JP4605799B2 - Modified polynucleotide for use in Rna interference - Google Patents

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Description

(発明の分野) (Field of the Invention)
本発明は修飾ポリヌクレオチドに関する。 The present invention relates to modified polynucleotides.

(背景) (background)
哺乳類細胞でのRNA誘導遺伝子サイレンシング(RNA−induced gene silencing)は、現在のところ、最低でも3通りの異なる制御レベルが関係していると考えられている。 RNA-induced gene silencing in mammalian cells (RNA-induced gene silencing) is currently believed to have different control levels as at least 3. Are involved. すなわち、(i)転写不活性化(siRNA誘導DNAおよびヒストン・メチル化)、(ii)小さな干渉RNA(siRNA)によって誘導されたmRNAの分解、ならびに(iii)mRNA誘導転写減衰である。 That is, (i) transcriptional inactivation (siRNA-induced DNA and histone methylation), (ii) decomposition of a small interfering RNA mRNA induced by (siRNA), and (iii) mRNA induced transcriptional attenuation. siRNAによって発生するRNA干渉(RNAi)は、長時間にわたって効果があり、細胞分裂が多数繰り返されても効果を示すことができる。 RNA interference generated by siRNA (RNAi) is effective for a long time, can be repeated cell division number showing the effects. したがって、siRNA媒介方法を介して遺伝機能にアクセスする能力は、過剰発現遺伝子に対する治療法を開発するのと同様に、遺伝子機能分析、薬物標的の確証(バリデーション)、および広範囲にわたるゲノム研究を促す刺激的かつ有益なツールを意味する。 Thus, the ability to access the gene function via siRNA-mediated method, as well as to develop therapies for over-expressed genes, prompting gene function analysis, confirmation of drug targets (validation), and a wide range of genome research It means an exciting and useful tool. さらに、RNAiは治療的なツールとして幅広い可能性がある。 In addition, RNAi is there is a wide range of possibilities as a therapeutic tool.

RNA代謝に関する分野での比較的最近の発見によって、二本鎖RNA(dsRNA)の取り込みがRNAiを誘導し得ることが明らかになった。 The relatively recent discovery in the field of RNA metabolism, uptake of double-stranded RNA (dsRNA) was found to be capable of inducing RNAi.

これらの状況下では、ダイサー(Dicer)と呼ばれるIII型RNアーゼは、長いdsRNAを処理してsiRNAにするもので、該siRNAはその後RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と協力して配列特異的に標的転写産物の分解をもたらす。 Under these circumstances, III type RN ase called Dicer (Dicer) is longer dsRNA processes and as to the siRNA, the siRNA is then RNA-induced silencing complex cooperation to sequence-specific and (RISC) resulting in degradation of the target transcript. この現象は、多種多様な生物体で見られた。 This phenomenon was seen in a wide variety of organisms. 残念なことに、哺乳動物細胞では、長いdsRNAを用いたRNAiの誘導は、ある程度の成功が得られたに過ぎなかった。 Unfortunately, in mammalian cells, the induction of RNAi with long dsRNA was only obtained some degree of success. 主に、このような無効性は、インターフェロン反応の誘導によるものであり、該反応は標的化されたものとは対照的に一般的なタンパク質合成の阻害をもたらす。 Primarily, such ineffectiveness is due to the induction of interferon response, the reaction is assumed to have been targeted in contrast, results in inhibition of general protein synthesis.

最近では、培養液中で哺乳動物細胞に合成siRNAを導入する場合、標的mRNAの配列特異的阻害を、インターフェロン反応の誘導を伴うことなく、実現することができる。 Recently, when introducing mammalian cells into synthetic siRNA in culture, sequence-specific inhibition of target mRNA, without the induction of interferon response can be realized. これらの短い二本鎖は、モル濃度以下(sub−molar concentrations)で触媒的に作用して、95%を越える細胞内標的mRNAを切断する。 These short duplexes, acts catalytically on a molar or less (sub-molar concentrations), cutting the cellular target mRNA greater than 95%. siRNA活性のメカニズム、ならびにその用途のいくつかについては、Provost et al. Mechanism of siRNA activity, as well as for some of its applications, Provost et al. ,Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer,E. , Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer, E. M. M. B. B. O. O. J. J. ,2002 Nov. , 2002 Nov. ,1,21(21):5864−5874;Tabara et al. , 1,21 (21): 5864-5874; Tabara et al. ,The dsRNA Binding Protein RDE−4 Interacts with RDE−1,DCR−1 and a DexH−box Helicase to Direct RNAi in C. , The dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-1, DCR-1 and a DexH-box Helicase to Direct RNAi in C. elegans,Cell. elegans, Cell. 2002,June 28,109(7):861−71;Ketting et al. 2002, June 28,109 (7): 861-71; Ketting et al. ,Dicer Functions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involved in Developmental Timing in C. , Dicer Functions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involved in Developmental Timing in C. elegans;およびMartinez et al. elegans; and Martinez et al. ,Single−Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi,Cell 2002,Sept. , Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi, Cell 2002, Sept. 6,110(5):563に記載されている。 6,110 (5): it is described in the 563.

siRNAを用いて作業をおこなう場合、解決しなければならない主要な問題が4つある。 When working with siRNA, key issues to be solved there are four. すなわち、(i)機能性、(ii)特異性、(iii)送達方法、および(iv)安定性である。 That is, (i) functional, (ii) specificity, (iii) delivery methods, and (iv) stability. 機能性とは、特定のsiRNAが所望の標的をサイレンシングする能力のことをいう。 The functional refers to the ability of a particular siRNA to silence the desired target. 機能性を改善するための方法は、例えば、例えば、米国特許出願第10/714,333号の主題である。 Methods for improving the functionality, for example, for example, is the subject of U.S. Patent Application No. 10 / 714,333. 特異性とは、特定のsiRNAが、所望の標的、しかもその標的のみをサイレンシングする能力のことをいう。 Specificity specific siRNA, the desired target, yet refers to the ability to silence only its target. したがって、特異性は、オフ・ターゲット効果(off−target effects)を最小限化することを意味する。 Thus, specificity refers to minimizing off-target effects (off-target effects). 送達方法は、ユーザが特定のsiRNAを細胞に導入する手段であり、例えばベクターまたはsiRNAそれ自体の修飾を用いることを含むものであってもよい。 Delivery method is a means for the user to introduce specific siRNA into the cell, may include the use of for example a vector or siRNA itself modified. 安定性とは、細胞内または細胞外環境に存在する酵素または他の有害な物質による分解を抑えるsiRNAの能力のことをいう。 The stability refers to the ability of the siRNA to suppress degradation by enzymes or other harmful substances present in the intracellular or extracellular environment. 例えば、裸siRNA分子を血液、血清、または血清含有培地に導入する場合、裸siRNA分子は安定ではなく、ほとんどが素早く分解されて裸siRNA分子の効力が減少または除去される。 For example, when introducing naked siRNA molecules in blood, serum or serum-containing medium, naked siRNA molecules are not stable, most are decomposed quickly potency naked siRNA molecules are reduced or eliminated.

本発明は、特異性を増加または減少させること、および/または安定性を増加させることができるsiRNAに対する修飾をおこなうことで、第2および第4の問題(すなわち、特異性および安定性)を解決する。 The present invention is, increasing or decreasing the specificity, and / or stability by performing modifications to siRNA which can increase, second and fourth problems (i.e., specificity and stability) solutions to.

(発明の要旨) Summary of the Invention
本発明は、RNA干渉を実施するための組成物および方法に関する。 The present invention relates to compositions and methods for performing RNA interference. 一般に、本明細書に記載されたsiRNA化学修飾は、それが結合した分子の2つの重大な性質、すなわち安定性と特異性とに影響を及ぼす。 In general, been siRNA chemical modifications described herein, two significant properties of the molecule to which it has been linked, ie affects the stability and specificity. 安定性に影響を及ぼすそのような修飾は、核酸を分解させる傾向があるヌクレアーゼまたは他の因子を含む血液、血清、血清含有培地、および他の生物物質への曝露を必要とする応用での使用にとって、特に有利である。 Affect the stability Such modifications used in applications that require blood containing nuclease or other factors that tend to degrade nucleic acids, serum, serum-containing medium, and exposure to other biologics taking in, is particularly advantageous. 特定の標的に向けられるsiRNAによって誘導されたオフ・ターゲット効果(off−target effects)の度合いを減少させる修飾は、研究および治療的な設定にとって特に有益である。 Modified to reduce the degree of the induced off-target effects by siRNA directed to a specific target (off-target effects) is particularly beneficial for research and therapeutic settings. 実質的にRNAi適用を改善する修飾の多数の異なる組み合わせが開示されており、またこれらの組み合わせは最適サイレンシング試薬、形質移入制御、およびエクサエクオ(exaequo)試薬の設計に適用可能である。 Substantially have a number of different combinations of modifications that improve the RNAi applications is disclosed, also combinations of these can be applied to the optimum silencing reagents, transfection control and Ekusaekuo (exaequo) reagent design.

第1の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも1つの 2'修飾ヌクレオチド単位から構成されるポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを有するsiRNAを提供する。 According to the first embodiment, the present invention is antisense comprising a sense strand comprising a polynucleotide comprised of at least one orthoester modified nucleotide, a polynucleotide comprised of at least one 2 'modified nucleotide unit It provides siRNA having a chain.

第2の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも1つの 2'修飾ヌクレオチド単位から構成されるポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するsiRNAを提供する。 According to the second embodiment, the present invention is antisense comprising a sense strand comprising a polynucleotide comprised of at least one orthoester modified nucleotide, a polynucleotide comprised of at least one 2 'modified nucleotide unit It provides an siRNA having a chain, a conjugate.

第3の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖と、アンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するsiRNAを提供する。 According to the third embodiment, the present invention provides an siRNA having a sense strand comprising at least one orthoester modified nucleotide, an antisense strand, and a conjugate.

第4の実施形態によれば、本発明は、センス鎖と、アンチセンス鎖と、コンジュゲートとを有するsiRNAを提供し 、センス鎖および/またはアンチセンス鎖が少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドを有する。 According to the fourth embodiment, the present invention includes a sense strand, antisense strand, provides siRNA having conjugated, the sense strand and / or antisense strand at least one 2 'modified nucleotide .

第5の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖と、2'ハロゲン修飾ヌクレオチド、2'アミン修飾ヌクレオチド、2'−O− アルキル修飾ヌクレオチド、および2'アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるコンジュゲートとを有し、ポリリボヌクレオチドが18個と30個との間のヌクレオチド塩基対を含むsiRNAを提供する。 According to the fifth embodiment, the present invention includes a sense strand comprising at least one orthoester modified nucleotide, 2 'halogen modified nucleotide, 2' amine modified nucleotide, 2'-O-alkyl modified nucleotide, and 2 ' and an antisense strand comprising at least one 2 'modified nucleotide is selected from the group consisting of alkyl modified nucleotide, amino acids, peptides, polypeptides, proteins, sugars, carbohydrates, lipids, polymers, nucleotides, polynucleotides, and combinations thereof and a conjugate selected from the group consisting of, polyribonucleotide provides a siRNA comprising 18 nucleotide base pairs between 30.

第6の実施形態によれば、本発明は以下の構造の一つを含む。 According to the sixth embodiment, the present invention comprises one of the following structures.

式中、B およびB の各々は、窒素塩基、複素環、または炭素環式化合物であり、Xは、O、S、C、およびNからなる群から選択され、Wは、OH、リン酸塩、リン酸エステル、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、修飾ヌクレオチド間連結、コンジュゲート、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、R1は、オルトエステルであり、R2は、2'−O−アルキル基、アルキル基、アミン、ハロゲンからなる群から選択され、ならびにYはヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。 Wherein each of B 1 and B 2 are nitrogen bases, a heterocyclic or carbocyclic compound,, X is, O, selected S, C, and from the group consisting of N, W is, OH, phosphorus salt, phosphoric acid ester, phosphate diester, phosphate triester, modified internucleotide linkage is selected conjugated nucleotides, from the group consisting of polynucleotides, R1 is ortho ester, is R2, 2' O- alkyl group, an alkyl group, an amine is selected from the group consisting of halogen, and Y is a nucleotide or polynucleotide. とB とのあいだの破線は、窒素含有塩基間の水素結合による相互作用を示す。 Dashed between the B 1 and B 2 represents an interaction by hydrogen bonding between nitrogenous bases.

第7の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施する方法を提供する。 According to the seventh embodiment, the present invention provides a method of performing RNA interference. この方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含む。 The method includes exposing an siRNA to a target nucleic acid, the siRNA is comprised of sense and antisense strands and at least one of the sense strand and antisense strand comprises at least one orthoester modified nucleotide.

第8の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施する別の方法を提供する。 According to the eighth embodiment, the present invention provides an alternative method of performing RNA interference. この方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAはセンス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成される。 The method includes exposing an siRNA to a target nucleic acid, the siRNA sense strand, antisense strand, and a conjugate. この実施形態によれば、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが2'修飾ヌクレオチドから構成される。 According to this embodiment, either the sense strand or antisense strand 2 'comprised of modified nucleotides.

本発明の第1〜第8の実施形態の組成物は、ヌクレアーゼ分解に対して耐性を示すsiRNAを与えることができ、その一方で生物学的機能性を保つ。 The first to the composition of the eighth embodiment of the present invention can provide an siRNA resistant to nuclease degradation, while maintaining the biological functionality. 例えば、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを持つsiRNA(例えば、センス鎖上のもの)と少なくとも1つの他の修飾(例えば、アンチセンス鎖上の適当な位置にあるもの)とを用いることで、RNA干渉用途での機能性を保ちながら安定性を高めることができる。 For example, by using a siRNA having at least one orthoester modified nucleotide (e.g., those on the sense strand) and at least one other modifications (e.g., those in the appropriate position on the antisense strand), RNA while maintaining the functionality of the interference applications can be enhanced stability. さらに、RNA干渉用途で、コンジュゲートと共に、1種類以上の2'修飾を持つsiRNAおよび/または修飾ヌクレオチド間連結を用いることによっても、各々の鎖上にオルトエステル修飾が存在しない場合でも、機能性を保ちながら安定性を高めることができる。 Furthermore, in RNA interference applications, along with the conjugate, one or more 2 'by the use of the coupling between the siRNA and / or modified nucleotides having a modification, even in the absence of orthoester modifications on each strand, functional it is possible to increase the stability while maintaining.

第9の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施する方法を提供するもので、該方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらにセンス鎖が実質的に非機能的である。 According to the ninth embodiment, consist present invention provides a method of performing RNA interference, said method comprising exposing an siRNA to a target nucleic acid, the siRNA is a sense strand and an antisense strand it is further sense strand is substantially nonfunctional.

第10の実施形態によれば、本発明 RNA干渉を実施する方法を提供するもので、該方法は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAが、(a)コンジュゲートと、(b)少なくとも1つの2'−O−アルキル修飾を含み、実質的に非機能的であるセンス鎖と、(c)少なくとも1つの2'−フッ素修飾を含むアンチセンス鎖とを含み、センス鎖とアンチセンス鎖とが18〜30塩基対の二鎖を形成する。 According to the tenth embodiment, the present invention provides a method of performing RNA interference, said method comprising exposing an siRNA to a target nucleic acid, the siRNA is, (a) a conjugate, ( b) comprises at least one 2'-O- alkyl modification comprises a sense strand is substantially nonfunctional, the antisense strand comprising at least one 2'-fluorine modification (c), a sense strand and antisense strand to form a duplex of 18-30 base pairs.

第11の実施形態によれば、本発明は、 According to the eleventh embodiment, the present invention,
(a)(i)第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドであって、第1の2'−O−アルキル・センス修飾を含む第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の2'−O−アルキル・センス修飾を含む第2の5'末端センス・ヌクレオチドである、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドと、 (A) (i) a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense including a first 2'-O- alkyl sense modification and nucleotide and a 'is a terminal sense nucleotide, the first 5' second 5 including a second 2'-O- alkyl sense modification terminal sense nucleotide and a second 5 'terminal sense nucleotide,
(ii)少なくとも1つの2'−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2'−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、から構成されるセンス鎖と、 (Ii) at least one 2'-O- alkyl pyrimidine modified sense nucleotide is a different nucleotide to the above first 5 'terminal sense nucleotide or said second 5' terminal sense nucleotide, at least one 2'-O- alkyl pyrimidine modified sense nucleotide, a sense strand consisting of,
(b)(i)少なくとも1つの2'ハロゲン修飾ピリミジン・ヌクレオチド、ならびに (ii)第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、5'炭素位がリン酸化された第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖と、 (B) (i) at least one 2 'halogen modified pyrimidine nucleotides, and (ii) a first 5' to a terminal antisense nucleotide, terminal 5 'first 5-carbon position is phosphorylated' and an antisense strand consisting of antisense nucleotide,
から構成され、 It is composed of,
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、18と30との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、siRNAを提供する。 The sense strand and the antisense strand are capable of forming a double-stranded base pair between 18 and 30, provides a siRNA.

第11の実施形態の分子を、標的のサイレンシングに用いること、および/あるいは対照として用いることも可能である。 The molecules of the eleventh embodiment, be used to target silencing, and / or be used as a control are also possible. これらの分子は、蛍光標識等の標識、および/または第3の2'−O−アルキル/センス修飾を含む第3の5'末端センス・ヌクレオチドを、さらに含むものであってもよい。 These molecules, labels such as fluorescent labels, and / or a third 5 'terminal sense nucleotide comprises a third 2'-O- alkyl / sense modification, may further include.

第12の実施形態によれば、本発明は、 According to the twelfth embodiment of the present invention,
(a)(i)第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドであって、第1の2'−O−アルキル・センス修飾を含む第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の2'−O−アルキル・センス修飾を含む第2の5'末端センス・ヌクレオチドである、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドと、 (A) (i) a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense including a first 2'-O- alkyl sense modification and nucleotide and a 'is a terminal sense nucleotide, the first 5' second 5 including a second 2'-O- alkyl sense modification terminal sense nucleotide and a second 5 'terminal sense nucleotide,
(ii)少なくとも1つの2'−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2'−O−アルキル・ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドと、 (Ii) at least one 2'-O- alkyl pyrimidine modified sense nucleotide is a different nucleotide to the above first 5 'terminal sense nucleotide or said second 5' terminal sense nucleotide, at least one 2'-O- alkyl pyrimidine modified sense nucleotide,
から構成されるセンス鎖と、 And the sense strand consists of,
(b)(i)第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドであって、第1の2'−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の2'−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドである、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと、 (B) (i) a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide, first 5 comprising a first 2'-O- alkyl antisense modification a 'terminal antisense nucleotide and a second 5 comprises a second 2'-O- alkyl antisense modification' terminal antisense nucleotide, the first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5 'and the terminal antisense nucleotide,
(ii)少なくとも1つの2'−O−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドであって、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび上記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである、少なくとも1つの2'−O−アルキル・ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドと、 (Ii) at least one 2'-O- alkyl pyrimidine modified antisense nucleotide, different nucleotide and said first 5 'terminal antisense nucleotide and the second 5' terminal antisense nucleotide and it is, at least one 2'-O- alkyl pyrimidine modified antisense nucleotide is,
から構成されるアンチセンス鎖と、 And the antisense strand consists of,
から構成され、 It is composed of,
上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、16 28 との間の塩基対の二本鎖を形成することができる、siRNAを提供する。 The sense strand and the antisense strand are capable of forming a double-stranded base pair between 16 and 28, provides a siRNA.

好ましくは、第12の実施形態の分子もまた、例えば蛍光色素であってもよい標識を含み、ならびに/または第3の2'−O−アルキル・センス修飾を含む第3の5'末端センス・ヌクレオチドおよび/もしくは第3の2'−O−アルキル・アンチセンス修飾を含む第3の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドを含む。 Preferably, molecules of the twelfth embodiment also, for example, a fluorescent component containing a dye and a an optionally labeled also, and / or the third 5 'terminal sense including a third 2'-O- alkyl sense modification including nucleotide and / or a third 5 'terminal antisense nucleotide comprises a third 2'-O- alkyl antisense modification. 第12の実施形態の分子は、例えば19〜25塩基対、または例えば19〜28塩基対の二本鎖を形成することができる。 Molecules of the twelfth embodiment can form a duplex of, for example, 19 to 25 base pairs, or such as 19-28 base pairs.

第13の実施形態によれば、本発明は、 According to a thirteenth embodiment of the present invention,
(a)第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖であって、この第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されてる、アンチセンス鎖と、 (A) 'an antisense strand consisting of terminal antisense nucleotide, the first 5' first 5 terminal antisense nucleotide, 5 of the first 5 'terminal antisense nucleotide 'are phosphorylated at carbon position, and the anti-sense strand,
(b)第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成されるセンス鎖であって 、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を有し、また上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を有する、センス鎖と、 (B) a first 5 sense strand that consists of 'late Tanse Nsu nucleotide and a second 5' end Tanse Nsu nucleotide, the first 5 'end Tanse Nsu nucleotide is first 1 of 2 'has a carbon Motose Nsu modification, also the second 5' end Tanse Nsu-nucleotides that have a second 2 'carbon Motose Nsu modification, and cell Nsu chain,
を含む、siRNAを提供する。 Including, to provide the siRNA.

好ましくは、上記2'−修飾が'2'−O−アルキル修飾である。 Preferably, a said 2'-modified is' 2'-O-alkyl modification. この実施形態によれば、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、少なくとも実質的に相補的である18〜30塩基対を、好ましくは含む。 According to this embodiment, the sense strand and the antisense strand, a 18-30 base pairs at least substantially complementary, preferably.

第14の実施形態によれば、本発明は、ヘアピンsiRNAを形成することができる単分子のsiRNAに関する。 According to the fourteenth embodiment, the present invention relates to siRNA single molecule capable of forming a hairpin siRNA. この単分子siRNAは、 The single molecule siRNA is,
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化される、アンチセンス領域と、 (A) an antisense region, wherein said antisense region 'is composed of a terminal antisense nucleotide, the first 5' first 5-terminal antisense nucleotide is the first 5 'terminal antisense is phosphorylated at the 5 'carbon position of the sense nucleotide, and an antisense region,
(b)センス領域であって、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を有し、第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を有する、センス領域と、 (B) a sense region, is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, 'the terminal sense nucleotide first 2' first 5 carbon sense modification having, 'the terminal sense nucleotide second 2' second 5 carbon sense modification, and a sense region,
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域と、 (C) a loop region located between said sense region and said antisense region,
を含む。 including.

この第14の実施形態によれば、センス領域およびアンチセンス領域が少なくとも実質的に相補的であり、安定な二本鎖を形成することが可能である。 According to the fourteenth embodiment, the sense and antisense regions are at least substantially complementary, it is possible to form a stable duplex. 第13の実施形態と同様に、この第14の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域が、好ましくは18〜30塩基対を含む二本鎖を形成する。 Like the thirteenth embodiment, according to the fourteenth embodiment, the sense region and the antisense region is preferably form a duplex comprising 18-30 base pairs. 好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流である。 Preferably, the loop region is downstream of the antisense region.

第15の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、siRNAをさらすことを含むもので、上記siRNAがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、 According to a fifteenth embodiment of the present invention relates to a method for minimizing off-target effects, the method may the target nucleic acid, or expressing a target nucleic acid, or expresses to cells, those comprising exposing the siRNA, the siRNA comprises an antisense strand and sense strand,
(a)上記センス鎖が、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を有し、第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を有し、ならびに (b)上記アンチセンス鎖が、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されている。 (A) said sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, 'the terminal sense nucleotide first 2' first 5 carbon sense modification a, 'the terminal sense nucleotide second 2' second 5 has a carbon sense modification, and (b) the antisense strand are composed of a first 5 'terminal antisense nucleotide the first 5 'terminal antisense nucleotide is the first 5' phosphorylated at the 5 'carbon position of the terminal antisense nucleotide.

第16の実施形態によれば、オフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ヘアピンを形成することができる修飾された単分子のsiRNAをさらすことを含み、上記単分子siRNAが、アンチセンス領域とセンス領域とから構成され、 According to a sixteenth embodiment, it relates to a method for minimizing off-target effects, the method, to cells that can be the target nucleic acid, or expressing a target nucleic acid, or expresses Te, said method comprising exposing an siRNA of modified single molecule capable of forming a hairpin, the unimolecular siRNA that is composed of the antisense region and a sense region,
(a)上記センス鎖が、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を有し、第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を有し、 (A) said sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, 'the terminal sense nucleotide first 2' first 5 carbon sense modification a, 'the terminal sense nucleotide second 2' second 5 has a carbon sense modification,
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成されており、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されおり、さらに、 (B) the antisense strand, 'is composed of a terminal antisense nucleotide, the first 5' first 5-terminal antisense nucleotide is the first 5 'terminal antisense 5 nucleotides' and phosphorylated at carbon position, further,
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置したループ領域を含む。 And (c) a loop region located between said sense region and said antisense region.

好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流に位置している。 Preferably, the loop region is located downstream of the antisense region.

第17の実施形態によれば、本発明はsiRNAに関するもので、該siRNAは、 According to the seventeenth embodiment, the present invention relates to siRNA, the siRNA is
(a)アンチセンス鎖であって、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2'炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2'炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第1の5'末端のアンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位で上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている、アンチセンス鎖と、 (A) an antisense strand, is comprised of a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide, the first 5 'terminal antisense nucleotide is first 2 'has a carbon antisense modification and said second 5' terminal antisense nucleotide 'has a carbon antisense modification, further said first 5' second second end of the antisense nucleotide 5 'carbon position in the first 5' terminal antisense nucleotide is phosphorylated, and an antisense strand,
(b)センス鎖であって、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を有し、第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を有する、センスと、 (B) a sense strand, is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, 'the terminal sense nucleotide first 2' first 5 carbon sense modification having, 'the terminal sense nucleotide second 2' second 5 carbon sense modification and the sense strand,
を含む。 including.

好ましくは、上記2'炭素修飾が2'−O−アルキル修飾である。 Preferably, the 2 'carbon modification Ru der 2'-O- alkyl modification. この第17の実施形態によれば、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が、好ましくは、少なくとも実質的に相補的である18〜30塩基対を含む。 According to the seventeenth embodiment, the sense strand and the antisense strand preferably comprises a 18-30 base pairs that are at least substantially complementary.

第18の実施形態によれば、本発明はヘアピンsiRNAを形成することができる単分子siRNAに関するもので、該単分子siRNAは、 According to an eighteenth embodiment of the present invention relates to a unimolecular siRNA capable of forming a hairpin siRNA, monomolecular siRNA is
(a)アンチセンス領域であって、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、 (A) an antisense region, is composed of a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide,
第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2'炭素アンチセンス修飾を含み、第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2'炭素アンチセンス修飾を含み、さらに上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位で上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化化されている、アンチセンス領域と、 'Is terminal antisense nucleotide first 2' first 5 containing carbon antisense modification, 'the terminal antisense nucleotide second 2' second 5 containing carbon antisense modification, further said first 5 the carbon position 5 'terminal antisense nucleotide' first 5 'terminal antisense nucleotide is phosphorylated reduction, and an antisense region,
(b)センス領域であって、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を含む、センス領域と、 (B) a sense region, is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide first 2' carbon sense comprise modified, the second 5 'terminal sense nucleotide second 2' containing carbon sense modification, and a sense region,
(c)上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置するループ領域と、 And a loop region located between (c) said sense region and said antisense region,
を含む。 including.

この第18の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域が実質的に相補的であり、安定な二本鎖を形成することが可能である。 According to the eighteenth embodiment, the sense region and the antisense region are substantially complementary, it is possible to form a stable duplex. 第14の実施形態に類似して、この第18の実施形態によれば、上記センス領域および上記アンチセンス領域は、好ましくは、少なくとも実質的に相補的である18〜30塩基対を含む二本鎖を形成する。 Similar to the fourteenth embodiment, according to the eighteenth embodiment, the sense region and the antisense region, preferably, two containing 18-30 base pairs that are at least substantially complementary chain to form. 好ましくは、上記ループ領域がアンチセンス領域の下流に位置している。 Preferably, the loop region is located downstream of the antisense region.

第19の実施形態によれば、本発明は、オフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は、標的核酸に対して、または該標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、siRNAをさらすことを含み、該siRNAがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、 According to a nineteenth embodiment, the present invention relates to a method for minimizing off-target effects, the method, the target nucleic acid, or expressing the target nucleic acid, or to be expressed against cells which may include exposing the siRNA, the siRNA comprises an antisense strand and sense strand,
(a)上記センス鎖が、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を有し、第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を有し、 (A) said sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, 'the terminal sense nucleotide first 2' first 5 carbon sense modification a, 'the terminal sense nucleotide second 2' second 5 has a carbon sense modification,
(b)上記アンチセンス鎖が、第1の2'炭素アンチセンス修飾を有する第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の2'炭素アンチセンス修飾を有する第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、該第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位で第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されている。 (B) the antisense strand, terminal antisense 'second 5 carbon antisense modification' of terminal antisense nucleotide and a second 2 'first 5 carbon antisense modification' first 2 - is composed of a nucleotide, the first 5 'terminal antisense nucleotide at carbon position 5' terminal antisense nucleotide 'first 5 are phosphorylated.

第20の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化させるための方法に関し、この方法は標的核酸に対して、または該標的核酸を発現している、もしくは発現することができる細胞に対して、ヘアピンsiRNAを形成することができる単分子のsiRNAをさらすことを含み、上記単分子siRNAが、アンチセンス領域およびセンス領域を含み、 According to a twentieth embodiment, the present invention relates to a method for minimizing off-target effects, the method may be to the target nucleic acid, or expressing the target nucleic acid, or expresses to cells, the method comprising exposing an siRNA single molecule capable of forming a hairpin siRNA, said unimolecular siRNA comprises an antisense region and a sense region,
(a)上記センス領域が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を有し、また上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を有し、 (A) said sense region is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide first 2' carbon sense modification has also the second 5 'terminal sense nucleotide second 2' has a carbon sense modification,
(b)上記アンチセンス領域が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2'炭素アンチセンス修飾を有し、また上記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2'炭素アンチセンス修飾を有し、さらに上記第1の5'アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位で、上記第1の5'アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されており、 (B) the antisense region is comprised of a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide, the first 5 'terminal antisense nucleotide is the first 2' a carbon antisense modification and said second 5 'terminal antisense nucleotide is the second 2' has a carbon antisense modification, further carbon position 5 'antisense nucleotide' the first 5 in, the first 5 'antisense nucleotide is phosphorylated,
(c)ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している。 (C) a loop region is located between said sense region and said antisense region.

好ましくは、上記ループ領域が上記アンチセンス領域の下流にある。 Preferably, the loop region downstream of the antisense region.

本発明は、siRNA適用のための制御、トラッキング剤、およびエクサエクオ(exaequo)剤も提供する。 The present invention, control for siRNA application also provides tracking agents, and Ekusaekuo (exaequo) agent. これらの薬剤は、リン酸化5'末端アンチセンス・ヌクレオチドを含まないという点を除いて、第17および第18の実施形態の分子を含む。 These agents, except that does not contain a phosphorylated 5 'terminal antisense nucleotide comprises a molecule of the seventeenth embodiment and eighteenth. したがって、これらの薬剤は、(i)各々が2'炭素アンチセンス修飾、好ましくは2'−O−アルキル修飾、より好ましくは2'−O−メチル修飾を含む第1および第2(または第1、第2、および第3)の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと、(ii)各々が2'炭素センス修飾、好ましくは2'−O−アルキル修飾、より好ましくは2'−O−メチル修飾を含む第1および第2(または第1、第2、および第3)の5'末端センス・ヌクレオチドとを含む。 Thus, these agents, (i) each 2'carbon antisense modification, preferably 2'-O- alkyl modification, preferably the first and second containing 2'-O- methyl modification (or first , 'the terminal antisense nucleotide, (ii) each 2' second, and third) of 5 carbon sense modification, preferably 2'-O- alkyl modification, more preferably a 2'-O- methyl modification first and second including and a (or first, second, and third) 5 'terminal sense nucleotide. いくつかの実施形態では、例えば蛍光標識であり、また第1の5'末端センス・ヌクレオチド上に位置している標識以外の他のヌクレオチドが、いずれも修飾を受けていない。 In some embodiments, for example, a fluorescent label, also the first 5 'terminal sense nucleotide other nucleotide other than labels located on has not any undergo modification. また、2'−O−アルキル基による1つ以上のセンス・ピリミジンの修飾、および/または2'−ハロゲン基による1つ以上のアンチセンス・ピリミジンの修飾の修飾、あるいは/またはセンスおよび/もしくはアンチセンス鎖の5'末端ヌクレオチドの5'炭素上にあるブロック基があってもよい。 Further, 2'-O-alkyl group one or more sense pyrimidine modification by, and / or 2'-halogen groups one or more modified antisense pyrimidine modification by, or / or sense and / or antisense there may be blocking groups located on the carbon 5 'terminal nucleotide 5' of the sense strand.

本発明の他の利点および実施形態ならびにさらなる利点および実施形態をより良く理解するために、実施例と関連した以下の説明について言及するもので、その範囲は添付した特許請求の範囲に記述されている。 To better understand the other advantages and embodiments as well as further advantages and embodiments of the present invention, intended to refer to the following description taken in conjunction with the embodiment, the range is described in the appended claims there.

本発明の好ましい実施形態は、いかなる形であれ本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、例証および記述を目的として選択されている。 A preferred embodiment of the present invention is not intended to limit the scope of the invention in any way, it is selected for purposes of illustration and description. 本発明のいくつかの態様の好ましい実施形態の利点は、添付の図面に示される。 An advantage of a preferred embodiment of some aspects of the invention are illustrated in the accompanying drawings.

(詳細な説明) (Detailed description)
ここで、本発明を好ましい実施形態と関連させて説明する。 Here it will be described in connection with preferred embodiments of the present invention. これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提示されており、いかなる形であれ、本発明を制限することを意図したものではなく、またそのように解釈されてはならない。 These embodiments are presented to aid the understanding of the present invention, in any way, and not intended to limit the present invention and must not be interpreted as such. この開示を読むことで当業者にとって容易に理解されうる全ての代替、修飾、および等価物は、本発明の精神および範囲のなかに包含される。 Readily understood and can all alternatives to those of skill in the art upon reading this disclosure, modifications, and equivalents are encompassed within the spirit and scope of the invention.

この開示は、R NA干渉を実行するための組成物および方法についてのプライマーない。 This disclosure is not a primer on compositions and methods for performing R NA interference. 当業者に知られている基礎概念については、詳しくは説明しなかった。 For the basic concepts that are known to those skilled in the art, details have not been described.

本発明は、siRNA誘導遺伝子サイレンシングを含むRNA干渉を実施するための組成物および方法に関する。 The present invention relates to compositions and methods for performing RNA interference comprising the siRNA-induced gene silencing. 本発明、修飾ポリヌクレオチド、およびその誘導体を用いることで、RNA干渉用途の効率を改善することが可能である。 The present invention, modified polynucleotides, and by using the derivatives thereof, it is possible to improve the efficiency of RNA interference applications.

特に明記しない限り、以下の用語および表現は、以下で規定される意味を持つ。 Unless otherwise stated, the following terms and expressions have the meanings as defined below.

(アルキル) (Alkyl)
用語「アルキル(alkyl)」とは、飽和または不飽和、さらに置換または非置換型であるヒドロカルビル部分のことをいう。 The term "alkyl (alkyl)" is a saturated or unsaturated, further refers to a hydrocarbyl moiety which is substituted or unsubstituted. それは、直鎖状、分岐状、環状、および/または複素環状であり、かつエーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸塩等の官能基を含む部分から構成されるものであってもよい。 It is a linear, branched, cyclic, and / or a heterocyclic, and ethers, ketones, aldehydes, or may be composed of a moiety comprising a functional group such as a carboxylic acid salt.

典型的なアルキル基として、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、およびより大きい炭素数のアルキル基、同様に2−メチルプロピル、2−メチルー4−エチルブチル、2,4−ジエチルプロイル、3−プロピルブチル、2,8−ジブチルデシル、6,6−ジメチロクチル、6−プロピル−6−ブチロクチル、2−メチルブチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、および2−エチルヘキシルが挙げられる。 Typical alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl , nonadecyl, eicosyl, and larger alkyl groups having a carbon number, likewise 2-methylpropyl, 2-methyl-4-ethylbutyl, 2,4-diethyl-Pro-yl, 3-propyl butyl, 2,8-Jibuchirudeshiru, 6, 6 Jimechirokuchiru, 6-propyl-6-Buchirokuchiru, 2-methylbutyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, and 2-ethylhexyl and the like. 上記用語アルキルはまた、アルケニル基、例えばビニル、アリル、アラルキル、およびアルキニル基も包含する。 The term alkyl also includes alkenyl groups such as vinyl, allyl, aralkyl, and also alkynyl groups include.

アルキル基内での置換として、任意の原子または基を含むことができる。 As substitutions within the alkyl group can include any atom or group. そのことはアルキル部分で許容され、限定されるものではないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン(一級、二級、または三級)、アミド、エーテル、エステル、アルコール、ならびに酸素が挙げられる。 Its it is allowed in the alkyl moiety, but are not limited to, halogen, sulfur, thiols, thioethers, thioesters, amines (primary, secondary, or tertiary), amides, ethers, esters, alcohols, and oxygen and the like. 一例として、アルキル基は、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ、ニトロソまたはニトリル基等の修飾と、イミダゾール、ヒドラジノまたはヒドロキシルアミノ基等のヘテロ環、イソシアネートまたはシアネート基、スルホキシド、スルホン、ジスルフィド等の硫黄含有基を、含むこともできる。 As an example, alkyl groups, azo groups, keto groups, aldehyde groups, carboxyl group, nitro, heterocycle, isocyanate or cyanate groups, such as modified and, imidazole, hydrazino or hydroxylamino groups such as nitroso or nitrile groups, sulfoxide, sulfone the sulfur-containing group disulfide etc., may also be included.

さらに、アルキル基はまた、ヘテロ置換を含むものであってもよく、このような置換では、炭素原子が、例えば窒素、酸素、もしくは硫黄によって置換される。 Further, the alkyl group also may comprise a hetero-substituted, with such substitutions, the carbon atom is substituted such as nitrogen, oxygen, or by a sulfur. 複素環置換は、1つ以上のヘテロ原子を持つアルキル環のことをいう。 Heterocyclic-substituted refers to alkyl rings having one or more hetero atoms. ヘテロ環部分の例として、限定されるものではないが、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリドンが挙げられる。 Examples of heterocyclic moieties include, but are not limited to, morpholino, imidazole, and pyrrolidone.

(2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド) (2'-O- alkyl modified nucleotides)
「2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド(2'−O−alkyl modified nucleotide)」という成句は、ヌクレオチド単位のことをいい、該ヌクレオチド単位は糖部分、例えば、該糖の2'位に位置した炭素原子とアルキル基との両方に酸素原子が結合するようにして2'位で修飾されるデオキシリボシル部分を持つ。 Carbon phrase "2'-O- alkyl modified nucleotide (2'-O-alkyl modified nucleotide)" refers to a nucleotide unit, the nucleotide units sugar moiety, for example, located at the 2 'position of the sugar with deoxyribosyl moiety which both oxygen atoms are modified at the 2 'position so as to bind to the atom and an alkyl group.

(アミンおよび2'アミン修飾ヌクレオチド) (Amine and 2 'amine modified nucleotide)
用語「アミン(amine)」とは、例えば、1、2、または3つの水素原子を他の基(例えば、アルキル基)で置き換えることで、アンモニアから直接または間接的に誘導されることをいう。 The term "amine (Amine)", for example, 1, 2, or 3 hydrogen atoms of other groups (e.g., alkyl group) by replacing in refers to derived directly or indirectly from the ammonia. 一級アミンは、一般構造RNH を有し、二級アミンは一般の構造R NHを有する。 Primary amines have the general structure RNH 2, secondary amines have the general structure R 2 NH in. 成句「2'アミン修飾ヌクレオチド」とは、糖の2'位に付着したアミンまたは窒素含有基によって修飾される糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。 'The term "amine-modified nucleotides, 2 sugar phrase 2"' refers to a nucleotide unit having a sugar moiety that is modified by an amine or nitrogen-containing group attached to the position.

アミンという用語として、限定されるものではないが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、多環式アミン、ヘテロ原子置換アリールおよびアルキルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルフォリン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、2,6−ジメチルピペリジン、ピペラジン、ならびにヘテロ原子置換アルキルもしくはアリール二級アミンが挙げられる。 As the term amines include, but are not limited to, methylamine, ethylamine, propylamine, isopropylamine, aniline, cyclohexylamine, benzylamine, polycyclic amines, heteroatom substituted aryl and alkyl amines, dimethylamine, diethylamine, diisopropylamine, dibutylamine, methylpropylamine, methylhexylamine, methyl cyclopropylamine, ethyl cyclohexylamine, methyl benzylamine, methylcyclohexyl main ethylamine, butyl cyclohexylamine, morpholine, thiomorpholine, pyrrolidine, piperidine, 2,6 dimethylpiperidine, piperazine, as well as heteroatom substituted alkyl or aryl secondary amines.

(アンチセンス鎖) (Antisense strand)
本明細書で用いられるフレーズ「アンチセンス鎖(antisense strand)」とは、目的とするところの標的核酸に対して、実質的または100%相補的であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一領域のことをいう。 Phrase "antisense strand (antisense strand)" as used herein, the target nucleic acid it is an object, the one region of a polynucleotide or polynucleotides that are substantially or 100% complementary Say. アンチセンス鎖は、ポリヌクレオチド領域(すなわちRNA、DNA、またはキメラRNA/DNA)から構成可能である。 Antisense strand can be constructed from a polynucleotide region (i.e. RNA, DNA or chimeric RNA / DNA,). 例えば、アンチセンス鎖は、一分子の伝令RNA、mRNAではないRNA(例えば、tRNA、rRNA、およびhnRNA)、あるいはコードまたは非コードのDNA配列に対して全体的または部分的に相補的であってもよい。 For example, the antisense strand messenger RNA of one molecule is not the mRNA RNA (e.g., tRNA, rRNA, and hnRNA), or be wholly or partially complementary to the DNA sequence of the coding or non-coding it may be. フレーズ「アンチセンス鎖」として、2本の異なる鎖から形成される両方のポリヌクレオチドのアンチセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子のsiRNAとが挙げられる。 As a phrase "antisense strand", and the antisense region of both polynucleotides that are formed from the two different chains, it includes the siRNA single molecule capable of forming a hairpin structure. フレーズ「アンチセンス鎖」および「アンチセンス領域(antisense region)」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。 The phrase "antisense strand" and "antisense region (antisense region)" are intended to be equivalent, they are interchangeably used. アンチセンス鎖を、低分子および/またはコンジュゲートの多様な群によって修飾させることができる。 The antisense strand can be modified by small and / or diverse group of the conjugate.

(2'炭素修飾) (2 'carbon modifications)
フレーズ「2'炭素修飾(2' carbon modification)」とは、糖部分(例えば2'位で修飾されるデオキシリボシル部分)を持つヌクレオチド単位のことをいう。 Phrase "2 'carbon modifications (2' carbon modification)" refers to a nucleotide unit having a sugar moiety (e.g. deoxyribosyl moiety that is modified at the 2 'position). この位置で、糖の2'位に位置した炭素原子と、2'−O−メチル、2'−O−エチル、2'−O−プロピル、2'−O−イソプロピル、2'−O−ブチル、2'−O−イソブチル、2'−O−エチル−O−メチル(−OCH CH OCH )、および2'−O−エチル−OH(−OCH CH OH)等のアルキル基との両方に、酸素原子が付着するようにして、「2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド」が修飾を受ける。 In this position, the carbon atom located at the 2 'position of the sugar, 2'-O-methyl, 2'-O-ethyl, 2'-O-propyl, 2'-O-isopropyl, 2'-O-butyl , 2'-O- isobutyl, 2'-O- ethyl -O- methyl (-OCH 2 CH 2 OCH 3) , and an alkyl group such as 2'-O- ethyl -OH (-OCH 2 CH 2 OH) both, so as to be an oxygen atom attached "2'-O- alkyl modified nucleotide" is subjected to modification. 「2'炭素センス修飾」とは、センス鎖上またはポリヌクレオチドのセンス領域内にあるヌクレオチドの2'炭素位における修飾のことをいう。 'The term "carbon sense modification, 2 nucleotides in the sense region of the sense strand or on the polynucleotide 2"' refers to a modification at carbon position. 「2'炭素アンチセンス修飾」とはアンチセンス鎖上またはポリヌクレオチドのアンチセンス領域内にあるヌクレオチドの2'炭素位における修飾のことをいう。 Refers to a modification in the carbon position '2 nucleotides in the antisense strand on or polynucleotide antisense region are as "carbon antisense modification 2"'.

(相補性) (Complementary)
用語「相補性(complementary)」とは、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力のことをいう。 The term "complementarity (Complementary)" refers to the ability of polynucleotides to form a mutually bp. 塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって、概ね形成される。 Base pairs by hydrogen bonds between nucleotide units in antiparallel polynucleotide strands or regions, generally are formed. 相補性ポリヌクレオチド鎖または領域は、ワトソン・クリック(Watson−Crick)方式(例えば、AとT、AとU、CとG)で塩基対を形成することができ、あるいは安定な二本鎖を形成することを可能とする他の任意の方法で塩基対を形成することができる。 Complementary polynucleotide strand or region, Watson-Crick (Watson-Crick) scheme (e.g., A and T, A and U, C and G) can form base pairs, or a stable duplex it is capable of forming base pairs with any other method capable of forming.

完全な相補性または100%相補性は、一方のポリヌクレオチド鎖または領域の各々のヌクレオチド単位が他方のポリヌクレオチド鎖または領域の各のヌクレオチドと水素結合を形成することができる状況のことをいう。 Complete complementarity or 100% complementarity refers to the situation that can each nucleotide unit of one polynucleotide strand or region forms a respective nucleotide and hydrogen bonding of the other polynucleotide strand or region. 完全な相補性に満たないことは、2本の鎖または2つの領域の、すべてではないがいくつかのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができることをいう。 To less than perfect complementarity, the two strands or two regions means that everything can be some but not of the nucleotide units are hydrogen bonded to each other. 例えば、2つの20量体に関して、もし鎖上の2つの塩基対のみが互いに水素結合することができる場合、それらのポリヌクレオチド鎖または領域の相補性が10%であることを示している。 For example, for two 20-mer, if capable of only two base pairs on each strand hydrogen bond with each other, complementary to their polynucleotide strand or region is shown to be 10%. 同じ例で、各鎖または各領域上の18塩基対が互いに水素結合することができる場合、ポリヌクレオチド鎖は90%相補性を示す。 In the same example, if 18 base pairs on each strand or each region can hydrogen bond with each other, the polynucleotide strands exhibit 90% complementarity. 実質的な相補性とは、90%以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖または領域のことをいう。 Substantial complementarity refers to polynucleotide strands or regions show 90% or more complementarity.

(コンジュゲートおよび末端コンジュゲート) (Conjugate and terminal conjugate)
用語「コンジュゲート(conjugate)」とは、安定性の増加および/またはそれ自体によるsiRNAの取り込みの促進をおこなう等、siRNAの物性を変える分子または部分(moiety)のことをいう。 The term "conjugate (conjugate)" is such performed increased stability and / or itself promote siRNA uptake by, refers to a molecule or moiety changing the physical properties of siRNA (moiety). 「末端コンジュゲート(terminal conjugate)は、siRNAの3'および/または5'末端に直接またはリンカーを介して付着することが可能である。内部コンジュゲートは、直接またはリンカーを介して間接的に、塩基、リボースの2'位、または他の適当な1つの位置または複数の位置、例えば5−アミノアリル・ウリジンに付着することが可能である。 "Terminal conjugate (terminal Enter conjugate) may be attached directly or through a linker to the 3 'and / or 5' end of the siRNA. Internal conjugates indirectly directly or through a linker, bases, 2 'position of the ribose, or other suitable single location or multiple locations, it is possible to attach, for example, 5-amino allyl-uridine.

互いに付着しない異なる2本の鎖を持つsiRNA(すなわち、siRNAが単分子またはヘアピンsiRNAではない)では、該鎖の一方または両方の5'末端がコンジュゲートを持つことができ、さらに/またはsiRNAを含む該鎖の一方または両方の3'末端がコンジュゲートを持つことができる。 siRNA (i.e., siRNA is not a unimolecular or hairpin siRNA) having two strands differ not adhere to each other in, can 5 'end of one or both of the chain have a conjugate, a further / or siRNA 3 'end of one or both of the chain, including can have a conjugate.

コンジュゲートは、例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、 炭水化物 、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール)、さらにまたこれらの物質類の全ての類似体または誘導体であってもよい。 Conjugate, for example, amino acids, peptides, polypeptides, proteins, antibodies, antigens, toxins, hormones, lipids, nucleotides, nucleosides, sugars, carbohydrates, polymers (e.g., polyethylene glycol and polypropylene glycol), furthermore these substances it may be all of the analogue or derivative. コンジュゲートのさらなる例として、ステロイド(例えば、コレステロール)、リン脂質、ジおよびトリアルグリセロール、脂肪酸、不飽和または置換を含む、もしくは含まない炭水化物 、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類も挙げられる。 Further examples of the conjugate, steroids (e.g., cholesterol), include phospholipids, di- and triacylate Le glycerol, fatty acids, including unsaturated or substituted, or carbohydrate containing no, enzyme substrates, biotin, digoxigenin, and also polysaccharides It is. さらに他の例として、ヘキシル−S−トリチルチオール等のチオエーテル、チオコレステロール、ドデカンジオールまたはウンデシル基等のアシル鎖、ジヘキサデシル−rac−グリセロール、トリエチルアンモニウム、1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン部分、ヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール、ファルネシル、ゲラニル、およびゲラニルゲラニル部分が挙げられる。 As yet another example, a thioether hexyl -S- trityl thiol such as thiocholesterol, acyl chains, such as dodecane diol or undecyl group, dihexadecyl -rac- glycerol, triethylammonium, 1,2-di -O- hexadecyl -rac- glycero -3-H- phosphonate, a polyamine, polyethylene glycol, adamantane acetic acid, a palmityl moiety, an octadecylamine moiety, hexylaminocarbonyl - oxycholesterol, farnesyl, geranyl, and geranylgeranyl moieties.

コンジュゲートもまた、検出可能な標識であってもよい。 Conjugates also may be a detectable label. 例えば、コンジュゲートをフルオロフォアとすることができる。 For example, it is possible to conjugate a fluorophore. コンジュゲートとして、TAMRA等のフルオロフォア、BODIPY、シアニン誘導体(例えば、Cy3またはCy5ダブシル(Dabsyl))、フルオロセイン、または公知の他の適当なフルオロフォアが挙げられる。 As conjugates, fluorophore TAMRA etc., BODIPY, cyanine derivatives (e.g., Cy3 or Cy5 dabsyl (Dabsyl)), fluorescein or other known suitable fluorophores include.

コンジュゲートを、都合がよく、かつそれを持つsiRNAの所望の活性と実質的に干渉しない末端ヌクレオチド上の任意の位置(例えば、リボシル糖の3'または5'位に付着させてもよい。コンジュゲートは、R NA干渉の媒介となるsiRNAの能力が、形質移入後24時間で機能性が測定される培養細胞を用いた生体外(in vitro)アッセイで80%を上回る減少となるような、その機能性への悪影響を及ぼす場合 、実質的にsiRNAの所望の活性と干渉する。 The conjugate, conveniently found and any position on the desired activity and do not substantially interfere with terminal nucleotide of the siRNA with it (for example, may be attached to the 3 'or 5' position of a ribosyl sugar. Gongju gates, such as the ability of siRNA to be borne in R NA interference, a decrease of more than 80% in vitro (in vitro) assays using cultured cells functional in 24 hours after transfection is measured, adversely affect to its functionality, to interfere substantially desired activity of siRNA.

(デオキシヌクレオチド) (Deoxynucleotides)
用語「デオキシヌクレオチド(deoxynucleotide)」とは、2'および/または3'炭素に結合した水素を持つ代わりに、適当な結合および/または2'、3'末端ジデオキシを持つ糖部分の2'または3'位で、OH基を欠いているヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。 The term "deoxynucleotide (Deoxynucleotide)", instead of having hydrogens attached to the 2 'and / or 3' carbon, suitable binding and / or 2 ', 3' 2 of the sugar moiety having a terminal dideoxy 'or 3 'position in, refers to a nucleotide or polynucleotide lacking an OH group.

(デオキシリボヌクレオチド) (Deoxyribonucleotides)
用語「デオキシリボヌクレオチド(deoxyribonulreotide)および「DNA」は、リボシル部分の2'位にHを持つ少なくとも1つのリボシル部分を含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。 The term "deoxyribonucleotide (deoxyribonulreotide) and" DNA "refers to a nucleotide or polynucleotide comprising at least one ribosyl moiety with H at the 2 'position of a ribosyl moiety.

(下流) (downstream)
ヌクレオチドからなる1本の鎖の1つの領域は、もし該第1の領域の5'側最末端部分(most portion)が第2の領域の3'末端に対してその領域の最も近接した部分である場合、第2の領域の下流であると見なされる。 One region of one strand consisting of nucleotides, if 5 the first region 'side top end portion (most Portion) is 3 in the second region' in closest part of the area with respect to terminal some cases, are considered to be downstream of the second region.

(エクサエクオ剤) (Ekusaekuo agent)
フレーズ「エクサエクオ剤(exaequo agent)」とは、RNAi経路への参加見込み、またはRNAi経路へ参加する能力について他の核酸と競合する能力という観点から、不活性または半不活性である核酸のことをいう。 Phrase "Ekusaekuo agent (exaequo agent)" participated expected to RNAi pathway, or from the viewpoint of the ability to compete with other nucleic acids for the ability to participate in the RNAi pathway, to a nucleic acid which is inert or semi-inert Say. 分子をエクサエクオ剤として用いることができ、エクサエクオ剤溶液中の核酸の総量を均一または同等にするために使用される It can be used molecules as Ekusaekuo agent, e Kusaekuo agents are used to equalize or equivalent the total amount of nucleic acid in solution.

(第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド) (First 5 'terminal antisense nucleotide)
フレーズ「第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、センス鎖または領域上に対応の相補的塩基を持つアンチセンス鎖または領域の塩基に関して、その鎖の5'側最末端位置(most position)に位置しているアンチセンス鎖または領域のヌクレオチドのことをいう。 Phrase 'The' terminal antisense nucleotide, for bases of the antisense strand or region having a complementary base corresponding to the sense strand or region, 5 of the chain first 5 '' of the outermost end position (most position refers to the antisense strand or region of the nucleotide is located). したがって、2本の異なる鎖から構成されるsiRNA(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)において、アンチセンス鎖上の任意の5'オーバーハングの一部である塩基とは異なる5'側最末端塩基(most base)と呼ぶ。 Therefore, composed of two different chain siRNA (i.e., a single non-molecule or hairpin siRNA) in any 5 top end 'different 5 from the base is part of the overhang' side of the antisense strand It referred to as the base (most base). 第1の5'末端アンチセンスセンス・ヌクレオチドがヘアピン分子の一部である場合、用語「末端(terminal)」はアンチセンス領域内にある相対的に5'側の最末端位置のことをいい、したがってアンチセンス領域の5'側最末端ヌクレオチドである。 'If terminal antisense sense nucleotide is part of a hairpin molecule, the term "terminal (terminal Enter)" is relatively 5 in the antisense region' first 5 refers to the most distal position of the side, therefore 5 'most terminal nucleotide of the antisense region.

(第1の5'末端センス・ヌクレオチド) (First 5 'terminal sense nucleotide)
フレーズ「第1の5'末端センス・ヌクレオチド」は、アンチセンス・ヌクレオチドに関して定義される。 The phrase "first 5 'terminal sense nucleotide" is defined in terms of antisense nucleotide. 2本の異なる鎖から構成される分子(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)では、アンチセンス鎖上の対応の相補的塩基を持つセンス鎖の塩基に関して、その鎖の5'最末端位置に位置しているセンス鎖のヌクレオチドのことをいう。 Two different molecules composed of chains (i.e., a single non-molecule or hairpin siRNA) in respect nt sense strand having a corresponding complementary nucleotide on the antisense strand, the 5 'most terminal position of the chain position to say that of the nucleotide of the sense strand are. したがって、2本の異なる鎖(すなわち、単分子またはヘアピンsiRNAではない)から構成されるsiRNAでは、センス鎖または領域上の任意の5'オーバーハングの一部である塩基以外の5'最末端塩基である。 Thus, two different chains (i.e., is not a single molecule or hairpin siRNA) in siRNA composed of any 5 'non-nucleotide which is part of the overhang 5' most terminal nucleotide on the sense strand or region it is. 第1の5'末端センス・ヌクレオチドが、ヘアピンを形成することができる単分子siRNA分子の一部分である場合、用語「末端」は、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補性を持つ塩基からの距離で測定されるセンス鎖または領域内の相対的位置のことをいう。 The first 5 'terminal sense nucleotide, when a portion of the unimolecular siRNA molecule capable of forming a hairpin, the term "terminal", the first 5' complementarity to terminal antisense nucleotide measured at a distance from the base with refers to the relative positions of the sense strand or region.

(機能性) (Functionality)
siRNAを、培養細胞系で誘導されるサイレンシングのレベルまたは度合いに基づいて、5つのグループ(非機能性、半機能性、機能性、高機能性、および超機能性)に分けることが可能である。 The siRNA, based on the level or degree of silencing induced in cultured cell lines, five groups can be divided into (non-functional, semi-functional, functional, highly functional, and ultra functional) is there. 本明細書に用いられるように、これらの違いは、一組の条件に基づいていおり、該条件とは、siRNAが100nMの濃度で上記細胞系に形質移入されること、サイレンシングのレベルが形質移入後おおよそ24時間(しかし形質移入後72時間を超えてはならない)に調べられることである。 As used herein, these differences are based on a set of conditions, and the condition, that the siRNA is transfected into said cell line at a concentration of 100 nM, the level of silencing trait approximately 24 hours after transfection (but more than 72 hours after transfection it should not) is to be examined. この文脈のなかで、「非機能性siRNA(non−functional siRNA)」は、誘導される標的サイレンシングが50%未満(<50%)であるsiRNAとして定義される。 Among this context, "non-functional siRNA (non-functional siRNA)" is a target silencing induced is defined as siRNA is less than 50% (<50%). 「半機能性siRNA(semi−functional siRNA)」は、50〜79%標的サイレンシングを誘導する。 "Semi-functional siRNA (semi-functional siRNA)" induce 50-79% target silencing. 「機能性siRNA(functional siRNA)」は、80〜95%遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。 "Functional siRNA (functional siRNA)" is a molecule that induces 80% to 95% gene silencing. 「高機能性siRNA(high functional siRNA)は、95%を上回る遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「 機能性siRNA(hyperfunctional siRNA)」は、特別な分子種である。 "High Functional siRNA (high functional siRNA) are molecules that induce gene silencing in excess of 95%." Super functional siRNA (hyperfunctional siRNA) "is a special species. この文書の目的のために、 機能性siRNA 、(1)サブナノモル未満の濃度(すなわち、1ナノモル未満)で形質移入した場合に特異的標的のサイレンシングを95%を上回る率で誘導し、さらに/または(2)96時間を上回る時間にわたってサイレンシングの機能的(または良好な)レベルを誘導する分子として定義される。 For the purposes of this document, super functional siRNA induces by a rate exceeding 95% silencing of a specific target when transfected with (1) a concentration of less than subnanomolar (i.e., less than 1 nanomolar) further / or (2) it is defined as a molecule that induces functional (or better) levels of silencing for a time greater than 96 hours. これらの相対的機能性(絶対であることを意図していない)は、機能的ゲノム解析、標的同定、および薬物療法等の用途に対する特定の標的とsiRNAとを比較するのに用いられる。 These relative functionalities (you have not intended to be absolute) is functional genomics, it is used to compare the particular target and siRNA for use in target identification and drug therapy and the like.

(機能的用量) (Functional dose)
「機能的用量(functional dose)」とは、投与後24、48、72、および96時間で100nM濃度のmRNAを95%以上減少させるという効果を示すsiRNAの用量のことをいう。 A "functional doses (functional dose)" refers to the dose of siRNA showing the effect of reducing 24, 48, 72, and the mRNA of 100nM concentration 95% at 96 hours after administration. 一方、siRNAの「僅かに機能的用量(marginally functional dose)」は投与後24時間で100nM濃度のmRNAを50%以上減少させる効果を示し、さらにRNAの 「非機能的用量(non−functional dose)」は投与後24時間で100nM濃度のmRNAの減少を50%未満とする効果を示す。 On the other hand, "slightly functional doses (marginally functional dose)" of the siRNA indicates the effect of reducing 50% or more mRNA of 100nM concentration 24 hours after administration, yet RNA "nonfunctional dose (non-functional dose) "indicates the effect of less than 50% reduction of mRNA 100nM concentration 24 hours after administration.

(ハロゲン) (halogen)
用語「ハロゲン(halogen)」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、またはアスタチンのいずれかの原子のことをいう。 The term "halogen (Halogen)" refers to fluorine, chlorine, bromine, iodine or the one atom of astatine, it says. フレーズ「2'ハロゲン修飾ヌクレオチド(2'halogen modified nucleotide)」とは、2'炭素に直接付着した2'位にあるハロゲンにより修飾された糖部分を持つヌクレオチド単位のことをいう。 The phrase "2 'halogen modified nucleotide (2'halogen modified nucleotide)" is 2' refers to a nucleotide unit having a modified sugar moiety by halogen in the 2 'position attached directly to a carbon.

(2'ハロゲン修飾ピリミジン) (2 'halogen modified pyrimidine)
フレーズ「2'ハロゲン修飾ピリミジン(2'halogen modified pyrimidine)」とは、ヌクレオチドの糖の2'炭素に対して付着したハロゲン基を含むピリミジン(例えば、シトシンまたはウラシル)のことをいう。 The phrase "2 'halogen modified pyrimidine (2'halogen modified pyrimidine)" is 2 nucleotides of the sugar' refers to a pyrimidine (e.g., cytosine or uracil) that contains a halogen group attached to the carbon.

(ヌクレオチド間連結) (Linkages)
フレーズ「ヌクレオチド間連結(internucleotide linkage)」とは、1つのsiRNA内での2つのヌクレオチド単位間に存在する結合または連結のタイプのことをいうもので、修飾されたもの、または未修飾のものであってもよい。 Phrase "linkages (internucleotide linkage)" is intended to refer to types of binding or coupling exists between two nucleotide units within a single siRNA, those modified, or those of unmodified it may be. フレーズ「修飾ヌクレオチド間連結」は、現在のところ公知、これから知られる、さらにまたはこの開示を読むことで当業者が推論する、全ての修飾ヌクレオチド間結合を包含する。 The phrase "between modified nucleotides linked" currently encompasses known, now known, further or skilled person reasoning by a reading of this disclosure, the binding between all modified nucleotides. ヌクレオチド間連結は、関連した対イオンを有するものであってもよく、この用語は、そのような対イオンと、ヌクレオチド間連結で形成され得る任意の配位化合物とを含むことが意図されている。 Linkages may be one having an associated counter ions, this term is intended to include with such counterions, and any coordination compound may be formed by linkages .

ヌクレオチド間連結の修飾として、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、5'−アルキレンホスホネテート、5'−メチルホスホネート、3'−アルキレンホスホネート、3'−5'連結または2'−5'連結の三フッ化ホウ素、ボノホスフェートエステル、およびセレノホスフェート、リン酸トリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホン酸塩結合、アルキル・ホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホンチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスフィネート、ホスホルアミダート、3'−アルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、ホスホロピペラジダート、ホスホ As modification of internucleotide linkages, but are not limited to, phosphorothioate, phosphorodithioate, methyl phosphonates, 5'-alkylene phosphonate bone Tate, 5'Mechiruhosu bone over preparative, 3'-alkylene phosphonates, 3' 5 'linkage or a 2'-5' boron trifluoride consolidated, Bo La Roh phosphate esters, and selenophosphate, phosphoric acid triester, thio-alkyl phosphotriester, hydrogen phosphonate bond, alkyl phosphonates, Arukiruhosuho Nochioeto, aryl phosphonthioate, phosphoroselenoate, phosphorodithioate dideoxyribose benzoate, phosphinates, phosphoramidates, 3'alkyl phosphoramidate, aminoalkyl phosphoramidate, thionoalkylphosphonates phosphoramidate, phosphoro Piperajidato, phospho アニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カルボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、 ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミダート、リボアセチル基との連結、アミノエチルグリシン、シリルまたはシキサン連結、ヘテロ原子を含む、ならびに/あるいは飽和もしくは未飽和および/または置換し得る1〜10の炭素からなるヘテロ原子を有するか、もしくは持たないアルキルまたはシクロアルキル連結、モルホリノ構造との連結、直接または間接的に主鎖のアザ窒素に対して塩基が付着し得るポリアミド、さらにsiRNA内でのそれらの修飾ヌクレオチド間連結の組合わせである。 Anirochioeto, coupling of phosphorothioate anilinium Romantic, ketone, sulfone, sulfonamide, carbonate, carbamate, methylene hydrazo, methylene dimethyl hydrazo, Horumua acetal, thio Horumua acetal, oxime, Mechiren'imino, methylenemethylimino, Chioamidato and Riboasechiru group , aminoethyl glycine, silyl or b hexane coupling, containing a hetero atom, and / or saturated or unsaturated and / or having a hetero atom of carbon of 1 to 10 which may be substituted, or have not alkyl or cycloalkyl connection, the connection between the morpholino structure, directly or indirectly polyamide base against aza nitrogen in the main chain can be attached, a further combination of the connection between their modified nucleotides in the siRNA.

(リンカー) (Linker)
「リンカー(linker)は、他の部分(例えばヌクレオチドおよびそのコンジュゲート)と互いに付着する部分である。細胞に取り込まれる分子の安定性および/または能力をコンジュゲートが高める一方で、リンカーは細胞に取り込まれる分子に対してコンジュゲートを単に付着させることから、リンカーとコンジュゲートとを区別することが可能である。 "Linker (linker) is another portion (e.g., nucleotides and conjugates thereof) portion adhering to each other. Stability of the molecule that is incorporated into cells and / or the ability while increasing conjugates, linkers to cells from simply depositing a conjugate with respect to molecules captured, it is possible to distinguish between linker conjugated.

一例として、リンカーは修飾または未修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリマー、糖および他の炭水化物 、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアルコール、ポリプロピレン、プロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールとの混合物、ポリアルキルアミン、スペルミジンのポリアミン、ポリ(エチルアクリレート)等のポリエステル、ポリスホエステル、およびアルキレンを含むことができる。 As an example, the linker modified or unmodified nucleotides, nucleotides, polymers, sugars and other carbohydrates, polyethers such as polyethylene glycol, polyalcohols, polypropylene, propylene glycol, mixtures of ethylene and propylene glycol, polyalkyl amine, spermidine polyamines etc., poly (ethyl acrylate) polyesters such as poly ho Suho di- esters, and may include alkylene. コンジュゲートおよびそのリンカーの一例は、コレステロール−TEG−ホスホラミダイトであり、コレステロールはコンジュゲートであり、テトラエチレングリコールおよびホスフェートはリンカーとして用いられる。 One example of a conjugate and linker is cholesterol -TEG- phosphoramidite, cholesterol is conjugated, tetraethylene glycol and phosphate is used as a linker.

(ヌクレオチド) (nucleotide)
用語「ヌクレオチド(nucleotide)」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらの修飾された形態、さらにはそれらの類似体のことをいう。 The term "nucleotide (nucleotide)" is ribonucleotide or deoxyribonucleotide or their modified forms, further refers to analogs thereof. ヌクレオチドとして、プリン、例えばアダニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられ、さらにピリミジンとして、例えばシトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられる。 As a nucleotide, purine, e.g. Adanin, hypoxanthine, guanine, and their derivatives and analogs. Examples of further pyrimidines, e.g. cytosine, uracil, thymine, and their derivatives and analogs.

ヌクレオチド類似体として、塩基、糖、および/またはリン酸塩の化学構造に修飾を持つヌクレオチドが挙げられ、限定されるものではないが、該ヌクレオチドとして、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、シトシン環外アミン、および5ブロモウラシルの置換;ならびに2'位糖修飾として、限定されるものではないが、糖修飾リボヌクレオチドが挙げられ、ここで該リボヌクレオチドの2'−OHがH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH 、NHR、NR 、もしくはCN等によって置換されており、Rが本明細書に定義したようにアルキル部分である。 As a nucleotide analogue, nucleotide, sugar, and / or nucleotides having a modification in the chemical structure of the phosphoric acid salt and the like, but are not limited to, as the nucleotide, 5-position pyrimidine modifications, 8-position purine modifications, cytosine exocyclic amines, and 5-substituted-bromouracil; as well as 2'-position sugar modifications, but are not limited to, include sugar-modified ribonucleotides, wherein 2'-OH of the ribonucleotide is H, oR, R, halo, SH, SR, NH 2, NHR, which is substituted by NR 2, or CN or the like, R is an alkyl moiety as defined herein. ヌクレオチド類似体もまた、塩基(例えば、イノシン、キューオシン、キサンチン)、糖(例えば、2'−メチルリボース)、非天然ホスホジエステル連結(例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート)、ならびにペプチドが含まれることを意図している。 Nucleotide analogs are also bases (e.g., inosine, queosine, xanthine) intended, sugars (e.g., 2'-methyl ribose), unnatural phosphodiester linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphorothioates), and to include peptide doing.
修飾塩基とは、ヌクレオチド塩基のことをいい、該塩基として、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ならびに、1つ以上の原子もしくは基の置換または付加によって修飾されたウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンが挙げられる。 The modified bases, refers to a nucleotide base, as the base, for example, adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, which is modified by the substitution or addition of one or more atoms or groups, xanthine, inosine, and queuosine and the like. 塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドから構成し得る修飾の種類のいくつかの例として、限定されるものではないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミン化、アミド化、またはアセチル化された種々の組み合わせの塩基が挙げられる。 Some examples of modifications of the type capable of constituting a modified nucleotide with respect to the base portion, but are not limited to, alkylated, halogenated, thiolated, aminated, amidated, or acetylated various It includes basic combination of the. より特異的な修飾塩基として、例えば、5−プロピニルウリジン、5−プロピニルシチジン、6−メチルアデニン、6−メチルグアニン、N,N−ジメチルアデニン、2−プロピルアデニン、2−プロピルグアニン、2−アミノアデニン、1−メチルイノシン、3−メチルウリジン、5−メチルシチジン、5−メチルウリジンおよび5位に修飾を持つ他のヌクレオチド、5−(2−アミノ)プロピルウリジン、5−ハロシチジン、5−ハロウリジン、4−アセチルシチジン、1−メチルアデノシン、2−メチルアデノシン、3−メチルシチジン、6−メチルウリジン、2−メチルグアノシン、7−メチルグアノシン、2,2−ジメチルグアノシン、5−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば7−デアザ−アデノシン、6−アゾ As a more specific modified bases, e.g., 5-propynyl uridine, 5-propynyl cytidine, 6-methyl adenine, 6-methylguanine, N, N-dimethyl adenine, 2-propyl adenine, 2-propyl guanine, 2-amino adenine, 1-methyl inosine, 3-methyluridine, 5-methylcytidine, other nucleotides with modified 5-methyluridine and 5, 5- (2-amino) propyl uridine, 5-Haroshichijin, 5- Harourijin, 4-acetyl cytidine, 1-methyl adenosine, 2-methyl adenosine, 3-methylcytidine, 6-methyluridine, 2-methylguanosine, 7-methyl guanosine, 2,2-dimethyl-guanosine, 5-methyloxy uridine, de aza nucleotides, for example 7-deaza - adenosine, 6-azo リジン、6−アゾシチジン、6−アゾチミジン、5−メチル−2−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば2−チオウリジンおよび4−チオウリジン、および2−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のO−およびN−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばN6−メチルアデノシン、5−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン5−オキシ酢酸、ピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えばアミノフェノールもしくは2,4,6−トリメトキシベンゼン、G−クランプ・ヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、8−置換アデニン、およびグアニン、5−置換ウラシルおよびチアミン、アザピリミジ Lysine, 6-Azoshichijin, 6- Azochimijin, 5-methyl-2-thiouridine, other thio bases such as 2-thiouridine and 4-thiouridine, and 2-thiocytidine, dihydrouridine, Puso Lee Dourijin, queosine, alk eosin, naphthyl and substituted naphthyl groups, any O- and N- alkylated purines and pyrimidines, for example N6- methyl adenosine, 5-methylcarbonyl-methyl uridine, uridine 5-oxyacetic acid, pyridine-4-one, pyridin-2-one, phenyl and modified phenyl groups such as aminophenol or 2,4,6-trimethoxy benzene, modified cytosines that act as G- clamp nucleotides, 8-substituted adenines and guanines, 5-substituted uracils and thiamine, Azapirimiji 、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシルアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。 , Carboxyalkyl hydroxyalkyl nucleotides, carboxyl alkyl nucleotides, and alkyl carbonyl A Ruki Le nucleotides. 修飾ヌクレオチドもまた、糖部分に関して修飾されたヌクレオチドと、さらにリボシルではない糖または類似体を持つヌクレオチドとが挙げられる。 Modified nucleotides also a nucleotide that is modified with respect to the sugar moiety include the nucleotides having sugars or analogs are not yet ribosyl. 例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、4'−チオリボース、ならびに他の糖、ヘテロ環、または炭素環が挙げられる。 For example, sugar moieties, mannose, arabinose, glucopyranose, galactopyranose, 4'Chioribosu, and other sugars, heterocycles, or include carbon ring. ヌクレオチドという用語もまた、広範な塩基として当業者に知られているものを含むことが意図されている。 The term nucleotides are also intended to include what is known as a wide range of bases to those skilled in the art. 実施例として、一例として、広範な塩基として、限定されるものではないが、3−ニトロピロール 、5−ニトロインドール、またはネブラリンが挙げられる。 As an example, as an example, as a wide range of bases, but are not limited to, 3-Nitoropi roll, 5-nitroindole or nebularine the like.

さらに、ヌクレオチドという用語はまた、ヌクレオチドに付着した検出可能な標識(例えば放射活性部分または蛍光部分)または質量標識を有する種を含む。 Further, the term nucleotide also includes species having a detectable label (e.g. a radioactive moiety or a fluorescent moiety) or mass label attached to the nucleotide.

(ヌクレオチド単位) (Nucleotide units)
フレーズ「ヌクレオチド単位(nucleotide unit)」とは、単一のヌクレオチド残基のことをいい、修飾または未修飾窒素塩基、修飾もしくは未修飾の糖、 および2つのヌクレオチドまたはさらなる連結を除外するコンジュゲートの連結を可能にする修飾もしくは未修飾の部分とから構成される。 Phrase "nucleotide unit (nucleotide Unit)" refers to a single nucleotide residue, a modified or unmodified nitrogenous base, a modified or unmodified sugar, and two nucleotide or exclude conjugate further connected It constituted from minute parts of the modified or unmodified enabling ligation.

(オフ・ターゲット) (Off-target)
用語「オフ・ターゲット(off−target)」およびフレーズ「オフ・ターゲット効果」とは、所定の標的に向けられたsiRNA または shRNAが、別のmRNA配列、DNA配列、または細胞タンパク質もしくは他の部分と直接あるいは間接的に相互作用することによって、意図されていない効果を生ずる、任意の事象をいう The term "off-target (off-target)" and the phrase "off-target effects" are, siRNA or shRNA directed to a predetermined target, another mRNA sequence, a DNA sequence or cellular protein or other moiety, by directly or indirectly interacting, produce an effect that is not intended, it refers to any event. 例えば、「オフ・ターゲット効果(off−target effect)」は、siRNA または shRNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖と他の転写産物との間の部分的相同性または相補性にって、他の転写産物の同時に起こる分解が存在する時に、生ずる可能性がある。 For example, "off-target effects (off-target effect)" is I by the partial homology or complementarity between the siRNA or shRNA sense and / or antisense strand and the other transcripts, other when the simultaneous degradation of the transcript is present, there can result.

(オルトエステル) (Ortho ester)
用語「オルトエステル保護(orthoester protected)」または「オルトエステル修飾(orthoester modified)」とは、オルトエステルによるヌクレオチド単位内の糖部分の修飾のことをいう。 The term "orthoester protecting (orthoester protected)" or "ortho ester modifications (orthoester modified)" refers to the modification of the sugar moiety in a nucleotide unit by ortho ester. 好ましくは、この糖部分がリボシル部分である。 Preferably, the sugar moiety is a ribosyl moiety. 一般に、R (OR') 構造を持ち、式中R'は同一または異なるもの、RはH、さらに下線が引かれたCはオルトエステルの中心炭素である。 In general, 'has three structure, wherein R R C (OR)' is the same or different, R represents H, the further C underlined is a central carbon of the orthoester. 本発明のオルトエステルは、ヌクレオチド単位の糖部分の炭素が酸素に結合し、次にオルトエステルの中心炭素に結合しているオルトエステルから構成される。 Ortho esters of the present invention, carbon attached to the oxygen of the sugar moiety of the nucleotide unit, then consists orthoester bonded to the central carbon of the orthoester. オルトエステルの中心炭素に対して次に結合するものは、2つの酸素原子であり、合計3つの酸素がそのオルトエステルの中心炭素に結合することになる。 Which then binds to the central carbon of the orthoester is two oxygen atoms, so that the total of three oxygen is bound to the central carbon of the orthoester. 中心炭素に結合したこれら2つの酸素(いずれも糖部分の炭素には結合しない)は、次に同一または異なる2つの部分を構成する炭素に結合する。 These two oxygen bonded to the central carbon (both not bind to the carbon of the sugar moiety) is then bonded to the carbon constituting the same or different two parts. 例えば、上記酸素の一方はエチル部分に結合することができ、また他方はイソプロピル部分に結合することができる。 For example, one of the oxygen may be coupled to the ethyl moiety, and the other is capable of binding to the isopropyl moiety. 一例では、RをH、1つのR'をリボシル部分とすることができ、他の2つのR'を2つの2−エチル−ヒドロキシル部分とすることができる。 In one example, R a H, 1 single R 'a can be a ribosyl moiety, and the other two R' two 2-ethyl - may be a hydroxyl moiety. オルトエステルを糖部分の任意の位置に置くことができ、例えば、2'、3'、および/または5'位に置くことができる。 The orthoester can be placed at any position on the sugar moiety, e.g., 2 ', 3', and / or can be placed at a site 5 '. 好ましいオルトエステル、さらにオルトエステル保護ポリヌクレオチドの製造方法については、米国特許第5,889,136号および第6,008,400号に記載されている。 Preferred orthoesters, for further manufacturing method of orthoester protected polynucleotides, are described in U.S. Pat. No. 5,889,136 and No. 6,008,400.

(オーバーハング) (Overhang)
用語「オーバーハング(overhang)」とは、第1の鎖または領域が二本鎖を形成する相補性鎖の末端を越えて延びる1本の鎖または領域から生ずる、末端の塩基対を形成していない1つまたは複数のヌクレオチドのことをいう。 The term "overhang (overhang)" arises from one strand or region that extends beyond the end of the complementary strand of the first strand or region forms a double strand, to form a base pair terminal It refers to one or more nucleotides not. 塩基対の結合を介して二本鎖を形成することができる2つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域の一方または両方が、2つのポリヌクレオチドまたは領域によって共有された相補性の5'および/または3'末端を越える3'および/または5'末端を有することが可能である。 One or both of the two polynucleotide or polynucleotide region via a hydrogen bond base pairing can form a duplex, 5 of the complementarity shared by the two polynucleotides or region 'and / or 3 it is possible to have and / or 5 'end 3' exceeds' end. 二本鎖の3'および/または5'末端を越えて延びる一本鎖領域を、オーバーハングという。 The single-stranded region extending beyond the 3 'and / or 5' end of the duplex, as overhangs.

(医薬的に許容される担体) (Pharmaceutically acceptable carrier)
フレーズ「医薬的に許容される担体(pharmaceutically acceptable carrier)」として、細胞へのdsRNA、dsDNA、またはdsRNA/DNAハイブリッドの導入を促進させる組成物が挙げられ、また限定されるものではないが、溶媒または分散剤、コーティング剤、抗感染剤、等張剤、および本発明のポリヌクレオチドおよびsiRNAの吸収時間もしく放出の媒介となる薬剤が挙げられる。 As a phrase "pharmaceutically acceptable carrier (pharmaceutically acceptable carrier)", dsRNA into a cell, dsDNA, or compositions that facilitate the introduction of dsRNA / DNA hybrids can be mentioned, also without limitation, solvent or dispersing agents, coating agents, anti-infective agents, isotonic agents, and absorption time of the polynucleotides and siRNA of the present invention also include agents to be mediated verses release.

(ポリヌクレオチド) (Polynucleotides)
用語「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」とは、ヌクレオチドのポリマーのことをいい、限定されるものではないが、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドが挙げられ、規則的および不規則的に交互になったデオキシリボシル部分およびリボシル部分からなるポリヌクレオチド鎖(すなわち、交互ヌクレオチド単位が、糖部分の2'位で、−OH、次に−H、次に−OH、つぎにH、等を持つ)と、種々の構成要素または部分が任意の位置でヌクレオチド単位に付着しているそのような種類のポリヌクレオチドの修飾とが含まれる。 The term "polynucleotide (Polynucleotide)" refers to a polymer of nucleotides, but are not limited to, DNA, RNA, include DNA / RNA hybrids, became regular and irregular alternating polynucleotide chain comprising deoxyribosyl moieties and ribosyl moieties (i.e., alternating nucleotides units, at the 2 'position of the sugar moiety, -OH, then -H, then -OH, then with H, etc.) and, various components or parts include modified and the kind of polynucleotide attached to the nucleotide units at any position. 特に明記しない限り、または文脈から明らかにならない限り、用語「ポリヌクレオチド」として、単分子siRNAと2本のことなる鎖から構成されるsiRNAとが挙げられる。 Unless otherwise stated, or unless apparent from the context, the term "polynucleotide" includes a configured siRNA monomolecular siRNA and chain composed that two.

(ポリリボヌクレオチド) (Poly-ribonucleotide)
用語「ポリリボヌクレオチド(polyribonucletotide)」とは、2つ以上の修飾または未修飾リボヌクレオチドおよび/あるいはそれらの類似体を含むポリヌクレオチドのことをいう。 The term "polyribonucleotides (polyribonucletotide)" refers to two or more modified or unmodified ribonucleotides and / or polynucleotides comprising such analogs.

(リボヌクレオチドおよびリボ核酸) (Ribonucleotide and ribonucleic acid)
用語「リボヌクレオチド(ribonucleotide)」およびフレーズ「リボ核酸(ribonucleic acid)」(RNA)は、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含む修飾または未修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。 The term "ribonucleotide (ribonucleotide)" and the phrase "ribonucleic acid (ribonucleic acid)" (RNA) refers to at least one modified or unmodified including ribonucleotide units or polynucleotide. リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の1位でのN−グリコシド連結に付着した窒素塩基を持つリボシル部分の '位、さらに別のヌクレオチドに対する連結を可能にするか、もしくは連結を妨げる部分の2'位に対して付着する酸素を含む。 Ribonucleotide units, one ribosyl moiety having a nitrogenous base attached to the N- glycosidic linkages at the 1-position of the ribosyl moiety 'position, further or not to allow the connection to another nucleotide, or second portion to prevent the coupling' It contains an oxygen attached against position.

(RNA干渉およびRNAi) (RNA interference and RNAi)
フレーズ「RNA干渉(RNA interference)」および用語「RNAi」は同義であり、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含むポリヌクレオチドまたはsiRNAが生物学的プロセスに対する効果を奏するプロセスのことをいう。 The phrase "RNA interference (RNA interference)" and the term "RNAi" are synonymous, polynucleotide or siRNA comprising at least one ribonucleotide unit refers to the process of the effect on the biological process. このプロセスは、限定されるものではないが、mRNAを分解し、翻訳を減衰させ、tRNA、rRNA、hnRNA、cDNA、およびゲノムDNAによる相互作用を生ずることによって、同様に付加的なタンパク質によってDNAのメチル化をおこなうことによっておこなわれる遺伝子サイレンシングを含む。 This process is not limited to decompose the mRNA, translated attenuate, tRNA, rRNA, hnRNA, cDNA, and by causing interaction by genomic DNA, the DNA by similarly additional protein including gene silencing is effected by performing the methylation.

(第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド) (The second of the 5 'terminal antisense nucleotide)
フレーズ「第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド」とは、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの3'位に付着したヌクレオチドのことをいう。 Phrase 'The' terminal antisense nucleotide, first 5 second 5 '' directly next to the terminal antisense nucleotide and attached to the position 3 'terminal antisense nucleotide' first 5 nucleotides It refers to. したがって、それは、対応のセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のアンチセンス鎖または領域の最も5'末端側にある第2のヌクレオチドである。 Therefore, it is the second nucleotide at the most 5 'end of the antisense strand or region within the set of nucleotides corresponding sense nucleotide is present.

(第2の5'末端センス・ヌクレオチド) (The second of the 5 'terminal sense nucleotide)
フレーズ「第2の5'末端センス・ヌクレオチド」とは、第1の5'末端センス・ヌクレオチドに直接隣接し、かつ第1の5'末端センス・ヌクレオチドの3'位に付着したヌクレオチドのことをいう。 Phrase 'The "terminal sense nucleotide, first 5 second 5' 'to a nucleotide immediately adjacent to the terminal sense nucleotide and attached to the position 3' terminal sense nucleotide 'first 5 Say. したがって、それは、対応のアンチセンス・ヌクレオチドが存在する一組のヌクレオチド内のセンス鎖または領域の最も5'末端側にある第2のヌクレオチドである。 Therefore, it is the second nucleotide at the most 5 'end of the sense strand or region within the set of nucleotides present corresponding antisense nucleotides.

(センス鎖) (Sense strand)
フレーズ「センス鎖(sense strand)」とは、伝令RNAまたはDNA配列等の標的核酸として、部分的または全体的に、同一のヌクレオチド配列の持つポリヌクレオチドまたは領域のことをいう。 Phrase "sense strand (sense strand)" as the target nucleic acids such as messenger RNA or DNA sequences, in part or in whole, refers to a polynucleotide or region having the same nucleotide sequence. フレーズ「センス鎖」として、2本の異なる鎖から形成されるポリヌクレオチドの両方のセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子siRNAのセンス領域とが挙げられる。 As a phrase "sense strand", and both sense region of polynucleotide formed from the two different chains, it includes a sense region of unimolecular siRNA capable of forming a hairpin structure. 配列が提供される場合、慣例によって、特に明記しない限り、それはセンス鎖(または領域)であり、相補性アンチセンス鎖(または領域)の存在が暗に含まれる。 If the array is provided, by convention, unless otherwise indicated, it is the sense strand (or region), the presence of the complementary antisense strand (or region) is implicit. フレーズ「センス鎖(sense strand)」および「センス領域(sense region)」は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。 The phrase "sense strand (sense strand)" and "sense region (sense region)" are intended to be equivalent, they are interchangeably used.

(siRNA、すなわち短い干渉RNA) (SiRNA, ie short interfering RNA)
用語「siRNA」およびフレーズ「短い干渉RNA(short interfering RNA)」とは、単分子の核酸のことをいい、またRNAiを実行することが可能であり、かつ18と30との間の塩基対長である二本鎖を持つ2本の異なる鎖から構成される核酸のことをいう。 The term "siRNA" and the phrase "short interfering RNA (short interfering RNA)" refers to a single molecule of nucleic acid, also it is possible to perform RNAi, and base pairs in length between 18 and 30 It refers to a nucleic acid composed of two separate strands with double stranded is. また、用語「siRNA」およびフレーズ「短い干渉RNA」として、リボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が挙げられ、該部分として、限定されるものでないが、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド連結、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、および上記ヌクレオチドの類似体が挙げられる。 Further, the term "siRNA" and the phrase "short interfering RNA" includes a nucleic acid including a portion other than ribonucleotide moieties, as partial, but are not limited to, modified nucleotides, modified internucleotide linkages, non-nucleotides, deoxynucleotides nucleotides, and analogs of the nucleotides and the like.

siRNAを二本鎖とすることができ、また短いヘアピンRNA、4〜23以上のヌクレオチドほどの長さのループを持つRNA、ステムループ状の突出持つRNA、ミクロRNA、および短い一過性のRNAが挙げられる。 siRNA to be a double-stranded, and short hairpin RNA, RNA having a loop length of about 4 to 23 or more nucleotides, the stem-loop-like projection with RNA, micro RNA, and a short transient RNA and the like. ループまたはヘアピン・ループを持つRNAとして、該ループがフレキシブル・リンカー等のリンカーによって幹部分(ステム)に結合している構造が挙げられる。 As RNA with loops or hairpin loops, the loop can be mentioned a structure attached to the stem portions (stems) by a linker such as a flexible linker. フレキシブル・リンカーは、多種多様な化学構造から構成せれ、かつステム構成要素の効果的な分子間ハイブリダイゼーションを可能にする十分な長さと材料とからなる。 Flexible linkers, ask composed from a wide variety of chemical structures, and composed of a sufficient length and materials which permit hybridization between effective molecules stem component. 概して、スパンの長さは、少なくとも 10〜24原子である。 Generally, the length of the span is at least about 10-24 atoms.

siRNAがヘアピンである場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、1つの長い分子の一部分である。 If siRNA is a hairpin, the sense and antisense strands, are part of one long molecule.

(安定化) (Stabilization)
用語「安定化(stabilized)」とは、dsRNAが分解に抗する一方で機能性を保つ該dsRNAの能力のことをいい、その能力は、例えば血清等の生物学的材料の存在下で、半減期として測定される。 The term "stabilized (Stabilized)" refers to the ability of the dsRNA to maintain functionality while the dsRNA against degradation, their ability, for example in the presence of biological materials such as serum, half It is measured as the period. siRNAの半減期とは、例えば血清中で、siRNAが50%分解するのにかかった時間のことをいう。 The half-life of the siRNA, for example, serum, siRNA refers to a time taken to degrade to 50%.

(実質的な相補性) (Substantial complementarity)
実質的相補性(substantial complementarity)とは、90%以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖のことをいう。 Substantial complementarity (substantial complementarity), refers to a polynucleotide chains exhibiting 90% or higher complementarity.

(トラックアビリティ) (Track ability)
用語「トラックアビリティ」とは、分子が細胞に導入される等の後に、該分子の移動または配置を追跡する能力のことをいう。 The term "track A Birite I", after such a molecule is introduced into a cell, it refers to the ability to track the movement or placement of the molecule. 「トラッカブル(trackable)」である分子は、細胞形質移入手順等の成功および失敗を観察する上で有用である。 Molecule is a "Torakkaburu (trackable)" is useful in observing the success and failure of the cell transfection procedures like.

(好ましい実施形態) (Preferred embodiment)
ここで、好ましい実施形態に関連して本発明を説明する。 Here, in connection with the preferred embodiment illustrating the present invention. これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために提供されており、いかなるかたちであれ、本発明を限定することを意図したものではなく、またそのような意図があると解釈すべきものではない。 These embodiments are provided to aid the understanding of the present invention, any any form, and not intended to limit the present invention, also is not to be construed as such intended . この開示を読むことによって当業者が理解しうる代替物、修飾、および等価物の全てが本発明の精神および範囲内である。 Alternatives by those skilled in the art can be understood by a reading of this disclosure, modifications, and all equivalents are within the spirit and scope of the invention.

第1の実施形態によれば、本発明はsiRNAを提供する。 According to the first embodiment, the present invention provides a siRNA. このsiRNAは、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドを含むセンス鎖と、少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチド単位を含むアンチセンス鎖とを含む。 The siRNA comprises a sense strand comprising a polynucleotide comprised of at least one orthoester modified nucleotide, an antisense strand comprising at least one 2 'modified nucleotide unit. 好ましくは、修飾ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはその類似体である。 Preferably, the modified nucleotides are ribonucleotides or analogs thereof. オルトエステルを、糖部分の任意の位置、例えば2'、3'、および/または5'位に、置くことができる。 Orthoester, any position on the sugar moiety, for example 2 ', 3', and / or 5 'position, can be placed. 好ましくは、オルトエステル部分は、糖部分の2'位にある。 Preferably, the ortho ester moiety is in the 2 'position of the sugar moiety. 好ましくは、オルトエステル、およびポリヌクレオチドで保護されたオルトエステルの製造方法は、米国特許第5,889,136号および第6,008,400号に記載されている。 Preferably, the production method of the orthoester and protected orthoester polynucleotide, are described in U.S. Pat. Nos. 5,889,136 and No. 6,008,400. また、好ましくは、オルトエステルは、リボシル部分の2'位に付着している。 Also, preferably, the ortho ester is attached to the 2 'position of a ribosyl moiety. 好ましくは、オルトエステルは、2つの2−エチル−ヒドロキシル置換基を含む。 Preferably, orthoester, two 2-ethyl - containing hydroxyl substituents. 最も好ましいオルトエステルを以下に示、また本明細書では、2'−ACEまたは2'−ビス(ヒドロキシエチル)オルトエステル部分と呼ぶ。 The most preferred ortho ester shown below, also herein referred to as 2'-ACE or 2'-bis (hydroxyethyl) orthoester moiety. すなわち、 That is,

センス鎖上のオルトエステル基を含む利点は、図1A、1B、2A、および2Cを参照することによってわかる。 Advantages including orthoester groups on the sense strand, can be seen by referring to FIG. 1A, 1B, 2A, and 2C.

図1に示すデータの生成は、いくつかの変異体でDharmacon Inc. Generation of data shown in FIG. 1, Dharmacon Inc. in several variants の登録商標ACEケミストリーを用いることで合成したsiRNA二本鎖標的SEAP(ヒト分泌アルカリ・ホスファターゼ)を用いて、おこなった。 Using synthesized siRNA duplexes targeting SEAP by using a registered trademark ACE chemistry (human secreted alkaline phosphatase) was carried out. これらの変異体として、裸、または未修飾のRNA、すなわち各の2'−OHがオルトエステルによる修飾を受けているACE保護RNAと、フッ素が各2 '炭素および各CおよびUに結合している2'フルオロ修飾変異体とが挙げられる。 As these mutants, naked or unmodified RNA,, i.e. the ACE protected RNA of 2'-OH of each is qualified with the orthoester, fluorine bonded to each 2 'carbon and the C and U include a 2 'fluoro modified variant there are.

siRNAの二鎖を、センス鎖とアンチセンス鎖とから構成することができる。 duplexes of siRNA, and thus can be composed of a sense strand and an antisense strand. センスおよびアンチセンス鎖の全ての可能な組み合わせからなるアレイが生成された。 Array of all the possible combinations of sense and antisense strand was generated. 図1を参照すると、以下の用語が用いられる。 Referring to FIG. 1, the following terms are used.

S − siRNA二本鎖内の裸センス鎖。 S - naked sense strand of the double within the chain siRNA.

AS − siRNA二本鎖内の裸アンチセンス鎖。 AS - naked antisense strand of the double-within the chain siRNA.

pS − siRNA二本鎖内の2'ACE保護センス鎖。 pS - 2'ACE protection sense strand of the double within the chain siRNA.

pAS − siRNA二本鎖内の2'ACE保護アンチセンス鎖。 pAS - 2'ACE protection antisense strand of the double-within the chain siRNA.

2FS − フッ素原子が各Cおよび/またはU保持ヌクレオチド単位の2'炭素に結合するようにして、全てのCおよびUを持つsiRNA内のセンス鎖。 2FS - fluorine atoms so as to bind the 2 'carbon of the C and / or U holding nucleotide unit, the sense strand of the siRNA with all C and U.

2FAS − フッ素原子が2'炭素、または各Cおよび/またはU保持ヌクレオチド単位に結合するようにして、全てのCおよびUを持つsiRNA内のアンチセンス鎖。 2FAS - fluorine atom 2 'so as to bond to the carbon or the C and / or U holding nucleotide unit, the antisense strand of the siRNA with all C and U.

S−ASとは、裸センス鎖および裸アンチセンス鎖から形成された二本鎖siRNAのことをいう。 The S-AS, refers to duplex siRNA formed from naked sense strand and naked antisense strand.

pS−ASとは、ACE修飾センス鎖および裸アンチセンス鎖から形成された二本鎖siRNAのことをいう。 The pS-AS, refers to duplex siRNA formed from ACE modified sense strand and naked antisense strand.

P2'F− 2'修飾を有する、 CsおよびUsを除く全てのヌクレオチドの2'− ACE修飾。 P2'F- 2 'has a modified, 2'ACE modification of all nucleotides except Cs and Us.

pAAV6プラスミド(SEAP発現プラスミド)と目的のsiRNAとによって、二本鎖を同時形質移入し、あるいは安定にSEAPを発現するHEK293細胞中にsiRNAを形質移入した。 pAAV6 plasmid (SEAP expression plasmid) by the purpose of the siRNA, co-transfected with double-stranded, or a siRNA were transfected into HEK293 cells expressing SEAP stable. 両方の条件下で、標準的な形質移入用の手順を用いたが、結果はHela、MDA75、または3TELi(マウス)細胞系のあいだで変化はなかった。 Under both conditions, although using standard procedures for transfection, results Hela, MDA75, or 3TELi (mouse) did not vary between cell lines.

siRNA誘導SEAPサイレンシングのレベルは、製造元のプロトコルに従ってClontechのSEAP検出キットを用いて、形質移入後の異なる時点(24、48、72、または144時間)で決定した。 Level of siRNA induced SEAP silencing, using SEAP detection kits Clontech according to the manufacturer's protocol, were determined at different time points after transfection (24, 48, 72 or 144 hours). タンパク質減少レベルは、mRNA減少レベルと良好な一致が見られる(mRNAのレベルは、QuantiGeneキット(Bayer)を用いて測定した)。 Protein reduction levels, mRNA decreased levels and good match is found (the level of mRNA was measured using the QuantiGene kit (Bayer)). siRNA誘導毒性は、AlmaBlue毒性アッセイあるいはハウスキーピング遺伝子(シクロリン)さもなければ両方の発現レベルを用いて測定した。 siRNA-induced toxicity was measured using a AlmaBlue cytotoxicity assay or a housekeeping gene (Shikurorin) otherwise both expression levels. 特に明記しない限り、著しい毒性は何ら観察されなかった。 Unless stated otherwise, significant toxicity was not any observed.

1〜100ナノモル濃度のあいだ(図1)、および10ピコモル濃度 〜1マイクロモル濃度 (図2)のあいだで濃度を変えて、細胞に各の二本鎖を形質移入した(図1)。 During 1-100 nanomolar concentrations (Fig. 1), and 10 picomolar to 1 micromolar concentrations by changing the concentration between the (Figure 2), each of the duplex was transfected into cells (Fig. 1). 図1および図2では、裸および2'フルオロ修飾と組み合わせて、siRNA二本鎖のセンスおよびアンチセンス鎖に対するACE修飾の導入の効果が示されている。 1 and 2, in combination with a naked and 2 'fluoro modified, is shown the effect of the introduction of the ACE modifications on the sense and antisense strand of the siRNA duplex.

オリゴのアンチセンス鎖に対するACE修飾の存在がsiRNA二本鎖の機能性と著しく干渉する。 Significantly interfering presence of ACE modifications on the antisense strand oligos and functionality of the siRNA duplex. ACE修飾センス・オリゴは、裸または2'F修飾ASオリゴと一緒に使用されているかどうかに関わらず SEAPサイレンシングで影響を及ぼした。 ACE modified sense oligos, affected by SEAP silencing irrespective of whether they are used with bare or 2'F modified AS oligos.

サイレンシングの程度を24、48、または72時間で比較し、siRNAサイレンシングでの検出可能な減少を144時間後に観察した。 Comparing the degree of silencing 24, 48 or 72 hours, the, was observed detectable decrease in siRNA silencing after 144 hours.

図3および図4は、AS(図3)およびセンス(図4)鎖を一定に保ち、反対側の鎖に対する種々の修飾を組み合わせてスクリーニングしたsi RNA機能性スクリーニングをまとめたものである。 3 and 4, keep AS (Figure 3) and the sense (Fig. 4) chain constant summarizes the si RNA functional screening were screened by combining various modifications to opposite strands. 特に、AS鎖を、(1)裸に、(2) 全ての CおよびUで2'F基によって修飾、(3)2、4、6、14、および18位(5'側から数える)で2'デオキシ基により修飾、(4)67〜10位(鎖の5'側から計算)に位置したものを除く、UおよびCsの全てでの2'−O−メチル基による修飾、(5)全ての位置でのホスホロチオエートによる修飾、あるいは(6)1〜6位および14〜19位(鎖の5'側から計算)でのホスホロチオエートによる修飾のいずれかをおこなった。 In particular, the AS strand, (1) naked, (2) modified with 2'F groups in all C and U, (counting from the 5 'side) (3) 2,4,6,14, and 18 2 'modified by deoxy group, (4) 67-10 position (5 strands' except those located calculated from side), modified by 2'-O- methyl group at every U and Cs, (5) modification by phosphorothioates at all positions, or (6) was carried out either phosphorothioate by modification of the 1 to 6-position and 14-19 position (calculated from the 5 'side of the chain). これらのAS鎖に対して、(1)裸、(2)全ての位置で2'−ACE修飾、(3)全てのC およびU での2'F修飾、(4)全てのU で修飾された2'アミン(NH )、(5)全ての奇数のヌクレオチド(例えば、1、3、5、...)に対する2'−デオキシ修飾、(6)全てのCおよびUでの2'−O−メチル修飾、あるいは(7)全ての位置でホスホロチエートを担持するセンス鎖との対形成をおこなった。 For these AS chain, (1) naked, (2) 2'-ACE modified at all positions, (3) 2'F modified at all C s and U s, (4) All U s in modified 2 'amine (NH 2), (5) all odd nucleotides (e.g., 1,3,5, ...) 2'-deoxy modifications to, (6) at all C and U 2'-O- methyl modification, or (7) was carried out pairing with the sense strand carrying the Hosuhorochieto in all positions. これらの実験の結果は、アンチセンス鎖の記述された2'−O−メチル修飾が耐容性を示さない一方で、ホスホロチオエート、2'F、および2'デオキシ修飾を含む他の修飾が、種々のセンス鎖修飾と組み合わさって、この鎖上で可能であることを示している。 The results of these experiments, while the described 2'-O- methyl modification of the antisense strand does not exhibit tolerated, phosphorothioates, 2'F, and 2 'are other modifications, including deoxy modification, various in combination with the sense strand modifications, it indicates that it is possible on this chain. 同様に、図4では、アミン修飾が一般にセンス鎖に対して耐容性を示さない一方で、2'−ACE、2'F、2'デオキシ、2'−O−メチル、およびホスホロチオエート付加が、種々のAS鎖修飾と組み合わさって、重大な機能性の混乱を招くことなく、可能であることが示されている。 Similarly, in FIG. 4, while the amine-modified is not generally exhibit tolerated to the sense strand, 2'-ACE, 2'F, 2 'deoxy, 2'-O-methyl, and phosphorothioate addition, various the combination with aS chain modifications, and without causing significant functionality of the confusion, it is possible shown.

図5、6、7,および8は、使用した修飾の種類に応じてグループ分けしたより詳細なデータを表す。 Figure 5, 6, 7, and 8 represents a more detailed data were grouped according to the type of modification used. 図5では、裸、2'O−ACE修飾、または2'F修飾センス鎖が、2'F−8T AS = 鎖の各端にある4つのホスホロチオエート、各端の第2のヌクレオチドから開始、それに加えてCおよびUにF基;8T AS = 鎖の各端にある4つのホスホロチオエート、各端の第2のヌクレオチドから開始;4T−AS = 各端の第2のヌクレオチドから開始して鎖の各端上に2つのホスホロチオエートのいずれかと、対を形成した。 In Figure 5, naked, 2'O-ACE modified or 2'F modified sense strand, four phosphorothioates on each end of the 2'F-8T AS = chain, starting from the second nucleotide of each end, it in addition to the C and U F group; each strand starting from the second nucleotide of 4T-AS = each end; four phosphorothioates on each end of the 8T AS = chain, starting from the second nucleotide of each end and one of the two phosphorothioate on the end to form a pair. 図6では、 偶数位置、または12位(AS−Thio12、鎖のいずれかの端部上にある6つのホスホロチオエート)でのホスホロチオエート修飾を含むアンチセンス鎖を、裸にした、全ての位置で2'−ACE修飾した、または全ての位置でホスホロチオエート修飾した相補的センス鎖と対を形成した。 6, even positions, or 12 positions an antisense strand comprising a phosphorothioate modification at (AS-Thio12, 6 one phosphorothioate located on either end of the chain), and naked, 2 at every position ' and -ACE modified, or to form any complementary sense strand pairs phosphorothioate modifications at position. あるいは、全ての位置でホスホロチオエートを持つセンス鎖を、裸にした、全てのCおよびUで2'F基を持つ、全ての位置でホスホロチオエートを持つ、あるいは12ホスホロチオエートを持つ(各末端での6つのヌクレオチドの修飾)アンチセンス鎖と対を形成した。 Alternatively, the sense strand with phosphorothioate at all positions were naked, with 2'F groups in all C and U, with phosphorothioate at all positions, or with 12 phosphorothioate (six in each end to form a nucleotide of modification) the antisense strand and pairs. 図7について、2'−Ome = ヌクレオチド7〜11位のあいだに生ずるものを除いた全てのUおよびC上の2'−O−メチル修飾と、S−Ome = センスのCおよびU上の2'−O−メチル修飾とを担持するアンチセンス鎖は、裸の、S−2'ACE = 全てのヌクレオチド上の2'ACE修飾;S−デオキシ・ハイブリッド = 上記鎖をまたがる全ての奇数ヌクレオチド(1,3,5...)上の2'デオキシ修飾;S−Ome = センス鎖の全てのCおよびUの2'−O−メチル修飾;AS−2'F = 上記鎖上の全てのCおよびUの2'F修飾;AS−デオキシ・ハイブリッド = ヌクレオチド2、4、6、14、16、18の2'デオキシ修飾;あるいはAs−Ome = ヌクレオチド7〜11位のあいだに生ずるものを除く全てのUおよびCの For Figure 7, 2'-Ome = nucleotides 7-11 of the 2'-O- methyl modifications on all U and C except those that occur during the, S-Ome = 2 on the sense of C and U '-O- antisense strand carrying a methyl modification, naked, S-2'ACE = all 2'ACE modifications on nucleotides; S- deoxy hybrid = all odd nucleotides across the chain (1 , 3,5 ...) 2 'deoxy modification on; S-Ome = 2'-O- methyl modification of all C and U of the sense strand; AS-2'F = all C and on the strand 2'F modification of U; aS-deoxy-hybrid = nucleotide 2,4,6,14,16,18 2 'deoxy modification; or all except those that occur between the as-Ome = nucleotides 7-11 of of U and C '−O−メチル修飾のいずれかと一致した。 'Matches one of -O- methyl modification. 図8に関して、デオキシ修飾を担持するAS鎖(AS−デオキシハイブリッド=ヌクレオチド2、4、6、14、16、18の2'デオキシ修飾)をセンス鎖と組み合わせた。 With respect to Figure 8, in combination with the sense strand AS strand (2 'deoxy modification of AS- deoxyribohybrid = nucleotides 2,4,6,14,16,18) carrying a deoxy modification. ここでセンス鎖は、裸の、S−2'ACE修飾 = 全てのヌクレオチド上の2'ACE修飾;S−Ome = 全てのUおよびCでの2'O−メチル修飾;または2'デオキシ(1位、3位、5位、...その他)であった。 Here sense strand, naked, S-2'ACE modification = all 2'ACE modifications on nucleotides; S-Ome = at all U and C 2 'O-methyl modifications; or 2' deoxy (1 place, 3, 5, was ... other). 同様に、センス−2'デオキシ・ハイブリッド(1位、3位、5位、...その他)を、裸の、2'F修飾(CおよびU)、2'−O−メチル(7位〜11位のあいだにあるものを除いたUおよびC)、ならびに2'デオキシ(2位、3位、6位、14位、16位、18位)であるアンチセンス鎖と対を形成した。 Similarly, the sense-2 'deoxy-hybrid (position 1, 3, 5, ... etc.), naked, 2'F modified (C and U), 2'-O-methyl (position 7 ~ U and C) except what is between the 11-position, and 2 'deoxy (2-, 3-, 6, 14, 16, to form a 18-position) antisense strand paired is.

特に、図5は、裸の2'ACE修飾および2'F修飾センス鎖との組み合わせでアンチセンス鎖に置かれた場合、ホスホロチオエート修飾が十分に許容される。 In particular, FIG. 5, when placed in the antisense strand in combination with naked 2'ACE modifications and 2'F modified sense strand, phosphorothioate modifications are well tolerated.

図6は、ホスホロチオエート主鎖修飾が非特異的に誘導された毒性について同様の制限を持つセンスおよびアンチセンス鎖上の両方で許容されることを、さらに示す。 6, that the phosphorothioate backbone modification is allowed in both the sense and antisense strand having the same limitations for non-induced toxicity is further illustrated.

図7は、2'−O−メチル修飾の存在がsiRNA二本鎖のセンス上で十分に許容されるが、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖では許容されないことを示している。 7, the presence of 2'-O- methyl modification are well tolerated on the sense of the siRNA duplex, the antisense strand of the siRNA duplex indicates that unacceptable. 機能的siRNA二本鎖が2'−O−メチル修飾AS鎖とセンス鎖のデオキシハイブリッドとの組み合わせによって形成されることについて述べる価値がある。 Functional siRNA duplex is worth describing that formed by the combination of the deoxyribohybrid of 2'-O- methyl modified AS strand and the sense strand.

図8は、RNA干渉でのデオキシハイブリッド型の修飾の適合性を示す。 Figure 8 shows the suitability of the deoxy hybrid modifications at the RNA interference. デオキシリボハイブリッドは、RNA/DNAハイブリッド・オリゴであり、デオキシおよびリボ構成要素が共に、例えばデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとが交互になった配列中のオリゴに取り込まれる。 Deoxyribonucleotides hybrid is a RNA / DNA hybrid oligonucleotide, deoxy and ribo components together, for example a deoxyribonucleotide and ribonucleotide is incorporated into the oligo in sequence alternating. これらの種類のオリゴの設計で、連続したDNA/RNA二本鎖の広がりの大きさを5ヌクレオチドよりも短く保つことで、RNアーゼH活性の導入を避けることが重要である。 In these types of oligo design, to keep the size of the contiguous DNA / RNA duplexes spread shorter than 5 nucleotides, it is important to avoid the introduction of RN-ase H activity. デオキシリボハイブリッドは、2'フルオロおよび2'ACE修飾オリゴと組み合わせてセンスおよびアンチセンス鎖の両方で機能的であった。 Deoxyribonucleotides hybrids were functional 2 'in combination with fluoro and 2'ACE modified oligonucleotides in both the sense and antisense strand. また、デオキシハイブリッド・センス鎖は、アンチセンス鎖が2'−O−メチルで修飾された場合にsiRNA活性を支持する唯一の修飾(それらの条件下)であった。 Further, deoxyribohybrid-sense strand, the antisense strand was the only modification (those conditions) for supporting the siRNA activity when modified with 2'-O- methyl.

図9は、ACEおよび2'フルオロ修飾siRNAの効力を改善するためのコレステロールを含むコンジュゲートの有用性を示す。 Figure 9 demonstrates the utility of a conjugate comprising cholesterol to improve the efficacy of ACE and 2 'fluoro modified siRNA. 上記センス鎖上でコレステロールを含むコンジュゲートを用いることで、センス鎖に対する修飾による不の効果を軽減するが、アンチセンス鎖に対する修飾による負の効果を改善することはない。 Said By using a conjugate comprising cholesterol on the sense strand, but to reduce the non-effective due to modifications to the sense strand, it is not to improve the negative effects of modifications on the antisense strand.

図10は、センス鎖上のPEGコンジュゲートに関して等価なデータを示す。 Figure 10 shows the equivalent data on PEG conjugate on the sense strand.

図11は、コレステロールを含むコンジュゲートの存在が修飾siRNAオリゴの効力を改善することを示す。 Figure 11 shows that the presence of a conjugate comprising cholesterol to improve the efficacy of the modified siRNA oligos.

図12は、Dharmaconの2'−ACE RNA合成ケミストリーで使用される保護RNAヌクレオチドの構造を示す。 Figure 12 shows the structure of a protective RNA nucleotides used in 2'-ACE RNA synthesis chemistry Dharmacon.

図13は、RNA合成サイクルを概説する。 Figure 13 outlines an RNA synthesis cycle. 好ましくは、そのサイクルは、適当な合成装置上で自動化された様式でおこなわれる。 Preferably, the cycle is carried out in an automated fashion on a suitable synthesizer. ステップ(i)では、取り込まれるホスホラミダイト(ここでは、窒素塩基としてウリジンを持つ)は、示したメチル基のかわりに3'位のホスホラミダイト部分上に任意の許容可能な基を持つことができる。 In step (i), (here, with uridine as nitrogen base) phosphoramidite incorporated can have any acceptable group on the phosphoramidite portion of the 3 'position in place of the methyl group shown. 例えば、アルキル基またはシアノエチル基をその位置で用いることができる。 For example, it is possible to use an alkyl group or a cyanoethyl group at that position. このRNA合成サイクルを、修飾ヌクレオチド間連結を持つポリヌクレオチドを合成する場合、および/または他の修飾(例えば、2'位で)を持つポリヌクレオチドを合成する場合、ある種の変化によって、以下に説明するように、実施することができる。 The RNA synthesis cycle, when synthesizing polynucleotides having between modified nucleotides linked, and / or other modifications (e.g., at the 2 'position) when synthesizing polynucleotides having, by certain changes, the following as will be explained, it can be implemented.

図14は、2'脱保護直前の2'−ACE保護RNA産物の構造を示す。 14, 2 'show the structure of a 2'-ACE protected RNA products of the deprotection immediately before. 2'位にオルトエステルを保持することが必要な場合、この2'脱保護ステップが実施されない。 'If position to be necessary to retain the orthoester, the 2' 2 deprotection step is not carried out.

3'末端にジ−dTオーバーハングを持つ19量体二本鎖、すなわちセンス鎖の第2、第5、第7、第9、第11、および第19位で2'アミン修飾ヌクレオチド単位を持つG2'−N−UGA2'−N−UG2'−N−UA2'−N−UG2'−N−UCAGAGAG2'−NUdTdTについて、アンチセンス鎖が裸であるか、全てのCおよびUで2'フルオロ修飾されているか、交互にリボヌクレオチド単位とデオキシリボ単位とを含むデオキシハイブリッドであるか、または2'−O−メチル修飾を有するか否かに関わらず、機能性の著しい喪失が生じた 3 'end 19 mer duplex with di -dT overhang, i.e. the second sense strand, fifth, seventh, ninth, eleventh, and # 19 in the 2' with amine-modified nucleotide units for G2'-N-UGA2'-N- UG2'-N-UA2'-N-UG2'-N-UCAGAGAG2'-NUdTdT, or antisense strand is naked, 2 'fluoro modified in all C and U are either alternately or a deoxyribohybrid and a ribonucleotide units and deoxyribonucleic units, or regardless of whether they have 2'-O- methyl modification, a significant loss of functionality occurs. 好ましくは、センス鎖は、第2、第5、第7、第9、第11、および第19位で2'アミノ修飾を含まない。 Preferably, the sense strand, the second, fifth, seventh, ninth, eleventh, and 2 'does not include the amino-modified at the 19-position.

3' ジ−dTオーバーハングを持つsiRNA19量体(配列番号171〜314を見よ)上で、デオキシリボヌクレオチド単位による任意のリボヌクレオチド単位の置換は、修飾がセンスまたはアンチセンス鎖のいずれにあっても、RNAiにおける19量体の機能性に対して著しい影響を及ぼすことはない(図15A参照)。 3 '(see SEQ ID NO: 171-314) di -dT over siRNA19 mer with hang over, substitution of any ribonucleotide unit by deoxyribonucleotide units be in any modification of the sense or antisense strand , it does not affect significantly on the function of the 19-mer in RNAi (see FIG. 15A). 同一siRNA19量体上で、相前後した2つのデオキシリボヌクレオチド単位による2つの隣接リボヌクレオチド単位の置換はRNAi内での19量体の機能性に著しい影響を及ぼすものではない。 Identical siRNA19 mer on substitution of two adjacent ribonucleotide units with two deoxyribonucleotide units in tandem does not significantly affect the functionality of the 19-mer in RNAi. 図15Bは、1および2位、3および4位、5および6位等が個々にデオキシリボヌクレオチドに修飾される場合、該修飾がセンス鎖に生じると機能性が著しく影響を受けることはなく、そのような修飾がアンチセンス鎖上に生ずると機能性に対して僅かに負の影響が現れることを、示している。 15B is 1 and position 2, 3 and 4, if the 5 and 6 position, etc. are modified individually deoxyribonucleotide, never said modification is subjected to occur and functionality significantly affects the sense strand, the modified such that that the effect slightly negative with respect to the functionality occurring on the antisense strand appears shows. 同一のsiRNA19量体上では、相前後した3つのデオキシリボヌクレオチド単位による3つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、その修飾がアンチセンス上でのものであれば機能性に著しい影響を及ぼすものではないが、修飾された単位がセンス鎖の第1から第3、または第7から第9ヌクレオチドである場合、機能的に著しい影響(場合によっては)を受ける。 The same siRNA19 mer on the replacement of three adjacent ribonucleotide units with three deoxyribonucleotide units in tandem, although the modification is not intended significantly affect the functionality if those on the antisense If the modified unit is ninth nucleotide from the first sense strand from the third or seventh, functionally significantly affected (in some cases). この実験では、ポリリボヌクレオチドの単位1〜3、4〜6、7〜9等を、個々にデオキシリボヌクレオチド単位によって置換した(図15C参照)。 In this experiment, the unit 1~3,4~6,7~9 like polyribonucleotide was replaced by individual deoxyribonucleotide units (see FIG. 15C).

3'ジ−dTオーバーハングを有する同一siRNA19量体ポリリボヌクレオチド上で、2'−O−メチル部分による任意の個々の単位の修飾は、修飾がセンスまたはアンチセンス鎖にあろうとなかろうと、RNAiでの19量体の機能性に対して著しい影響を与えることはない(図16A参照)。 3 'on the same siRNA19 mer polyribonucleotide having di -dT overhang, 2'-O-modifications of any individual unit by methyl moiety, the modification or Not I allo sense or antisense strand, RNAi without significantly impacting on the function of the 19-mer (see Figure 16A). 同一siRNA19量体を用いて、相前後する2つの2'−O−メチル修飾による2つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、アンチセンス鎖の第1および第2、または第13および第14の位置で、あるいはセンス鎖の第17および第18の位置で、修飾が起こらない限り、RNAiでの19量体の機能性に著しい影響を与えない(図16B参照)。 Using the same siRNA19 mer, demixing of two adjacent ribonucleotide units with two 2'-O- methyl modifications to the front and rear, the first and second antisense strand, or in the 13th and 14th position of the or at the location of the first 17 and second 18 of the sense strand, as long as the modifications do not occur, not significantly affect the functionality of the 19-mer in RNAi (see FIG. 16B). 以降の実験によって、アンチセンス鎖の第13位および第14位、さらにセンス鎖の第7位および第8位が決定的ではないことが確認された。 The subsequent experiments, # 13 and # 14 of the antisense strand, further it is not decisive # 7 and # 8 of the sense strand was confirmed. 最も顕著に、機能性の変化を補正する修飾が追加されない場合、機能性を維持するならばアンチセンス鎖の第1および第2位が2'−O−メチル修飾を持ってはならない。 Most notably, if modified to correct for changes in functionality is not added, if maintaining the functional first and second positions of the antisense strand should not have a 2'-O- methyl modification. 同一のsiRNA19量体を用いて、相前後する2'−O−メチル修飾を持つ3つの隣接リボヌクレオチド単位の置換は、第1位〜第3位以外の位置でその修飾がアンチセンス鎖上にある場合、機能性に対して著しい影響を及ぼさない(図16C参照)。 Identical with siRNA19 mer, replacement of three adjacent ribonucleotide units with 2'-O- methyl modifications to the front and rear phases, the first of - the modification on the antisense strand at the position other than the 3-position In some cases, it does not significantly affect on the function of (see FIG. 16C). この実験では、ポリリボヌクレオチドの1〜3位、4〜6位、7〜9位等を2'O−メチル部分により個々に修飾した。 In this experiment, 1-3 of polyribonucleotide, 4-6 position, were individually modified by the 7-9 position such 2'O- methyl moiety.

単一の2'−デオキシ部分または単一の2'−O−メチル部分のいずれかによる同一ポリリボヌクレオチドの修飾は、機能性に対して著しい影響を及ぼすことはない。 Modification of the same polyribonucleotide with either a single 2'-deoxy moiety or a single 2'-O- methyl moiety is never significant effect on functionality. タンデムになった2つ以上の2'−O−メチル部分によるアンチセンス鎖の1および2位、あるいは1、2、および3位の修飾によって、機能性を著しく減少させることができる。 2'-O- two or more became tandem methyl moiety by 1 and 2 of the antisense strand, or 1, 2 and the 3-position modifications, can be significantly reduced functionality. センス鎖上の7〜9位およびアンチセンス鎖上の13〜15は、タンデムになった2つ以上の2'−O−メチル修飾に対して感受性を持つ。 13-15 on 7-9-position and the antisense strand of the sense strand, with sensitivity to more than one 2'-O- methyl modification became tandem. したがって、好ましくはアンチセンス鎖は、二本鎖内の他の位置に競合する修飾が起こらない限り、第1および第2、第1、第2、および第3、第13および第14、ならびに第13、第14および第15位に2'−O−メチル修飾を含まない。 Thus, preferably the antisense strand, as long as the modifications do not occur to compete in other locations within a double-stranded, the first and second, first, second, and third, thirteenth and fourteenth, and the 13, does not include a 2'-O- methyl modifications to the 14 and # 15. 以降の実験は、アンチセンス鎖上の1および2位(または1および2、ならびに3位)の2'−O−メチル修飾は、二本鎖機能性の鍵である。 Subsequent experiments, 2'-O-methyl modification of positions 1 and 2 on the antisense strand (or 1 and 2 and 3-position) is the key to double-stranded functionality. センス鎖上の7〜9位ならびにアンチセンス鎖上の13〜15位はあまり重要ではない。 7-9 position on the sense strand, as well as 13 to 15-position on the antisense strand is not very important.

ヌクレオチドの全てが、選択されたヌクレオチドのみが修飾されるセンス鎖よりも、オルトエステル基で全てのヌクレオチドが修飾されるセンス鎖を合成するほうが、実用上の問題として無駄がない。 All nucleotides, than sense strand only nucleotides selected is modified, better to synthesize a sense strand all nucleotides are modified at the ortho ester group, no waste as a practical problem. しかし、理論的には、ある種のヌクレオチドのみが修飾される実用的手段がセンス鎖を合成するために開発されていることから、本発明ではこれらのポリヌクレオチドを用いることができた。 However, in theory, since the practical means of only certain nucleotides are modified has been developed to synthesize sense strand, the present invention could be used these polynucleotides.

好ましくは、2'修飾ヌクレオチドは、2'ハロゲン修飾ヌクレオチド、2'アミン修飾ヌクレオチド、2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2'アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される。 Preferably, 2 'modified nucleotide is a 2' halogen modified nucleotide, 2 is selected 'amine modified nucleotide, 2'-O-alkyl modified nucleotide, and 2' from the group consisting of alkyl modified nucleotide. 修飾がハロゲンである場合、そのハロゲンは好ましくはフッ素である。 If modification is a halogen, the halogen is preferably fluorine. 上記修飾がフッ素であると、好ましくは、シトシンまたはウラシル塩基部分を含む1つ以上のヌクレオチドにそれが付着する。 When the modification is a fluorine, preferably it is attached to one or more nucleotides comprising a cytosine or uracil base portion. 2'修飾ヌクレオチドが2'アミノ修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくは−NH である。 When 2 'modified nucleotide is 2' is an amino modified nucleotide, the amine is preferably -NH 2. この2'修飾ヌクレオチドが2'−O−アルキル修飾である場合、好ましくは上記修飾が2'−O−メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはイソブチル部分であり、最も好ましくは、2'−O−アルキル修飾が2'−O−メチル部分である。 If the 2 'modified nucleotide is a 2'-O- alkyl modification, preferably the modification is 2'-O- methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl or isobutyl moiety, and most preferably, 2' O- alkyl modification is a 2'-O- methyl moiety. 2'修飾ヌクレオチドが2'−アルキル修飾である場合、好ましくは修飾は2'メチル修飾であり、該メチル部分の炭素が直接、糖部分の2'炭素に付着する。 'If the modified nucleotides are 2'-alkyl modification, preferably the modified 2' 2 is methyl modification, the carbon of the methyl moiety is directly attached to the 2 'carbon of the sugar moiety.

図2Cは、siRNA効果が形質移入後144時間で次第に消え始めていくことを示している。 Figure 2C shows that siRNA effects will begun fade at 144 hours post transfection. 修飾されたオリゴの用量および効力は、裸siRNA二本鎖と同等であった。 Dose and efficacy of the modified oligos were comparable to the naked siRNA duplex.

第2の実施形態によれば、本発明はセンス鎖を含むsiRNAを提供する。 According to the second embodiment, the present invention provides an siRNA comprising a sense strand. ここで、このセンス領域は、第1の実施形態に基づいて提供される少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、第1の実施形態に基づいて提供される少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドと、コンジュゲートとを含む。 Wherein the sense region comprises at least one orthoester modified nucleotide is provided in accordance with the first embodiment, at least one 2 'modified nucleotide is provided in accordance with the first embodiment, the conjugate including the door. 好ましくは、上記修飾が2'メチル修飾であり、そのメチル部分の炭素が糖部分の2'炭素に直接付着している。 Preferably, 'methyl modification, carbon in the methyl part 2 of the sugar moiety' the modification 2 are attached directly to a carbon.

図2Cは、siRNA効果が形質移入後144時間で次第に消え始めていくことを示している。 Figure 2C shows that siRNA effects will begun fade at 144 hours post transfection. 修飾されたオリゴの用量および効力は、裸siRNA二本鎖と同等であった。 Dose and efficacy of the modified oligos were comparable to the naked siRNA duplex.

第2の実施形態によれば、本発明はセンス鎖を含むsiRNAを提供する。 According to the second embodiment, the present invention provides an siRNA comprising a sense strand. ここで、このセンス領域は、第1の実施形態に基づいて提供される少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、第1の実施形態にもとづいて提供される少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドと、コンジュゲートとを含む。 Wherein the sense region comprises at least one orthoester modified nucleotide is provided in accordance with the first embodiment, at least one 2 'modified nucleotide is provided based on the first embodiment, the conjugate including the door.

この実施形態内のコンジュゲートは、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。 Conjugates in this embodiment, preferably, amino acids, peptides, polypeptides, proteins, sugars, carbohydrates, lipids, polymers, nucleotides, polynucleotides, and are selected from the group consisting of. より好ましくは、コレステロール、ポリエチレングリコール、抗原、抗体、およびレセプター・リガンドからなる群から選択される。 More preferably, it is selected cholesterol, polyethylene glycol, antigens, antibodies, and from the group consisting of receptor ligands. よりいっそう好ましくは、コンジュゲートはコレステロールまたはポリエチレングリコールを含む。 Even more preferably, the conjugate comprises cholesterol or polyethylene glycol. もっとも好ましくは、コンジュゲートはコレステロールを含み、5'炭素位でセンス鎖の5'末端ヌクレオチド単位と連結する。 Most preferably, the conjugate comprises cholesterol, 5 connects the terminal nucleotide units '5 of the sense strand in' carbon position.

センス鎖の5'末端におけるコレステロール修飾コンジュゲートの導入は、裸または未修飾二本鎖に匹敵する、あるいはそれよりも優れたオルトエステル修飾および2'アンチセンス修飾siRNAに対する効力の増加をもたらした。 5 of the sense strand 'introduction of cholesterol-modified conjugate at the distal end is bare or comparable to unmodified duplexes, or superior orthoester modified and 2 than' resulted in increased efficacy against antisense modified siRNA. 図9および11を見よ。 See FIG. 9 and 11. センス鎖の5'末端でのコレステロール含有コンジュゲートの導入は、対応する裸二本鎖に匹敵する、あるいはそれよりも優れたオルトエステル修飾および2'フッ素修飾siRNAに対する機能的有効量の減少をもたらした。 5 of the sense strand 'introduction of cholesterol-containing conjugate at the end, the corresponding comparable to bare duplex, or orthoester modified and 2 superior to that' resulted in a decrease in functional effective amount for the fluorine modified siRNA It was.

図9は、ACEおよび2'フッ素修飾siRNAの効力を改善するためのコレステロールの有用性を示す。 Figure 9 illustrates the utility of the cholesterol to improve the efficacy of ACE and 2 'fluorine modified siRNA. 正のコレステロール効果が、 主にセンス塩化物上に導入された修飾によって観察された。 Positive cholesterol effect was observed mainly by modifications introduced on the sense chloride. 例えば、配列番号1〜16のセンス鎖の5'位にある5'末端に対してコレステロール部位が付着することで、形質移入作用因子の不在下でRNAiが生ずる(図18参照)。 For example, when cholesterol site adheres against 5 'end in' position of 5 of the sense strand of SEQ ID NO: 1 to 16, RNAi occurs in the absence of transfection agents (see FIG. 18).

第3の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチド、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成されるセンス鎖を持つsiRNAを提供する。 According to the third embodiment, the present invention provides an siRNA having at least one orthoester modified nucleotide, an antisense strand, and the sense strand consists of the conjugate. この実施形態では、上記第1の実施形態のオルトエステル修飾を、上記第2の実施形態のコンジュゲートと組み合わせて、用いてもよい。 In this embodiment, the orthoester modification of the first embodiment, in combination with the conjugate of the second embodiment may be used.

第4の実施形態によれば、本発明は、センス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートを有し、上記センス鎖および/またはアンチセンス鎖が少なくとも2'修飾ヌクレオチドを有するsiRNAを提供する。 According to the fourth embodiment, the present invention provides the sense strand, antisense strand, and has a conjugate, the sense strand and / or antisense strand provides siRNA having at least 2 'modified nucleotide. この実施形態の2'修飾ヌクレオチドは、上記第1の実施形態の2'修飾ヌクレオチドと同様のパラメーターに基づいて、好ましくは選択される。 2 of this embodiment 'modified nucleotide is 2 in the first embodiment' based on the same parameters and modified nucleotides are preferably selected. 同様に、上記コンジュゲートは、上記第2の実施形態でコンジュゲートが選択された同一のパラメータにもとづいて選択される。 Similarly, the conjugate is selected based on the same parameters conjugated is selected in the second embodiment.

第5の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドと、2'ハロゲン修飾ヌクレオチド、2'アミン修飾ヌクレオチド、2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2'アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドから構成されるアンチセンス鎖と、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるコンジュゲートとを有し、上記ポリヌクレオチドが18〜30のヌクレオチド塩基対を含むsiRNAを提供する。 According to the fifth embodiment, the present invention includes at least one orthoester modified nucleotide, 2 'halogen modified nucleotide, 2' amine modified nucleotide, 2'-O-alkyl modified nucleotide, and 2 'alkyl modified nucleotide and an antisense strand comprised of at least one 2 'modified nucleotide is selected from the group consisting, comprising amino acids, peptides, polypeptides, proteins, sugars, carbohydrates, lipids, polymers, nucleotides, polynucleotides, and combinations thereof and a conjugate selected from the group, the polynucleotide provides a siRNA comprising a nucleotide base pairs 18-30.

この実施形態のオルトエステルは、上記第1の実施形態のオルトエステルを選択するための基準に基づいて選択される。 Orthoester of this embodiment is selected based on the criteria for selecting the orthoester of the first embodiment. 上記2'修飾がハロゲンである場合、好ましくはハロゲンがフッ素であり、アンチセンス鎖の少なくとも1つはCおよび/またはU含有ヌクレオチド単位に付着する。 When the 2 'modification is a halogen, preferably a halogen is fluorine, at least one of the antisense strand is attached to C and / or U-containing nucleotide units. 上記2'修飾ヌクレオチドが2'アミノ修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくはNH である。 When the 2 'modified nucleotide is 2' is an amino modified nucleotide, the amine is preferably NH 2. 2'修飾ヌクレオチドが2'−O−アルキル修飾である場合、好ましくは2'−O−アルキル修飾が2'−O−メチル、エチル、プロピル、イソプロビル、ブチル、またはイソブチル部分であり、最も好ましくは2'−O−アルキル修飾が2'−O−メチル部分である。 When 2 'modified nucleotide is a 2'-O- alkyl modification, preferably 2'-O- methyl 2'-O- alkyl modification, ethyl, propyl, isopropyl buildings, butyl or isobutyl moiety, and most preferably is 2'-O- methyl moiety is 2'-O- alkyl modification. 2'修飾ヌクレオチドが2'アルキル修飾である場合、好ましくは、それは2'メチル修飾であり、そのメチル部分の炭素が直接、糖部分の2'炭素に付着している。 When 2 'modified nucleotide is 2' is alkyl modification, preferably it is 'methyl modification, carbon in the methyl moiety is directly 2 of the sugar moiety' 2 are attached to the carbon.

第6の実施形態によれば、本発明は以下の構造を含む組成物を包含する。 According to the sixth embodiment, the present invention encompasses a composition comprising the following structure.

式中、B およびB の各々が窒素含有塩基、複素環、または炭素環式化合物であり、XがO、S、C、およびNからなる群からなる群から選択され、WがOH、リン酸塩、リン酸エステル、リン酸ジエステル、ホスホトリエステル、修飾ヌクレオチド間連結、コンジュゲート、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、R1がオルトエステル、R2が2'−O−アルキル基、アルキル基、アミン、およびハロゲン、さらにYがヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。 Wherein, B 1 and each B 2 is a nitrogen-containing base, a heterocyclic or carbocyclic compound,, X is O, S, is selected from the group consisting of the group consisting of C, and N, W is OH, phosphate, phosphoric acid ester, phosphate diester, phosphotriester, modified internucleotide linkage is selected conjugated nucleotides, from the group consisting of polynucleotides, R1 is ortho ester, R2 is 2'-O- alkyl group , alkyl groups, amines, and halogen, furthermore Y is a nucleotide or polynucleotide. R2がハロゲンである場合、このハロゲンは好ましくはフッ素である。 When R2 is a halogen, the halogen is preferably fluorine. R2がフッ素である場合、フッ素は好ましくは1つ以上のCおよび/またはU含有ヌクレオチド単位に付着している。 When R2 is fluorine, fluorine is preferably attached to one or more of C and / or U-containing nucleotide units. R2がアミンである場合、このアミンは好ましくは−NH である。 If R2 is an amine, the amine is preferably -NH 2. R2が2'−O−アルキル修飾である場合、好ましくは、それは2'−O−メチル、エチル、プロピル、イソプロビル、ブチル、またはイソブチル部分であり、より好ましくは、2'−O−メチル部分である。 When R2 is a 2'-O- alkyl modification, preferably it is 2'-O- methyl, ethyl, propyl, isopropyl buildings, butyl or isobutyl moiety, and more preferably, 2'-O- methyl moiety it is. R2が2'アルキル修飾である場合、好ましくは、それは2'メチル修飾であり、該メチル修飾の炭素が直接、糖部分の2'炭素に付着している。 'When it is alkyl modification, preferably it is 2' R2 is 2 is methyl modification, the carbon of the methyl modification directly attached to the 2 'carbon of the sugar moiety.

この実施例のR1、オルトエステルは、上記第1の実施形態のオルトエステルを選択するためのパラメータに基づいて選択される。 R1, orthoester of this embodiment is selected based on the parameters for selecting the orthoester of the first embodiment.

式中の破線は、窒素含有塩素間の水素結合による相互作用を示す。 The broken line in the formula indicates the interaction by hydrogen bonding between the nitrogen-containing chlorine. 好ましくは、B およびB は、天然の窒素含有塩素、例えばアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、およびクエウオシン、あるいはそれらの類似体である。 Preferably, B 1 and B 2, is a naturally occurring nitrogen-containing chlorine, for example adenine, thymine, guanine, cytosine, uracil, xanthine, hypoxanthine, and Kueuoshin or analogs thereof. 好ましくは、XがOである。 Preferably, X is O.

上記実施形態の各々に関して、siRNAは任意の長さのものであり、好ましくは18〜30ヌクレオチド塩基対、より好ましくは18〜19塩基対であり、任意のオーバーハングが除かれる。 For each of the above embodiments, siRNA is of any length, preferably 18-30 nucleotide base pairs, more preferably 18 to 19 base pairs, any overhangs are removed. 長さが約30塩基対未満のsiRNAを用いることで、非特異的なプロセス(例えばsiRNA適用の機能性を減少させるインターフェロン関連の反応)を避けることができ、その一方でRNA干渉適用における機能的反応が保たれる。 By length used about 30 base pairs less than siRNA, non-specific processes (e.g. siRNA application of functional response of interferon-related decrease the) can avoid, functional in while RNA interference applications reaction is maintained. さらに、好ましくは、上記ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。 Further, preferably, said nucleotide is a ribonucleotide.

上記実施形態において、オーバーハングが鎖の一方または両方に存在し得る。 In the above embodiments, the overhang may be present in one or both strands. 好ましくは、siRNAがオーバーハングを有する場合、長さが1〜6ヌクレオチド単位、より好ましくは2〜3、さらに最も好ましくは2であり、siRNAの各々の鎖の3'末端に位置する。 Preferably, if the siRNA has an overhang, it is 1-6 nucleotide units in length, more preferably 2-3, and most preferably 2 located at the 3 'end of each strand of the siRNA. しかし、平滑末端を有するsiRNAは機能的である。 However, siRNA with blunt ends are functional. 2つのヌクレオチドのオーバーハングが最も好ましい。 Overhang of two nucleotides are most preferred.

上記実施形態での類似性は、siRNAのいずれか一方の鎖または両方の鎖が、1つ以上の修飾ヌクレオチド間連結を持ち得ることである。 Similarity of the above embodiments, either or both strands of the siRNA, is that may have a connection between one or more modified nucleotides. 好ましくは、修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートとホスホロジチオエートとからなる群から選択される。 Preferably, between modified nucleotides linked it is selected from the group consisting of a phosphorothioate and a phosphorodithioate. さらに、好ましくは、上記ポリヌクレオチドが4を上回る数の修飾ヌクレオチド関連結を持つことができる。 Further, preferably, may have a modified nucleotide relevant binding number of the polynucleotide is greater than 4. より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドが、8を上回る数の修飾ヌクレオチド間連結を含む。 More preferably, the polynucleotide of the present invention includes a connection between the number of modified nucleotides in excess of 8. 最も好ましくは、約10個の修飾ヌクレオチド間連結が用いられる。 Most preferably, between about 10 modified nucleotides linked is used. 安定性を最も高くするために、完全な修飾が好ましいが、実際に用いることができる修飾連結の数に対して、数多くの因子が影響を及ぼす。 For the most stable, although fully qualified is preferred, for the number of modified linkages can be actually used, a number of factors influence. このような因子として、連結によって与えられる安定性の度合い、連結が機能性に影響を及ぼす度合い、化学的に連結を導入する能力、さらに連結の毒性が挙げられる。 Such factors include the stability of the degree provided by the coupling, coupling degree affect the functionality, the ability to introduce chemically linked include further coupled toxicity. 好ましくは、修飾はエクソヌクレアーゼ活性に対する保護のために、3'および5'末端に配置される。 Preferably, modification is to protect against exonuclease activity is located in the 3 'and 5' ends.

本発明の上記実施形態のポリヌクレオチドは、安定化されている。 The polynucleotide of the above embodiments of the present invention are stabilized. これらの安定化したsiRNAの半減期は、約20秒から100時間以上である。 The half-life of these stabilized siRNA is from about 20 seconds to 100 hours or more. 好ましくは、本発明の安定化siRNAの半減期は1時間を超える。 Preferably, the half-life of the stabilized siRNA of the present invention is more than 1 hour. より望ましくは、本発明の安定化siRNAは、10時間を超える半減期を示す。 More desirably, the stabilizing siRNA of the present invention exhibit a half-life greater than 10 hours. もっとも好ましくは、本発明の安定化siRNAは、100時間を上回る半減期を示す。 Most preferably the stabilized siRNA of the present invention exhibit a half-life of more than 100 hours. その上、望ましくは、siRNAの効果は、少なくとも1世代以上にわたる細胞分裂を存続する。 Moreover, desirably, the effect of the siRNA, surviving cell division over at least one generation or more.

本発明のポリヌクレオチドは、ヒト血清存在下で高い安定性を示す。 The polynucleotide of the present invention exhibit a high stability in the presence of human serum. 好ましくは、例えば、ヒト血清中での本発明の19量体二本鎖の半減期が数分から24時間である。 Preferably, for example, the half-life of 19-mer duplex of the invention in human serum is from a few minutes to 24 hours. より好ましくは、ヒト血清での19量体二本の半減期が24時間から3日間である。 More preferably, the half-life of 19-mer duplex in human serum is 3 days 24 hours. 最も好ましくは、血清中での19量体二本鎖の半減期は3〜20日以上である。 Most preferably, the half-life of 19-mer duplex in serum is not less than 3 to 20 days.

第2、第4、第6、第14、第16、および第18位でのデオキシリボ核酸修飾を持つアンチセンス鎖を有する19量体ポリリボヌクレオチド二本鎖にとって、37℃で1時間30分、胎仔牛血清にさらすことで、おそらくは血清ヌクレアーゼによって、第4および第6位が分解から守られた。 Second, fourth, sixth, fourteenth, for 19-mer polyribonucleotide duplex with an antisense strand having a deoxyribonucleic acid modifications at 16, and # 18, 1 hour 30 minutes at 37 ° C., by exposure to fetal bovine serum, possibly by serum nucleases, fourth and sixth positions were protected from degradation. 同様に、第2〜第6、第12、第14、第16および第17、さらに第19位にあるアンチセンス鎖上の2'−O−メチル修飾を含む19量体ポリリボヌクレオチド二本鎖に関して、血清ヌクレアーゼによる分解からこれらの位置が保護された。 Similarly, second to sixth, twelfth, fourteenth, sixteenth and seventeenth, 19-mer polyribonucleotide duplex comprising more 2'-O- methyl modifications on the antisense strand at the 19-position regard, these positions from degradation by serum nucleases is protected. ヌクレオチド1〜6および13〜19間での19量体ポリリボヌクレオチド二本鎖に対するアンチセンス鎖内のホスホロチオエート修飾の導入によって、血清ヌクレアーゼ分解に抵抗する修飾ヌクレオチド間結合が与えられる。 The introduction of phosphorothioate modifications in the antisense strand for 19-mer polyribonucleotide duplex between nucleotides 1-6 and 13-19, are given modified linkages to resist serum nuclease degradation. しかし、アンチセンス鎖の各2'位でACEオルトエステル部分により修飾された19量体によっては、ヒト血清に対する安定性が得られなかったが、おそらく血清リボヌクレアーゼのみならず血清ホスホジエステラーゼが原因と考えられる。 However, some 19-mer modified by ACE orthoester moiety in each 2 'position of the antisense strand, but stability against human serum was not obtained, it is probably the cause serum phosphodiesterase not only serum ribonucleases .

ポリヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖における2'位での修飾は、CおよびUヌクレオチド単位で、血清中でのポリリボヌクレオチド二鎖の安定性を著しく高める。 Modifications at the 2 'position in the antisense strand of the polynucleotide duplex is C and U nucleotide units, greatly enhance the stability of the polyribonucleotide duplex in serum. 図17は、センスおよびアンチセンス鎖の両方の2'位での修飾の種類の関数として、2'−O−メチル(配列番号13)に関して、2'F(5'−2'GfUGAfUGfUAfUGfUfCAGAGAGfUdTdT−3')(配列番号17)、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結(配列番号10および11)、さらにACE保護(配列番号3および4)に関して、安定性を示す。 17, 2 of both the sense and antisense strand 'as a function of the type of modification in the position, with respect to 2'-O- methyl (SEQ ID NO: 13), 2'F (5'-2'GfUGAfUGfUAfUGfUfCAGAGAGfUdTdT-3' ) (SEQ ID NO: 17), between the phosphorothioate internucleotide linkages (SEQ ID NO: 10 and 11), with respect to further ACE protection (SEQ ID NO: 3 and 4) shows the stability. 縦軸は、非分解性ポリヌクレオチドと対照との割合を示す。 The ordinate shows the ratio between the control and the nondegradable polynucleotide. したがって、対照と比較した安定性率が高くなれば、観察される分解も少なくなる。 Thus, the higher contrast as compared to the stability index, decompose less observed. 図17から、センス鎖を修飾することは、安定性を達成する上で十分である。 From Figure 17, modifying the sense strand are sufficient to achieve stability.

2'−O−メチル部分または2'フルオロ部分のいずれかによる各Cおよび各Uの修飾は、センスおよびアンチセンス鎖の完全な安定化をもたらす。 2'-O- methyl moiety or 2 'modification of each C and each U with either fluoro moiety results in complete stabilization of the sense and antisense strands. 安定なセンス鎖、例えば2'フルオロまたは2'−O−メチル修飾を持つものを裸のアンチセンス鎖にアニーリングして、安定性が改善される。 Stable sense strand, e.g., 2 'fluoro or those with 2'-O- methyl modifications annealed naked antisense strand, stability is improved.

本発明の組成物は、新規の保護基スキームに準拠したDharmaconのRNA合成ケミストリーに基づいて作ることができる。 The compositions of the present invention can be made based on RNA synthesis chemistry Dharmacon conforming to the new protecting group scheme. 2'−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基(2'−ACE)と併用して5'−ヒドロキシル(5'−SIL)の保護に、シリルエステル類を用いることができる。 Acid-labile orthoester protecting group on the 2'-hydroxyl protection of (2'-ACE) in combination with 5'-hydroxyl (5'-SIL), can be used silyl esters. このような保護基の組が、続いて標準的なホスホラミダイト固相合成技術で使われる。 The set of such protecting groups are subsequently used in standard phosphoramidite solid-phase synthesis techniques. いくつかの保護および機能化リボヌクレオチド・ホスホラミダイトの構造を図12に示す。 The structures of several protection and functionalized ribonucleotide phosphoramidite is shown in Figure 12. とって代わるものとして、本発明の組成物を任意の他の適当なRNA合成ケミストリーを用いて作ることができる。 As an taking place in the composition of the present invention can be made using any other suitable RNA synthesis chemistry.

第7の実施形態によれば、本発明はRNA干渉を実施するための方法を提供する。 According to the seventh embodiment, the present invention provides a method for performing RNA interference. この方法は、RNAiを実施するために、siRNAを標的核酸にさらすことから構成される。 The method for carrying out RNAi, consists of exposing an siRNA to a target nucleic acid. この方法では、siRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらに上記センス鎖および上記アンチセンス鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドを含む。 In this way, siRNA is composed of a sense strand and an antisense strand, but still at least one of said sense strand and said antisense strand comprises at least one orthoester modified nucleotide.

好ましくは、目的とする標的核酸に対して、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドが90%以上の相補性を表す。 Preferably, the target nucleic acid of interest, the polynucleotide of the antisense strand represents 90% or more complementarity. より好ましくは、本発明のアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、目的とする標的核酸に対して、99%以上の相補性を示す。 More preferably, the antisense strand polynucleotides of the present invention, to the target nucleic acid of interest, showing a 99% or higher complementarity. 最も好ましくは、本発明のポリヌクレオチドが、連続する少なくとも18〜19塩基にわたって、目的とする標的核酸に対して完全な相補性を持つ。 Most preferably, the polynucleotide of the present invention, over at least 18 to 19 consecutive bases, with full complementarity to the target nucleic acid of interest.

好ましくは、上記少なくとも1つのオルトエステル修飾ヌクレオチドがセンス鎖上に位置し、上記オルトエステルの組成物が第1の実施形態について前述されたパラメーターによって定義される。 Preferably, the at least one orthoester modified nucleotide is positioned on the sense strand, the composition of the ortho ester is defined by the aforementioned parameters that were for the first embodiment.

オルトエステル修飾に加えて、上記した他の修飾のいずれかもまた、この方法で使用する場合に提示可能である。 In addition to the orthoester modification, also any other modification described above, and can be presented when used in this way. 例えば、アンチセンス鎖は、2'ハロゲン修飾ヌクレオチド、2'アミン修飾ヌクレオチド、2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2'アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを、好ましくは含む。 For example, the antisense strand, 2 'halogen modified nucleotide, 2' amine modified nucleotide, 2'-O-alkyl modified nucleotide, and 2 'at least one modified nucleotide is selected from the group consisting of alkyl modified nucleotide, preferably including. 修飾ヌクレオチドが2'ハロゲン修飾ヌクレオチドである場合、上記ハロゲンは好ましくはフッ素である。 If the modified nucleotide is a 2 'halogen modified nucleotide, the halogen is preferably fluorine. このハロゲンは好ましくはフッ素である。 The halogen is preferably fluorine. ハロゲンがフッ素である場合、このフッ素は、好ましくは、CまたはU含有ヌクレオチド単位に付着している。 When the halogen is fluorine, the fluorine is preferably attached to the C or U-containing nucleotide units. 上記2'修飾がアミンである場合、好ましくは、そのアミンは、−NH という部分を有する。 When the 2 'modification is an amine, preferably the amine has a part called -NH 2. 上記2'修飾が2'−O−アルキル基である場合、好ましくは、その基は、メソオキシ−OCH という部分を有する。 When the 2 'modification is a 2'-O- alkyl group, preferably the group has a portion that Mesookishi -OCH 3. 上記2'修飾がアルキル基である場合、好ましくはその修飾がメチル基(−CH )である。 When the 2 'modification is an alkyl group, preferably the modification is a methyl group (-CH 3). さらに、好ましくは、これらの修飾のいずれもがヌクレオチド8〜11で生じず、より好ましくはこれらの修飾のいずれもがアンチセンス鎖の7〜12位で生じない。 Further, preferably, none of these modifications is not generated at nucleotide 8-11, more preferably none of these modifications do not occur in 7-12 of the antisense strand.

上記方法はまた、siRNAが5'コンジュゲートを含むかたちで、実施される。 The method also, siRNA is in the form containing the 5 'conjugate, is performed. このコンジュゲートを、コンジュゲートの選択に関する前述の基準に基づいて、選択することができる。 The conjugate, on the basis of the above-mentioned criteria for the selection of the conjugate, can be selected.

これらの方法を用いる際、上記siRNAは任意の数の塩基対ではあるが、好ましくは18〜30塩基対、より好ましくは19塩基対である。 When using these methods, the siRNA is at any number of base pairs, but is preferably 18 to 30 base pairs, more preferably 19 base pairs. さらに好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドのアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。 More preferably, the polynucleotide comprises an antisense strand and sense strand of ribonucleotides.

一方または両方の鎖上の3'および/または5'末端ヌクレオチド単位の1つ以上の塩基対のオーバーハングもまた、オーバーハングのための上記パラメータにもとづいて存在する。 One or more than one overhang base pairs 3 'and / or 5' terminal nucleotide units on both strands is also present on the basis of the above parameters for the overhang.

第8の実施形態によれば、本発明は、RNA干渉を実行するための方法を提供するもので、siRNAを標的核酸にさらすことを含む。 According to the eighth embodiment, the present invention is to provide a method for performing RNA interference, comprising exposing an siRNA to a target nucleic acid. このsiRNAは、センス鎖、アンチセンス鎖、およびコンジュゲートから構成される。 The siRNA is a sense strand, antisense strand, and a conjugate. センスまたはアンチセンス鎖のいずれも、2'修飾ヌクレオチドを含む。 None of the sense or antisense strand, including a 2 'modified nucleotides. 好ましくは、本発明のこの実施形態のsiRNAは、前述の実施形態と同程度の相補性を示す。 Preferably, siRNA of this embodiment of the present invention, showing the complementation of the same level as the previous embodiment.

この実施形態によれば、アンチセンス鎖は、好ましくは、2'ハロゲン修飾ヌクレオチド、2'アミノ修飾ヌクレオチド、2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2'アルキル修飾ヌクレオチドから選択される少なくとも1つのヌクレオチドを含む。 According to this embodiment, the antisense strand, preferably, 2 'halogen modified nucleotide, 2' amino-modified nucleotides, 2'-O-alkyl modified nucleotide, and 2 'at least one nucleotide selected from alkyl modified nucleotide including. 上記修飾は、アンチセンス鎖および/またはセンス鎖に対しておこなうことができる。 The above modifications can be made to the antisense strand and / or sense strand. 修飾ヌクレオチドが2'ハロゲン修飾ヌクレオチドである場合、ハロゲンが好ましくはフッ素である。 If the modified nucleotide is a 2 'halogen modified nucleotide, the halogen is preferably fluorine. ハロゲンがフッ素である場合、上記フッ素は好ましくは、少なくとも2つのCまたはU含有ヌクレオチドに結合する。 When the halogen is fluorine, the fluorine is preferably bound to at least two C or U-containing nucleotide. 好ましい2'アミン修飾は−NH である。 Preferred 2 'amine modified is -NH 2. 好ましい2'−O−アルキル修飾は−OCH である。 Preferred 2'-O- alkyl modification is -OCH 3. 好ましくは2'アルキル修飾は、−CH である。 Preferably 2 'alkyl modification is -CH 3.

上記方法はまた、siRNAがコンジュゲートを含んで実行することができる。 The method also can siRNA executes comprise conjugate. コンジュゲートは、既に述べられたコンジュゲートを選択するためのパラメータに基づいて選択される。 Conjugate is selected based on the parameters for selecting the conjugate already mentioned. siRNAは、任意の数の塩基対であってもいが、前述の実施形態では、好ましくは18〜30塩基対、最も好ましくは18〜19塩基対である。 The siRNA, bur even bp any number in the above-described embodiment, and preferably 18 to 30 base pairs, and most preferably 18 to 19 base pairs. 同様に、いずれかの、または両方の鎖の3'および/または5'末端ヌクレオチド上の1つ以上の塩基対のオーバーハングを与えることができる。 Similarly, it is possible to provide either, or both strands 3 'and / or 5' overhangs of one or more base pairs on the terminal nucleotide. さらに、センスまたはアンチセンスのいずれかが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含むことができ、好ましくはホスホロチオエート連結およびホスホロジエチエート連結から選択される。 Furthermore, either the sense or antisense, that can include a connection between at least one modified nucleotide, preferably selected from phosphorothioate linkage and phosphorodithioate diethylcarbamoyl benzoate connection. 好ましくは、上記センスおよびアンチセンス鎖は、ポリリボヌクレオチドである。 Preferably, the sense and antisense strand are polyribonucleotides.

上述した実施形態の各々は、ポリヌクレオチドが裸ポリヌクレオチドよりもより安定していることから、効果的なRNAi干渉を実施することが可能である。 Each of the embodiments described above, since the polynucleotide is more stable than naked polynucleotide, it is possible to implement effective RNAi interference. 裸ポリヌクレオチドとは異なり、本発明のポリヌクレオチドは、血液、血清、および他の生物学的媒体に存在するヌクレアーゼおよび他に物質による分解に対して耐性を示す。 Unlike naked polynucleotide, the polynucleotide of the present invention show blood, serum, and resistant to degradation by nucleases and other substances present in other biological media.

本発明のさらなる驚くべき利点は、「オフ・ターゲット化(off−targeting)とも呼ばれる非特異的RNA干渉を最小限にすることである。非特異的RNA干渉は、標識にされていない遺伝子の機能をセンス鎖がサイレンシングまたは部分的にサイレンシングする場合に生ずる。本明細書に記載するオルトエステル修飾および他の修飾は、単独または互いに組み合わさって、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖で用いられ、そのような非特異的RNA干渉の削減または防止をおこなう。 A further surprising advantage of the present invention is to minimize non-specific RNA interference, also referred to as "off-targeting (off-targeting). Nonspecific RNA interference function of a gene that is not a label the sense strand occurs when the silencing or partially silencing orthoester modification and other modifications described. herein, in combination either alone or with each other, the sense strand, antisense strand or both strands, used in, making such reduction or prevention of non-specific RNA interference.

非特異的RNA干渉を減少させるために、好ましくはセンス鎖修飾 、5'末端ヌクレオチドを第1番目として、5'末端から第8、第9、第10、または第11番目のヌクレオチドで、おこなう。 To reduce non-specific RNA interference, preferably sense strand modifications, 'as the first terminal nucleotide, 5' 5 8 from the end, in the ninth, tenth or 11th nucleotide, performed . より好ましくは、第8、第9、第10、および第11番目のヌクレオチドの全てを2'位で修飾する。 More preferably, the eighth, ninth, modified with all 2 'position of the second 10, and 11th nucleotides. 最も好ましくは、第8、第9、第10、および第11番目のヌクレオチドが全て2'位で修飾され、かつ該修飾がオルトエステルである。 Most preferably, the eighth, ninth, tenth, and 11th nucleotides are modified at all 2 'position, and the modification is ortho ester.

第9の実施形態によれば、本発明は、siRNAを標的核酸にさらすことを含み、上記siRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成され、さらに前記センス鎖は実質的に非機能的である、RNA干渉を実施する方法を提供する。 According to the ninth embodiment, the present invention comprises exposing an siRNA to a target nucleic acid, the siRNA is comprised of a sense strand and an antisense strand, further wherein said sense strand is substantially nonfunctional , it provides a method of performing RNA interference. 「実質的に非機能的(substantially nonfunctional)」によって意味されることは、いっさいの非標的遺伝子の発現を、上記センス鎖が50%以上阻害することができないということである。 What is meant by "substantially non-functional (substantially nonfunctional)" is the any of the expression of non-target genes, the sense strand is the inability to inhibit 50% or more. したがって、「実質的に非機能的」センス鎖によって阻害される非特異的mRNAの発現は50%未満である。 Thus, the expression of non-specific mRNA is inhibited by "substantially non-functional" sense strand is less than 50%. 本発明の付加的な利点として、血清含有培地および血清中での安定性が高められる。 As an additional advantage of the present invention, stability in serum-containing medium and serum are enhanced.

この実施形態によれば、上記センス鎖は、少なくとも1つの2'−O−アルキル修飾、少なくとも1つのシトシン含有ヌクレオチド塩基またはウラシル含有ヌクレオチド塩基を含むことができ、その少なくとも1つのシトシン含有ヌクレオチド塩基またはウラシル含有ヌクレオチド塩基は、2'−O−メチル修飾を有する。 According to this embodiment, the sense strand comprises at least one 2'-O- alkyl modification may comprise at least one cytosine-containing nucleotide bases or uracil-containing nucleotide bases, at least one cytosine-containing nucleotide bases or uracil-containing nucleotide base has a 2'-O- methyl modification. 好ましくは、2'−O−アルキル修飾が2'−O−メチル修飾である。 Preferably, 2'-O- alkyl modification is a 2'-O- methyl modification. より好ましくは、上記2'−O−アルキル修飾が第1,第2、第18、および/または第19ヌクレオチド塩基上の、2'−O−メチル修飾である。 More preferably, the 2'-O- alkyl modification is first, second, third 18, and / or on the 19 nucleotide bases, a 2'-O- methyl modification.

上記センス鎖は、さらに、コンジュゲートを含み得る。 The sense strand can further comprise a conjugate. 好ましくは、コンジュゲートがコレステロールである。 Preferably, the conjugate is cholesterol. 好ましくは、このコレステロールは、センス鎖の5'および/または3'末端に付着している。 Preferably, this cholesterol is attached to the 5 'and / or 3' end of the sense strand. コレステロールによるsiRNA二本鎖の修飾は、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対する二本鎖の親和性を著しく増加させ、顕著な毒性をいっさい生ずることなく二本鎖の体内分布を変える。 Modification of the siRNA duplex by cholesterol, increases significantly the affinity of duplex for albumin and other serum proteins, altering the two biodistribution chains without causing significant toxicity at all.

上記センス鎖は、その3'末端にキャップを含み得る。 The sense strand may include a cap on its 3 'end. 好ましくは、このキャップは逆位のデオキシチミジンまたは末端位置(ヌクレオチド18および19)にある2つの連続的な2'−O−メチル修飾塩基である。 Preferably, the cap is two consecutive 2'-O- methyl modified bases at the deoxythymidine or terminal position of the inverted (nucleotides 18 and 19).

上記アンチセンス鎖は、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含み得る。 The antisense strand can comprise at least one modified nucleotide. 好ましくは、この少なくとも1つの修飾ヌクレオチドは、2'−ハロゲン修飾ヌクレオチドである。 Preferably, the at least one modified nucleotide is a 2'-halogen modified nucleotide. 最も好ましくは、その修飾ヌクレオチドは2'−フッ素修飾ヌクレオチドである。 Most preferably, the modified nucleotide is a 2'-fluorine modified nucleotides.

前記センス鎖が1つ以上のシトシン含有ヌクレオチド塩基および/またはウラシル含有ヌクレオチド塩基を含む場合、1つ以上のシトシン含有ヌクレオチド塩基および/またはウラシル含有ヌクレオチド塩基は、2'−フッ素修飾されたものである。 If the sense strand comprises one or more cytosine-containing nucleotide bases and / or uracil-containing nucleotide bases, one or more cytosine-containing nucleotide bases and / or uracil-containing nucleotide bases are those which are 2'fluorine modified .

第10の実施形態によれば、本発明は、RNA干渉を実施する方法を提供するもので、該方法はsiRNAを標的核酸にさらすことを含み、このsiRNAは、(a)コンジュゲートと、(b)少なくとも1つの2'−O−アルキル修飾を含み、実質的に非機能的であるセンス鎖と、(c)少なくとも1つの2'−フッ素修飾を含むアンチセンス鎖とから構成され、上記センス鎖および上記アンチセンス鎖が18〜30塩基対の二鎖を形成する。 According to the tenth embodiment, the present invention is to provide a method of performing RNA interference, said method comprising exposing an siRNA to a target nucleic acid, the siRNA comprises (a) a conjugate, ( b) comprises at least one 2'-O- alkyl modification, is composed of a sense strand is substantially nonfunctional, the antisense strand comprising at least one 2'-fluorine modification (c), the sense strand and the antisense strand to form a duplex of 18-30 base pairs. 好ましくは、上記少なくとも1つの2'−O−アルキル修飾が、第1、第2、第18、および/または第19のヌクレオチド塩基である。 Preferably, it said at least one 2'-O- alkyl modification is, first, second, third 18, and / or 19 is a nucleotide base. 好ましくは、上記コンジュゲートがコレステロールである。 Preferably, the conjugate is cholesterol. 好ましくは、上記コレステロールは、センス鎖の5'および/または3'末端に付着している Preferably, the cholesterol is attached to the 5 'and / or 3' end of the sense strand.
上記センス鎖は、さらにその3'末端にキャップを含み得る。 The sense strand can further comprise a cap on its 3 'end. 好ましくは、このキャップは逆位のデオキシチミジン(idT)または末端位置(ヌクレオチド18および19)にある2つの連続的な2'−O−メチル修飾塩基である。 Preferably, the cap is two consecutive 2'-O- methyl modified bases at the deoxythymidine (idT) or terminal position of the inverted (nucleotides 18 and 19).

本発明の上記した実施形態の利点は、RISC複合体アセンブリーの方向性を促進するsiRNA二本鎖のセンス鎖の修飾を可能にし、センス鎖が遺伝子サイレンシングに関わるのを防ぐことである。 An advantage of the above described embodiments of the present invention allows modification of the sense strand of siRNA duplexes to promote the directionality of the RISC complex assembly, the sense strand is to prevent involved in gene silencing. 本発明者は、siRNA媒介サイレンシングの効率に対する種々の修飾を持つsiRNAを用いる効果を系統的に研究した。 The present inventors have systematically studied the effect of using the siRNA with different modifications to the efficiency of siRNA-mediated silencing. 本発明者は、2'− デオキシまたは2'−O−メチル修飾を持つ二本鎖を有するセンスおよびアンチセンス鎖の各々の位置での修飾が、siRNA機能と干渉しないことを発見した。 The present inventor has modifications at each position of the sense and antisense strands having a lifting one duplex 2'-deoxy or 2'-O- methyl modifications were found not to interfere with siRNA functionality. 2または3つのそのような修飾に対してタンデム(相前後した)阻害を用いる場合、十分に許容された(well−tolerated)修飾のパターンがセンス鎖とアンチセンス鎖とで異なる。 When using tandem (phase was back and forth) inhibition on two or three such modifications, well-tolerated (well-tolerated) modification patterns are different between the sense and antisense strands. 2−O−メチルで修飾されたセンス鎖の1位および2位を持つsiRNA二本鎖は、完全に機能的であった。 SiRNA duplexes with positions 1 and 2 of the sense strand modified with 2-O-methyl, was fully functional. しかし、アンチセンス鎖の同様な位置での修飾は、完全に非機能的なsiRNAをもたらした。 However, modifications in the same position in the antisense strand resulted in completely non-functional siRNA. 図19〜31を参照せよ。 See FIG 19-31. 5'末端でのアンチセンス鎖のリン酸化は、部分的にアンチセンス鎖機能性を回復させた。 5 phosphorylation of the antisense strand at the 'end, were allowed to recover partially the antisense strand functionality.

本明細書に記載した修飾は安価であり、信頼性が高く、かつ非毒性であり、センス鎖がアンチセンス鎖としての機能を実質的におこなうことができないようにsiRNA二本鎖を修飾する方法ある。 Modifications described herein are inexpensive, reliable, and non-toxic method of modifying the siRNA duplex so that it can not sense strand substantially performs the function of the antisense strand is there. これの実質的な効果は、siRNA特異性および効力が増加することである。 The net effect of this is that the siRNA specificity and potency is increased. 最近のマイクロアレイ分析によれば、11個のヌクレオチドの存在が非特異的サイレンシングを誘発するのに十分であることを示唆しており、さらにsiRNA二本鎖と他のmRNA転写産物のセンス鎖との間の相同性は、場合によっては、少なくとも非特異的な活性の半分を生み出すことが可能であることも示唆されている(Jack so n,A.L.,et al.(2003)Expression profiling reveals off−target gene regulation by RNAi.Nature Biotechnology 21,635−637)。 Recent microarray analysis, the sense strand of the 11 pieces of the presence of the nucleotides have suggested that it is sufficient to induce nonspecific silencing, further siRNA duplexes with other mRNA transcripts the homology between the, in some cases, it has been suggested that it is possible to produce at least half of nonspecific activity (Jack so n, A.L., et al. (2003) Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nature Biotechnology 21,635-637). したがって、センス鎖の非特異的活性が阻害されるとすれば、二本鎖特異性が増加する。 Therefore, if non-specific activity of the sense strand is inhibited, duplex specificity is increased. このこともまた、機能的RISC形成の方向へ平衡が移る効果を持つと思われ、同様に必要なsiRNA濃度を低下させる。 This also seems to have the effect of equilibrium in the direction moves functional RISC formation, reducing the siRNA concentration required as well.

本発明者は、十分に許容され、かつ血清(例えば、ヒト血清)存在下でsiRNA二本鎖の安定性を高める修飾を提供する。 The present inventors have, well tolerated, and serum (e.g., human serum) to provide modifications that increase the stability of the siRNA duplex in the presence. siRNA二本鎖のセンス鎖修飾を安定化させることのみで、非修飾または裸のアンチセンス鎖に対してある程度の安定性を与える。 Only to stabilize the sense strand modifications of the siRNA duplex, provide a degree of stability to unmodified or naked antisense strand. 2'−O−アルキル修飾によるセンス鎖のCまたはU毎の修飾(例えば、2'−O−メチル部分)は、いくつかの配列の安定性にとってかなり効果的ではあるが、他の配列にとっては効果的ではない。 2'-O- alkyl modification C or modification of each U of the sense strand by (e.g., 2'-O- methyl moiety), albeit quite effective for the stability of some sequences, for the other sequences not effective. さらに、本発明者は、センス鎖の5'末端ヌクレオチドの2'−O−メチル修飾が重要であることを発見した。 Furthermore, the present inventors have discovered that 2'-O- methyl modification of 5 'terminal nucleotide of the sense strand is important. このようなかたちでの修飾もまた、完全に修飾されたsiRNAと比較して、非特異的効果の度合いが低いという結果になることが予想される。 Modified in such form also, in comparison with the fully modified siRNA, are expected to result in a degree of non-specific effects is low. 本明細書のデータが記述しているように、センス鎖の1、2、18、および19位での修飾が二本鎖性能と干渉しない。 As data herein are described, the sense strand 1,2,18, and modification at position 19 does not interfere with duplex performance. センス鎖修飾によって生ずる二本鎖安定性の一例を図32に示す。 An example of duplex stability caused by the sense strand modifications shown in FIG. 32. この図は、全てのUおよびCに対するO−メチル修飾を二本鎖のセンス鎖に施すことで、抗SEAPsiRNA2217の半減期が10分から4時間に増加したことを示している。 This figure, by performing O- methyl modification for all U and C to the sense strand of double-stranded, it is shown that the half-life of the anti SEAPsiRNA2217 is increased to 10 minutes to 4 hours. アンチセンス鎖の dTバージョンは安定性が2倍低いことから、dTdTによる3'末端の修飾は重要である。 Since i dT versions of the antisense strand are 2 times lower stability, modification of the 3 'end by dTdT it is important. アンチセンス鎖が裸のままであることから、このような修飾モードは任意の配列に適用することができる。 Since the antisense strand remains bare, such modified mode can be applied to any sequence.

血清中での数時間に及ぶ半減期は、siRNAの効果的送達を高める上で十分なものでなければならない。 The half-life of up to several hours in serum should be sufficient for increasing the effective delivery of siRNA. なぜなら、細胞内siRNAはRISC複合体によって安定化されるからである。 This is because the intracellular siRNA is because is stabilized by the RISC complex. 図35は、センス鎖のCおよびUが2'−O−メチルで修飾され、idTキャップが3'末端に置かれた場合のsiRNA二本鎖の安定性を示す。 Figure 35 is, C and U of the sense strand is modified with 2'-O- methyl, showing the stability of the siRNA duplexes when idT cap is placed on the 3 'end. この種の処方の機能性は配列依存的ではあるが、センス鎖の5'末端上にコレステロールが存在することで、著しく改善される。 Although this kind of functionality formulations some sequence dependent, the presence of cholesterol on the 5 'end of the sense strand, is significantly improved. さらなる修飾(例えば、センス鎖CおよびUの2'−O−メチル修飾、それに加えてセンス鎖の1位および2位の2'−O−メチル修飾、アンチセンス鎖のCおよびUの2'F修飾、さらにアンチセンス鎖の5'末端上のリン酸基、図37参照)は、サイレンシング機能性を感知できるほどに変えることなしに、そのような分子の血清安定性を5日間、さらに増加させることができる。 Further modifications (e.g., 2'-O- methyl modification of the sense strand C and U, 1-position and 2-position of 2'-O- methyl modification of the sense strand in addition, the C and U antisense strand 2'F modified further phosphate groups on 5 'end of the antisense strand, see Fig. 37), without changing appreciably the silencing functionality, serum stability of such molecules 5 days, further increased it can be.

コレステロール・コンジュゲートによるsiRNAの修飾は、別の予想外の特徴を持つ。 Modification of siRNA by cholesterol conjugate has another unexpected feature. コレステロールによって修飾されたsiRNAは、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対して、かなり高い親和性を示す。 Modified siRNA by cholesterol, to albumin and other serum proteins, indicating a much higher affinity. 図33を参照せよ。 See FIG 33. 血清タンパク質親和性は、マウスにおけるアンチセンス生体内分解に関する以前の研究で有用であることが証明された。 Serum protein affinity, it has proven useful in previous studies of antisense biodegradation in mice. ホスホチオ修飾の存在は、非特異的アンチセンス結合活性の大部分に関与するが、血清タンパク質に対する高い親和性を持ち、それによって薬物動態学的挙動を変えることから、生体内(in vivo)アンチセンス適用にとっては有益であることが証明された。 The presence of phosphothio modifications are involved in the majority of non-specific antisense binding activity, it has a high affinity for serum proteins, then by changing the pharmacokinetic behavior in vivo (in vivo) antisense it has proven to be beneficial to apply. コレステロール修飾siRNAは、ホスホチオ修飾の非特異性が高まるという欠点なしに血清タンパク質親和性の利点を示す。 Cholesterol-modified siRNA indicates the advantages of serum protein affinity without disadvantage increases the nonspecific phosphothio modified.

第11の実施形態によれば、本発明はセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成されるsiRNAを提供する。 According to the eleventh embodiment, the present invention provides a composed siRNA and a sense strand and an antisense strand. このセンス鎖は、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドを有し、それら両方とも2'炭素修飾、好ましくは2'−O−アルキル修飾を持つ。 The sense strand has a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, both of which 2 'carbon modifications, preferably with a 2'-O- alkyl modification. いくつかの実施形態では、このsiRNAは標識も含む。 In some embodiments, the siRNA also comprises a label. この標識が存在する場合、好ましくはこの標識が第1の5'末端センス・ヌクレオチド上に位置する。 If this indicator is present, preferably this indicator located on the first 5 'terminal sense nucleotide. さらに、センス鎖上の少なくとも1つのピリミジン(例えば、シトシンまたはウラシル)、好ましくは複数のピリミジンの各々が、2'炭素修飾、好ましくは2'−O−アルキル修飾を有する。 Furthermore, at least one pyrimidine of the sense strand (e.g., cytosine or uracil), preferably each of the plurality of pyrimidine, 2 'carbon modifications, preferably a 2'-O- alkyl modification. これらの修飾は、ピリミジンであってもよい第1または第2の5'末端センス・ヌクレオチドの任意の修飾に加えて、siRNAの配列に依存している。 These modifications, in addition to any modification may be a pyrimidine first or second 5 'terminal sense nucleotide is dependent on the sequence of siRNA.

第11の実施形態のアンチセンス鎖は、少なくとも1つの2'−ハロゲン修飾ピリミジン、好ましくはフッ素修飾ピリミジンと、リン酸化されている第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとを含む。 The antisense strand of the eleventh embodiment comprises at least one 2'-halogen modified pyrimidine, preferably a fluorine modified pyrimidine, and a first 5 'terminal antisense nucleotide is phosphorylated. 好ましくは、アンチセンス鎖上の全てのピリミジンが2'−フッ素修飾を持つ。 Preferably, all pyrimidines on the antisense strand has 2'-fluorine modification.

好ましくは、siRNAは、18〜30塩基対、より好ましくは19〜25塩基対、さらに最も好ましくは19〜2 塩基対を持つ(ヘアピンを形成することができる単分子siRNA中に存在する場合にオーバーハングまたはループもしくはステム構造を除く)。 Preferably, siRNA is 18-30 base pairs, more preferably 19 to 25 base pairs, and most preferably when present in unimolecular siRNA capable of forming a (hairpins with 19-2 3 base pairs except for the overhang or loop or stem structure). 好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖は、オーバーハング、ループ、またはステム構造を除いて、少なくとも79%相補性、より好ましくは塩基対の範囲にわたって90%相補性、さらに最も好ましくはこの範囲にわたって100%相補性である。 Preferably, sense and antisense strands, overhangs, with the exception of loop or stem structures at least 79% complementarity, 90% complementarity and more preferably over the range of base pairs, and most preferably 100 over this range % which is complementary. 同様に、好ましくは、アンチセンス領域は、標的領域に対して、少なくとも79%、より好ましくは少なくとも90%、さらに最も好ましくは少なくとも100%相補性である。 Similarly, preferably, the antisense region to the target region, at least 79%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 100% complementarity. 好ましくは、上記ポリヌクレオチドはRNAである。 Preferably, said polynucleotide is RNA.

siRNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの5'または3'末端のいずれかに、オーバーハングを含むものであってもよい。 siRNA is any of either the 5 'or 3' end of the sense strand or the antisense strand, or may include an overhang. しかし、2本の異なる鎖から構成されるポリヌクレオチドの場合、任意のオーバーハングが存在するとすれば、該オーバーハングはセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端のみに存在する。 However, if two separate strands of configured polynucleotide, if any overhangs are present, the overhang is present only at the 3 'end of the sense strand and / or antisense strand. また、好ましくは任意のオーバーハングは長さが6塩基長以下、好ましくは2塩基長以下である。 Further, preferably any overhang length 6 base long or less, preferably 2 bases in length or less. 最も好ましくは、オーバーハングが存在しないか、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方もしくは両方の3'末端上に2塩基からなるオーバーハングが存在する。 Most preferably, either overhang does not exist, or overhangs of two bases present in one or both of the 3 'end of the sense strand and antisense strand. 第11の実施形態によれば、アンチセンス鎖の5'末端にオーバーハングを持たないことが好ましい。 According to the eleventh embodiment, it is preferred that the 5 'end of the antisense strand does not have an overhang. オーバーハング・ヌクレオチドは、非リン酸5'−ヌクレオチドを残す1種類以上の細胞内酵素プロセスまたはイベントによって頻繁に取り除かれる。 Overhang nucleotides are frequently removed by one or more intracellular enzymatic processes or events that leave non-phosphate 5'-nucleotides. したがって、アンチセンス鎖の5'末端にオーバーハングを持たないことが望ましい。 Therefore, it is desirable that the 5 'end of the antisense strand does not have an overhang.

第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化とは、そのヌクレオチドの糖部分の5'炭素に付着した1つ以上のリン酸基が存在することをいう。 'The phosphorylation of the terminal antisense nucleotide, 5 of the sugar moiety of the nucleotides' first 5 means that one or more phosphate groups attached to the carbon is present. 好ましくは、リン酸基が1つだけ存在する。 Preferably, the phosphate group can have only one.

2'−O−アルキル修飾は、どの塩基に該修飾が現れるかに関わらず、好ましくは、2'−O−メチル、2'−O−エチル、2'−O−プロピル、2'−O−イソプロビル、2'−O−ブチル、2'−O−イソブチル、2'−O−エチル−O−メチル(−CH CH OCH )、および2'−O−エチル−OH(−OCH CH OH)からなる群から選択される。 2'-O- alkyl modification, whether the modification in which base appears, preferably, 2'-O- methyl, 2'-O- ethyl, 2'-O- propyl, 2'-O- isopropyl building, 2'-O- butyl, 2'-O- isobutyl, 2'-O- ethyl -O- methyl (-CH 2 CH 2 OCH 3) , and 2'-O- ethyl -OH (-OCH 2 It is selected from the group consisting of CH 2 OH). 最も好ましくは、2'−O−アルキル修飾が2'−O−メチル部分である。 Most preferably, 2'-O- alkyl modification is a 2'-O- methyl moiety. さらに、修飾が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドの各々で同一である必要はない。 Furthermore, modifications need not be the same in each of the first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide. しかし、本発明の分子を合成することに関して実用上の観点から、全体として同一の修飾を用いることが求められる場合もある。 However, from the viewpoint of practical use with respect to synthesize the molecules of the present invention, it may be used the same modified as a whole is determined.

2'−O−アルキル・ピリミジン修飾に関して、第1の2つの5'末端センスヌクレオチドにあるピリミジン以外の少なくとも1つのピリミジンが、2'−O−アルキル基により修飾される。 Respect 2'-O- alkyl pyrimidine modifications, at least one pyrimidine other than pyrimidine in the first two 5 'terminal sense nucleotide is modified by 2'-O- alkyl group. 好ましくは、二本鎖形成領域内にある上記センス鎖上の全てのピリミジンが修飾される。 Preferably, all pyrimidines on said sense strand is modified in the duplex forming region. さらに、好ましくは、2'−O−アルキル修飾が2'−O−メチル基である。 Further, preferably, 2'-O- alkyl modification is 2'-O- methyl group. 2'−O−アルキル修飾と同様に、同じアルキル修飾が、2'−O−アルキル基を有する各々のヌクレオチドの上で、使われる必要はない。 As with 2'-O- alkyl modification, the same alkyl modification, on each of the nucleotides having a 2'-O- alkyl group, you need not be used. オーバーハング、ループまたはステムがある場合、それらの領域のピリミジンは、2'−O−アルキル基を含んでもよく、あるいは含まなくてもよい。 Overhangs, if there is a loop or stem, pyrimidine those regions may comprise a 2'-O- alkyl, or may not include. しかし、2'−O−アルキル基のうちの少なくとも1つは、望ましくはセンス領域である。 However, 2'-O-at least one of the alkyl groups are preferably sense region.

2'ハロゲン修飾ヌクレオチドに関して、修飾はアンチセンス鎖のピリミジンの少なくとも1つに生じ、より好ましくはアンチセンス鎖のピリミジンの全てに生ずる。 For two 'halogen modified nucleotide, the modification occurs at least one pyrimidine of the antisense strand and more preferably occurs all pyrimidine of the antisense strand. さらに、好ましくは、上記ハロゲンがフッ素である。 Further, preferably, the halogen is fluorine. オーバーハング、ステム、またはループが存在する場合、それらの領域のピリミジンは、ハロゲン基を含んでもよく、あるいは含まなくてもよいが、好ましくはいずれのステムまたはループ構造はこの修飾を含まず、上記少なくとも1つのハロゲン基がセンス領域内にある。 Overhang, when the stem or loop is present, pyrimidine those regions may contain a halogen group, or may be free, preferably any stem or loop structure do not contain this modification, the at least one halogen group is in the sense region. 本明細書中に記載されるその他の修飾に影響されることなくsiRNAの安定性を増加させるために、2'−ハロゲン修飾(2'フルオロ修飾を含む)を用いることが可能であるという点に、留意する必要がある。 To increase the stability of the siRNA, without being affected by the other modifications described herein, to the point that it is possible to use a 2'-halogen modification (including 2 'fluoro modified) , it is necessary to pay attention. したがって、それらの修飾をsiRNA用途での他の修飾と共に使用することと同様に、それらを別々に用いることも可能である。 Thus, as with the use of these modifications with other modifications in siRNA applications, it is also possible to use them separately.

安定性および第11の実施形態に関連して機能性という本発明の利益を著しく否定するものでなければ、センスおよび/またはアンチセンス鎖のヌクレオチド修飾の他の種類を含めることが可能である。 If it intended to significantly negate the benefits of the present invention that functionality in conjunction with the stability and the eleventh embodiment, it is possible to include a sense and / or other types of nucleotide modifications of the antisense strand. ピリミジン修飾ヌクレオチド(例えば、ハロゲン、好ましくはフッ素修飾)と追加の2'−O−アルキル修飾ピリミジンとを持ちいることで、一定レベルのヌクレアーゼ耐性が得られる。 Pyrimidine modified nucleotides (e.g., halogen, preferably fluorine modified) that that has an additional 2'-O- alkyl modified pyrimidines, certain level of nuclease resistance is obtained.

化学修飾に加えて、塩基対ミスマッチまたは隆起(バルジ)をセンスおよび/またはアンチセンス鎖に付加することができ、該付加によって100%未満の相同性を共有する標的とのRISC媒介付着に関与するそれらの鎖の能力を変える。 In addition to chemical modification, base pair mismatches or uplift (bulge) can be added to the sense and / or antisense strand, it is involved in RISC-mediated adhesion to the target share homology of less than 100% by the addition alter the ability of those chain. そのようなミスマッチの例として(限定されるものではないが)プリン−ピリミジン・ミスマッチ(例えば、G−U、C−A)およびプリン−プリンもしくはピリミジン−ピリミジン・ミスマッチ(例えば、G−A、U−C)が挙げられる。 Examples of such mismatches (but not limited to) purine - pyrimidine mismatches (e.g., G-U, C-A) and purine - purine or pyrimidine - pyrimidine mismatches (e.g., G-A, U -C), and the like. これらの種類の修飾を導入することは、前述の修飾と組み合わせてもよく、それらが本発明の利点を損なうことなく機能性の他の属性(例えば、オフ・ターゲット効果)を変えるかどうかを決定するために、評価することができる。 Introducing these types of modifications may determine whether may be combined with the aforementioned modifications, they alter other attributes of functionality without detracting from the merits of the present invention (e.g., off-target effects) in order to, it can be evaluated.

いくつかの用途では、蛍光標識等の標識を使用することが求められる場合もある。 In some applications, also if it is desired to use a label such as a fluorescent label. 標識が蛍光である場合、蛍光標識はCy3(商標)、Cy5(商標)、またはAlexa色素(Molecular Probles,Eugene,OR)である。 Where the label is a fluorescent, fluorescent label is Cy3 (TM), Cy5 (TM), or Alexa dyes (Molecular Probles, Eugene, OR) . これらの標識は、好ましくは、センス鎖の5'末端に加えられ、より好ましくは5'末端センス・ヌクレオチドに加えられる。 These labels are preferably 'added to the end, more preferably 5' 5 of the sense strand are added to the terminal sense nucleotide. これらは、形質移入細胞等の中の標識siRNAの分布をユーザが視覚化することを可能とさせて、ある一定の形質移入の成功を評価することを可能とする。 These by it possible to visualize the user distribution of the labeled siRNA in such transfected cells, makes it possible to evaluate the success lies in certain transfection. 標識ヌクレオチドの使用は、当業者に周知であり、蛍光標識以外の標識として、例えば質量または放射活性標識を、そのような標識が有益であると考えられる用途で、用いることが可能である。 The use of labeled nucleotides is well known to those skilled in the art, as a label other than a fluorescent label, for example, mass or radioactive labels, in applications where such labels would be beneficial, it is possible to use.

蛍光修飾(fluorescent modification)は、非形質移入細胞から形質移入細胞を分離するために用いることができる。 Fluorescence-modified (fluorescent modification) can be used from the non-transfected cells to isolate transfected cells. 具体的には、第11の実施形態の分子を細胞集団に対して形質移入した後、FAGSによってソートすることで、形質移入された細胞を非形質移入細胞から分離する。 Specifically, after transfection of the molecules of the eleventh embodiment with respect to the cell population, by sorting by fags, separating the transfected cells from untransfected cells. このことによって、より純度の高い集団(混合したものよりも)を得ることができ、その後、遺伝子サイレンシングによって得られる表現型を明確に同定する能力が改善される。 This allows the higher purity populations (than a mixture) can be obtained, then, it improves the ability to clearly identify the phenotype obtained by gene silencing.

第11の実施形態の分子は、種々の用途を持ち、例えばその分子を形質移入コントロール試薬または安定的サイレンシング試薬として用いることが可能である。 Molecules of the eleventh embodiment has a variety of applications, it is possible for example to use the molecule as a transfection control reagents or stable silencing reagents. これらの分子が標識を含む場合、該分子を細胞へ形質移入することで、細胞のどの分画に成功裏に形質移入がなされたかをユーザーが視覚化および判断することを可能とする。 When these molecules contain labels, by transfecting the molecule into a cell, whether transfection successfully to any fraction of cells has been made the user makes it possible to visualize and determine. また、これらの修飾は、siRNA機能をこれといって変えないことから、第11の実施形態の分子は、同時に形質移入制御およびサイレンシング試薬となることができる。 Further, these modifications, the siRNA function since it does not alter say this, molecules of the eleventh embodiment may be a transfection control and silencing reagents simultaneously. さらに、使用しうる配列に対して上記修飾が制限を加えるものではないことから、該修飾を多様なsiRNAおよびRNAi用途で使用することができ、また標的配列依存的ではない。 Furthermore, since not to the modification imposes limits on the sequence that can be used, it is possible to use the said modification in a variety of siRNA and RNAi applications and are not target sequence dependent.

したがって、上記第11の実施形態の分子は、その独特な修飾セットを持つことから、機能性を変えることなく、安定性および「トラックアビリティ(trackability)」を提供する。 Thus, the molecules of the eleventh embodiment, since it has the unique modifications set, without changing the functionality, to provide stability and "Track Ability (trackability)." それらの分子を、形質移入された細胞の純粋集団を単離することにも用いることができる。 Their molecular, pure populations of cells that have been transfected can be used in isolation. もし2'−O−アルキル基をアンチセンス鎖の最初の2つまたは最初の3つのヌクレオチドに加えると、オフ・ターゲット効果を減少させる付加的な利益を実現することができる。 If the 2'-O- group when added to the first two or first three nucleotides of the antisense strand, it is possible to realize additional benefits of reducing the off-target effects. さらに、2'−O−アルキル基をセンス鎖の最初の2つまたは3つのヌクレオチドに加えると、それらがセンス鎖オフ・ターゲット効果を減少させる付加的な利益を持つことができる。 Furthermore, the addition of 2'-O- alkyl group in the first two or three nucleotides of the sense strand, they can have the additional benefit of reducing sense strand off-target effects.

第12の実施形態によれば、本発明はセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される別のsiRNAを提供する。 According to the twelfth embodiment, the present invention provides a different siRNA composed of a sense strand and an antisense strand. このセンス鎖は、第11の実施形態のセンス鎖のパラメータと同様のパラメータに基づいて決定され、該パラメータとして第1および第2の5'末端センス・ヌクレオチドの2'炭素修飾、好ましくは2'−O−アルキル修飾と、ピリミジンの少なくとも1つの2'炭素修飾、好ましくは2'−O−アルキル修飾とが挙げられる。 The sense strand is determined based on the 11 same parameters as parameters of the sense strand of embodiments, the carbon modified 'second terminal sense nucleotide' first and second 5 as the parameter, preferably 2 ' and -O- alkyl modification, at least one 2 'carbon modification of pyrimidines, preferably include a 2'-O- alkyl modification. しかし、アンチセンス鎖に対する上記修飾の代わりに、第12の実施形態のアンチセンスは、第1および第2、あるいは第1、第2,および第3の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、該ヌクレオチドの各々が2'−O−アルキル修飾を持つ。 However, instead of the above modifications to the antisense strand, the antisense of the twelfth embodiment, the first and second or the first, is composed of a second, and a third 5 'terminal antisense nucleotide, each of said nucleotides has a 2'-O- alkyl modification. さらに、第1および第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド以外に、アンチセンス鎖上に、少なくとも1つの2'−O−アルキル修飾ピリミジンが存在する。 Furthermore, in addition to the first and second 5 'terminal antisense nucleotide, on the antisense strand, at least one 2'-O- alkyl modified pyrimidines are present. さらにまた、好ましくは、2'Fl修飾が存在せず、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化が存在しない。 Furthermore, preferably, there is no 2'Fl modifications, not phosphorylation of the first 5 'terminal antisense nucleotide is present. リン酸化の欠如は、対応する機能的ポリヌクレオチドと比較して、限定された機能性の分子を与える。 The lack of phosphorylation, as compared to the corresponding functional polynucleotide, gives the molecules of limited functionality. 上記説明に対する別のバリエーションとして、第12の実施形態の分子は、上記の属性全てに加えて、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に5'ブロック基を含む。 As another variation to the above description, molecules of the twelfth embodiment includes, in addition to all of the above attributes, the sense strand, the antisense strand or sense strand and both 5 'blocking group of the antisense strand. そのようなブロック基は、さらに、この分子がリン酸化されてR IS Cに入ることを除外するもので、5'−アルキル、5'−O−アルキル、アジド(N )、アミン類、および他の部分からなる。 Such blocking groups further exclude that this molecule enters the phosphorylated R IS C, 5'alkyl, 5'-O-alkyl, azido (N 3), amines, and consisting of the other part.

サイズ、オーバーハング、および他の修飾に関する他の好ましいパラメータは、第11の実施形態に対するものと同じである。 Size, another preferable parameter relating overhangs, and other modifications are the same as for the eleventh embodiment. しかし、これらの組成物が遺伝子のサイレンシングに用いられないことから、それらは長さが16〜28塩基対とすることができ、好ましくは18〜30塩基対長であると考えられる。 However, because these compositions are not used to silencing of genes, they can be that the 16 to 28 base pairs in length, is considered to be preferably 18 to 30 base pairs in length.

第12の実施形態の分子は、形質移入制御に加えて、潜在的な「フィルター(filter)」またはエクサエクオ剤として作用することも可能であり、これは用量実験で、またはマイクロアッセイ研究の負の対照として、特に有用である。 Molecules of the twelfth embodiment, in addition to transfection control, it is also possible to act as a potential "filter (filter)" or Ekusaekuo agent, which is a dose experiment or negative micro assay studies, as a control, it is particularly useful. 多くの実験が、異なる濃度(例えば、100nM、50nM、25nM、および1nM)での所定のsiRNAの効果を試験する。 Many experiments, different concentrations (e.g., 100 nM, 50 nM, 25 nM, and 1 nM) to test the effect of a given siRNA in. 必要に応じて、形質移入実験を実施した場合、異なる核酸レベルでの形質移入の結果として生ずるいかなる例外も回避するために、一定濃度の「全siRNA(total siRNA)」を持つことが望まれる。 If necessary, when carrying out the transfection experiments, in order to avoid any exception resulting from the transfection with different nucleic acid level, it is desirable to have a "total siRNA (total siRNA)" constant concentration. 残念なことに、任意の未修飾対照siRNA(例えば、非特異的対照)を加えることは、RISCとの相互作用にする研究のもとで、siRNAと競争する潜在的な下落傾向を有する。 Unfortunately, any unmodified control siRNA (e.g., non-specific control) the addition of has a potential downside to compete under the research on the interaction with RISC, and siRNA. 第12の実施形態の分子は、この問題を軽減する。 Molecules of the twelfth embodiment, to alleviate this problem. 両方のセンスおよびアンチセンス鎖の1および2位(または1、2、および3位)上の2'−O−メチル修飾の追加は、リン酸化5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがない場合、それは、RISCとの相互作用に対するこの分子の能力を制限する。 Both the sense and 1 and 2 of the antisense strand (or 1, 2, and 3) additional 2'-O- methyl modifications on if there are no phosphorylated 5 'terminal antisense nucleotide, it It limits the ability of this molecule to interaction with the RISC. したがって、この分子は形質移入することができるが、RISCに関して他のsiRNAと競争することはできない。 Therefore, this molecule can be transfected, can not compete with other siRNA respect RISC. 第11の実施形態の分子の場合と同様に、ピリミジン(CおよびU)に対する2'−O−メチル基の付加は、ヌクレアーゼ消化の可能性を最小限にする。 As with the molecules of the eleventh embodiment, 2'-O-addition of a methyl group to the pyrimidine (C and U) minimizes the likelihood of nuclease digestion.

第12の実施形態の分子は、他の「非特異的(non−specific)配列または対照群とは異なり、RISCと十分な相互作用をおこなうことはない。このように、これらの分子は限られたオフ・ターゲット化副作用のみを生ずるはずなので、RISC上の部位を争うことのないトラッカブルである能力を有する。 Molecules of the twelfth embodiment differs from the other "non-specific (non-specific) sequence or control group, does not provide adequate interaction with RISC. Thus, these molecules are limited since such should result only off-targeting side effects, has the ability is Torakkaburu without competing for sites on RISC.

上記した実施形態(第11および第12の両方)を、隣接したセンスおよびアンチセンス鎖(すなわち、2本の別々の鎖)を持たない iRNA、さらにはヘアピンを形成することができる単分子siRNA(shRNA)に適用することが可能ある。 Above-described embodiment (both the first 11 and second 12), adjacent sense and antisense strand (i.e., two separate strands) no s iRNA, unimolecular siRNA capable further forms a hairpin there can be applied to (shRNA). 用語「siRNA」として、両方のタイプのRNAが挙げられる。 The term "siRNA" includes both types of RNA. 例えば、ヘアピンは、ループ構造(好ましくは4〜10塩基対を含み得る)と、センス領域とを含み、センス領域とアンチセンス領域とが個々に19〜23塩基対長であり、実質的に互いに相補的である。 For example, hairpin loop structure (preferably may include 4-10 base pairs), and a sense region, the sense region and the antisense region are individually 19-23 base pairs in length, substantially mutually it is complementary. ループ構造の好ましい配列が、例えば、5'−UUCG(配列番号319)、5'−UUUGUGUAG(配列番号320)、および5'−CUUCCUGUCA(配列番号321)である。 Preferred sequences of the loop structure, for example, 5'-UUCG (SEQ ID NO: 319), 5'-UUUGUGUAG (SEQ ID NO: 320), and 5'-CUUCCUGUCA (SEQ ID NO: 321).

ヘアピンは、アンチセンス領域の下流にあるループ流域とともに望ましくは構築される。 Hairpins, preferably together with the loop basin downstream of the antisense region is constructed. この構成は、第11の実施形態にとっては特に望ましい。 This configuration is particularly desirable for the eleventh embodiment. なぜならば、末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化するのがより容易であるからである。 This is because, the terminal antisense nucleotide is to phosphorylation is because it is easier. このように、単分子siRNAsを設計する際、オーバーハングが5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの上流にないことが好ましい。 Thus, when designing the unimolecular siRNAs, it is preferable overhang is not upstream of 5 'terminal antisense nucleotide.

本発明にもとづいて、単分子siRNA、特に左回りの(left−handed)単分子構造(例えば、5'−AS−Loop−S)を設計する場合、好ましくは、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補的である塩基から数えて(すなわち、センス領域の3'末端から数えて)、センス領域の第18、第19、または第20の塩基であるヌクレオチドとして定義される。 In accordance with the present invention, a monomolecular siRNA, particularly the counterclockwise (left-handed) unimolecular structure (e.g., 5'-AS-Loop-S) When designing, preferably, the first 5 'terminal sense nucleotides, 'counting from the base that is complementary to the terminal antisense nucleotide (i.e., 3 of the sense region' first 5 counting from the end), 18th, 19th sense region or the 20, it is defined as a base nucleotides. 第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、このように定義される。 The first 5 'terminal sense nucleotide is defined in this manner. なぜなら、ヘアピンを形成することができる単分子siRNAが細胞に入る場合、ダイサー(Dicer)が、2本の異なる鎖(siRNA)から構成されるヘアピンsiRNAを約18〜20塩基対から構成されるヘアピンsiRNA分子に処理し、これらの分子がこの処理された分子の末端にセンス鎖修飾を持つことが要求されるからである。 This is because, if the unimolecular siRNA capable of forming a hairpin to enter the cells, and Dicer (Dicer) is a composed hairpin siRNA of about 18-20 base pairs from two separate strands (siRNA) hairpins processed siRNA molecules, these molecules is because it is required to have a sense strand modified at the end of this processed molecule. 最も好ましくは、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、センス領域の3'末端からセンス領域の19番目の塩基であるヌクレオチドとして定義される。 Most preferably, the first 5 'terminal sense nucleotide, 3 of the sense region' is defined as the 19 th bases in a nucleotide of the sense region from the end. さらに、好ましくは、ポリヌクレオチドは、左回りのヘアピンを形成することができる。 Still preferably, the polynucleotide can form a left-handed hairpin.

shRNAは、さらに、ステム領域を含むことができ、該ステム領域は、ループ構造の第5'末端および第3'末端に直接隣接した1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み、さらに該ステム領域の1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが標的特異的もしくは非標的特異的である。 shRNA can further comprise a stem region, the stem region comprises one or more nucleotides or modified nucleotides immediately adjacent to the 5 'end and a 3' end of the loop structure, further of the stem region one or more nucleotides or modified nucleotides are target-specific or non-target-specific. 好ましくは、その単分子siRNAの全長は、100塩基対未満であり、より好ましくは85塩基対未満である。 Preferably, the entire length of the unimolecular siRNA is less than 100 base pairs, more preferably less than 85 base pairs.

本発明の単分子siRNAは、最終的には細胞の機能(cellular machinery )によって2本の異なる鎖に変換されるように処理される。 Unimolecular siRNA of the present invention may ultimately be processed as converted to different strands of two by the function of the cells (cellular machinery). あるいは、この分子をRNAi経路の1つ以上のステップ(例えば、ダイサーによる処理)にかけ、RISCに単分子状ヘアピン分子として入れることも可能である。 Alternatively, one or more steps of the molecule RNAi pathway (e.g., processing by Dicer) subjected to, it is also possible to add a single molecular hairpin molecule RISC. さらに、これらの単分子siRNAを、全ての修飾よりも少ないもので細胞に導入してもよく、また導入された天然のプロセスまたはプロセッシング用分子を用いて、細胞自体の中で修飾することも可能である(例えば、第11の実施形態に関して、天然キナーゼによる細胞内でのリン酸化)。 Further, these unimolecular siRNA, all may be introduced into cells in those less than modification, and using the introduced natural processes or processing molecule it was, also be modified in the cells themselves it is (e.g., with respect to the eleventh embodiment, phosphorylation in the cell by native kinases). しかし、好ましくは、上記ポリヌクレオチドに対して、既に存在している全ての修飾が導入される(同様に、siRNAが2つの異なる鎖から構成される場合、好ましくは、それらの鎖が、細胞に導入された場合に全ての修飾を含む。アンチセンス鎖が、例えば、導入後にリン酸化の基によって修飾されるにもかかわらず)。 However, preferably, with respect to said polynucleotide, already all modifications are introduced which are present (as when siRNA is comprised of two different chains, preferably, their chains, the cell . antisense strand comprising all modifications when introduced, for example, obtained is modified by a group of phosphorylated after introduction Runimokakawarazu).

上記実施形態(第11および第12)が安定性増加を目的としているにもかかわらず、それらのタイプまたは他のタイプの修飾が他のパラメータ、例えば特異性に対しても影響を及ぼすという点に注意することが重要である。 Above embodiments Despite (11th and 12th) are intended to increase stability, their type or other type of modification of the other parameters, in that for example also affect relative specificity Note it is important to.

さらに、これらの安定性および機能性修飾を組み合わせてもよい(例えば、少なくとも1つのセンス・ピリミジンを持つ追加の2'炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾)と、2'炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾)を持つ第1の2(または3)以外の好ましくは全てのセンス・ピリミジンと、2'炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾)を持つ第1の2(または3)以外の、少なくとも1つの、好ましくは全ての、アンチセンス・ピリミジンの2'Fl修飾と、5'アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化とを併用した、第1および第2の(または第1、第2、および第3の)5'末端センスおよびアンチセンス・ヌクレオチド2'炭素修飾(好ましくは、−O−メチル修飾))。 Furthermore, even if a combination of these stability and functionality modifications may (e.g., additional 2'carbon modified (preferably, a -O- methyl modified), 2 'having at least one sense pyrimidine carbon modifications (preferably It comprises a first 2 (or 3) other than preferably all sense pyrimidine with -O- methyl modified), 2 'carbon modifications (preferably, the first 2 with -O- methyl modified) ( or 3) than at least one, preferably all, the 2'Fl modified antisense pyrimidine, 5 'was used together with phosphorylation of antisense nucleotide, first and second (or first , second, and third) 5 'terminal sense and antisense nucleotide 2' carbon modifications (preferably, -O- methyl modified)). さらに、本発明の上記修飾は、無作為に選択される、または、例えば、米国特許出願第10/714,333号に記載されているような論理的設計に基づいて、選択された配列を含むsiRNAと組み合わせてもよい。 Furthermore, the modification of the present invention are selected randomly, or, for example, based on the logical design as described in U.S. Patent Application No. 10 / 714,333, including the selected sequence it may be combined with siRNA.

リン酸主鎖に対する安定化修飾は、本発明のいくつかの用途のためにポリヌクレオチド内に含めることが可能である。 Stabilizing modifications to the phosphate backbone may be included in the polynucleotides for some applications of the present invention. 例えば、少なくとも1つのホスホロチオエートおよび/またはメチルホスホネートを、オリゴヌクレオチド主鎖のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖にある、同様に存在しうる任意のオーバーハング、ループ構造、またはステム構造にある、任意の、または全てのピリミジンのいくつかの、または全ての3'位にあるリン酸基と置換してもよい。 For example, at least one phosphorothioate and / or methylphosphonate, in the sense strand and / or antisense strand of the oligonucleotide backbone, as well as any overhangs that may be present, in loop structures or stem structures, any , or some of all of the pyrimidines, or may be replaced with a phosphate group in all of the 3 'position. ホスホロチオエート(およびメチルホスホネート)類似体は、オリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基の修飾から生ずる。 Phosphorothioate (and methylphosphonate) analogues arise from modification of the phosphate group of the oligonucleotide backbone. ホスホロチオエート内では、リン酸塩Oが硫黄原子に置き換わる。 Within phosphorothioate, the phosphate O is replaced by a sulfur atom. メチルホスホネートでは、酸素がメチル基によって置き換わる。 In methylphosphonates, the oxygen is replaced by a methyl group. 一実施形態では、ホスホロチオエート修飾またはメチルホスホネートは、2'フッ素(または他のハロゲン)修飾ヌクレオチドも含む全てのアンチセンス鎖ヌクレオチドの3'位に置かれている。 In one embodiment, a phosphorothioate modification or methylphosphonate is 2 are placed in position 'fluorine (or other halogen) 3 of all antisense strand nucleotides that also includes modified nucleotides'. さらに、ホスホロチオエート3'修飾を、2'フッ素置換の代わりに、および独立して用い、siRNA分子の安定性を高めることが可能である。 Furthermore, 'a modification, 2' phosphorothioate 3 instead of the fluorine-substituted, and independently used, it is possible to increase the stability of the siRNA molecule. これらの修飾は、siRNA用途において、本明細書に記載された他の修飾と併用して、あるいはそれらの修飾とは別個に、用いることが可能である。 These modifications, in siRNA applications, in combination with other modifications described herein, or separately from the modifications thereof, can be used.

ヌクレアーゼは、一般に、リン酸塩部分およびリボース環の2'OH位にある酸素基の両方を用いてRNAに対する攻撃を媒介する。 Nuclease generally to mediate attack on RNA using both oxygen radicals in the 2'OH-position of the phosphate moiety and the ribose ring. 複数の酸素の1つに対する硫黄基の置換によって、この反応に参加するリン酸塩の能力が取り除かれ、ヌクレアーゼ消化に対するこの部位の感度が制限される。 By the substitution of a sulfur group for one of a plurality of oxygen, the ability of the phosphate to participate in this reaction is removed, the sensitivity of this site to nuclease digestion is limited. しかし、ホスホロチオエートが典型的に有毒な点に留意する必要があることから、いかなる毒作用も否定される場合に主に有益であり、例えば、他のヌクレオチド毎、第3のヌクレオチド毎、または第4のヌくレオチド毎にこの修飾を用いることを制限することによって、達成しうると考えることができる。 However, since the phosphorothioate is typically needs to be noted toxic respects, it is primarily beneficial when any toxic effects are negated, for example, every other nucleotide, every third nucleotide, or fourth by each of the nucleotides to limit the use of this modification, it can be considered that can be achieved.

第12の実施形態の分子は、限定された機能のものではあるが、上記したように、負の対照研究で使用可能であり、またエクサエクオ剤として用いることができる。 Molecules of the twelfth embodiment, albeit intended limited function, as described above, may be used in negative control studies, also it can be used as Ekusaekuo agent. 複数の分子に関連する上記修飾セットは、該分子を、siRNAのアンチセンス鎖の5'末端に対して必須のリン酸基を付加する細胞内キナーゼにとって劣った基質とする。 The modified set associated with a plurality of molecules, a molecule, a poor substrate for intracellular kinase for adding the requisite phosphate group to the 5 'end of the antisense strand of the siRNA. 修飾がリン酸化を著しく阻害する一方で、これらの修飾を担持する分子のいくつかの小分画が、いまだに5'アンチセンス位置のC5でリン酸化を受けて小量のサイレンシングを生成することも考えられる。 Modifications While significantly inhibited phosphorylation, some small fraction of molecules carrying these modifications, to produce a small amount of silencing undergo phosphorylation at C5 of still 5 'antisense position It may be considered. そのような場合、それらの分子のセンスおよび/またはアンチセンス鎖の5'末端の5'炭素位を、キナーゼリン酸化を防ぐブロック基によって、修飾することが求められる可能性がある。 In such a case, the carbon position 5 'end 5' sense and / or antisense strand of these molecules, the blocking groups to prevent kinase phosphorylation, it may be required to modify. ブロック基は、例えば、末端ヌクレシドの5'炭素位のリン酸化を防ぐ任意の基であってもよく、限定されるものではないが、5'−アルキル、5'−O−メチル、および5'−アミン基が挙げられる。 Blocking groups, for example, 5 end Nukureshido 'may be any group which prevents the phosphorylation of carbon position, but are not limited to, 5'-alkyl, 5'-O-methyl, and 5' - it includes an amine group.

対照またはエクサエクオ剤の別の例は、以下の2'炭素修飾のみを含む。 Another example of a control or Ekusaekuo agent comprises only the following 2 'carbon modification. すなわち、(i)各々が2'修飾、例えば上記した2'修飾(例として、2'−O−メチル修飾)を含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5'末端センス・ヌクレオチドと、(ii)各々が2'修飾、例えば上記した2'修飾(例として、2'−O−メチル修飾)を含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとを含み、ならびに5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがリン酸化されていない。 That, (i) each 2 'modification, e.g., 2 to the' (as an example, 2'-O-methyl modifications) modified first and second containing or first, second, and third 5 ' and terminal sense nucleotide, (ii) each 2 'modification, e.g., 2 to the' (as an example, 2'-O-methyl modifications) modified first and second containing or first, second, and third 3 of 5 'and a terminal antisense nucleotide, and 5' terminal antisense nucleotide is not phosphorylated.

本発明のポリヌクレオチドは、現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法が、本発明の分子を合成する上で有用である。 The polynucleotide of the present invention, a method will be now-known are, or now known, the further any method as those skilled in the art to be useful in connection with the present invention issues conclusions upon reading this disclosure, the present invention it is a molecule useful in the synthesis. 特定の修飾を含むsiRNA二本鎖は、Scaringe,S. SiRNA duplexes containing the specified modifications, Scaringe, S. A. A. (2000)”Advanced 5'−silyl−2'−orthoeter approach to RNA oligonucleotide synthesis,”Methods Enzymol. (2000) "Advanced 5'-silyl-2'-orthoeter approach to RNA oligonucleotide synthesis," Methods Enzymol. 317,3−18;Scaringe,S. 317,3-18; Scaringe, S. A. A. (2001)”RNA oligonucleotide synthesis via 5'−silyl−2'− orthoeter chemistry,”Methods 23,206−217;Scaringe,S. (2001) "RNA oligonucleotide synthesis via 5'-silyl-2'- orthoeter chemistry," Methods 23,206-217; Scaringe, S. and Caruthers,M. and Caruthers, M. H. H. (1999)米国特許第5,889,136号;Scaringe,S. (1999) U.S. Pat. No. 5,889,136; Scaringe, S. and Caruthers,M. and Caruthers, M. H. H. (1999)米国特許第6,008,400号;Scaringe,S. (1999) U.S. Pat. No. 6,008,400; Scaringe, S. (2000)米国特許第6111086号;Scaringe,S. (2000) U.S. Pat. No. 6111086; Scaringe, S. (2003)米国特許第6,590,093号に記載されている事項および方法を用いて、化学的に合成することが可能である。 (2003) US using matter and methods described in Patent No. 6,590,093, it is possible to chemically synthesized. 上記合成方法は、ヌクレオシド塩基保護5'−O−シリル−2'−O−オルトエステル−3'−O−ホスホラミダイトを用いて、3'から5'方向に固体担体上に所望の未修飾siRNA配列をアセンブルする。 The above synthesis method using a nucleoside base protecting 5'-O- silyl -2'-O-orthoester-3'-O-phosphoramidite, the desired unmodified siRNA sequence on a solid support in the 3 'to 5' direction the assemble. 手短に言うと、必須のホスホラミダイトの合成は、標準塩基保護リボヌクレオシド(ウリジン、N −アセルエチジン、N −イソブチリルグアノシン、およびN −イソブチリルアデノシン)から始まる。 Briefly, the synthesis of the required phosphoramidites, standard base-protected ribonucleosides (uridine, N 4 - Aseruechijin, N 2 - isobutyryl guanosine, and N 6 - isobutyryl adenosine) starts from. 5'−O−シリルおよび2'−O−オルトエステル保護基の導入、ならびに反応性3'−O−ホスホラミダイト部分が次に4つのステップによって達成される。 5'-O- silyl and 2'-O- orthoester introduction of protecting groups as well as reactive 3'-O- phosphoramidite moiety is achieved by then four steps. すなわち、 That is,
1. 1. Markiewicz試薬によるヌクレオシド糖の5'−および3'−ヒドロキシル基の同時かつ一時的なブロッキング(1,3−ジクロロ−1,1,3,3,−テトライソプロピルジシロキサン[TIPS−Cl ]含有ピリジン溶液{Markiewicz,W.T.(1979)(1979)”Tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl,a Group for Simultaneous Protection of 3'− and 5'−Hydroxy Functions of Nucleoside ,”J.Chem.Research(S),24−25}をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製; Simultaneous and temporary blocking of the 5'- and 3'-hydroxyl groups of the nucleoside sugar by Markiewicz reagent (1,3-dichloro -1,1,3,3, - tetraisopropyldisiloxane [TIPS-Cl 2] containing pyridine The solution {Markiewicz, W.T. (1979) (1979) "Tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl, a Group for Simultaneous Protection of 3'- and 5'-Hydroxy Functions of Nucleoside," J.Chem.Research (S) after subjected to 24-25}, purification by chromatography;
2. 2. 触媒としてピリジニウムp−トルエンスルホネートを用いてトリス(アセトキシエチル)−オルトフォルメート含有ジクロロメタンを用い、TIPS−ヌクレオシド糖の2'−ヒドロキシルをビス(アセトキシエチル)オルトエステル[ACE誘導体]に位置特異的変換した後、クロマトグラフィーによる精製; Tris using pyridinium p- toluenesulfonate as catalyst (acetoxyethyl) - with orthoformate in dichloromethane, TIPS-nucleoside sugar of the 2'-hydroxyl with bis (acetoxyethyl) orthoester regiospecific converted to [ACE derivative] after purification by chromatography;
3. 3. フッ化水素およびN,N,N”N'−テトラメチルエチレンジアミン含有アセトニトリルを用いてTIP保護基の特異的除去によるヌクレオシド糖の5'−および3'−ヒドロキシル基の放出をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製; After performing the hydrogen fluoride and N, N, N "N'-tetramethylethylenediamine containing with acetonitrile nucleoside sugar by specific removal of TIP protecting group 5'- and 3'-hydroxyl group release, chromatography purification by;
4. 4. ベンズヒドロキシル−ビス(トリメチルシリロキシル)クロリド[BzH−Cl]含有ジクロロメタンを用いて5'−O−シリルエタノールとして5'−ヒドロキシルの保護を行った後、クロマトグラフィーによる精製;ならびに5. Benz hydroxyl - After bis protection (trimethyl silicon ii cyclohexyl) chloride [BzH-Cl] as 5'-O- silyl ethanol with dichloromethane containing 5'-hydroxyl, purification by chromatography; and 5. ビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)メトキシホスフィンおよび5−メチルチオ−1H−テトラゾール含有ジクロロメタン/アセトニトリルを用いて3'−O−ホスホラミダイトへの変換を行った後、クロマトグラフィーによる精製。 Bis (N, N-diisopropylamino) after conversion to 3'-O- phosphoramidite with methoxy phosphine and 5-methylthio -1H- tetrazole in dichloromethane / acetonitrile, purified by chromatography.

ホスホラミダイト誘導体は、一般に厚く、無色から薄黄色のシロップでる。 Phosphoramidite derivatives are typically thick, Ru Oh syrup pale yellow from colorless. 自動RNA合成装置に適合させるために、生成物の各々を予め定めた量の無水アセトニトリルに溶解し、この溶液を適当な数の血清バイアルに等分にして加え、各バイアル内のホスホラミダイトが1.0mmole量とする。 In order to adapt the automatic RNA synthesizer, product were each dissolved in a predetermined amount of anhydrous acetonitrile, and added equally to the solution to the appropriate number of serum vials, phosphoramidite in each vial 1. and 0mmole amount. 次に、これらのバイアルを適当な真空デシケーターに置いて、高真空に一晩置くことで溶媒の除去をおこなう。 Next, place the vials in a suitable vacuum desiccator to remove the solvent by placing overnight high vacuum. 次に、雰囲気を乾燥アルゴンに置き換えて、バイアルをゴム製のセプタムでキャップし、密閉されたホスホラミダイトを、必要とする時まで−20℃に保存する。 Then, by replacing the atmosphere in dry argon, the vials were capped with rubber septa, a sealed phosphoramidite and stored in -20 ° C. until needed. 合成装置に投入する前に、各ホスホラミダイトを十分な無水アセトニトリルで溶解して所望の濃度にする。 Before turning to the synthesizer, to the desired concentration by dissolving the phosphoramidite with sufficient anhydrous acetonitrile.

所望のオリゴリボヌクレオチドの合成は、自動合成装置を使用して行われる。 Synthesis of the desired oligoribonucleotide is carried out using an automatic synthesizer. それは、3'−ヒドロキシルを介して固体ビーズ状ポリスチレン担体に、切断可能な連結を介して、3'−末端ヌクレオシドの共有結合から始まる。 It solid beaded polystyrene support via the 3'-hydroxyl via a cleavable linking begins covalent attachment of 3'-end nucleoside. 所望の合成スケールにとって適当な量の担体を測定して反応用カートリッジに入れ、それを次に合成装置に固定する。 By measuring the appropriate amount of carrier placed in the reaction for cartridge for the desired synthesis scale is fixed to the next synthesizer it. 結合したヌクレオシドを5'−O−ジメトキシトリチル部分で保護し、鎖アセンブリのための5'−ヒドロキシルを遊離させるために、その部分を無水酸(3%[v/v]ジクロロ酢酸含有ジクロロメタン)で除去する。 Bound nucleoside was protected with 5'-O- dimethoxytrityl moiety, to liberate the 5'-hydroxyl for chain assembly, the partial acid anhydride (3% [v / v] dichloroacetic acid in dichloromethane) in Remove.

アセンブルされる配列のそれ以降のヌクレオシドを、以下の一般的な反応からなる4ステップ・サイクルを用いて、固体担体上で成長する鎖に対して、順次加える。 The subsequent nucleoside assembled are arranged, using a four step cycle consisting of the general reaction below, with respect to the growing chain on the solid support are added sequentially.
1. 1. カップリング:適当なホスホラミダイトを5−エチルチオ−1H−テトラゾールで活性化させ、担体結合ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの遊離5'ヒドロキシルと反応させる。 Coupling: the appropriate phosphoramidite is activated with 5-ethylthio--1H- tetrazole, is reacted with the free 5 'hydroxyl of the support bound nucleoside or oligonucleotide. これら2種類の試薬の濃度の最適化とモル過剰、さらにはその反応時間が、一般にサイクルあたり98%を上回るカップリング収率が得られる。 These two concentrations of reagents optimization and molar excess, more is the reaction time, generally coupling yields in excess of 98% per cycle can be obtained.
2. 2. 酸化:カップリング・ステップで形成した分子間連結は、リン原子をそのP(III)[亜リン酸塩]酸化状態に残す。 Oxide: coupling between the molecules formed in the coupling step leaves the phosphorous atom in its P (III) [phosphite] oxidation state. 生物学的に関連した酸化状態は、P(V)[リン酸塩]である。 Biologically relevant oxidation state is P (V) [phosphate]. したがって、亜リン酸はtert−ブチルヒドロペルオキシド含有トルエン溶液を用いて、P(III)からP(V)に酸化する。 Therefore, phosphorous acid with tert- butyl hydroperoxide-containing toluene solution is oxidized from P (III) to P (V).
3. 3. キャッピング:小量の残留未反応5'−ヒドロキシル基は、欠失を含む配列の形成を防ぐために、以降の結合サイクルへの参加かがブロックされなければならない。 Capping: a small amount of residual unreacted 5'-hydroxyl groups, in order to prevent the formation of sequence comprising a deletion, or participation in subsequent coupling cycles must be blocked. このことは、過剰の無水酢酸と1−メチルイミダゾールとを含むアセトニトリルで担体を処置することによって達成され、酢酸エステルとして効率的に残留5'−ヒドロキシル基がブロックされる。 This is achieved by treating the support with acetonitrile containing an excess of acetic anhydride and 1-methylimidazole, efficiently residual 5'-hydroxyl groups are blocked as acetates.
4. 4. 脱シリル化:シリル保護された5'−ヒドロキシルは、次の共役反応の前に脱保護されなければならない。 Desilylated silyl-protected 5'-hydroxyl must be deprotected prior to the next coupling reaction. このことは、トリエチルアミン・トリヒドロゲンフルオリド含有N,N−ジメチホルムアミドによる処理を介して達成され、他の保護基(2'−O−ACE、N−アシル塩基保護基またはメチルホスホネート)が同時に取り除かれることなしに、素早く、かつ特異的に5'−ヒドロキシルを放出する。 This is triethylamine trihydrofluoride Gen fluoride containing N, is accomplished via treatment with N- dimethylcarbamoyl formamide, other protecting groups (2'-O-ACE, N- acyl basic protecting group or a methyl phosphonate) at the same time without removed, quickly, and to release the specific 5'-hydroxyl.

上記4つの反応ステップの間で、アセトニトリルによるいくつかの洗浄がある点に留意する必要があり、洗浄を用いることで、次の反応ステップに先立って過剰な試薬および溶媒が取り除かれる。 Among the above four reaction steps must be noted that there are several washing with acetonitrile, the use of the washing, excess reagent and solvent are removed prior to the next reaction step. 上記サイクルは、オリゴリボヌクレオチドの未修飾部分がアセンブルされるまでの必要な回数が繰り返される。 The above cycle is required times until the unmodified portion of the oligoribonucleotide is assembled is repeated. 上記合成方法は、例示のみであり、分子が作られる手段を限定するものとして構成されるものではない。 The above synthesis method is exemplary only and are not to be construed as limiting the means molecules are produced. siRNAを合成するために現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法も、用いることが可能である。 How would the currently known, or now known to synthesize siRNA, any method out conclusions and those skilled in the art to be useful in connection with the present invention by reading further this disclosure, it is used possible it is.

第11および第12の実施形態のいくつかの実施形態のsiRNAは、2つの修飾ヌクレオシド(例えば、2'−O−メチル誘導体)を各々の鎖の5'末端に含む。 siRNA of some embodiments of the eleventh and twelfth embodiment, two modified nucleosides (e.g., 2'-O-methyl derivatives) containing the 5 'end of each strand. これらの修飾ヌクレオシドで5'−O−シリル−2'−O−メチル−3'−O−ホスホラミダイト誘導体は、既に記載したものと同様の手順(上記ステップ4および5)を用いて調製され、塩基保護2'−O−メチルヌクレオシド(2'−O−メチル−ウリジン、2'−O−メチル−N −アセチルシチジン、2'−O−メチル−N −イソブチリルグアノシン、および2'−O−メチル−N −イソブチリルアデノシン)から開始される。 5'-O- silyl -2'-O-methyl-3'-O-phosphoramidite derivatives in these modified nucleosides are prepared using the same procedure (step 4 and 5) as previously described, a base protection 2'-O- methyl nucleoside (2'-O- methyl - uridine, 2'-O- methyl -N 4 - acetyl cytidine, 2'-O- methyl -N 2 - isobutyryl guanosine, and 2' O- methyl -N 6 - starting from isobutyryl adenosine). これらの修飾ヌクレオシドに2'−ヒドロキシルが存在しないことで、これらの化合物のACE保護の必要性がなくなる。 By these modified nucleosides have 2'-hydroxyl no need for ACE protection of these compounds is eliminated. このように、5'−O−シリルおよび反応性3'−O−ホスホラミダイト部分の誘導は、以下の2つのステップによって達成される。 Thus, 5'-O-silyl and induction of reactive 3'-O- phosphoramidite moiety is accomplished by the following two steps.

1. 1. ベンズヒドロシ−ビス(トリメチルシリルオキシ)シリルクロリド(BzH−Cl)含有N,N−ジメチルホルムアミドを用いて、5'−O−シリルエーテルとして5'−ヒドロキシルの保護をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製、および 2. Benzuhidoro key sheet - bis (trimethylsilyloxy) silyl chloride (BZH-Cl) containing N, using N- dimethylformamide, after subjected to protection of the 5'-hydroxyl as a 5'-O- silyl ether, purified by chromatography , and 2. ビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)メトキシホスフィンおよび5−エチルチオ−1H−テトラゾール含有ジクロロメタン/アセトニトリルを用いて3'−O−ホスホラミダイトの変換をおこなった後、クロマトグラフィーによる精製。 Bis (N, N-diisopropylamino) After performing the conversion of 3'-O- phosphoramidite with methoxy phosphine and 5-ethylthio--1H- tetrazole in dichloromethane / acetonitrile, purified by chromatography.

ホスホラミダイトの精製後パッケージングを、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された手順を用いて実施する。 The purified after packaging of the phosphoramidite is carried out using the previously described procedures for the standard nucleoside phosphoramidites. 同様に、2つの5'− O−シリル−2'−O−メチル ヌクレオシドのホスホラミダイト誘導体を介しておこなわれる該5'−O−シリル−2'−O−メチル ヌクレオシドの取り込みは、標準的なヌクレオシド ホスホラミダイトに介して既に記載された同一の4ステップ/サイクルを2回適用することによって、達成される。 Similarly, the 5'-O- silyl -2'-O-methyl nucleoside uptake takes place via two 5'O-silyl--2'-O-methyl nucleoside phosphoramidite derivative, standard nucleoside by applying two identical four-step / cycle already described through the phosphoramidite it is accomplished.

この発明の第11の実施形態のいくつかの実施形態のsi RNA二本鎖は、アンチセンス鎖の5'末端にリン酸塩部分を含む。 The 11 si RNA duplexes of certain embodiments of the embodiment of the present invention includes a phosphate moiety to the 5 'end of the antisense strand. このリン酸塩は、アンチセンス鎖に対する最終カップリングとして化学的に導入される。 This phosphate is introduced chemically as the final coupling to the antisense strand. 所望のホスホラミダイト誘導体(ビス(シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルアミノホスホラミダイト)は、要するに以下のようにして合成される。 Desired phosphoramidite derivative (bis (cyanoethyl) -N, N-diisopropylamino phosphoramidite) is short in the following synthesis. すなわち、三塩化リンを1当量のN,N−ジイソプロピルアミンを含む無水テトラヒドロフランで、過剰のトリエチルアミンの存在下で反応させる。 That is, phosphorus trichloride one equivalent of N, in anhydrous tetrahydrofuran containing N- diisopropylamine, are reacted in the presence of excess triethylamine. 次に、2当量の3−ヒドロキシプロピオニトリルを添加して完全に反応させる。 Then added 2 equivalents of 3-hydroxy-propionitrile complete reaction. 最後に、生成物をクロマトグラフィーによって精製する。 Finally, the product is purified by chromatography. ホスホラミダイトの精製後パッケージングは、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された手順を用いて実施される。 After purification packaging of the phosphoramidite is carried out using the previously described procedures for the standard nucleoside phosphoramidites. 同様に、アンチセンス鎖の5'末端でのホスホラミダイトの取り込みは、標準的なヌクレオシド・ホスホラミダイトについて既に記載された同一の4ステップ・サイクルを適用することによって、達成される。 Similarly, the phosphoramidite incorporation at the 5 'end of the antisense strand, by applying the same four-step cycle already described for the standard nucleoside phosphoramidite is achieved.

修飾かつ保護されたオリゴヌクレオチドは、鎖アセンブリーの最後で固体担体に連結したままである。 Modified and protected oligonucleotide remains attached to the solid support at the end of the chain assembly. 二段階の迅速な切断/脱保護手順を用いてメチルホスホネート保護基を取り除き、オリゴヌクレオチドを固体担体から切り離し、N−アシル塩基保護基を除去する。 Removing the methyl phosphonate protecting groups using quick disconnect / deprotection steps in two stages, detach the oligonucleotide from the solid support, removing the N- acyl basic protecting group. この手順がシアノエチル保護基をアンチセンス鎖上の5'−リン酸塩から取り除くという点に留意する必要がある。 This procedure is to be noted that removing the cyanoethyl protecting group from the 5'-phosphate on the antisense strand. さらに、この手順はACEオルトエステルからアシル機能性を取り除き、2'−O−ACE保護基をビス(2−ヒドロキシエチル)オルトエステルに変換する。 Furthermore, this procedure removes the acyl functionality from ACE orthoester, converting the 2'-O-ACE protecting group bis (2-hydroxyethyl) orthoester. この新規のオルトエステルは弱酸に対して著しく不安定であり、同様に親ACE基よりも親水性が高い。 This new orthoester is significantly unstable to weak acids, likewise more hydrophilic than the parent ACE group. 二段階の手順を以下に手短に示す。 The two-stage procedure briefly described below.
1. 1. 担体結合オリゴリボヌクレオチドを、二ナトリウム− 2−カルバモイル− 2−シアノエチレン−1,1−ジチオレートトリヒドレート含有N,N−ジメチルホルムアミドで処理する。 The carrier-bound oligoribonucleotide, disodium - 2-carbamoyl - 2-cyano-1,1-dithiolate trihydrate containing N, treated with N- dimethylformamide. この試薬は、素早くかつ能率的に、ヌクレオチド間リン酸連結からメチル保護基を取り除く。 This reagent rapidly and efficiently removes the methyl protecting groups from the nucleotide between phosphoric acid coupling. この際、固体担体からオリゴヌクレオチドを切り離すことはない。 At this time, not to detach the oligonucleotide from the solid support. 次に、担体を水で洗浄し、過剰のジチオレートを除去する。 Then, the carrier was washed with water to remove excess dithiolate.
2. 2. オリゴリボヌクレオチドを、室温で、40%(w/v)水溶性メチルアミンを用いて固体担体から切り離す。 The oligoribonucleotides, at room temperature, separated from the solid support with 40% (w / v) aqueous methylamine. 粗オリゴリボヌクレオチド含有メチルアミン溶液を次に55℃まで加熱して保護基をヌクレオシド塩基から取り除く。 Crude oligoribonucleotide containing methylamine solution was then heated to 55 ° C. The by removing the protecting group from the nucleoside bases. 粗オルトエステル保護オリゴヌクレオチドを以下の溶媒から真空中で得る。 The crude orthoester protecting oligonucleotides from the solvent obtained in vacuo.

2'−オルトエステルの除去は、合成プロセスの最終ステップである。 Removal of the 2'-orthoesters is the final step of the synthesis process. このことは、粗オリゴヌクレオチドを、 酸およびN,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液、pH3.8、55℃で、35分間にわたって処理することで達成される。 This crude oligonucleotide, acetic acid and N, N, N ', an aqueous solution of N'- tetramethylethylenediamine, at PH3.8,55 ° C., is achieved by treatment for 35 min. 完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、次に、エタノール沈殿によって脱塩し、さらに遠心によって単離する。 The fully deprotected oligonucleotides, then, by ethanol precipitation and desalting, further isolated by centrifugation.

また、ポリヌクレオチドの5'末端での蛍光標識の取り込みは、当業者にとって一般的であり、かつ周知の操作である。 The fluorescent label incorporation at the 5 'end of the polynucleotide is common for those skilled in the art and is a well known operation. 一般に、この取り込みを達成するために用いられる方法が2つあり、必要な材料はいくつかの市販元(例えば、Glen Research Inc.,Sterling,Virginia,USA;Molecular Probes Inc.,Eugene,Oregon,USA;TriLink BioTechnologies Inc.,San Diego,California,USA;およびその他)から入手可能である。 In general, there are two methods used to achieve this incorporation, necessary materials some commercial sources (e.g., Glen Research Inc., Sterling, Virginia, USA; Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA ; available from and others); TriLink BioTechnologies Inc., San Diego, California, USA. 第1の方法は、蛍光分子を利用するもので、該蛍光分子は、既に述べたヌクレオシドのホスホラミダイト誘導体に類似したホスホラミダイト部分で誘導体化された。 The first method is to use a fluorescent molecule, fluorescent molecule was derivatized with a phosphoramidite moiety similar to the already phosphoramidite derivatives of nucleosides described. そのような場合、この蛍光色素は、鎖アセンブリの最終サイクルで担体結合ポリヌクレオチドに追加される。 In such cases, the fluorescent dye is added to the support-bound polynucleotide in the final cycle of chain assembly. フルオロフォア修飾ポリヌクレオチドを次に、固体担体から切り離し、前述の標準的手順を用いて脱保護した。 The fluorophore-modified polynucleotide then cleaved from the solid support and deprotected using standard procedures described above. この方法を「直接標識(direct labeling)」と呼ぶ。 This method is referred to as a "direct labeling (direct labeling)". あるいは、上記第2の方法は、ホスホラミダイト部分により誘導体化されるリンカー分子を利用する。 Alternatively, the second method utilizes a linker molecule derivatized with a phosphoramidite moiety. その部分は、保護された反応性官能基(例えばアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、その他)を含む。 The portion comprises a protected reactive functional group (e.g. amino, sulfhydryl, carbonyl, carboxyl, etc.). このリンカー分子は、鎖アセンブリの最後のサイクルに、担体結合したポリヌクレオチドに追加される。 The linker molecule, in the last cycle of chain assembly, is added to the polynucleotide carrier-bound. リンカー修飾ポリヌクレオチドは、それから固体担体から切り離されて、上述の標準的な手順を使用して脱保護される。 Linker-modified polynucleotide is then disconnected from the solid support, are deprotected using standard procedures described above. リンカーの官能基も、標準的な脱保護手順を実施している間、またはそれ以降の基特異的処置を利用することによって脱保護される。 Functional groups of the linker are also deprotected by utilizing during or subsequent group-specific treatment, has implemented standard deprotection procedures. 粗リンカー修飾ポリヌクレオチドが次にフルオロフォア誘導体で反応を起こす。 Crude linker-modified polynucleotide causes the next reaction fluorophore derivative. 誘導体は、フルオロフォアの部位とリンカーの官能基との間で共有結合の形成をもたらす。 Derivatives results in the formation of a covalent bond between the sites and the linker functional groups of the fluorophore. この方法は「間接的標識化(indirect labeling)」と呼ばれている。 This method is referred to as "indirect labeling (indirect labeling)".

一旦合成されるならば、本発明のポリヌクレオチドを直ちに使用してもよく、あるいは将来の使用のために保存してもよい。 Once synthesized, may be used a polynucleotide of the present invention immediately, or may be stored for future use. 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを適当な緩衝液中に二本鎖として保存する。 Preferably, it saved as duplexes suitable buffer polynucleotides of the present invention. 多くの緩衝液がsiRNAを保存するのに適していることが当技術分野で知られている。 That many buffers are suitable for storing siRNA are known in the art. 例えば、緩衝液は100 M KC 、30mM HEPES−pH 7.5、および1mM MgC1 を含むものであってもよい。 For example, the buffer 100 m M KC l, 30mM HEPES -pH 7.5, and may include a 1 mM MgCl 2. 好ましくは、 本発明のsiRNAは、4℃で1年間そのような緩衝液中で保存された場合、その活性の30%〜100%を保持する。 Preferably, siRNA of the present invention, when stored for one year such buffer at 4 ° C., held for 30% to 100% of its activity. より好ましくは、そのような緩衝液に4℃で1年間保存した場合に、本発明のsiRNAが生物学的活性を80〜100%保持する。 More preferably, when it is stable for one year at 4 ℃ such buffer, siRNA of the present invention retains 80% to 100% of the biological activity. あるいは、上記組成物は、そのような緩衝液に−20℃で少なくとも1年以上保存することができる。 Alternatively, the composition can be stored such buffer over at least one year at -20 ° C.. 好ましくは、−20℃での1年以上の保存は、生物学的活性の50%未満の減少を生じる。 Preferably, storage of one year or more at -20 ° C. results in a reduction of less than 50% of the biological activity. 好ましくは、−20℃での保存による生物学的活性の減少が1年以上後に 20%未満である。 Preferably, the reduction in biological activity due to storage at -20 ° C. is less than 20% after more than one year. 最も好ましくは、−20℃での1年以上の保存による生物学的活性の減少が10%未満である。 Most preferably, the reduction in biological activity due to storage of one year or more at -20 ° C. is less than 10%.

使用前にsiRNAプールの安定性を確実にするために、それらが使用の準備が整うまで、−20℃で乾燥した状態に保つことが可能である。 For prior to use to ensure the stability of the siRNA pools until they ready for use, it is possible to keep drying at -20 ° C.. 使用前に、再懸濁しなければならないが、一旦再懸濁すると、例えば上述した緩衝液で、使用するまで−20℃に保たなければならない。 Before use, it must be resuspended, once resuspended, for example, in the above-described buffer solution, should be maintained at -20 ° C. until used. 上述した緩衝液を、使用前に、ほぼ4℃または室温で保存してもよい。 The above-mentioned buffer solution, prior to use, may be stored almost 4 ° C. or room temperature. 形質移入を実施する実効温度は、当業者によく知られており、例えば、室温が挙げられる。 The effective temperature at which the transfection are well known to those skilled in the art, for example, room temperature.

本発明を開発する際に、二種類以上の修飾を、安定性を増加させるために二本鎖に加えた。 In developing the present invention, two or more types of modifications were added to the duplex to increase stability. 出願人は、安定性を改善する際の手助けになる他の修飾との組合せが、将来、発見可能であることを理解している。 Applicants combination with other modifications will assist in improving stability, we have understood that the future, it is discoverable. その上、本発明の修飾は、他の目的のために所望である修飾と結合されることができた。 Moreover, modifications of the present invention could be combined with desired be modified for other purposes. 例えば、いくつかの例で、1つの修飾は、特定の1組の条件(例えば1種類のヌクレアーゼ)に対して、分子を安定化させることができ、その一方で第2の修飾が条件(例えばヌクレアーゼの異なるファミリー)の第2の組に対して分子を安定化させることができる。 For example, in some instances, one modification, a particular set of conditions for (e.g. one nuclease), molecules can be stabilized, while the second modification conditions (e.g. molecules can be stabilized with respect to the second set of different families) nuclease. あるいは、2つの別々の修飾が、ある種の条件セットの方へ分子を安定させるために、相加的にまたは相乗的に作用することができた。 Alternatively, two separate modifications, in order to stabilize the molecule towards certain set of conditions, it was possible to act additively or synergistically. さらに他の例において、1つの修飾は、分子を安定させることができた、しかし、それは他の所望の性質(例えばsiRNAの効力または毒性)上、有害な結果を有する。 In still other instances, one modification could be made to stabilize the molecule, but it on other desired properties (e.g., siRNA potency or toxicity), has adverse consequences. これらのようなケースにおいて、分子の機能性のこれらの態様を修復する付加的な修飾を加えることができた。 In these cases like, it could be added additional modifications to repair these aspects of functionality of the molecule.

種々のアプローチを、安定性を強化するために必要とされる分子のタイプとキー・ポジションとを同定するのに用いることができる。 Various approaches, the type of molecules which are needed to enhance the stability and the key position can be used to identify. 1つの非限定的な実施例において、修飾−機能ウォークが実行される。 In one non-limiting example, modified - function walk is performed. この手順では、一つの種類の修飾が、センスおよび/またはアンチセンス鎖をまたがって1つ以上のヌクレオチドに対して加えられる。 In this procedure, one type of modification is added to one or more nucleotides across the sense and / or antisense strand. 実質的に、修飾および未修飾を、いくつかの方法の1つによって、(1)機能性および(2)安定性について試験した。 Substantially modified and unmodified, by one of several methods, and tested for (1) functionality and (2) stability. したがって、例えば、センスおよび/またはアンチセンス鎖の1および2位、3および4位、5および6位、7および8位、9および10位、11および12位、13および14位、15および16位、17よび18位、または18および19位に対して、2'−O−Me基を付加することができ、さらに機能性(例えば、特異的標的をサイレンシングするそれらの分子の能力)について試験し、作用(例えばヌクレアーゼによる)対して分子を安定化させる。 Thus, for example, the sense and / or 1 and 2 of the antisense strand, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10 positions, 11 and 12 positions, 13 and 14-position, 15 and 16 position, 17 spare position 18, or for 18 and 19 of, for can be added to 2'-O-Me group, further functionality (e.g., the ability of these molecules to silence specific targets) tested, (for example by nucleases) acts to stabilize the molecule against. 安定性を強化するキーポジションが同定されるが、二本鎖機能性の損失を招く場合、続いて修飾ウォークの第2のラウンドとなることで、二本鎖機能性を高めると思われるミスマッチまたは隆起が起こる付加的な化学基(例えば、アンチセンス鎖上の5'末端の5'リン酸塩)が、安定性を高める修飾を既に含む分子に付加される。 Although key position to enhance the stability is identified, it may lead to double-stranded functional loss, followed by a second round of modification walks, the mismatch is believed to enhance the duplex functional or additional chemical groups uplift occurs (e.g., phosphate '5 5' end on the antisense strand) is added to a molecule already containing a modification that enhance stability.

本発明の第13の実施形態は、siRNAに関するもので、該siRNAは、 Thirteenth embodiment of the present invention relates to siRNA, the siRNA is
(a)アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖は第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、その第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、 (A) an antisense strand, the antisense strand 'consists terminal antisense nucleotide, the first 5' first 5-terminal antisense nucleotide comprises a first 5 'terminal antisense nucleotides of 5 'is phosphorylated at carbon position, and the anti-sense strand,
(b)センス鎖であって、該センス鎖は第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の2'炭素センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドは第2の2'炭素センス修飾を含む、センス鎖と、を有する。 (B) a sense strand, wherein said sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide comprises a first 2 'comprises a carbon sense modification, said second 5' terminal sense nucleotide comprises a second 2 'carbon sense modification comprises a sense strand, the.

好ましくは、siRNAは、オーバーハングを除いて、18〜30塩基対、より好ましくは19〜25塩基対、最も好ましくは19〜23塩基対含む。 Preferably, siRNA, except overhangs, 18-30 bp, more preferably 19 to 25 base pairs, and most preferably from 19 to 23 base pairs. 好ましくは、上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、塩基対の範囲にわたって少なくとも実質的に相補的であり、より好ましくはこの範囲にわたって100%相補性を持つ。 Preferably, the sense strand and the antisense strand is at least substantially complementary over the range of base pairs, more preferably with 100% complementarity over this range. 好ましくは、ポリヌクレオチドがRNAである。 Preferably, the polynucleotide is RNA.

siRNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの5'または3'末端のいずれかにオーバーハングを有するものであってもよい。 siRNA may be one having an overhang on one of either the 5 'or 3' end of the sense strand or the antisense strand. しかし、好ましくは、任意のオーバーハングが存在する場合、該オーバーハングはセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端にある。 Preferably, however, if there are any overhangs, the overhang is at the 3 'end of the sense strand and / or antisense strand. さらに、好ましくは任意のオーバーハングが6以下の塩基長、より好ましくは2以下の塩基長である。 Additionally, preferably any overhangs are six or fewer bases in length, more preferably 2 or less bases in length. 最も好ましくは、オーバーハング無し、または3'末端でセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方にある2つの塩基のオーバーハングが存在する。 Most preferably, no overhang, or 3 'end overhang two bases present in either or both the sense and antisense strands with. オーバーハングしているヌクレオチドは、1種類以上の細胞内酵素プロセスまたはイベントによって頻繁に除去されることから、非リン酸化5'−ヌクレオチドが残り、アンチセンス鎖の5'末端上にオーバーハングを持たないことが好ましい。 Nucleotides, because it is frequently removed by one or more intracellular enzymatic processes or events, remains unphosphorylated 5'-nucleotides, have overhangs on the 5 'end of the antisense strand overhanging it is preferable not.

第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドのリン酸化は、ヌクレオチドの糖部分の5'炭素に付着した1つ以上のリン酸基の存在に言及するものである。 The first 5 'phosphorylation of the terminal antisense nucleotide, 5 of the sugar moiety of the nucleotides' is intended to refer to the presence of one or more phosphate groups attached to the carbon. 好ましくは、1つのリン酸基のみが存在する。 Preferably, only one phosphate group is present.

2'炭素修飾とは、ヌクレオチドの糖部分の2'炭素上にある修飾のことをいう。 'The carbon modification, 2 of the sugar moiety of the nucleotides' 2 refers to the modification that is on the carbon. 「第1の2'炭素センス修飾」とは、第1の5'末端センス・ヌクレオチド上にある修飾のことをいう。 'The term "carbon sense modification, first 5 first 2"' refers to modifications in the terminal sense nucleotide. 「第2の2'炭素センス修飾」とは、第2の5'末端センス・ヌクレオチド上にある修飾のことをいう。 'The term "carbon sense modification, the second 5 second 2' 'refers to the modification that is on the terminal sense nucleotide.

化学修飾のRNA−RNA、RNA−DNA、またはDNA DNA二本鎖に沿ったキーポジションへの追加がこれらの分子の化学的かつ機能的な特性を有意に変えることができることが、知られている。 Chemical modification of RNA-RNA, RNA-DNA or DNA, - that the addition to key positions along the DNA duplex can alter the chemical and functional properties of these molecules significantly, known there. 出願人は、修飾をsiRNAのセンス鎖に付加することで、該鎖がRISCに入るのを防ぎ、センス鎖特異的オフ・ターゲット効果を誘導することができることを、理解する。 Applicant modified by adding to the sense strand of siRNA, prevents the chain from entering the RISC, that can induce a sense strand-specific off-target effects, understanding. そのような修飾として、任意の数の化学部分を付加することが含まれる。 Such modifications include the addition of chemical moieties any number. 好ましくは、その部分はヌクレオチドのリボース環の2'位(すなわち、2'炭素)に付着される。 Preferably, the moiety 2 of the ribose ring of a nucleotide 'position (i.e., 2' carbon) is attached to. 本発明によれば、好ましくは、上記修飾が2'−O−アルキル基である。 According to the present invention, preferably, the modification is 2'-O- alkyl group. しかし、本発明の文脈のなかで使用された場合に、他の修飾がこの鎖によってオフ・ターゲット効果を最小限にする。 However, when used among the context of the present invention, other modifications to minimize off-target effects by this chain. そのような修飾がオフ・ターゲット効果を最小化する条件の下で含まれる場合、例えば、2'修飾ヌクレオチドを、2'ハロゲン修飾ヌクレオチド、2'アミン修飾ヌクレオチド、および2'アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択してもよい。 If such modifications are included under conditions to minimize off-target effects, for example, 'modified nucleotides, 2' 2 halogen modified nucleotide, 2 'amine modified nucleotide, and 2' the group consisting of alkyl modified nucleotide it may be selected from. 修飾がハロゲンの場合、このハロゲンは好ましくはフッ素である。 If modification is a halogen, the halogen is preferably fluorine. 2'修飾ヌクレオチドが2'アミン修飾ヌクレオチドである場合、アミンは好ましくは−NH である。 When 2 'modified nucleotide is 2' amine modified nucleotide, the amine is preferably -NH 2. この2'修飾ヌクレオチドが2'−アルキル修飾である場合、好ましくは、その修飾は2'メチル修飾であり、該メチル部分の炭素は糖部分の2'炭素に直接付着する。 'If the modified nucleotides are 2'-alkyl modification, preferably the modification is 2' The 2 methyl modification, the carbon of the methyl moiety is attached directly to the 2 'carbon of the sugar moiety.

上記したように、好ましくは、修飾は2'−O−アルキル基である。 As noted above, preferably the modification is a 2'-O- alkyl group. より好ましくは、修飾は、2'−O−メチル、2'−O−エチル、2'−O−プロピル、2'−O−イソプロビル、2'−O−ブチル、2'−O−イソブチル、2'−O−メチル−O−メチル(−CH CH OCH )、および2'−O−エチル−OH(−OCH CH OH)からなる群から選択される。 More preferably, the modifications, 2'-O-methyl, 2'-O-ethyl, 2'-O-propyl, 2'-O-isopropyl building, 2'-O-butyl, 2'-O-isobutyl, 2'-O- methyl -O- methyl (-CH 2 CH 2 OCH 3) , and 2'-O- ethyl -OH is selected from the group consisting of (-OCH 2 CH 2 OH). 最も好ましくは、2'−O−アルキル修飾が2'−O−メチル部分である。 Most preferably, 2'-O- alkyl modification is a 2'-O- methyl moiety. さらに、修飾が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドの各々で同一である必要はない。 Furthermore, modifications need not be the same in each of the first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide. しかし、本発明の分子を合成することに関して実用上の観点から、全体として同一の修飾を用いることが求められる場合もある。 However, from the viewpoint of practical use with respect to synthesize the molecules of the present invention, it may be used the same modified as a whole is determined.

上記の修飾は、他のいかなる部分も修飾されないことを示唆していると解釈してはならない。 The above modifications are not to be construed as suggesting that other any part of is also not modified. オフ・ターゲット効果を増加させない限り、他の種類の修飾が許される。 Unless increasing the off-target effects, other types of modifications are allowed. 例えば、いくつかの実施形態で、付加的な修飾を、センス鎖の1、2、3、またはそれ以上の連続的なヌクレオチドまたは1つ置きのヌクレオチドに加えることができる。 For example, in some embodiments, additional modifications can be added to one, two, three or more consecutive nucleotides or every other nucleotide of the sense strand. あるいは、付加的な修飾を、RISC複合体へセンス鎖を入れるためのキーとして同定される特異的な位置に限定することができる。 Alternatively, additional modifications can be limited to specific locations identified as a key to put the sense strand into the RISC complex. さらに、付加的な2'−O−メチル基(または他の2'修飾)は、センス鎖の一つ以上、好ましくは全てのピリミジン(例えば、Cおよび/またはUヌクレオチド)に加えられることができ、さらに/あるいは2'F 修飾(または他のハロゲン修飾)をアンチセンス鎖の1つ以上、好ましくは全てのピリミジン(例えば、Cおよび/またはUヌクレオチド)に加えることができる(もし、ハロゲン修飾を以下の第16および第17の実施形態と併用して用いるならば、好ましくは、最初の2つの5'末端アンチセンス・ヌクレオチドに入るもの以外の全てのピリミジンが、ハロゲン修飾であり、あるいは最初の3つが他の修飾を含むならば、最初の3つの5'末端アンチセンス・ヌクレオチド)。 Furthermore, additional 2'-O- methyl group (or other 2 'modification) is one or more of the sense strand, preferably all pyrimidines (e.g., C and / or U nucleotides) can be added to further / or 2'F l modified (or other halogen modification) one or more of the antisense strand, preferably all pyrimidines (e.g., C and / or U nucleotides) can be added to (if halogen-modified if the use in combination with the following embodiment of the 16 and the 17, preferably, all pyrimidines other than those that fall in the first two 5 'terminal antisense nucleotide is a halogen-modified, or the first if three including other modifications, the first three 5 'terminal antisense nucleotides).

化学修飾に加えて、100%未満の相同性を共有する標的とのRISC媒介結合に関与するこれらの鎖の能力を変える塩基対のミスマッチまたは隆起(バルジ)をセンスおよび/またはアンチセンス鎖に加えることができると仮定される。 In addition to the chemical modification, adding base pairs alter the ability of these strands to participate in RISC-mediated binding to a target which share homology of less than 100% mismatches or uplift (bulge) in the sense and / or antisense strand it is assumed that it is. そのようなミスマッチの例として(限定されるものではないが)、プリン−ピリミジン・ミスマッチ(例えばG−U,C−A)とプリン−プリンまたはピリミジン−ピリミジン・ミスマッチ(例えばG−A、U−C)が挙げられる。 Such examples of mismatches such (but not limited to) purine - pyrimidine mismatches (e.g. G-U, C-A) and purine - purine or pyrimidine - pyrimidine mismatches (e.g. G-A, U- C), and the like. この種の修飾の導入は、上記の修飾と組み合わせることが可能であり、さらにオフ・ターゲット効果を減らすかどうか決定するために、それらを評価すること可能である。 The introduction of such modifications, can be combined with the modifications described above, to determine if further or reduce off-target effects, it is possible to evaluate them.

どんな修飾が許されるかについて決定するために、いくつかの非制限アッセイを、オフ・ターゲット効果を制限する修飾を同定するために実行することができる。 To determine whether what modifications are allowed, a number of non-limiting assays can be performed to identify modifications to limit the off-target effects. 1つの非限定的例において、センス鎖(試験されている修飾を担持する)を、多くの標識ヌクレオチドのうちの1つで標識さすることができる。 In one non-limiting example, the sense strand (carrying modifications being tested) can be one in of labeling of many labeled nucleotides. その後、結合アッセイを実施して、修飾センス鎖に対するRISCの親和性を未修飾形状のそれと比較することができる。 Then carrying out binding assays, it can be compared to that of the RISC affinity unmodified shape for modified sense strand.

第14の実施形態によれば、本発明は、ヘアピンをsiRNAを形成することができる単分子のsiRNAに関するもので、該単分子siRNAは、 According to the fourteenth embodiment, the present invention relates to siRNA unimolecular hairpin can be formed a siRNA, monomolecular siRNA is
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドは、この第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、 (A) an antisense region, wherein said antisense region 'consists terminal antisense nucleotide, the first 5' first 5-terminal antisense nucleotide is the first 5 'terminal antisense is phosphorylated at 5 'carbon position of the sense nucleotide, and an antisense region,
(b)センス領域であって、該センス鎖は第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の2'炭素センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドは第2の2'炭素センス修飾を含む、センス鎖と、 (B) a sense region, wherein said sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide comprises a first 2 'comprises a carbon sense modification, said second 5' terminal sense nucleotide comprises a second 2 'carbon sense modification and the sense strand,
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、 A (c) a loop region, wherein said loop region is located between said sense region and said antisense region, a loop region,
を含む。 including.

この実施形態によれば、修飾の範囲は第13の実施形態のものと同一である。 According to this embodiment, the range of modification are identical to those of the thirteenth embodiment. しかし、ポリヌクレオチドが単分子であり、かつヘアピンを形成することができるが、2本の異なる鎖ではないことから、センス領域とアンチセンス領域との両方を含む連続した1本の分子が存在する。 However, the polynucleotide is a single molecule, and can form a hairpin, since not the two different chains, one molecule contiguous to include both the sense and antisense regions are present . 好ましくは、上記センス領域およびアンチセンス領域が少なくとも実質的に相補的であり、より好ましくは100%の相補性を有する。 Preferably, the sense and antisense regions are at least substantially complementary, more preferably 100% complementary. 第13の実施形態と同様に、好ましくは、上記センス領域およびアンチセンス領域は18〜30の塩基対、より好ましくは19〜25塩基対、さらに好ましくは19〜25塩基対を含み、最も好ましくは19〜23塩基対を含む。 Similar to the thirteenth embodiment, preferably, the sense and antisense regions base pair 18 to 30, more preferably 19 to 25 base pairs, more preferably comprises 19 to 25 base pairs, and most preferably containing 19 to 23 base pairs. 好ましくは、上記ヌクレオチドがRNAである。 Preferably, the nucleotides are RNA.

本発明にもとづいて、単分子siRNA、特に左回りの(left−handed)単分子構造(例えば、5'−AS−Loop−S)を設計する場合、好ましくは、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドに対して相補的である塩基から数えて(すなわち、センス領域の3'末端から数えて)、センス領域の第18、第19、または第20の塩基であるヌクレオチドとして定義される。 In accordance with the present invention, a monomolecular siRNA, particularly the counterclockwise (left-handed) unimolecular structure (e.g., 5'-AS-Loop-S) When designing, preferably, the first 5 'terminal sense nucleotides, 'counting from the base that is complementary to the terminal antisense nucleotide (i.e., 3 of the sense region' first 5 counting from the end), 18th, 19th sense region or the 20, it is defined as a base nucleotides. 第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、このように定義される。 The first 5 'terminal sense nucleotide is defined in this manner. なぜなら、ヘアピンを形成することができる単分子siRNAが細胞に入る場合、典型的には、ダイサー(Dicer)が、約18〜20塩基対の2本の異なる鎖(siRNA)から構成される分子に、長い二本鎖領域を含む絵ヘアピンsiRNAのなかに処理し、この処理された分子の5'末端に結合したセンス鎖修飾をそれらの分子が保持することが求められるからである。 This is because, if the unimolecular siRNA capable of forming a hairpin to enter the cells, typically, Dicer (Dicer) is a molecule comprised of two different chains of about 18 to 20 base pairs (siRNA) long treated Some picture hairpin siRNA comprising a double-stranded region, because the sense strand modifications linked to the 5 'end of the treated molecules such molecules is required to hold. 最も好ましくは、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、センス領域の3'末端からセンス領域の19番目の塩基であるヌクレオチドとして定義される。 Most preferably, the first 5 'terminal sense nucleotide, 3 of the sense region' is defined as the 19 th bases in a nucleotide of the sense region from the end. さらに、好ましくは、ポリヌクレオチドは、左回りのヘアピンを形成することができる。 Still preferably, the polynucleotide can form a left-handed hairpin.

上記ヘアピンは、4〜10塩基から構成されるループ構造と、センス領域とを含み、センス領域およびアンチセンス領域は個々に19〜23塩基対長であり、互いに実質的に相補的である。 The hairpin comprises a loop structure composed of 4 to 10 bases, and a sense region, the sense and antisense regions are individually 19-23 base pairs in length, which is substantially complementary to each other. ループ構造の好ましい配列として、例えば、5'−UUCG(配列番号323)、5'−UUUGUGUAG(配列番号324)、および 5'−CUUCCUGUCA(配列番号325)が挙げられる。 Preferred sequences of the loop structure, for example, 5'-UUCG (SEQ ID NO: 323), 5'-UUUGUGUAG (SEQ ID NO: 324), and 5'-CUUCCUGUCA (SEQ ID NO: 325) can be mentioned.

ヘアピンは、好ましくは、アンチセンス領域の下流にあるループ領域によって構築される。 Hairpin is preferably constructed by a loop region downstream of the antisense region. この構成は、末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化することがより容易なので、この構造が望ましい。 This arrangement, because it is easier to phosphorylate terminal antisense nucleotide, this structure is preferable. このように、単分子siRNAを設計する際、オーバーハングが5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの上流にないことが好ましい。 Thus, when designing the unimolecular siRNA, it is preferable overhang is not upstream of 5 'terminal antisense nucleotide. いくつかの実施形態のセンス領域3'末端で、例えば、1、2、または3ヌクレオチドのオーバーハングを有することが望ましい場合もある。 In some sense region 3 'end of the embodiment, for example, it may be desirable to have an overhang of 1, 2 or 3 nucleotides. さらに、好ましくは、単分子siRNAは左回りのヘアピンを形成することができる。 Further, preferably, unimolecular siRNA is capable of forming a hairpin counterclockwise.

RNAは、さらに、ステム領域を含むことができ、該ステム領域は、ループ構造の第5'末端および第3'末端に直接隣接した1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み、さらに該ステム領域の1つ以上のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが標的特異的(もしくは非標的特異的)である。 s h RNA can further comprise a stem region, the stem region comprises one or more nucleotides or modified nucleotides immediately adjacent to the 5 'end and a 3' end of the loop structure, further the stem one or more nucleotides or modified nucleotides regions are target-specific (or non-target-specific). 好ましくは、その単分子siRNAの全長は、100塩基対未満であり、より好ましくは85塩基対未満である。 Preferably, the entire length of the unimolecular siRNA is less than 100 base pairs, more preferably less than 85 base pairs.

本発明の単分子siRNAは、最終的には細胞の機能(cellular machinery )によって2本の異なる鎖に変換されるように処理される。 Unimolecular siRNA of the present invention may ultimately be processed as converted to different strands of two by the function of the cells (cellular machinery). さらに、これらの単分子siRNAを、全ての修飾よりも少ないもので細胞に導入してもよく、また導入された天然のプロセスまたはプロセッシング用分子を用いて、細胞自体の中で修飾することも可能である(例えば、細胞内でのリン酸化)。 Further, these unimolecular siRNA, all may be introduced into cells in those less than modification, and using the introduced natural processes or processing molecule it was, also be modified in the cells themselves is (e.g., phosphorylation in the cell). しかし、好ましくは、上記siRNAに対して、既に存在している全ての修飾が導入される(同様に、siRNAが2つの異なる鎖から構成される場合、第1の実施形態の鎖が好ましくは全ての修飾を持つ細胞に導入される。例えば、導入後にリン酸化の基によって修飾されるにもかかわらず)。 However, preferably, with respect to the siRNA, already all modifications are introduced which are present (Similarly, if the siRNA is comprised of two different chains, chains of the first embodiment is preferably all is introduced into cells with modifications. for example, modified by groups of phosphorylation after introduction give Runimokakawarazu).

第15の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化するための方法に関し、該方法は、修飾siRNAを標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、さらすことを含み、上記siRNAは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを有し、 According to a fifteenth embodiment of the present invention relates to a method for minimizing off-target effects, the method or the modified siRNA expressing target nucleic acid or target nucleic acid, expresses the target nucleic acid it the cell or tissue that may include exposing, the siRNA has an antisense strand and sense strand,
(a)上記センス鎖が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の2'炭素センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドは第2の2'炭素センス修飾を含む、センス鎖と、 (A) said sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide comprises a first 2' carbon sense modification wherein, the second 5 'terminal sense nucleotide and the second 2' containing carbon sense modification and the sense strand,
(b)上記アンチセンス鎖が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、 (B) the antisense strand 'consists terminal antisense nucleotide, the first 5' first 5 terminal antisense nucleotide at position 5 'terminal antisense nucleotide "The first 5 It is phosphorylated, and the anti-sense strand,
を含む。 including.

第15の実施形態の修飾siRNAは、好ましくは第13の実施形態のsiRNAである。 Modified siRNA of the fifteenth embodiment is preferably a siRNA of the thirteenth embodiment.

第16の実施形態によれば、本発明はオフ・ターゲット効果を最小化するための方法に関し、上記方法は、修飾siRNAを標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、ヘアピンを形成することができる単一siRNAをさらすことを含み、上記siRNAは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを有し、 According to a sixteenth embodiment, the present invention relates to a method for minimizing off-target effects, the method or the modified siRNA expressing target nucleic acid or target nucleic acid, expresses the target nucleic acid it the cell or tissue that may include exposing a single siRNA capable of forming a hairpin, the siRNA has an antisense strand and sense strand,
(a)該センス領域は第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の2'炭素センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドは第2の2'炭素センス修飾を含む、センス領域と、 (A) said sense region is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide comprises a first 2' carbon sense modification wherein, the second 5 'terminal sense nucleotide and the second 2' containing carbon sense modification, and a sense region,
(b)上記アンチセンス領域が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、 (B) the antisense region 'consists terminal antisense nucleotide, the first 5' first 5-terminal antisense nucleotide is carbon position 5 'terminal antisense nucleotide "The first 5 in it is phosphorylated, and the antisense region,
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、 A (c) a loop region, wherein said loop region is located between said sense region and said antisense region, a loop region,
を含む。 including.

第16の実施形態の修飾siRNAは、好ましくは第14の実施形態のsiRNAである。 Modified siRNA of the sixteenth embodiment is preferably a siRNA of the fourteenth embodiment.

他の実施形態では、修飾の組み合わせが以下のように記載されるように、なおも追加の修飾が存在し得る。 In another embodiment, as a combination of modifications are described as follows, there may be still additional modifications. すなわち、(1)2'修飾基(リボース上の炭素2)によって修飾される鎖の5'から数えて、センス領域(またはshRNAのセンス領域)の1および2位(または1、2、および3位)、(2)2'修飾基(リボース上の炭素2)によって修飾される鎖の5'末端から数えて、センス領域(またはshRNAのアンチセンス領域)の1および2位(または1、2、および3位)、および(3)アンチセンス鎖の5'末端がリン酸化されている(リボースの炭素5)。 That is, (1) 2, counting from the 5 'strand is modified by the modifying group (carbon 2 on the ribose)', 1 and 2 of the sense region (or sense region of shRNA) (or 1, 2, and 3 position), (2) 2 counted from the 5 'end of the strand is modified by the modifying group (carbon 2 on the ribose)', 1 and 2 of the sense region (or antisense region of the shRNA) (or 1, 2 , and 3), and (3) 5 'end of the antisense strand is phosphorylated (carbon of ribose 5). 3種類の修飾全ての組み合わせは、実質的に、センスおよびアンチセンス鎖によって誘導されたオフ・ターゲット効果を減少させる点で有益であると思われる。 All three combinations modifications is substantially appears to be beneficial in reducing the induced off-target effects by the sense and antisense strand.

第17の実施形態によよれば、本発明はsiRNAを提供するもので、該siRNAは、 According by the seventeenth embodiment, the present invention provides an siRNA, the siRNA is
(a)アンチセンス鎖であって、上記アンチセンス鎖が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2'炭素アンチセンス修飾を含み、上記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2'炭素アンチセンス修飾を含み、該第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されている、アンチセンス鎖と、 (A) an antisense strand, the antisense strand is comprised of a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide, the first 5 'terminal antisense nucleotide is 'comprises a carbon antisense modification, the second 5' first 2 terminal antisense nucleotide 'comprises a carbon antisense modification, 5 of the first' second 2 terminal antisense nucleotide There is phosphorylated at carbon position 5 'terminal antisense nucleotide "the first 5, and an antisense strand,
(b)センス鎖であって、上記センス鎖が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を含む、センス鎖と、 (B) a sense strand, the sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide first 2 'comprises a carbon sense modification, said second 5' terminal sense nucleotide comprises a second 2 'carbon sense modification and the sense strand,
を含む。 including.

この第17の実施形態によれば、上記修飾は、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドに2'炭素修飾の付加することで第13の実施形態のものと同様に定義される。 According to the seventeenth embodiment, the modification is the thirteenth embodiment at the 2 'adding carbon modifications on the first 5' terminal antisense nucleotide and a second 5 'terminal antisense nucleotide They are defined as those. あるいは、第2の末端アンチセンス・ヌクレオチド上の2'炭素修飾の付加によって、上記修飾は第13の実施形態のものと同様に定義される。 Alternatively, the 2 'addition of carbon modifications on the second terminal antisense nucleotide, the modification is defined in the same manner as in the thirteenth embodiment. これらの2'炭素修飾は、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドに対する修飾と同じように定義される。 These 2 'carbon modification, the first 5' are defined in the same way as modifications to terminal sense nucleotide and a second 5 'terminal sense nucleotide. さらに、第3の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド上にさらなる2'炭素修飾が存在してもよい。 Further, there may be a carbon-modified 'further 2 on the terminal antisense nucleotide' third 5.

第18の実施形態によれば、本発明はヘアピンを形成することができる単分子のsiRNA分子を提供する。 According to the eighteenth embodiment, the present invention provides a siRNA molecule of single molecule capable of forming a hairpin. このsiRNAは、 This siRNA is,
(a)アンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2'炭素アンチセンス修飾を含み、上記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2'炭素アンチセンス修飾を含み、さらに第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドがこの第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの5'炭素位でリン酸化されている、アンチセンス領域と、 (A) an antisense region, wherein said antisense region is comprised of a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide, the first 5 'terminal antisense nucleotide is 'comprises a carbon antisense modification, the second 5' first 2 terminal antisense nucleotide 'comprises a carbon antisense modification, yet the first 5' second 2 terminal antisense nucleotide There is phosphorylated at carbon position 5 'terminal antisense nucleotide "the first 5, and an antisense region,
(b)センス領域であって、該センス鎖は第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、前記第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を含み、前記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を含む、センス領域と、 (B) a sense region, wherein said sense strand is comprised of a first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide, wherein said first 5 'terminal sense nucleotide first 2 'comprises a carbon sense modification and said second 5' terminal sense nucleotide comprises a second 2 'carbon sense modification, and a sense region,
(c)ループ領域であって、該ループ領域が上記センス領域と上記アンチセンス領域との間に位置している、ループ領域と、 A (c) a loop region, wherein said loop region is located between said sense region and said antisense region, a loop region,
から構成される。 It consists of.

この18の実施形態によれば、上記修飾は、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドに2'炭素修飾の付加することで第17の実施形態のものと同様に定義される。 According to an embodiment of the 18, the modification of embodiment of the first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide 2 '17 by the addition of the carbon modified It is similarly defined and stuff. これらの2'炭素修飾は、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドに対する修飾と同じように定義される。 These 2 'carbon modification, the first 5' are defined in the same way as modifications to terminal sense nucleotide and a second 5 'terminal sense nucleotide. さらに、第3の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド上にさらなる2'炭素修飾が存在してもよい。 Further, there may be a carbon-modified 'further 2 on the terminal antisense nucleotide' third 5.

第19の実施形態によれば、本発明は、遺伝子サイレンシングの過程でオフ・ターゲット効果を減少させるための方法を提供する。 According to a nineteenth embodiment, the present invention provides a method for reducing off-target effects during gene silencing. この方法は、第17の実施形態のsiRNAを、標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、投与することを含む。 The method, the siRNA of the seventeenth embodiment, or express the target nucleic acid or target nucleic acid, to cells or tissue capable of expressing the target nucleic acid, comprising administering.

第20の実施形態によれば、本発明は、遺伝子サイレンシングの過程でオフ・ターゲット効果を減少させるための方法を提供する。 According to a twentieth embodiment, the present invention provides a method for reducing off-target effects during gene silencing. この方法は、第18の実施形態のsiRNAを、標的核酸、または該標的核酸を発現するか、該標的核酸を発現することができる細胞もしくは組織に、投与することを含む。 The method, the siRNA of the eighteenth embodiment, or express the target nucleic acid or target nucleic acid, to cells or tissue capable of expressing the target nucleic acid, comprising administering.

上記の実施形態が増加した特異性を目的とするにもかかわらず、他のパラメータ(例えば、安定性に影響を及ぼす上述のもの)に影響を及ぼすように設計可能である修飾の他の種類やそれらの組合せによって、siRNAが修正される点に注意することは重要である。 The above embodiment even though an object of the specificities increased, other parameters (for example, affect the above-mentioned ones stability) other types of modifications can be designed to affect the Ya a combination thereof, it is important to note that siRNA is modified.

しかし、いくつかの安定性指向の修飾は、機能性が制限されたsiRNAを与え、例えば対照またはエクサエクオ剤として使用する以外は使用されない(例えば、センス鎖であって、上記センス鎖が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'−O−アルキル(好ましくはメチル)センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'−O−アルキル(好ましくは、メチル)センス修飾を含む;少なくとも1つの(好ましくは、全ての)2'−O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジン修飾センス・ヌクレオチドであって、上記少なくとも1つの、好ましくは全ての2'−O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジ However, some of the stability-oriented modification gives the functionality is limited siRNA, for example not be used except that used as a control or Ekusaekuo agent (e.g., a sense strand, the sense strand first 5 is composed of 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide comprises the first 5 'terminal sense nucleotide first 2'-O- alkyl (preferably methyl) sense modification, It said second 5 'terminal sense nucleotide second 2'-O-alkyl (preferably methyl) of a sense modification; at least one (preferably all) 2'-O-alkyl (preferably a methyl) pyrimidine modified sense nucleotide, wherein said at least one, preferably all of 2'-O- alkyl (preferably methyl) pyrimidine 修飾センス・ヌクレオチドが、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドまたは上記第2の5'末端センス・ヌクレオチド以外のヌクレオチドである;アンチセンス鎖であって、上記アンチセンス鎖が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2'−O−アルキル(好ましくはメチル)アンチセンス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'−O−アルキル(好ましくはメチル)アンチセンス修飾を含む;上記アンチセンス鎖上の2'標識ピリミジン、好ましくは少なくとも1つの2'−O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドであって、上記少なくとも1つの2' Modified sense nucleotide is located in the first 5 nucleotides other than 'terminal sense nucleotide or said second 5' terminal sense nucleotide; an antisense strand, the antisense strand first 5 ' 'is composed of a terminal antisense nucleotide, the first 5' terminal antisense nucleotide and a second 5-terminal antisense nucleotide is the first 2'-O- alkyl (preferably methyl) antisense modification hints, the second 5 'terminal sense nucleotide second 2'-O-alkyl (preferably methyl) of including antisense modification; 2 on the antisense strand' labeled pyrimidine, preferably at least one 2'-O- alkyl (preferably methyl) a pyrimidine modified antisense nucleotide, wherein said at least one 2 ' O−アルキル(好ましくはメチル)ピリミジン修飾アンチセンス・ヌクレオチドが、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドまたは上記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、さらに必要に応じて、蛍光標識等の標識を上記5'末端センス・ヌクレオチドに有する)。 O- alkyl (preferably methyl) pyrimidine modified antisense nucleotide is a nucleotide other than said first 5 'terminal antisense nucleotide or said second 5' terminal antisense nucleotide, depending on further required , a label such as a fluorescent label on the 5 'terminal sense nucleotides).

さらに、 修飾のいくつかの他の関連した組み合わせを用いて、対照群またはエクサエクオ剤として用いることができるsiRNAを開発することができる。 Furthermore, it is possible to use a number of other related combinations of modifications, to develop siRNA which can be used as a control group or Ekusaekuo agent. 例えば、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドをリン酸化することなく、siRNAまたはshRNAをこの開示で記載される第17および第18の実施形態と同様で開発することができる。 For example, it is possible to the first 5 'terminal antisense nucleotide without phosphorylation, to develop the same as the 17th embodiment and 18th described siRNA or shRNA in this disclosure. したがって、一実施形態下で、(i)各々が2'修飾、例えば上記した2'修飾(例として2'−O−メチル修飾)を各々が含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5'炭素末端センス・ヌクレオチドと、(ii)各々が2'修飾、例えば上記した2'修飾(例として2'−O−メチル修飾)を各々が含む第1および第2、または第1、第2、および第3の5'炭素末端アンチセンス・ヌクレオチドとに制限される2'修飾がある。 Thus, under one embodiment, (i) each 2 'modification, e.g., the above-mentioned 2' modification (2'-O-methyl modification as an example) the first and second each including or first, second , and 'carbon terminal sense nucleotide, (ii) each 2' third 5 modifications, for example the above-mentioned 2 'modification (2'-O-methyl modification as an example) the first and second each including, or the first, second, and third 5 certain modifications '2 is limited to the carbon terminal antisense nucleotide'.

エクサエクオ(exaequo)剤または対照群を用いる場合、ブロック基によりセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の5'末端の5'炭素位を修飾することが求められる場合もある。 When using a Ekusaekuo (exaequo), or a control group, there is a case where it is desired to modify the carbon position 5 'end 5' sense strand and / or antisense strand by a blocking group. このブロック基は、例えば、アルキル基または他のいずれかの基であってもよく、ヌクレオチドの5'炭素位のリン酸化を防ぐ。 The blocking group may for example be an alkyl group or any other group, prevents the phosphorylation of the 5 'carbon position of a nucleotide. リン酸化は、細胞内に存在するキナーゼの働きによって細胞内で生ずると思われる。 Phosphorylation is believed to occur in the cell by the action of the kinase present in the cell. 典型的なブロック基として、限定されるものではないが、メチル、O−メチル、およびアミン基が挙げられる。 Typical blocking groups include, but are not limited to, methyl, O- methyl, and amine groups.

これらの分子は、機能的ではないが、負の対照研究で使用され、またエクサエクオ剤として使用することが可能である。 These molecules are not functional and are used in negative control studies, also it can be used as Ekusaekuo agent. さらに、もし上記した標識等の方式が用いられる場合、これらの薬剤はトラッキング剤として有用であり、形質移入の検出を助けると思われ、さらに細胞内で分子がどこに存在するかの検出も助けるものと思われる。 Furthermore, if the method of labeling such as described above is used, these agents are useful as a tracking agent, appears to aid in the detection of transfection, or also detects an aid additionally present where the molecule in a cell I think that the. これらの薬剤は、サイレンシングのために用いられないことから、好ましくは18〜30塩基対ではあるが、それらは16〜28塩基対を含むことができる。 These agents, since not used for silencing, albeit at preferably 18-30 base pairs, they can contain 16-28 base pairs.

さらに、リン酸主鎖に対する安定化修飾は、本発明のいくつかの用途のためにsiRNA内に含めることが可能である。 Moreover, stabilizing modifications to the phosphate backbone may be for some applications of the present invention include in siRNA. 例えば、少なくとも1つのホスホロチオエートおよび/またはメチルホスホネートを、オリゴヌクレオチド主鎖のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖にある、同様に存在しうる任意のオーバーハング、ループ構造、またはステム構造にある、任意の、または全てのピリミジンのいくつかの、または全ての3'位にあるリン酸基と置換してもよい。 For example, at least one phosphorothioate and / or methylphosphonate, in the sense strand and / or antisense strand of the oligonucleotide backbone, as well as any overhangs that may be present, in loop structures or stem structures, any , or some of all of the pyrimidines, or may be replaced with a phosphate group in all of the 3 'position. ホスホロチオエート(およびメチルホスホネート)類似体は、オリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基の修飾から生ずる。 Phosphorothioate (and methylphosphonate) analogues arise from modification of the phosphate group of the oligonucleotide backbone. ホスホロチオエート内では、リン酸塩O が硫黄原子に置き換わる。 Within phosphorothioates, phosphate O - is replaced by a sulfur atom. メチルホスホネートでは、酸素がメチル基によって置き換わる。 In methylphosphonates, the oxygen is replaced by a methyl group. 一実施形態では、ホスホロチオエート修飾またはメチルホスホネートは、2'フッ素(または他のハロゲン)修飾ヌクレオチドも含む全てのアンチセンス鎖ヌクレオチドの3'位に置かれている。 In one embodiment, a phosphorothioate modification or methylphosphonate is 2 are placed in position 'fluorine (or other halogen) 3 of all antisense strand nucleotides that also includes modified nucleotides'. さらに、ホスホロチオエート3'修飾を、2'フッ素置換の代わりに、および独立して用い、siRNA分子の安定性を高めることが可能である。 Furthermore, 'a modification, 2' phosphorothioate 3 instead of the fluorine-substituted, and independently used, it is possible to increase the stability of the siRNA molecule. これらの修飾は、siRNA用途において、本明細書に記載された他の修飾と併用して、あるいはそれらの修飾とは別個に、用いることが可能である。 These modifications, in siRNA applications, in combination with other modifications described herein, or separately from the modifications thereof, can be used.

ヌクレアーゼは、一般に、リン酸塩部分およびリボース環の2'OH位にある酸素基の両方を用いてRNAに対する攻撃を媒介する。 Nuclease generally to mediate attack on RNA using both oxygen radicals in the 2'OH-position of the phosphate moiety and the ribose ring. 複数の酸素の1つに対する硫黄基の置換によって、この反応に参加するリン酸塩の能力が取り除かれ、ヌクレアーゼ消化に対するこの部位の感度が制限される。 By the substitution of a sulfur group for one of a plurality of oxygen, the ability of the phosphate to participate in this reaction is removed, the sensitivity of this site to nuclease digestion is limited. しかし、ホスホロチオエートが典型的に有毒な点に留意する必要があることから、いかなる毒作用も否定される場合に主に有益であり、例えば、他のヌクレオチド毎、第3のヌクレオチド毎、または第4ののくレオチド毎にこの修飾を用いることを制限することによって、達成しうると考えることができる。 However, since the phosphorothioate is typically needs to be noted toxic respects, it is primarily beneficial when any toxic effects are negated, for example, every other nucleotide, every third nucleotide, or fourth by limiting the use of this modification of carbonochloridate every Reochido, it can be considered to be achieved.

さらに、いくつかの用途では、本発明のヌクレオチドに標識(例えば、蛍光標識、放射性標識、または質量標識)を取り込むことが望ましい場合もある。 Furthermore, in some applications, labeled nucleotides of the present invention (e.g., a fluorescent label, radioactive label, or mass label) it is sometimes desirable to incorporate also.

本発明の上記修飾は、siRNAと組み合わせてもよく、このsiRNAは、無作為に選択、または、例えば、米国特許出願第10/714,333号に記載されているような論理的設計に基づいて、選択された配列を含む。 The modification of the present invention may be combined with siRNA, the siRNA is randomly selected, or, for example, based on the logical design as described in U.S. Patent Application No. 10 / 714,333 , including the selected sequence. さらに、細胞の機能(cellular machinery)による処理を促進し得る全体的または部分的な内部熱安定性に基づいて、配列を選択することが望ましい場合もある。 Furthermore, based on the total or partial internal heat stability may promote the process by the functional cells (cellular machinery), it may be desirable to select sequences.

本発明の第13〜20の実施形態を開発する際に、2種類以上の修飾を二本鎖に加えてオフ・ターゲット効果を最小化させた。 When developing the first 13-20 embodiment of the present invention was minimized added off-target effects on double-stranded two or more modifications. 上記したように、出願人は、オフ・ターゲット効果を最小化する際の手助けになる他の修飾および組合せが、将来、発見可能であることを理解している。 As noted above, the applicant, other modifications and combinations of help when minimizing off-target effects, understands that the future, it is discoverable. その上、本発明の修飾を、他の目的のために望まれる修飾と結合することができた。 Moreover, the modification of the present invention, could be combined with modifications that are desired for other purposes. 例えば、いくつかの例で、1つの修飾は、オフ・ターゲット・サイレンシング(例えば、RISCに結合したセンス鎖)の1つの特定のステップに影響を及ぼすことができ、その一方で第2の修飾は、例えば相同性が100%未満である標的と結合するセンス/アンチセンス鎖の能力を変えることなく、異なるステップに完全に影響を及ぼすことができた。 For example, in some instances, one modification, the off-target silencing (e.g., the sense strand bound to RISC) can affect one specific step of, while the second modified , for example homology without changing the ability of the sense / antisense strand that binds to a target is less than 100%, it was possible influence completely different step. あるいは、2つの別々の修飾が同一のステップに影響を及ぼすことができた。 Alternatively, two separate modifications could affect the same step. いくつかの例では、2つ以上の修飾が、1つ以上のステップでの不要な相互作用またはプロセスを最小化することで、相加的または相乗的に作用して、オフ・ターゲット効果を制限した。 In some instances, two or more modifications, to minimize unwanted interactions or processes in one or more steps, additive or synergistically acts, limits the off-target effects did. さらに他の例において、1つの修飾は、オフターゲット効果を除去することができたが、それは他の所望の性質(例えばsiRNAの効力または安定性)上、有害な結果を有する。 In still other instances, one modification has been able to eliminate off-target effects, it on the other desired properties (e.g., siRNA potency or stability), have detrimental consequences. これらのようなケースにおいて、分子の機能性のこれらの態様を修復する付加的な修飾を加えることができた。 In these cases like, it could be added additional modifications to repair these aspects of functionality of the molecule.

種々のアプローチを、センスおよび/またはアンチセンス鎖オフ・ターゲット化効果を除去するために必要とされる分子のタイプとキー・ポジションとを同定するのに用いることができる。 Various approaches can be used to identify the type and key position of molecules which are needed to remove the sense and / or antisense strand off-targeting effects. 1つの非限定的な実施例において、修飾−機能ウォークが実行される。 In one non-limiting example, modified - function walk is performed. この手順では、一つの種類の修飾が、センスおよび/またはアンチセンス鎖をまたがって1つ以上のヌクレオチドに対して加えられる。 In this procedure, one type of modification is added to one or more nucleotides across the sense and / or antisense strand. 実質的に、修飾および未修飾を、いくつかの方法の1つによって、(1)機能性および(2)オフ・ターゲット効果について試験した。 Substantially modified and unmodified, by one of several methods, and tested for (1) functionality and (2) off-target effects. したがって、例えば、センスおよび/またはアンチセンス鎖の1および2位、3および4位、5および6位、7および8位、9および10位、11および12位、13および14位、15および16位、17よび18位、または18および19位に対して、2'−O−Me基を付加することができ、さらに機能性(例えば、特異的標的をサイレンシングするそれらの分子の能力)とオフ/ターゲット効果(例えば、マイクロアレイ分析による)について試験する。 Thus, for example, the sense and / or 1 and 2 of the antisense strand, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10 positions, 11 and 12 positions, 13 and 14-position, 15 and 16 position, 17 spare position 18, or for 18 and 19-position, 2'-O-Me group can be added to, and further functionality (e.g., the ability of these molecules to silence specific targets) off / target effects (e.g., by microarray analysis) to test for. いくつかの、または全てのオフ・ターゲット効果を取り除くキーポジションが同定されるが、二本鎖機能性の損失を招く場合、続いて修飾ウォークの第2のラウンドとなることで、二本鎖機能性を高めると思われるミスマッチまたは隆起が起こる付加的な化学基(例えば、アンチセンス鎖上の5'末端の5'リン酸塩)が、オフ・ターゲット効果を取り除く修飾を既に含む分子に付加される。 While some or key positions to remove any off-target effects are identified, it may lead to double-stranded functional loss, followed by a second round of modification walks, duplex feature additional chemical groups mismatches or ridges occur appears to enhance the sexual (e.g., phosphate '5 5' end on the antisense strand) is added to a molecule already containing a modified removing off-target effects that.

本発明の第13〜第20の実施形態の修飾が、用いるsiRNAの機能性に依存して、異なる効果を有することが可能である点に留意する必要がある。 Modification of the thirteenth to twentieth embodiment of the present invention is used, depending on the functionality of the siRNA, it should be noted that it is possible to have different effects. このように、高機能的siRNAでは、本発明の修飾は、分子が一定郎の機能性を失う原因になり得るが、それにもかかわらずオフ・ターゲット効果が減少することから望ましい。 Thus, the high-functional siRNA, modifications of the present invention, although molecules can cause loss of functionality of the constant Lang, nevertheless desirable to reduce the off-target effects. 対照的に、適度または不十分に機能的なsiRNAが使用される場合、機能性の減少はわずかであり、いくつかの例では、機能性を高めることができる。 In contrast, if moderately or poorly functional siRNA is used, reduction in functionality is only, in some instances, it is possible to enhance the functionality.

機能性を保持し、かつ分解に抵抗する本発明のdsRNAの安定性が塩基配列、細胞種、または導入される種に依存することがないことから、本発明は広範囲に及ぶ生物に適用可能であり、該生物として、限定されるものではないが、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス、および菌類が挙げられる。 Retain functional properties and stability nucleotide sequence of the dsRNA of the present invention to resist degradation, since it does not depend on cell type or species to be introduced, the present invention is applicable to a wide range of biological There, as the organism, but are not limited to, plant, animal, protozoan, bacterium, virus, and fungi, and the like. 本発明は、牛、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、犬歯、齧歯動物(例えばハムスター)、マウス、およびラット、さらに霊長類(例えばゴリラ、チンパンジー、およびヒト)等の哺乳類での使用にとって特に有利である。 The present invention, cows, horses, goats, pigs, sheep, canine, rodent (e.g. hamster), mice, and rats, further primate (e.g. gorilla, chimpanzee, and a human) particularly advantageous for use in mammals, such as it is.

本発明を、多様な細胞型(例えば、限定されるものではないが、一次細胞、生殖細胞系列、および体細胞)で、有利に使うことが可能である。 The present invention, a variety of cell types (e.g., but not limited to, primary cells, germline and somatic cells) with, it is possible to advantageously use. 細胞は、例えば、幹細胞または分化した細胞である。 Cells, for example, stem cells or differentiated cells. 例えば、細胞型として、胚細胞、卵母細胞、精細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球(ケラチノサイト)、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、さらに内分泌物または外分泌腺の細胞が挙げられる。 For example, a cell type, embryonic cells, oocytes, sperm cells, adipocytes, fibroblasts, myocytes, cardiomyocytes, endothelial cells, neurons, glia, blood cells, megakaryocytes, lymphocytes, macrophages, neutrophils , eosinophils, basophils, mast cells, leukocytes, granulocytes (keratinocytes), chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, hepatocytes, and more cells of endocrine or exocrine glands.

本発明は、幅広い範囲の遺伝子に対するRNA干渉を用いる(および/または対照として用いる)用途に適用可能であり、該遺伝子として、限定されるものではないが、糖尿病、アルツハイマーおよび癌等の疾患に関係するヒトゲノムの45,000遺伝子、さらにヒト、マウス、ハムスター、チンパンジー、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ブタ、イヌ、ネコ、線形動物(例えば線虫C.elegans)、ハエ(例えばキイロショウジョウバエD.melanogaster)、さらに他の脊椎動物および無脊椎動物のゲノムに含まれる全ての遺伝子が挙げられる。 The present invention is applicable to a wide range of use of RNA interference to the scope of the gene (used as and / or control) applications, as the gene, but are not limited to, diabetes, related to diseases of Alzheimer and cancer etc. to 45,000 genes of the human genome, yet the human, mouse, hamster, chimpanzees, goats, sheep, horses, camels, pigs, dogs, cats, nematodes (e.g. nematode C.elegans), flies (e.g., Drosophila melanogaster D.melanogaster ), it includes all genes further contained in other vertebrate and invertebrate genomes.

本発明のsiRNAは、任意の方法によって細胞に投与することが可能であり、該方法は、現在しられている、またはこれから知られるであろう方法、さらにこの開示を読むことによって本発明と関連して有用であると当業者が結論出すいかなる方法である。 siRNA of the invention can be administered to cells by any method, related method, a method that would be currently-known are, or now known as, with the present invention by reading further this disclosure and those skilled in the art to be useful is any way out conclusions. 例えば、siRNAを受動的に細胞へ送達することが可能である。 For example, it is possible to passively delivered to cells siRNA.

修飾siRNAの受動的な取り込みは、例えば、コンジュゲート、例えばセンス鎖の5'末端にあるポリエチレングリコール部分またはコレステロール部分、および/または、適当な状況下で、医薬的に許容される担体の存在によって、調整することができる。 Passive uptake of modified siRNA example, conjugates such as polyethylene glycol moiety or a cholesterol moiety at the 5 'end of the sense strand, and / or, under appropriate circumstances, by the presence of a pharmaceutically acceptable carrier , it can be adjusted.

送達のための他の方法として、限定されるものではないが、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム、陽イオン性脂質/リポソーム、マイクロインジェクション、電気穿孔法、免疫沈降法、およびsiRNAと特定のコンジュゲートまたはリガンド(例えば抗体、抗原、もしくは受容体)とのカップリングが挙げられる。 Other methods for delivery include, but are not limited to, DEAE-dextran, calcium phosphate, cationic lipids / liposomes, microinjection, electroporation, immunoprecipitation, and siRNA and specific conjugates or ligands (e.g. antibodies, antigens, or receptors) include coupling with.

好ましくは、siRNAは、投与される際に二本鎖を含む。 Preferably, siRNA includes a duplex when administered.

さらに、遺伝子サイレンシングのレベルを評価する方法は制限されない。 Furthermore, a method of assessing the level of gene silencing is not limited. したがって、 任意の所定のsiRNAのサイレンシング能力は、ノーザン分析、ウェスタン分析、PTPCR、発現プロファイリング、その他を含むがこれらの限定されない任意の多数の当該分野で試験された手順のうちの1つによって、研究され得る Thus, the silencing ability of any given siRNA can Northern analysis, Western analysis, PTPCR, expression profiling, by including other one of the procedures that have been tested in any of a number of art not these limitations, It can be studied.

さらに、本発明のsiRNAは、多様な用途の組み合わせに使用することが可能であり、限定されるものではないが、該用途として、基礎研究、創薬および開発、診断、ならびに薬物療法が挙げられる。 Furthermore, siRNA of the present invention can be used in combination of a variety of applications, but are not limited to, as the applications, basic research, drug discovery and development, and diagnostic, and drug therapy . 例えば、本発明を、遺伝子産物が創薬または開発のための標的であるかどうかを確認するのに用いることができる。 For example, the present invention, the gene product can be used to determine whether a target for drug discovery or development. このような用途では、目的とするところの標的核酸配列に対応するmRNAは、標的にされた分解に関して同定される。 In such applications, mRNA corresponding to the target nucleic acid sequence at which an object is identified for degradation was targeted. 特定の遺伝子を標的することに特異的である本発明のsiRNAを細胞または器官、好ましくは二本鎖の形態に導入する。 siRNA to cells or organs of the present invention is specific to target specific genes, preferably introduced in the form of a double-stranded. 細胞または生体を、標的mRNAの分解を可能とする条件下に保つことで、遺伝子の活性または発現が減少する。 The cell or organism, by keeping under conditions that allow the degradation of target mRNA, reducing the activity or expression of a gene. 遺伝子の発現または活性の減少の程度を測定し、そのような減少発現または活性の効果とともに、測定は、もし発現または活性が減少した場合、目的とする核酸配列が創薬または開発のための作用因子である。 To determine the extent of the reduction in expression or activity of the gene, with the effect of such decreased expression or activity, measurements, if the expression or activity is decreased, the action for the nucleic acid sequence is drug discovery or development of interest it is a factor. このように、表現型的に望ましい効果は、目的とするところの特定の標的核酸のRNA干渉を伴うことがありえ、適当な例では、毒性および薬物動態研究は行わうことができる、治療製剤が開発される。 Thus, phenotypically desirable effects, unlikely to be associated with RNA interference of particular target nucleic acid it is an object, in the appropriate examples, toxicity and pharmacokinetic studies can be will performed, the treatment formulation It is developed.

本発明は、例えば、目的とする疾患または障害の原因または因子と考えられる目的とする標的核酸の活性を減衰させることによって、生体での疾患または障害の一時的または永続的な状態を誘発するRNA干渉の用途にも用いることが可能である。 The present invention is, for example, by attenuating the activity of the target nucleic acid of interest that may be causing or agent of a disease or disorder of interest, RNA to induce transient or permanent states of disease or disorder in vivo it is possible to use in interference applications. 目的とする標的核酸の活動亢進は、疾患または障害をより悪化させ、あるいは場合によっては、目的とするところの疾患または障害を改善するか、治療する傾向がある。 Hyperactivity of the target nucleic acid of interest, is worse the disease or disorder, or in some cases, improve the diseases or disorders it is an object tend to be treated. 同様に、目的とする標的核酸の活性減少によって、疾患または障害が生ずる場合もあり、それによってより悪化したり、場合によっては、改善または治癒する傾向がある。 Similarly, the decreased activity of the target nucleic acid of interest, in some cases the disease or disorder is caused, thereby or worse, in some cases, tends to improve or cure. 目的とする標的核酸は、ゲノムもしくは染色体核酸または染色体外核酸(例えばウィルス核酸)を含むことができる。 Target nucleic acid of interest can comprise genomic or chromosomal nucleic acids or extrachromosomal nucleic acids (e.g., viral nucleic acid).

さらに、本発明は、目的とする標的核酸または標的核酸配列の機能を判断するRNA干渉用途で使用することが可能である。 Furthermore, the present invention can be used in RNA interference applications that determine the function of a target nucleic acid or target nucleic acid sequence of interest. 例えば、目的とする一定の標的核酸の活動を除外または減少させるノックダウン実験である。 For example, a knockdown experiments to exclude or reduce the activity of certain target nucleic acid of interest. このことは、目的とする特定の標的核酸を標的化する1種類以上のsiRNAによるRNA干渉を実行することで、達成することができる。 This is, by performing RNA interference with one or more siRNA targeting a particular target nucleic acid of interest can be achieved. そのようなノックダウンの効果を観察することは、目的とする標的核酸の機能に関する推論を導くことができる。 Observing the effect of such knockdown can lead to inferences regarding the function of the target nucleic acid of interest. RNA干渉は、対立遺伝子のどちらか一方を有している目的とする標的核酸の活性を弱毒化させ、生体または系に対する効果を観察することで、多形性の効果(例えば双対立形質の多形性)を検討するのに用いられることもできる。 RNA interference, the activity of the target nucleic acid of interest to have either allele is attenuated, by observing the effect on the living body or system, polymorphisms effects (e.g., bi-allelic multi shape retention) it can also be used to consider. 治療的に、対立遺伝子の一方または他方、あるいは両方を、選択的な対立遺伝子サイレンシングが望ましいRNA干渉を使用して選択的に対立遺伝子サイレンシングことができる。 Therapeutically, one or the other or both, of the alleles can be selectively allele silencing using desirably RNA interference selective allele silencing.

さらに、本発明が、疾患の治療、または標的の過剰または過小発現における動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの医薬製造での組成物の使用を含む、診断、予防、および治療等のRNA干渉用途で使用可能である。 Furthermore, the present invention is, animals in over-or under-expression of the therapeutic, or target of the disease, preferably a mammal, more preferably the use of the composition of the pharmaceutical preparation for human, diagnosis, prevention, and treatment such as the RNA interference It can be used in applications. 好ましくは、上記疾患または障害は、1種類以上のタンパク質の機能異常に起因するものであり、その疾患または障害は1種類以上のタンパク質からなる遺伝子産物の発現に関係している。 Preferably, the disease or disorder is due to dysfunction of one or more proteins, the disease or disorder is related to expression of the gene product of one or more proteins. 例えば、特定のヒト胸部ガンが一般に「bcl−2」遺伝子として知られている遺伝子から発現されるタンパク質の機能障害に関連があると広く認められる。 For example, widely recognized if there is associated with dysfunction of the protein expressed from the gene specific human breast cancer is commonly known as "bcl-2" gene. bcl−2遺伝子に対する1種類以上のsiRNAを使用し、また必要に応じて、薬物が乳癌の処置のために使われる医薬的に許容される担体、希釈剤および/またはアジュバント組み合わせて、薬物を、本発明の組成物および教示に従って製造することができる。 Using one or more siRNA against bcl-2 gene, and if necessary, pharmaceutically acceptable carriers which drug is used for treatment of breast cancer, in combination diluents and / or adjuvants, drugs, it can be prepared according to the compositions and teachings of the present invention. 出願人は、細胞モデルで方法および組成物の有用性を確立した。 Applicants have established the utility of methods and compositions in cellular models. ヒトを含む動物の細胞に対するポリヌクレオチド(例えばsiRNA)の送達の方法は、周知である。 The method of delivery of a polynucleotide (e.g., siRNA) for animal cells, including human, are well known. 当技術分野で現在知られている、または知られるであろいっさいの送達ビヒクルであって 、siRNA等のポリヌクレオチドをヒト等の動物に導入するための有用性を有する送達ビヒクルは 、本発明に従って製された組成物中に存在しうる任意の修飾にこの送達ヒビクルが適合ない限り、 本発明に従う医薬の製造において有用であることが予測される A art currently known in the art or any of the delivery vehicles will be known, delivery vehicle polynucleotide such as siRNA to have a utility for introduction into an animal such as a human, the present invention unless the delivery Hibikuru is not not adapted to any modifications which may be present in a composition that is manufacturing in accordance with, it is expected to be useful in the manufacture of a medicament according to the invention. 本発明によって作られる組成物に適合しない送達ビヒクルは、細胞培養での有効性に対して測定される場合に 95%を超え組成物の有効性を減らすものである。 Delivery vehicles that do not comply with compositions made by the present invention is to reduce the effectiveness of the composition greater than 95% when measured against efficacy in cell culture.

動物モデルは、例えば、癌、脈管系、先天異常または代謝の疾患を含む多くの、多くの疾患に対して存在する。 Animal models, for example, exist for many, many diseases, including cancer, vascular system, congenital abnormalities or metabolic disease. 哺乳類(例えばマウス、ラットまたはヒト以外の霊長類)のような動物で、特定の疾患または障害のために最適投薬計画に到達するための投薬計画で、動物に核酸を投与することは、当業者に周知である。 In animals such as mammals (e.g. mice, nonhuman primates rat or human), on a regimen to reach the optimal dosing regimen for a particular disease or disorder, administering a nucleic acid to an animal, those skilled in the art It is well known to. 一旦有効性が当業者により、単調な実験によって哺乳類で確立されるならば、ヒト治験の開始の間の投薬計画はそのような研究で達されるデータに基づいて達成することができる。 Once the efficacy skilled person, if it is established in a mammal by a routine experimentation, the dosage schedule between the start of human trials can be achieved on the basis of the data is reached in such studies.

本発明にもとづいて製造される薬物の投薬量は、被検体のキログラムあたり数マイクログラムから数ミリグラムまで変化する。 The dosage of drug to be manufactured in accordance with the present invention may vary up to several milligrams kilograms per microgram of the analyte. 当技術分野で知られていているように、投薬は投与を受けた哺乳類の質量、用量の投与を受けた哺乳類の性質、疾患または疾患の重症度、さらに、当業者に知られている他のファクターの中で、被験体の血清の薬物の安定性によって変化する。 As is known in the art, the mass of the dosage received a dose mammal, of a received mammalian administration dose nature, severity of the disease or disease, further other known to those skilled in the art among the factors will vary by the stability of serum drug in a subject.

これらの用途に関して、疾患を有することが疑われる生体または特定の目的とする標的核酸の操作による変調に従う疾患は、siRNAを投与することによって処置される。 For these applications, a disease according to modulation by manipulation of a target nucleic acid of a biological or particular purpose suspected of having a disease is treated by administering siRNA. siRNA処置による結果として、寛解性、一時的な軽減、予防、および/または特定の疾患に対する診断が得られる。 As result of the siRNA treatment, ameliorative, temporary relief, prevention, and / or diagnosis of a particular disease can be obtained. 好ましくは、siRNAは医薬的に許容される担体または希釈剤で医薬的に許容可能な方法で投与される。 Preferably, siRNA is administered in a pharmaceutically acceptable manner with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

本発明の治療上の適用は、種々の治療組成物および投薬方法によって、実行することができる。 Therapeutic applications of the present invention, by various therapeutic compositions and dosage method can be performed. 医薬的に許容される担体および希釈剤は、当業者に良く知られいる。 Pharmaceutically acceptable carriers and diluents are well known to those skilled in the art. 細胞および生体に対する投与の方法もまた、当業者に周知である。 The method of administration to cells and organisms are also well known to those skilled in the art. 投与計画が、例えば、治療を受ける疾患または障害の反応の重症度および程度次第であることが、知られており、 治療の過程は数日から数ヶ月にまで及ぶか、または障害または疾患状態に対して所望効果が達成されるまでである Dosing regimen, for example, it is up to the degree, severity and the response of the disease or disorder undergo therapy are known and either extend the course of treatment from a few days to several months or disorder or disease state, up to the desired effect is achieved for. siRNAの慢性投与は、いくつかの疾患または障害で持続する所望効果のために必要であることができる。 Chronic administration of siRNA may be required for the desired effect that lasts for several diseases or disorders. 例えば、適当な投与計画は、医薬的に許容可能な送達ルート近傍で、医薬的に許容される担体または希釈剤で1種類以上のsiRNAの変更量を投与することによって決定することができ、レシピエント生体の体内薬物累積値の量は投与の後で種々の時間で測定することができる。 For example, suitable dosage regimen in a pharmaceutically acceptable delivery route near a pharmaceutically an acceptable carrier or diluent can be determined by administering one or more of the change amount of siRNA, recipe the amount of body drug accumulation value of the entry vivo can be measured at various times after administration. 同様に、所期の効果(例えば、遺伝子産物または遺伝子活性の発現の抑制の程度)をsiRNAの投与の後で種々の時間に測定することができる、また、このデータは他の薬物動態学的なデータ(例えば生体または器官での蓄積)と相関していることができる。 Similarly, the desired effect (e.g., the degree of suppression of expression of a gene product or gene activity) can be measured at various times after administration of siRNA, also this data other pharmacokinetic it can be correlated such data (e.g. accumulation in vivo or organ). 当業者は、最適な投薬量、投与計画、その他を決定することができる。 Those skilled in the art, the optimal dosage regimen can determine the other. 当業者は、ヒトに関する研究ガイド通りに生体内および生体外からEC 50を用いることが可能である。 Those skilled in the art, it is possible to use an EC 50 from the in vivo and in vitro to study guide as humans.

またさらに、本発明をRNA干渉用途(例えば診断法、予防薬、および薬物療法学)で用いることが可能である。 Furthermore, the present invention RNA interference applications (eg diagnostics, prophylactics, and therapeutics) may be used in. これらの用途のために、特定の目的とする標的核酸の操作よる変調に従う疾患または障害を有すると疑われる生体が、siRNAを投与することで処置される。 For these applications, organism suspected of having a disease or disorder according to modulation by manipulation of a target nucleic acid with a specific purpose, are treated by administering siRNA. siRNA処置の結果は寛解性を示し、一時的軽減、予防的であり、さらに/または特定の疾患もしくは障害の診断となる。 Results of the siRNA treatment indicates ameliorative, palliative, a prophylactic, the further / or diagnosis of a particular disease or disorder. 好ましくは、siRNAを医薬的に許容される担体または希釈剤で、医薬的に許容される方法で、siRNAが投与される。 Preferably, siRNA with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, in a pharmaceutically acceptable methods, siRNA is administered.

さらに、上記siRNAは、局所的にクリームまたは軟膏、経口製剤(例えばカプセルまたは錠剤または懸濁液または溶液など)として適用することがでる。 Furthermore, the siRNA, it comes out to apply a topical cream or ointment, oral preparations (e.g., capsule or tablet or suspension or solution). 投与経路として、静脈内、筋肉内、経皮、真皮、皮膚、皮下、鼻腔内、経口、直腸、点眼、さらには有利な場所、例えば器官または組織に近い場所、標的となる目的の核酸を持つ細胞種にsiRNAを放出するための装置を組織移植することによってもよい。 As the route of administration, with intravenous, intramuscular, transdermal, dermal, dermal, subcutaneous, intranasal, oral, rectal, ophthalmic, more advantageous location, such as an organ or tissue as close, the purpose of the nucleic acid to be targeted the device for releasing the siRNA on the cell type may be by tissue transplantation.

別の実施形態によれば、本発明は、siRNA,センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が少なくとも1つのオルトエステル修飾を2'位に有する。 According to another embodiment, the present invention is, siRNA, comprising a sense strand and an antisense strand, wherein each of said sense strand and said antisense strand has at least one orthoester modified at the 2 'position.

本発明の別の態様にれば、本発明は、siRNAであって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、該アンチセンス鎖が少なくとも1つのオルトエステル修飾および/または2'−ハロゲン修飾、2'−アルキル修飾、2'−O−アルキル修飾、2'−アミン修飾、および2'−デオキシ修飾からなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含む。 If Re to another aspect of the present invention, the present invention provides a siRNA, comprising a sense strand and an antisense strand, the antisense strand at least one orthoester modified and / or 2'-halogen modification, 2 '- containing alkyl-modified, 2'-O-alkyl modification, 2'amine-modified, and at least one modified is selected from the group consisting of 2'-deoxy modification.

別の実施形態によれば、本発明はsiRNAを含み、該siRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖および/またはアンチセンス鎖が、少なくとも1つのオルトエステル修飾を含み、さらに塩基センス鎖および/またはアンチセンス鎖が、2'−ハロゲン修飾、2'−アルキル修飾、2'−O−アルキル修飾、2'−アミン修飾、および2'−デオキシ修飾からなる群から選択される少なくとも1つの2'修飾を含む。 According to another embodiment, the present invention includes a siRNA, the siRNA comprises a sense strand and an antisense strand, the sense strand and / or antisense strand comprises at least one orthoester modified further bases sense strand and / or antisense strand, 2'-halogen modification, 2'-alkyl modification, at least is selected from the group consisting of 2'-O- alkyl modification, 2'amine-modified, and 2'-deoxy-modified including one 2 'modified.

さらに別の実施形態では、本発明は、siRNAを含み、該siRNAは、(a)センス鎖であって、上記センス鎖が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の2'炭素センス修飾を含み、上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドは第2の2'炭素センス修飾を含む、センス鎖と、(b)アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖が第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第1の2'炭素アンチセンス修飾および5'修飾を含み、さらに前記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドが第2の2'炭素アンチセンス修飾を含む、ア In yet another embodiment, the present invention includes a siRNA, the siRNA is (a) a sense strand, the sense strand first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense consists nucleotides, the first 5 'terminal sense nucleotide comprises a first 2' comprises a carbon sense modification, said second 5 'terminal sense nucleotide and the second 2' containing carbon sense modification, the sense and chain, (b) an antisense strand, the antisense strand is comprised of a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide, the first 5 ' terminal antisense nucleotide comprises a first 2 'carbon antisense modification and 5' modifications, 'the terminal antisense nucleotide second 2' further the second 5 containing carbon antisense modification, a ンチセンス鎖と、を含む。 Including the antisense strand, the.

さらに別の実施形態では、本発明はsiRNAを含み、該siRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、上記アンチセンス鎖は、少なくとも1つの2'−オルトエステル修飾を含み、また上記アンチセンス鎖は、少なくとも1つの2'−オルトエステル修飾を含み、上記アンチセンス鎖は、さらに、2'−オルトエステル修飾、2'−アルキル修飾、2'−ハロゲン修飾、2'−O−アルキル修飾、2'−アミン修飾、および2'−デオキシ修飾からなる群から選択される1つ以上の修飾によって修飾され、上記2'−アルキル修飾、2'−O−メチル修飾、および2'−ハロゲン修飾がアンチセンス鎖の1つ以上のピリミジン上にあり、さらにsiRNAは、3'キャップを含む。 In yet another embodiment, the present invention includes a siRNA, the siRNA comprises a sense strand and an antisense strand, the antisense strand comprises at least one 2'-orthoester modification, also the antisense strand includes at least one 2'-orthoester modification, the antisense strand, further 2'orthoester modification includes 2'-alkyl modification, 2'halogen modifications, 2'-o-alkyl modification, 2 '- amine-modified, and modified by one or more modifications selected from the group consisting of 2'-deoxy modification, the 2'-alkyl modification, 2'-O-methyl modifications, and 2'-halogen modification anti located on one or more pyrimidines in the sense strand, further siRNA comprises a 3 'cap. この2'炭素修飾は、例えば、2'−O−メチル修飾等の2'−O−アルキル修飾である。 The 2 'carbon modification, for example, a 2'-O- alkyl modification, such as 2'-O- methyl modification. 上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび/または第1の5'末端ンチセンス・ヌクレオチドは、5'ブロック基によってさらに修飾される。 The first 5 'terminal sense nucleotide and / or the first 5' terminal antisense nucleotide is further modified by 5 'blocking group. この5'ブロック基は、5'−メチル修飾、5'−O−メチル修飾、および5'−アジド修飾からなる群から選択することができる。 The 5 'blocking group, 5'-methyl modification, can be selected from the group consisting of 5'-O- methyl modification, and 5'-azido modified.

別の実施形態では、上記5'末端センス・ヌクレオチドおよび/または5'末端アンチセンス・ヌクレオチドの第1および第2の2'−O−アルキル修飾は、2'−O−メチル修飾であり、さらに上記第1の5'末端センスおよび/またはアンチセンス・ヌクレオチドは、さらに、5'ブロック基を含むことができる。 In another embodiment, the 5 'terminal sense nucleotide and / or 5' terminal antisense first and second nucleotide 2'-O- alkyl modification is a 2'-O- methyl modification, further the first 5 'terminal sense and / or antisense nucleotide, further 5' can include a blocking group. この5'ブロック基は、5'−メチル修飾、5'−O−メチル修飾、または5'アジド修飾からなる群から選択される。 The 5 'blocking group, 5'-methyl modification, 5'-O-methyl modification, or 5' is selected from the group consisting of azido modified. 別の実施形態では、本発明は、アンチセンス鎖およびセンス鎖からなるsiRNAを提供するもので、該センス鎖は、第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドは、第1の2'炭素センス修飾を含み、また第2の5'末端センス・ヌクレオチドは第2の2'炭素センス修飾を含む。 In another embodiment, the present invention is to provide a siRNA consisting antisense strand and sense strand, wherein the sense strand, the first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' terminal sense nucleotide is configured, the first 5 'terminal sense nucleotide comprises a first 2' comprises a carbon sense modification and the second 5 'terminal sense nucleotide and the second 2' including the carbon sense modification.

他の実施形態では、本発明は、siRNAを提供するもので、該siRNAは、(a)センス鎖であって、該センス鎖が第1の5'末端センス・ヌクレオチドおよび第2の5'末端センス・ヌクレオチドから構成され、上記第1の5'末端センス・ヌクレオチドが第1の2'炭素センス修飾を含み、また上記第2の5'末端センス・ヌクレオチドが第2の2'炭素センス修飾を含む、センス鎖と、(b)アンチセンス鎖であって、該アンチセンス鎖は、第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドと第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドとから構成され、上記第1の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドは5'リン酸塩修飾を含み、また上記第2の5'末端アンチセンス・ヌクレオチドは2'炭素アンチセンス修飾を含む、アンチセンス鎖と、を含む。 In another embodiment, the present invention is to provide a siRNA, the siRNA is (a) a sense strand, wherein the sense strand first 5 'terminal sense nucleotide and a second 5' end consists sense nucleotide, the first 5 'terminal sense nucleotide first 2' comprises a carbon sense modification and said second 5 'terminal sense nucleotide second 2' carbon sense modification comprising a sense strand, (b) the antisense strand, the antisense strand is comprised of a first 5 'terminal antisense nucleotide and a second 5' terminal antisense nucleotide, said first 1 of 5 'terminal antisense nucleotide is 5' comprises a phosphate modification, also the second 5 'terminal antisense nucleotide is 2' comprises a carbon antisense modification, including an antisense strand, the.

他の実施形態では、本発明の組成物のいずれかが、さらに3'キャップを含む。 In other embodiments, any of the compositions of the present invention further comprises a 3 'cap. この3'キャップは、例えば、逆位のデオキシチミジンである。 The 3 'cap, for example, a deoxythymidine inversions.

他の実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも1つの2'−デオキシ修飾および/またはメチルホスホネート・ヌクレオチド間連結を含むことができる。 In another embodiment, the compositions of the present invention, and a connection between at least one 2'-deoxy-modified and / or methyl phosphonate nucleotides. 本発明の組成物はまた、1つ以上のピリミジン上に、2'−アルキル修飾、2'−O−アルキル修飾、および2'−ハロゲン修飾から選択される修飾を含む。 The compositions of the present invention also include on one or more pyrimidines, 2'-alkyl modification, 2'-O-alkyl modification, and the modification selected from 2'-halogen modification. 上記2'−アルキル修飾を2'−メチル修飾、例えば2'−O−メチル修飾とすることができる。 The 2'-alkyl-modified 2'-methyl modification can be, for example, 2'-O- methyl modification. 上記2'−ハロゲン修飾を、例えば2'−フッ素修飾とすることができる。 The 2'-halogen modification can be, for example, 2'-fluorine modification.

他の実施形態では、本発明の上記組成物は、少なくとも1つの2'−アミン修飾および/または2'−ハロゲン修飾を含むことができる。 In other embodiments, the composition of the present invention can comprise at least one 2'-amine modification and / or 2'-halogen modification. この2'−アミン修飾は、例えば、2'−NH 修飾である。 The 2'-amine modification, for example, a 2'-NH 2 modifications. 2'−ハロゲン修飾は、例えば、2'−フッ素修飾である。 2'halogen modifications include, for example, a 2'-fluorine modification. 本発明の組成物は、1つ以上の修飾ヌクレオチド間連結を含むことができ、例えば、1つ以上のホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、メチルホスホネート連結、さらにそれらの組み合わせを含むことができる。 The compositions of the present invention may include a connection between one or more modified nucleotides, for example, one or more phosphorothioate linkages, phosphorodithioate connection, methyl phosphonate coupling may further comprise a combination thereof.

本発明の他の実施形態では、上記組成物のいずれかも、コンジュゲートを含むことができる。 In another embodiment of the present invention, it is any of the above compositions may comprise a conjugate. このコンジュゲートは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。 The conjugates can amino acids, peptides, polypeptides, proteins, sugars, carbohydrates, lipids, polymers, nucleotides, it is selected polynucleotides, and combinations thereof. コンジュゲートは、コレステロールまたはPEGであってもよい。 Conjugates may be cholesterol or PEG. コンジュゲートは、さらに、蛍光標識等の標識を含む。 Conjugate further comprise a label such as a fluorescent label. この蛍光標識は、TAMRA、BODIPY、Cy3、Cy5、フルオロセイン、およびDabsy からなる群から選択される。 The fluorescent label, TAMRA, BODIPY, Cy3, Cy5, are selected from the group consisting of fluorescein, and Dabsy l. あるいは、上記蛍光標識は、当技術分野で公知のいずれかの蛍光標識を用いてもよい。 Alternatively, the fluorescent label may be used fluorescent labeling of any of the known in the art.

他の実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも1つの2'−オルトエステル修飾を含み、この2'−オルトエステル修飾が、好ましくは2'−ビス(ヒドロキシエチル)オルトエステル修飾である。 In another embodiment, the compositions of the present invention comprises at least one 2'-orthoester modification, the 2'-orthoester modification, preferably 2'-bis (hydroxyethyl) orthoester modification.

他の実施形態では、本発明の組成物のいずれかがRNA干渉を実施する方法で用いることができ、該方法は、本発明の1種類以上の組成物を細胞に投与することを含む。 In other embodiments, any of the compositions of the present invention can be used in a method of performing RNA interference, said method comprising administering one or more compositions of the present invention to the cells. 好ましくは、オルトエステル修飾がsiRNAに存在し、オルトエステル修飾が2'−ビス(ヒドロキシエチル)オルトエステルである。 Preferably, the orthoester modification is present in the siRNA, orthoester modification is a 2'-bis (hydroxyethyl) orthoester.

ある程度の具体性をもって本発明を記載するために 、ここで実施例が提供される。 To describe the present invention with a certain degree of particularity, wherein examples are provided. これらの実施例は、いかなる形であれ特許請求の範囲の範囲を制限することを意図したものでも制限を加えるものでもない。 These examples are not intended to limit also intended to limit the scope of the appended claims in any way. 本発明は以下の実施例への言及を通して容易に理解されるにもかかわらず、それらは本発明を説明するための手段で、特に言及しない限り、本発明を制限することを意図したものではない。 The present invention despite being readily understood through reference to the following examples, which are by means of illustrating the present invention, unless otherwise specified, are not intended to limit the present invention .

(実施例1) (Example 1)
(siRNAの合成) (Synthesis of siRNA)
RNAオリゴ・ヌクレオチドは、図13に例示したヌクレオチド添加反応サイクルを使用する段階的な方式で合成した。 RNA oligo nucleotides were synthesized in a stepwise manner to use the nucleotide addition reaction cycle illustrated in Figure 13. 合成は、好ましくは、適切な機械上での自動化プロセスとして行う。 Synthesis is preferably carried out as an automated process on a suitable machine. いくつかのこのような合成機械は、当業者に周知である。 Some such synthesis machines are well known to those skilled in the art. 各ヌクレオチドは、固体担体に結合したオリゴ・ヌクレオチドに連続的に加える(3'方位から5'方位)。 Each nucleotide is oligo-nucleotide linked to a solid support continuously added (3 'to 5 azimuth' orientation). ポリスチレン担体が好ましいが、いかなる適切な担体を使用してもよい。 Although polystyrene carrier is preferred, it may be used any suitable carrier. 鎖の3'位末端での第1のヌクレオシドは、固体担体に共有結合的に付着される(固体担体に対する付着)。 The first nucleoside at the 3 'position end of the chain is covalently attached to a solid support (adhesion to the solid support). ヌクレオチド前駆体、ホスホラミダイトやH−ホスホン酸塩などの活性化リボ・ヌクレオチド、およびテトラゾール、たとえば、Sエチル・テトラゾール(他のいかなる適切な活性化因子を使用してもよいが)などの活性化因子を加え(図13のステップi)て、第1のヌクレオシドの5'位末端上へ第2の塩基をカップリングさせる。 Nucleotide precursors, phosphoramidite and H- activated ribonucleotides nucleotides such as phosphonates, and tetrazole, for example, activators such as S-ethyl-tetrazole (may be used any other suitable activators but) Te was added (step i in Figure 13), the second base is coupled to the first 5 'terminal on the nucleoside. 担体を洗浄し、いかなる未反応の5'ヒドロキシル基も、それだけには限定されないが、例えば無水酢酸やフェノキシ無水酢酸などのアセチル化剤でキャップして未反応5'アセチル部位(moieties)を得る(ステップii)。 The support is washed, 5 of any unreacted 'also hydroxyl groups, is not limited, for example, capped unreacted 5 with an acetylating agent such as acetic anhydride or phenoxy acetic anhydride only to it' obtain acetyl site (moieties) (step ii). 次いで、たとえば、t−ブチルヒドロペルオキシドやヨウ素などの適切な酸化剤、および水を用いて、P(III)結合を、より安定で最終的に所望のP(V)結合に酸化する(ステップiii)。 Then, for example, t-Buchiruhidorope Luo Kishido and suitable oxidizing agents such as iodine, and with water, a P (III) binding, oxidized to more stable and ultimately desired P (V) linkage (Step iii ). ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、5'シリル基を、フッ化物イオン(たとえば、フッ化トリエチルアンモニウムまたはフッ化t−ブチルアンモニウム)を用いて切断する(ステップiv) At the end of the nucleotide addition cycle, 5 'silyl group, a fluoride ion (e.g., fluoride triethyl Luer ammonium fluoride or t- butyl luer ammonium) cut using a (step iv). このサイクルを、後続のヌクレオチドそれぞれに対して繰り返す。 This cycle is repeated for each subsequent nucleotide. 図13にはメチル保護基を有するホスホラミダイトを例示するが、ホスホラミダイト部分(moiety)の酸素を保護または置換するために他のいかなる適切な基を用いてもよいことを強調すべきである。 Although FIG. 13 illustrates a phosphoramidite having a methyl protecting group, it should be emphasized that may be used any other suitable group to protect or replace oxygen phosphoramidite moiety (moiety). たとえば、アルキル基、シアノエチル基、またはチオ誘導体をこの位置で使用してもよい。 For example, it may be used an alkyl group, a shear Noe ethyl group or a thio derivative, in this position. さらに、ステップ(i)に入る活性化ヌクレオシドは、異なる種類の活性化のヌクレオシド(例えばH−ホスホン酸塩、メチルホスホラミダイト、またはチオホスホラミダイト)であってもよい。 Furthermore, activated nucleoside entering step (i) is different from the type of activated nucleoside (e.g. H- phosphonate, methylcarbamoyl sulfo Suhoramidaito or Chi Ojo Suhoramidaito,) may be used. 担体に取り付けた初期または '位のヌクレオシドは、シリル基よりむしろジメトキシトリチル基などの異なる5'位保護基を有することができることに留意すべきである。 Initial or 3 attached to the carrier 'nucleoside position is rather different 5, such as dimethyl Toki citrate salicylic group from a silyl group' It should be noted that it is possible to have a position protecting group. 標準のDNA合成化学に使用されるとき、 ジメトキシトリチル基の切断は酸水解を必要とする。 When used in standard DNA synthetic chemistry, cleavage of dimethyl Toki citrate salicylic group requires acid hydrolysis. すなわち、ジクロロ酢酸(DCA)やトリクロロ酢酸(TCA)などの酸は、このステップのために単独で使用される。 That is, an acid such as dichloroacetic acid (DCA) or trichloroacetic acid (TCA) is used alone for this step. DCA切断ステップとは別に、このサイクルを、所望のポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数繰り返す。 Apart from the DCA cutting step, the cycle is repeated as many times as necessary to synthesize the desired polynucleotide.

合成の後に、リン酸塩上の保護基(図13ではメチル基として示したが、必ずしもメチル基に限定されない)を、DMF( ジメルホムアミド)中1モル濃度の二ナトリウム −2−カルバモイル−2−シアノエチレン−1 1− ジチオレート三水和物ジチート)を用いて30分で切断する。 After synthesis, (although shown as FIG. 13, a methyl group, not necessarily limited to methyl group) protecting groups on phosphates and disodium DMF (dimethyl Chi sulfo Le Mua bromide) in 1 molar 2- cut at 30 minutes using a carbamoyl-2-shear Noe styrene -1, 1-dithiadiphosphetane oleate trihydrate (dithiasuccinoyl O La chromatography g). この脱保護溶液は、水を使用している固体担体に結合したオリゴ・ヌクレオチドで洗浄する。 The deprotection solution is washed with oligo-nucleotide linked to a solid support using water. 次いで、担体を、55℃で20分間40%のメチルアミンで処置する。 Then, carrier, treated for 20 minutes 40% of the methylol Rua Min at 55 ° C.. これによって、RNAオリゴヌクレオチドを溶液中に放出し、環外アミンを脱保護(deprotect)し、かつ、2'ACE基上のアセチル保護を除去する。 This releases the RNA oligo nucleotides in solution, deprotects the exocyclic amines (deprotect), and to remove an acetyl protection on 2'ACE group. オリゴヌクレオチドは、この段階で陰イオン交換型HPLC(高速液体クロマトグラフィ)によって分析することができる。 Oligo nucleotides can be analyzed at this stage by anion exchange HPLC (High Performance Liquid Chromatography).

除去が所望される場合、2'オルトエステル基は、除去される最後の保護基である。 If removal is desired, 2 'orthoester groups are the last protecting groups to be removed. 2'脱保護の直前の2'ACEで保護されたRNAの構造は、図14に示すとおりである。 Structure of protected RNA in 2'ACE immediately before the 2 'deprotection is shown in FIG. 14.

自動化処理の場合、最初のヌクレオシドを有する固体担体を、合成装置に取り付ける。 For automated processing, a solid support having a first nucleoside attached to the synthesizer. この装置は、合成のために必要とされる全ての必要な補助剤と単量体を含む。 The apparatus includes all the necessary auxiliary agents and monomers that are required for the synthesis. 試薬は不活性ガス下に維持する。 Reagents are maintained under an inert gas. というのは、不活性ガス下に維持しない場合、いくつかの単量体は加水分解するおそれがあるからである。 Because, if not maintained under an inert gas, some monomers there is a hydrolyzing fear. 全てのラインを試薬で充填するように装置を準備する。 Prepare the device to fill all lines in the reagent. 合成サイクルに従って正しい順序の試薬の分配を規定する合成サイクルを設計して、図13で指定される順序で試薬を分配する。 Designing a synthesis cycle that defines the distribution of the correct order of the reagent according to the synthesis cycle, dispensing reagents in the order specified in Figure 13. サイクルが一旦規定されると、加えるべき各試薬の量が規定され、ステップ間の時間が規定され、かつ洗浄ステップが規定され、また、最初のヌクレオシドを有する固体担体が一旦加えられると合成が進行する準備ができる。 When the cycle is once defined, is prescribed quantity of each reagent to be added, the time between steps is defined, and the washing steps are defined, also, synthesis proceeds with a solid carrier is added once with a first nucleoside ready to can.

本明細書に記載されたRNA類似体に関して、修飾は、3つの異なる一般的な方法で実施される。 Respect RNA analogs described herein, modification is carried out in three different general methods. 第1は、炭水化物および塩基修飾に関して実施されるもので、同様にある種のリンカーおよびコンジュゲートの導入に対しても実施され、修飾が既に存在する修飾ホスホラミダイトを用いる。 The first is intended to be performed on carbohydrates and base modifications, similarly also performed on the introduction of certain linkers and conjugates, modifications used already exists qualified phosphoramidite. このような修飾の例は、炭水化物2'位の修飾種 (2'−F、2'−NH 、2'−O−アルキル、等) であり、2'位のオルトエステルが、所望の修飾で置換されている。 Examples of such modifications, carbohydrates 2 'position of qualified species (2'-F, 2'-NH 2, 2'-O- alkyl, etc.) der is, 2' orthoester-position, optionally It has been replaced with modifications. フルオロセイン誘導体、ダシル(Dabsyl)、コレステロール、シアニン誘導体、またはポリエチレン・グリコールなどの3'位または5'位末端修飾もまた、導入することができる Fluorescein derivatives, Da Bed sill (Dabsyl), cholesterol, cyanine derivatives, or 3 'position or 5' position terminal modifications, such as polyethylene glycol can also be introduced. 特定のヌクレオチド間結合修飾もまた 、入って来る反応性ヌクレオシド介在物を介して導入される。 Specific linkage modifications also Ru is introduced via a reactive nucleoside inclusions incoming. 得られるヌクレオチド間結合修飾のは、限定されるものではないがメチルホスホン酸塩、ホスホアミダート、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートを含む。 Examples of the resulting linkage modifications include, but are not limited to including methylphosphonate, phospho b amidate, a phosphorothioate or phosphorodithioate.

同じまたは類似のサイクルを用いて、多くの修飾因子を、使用することができる。 The same or with similar cycles, the number of modifiers can be used. このクラスのは、たとえば、2‐アミノプリン、5−メチルシチジン、5−アミノアルウリジン、ジアミノプリン、2−O−アルキル、マルチ原子スペーサー類、単一の単量体スペーサー、2'アミノヌクレオシド、2'フッ化ヌクレオシド、5−ヨードウリジン、4−チオウリジン、アクリジン、5−ブロモウリジン、5−フルオロシチジン、5−フルオロウリジン、5−ヨードウリジン、5−ヨードシチジン、5−ビオチンチミジン、5−フルオロセインチミジン、イノシン、プソイドウリジン、脱塩基単量体、ネブラリン (nebularane)、 ザヌクレオシド、ピレンヌクレオシド、アザヌクレオシド等を含む。 Examples of this class, for example, 2-aminopurine, 5-methylcarbamoyl Cie cytidine, 5-amino Noah Li Lu lysine, diaminopurine, 2-O-alkyl, multi-atom spacer compound, single monomeric spacer, 2 'amino nucleoside, 2' fluorinated nucleosides, 5-iodo-uridine, 4-thiouridine, acridine, 5-bromo uridine, 5-fluorocytidine, 5-fluorouridine, 5-iodo uridine, 5-yaw de shea cytidine, 5- biotin inch spermidine, 5-fluoro-Say inch thymidine, inosine, pseudouridine, abasic monomer, Nebula phosphorus (nebularane), de a the nucleoside, pyrene N'nu Kureoshido, including the a the nucleoside or the like. しばしば、合成における残りのステップは、標準の脱保護条件になりやすい置換基を導入する修飾を除き同じままである。 Often, the remaining steps in the synthesis are except for modifications to introduce prone substituents standard deprotection conditions to the same or. ここでは、修飾条件は、置換基に影響を及ぼさないものが使用される。 Here, the modified conditions, which does not affect the substituents Ru is used. 第2の、特定のヌクレオチド間結合修飾は、それらの導入を可能にする酸化ステップの変更を要求する。 Second, between specific nucleotide linkage modification requests to change the oxidation step that allows their introduction. このクラスのは、 元素硫黄または別の適切な硫黄移動剤による酸化剤が必要であるホスホロチオエート類とホスホロジチオエート類を含む。 Examples of this class include elemental sulfur or another is required oxidizing agent with a suitable sulfur transfer agents phosphorothioates and phosphorodithioates such. 第3の、特定のコンジュゲートと修飾は、「後合成工程」により導入され、そこで、固相合成が完了した後、所望の分子が生体高分子に加えられる。 Third, the specific conjugate and modified, introduced by "post synthesis step", where, after the solid phase synthesis is completed, the desired molecules are added to the biopolymers. これの例は、ポリエチレングリコールを、炭化水素リンカーに付着した一級アミンを含む予備合成されたオリゴヌクレオチドに添加することである。 This example is a polyethylene ring recall, is the child added to the pre-synthesized oligonucleotide comprising a primary amine attached to a hydrocarbon linker. この場合の取付けは、溶液相反応でポリエチレングリコールのN−ヒドロキシサクシニミジル(succinimidyl)エステルを用いて、実現することができる。 Mounting in this case, using N- hydroxy parallax Kushinimijiru (succinimidyl) esters of polyethylene ring recall in solution phase reactions can be realized.

ここで、合成RNAとその類似体の合成のための最も好ましい方法を概説してきたが、これらの分子をアセンブルすることができるいかなる核酸合成法もそれらのアセンブリに使用することができるはずである。 Here, it has been outlined synthetic RNA and the most preferred method for the synthesis of analogs thereof, any nucleic acid synthesis method which is capable of assembling these molecules should also be able to use their assembly. 代替方法の例には、5'DMT−2'TBDMSおよび5'DMT−2'TOMの合成手法を含む。 Examples of alternative methods, including synthesis techniques 5'DMT-2'TBDMS and 5'DMT-2'TOM. いくつかの2'−O−メチル、2'−F、および主鎖修飾は、たとえば、修飾型および野生型T7、ならびにSP6ポリメラーゼを用いる転写反応に導入することができる。 Several 2'-O- methyl, 2'-F, and backbone modifications, for example, can be introduced into the transcription reaction using modified and wild-type T7, and SP6 polymerases.

(修飾RNAを合成すること) (Possible to synthesize a modified RNA)
以下のガイドラインは、修飾RNAの合成のために提供し、当技術分野で知られているいかなる自動合成器にも容易に適合することができる。 The following guidelines can be provided for the synthesis of modified RNA, also fit easily into any automated synthesizer known in the art.

(3'位末端修飾) (3 'end modifications)
3'位修飾を組み込むためのいくつかの方法がある。 There are several methods for incorporating the 3 'modification. 3'位修飾は、当技術分野で周知の方法を用いて、 選択された固体担体上へ固着または搭載 (load)」することができる。 3 'modification, using methods well known in the art, may be secured or "mounting (load)" onto a solid support selected. 代替として、3'位修飾を、ホスホラミダイトとして使用することができる。 Alternatively, the 3 'modification can be used as a phosphoramidite. このホスホラミダイトは、標準の合成方法を用いて一般的な担体にカップリングさせ、この一般的な担体は、所望の末端修飾の活性化ホスホラミダイトを導入することによって3'位末端修飾が生成されるヒドロキシルを提供する。 The phosphoramidites hydroxyl and coupled to a common carrier using standard synthetic methods, this general carriers, the 3 'position terminal modified by introducing an activated phosphoramidite desired terminal modifications produced I will provide a. 代替として、ポリヌクレオチドが固体担体から除去された後、後合成的に3'位修飾を導入することもできる。 Alternatively, after the polynucleotide has been removed from the solid support, it can be introduced post-synthetically 3 'modification. 遊離ポリヌクレオチドは、最初は、 選択された修飾の適切に活性化された形態と反応する3'位末端のヒドロキシルアミノ、チオール、またはハロゲンを有する。 Free polynucleotide initially has hydroxy Rua amino 3 'position end of reacting with an appropriately activated for the selected modified form, thiol, or halogen. は、それだけには限定されないが、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、チオエーテル、 ジスルフィド、マレイミド(maliemido)またはハロアルキルの反応を含む。 Examples include, but are not limited to, include N- hydroxy-cis Kushin'imiji Rue ester, Ji Oe ether, disulphide, the reaction between Ray bromide (maliemido) or haloalkyl. この修飾は、今や、ポリヌクレオチドの3'位末端になる。 This modification is now made to the 3 'position end of the polynucleotide. 後合成的にコンジュゲート化することができる修飾の例は、それだけには限定されないが、フルオロセイン(fluoroscein)類、アクリジン類、TAMRA、ダブシル(dabsyl)、コレステロール、ポリエチレングリコール類、マルチ原子スペーサー類(multi−atom spacer)、シアニン類、脂質類、 炭水化物類、脂肪酸類、ステロイド類、ペプチド類、またはポリペプチド類であってもよい。 Examples of post-synthetically modified which can be conjugated include, but are not limited to, fluorescein (Fluoroscein) compounds, acridines, TAMRA, Dabcyl (dabsyl), cholesterol, polyethylene glycol, multi-atom spacer compound ( multi-atom spacer), cyanines, lipids, carbohydrates, fatty acids, steroids, may be peptides or polypeptides.

(5'位末端修飾) (5 'end modifications)
5'位修飾をポリヌクレオチド内に導入するいくつかの方法がある。 5 'modification of a number of ways to be introduced into the polynucleotide. 例えば、5'修飾を有するヌクレオチドは購入することができ、そしてその後ホスホラミダイトで活性化することができる。 For example, it is possible to the nucleotide having a 5 'modification can be purchased and activated with subsequent phosphoramidite. 5'位修飾を有するこのホスホラミダイトも、商業的に入手可能である。 The phosphoramidite with 5 'modification is also commercially available. 次いで、5'位修飾を有する活性化ヌクレオシドを、他のいかなる活性化ヌクレオシドも使用できるのと同様にサイクルに使用する。 Then, the activated nucleoside having a 5 'modification, also used cycles Just as you can use any other activated nucleoside. しかし、全ての5'位修飾が、ホスホラミダイトとして使われる訳ではない。 However, all of the 5 'modification, not to be used as a phosphoramidite. このような場合には、5'位修飾は、3'位修飾の場合に上記で記載した類似の方法で導入することができる。 In such a case, 5 'modification is 3' can be introduced in a similar manner to that described above in the case of position modification.

(チオエート) (Thioate)
ホスホロチエート結合などの1つまたは複数のチオエート部分を有するポリヌクレオチドを、上記で説明しかつ図13に例示した合成サイクルに従って作製した。 Polynucleotides having one or more thioate moiety such Hosuhorochieto binding was prepared in accordance with the illustrative synthetic cycle Description vital Figure 13 above. しかし、t−ブチルヒドロペルオキシドの酸化ステップの代わりに、 元素硫黄または別の硫化剤を使用した。 However, instead of the oxidation step of t- butyl Ruhi mud peroxide, using elemental sulfur or another sulfurizing agent.

(5'位チオ修飾) (5 'thio modifications)
5'位チオールを有する単量体は、グレン・リサーチ(Glen Research)などの商業的な供給元から、ホスホラミダイトとして購入することができる。 5 'position monomer having a thiol from commercial sources, such as Glen Research (Glen Research), can be purchased as phosphoramidites. これらの5'位チオール修飾単量体は、一般的に、トリチル保護基を担持する。 These 5 'thiol modified monomers, generally carrying a trityl protecting group. 合成の後に、このトリチル基は当技術分野で周知のいかなる方法によっても除去することができる。 After synthesis, the trityl group may be removed by any method known in the art.

(他の修飾) (Other modifications)
特定の修飾のために、この合成サイクルの諸ステップは、いくらか変わる。 For certain modifications, the steps of the synthesis cycle, vary somewhat. たとえば、3'の末端が逆のチミジン(dT)を有する場合 (第1の塩基が5'水酸基によって固体担体に付着され、第1のカップリングが3'−3'結合である)では、脱トリチル化およびカップリングがより緩やかに生じるので、ジクロロ酸(DCA)などの過剰な脱トリチル化剤を用いるべきであり、カップリング時間を300秒まで増加させるべきである。 For example, the 'where the terminal of having inverted thymidine (dT) (the first base is 5' 3 by hydroxyl is attached to a solid support, the first coupling is 3'-3 'linkage), since detritylation and coupling occurs more slowly, should be used an excess of detritylation agent such as dichloro acetic acid (DCA), it should increase the coupling time to 300 seconds. いくらかの5'修飾は、 長いカップリング時間を必要とすることある。 Some 5 'modifications are possible and require a long coupling time. は、コレステロールと、Cy3またはCy5ビオチンのようなフルオロフォア 、ダブシル(dabsyl)、アミノリンカー類、チオリンカー類、スペーサー類、ポリエチレングリコール、リン酸化剤、BODIPYまたは光切断可能なリンカーなどを含む。 Examples are fluorophores such as cholesterol and, Cy3 or Cy5 biotin, dabcyl (dabsyl), Ami glue anchor such, Ji sediment linker compound, a spacer such, polyethylene packaging recall, the phosphorylating agent, a BODIPY or photocleavable linker including etc..

ポリヌクレオチドが一つの修飾だけを有する場合、この修飾は、部分的に構築されたポリヌクレオチドをその上に有した担体を取り出し、修飾を有する単量体手動でカップリングし、次いで自動合成器中担体を再び配置しそして自動合成を再開することによって、手動で最も効率的に実施することができることに留意すべきである Where the polynucleotide has only one modified, the modification is partially constructing polynucleotides removed carrier having thereon coupling manually monomer having a modified, then automatic synthesizer again placing the carrier into and by resuming the automatic synthesis, it should be noted that it is possible to most efficiently performed manually.

(実施例2) (Example 2)
(担体からの合成オリゴの脱保護および切断) (Deprotection and cleavage of the synthesized oligonucleotide from the support)
切断は、手動で、または機械上で自動化したプロセスで行った。 Cleavage was carried out manually or in an automated process on a machine. ヌクレオチド間連結からの保護部分、例えばメチル基、の切断は、当技術分野で知られているいかなる適当な切断試薬、例えばジチオレートまたはチオフェノール、を使用することによって達成することができる。 Protecting moiety from internucleotide linkage, for example a methyl group, the cleavage of any suitable cutting reagents known in the art, can be achieved by using e.g. dithiolate or thiophenol, a. DMF中1モルのジチオレートを室温で10〜20分間にわたって固体担体に加える。 Add to the solid support for 10-20 minutes at room temperature 1 mole of dithiolate in DMF. 次いで担体を、例えばDMFで、それから水、そしてアセトニトリルで完全に洗浄する。 Then the carrier, for example, DMF, then water, and thoroughly washed with acetonitrile. 別法として、水での洗浄、それに引く完全なアセトニトリルでの洗浄は、いかなる残留ジチオレートを除去するのにも十分である。 Alternatively, washing with water, washing with full acetonitrile pulling it is also sufficient to remove any residual dithiolate.

担体からのポリヌクレオチドの切断および環外塩基保護の除去は、40%のN−メチルアミン(NMA)水溶液を用いて、引き続き20分間にわたって55℃まで加熱することによって行うことができる。 Removal of cleavage of a polynucleotide from the carrier and exocyclic base protection can be carried out by heating with 40% N- methylamine (NMA) aqueous solution, for continued 20 minutes until 55 ° C.. 一旦、ポリヌクレオチドが溶液中に存在したら、固体担体からNMAを慎重に除去する。 Once a polynucleotide Once in solution, carefully remove the NMA from the solid support. 次いで、ポリヌクレオチドを含有する溶液を、真空下でNMAを除去するまで乾燥させる。 Then, a solution containing the polynucleotide, dried to remove the NMA under vacuum. 二本鎖化(duplexing)、脱塩、ゲル精製、品質制御などを含むさらなる加工処理は、当技術分野で知られているいかなる方法によっても実施することができる。 Two stranded (duplexing), desalted, gel-purified, further processing, including quality control can be carried out by any method known in the art.

いくつかの修飾のために、NMAステップを変更してもよい。 For some modifications, it may change the NMA step. 例えば、3'アミノ修飾については、NMAでの処理は55℃で40分間にしなければならない。 For example, 3 for 'amino modification, treatment with NMA must be made 40 minutes at 55 ° C.. ピューロマイシン、5'末端アミノ結合修飾、および2'アミノヌクレオシド修飾は、40%のNMAを追加した後、1時間にわたって加熱する。 Puromycin, 5 'terminal amino linkage modification, and 2' Ami Nonu Kureoshido modification after adding a 40% NMA, heated for 1 hour. Cy5で修飾したオリゴヌクレオチドは、遮光しながら、24時間にわたって水酸化アンモニウムで処理する。 Oligonucleotides modified with Cy5, while shading and treated with ammonium hydroxide for 24 hours.

(切断試薬の調製) (Preparation of cleavage reagent)
HPLC等級の水および合成等級のアセトニトリルを使用する。 Using acetonitrile water and synthetic grade HPLC grade. ジチオレートは、結晶として予め調製されたものである。 Dithiolate are those that are previously prepared as crystals. 4.5グラムのジチオレート結晶を90mLのDMFに添加する。 4.5 adding grams of dithiolate crystals of DMF 90 mL. 40パーセントのNMAは、Sigma Aldrich社などの供給元から、購入することができ、使用の準備ができている。 40% of the NMA is, from sources such as Sigma Aldrich, Inc., can be purchased, it is ready for use.

(一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリング) (Annealing of single-stranded polynucleotide)
一本鎖(Single stranded)ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られているいかなる方法によって、いかなる適当な緩衝液を使用してもアニールすることができる。 Single-stranded (Single stranded) polynucleotides by any method known in the art, the use of any suitable buffer may be annealed. 例えば、等しい量の各々の鎖を、適当な緩衝液、例えば、50mMのHEPES pH7.5、100mMの塩化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、に混合することができる。 For example, an equal amount of each chain, a suitable buffer, for example, can be mixed potassium chloride HEPES pH 7.5, 100 mM of 50 mM, magnesium chloride 1 mM, to. 混合物を1分間にわたって90℃で加熱し、室温まで冷却する。 The mixture for 1 minute and heated at 90 ° C., cooled to room temperature. 他の例では、それぞれ50ミクロモル濃度となるように、各ポリヌクレオチドを別々に調製する。 In another example, as each of 50 micromolar concentration, to prepare each polynucleotide separately. 次いで、30ミクロリットルの各々のポリヌクレオチド溶液を、15マイクロリットルのアニーリング緩衝液(×5)と一緒に管に加える。 Then, each of the polynucleotide solution at 30 microliters, is added to the tube along with annealing buffer 15 microliters (× 5). ここで、アニーリング緩衝液の最終濃度は、100mMの塩化カリウム、30mMのHEPES−KOH pH7.4、および2mMの塩化マグネシウムである。 Here, the final concentration of annealing buffer, 100 mM potassium chloride, 30 mM of HEPES-KOH pH 7.4, and magnesium chloride 2 mM. 最終的な体積は75ミクロリットルである。 The final volume is 75 microliters. 次いで溶液を、90℃で1分間にわたってインキュベートし、15秒間にわたって遠心機で回転させ、1時間にわたって37℃でインキュベートした後に、室温に戻す。 The solution was then incubated for 1 minute at 90 ° C., spun on a centrifuge for 15 seconds, after incubation at 37 ° C. for 1 hour, returned to room temperature. 次いで溶液を、マイナス20℃で冷凍貯蔵し、5回まで凍結融解させることができる。 Then solution was stored frozen at minus 20 ° C., it can be freeze-thawed up to 5 times. 二本鎖の最終濃度は、20マイクロモルである。 The final concentration of duplex is 20 micromolar. ポリヌクレオチド貯蔵のための適当な緩衝液の例は、20mMのKC 、6mMのHE PE S pH7.5、0.2mMのMgC である。 Examples of suitable buffers for polynucleotide storage is, 20 mM of KC l, it is MgC l 2 of HE PE S pH7.5,0.2mM of 6 mM. 使用される全ての緩衝液は、RNaseを含まないものでなければならない。 All buffers to be used must be free of RNase.

(オルトエステル部分の除去) (Removal of ortho ester moiety)
所望する場合、オルトエステル部分またはその複数部分は、当技術分野で知られているいかなる適当な方法によっても、ポリヌクレオチドから除去することができる。 If desired, the ortho ester moiety or portions thereof, by any suitable method known in the art, can be removed from the polynucleotide. そのような方法は、揮発性の酢酸テトラメチレンジアミン(TEMED)pH3.8緩衝系を使用する。 Such method uses a volatile acid tetramethylenediamine (TEMED) pH 3.8 buffer system. その緩衝系はオルトエステル部分またはその複数部分の除去後に凍結乾燥によって除去することができる。 Its buffer system can be removed by lyophilization after removal of the ortho ester moiety or portions thereof. 3.0を超えるpHでの脱保護は、リン酸ジエステル主鎖の酸触媒による切断の可能性を最小にする助けとなる。 Deprotection with pH above 3.0 can help to the possibility of cleavage by acid catalyzed phosphodiester backbone minimized. 例えば、脱保護は、オルトエステルで保護されているポリヌクレオチドを懸濁させ、60℃で30分間にわたってインキュベートすることによって、TEMEDでpHを3.8に調節した100mMの酢酸を使用して達成することができる。 For example, deprotection, was suspended polynucleotide that is protected by ortho ester by incubation for 30 minutes at 60 ° C., achieved using 100mM of acetate the pH was adjusted to 3.8 with TEMED be able to. 溶液を次いで、凍結乾燥させるか、使用前に乾燥させるために素早く真空下(SpeedVac)におく。 The solution is then either freeze-dried and placed under a quick vacuum to dry prior to use (SpeedVac). 必要に応じて、脱保護後の脱塩は、当技術分野で知られているいかなる方法、例えば逆相カートリッジのエタノール沈殿または脱塩、によって実施することができる。 If necessary, desalting after deprotection, any method known in the art, can be carried out, for example reverse phase cartridge ethanol precipitation or desalting by.

(実施例3) (Example 3)
(RNA干渉での使用に向けて合成したsiRNA) (Synthesized siRNA is directed to the use of an RNA interference)
以下は、Dharmacon社の登録商標のACE試薬を使用して合成され、設計され、ここに記載される本発明に従って使用される、ジdTオーバーハングを有する19量体のsiRNAのリストである。 The following are synthesized using ACE reagent Dharmacon's trademark, is designed, here are used according to the invention described, a list of the 19 mer siRNA having a di dT overhangs. 「SEAP」は、人間の分泌されたアルカリホスファターゼを意味する。 "SEAP" refers to a human secreted Arca Riho phosphatase. 「ヒト・シクロ」は、ヒト・シクロフィリンを意味する。 "Human cyclo" refers to a human cyclophilin. ヌクレオチド単位間の星印は、ホスホロチオエート結合である修飾ヌクレオチド間連結を意味する。 Stars between nucleotides units refers to modified linkages are phosphorothioate linkages. 構造2'−F−Cまたは2'−F−Uは、リボシル部分の2'炭素に付着したフッ素を有するヌクレオチド単位を意味する。 Structure 2'-F-C or 2'-F-U refers to a nucleotide unit having a fluorine attached to the 2 'carbon of a ribosyl moiety. 構造2'−N−Cまたは2'−N−Uは、リボシル部分の2'炭素に付着した−NH 基を有するヌクレオチド単位を意味する。 Structure 2'-N-C or 2'-N-U refers to a nucleotide unit having a 2 '-NH 2 group attached to the carbon of a ribosyl moiety. 構造2'−OME−Cまたは2'−OME−Uは、CsまたはUsのいずれかのリボシル部分の2'炭素で、それぞれ2'−O−メチル修飾がむき出しになった(baring)ヌクレオチド単位を意味する。 Structure 2'-OME-C or 2'-OME-U is a 2 'carbon of one of a ribosyl moiety of Cs or Us, 2'-O-methyl modification are bared each (Baring) nucleotide unit means. dG、dU、dA、dC、およびdTは、2'位に関してデオキシであり、代わりにリボシル部分の2'炭素に付着した水素を有するヌクレオチド単位を意味する。 dG, dU, dA, dC, and dT is 'deoxy respect position, 2 ribosyl moieties in place' 2 means a nucleotide unit having a hydrogen attached to the carbon. 特に記載されない限り、以下のリストにある全てのヌクレオチド単位は、2'炭素に−OHを有するリボシルである。 Unless otherwise indicated, all nucleotide units in the following list, which is ribosyl having an -OH at the 2 'carbon.

(実施例4) (Example 4)
(RNA干渉の実施) (Implementation of the RNA interference)
(形質移入) (Transfection)
siRNA二本鎖を、標準の緩衝液(50ミリモルのHEPES pH7.5、100ミリモルのKC 、1mMのMgCl )を使用してアニールした。 The siRNA duplexes were annealed using standard buffer (50 mM HEPES PH7.5,100 mM KC l, 1 mM of MgCl 2) a. 形質移入は、後述する標準プロトコルに従って行う。 Transfection is carried out according to standard protocols described below.

(96穴プレートおよび6穴プレートのための標準形質移入プロトコル:siRNA) (96 standard transfection protocols for well plates and 6-well plates: siRNA)
1.293およびCalu6のためのプロトコル、HeLa、MDA 75は同一である。 1.293 and protocols for Calu6, HeLa, MDA 75 are identical.
2. 2. 細胞は、形質移入の日に95%の集密的であるように平板培養される。 Cells are plated as 95% confluent on the day of transfection.
3. 3. SuperRNAsin(Ambion)が、RNAsesに対する防御のために形質移入混合物に加えられる。 SuperRNAsin (Ambion) is added to the transfection mixture for protection against RNAses.
4. 4. 全ての溶液と取扱いは、RNAseを含まない条件下で実施しなければならない。 All solutions and handling, must be carried out under conditions that do not contain RNAse.
プレート1 小さなフラスコにおいて25ml媒体の0.5〜1ml、または大きいフラスコにおいて50ml媒体の1ml。 Plate 1 of 25ml medium in a small flask 0.5~1ml or greater in flask 50ml medium 1 ml,.

(96穴プレート) (96-well plate)
1.3mlの0.05%トリプシン−EDTAを培養フラスコ(6インチ大)に添加して5分間、37℃でインキュベート。 And 0.05% trypsin -EDTA of 1.3ml in culture flasks (Univ 6 inches) by 5 minutes, incubated at 37 ° C..
2.7ml(14ml大)の通常培地の添加およびピペッティング10回繰り返して、細胞を再懸濁。 2.7 ml (14 ml Univ.) Usually repeated addition and pipetting 10 times medium, resuspend the cells.
3. 3. ステップ2から細胞懸濁液を25マイクロリットル採取し、75マイクロリットルのトリパンブルー染色(1:4)および細胞カウンターに10マイクロリットル入れる。 Step 2 cell suspensions from the then 25 microliters harvested 75 trypan blue staining microliters (1: 4) and cell counter Add 10 microliters.
4. 4. 標準血球計算板で細胞数を計数。 Counting the number of cells in a standard hemocytometer.
5. 5. 細胞平均数x4x10000は、1mlあたりの細胞数。 Cell average number x4x10000, the number of cells per 1ml.
6. 6. 通常培地で希釈して350000/mlにする。 Diluted with normal medium to 350000 / ml.
7.100マイクロリットル(HEK293では35,000細胞)を96穴プレートにプレーティング。 7.100 plated microliters (35,000 cells in HEK293) in 96 well plates.

(2×96穴プレート(60穴フォーマット)に対する形質移入) (2 × 96 well plate (60 well format) transfection for)
1. PTI−MEM 2 ml + 80マイクロリットルのLipofectamine 2000(1:25)+ 15 マイクロリットルのSuperRNAsin(AMBION)。 O PTI-MEM 2 ml + 80 Lipofectamine 2000 (1:25) microliters + 15 microliters SuperRNAsin (AMBION).
2. 2. 等分量(アリコート)のsiRNA(スクリーニング用100マイクロモル、0.8マイクロリットル(全希釈比は、1:7 0、0.8マイクロリットルの100マイクロモル溶液で最終濃度100ナノモルを得る)を所望のオーダーで深皿に移す(通常、60穴フォーマットに対して3カラムx6、または96穴に対して4カラムx8)。 SiRNA (100 micromoles for screening aliquots (aliquots), 0.8 microliters (total dilution ratio is 1: 7 5 0, 0.8 obtain 100 micromolar solution at a final concentration of 100 nmol microliters) of transferred to deep dish with a desired order (typically, four columns x8 to three columns x6 or 96 for 60-well format).
3.100マイクロリットルのOPT1−MEMを移す。 3.100 Transfer the OPT1-MEM of micro liter.
4. 4. Lipofectamine 2000およびSuperRNAsinとともに100マイクロリットルのOPT1−MEMを各ウエルに移す。 Lipofectamine 2000 and SuperRNAsin with transferring the OPT1-MEM of 100 microliters to each well.
5. 5. 室温(RT)に20〜30分放置。 20 to 30 minutes left at room temperature (RT).
6. 6. 各ウエルに0.55mlの通常培地を添加。 It added to the normal medium of 0.55ml to each well. プレートをフィルムで覆って混合。 Mixing covering the plate in the film.
7.100x3x2を直接、細胞に対してアレイ・アウト(2枚のプレートに十分)。 7.100x3x2 directly, (enough to two plates) array out to the cell.

(2×6穴プレートに対する形質移入) (Transfection for 2 × 6 well plates)
8.8ml OPTI−MEM +160マイクロリットル Lipofectamine 2000(1:25)、30マイクロリットルのSuperRNAsin(AMBION)。 8.8ml OPTI-MEM +160 microliters of Lipofectamine 2000 (1:25), of 30 microliters SuperRNAsin (AMBION).
9. 9. 等分量のsiRNA(全希釈比は、1:750、5マイクロリットルの100マイクロモル溶液によって最終濃度100ナノモルを得る)をポリスチレン管に移す。 Aliquot of siRNA (total dilution ratio is 1: 750,5 give a final concentration of 100 nanomolar by 100 micromolar solution microliters) was transferred to polystyrene tubes.
10. 10. Lipofectamine 2000およびSuperRNAsin(AMBION)とともに1,300マイクロリットルのOPT1−MEMを移す。 Lipofectamine 2000 and SuperRNAsin (AMBION) along with the transfer of OPT1-MEM of 1,300 micro liter.
11. 11. 室温(RT)で20〜30分間放置。 Standing for 20 to 30 minutes at room temperature (RT).
12. 12. 各ウエルに0.55mlの通常培地を添加。 It added to the normal medium of 0.55ml to each well. プレートをフィルムで覆って混合。 Mixing covering the plate in the film.
13.2mlを各ウェルに移す(2ウエルにとって十分)。 Transfer the 13.2ml to each well (enough for 2 well).

mRNAまたはタンパク質濃度を、標準キットまたはCustom B−DNAセットおよびQuantigene キット(Bayer)を用いて、形質移入後24、48、72、および96時間で測定する。 MRNA or protein levels, using standard kits or Custom B-DNA set and Quantigene kit (Bayer), measured after transfection 24, 48, 72, and 96 hours.

(実施例5) (Example 5)
(活性の測定/検出) (Activity of the measurement / detection)
siRNA誘導RNA干渉のレベル、または遺伝子サイレンシングを、標的mRNAレベルまたは対応のタンパク質レベルによって評価した。 Level of siRNA induced RNA interference or gene silencing was evaluated by the target mRNA levels or the corresponding protein level. mRNAレベルのアッセイは、B−DNA(商標)技術(Quantagene Corp.)を用いて実施した。 Assay of the mRNA levels was performed using B-DNA (TM) technology (Quantagene Corp.). fLUCおよびrLUCに対するタンパク質レベルは、STEADY GLO(商標)キット(Promega Corp.)によってアッセイした。 Protein levels for fLUC and rLUC were assayed by STEADY GLO (TM) kit (Promega Corp.). トアルカリホスファターゼレベルは、Great EscAPe SEAP Fluorescence Detection Kits(#K2043−1)、BD Biosciences,Clontech. Human Tor Luke Riho Sufata zero level is, Great EscAPe SEAP Fluorescence Detection Kits ( # K2043-1), BD Biosciences, Clontech. を用いてアッセイした。 It was assayed using.

(実施例6) (Example 6)
(2'−デオキシ修飾/ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子) (2'-deoxy-modified / firefly luciferase gene)
センス鎖およびアンチセンス鎖にある2つのタンデム2'−デオキシ修飾を持つsiRNAの機能的効果を、19量体領域の相補性とジdTオーバーハングを二本鎖の3'末端に有する21量体siRNAに導入することで、系統的に試験した。 The functional effects of siRNA with two tandem 2'-deoxy modifications in the sense strand and antisense strand, 21 mer having complementarity and di dT overhangs 19 mer region at the 3 'end of the duplex by introducing the siRNA, it was systematically tested. siRNAは、HEK293細胞に導入したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子(fLUC5)に向けられた。 siRNA is directed to the firefly luciferase gene (fLUC5) which was introduced into HEK293 cells. siRNA機能性を上記したようにして測定した。 The siRNA functionality was measured as described above. 毒性は、ALMARブルーで測定したところ、影響を受けていないように見えた。 Toxicity was measured by ALMAR blue, it appeared to be unaffected. 機能性は、3通りの濃度で評価した。 Function was evaluated at a concentration of three ways. すなわち、1、10、および100nM最終。 In other words, 1, 10, and 100nM final. 使用したsiRNAの配列、および2'−デオキシ修飾の置換を、表1に示す。 Sequences of siRNA used were, and 2'-substitutions deoxy modifications, shown in Table 1. これらの実験の結果を図19−23に示す。 The results of these experiments are shown in Figure 19-23.

(実施例7) (Example 7)
(2'−O−メチル修飾/ホタルルシフェラーゼ遺伝子) (2'-O-methyl modification / firefly luciferase gene)
センス鎖およびアンチセンス鎖に単一2'−O−メチル修飾、2つのタンデム2'−O−メチル修飾、および3つのタンデム2'−O−メチル修飾を持つsiRNAの機能的効果を、19量体領域の相補性とジdTオーバーハングを二本鎖の3'末端に有する21量体siRNAに導入することで、系統的に試験した。 Single 2'-O- methyl modifications on the sense strand and antisense strand, two tandem 2'-O- methyl modification, and the functional effect of siRNA with three tandem 2'-O- methyl modification, 19 weight complementarity and di dT overhang of the body region by introducing a 21-mer siRNA having a 3 'end of the duplex, was systematically tested. siRNAは、HEK293細胞に形質移入されたホタル・ルシフェラーゼ遺伝子(fLUC5)に向けられた。 siRNA is directed to transfected firefly luciferase gene (fLUC5) into HEK293 cells. siRNA機能性は、以下のように測定した。 siRNA functionality, was measured as follows. 機能性は、3通りの濃度で評価した。 Function was evaluated at a concentration of three ways. すなわち、1、10、および100nM最終。 In other words, 1, 10, and 100nM final. 毒性は、ALMARブルーで測定したところ、影響を受けていないように見えた。 Toxicity was measured by ALMAR blue, it appeared to be unaffected. 使用したsiRNAの配列および2'−O−メチル修飾の配置は、表5に示す。 Placement sequence and 2'-O- methyl modification of siRNA used were shown in Table 5. これらの実験の結果を図24〜28に示す。 The results of these experiments are shown in Figure 24-28.


(実施例8) (Example 8)
(2'−デオキシおよび2'−O−メチル修飾/センス対アンチセンス鎖) (2'-deoxy and 2'-O- methyl modification / sense pair antisense strand)
15の二本鎖(そのうち5つがヒト・シクロフィリン遺伝子に向けられ、10がホタル/ルシフェラーゼに向けられている)を種々の修飾により試験した(図29〜31参照)。 15 duplex (five of which is directed to human cyclophilin gene, 10 are being directed to the firefly / luciferase) were tested by various modifications (see Figure 29-31). ヒトのシクロフィリンBについて、試験した二本鎖は、(1)未修飾、(2)センス鎖の第1および第2の位置に2'−O−メチル修飾、および(3)アンチセンス鎖の第1および第2の位置に2'−O−メチル修飾、さらに(4)センス鎖およびアンチセンス鎖上に2'−O−メチル修飾を含む。 The cyclophilin B human duplexes tested were (1) unmodified, (2) 2'-O-methyl modifications to the first and second positions of the sense strand, and (3) of the antisense strand first 1 and 2'-O- methyl modifications to the second position, further comprises (4) 2'-O- methyl modifications on the sense strand and the antisense strand. ルシフェラーゼに関して、ヒト/シクロフィリンBについて記載された修飾の全てに加えて、(1)AS鎖の5'リン酸化と併用したAS鎖上の2'−O−メチル修飾と、(2)アンチセンス鎖の5'リン酸化と併用したセンスおよびアンチセンス鎖の2'−O−メチル修飾を、試験した。 Respect luciferase, in addition to all have been modified described for human / cyclophilin B, (1) AS 5 'and 2'-O- methyl modifications on the AS strand combination with the phosphorylated strand, (2) the antisense strand 5 'phosphorylated with 2'-O- methyl modification of combination with sense and antisense strands of a, were tested. 全ての15の二本鎖について、2'−O−メチル部分を持つセンス鎖の位置1および2での修飾は、機能性と干渉しなかった。 For duplex for all 15, the modification at positions 1 and 2 of the sense strand with a 2'-O- methyl moiety did not interfere with the functionality. アンチセンス鎖の同一の修飾は、二本鎖の機能性を制限した。 Identical modifications of the antisense strand has limited functionality of the duplex. この機能性の減少は、アンチセンス鎖がその5'末端でリン酸化された場合に 、部分的に少なくなった(図30および31) The functionality of the reduction, when the antisense strand is phosphorylated at its 5 'end, was partially reduced (Fig. 30 and 31). 上記のデータを考え合わせると、アンチセンス鎖の5'リン酸化と併用したセンス鎖の1位および2位の2'−O−メチル化は、二本鎖の機能性を変えることなくセンス鎖オフ・ターゲット化を制限するように siRNA二本鎖を修飾する、安価で信頼性があり、さらに非毒性である方法である。 Taken together the above data, 1 and 2 positions 2'-O- methylation of the sense strand in combination with 5 'phosphorylation of the antisense strand, the sense strand off without changing the functionality of the double-stranded · modifying siRNA duplexes to limit targeted, reliable inexpensive, a method is furthermore non-toxic. この情報は、商業的価値がある。 This information, there is a commercial value. なぜなら、それによってsiRNAの特異性と効力とが高められるからである。 Because thus because there is a specificity and potency of siRNA is enhanced. 最近のマイクロアレイ・データによれば、丁度11ヌクレオチドの存在で非特異的なサイレンシングの誘導が十分なされることを示している。 Recent microarray data, induction of non-specific silencing indicates that it is sufficient in the presence of just 11 nucleotides. siRNA二本鎖のセンス鎖内に存在する相同性は、概ね、少なくとも半分の非特異的機能性を構成する。 homology present in the sense strand of the siRNA duplex is generally constitutes a non-specific functionality of at least half. 固有の非特異性がブロックされる場合 、センス鎖はオフ・ターゲット化に貢献することができ 、siRNAの特異性は増加するはずである If inherent non-specific resistance Ru is blocked, the sense strand can not contribute to off-targeting, should the specificity of siRNA is increased. 機能的RISCアンチセンス鎖複合体への平衡の移動もまた、siRNAの有効濃度を下げる。 Movement of the equilibrium of the functional RISC antisense strand complexes also reduce the effective concentration of siRNA.

(実施例9) (Example 9)
(5'コンジュゲートによる修飾siRNA) (5 'conjugate with modified siRNA)
二本鎖安定性、機能性、および受動的取り込みに対する種々の修飾の効果をアッセイした。 Duplex stability was assayed the effect of various modifications on functional and passive uptake. 図33は、二本鎖安定性に対するコレステロール・コンジュゲーションおよび(センスおよびアンチセンス鎖の1位および2位上の2'−O−メチル修飾、プラス、センス鎖の全てのCおよびUの2'−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全てのCおよびUの2'F修飾、プラス、アンチセンス鎖の5'リン酸化)の効果を示す。 Figure 33 is a double-stranded cholesterol conjugation and on the stability (2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense and antisense strand, plus 2 for all C and U of the sense strand ' -O- methyl modified shows 2'F modified all C and U of the antisense strand, plus the effect of 5 'phosphorylated) of the antisense strand. のsiRNAまたは修飾siRNAは32 P標識(AS鎖、T4キナーゼ、プロメガ) 、血清(または血清アルブミン)とともにインキュベート 、さらにゲル・シフト・クロマトグラフィー( 変性 、15%PAGE)で走らせた。 Naked siRNA or modified siRNA 32 P-labeled (AS chain, T4 kinase, Promega), and incubated with serum (or serum albumin), was run for an additional gel shift chromatography (denaturation, 15% PAGE). これらの実験の結果は、未修飾二鎖が素早く分解した一方で、 コレステロールおよび既に説明した修飾を持つ siRNAは、血清または血清アルブミン存在下で安定であることを示す The results of these experiments, while unmodified duplex is degraded quickly, siRNA having modifications to cholesterol and previously described shows that it is stable in the presence of serum or serum albumin. 同様に、3'idTキャッピングおよびCHO(5'センス)コンジュゲーションと併用したCおよびU の2 '−O−メチル修飾を担持するsiRNAについてもまた、安定性の増大が示される(図35)。 Similarly, also, an increase in stability is indicated for siRNA carrying -O- methyl modification '2 (sense in combination with conjugation was C and U 3'IdT capping and CHO 5)' (FIG. 35).

同様に修飾した分子に対する研究(例えば、センス鎖の2'F 修飾と併用してセンス鎖の5'末端のコレステロール修飾)は、そのような修飾が機能性(図34)および受動的取り込み(図36、 修飾=コレステロールを有するセンスおよびアンチセンスの両方のCおよびUに対する2 'F)が高めることを明らかにする。 Studies (e.g., the 5 'end of the cholesterol-modified sense strand in combination with 2'F l modification of the sense strand) for the similarly modified molecule, such modifications are functional (Figure 34) and passive uptake ( Figure 36, modified = reveal that 2 'F) is increased against the C and U in both sense and antisense with cholesterol.

(実施例10) (Example 10)
(SEAP2217標的上での2'でのデオキシおよび2'−O−メチル修飾ウオーク) (Deoxy and 2'-O- methyl modification walk at 2 'on SEAP2217 target)
SEAPコンストラクトを標的にしたsiRNAを用いた2'−デオキシおよび2'−O−メチル・ウオークに使用するコンストラクト(図31および図32参照)を表6に示す。 Construct using the SEAP construct the 2'-deoxy and 2'-O- methyl Walk with siRNA that targets (see FIGS. 31 and 32) are shown in Table 6.

(実施例11) (Example 11)
(分子1修飾および安定性) (1 Modifications and stability molecule)
実施例11〜18の目的のために、用語「分子1修飾(molecule 1 modifications)」とは、センス鎖上の1および2位に2'−O−メチル修飾、センス鎖の全てのCおよびU上に2'−O−メチル修飾、 アンチセンス鎖上の全てのCおよびUの2'−フッ素(Fl)修飾、およびアンチセンス鎖の5'末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 For purposes of example 11 to 18, the term "molecule 1 modifications (Molecule 1 Modifications)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 on the sense strand, all C and on the sense strand 2'-O- methyl modifications on U, 2'fluorine (Fl) of all C and U on the antisense strand modifications, and the antisense strand 5 'of the molecule containing the phosphate modification is on the end say that. 同様に、用語「分子2修飾(molecule 2 modification)」は、センス鎖の1および2位上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の5'末端上のCy3標識、アンチセンス鎖の全てのCおよびU上の2'−フッ素(Fl)修飾、ならびにアンチセンス鎖の5'末端上のリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 Similarly, the term "molecule 2 modifications (Molecule 2 modification)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense strand, 2'-O-methyl modifications on all Cs and Us of the sense strand, 'Cy3 label on the terminal, 2'fluorine (Fl) modification on all C and U of the antisense strand, and the antisense strand 5' 5 cell Nsu chains on end of the molecule containing the phosphate-modified say that.

siRNA安定性に対する分子1修飾の効果を評価するために、4種類のユニークなsiRNAを、修飾および未修飾形態で合成した。 To assess the effects of molecule 1 modifications on siRNA stability, four unique siRNA, were synthesized in modified and unmodified forms. 続いて、これらの分子を時間を変えて37℃で100%血清中でインキュベートし、PAGEで分析することで二本鎖の未分解性(intactness)を評価した。 Subsequently, by changing the these molecules times incubated in 100% serum at 37 ° C., to evaluate non-degradable duplexes by analyzing by PAGE and (intactness). 配列の視覚化は、エチジウム・ブロマイド染色によっておこなった。 Visualization of the sequence was carried out by ethidium bromide staining.

図37に示されるこれらの実験結果は、分子1修飾を持つ二本鎖が、未修飾の等価物と比べて著しく安定性が高いことを示す These experimental results shown in Figure 37, the double-stranded with a molecular 1 modification indicates that remarkably high stability in comparison with the equivalent unmodified. 未修飾分子は、室温で血清にさらしたところ、2分以内に50%以上分解した。 Unmodified molecules was exposed to serum at room temperature and decomposed within 50% more than 2 minutes. それに比べて、分子1修飾を持つ配列の半減期は、概ね125〜135時間であった。 In contrast, the half-life of arrays with molecule 1 modifications, was generally 125 to 135 hours. したがって、分子1修飾は、安定性約500倍著しく高た。 Thus, molecule 1 modifications, about 500-fold stability was significantly high because.

(実施例12) (Example 12)
(分子1修飾およびsiRNAサイレンシング抗力) (Molecule 1 modifications and siRNA silencing drag)
siRNA抗力に対する分子1修飾の効果を評価するために、ヒト・シクロフィリンB(U1およびU2)に向けられた2種類のユニークなsiRNAを、2'−O−ACEケミストリーを用いて、修飾および未修飾形態で合成し、その機能性について、全細胞アッセイで調べた。 To assess the effects of molecule 1 modifications on siRNA drag, two unique siRNA directed to human cyclophilin B (U1 and U2), using 2'-O-ACE chemistry, modified and unmodified was synthesized in the form, its functionality was investigated in whole cell assays. 手短に言えば、濃度0.01〜200n Mで 、修飾および未修飾siRN Aを HeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)に形質移入(Lipofectamine 2000)、24〜48時間培養した Briefly, in a concentration 0.01~200N M, the modified and unmodified siRNA A HeLa cells (10,000 cells / well, 96 well plate) in the transfected (Lipofectamine 2000), and cultured for 24 to 48 hours . 続いて、指定された標的の発現レベルを、分岐DNAアッセイを用いて評価した(Genospectra、Femont、CA)。 Subsequently, the expression levels of the specified target was assessed using a branched DNA assay (Genospectra, Femont, CA).

これらの実験結果を図 8に示す。 The results of these experiments are shown in Figure 3 8. また、これらの実験結果は分子1修飾を持つ二本鎖が、試験した全ての濃度で、未修飾siRNAと同等に機能することを示す Moreover, results of these experiments are duplexes with molecule 1 modifications, at all concentrations tested, indicating that the function equivalent to the unmodified siRNA. したがって、分子1修飾は、siRNAの抗力を変えるようには見えない。 Thus, molecule 1 modifications do not appear to change the drag of siRNA.

(実施例13) (Example 13)
(分子1修飾およびサイレンシング寿命) (Molecule 1 modifications and silencing life)
siRNAのサイレンシング寿命(silencing longevity)に対する分子1修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンB遺伝子を対象とするsiRNAを修飾および未修飾形態で合成し、前述のごとくHeLa細胞(100nM)に形質移入した。 To determine the effects of molecule 1 modifications on siRNA silencing longevity (silencing longevity), synthesized in modified and unmodified forms of siRNA targeting human cyclophilin B gene, the HeLa cells as described above (100 nM) It was transfected. 続いて、サイレンシングのレベルを分岐DNAアッセイを用いて、7日間にわたってモニターした。 Subsequently, the level of silencing using branched DNA assay was monitored over 7 days.

図39に示すこれらの実験の結果の一例は、未修飾分子によって誘導されるサイレンシングのレベルが7日間にわたって約70%から0%に低下することが示され、修飾二本鎖が実験の過程全体を通して>80%機能性を誘導することを実証する An example of the results of these experiments shown in FIG. 39, indicated that the level of silencing induced by unmodified molecules is reduced to 0% to about 70% over 7 days, the course of the modified duplex experiment It demonstrates that induces whole through> 80% functionality. したがって、分子1修飾にって修飾されたsiRNAは、これらの二本鎖によって誘導されたサイレンシングの寿命を高める。 Thus, it modified siRNA me to molecule 1 modifications enhance the longevity of silencing induced by these duplexes.

(実施例14) (Example 14)
(分子1修飾および毒性) (Molecule 1 modifications and toxicity)
siRNA毒性に対する分子1修飾の効果を判断するために、ヒト・シクロフィリンBを対象とする4種類の siRNA(U1〜U4)を修飾および未修飾形態で合成し、0.01〜200nMの濃度範囲で、HeLa細胞に形質移入した。 To determine the effects of molecule 1 modifications on siRNA toxicity, synthesized in modified and unmodified forms of the 4 types of siRNA (U1 to U4) directed to the human cyclophilin B, and a concentration range of 0.01~200nM , it was transfected into HeLa cells. 形質移入後t=48時間の時点で、Alamer Blue生存度アッセイを実施して細胞個体群内での細胞死のレベルを評価した At the time of after transfection t = 48 h to assess the level of cell death in a cell population by implementing Alamer Blue viability assay. 修飾二本鎖と未修飾二本鎖との並列比較では、試験した濃度のいずれかで誘導される細胞死のレベルに違いは無かった(図40)。 The parallel comparison of the modified double-stranded and the unmodified double-stranded, the difference was not on the level of cell death induced by any of the concentrations tested (Figure 40).

(実施例15) (Example 15)
(分子1修飾およびオフ・ターゲット効果) (Molecule 1 modifications and off-target effects)
オフ・ターゲット効果に対する分子1修飾の効果を評価するために、4種類のsiRNA標的ヒト・シクロフィリンB(U1〜U4)を修飾および未修飾形態で合成し、100nMの濃度でHeLa細胞に形質移入した。 To assess the effects of molecule 1 modifications on off-target effects, synthesized in modified and unmodified forms of the 4 types of siRNA target human cyclophilin B (U1 to U4), it was transfected into HeLa cells at a concentration of 100nM . 続いて、(1)偽形質移入、(2)形質移入(未修飾)、および(3)形質移入(修飾)細胞から得た全 NAを精製(Qiagen)し、cDNAに変換し、さらにAgilent's Low RNA Input Linear Amp Kitを用いて、 Cy3(偽形質移入)またはCy5(形質移入−未修飾、形質移入−修飾)による標識をおこなった。 Subsequently, (1) mock transfected, (2) transfection (unmodified), and (3) were transfected (modified) purifying the total R NA obtained from cells (Qiagen), and transformed into cDNA, further Agilent 'using s Low RNA Input Linear Amp Kit, Cy3 (mock transfected) or Cy5 was subjected to labeling with (transfection - modified - unmodified, transfection). 偽形質移入および非形質移入細胞から得た標識cDNAを混合し、21,000を上回る数のプローブが含まれるAgilent Human1A(V2)Oligo Microarrayにハイブリダイズさせた。 The labeled cDNA from mock transfected and untransfected cells were mixed and hybridized to the Agilent Human1A (V2) Oligo Microarray containing the number of probes greater than 21,000. 修飾および未修飾料と結合したオフ・ターゲットの数を、ソフトウェア(Aglilent's Feataure Extraction,Sptfire,およびSptfire Functional Genomics)(それぞれバージョン7.2、7,2、および7.1)を用いて、評価した。 The number of off-target bound to modified and unmodified specimen, using software (Aglilent's Feataure Extraction, Sptfire, and Sptfire Functional Genomics) (each version 7.2,7,2, and 7.1) ,evaluated.

これらのオフ・ターゲット研究のまとめを図41に示す。 A summary of these off-target studies are shown in Figure 41. また、このまとめによれば、修飾および未修飾siRNAは、オフ・ターゲットされた遺伝子の数に関して、類似した機能を示した。 Further, according to this summary, modified and unmodified siRNA is with respect to the number of genes offtarget showed similar function. 具体的には、オフ・ターゲット遺伝子誘導または抑制のレベル(野生型遺伝子発現と比較)に基づいて分離した場合、修飾siRNAは未修飾のものと類似して(またはそれよりも良好に)機能した。 Specifically, when separated on the basis of the level of induction or repression offtarget gene (compared to the wild-type gene expression), the modified siRNA is similar to that of unmodified (or greater better) Function did.

(実施例16) (Example 16)
(分子2修飾およびサイレンシング効力) (Molecule 2 modifications and silencing efficacy)
分子2修飾を含むsiRNAの機能性を試験するために、ヒト・シクロフィリンBを対象とするsiRNAであるシクロ14(5'GOCCTTAGCTACAGGAGAG、センス鎖 配列番号322)を、分子2修飾により合成し、さらに指定した標的をサイレンシングする能力について試験した。 To test the functionality of siRNA containing molecule 2 modifications, a siRNA targeting the human cyclophilin B cyclo 14 (5'GOCCTTAGCTACAGGAGAG, sense strand SEQ ID NO: 322) was synthesized by molecular 2 modification, further designated were targets were tested for their ability to silence. 手短に言えば、 cyclo 14を、2'−O−ACEケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。 Briefly, obtain cyclo 14, were synthesized by appropriate modification with 2'-O-ACE chemistry. 続いて、T482HeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)をプレーティングして一晩培養し、さらに100nM濃度でcyclo 14二本鎖による形質移入(Lipofectamine 2000)をおこなった。 Subsequently, T482HeLa cells (10,000 cells / well, 96 well plate) and cultured overnight plated, was subjected to further transfection with obtain cyclo 14 duplexes 100nM concentrations (Lipofectamine 2000). 形質移入後3日、mRNAサイレンシングのレベルを分岐DNAアッセイ(Genospectra、Fremont、CA)を用いて評価した。 After transfection 3 days, the level of mRNA silencing branched DNA assay (Genospectra, Fremont, CA) was used to evaluate.

これらの研究の結果を図42に示す。 The results of these studies are shown in Figure 42. 未修飾cyclo 14二本鎖は概ね80〜95%サイレンシングを誘導する。 Unmodified obtain cyclo 14 duplex generally induces 80% to 95% silencing. Cy3標識単独で修飾されたcyclo 14二本鎖は、約70〜80%サイレンシングを誘導、また分子2修飾を持つcyclo 14siRNAは80%またはそれよりも良好なサイレンシングを誘導し、分子2修飾の付加は二本鎖の機能性に対してほとんど影響がない。 Obtain cyclo 14 duplexes modified with Cy3-labeled alone induces about 70-80% silencing, also obtain cyclo 14SiRNA with a molecular 2 modifications induced 80% or better silencing than the molecules 2 modified the addition of almost no effect on the function of the double-stranded.

(実施例17) (Example 17)
(トラックアビリティに対する分子2修飾の効果) (Effect of molecule 2 modifications to the track ability)
分子2修飾の有用性を試験するために、形質移入効率を評価する手段として、 cyclo 14siRNAを前述の修飾により調製し、蛍光顕微鏡で視覚化をおこなった。 To test the utility of the molecule 2 modifications as a means of assessing transfection efficiencies, the cyclo 14siRNA was prepared by modification of the above was subjected to visualization by fluorescence microscopy. 具体的には、 cyclo 14を、2'−O−ACEケミストリーを用いた適当な修飾により合成した。 Specifically, obtain cyclo 14, were synthesized by appropriate modification with 2'-O-ACE chemistry. 続いて、T482HeLa細胞(10,000細胞/ウエル、96穴プレート)をプレーティングして一晩培養し、さらに100nM濃度で適当な二本鎖による形質移入(Lipofectamine 2000)をおこなった。 Subsequently, T482HeLa cells (10,000 cells / well, 96 well plate) and cultured overnight plated, was subjected to transfection (Lipofectamine 2000) according to still suitable duplexes 100nM concentrations. 形質移入後48時間で、培地をHoechst33342(2μg/ml、20分、37℃)でインキュベートし、次にDapiおよびRhodamineフィルターを用いてLeica DMIL蛍光顕微鏡による視覚化をおこなった。 In transfection after 48 hours, the cultures are incubated for Hoechst33342 (2μg / ml, 20 min, 37 ° C.) with and subjected to visualization Leica DMIL fluorescence microscope then using Dapi and Rhodamine filters.

分子2修飾を持つcyclo 14 siRNAによる形質移入がなされたHeLa細胞の蛍光顕微鏡写真(添付図面なし)は、強く染色された核およびその周囲を示している。 Fluorescence micrographs of HeLa cells transfected was made according obtain cyclo 14 siRNA having a molecular 2 modified (without accompanying drawings) shows a strongly stained nuclei and its surroundings. 未修飾cyclo 14siRNAにより形質移入された細胞では、同等の染色が見られないことから(データ不図示)、分子2修飾が所定のsiRNAの細胞内位置および形質移入の成功を評価する優れた手段であることがわかる。 In transfected cells by unmodified obtain cyclo 14SiRNA, since the equivalent staining is not observed (data not shown), an excellent means for molecule 2 modifications to assess the success of the subcellular location and transfection of certain siRNA there it can be seen.

(実施例18) (Example 18)
(安定性に対する分子2修飾の効果) (Effect of molecule 2 modifications to stability)
分子2修飾が二本鎖の細胞内安定を高めたかどうかを試験するために、分子2修飾を持つcyclo 14siRNAをHeLa細胞に形質移入し、Cy 標識Cyclo14形質移入細胞と7日間にわたって比較した。 For molecules 2 modified to test whether increased intracellular stability of duplexes, the cyclo 14siRNA with a molecular 2 modified transfected into HeLa cells was compared for Cy 3 labeled Cyclo14 transfected cells and 7 days. 前述の修飾の付加によってCy 単独による修飾を受けた二本鎖を上回る著しく強化されたsiRNA安定性を示す。 Exhibit significantly enhanced siRNA stability over duplexes were qualified with Cy 3 solely by the addition of the aforementioned modifications. 両方の試料が第2日目(Day2)に強い染色パターンを示す一方で、Cy −Cyclo14形質移入細胞は、第7日目(Day7)までに失う。 Both samples second day while exhibiting strong staining pattern in (Day2), Cy 3 -Cyclo14 transfected cells may lose up to day the 7 (Day 7). 対照的に、分子2修飾を持つcyclo 14siRNAを含む細胞は、第7日(Day7)に強い染色パターンを保持している。 In contrast, cells containing obtain cyclo 14SiRNA with a molecular 2 modifications retain a strong pattern of staining on day 7 (Day 7). さらに、Cy3標識二本鎖とは異なり、分子2修飾を持つsiRNA また、二本鎖への核アクセス(nuclear access)を促進する。 Moreover, unlike Cy3-labeled double-stranded, siRNA having a molecular 2 modifications also promote nuclear access to the duplex (nuclear access).

(実施例19) (Example 19)
(サイレンシング活性を修飾する化学修飾の同定) (Identification of chemical modification that modifies the silencing activity)
RNA合成のためのプラットホームとして2'−O−ACEケミストリーを用い 、センス(S)およびアンチセンス(AS)鎖に1、2、または3つの連続的(consecutively)に修飾したヌクレオチドからなる修飾ウォークをSEAP−2217、ヒト分泌アルカリホスファターゼ(SEAP、SEAP−2217−センス鎖5'−G U G A U G U A U G U C A G A GAG U dT dT(配列番号326))上で実行した。 With 2'-O-ACE chemistry as a platform for RNA synthesis, the sense (S) and antisense (AS) strands 1, 2 or 3 modified Wo consisting nucleotides modified continuously (consecutively), SEAP-2217 to over click, on human secreted alkaline phosphatase (SEAP, SEAP-2217- sense strand 5'-G U G a U G U a U G U C a G a GAG U dT dT (SEQ ID NO: 326)) It was performed. 続いて、これらの修飾siRNAのサイレンシング効率を、SEAP発現ベクター(Clontech)を持つ各二本鎖をHEK293細胞(100nM siRNA、50ng/ウエルSEP発現ベクター、Lipofectamine 2000)に同時形質移入し、形質移入後24時間での標的タンパク質活性の減少をアッセイすることによって、評価した。 Then, the silencing efficiency of these modifications siRNA, each duplex with SEAP expression vector (Clontech) HEK293 cells (100 nM siRNA, 50 ng / well SEP expression vector, Lipofectamine 2000) was co-transfected into transfection by assaying a decrease in target protein activity at 24 hours after, and evaluated. 図43Aおよび図43Bは、2'−O−メチル化SEAP−2217siRNAに対する修飾と機能とのあいだの相互関係を示す。 Figure 43A and Figure 43B show the interrelationship of between the modified and the function for 2'-O- methylated SEAP-2217siRNA. SEAPを標的とする未修飾二鎖は、SEAP遺伝子のサイレンシングを>90%誘導する。 Unmodified duplexes the SEAP targeting induces silencing of the SEAP gene> 90%. SおよびAS鎖の単一塩基修飾は、siRNA活性に対する効果をほとんど誘導しなかった。 Single base modification of S and AS strands did not induce little effect on siRNA activity. このことは、RNAiで必須の役割を演ずるような単一の2'−ヒドロシル基がいずれの鎖にもないことを示唆している。 This suggests that single 2'hydrosilation groups such as play an essential role in RNAi is not in either strand. それとは対照的に、二重の並列した修飾のウオークは、修飾塩基の導入がサイレンシング活性にって著しく干渉したいくつかのキー・ポジションを同定した。 In contrast, walk dual juxtaposed modifications, introduction of modified bases have identified several key positions which interfere significantly I silencing activity.

機能との最も顕著な干渉は、AS鎖の5'末端の2つの連続的な塩基(1および2位)または3つの連続的な塩基(1、2、および3位)を修飾した場合に観察されるので、隣接する修飾基間の連携効果が暗示される。 The most significant interference with function, observed when modifying the two successive bases of the 5 'end of the AS strand (1 and 2 positions), or three consecutive bases (1, 2, and 3) since the, cooperative effect between adjacent modifying group is implied. S鎖の同様な修飾は、二本鎖機能性を変えるのに失敗したことから、対を形成した2'−O−メチル修飾塩基はS鎖とAS鎖との区別を可能にする。 Similar modifications of the S chain, since a failure to change the duplex functionality, 2'-O-methyl modified bases unpaired enables distinction between S chain and the AS strand.

実験の同一セットを2'−デオキシ修飾を用いて実行した。 The same set of experiments was performed using the 2'-deoxy-modified. 図44Aおよび図44Bに示す研究は、二本鎖のいずれかの鎖上に異なる位置(例えば、1+2+3、4+5+6、その他...)で3つの連続的な2'−デオキシ基を付加することは、二鎖サイレンシングに対してなんら効果がないことを示している。 Study of FIG. 44A and FIG. 44B, either strand on the different positions of the double-stranded (e.g., 1 + 2 + 3, 4 + 5 + 6, etc ...) by adding the three consecutive 2'-deoxy groups indicates that there is no any effect on the double stranded silencing. 同様の結果は、2および1の連続的な2'−デオキシ基(データ不図示)の効果試験するウオークについて観察れた。 Similar results were observed for walk to effect test of 2 and 1 consecutive 2'-deoxy groups (data not shown).

二本鎖機能性に対する2'−O−メチル修飾の効果をさらに試験するために、ルシフェラーゼ遺伝子(luc 8、18、56、58、63、および81)を対象とする一連のsiRNAを、2'−O−ACEケミストリーを用いて合成してリボース環の2'位にO−メチル基を含むように修飾する。 To further test the effect of 2'-O- methyl modifications on duplex functionality, a series of siRNA for the luciferase gene (luc 8,18,56,58,63, and 81) to a target, 2 ' synthesized and modified to include 2 'position in O- methyl groups of the ribose ring with a -O-ACE chemistry.
Luc 8 5'−GAAAAAUCAGAGAGAUCCU(配列番号327) Luc 8 5'-GAAAAAUCAGAGAGAUCCU (SEQ ID NO: 327)
Luc 18 5'−UACCGGAAAACUCGACGCA(配列番号328) Luc 18 5'-UACCGGAAAACUCGACGCA (SEQ ID NO: 328)
Luc 56 5'−ACGUCGCCAGUCAAGUAAC(配列番号329) Luc 56 5'-ACGUCGCCAGUCAAGUAAC (SEQ ID NO: 329)
Luc 58 5'−GAUUACGUCGCCAGUCAAG(配列番号330) Luc 58 5'-GAUUACGUCGCCAGUCAAG (SEQ ID NO: 330)
Luc 63 5'−AGAGALTCGUGGALIJACGUC(配列番号331) Luc 63 5'-AGAGALTCGUGGALIJACGUC (SEQ ID NO: 331)
Luc 81 5'−UGUUGUUUUGGAGCACGGA(配列番号332) Luc 81 5'-UGUUGUUUUGGAGCACGGA (SEQ ID NO: 332)
(上に列挙した配列はセンス鎖である)。 (Sequences listed above is the sense strand).

具体的には、(1)センス鎖、(2)アンチセンス鎖、または(3)これら両方の鎖の2つの5'最端ヌクレオチド上に2'−O−メチル修飾を含むsiRNA 、Luc−発現プラスミド(pCMVLuc,50ng/ウエル)を介して、HEK283細胞に形質移入る。 Specifically, (1) a sense strand, (2) the antisense strand, or (3) two 5 'siRNA containing 2'-O- methyl modifications on endmost nucleotides of both strands,, Luc- expression plasmid (pCMVLuc, 50 ng / well) through, transfected into HEK283 cells. 続いて、各二鎖のサイレンシング能力の並列比較を実行して、標的転写分解に対するこの修飾の効果を判断した。 Subsequently, by performing the parallel comparison silencing ability of each duplex it was determined the effect of this modification to the target transfer degradation.

これらの研究の結果は、AS鎖への2'−O−メチル基の付加のみが、標的mRNAをサイレンシングするための二本鎖の能力を著しく削減することを示した(図45A〜F参照)。 The results of these studies, only the addition of 2'-O- methyl group to the AS chain was shown to significantly reduce the ability of the duplex to silence a target mRNA (Fig 45A~F see ). 対照的に、センス鎖上にこの修飾を持つ二本鎖は、同等物である未修飾siRNAよりも十分に(luc 58、63、81)、あるいは良好に(luc 56、8、18)機能した In contrast, duplexes having this modification on the sense strand is sufficiently than unmodified siRNA is equivalent (luc 58,63,81), or better (luc 56,8,18) to function . このことは、センス鎖の修飾がRISCによる鎖選択を偏らせ、(いくつかの例では)有効なアンチセンス鎖濃度を高めたことを示唆している。 This modification of the sense strand biased strand selection by RISC, suggesting that enhanced (in some instances) effective antisense strand concentration. 強化されたサイレンシングは、分子の5'センス末端に対するRISCの結合親和性の減少(そのため、対向端に結合するための遊離のRISCの可用性が増加)、センス鎖をリン酸化するための天然キナーゼの能力減少(したがって、RISCへのアクセスに対するセンス鎖とアンチセンス鎖の競合の減少)、あるいは5'センス末端からの二鎖の解き放しをおこなうRISCの能力の減少の結果であり得る Enhanced silencing, reduction in binding affinity of RISC for 5 'sense end of the molecule (so, increase free RISC availability for coupling opposite ends), natural kinase to phosphorylate the sense strand capacity decreases (thus, the sense strand and reduces competition of the antisense strand for access to RISC) of may be, or 5 'results in the reduction of the RISC's ability to perform the Tokihanashi duplex from the sense terminal. 両方の鎖に2'−O −メチル修飾を含むsiRNAは、いずれかの単一鎖上に修飾を含んだ分子に対して観察された値間にある減少したサイレンシング能力を示した。 Both strands 2'-O - siRNA comprising methylation modification showed either silencing ability decreased in between the observed values with respect to molecules that contain modifications on a single strand. これらの結果に対する1つの解釈は、修飾鎖に関して2'−O−メチル修飾の結合親和性がRISCのものよりも低いということである。 One interpretation of these results, the binding affinity of the 2'-O- methyl modifications with respect to the modified chains is that lower than that of RISC. 両方の鎖が修飾された場合では、どちらの鎖もその相補体を越える利益を得ることはく、両方の修飾分子の機能性の平均を表す新しい平衡が確される。 In the case where both strands are modified, that both chains benefit exceeding its complement Ku, new equilibrium that represents the average functionality of both modified molecules is established.

2'−O−メチル化S/ASsiRNAを含む細胞内で観察されたサイレンシングの減少レベルは、二本鎖をリン酸化するための細胞キナーゼの弱体化した能力の結果であるかどうかを試験するために、2'−O−メチル修飾を持つsiRNA を、 AS鎖の5'末端上にリン酸基を持つように修飾した Decrease the level of silencing was observed in cells containing 2'-O- methylated S / ASsiRNA tests whether the result of the ability of weakened cellular kinases to phosphorylate duplex for the siRNA with 2'-O- methyl modification were modified to have a phosphate group on the 5 'end of the aS strand. 具体的には、(1)アンチセンス鎖の5'末端の位置1および2、 または (2)アンチ鎖およびセンス鎖の両方の5'末端の位置1および2 、のいずれかにおいて2'−O−メチル基を有するLuc siRNAを 、合成の過程でAS鎖上で5'−リン酸化た。 Specifically, 2'-O in any of the positions 1 and 2, of (1) 5 of the antisense strand 'position of the terminal 1 and 2 or (2), both 5 anti-strand and the sense strand' end - the Luc siRNA having a methyl group, and 5'-phosphorylated on the AS strand in the course of the synthesis. 次に、これらの二本鎖を、既に記載した手順を用いて、HEK293細胞に導入し、所望の標的をサイレンシングする能力について試験した。 Then, these double-stranded, with the already procedure described, were introduced into HEK293 cells, they were tested for their ability to silence the desired target. 結果は、試験した例の 83% (10/12)で、アンチセンス鎖の5'リン酸化が、等価物である非リン酸化分子を超えて二鎖のサイレンシング効率を改善したことを示した (図45A〜F)。 Results in 83% of the examples were tested (10/12), it indicates that the 5 'phosphorylation of the antisense strand, was beyond the non-phosphorylated molecules is equivalent to improve the silencing efficiency of double-stranded It was (Figure 45A~F). 残りの2つの例では、サイレンシングが未変化のままであり、あるいは僅かに改善されただけである。 The remaining two examples, remains silencing unchanged or were only slightly improved.

用量応答曲線を用いたサイレンシングに対する化学修飾の効果についてのより詳しい実験は、以前のデータを支持している。 More experiments on the effect of chemical modification on silencing using dose response curves supports the previous data. ルシフェラーゼ遺伝子(luc 8、56、58,63、および81)を対象とする5つの異なるsiRNAを、2'−O−メチル修飾および未修飾形態で、2−O−ACEケミストリーを用いて合成した。 Luciferase gene (luc 8,56,58,63, and 81) Five different siRNA to target, with 2'-O- methyl modified and unmodified forms, were synthesized using 2-O-ACE chemistry. 次に、これらの二本鎖を、濃度を0.01〜200nMのあいだで変えながら、HeLa細胞(ルシフェラーゼ発現ベクターと共に)に形質移入し、ルシフェラーゼタンパク質のサイレンシングのレベルについて、アッセイした(t=24〜48)。 Then, these double-stranded, while changing the concentration between the 0.01~200NM, were transfected into HeLa cells (with luciferase expression vector), the level of silencing of luciferase protein was assayed (t = 24 to 48). これらの実験結果を図46にまとめて以下のような結論を導いた。 The results of these experiments are summarized in Figure 46 led to conclusions as follows. すなわち、(1)アンチセンス鎖の5'末端の1位および2位への2'−O−メチル基の付加によって、サイレンシング活性が一貫して崩壊する。 That is, (1) by 2'-O- addition of a methyl group to positions 1 and 2 of the 5 'end of the antisense strand, silencing activity decays consistently. (2 )s iRNAのセンス鎖の 5'末端の1位および2位への2'−O−メチル基の付加によって、標的特異的サイレンシングの効果が改善されるか、または該サイレンシングに対してほとんど効果ないかのいずれかである (2) by 2'-O- addition of a methyl group to positions 1 and 2 of the 5 'end of the sense strand of s iRNA, or the effect of the target specific silencing is improved, or to the silencing it is one of the most effective medical Te. (3)両鎖(センスおよびアンチセンス)の5'末端の1および2位に対する2'−O−メチル基の付加によって、アンチセンス鎖の5'末端上にある未修飾二本鎖と、2'−O−メチル修飾を持つ二本鎖とにより観察されたもののあいだにある中間のサイレンシング効果が生ずる。 (3) 'by the addition of 2'-O- methyl groups to positions 1 and 2 of the terminal, 5 of the antisense strand 5' of both strands (sense and antisense) and unmodified double strand that is on the end, 2 'silencing effect of the intermediate occurs in between that observed by a duplex with -O- methyl modification. (4)センスおよびアンチセンス鎖の両方の5'末端の1および2位に2'−O−メチル修飾を持つ分子のアンチセンス鎖の5'末端に対してリン酸基を付加することで、両方の鎖の5'末端上に2'−O−メチル修飾を有する二本鎖を超えて分子のサイレンシング機能が改善される。 (4) By adding a phosphate group against the 5 'end of the antisense strand of the molecule with a 2'-O- methyl modifications on positions 1 and 2 of the 5' end of both the sense and antisense strand, silencing function of the molecule is improved beyond the duplexes with 2'-O- methyl modifications on the 5 'end of both strands.

これらの結果は、アンチセンス鎖の第1の末端ヌクレオチドの5'リン酸化に加えて、siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖の1位および2位置の2'−O−メチル修飾の付加が、種々の濃度での二本鎖の効力を高めることを示唆する These results, in addition to the 5 'phosphorylation of the first terminal nucleotide of the antisense strand, the addition of 2'-O- methyl modification of positions 1 and 2 positions of the sense and antisense strands of siRNA, various suggests that increasing the efficacy of the duplex at a concentration. さらに、種々の修飾の効果は、以下の結論を導く。 Furthermore, the effect of various modifications leads to the following conclusions. すなわち、(1)センスまたはアンチセンス鎖の5'末端への2' −O−メチル基の付加は、その鎖によるサイレンシングの著しい減少をもたらす。 That is, (1) addition of -O- methyl groups '2 to end' sense or 5 of the antisense strand, results in a significant reduction of silencing by the chain. (2)5'リン酸基の付加は、2 '−O−メチル基の存在下あっても、ほぼ完全に、サイレンシングを回復する。 (2) 5 'addition of a phosphate group is 2' even in the presence of -O- methyl group, almost completely, to recover the silencing. したがって、As−2'−O−メチル化の阻害効果のいくつかのフラクションがおそらく二本鎖リン酸化の阻害の結果であると思われる一方で、効果のいくつかの部分が、RNAi経路の他のステップ(例えば、RISC結合、siRN巻き戻し、RISC媒介siRNA標的結合、またはRISC媒介標的切断) についてのこの形態の修飾の効果によるものであるとかなりの蓋然性で思われる。 Thus, while you think that some fraction of the inhibitory effect of As-2'-O- methylation is probably the result of the inhibition of the double-stranded phosphorylated some parts of the effects, other RNAi pathway step (e.g., RISC binding, rewind siRNA, RISC mediated siRNA target binding, or RISC mediated target cleavage) seems a considerable probability to be due the effect of this form of modification for. 重要なことに、これらの他のステップでの2'−O−メチル化の潜在的効果は、著者らに、上記修飾が、アンチセンス鎖との100%相同性を有する意図された標的と、相同性が劣るオフ・ターゲットとの間を区別するRISCの能力をも変えるかもしれない可能性があることを考えさせた。 Importantly, the potential effect of the 2'-O- methylation at these other steps, the authors, the modification is a target which is intended with a 100% homology to the antisense strand, It was to think that there is a possibility that may change also the RISC of ability to distinguish between the off-target homology is poor.

(実施例20) (Example 20)
(オフ・ターゲッティングに対する2'−O−メチル化および5'リン酸化の効果) (Effect of 2'-O- methylation and 5 'phosphorylation for off-targeting)
アンチセンス鎖の2'−O−メチル化がサイレンシングを中断させ、一方で等価なセンス鎖標識が標的特異的サイレンシングに対してなんら効果を持たないという観察によって、センス鎖によって生ずるオフ・ターゲット・サイレンシングを排除するための戦略を示唆する。 By the observation that 2'-O- methylation of the antisense strand is interrupted silencing, whereas equivalent sense strand labeled with does not have any effect against target specific silencing off-target caused by the sense strand · suggest a strategy to eliminate silencing. さらに、二本鎖リン酸化の下流にあるステップが2'−O−メチル化によって影響を及ぼされる可能性があるという観察は、この組み合わせ(センスおよびアンチセンス鎖の5'の位置1および2の2'−O−メチル化、プラス、AS鎖の5'末端のリン酸化)の修飾を含むsiRNAが、高効力および/または低センス/アンチセンス・オフ・ターゲッティング効果を有するものである可能性を導く Furthermore, the observation that steps downstream of duplex phosphorylation is likely to be affected by 2'-O- methylation of positions 1 and 2 of this combination (the sense and antisense strand 5 ' 2'-O- methylation, plus, siRNA containing a 5 'phosphorylated end) modifications of aS strand, possibility Ru der those with high potency and / or low sense / off targeting effect the lead.

(1)センス鎖、(2)アンチセンス鎖、および(3)センスおよびアンチセンス鎖の2'−O−メチル化と組み合わさったアンチセンス鎖の5'−リン酸化の、オフ・ターゲット化に対する効果を試験するために、4種類の異なる遺伝子を対象とする2つのsiRNAトータルつのsi RN A; MAPK14−193 および −153、MPHOSPH1−202 および −203、IGF1R−73、ならびに−74、およびPTEN−213、さらに−214 )を 、2'−O−ACEケミストリーを用いて合成し、さらに適当な部位で修飾した。 (1) a sense strand, (2) the antisense strand, and (3) a sense and antisense strand 2'-O- methylated and combined Tsu were of the antisense strand of the 5'-phosphorylated, for off-targeting to test the effect, four different genes two of interest of siRNA (total eight si RN a; MAPK14-193 and -153, MPHOSPH1-202 and -203, IGF1R-73, and -74, and PTEN-213, a further -214) were synthesized using 2'-O-ACE chemistry and modified with more appropriate sites. APK14−153がアンチセンス鎖の5'末端上にリン酸基のみを含む条件下で、実験を実施した場合、広範囲のオフ・ターゲット化が観察される。 M APK14-153 under conditions containing only phosphate group on the 5 'end of the antisense strand, when carrying out the experiments, a wide range of off-targeting is observed. 上記センス鎖がさらに1および2位で2'−O−メチル基により、さらに修飾される場合、その鎖によるオフターゲット化が取り除かれる。 The 2'-O- methyl group at the sense strand further positions 1 and 2 if, be further modified, off-target reduction is removed by the chain. しかし、アンチセンス鎖オフセット・ターゲットの新規セットが生ずる。 However, a new set of anti-sense strand offset target occurs. アンチセンス鎖オフ・ターゲット化の増大は、センス鎖による競合の非存在下での 、AS鎖−RISC相互作用増加に起因すると思われる Increase of the antisense strand off-targeting is in the absence of competition by the sense strand, it is believed to be due to an increase in AS strand -RISC interaction. 記アンチセンス鎖が5'末端上にリン酸基を有し、位置1および2で2'−O−メチル基により修飾されている場合、アンチセンス鎖によるオフ・ターゲットが喪失するが、センス鎖オフ・ターゲットが再び観察される。 It has an upper Symbol antisense strand phosphate group at the 5 'end, if it is modified by 2'-O- methyl group at position 1 and 2, but off-target is lost due to the antisense strand, the sense chain off-target is observed again. 最後に、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、2'−O−メチル基(各々の鎖の1および2位上)によって修飾され、 かつアンチセンス鎖 5'末端上にリン酸基が結合する場合 、両方の鎖によるオフターゲット化の度合いが急激に減少する。 Finally, both the sense strand and antisense strand, 2'-O-methyl groups (1 and 2 of the of each chain) is modified by, and a phosphate group on the 5 'end of the antisense strand bound If the degree of off-targeting by both strands decreases rapidly.

上記したものと同様の結果が、IGF1R、PTEN、MAPK1、およびMPHOSPHIに対応する残りの7種類のsiRNAについて得られた。 Those described above similar to the results, IGF1R, PTEN, MAPK1, and was obtained for the remaining seven siRNA corresponding to MPHOSPHI. したがって、それらの実験から、 以下を結論付けることが可能である (1)同一ターゲットを対象とする別のsiRNAは、変化するレベルのオフ・ターゲット効果を誘導する。 Therefore, from these experiments, another siRNA that target can be (1) the same target to conclude the following, induces off-target effects of varying levels. (2)アンチセンス鎖(アンチセンス鎖の5'−リン酸化と組み合わせて)の5'末端の1および2位の2'−O−メチル修飾は、その鎖によるオフ・ターゲット効果を取り除く 、しかし多くの場合、付加的なセンス鎖オフターゲットをもたらす。 (2) 5 '1 and 2 of the 2'-O- methyl modification of end of the antisense strand (in combination with 5'-phosphorylation of the antisense strand) is removed off-target effects due to that strand, However, in many cases, provide additional sense strand off-target. (3)センス鎖の5'末端の1および2位の2'−O−メチル修飾(アンチセンス鎖の5'−リン酸化と組み合わせて)が、その鎖に基づいてオフターゲット効果を取り除くが、しばしば付加的なアンチセンス鎖オフターゲットをもたらす (3) 2'-O-methyl modification of positions 1 and 2 of the 5 'end of the sense strand (in combination with 5'-phosphorylation of the antisense strand) is, but eliminate off-target effects based on the chain, often it results in additional anti-sense strand off-target. (4)センスおよびアンチセンス鎖の両方の1および2位の2'−O−メチル修飾 (アンチセンス鎖の5'リン酸化との組み合わせ)は、両方の鎖から標的効果を劇的に取り除く。 (4) 2'-O-methyl modification of positions 1 and 2 of both the sense and antisense strand (in combination with 5 'phosphorylation of the antisense strand), dramatically removes the targeted effects from both strands. したがって、3通りの修飾の組み合わせ(アンチセンス鎖の5'−リン酸化、センス鎖の1および2位の2'−O−メチル化、およびアンチセンス鎖の1および2の2'−O−メチル化)が、両方の鎖によって一般に生ずるオフ・ターゲット効果での急激な減少に到る。 Thus, the combination of three kinds of modification (antisense strand 5'-phosphorylated, 2'-O- methylation of positions 1 and 2 of the sense strand, and 1 and 2 of the 2'-O- methyl antisense strand reduction) is, reaches by both strands sharp decline in general produce off-target effects. さらに、特異的サイレンシング活性が試験された3つのケース(MAPK14、PTEN、およびMPHOSPH1)では、最小オフ・ターゲット効果を有する完全に修飾された分子(例えば、アンチセンス鎖上に5'リン酸塩、センス鎖の1位および2位の2'−O−メチル化、ならびにアンチセンス鎖の1位および2位の2'−O−メチル化)が、アンチセンス鎖の5'末端上の5'リン酸基のみを含むsiRNAと同等かそれ以上に所定の標的をサイレンシングした。 Further, specific silencing activity are three cases tested (MAPK14, PTEN, and MPHOSPHl) In a fully modified molecule (e.g., 5 'phosphate on the antisense strand having a minimum off-target effects , positions 1 and 2 2'-O- methylation of the sense strand, and positions 1 and 2 2'-O- methylation of the antisense strand) is of the antisense strand 5 '5 on the terminal' silenced predetermined targets siRNA equal to or greater than that containing only phosphate group.

(2'−O−メチル化の効果) (Effect of 2'-O- methylation)
上記したデータは、AS鎖の5'末端の1位および2位に対して2'−O−メチル基を付加することで、siRNA活性が中断することを明瞭に示している。 Data described above, by adding the 2'-O- methyl group with respect to positions 1 and 2 of the 5 'end of the AS strand, siRNA activity clearly shows that the interruption. この修飾が二本鎖機能を中断させる方法は、RNAi経路で2つの異なるステップに分解することができる。 How this modification disrupts the duplex function can be decomposed into two different steps in the RNAi pathway. 第1のステップでは、2'−O−メチル化が、二本鎖をリン酸化する常在キナーゼの活性を明確に中断させる。 In a first step, 2'-O-methylation, is clearly interrupted activity of resident kinases that phosphorylate duplexes. 5'リン酸基を添加することで、細胞酵素の必要性を総合的に軽減することで、この機能を満たし、さらに二本鎖機能性を改善する。 5 'The addition of phosphate groups, by comprehensively reducing the need for cellular enzymes, fulfill this function, to further improve the duplex functionality. したがって、この化学的修飾の効果の1つが十分に定義される。 Thus, one effect of this chemical modification is well defined. 両方の鎖の1位および2位のヌクレオチドで2'−O−メチル基によって修飾されたsiRNAのアンチセンス鎖の5'末端に、リン酸基を合成付加することで活性を増加させる一方で、完全な機能性は回復しない。 The 5 'end of the 2'-O- at position 1 and 2 of the nucleotides in both strands the antisense strand of the modified siRNA by a methyl group, while increasing the activity by the phosphate group to synthesize added, full functionality is not recovered. この結果は、リン酸化イベントの下流にあるステップ(例えば、RISC結合、RISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット相互作用、ならびに/またはRISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット切断)もまた、2'−O−メチル化によって影響を受けることを示唆している。 As a result, the step that is downstream of phosphorylation events (e.g., RISC binding, RISC mediated siRNA target / off-target interactions, and / or RISC mediated siRNA target / off-target cleavage) also, 2'-O- suggesting that affected by methylation.

(2'−O−メチル化および強化された二本鎖機能性) (2'-O-methylated and enhanced duplex functionality)
機能性に関する重要なパラメータとして、RISCに対するsiRNA結合と、それに続く二本鎖巻き戻し(アンワインディング)である。 An important parameter related functionality is a siRNA binding to RISC, unwinding duplex followed (unwinding). ここに提示される研究は、場合によっては、その分子の本来の機能性に対して反比例する様式で、センス鎖の2'−O−Me修飾が用量応答曲線を変える。 The studies presented here, in some cases, in a manner inversely proportional to the original function of the molecule, 2'-O-Me modification of the sense strand alters the dose response curves. これらの知見の1つの解釈は、センスおよびアンチセンス鎖とRISCとの連携が平衡した状態で存在しており、該平衡は「オン(on)」および「オフ(off)」の係数(例えば、k 、k '、k 、およびk 2' 、図47)によって定義されるということである。 One interpretation of these findings are present in a state of cooperation equilibrated with sense and antisense strand and RISC, the coefficient of the equilibrium "On (on)" and "off (off)" (e.g., k 1, k 1 ', k 2, and k 2', is that defined by Figure 47). 高機能分子は、K overall (k /k 'k ')を示し、アンチセンス鎖(例えば、K overall =100)と結合する方向への傾きを反映している。 Sophisticated molecules, K overall (k 1 k 2 / k 1 'k 2') shows the antisense strand (e.g., K overall = 100) reflects the inclination of the direction to bind. 対照的に、非機能性または半機能性分子(<F70)は、よりいっそう偏りがなくバランスのとれた鎖相互作用を示すK overallを表す(例えば、<70siRNA については 、K overall は約1である )。 In contrast, non-functional or semi-functional molecules (<F70) represents a K overall showing a balanced chain interactions balance no more biased (e.g., about <70SiRNA is a K overall about 1 a). 非機能性分子または半機能性分子のセンス鎖の化学修飾は、RISC−AS相互作用に対する平衡状態を駆動するので、RISC−AS:RISC−S(K overall は約 5)および全体の二重機能性を大幅に変化させる。 Chemical modification of the sense strand of the non-functional molecules or semi functional molecules, so to drive the equilibrium for RISC-AS interactions, RISC-AS: RISC-S (K overall is approximately 5) and the overall dual function sex significantly changing the. 対照的に、高機能性分子の場合、RISC−AS相互作用は既に好ましく、そのため化学修飾は、RISC−AS関連と機能性とをさらに強化することがより少なくなる。 In contrast, when the high-functional molecules, RISC-AS interactions rather already preferable, therefore chemical modification further that there is less to enhance the RISC-AS associated with functionality.

(2'−O−メチル化およびオフ・ターゲット・サイレンシング) (2'-O-methylated and off-target silencing)
両方の鎖の第1位および第2位にある2'−O−メチル修飾を含む二本鎖のアンチセンス鎖の5'末端に対するリン酸基の合成的付加によって、サイレンシング表現型の部分的レスキューに到る一方で、完全回復に欠けていることから、この修飾が二本鎖リン酸化の下流である付加的なステップ(例えば、RISC結合、RISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット相互作用、ならびに/またはRISC媒介siRNA標的/オフ・ターゲット切断) に影響を及ぼすことが示唆される By synthetic addition of a phosphate group for two 5 'end of the antisense strand of the strand containing 2'-O- methyl modifications in the first position and the second position of both strands, partial silencing phenotype while leading to the rescue, because of its lack of full recovery, downstream in a additional step in this modification duplex phosphorylation (e.g., RISC binding, RISC mediated siRNA target / off-target interactions, and it is suggested affecting / or RISC mediated siRNA target / off-target cleavage). この事実は、これらの同一の修飾が、サイレンシングにとって必要な iRNA−標的相補性の度合いに対してより大きな要求がなされるかもしれない可能性を拡げる This fact, these same modifications, expand the possibilities that might greater demands are made for the required s IRNA- target complementarity degree for silencing. '−O−メチルの位置がオフ・ターゲットと所定のsiRNA(センスまたはアンチセンス鎖)との相同性の部分と場合には、化学修飾の付加は、siRNAオフ標的相互作用を脱安定化させることで、RNAi媒介ダウン・レギュレーションでの重要なステップを抑制する可能性がある When 2 '-O- position of methyl homology parts and weight ing the off-target and a given siRNA (sense or antisense strand), additions of chemical modification, leaving a siRNA off target interactions by stabilize, it may suppress the important step in the RNAi-mediated down-regulation. あるいは、2 '−O−メチル基の位置がオフターゲットと所定のsiRNAとのあいだの相同性の部分と重なり合う場合、付加的な化学修飾がその領域で二本鎖の可撓性をかえ、それによって標的分子を分解するRISCの能力を阻害し得る Alternatively, 2 '-O- if the position of the methyl group overlaps the homology part in between the off-target and a predetermined siRNA, additional chemical modification changes the flexibility of the double-stranded in that region, it drunk can inhibit RISC ability to degrade the target molecule. さらに別のシナリオでは、 '−O−メチル修飾の部位がオフ・ターゲットとの相同性の場所とは重なり得ない。 In yet another scenario, 2 '-O- site methyl modification is not heavy Do Ri obtained from homology location off target. この場合には 、修飾の脱安定化効果がその分子の下流へ移され、それによって siRNAに100%未満の相同性を有する標的と対を形成し、そして/または分解るR ISCの能力を除去するという可能性がある In this case, de-stabilizing effect of the modification are transferred to the downstream of the molecule, thereby forming a target pair which has a homology of less than 100% to siRNA, and / or the ability of to that R ISC decomposition there is a possibility of removal. そのため、SまたはAS鎖の5'末端以外の位置にある2'−O−メチル修飾がオフ・ターゲット効果を取り除くために使用することが可能である。 Therefore, 2'-O-methyl modifications at positions other than 5 'end of the S or AS strands can be used to remove off-target effects.

(実施例21) (Example 21)
(エクサエクオ剤としての修飾二本鎖) (Modified duplexes as Ekusaekuo agent)
siRNAによる継続的投薬またはマイクロアレイ実験の最中に、形質移入の間、全siRNA濃度を一定に保つことが所望される During continuous medication or microarray experiments with siRNA, during transfection, keeping the total siRNA concentration constant is desired. 残念なことに、第2のsiRNAの付加(例え非特異的であっても) が、標的特異的 iRNAによって誘導されたサイレンシングの度合いを少なくすることができ、 このことは、おそらくRISC へのアクセスのための 2本の配列のあいだの競合よる。 Unfortunately, the addition of the second siRNA (even non-specific example) is, it is possible to reduce the degree of silencing induced by target-specific s iRNA, this is probably the RISC According to the conflicts between the two sequences for access. そのような理由から、遺伝子標的化を中断させることがないエクサエクオ(exaequo)剤として作用し得る二本鎖の開発が重要である。 For that reason, it is important to develop a duplex that can act as no Ekusaekuo (exaequo) agents disrupting gene targeting.

例えば用量実験などにおける非競合的エクサクオ(exaequo)剤として作用する修飾二本鎖の能力を評価するために、修飾および非修飾の、非特異的siRNAの特異的siRNAサイレンシングに対する効果を調べた。 For example, in order to assess the ability of the modified duplexes to act as non-competitive Ekusakuo (exaequo) agents in such dosage experiments, qualified and unqualified investigated the effect on specific siRNA silencing of non-specific siRNA . このことを達成するために、ヒト・シクロフィリンB遺伝子(例えば、cyclo4)を対象とするsiRNA二本鎖を最初に、種々の濃度(例えば、用量応答)で細胞に形質移入した。 To accomplish this, human cyclophilin B gene (e.g., Cyclo4) first siRNA duplexes that target were transfected into cells at various concentrations (e.g., a dose response). cyclo4単独で誘導された標的特異的サイレンシングを次に、(a)非修飾かつ非特異的配列#4(NS4)または(b)修飾NS4 の存在下で、この分子によって誘導したサイレンシングと比較した then the induced target specific silencing cyclo4 alone, and silencing was induced by (a) non-modified and non-specific sequence # 4 (NS4) or (b) modified NS4, in the presence of this molecule They were compared. この場合、NS4の修飾バージョンは、1 または17塩基対長のいずれかであり(それぞれ、配列番号333:UAGCGACUAAACACAUCAAおよび配列番号334:UAGCGACUAAACACAUC)、センスおよびアンチセンス鎖上の1位および2位にある−O−メチル基を含み、またCおよびU上の2'−O−メチル基2'−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCおよびU上の2'Flを含んだ In this case, modification version of NS4 is either 1 9 or 17 base pairs in length (respectively, SEQ ID NO 333: UAGCGACUAAACACAUCAA and SEQ ID NO 334: UAGCGACUAAACACAUC), the 1 and 2 positions on the sense and antisense strand there -O- include methyl group, also 2'-O- methyl 2'-O- methyl group on C and U, as well as containing 2'Fl on C and U of the antisense strand. ンスおよびアンチセンス鎖の5'末端には、リン酸基は結合していない The 5 'end of the cell Manual and antisense strand, a phosphate group is not bonded.

具体的には、HeLa細胞を96穴プレートにプレーティングし、一晩置いて接着させた。 Specifically, the HeLa cells were plated in 96 well plates and allowed to adhere to overnight. 続いて、 Lipofectamine 2000 を用いて、以下のものの1つを細胞に形質移入した。 Subsequently, using Lipofectamine 2000, one of the following ones were transfected into cells. すなわち、 That is,
a)cyclo4 siRNA(1−100nM)、(配列番号318:GGA AAG ACU GUU CCA AAA A) a) cyclo4 siRNA (1-100nM), (SEQ ID NO 318: GGA AAG ACU GUU CCA AAA A)
b)cyclo4 siRNA(1−100nM) 、プラス、 NS4(19塩基対)、 b) cyclo4 siRNA (1-100nM), plus, NS4 (19 base pairs),
c)cyclo4 siRNA(I−100nM)、プラス、修飾NS4(17または19塩基対)、 c) cyclo4 siRNA (I-100nM), plus modified NS4 (17 or 19 base pairs),
d)センス鎖の5'末端上にC y3標識も含むcyclo4 siRNA(1−100nM)プラス、修飾NS4(17または19塩基対)。 d) C y3-labeled including Cyclo4 siRNA on 5 'end of the sense strand (1-100 nM) plus modified NS4 (17 or 19 base pairs). 第2のsiRNAの濃度は、形質移入の最中に全siRNA濃度が100nMに保たれるように、 cyclo4の濃度に第2のsiRNA濃度を一致させた。 The concentration of the second siRNA, as the full siRNA concentration during the transfection kept 100 nM, and to match the second siRNA concentration to the concentration of Cyclo4. 次に、分岐DNAアッセイ(Genospectra、Fremont、CA)を用いて、標的特異的サイレンシングを測定した(t=24時間)。 Next, branched DNA assay (Genospectra, Fremont, CA) was used to measure target specific silencing (t = 24 hours).

これらの実験の結果を図43に示し、かつ以下に説明した。 The results of these experiments are shown in Figure 43, and described below.
1. 1. cyclo4は、有力な二本鎖である。 cyclo4 is a powerful double-stranded. cyclo4の濃度を100nMから1nMに減少させても、この二本鎖のサイレンシング能は、かえられない(F95、図48A−I参照)。 Also the concentration of cyclo4 reduces from 100nM to 1 nM, silencing ability of the duplex, not changed (F95, see FIG. 48A-I).
2.19塩基対未修飾NS4siRNAをcyclo4に加えることで、c yclo4誘導遺伝子サイレンシングに対して好適な濃度依存的減少をもたし、NS4 が例えばRISC複合体へのアクセスについて cyclo4と競合していることを示唆している(図48B−I参照)。 2.19 bp unmodified NS4siRNA a by adding the cyclo4, c yclo4 Motashi suitable concentration-dependent decrease relative to induce gene silencing, compete with Cyclo4 for access to NS4 is example if the RISC complex suggesting that (see FIG. 48B-I).
3. 3. センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2'−O−メチル基と、センス鎖のCおよびU上の2'−O−メチル基と、アンチセンス鎖のCおよびU上の2'F 基とを含むNS4二本鎖(17または19塩基対)は 、cyclo4による標的特異的サイレンシング減少させず 、それらの二本鎖は例えばRISC に対してcyclo4と競合しないことが示唆される(図43BIIおよびBIII参照)。 And 2'-O- methyl groups on positions 1 and 2 of the sense and antisense strand, and 2'-O- methyl group on C and U of the sense strand, 2'F on C and U antisense strand l group and the including NS4 duplexes (17 or 19 base pairs), Cyclo4 without causing reduction target specific silencing by their duplexes suggested that compete with Cyclo4 respect RISC if example embodiment It is Ru (see FIG 43BII and BIII).
4. 4. センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2'−O−メチル基と、センス鎖のCおよびU上の2'−O−メチル基と、アンチセンス鎖のCおよびU上の2'F 基と、センス鎖の5'末端上のCy3とを含むNS4二本鎖(17または19塩基対)はcyclo4による標的特異的サイレンシングを減少させず、それらの二本鎖は例えばRISC に対してcyclo4と競合しないことが示唆される(48 AIIおよびAIII参照)。 And 2'-O- methyl groups on positions 1 and 2 of the sense and antisense strand, and 2'-O- methyl group on C and U of the sense strand, 2'F on C and U antisense strand and l group, NS4 duplexes containing a Cy3 on the 5 'end of the sense strand (17 or 19 base pairs) does not decrease the target-specific silencing by Cyclo4, their duplex if example embodiment it Ru is suggested that does not conflict with cyclo4 respect RISC (see Figure 48 AII and AIII).

これらの結果は、上記の修飾を含むsiRNAが機能的siRNAと競合せず、マイクロアレイ研究等のsiRNA研究でエクサエクオ(exaequo)剤として使用することができることを、示している。 These results do not compete with siRNA functional siRNA comprising the above-described modification, that can be used as Ekusaekuo (exaequo) agent with siRNA studies of the microarray studies have shown.

上記修飾を持つsiRNAが、標的特異的siRNAと競合しない理由は、 修飾二本鎖が細胞へ入ることができないからであると、考えられる。 SiRNA having the above modification, reason not to compete with the target specific siRNA, the modified duplex is not possible to enter the cell, it is contemplated. これを試験するために、センスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基と 、センス鎖のCおよびU上の2'−O−メチル基と、アンチセンス鎖 CおよびU上の2'F l基 (アンチセンス鎖上には5'リン酸基がない)とをを担持するsiRNAを 、センス鎖の5'末端上 Cy3部分で標識し、HeLa細胞に形質移入した。 To test this, a 2'-O- methyl group at the 1 and 2 of the sense and antisense strand, and 2'-O- methyl group on C and U of the sense strand, the antisense strand C and 'an siRNA carrying the (no phosphate group, 5 of the sense strand 2'F l groups on U 5 is on the antisense strand)' was labeled with Cy3 portions on end, transformed into HeLa cells populate the. 形質移入後48時間、細胞を蛍光顕微鏡で分析した。 48 hours after transfection, the cells were analyzed by fluorescence microscopy. これらの実験の結果は、Lipofectamine2000形質移入によって、細胞内に入るそれらの二本鎖の能力に上記修飾が変更を加えることはないことを示す。 The results of these experiments, by Lipofectamine2000 transfection, indicating the modification that does not make changes to the capabilities of their duplexes enter cells. (A)センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上の2'−O−メチル基、センス鎖のCおよびU上の2'−O−メチル基、アンチセンス鎖のCおよびUに付加された2'F 基、 ならびにセンス鎖の5'末端上のCy3基、によって修飾されたcyclo14 siRNA 二本鎖によって染色されたHeLa細胞と、(B)(A)と同様に染色され、かつ核の位置を同定するためのHoechst33342による対比染色されたものとの顕微鏡写真(本明細書では複製せず)によって、これらの修飾を含むsiRNAの核および核周囲を示した。 (A) Sense and 1 and 2-position on the 2'-O- methyl group of the antisense strand, 2'-O- methyl group on C and U of the sense strand, was added to the C and U antisense strand and 2'F l group HeLa cells and Cy3 group on the 5 'end of the sense strand, stained with modified Cyclo14 siRNA duplexes by, stained in the same manner as (B) (a), and nuclear the position photomicrograph of what was counterstained by Hoechst33342 to identify (not replicate in this specification), showed nuclear and perinuclear siRNA containing these modifications.

センスおよびアンチセンス鎖の1および2位上への2'−O−メチル基の付加が他の同時形質移入されたsiRNAと競合する二本鎖の能力取り除くのに十分であるかどうかを試験するために、G APDH(GAPDH4)を対象とするsiRNAを、(1)非特異的対照#2(NS2−配列番号334:UAAGGCUAUGAAGAGAUAC)、(2)センスおよびアンチセンス鎖の両方の1位および2位に2'−O−メチル修飾を担持する非特異的対照#2、あるいは(3)cyclo14(配列番号335:GGCCUUAGCUACAGGAGAG、GAPDH4と競合しないシクロフィリンsiRNA)とともに、様々な濃度(0.781〜100nM)でHeLa細胞に形質移入した。 Test 2'-O- addition of a methyl group to sense and 1 and 2 of the antisense strand whether sufficient to eliminate the ability of the duplex conflict with other co-transfected siRNA to, the siRNA that target G APDH (GAPDH4), (1 ) non-specific control # 2 (NS2- SEQ ID NO 334: UAAGGCUAUGAAGAGAUAC), (2) 1 -position of both the sense and antisense strand and 2 nonspecific control # 2 carrying 2'-O- methyl modifications on positions or, (3) cyclo14: with (SEQ ID nO: 335 GGCCUUAGCUACAGGAGAG, cyclophilin siRNA that does not compete with GAPDH4), various concentrations (0.781~100NM) They were transfected in HeLa cells. 第2のsiRNAの濃度を、形質移入中の全siRNA濃度が100nMとなるように、GAPDH4の濃度と一致させた。 The concentration of the second siRNA, so that the total siRNA concentration in the transfected become 100 nM, were consistent with the concentration of GAPDH4. 次に、GAPDH転写産物のレベルを評価するために分岐DNAアッセイを実施する前に、細胞をさらに24時間培養した。 Then, prior to performing the branched DNA assay to evaluate the levels of GAPDH transcripts was further cultured for 24 hours cells. これらの実験の結果を図49で説明するとともに、以下に示す。 With describing the results of these experiments in Figure 49, it is shown below.
1. 1. GAPDH4が、Cyclo14の存在下で(またはそれ自体で、データ不図示)、野生型転写産物の約90%サイレンシングを誘導する。 GAPDH4 is in the presence of Cyclo14 (or by itself, data not shown), induces about 90% silencing of wild-type transcripts.
2. 2. 未修飾NS2の付加によってGAPDHサイレンシングでの劇的な減少がもたらされた。 Dramatic decrease in GAPDH silencing brought about by the addition of unmodified NS2.
3. 3. センスおよびアンチセンス鎖の両方の1および2位で2'−O−メチル基によるNS2の修飾が、未修飾分子によって観察された干渉効果を除去した。 2'-O- modification of NS2 with methyl groups at positions 1 and 2 of both the sense and antisense strand, to remove an interference effect observed by unmodified molecules.

これらの結果は、既に述べた修飾を含むsiRNAは、機能的siRNAと競合することがなく、マイクロアレイ研究を含む種々のsiRNA適用で、エクサエクオ剤として用いられることを実証する These results indicate that siRNA containing already mentioned modifications, without having to compete with functional siRNA, a variety of siRNA applications including microarray studies demonstrate that used as Ekusaekuo agent.

本発明を、いくつかの具体的または好ましい独創的な実施形態と組み合わせて説明および例証したが、本発明が多くのさらなる修飾をおこなうことができることは、当業者に理解される。 The present invention, some specific or preferred ingenious combination with embodiments described and illustrated the, but the present invention is to be able to perform many further modifications, it will be understood by those skilled in the art. 本願は、一般に本発明の原理に従うありとあらゆる変形例、使用、または適用に及ぶもので、添付した請求の範囲の適用および範囲に記載された必須の特徴に適用しうるものとして、当技術分野で既知または慣習にともなう開示からの逸脱を含む。 This application, any and all modification in accordance with the principles of the present invention generally, used, or intended to cover applications, assuming that can be applied to the essential features set forth in the application and scope of the appended claims, known in the art or a departure from the disclosure associated with convention.

図1Aは、トランスフェクションの24時間後に測定されるセンスおよび/またはアンチセンス鎖に対するオルトエステル修飾の機能性を説明する。 Figure 1A illustrates the functionality of orthoester modifications on sense and / or antisense strand is measured 24 hours after transfection. 修飾二本鎖の説明については「好ましい実施形態」を参照せよ。 For a description of the modified duplex cf. "preferred embodiment". siRNA+SEAP発現プラスミドによって同時にトランスフェクトされた細胞でのSEAP発現レベルを、SEAP発現プラスミド単独によってトランスフェクトされた細胞と比較することで、各siRNAによって誘導されたSEAPサイレンシングの度合いを決定した。 The SEAP expression levels in cells transfected simultaneously by siRNA + SEAP expression plasmid, by SEAP expression plasmid alone is compared with transfected cells was determined the degree of SEAP silencing induced by each siRNA. 図1Bは、トランスフェクションの48時間後に測定されるオルトエステル修飾(センスおよび/またはアンチセンス鎖上)の機能性を示す。 Figure 1B illustrates the functionality of orthoester modifications measured 48 hours after transfection (sense and / or on the antisense strand). 図2Aは、トランスフェクションの24時間後に測定される、他の修飾とともにオルトエステル修飾(センスおよび/またはアンチセンス鎖上)の機能性を示す。 Figure 2A shows the functionality of the measured 24 hours after transfection, orthoester modified with other modifications (sense and / or on the antisense strand). 図2Bは、トランスフェクションの72時間後に測定される、他の修飾とともにセンスおよび/またはアンチセンス鎖上のオルトエステル修飾の機能性を示す。 Figure 2B is measured 72 hours after transfection, showing the functionality of orthoester modifications of the sense and / or on the antisense strand in conjunction with other modifications. 図2Cは、トランスフェクションの144時間後に測定される、他の修飾とともにセンスおよび/またはアンチセンス鎖上のオルトエステル修飾の機能性を示す。 Figure 2C is measured after 144 hours of transfection, showing the functionality of orthoester modifications of the sense and / or on the antisense strand in conjunction with other modifications. 図3は、siRNA機能性に対するセンスおよびアンチセンス鎖修飾の効果を示す。 Figure 3 shows the effect of sense and antisense strand modifications on siRNA functionality. 図4は、siRNA機能性に対するセンスおよびアンチセンス鎖修飾の効果を説明する。 Figure 4 illustrates the effects of sense and antisense strand modifications on siRNA functionality. 図5は、センス鎖上の種々の修飾と併用したアンチセンス鎖のチオ系修飾の効果を示す。 Figure 5 shows the effect of various modifications in combination with thio-based modification of the antisense strand of the sense strand. 図6は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方でのホスホロチオエート修飾の効果を示す。 Figure 6 shows the effect of phosphorothioate modifications in both the sense and antisense strands. 図7は、他の多様な修飾と併用した2'−O−メチル修飾(センスおよびアンチセンス鎖の両方で)の効果を示す。 Figure 7 shows the effect of combination with 2'-O- methyl modification and other various modifications (in both sense and antisense strands). 図8は、他の化学修飾と併用した2'−デオキシ−RNAハイブリッド(どちらか一方の鎖)であるsiRNAの効果を示す。 Figure 8 shows the effect of siRNA is used in combination with other chemical modifications include 2'-deoxy -RNA hybrids (either strand). 図9は、他の化学修飾と併用したセンス鎖5'末端でのコレステロール・コンジュゲートの5'末端の機能性を示す。 Figure 9 shows the end of a functional 5 'cholesterol conjugate at the end' sense strand 5 in combination with other chemical modifications. 図10は、他の化学修飾と併用したセンス鎖5'末端でのPEGコンジュゲートの機能性を示す。 Figure 10 shows the functionality of the PEG conjugate in combination with the sense strand 5 'end with other chemical modifications. 図11は、センス鎖5'末端でのコレステロール・コンジュゲートを持つ修飾siRNAの効力増加を示す。 Figure 11 shows the increased efficacy of the modified siRNA with cholesterol conjugate in the sense strand 5 'end. 図12は、ダルマコン(Dharmacon)2'−ACE・RNA合成化学に用い得る保護RNAヌクレオチド・ホスホラミダイトを示す。 Figure 12 shows the protective RNA nucleotide phosphoramidites usable in Dharmacon (Dharmacon) 2'-ACE · RNA synthesis chemistry. 図13は、ダルマコン(Dharmacon)RNA合成サイクルの概略を示す。 Figure 13 shows a schematic of Dharmacon (Dharmacon) RNA synthesis cycle. 図14は、好ましい2'−ACE保護RNAの構造を示す。 Figure 14 shows the structure of a preferred 2'-ACE protected RNA. 図15Aは、他の裸siRNA上の単一2'−デオキシ修飾(センスまたはアンチセンス鎖)の機能的な影響(functional consequences)を示す。 Figure 15A shows a single 2'-deoxy modification on other naked siRNA functional consequences of (sense or antisense strand) (functional consequences). 図15Bは、他の裸siRNA上の2つのタンデム2'−デオキシ修飾(センスまたはアンチセンス鎖)の機能的な影響を示す。 Figure 15B illustrates the functional consequences of two tandem 2'-deoxy modifications on other naked siRNA (sense or antisense strand). 図15Cは、他の裸siRNA上の3つのタンデム2'−デオキシ修飾(センスまたはアンチセンス鎖)の機能的な影響を示す。 Figure 15C illustrates the functional consequences of three tandem 2'-deoxy modifications on other naked siRNA (sense or antisense strand). 図16Aは、他の裸siRNA上の単一2'−O−メチル修飾(センスまたはアンチセンス鎖)の機能性影響(functionality consequences)を示す。 Figure 16A illustrates the functional effect of a single 2'-O- methyl modifications on other naked siRNA (sense or antisense strand) and (Functionality consequences). 図16Bは、他の裸siRNA上の2つのタンデム2'−O−メチル修飾(センスまたはアンチセンス鎖)の機能性影響を示す。 Figure 16B illustrates the functional effect of two tandem 2'-O- methyl modifications on other naked siRNA (sense or antisense strand). 図16Cは、他の裸siRNA上の3つのタンデム2'−O−メチル修飾(センスまたはアンチセンス鎖)の機能性影響を示す。 Figure 16C illustrates the functional impact of the three tandem 2'-O- methyl modifications on other naked siRNA (sense or antisense strand). 図17は、二本鎖安定性に対するセンスおよびアンチセンス鎖での修飾の影響を示す。 Figure 17 shows the effect of modifications on the sense and antisense strand to duplex stability. 図18は、裸および修飾siRNAの受動的な取り込みに対する5'コレステロール部分を含むコンジュゲートの効果を示す。 Figure 18 shows the effect of a conjugate comprising 5 'cholesterol moiety to the passive uptake of naked and modified siRNA. 図19は、センス鎖内の種々の位置における2つのタンデム2'−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 Figure 19 illustrates the functional consequences of two tandem 2'-deoxy modifications at various positions in the sense strand. 図20は、センス鎖内の種々の位置における3つのタンデム2'−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 Figure 20 illustrates the functional consequences of three tandem 2'-deoxy modifications at various positions in the sense strand. 図21は、アンチセンス鎖内の種々の位置における単一2'−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 Figure 21 illustrates the functional consequences of a single 2'-deoxy modifications at various positions in an antisense strand. 図22は、アンチセンス鎖内の種々の位置における2つのタンデム2'−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 Figure 22 illustrates the functional consequences of two tandem 2'-deoxy modifications at various positions in an antisense strand. 図23は、アンチセンス鎖内の種々の位置における3つのタンデム2'−デオキシ修飾の機能的な影響を示す。 Figure 23 illustrates the functional consequences of three tandem 2'-deoxy modifications at various positions in an antisense strand. 図24は、センス鎖内での種々の位置における2つのタンデム2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 Figure 24 illustrates the functional consequences of two tandem 2'-O- methyl modifications at various positions in the sense strand. 図25は、センス鎖内での種々の位置における3つのタンデム2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 Figure 25 illustrates the functional consequences of three tandem 2'-O- methyl modifications at various positions in the sense strand. 図26は、アンチセンス鎖での種々の位置における単一2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 Figure 26 illustrates the functional consequences of a single 2'-O- methyl modifications at various positions in an antisense strand. 図27は、アンチセンス鎖での種々の位置における2つのタンデム2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 Figure 27 illustrates the functional consequences of two tandem 2'-O- methyl modifications at various positions in an antisense strand. 図28は、アンチセンス鎖での種々の位置における3つのタンデム2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 Figure 28 illustrates the functional consequences of three tandem 2'-O- methyl modifications at various positions in an antisense strand. 図29は、ヒト・シクロフィリン遺伝子に対するsiRNAを用いた(1)5'センス、(2)5'アンチセンス、または(3)5'センスおよびアンチセンス鎖の位置1および2上での2つの2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 29, using siRNA against human cyclophilin gene (1) 5 'sense, (2) 5' antisense or (3) 5 'sense and antisense position of strand 1 and two 2 on 2, '-O- illustrates the functional consequences of methyl modification. 図30は、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子に対するsiRNAを用いた(1)5'センス、(2)5'アンチセンス、または(3)5'センスおよびアンチセンス鎖の位置1および2上での2つの2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 Figure 30 is using siRNA against firefly luciferase gene (1) 5 'sense, (2) 5' antisense or (3) 5 'sense and antisense position of strand 1 and two 2 on 2, '-O- illustrates the functional consequences of methyl modification. 注記:この図では、アンチセンス鎖の5'末端のリン酸化を「P」で表す。 Note: In this figure represents the phosphorylation of the 5 'end of the antisense strand by "P". 図31は、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子に対するsiRNAを用いた(1)5'センス、(2)5'アンチセンス、または(3)5'センスおよびアンチセンス鎖の位置1および2上での2つの2'−O−メチル修飾の機能的な影響を示す。 Figure 31 is using siRNA against firefly luciferase gene (1) 5 'sense, (2) 5' antisense or (3) 5 'sense and antisense position of strand 1 and two 2 on 2, '-O- illustrates the functional consequences of methyl modification. 注記:この図では、アンチセンス鎖の5'末端のリン酸化を「P」で表す。 Note: In this figure represents the phosphorylation of the 5 'end of the antisense strand by "P". 図32は、ヒト血清での修飾siRNAの安定性を示す。 Figure 32 shows the stability of the modified siRNA in human serum. 修飾”a”=センス鎖での全CsおよびUsの2'−O−メチル修飾(3'idTキャッピングと組み合わさっている)。 Modified "a" = all Cs and Us 2'-O-methyl modification of the sense strand (3'IdT are capped and Kumiawasa'). 修飾”b”=センス鎖での全CsおよびUsの2'F修飾(3'idTキャッピングと組み合わさっている)。 Modified "b" = all Cs and Us 2'F modification of the sense strand (3'IdT are capped and Kumiawasa'). 図33は、アルブミンおよび他の血清タンパク質に対する修飾si RNA−コレステロール・コンジュゲートの親和性を示す。 Figure 33 shows the affinity of the modified si RNA-cholesterol conjugates for albumin and other serum proteins. 図34は、小分子コンジュゲートがsiRNA効力について有する効果を示す。 Figure 34 shows the effect of small molecule conjugate is closed for siRNA efficacy. 図35は、ヒト血清でのsiRNAコンジュゲートの安定性を示す。 Figure 35 shows the stability of the siRNA conjugates in human serum. siRNAは、センス鎖上に、(1)全CsおよびUs上の2'−O−メチル基と、(2)3'idTキャップとを運び、siRNAa−コンジュゲートは、センス鎖上に、(1)全CsおよびUs上の2'−O−メチル基、(2)3'idTキャップ、および(3)5'コレステロール・コンジュケートを担持する。 siRNA is on the sense strand, (1) a 2'-O- methyl group on all Cs and Us, (2) carries a 3'idT cap, SiRNAa- conjugate on the sense strand, (1 ) 2'-O-methyl groups on all Cs and Us, carrying (2) 3'IdT caps, and (3) 5 'cholesterol Konjuketo. 図36は、コレステロール・コンジュゲートが受動的なsiRNA取り込みについて有する効果を示す。 Figure 36 shows the effect of cholesterol conjugate is closed for passive siRNA uptake. 図37Aは、血清にさらされたsiRNAを含むエチジウム・ブロミド染色ゲルを示す典型的な血清安定性試験から得られた結果を表す(上側が未修飾、下側が「分子1修飾」による修飾)。 Figure 37A shows the ethidium bromide stained gel containing serum exposed the siRNA, typical serum represents the results obtained from stability tests (modified upper unmodified, lower side by the "molecule 1 modifications") . この図の目的にとって、用語「分子1修飾(molecule 1 modifications)」とは、センス鎖の1および2位上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2'−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全CsおよびUs上の2'−フルオロ(Fl)修飾、およびアンチセンス鎖の5'末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 For the purposes of this figure, the term "molecule 1 modifications (Molecule 1 Modifications)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense strand, 2'-O on all Cs and Us of the sense strand - methyl modified, it refers to a molecule comprising 2'-fluoro (Fl) modifications on all Cs and Us of the antisense strand, and a phosphate modification on the 5 'end of the antisense strand. 図37Bは、修飾および未修飾形態である4種類のヒト・シクロフィリンB・siRNAの相対的安定性をプロットする一組の折れ線グラフである(U 1 = 5'GAA AGA GCA UCU ACG GUG A(配列番号315)、U2 = 5'GAA AGG AUU UGG CUA CAA A(配列番号316)、U3 = 5'ACA GCA AAU UCC AUC GUG U(配列番号317)、およびU4 = 5'GGA AAG ACU GUU CCA AAA A、(配列番号318)、センス鎖)。 Figure 37B is a set of line graphs that plot the relative stability of the modified and four human cyclophilin B-siRNA is unmodified form (U 1 = 5'GAA AGA GCA UCU ACG GUG A (SEQ No. 315), U2 = 5'GAA AGG AUU UGG CUA CAA A (SEQ ID NO: 316), U3 = 5'ACA GCA AAU UCC AUC GUG U (SEQ ID NO: 317), and U4 = 5'GGA AAG ACU GUU CCA AAA A , (SEQ ID NO: 318), the sense strand). X軸は、時間(hr)を表す。 X-axis represents the time (hr). Y軸は元のままの状態を保つ二本鎖が占める割合を表す。 Y axis represents the percentage of double-stranded to maintain the state of intact. 黒四角は、未修飾配列を示す。 Black squares represent unmodified sequences. 白四角は、修飾配列を示す。 White squares represent modified sequences. 図38は、種 々の濃度で所定の標的をサイレンシングするために、裸、または修飾(分子1修飾)されているsiRNA(U1およびU3)の能力を比較する。 Figure 38, in order to silence a given target at a concentration of species s, compares the ability of the naked or modified, (molecule 1 modifications) has been that siRNA (U1 and U3). Y軸は、対照群(形質移入されていない細胞)と比較した発現の度合いを表す。 Y axis represents the degree of expression compared to the control group (cells not transfected). X軸は形質移入の手順を進めている最中のsiRNAの濃度を表す。 X-axis represents the concentration of the middle of siRNA that perform the procedures of transfection. 黒棒は、未修飾配列を表す。 Black bars represent unmodified sequences. 白棒は修飾配列を表す。 Open bars represent the modified sequences. この図の目的にとって、用語「分子1修飾(molecule 1 modifications)」とは、センス鎖の1および2位上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2'−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全CsおよびUs上の2'−フルオロ(Fl)修飾、およびアンチセンス鎖の5'末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 For the purposes of this figure, the term "molecule 1 modifications (Molecule 1 Modifications)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense strand, 2'-O on all Cs and Us of the sense strand - methyl modified, it refers to a molecule comprising 2'-fluoro (Fl) modifications on all Cs and Us of the antisense strand, and a phosphate modification on the 5 'end of the antisense strand. 図39は、修飾siRNA(「分子1修飾」を持つ)および未修飾siRNAによって、7日間にわたり誘導されたサイレンシングの度合いを評価する。 Figure 39 is the modified siRNA (with the "molecule 1 modifications") and unmodified siRNA, to evaluate the degree of induced silencing for 7 days. Y軸は、対照群(形質移入されていない細胞)と比較した場合の遺伝子発現の度合いを表す。 Y-axis represents the degree of gene expression when compared to the control group (cells not transfected). X軸は、形質移入後の日数を表す。 X-axis represents the number of days after transfection. 黒棒は、未修飾配列を表す。 Black bars represent unmodified sequences. 白棒は、修飾配列を表す。 The open bar represents the modified sequence. この図の目的にとって、用語「分子1修飾(molecule 1 modifications)」とは、センス鎖の1および2位上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2'−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全CsおよびUs上の2'−フルオロ(Fl)修飾、およびアンチセンス鎖の5'末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 For the purposes of this figure, the term "molecule 1 modifications (Molecule 1 Modifications)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense strand, 2'-O on all Cs and Us of the sense strand - methyl modified, it refers to a molecule comprising 2'-fluoro (Fl) modifications on all Cs and Us of the antisense strand, and a phosphate modification on the 5 'end of the antisense strand. 図40は、種々の濃度で細胞に形質移入された4通りの個々の修飾siRNA(分子1修飾にもとづく)および未修飾siRNAによって誘導された細胞死の度合いを比較する。 Figure 40 compares the degree of individual modified siRNA (based on molecule 1 modifications) and cell death induced by the unmodified siRNA four kinds transfected to the cells at various concentrations. Y軸は、細胞の相対的生存度(非形質移入細胞にもとづく)を表す。 Y axis represents relative cell viability (based on the non-transfected cells). X軸は、形質移入の手順を実施している際のsiRNAの濃度を表す。 X-axis represents the concentration of siRNA during that implement the procedures of transfection. 培養物を、アラマー・ブルー(Alamar Blue)アッセイを用いた形質移入の24〜48時間後に試験した。 Cultures were tested 24-48 hours after transfection with the Alamar Blue (Alamar Blue) assay. 黒棒は未修飾配列を表す。 Black bars represent unmodified sequences. 白棒は、修飾配列を表す。 The open bar represents the modified sequence. この図の目的にとって、用語「分子1修飾(molecule 1 modifications)」とは、センス鎖の1および2位上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2'−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全CsおよびUs上の2'−フルオロ(Fl)修飾、およびアンチセンス鎖の5'末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 For the purposes of this figure, the term "molecule 1 modifications (Molecule 1 Modifications)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense strand, 2'-O on all Cs and Us of the sense strand - methyl modified, it refers to a molecule comprising 2'-fluoro (Fl) modifications on all Cs and Us of the antisense strand, and a phosphate modification on the 5 'end of the antisense strand. 図41は、修飾形態(分子1修飾にもとづく)および未修飾形態である4通りの個々のヒト・シクロフィリンB・siRNAによるオフ・ターゲット化の度合いを比較する。 Figure 41 compares the modified forms (based on molecule 1 modifications) and degree of off-targeting by individual human cyclophilin B-siRNA four types are unmodified forms. データを6つの異なる群にわけた。 Data were divided into six different groups. すなわち、4倍(4x)を上回る発現減少が見られる標的の数、3〜4倍(3〜4x)の発現減少が見られる標的の数、2.5〜3倍(2.5〜3x)の発現減少が見られる標的の数、 4倍(>4x)を上回る発現増加が見られる標的の数、 3〜4倍(3〜4x)の発現増加が見られる標的の数、さらに2.5〜3倍(2.5〜3x)の発現増加が見られる標的の数である。 That is, four times the number of targets that decreased expression is seen over the (4x), number of targets that decreased expression is observed in three to four times (3~4x), 2.5~3 fold (2.5~3x) the number of targets that decreased expression of is seen, four times (> 4x) the number of targets that increased expression is seen over a number of targets that increased expression is seen in the three to four times (3~4x), further 2.5 increased expression of 3 times (2.5~3x) is the number of targets found. 黒棒は、未修飾配列を表す。 Black bars represent unmodified sequences. 白棒は、修飾配列を表す。 The open bar represents the modified sequence. この図の目的にとって、用語「分子1修飾(molecule 1 modifications)」とは、センス鎖の1および2位上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2'−O−メチル修飾、アンチセンス鎖の全CsおよびUs上の2'−フルオロ(Fl)修飾、 およびアンチセンス鎖の5'末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 For the purposes of this figure, the term "molecule 1 modifications (Molecule 1 Modifications)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense strand, 2'-O on all Cs and Us of the sense strand - methyl modified, it refers to a molecule comprising 2'-fluoro (Fl) modifications on all Cs and Us of the antisense strand, and a phosphate modification on the 5 'end of the antisense strand. 図42は、(1)分子2修飾(molecule 2 modifications)、(2)Cy3による裸分子修飾、および(3)Cy3により修飾された裸NSC9分子を含むcyclo 14siRNAの遺伝子サイレンシング能力を比較するヒストグラムを示す。 Figure 42 is a histogram comparing (1) molecule 2 modifications (Molecule 2 Modifications), (2) Cy3 naked molecule modification by, and (3) gene silencing ability of cyclo 14siRNA including naked NSC9 molecules modified by Cy3 It is shown. Y軸は、対照遺伝子(GAPDH)と比較したヒト・シクロフィリンB発現の度合いを示す。 Y-axis shows the degree of human cyclophilin B expression relative to a control gene (GAPDH). 「脂質(lipid)」は、形質移入試薬であるLipofectamine 2000によって処置された対照細胞を表す。 "Lipid (lipid)" represents the control cells treated with Lipofectamine 2000 is transfection reagent. 「対照(control)」は、未処理の細胞のことをいう。 "Control (control)" refers to the untreated cells. NS は、非特異的配列#9である。 NS 9 is a non-specific sequence # 9. この図の目的にとって、用語「分子2修飾(molecule 2 modifications)」とは、センス鎖の1および2位上の2'−O−メチル修飾、センス鎖の全CsおよびUs上の2'−O−メチル修飾、センス領域の5'末端にあるCys3標識、アンチセンス鎖の全CおよびU上の2'−フルオロ(Fl)修飾、およびアンチセンス鎖の5'末端上にあるリン酸塩修飾を含む分子のことをいう。 For the purposes of this figure, the term "molecule 2 modifications (Molecule 2 Modifications)" is, 2'-O-methyl modifications on positions 1 and 2 of the sense strand, 2'-O on all Cs and Us of the sense strand - methyl modification, 5 of the sense region 'Cys3 labeled at the end, 2'-fluoro (Fl) modifications on all C and U of the antisense strand, and 5 of the antisense strand' phosphate modification in the terminal It refers to a molecule that contains. 図43AおよびBは、2'−O−メチル化SEAP−2217siRNAに関する機能と修飾との関係を示す。 Figure 43A and B show a relationship between the function and the modified regarding 2'-O- methylated SEAP-2217siRNA. これらの図は、SEAP−2217のセンス鎖(図43A)およびアンチセンス鎖(図43B)の単一鎖2'−O−メチル修飾(黒棒)および対形成2'−O−メチル修飾(灰)の遺伝子サイレンシングの効果を示す。 These figures, single chain 2'-O- methyl modification (black bars) of the sense strand of SEAP-2217 (Figure 43A) and antisense strand (Figure 43B) and pairing 2'-O- methyl modification (ash ) shows the effect of gene silencing. X軸は、siRNA(5'→3')に沿った修飾の相対的位置を表す。 X-axis represents the relative position of the modified along the siRNA (5 '→ 3'). Y軸は、対照群に対する発現比を表す。 Y-axis represents the expression ratio control group. 図44Aおよび図44Bは、SEAP2217機能に対する2'−デオキシ基の付加の効果を示す。 Figure 44A and Figure 44B show the effect of the addition of 2'-deoxy groups to SEAP2217 function. 特に、2'−デオキシ基によって3つの連続的なヌクレオチド(例えば、位置1、2、および3)が修飾される。 In particular, 2'three consecutive nucleotides by deoxy group (e.g., position 1, 2, and 3) are modified. 識別番号が各基に対応づけられている(例えば、S3D−16は以下のようにデコードされる。すなわち、「S」=センス鎖修飾、「3」=連続的に修飾されるヌクレオチドの数、「 D”=2'デオキシ修飾、「16」=修飾の第1の位置 )。 Identification number is associated to each group (e.g., S3D-16 is decoded as follows. That is, "S" = sense strand modifications, "3" = the number of nucleotides that are continuously modified, "" D "= 2 'deoxy modification," 16 "= modified first position). 図44Aは、センス鎖修飾を示す。 Figure 44A shows the sense strand modifications. 図44Bは、アンチセンス鎖修飾を示す。 Figure 44B shows the antisense strand modifications. 対照群として、s iRNA なしおよび非特異的(ns)RNAを含む。 As a control group, including s iRNA without and nonspecific (ns) RNA. 図45A〜図45Fは、6種類のルシフェラーゼ特異的siRNA(luc8、18、56、58、63、および81)のアンチセンス鎖に対する、5'リン酸化を持つまたは持たない2'−O−メチル化の効果を示す Figure 45A~ Figure 45F is antisense to the sense strand, 5 '2'-O-methylated with or without the phosphorylation of six luciferase-specific siRNA (luc8,18,56,58,63, and 81) It shows the effect. S」=センス鎖。 "S" = sense strand. 「AS」=アンチセンス鎖。 "AS" = antisense strand. 「*」は、指定鎖の1および2位での2'−O−メチル化を示す。 "*" Indicates a 2'-O- methylation at positions 1 and 2 of the designated strand. 「p」は、指定された鎖の5'リン酸化を示す。 "P" indicates a 5 'phosphorylation of the specified strand. Y軸は、対照(非形質移入)細胞の発現率(%)を示す。 Y-axis indicates control (untransfected) incidence of cells (%). 「対照」=偽形質移入細胞である。 "Control" = is false transfected cells. 図46A〜Eは、本発明の一実施形態にもとづいて生産された5つのルシフェラーゼ特異的siRNA(luc8、56、58、63、81)の用量依存を表す。 FIG 46A~E represents a dose-dependent five Luciferase specific siRNA produced based on an embodiment of the present invention (luc8,56,58,63,81). 「S」=センス鎖。 "S" = sense strand. 「AS」=アンチセンス鎖。 "AS" = antisense strand. 「M」は、指定の鎖の1および2位にある2'−O−メチル化を示す。 "M" indicates a 2'-O- methylated in positions 1 and 2 of the specification of the chain. 「p」は、指定の鎖の5'リン酸化を示す。 "P" indicates the 5 'phosphorylation of the specified chain. Y軸は、対照(形質移入されていない)細胞の発現率を表す。 Y-axis represents the control (non-transfected) incidence of cells. X軸は、1=200mM、2=100nM、3=10nM、4=1nM、5=0.1nM、および6=0.01nMによる形質移入の過程でのsiRNAの濃度を表す。 X-axis represents the concentration of siRNA in 1 = 200mM, 2 = 100nM, 3 = 10nM, 4 = 1nM, 5 = 0.1nM, and 6 = 0.01 nM process of transfection with. 図47は、センスおよびアンチセンス鎖−RISC相互作用の予想反応速度と、(1)2'−O−メチル化(*)および(2)該分子の相対的機能性に対するその相互作用の感受性とを表す。 Figure 47 is a predicted rate of reaction of the sense and antisense strand -RISC interaction, (1) 2'-O-methylated (*) and (2) sensitive receiving the interaction with the molecule of the relative functional representing the sex. 高度に機能的な分子(例えば、>F90、90%を上回る機能性)では、RISCがアンチセンス鎖(K overall =100)に対して選択性が高い。 Highly functional molecules (e.g.,> functionality greater than F90,90%) at a higher selectivity for RISC antisense strand (K overall = 100). ヌクレオチド1および2位での2'−O−メチル基によるセンス鎖の修飾は、さらに、AS鎖選択に傾くが、相対的な増減率は軽度である。 2'-O- modification of the sense strand by a methyl group at nucleotide positions 1 and 2 are further tilts the AS strand selection, relative percentage changes are minor. 乏しい機能性または適度な機能性の二本鎖に由来するセンスおよびアンチセンス鎖は、RIS Cとのより良く均整のとれた平衡(K overall 約1)を示す。 Sense and antisense strands from poor functionality or moderate functional double-stranded shows better proportioned equilibrium with RIS C (K overall approximately 1). これらの場合、Sの修飾は、RISCに結合する能力を本質的に取り除き、 RISC−AS相互作用への選択性を強く傾ける In these cases, modification of the S essentially removes the ability to bind to RISC, Keru strongly tilted selectivity for RISC-AS interactions. 図48Aおよび48Bは、 cyclo 4siRNAとNS4siRNAとのあいだの競合についての研究を示す。 Figure 48A and 48B shows a study of the conflict between the cyclo 4siRNA and NS4siRNA. A−I: cyclo 4siRNAを種々の濃度で細胞に形質移入た。 A-I: Cells were transfected with cyclo 4siRNA at various concentrations. A−II: cyclo 4(種々の濃度で)とセンスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、アンチセンス鎖のCsおよびUsにある2'F1基、ならびにセンス鎖の5'末端にあるCy3基により修飾された、Cy3コンジュゲート 19bpNS4二本鎖。 A-II: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, 2'F1 groups on the Cs and Us of the antisense strand, and has been modified by Cy3 group on the 5 'end of the sense strand, Cy3 conjugated 19bpNS4 duplex. A−III: cyclo 4(種々の濃度で)とセンスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCsおよびUsに結合された2'F1基によって修飾され Cys3コンジュゲート17bpNS4二本鎖。 A-III: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, and Cys3 conjugate 17bpNS4 duplex modified by 2'F1 group coupled to the Cs and Us of the antisense strand. B−I: cyclo 4(種々の濃度で) 、19bpNS4二本鎖。 B-I: cyclo 4 and (at various concentrations), 19bpNS4 duplex. B−II: cyclo 4(種々の濃度で) 、センスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCsおよびUsにある2'F1基により修飾された19bpNS4二本鎖。 B-II: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, and 19bpNS4 duplex modified by 2'F1 groups on the Cs and Us of the antisense strand. B−III: cyclo 4(種々の濃度で) 、センスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCsおよびUsにある2'F 基により修飾された17bpNS4二本鎖。 B-III: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, and 17bpNS4 duplex modified with 2'F l groups on the Cs and Us of the antisense strand. 注:全ての形質移入を、リポフェクタミン(Liphofectamin)2000(製造元の指示)および100nMの核酸濃度を用いて実施した。 Note: All transfections were performed with Lipofectamine (Liphofectamin) 2000 (manufacturer's instructions) and nucleic acid concentration of 100 nM. データを内部GAPDHレベルを正規化した。 Data were normalized internally GAPDH levels. 図48Aおよび48Bは、 cyclo 4siRNAとNS4siRNAとのあいだの競合についての研究を示す。 Figure 48A and 48B shows a study of the conflict between the cyclo 4siRNA and NS4siRNA. A−I: cyclo 4siRNAを種々の濃度で細胞に形質移入た。 A-I: Cells were transfected with cyclo 4siRNA at various concentrations. A−II: cyclo 4(種々の濃度で)とセンスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、アンチセンス鎖のCsおよびUsにある2'F1基、ならびにセンス鎖の5'末端にあるCy3基により修飾された、Cy3コンジュゲート 19bpNS4二本鎖。 A-II: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, 2'F1 groups on the Cs and Us of the antisense strand, and has been modified by Cy3 group on the 5 'end of the sense strand, Cy3 conjugated 19bpNS4 duplex. A−III: cyclo 4(種々の濃度で)とセンスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCsおよびUsに結合された2'F1基によって修飾され Cys3コンジュゲート17bpNS4二本鎖。 A-III: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, and Cys3 conjugate 17bpNS4 duplex modified by 2'F1 group coupled to the Cs and Us of the antisense strand. B−I: cyclo 4(種々の濃度で) 、19bpNS4二本鎖。 B-I: cyclo 4 and (at various concentrations), 19bpNS4 duplex. B−II: cyclo 4(種々の濃度で) 、センスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCsおよびUsにある2'F1基により修飾された19bpNS4二本鎖。 B-II: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, and 19bpNS4 duplex modified by 2'F1 groups on the Cs and Us of the antisense strand. B−III: cyclo 4(種々の濃度で) 、センスおよびアンチセンス鎖の1および2位にある2'−O−メチル基、センス鎖のCsおよびUsにある2'−O−メチル基、ならびにアンチセンス鎖のCsおよびUsにある2'F 基により修飾された17bpNS4二本鎖。 B-III: cyclo 4 and (at various concentrations), sense and 1 and 2 of 2'-O- methyl group at the antisense strand, 2'-O- methyl group on the Cs and Us of the sense strand, and 17bpNS4 duplex modified with 2'F l groups on the Cs and Us of the antisense strand. 注:全ての形質移入を、リポフェクタミン(Liphofectamin)2000(製造元の指示)および100nMの核酸濃度を用いて実施した。 Note: All transfections were performed with Lipofectamine (Liphofectamin) 2000 (manufacturer's instructions) and nucleic acid concentration of 100 nM. データを内部GAPDHレベルを正規化した。 Data were normalized internally GAPDH levels. 図49は、GAPDHと非特異的対照#2との競合実験を示す。 Figure 49 shows a competition experiment with GAPDH and nonspecific control # 2. (1)非競合siRNAであるcyclo 14、(2)競合siRNA(非特異的配列#2)、もしくは(3)センスおよびアンチセンス鎖の両方の 1および2位で2'−O−メチル基によって標識された競合siRNAとともに、GAPDH・siRNAを、種々の濃度(0.781〜100nM)でHeLa細胞に導入した。 (1) obtain cyclo 14 is a non-competitive siRNA, by (2) competing siRNA (non-specific sequence # 2), or (3) 2'-O-methyl groups at positions 1 and 2 of both the sense and antisense strand with labeled, competing siRNA, the GAPDH · siRNA, it was introduced into HeLa cells at various concentrations (0.781~100nM).

Claims (8)

  1. siRNAであって、 A siRNA,
    (a)センス鎖と、 (A) a sense strand,
    (b)アンチセンス鎖と、 (B) and the anti-sense strand,
    (c)コンジュゲートと、 (C) conjugated,
    を含み、前記センス鎖および/またはアンチセンス鎖が少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドを含み、前記2'修飾ヌクレオチドが、2'ハロゲン修飾ヌクレオチド、2'アミン修飾ヌクレオチド、2'−O−アルキル修飾ヌクレオチド、および2'アルキル修飾ヌクレオチドからなる群から選択され、前記コンジュゲートがコレステロールである、siRNA。 Wherein the 'comprise modified nucleotides, the 2' the sense strand and / or antisense strand of at least one 2 modified nucleotides, 2 'halogen modified nucleotide, 2' amine modified nucleotide, 2'-O-alkyl modified nucleotide and 2 'is selected from the group consisting of alkyl modified nucleotide, wherein the conjugate is cholesterol, siRNA.
  2. 前記2'修飾ヌクレオチドが2'ハロゲン修飾ヌクレオチドであり、前記ハロゲンがフッ素である、請求項1に記載のsiRNA。 The 2 'modified nucleotide is 2' halogen modified nucleotide, the halogen is fluorine, siRNA of claim 1.
  3. 前記siRNAが18〜30ヌクレオチド塩基対から構成される、請求項1に記載のsiRNA。 The siRNA consists of 18-30 nucleotide base pairs, siRNA of claim 1.
  4. 前記siRNAが19ヌクレオチド塩基対から構成される、請求項1に記載のsiRNA。 The siRNA consists of 19 nucleotide base pairs, siRNA of claim 1.
  5. さらに、 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも1つが 、少なくとも1つのヌクレオチド・ユニットのオーバーハングを含む 、請求項1に記載のsiRNA。 Furthermore, the sense strand and said at least one of the antisense strand includes an overhang of at least one nucleotide unit, siRNA of claim 1.
  6. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項1に記載のsiRNA。 The sense strand and the antisense strand at least one, comprises a coupling between at least one modified nucleotide, siRNA of claim 1.
  7. 前記修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート結合とホスホロジチオエート結合とからなる群から選択される、請求項に記載のsiRNA。 The modified internucleotide linkage is selected from the group consisting of a phosphorothioate bond and phosphorodithioate bonds, siRNA of claim 6.
  8. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の少なくとも1つが、ポリリボヌクレオチドである、請求項1に記載のsiRNA。 The sense strand and the antisense strand at least one, but polyribonucleotides, siRNA of claim 1.
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