WO2011125943A1 - 修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

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WO2011125943A1
WO2011125943A1 PCT/JP2011/058440 JP2011058440W WO2011125943A1 WO 2011125943 A1 WO2011125943 A1 WO 2011125943A1 JP 2011058440 W JP2011058440 W JP 2011058440W WO 2011125943 A1 WO2011125943 A1 WO 2011125943A1
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WO
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nucleotide
rnu
modified
modified oligonucleotide
oligonucleotide
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PCT/JP2011/058440
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Inventor
直樹 渡辺
博文 増田
春奈 成岡
Original Assignee
日本新薬株式会社
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to a novel modified oligonucleotide.
  • RNA interference is a phenomenon conserved among various species including insects, plants and fungi including nematodes.
  • Tuschl et al. Produced 19 to 23 short double-stranded RNAs (hereinafter referred to as “siRNA”) produced from long double-stranded RNA by an enzyme having RNAase III-like activity called dicer existing in cells.
  • RNA having a double-stranded structure in the molecule (hereinafter referred to as “shRNA”) is also said to exhibit RNAi by acting as a precursor of siRNA, processed by Dicer, and having a structure similar to siRNA. Yes.
  • TLR Toll-like receptor
  • TLR When TLR recognizes a ligand, it induces inflammatory cytokines and chemokines to form an inflammatory response. On the other hand, it also has the effect of enhancing the expression of costimulatory molecules on the cell surface and activating T cells, ie acquired immunity. Certain TLR family members specifically recognize viral components and induce type I interferon (IFN) to produce an immune response against the virus. It has been shown that TLR7 (TLR7 and TLR8 in humans) recognize viral single-stranded RNA.
  • IFN type I interferon
  • nucleic acids activate innate immunity and have a cytokine-inducing action. Therefore, administration of a nucleic acid to a living body can induce inflammatory cytokines such as IFN as a side effect.
  • cytokines such as IFN
  • the main object of the present invention is to provide a modified oligonucleotide capable of suppressing the expression of a target gene with few side effects such as cytokine induction such as interferon, and a pharmaceutical composition containing the modified oligonucleotide. .
  • the present inventors added two constant (modified) nucleotide dimers to the 5′-end and 3′-end of the shRNA, thereby maintaining the effect of suppressing the expression of the target gene, and inducing cytokine induction such as interferon.
  • the inventors have found that side effects can be reduced and have completed the present invention.
  • Examples of the present invention include the following aspects 1 and 2. 1.
  • a modified oligonucleotide represented by the following general formula (I) hereinafter referred to as “the oligonucleotide of the present invention”) that can be blunt ended when a double strand is formed in the molecule and can suppress the expression of a target gene.
  • A is a modified or unmodified oligonucleotide consisting of a base sequence having a length of 15 to 50 bases having a sequence similarity of at least 80% with the base sequence of a part of the target gene mRNA (hereinafter referred to as “target nucleotide sequence”)
  • a portion, at least the 5 ′ terminal nucleotide of A, is the same ribonucleotide as the 5 ′ terminal ribonucleotide of the target nucleotide sequence.
  • Z is a modified or unmodified oligonucleotide moiety consisting of a base sequence of 15-50 bases long having at least 80% complementarity with the base sequence of the target nucleotide sequence, wherein at least the nucleotide at the 3 ′ end of Z is the target A ribonucleotide complementary to the nucleotide at the 5 ′ end of the nucleotide sequence.
  • L represents a modified or unmodified (oligo) nucleotide part consisting of a base sequence having a length of 1 to 20 bases.
  • X represents a monovalent group (nucleotide dimer moiety (1)) represented by the following general formula (1).
  • Y represents a monovalent group (nucleotide dimer moiety (2)) represented by the following general formula (2).
  • B 1a and B 1b are the same or different and represent a purine base or a pyrimidine base.
  • B 2a and B 2b are the same or different and represent a purine base or a pyrimidine base.
  • B 1a and B 2a , B 1b and B 2b are nucleobases that can form base pairs with each other.
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents alkyl, or one of R 1 and R 2 represents H and the other represents alkyl. * Represents a bonding position.
  • a pharmaceutical composition comprising a complex of the oligonucleotide of the present invention and a carrier (hereinafter referred to as “the composition of the present invention”).
  • FIG. 1 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the upper row shows the expression level of Bcl-2 protein, and the lower row shows the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the top row represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 2 shows the expression inhibitory activity of Bcl-2 protein.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of Bcl-2 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 3 shows the expression inhibitory activity of Bcl-2 protein.
  • the upper row shows the expression level of Bcl-2 protein, and the lower row shows the expression level of ⁇ -actin protein.
  • FIG. 4 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of Bcl-2 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 5 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the upper row shows the expression level of Bcl-2 protein, and the lower row shows the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the top row represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 6 shows Bcl-2 protein expression inhibitory activity.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of Bcl-2 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 7 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the upper row shows the expression level of Bcl-2 protein, and the lower row shows the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the top row represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 8 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of Bcl-2 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 9 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the upper row shows the expression level of Bcl-2 protein, and the lower row shows the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the top row represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 10 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of Bcl-2 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 11 shows the expression suppression activity of SOD1 protein.
  • the upper row represents the expression level of SOD1 protein, and the lower row represents the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the top row represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 12 shows the expression suppression activity of SOD1 protein.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of SOD1 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 13 shows the inducibility of interferon ⁇ .
  • the white column represents the 10 nM addition group
  • the gray column represents the 100 nM addition group
  • the black column represents the 300 nM addition group.
  • the vertical axis represents the concentration of interferon ⁇ (pg / mL).
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 14 shows the ability to induce interferon ⁇ .
  • the white column represents the 10 nM addition group
  • the gray column represents the 100 nM addition group
  • the black column represents the 300 nM addition group.
  • the vertical axis represents the concentration of interferon ⁇ (pg / mL).
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 15 shows the inducibility of interferon ⁇ .
  • the white column represents the 10 nM addition group
  • the gray column represents the 100 nM addition group
  • the black column represents the 300 nM addition group.
  • the vertical axis represents the concentration of interferon ⁇ (pg / mL).
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 16 shows the inducibility of interferon ⁇ .
  • the white column represents the 10 nM addition group
  • the gray column represents the 100 nM addition group
  • the black column represents the 300 nM addition group.
  • the vertical axis represents the concentration of interferon ⁇ (pg / mL).
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 17 shows the inducibility of interferon ⁇ .
  • the white column represents the 10 nM addition group
  • the gray column represents the 100 nM addition group
  • the black column represents the 300 nM addition group.
  • the vertical axis represents the concentration of interferon ⁇ (pg / mL).
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • FIG. 18 shows the inducibility of interferon ⁇ .
  • the white column represents the 10 nM addition group
  • the gray column represents the 100 nM addition group
  • the black column represents the 300 nM addition group.
  • the vertical axis represents the concentration of interferon ⁇ (pg / mL).
  • the lower part represents the name of the nucleic acid contained in the examined pharmaceutical composition.
  • the Oligonucleotide of the Present Invention is a modified oligonucleotide represented by the following general formula (I) that can form a blunt end when a double strand is formed in the molecule and can suppress the expression of a target gene.
  • 5'-XALLZY-3 '(I) [Wherein, A, X, Y, Z and L are as defined above.
  • the oligonucleotide of the present invention comprises a modified or unmodified oligonucleotide part (A) consisting of a base sequence having a length of 15 to 50 bases having a sequence similarity of at least 80% with the base sequence of the target nucleotide sequence, and the base sequence of the target nucleotide sequence And a modified or unmodified oligonucleotide part (Z) having a base sequence of 15 to 50 bases having at least 80% complementarity and a base sequence of 1 to 20 bases in length
  • X which is the nucleotide dimer moiety (1)
  • Y which is a nucleotide dimer moiety (2) capable of forming a base pair with each other, is added.
  • X can be selected independently of the mRNA of the target gene.
  • Y is complementary to X. Therefore, when the oligonucleotide of the present invention forms a double strand in the molecule, both the 5 ′ end and the 3 ′ end are paired without protruding and become a blunt end.
  • the oligonucleotide of the present invention can suppress the expression of a target gene.
  • the oligonucleotide of the present invention is characterized in that it induces less cytokines including interferon when administered in vivo or introduced into cells.
  • the oligonucleotides of the present invention described in the following (a) to (d) are preferred.
  • the oligo of the present invention wherein both R 1 and R 2 are methyl, or R 1 is methyl and R 2 is H, or R 1 is H and R 2 is methyl Nucleotides are particularly preferred.
  • the oligo of the present invention wherein both R 1 and R 2 are methyl, or R 1 is methyl and R 2 is H, or R 1 is H and R 2 is methyl Nucleotides are particularly preferred.
  • D The oligonucleotide of the present invention in which both B 1a and B 1b are cytosine and both B 2a and B 2b are guanine.
  • the oligo of the present invention wherein both R 1 and R 2 are methyl, or R 1 is methyl and R 2 is H, or R 1 is H and R 2 is methyl Nucleotides are particularly preferred.
  • each B 3 independently represents a purine base or a pyrimidine base.
  • Each R 3 independently represents H, OH, or alkoxy.
  • n represents an integer in the range of 1-20. * Is as defined above.
  • the oligonucleotide of the present invention in which each B 3 is independently adenine, cytosine, uracil, 5-methyluracil or hypoxanthine is preferable.
  • n is suitably an integer in the range of 1 to 20, preferably an integer in the range of 2 to 15, particularly preferably an integer in the range of 3 to 10.
  • the expression of the target gene can be suppressed means that when the expression of the target gene is determined using the expression level of mRNA or protein of the target gene as an index, in the cell into which the oligonucleotide of the present invention has been introduced. This refers to the case where the inhibition rate is 50% or more with respect to the negative control.
  • the suppression rate is 0% when the expression of mRNA or protein of the target gene is equal to that of the negative control.
  • a preferable suppression rate is 75% or more, More preferably, it is 90% or more.
  • “Low cytokine induction” includes not only when cytokine induction is completely inhibited, but also when induction is reduced by at least 20% compared to the natural double-stranded nucleic acid corresponding to the oligonucleotide of the present invention.
  • the induction of cytokine may also occur when cytokine induction is completely inhibited or reduced in at least one system or subject. Included in less.
  • Examples of “cytokines” include interferon ⁇ (IFN ⁇ ), interferon ⁇ (IFN ⁇ ), interleukin-8 (IL-8), interleukin-12 (IL-12), and tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ).
  • target gene is not particularly limited and can be arbitrarily selected.
  • examples of the target gene include a gene encoding a protein that can cause a disease.
  • target genes include genes that act in a suppressive manner or genes that act in a proactive manner against various diseases. Specifically, cancer-related genes, apoptosis-related genes, hematological malignant disease-related genes, metabolic disease-related genes, cardiovascular disease-related genes, neurological disease-related genes, urological disease-related genes, autoimmune disease-related genes, cytokines Examples include genes, development-related genes, growth factor-related genes, aging-related genes, immune-related genes, viral genes, viroid genes, prion genes, microorganism-derived genes, and protozoan-derived genes.
  • Cancer-related genes include, for example, oncogenes (eg, bcr / abl gene, c-fms gene, c-fos gene, c-myb gene, c-myc gene, K-ras gene, c-erbB-2 Gene) and tumor suppressor genes (for example, p53 gene, RB gene, BRCA1 / BRCA2 gene, WT1 gene, VHL gene, PTEN gene, bcl-2 gene, bcl-XI gene).
  • tumor suppressor genes for example, p53 gene, RB gene, BRCA1 / BRCA2 gene, WT1 gene, VHL gene, PTEN gene, bcl-2 gene, bcl-XI gene.
  • examples of the “viral gene” include human papilloma virus genes, hepatitis B and C viruses, and cytomegalovirus (CMV) genes.
  • Viroid genes include potato and rust viroid (PSTV) genes.
  • autoimmune disease-related gene include tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ gene.
  • cytokine gene include an interferon gene and an interleukin gene.
  • development-related genes include homeogenes.
  • growth factor-related gene include vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, hepatocyte growth factor (HGF) gene, and fibroblast growth factor (FGF) gene.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • prion gene include a human prion gene and a bovine prion gene.
  • microbe-derived gene include pathogenic E. coli-derived genes such as O157.
  • protozoan-derived gene include a malaria parasite-derived gene.
  • A is a modified or unmodified oligonucleotide moiety having at least 80% sequence similarity to the base sequence of the target nucleotide sequence as long as the target gene expression can be suppressed. Those that are modified or unmodified oligonucleotide moieties having at least 90% sequence similarity are preferred, and those that are modified or unmodified oligonucleotide moieties consisting of 100% identical base sequences are more preferred. Further, A is preferably a nucleotide sequence that is exactly the same as the target nucleotide sequence.
  • the modified or unmodified oligonucleotide part according to A and Z is suitably 15 to 50 bases, preferably 20 to 45 bases, more preferably 22 to 42 bases.
  • a and Z are arranged so that a double strand can be formed in the molecule.
  • the oligonucleotide of the present invention does not necessarily form a complete duplex within the molecule, but the modified or unmodified oligonucleotide parts according to A and Z preferably have the same base length.
  • Z is suitably a modified or unmodified oligonucleotide moiety consisting of a base sequence having at least 80% complementarity with the base sequence of the target nucleotide sequence, as long as the expression of the target gene can be suppressed.
  • a modified or unmodified oligonucleotide part consisting of a base sequence having at least 90% complementarity with the base sequence of the target nucleotide sequence, and from a base sequence having 100% complementarity with the base sequence of the target nucleotide sequence
  • Those that are modified or unmodified oligonucleotide moieties are more preferred.
  • Z is a modified or unmodified oligonucleotide part consisting of a base sequence having 100% complementarity with the base sequence of the target nucleotide sequence, and each nucleotide constituting the oligonucleotide part is a ribonucleotide Is more preferable.
  • Complementarity between the base sequence of the target nucleotide sequence and the base sequence of Z is based on the base sequence obtained by converting the base sequence of the target nucleotide sequence to form a Watson-Crick base pair or a Wobble base pair and the base of Z Sequence similarity to sequences is described in Altschul et al., J. MoI. Mol. Biol.
  • “complementary” refers to a relationship that can be a Watson-Crick base pair or a wobble base pair.
  • Examples of combinations of nucleobases that can form base pairs include Watson-Crick base pairs and Wobble base pairs. Examples include the following. (1) Nucleobase capable of forming a base pair with adenine: 5-methyluracil, uracil, hypoxanthine (2) Nucleobase capable of forming a base pair with guanine: cytosine, uracil (3) uracil, 5-methyluracil Nucleobase that can form base pairs: adenine, hypoxanthine, guanine (4) Nucleobase that can form base pairs with cytosine: guanine, hypoxanthine
  • examples of the nucleobase include a purine base and a pyrimidine base.
  • purine bases include 2-aminopurine, 2-amino-1,9-dihydro-6H-purin-6-one (guanine), 6-amino-9H-purine (adenine), 8-aminopurine, , 6-diaminopurine, 2,6,8-triaminopurine, 6,8-diaminopurine, 6-amino-2-hydroxypurine, 2-amino-6-hydroxypurine, 8-amino-6-hydroxypurine, Mention may be made of 6-amino-8-hydroxypurine, 6-hydroxypurine, 2,6-dihydroxypurine, 3,7-dihydropurin-6-one (hypoxanthine) or their tautomers.
  • Examples of the pyrimidine base include 5-methyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-2,4-dione (thymine or 5-methyluracil), 4-aminopyrimidin-2 (1H) -one ( Cytosine), pyrimidine-2,4 (1H, 3H) -dione (uracil), 4,5-diaminopyrimidin-2-one, 4,6-diaminopyrimidin-2-one, 5-aminopyrimidine-2,4- Mention may be made of dione, 6-aminopyrimidine-2,4-dione, 5-aminopyrimidin-2-one, 6-aminopyrimidin-2-one, 2,4-dihydroxypyrimidine or their tautomers.
  • Each nucleotide constituting the unmodified oligonucleotide part according to A and Z represents a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide.
  • Each nucleotide constituting the modified oligonucleotide moiety according to A and Z represents a ribonucleotide, deoxyribonucleotide, or modified nucleotide, and at least one nucleotide of the modified oligonucleotide moiety according to A or Z is a modified nucleotide.
  • ribonucleotide refers to a nucleotide composed of ribose, phosphate ester, and nucleobase, wherein the nucleobase is adenine, guanine, cytosine, or uracil.
  • deoxyribonucleotide refers to a nucleotide composed of deoxyribose, phosphate ester, and nucleobase, wherein the nucleobase is adenine, guanine, cytosine, or thymine.
  • the modified nucleotide refers to a nucleotide represented by any of the following (I) to (IV).
  • B A is a nucleic acid substituted with 1 to 3 groups selected from the group consisting of halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, carboxy, cyano and nitro
  • T 1 represents H or OH.
  • [P] represents a group represented by the following general formula. (In the formula, R A , R B , and R C are the same or different and represent alkyl.
  • B B is halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, carboxy, be a group selected from the group consisting of cyano and nitro are 1-3 substituents Represents a good nucleobase.
  • T 2 is alkyl, aryl, arylalkyl, alkoxyalkyl, aryloxyalkyl, alkoxy, aryloxy, arylalkyloxy, alkoxyalkyloxy, aryloxyalkyloxy, thiol, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, aminoalkyl Represents oxy, alkylaminoalkyloxy, dialkylaminoalkyloxy, azide, cyano, nitro, or halogen.
  • [P] has the same meaning as described above. * Is as defined above. (III) In the formula, B B , [P], and * are as defined above.
  • T 3 is H, OH, alkyl, aryl, arylalkyl, alkoxyalkyl, aryloxyalkyl, alkoxy, aryloxy, arylalkyloxy, alkoxyalkyloxy, aryloxyalkyloxy, thiol, alkylthio, amino, alkylamino, dialkyl Represents amino, aminoalkyloxy, alkylaminoalkyloxy, dialkylaminoalkyloxy, azide, cyano, nitro, or halogen.
  • B B , [P], and * are as defined above.
  • D represents a single bond, methylene, ethylene, —N (CH 3 ) —, or —OCH 2 —.
  • examples of the “alkyl” include linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl and isohexyl. Of these, methyl is preferred.
  • Examples of “alkoxy” include linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples thereof include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy and isohexyloxy. Of these, methoxy is preferred.
  • Examples of “halogen” include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • Examples of “aryl” include aryl having 6 to 10 carbon atoms. Specific examples include phenyl, ⁇ -naphthyl, and ⁇ -naphthyl. Particularly preferred is phenyl.
  • acyl examples include linear or branched alkanoyl having 1 to 6 carbon atoms and aroyl having 7 to 13 carbon atoms. Specific examples include formyl, acetyl, n-propionyl, isopropionyl, n-butyryl, isobutyryl, tert-butyryl, valeryl, hexanoyl, benzoyl, naphthoyl and levulinyl.
  • Arylalkyl “arylalkyloxy”, “alkoxyalkyl”, “alkoxyalkyloxy”, “alkylthio”, “alkylamino”, “dialkylamino”, “aminoalkyloxy”, “alkylaminoalkyloxy”, “alkylaminoalkyloxy”, “ Examples of the “alkyl” part of “dialkylaminoalkyloxy”, “aryloxyalkyl” and “aryloxyalkyloxy” include the same as the above “alkyl”. Examples of the “alkoxy” part of “alkoxyalkyl” and “alkoxyalkyloxy” include the same as the above “alkoxy”.
  • the oligonucleotide of the present invention can be produced, for example, by the phosphoramidite method [for example, the 2′-position hydroxyl group is converted to 2 ′-(2-cyanoethoxy) methyl (CEM) (Nucleic Acids Res., 35 (10): 3287-3296 ( 2007))) 2′-tert-butyldimethylsilyloxymethyl (TOM) conversion (see, for example, Helv. Chim. Acta., 84: 3775-3795 (2001)), 2′-bis (acetoxymethoxy) Ribonucleotide phosphoramidite compounds converted into methylethyl (ACE) (see, for example, J. Am. Chem.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used, for example, for treatment and / or prevention of a disease caused by abnormal expression of a protein encoded by a target gene.
  • a disease caused by abnormal expression of a protein encoded by a target gene.
  • used for the treatment and / or prevention of cancer viral diseases, metabolic diseases, cardiovascular diseases, neurological diseases, urological diseases, hematological malignancies, or diseases where the promotion or suppression of apoptosis is desired Can do.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used to treat a disease caused by abnormal expression of a protein encoded by, for example, a cancer-related gene bcl-2 related gene, particularly a bcl-2 gene (eg, SEQ ID NO: 43). Or it can be used for prevention.
  • a cancer-related gene bcl-2 related gene particularly a bcl-2 gene (eg, SEQ ID NO: 43).
  • a bcl-2 gene eg, SEQ ID NO: 43
  • oligonucleotide of the present invention that can suppress the expression of the Bcl-2 gene include the following modified oligonucleotides (1) to (27).
  • modified oligonucleotides (1) to (27) include the following modified oligonucleotides (1) to (27).
  • “rA”, “rU”, “rG”, “rC”, “rI”, “rT”, “dT”, “a”, “u”, “g” and “c” "Represents a nucleotide having a partial structural formula shown in Table 1 below.
  • RNU-251 (SEQ ID NO: 9) 5′-aarGrUrGrArArArGrUrCrArArArUrGrCrCrUrGrCrCrAuuuurUrGrGrGrCrArGrGrCrArUrGrUrUrGrArCrUrCrTrT-3 ′
  • RNU-268 SEQ ID NO: 10 5'-aarGrUrGrArArGrUrCrArArArArArUrGrCrCrUrGrCrCrCrArTrTrTrTrTrTrUrGrGrGrCrArArArGrGrCrArArGrUrUrGrCrCrArTrTrTrTrUrGrGrGrCrArArGrGrCrArArU
  • the oligonucleotides of the present invention (1) to (24) are modified oligonucleotides containing the nucleotide sequences of the sense strand (SEQ ID NO: 1) and antisense strand (SEQ ID NO: 2) of B717, which are known bcl-2 siRNAs It has the characteristics that it suppresses the expression of the bcl-2 gene and does not induce interferon ⁇ as compared with B717.
  • the oligonucleotides of the present invention described in (25) to (27) above contain the nucleotide sequences of the sense strand (SEQ ID NO: 5) and antisense strand (SEQ ID NO: 6) of B532-UU, which is a known bcl-2 siRNA. It is a modified oligonucleotide and has the characteristics that it suppresses the expression of the bcl-2 gene and does not induce interferon ⁇ as compared with B532-UU.
  • oligonucleotide of the present invention that can suppress the expression of the sod1 gene include the following modified oligonucleotides.
  • RNU-303 SEQ ID NO: 36
  • the oligonucleotide of the present invention (1) is a modified oligonucleotide containing the nucleotide sequence of the sense strand (SEQ ID NO: 7) and the antisense strand (SEQ ID NO: 8) of SOD385, which is a known sod1 siRNA, It has the characteristics that it suppresses expression and does not induce interferon ⁇ as compared to SOD385.
  • composition of the present invention is characterized by containing a complex of the oligonucleotide of the present invention and a carrier.
  • the carrier is not particularly limited as long as it is effective for transferring the oligonucleotide of the present invention into cells.
  • examples thereof include cationic carriers such as cationic liposomes, cationic polymers, and cationic dendrimers, and carriers using virus envelopes or nanoparticles.
  • liposome A A cationic liposome carrier (hereinafter referred to as “liposome A”) formed with 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipid as essential components.
  • liposome B 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol, 1,3-distearoylglycero-2-phosphatidyl-N- (methoxypolyethyleneglycol succinyl) ethanolamine and phosphorus
  • liposome B 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol, N- (methoxy polyethylene glycol succinyl) distearoyl phosphatidylethanolamine [SUNBRIGHT DSPE-020C; manufactured by NOF Corporation]
  • liposome C a cationic liposome (hereinafter, referred to as “liposome C”) containing phospholipid as an essential constituent component
  • Oligofectamine registered trademark
  • 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol can be produced by the method described in the literature (Example 20 of WO 94/19314).
  • 1,3-distearoylglycero-2-phosphatidyl-N- (methoxypolyethyleneglycol succinyl) ethanolamine is produced by the method described in the literature (Cancer Research vol. 68, no. 21 (2008) pp. 8843-8851). can do.
  • the compound is preferably distributed within a molecular weight range of 2000 to 3800.
  • the molecular weight can be measured by a mass spectrum using an electrospray ionization method.
  • Phospholipids that can be used in liposome A, liposome B and liposome C include, for example, phosphatidylcholine [eg, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero -3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine], phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine Sphingomyelin, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG), egg yolk lecithin, soybean lecithin or hydrogenated phospholipids thereof.
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DSPC 1,2-dist
  • Lipofectin® is composed of N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) as a neutral lipid. ) At 1: 1 (mol / mol). Lipofectamine® is a product of 2,3-diolexioxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate (DOSPA) and diole.
  • DOSPA dioleolexioxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate
  • DMRIE-C® is a cationic liposome containing 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE) and cholesterol (Cholesterol) at 1: 1 (mol / mol). .
  • cationic polymer examples include jetSI (manufactured by Qbiogene), jetPEI (registered trademark) (polyethyleneimine; manufactured by Qbiogene), and atelocollagen.
  • viruses envelope examples include GenomeONE (registered trademark) (HVJ-E liposome; manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.).
  • cationic dendrimer examples include a cationic amino acid dendrimer (for example, dendritic poly (L-lysine) (for example, “Organic Biomolecular Chemistry”, 2003, Vol. 1, pages 1270-1273) or a polyamidoamine dendrimer. Can be mentioned.
  • a cationic amino acid dendrimer for example, dendritic poly (L-lysine) (for example, “Organic Biomolecular Chemistry”, 2003, Vol. 1, pages 1270-1273) or a polyamidoamine dendrimer.
  • nanoparticles include gold nanoparticles and silica nanoparticles, and the average particle diameter is suitably in the range of 1 nm to 5000 nm, for example.
  • gold nanoparticles examples include cationic gold nanoparticles (“Bioconjugate Chemistry”, 2002, 13, 3-6), cationic gold nanoparticles modified with polyethylene glycol (for example, “Journal of” Controlled Release ", 2006, 111, 382-389).
  • the composition of the present invention can optionally contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • additives include emulsification aids (for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran), stabilizers (for example, cholesterol, phosphatidic acid), and isotonic agents.
  • emulsification aids for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran
  • stabilizers for example, cholesterol, phosphatidic acid
  • isotonic agents for example, sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose
  • pH adjusters for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine
  • the content of the additive in the composition of the present invention is suitably 90% by weight or less, preferably 70% by weight or less, and more preferably 50% by weight or less.
  • the type of the oligonucleotide of the present invention contained in the composition of the present invention may be one type, but may be, for example, 2 to 10 types.
  • the concentration of the oligonucleotide of the present invention contained in the composition of the present invention varies depending on the type of carrier and the like, but when used in vitro, for example, it is suitably in the range of 0.1 nM to 10 ⁇ M, and 10 nM to A range of 1 ⁇ M is preferred. Further, when used in vivo, for example, the range of 0.1 to 10 mg / mL is appropriate, and the range of 0.5 to 2 mg / mL is preferable.
  • the weight ratio of the oligonucleotide of the present invention to the carrier (carrier / oligonucleotide of the present invention) contained in the composition of the present invention varies depending on the properties of the oligonucleotide of the present invention, the type of the carrier, etc., but is in the range of 0.01-100. Is suitably in the range of 1-50, more preferably in the range of 5-30.
  • the composition of the present invention can be prepared by adding the oligonucleotide of the present invention to a carrier dispersion and stirring appropriately.
  • the additive can be added in an appropriate step before or after the addition of the oligonucleotide of the present invention.
  • the solvent that can be used when adding the oligonucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, for example, electrolyte solution such as water for injection, distilled water for injection, physiological saline, glucose solution, A sugar solution such as maltose solution can be mentioned.
  • conditions, such as pH and temperature in such a case can be suitably selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention can be, for example, a solution or a lyophilized preparation thereof.
  • the lyophilized preparation can be prepared by lyophilizing the composition of the present invention having a liquid form according to a conventional method. For example, after properly sterilizing the composition of the present invention in the form of a liquid agent, a predetermined amount is dispensed into a vial, and pre-freezing is performed at about ⁇ 40 to ⁇ 20 ° C. for about 2 hours. Primary drying can be performed at about 0 to 10 ° C. under reduced pressure, followed by secondary drying at about 15 to 25 ° C. under reduced pressure and freeze-drying.
  • the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized preparation of the composition of the present invention.
  • the lyophilized preparation can be re-dissolved and used by adding any appropriate solution (re-dissolved solution).
  • re-dissolved solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of this redissolved solution varies depending on the use and the like and is not particularly limited, but is suitably 0.5 to 2 times the amount of the solution before lyophilization or 500 mL or less.
  • the oligonucleotide of the present invention or the composition of the present invention is administered intravenously, intraarterially, orally, or tissue (for example, intravesical, intrathoracic, intraperitoneal, intraocular administration) to animals including humans.
  • tissue for example, intravesical, intrathoracic, intraperitoneal, intraocular administration
  • Intracerebral administration transdermal administration, transmucosal administration, pulmonary administration, or rectal administration.
  • intravenous administration, transdermal administration, and transmucosal administration are desirable.
  • these dosage forms are suitable for administration, for example, various injections, oral preparations, drops, inhalants, eye drops, ointments, lotions and suppositories.
  • the dosage of the oligonucleotide of the present invention or the composition of the present invention is determined, for example, in consideration of the type of the oligonucleotide of the present invention, dosage form, patient condition such as age and weight, administration route, nature and degree of disease
  • the range of 0.1 mg to 5 g / human is suitable for the oligonucleotide of the present invention, and preferably the range of 1 mg to 2 g / human for the present oligonucleotide.
  • This number may vary depending on the type of target disease, dosage form, and target molecule. Therefore, in some cases, a lower dose may be sufficient, and conversely, a higher dose may be required.
  • it can be administered once to several times a day or at intervals of 1 day to several days.
  • the residue was dissolved in ethyl acetate and washed successively with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, saturated brine, 0.5 M potassium dihydrogen phosphate aqueous solution and saturated brine. After drying over anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure, and ethyl acetate (200 mL) was added to the residue to form a powder. The precipitated crystals were collected by filtration, washed with ice-cooled ethyl acetate (100 mL), and dried to obtain 76 g of the target compound (yield 75%).
  • Step 2 2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) inosine 3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) inosine ( 37 g, 62.3 mmol) was dissolved in dehydrated tetrahydrofuran (130 mL), triethylamine trishydrofluoride (10 g, 62.3 mmol) was added, and the mixture was stirred at 45 ° C. for 2 hours. The reaction mixture was ice-cooled, the supernatant was removed, methanol (80 mL) was added to the residue, and the mixture was ice-cooled to crystallize.
  • Antisense strand (SEQ ID NO: 2): 5'-rGrCrArGrGrCrArUrGrUrUrGrArCrUrUrCrArCdTdT-3 ' MALDI-TOF-MS: Calculated value 6646.11 Actual value 6646.69 (2) B717-UU: (bcl-2 siRNA) Sense strand (SEQ ID NO: 3): 5'-rGrUrGrArArGrUrCrArArArArArUrGrCrCrUrGrCrUrU-3 ' MALDI-TOF-MS: calculated value 6673.11.
  • a body (pharmaceutical composition) was formed.
  • concentration of the oligonucleotide of the present invention in the complex was 0.1 ⁇ M to 3 ⁇ M, and the ratio of the oligonucleotide of the present invention to the carrier in the complex was 1:16 (w / w).
  • the prepared complex was appropriately diluted with 10% maltose.
  • the CPG solid phase carrier is cleaved from the CPG solid phase carrier over 2 hours at 40 ° C. using a concentrated ammonia water-ethanol mixed solution as a cleaving agent and the base protecting group is removed. A release reaction was performed. The reaction mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. To the residue was added a 0.67 M tetrabutylammonium fluoride DMSO solution (1.5 ml) containing 0.5% nitromethane, and the mixture was reacted at room temperature for 5 hours to remove the hydroxyl-protecting group at the 2 ′ position.
  • modified oligonucleotides according to SEQ ID NO: 10 to SEQ ID NO: 42 were produced by a method according to the above (1) RNU-251 (SEQ ID NO: 9).
  • RNU-251 SEQ ID NO: 9
  • a commercially available 5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (t-butyldimethylsilyl) uridine is supported.
  • RNU-268 (SEQ ID NO: 10) 5'-aarGrUrGrArArArGrUrCrArArArUrGrCrCrUrGrCrCrCrArTrTrTrTrTrUrGrGrGrCrArGrGrCrArUrGrUrUrGrArCrUrCrArTrT-3 ' LC-ESI-MS: calculated value 17344.40 Actual value 17343.90 (3) RNU-269 (SEQ ID NO: 11) 5'-aarGrUrGrArArArGrUrCrArArArArUrGrCrCrUrGrCrCrCrAdTdTdTdTdTdTdTdTrUrGrGrGrGrCrArGrGrCrArArGrGrGrCrArGrG
  • RNU-317 (SEQ ID NO: 24) 5'-aarGrUrGrArArGrUrCrArArArUrGrCrCrUrGrCrCrCrCrUrGrCrCrCccccccccccrGrGrGrGrCrArGrGrCrArUrGrUrUrGrArCrUrUrCrArCrTrT-3 ' MALDI-TOF-MS: Calculated value 17353.51 Actual value 17353.15 (17) RNU-318 (SEQ ID NO: 25) 5'-aarGrUrGrArArArGrUrCrArArArArArUrGrCrCrUrGrCrCrCrCrCrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIrIr
  • the concentration of the oligonucleotide of the present invention in the complex was 0.1 ⁇ M to 3 ⁇ M, and the ratio of the oligonucleotide of the present invention to the carrier in the complex was 1:16 (w / w).
  • the prepared complex was appropriately diluted with 10% maltose.
  • RNAi-active A431 cells (human epithelial cancer cell line) were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm diameter petri dish. The cells were cultured overnight in 3 mL of DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (manufactured by Sigma, the same applies hereinafter) at 37 ° C. and 5% CO 2 . The medium was replaced with 2.7 mL of fresh medium, 0.3 mL of 100 nM pharmaceutical composition prepared in Example 2 was added, and the mixture was cultured for 3 days. The cells were washed twice with PBS (manufactured by Nissui, the same applies hereinafter), and then transferred to a 1.5 mL tube using a cell scraper.
  • PBS manufactured by Nissui, the same applies hereinafter
  • the supernatant is removed, suspended in 50 ⁇ L to 100 ⁇ L of buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40], and then on ice for 30 minutes. Left to stand. Centrifugation was performed at 15000 ⁇ g and 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant (cell extract) was recovered. The protein concentration in the cell extract was measured using a BCA protein assay system (Pierce Biotechnology).
  • Bcl-2 protein, SOD1 protein or ⁇ -actin protein was detected with ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories). The expression level of each protein was quantified.
  • a mouse anti-human bcl-2 antibody (M0887, manufactured by DAKO CYTOMATION) was diluted 500 times as a primary antibody, and a peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody.
  • the density of the Bcl-2 protein band when transfected with a natural double-stranded nucleic acid (eg, B717, B-352UU) having ⁇ was basically visually observed.
  • the photosensitive film is converted into image data, and the NIHI image ver. 62.
  • modified oligonucleotides RNU-252 that are not the oligonucleotides of the present invention and have a hydroxyl group at the 2 ′ position of each nucleotide constituting the 5 ′ terminal nucleotide dimer moiety.
  • RNU-253, RNU-300 have a lower RNAi activity than the corresponding natural double-stranded nucleic acid.
  • the modified oligonucleotide which is not the oligonucleotide of the present invention, is such that the 2 ′ position of each nucleotide constituting the nucleotide dimer portion at the 5 ′ end and the 2 ′ position of each nucleotide constituting the nucleotide dimer portion at the 3 ′ end are both methoxy.
  • RNU-234 had a lower RNAi activity than the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717). As shown in FIG. 3 and FIG.
  • the oligo of the present invention in which the 2′-position of each nucleotide constituting a modified or unmodified (oligo) nucleotide portion that can become a loop portion when a double strand is formed in the molecule is modified
  • the oligonucleotides (RNU-268, RNU-269) of the present invention in which the nucleotide or nucleobase moiety was modified were equivalent in RNAi activity to the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717). As shown in FIGS.
  • the oligonucleotide of the present invention (RNU-292, RNU-293, RNU-294)
  • the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717) and its RNAi activity were equivalent. Further, as shown in FIG. 5 and FIG.
  • the oligonucleotide of the present invention ( RNU-295 and RNU-296) were equivalent in RNAi activity to the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717). As shown in FIGS.
  • oligonucleotides (RNU-322, RNU-323, RNU-324, RNU-325) of the present invention are equivalent in RNAi activity to the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717) It was. However, as shown in FIGS.
  • At least one nucleotide (corresponding to the 5 ′ terminal nucleotide of A) following the 5 ′ terminal nucleotide dimer moiety is a modified nucleotide ( A nucleotide that is methoxy at the 2 ′ position) and at least one nucleotide (corresponding to the nucleotide at the 3 ′ end of Z) following the nucleotide dimer portion at the 3 ′ end is a modified nucleotide (nucleobase replaced with methyl)
  • modified oligonucleotides RNU-270, RNU-271 which are nucleotides
  • the RNAi activity was lower than that of the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717).
  • oligonucleotides of the present invention were equivalent in RNAi activity to the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717).
  • the oligonucleotide (RNU-319, RNU-320, RNU-321) of the present invention is not affected by its RNAi.
  • the activity was equivalent to that of the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717).
  • the oligonucleotides of the present invention (RNU-276, RNU-277, RNU-278) can also be used for their RNAi against different target nucleotide sequences of the same target gene (Bcl-2 gene).
  • the activity was equivalent to that of the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B532-UU).
  • the oligonucleotide (RNU-303) of the present invention also has a natural double-stranded nucleic acid (RNU-303) corresponding to the RNAi activity corresponding to a target gene different from the Bcl-2 gene. SOD385).
  • Test Example 2 Interferon- ⁇ Inducing Action Fresh human blood collected was mixed with 1 mL of heparin sodium injection (Ajinomoto Co., Inc.) per 10 mL to prevent coagulation. An equal volume of PBS (manufactured by Nissui Pharmaceutical) was added, and 10 mL of blood per 3 mL of Ficoll-Paque (registered trademark) PLUS (manufactured by GE Healthcare Bio-Sciences) was gently layered so as not to disturb the interface. The PBMC layer was recovered by centrifugation at 400 ⁇ g for 30 minutes at room temperature.
  • PBS manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • RPMI 1640 medium manufactured by SIGMA
  • 10% fetal calf serum manufactured by Invitrogen
  • the number of cells was measured to prepare a cell suspension of 2 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • 300 ⁇ L (6 ⁇ 10 5 cells / well) was seeded in a 48-well plate, cultured at 5% CO 2 and 37 ° C.
  • oligonucleotide of the present invention prepared with 300 to 3000 nM of the oligonucleotide of the present invention and a carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing a complex with was added. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected and measured by ELISA. IFN- ⁇ was measured using a Human Interferon-alpha ELISA Kit (manufactured by PBL Biomedical Laboratories).
  • each nucleotide constituting the nucleotide dimer moiety at the 5 ′ end is methoxy
  • the 5 position of each nucleotide constituting the nucleotide dimer moiety at the 3 ′ end is methyl or each nucleotide is
  • the oligonucleotide of the present invention (RNU-251, RNU-268, RNU-269, RNU-272), which is hypoxanthine, suppressed the induction of IFN- ⁇ more than the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717).
  • the oligonucleotide of the present invention (RNU-251) in which the 2′-position of each nucleotide constituting a modified or unmodified (oligo) nucleotide portion that can become a loop portion when a double strand is formed in the molecule is methoxy,
  • the induction of IFN- ⁇ was further suppressed.
  • the oligonucleotides of the present invention (RNU-292, RNU-293, RNU-294) are compatible even if the base length of the modified or unmodified oligonucleotide part corresponding to A and Z is changed.
  • the induction of IFN- ⁇ was suppressed more than the natural double-stranded nucleic acid (B717).
  • the oligonucleotides (RNU-322, RNU-323, RNU-324, RNU-325) of the present invention can induce IFN- ⁇ more than the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717). Suppressed. As shown in FIG.
  • the oligo of the present invention can be obtained by changing the type of nucleobase of each nucleotide constituting a modified or unmodified (oligo) nucleotide part that can become a loop part when a double strand is formed in the molecule.
  • Nucleotides (RNU-315, RNU-316, RNU-317, RNU-318) suppressed IFN- ⁇ induction more than the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717). Further, as shown in FIG.
  • the oligonucleotide of the present invention (even if the nucleotide constituting the 5 ′ terminal nucleotide dimer part and the nucleobase of each nucleotide constituting the 3 ′ terminal nucleotide dimer part are changed) RNU-319, RNU-320, and RNU-321) suppressed IFN- ⁇ induction more than the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717).
  • the oligonucleotides of the present invention (RNU-276, RNU-277, RNU-278) can be used for different target nucleotide sequences of the same target gene (Bcl-2 gene).
  • the induction of interferon ⁇ was suppressed more than the single-stranded nucleic acid (B532-UU). Further, as shown in FIG. 18, the oligonucleotide (RNU-303) of the present invention also suppressed the induction of interferon ⁇ as compared with the corresponding natural double-stranded nucleic acid (SOD385) even for different target genes. As shown in FIG. 13, the modified oligonucleotide (RNU-252), which is not the oligonucleotide of the present invention and in which the two nucleotides at the 5 ′ end are not modified, is more IFN than the corresponding natural double-stranded nucleic acid (B717). It did not inhibit the induction of - ⁇ .
  • the modified oligonucleotide which can suppress the expression of a target gene with few side effects, such as cytokine induction, such as interferon, and the pharmaceutical composition containing the said modified oligonucleotide.

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Abstract

本発明の目的は、インターフェロン等のサイトカイン誘導などの副作用が少なく、標的遺伝子の発現を抑制することができる修飾オリゴヌクレオチド、及び、当該修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の提供することにある。本発明としては、分子内で二重鎖を形成すると平滑末端となり、標的遺伝子の発現を抑制することができる修飾オリゴヌクレオチドを挙げることができる。

Description

修飾オリゴヌクレオチド
　本発明は、新規な修飾オリゴヌクレオチドに関するものである。
 
　１９９８年に、Ｆｉｒｅらは線虫における長鎖二本鎖ＲＮＡによる配列特異的な遺伝子の発現抑制機構をＲＮＡ干渉（以下、「ＲＮＡｉ」という。）として報告した（例えば、非特許文献１を参照。）。その後、ＲＮＡ干渉は線虫を含めて昆虫、植物、菌類等の様々な生物種間で保存されている現象であることが明らかとなった。
　２００１年に、Ｔｕｓｃｈｌらは細胞内に存在するダイサーと呼ばれるＲＮＡａｓｅIII様の活性をもつ酵素によって長鎖二本鎖ＲＮＡから生成される１９個～２３個程度の短い二本鎖ＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」という。）を直接哺乳動物の細胞に導入することにより、非特異的な細胞障害を引き起こさず、配列特異的な遺伝子の発現抑制を行うことができるということを報告した（例えば、非特許文献２を参照。）。
　また、分子内において二重鎖構造を有するＲＮＡ（以下、「ｓｈＲＮＡ」という。）もｓｉＲＮＡの前駆体として働き、ダイサーによってプロセッシングされ、ｓｉＲＮＡと同様の構造になることによってＲＮＡｉを示すと言われている。
 
　一方、生体内には、細菌やウイルス、寄生虫などの異物が体内に進入した際にそれを排除しようとする感染防御システムとして免疫系が存在する。哺乳類の免疫系は大きく分けて、自然免疫と獲得免疫とからなる。獲得免疫は、遺伝子再構成により、無数の個々に異なる抗原特異性を持つ受容体がＴ細胞やＢ細胞表面に発現され、外来抗原に対処する機構である。自然免疫は、主にマクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞などによって担われる。自然免疫は、主に、Ｔｏｌｌ様受容体（以下、「ＴＬＲ」という。）を介して活性化される。ＴＬＲはリガンドを認識すると、炎症性サイトカインやケモカインを誘導し炎症反応を形成する。一方で、細胞表面に共刺激分子の発現を増強させ、Ｔ細胞、すなわち獲得免疫を活性化する作用も有する。ある特定のＴＬＲファミリーメンバーはウイルスの構成成分を特異的に認識し、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を誘導してウイルスに対する免疫応答を行う。ＴＬＲ７（ヒトではＴＬＲ７とＴＬＲ８）がウイルスの一本鎖ＲＮＡを認識することが明らかにされている。
 
　このように、核酸の中には、自然免疫を活性化し、サイトカイン誘導作用を有するものがあるので、生体への核酸投与により、副作用としてＩＦＮを初めとする炎症性サイトカインの誘導が起こり得る。その副作用をどのような手段で回避するかが、核酸医薬の開発において大きな課題の一つとなっている。
 
　従来、核酸を医薬品として開発するにあたって、リボースの２’位にメトキシやフッ素を導入したり、リン酸結合部位にホスホロチオエートを導入することにより、オリゴ核酸を安定化する試みが行われてきた。最近、これら修飾技術を天然型ＲＮＡの自然免疫活性化の回避を目的に使用している報告が数多く見られる（例えば、非特許文献３参照。）。また、天然型ＲＮＡに生体内に存在する修飾ヌクレオシドを入れると、自然免疫活性化作用を回避できる可能性があることが示唆されている（例えば、非特許文献４参照。）。
　しかしながら、過剰な修飾はＲＮＡｉ効果を低下させることが知られており、免疫系を活性化させずにＲＮＡｉ効果を保持する最小限の修飾を、天然型ＲＮＡのＲＮＡｉ効果と比較しつつ、ヌクレオチド配列ごとに確認することが必要である（例えば、非特許文献５参照）。
 
Ｎａｔｕｒｅ，１９９８年，３９１巻，８０６－８１１頁 Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，４１１巻，４９４－４９８頁 Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００６年，３６巻，１－９頁 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００５年，２３巻，１６５－１７５頁 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００８年， １９巻， １１１－１２４頁
　本発明の主な目的は、インターフェロン等のサイトカイン誘導などの副作用が少なく、標的遺伝子の発現を抑制することができる修飾オリゴヌクレオチド、及び、当該修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供することにある。
 
　本発明者らは、ｓｈＲＮＡにおいて、５'末端及び３’末端に２個の一定の（修飾）ヌクレオチドダイマーを付加することにより、標的遺伝子の発現抑制効果を保ちながら、インターフェロン等のサイトカイン誘導などの副作用を少なくしうることを見出し、本発明を完成した。
　本発明として、例えば、下記１、２の態様を挙げることができる。
 
１.　分子内で二重鎖を形成すると平滑末端となり、標的遺伝子の発現を抑制することができる次の一般式（Ｉ）で表される修飾オリゴヌクレオチド（以下、「本発明オリゴヌクレオチド」という。）：
　５'－Ｘ－Ａ－Ｌ－Ｚ－Ｙ－３'　（Ｉ）
　式中、
　Ａは、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部（以下、「標的ヌクレオチド配列」という。）の塩基配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する１５～５０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であって、少なくともＡの５'末端のヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の５'末端のリボヌクレオチドと同じリボヌクレオチドである。
　Ｚは、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と少なくとも８０％の相補性を有する１５～５０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であって、少なくともＺの３'末端のヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の５’末端のヌクレオチドと相補的なリボヌクレオチドである。
　Ｌは、１～２０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分を表す。
　Ｘは次の一般式（１）で表される１価の基（ヌクレオチドダイマー部分（１））を表す。
　Ｙは次の一般式（２）で表される１価の基（ヌクレオチドダイマー部分（２））を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　式中、
　Ｂ１ａ、Ｂ１ｂは、同一又は異なって、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。
　Ｂ２ａ、Ｂ２ｂは、同一又は異なって、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。
　但し、Ｂ１ａとＢ２ａ、Ｂ１ｂとＢ２ｂとは、互いに塩基対を形成しうる核酸塩基である。
　Ｒ１、Ｒ２は、同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ１、Ｒ２の一方がＨを、他方がアルキルを表す。
　＊は結合位置を表す。
 
２．　本発明オリゴヌクレオチドと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物（以下、「本発明組成物」という。）。
 
図１は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＢｃｌ－２タンパク質の発現量を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量をそれぞれ表す。最上段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図２は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現量の比を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図３は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＢｃｌ－２タンパク質の発現量を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量をそれぞれ表す。最上段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図４は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現量の比を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図５は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＢｃｌ－２タンパク質の発現量を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量それぞれ表す。最上段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図６は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現量の比を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図７は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＢｃｌ－２タンパク質の発現量を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量をそれぞれ表す。最上段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図８は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現量の比を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図９は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＢｃｌ－２タンパク質の発現量を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量をそれぞれ表す。最上段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１０は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現量の比を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１１は、ＳＯＤ１タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＳＯＤ１タンパク質の発現量を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量をそれぞれ表す。最上段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１２は、ＳＯＤ１タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、ＳＯＤ１タンパク質の発現量の比を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１３は、インターフェロンαの誘導能を示す。白カラムは１０ｎＭ添加群を、グレーカラムは１００ｎＭ添加群を、黒カラムは３００ｎＭ添加群をそれぞれ表す。縦軸は、インターフェロンαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１４は、インターフェロンαの誘導能を示す。白カラムは１０ｎＭ添加群を、グレーカラムは１００ｎＭ添加群を、黒カラムは３００ｎＭ添加群をそれぞれ表す。縦軸は、インターフェロンαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１５は、インターフェロンαの誘導能を示す。白カラムは１０ｎＭ添加群を、グレーカラムは１００ｎＭ添加群を、黒カラムは３００ｎＭ添加群をそれぞれ表す。縦軸は、インターフェロンαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１６は、インターフェロンαの誘導能を示す。白カラムは１０ｎＭ添加群を、グレーカラムは１００ｎＭ添加群を、黒カラムは３００ｎＭ添加群をそれぞれ表す。縦軸は、インターフェロンαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１７は、インターフェロンαの誘導能を示す。白カラムは１０ｎＭ添加群を、グレーカラムは１００ｎＭ添加群を、黒カラムは３００ｎＭ添加群をそれぞれ表す。縦軸は、インターフェロンαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。 図１８は、インターフェロンαの誘導能を示す。白カラムは１０ｎＭ添加群を、グレーカラムは１００ｎＭ添加群を、黒カラムは３００ｎＭ添加群をそれぞれ表す。縦軸は、インターフェロンαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。下段は、検討を行った医薬組成物中に含まれる核酸の名称を表す。
　本発明の実施の形態について説明する。
Ｉ．本発明オリゴヌクレオチド
　本発明オリゴヌクレオチドは、分子内で二重鎖を形成すると平滑末端となり、標的遺伝子の発現を抑制することができる次の一般式（Ｉ）で表される修飾オリゴヌクレオチドである。
　５'－Ｘ－Ａ－Ｌ－Ｚ－Ｙ－３'　（Ｉ）
［式中、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｌは前記と同義である。］
 
　本発明オリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する１５～５０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分（Ａ）と、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と少なくとも８０％の相補性を有する１５～５０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分（Ｚ）とが、１～２０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分（Ｌ）を介して連結している修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分において、さらにＡの５’末端にヌクレオチドダイマー部分（１）であるＸが付加し、また、Ｚの３’末端にＸと互いに塩基対を形成しうるヌクレオチドダイマー部分（２）であるＹが付加している。
 
　Ｘは標的遺伝子のｍＲＮＡとは無関係に選択されうる。また、ＹはＸと相補的である。
　したがって、本発明オリゴヌクレオチドは、分子内で二重鎖を形成すると、５’末端と３’末端のどちらもが突き出ることなく対になり、平滑末端となる。
 
　本発明オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を抑制することができる。また、本発明オリゴヌクレオチドは、生体内に投与又は細胞内に導入された場合に、インターフェロンを初めとするサイトカインの誘導が少ないという特徴を有する。
 
　次の（ａ）～（ｄ）に記載の本発明オリゴヌクレオチドが好ましい。
（ａ）Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がアデニンであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂが、それぞれ同一又は異なって、５－メチルウラシル、ウラシル、又は、ヒポキサンチンである本発明オリゴヌクレオチド。当該態様において、Ｒ１、Ｒ２の両方がメチルであるか、Ｒ１がメチルであって、Ｒ２がＨであるか、Ｒ１がＨであって、Ｒ２がメチルである本発明オリゴヌクレオチドが特に好ましい。
（ｂ）Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がウラシルであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂの両方がアデニンである本発明オリゴヌクレオチド。当該態様において、Ｒ１、Ｒ２の両方がメチルであるか、Ｒ１がメチルであって、Ｒ２がＨであるか、Ｒ１がＨであって、Ｒ２がメチルである本発明オリゴヌクレオチドが特に好ましい。
（ｃ）Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がグアニンであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂの両方がシトシンである本発明オリゴヌクレオチド。当該態様において、Ｒ１、Ｒ２の両方がメチルであるか、Ｒ１がメチルであって、Ｒ２がＨであるか、Ｒ１がＨであって、Ｒ２がメチルである本発明オリゴヌクレオチドが特に好ましい。
（ｄ）Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がシトシンであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂの両方がグアニンである本発明オリゴヌクレオチド。当該態様において、Ｒ１、Ｒ２の両方がメチルであるか、Ｒ１がメチルであって、Ｒ２がＨであるか、Ｒ１がＨであって、Ｒ２がメチルである本発明オリゴヌクレオチドが特に好ましい。
 
　また、Ｌが次の一般式（３）で表される２価の基である本発明オリゴヌクレオチドが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　式中、
　各Ｂ３は、それぞれ独立して、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。
　各Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、又はアルコキシを表す。
　ｎは、１～２０の範囲内にある整数を表す。
　＊は前記と同義である。
 
　各Ｂ３が、それぞれ独立して、アデニン、シトシン、ウラシル、５－メチルウラシル又はヒポキサンチンである本発明オリゴヌクレオチドが好ましい。
　また、各Ｒ３が、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ又はメトキシである本発明オリゴヌクレオチドが好ましく、各Ｒ３が全てメトキシである本発明オリゴヌクレオチドがさらに好ましい。
　ｎは、１～２０の範囲内にある整数が適当であり、２～１５の範囲内にある整数が好ましく、３～１０の範囲内にある整数が特に好ましい。
 
　ここで、「標的遺伝子の発現を抑制することができる」とは、標的遺伝子の発現を当該標的遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、本発明オリゴヌクレオチドを導入した細胞において、陰性対照に対して、抑制率が５０％以上である場合をいう。なお、当該標的遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が陰性対照のそれと等しい場合を抑制率が０％であるとする。また、本発明において、好ましい抑制率は７５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。
 
　「サイトカインの誘導が少ない」とは、サイトカインの誘導が完全に阻害される場合だけではなく、本発明オリゴヌクレオチドに対応する天然型二本鎖核酸よりも少なくとも２０％誘導が減じられる場合も含む。また、サイトカインの誘導の阻害も試験系や被験体によって、程度が異なることがあるので、少なくとも一つの系又は被験体においてサイトカイン誘導が完全に阻害される場合あるいは減じられる場合も、サイトカインの誘導が少ないことに含まれる。
　「サイトカイン」としては、例えば、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、及び、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）が挙げられる。
 
　「標的遺伝子」は、特に制限されず、任意に選択することができる。標的遺伝子としては、例えば、疾患の原因となりうるタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。また、標的遺伝子には、各種疾患等に対して、抑制的に作用する遺伝子又は促進的に作用する遺伝子も含まれる。
　具体的には、癌関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、血液学的悪性疾患関連遺伝子、代謝性疾患関連遺伝子、循環器疾患関連遺伝子、神経疾患関連遺伝子、泌尿器疾患関連遺伝子、自己免疫疾患関連遺伝子、サイトカイン遺伝子、発生関連遺伝子、増殖因子関連遺伝子、老化関連遺伝子、免疫関連遺伝子、ウイルス遺伝子、ウイロイド遺伝子、プリオン遺伝子、微生物由来遺伝子、原虫由来遺伝子を挙げることができる。
 
　「癌関連遺伝子」としては、例えば、癌遺伝子（例えば、ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子、ｃ－ｆｍｓ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、ｃ－ｍｙｂ遺伝子、ｃ－ｍｙｃ遺伝子、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、ｃ－ｅｒｂＢ－２遺伝子）や癌抑制遺伝子（例えば、ｐ５３遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＢＲＣＡ１・ＢＲＣＡ２遺伝子、ＷＴ１遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｂｃｌ－２遺伝子、ｂｃｌ－ＸＩ遺伝子）を挙げることができる。
　「ウイルス遺伝子」としては、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス遺伝子、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）遺伝子を挙げることができる。
　「ウイロイド遺伝子」としては、例えば、ジャガイモやせいも病ウイロイド（ＰＳＴＶ）遺伝子を挙げることができる。
　「自己免疫疾患関連遺伝子」としては、例えば、腫傷壊死因子（ＴＮＦ）－α遺伝子を挙げることができる。
「サイトカイン遺伝子」としては、例えば、インターフェロン遺伝子、インターロイキン遺伝子を挙げることができる。
　「発生関連遺伝子」としては、例えば、ホメオ遺伝子を挙げることができる。
　「増殖因子関連遺伝子」としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）遺伝子を挙げることができる。
　「プリオン遺伝子」としては、例えば、ヒトプリオン遺伝子、ウシプリオン遺伝子を挙げることができる。
　「微生物由来遺伝子」としては、例えば、Ｏ１５７等の病原性大腸菌由来遺伝子を挙げることができる。
　「原虫由来遺伝子」としては、例えば、マラリア原虫由来遺伝子を挙げることができる。
 
　Ａとしては、標的遺伝子の発現を抑制することができる限りにおいて、標的ヌクレオチド配列の塩基配列に対して、少なくとも８０％の配列類似性を有する修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であるものが適当であり、少なくとも９０％の配列類似性を有する修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であるものが好ましく、１００％同一の塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であるものがより好ましい。さらに、Ａとしては、標的ヌクレオチド配列と全く同じヌクレオチド配列であるものが好ましい。
 
　標的ヌクレオチド配列の塩基配列とＡの塩基配列との配列類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）及び　Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムは、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。デフォルトパラメーター（期待値１０以下；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）を使用する。］を用いて計算し決定する。
 
　Ａ及びＺに係る修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分は、１５～５０塩基長が適当であり、２０～４５塩基長が好ましく、２２～４２塩基長がより好ましい。
 
　本発明オリゴヌクレオチドにおいて、ＡとＺとは互いに分子内で二重鎖を形成しうるように配置される。
　本発明オリゴヌクレオチドは、分子内で必ずしも完全な二重鎖を形成する必要はないが、ＡとＺに係る修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分は、同じ塩基長であるものが好ましい。
 
　Ｚとしては、標的遺伝子の発現を抑制することができる限りにおいて、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と少なくとも８０％の相補性を有する塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であるものが適当であり、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と少なくとも９０％の相補性を有する塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であるものが好ましく、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と１００％の相補性を有する塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であるものがより好ましい。さらに、Ｚとしては、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と１００％の相補性を有する塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であって、該オリゴヌクレオチド部分を構成する各ヌクレオチドがリボヌクレオチドであるものがより好ましい。
 
　標的ヌクレオチド配列の塩基配列とＺの塩基配列との相補性は、標的ヌクレオチド配列の塩基配列とワトソン・クリック型塩基対又はＷｏｂｂｌｅ塩基対を形成するように変換して得られる塩基配列とＺの塩基配列との配列類似性を、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）及び　Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムは、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。デフォルトパラメーター（期待値１０以下；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）を使用する。］を用いて計算し決定する。
　上記計算式で配列類似性が８０％であれば、標的ヌクレオチド配列の塩基配列とＺの塩基配列との相補性は８０％であり、配列類似性が１００％であれば、当該相補性は１００％である。
 
　また、本明細書において、「相補的」であるとは、ワトソン・クリック型塩基対やＷｏｂｂｌｅ塩基対となりうる関係をいう。
　塩基対を形成しうる核酸塩基の組合せとしては、ワトソン・クリック型塩基対やＷｏｂｂｌｅ塩基対が挙げられ、例えば、以下のようなものがある。
（１）アデニンと塩基対を形成しうる核酸塩基：５－メチルウラシル、ウラシル、ヒポキサンチン
（２）グアニンと塩基対を形成しうる核酸塩基：シトシン、ウラシル
（３）ウラシル、５－メチルウラシルと塩基対を形成しうる核酸塩基：アデニン、ヒポキサンチン、グアニン
（４）シトシンと塩基対を形成しうる核酸塩基：グアニン、ヒポキサンチン
 
　本発明において、核酸塩基としては、例えば、プリン塩基、ピリミジン塩基を挙げることができる。
　プリン塩基としては、例えば、２－アミノプリン、２－アミノ－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（グアニン）、６－アミノ－９Ｈ－プリン（アデニン）、８－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、２，６，８－トリアミノプリン、６，８－ジアミノプリン、６－アミノ－２－ヒドロキシプリン、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン、８－アミノ－６－ヒドロキシプリン、６－アミノ－８－ヒドロキシプリン、６－ヒドロキシプリン、２，６－ジヒドロキシプリン、３，７－ジヒドロプリン－６－オン（ヒポキサンチン）又はそれらの互変異性体を挙げることができる。
　ピリミジン塩基としては、例えば、５－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－２，４－ジオン（チミン、又は、５－メチルウラシル）、４－アミノピリミジン－２（１Ｈ）－オン（シトシン）、ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン（ウラシル）、４，５－ジアミノピリミジン－２－オン、４，６－ジアミノピリミジン－２－オン、５－アミノピリミジン－２，４－ジオン、６－アミノピリミジン－２，４－ジオン、５－アミノピリミジン－２－オン、６－アミノピリミジン－２－オン、２，４－ジヒドロキシピリミジン又はそれらの互変異性体を挙げることができる。
 
　Ａ、Ｚに係る未修飾オリゴヌクレオチド部分を構成する各ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドを表す。
　Ａ、Ｚに係る修飾オリゴヌクレオチド部分を構成する各ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドを表し、Ａ、Ｚに係る修飾オリゴヌクレオチド部分の少なくとも１つのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
　本明細書において、リボヌクレオチドとは、リボースとリン酸エステルと核酸塩基からなるヌクレオチドであって、かかる核酸塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルであるものをいう。
　本明細書において、デオキシリボヌクレオチドとは、デオキシリボースとリン酸エステルと核酸塩基からなるヌクレオチドであって、かかる核酸塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンであるものをいう。
　本明細書において、修飾ヌクレオチドとは、次の（Ｉ）～（ＩＶ）のいずれかで表されるヌクレオチドをいう。
（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　　　　　　　　　　　　　　　　　 
　式中、ＢＡはハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される基が１～３個置換されている核酸塩基を表す。Ｔ１は、Ｈ又はＯＨを表す。＊は前記と同義である。［Ｐ］は、次の一般式で表される基を表す。
（式中、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣは、同一又は異なって、アルキルを表す。＊は前記と同義である。）
 
（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　式中、ＢＢはハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される基が１～３個置換されていてもよい核酸塩基を表す。Ｔ２は、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ、又はハロゲンを表す。［Ｐ］は、前記と同義である。＊は前記と同義である。
 
（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　式中、ＢＢ、［Ｐ］、＊は、前記と同義である。Ｔ３は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ、又はハロゲンを表す。
 
（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　式中、ＢＢ、［Ｐ］、＊は、前記と同義である。Ｄは、単結合、メチレン、エチレン、－Ｎ（ＣＨ３）－、又は－ＯＣＨ２－を表す。（例えば、Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４：４５５－４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：３６０７－３６３０、ＷＯ０３／０６８７９５、ＷＯ２００５／０２１５７０を参照。）
 
　ここで、「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルキルを挙げることができる。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ｎ－ヘキシル及びイソヘキシルを挙げることができる。これらの中で、メチルが好ましい。
　「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルコキシを挙げることができる。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。これらの中で、メトキシが好ましい。
　「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
　「アリール」としては、例えば、炭素数６～１０のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。
　「アシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルカノイル、炭素数７～１３のアロイルを挙げることができる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ－プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ－ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ－ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニルを挙げることができる。
　「アリールアルキル」、「アリールアルキルオキシ」、「アルコキシアルキル」、「アルコキシアルキルオキシ」、「アルキルチオ」、「アルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」、「アミノアルキルオキシ」、「アルキルアミノアルキルオキシ」、「ジアルキルアミノアルキルオキシ」、「アリールオキシアルキル」及び「アリールオキシアルキルオキシ」の「アルキル」部分としては、上記の「アルキル」と同じものを挙げることができる。
　「アルコキシアルキル」及び「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分は、上記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
　「アリールアルキル」、「アリールオキシアルキル」、「アリールアルキルオキシ」、「アリールオキシアルキルオキシ」及び「アリールオキシ」の「アリール」部分としては、上記の「アリール」と同じものを挙げることができる。
　「アルキル」、「アリール」の置換基である「ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。
 
　本発明オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロアミダイト法［例えば、２’位水酸基が、２’－（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）化（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，３５（１０）：３２８７－３２９６（２００７）参照。）、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）化（例えば、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，８４：３７７５－３７９５（２００１）参照。）、２’－ビス（アセトキシメトキシ）メチルエチル（ＡＣＥ）化（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：１１８２０－１１８２１（１９９８）参照。）又は２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）化されたリボヌクレオチドホスホロアミダイト化合物（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５７６４（１９８８）参照。）を使用する方法］若しくはＨ－ホスホネート法による固相合成法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２（１）：９４－９９（１９９４）参照。）によって、又はトリエステル法による液相合成法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：５４９３－５４９７（１９８１）参照。）によって製造することができる。
 
　本発明オリゴヌクレオチドは、例えば、標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が原因となっている疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。
　例えば、癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患、泌尿器疾患、血液学的悪性疾患、又はアポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。
 
　本発明オリゴヌクレオチドは、例えば、癌関連遺伝子であるｂｃｌ－２関連遺伝子、とりわけｂｃｌ－２遺伝子（例えば、配列番号４３）のコードするタンパク質の異常な発現が原因となって起こる疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。
 
　Ｂｃｌ－２遺伝子の発現を抑制することができる本発明オリゴヌクレオチドの具体例として、次の（１）～（２７）の修飾オリゴヌクレオチドを挙げることができる。
　なお、本明細書において使用する「ｒＡ」、「ｒＵ」、「ｒＧ」、「ｒＣ」、「ｒＩ」、「ｒＴ」、「ｄＴ」、「ａ」、「ｕ」、「ｇ」及び「ｃ」の各記号は、それぞれ次の表１に記載の部分構造式を有するヌクレオチドを表す。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 （１）ＲＮＵ－２５１（配列番号９）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（２）ＲＮＵ－２６８（配列番号１０）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｒＴｒＴｒＴｒＴｒＴｒＴｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（３）ＲＮＵ－２６９（配列番号１１）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（４）ＲＮＵ－２７２（配列番号１２）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＩｒＩ－３’
（５）ＲＮＵ－２９１（配列番号１３）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（６）ＲＮＵ－２９２（配列番号１４）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＡｒＡｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＵｒＵｒＧｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（７）ＲＮＵ－２９３（配列番号１５）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＡｒＡｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＡｒＵｒＵｒＵｒＧｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（８）ＲＮＵ－２９４（配列番号１６）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＡｒＡｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＡｒＵｒＧｕｕｕｕｕｕｒＣｒＡｒＵｒＡｒＵｒＵｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＡｒＵｒＵｒＵｒＧｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（９）ＲＮＵ－２９５（配列番号１７）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１０）ＲＮＵ－２９６（配列番号１８）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１１）ＲＮＵ－２９７（配列番号１９）
５’－ａｒＡｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１２）ＲＮＵ－２９８（配列番号２０）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＵ－３’
（１３）ＲＮＵ－２９９（配列番号２１）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＵｒＵｒＵｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１４）ＲＮＵ－３１５（配列番号２２）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣａａａａａａｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１５）ＲＮＵ－３１６（配列番号２３）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｇｇｇｇｇｇｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１６）ＲＮＵ－３１７（配列番号２４）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｃｃｃｃｃｃｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１７）ＲＮＵ－３１８（配列番号２５）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＩｒＩｒＩｒＩｒＩｒＩｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（１８）ＲＮＵ－３１９（配列番号２６）
５’－ｇｇｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＣｒＣ－３’
（１９）ＲＮＵ－３２０（配列番号２７）
５’－ｕｕｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡ－３’
（２０）ＲＮＵ－３２２（配列番号２８）
５’－ａｒＡｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＴ－３’
（２１）ＲＮＵ－３２３（配列番号２９）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＴ－３’
（２２）ＲＮＵ－３２４（配列番号３０）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＵ－３’
（２３）ＲＮＵ－３２５（配列番号３１）
５’－ｒＡａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
（２４）ＲＮＵ－３２１（配列番号３２）
５’－ｃｃｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＧｒＧ－３’
（２５）ＲＮＵ－２７６（配列番号３３）
５’－ａａｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＴｒＴ－３’
（２６）ＲＮＵ－２７７（配列番号３４）
５’－ａａｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｒＵｕｕｕｕｕｕｒＡｒＧｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＴｒＴ－３’
（２７）ＲＮＵ－２７８（配列番号３５）
５’－ａａｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｕｕｕｕｕｕｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＴｒＴ－３’
 
　上記（１）～（２４）の本発明オリゴヌクレオチドは、公知のｂｃｌ－２　ｓｉＲＮＡである、Ｂ７１７のセンス鎖（配列番号１）及びアンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド配列を含む修飾オリゴヌクレオチドであり、ｂｃｌ－２遺伝子の発現を抑制するとともに、Ｂ７１７と比較してインターフェロンαを誘導しないという特徴を有する。
　また、上記（２５）～（２７）の本発明オリゴヌクレオチドは、公知のｂｃｌ－２　ｓｉＲＮＡであるＢ５３２－ＵＵのセンス鎖（配列番号５）及びアンチセンス鎖（配列番号６）のヌクレオチド配列を含む修飾オリゴヌクレオチドであり、ｂｃｌ－２遺伝子の発現を抑制するとともに、Ｂ５３２－ＵＵと比較してインターフェロンαを誘導しないという特徴を有する。
 
　ｓｏｄ１遺伝子の発現を抑制することができる本発明オリゴヌクレオチドの具体例として、次の修飾オリゴヌクレオチドを挙げることができる。
 
（１）ＲＮＵ－３０３（配列番号３６）
５’－ａａｒＧｒＧｒＵｒＧｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＡｒＡｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＡｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＵｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＵｒＵｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＵｒＵｒＵｒＣｒＣｒＡｒＣｒＣｒＴｒＴ－３’
 
　上記（１）の本発明オリゴヌクレオチドは、公知のｓｏｄ１　ｓｉＲＮＡである、ＳＯＤ３８５のセンス鎖（配列番号７）及びアンチセンス鎖（配列番号８）のヌクレオチド配列を含む修飾オリゴヌクレオチドであり、ｓｏｄ１遺伝子の発現を抑制するとともに、ＳＯＤ３８５と比較してインターフェロンαを誘導しないという特徴を有する。
 
ＩＩ．本発明組成物
　本発明組成物は、本発明オリゴヌクレオチドと担体との複合体を含有することを特徴とするものである。
 
　上記担体としては、本発明オリゴヌクレオチドを細胞内に移行させるのに有効なものであれば特に制限さない。例えば、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー、カチオン性デンドリマー等のカチオン性担体、ウイルスエンベロープ又はナノ粒子を利用した担体を挙げることができる。
　「カチオン性リポソーム」としては、例えば、
（１）２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるカチオン性リポソーム担体（以下、「リポソームＡ」という。）、
（２）２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム（以下、「リポソームＢ」という。）、
（３）２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＤＳＰＥ－０２０Ｃ；日本油脂社製］及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム（以下、「リポソームＣ」という。）、
（４）オリゴフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（５）リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（６）リポフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（７）セルフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（８）リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（９）ＤＭＲＩＥ－Ｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（１０）ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
（１１）ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社製）、
（１２）ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ社製）を挙げることができる。
　それらの中で、リポソームＡ、リポソームＢ、リポソームＣが好ましい。
 
　２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールは、文献（ＷＯ９４／１９３１４の実施例２０）に記載の方法により製造することができる。
　１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミンは、文献（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｖｏｌ．６８，ｎｏ．２１（２００８）ｐｐ．８８４３－８８５１）に記載の方法により製造することができる。当該化合物は、分子量２０００～３８００の範囲内で分布するものが好ましい。なお、分子量は、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルで測定することができる。
 
　リポソームＡ、リポソームＢ及びリポソームＣにおいて使用しうるリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン［例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン］、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの水素添加リン脂質を挙げることができる。
 
　リポフェクチン（登録商標）は、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）と中性脂質としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
　リポフェクトアミン（登録商標）は、２，３－ジオレキシオロキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウム　トリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を３：１（ｗ／ｗ）で含むカチオン性リポソームである。
　セルフェクチン（登録商標）は、Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３－テトラメチル－テトラパルミチルスペルミン（ＴＭ－ＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を１：１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
　ＤＭＲＩＥ－Ｃ（登録商標）は、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）とコレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
　「カチオン性ポリマー」としては、例えば、ｊｅｔＳＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、アテロコラーゲンを挙げることができる。
　「ウイルスエンベロープ」としては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ（登録商標）（ＨＶＪ－Ｅリポソーム；石原産業社製）を挙げることができる。
　「カチオン性デンドリマー」としては、例えば、カチオン性アミノ酸デンドリマー（例えば、デンドリックポリ（Ｌ－リジン）（例えば、“Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００３年、１巻、１２７０－１２７３頁）又はポリアミドアミンデンドリマーを挙げることができる。
　「ナノ粒子」としては、例えば、金ナノ粒子、シリカナノ粒子を挙げることができ、その平均粒子径としては、例えば、１ｎｍ～５０００ｎｍの範囲内が適当である。
　「金ナノ粒子」としては、例えば、カチオン性金ナノ粒子（“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００２年、１３巻、３－６頁）、ポリエチレングリコールで修飾されたカチオン性金ナノ粒子（例えば、“Ｊｏuｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ”、２００６年、１１１巻、３８２－３８９頁）を挙げることができる。
 
　本発明組成物には、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６～２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
 
　本発明組成物中に含まれる本発明オリゴヌクレオチドの種類は、一種類であってもよいが、例えば、２～１０の複数種であってもよい。
 
　本発明組成物中に含まれる本発明オリゴヌクレオチドの濃度は、担体の種類等によって異なるが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合には、例えば、０．１ｎＭ～１０μＭの範囲内が適当であり、１０ｎＭ～１μＭの範囲内が好ましい。また、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合には、例えば、０．１～１０ｍｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、０．５～２ｍｇ／ｍＬの範囲内か好ましい。
　本発明組成物中に含まれる本発明オリゴヌクレオチドと担体との重量比（担体／本発明オリゴヌクレオチド）は、本発明オリゴヌクレオチドの性質、担体の種類等によって異なるが、０．０１～１００の範囲内が適当であり、１～５０の範囲内が好ましく、５～３０の範囲内がより好ましい。
 
　本発明組成物は、担体の分散液に本発明オリゴヌクレオチドを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明オリゴヌクレオチドの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明オリゴヌクレオチドを添加する際に用い得る溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨ及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
 
　本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－４０～－２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０～１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５～２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。当該凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５～２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
 
　本発明オリゴヌクレオチドないし本発明組成物は、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与（例えば、膀胱内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与）、経皮投与、経粘膜投与、経肺投与又は経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与されるのはもちろんである。
 
　本発明オリゴヌクレオチドないし本発明組成物の投与量は、本発明オリゴヌクレオチドの種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質や程度を考慮した上で、例えば、成人に対して、１日当たり、本発明オリゴヌクレオチドとして０．１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が適当であり、好ましくは本発明オリゴヌクレオチドとして１ｍｇ～２ｇ／ヒトの範囲内である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
 
　以下に参考例、製造例、試験例により本発明をさらに詳述する。但し、本発明は、下記に限定されないことは言うまでもない。
 
参考例１　メチルチオメチル　２－シアノエチルエーテル
　３２ｇの３－ヒドロキシプロピオニトリル（４５０ｍｍｏｌ）を４５０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、３２４ｍＬの無水酢酸、２３１ｍＬの酢酸を加え室温で２４時間攪拌した。９９０ｇの炭酸水素ナトリウムを４．５Ｌの水に溶解した溶解液を調製し、これに反応液を一時間かけて滴下した。滴下終了後、そのまま一時間攪拌した。反応液に酢酸エチルを加えて抽出操作を行った。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥した後、酢酸エチルを留去し得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、無色油状物の目的化合物を４１ｇ得た（収率７０％）。
 
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　２．１８（ｓ，３Ｈ）；２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；４．６９（ｓ，２Ｈ）
 
参考例２　３’，５’－Ｏ－（テトライソプロピルジシロキサン－１，３－ジイル）イノシン
　イノシン（５３ｇ，１９７．６ｍｍｏｌ）、イミダゾール（２６．９ｇ，３９５．２ｍｍｏｌ）に脱水ピリジン（４３０ｍＬ）を加え、氷冷下、１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサン（６５．４ｇ，２０７．３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で終夜撹拌した。反応液にメタノール（２０ｍＬ）を加えて減圧濃縮後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水、０．５Ｍ　リン酸二水素カリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去し、残渣に酢酸エチル（２００ｍＬ）を加えて粉末化した。析出晶をろ取し、氷冷した酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄後、乾燥し、７６ｇの目的化合物を得た（収率７５％）。
 
ＥＳＩ－Ｍａｓｓ：５１１［Ｍ＋Ｈ］＋
 
元素分析値　（Ｃ２２Ｈ３８Ｎ４Ｏ６Ｓｉ２・０．１Ｈ２Ｏとして）
計算値（％）　Ｃ：５１．５５　Ｈ：７．５１　Ｎ：１０．９３
分析値（％）　Ｃ：５１．１７　Ｈ：７．５１　Ｎ：１０．９７
 
参考例３　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシンの製造
 
工程１　３’，５’－Ｏ－（テトライソプロピルジシロキサン－１，３－ジイル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシン
　３’，５’－Ｏ－（テトライソプロピルジシロキサン－１，３－ジイル）イノシン（４８．０ｇ，９４．０ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（２４ｇ）に脱水テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）を加え、－４５℃に冷却下、トリフルオロメタンスルホン酸（２８．２ｇ，１８７．９ｍｍｏｌ）を２０分間かけて滴下した。次いで、２－シアノエチル　メチルチオメチルエーテル（１４．８ｇ，１１２．８ｍｍｏｌ）を加えた後、Ｎ－ヨードスクシンイミド（３１．７１ｇ，１４０．９ｍｍｏｌ）を加え、１５分間撹拌した。反応液にトリエチルアミン（２６．６ｍＬ）を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和チオ硫酸ナトリウムの混合溶液（１／１）にあけ、酢酸エチルで抽出操作を行った。飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、３７．０ｇの３’，５’－Ｏ－（テトライソプロピルジシロキサン－１，３－ジイル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシンを得た（収率：６６％）。
 
工程２　２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシン
　３’，５’－Ｏ－（テトライソプロピルジシロキサン－１，３－ジイル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシン（３７ｇ，６２．３ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミントリスヒドロフルオリド（１０ｇ，６２．３ｍｍｏｌ）を加えて４５℃にて２時間撹拌した。反応液を氷冷後、上清を除き、残渣にメタノール（８０ｍＬ）を加え氷冷して結晶化した。析出晶をろ取し、氷冷したメタノール（５０ｍＬ）で洗浄後乾燥して２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシンを得た（収率：８４％）。
 
工程３　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシン
　２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシン（１８．４ｇ，５２．４ｍｍｏｌ）、に脱水テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）と脱水ピリジン（１５０ｍＬ）を加え、さらに４，４’－ジメトキシトリチルクロライド（２３．１ｇ，６８．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜撹拌した。反応液を氷冷し、メタノール（１０ｍＬ）を加えて室温で１０分撹拌後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシンを得た（収率：９０％）。
 
参考例４　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）
　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシン（５１．６ｇ，７８．９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアミンテトラゾリド（１７．６ｇ，１０２．６ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（２０ｇ）に脱水アセトニトリル（４１６ｍＬ）を加えた後、ビス（ジイソプロピルアミン）シアノエチルホスファイト（３０．９ｇ，１０２．６ｍｍｏｌ）を加えて４０℃で７時間撹拌した。反応液を氷冷後ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、５５．５ｇの目的化合物を得た（収率８２％）。
 
３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：　１５２．５９８，１５２．８１２
 
参考例５　天然型二本鎖核酸の製造
　次の（１）の天然型二本鎖核酸は、ＷＯ２００４／１０６５１１号の実施例１　ｉ）に記載された方法に準じて製造した。また、次の（２）～（４）の天然型二本鎖核酸は株式会社日本バイオサービスから購入した。
 
（１）Ｂ７１７：（ｂｃｌ－２　ｓｉＲＮＡ）
　センス鎖　（配列番号１）：
　　　５’－ｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｄＴｄＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６６６９．１５
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６６６９．１０
　アンチセンス鎖　（配列番号２）：
　　　５’－ｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｄＴｄＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６６４６．１１
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６６４６．６９
 
（２）Ｂ７１７－ＵＵ：（ｂｃｌ－２　ｓｉＲＮＡ）
　センス鎖　（配列番号３）：
　　　５’－ｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＵｒＵ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６６７３．１１
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６６７３．６３
　アンチセンス鎖　（配列番号４）：
　　　５’－ｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＵ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６６５０．０７
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６６５２．２０
 
（３）Ｂ５３２－ＵＵ：（ｂｃｌ－２　ｓｉＲＮＡ）
　センス鎖　（配列番号５）：
　　　５’－ｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＧｒＧｒＣｒＵｒＵ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６６７２．０１
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６６７１．２２
　アンチセンス鎖　（配列番号６）：
　　　５’－ｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＵｒＵ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６６６５．９５
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６６６６．８３
 
（４）ＳＯＤ３８５：（ｓｏｄ１　ｓｉＲＮＡ）
　センス鎖　（配列番号７）：
　　　５’－ｒＧｒＧｒＵｒＧｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＡｒＡｒＡｒＧｒＵｒＡｄＴｄＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６８４４．２１
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６８４５．１０
　アンチセンス鎖　（配列番号８）：
　　　５’－ｒＵｒＡｒＣｒＵｒＵｒＵｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＵｒＵｒＵｒＣｒＣｒＡｒＣｒＣｄＴｄＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　６４２５．８０
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　６４２７．５４
 
参考例６　天然型二本鎖核酸と担体との複合体を含有する組成物の製造
（１）担体（リポソームＡ）の調製
　文献（ＷＯ９４／１９３１４の実施例２０）に記載の方法により製造した２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール　６０ｍｇと１００ｍｇの卵黄レシチン（キューピー社製）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１０００ｍｇのマルトース（林原社製）、４．０ｍＬの注射用水及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブ（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ－２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて、１０分間超音波処理を行った。その後、注射用水を用いて１０ｍＬになるように定容し、１６ｍｇ／ｍＬの分散液を調製した。
 
（２）医薬組成物の調製
　参考例５で製造した配列番号１～配列番号８から選ばれる、相補性を有するセンス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸とをそれぞれ注射用水で溶解した。各核酸を等モルで混合し、１０％マルトース溶液（大塚製薬工場社製、以下同じ。）で希釈した。上記（１）で調製した担体を１０％マルトース溶液にて適宜希釈し、同容量の本発明オリゴヌクレオチドの１０％マルトース溶液を攪拌しながら少量ずつ滴下して、本発明オリゴヌクレオチドと担体との複合体（医薬組成物）を形成させた。
　複合体中の本発明オリゴヌクレオチドの濃度は０．１μＭ～３μＭであり、複合体中の本発明オリゴヌクレオチドと担体との比率は１：１６（ｗ／ｗ）であった。なお、調製した複合体は１０％マルトースで適宜希釈した。
 
製造例１　修飾オリゴヌクレオチドの製造
（１）ＲＮＵ－２５１（配列番号９）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
 
　ＷＯ２００６／０２２３２３Ａ１に記載された方法に準じて、目的とする修飾オリゴヌクレオチドの製造を行った。
　核酸原料として５－メチルウリジンを用い、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）－５－メチルウリジンを合成した。それを担持させたＣＰＧ固相担体（３２ｍｇ，０．８μｍｏｌ）をフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）：アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、標記核酸を製造した。
　核酸モノマー化合物として、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）ウリジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（ＷＯ２００６／０２２３２３Ａ１、実施例２）、Ｎ４－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）シチジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（ＷＯ２００６／０２２３２３Ａ１、実施例５）、Ｎ６－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）アデノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（ＷＯ２００６／０２２３２３Ａ１、実施例９）、Ｎ２－フェノキシアセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）グアノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（ＷＯ２００６／０２２３２３Ａ１、実施例１２）、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メチル　ウリジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）、Ｎ４－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メチル　シチジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）、Ｎ６－フェノキシアセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メチル　アデノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）、Ｎ２－イソプロピルフェノキシアセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メチル　グアノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）を、縮合触媒として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾール／２，６－ルチジン溶液を使用した。
　核酸モノマー化合物を５３回縮合させた後、ＣＰＧ固相担体を切り出し剤として濃アンモニア水－エタノール混合液を用いて、４０℃で２時間かけてＣＰＧ固相担体から切り出し及び塩基の保護基の脱離反応を行った。反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下にて濃縮した。残渣に０．５％のニトロメタンを含む０．６７ＭのテトラブチルアンモニウムフルオリドのＤＭＳＯ溶液（１．５ｍｌ）を加えて室温で５時間反応し、２’位の水酸基の保護基を脱離した。反応液に１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（１．０ｍｌ）を氷冷下加え、この溶液をエタノール（１０ｍｌ）に滴下し、生じた沈殿を逆相カラム（ＯＤＳ）にて精製した（溶出溶媒：アセトニトリル－５０ｍＭ　トリエチルアミン－酢酸緩衝液）。残渣を減圧下にて濃縮して目的とする核酸を得た。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３４４．４０　
　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３２７．１３　
 
　以下、配列番号１０～配列番号４２に係る修飾オリゴヌクレオチドは、上記（１）ＲＮＵ－２５１（配列番号９）に準じた方法で製造した。ただし、３’末端がＵの修飾オリゴヌクレオチドを製造する場合には、市販の５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（ｔ－ブチルジメチルシリル）ウリジンを担持したＣＰＧ固相担体を、３’末端がＡの核酸を製造する場合には、市販のＮ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（ｔ－ブチルジメチルシリル）アデニンを担持したＣＰＧ固相担体を、３’末端がシチジンの修飾オリゴヌクレオチドを製造する場合には、Ｎ４－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（ｔ－ブチルジメチルシリル）シチジンを担持したＣＰＧ固相担体を、３’末端がＩの修飾オリゴヌクレオチドを製造する場合には、以下の合成法に従って５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）イノシンを合成し、それを坦持させたＣＰＧ固相担体を使用した。
 
（２）ＲＮＵ－２６８（配列番号１０）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｒＴｒＴｒＴｒＴｒＴｒＴｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ    ：計算値　１７３４４．４０
　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３４３．９０
 
（３）ＲＮＵ－２６９（配列番号１１）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ    ：計算値　１７２４８．４０
　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７２４７．７０
 
（４）ＲＮＵ－２７２（配列番号１２）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＩｒＩ－３’
　　　ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ    ：計算値　１７３６４．４０
　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３６４．３０
 
（５）ＲＮＵ－２９１（配列番号１３）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３５９．４１
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３５９．９７
 
（６）ＲＮＵ－２９２（配列番号１４）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＡｒＡｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＵｒＵｒＧｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　２１８２２．０３
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　２１８８６．５７
 
（７）ＲＮＵ－２９３（配列番号１５）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＡｒＡｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＡｒＵｒＵｒＵｒＧｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　２６２９９．６７
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　２６３５７．８７
 
（８）ＲＮＵ－２９４（配列番号１６）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＡｒＡｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＡｒＵｒＧｕｕｕｕｕｕｒＣｒＡｒＵｒＡｒＵｒＵｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＡｒＵｒＵｒＵｒＧｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　２９４９１．５４
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　２９７５４．８６
 
（９）ＲＮＵ－２９５（配列番号１７）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１６３９８．８４
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１６３９９．６３
 
（１０）ＲＮＵ－２９６（配列番号１８）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１８６４０．１８
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１８６３９．７２
 
（１１）ＲＮＵ－２９７（配列番号１９）
５’－ａｒＡｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３４５．３９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３３１．３６
 
（１２）ＲＮＵ－２９８（配列番号２０）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＵ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３３１．３６
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３８２．８３
 
（１３）ＲＮＵ－２９９（配列番号２１）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＵｒＵｒＵｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７２７５．２５
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７２６９．７７
 
（１４）ＲＮＵ－３１５（配列番号２２）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣａａａａａａｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７４９７．６５
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７５０１．０２
 
（１５）ＲＮＵ－３１６（配列番号２３）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｇｇｇｇｇｇｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７５９３．６５
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７５９６．１１
 
（１６）ＲＮＵ－３１７（配列番号２４）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｃｃｃｃｃｃｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３５３．５１
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３５３．１５
 
（１７）ＲＮＵ－３１８（配列番号２５）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｒＩｒＩｒＩｒＩｒＩｒＩｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７４１９．４０
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７４２１．８６
 
（１８）ＲＮＵ－３１９（配列番号２６）
５’－ｇｇｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＣｒＣ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３６１．３９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３５８．６１
 
（１９）ＲＮＵ－３２０（配列番号２７）
５’－ｕｕｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３３１．３６
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３３２．６０
 
（２０）ＲＮＵ－３２２（配列番号２８）
５’－ａｒＡｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３３１．３６
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３２４．０６
 
（２１）ＲＮＵ－３２３（配列番号２９）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３４５．３９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３３８．６５
 
（２２）ＲＮＵ－３２４（配列番号３０）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＵ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３４５．３９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３３５．８８
 
（２３）ＲＮＵ－３２５（配列番号３１）
５’－ｒＡａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３４５．３９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３３８．８０
 
（３４）ＲＮＵ－３２１（配列番号３２）
５’－ｃｃｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＧｒＧ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３６１．３９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３５４．５８
 
（２４）ＲＮＵ－２７６（配列番号３３）
５’－ａａｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３５９．４１
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３６５．４５
 
（２５）ＲＮＵ－２７７（配列番号３４）
５’－ａａｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｒＵｕｕｕｕｕｕｒＡｒＧｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７９９４．７９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７９９７．６６
 
（２６）ＲＮＵ－２７８（配列番号３５）
５’－ａａｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＣｒＵｒＧｕｕｕｕｕｕｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１８６４５．１７
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１８６４５．４８
 
（２７）ＲＮＵ－３０３（配列番号３６）
５’－ａａｒＧｒＧｒＵｒＧｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＡｒＡｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＡｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＵｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＵｒＵｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＵｒＵｒＵｒＣｒＣｒＡｒＣｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７２８４．３４
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７２８９．４０
 
（２８）ＲＮＵ－２３４（配列番号３７）
５’－ａａｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｕｕ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３４４．４０
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３４２．６３
 
（２９）ＲＮＵ－２５２（配列番号３８）
５’－ｒＡｒＡｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３１６．３５
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７２９９．１６
 
（３０）ＲＮＵ－２５３（配列番号３９）
５’－ｒＩｒＩｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３１８．３２
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３７７．５３
 
（３１）ＲＮＵ－２７０（配列番号４０）
５’－ａａａｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＴｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３５７．４４
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７３７９．７０
 
（３２）ＲＮＵ－２７１（配列番号４１）
５’－ａａａａｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＡｕｕｕｕｕｕｒＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＴｒＴｒＴｒＴ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７３８５．４９
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７４０７．６０
 
（３３）ＲＮＵ－３００（配列番号４２）
５’－ｒＡｒＡｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＣｕｕｕｕｕｕｒＧｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＣｒＵｒＵ－３’
　　　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１７２１９．１５
　　　　　　　　　　　　　　　　実測値　１７２８０．０１
 
製造例２　医薬組成物の調製
（１）担体（リポソームＡ）の調製
　文献（ＷＯ９４／１９３１４の実施例２０）に記載の方法により製造した２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール　６０ｍｇと１００ｍｇの卵黄レシチン（キューピー社製）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１０００ｍｇのマルトース（林原社製）、４．０ｍＬの注射用水及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブ（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ－２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて、１０分間超音波処理を行った。その後、注射用水を用いて１０ｍＬになるように定容し、１６ｍｇ／ｍＬの分散液を調製した。
 
（２）医薬組成物の調製
　製造例１で製造した本発明オリゴヌクレオチドを１０％マルトース溶液（大塚製薬工場社製、以下同じ。）で希釈し、上記（１）で調製した担体を１０％マルトース溶液にて適宜希釈し、同容量の本発明オリゴヌクレオチドの１０％マルトース溶液を攪拌しながら少量ずつ滴下して、本発明オリゴヌクレオチドと担体との複合体（医薬組成物）を形成した。
　複合体中の本発明オリゴヌクレオチドの濃度は０．１μＭ～３μＭであり、複合体中の本発明オリゴヌクレオチドと担体との比率は１：１６（ｗ／ｗ）であった。なお、調製した複合体は１０％マルトースで適宜希釈した。
 
試験例１　ＲＮＡｉ活性
　Ａ４３１細胞（ヒト上皮癌細胞株）を６ｃｍ径のシャーレに１×１０５個で播種した。１０％ウシ胎児仔血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社製、以下同じ。）３ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。新鮮な上記培地２．７ｍＬに交換し、実施例２で調製した１００ｎＭの医薬組成物０．３ｍＬを添加し、３日間培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ。）で２回洗浄した後、セルスクレーパーを用いて１．５ｍＬチューブに移した。１０００×ｇで２分間遠心し、上清を取り除き、５０μＬ～１００μＬの緩衝液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＮＰ－４０］に懸濁した後、氷上に３０分間静置した。１５０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、上清（細胞抽出液）を回収した。
　細胞抽出液中のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイシステム（ピアスバイオテクノロジー社製）を使用し、測定した。
　細胞抽出液中のタンパク質１５μｇをｅ－ＰＡＧＥＬ（登録商標）（アトー社製）で電気泳動し、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社製）に転写した。タンパク質を転写した膜を、ブロッキングワン（ナカライテスク社製、以下同じ。）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングを行った。１次抗体を０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で２０倍希釈したブロッキングワン(５％ブロッキングワン)で希釈し、当該希釈溶液中で室温１時間振盪した。ＰＢＳＴで洗浄した後、５％ブロッキングワンで希釈した２次抗体中で室温１時間振盪した。ＰＢＳＴで洗浄した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ (パーキンエルマー社製)を用いて発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオ・ラッド ラボラトリー社製）にてＢｃｌ－２タンパク質、ＳＯＤ１タンパク質又はβ－ａｃｔｉｎタンパク質を検出し、各タンパク質の発現量を定量化した。
　Ｂｃｌ－２タンパク質の検出では、１次抗体としてはマウス抗ヒトｂｃｌ－２抗体（Ｍ０８８７、ＤＡＫＯ　ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を５００倍希釈したものを、２次抗体としてはペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐ０２６０、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
　ＳＯＤ１タンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトＳＯＤ１抗体(＃ＳＯＤ－１０１、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社製)を１０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（＃７０７４、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
　β-ａｃｔｉｎタンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトβ-ａｃｔｉｎ抗体(ｓｃ－１６１５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製)を２０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ 抗体（Ｐ０４４９、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものを、又は、１次抗体としてはマウス抗ヒトβ-ａｃｔｉｎ抗体(ｓｃ－８４３２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製)を２０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ 抗体（Ｐ－０２６０、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
　バンドの濃さの判断は、ルシフェラーゼの発現を抑制する天然型二本鎖核酸（ＧＬ３）をトランスフェクションした時のＢｃｌ－２タンパク質のバンドの濃さを陰性対照に、Ｂｃｌ－２タンパク質発現抑制活性を有する天然型二本鎖核酸（例えば、Ｂ７１７、Ｂ－３５２ＵＵ）をトランスフェクションした時のＢｃｌ－２タンパク質のバンドの濃さを陽性対照として、これらと比較し、基本的には目視で行った。バンドの濃さを数値化する場合は、感光フィルムを画像データに変換し、ＮＩＨＩｍａｇｅ　ｖｅｒ　ｌ．６２を用いて行った。
 
　その結果を図１～図１２に示す。
 
　図１，図２，図５，図６に示すように、本発明オリゴヌクレオチドではない、５’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの２’位が水酸基である修飾オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２５２，ＲＮＵ－２５３，ＲＮＵ－３００）は、対応する天然型二本鎖核酸よりもＲＮＡｉ活性が低下した。また、本発明オリゴヌクレオチドではない、５’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの２’位と３’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの２’位がともにメトキシである修飾オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２３４）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＲＮＡｉ活性が低下した。
　図３，図４に示すように、分子内で二重鎖を形成した場合にループ部分となりうる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分を構成する各ヌクレオチドの２’位が修飾された本発明オリゴヌクレオチド、又は核酸塩基部分が修飾された本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２６８，ＲＮＵ－２６９）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）とそのＲＮＡｉ活性が同等であった。
　図５，図６に示すように、Ａ及びＺに対応する修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分の塩基長を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２９２，ＲＮＵ－２９３，ＲＮＵ－２９４）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）とそのＲＮＡｉ活性が同等であった。
　また、図５，図６に示すように、分子内で二重鎖を形成した場合にループ部分となりうる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分の塩基長を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２９５，ＲＮＵ－２９６）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）とそのＲＮＡｉ活性が同等であった。
　図５～図８に示すように、５’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの２’位の修飾の数及び／又は３’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの核酸塩基の修飾の数を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３２２，ＲＮＵ－３２３，ＲＮＵ－３２４，ＲＮＵ－３２５）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）とそのＲＮＡｉ活性が同等であった。
　しかしながら、図３，図４に示すように、本発明オリゴヌクレオチドではないが、５’末端のヌクレオチドダイマー部分に続く少なくとも１個のヌクレオチド（Ａの５’末端のヌクレオチドに対応する）が修飾ヌクレオチド（２’位がメトキシであるヌクレオチド）であり、３’末端のヌクレオチドダイマー部分に続く少なくとも１個のヌクレオチド（Ｚの３’末端のヌクレオチドに対応する）が修飾ヌクレオチド（核酸塩基がメチルで置換されたヌクレオチド）である修飾オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２７０，ＲＮＵ－２７１）の場合には、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＲＮＡｉ活性が低下した。
　図７，図８に示すように、分子内で二重鎖を形成した場合にループ部分となりうる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分を構成する各ヌクレオチドの核酸塩基の種類を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３１５，ＲＮＵ－３１６，ＲＮＵ－３１７，ＲＮＵ－３１８）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）とそのＲＮＡｉ活性が同等であった。また、５’末端及び３’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの核酸塩基の種類を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３１９，ＲＮＵ－３２０，ＲＮＵ－３２１）は、そのＲＮＡｉ活性が対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）のものと同等であった。
　図９，図１０に示すように、同じ標的遺伝子（Ｂｃｌ－２遺伝子）の異なる標的ヌクレオチド配列に対しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２７６，ＲＮＵ－２７７，ＲＮＵ－２７８）は、そのＲＮＡｉ活性が対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ５３２－ＵＵ）のものと同等であった。
　また、図１１，図１２に示すように、Ｂｃｌ－２遺伝子とは異なる標的遺伝子に対しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３０３）は、そのＲＮＡｉ活性が対応する天然型二本鎖核酸（ＳＯＤ３８５）のものと同等であった。
 
試験例２　インターフェロン－α誘導作用
　採取したヒト新鮮血は凝固を防ぐため１０ｍＬあたり１ｍＬのヘパリンナトリウム注　（味の素社製）を混合した。等量のＰＢＳ（日水製薬社製）を加え、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３ｍＬあたり１０ｍＬの血液を界面を乱さないよう穏やかに重層した。４００×ｇ、室温で３０分間遠心し、ＰＢＭＣ層を回収した。ＰＢＳでＰＢＭＣを２度洗浄し、細胞を１０％ウシ胎児仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１００Ｕ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）に浮遊させ、細胞数を測定して、２×１０６個／ｍＬ　の細胞懸濁液を調製した。これを４８穴プレートに３００μＬ（６×１０５個／ｗｅｌｌ）ずつ播種し、５％ＣＯ２、３７℃条件下で３時間培養後、実施例において調製した３００～３０００ｎＭの本発明オリゴヌクレオチドと担体との複合体を含有する本発明医薬組成物を添加した。２４時間培養した後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによる測定を行った。ＩＦＮ－αの測定はＨｕｍａｎ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａｌｐｈａ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＰＢＬ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて行った。
 
　その結果を図１３～図１８に示す。
 
　図１４に示すように、５’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチド
の２’位がメトキシであって、３’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの５位がメチル又は各ヌクレオチドがヒポキサンチンである本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２５１、ＲＮＵ－２６８、ＲＮＵ－２６９、ＲＮＵ－２７２）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＩＦＮ－αの誘導を抑制した。特に、分子内で二重鎖を形成した場合にループ部分となりうる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分を構成する各ヌクレオチドの２’位がメトキシである本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２５１）は、より一層ＩＦＮ－αの誘導を抑制した。
　図１５に示すように、Ａ及びＺに対応する修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分の塩基長を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２９２，ＲＮＵ－２９３，ＲＮＵ－２９４）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＩＦＮ－αの誘導を抑制した。
　図１５，図１６に示すように、５’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの２’位の修飾の数及び／又は３’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの核酸塩基の修飾の数を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３２２，ＲＮＵ－３２３，ＲＮＵ－３２４，ＲＮＵ－３２５）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＩＦＮ－αの誘導を抑制した。
　図１６に示すように、分子内で二重鎖を形成した場合にループ部分となりうる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分を構成する各ヌクレオチドの核酸塩基の種類を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３１５，ＲＮＵ－３１６，ＲＮＵ－３１７，ＲＮＵ－３１８）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＩＦＮ－αの誘導を抑制した。
　また、図１６に示すように、５’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチド及び３’末端のヌクレオチドダイマー部分を構成する各ヌクレオチドの核酸塩基の種類を変更しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３１９，ＲＮＵ－３２０、ＲＮＵ－３２１）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＩＦＮ－αの誘導を抑制した。
　図１７に示すように、同じ標的遺伝子（Ｂｃｌ－２遺伝子）の異なる標的ヌクレオチド配列に対しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２７６，ＲＮＵ－２７７，ＲＮＵ－２７８）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ５３２－ＵＵ）よりもインターフェロンαの誘導を抑制した。
　また、図１８に示すように、異なる標的遺伝子に対しても、本発明オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－３０３）は、対応する天然型二本鎖核酸（ＳＯＤ３８５）よりもインターフェロンαの誘導を抑制した。
　図１３に示すように、本発明オリゴヌクレオチドではない、５’末端２個のヌクレオチドが修飾されていない修飾オリゴヌクレオチド（ＲＮＵ－２５２）は、対応する天然型二本鎖核酸（Ｂ７１７）よりもＩＦＮ－αの誘導を抑制しなかった。
 
　本発明によれば、インターフェロン等のサイトカイン誘導などの副作用の少ない、標的遺伝子の発現を抑制することができる修飾オリゴヌクレオチド、及び、当該修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供することができる。
 

Claims (21)

  1. 分子内で二重鎖を形成すると平滑末端となり、標的遺伝子の発現を抑制することができる次の一般式（Ｉ）で表される修飾オリゴヌクレオチド。
    ５'－Ｘ－Ａ－Ｌ－Ｚ－Ｙ－３'　（Ｉ）
    式中、
    Ａは、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部（以下、「標的ヌクレオチド配列」という。）の塩基配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する１５～５０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であって、少なくともＡの５'末端のヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の５'末端のリボヌクレオチドと同じリボヌクレオチドである。
    Ｚは、標的ヌクレオチド配列の塩基配列と少なくとも８０％の相補性を有する１５～５０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾オリゴヌクレオチド部分であって、少なくともＺの３'末端のヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の５’末端のヌクレオチドと相補的なリボヌクレオチドである。
    Ｌは、１～２０塩基長の塩基配列からなる修飾又は未修飾（オリゴ）ヌクレオチド部分を表す。
    Ｘは次の一般式（１）で表される１価の基を表す。
    Ｙは次の一般式（２）で表される１価の基を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、
    Ｂ１ａ、Ｂ１ｂは、同一又は異なって、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。
    Ｂ２ａ、Ｂ２ｂは、同一又は異なって、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。
    但し、Ｂ１ａとＢ２ａ、Ｂ１ｂとＢ２ｂとは、互いに塩基対を形成しうる核酸塩基である。
    Ｒ１、Ｒ２は、同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又はＲ１、Ｒ２の一方がＨを、他方がアルキルを表す。
    ＊は結合位置を表す。
  2. Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がアデニンであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂが、それぞれ同一又は異なって、５－メチルウラシル、ウラシル、又はヒポキサンチンである、請求項１記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  3. Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がウラシルであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂの両方がアデニンである、請求項１記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  4. Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がグアニンであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂがシトシンである、請求項１記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  5. Ｂ１ａ、Ｂ１ｂの両方がシトシンであって、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂの両方がグアニンである、請求項１記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  6. Ｒ１、Ｒ２の両方がメチルであるか、Ｒ１がメチルであって、Ｒ２がＨであるか、又は、Ｒ１がＨであって、Ｒ２がメチルである、請求項１～５のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  7. Ｌが下記一般式（３）で表される２価の基である、請求項1～６のいずれか１項に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     式中、
    各Ｂ３は、それぞれ独立して、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。
    各Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシを表す。
    ｎは、１～２０の範囲内にある整数を表す。
    ＊は結合位置を表す。
  8. 各Ｂ３が、それぞれ独立して、アデニン、シトシン、ウラシル、５－メチルウラシル、又はヒポキサンチンである、請求項７に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  9. 各Ｒ３が、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ又はメトキシである、請求項７又は８のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  10. 各Ｒ３が、全てメトキシである、請求項７～９のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  11. Ａ及びＺにおいて、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  12. 修飾ヌクレオチドが、次の（Ｉ）～（ＩＶ）のいずれかで表されるヌクレオチドである、請求項１１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
    （Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     式中、ＢＡはハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される１～３個の置換基が置換されている核酸塩基を表す。Ｔ１は、Ｈ又はＯＨを表す。＊は結合位置を表す。［Ｐ］は、次の一般式で表される基を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣは、同一又は異なって、アルキルを表す。＊は、前記と同義である）
     
    （ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     式中、ＢＢはハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される１～３個の置換基で置換されていてもよい核酸塩基を表す。Ｔ２は、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ、又はハロゲンを表す。［Ｐ］、＊は、前記と同義である。
     
    （ＩＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     式中、ＢＢ、［Ｐ］、＊は、前記と同義である。Ｔ３は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ、又はハロゲンを表す。
     
    （ＩＶ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     式中、ＢＢ、［Ｐ］、＊は、前記と同義である。Ｄは、単結合、メチレン、エチレン、－Ｎ（ＣＨ３）－、又はＯＣＨ２－を表す。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾オリゴヌクレオチドと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物。
  14. 担体がカチオン性担体、ウイルスエンベロープ又はナノ粒子を利用した担体である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. カチオン性担体がカチオン性リポソームである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. カチオン性リポソームが２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須の構成成分とするカチオン性リポソーム；２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム；又は２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソームである、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. リン脂質がホスファチジルコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの水素添加リン脂質である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. カチオン性担体がカチオン性ポリマーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  19. カチオン性担体がカチオン性デンドリマーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  20. カチオン性デンドリマーがポリアミドアミンデンドリマーである、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１４に記載の医薬組成物。
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