(fLUC5)に向けられた。siRNA機能性は、以下のように測定した。機能性は、3通りの濃度で評価した。すなわち、1、10、および100nM最終。毒性は、ALMARブルーで測定したところ、影響を受けていないように見えた。使用したsiRNAの配列および2’−O−メチル修飾の配置は、表5に示す。これらの実験の結果を図24〜28に示す。
(実施例8)
(2’−デオキシおよび2’−O−メチル修飾/センス対アンチセンス鎖)
15の二本鎖(そのうち5つがヒト・シクロフィリン遺伝子に向けられ、10がホタル/ルシフェラーゼに向けられている)を種々の修飾により試験した(図29〜31参照)。ヒトのシクロフィリンBについて、試験した二本鎖は、(1)未修飾、(2)センス鎖の第1および第2の位置に2’−O−メチル修飾、および(3)アンチセンス鎖の第1および第2の位置に2’−O−メチル修飾、さらに(4)センス鎖およびアンチセンス鎖上に2’−O−メチル修飾を含む。ルシフェラーゼに関して、ヒト/シクロフィリンBについて記載された修飾の全てに加えて、(1)AS鎖の5’リン酸化と併用したAS鎖上の2’−O−メチル修飾と、(2)アンチセンス鎖の5’リン酸化と併用したセンスおよびアンチセンス鎖の2’−O−メチル修飾を、試験した。全ての15の二本鎖について、2’−O−メチル部分を持つセンス鎖の位置1および2での修飾は、機能性と干渉しなかった。アンチセンス鎖の同一の修飾は、二本鎖の機能性を制限した。この機能性の減少は、アンチセンス鎖がその5’末端でリン酸化された場合に、部分的に少なくなった(図30および31)。上記のデータを考え合わせると、アンチセンス鎖の5’リン酸化と併用したセンス鎖の1位および2位の2’−O−メチル化は、二本鎖の機能性を変えることなくセンス鎖オフ・ターゲット化を制限するようにsiRNA二本鎖を修飾する、安価で信頼性があり、さらに非毒性である方法である。この情報は、商業的価値がある。なぜなら、それによってsiRNAの特異性と効力とが高められるからである。最近のマイクロアレイ・データによれば、丁度11ヌクレオチドの存在で非特異的なサイレンシングの誘導が十分なされることを示している。siRNA二本鎖のセンス鎖内に存在する相同性は、概ね、少なくとも半分の非特異的機能性を構成する。固有の非特異性がブロックされる場合、センス鎖はオフ・ターゲット化に貢献することができず、siRNAの特異性は増加するはずである。機能的RISCアンチセンス鎖複合体への平衡の移動もまた、siRNAの有効濃度を下げる。
(実施例9)
(5’コンジュゲートによる修飾siRNA)
二本鎖安定性、機能性、および受動的取り込みに対する種々の修飾の効果をアッセイした。図33は、二本鎖安定性に対するコレステロール・コンジュゲーションおよび(センスおよびアンチセンス鎖の1位および2位上の2’−O−メチル修飾、プラス、センス鎖の全てのCおよびUの2’−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全てのCおよびUの2’F修飾、プラス、アンチセンス鎖の5’リン酸化)の効果を示す。裸のsiRNAまたは修飾siRNAは32P標識(AS鎖、T4キナーゼ、プロメガ)し、血清(または血清アルブミン)とともにインキュベートし、さらにゲル・シフト・クロマトグラフィー(変性、15%PAGE)で走らせた。これらの実験の結果は、未修飾二本鎖が素早く分解した一方で、コレステロールおよび既に説明した修飾を持つsiRNAは、血清または血清アルブミン存在下で安定であることを示す。同様に、3’idTキャッピングおよびCHO(5’センス)コンジュゲーションと併用したCおよびUの2’−O−メチル修飾を担持するsiRNAについてもまた、安定性の増大が示される(図35)。
(5’コンジュゲートによる修飾siRNA)
二本鎖安定性、機能性、および受動的取り込みに対する種々の修飾の効果をアッセイした。図33は、二本鎖安定性に対するコレステロール・コンジュゲーションおよび(センスおよびアンチセンス鎖の1位および2位上の2’−O−メチル修飾、プラス、センス鎖の全てのCおよびUの2’−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全てのCおよびUの2’F修飾、プラス、アンチセンス鎖の5’リン酸化)の効果を示す。裸のsiRNAまたは修飾siRNAは32P標識(AS鎖、T4キナーゼ、プロメガ)し、血清(または血清アルブミン)とともにインキュベートし、さらにゲル・シフト・クロマトグラフィー(変性、15%PAGE)で走らせた。これらの実験の結果は、未修飾二本鎖が素早く分解した一方で、コレステロールおよび既に説明した修飾を持つsiRNAは、血清または血清アルブミン存在下で安定であることを示す。同様に、3’idTキャッピングおよびCHO(5’センス)コンジュゲーションと併用したCおよびUの2’−O−メチル修飾を担持するsiRNAについてもまた、安定性の増大が示される(図35)。
同様に修飾した分子に対する研究(例えば、センス鎖の2’Fl修飾と併用してセンス鎖の5’末端のコレステロール修飾)は、そのような修飾が機能性(図34)および受動的取り込み(図36、修飾=コレステロールを有するセンスおよびアンチセンスの両方のCおよびUに対する2’F)が高めることを明らかにする。
(実施例10)
(SEAP2217標的上での2’でのデオキシおよび2’−O−メチル修飾ウオーク)
SEAPコンストラクトを標的にしたsiRNAを用いた2’−デオキシおよび2’−O−メチル・ウオークに使用するコンストラクト(図31および図32参照)を表6に示す。
(SEAP2217標的上での2’でのデオキシおよび2’−O−メチル修飾ウオーク)
SEAPコンストラクトを標的にしたsiRNAを用いた2’−デオキシおよび2’−O−メチル・ウオークに使用するコンストラクト(図31および図32参照)を表6に示す。
(分子1修飾および安定性)
実施例11〜18の目的のために、用語「分子1修飾(molecule 1 modifications)」とは、センス鎖上の1および2位に2’−O−メチル修飾、センス鎖上の全てのCおよびU上に2’−O−メチル修飾、アンチセンス鎖上の全てのCおよびUの2’−フッ素(Fl)修飾、およびアンチセンス鎖の5’末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。同様に、用語「分子2修飾(molecule 2 modification)」は、センス鎖の1および2位上の2’−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2’−O−メチル修飾、センス鎖の5’末端上のCy3標識、アンチセンス鎖の全てのCおよびU上の2’−フッ素(Fl)修飾、ならびにアンチセンス鎖の5’末端上のリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。
siRNA安定性に対する分子1修飾の効果を評価するために、4種類のユニークなsiRNAを、修飾および未修飾形態で合成した。続いて、これらの分子を時間を変えて37℃で100%血清中でインキュベートし、PAGEで分析することで二本鎖の未分解性(intactness)を評価した。配列の視覚化は、エチジウム・ブロマイド染色によっておこなった。
図37に示されるこれらの実験結果は、分子1修飾を持つ二本鎖が、未修飾の等価物と比べて著しく安定性が高いことを示す。未修飾分子は、室温で血清にさらしたところ、2分以内に50%以上分解した。それに比べて、分子1修飾を持つ配列の半減期は、概ね125〜135時間であった。したがって、分子1修飾は、安定性を約500倍、著しく高めた。
(実施例12)
(分子1修飾およびsiRNAサイレンシング抗力)
siRNA抗力に対する分子1修飾の効果を評価するために、ヒト・シクロフィリンB(U1およびU2)に向けられた2種類のユニークなsiRNAを、2’−O−ACEケミストリーを用いて、修飾および未修飾形態で合成し、その機能性について、全細胞アッセイで調べた。手短に言えば、濃度0.01〜200nMで、修飾および未修飾siRNAをHeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)に形質移入(Lipofectamine 2000)し、24〜48時間培養した。続いて、指定された標的の発現レベルを、分岐DNAアッセイを用いて評価した(Genospectra、Femont、CA)。
(分子1修飾およびsiRNAサイレンシング抗力)
siRNA抗力に対する分子1修飾の効果を評価するために、ヒト・シクロフィリンB(U1およびU2)に向けられた2種類のユニークなsiRNAを、2’−O−ACEケミストリーを用いて、修飾および未修飾形態で合成し、その機能性について、全細胞アッセイで調べた。手短に言えば、濃度0.01〜200nMで、修飾および未修飾siRNAをHeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)に形質移入(Lipofectamine 2000)し、24〜48時間培養した。続いて、指定された標的の発現レベルを、分岐DNAアッセイを用いて評価した(Genospectra、Femont、CA)。
これらの実験結果を図38に示す。また、これらの実験結果は分子1修飾を持つ二本鎖が、試験した全ての濃度で、未修飾siRNAと同等に機能することを示す。したがって、分子1修飾は、siRNAの抗力を変えるようには見えない。
(実施例13)
(分子1修飾およびサイレンシング寿命)
siRNAのサイレンシング寿命(silencing longevity)に対する分子1修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンB遺伝子を対象とするsiRNAを修飾および未修飾形態で合成し、前述のごとくHeLa細胞(100nM)に形質移入した。続いて、サイレンシングのレベルを分岐DNAアッセイを用いて、7日間にわたってモニターした。
(分子1修飾およびサイレンシング寿命)
siRNAのサイレンシング寿命(silencing longevity)に対する分子1修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンB遺伝子を対象とするsiRNAを修飾および未修飾形態で合成し、前述のごとくHeLa細胞(100nM)に形質移入した。続いて、サイレンシングのレベルを分岐DNAアッセイを用いて、7日間にわたってモニターした。
図39に示すこれらの実験の結果の一例は、未修飾分子によって誘導されるサイレンシングのレベルが7日間にわたって約70%から0%に低下することが示され、修飾二本鎖が実験の過程全体を通して>80%機能性を誘導することを実証する。したがって、分子1修飾にって修飾されたsiRNAは、これらの二本鎖によって誘導されたサイレンシングの寿命を高める。
(実施例14)
(分子1修飾および毒性)
siRNA毒性に対する分子1修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンBを対象とする4種類のsiRNA(U1〜U4)を修飾および未修飾形態で合成し、0.01〜200nMの濃度範囲で、HeLa細胞に形質移入した。形質移入後t=48時間の時点で、Alamer Blue生存度アッセイを実施して細胞個体群内での細胞死のレベルを評価した。修飾二本鎖と未修飾二本鎖との並列比較では、試験した濃度のいずれかで誘導される細胞死のレベルに違いは無かった(図40)。
(分子1修飾および毒性)
siRNA毒性に対する分子1修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンBを対象とする4種類のsiRNA(U1〜U4)を修飾および未修飾形態で合成し、0.01〜200nMの濃度範囲で、HeLa細胞に形質移入した。形質移入後t=48時間の時点で、Alamer Blue生存度アッセイを実施して細胞個体群内での細胞死のレベルを評価した。修飾二本鎖と未修飾二本鎖との並列比較では、試験した濃度のいずれかで誘導される細胞死のレベルに違いは無かった(図40)。
(実施例15)
(分子1修飾およびオフ・ターゲット効果)
オフ・ターゲット効果に対する分子1修飾の効果を評価するために、4種類のsiRNA標的ヒト・シクロフィリンB(U1〜U4)を修飾および未修飾形態で合成し、100nMの濃度でHeLa細胞に形質移入した。続いて、(1)偽形質移入、(2)形質移入(未修飾)、および(3)形質移入(修飾)細胞から得た全RNAを精製(Qiagen)し、cDNAに変換し、さらにAgilent’s Low RNA Input Linear Amp Kitを用いて、 Cy3(偽形質移入)またはCy5(形質移入−未修飾、形質移入−修飾)による標識をおこなった。偽形質移入および非形質移入細胞から得た標識cDNAを混合し、21,000を上回る数のプローブが含まれるAgilent Human1A(V2)Oligo Microarrayにハイブリダイズさせた。修飾および未修飾試料と結合したオフ・ターゲットの数を、ソフトウェア(Aglilent’s Feataure Extraction,Sptfire,およびSptfire Functional Genomics)(それぞれバージョン7.2、7,2、および7.1)を用いて、評価した。
(分子1修飾およびオフ・ターゲット効果)
オフ・ターゲット効果に対する分子1修飾の効果を評価するために、4種類のsiRNA標的ヒト・シクロフィリンB(U1〜U4)を修飾および未修飾形態で合成し、100nMの濃度でHeLa細胞に形質移入した。続いて、(1)偽形質移入、(2)形質移入(未修飾)、および(3)形質移入(修飾)細胞から得た全RNAを精製(Qiagen)し、cDNAに変換し、さらにAgilent’s Low RNA Input Linear Amp Kitを用いて、 Cy3(偽形質移入)またはCy5(形質移入−未修飾、形質移入−修飾)による標識をおこなった。偽形質移入および非形質移入細胞から得た標識cDNAを混合し、21,000を上回る数のプローブが含まれるAgilent Human1A(V2)Oligo Microarrayにハイブリダイズさせた。修飾および未修飾試料と結合したオフ・ターゲットの数を、ソフトウェア(Aglilent’s Feataure Extraction,Sptfire,およびSptfire Functional Genomics)(それぞれバージョン7.2、7,2、および7.1)を用いて、評価した。
これらのオフ・ターゲット研究のまとめを図41に示す。また、このまとめによれば、修飾および未修飾siRNAは、オフ・ターゲットされた遺伝子の数に関して、類似した機能を示した。具体的には、オフ・ターゲット遺伝子を誘導または抑制のレベル(野生型遺伝子発現と比較)に基づいて分離した場合、修飾siRNAは未修飾のものと類似して(またはそれよりも良好に)機能した。
(実施例16)
(分子2修飾およびサイレンシング効力)
分子2修飾を含むsiRNAの機能性を試験するために、ヒト・シクロフィリンBを対象とするsiRNAであるシクロ14(5’GOCCTTAGCTACAGGAGAG、センス鎖 配列番号322)を、分子2修飾により合成し、さらに指定した標的をサイレンシングする能力について試験した。手短に言えば、cyclo14を、2’−O−ACEケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。続いて、T482HeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)をプレーティングして一晩培養し、さらに100nM濃度でcyclo14二本鎖による形質移入(Lipofectamine 2000)をおこなった。形質移入後3日、mRNAサイレンシングのレベルを分岐DNAアッセイ(Genospectra、Fremont、CA)を用いて評価した。
(分子2修飾およびサイレンシング効力)
分子2修飾を含むsiRNAの機能性を試験するために、ヒト・シクロフィリンBを対象とするsiRNAであるシクロ14(5’GOCCTTAGCTACAGGAGAG、センス鎖 配列番号322)を、分子2修飾により合成し、さらに指定した標的をサイレンシングする能力について試験した。手短に言えば、cyclo14を、2’−O−ACEケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。続いて、T482HeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)をプレーティングして一晩培養し、さらに100nM濃度でcyclo14二本鎖による形質移入(Lipofectamine 2000)をおこなった。形質移入後3日、mRNAサイレンシングのレベルを分岐DNAアッセイ(Genospectra、Fremont、CA)を用いて評価した。
これらの研究の結果を図42に示す。未修飾cyclo14二本鎖は概ね80〜95%サイレンシングを誘導する。Cy3標識単独で修飾されたcyclo14二本鎖は、約70〜80%サイレンシングを誘導、また分子2修飾を持つcyclo14siRNAは80%またはそれよりも良好なサイレンシングを誘導し、分子2修飾の付加は二本鎖の機能性に対してほとんど影響がない。
(実施例17)
(トラックアビリティに対する分子2修飾の効果)
分子2修飾の有用性を試験するために、形質移入効率を評価する手段として、cyclo14siRNAを前述の修飾により調製し、蛍光顕微鏡で視覚化をおこなった。具体的には、cyclo14を、2’−O−ACEケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。続いて、T482HeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)をプレーティングして一晩培養し、さらに100nM濃度で適当な二本鎖による形質移入(Lipofectamine 2000)をおこなった。形質移入後48時間で、培地をHoechst33342(2μg/ml、20分、37℃)でインキュベートし、次にDapiおよびRhodamineフィルターを用いてLeica DMIL蛍光顕微鏡による視覚化をおこなった。
(トラックアビリティに対する分子2修飾の効果)
分子2修飾の有用性を試験するために、形質移入効率を評価する手段として、cyclo14siRNAを前述の修飾により調製し、蛍光顕微鏡で視覚化をおこなった。具体的には、cyclo14を、2’−O−ACEケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。続いて、T482HeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)をプレーティングして一晩培養し、さらに100nM濃度で適当な二本鎖による形質移入(Lipofectamine 2000)をおこなった。形質移入後48時間で、培地をHoechst33342(2μg/ml、20分、37℃)でインキュベートし、次にDapiおよびRhodamineフィルターを用いてLeica DMIL蛍光顕微鏡による視覚化をおこなった。
分子2修飾を持つcyclo14 siRNAによる形質移入がなされたHeLa細胞の蛍光顕微鏡写真(添付図面なし)は、強く染色された核およびその周囲を示している。未修飾cyclo14siRNAにより形質移入された細胞では、同等の染色が見られないことから(データ不図示)、分子2修飾が所定のsiRNAの細胞内位置および形質移入の成功を評価する優れた手段であることがわかる。
(実施例18)
(安定性に対する分子2修飾の効果)
分子2修飾が二本鎖の細胞内安定を高めたかどうかを試験するために、分子2修飾を持つcyclo14siRNAをHeLa細胞に形質移入し、Cy3標識Cyclo14形質移入細胞と7日間にわたって比較した。前述の修飾の付加によってCy3単独による修飾を受けた二本鎖を上回る著しく強化されたsiRNA安定性を示す。両方の試料が第2日目(Day2)に強い染色パターンを示す一方で、Cy3−Cyclo14形質移入細胞は、第7日目(Day7)までに失う。対照的に、分子2修飾を持つcyclo14siRNAを含む細胞は、第7日(Day7)に強い染色パターンを保持している。さらに、Cy3標識二本鎖とは異なり、分子2修飾を持つsiRNAはまた、二本鎖への核アクセス(nuclear access)を促進する。
(安定性に対する分子2修飾の効果)
分子2修飾が二本鎖の細胞内安定を高めたかどうかを試験するために、分子2修飾を持つcyclo14siRNAをHeLa細胞に形質移入し、Cy3標識Cyclo14形質移入細胞と7日間にわたって比較した。前述の修飾の付加によってCy3単独による修飾を受けた二本鎖を上回る著しく強化されたsiRNA安定性を示す。両方の試料が第2日目(Day2)に強い染色パターンを示す一方で、Cy3−Cyclo14形質移入細胞は、第7日目(Day7)までに失う。対照的に、分子2修飾を持つcyclo14siRNAを含む細胞は、第7日(Day7)に強い染色パターンを保持している。さらに、Cy3標識二本鎖とは異なり、分子2修飾を持つsiRNAはまた、二本鎖への核アクセス(nuclear access)を促進する。
(実施例19)
(サイレンシング活性を修飾する化学修飾の同定)
RNA合成のためのプラットホームとして2’−O−ACEケミストリーを用いて、センス(S)およびアンチセンス(AS)鎖に1、2、または3つの連続的(consecutively)に修飾したヌクレオチドからなる修飾ウォークをSEAP−2217、ヒト分泌アルカリホスファターゼ(SEAP、SEAP−2217−センス鎖5’−G U G A U G U A U G U C A G A GAG U dT dT(配列番号326))上で実行した。続いて、これらの修飾siRNAのサイレンシング効率を、SEAP発現ベクター(Clontech)を持つ各二本鎖をHEK293細胞(100nM siRNA、50ng/ウエルSEP発現ベクター、Lipofectamine 2000)に同時形質移入し、形質移入後24時間での標的タンパク質活性の減少をアッセイすることによって、評価した。図43Aおよび図43Bは、2’−O−メチル化SEAP−2217siRNAに対する修飾と機能とのあいだの相互関係を示す。SEAPを標的とする未修飾二本鎖は、SEAP遺伝子のサイレンシングを>90%誘導する。SおよびAS鎖の単一塩基修飾は、siRNA活性に対する効果をほとんど誘導しなかった。このことは、RNAiで必須の役割を演ずるような単一の2’−ヒドロシル基がいずれの鎖にもないことを示唆している。それとは対照的に、二重の並列した修飾のウオークは、修飾塩基の導入がサイレンシング活性にって著しく干渉したいくつかのキー・ポジションを同定した。
(サイレンシング活性を修飾する化学修飾の同定)
RNA合成のためのプラットホームとして2’−O−ACEケミストリーを用いて、センス(S)およびアンチセンス(AS)鎖に1、2、または3つの連続的(consecutively)に修飾したヌクレオチドからなる修飾ウォークをSEAP−2217、ヒト分泌アルカリホスファターゼ(SEAP、SEAP−2217−センス鎖5’−G U G A U G U A U G U C A G A GAG U dT dT(配列番号326))上で実行した。続いて、これらの修飾siRNAのサイレンシング効率を、SEAP発現ベクター(Clontech)を持つ各二本鎖をHEK293細胞(100nM siRNA、50ng/ウエルSEP発現ベクター、Lipofectamine 2000)に同時形質移入し、形質移入後24時間での標的タンパク質活性の減少をアッセイすることによって、評価した。図43Aおよび図43Bは、2’−O−メチル化SEAP−2217siRNAに対する修飾と機能とのあいだの相互関係を示す。SEAPを標的とする未修飾二本鎖は、SEAP遺伝子のサイレンシングを>90%誘導する。SおよびAS鎖の単一塩基修飾は、siRNA活性に対する効果をほとんど誘導しなかった。このことは、RNAiで必須の役割を演ずるような単一の2’−ヒドロシル基がいずれの鎖にもないことを示唆している。それとは対照的に、二重の並列した修飾のウオークは、修飾塩基の導入がサイレンシング活性にって著しく干渉したいくつかのキー・ポジションを同定した。
機能との最も顕著な干渉は、AS鎖の5’末端の2つの連続的な塩基(1および2位)または3つの連続的な塩基(1、2、および3位)を修飾した場合に観察されるので、隣接する修飾基間の連携効果が暗示される。S鎖の同様な修飾は、二本鎖機能性を変えるのに失敗したことから、対を形成した2’−O−メチル修飾塩基はS鎖とAS鎖との区別を可能にする。
実験の同一セットを2’−デオキシ修飾を用いて実行した。図44Aおよび図44Bに示す研究は、二本鎖のいずれかの鎖上に異なる位置(例えば、1+2+3、4+5+6、その他...)で3つの連続的な2’−デオキシ基を付加することは、二本鎖サイレンシングに対してなんら効果がないことを示している。同様の結果は、2および1の連続的な2’−デオキシ基(データ不図示)の効果試験するウオークについて観察された。
二本鎖機能性に対する2’−O−メチル修飾の効果をさらに試験するために、ルシフェラーゼ遺伝子(luc 8、18、56、58、63、および81)を対象とする一連のsiRNAを、2’−O−ACEケミストリーを用いて合成してリボース環の2’位にO−メチル基を含むように修飾する。
Luc 8 5’−GAAAAAUCAGAGAGAUCCU(配列番号327)
Luc 18 5’−UACCGGAAAACUCGACGCA(配列番号328)
Luc 56 5’−ACGUCGCCAGUCAAGUAAC(配列番号329)
Luc 58 5’−GAUUACGUCGCCAGUCAAG(配列番号330)
Luc 63 5’−AGAGALTCGUGGALIJACGUC(配列番号331)
Luc 81 5’−UGUUGUUUUGGAGCACGGA(配列番号332)
(上に列挙した配列はセンス鎖である)。
Luc 8 5’−GAAAAAUCAGAGAGAUCCU(配列番号327)
Luc 18 5’−UACCGGAAAACUCGACGCA(配列番号328)
Luc 56 5’−ACGUCGCCAGUCAAGUAAC(配列番号329)
Luc 58 5’−GAUUACGUCGCCAGUCAAG(配列番号330)
Luc 63 5’−AGAGALTCGUGGALIJACGUC(配列番号331)
Luc 81 5’−UGUUGUUUUGGAGCACGGA(配列番号332)
(上に列挙した配列はセンス鎖である)。
具体的には、(1)センス鎖、(2)アンチセンス鎖、または(3)これら両方の鎖の2つの5’最端ヌクレオチド上に2’−O−メチル修飾を含むsiRNAを、Luc−発現プラスミド(pCMVLuc,50ng/ウエル)を介して、HEK283細胞に形質移入する。続いて、各二本鎖のサイレンシング能力の並列比較を実行して、標的転写分解に対するこの修飾の効果を判断した。
これらの研究の結果は、AS鎖への2’−O−メチル基の付加のみが、標的mRNAをサイレンシングするための二本鎖の能力を著しく削減することを示した(図45A〜F参照)。対照的に、センス鎖上にこの修飾を持つ二本鎖は、同等物である未修飾siRNAよりも十分に(luc 58、63、81)、あるいは良好に(luc 56、8、18)機能した。このことは、センス鎖の修飾がRISCによる鎖選択を偏らせ、(いくつかの例では)有効なアンチセンス鎖濃度を高めたことを示唆している。強化されたサイレンシングは、分子の5’センス末端に対するRISCの結合親和性の減少(そのため、対向端に結合するための遊離のRISCの可用性が増加)、センス鎖をリン酸化するための天然キナーゼの能力減少(したがって、RISCへのアクセスに対するセンス鎖とアンチセンス鎖の競合の減少)、あるいは5’センス末端からの二本鎖の解き放しをおこなうRISCの能力の減少の結果であり得る。両方の鎖に2’−O−メチル修飾を含むsiRNAは、いずれかの単一鎖上に修飾を含んだ分子に対して観察された値間にある減少したサイレンシング能力を示した。これらの結果に対する1つの解釈は、修飾鎖に関して2’−O−メチル修飾の結合親和性がRISCのものよりも低いということである。両方の鎖が修飾された場合では、どちらの鎖もその相補体を越える利益を得ることはく、両方の修飾分子の機能性の平均を表す新しい平衡が確立される。
2’−O−メチル化S/ASsiRNAを含む細胞内で観察されたサイレンシングの減少レベルは、二本鎖をリン酸化するための細胞キナーゼの弱体化した能力の結果であるかどうかを試験するために、2’−O−メチル修飾を持つsiRNAを、AS鎖の5’末端上にリン酸基を持つように修飾した。具体的には、(1)アンチセンス鎖の5’末端の位置1および2、または(2)アンチ鎖およびセンス鎖の両方の5’末端の位置1および2、のいずれかにおいて2’−O−メチル基を有するLuc siRNAを、合成の過程でAS鎖上で5’−リン酸化した。次に、これらの二本鎖を、既に記載した手順を用いて、HEK293細胞に導入し、所望の標的をサイレンシングする能力について試験した。結果は、試験した例の83%(10/12)で、アンチセンス鎖の5’リン酸化が、等価物である非リン酸化分子を超えて二本鎖のサイレンシング効率を改善したことを示した(図45A〜F)。残りの2つの例では、サイレンシングが未変化のままであり、あるいは僅かに改善されただけである。
用量応答曲線を用いたサイレンシングに対する化学修飾の効果についてのより詳しい実験は、以前のデータを支持している。ルシフェラーゼ遺伝子(luc 8、56、58,63、および81)を対象とする5つの異なるsiRNAを、2’−O−メチル修飾および未修飾形態で、2−O−ACEケミストリーを用いて合成した。次に、これらの二本鎖を、濃度を0.01〜200nMのあいだで変えながら、HeLa細胞(ルシフェラーゼ発現ベクターと共に)に形質移入し、ルシフェラーゼタンパク質のサイレンシングのレベルについて、アッセイした(t=24〜48)。これらの実験結果を図46にまとめて以下のような結論を導いた。すなわち、(1)アンチセンス鎖の5’末端の1位および2位への2’−O−メチル基の付加によって、サイレンシング活性が一貫して崩壊する。(2)siRNAのセンス鎖の5’末端の1位および2位への2’−O−メチル基の付加によって、標的特異的サイレンシングの効果が改善されるか、または該サイレンシングに対してほとんど効果ないかのいずれかである。(3)両鎖(センスおよびアンチセンス)の5’末端の1および2位に対する2’−O−メチル基の付加によって、アンチセンス鎖の5’末端上にある未修飾二本鎖と、2’−O−メチル修飾を持つ二本鎖とにより観察されたもののあいだにある中間のサイレンシング効果が生ずる。(4)センスおよびアンチセンス鎖の両方の5’末端の1および2位に2’−O−メチル修飾を持つ分子のアンチセンス鎖の5’末端に対してリン酸基を付加することで、両方の鎖の5’末端上に2’−O−メチル修飾を有する二本鎖を超えて分子のサイレンシング機能が改善される。
これらの結果は、アンチセンス鎖の第1の末端ヌクレオチドの5’リン酸化に加えて、siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖の1位および2位置の2’−O−メチル修飾の付加が、種々の濃度での二本鎖の効力を高めることを示唆する。さらに、種々の修飾の効果は、以下の結論を導く。すなわち、(1)センスまたはアンチセンス鎖の5’末端への2’−O−メチル基の付加は、その鎖によるサイレンシングの著しい減少をもたらす。(2)5’リン酸基の付加は、2’−O−メチル基の存在下であっても、ほぼ完全に、サイレンシングを回復する。したがって、As−2’−O−メチル化の阻害効果のいくつかのフラクションがおそらく二本鎖リン酸化の阻害の結果であると思われる一方で、効果のいくつかの部分が、RNAi経路の他のステップ(例えば、RISC結合、siRN巻き戻し、RISC媒介siRNA標的結合、またはRISC媒介標的切断)についてのこの形態の修飾の効果によるものであるとかなりの蓋然性で思われる。重要なことに、これらの他のステップでの2’−O−メチル化の潜在的効果は、著者らに、上記修飾が、アンチセンス鎖との100%相同性を有する意図された標的と、相同性が劣るオフ・ターゲットとの間を区別するRISCの能力をも変えるかもしれない可能性があることを考えさせた。
(実施例20)
(オフ・ターゲッティングに対する2’−O−メチル化および5’リン酸化の効果)
アンチセンス鎖の2’−O−メチル化がサイレンシングを中断させ、一方で等価なセンス鎖標識が標的特異的サイレンシングに対してなんら効果を持たないという観察によって、センス鎖によって生ずるオフ・ターゲット・サイレンシングを排除するための戦略を示唆する。さらに、二本鎖リン酸化の下流にあるステップが2’−O−メチル化によって影響を及ぼされる可能性があるという観察は、この組み合わせ(センスおよびアンチセンス鎖の5’の位置1および2の2’−O−メチル化、プラス、AS鎖の5’末端のリン酸化)の修飾を含むsiRNAが、高効力および/または低センス/アンチセンス・オフ・ターゲッティング効果を有するものである可能性を導く。
(オフ・ターゲッティングに対する2’−O−メチル化および5’リン酸化の効果)
アンチセンス鎖の2’−O−メチル化がサイレンシングを中断させ、一方で等価なセンス鎖標識が標的特異的サイレンシングに対してなんら効果を持たないという観察によって、センス鎖によって生ずるオフ・ターゲット・サイレンシングを排除するための戦略を示唆する。さらに、二本鎖リン酸化の下流にあるステップが2’−O−メチル化によって影響を及ぼされる可能性があるという観察は、この組み合わせ(センスおよびアンチセンス鎖の5’の位置1および2の2’−O−メチル化、プラス、AS鎖の5’末端のリン酸化)の修飾を含むsiRNAが、高効力および/または低センス/アンチセンス・オフ・ターゲッティング効果を有するものである可能性を導く。
(1)センス鎖、(2)アンチセンス鎖、および(3)センスおよびアンチセンス鎖の2’−O−メチル化と組み合わさったアンチセンス鎖の5’−リン酸化の、オフ・ターゲット化に対する効果を試験するために、4種類の異なる遺伝子を対象とする2つのsiRNA(トータル8つのsiRNA;MAPK14−193 および −153、MPHOSPH1−202 および −203、IGF1R−73、ならびに−74、およびPTEN−213、さらに−214)を、2’−O−ACEケミストリーを用いて合成し、さらに適当な部位で修飾した。MAPK14−153がアンチセンス鎖の5’末端上にリン酸基のみを含む条件下で、実験を実施した場合、広範囲のオフ・ターゲット化が観察される。上記センス鎖がさらに1および2位で2’−O−メチル基により、さらに修飾される場合、その鎖によるオフターゲット化が取り除かれる。しかし、アンチセンス鎖オフセット・ターゲットの新規セットが生ずる。アンチセンス鎖オフ・ターゲット化の増大は、センス鎖による競合の非存在下での、AS鎖−RISC相互作用の増加に起因すると思われる。上記アンチセンス鎖が5’末端上にリン酸基を有し、位置1および2で2’−O−メチル基により修飾されている場合、アンチセンス鎖によるオフ・ターゲットが喪失するが、センス鎖オフ・ターゲットが再び観察される。最後に、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、2’−O−メチル基(各々の鎖の1および2位上)によって修飾され、かつアンチセンス鎖の5’末端上にリン酸基が結合する場合、両方の鎖によるオフターゲット化の度合いが急激に減少する。
上記したものと同様の結果が、IGF1R、PTEN、MAPK1、およびMPHOSPHIに対応する残りの7種類のsiRNAについて得られた。したがって、それらの実験から、以下を結論付けることが可能である(1)同一ターゲットを対象とする別のsiRNAは、変化するレベルのオフ・ターゲット効果を誘導する。(2)アンチセンス鎖(アンチセンス鎖の5’−リン酸化と組み合わせて)の5’末端の1および2位の2’−O−メチル修飾は、その鎖によるオフ・ターゲット効果を取り除くが、しかし多くの場合、付加的なセンス鎖オフターゲットをもたらす。(3)センス鎖の5’末端の1および2位の2’−O−メチル修飾(アンチセンス鎖の5’−リン酸化と組み合わせて)が、その鎖に基づいてオフターゲット効果を取り除くが、しばしば付加的なアンチセンス鎖オフターゲットをもたらす。(4)センスおよびアンチセンス鎖の両方の1および2位の2’−O−メチル修飾(アンチセンス鎖の5’リン酸化との組み合わせ)は、両方の鎖から標的効果を劇的に取り除く。したがって、3通りの修飾の組み合わせ(アンチセンス鎖の5’−リン酸化、センス鎖の1および2位の2’−O−メチル化、およびアンチセンス鎖の1および2の2’−O−メチル化)が、両方の鎖によって一般に生ずるオフ・ターゲット効果での急激な減少に到る。さらに、特異的サイレンシング活性が試験された3つのケース(MAPK14、PTEN、およびMPHOSPH1)では、最小オフ・ターゲット効果を有する完全に修飾された分子(例えば、アンチセンス鎖上に5’リン酸塩、センス鎖の1位および2位の2’−O−メチル化、ならびにアンチセンス鎖の1位および2位の2’−O−メチル化)が、アンチセンス鎖の5’末端上の5’リン酸基のみを含むsiRNAと同等かそれ以上に所定の標的をサイレンシングした。
(2’−O−メチル化の効果)
上記したデータは、AS鎖の5’末端の1位および2位に対して2’−O−メチル基を付加することで、siRNA活性が中断することを明瞭に示している。この修飾が二本鎖機能を中断させる方法は、RNAi経路で2つの異なるステップに分解することができる。第1のステップでは、2’−O−メチル化が、二本鎖をリン酸化する常在キナーゼの活性を明確に中断させる。5’リン酸基を添加することで、細胞酵素の必要性を総合的に軽減することで、この機能を満たし、さらに二本鎖機能性を改善する。したがって、この化学的修飾の効果の1つが十分に定義される。両方の鎖の1位および2位のヌクレオチドで2’−O−メチル基によって修飾されたsiRNAのアンチセンス鎖の5’末端に、リン酸基を合成付加することで活性を増加させる一方で、完全な機能性は回復しない。この結果は、リン酸化イベントの下流にあるステップ(例えば、RISC結合、RISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット相互作用、ならびに/またはRISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット切断)もまた、2’−O−メチル化によって影響を受けることを示唆している。
上記したデータは、AS鎖の5’末端の1位および2位に対して2’−O−メチル基を付加することで、siRNA活性が中断することを明瞭に示している。この修飾が二本鎖機能を中断させる方法は、RNAi経路で2つの異なるステップに分解することができる。第1のステップでは、2’−O−メチル化が、二本鎖をリン酸化する常在キナーゼの活性を明確に中断させる。5’リン酸基を添加することで、細胞酵素の必要性を総合的に軽減することで、この機能を満たし、さらに二本鎖機能性を改善する。したがって、この化学的修飾の効果の1つが十分に定義される。両方の鎖の1位および2位のヌクレオチドで2’−O−メチル基によって修飾されたsiRNAのアンチセンス鎖の5’末端に、リン酸基を合成付加することで活性を増加させる一方で、完全な機能性は回復しない。この結果は、リン酸化イベントの下流にあるステップ(例えば、RISC結合、RISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット相互作用、ならびに/またはRISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット切断)もまた、2’−O−メチル化によって影響を受けることを示唆している。
(2’−O−メチル化および強化された二本鎖機能性)
機能性に関する重要なパラメータとして、RISCに対するsiRNA結合と、それに続く二本鎖巻き戻し(アンワインディング)である。ここに提示される研究は、場合によっては、その分子の本来の機能性に対して反比例する様式で、センス鎖の2’−O−Me修飾が用量応答曲線を変える。これらの知見の1つの解釈は、センスおよびアンチセンス鎖とRISCとの連携が平衡した状態で存在しており、該平衡は「オン(on)」および「オフ(off)」の係数(例えば、k1、k1’、k2、およびk 2’ 、図47)によって定義されるということである。高機能分子は、Koverall(k1k2/k1’k2’)を示し、アンチセンス鎖(例えば、Koverall=100)と結合する方向への傾きを反映している。対照的に、非機能性または半機能性分子(<F70)は、よりいっそう偏りがなくバランスのとれた鎖相互作用を示すKoverallを表す(例えば、<70siRNAについては、Koverall は約1である)。非機能性分子または半機能性分子のセンス鎖の化学修飾は、RISC−AS相互作用に対する平衡状態を駆動するので、RISC−AS:RISC−S(Koverall は約5)および全体の二重機能性を大幅に変化させる。対照的に、高機能性分子の場合、RISC−AS相互作用は既に好ましく、そのため化学修飾は、RISC−AS関連と機能性とをさらに強化することがより少なくなる。
機能性に関する重要なパラメータとして、RISCに対するsiRNA結合と、それに続く二本鎖巻き戻し(アンワインディング)である。ここに提示される研究は、場合によっては、その分子の本来の機能性に対して反比例する様式で、センス鎖の2’−O−Me修飾が用量応答曲線を変える。これらの知見の1つの解釈は、センスおよびアンチセンス鎖とRISCとの連携が平衡した状態で存在しており、該平衡は「オン(on)」および「オフ(off)」の係数(例えば、k1、k1’、k2、およびk 2’ 、図47)によって定義されるということである。高機能分子は、Koverall(k1k2/k1’k2’)を示し、アンチセンス鎖(例えば、Koverall=100)と結合する方向への傾きを反映している。対照的に、非機能性または半機能性分子(<F70)は、よりいっそう偏りがなくバランスのとれた鎖相互作用を示すKoverallを表す(例えば、<70siRNAについては、Koverall は約1である)。非機能性分子または半機能性分子のセンス鎖の化学修飾は、RISC−AS相互作用に対する平衡状態を駆動するので、RISC−AS:RISC−S(Koverall は約5)および全体の二重機能性を大幅に変化させる。対照的に、高機能性分子の場合、RISC−AS相互作用は既に好ましく、そのため化学修飾は、RISC−AS関連と機能性とをさらに強化することがより少なくなる。
(2’−O−メチル化およびオフ・ターゲット・サイレンシング)
両方の鎖の第1位および第2位にある2’−O−メチル修飾を含む二本鎖のアンチセンス鎖の5’末端に対するリン酸基の合成的付加によって、サイレンシング表現型の部分的レスキューに到る一方で、完全回復に欠けていることから、この修飾が二本鎖リン酸化の下流である付加的なステップ(例えば、RISC結合、RISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット相互作用、ならびに/またはRISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット切断)に影響を及ぼすことが示唆される。この事実は、これらの同一の修飾が、サイレンシングにとって必要なsiRNA−標的相補性の度合いに対してより大きな要求がなされるかもしれない可能性を拡げる。2’−O−メチルの位置がオフ・ターゲットと所定のsiRNA(センスまたはアンチセンス鎖)との相同性の部分と重なる場合には、化学修飾の付加は、siRNAオフ標的相互作用を脱安定化させることで、RNAi媒介ダウン・レギュレーションでの重要なステップを抑制する可能性がある。あるいは、2’−O−メチル基の位置がオフターゲットと所定のsiRNAとのあいだの相同性の部分と重なり合う場合、付加的な化学修飾がその領域で二本鎖の可撓性をかえ、それによって標的分子を分解するRISCの能力を阻害し得る。さらに別のシナリオでは、2’−O−メチル修飾の部位がオフ・ターゲットとの相同性の場所とは重なり得ない。この場合には、修飾の脱安定化効果がその分子の下流へ移され、それによってsiRNAに100%未満の相同性を有する標的と対を形成し、そして/または分解するRISCの能力を除去するという可能性がある。そのため、SまたはAS鎖の5’末端以外の位置にある2’−O−メチル修飾がオフ・ターゲット効果を取り除くために使用することが可能である。
両方の鎖の第1位および第2位にある2’−O−メチル修飾を含む二本鎖のアンチセンス鎖の5’末端に対するリン酸基の合成的付加によって、サイレンシング表現型の部分的レスキューに到る一方で、完全回復に欠けていることから、この修飾が二本鎖リン酸化の下流である付加的なステップ(例えば、RISC結合、RISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット相互作用、ならびに/またはRISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット切断)に影響を及ぼすことが示唆される。この事実は、これらの同一の修飾が、サイレンシングにとって必要なsiRNA−標的相補性の度合いに対してより大きな要求がなされるかもしれない可能性を拡げる。2’−O−メチルの位置がオフ・ターゲットと所定のsiRNA(センスまたはアンチセンス鎖)との相同性の部分と重なる場合には、化学修飾の付加は、siRNAオフ標的相互作用を脱安定化させることで、RNAi媒介ダウン・レギュレーションでの重要なステップを抑制する可能性がある。あるいは、2’−O−メチル基の位置がオフターゲットと所定のsiRNAとのあいだの相同性の部分と重なり合う場合、付加的な化学修飾がその領域で二本鎖の可撓性をかえ、それによって標的分子を分解するRISCの能力を阻害し得る。さらに別のシナリオでは、2’−O−メチル修飾の部位がオフ・ターゲットとの相同性の場所とは重なり得ない。この場合には、修飾の脱安定化効果がその分子の下流へ移され、それによってsiRNAに100%未満の相同性を有する標的と対を形成し、そして/または分解するRISCの能力を除去するという可能性がある。そのため、SまたはAS鎖の5’末端以外の位置にある2’−O−メチル修飾がオフ・ターゲット効果を取り除くために使用することが可能である。
(実施例21)
(エクサエクオ剤としての修飾二本鎖)
siRNAによる継続的投薬またはマイクロアレイ実験の最中に、形質移入の間、全siRNA濃度を一定に保つことが所望される。残念なことに、第2のsiRNAの付加(例え非特異的であっても)が、標的特異的siRNAによって誘導されたサイレンシングの度合いを少なくすることができ、このことは、おそらくRISCへのアクセスのための2本の配列のあいだの競合による。そのような理由から、遺伝子標的化を中断させることがないエクサエクオ(exaequo)剤として作用し得る二本鎖の開発が重要である。
(エクサエクオ剤としての修飾二本鎖)
siRNAによる継続的投薬またはマイクロアレイ実験の最中に、形質移入の間、全siRNA濃度を一定に保つことが所望される。残念なことに、第2のsiRNAの付加(例え非特異的であっても)が、標的特異的siRNAによって誘導されたサイレンシングの度合いを少なくすることができ、このことは、おそらくRISCへのアクセスのための2本の配列のあいだの競合による。そのような理由から、遺伝子標的化を中断させることがないエクサエクオ(exaequo)剤として作用し得る二本鎖の開発が重要である。
例えば用量実験などにおける非競合的エクサクオ(exaequo)剤として作用する修飾二本鎖の能力を評価するために、修飾および非修飾の、非特異的siRNAの特異的siRNAサイレンシングに対する効果を調べた。このことを達成するために、ヒト・シクロフィリンB遺伝子(例えば、cyclo4)を対象とするsiRNA二本鎖を最初に、種々の濃度(例えば、用量応答)で細胞に形質移入した。cyclo4単独で誘導された標的特異的サイレンシングを次に、(a)非修飾かつ非特異的配列#4(NS4)または(b)修飾NS4、の存在下で、この分子によって誘導したサイレンシングと比較した。この場合、NS4の修飾バージョンは、19または17塩基対長のいずれかであり(それぞれ、配列番号333:UAGCGACUAAACACAUCAAおよび配列番号334:UAGCGACUAAACACAUC)、センスおよびアンチセンス鎖上の1位および2位にある−O−メチル基を含み、またCおよびU上の2’−O−メチル基2’−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCおよびU上の2’Flを含んだ。センスおよびアンチセンス鎖の5’末端には、リン酸基は結合していない。
具体的には、HeLa細胞を96穴プレートにプレーティングし、一晩置いて接着させた。続いて、Lipofectamine 2000 を用いて、以下のものの1つを細胞に形質移入した。すなわち、
a)cyclo4 siRNA(1−100nM)、(配列番号318:GGA AAG ACU GUU CCA AAA A)
b)cyclo4 siRNA(1−100nM)、プラス、NS4(19塩基対)、
c)cyclo4 siRNA(I−100nM)、プラス、修飾NS4(17または19塩基対)、
d)センス鎖の5’末端上にCy3標識も含むcyclo4 siRNA(1−100nM)プラス、修飾NS4(17または19塩基対)。第2のsiRNAの濃度は、形質移入の最中に全siRNA濃度が100nMに保たれるように、cyclo4の濃度に第2のsiRNA濃度を一致させた。次に、分岐DNAアッセイ(Genospectra、Fremont、CA)を用いて、標的特異的サイレンシングを測定した(t=24時間)。
a)cyclo4 siRNA(1−100nM)、(配列番号318:GGA AAG ACU GUU CCA AAA A)
b)cyclo4 siRNA(1−100nM)、プラス、NS4(19塩基対)、
c)cyclo4 siRNA(I−100nM)、プラス、修飾NS4(17または19塩基対)、
d)センス鎖の5’末端上にCy3標識も含むcyclo4 siRNA(1−100nM)プラス、修飾NS4(17または19塩基対)。第2のsiRNAの濃度は、形質移入の最中に全siRNA濃度が100nMに保たれるように、cyclo4の濃度に第2のsiRNA濃度を一致させた。次に、分岐DNAアッセイ(Genospectra、Fremont、CA)を用いて、標的特異的サイレンシングを測定した(t=24時間)。
これらの実験の結果を図43に示し、かつ以下に説明した。
1.cyclo4は、有力な二本鎖である。cyclo4の濃度を100nMから1nMに減少させても、この二本鎖のサイレンシング能は、かえられない(F95、図48A−I参照)。
2.19塩基対未修飾NS4siRNAをcyclo4に加えることで、cyclo4誘導遺伝子サイレンシングに対して好適な濃度依存的減少をもたし、NS4が例えばRISC複合体へのアクセスについてcyclo4と競合していることを示唆している(図48B−I参照)。
3.センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2’−O−メチル基と、センス鎖のCおよびU上の2’−O−メチル基と、アンチセンス鎖のCおよびU上の2’Fl基とを含むNS4二本鎖(17または19塩基対)は、cyclo4による標的特異的サイレンシングを減少させず、それらの二本鎖は例えばRISCに対してcyclo4と競合しないことが示唆される(図43BIIおよびBIII参照)。
4.センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2’−O−メチル基と、センス鎖のCおよびU上の2’−O−メチル基と、アンチセンス鎖のCおよびU上の2’Fl基と、センス鎖の5’末端上のCy3とを含むNS4二本鎖(17または19塩基対)は、cyclo4による標的特異的サイレンシングを減少させず、それらの二本鎖は例えばRISCに対してcyclo4と競合しないことが示唆される(図48AIIおよびAIII参照)。
1.cyclo4は、有力な二本鎖である。cyclo4の濃度を100nMから1nMに減少させても、この二本鎖のサイレンシング能は、かえられない(F95、図48A−I参照)。
2.19塩基対未修飾NS4siRNAをcyclo4に加えることで、cyclo4誘導遺伝子サイレンシングに対して好適な濃度依存的減少をもたし、NS4が例えばRISC複合体へのアクセスについてcyclo4と競合していることを示唆している(図48B−I参照)。
3.センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2’−O−メチル基と、センス鎖のCおよびU上の2’−O−メチル基と、アンチセンス鎖のCおよびU上の2’Fl基とを含むNS4二本鎖(17または19塩基対)は、cyclo4による標的特異的サイレンシングを減少させず、それらの二本鎖は例えばRISCに対してcyclo4と競合しないことが示唆される(図43BIIおよびBIII参照)。
4.センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2’−O−メチル基と、センス鎖のCおよびU上の2’−O−メチル基と、アンチセンス鎖のCおよびU上の2’Fl基と、センス鎖の5’末端上のCy3とを含むNS4二本鎖(17または19塩基対)は、cyclo4による標的特異的サイレンシングを減少させず、それらの二本鎖は例えばRISCに対してcyclo4と競合しないことが示唆される(図48AIIおよびAIII参照)。
これらの結果は、上記の修飾を含むsiRNAが機能的siRNAと競合せず、マイクロアレイ研究等のsiRNA研究でエクサエクオ(exaequo)剤として使用することができることを、示している。
上記修飾を持つsiRNAが、標的特異的siRNAと競合しない理由は、修飾二本鎖が細胞へ入ることができないからであると、考えられる。これを試験するために、センスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2’−O−メチル基と、センス鎖のCおよびU上の2’−O−メチル基と、アンチセンス鎖のCおよびU上の2’Fl基(アンチセンス鎖上には5’リン酸基がない)とをを担持するsiRNAを、センス鎖の5’末端上でCy3部分で標識し、HeLa細胞に形質移入した。形質移入後48時間、細胞を蛍光顕微鏡で分析した。これらの実験の結果は、Lipofectamine2000形質移入によって、細胞内に入るそれらの二本鎖の能力に上記修飾が変更を加えることはないことを示す。(A)センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2’−O−メチル基、センス鎖のCおよびU上の2’−O−メチル基、アンチセンス鎖のCおよびUに付加された2’Fl基、ならびにセンス鎖の5’末端上のCy3基、によって修飾されたcyclo14 siRNA 二本鎖によって染色されたHeLa細胞と、(B)(A)と同様に染色され、かつ核の位置を同定するためのHoechst33342による対比染色されたものとの顕微鏡写真(本明細書では複製せず)によって、これらの修飾を含むsiRNAの核および核周囲を示した。
センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上への2’−O−メチル基の付加が他の同時形質移入されたsiRNAと競合する二本鎖の能力を取り除くのに十分であるかどうかを試験するために、GAPDH(GAPDH4)を対象とするsiRNAを、(1)非特異的対照#2(NS2−配列番号334:UAAGGCUAUGAAGAGAUAC)、(2)センスおよびアンチセンス鎖の両方の1位および2位に2’−O−メチル修飾を担持する非特異的対照#2、あるいは(3)cyclo14(配列番号335:GGCCUUAGCUACAGGAGAG、GAPDH4と競合しないシクロフィリンsiRNA)とともに、様々な濃度(0.781〜100nM)でHeLa細胞に形質移入した。第2のsiRNAの濃度を、形質移入中の全siRNA濃度が100nMとなるように、GAPDH4の濃度と一致させた。次に、GAPDH転写産物のレベルを評価するために分岐DNAアッセイを実施する前に、細胞をさらに24時間培養した。これらの実験の結果を図49で説明するとともに、以下に示す。
1.GAPDH4が、Cyclo14の存在下で(またはそれ自体で、データ不図示)、野生型転写産物の約90%サイレンシングを誘導する。
2.未修飾NS2の付加によってGAPDHサイレンシングでの劇的な減少がもたらされた。
3.センスおよびアンチセンス鎖の両方の1および2位で2’−O−メチル基によるNS2の修飾が、未修飾分子によって観察された干渉効果を除去した。
1.GAPDH4が、Cyclo14の存在下で(またはそれ自体で、データ不図示)、野生型転写産物の約90%サイレンシングを誘導する。
2.未修飾NS2の付加によってGAPDHサイレンシングでの劇的な減少がもたらされた。
3.センスおよびアンチセンス鎖の両方の1および2位で2’−O−メチル基によるNS2の修飾が、未修飾分子によって観察された干渉効果を除去した。
これらの結果は、既に述べた修飾を含むsiRNAは、機能的siRNAと競合することがなく、マイクロアレイ研究を含む種々のsiRNA適用で、エクサエクオ剤として用いられることを実証する。
本発明を、いくつかの具体的または好ましい独創的な実施形態と組み合わせて説明および例証したが、本発明が多くのさらなる修飾をおこなうことができることは、当業者に理解される。本願は、一般に本発明の原理に従うありとあらゆる変形例、使用、または適用に及ぶもので、添付した請求の範囲の適用および範囲に記載された必須の特徴に適用しうるものとして、当技術分野で既知または慣習にともなう開示からの逸脱を含む。
Claims (9)
- siRNAであって、
(a)センス鎖と、
(b)アンチセンス鎖と、
(c)コンジュゲートと、
を含み、前記センス鎖および/またはアンチセンス鎖が少なくとも1つの2’修飾ヌクレオチドを含み、前記2’修飾ヌクレオチドが、2’ハロゲン修飾ヌクレオチド、2’アミン修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2’アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択され、前記コンジュゲートがコレステロールである、siRNA。 - 前記2’修飾ヌクレオチドが2’ハロゲン修飾ヌクレオチドであり、前記ハロゲンがフッ素である、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記コンジュゲートが、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記siRNAが18〜30ヌクレオチド塩基対から構成される、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記siRNAが19ヌクレオチド塩基対から構成される、請求項1に記載のsiRNA。
- さらに、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なく1つ上に、少なくとも1つのヌクレオチド・ユニットのオーバーハングを有する、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート結合とホスホロジチオエート結合とからなる群から選択される、請求項7に記載のsiRNA。
- 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも1つが、ポリリボヌクレオチドである、請求項1に記載のsiRNA。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10/406,908 US20040198640A1 (en) | 2003-04-02 | 2003-04-02 | Stabilized polynucleotides for use in RNA interference |
US10/613,077 US20040266707A1 (en) | 2003-04-02 | 2003-07-01 | Stabilized polynucleotides for use in RNA interference |
US54264604P | 2004-02-06 | 2004-02-06 | |
US54266804P | 2004-02-06 | 2004-02-06 | |
US54366104P | 2004-02-10 | 2004-02-10 | |
US54364004P | 2004-02-10 | 2004-02-10 | |
PCT/US2004/010343 WO2004090105A2 (en) | 2003-04-02 | 2004-04-01 | Modified polynucleotides for use in rna interference |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010106021A Division JP5468978B2 (ja) | 2003-04-02 | 2010-04-30 | Rna干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007525169A JP2007525169A (ja) | 2007-09-06 |
JP2007525169A5 true JP2007525169A5 (ja) | 2010-06-24 |
JP4605799B2 JP4605799B2 (ja) | 2011-01-05 |
Family
ID=33163279
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006509678A Expired - Lifetime JP4605799B2 (ja) | 2003-04-02 | 2004-04-01 | Rna干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1608733B1 (ja) |
JP (1) | JP4605799B2 (ja) |
WO (1) | WO2004090105A2 (ja) |
Families Citing this family (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7109165B2 (en) | 2001-05-18 | 2006-09-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
US9994853B2 (en) | 2001-05-18 | 2018-06-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
ATE508188T1 (de) | 2002-02-01 | 2011-05-15 | Life Technologies Corp | Oligonukleotid-zusammensetzungen mit verbesserter wirksamkeit |
GB2413557B (en) * | 2002-02-20 | 2006-08-16 | Sirna Therapeutics Inc | RNA interference mediated inhibtion of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US10011836B2 (en) | 2002-11-14 | 2018-07-03 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
US7612196B2 (en) | 2002-11-14 | 2009-11-03 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) (CDKN1B) |
US7691998B2 (en) | 2002-11-14 | 2010-04-06 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting nucleoporin 62kDa (Nup62) |
JP2006507841A (ja) | 2002-11-14 | 2006-03-09 | ダーマコン, インコーポレイテッド | 機能的siRNAおよび超機能的siRNA |
US9879266B2 (en) | 2002-11-14 | 2018-01-30 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
US7951935B2 (en) | 2002-11-14 | 2011-05-31 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (MYC) |
US9228186B2 (en) | 2002-11-14 | 2016-01-05 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
US9719092B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-08-01 | Thermo Fisher Scientific Inc. | RNAi targeting CNTD2 |
US9719094B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-08-01 | Thermo Fisher Scientific Inc. | RNAi targeting SEC61G |
US7635770B2 (en) | 2002-11-14 | 2009-12-22 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting protein kinase N-3 (PKN-3) |
US7977471B2 (en) | 2002-11-14 | 2011-07-12 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting TNFα |
US7592442B2 (en) | 2002-11-14 | 2009-09-22 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting ribonucleotide reductase M2 polypeptide (RRM2 or RNR-R2) |
US7619081B2 (en) | 2002-11-14 | 2009-11-17 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting coatomer protein complex, subunit beta 2 (COPB2) |
WO2006006948A2 (en) | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
US8198427B1 (en) | 2002-11-14 | 2012-06-12 | Dharmacon, Inc. | SiRNA targeting catenin, beta-1 (CTNNB1) |
US9839649B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-12-12 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
US9771586B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-09-26 | Thermo Fisher Scientific Inc. | RNAi targeting ZNF205 |
US20040167090A1 (en) * | 2003-02-21 | 2004-08-26 | Monahan Sean D. | Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery |
EP1605978B1 (en) | 2003-03-07 | 2010-09-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Therapeutic compositions |
MXPA06002216A (es) | 2003-08-28 | 2006-04-27 | Novartis Ag | Interferencia de arn doble que tiene extremos romos y modificaciones 3'. |
US20070269889A1 (en) * | 2004-02-06 | 2007-11-22 | Dharmacon, Inc. | Stabilized siRNAs as transfection controls and silencing reagents |
US20050176045A1 (en) * | 2004-02-06 | 2005-08-11 | Dharmacon, Inc. | SNP discriminatory siRNA |
US7858769B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-12-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional siNA) |
KR101147147B1 (ko) * | 2004-04-01 | 2012-05-25 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | Rna 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드 |
US7605250B2 (en) | 2004-05-12 | 2009-10-20 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting cAMP-specific phosphodiesterase 4D |
US10508277B2 (en) | 2004-05-24 | 2019-12-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
DK2302055T3 (da) * | 2004-11-12 | 2014-10-13 | Asuragen Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger involverende miRNA og miRNA-inhibitormolekyler |
US7923207B2 (en) | 2004-11-22 | 2011-04-12 | Dharmacon, Inc. | Apparatus and system having dry gene silencing pools |
EP1814994A4 (en) * | 2004-11-22 | 2010-07-14 | Dharmacon Inc | APPARATUS AND SYSTEM COMPRISING DRY EXTINCTION DRY COMPOSITIONS |
EP1948674A4 (en) * | 2005-11-02 | 2009-02-04 | Protiva Biotherapeutics Inc | MODIFIED SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF |
GB0608838D0 (en) | 2006-05-04 | 2006-06-14 | Novartis Ag | Organic compounds |
US8252755B2 (en) | 2006-09-22 | 2012-08-28 | Dharmacon, Inc. | Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by RNA interference |
MY153691A (en) | 2007-05-22 | 2015-03-13 | Arcturus Therapeutics Inc | Hydroxymethyl substituted rna oligonucleotides and rna complexes |
CL2008002775A1 (es) | 2007-09-17 | 2008-11-07 | Amgen Inc | Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea. |
WO2009046426A2 (en) * | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for improving cellular uptake of oligomeric compounds |
AU2008338464A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Amgen Inc. | Method for treating bone fracture with anti-sclerostin antibodies |
WO2009102427A2 (en) * | 2008-02-11 | 2009-08-20 | Rxi Pharmaceuticals Corp. | Modified rnai polynucleotides and uses thereof |
US8188060B2 (en) | 2008-02-11 | 2012-05-29 | Dharmacon, Inc. | Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation |
US9040492B2 (en) | 2008-03-31 | 2015-05-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Double-stranded lipid-modified RNA having high RNA interference effect |
TWI455944B (zh) | 2008-07-01 | 2014-10-11 | Daiichi Sankyo Co Ltd | 雙股多核苷酸 |
WO2010008582A2 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Phagocytic cell drug delivery system |
US10138485B2 (en) | 2008-09-22 | 2018-11-27 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Neutral nanotransporters |
WO2010059226A2 (en) | 2008-11-19 | 2010-05-27 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Inhibition of map4k4 through rnai |
BRPI0922355A8 (pt) | 2008-12-03 | 2017-12-12 | Marina Biotech Inc | Ácidos nucléicos, métodos para reduzir a expressão de um gene em uma célula in vitro, uso do ácido nucléico, complexo de rna e uso do complexo de rna |
WO2010078536A1 (en) | 2009-01-05 | 2010-07-08 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Inhibition of pcsk9 through rnai |
US9745574B2 (en) | 2009-02-04 | 2017-08-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality |
EP2454371B1 (en) | 2009-07-13 | 2021-01-20 | Somagenics, Inc. | Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression |
TWI465238B (zh) * | 2009-12-09 | 2014-12-21 | Nitto Denko Corp | Hsp47表現之調節 |
US8877439B2 (en) | 2009-12-17 | 2014-11-04 | Sirna Therapeutics, Inc. | Method for rapidly evaluating performance of short interfering RNA with novel chemical modifications |
RU2615143C2 (ru) | 2010-03-24 | 2017-04-04 | Адвирна | Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера |
KR20180044433A (ko) | 2010-03-24 | 2018-05-02 | 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 | 진피 및 섬유증성 적응증에서의 rna 간섭 |
US9095504B2 (en) | 2010-03-24 | 2015-08-04 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA interference in ocular indications |
WO2011125943A1 (ja) * | 2010-04-01 | 2011-10-13 | 日本新薬株式会社 | 修飾オリゴヌクレオチド |
JP2013539456A (ja) * | 2010-07-28 | 2013-10-24 | アルコン リサーチ,リミテッド | VEGFAをターゲティングするsiRNA及びinvivo治療のための方法 |
EP3372684B1 (en) | 2010-08-24 | 2020-10-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | Single-stranded rnai agents containing an internal, non-nucleic acid spacer |
KR20130100278A (ko) * | 2010-08-31 | 2013-09-10 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 신규 단일 화학 존재물 및 방법 |
WO2012058210A1 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA) |
EP3079707A4 (en) | 2013-12-02 | 2017-10-18 | RXi Pharmaceuticals Corporation | Immunotherapy of cancer |
JP6771387B2 (ja) | 2014-03-25 | 2020-10-21 | アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドArcturus Therapeutics,Inc. | 遺伝子サイレンシング用トランスサイレチン対立遺伝子選択的unaオリゴマー |
CN106460025A (zh) | 2014-03-25 | 2017-02-22 | 阿克丘勒斯治疗公司 | 在基因沉默中具有降低的脱靶效应的una寡聚物 |
US9856475B2 (en) | 2014-03-25 | 2018-01-02 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Formulations for treating amyloidosis |
EP3137119B1 (en) | 2014-04-28 | 2020-07-01 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Methods for treating cancer using a nucleic acid targeting mdm2 |
CN107073294A (zh) | 2014-09-05 | 2017-08-18 | 阿克赛医药公司 | 使用靶向tyr或mmp1的核酸治疗老化和皮肤病症的方法 |
WO2016161299A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Therapeutic una oligomers and uses thereof |
WO2017007825A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach |
JP6983752B2 (ja) | 2015-07-06 | 2021-12-17 | フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションPhio Pharmaceuticals Corp. | スーパーオキシドディスムターゼ1(sod1)を標的とする核酸分子 |
WO2017015671A1 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Compositions for treating amyloidosis |
ES2844398T3 (es) | 2015-07-31 | 2021-07-22 | Genecare Res Institute Co Ltd | ARNip modificado y composición farmacéutica que comprende el mismo |
WO2017053681A1 (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods of expanding hematopoietic stem cells, compositions, and methods of use thereof |
CA3002744A1 (en) | 2015-10-19 | 2017-04-27 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna |
WO2017079227A1 (en) | 2015-11-05 | 2017-05-11 | University Of Connecticut | Compositions and methods for the treatment of liver fibrosis |
MA45328A (fr) | 2016-04-01 | 2019-02-06 | Avidity Biosciences Llc | Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci |
KR20200098521A (ko) * | 2017-11-13 | 2020-08-20 | 사일런스 테라퓨틱스 게엠베하 | 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산 |
MX2020005860A (es) | 2017-12-06 | 2020-09-09 | Avidity Biosciences Inc | Composiciones y metodos de tratamiento de atrofia muscular y distrofia miotonica. |
JP2023537798A (ja) | 2020-03-19 | 2023-09-06 | アビディティー バイオサイエンシーズ,インク. | 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置するための組成物および方法 |
US20220348918A1 (en) * | 2021-03-29 | 2022-11-03 | University Of Massachusetts | Oligonucleotides for syngr-3 modulation |
AU2022345098A1 (en) | 2021-09-16 | 2024-04-04 | Avidity Biosciences, Inc. | Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
WO2023087062A1 (en) * | 2021-11-18 | 2023-05-25 | Resonance Health Analysis Services Pty Ltd | Method for treating cyclophilin b associated diseases |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
TR200401292T3 (tr) * | 2000-12-01 | 2004-07-21 | Max@Planck@Gesellschaft�Zur�F�Rderung�Der�Wissenschaften | RNAÁgirişimineÁyolÁaçanÁküçükÁRNAÁmolekülleri |
WO2003012052A2 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Specific inhibition of gene expression by small double stranded rnas |
-
2004
- 2004-04-01 EP EP04749718A patent/EP1608733B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-01 JP JP2006509678A patent/JP4605799B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-01 WO PCT/US2004/010343 patent/WO2004090105A2/en active Application Filing
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4605799B2 (ja) | Rna干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド | |
JP2007525169A5 (ja) | ||
EP2261334B1 (en) | Modified polynucleotides for use in RNA interference | |
EP2123759B1 (en) | Stabilized RNAS as transfection controls and silencing reagents | |
JP5112854B2 (ja) | Rna干渉においてオフターゲット効果を減じるための修飾されたポリヌクレオチド類 | |
JP5816556B2 (ja) | 治療剤のためのunaオリゴマー構造 | |
EP1986697B1 (en) | Compositions and methods for inhibiting gene silencing by rna interference | |
US8604183B2 (en) | Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation | |
CA2562685C (en) | Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety | |
AU2007299705B2 (en) | Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by RNA interference | |
US20040058886A1 (en) | Short interfering RNAs having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop | |
US20060223777A1 (en) | Highly functional short hairpin RNA | |
WO2004099387A2 (en) | siRNA INDUCED SYSTEMIC GENE SILENCING IN MAMMALIAN SYSTEMS | |
WO2005078095A1 (en) | SNP DISCRIMINATORY siRNA | |
US20090280567A1 (en) | Stabilized sirnas as transfection controls and silencing reagents | |
JP5468978B2 (ja) | Rna干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド |