BR112020009092A2 - ácidos nucleicos para inibição da expressão de um gene alvo compreendendo ligações fosforoditioato - Google Patents

ácidos nucleicos para inibição da expressão de um gene alvo compreendendo ligações fosforoditioato Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Em particular, a invenção refere-se a produtos de ácido nucleico que interferem na expressão do gene alvo ou inibem a expressão do gene alvo e aos usos terapêuticos de tais produtos.

Description

“ÁCIDOS NUCLEICOS PARA INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE UM GENE ALVO COMPREENDENDO LIGAÇÕES DE FOSFORODITIOATO”
[0001] A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Em particular, a invenção refere-se a produtos de ácido nucleico que interferem na expressão do gene alvo ou inibem a expressão do gene alvo e aos usos terapêuticos de tais produtos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] Demonstrou-se que o RNA de fita dupla (dsRNA) capaz de ligar complementarmente o mMRNA expresso é capaz de bloquear a expressão de gene (Fire et a/, 1998 e Elbashir et a/, 2001) por um mecanismo que foi denominado interferência de RNA (RNAi). Os dsRNAs curtos direcionam o silenciamento pós- transcricional específico do gene em muitos organismos, incluindo os vertebrados, e se tornaram uma ferramenta útil para o estudo da função do gene. O RNAi é mediado pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), uma nuclease multicomponente de sequência específica que degrada os RNAs mensageiros homólogos à gatilho de silenciamento carregada no complexo RISC. O RNA interferente (denominado iRNA neste documento), tal como siRNAs, RNA antisense e micro-RNA são oligonucleotídeos que impedem a formação de proteínas por silenciamento de genes, isto é, inibem a tradução de genes da proteína através da degradação de moléculas de mMRNA. Os agentes silenciadores de genes estão se tornando cada vez mais importantes para aplicações terapêuticas na medicina.
[0003] De acordo com Watts e Corey no Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379), existem algoritmos que podem ser usados para projetar ácidos nucleicos, mas nenhum é perfeito. Podem ser necessários vários métodos experimentais para identificar siRNAs potentes, pois os algoritmos não levam em conta fatores como a estrutura terciária do ou o envolvimento de proteínas de ligação ao RNA. Portanto, a descoberta de um de ácido nucleico potente com efeitos mínimos fora do alvo é um processo complexo. Para o desenvolvimento farmacêutico dessas moléculas altamente carregadas, é necessário que elas possam ser sintetizadas de forma econômica, distribuídas nos tecidos alvo, entrar nas células e funcionar dentro dos limites aceitáveis de toxicidade.
[0004] No entanto, a transmissão de ácidos nucleicos, como o RNA, às células, evitando a degradação pelas nucleases celulares, mantendo a eficácia e a especificidade do alvo, mostrou-se um desafio para aqueles no campo do desenvolvimento de moléculas de ácido nucleico para uso terapêutico.
[0005] Assim, os meios para a transmissão eficiente de oligonucleotídeos, em particular siRNAs de fita dupla, às células in vivo estão se tornando cada vez mais importantes e requerem direcionamento específico e proteção substancial do ambiente extracelular, particularmente proteínas séricas. Um método para alcançar um direcionamento específico é conjugar uma fração de direcionamento ao agente duplex de iRNA. A fração de direcionamento ajuda a direcionar o agente duplex de iRNA para o sítio alvo necessário e é necessário projetar frações de direcionamento apropriadas para os sítios de receptores desejados para as moléculas conjugadas serem absorvidas pelas células, como por endocitose.
[0006] No entanto, os ligantes de direcionamento desenvolvidos até o momento nem sempre se traduzem em configurações in vivo e há uma clara necessidade de agentes e métodos duplex de iRNA conjugados com ligantes específicos para receptores mais eficazes para sua preparação para a transmissão in vivo de terapêuticas de oligonucleotídeos, ácidos nucléicos e SIiRNAs de fita dupla.
[0007] Em vez de um sistema de transmissão lipídica isolado, a presente invenção trata da estrutura do próprio ácido nucleico. Foi inesperadamente descoberto que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção aumentou a estabilidade, o que impede a degradação do ácido nucleico antes da entrada em uma célula.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] A presente invenção fornece um ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene alvo, em que a referida primeira e/ou segunda fita inclui uma ligação fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos. A primeira fita não pode compreender uma ligação de fosforoditioato entre qualquer um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5'.
[0009] A primeira e/ou segunda fita pode incluir uma ligação fosforoditioato entre os pelo menos dois nucleotídeos 3' terminais e/ou a segunda fita pode incluir uma ligação fosforoditioato entre os pelo menos dois nucleotídeos 5' terminais.
[0010] O ácido nucleico pode compreender uma ligação de fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita. O ácido nucleico pode compreender uma ligação de fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da segunda fita. O ácido nucleico pode compreender uma ligação de fosforotiocato ou um fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5' da segunda fita.
[0011] O ácido nucleico da invenção pode compreender também uma ligação de fosforotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três 5' nucleotídeos da segunda fita quando não há ligação fosforoditicato presente nessa extremidade.
[0012] A primeira fita e a segunda fita do ácido nucleico podem ser fitas separadas. O ácido nucleico pode compreender uma única fita que compreende a primeira fita e a segunda fita.
[0013] A primeira fita e/ou a referida segunda fita podem ter 17-35 nucleotídeos de comprimento e pelo menos uma região dúplex pode consistir em
17-25 pares de bases de nucleotídeos.
[0014] O ácido nucleico pode: a) possuir extremidades cegas nas duas extremidades; b) possuir overhang em uma extremidade e uma extremidade cega na outra; ou c) possuir overhang nas duas extremidades.
[0015] UM ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita podem ser modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da primeira fita podem ser modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que pelo menos a segunda modificação é diferente da modificação em um ou mais nucleotídeos numerados ímpares. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados pode ser adjacente a pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados.
[0016] Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares pode ser modificada no ácido nucleico da invenção. Uma pluralidade de nucleotídeos de números pares pode ser modificada por uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação diferente.
[0017] Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificado por uma modificação que é diferente da modificação nos nucleotídeos de números ímpares na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos de números pares da segunda fita pode ser modificado pela mesma modificação que os nucleotídeos ímpares da primeira fita. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados da segunda fita pode ser adjacente a um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma modificação comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos de números pares pode ser modificada pela mesma modificação que está presente nos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares pode ser modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente em relação a modificação nos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[0018] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum, que pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação nos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[0019] No ácido nucleico da invenção, cada um dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita e cada um dos nucleotídeos de números pares na segunda fita pode ser modificado com uma modificação comum e, cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita com a segunda modificação.
[0020] O ácido nucleico da invenção pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de maneira diferente da segunda fita.
[0021] A primeira fita pode compreender uma sequência da SEQ ID NO: 1 e/ou a segunda fita pode compreender uma sequência da SEQ ID NO: 2.
[0022] A modificação e/ou modificações podem cada uma e individualmente ser selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'- terminal, 2':-O-metil, uma modificação 2'-desoxi, uma modificação 2'-amino, uma modificação 2'-alquil, uma modificação morfolino, uma modificação fosforamidato, modificação do grupo 5'-fosforotioato, uma modificação 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e uma derivação de colesteril ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado podem ser qualquer um de um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo. Pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metil e/ou pelo menos uma modificação pode ser 2'-F.
[0023] O ácido nucleico da invenção pode ser conjugado com um ligante.
[0024] Um ácido nucleico da invenção pode compreender uma ligação fosforotioato entre o terminal um, dois ou três 3' nucleotídeos e/ou 5'nucleotídeos da primeira e/ou a segunda fita, além de uma ligação fosforoditioato na mesma ou em uma extremidade ou fita diferente.
[0025] A presente invenção fornece como um segundo aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene alvo, em que a referida primeira e/ou segunda fita inclui uma ligação de fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos terminais 3' e/ou a segunda fita incluem uma ligação fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos terminais 5', e em que a molécula de ácido nucleico é conjugada a um ligante.
[0026] Um ligante a ser usado na presente invenção pode, portanto, compreender (i) uma ou mais frações N-acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligador, em que o ligador conjuga as frações GalNAc a uma sequência conforme definido em quaisquer aspectos anteriores. O ligador pode ser uma estrutura ramiíificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. Os nucleotídeos podem ser modificados como definido neste documento.
[0027] O ligante pode compreender a fórmula |: [S-X1-P-X2]3-A-X?- (1) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X' representa C3-Cs alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2,0uU3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato);
X? é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)J-O-CH2-, onde n=1-6; A é uma unidade de ramificação; X? representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a X? através de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato).
[0028] Portanto, a presente invenção fornece adicionalmente um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes estruturas:
oH oH oH no ACHN: oH o oH o o
ACHN o o -
SN X T ; o s—— | oH Ó. o | oH S=—P— o" ACHN. Í o oH (o) Na o o o s É o pt : j JS ii o oH no oH
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O OH o o o 9 X 9 LON o-P-o o s o oH Ho OH OH OH o AcHN Ho o o o NHÃe A ? o=P-sº . & o=P-sº A oH
À AH o a O oH Pp o o o SO o " 2-0-P=0 $º o fm) to oH Ho oH OH OH o
ACHN Ho o ) o NHAc AA o 1 o=P—sº ó : o ts oH oH
P ACHN o E o oH P o o o q 2—-0-P-O o u sº O0—P-O jd so oH Ho oH OH OH o
ACHN Ho o o o. NHAc DA q o=P-sº o o o=P-s oH oH P ACHN. o EL o oH P o o o o o o u u 2-01=0 O-P-O sº do em que Z representa um ácido nucleico como definido anteriormente neste documento.
[0029] O ligante pode compreender: oH
H MR o IHAaC o 020 oH E . TO
SOLARIS ADSSSOS
H HAC o o o a FO Ad
H H
[0030] A invenção também fornece uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado como definido neste documento e um ou mais excipientes fisiologicamente aceitáveis. O(s) excipiente(s) pode(m) ser: i) um lipídio catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídio PEGuUilado.
[0031] O teor do componente lipídico catiônico na composição pode ser de cerca de 55% mol a cerca de 65% mol do teor lipídico geral da formulação lipídica, preferencialmente cerca de 59% mol do teor lipídico total da composição lipídica.
[0032] A composição pode compreender; um lipídio catiônico possuindo a estrutura;
TIAGO ; Lu fo AO um esteroide possuindo a estrutura; a Colesterol 1 um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina o POOO0O00O0: q IDO Es VIA AA o Õ DPhyPE e um lipídio PEGuilado possuindo a estrutura;
À AMAODÔSAOS OS O0SAO0ÔSOS, P. O oo A o s/a O O n" mPEG-2000-DMG
[0033] Também é fornecido um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio e/ou na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio.
[0034] A invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio que compreende a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer aspecto da invenção a um indivíduo em necessidade de tratamento. O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado pode ser administrado ao sujeito por via subcutânea, intravenosa ou usando quaisquer outras vias de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal.
[0035] Um método para produzir o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com a invenção também está incluído.
Descrição Detalhada da Invenção
[0036] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico que é de dupla fita e direcionado a uma transcrição de RNA expresso de um gene alvo e suas composições. Estes ácidos nucleicos podem ser utilizados no tratamento de uma variedade de doenças e distúrbios em que a expressão reduzida dos produtos dos genes alvo é desejável.
[0037] A presente invenção fornece um ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene alvo para ser inibido, e em que a referida primeira e/ou segunda fita inclui uma ligação fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos.
[0038] A primeira e/ou segunda fita pode incluir uma ligação fosforoditioato entre os pelo menos dois nucleotídeos terminais 3' e/ou a segunda fita pode incluir uma ligação fosforoditioato entre os pelo menos dois nucleotídeos terminais 5'.
[0039] Opcionalmente, a primeira fita não compreende uma ligação fosforoditioato entre qualquer um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5', em outras palavras, compreende uma ligação diferente da ligação fosforoditioato entre qualquer um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5'.
[0040] Um aspecto relacionado é um ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene alvo, em que o ácido nucleico compreende ligações de fosforoditioato entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita, em que o ácido nucleico compreende uma ligação de fosforoditioato, cada um entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' e entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 5' da segunda fita, e em que a primeira fita compreende uma ligação diferente de um fosforoditioato entre as duas, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5'. Preferencialmente, esta ligação que não seja um fosforoditivcato é um fosfato ou um fosforotioato, mais preferencialmente um fosfato (não substituído). Preferencialmente, todas as ligações entre os nucleotídeos de ambas as fitas, exceto a ligação entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita e as ligações entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' e na extremidade 5' da segunda fita, são ligações fosfato não substituídas.
[0041] Por ácido nucleico, entende-se um ácido nucleico compreendendo duas fitas compreendendo nucleotídeos, que é capaz de interferir na expressão do gene. A inibição pode ser completa ou parcial e resulta na regulação negativa da expressão do gene de maneira direcionada. O ácido nucleico compreende duas fitas polinucleotídicas separadas; a primeira fita, que também pode ser uma fita guia; e uma segunda fita, que também pode ser uma fita passageira. A primeira fita e a segunda fita podem fazer parte da mesma molécula polinucleotídica que é autocomplementar que 'dobra' para formar uma molécula de fita dupla. O ácido nucleico pode ser uma molécula de siRNA.
[0042] O ácido nucleico pode compreender ribonucleotídeos, ribonucleotídeos modificados, desoxinucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou análogos de nucleotídeos. O ácido nucleico pode compreender ainda uma porção de ácido nucleico de fita dupla ou região duplex formada por toda ou uma porção da primeira fita (também conhecida na técnica como fita guia) e toda ou uma porção da segunda fita (também conhecida na técnica como fita passageira). À região duplex é definida como começando com o primeiro par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita, inclusive.
[0043] Por região duplex, entende-se a região em dois oligonucleotídeos complementares ou substancialmente complementares que formam pares de bases um com o outro, seja por pareamento de bases de Watson-Crick ou de qualquer outra maneira que permita um duplex entre as fitas de oligonucleotíidecos que sejam complementares ou substancialmente complementares. Por exemplo, uma fita de oligonucleotídeo possuindo 21 unidades de nucleotídeo pode formar pares de bases com outro oligonucleotídeo de 21 unidades de nucleotídeo, mas apenas 19 nucleotídeos em cada fita são complementares ou substancialmente complementares, de modo que a "região duplex" consiste em 19 pares de bases. Os pares de bases restantes podem existir como overhangs 5' e 3' ou como regiões de fita simples. Além disso, não é necessário 100% de complementaridade na região duplex; a complementaridade substancial é permitida dentro de uma região duplex. A complementaridade substancial refere-se à complementaridade entre as fitas, de modo que elas sejam capazes de anelamento sob condições biológicas. Técnicas para determinar empiricamente se duas fitas são capazes de anelamento em condições biológicas são bem conhecidas na técnica. Alternativamente, duas fitas podem ser sintetizadas e adicionadas juntas em condições biológicas para determinar se elas fazem anelamento uma com a outra.
[0044] A porção da primeira fita e da segunda fita que formam pelo menos uma região duplex podem ser totalmente complementares e são pelo menos parcialmente complementares entre si.
[0045] Dependendo do comprimento de um ácido nucleico, não é necessariamente — exigida uma combinação perfeita em termos de complementaridade de bases entre a primeira fita e a segunda fita. No entanto, a primeira e segunda fitas devem ser capazes de hibridar sob condições fisiológicas.
[0046] A complementaridade entre a primeira fita e a segunda fita em pelo menos uma região duplex pode ser perfeita, de maneira não haja incompatibilidade de nucleotídeos ou nucleotídeos adicionais/deletados em nenhuma fita, Alternativamente, a complementaridade pode não ser perfeita. À complementaridade pode ser de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%.
[0047] A primeira fita e a segunda fita podem cada uma compreender uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos.
[0048] O ácido nucleico envolve a formação de uma região duplex entre toda ou uma porção da primeira fita e uma porção do ácido nucleico alvo. A porção do ácido nucleico alvo que forma uma região duplex com a primeira fita, definida como começando com o primeiro par de bases formado entre a primeira fita e a sequência alvo e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a sequência alvo, inclusive, é a sequência de ácido nucleico alvo ou simplesmente, sequência alvo. A região duplex formada entre a primeira fita e a segunda fita não precisa ser a mesma como a região duplex formada entre a primeira fita e a sequência alvo. Ou seja, a segunda fita pode ter uma sequência diferente da sequência alvo; entretanto, a primeira fita deve ser capaz de formar uma estrutura duplex tanto com a segunda fita quanto a sequência alvo.
[0049] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência alvo pode ser perfeita (sem incompatibilidade de nucleotídeos ou nucleotídeos adicionais/deletados em nenhum ácido nucleico).
[0050] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência alvo pode não ser perfeita. A complementaridade pode ser de cerca de 70% a cerca de 100%. Mais especificamente, a complementaridade pode ser pelo menos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou um valor intermediário.
[0051] A identidade entre a primeira fita e a sequência complementar da sequência alvo pode variar de cerca de 75% a cerca de 100%. Mais especificamente, a complementaridade pode ser de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou um valor intermediário, desde que um ácido nucleico seja capaz de reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo.
[0052] Um ácido nucleico com complementaridade inferior a 100% entre a primeira fita e a sequência alvo pode ser capaz de reduzir a expressão de gene alvo para o mesmo nível que um ácido nucleico com complementaridade perfeita entre a primeira fita e a sequência alvo. Como alternativa, ele pode reduzir a expressão de um gene alvo para um nível que é 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% do nível de expressão alcançado pelo ácido nucleico com perfeita complementaridade.
[0053] Em um aspecto adicional, o ácido nucleico, como descrito neste documento, pode reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula em pelo menos 10% em comparação com o nível observado na ausência de um inibidor, que pode ser o ácido nucleico. Todas as características preferenciais de qualquer um dos aspectos anteriores também se aplicam a esse aspecto. Em particular, a expressão de um gene alvo em uma célula pode ser reduzida para 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% ou menos e valores intermediários, do que aquele observado na ausência de um inibidor (que pode ser o ácido nucleico).
[0054] O ácido nucleico pode compreender uma primeira fita e uma segunda fita com 19-25 nucleotídeos de comprimento cada. A primeira fita e a segunda fita podem ter comprimentos diferentes.
[0055] O ácido nucleico pode ter 15-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-23 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 23-24 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 19-21 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 21-23 pares de nucleotídeos de comprimento.
[0056] O ácido nucleico pode compreender uma região duplex que consiste em 19-25 pares de bases nucleotídicas. A região duplex pode consistir em 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases, que podem ser contíguos.
[0057] Preferencialmente, o ácido nucleico medeia a interferência de RNA.
[0058] Em um aspecto adicional, o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, conforme descrito, pode reduzir a expressão da transcrição alvo em pelo menos 15% em comparação com a expressão observada na ausência do ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado. Todas as características preferenciais de qualquer um dos aspectos anteriores também se aplicam a esse aspecto. Particularmente, a expressão da transcrição alvo pode ser reduzida para pelo menos as seguintes % ou menos de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% ou menos e valores intermediários, além dos observados na ausência do ácido nucleico ou do ácido nucleico conjugado ou na presença de um controle sem silenciamento.
[0059] O uso de uma ligação de fosforoditioato no ácido nucleico da invenção reduz a variação da estereoquímica de uma população de moléculas de ácido nucleico, que pode ser causada por uma ligação de fosforotioato possuindo um centro quiral que é incapaz de controlar o oxigênio não ligado que é substituído por enxofre. O uso de fosforoditioato garante que não exista um centro quiral nessa ligação e, assim, reduz ou elimina qualquer variação na população de moléculas de ácido nucleico, dependendo do número de ligações de fosforoditioato e fosforotioato usadas na molécula de ácido nucleico.
[0060] Além disso, sem estar limitado pela teoria, pode ser que uma única ligação de fosforoditioato possa ser usada no lugar de duas ligações de fosforotioato, reduzindo assim o número de ligações "não naturais" no ácido nucleico da invenção.
[0061] O ácido nucleico pode compreender uma ligação de fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita. O ácido nucleico pode compreender uma ligação de fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da segunda fita. O ácido nucleico pode compreender uma ligação de fosforotioato ou um fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5' da segunda fita.
[0062] O ácido nucleico da invenção pode compreender também uma ligação de fosforotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais da segunda fita quando não há ligação fosforoditioato presente nessa extremidade.
[0063] O ácido nucleico da invenção pode compreender uma mistura de ligações de fosforoticato e fosforoditioato, exemplos dos quais são apresentados neste documento. O ácido nucleico da invenção pode compreender um fosforoditioato na extremidade 3' de cada uma da primeira fita e da segunda fita.
[0064] O ácido nucleico pode possuir extremidades cegas nas duas extremidades; possuir overhang em uma extremidade e uma extremidade cega na outra extremidade; ou possuir overhang nas duas extremidades.
[0065] Um "overhang", conforme usado neste documento, tem seu significado normal e habitual na técnica, isto é, uma porção de fita simples de um ácido nucleico que se estende além do nucleotídeo terminal de uma fita complementar em um ácido nucleico de fita dupla. O termo "extremidade cega" inclui ácido nucleico de fita dupla, no qual ambas as fitas terminam na mesma posição, independentemente do(s) nucleotídeo(s) terminal(ais) ter(em) bases pareadas ou não. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega pode ter bases pareadas. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega pode não ser pareado. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega podem ter bases pareadas. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega podem não ser pareados.
[0066] Um "fosfato não substituído", conforme usado neste documento, designa um fosfato normal, como é normalmente encontrado entre dois nucleotídeos na natureza, por exemplo em moléculas naturais de DNA ou RNA. Tal fosfato pode ser conforme designado neste documento simplesmente como "fosfato", "fosfato não substituído" ou "fosfodiéster".
[0067] O ácido nucleico pode possuir overhang em uma extremidade e uma extremidade cega na outra. O ácido nucleico pode possuir overhang nas duas extremidades. O ácido nucleico pode possuir ser cego em ambas as extremidades. O ácido nucleico pode ser cego na extremidade com a extremidade 5' da primeira fita e na extremidade 3' da segunda fita ou na extremidade 3' da primeira fita e na extremidade 5' da segunda fita.
[0068] O ácido nucleico pode compreender um overhang na extremidade 3' ou 5'. O ácido nucleico pode possuir um overhang 3'na primeira fita. O ácido nucleico pode ter um overhang 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 5' na primeira fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 5' na segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang nas extremidades 5' e 3' da primeira fita. O ácido nucleico pode ter um overhang tanto na extremidade 5' quanto na 3' da segunda fita. O ácido nucleico pode ter um overhang 5' na primeira fita e um overhang 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter um overhang 3' na primeira fita e um overhang 5' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter um overhang 3' na primeira fita e um overhang 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter um overhang 5' na primeira fita e um overhang 5' na segunda fita.
[0069] Um overhang na extremidade 3' ou na extremidade 5' da segunda fita ou da primeira fita podem ser selecionados a partir dos nucleotídeos 1,2,3,4 e 5 em comprimento. Opcionalmente, um overhang pode consistir de 1 ou 2 nucleotídeos, que podem ou não ser modificados.
[0070] Polinucleotídeos não modificados, particularmente ribonucleotídeos, podem ser propensos à degradação por nucleases celulares e, como tal, modificações/nucleotídeos modificados podem ser incluídos no ácido nucleico da invenção. Tais modificações podem ajudar a estabilizar o ácido nucleico, tornando-o mais resistente às nucleases. Esta resistência melhorada permite que os ácidos nucleicos sejam ativos na mediação da interferência de RNA por períodos mais longos e é especialmente desejável se os ácidos nucleicos forem ser utilizados para tratamento.
[0071] Um ou mais nucleotídeos na segunda e/ou primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados.
[0072] As modificações do ácido nucleico da presente invenção geralmente fornecem uma ferramenta poderosa para superar possíveis limitações, incluindo, mas não se limitando a, estabilidade e biodisponibilidade in vitro e in vivo inerentes às moléculas de RNA nativas. O ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser modificado por modificações químicas. O ácido nucleico modificado também pode minimizar a possibilidade de induzir atividade de interferon em humanos. A modificação pode aprimorar ainda mais a transmissão funcional de um ácido nucleico a uma célula alvo. O ácido nucleico modificado da presente invenção pode compreender um ou mais ribonucleotídeos quimicamente modificados de uma ou ambas da primeira fita ou da segunda fita. Um ribonucleotídeo pode compreender uma modificação química das frações de base, açúcar ou fosfato. O ácido ribonucleico pode ser modificado por substituição ou inserção com análogos de ácidos nucleicos ou bases.
[0073] Um ou mais nucleotídeos de um ácido nucleico da presente invenção podem ser modificados. O ácido nucleico pode compreender pelo menos um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo modificado pode estar na primeira fita. O nucleotídeo modificado pode estar na segunda fita. O nucleotídeo modificado pode estar na região duplex. O nucleotídeo modificado pode estar fora da região duplex, isto é, em uma região de fita simples. O nucleotídeo modificado pode estar na primeira fita e pode estar fora da região duplex. O nucleotídeo modificado pode estar na segunda fita e pode estar fora da região duplex. O nucleotídeo 3' terminal da primeira fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 3' terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 5' terminal da primeira fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 5' terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado.
[0074] UM ácido nucleico da invenção pode ter 1 nucleotídeo modificado ou um ácido nucleico da invenção pode ter cerca de 2-4 nucleotídeos modificados, ou um ácido nucleico pode ter cerca de 4-6 nucleotídeos modificados, cerca de 6-8 nucleotídeos modificados, cerca de 8-10 nucleotídeos modificados, cerca de 10-12 nucleotídeos modificados, cerca de 12-14 nucleotídeos modificados, cerca de 14-16 nucleotídeos modificados cerca de 16- 18 nucleotídeos modificados, cerca de 18-20 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 22-24 nucleotídeos modificados, 24-26 nucleotídeos modificados ou cerca de 26-28 nucleotídeos modificados. Em cada caso, o ácido nucleico compreendendo os referidos nucleotídeos modificados retém pelo menos 50% de sua atividade em comparação ao mesmo ácido nucleico, mas sem os referidos nucleotídeos modificados. O ácido nucleico pode reter 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% ou um valor intermediário de sua atividade em comparação com o mesmo ácido nucleico, mas sem os referidos nucleotídeos modificados ou podem ter mais de 100% da atividade do mesmo nucleotídeo sem os referidos nucleotídeos modificados.
[0075] O nucleotídeo modificado pode ser uma purina ou uma pirimidina. Pelo menos metade das purinas pode ser modificada. Pelo menos metade das pirimidinas pode ser modificada. Todas as purinas podem ser modificadas. Todas as pirimidinas podem ser modificadas. Os nucleotídeos modificados podem ser selecionados do grupo que consiste em um nucleotídeo de desoxitimina (dT) 3'-terminal, um nucleotídeo modificado em 2'-O-metil, um nucleotídeo modificado em 2', um nucleotídeo modificado em 2'-desoxi, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo modificado em
2'-amino, um nucleotídeo modificado em 2'-alquil, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, uma base não natural compreendendo nucleotídeo, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5' fosforoticato, um nucleotídeo compreendendo um 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesteril ou a um grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico.
[0076]O ácido nucleico pode compreender um nucleotídeo compreendendo um nucleotídeo modificado, em que a base é selecionada de 2- aminoadenosina, 2,6-diaminopurina, inosina, piridin4-ona, piridin-2-ona, fenil, pseudouracil, 2, 4, 6-trimetoxi benzeno, 3-metil uracil, di-hidrouridina, naftil, aminofenil, 5-alquilcitidina (por exemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridina (por exemplo, ribotimidina), S5-halouridina (por exemplo, 5-bromouridina), 6- azapirimidina, 6-alquilpirimidina (por exemplo, 6-metiluridina), propino, quesosina, 2-tiouridina, — 4-tiouridina, vibutosina, — vibutoxosina, 4-acetilcitidina, 5- (carboxihidroximetil)uridina, B'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluridina, beta-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1- metilinosina, — 2,2-dimetilguanosina, — 3-metilcitidina, — 2-metiladenosina, — 2- metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2- tiouridina, 5 -metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, beta-D-manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético e 2-tiocitidina. A base pode ser 2,6-diaminopurina ribosídeo, piridin-4-ona ribosídeo, piridin-2-ona ribosídeo, fenil ribosídeo, 2,4,6- trimetoxi benzeno ribosídeo, aminofenil ribosídeo, 6-azapirimidina ribosídeo, propino ribosídeo.
[0077] Os ácidos nucleicos discutidos neste documento incluem RNA não modificado, bem como RNA que foi modificado, por exemplo, para melhorar a eficácia, e polímeros de substituintes de nucleosídeos. O RNA não modificado refere-se a uma molécula em que os componentes do ácido nucleico, quais sejam: açúcares, bases e frações de fosfato, são iguais ou essencialmente iguais aos que ocorrem na natureza, por exemplo, como ocorrem naturalmente no corpo humano. O nucleotídeo modificado, como usado neste documento, refere-se a um nucleotídeo no qual um ou mais dos componentes dos nucleotídeos, quais sejam açúcares, bases e frações fosfato, são diferentes daqueles que ocorrem na natureza. Embora sejam chamados de nucleotídeos modificados, é claro que, devido à modificação, incluem moléculas que não são nucleotídeos, por exemplo, uma molécula polinucleotídica na qual a estrutura principal do ribofosfato é substituída por uma construção não ribofosfática que permite a hibridação entre fitas, isto é, os nucleotídeos modificados imitam a estrutura principal do ribofosfato.
[0078] Muitas das modificações descritas abaixo que ocorrem dentro de um ácido nucleico serão repetidas dentro de uma molécula polinucleotídica, como uma modificação de uma base, ou uma fração de fosfato, ou um O não ligado de uma fração de fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições/nucleotídeos possíveis no polinucleotídeo, mas em muitos casos não ocorrerá, Uma modificação pode ocorrer apenas na posição terminal 3' ou 5', somente nas regiões terminais, como em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região de fita dupla, em uma região de fita simples ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de fita dupla de um ácido nucleico da invenção ou pode ocorrer apenas em uma região de fita simples de um ácido nucleico da invenção. Uma modificação de fosforotioato em uma posição O não ligada pode ocorrer apenas em um ou em ambos os terminais, pode ocorrer apenas em uma região do terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões duplex e/ou de fita simples, particularmente nos terminais. As extremidades 5' ou 3' podem ser fosforiladas.
[0079] A estabilidade de um ácido nucleico da invenção pode ser aumentada pela inclusão de bases específicas em overhangs, ou pela inclusão de nucleotídeos modificados, em overhangs de fita simples, por exemplo, em um overhang de 5' ou 3', ou em ambos. Os nucleotídeos de purina podem ser incluídos em overhangs. Todas ou algumas das bases em um overhang 3' ou 5' podem ser modificadas. As modificações podem incluir o uso de modificações no grupo 2' OH do açúcar ribose, o uso de desoxirribonucleotídeos, em vez de ribonucleotídeos, e modificações no grupo fosfato, como modificações de fosforotioato. Overhangs não precisam ser homólogos com a sequência alvo.
[0080] Os overhangs 5' ou 3' - na fita sense, fita antisense ou ambas as fitas do agente dsRNA da invenção podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, o overhang contém dois nucleotídeos que possuem um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, em que os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Numa modalidade, o overhang está presente na extremidade 3' da fita sense, fita antisense ou ambas Numa concretização, este overhang 3' está presente na fita antisense. Numa modalidade, esse overhang 3' está presente na fita sense.
[0081] Nucleases podem hidrolisar ligações fosfodiéster de ácido nucleico. No entanto, modificações químicas nos ácidos nucleicos podem conferir propriedades melhoradas e, podem tornar os oligoribonucleotídeos mais estáveis às nucleases.
[0082] Os ácidos nucleicos modificados, conforme usados neste documento, podem incluir um ou mais de: (i) alteração, por exemplo, substituição, de um ou de ambos os oxigênios de fosfato não ligados e/ou de um ou mais dos oxígenos de fosfato de ligação (chamados de ligação mesmo que estejam no terminal 5' e 3' do ácido nucleico da invenção); (ii) alteração, por exemplo, substituição, de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da hidroxila 2' no açúcar ribose; (iii) substituição da fração fosfato por ligadores peptídicos "defosfo"; (iv) modificação ou substituição de uma base de ocorrência natural; (v) substituição ou modificação da estrutura principal da ribose-fosfato; (vi) modificação da extremidade 3' ou da extremidade 5' do RNA, por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma fração, por exemplo, uma fração marcada com fluorescência, para a extremidade 3' ou 5' do RNA.
[0083] Os termos substituição, modificação, alteração indicam uma diferença em relação a uma molécula que ocorre naturalmente.
[0084] Modificações específicas são discutidas em mais detalhes abaixo.
[0085] Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotioato, fosforosselenatos, fosfatos de borano, ésteres de borano fosfato, fosfonatos de hidrogênio, fosforamidatos, fosfonatos de alquil ou aril e fosfotriésteres. Os fosforoditioatos têm ambos os oxigênios não ligados substituídos pelo enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênios não ligados no grupo fosfato pode ser independentemente qualquer um de S, Se, B, C, H, N ou OR (R é alquil ou aril).
[0086] O ligador de fosfato também pode ser modificado pela substituição de um oxigênio de ligação por nitrogênio (fosforamamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metilenofosfonatos em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. É possível substituir os oxigênios não ligados por nitrogênio.
[0087] Um nucleotídeo modificado pode incluir modificação dos grupos de açúcar. O grupo hidroxila 2' (OH) pode ser modificado ou substituído por vários substituintes "oxi" ou "desoxi" diferentes.
[0088] Exemplos de modificações do grupo hidroxila "oxi" -2' incluem alcoxi ou ariloxi (OR, por exemplo, R=H, alquil, cicloalquil, aril, aralquil, heteroaril ou açúcar); polietilenoglicóis (PEG), O(CH2CH20)nCH2CH2O0R; ácidos nucléicos "bloqueados" (LNA) nos quais o hidroxila 2' está conectado, por exemplo, por uma ponte de metileno, ao carbono 4' do mesmo açúcar ribose; O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diarilamina, heteroarilamino ou diheteroaril amino, etileno diamina, poliamino) e aminoalcoxi, O(CH2)nAMINA, (por exemplo, AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamina, heterociclil, arilamino, diarilamino, heteroarilamino ou di-heteroaril amino, etileno diamina, poliamino).
[0089] As modificações "desoxi" incluem hidrogênio halo; amino (por exemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, diheteroaril amino ou aminoácido); NH (CH2CH2NH) nocH2CH2- AMINA (AMINA = NH32; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino ou diheteroaril amino) —NHC (O) R (R = alquil, cicloalquil, aril, aralquil, heteroaril ou açúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquil; tioalcoxi; e alquil, cicloalquil, aril, alquenil e alquinil, que podem ser opcionalmente substituídos com, por exemplo, uma funcionalidade amino. Outros substituintes de certas modalidades incluem 2'-metoxietil, 2-O0CH3, 2'-O-alil, 2'-C-alil e 2'-fluoro.
[0090] O grupo açúcar também pode conter um ou mais átomos de carbono que possuem a configuração estereoquímica oposta à do carbono correspondente na ribose. Assim, um nucleotídeo modificado pode conter um açúcar como a arabinose.
[0091] Os nucleotídeos modificados também podem incluir açúcares "abásicos", que não possuem uma nucleobase em C-1'. Estes açúcares abásicos podem conter ainda modificações em um ou mais átomos de açúcar constituintes.
[0092] As modificações 2' podem ser usadas em combinação com uma ou mais modificações do ligante de fosfato (por exemplo, fosforotioato).
[0093] Os grupos fosfato podem ser substituídos individualmente por conectores que não contenham fósforo.
[0094] Exemplos de frações que podem substituir o grupo fosfato incluem siloxano, carbonato, carboximetil, carbamato, amida, tioéter, ligante de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formalcetal, oxima, metilenoimino, metilenometilimino, metileno-hidrazo, metilenodimetil-hidrazo e metileno-oximetilimino. Em certas modalidades, as substituições podem incluir os grupos metileno-carbonilamino e metileno-metilimino.
[0095] O ligante de fosfato e o açúcar ribose podem ser substituídos por nucleotídeos resistentes à nuclease.
[0096] Exemplos incluem os substitutos de nucleosídeo de morfolino,
ciclobutil, pirrolidina e ácido nucleico peptídico (PNA). Em certas modalidades, substitutos de PNA podem ser usados.
[0097] As extremidades 3' e 5' de um oligonucleotídeo podem ser modificadas. Tais modificações podem ocorrer na extremidade 3' ou na extremidade 5' ou em ambas as extremidades da molécula. Eles podem incluir modificação ou substituição de um fosfato terminal inteiro ou de um ou mais átomos do grupo fosfato. Por exemplo, as extremidades 3' e 5' de um oligonucleotídeo podem ser conjugadas a outras entidades moleculares funcionais, como frações de marcação, por exemplo, fluoróforos (por exemplo, pireno, TAMRA, fluoresceína, corantes Cy3 ou Cy5) ou grupos de proteção (com base em, por exemplo, enxofre, silício, boro ou éster). As entidades moleculares funcionais podem ser ligadas ao açúcar através de um grupo fosfato e/ou de um ligante peptídico. O átomo terminal do ligante peptídico pode conectar ou substituir o átomo de ligação do grupo fosfato ou do grupo C-3' ou C-5' O, N, S ou C do açúcar. Alternativamente, o ligante peptídico pode se conectar ou substituir o átomo terminal de um substituto de nucleotídeo (por exemplo, PNAs). Esses espaçadores ou ligantes podem incluir, por exemplo, —(CH2)J—, —(CH2))N—, — (CH2)/O—, HCH2))/S—, —O(CH2CH20)h/CH2CH20— (por exemplo, n = 3 ou 6), açúcares básicos, amida, carboxi, amina, oxiamina, oximina, tioéter, dissulfeto, tioureia, sulfonamida ou morfolino, ou reagentes de biotina e fluoresceína. À extremidade 3' pode ser um grupo —OH.
[0098] Outros exemplos de modificações de terminal incluem corantes, agentes intercalantes (por exemplo, acridinas), reticuladores (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPCA, texafirina, safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, diidrofenazina), endonucleases artificiais, EDTA, carreadores lipofílicos, por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-Bis- O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxi-hexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecil, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3- (oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritll ou fenoxazina e conjugados de peptídeos (por exemplo, peptídeo antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquil, alquil substituído, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agregados de imidazol, conjugados acridina-imidazo|, complexos Eu3+ de tetraazamacrociclos).
[0099] Modificações de terminal podem ser adicionadas por vários motivos, inclusive para modular a atividade ou para modular a resistência à degradação. Modificações de terminal úteis para modular a atividade incluem modificação da extremidade 5' com fosfato ou análogos de fosfato. Os ácidos nucleicos da invenção, na primeira ou na segunda fita, podem ser fosforilados em 5' ou incluir um análogo de fosforil no terminal 5'. As modificações de 5'-fosfato incluem aquelas que são compatíveis com o silenciamento de genes mediado por RISC. Modificações adequadas incluem: 5'-monofosfato ((HO)2(O0)P—O-5S'); 5"- difosfato — ((HO)2(O)P—O—P(HO)(0)—O-5'); B5"trifosfato — ((HO)2(0)P—O— (HO)(O)P—O—P(HO)(0)—O-5'); cap de 5"-guanosina (7-metilada ou não- metilada) (7mM-G-0-5'-(HO)(O)P—O—(HO)(O0)P—O—P(HO)(0)—O-5'); cap de 5"- adenosina (Appp) e qualquer estrutura de cap de nucleotídeo modificada ou não modificada (N—O-5'-(HO)(O0)P—O—(HO)(O0)P—O—P(HO)(0)—O-5'); 5- monotiofosfato (fosforotioato; (HO)(S)P—O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditivoato; — (HO)(HS)(S)P—O-5'), — 5'-fosforotiolato — ((HO)2(O)P—S-5'); qualquer combinação adicional de monofosfato, difosfato e trifosfatos substituídos por oxigênio/enxofre (por exemplo, 5'-alfa-tiotrifosfato, 5'-gama-tiotrifosfato, etc.), 5"'-fosforamidatos ((HO)2(O0)P—NH- 5', (HO)(NH2)(O0)P—O-S5'), 5'-alquilfosfonatos (R = alquil = metil, etil, isopropil, propil, etc., por exemplo, RP(OH)(0)—O-5"-, (OH)2(O0)P-5"-CH2-), 5'vinilfosfonato, 5'-alquiléterfosfonatos (R = alquiléter = metoximetil (MeOCH>2-), etoximetil, etc., por exemplo, RP(OH)(0)—O-5"-).
[0100] O ácido nucleico da presente invenção pode incluir uma ou mais modificações de fosforotiocato em uma ou mais das extremidades terminais da primeira e/ou da segunda fita. Opcionalmente, cada uma ou uma das extremidades da primeira fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforotioato. Opcionalmente, cada ou qualquer uma das extremidades da segunda fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforotioato. Opcionalmente, ambas as extremidades da primeira fita e a extremidade 5' da segunda fita podem compreender dois nucleotídeos modificados com fosforotioato. Por nucleotídeo modificado com fosforotioato, entende-se que a ligação entre o nucleotídeo e o nucleotídeo adjacente compreende um grupo fosforotioato em vez de um grupo fosfato padrão.
[0101] Modificações de terminal também podem ser úteis para monitorar a distribuição e, nesses casos, os grupos a serem adicionados podem incluir fluoróforos, por exemplo, fluoresceína ou corante Alexa. Modificações de terminal também podem ser úteis para melhorar a absorção, modificações úteis para isso incluem colesterol. Modificações de terminal também podem ser úteis para reticular um agente de RNA a outra fração.
[0102] Adenina, guanina, citosina e uracil são as bases mais comuns encontradas no RNA. Essas bases podem ser modificadas ou substituídas para fornecer RNAs com propriedades melhoradas. Por exemplo, os oligoribonucleotídeos resistentes à nuclease podem ser preparados com essas bases ou com nucleobases sintéticas e naturais (por exemplo, inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina ou tubercidina) e qualquer uma das modificações acima. Alternativamente, análogos substituídos ou modificados de qualquer uma das bases acima e "bases universais" podem ser empregados. Exemplos incluem 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 5-halouracil e citosina, 5-propinil uracil e citosina, 6-azo uracil, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 5-halouracil, 5-(2-aminopropil)uracil, 5-amino alil uracil, 8-halo, amino, tiol, tioalquil, hidroxila e outras adeninas e guaninas substituídas em 8, 5-trifluorometil e outros uracilas e citosinas substituídos em 5, 7-
metilguanina, pirimidinas substituídas em 5, 6-azapirimidinas e purinas substituídas em N-2, N-6 e O-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil e B-propinilcitosina, di-hidrouracil, 3-deseaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5- alquiluracil, 7-alguilguanina, 5-alguil citosinay 7-deseazaadeninay N6, N6- dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracil, N3-metiluracil, 1,2 4-triazóis substituídos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 5-metoxiuracil, ácido uracil-5- oxiacético, 5-metoxicarbonilmetiluracil, 5-metil-2-tiouracil, 5-metoxicarbonilmetil-2- tiouracil, — 5-metilaminometil-2-tiouracil, — 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracil, — 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N4-acetil citosina, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6- isopentiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N-metilguaninas ou bases O- alquiladas.
[0103] Conforme usado neste documento, os termos "análogo de nucleotídeo não pareante" significa um análogo de nucleotídeo que inclui uma fração pareante de não base, incluindo, mas não se limitando a: 6 de amino adenosina (Nebularine), 4-Me-indole, 3-nitropirrol, 5 -nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC, N3- Me dC. Em algumas modalidades, o análogo de nucleotídeo pareante de não base é um ribonucleotídeo. Em outras modalidades, ele é um desoxirribonucleotídeo.
[0104] Como usado neste documento, o termo "grupo funcional terminal" inclui, sem limitação, grupos halogênio, álcool, amina, carboxílico, éster, amida, aldeído, cetona, éter.
[0105] Certas frações podem ser ligadas ao terminal 5' da primeira fita ou da segunda fita e incluem fração de ribose abásica e de desoxirribose abásica, frações de ribose abásica e de desoxirribose abásica modificadas, incluindo modificações 2' O alquil; frações de ribose abásica e desoxirribose abásica invertidas e suas modificações; C6-imino-Pi; um nucleotídeo espelho incluindo L- DNA e L-RNA; nucleotídeo 5'O-Me; e análogos de nucleotídeo incluindo nucleotídeo de 4',5'-metileno; 1-(B-D-eritrofuranosil)nucleotídeo; nucleotídeo de 4'- tio, nucleotídeo carbocíclico; 5'-amino-alquil fosfato; 1,3-diamino-2-propil fosfato,
3-aminopropil fosfato; 6-aminohexil fosfato; 12-aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato; nucleotídeo de 1,5-anidrohexitol; alfa-nucleotídeo; nucleotídeo de treo- pentofuranosil; nucleotídeo 3',4'-seco acíclico; nucleotídeo de 3,4-dihidroxibutil; nucleotídeo de 3,5-dihidroxipentil, fração abásica 5'-5' invertida; 1,4-butanodiol fosfato; 5'-amino; e frações de metilfosfonato e de 5'-mercapto com ou sem ponte.
[0106] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser incluídos como um ou mais nucleotídeos invertidos, por exemplo timidina invertida ou adenina invertida (por exemplo, ver Takei, et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06).
[0107] Como usado neste documento, o termo "inibir", "regular negativamente" ou "reduzir" com relação à expressão do gene significa a expressão do gene ou nível de moléculas de RNA ou moléculas de RNA equivalentes que codificam uma ou mais proteínas ou subunidades de proteínas (por exemplo, mRNA), ou a atividade de uma ou mais proteínas ou subunidades de proteínas ou peptídeos é reduzida abaixo da observada na ausência de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção ou em referência a uma molécula de siRNA sem homologia conhecida para transcrições de humanos (denominada controle sem silenciamento neste documento). Esse controle pode ser conjugado e modificado de maneira análoga à molécula da invenção e transmitido na célula alvo pela mesma via; por exemplo, a expressão pode ser reduzida para 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% ou menos do que o observado na ausência de um inibidor (que pode ser o ácido nucleico) ou na presença de um controle não silenciador (que pode ser um ácido nucleico que não é complementar à sequência alvo).
[0108] O ácido nucleico da presente invenção pode compreender um nucleotídeo abásico. O termo "abásico", como usado neste documento, refere-se a frações que não possuem uma base ou que possuem outros grupos químicos no lugar de uma base na posição 1', por exemplo, um derivado de ribose desoxiabásica ligado a 3',3'ou ligado a 5',5'.
[0109] O ácido nucleico pode compreender um ou mais nucleotídeos na segunda e/ou primeira fita que são modificados. Nucleotídeos alternados podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados.
[0110] Alternar, como descrito neste documento, significa ocorrer um após o outro de maneira regular. Em outras palavras, alternar significa ocorrer seguida e repetidamente. Por exemplo, se um nucleotídeo é modificado, o próximo nucleotídeo contíguo não é modificado e o nucleotídeo contíguo seguinte é modificado e assim por diante. Um nucleotídeo pode ser modificado com uma primeira modificação, o próximo nucleotídeo contíguo pode ser modificado com uma segunda modificação e o nucleotídeo contíguo seguinte é modificado com a primeira modificação e assim por diante, em que a primeira e a segunda modificações são diferentes.
[0111] Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados em que a primeira fita é numerada 5' a 3', com o nucleotídeo mais próximo de 5' sendo o nucleotídeo número 1 da primeira fita. O termo "número ímpar", conforme descrito neste documento, significa um número não divisível por dois. Exemplos de números ímpares são 1, 3, 5, 7, 9, 11 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados, em que a primeira fita é numerada de 5' a 3'. O termo "número par", como descrito neste documento, significa um número que é divisível de forma exata por dois. Exemplos de números pares são 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da segunda fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados em que a segunda fita é numerada de 3' a 5', com o nucleotídeo mais próximo de 3' sendo o nucleotídeo número 1 da segunda fita. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da segunda fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados, em que a segunda fita é numerada de 3' a 5'.
[0112] UmM ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita podem ser modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da primeira fita podem ser modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que pelo menos a segunda modificação é diferente da modificação nos um ou mais nucleotídeos ímpares. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados pode ser adjacente a pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados.
[0113] Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares na primeira fita pode ser modificada no ácido nucleico da invenção. Uma pluralidade de nucleotídeos de números pares da primeira fita pode ser modificada por uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação diferente.
[0114] Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificado por uma modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos de números pares da segunda fita pode ser modificada pela mesma modificação que os nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados da segunda fita pode ser adjacente a um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma modificação comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos de números pares pode ser modificada pela mesma modificação que está presente nos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[0115] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum, que pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[0116] No ácido nucleico da invenção, cada um dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita e cada um dos nucleotídeos de números pares na segunda fita pode ser modificado com uma modificação comum e, cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita com a segunda modificação.
[0117] O ácido nucleico da invenção pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de maneira diferente da segunda fita.
[0118] Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita por uma modificação comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita por uma modificação comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação.
[0119] O ácido nucleico da invenção pode compreender construtos de fita simples ou dupla que compreendem pelo menos duas regiões de modificações alternadas em uma ou em ambas as fitas. Estas regiões alternadas podem compreender até cerca de 12 nucleotídeos, mas preferencialmente compreendem de cerca de 3 até cerca de 10 nucleotídeos. As regiões de nucleotídeos alternados podem estar localizadas nos terminais de uma ou de ambas as fitas do ácido nucleico da invenção. O ácido nucleico pode compreender de 4 a cerca de 10 nucleotídeos de nucleotídeos alternados em cada terminal (3' e 5') e essas regiões podem ser separadas por cerca de 5 a cerca de 12 nucleotídeos contíguos não modificados ou modificados de forma diferente ou comum.
[0120] Os nucleotídeos de números ímpares da primeira fita podem ser modificados e os nucleotídeos de números pares podem ser modificados com uma segunda modificação. A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum, que pode ser a mesma modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Um ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes um ao outro e a nucleotídeos com uma modificação que é a mesma que a modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. A primeira fita também pode compreender ligações de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 3' e na extremidade 5'. A segunda fita pode compreender uma ligação de fosforoticato entre os dois nucleotídeos na extremidade 5'. A segunda fita também pode ser conjugada a um ligante na extremidade 5'.
[0121] O ácido nucleico da invenção pode compreender uma primeira fita compreendendo nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum. Um ou mais desses nucleotídeos podem ser adjacentes a um ou mais nucleotídeos que podem ser modificados com uma segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes. A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum, que pode ser a mesma que uma das modificações de um ou mais dos nucleotídeos da primeira fita. Un ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes. A primeira fita também pode compreender ligações de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 5' e na extremidade 3'. A segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 3'. A segunda fita também pode ser conjugada a um ligante na extremidade 5".
[0122] Os nucleotídeos numerados (de 5' a 3' na primeira fita e 3 a 5' na segunda fita), 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na segunda fita. Os nucleotídeos são numerados de acordo com o ácido nucleico da presente invenção de 5' a 3' na primeira fita e 3' a 5' na segunda fita.
[0123] Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na segunda fita.
[0124] Claramente, se a primeira e/ou a segunda fita tiverem menos de nucleotídeos de comprimento, como 19 nucleotídeos de comprimento, não haverá nucleotídeos numerados 20, 21, 22, 23, 24 e 25 a serem modificados. Uma pessoa versada na técnica entende a descrição acima para aplicar a fitas mais curtas, conforme o caso.
[0125] Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser pareados a nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação comum. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser pareados a nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação diferente. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser pareados a nucleotídeos não modificados na segunda fita. Um ou mais nucleotídeos modificados na segunda fita podem ser pareados a nucleotídeos não modificados na primeira fita. Em outras palavras, os nucleotídeos alternados podem ser alinhados nas duas fitas, como, por exemplo, todas as modificações nas regiões alternadas da segunda fita são pareadas a modificações idênticas na primeira fita ou, alternativamente, as modificações podem ser deslocadas por um nucleotídeo com as modificações comuns nas regiões alternadas de uma fita pareando a modificações diferentes (ou seja, uma segunda ou mais modificações) na outra fita. Outra opção é ter modificações diferentes em cada uma das fitas.
[0126] As modificações na primeira fita podem ser deslocadas por um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos modificados na segunda fita, de modo que os nucleotídeos modificados comuns não estejam emparelhados um com o outro.
[0127] A modificação e/ou modificações podem cada uma e individualmente ser selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'- terminal, 2':-O-metil, uma modificação 2'-desoxi, uma modificação 2'-amino, uma modificação 2'-alquil, uma modificação morfolino, uma modificação fosforamidato, modificação do grupo 5'-fosforotioato, uma modificação 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e uma derivação de colesteril ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado podem ser qualquer um de um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo.
[0128] Pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metil e/ou pelo menos uma modificação pode ser 2'-F. Modificações adicionais, como as descritas neste documento, podem estar presentes na primeira e/ou na segunda fita.
[0129] O ácido nucleico da invenção pode compreender um nucleotídeo de RNA invertido em uma ou várias das extremidades da fita. Estes nucleotídeos — invertidos — fornecem — estabilidade ao ácido —nucleico. Preferencialmente, o ácido nucleico compreende pelo menos um nucleotídeo invertido em uma ou várias das extremidades 3' de pelo menos uma das fitas e/ou na extremidade 5' da segunda fita. Mais preferencialmente, o ácido nucleico compreende um nucleotídeo invertido na extremidade 3' da segunda fita. Mais preferencialmente, o ácido nucleico compreende um nucleotídeo de RNA invertido na extremidade 3' da segunda fita e este nucleotídeo é preferencialmente um À invertido. O nucleotídeo invertido preferencialmente está presente em uma extremidade de uma fita não como overhang, mas oposto a um nucleotídeo correspondente na outra fita. Um ácido nucleico com essa modificação é estável e fácil de sintetizar.
[0130] Ao longo da descrição da invenção, "modificação igual ou comum" significa a mesma modificação em qualquer nucleotídeo, seja A, G, C ou U modificado com um grupo como um grupo metil ou um grupo fluoro. Não significa a mesma adição no mesmo nucleotídeo. Por exemplo, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2/F-dG são todos considerados a mesma modificação ou modificação comum, assim como 2'-OMe-rU, 2-OMe -rA; 2-OMe-rC; 2-OMe-rG. Uma modificação 2'F é uma modificação diferente de uma modificação 2'OMe.
[0131] Algumas — sequências de ácidos nucleicos modificados representativas da presente invenção são mostradas nos exemplos. Esses exemplos têm a intenção de ser representativos e não limitativos.
[0132] Preferencialmente, o ácido nucleico pode compreender uma modificação e a segunda ou mais modificações, que são cada uma e individualmente selecionadas do grupo que compreende a modificação 2'-O-metil e modificação 2'-F. O ácido nucleico pode compreender uma modificação que é 2'-O-metil (2OMe) que pode ser uma primeira modificação e uma segunda modificação que é 2'-F. O ácido nucleico da invenção também pode incluir uma modificação de fosforotioato e/ou uma modificação desoxi que pode estar presente nos ou entre os 1, 2 ou 3 nucleotídeos terminais de cada uma ou quaisquer das extremidades de cada uma ou de ambas as fitas.
[0133] O ácido nucleico da invenção pode ser conjugado a um ligante, para formar um conjugado.
[0134] Alguns ligantes podem ter propriedades endossomolíticas. Os ligantes endossomolíticos promovem a lise do endossoma e/ou transporte da composição da invenção, ou de seus componentes, do endossoma ao citoplasma da célula. O ligante endossomolítico pode ser um peptídeo polianiônico ou peptidomimético que mostra atividade de membrana dependente de pH e fusogenicidade. O componente endossomolítico pode conter um grupo químico que sofre uma alteração na carga ou protonação em resposta a uma alteração no pH. O componente endossomolítico pode ser linear ou ramificado.
[0135] Os ligantes podem incluir modificadores terapêuticos, por exemplo, para aumentar a captação; compostos de diagnóstico ou grupos repórteres, por exemplo, para monitorar a distribuição; agentes de reticulação; e frações que conferem resistência à nuclease. Exemplos gerais incluem lipídios, esteroides, vitaminas, açúcares, proteínas, peptídeos, poliaminas e imitações de peptídeos. Os ligantes podem incluir uma substância que ocorre naturalmente, como proteínas, carboidratos ou lipídios. O ligante pode ser uma molécula recombinante ou sintética.
[0136] Os ligantes também podem incluir grupos de direcionamento, por exemplo, um agente de direcionamento de célula ou tecido. O ligante alvo pode ser uma lectina, glicoproteína, lipídio ou proteína.
[0137] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercalantes, reticuladores, porfirinas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, endonucleases artifiias ou um quelante, moléculas lipofílicas, agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG, MPEG, alquil, alquil substituído, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos, facilitadores de transporte/absorção, ribonucleases sintéticas ou aglomerados de imidazol.
[0138] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo glicoproteínas ou peptídeos. Os ligantes também podem ser hormônios ou receptores hormonais. Eles também podem incluir espécies não peptídicas, como lipídios, lectinas, carboidratos, vitaminas ou cofatores.
[0139] O ligante pode ser uma substância como um medicamento que pode aumentar a captação do ácido nucleico em uma célula, por exemplo, interrompendo o citoesqueleto da célula.
[0140] O ligante pode aumentar a captação do ácido nucleico na célula ativando uma resposta inflamatória. Esses ligantes incluem fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), interleucina-1 beta ou interferon gama.
[0141] O ligante pode ser uma molécula lipídica ou à base de lipídios. À molécula lipídica ou à base de lipídios liga-se preferencialmente a uma proteína sérica. De preferência, o ligando à base de lipídios se liga à albumina sérica humana (HSA). Uma molécula lipídica ou à base de lipídios pode aumentar a resistência à degradação do conjugado, aumentar o direcionamento ou o transporte para a célula alvo e/ou pode ajustar a ligação a uma proteína sérica. Um ligando à base de lipídios pode ser usado para modular a ligação do conjugado a um tecido alvo.
[0142] O ligante pode ser um esteroide. De preferência, o ligante é colesterol ou um derivado de colesterol.
[0143] O ligante pode ser uma frações, por exemplo, uma vitamina, que é absorvida por uma célula alvo. Vitaminas exemplares incluem vitaminas A, E, K e B. As vitaminas podem ser absorvidas por uma célula em proliferação, o que pode ser útil para fornecer o ácido nucleico a células como células tumorais malignas ou não malignas.
[0144] O ligante pode ser um agente de permeação celular, tal como um agente de permeação celular helicoidal. De preferência, esse agente é anfipático.
[0145] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida semelhante a um peptídeo natural. O peptídeo ou ligante peptidomimético pode incluir peptídeos de ocorrência natural ou modificados, ou ambos. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser um peptídeo de permeação celular, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático ou peptídeo hidrofóbico. A fração peptídica pode ser um peptídeo dendrimérico, um peptídeo restrito ou peptídeo reticulado. A fração peptídica pode incluir uma sequência de translocação hidrofóbica da membrana. A fração peptídica pode ser um peptídeo capaz de transportar grandes moléculas polares, como peptídeos, oligonucleotídeos e proteínas através das membranas celulares, por exemplo, sequências da proteína HIV Tat (GRKKRRORRRPPQ) e da proteína de Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK). Preferencialmente, o peptídeo ou peptidomimético é um peptídeo direcionado a células, por exemplo, peptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD).
[0146] O ligante pode ser um peptídeo de permeação celular que é capaz de permear, por exemplo, uma célula microbiana ou uma célula de mamífero.
[0147] O ligante pode ser um modulador farmacocinético. O modulador farmacocinético pode ser lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídios, peptídeos, agentes de ligação a proteínas, PEG, vitaminas, etc.
[0148] Quando dois ou mais ligantes estão presentes, todos os ligantes podem ter as mesmas propriedades, todos têm propriedades diferentes ou alguns ligantes têm as mesmas propriedades, enquanto outros têm propriedades diferentes. Por exemplo, um ligante pode ter propriedades de direcionamento, atividade endossomolítica ou propriedades moduladoras de PK. Numa concretização preferida, todos os ligantes têm propriedades diferentes.
[0149] Os ligantes podem ser acoplados ao ácido nucleico na extremidade 3', na extremidade 5' e/ou em uma posição interna. De preferência, o ligante é acoplado ao ácido nucleico por meio de uma aglutinação ou ligação intermediária.
[0150] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico de fita dupla. Num ácido nucleico de cadeia dupla, o ligante pode estar ligado a uma ou ambas as cadeias. Em algumas modalidades, um ácido nucleico de fita dupla contém um ligante conjugado com a fita sense. Noutras formas de realização, um ácido nucleico de cadeia dupla contém um ligante conjugado com a cadeia antisense
[0151] Os ligantes podem ser conjugados com nucleobases, frações de açúcar ou ligações internucleosídicas de moléculas de ácido nucleico. À conjugação com nucleobases de purinas ou seus derivados pode ocorrer em qualquer posição, incluindo átomos endocíclicos e exocíclicos. A conjugação com nucleotídeos de pirimidina ou seus derivados também pode ocorrer em qualquer posição. A conjugação com as frações de açúcar dos nucleosídeos pode ocorrer em qualquer átomo de carbono. A conjugação com ligações internucleosídicas pode ocorrer no átomo de fósforo de uma ligação contendo fósforo ou em um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado ao átomo de fósforo. Para ligações internucleosídicas contendo amina ou amida, a conjugação pode ocorrer no átomo de nitrogênio da amina ou amida ou com um átomo de carbono adjacente.
[0152] O ligante é tipicamente um carboidrato, por exemplo, um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo ou polissacarídeo. O ligante pode ser conjugado com o ácido nucleico por um ligante. O ligante pode ser um ligante ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.
[0153] Meios para distribuição eficiente de oligonucleotídeos, em particular ácidos nucleicos de fita dupla da invenção, para células in vivo é importante e exige direcionamento específico e proteção substancial do ambiente extracelular, particularmente proteínas séricas. Um método para atingir um direcionamento específico é conjugar uma fração de direcionamento ou ligante ao ácido nucleico. A fração de direcionamento ajuda a direcionar o ácido nucleico para o sítio alvo necessário e é necessário conjugar frações de direcionamento apropriadas para os sítios de receptores desejados para as moléculas conjugadas serem absorvidas pelas células, como por endocitose. A fração ou ligante alvo pode ser qualquer fração ou ligante capaz de atingir um receptor específico.
[0154] Por exemplo, o receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) é um receptor de alta capacidade, que é altamente abundante em hepatócitos. Uma das primeiras divulgações de glicosídeos de agrupamento triantenários estava na Patente US Nº 5.885.968. Conjugados com três ligantes GalNnAc e compreendendo grupos fosfato são conhecidos e são descritos em Dubber et al. (2003). ASGP-R apresenta uma afinidade 50 vezes maior para N-acetil-D- galactosilamina (GalNAc) do que D-Gal.
[0155] Os hepatócitos que expressam a lectina (receptor de asialoglicoproteína; ASGPR), que reconhece subunidades B-galactosil especificamente terminais de proteínas glicosiladas ou outros oligossacarídeos (PH Weigel et al., 2002), podem ser utilizados para direcionar uma droga ao fígado por acoplamento covalente de galactose ou galactosamina à substância farmacológica (Ishibashi, S .; et. al., J. Biol. Chem. 1994 Nov 11;269(45):27803-6). Além disso, a afinidade de ligação pode ser significativamente aumentada pelo efeito multivalência, que é alcançado pela repetição da unidade de direcionamento (Biessen EA, et al., J. Med. Chem. 1995 Abr 28;38(9):1538-46.).
[0156] O ASGPR é um mediador para um transporte endossômico ativo de glicoproteínas contendo B-galactosil terminal, portanto o ASGPR é altamente adequado para a transmissão direcionada de candidatos a medicamentos como ácidos nucléicos, que devem ser transmitidas à célula (Akinc et al.).
[0157] O sacarídeo, que também pode ser chamado de ligante, pode ser selecionado para ter uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula hepática de mamífero, por exemplo, o complexo receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R).
[0158] O “sacarídeo pode ser selecionado dentre N-acetil galactosamina, manose, galactose, glicose, glucosamina e fucose. O sacarídeo pode ser N-acetil galactosamina (GalNAc).
[0159] O ligante pode compreender (i) uma ou mais frações N-acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligante peptídico, em que o ligante peptídico conjuga as frações GalNAc a um ácido nucleico conforme definido em quaisquer aspectos anteriores. O ligado pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. Os nucleotídeos podem ser modificados como definido neste documento.
[0160] "GalNAc" se refere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D- galactopiranose, comumente referida na literatura como N-acetil galactosamina. Referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactosamina" inclui tanto a forma B-: 2- (Acetilamino)-2-desoxi-B-D-galactopiranose quanto a forma a: 2-(Acetilamino)-2- desoxi-a-D-galactopiranose. Tanto a forma B: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-B-D- galactopiranose como a forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranose podem ser utilizadas indistintamente. —Preferencialmente, os compostos da invenção compreendem a forma B, 2- (Acetilamino)-2-desoxi-B-D-galactopiranose.
[0161] O ligante pode compreender GalNAc.
[0162] O ligante pode compreender um composto da fórmula |: [S-X1-P-X2]3-A-X?- (1) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X' representa C3-Cs alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2,o0u3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X? é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2))-O-CH2-, onde n=1-6; A é uma unidade de ramificação; X? representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a Xº através de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato).
[0163] Na fórmula |, a unidade de ramificação “A” se ramiífica em três, a fim de acomodar os três ligantes de sacarídeos. A unidade ramiíficada é covalentemente ligada aos ligantes e ao ácido nucleico. A unidade de ramificação pode compreender um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados a partir de grupos alquil, amida, dissulfeto, polietilenoglicol, éter, tioéter e hidroxiamino. A unidade de ramificação pode compreender grupos selecionados a partir de grupos alquil e éter.
[0164] A unidade de ramificação A pode ter uma estrutura selecionada dentre: " T
A A / t A Aq p n A < AÇO A A, / e and ab à em que cada A: representa, independentemente, O, S, C=O ou NH; e cada n representa, independentemente, um número inteiro de 1 a 20.
[0165] A unidade de ramificação pode ter uma estrutura selecionada dentre: x À À A, 1 1 Ar$ h A h A ; o n n — n n ia A EM A, e nd EA o » ” É em que cada A: representa, independentemente, O, S, C=O ou NH; e cada n representa, independentemente, um número inteiro de 1 a 20.
[0166] A unidade de ramificação pode ter uma estrutura selecionada dentre:
| ho A ho A Zn ne and WWW nn Y» Y em que A: é O, S, C=O ou NH; e cada n representa, independentemente, um número inteiro de 1 a 20.
[0167] A unidade de ramificação pode ter a estrutura: o o 7 / NH o
LL
[0168] A unidade de ramificação pode ter a estrutura:
VT O mn o o o
[0169] A unidade de ramificação pode ter a estrutura:
A
[0170] Opcionalmente, a unidade de ramificação consiste em apenas um átomo de carbono.
[0171] A porção "X?" é uma unidade de formação de ponte. A unidade de formação de ponte é linear e está ligada covalentemente à unidade de ramificação e ao ácido nucleico.
[0172] Xº pode ser selecionado dentre -C1-C2o alquileno-, -C2-C2o alquenileno-, um éter alquileno de fórmula -(C1-C2o alquileno)-O(C1-C2o alquileno)-, -C(O0)-C1-C20 alquileno-, -Co-Ca alquileno(Cy)Co-Ca alquileno- em que Cy representa um anel cicloalquileno, arileno, heterociclileno ou heteroarileno substituído ou não substituído de 5 ou 6 membros, -C1-Ca alquileno-NHC(O)-C1- Ca alquileno-, -C1-Ca alquileno-C(O)NH-C1-Ca alquileno-, -C1-Ca alquileno-SC(O)- C1-Ca alquileno-, -C1-Ca alquileno-C(O)S-C1-Ca alquileno-, -C1-Ca alquileno- OC(O)-C1-Ca alquileno-, -C1-Ca alquileno-C(O0)O-C1-Ca alquileno- e -C1-Cs alquileno-S-S-C1-Cs alquileno-.
[0173] Xº pode ser um éter alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)-O- (C1-C20 alquileno)-. X? pode ser um éter alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)- OACa-C20 alquileno)-, em que o referido (C4-C20 alquileno) está ligado a Z. X? pode ser selecionado do grupo que consiste de -CH2-O-CaHs-, -CH2-O-CaHea-, - CH2-0-CsH12- e -CH2-0-CaH16-, especialmente -CH2-O0-CaHa-, -CH2-O0-CeH12- e - CH2-O0-CaH16-, em que em cada caso o grupo -CH>2- está ligado a A.
[0174] O ligante pode compreender um composto da fórmula (Il): [S-X1-P-X2]3-A-X? (11) em que: S representa um sacarídeo; X representa C3-Cs6 alquileno ou um ramo de etileno glicol (-CH2-CH2- O)m(-CH2)2- em que m é 1,2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X? é C1-Cs alquileno;
[0175] A é uma unidade de ramificação selecionada dentre: n n NA NAN AA.
A' = O, NH A'=O,NH A?=NH, CH, O 1a4 to4 1a4 =1to4 Xº? é uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a Xº? através de um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato).
[0176] A unidade de ramificação A pode ter a estrutura: A, Pá
PS
[0177] A unidade de ramificação A pode ter a estrutura: E, FP * , em que Xº é ligado ao átomo de nitrogênio.
[0178] Xº pode ser C1-Cxo alquileno. Preferencialmente, Xº é selecionado do grupo que consiste de -C3He5-, -CaHs-, -CeH12- e -CaHie-, especialmente -CaHsa-, -CeH12- e -CaH16-.
[0179] O ligante pode compreender um composto da fórmula (III): [S-X1-P-X2]3;-A-X? (11) em que: S representa um sacarídeo; X' representa C3-Cs6 alquileno ou um ramo de etileno glicol (-CH2-CH>- O)m(-CH2)2- em que m é 1,2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X?é um éter alquileno de fórmula -CaHs-O-CH2-; A é uma unidade de ramificação;
[0180] Xº é um éter alquileno de fórmula selecionado do grupo que consiste em -CH2-0-CH2-, -CH2-O0-CaHa-, -CH2-0-CaHe-, -CH2-O0-CaHg-, -CH2-O0- CsH10-, -CH2-0-CsH12-, -CH2-0-C7H14- e -CH2-0-CaH16-, em que em cada caso o grupo -CH>2- está ligado a A, em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a Xº através de um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato).
[0181] A unidade de ramificação pode compreender carbono. Preferencialmente, a unidade de ramificação é carbono.
[0182] Xº pode ser selecionado do grupo que consiste em -CH2-O- CaHg-, —-CH2-O0-CsH10-, — -CH2-O0-CeH12-, — -CH2-O-C7H1i4-, e -CH2-O-CaHi6-. Preferencialmente, X? é selecionado do grupo que consiste em -CH2-O-CaHs-, - CH2-0-CsH12- e -CH2-0-CaHi6.
[0183] Para qualquer um dos aspectos acima, P representa um grupo fosfato modificado. P pode ser representado por: Y' too
 em que Y' e Y? representam independentemente =O, =S, -O”, -OH, - SH, -BH3a, -OCH2CO2, -OCH2CO2R“, -OCH2C(S)JORY e -OR“, em que R* representa C1-Cs alquil e em que À indica ligação ao restante do composto.
[0184] Por fosfato modificado, entende-se um grupo fosfato em que um ou mais dos oxigênios são substituídos. Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotioato, fosforosselenatos, fosfatos de borano, ésteres de borano fosfato, fosfonatos de hidrogênio, fosforamidatos, fosfonatos de alquil ou aril e fosfotriésteres. Os fosforoditivcatos têm ambos os oxigênios não ligados substituídos pelo enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênios não ligados no grupo fosfato pode ser independentemente qualquer um de S, Se, B, C, H, N ou OR (R é alquil ou aril).
[0185] O ligante de fosfato também pode ser modificado pela substituição de um oxigênio de ligação por nitrogênio (fosforamamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metilenofosfonatos em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. É possível substituir os oxigênios não ligados por nitrogênio.
Por exemplo, Y* pode representar -OH e Y? pode representar = O ou = S; ou Y pode representar -O e Y? pode representar = O ou = S; Y pode representar =O e Y? pode representar —-CH3, -SH, -OR“, ou —
BHz3 Y pode representar =S e Y? pode representar -CH3, OR* ou -SH.
Será entendido pela pessoa versada na técnica que, em certos casos, haverá deslocalização entre Y' e Y?.
[0186] Preferencialmente, o grupo fosfato modificado é um grupo tiofosfato. Os grupos tiofosfato incluem ditiofosfato (ou seja, quando Y' representar =S e Y? representar —S") e monotiofosfato (ou seja, quando Y' representar -O e Y? representar =S, ou quando Y' representar =O e Y? representar —S). Preferencialmente, P é um monotiofosfato. Os inventores descobriram que os conjugados com grupos tiofosfato em substituição de grupos fosfato têm potência e duração de ação melhoradas in vivo.
[0187] P também pode ser um etil fosfato (ou seja, quando Y' representar =O e Y? representar OCH2CHs3).
[0188] O sacarídeo, que também pode ser chamado de ligante, pode ser selecionado para ter uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula hepática de mamífero, por exemplo, o complexo receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R).
[0189] Para qualquer um dos aspectos acima, o sacarídeo pode ser selecionado a partir de N-acetil com uma ou mais galactosamina, manose, galactose, glicose, glucosamina e frutose. De preferência, o sacarídeo é duas moléculas de N-acetil galactosamina (GalNAc). Os compostos da invenção podem ter 3 ligantes, cada um dos quais é, de preferência, N-acetil galactosamina.
[0190] "GalNAc" se refere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D- galactopiranose, comumente referida na literatura como N-acetil galactosamina. Referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactosamina" inclui tanto a forma B-: 2- (Acetilamino)-2-desoxi-B-D-galactopiranose quanto a forma a: 2-(Acetilamino)-2- desoxi-a-D-galactopiranose. Em certas modalidades, tanto a forma B: 2- (Acetilamino)-2-desoxi-B-D-galactopiranose como a forma a: 2-(Acetilamino)-2-
desoxi-a-D-galactopiranose podem ser utilizadas indistintamente. Preferencialmente, os compostos da invenção compreendem a forma B,2- (Acetilamino)-2-desoxi-B-D-galactopiranose. (9) oH Ho | O) "im DAS
OH 2-(Acetilamino)-2-Desoxi-D-galactopiranose oH
HO o á ESTA o A NHAc 2-(Acetilamino)-2-Desoxi-B-D-galactopiranose
OH Ho o
ST NHAc SS 2-(Acetilamino)-2-Desoxi-a-D-galactopiranose
[0191] Para qualquer um dos compostos acima da fórmula (Ill), X* pode ser um ramo de etileno glicol (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3. X' pode ser (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X* pode ser (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X*? pode ser (- CH2-CH2-0)3(-CH2)--. De — preferência X' é (-CH-CH2>-0O)2(-CH2)2-. Alternativamente, X* representa C3-Cs6 alquileno. X* pode ser propileno. X* pode ser butileno. X* pode ser pentileno. X* pode ser hexileno. De preferência o alquil é um alquileno linear. Em particular, X* pode ser butileno.
[0192] Para compostos de fórmula (Ill), X? representa um éter alquileno de fórmula -CaHes-O-CH>2- ou seja, C3 alcóxi metileno, ou -CH2CH2CH20CH>2-.
[0193] Portanto, a presente invenção fornece adicionalmente um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes estruturas: oH oH oH Ho AcHN. OH o oH o. o AcHN o o SN N |
LT A o eo | oH O. o | oH S=—=P— 0 AcCHN. | o OH
Ó o O. o: o o s rt o a o o Ss | Ss 'O—P— O
L oH Ho OH
OH OI o Ho o AcHN o o
NHAC A o osr-sº ' o o ; Grp so o oH o TT OH o ACHN o OH o Oo o ro o
UU Z-O-P-O So o
DAS Ss i
OH Ho oH
OH OH o Ho. o ACHN o o NHAcC A ? o=P-s" o S o=Pp-sº o oH o SP oH o ACHN
O OH o o o DA o z-0-p-o so 9 o-P-o so
OH Ho OH
OH OH o Ho. o ACHN O. o NHAc aa 1 o=P-sº p r o=P-sº o OH
OH o al ACHN
O OH o O o q 2-0-p-0 o sº O-P-O so ;
OH Ho OH
OH OH o Ho o ACHN o o
RAE r. o=p-sº o o O o=P-s [o] OoH o SO? oH o ACHN
O OH o o o 9 X 9 LON o-P-o o s o oH HO ou OH OH o AcHN HO o o o. NHÃe AA " o=P-sº o o 1 o=P-sº oH oH
O AHN o SP O OH P o o o UA o z-0o-P-o E o u 0-P-o o oH Ho oH OH OH o ACcHN Ho o o o NHAc DA o 1 o=P-sº ó 4 o: =p-sº oH oH ” ACHN o A o OH o o o o q Z-0-P-O o k u sº o—P-O
L Ff) oH Ho OH OH OH o ACcHN Ho o o fo) NHAc DA q o=P-sº o 5 o=P-s or oH
P ACHN o Fº O OH P o o o o i o un u 2-01=0 O-P-O sº do em que Z representa um ácido nucleico como definido anteriormente neste documento.
[0194] Um ligante de fórmula (1), (Il) ou (Ill) pode ser ligado na extremidade 3' da primeira fita (antisense) e/ou em qualquer uma das extremidades 3' e/ou 5' da fita (sentido). O ácido nucleico pode compreender mais de um ligante de fórmula (1), (11) ou (Ill). No entanto, prefere-se um único ligante de fórmula (1), (Il) ou (Ill) porque um único ligante é suficiente para um direcionamento eficiente do ácido nucleico para as células alvo.
[0195] Preferencialmente, a extremidade 5' da primeira fita (antisense) não está ligada a um ligante de fórmula (1), (11) ou (Ill), uma vez que um ligante nessa posição pode potencialmente interferir na atividade biológica do ácido nucleico.
[0196] Um ácido nucleico com um único ligante de fórmula (1), (11) ou (Ill) na extremidade 5' de uma fita é mais fácil e, portanto, mais barato de sintetizar do que o mesmo ácido nucleico com o mesmo ligante na extremidade 3', Portanto, preferencialmente, um único ligante de qualquer uma das fórmulas (!), (11) ou (Ill) é covalentemente ligado à (conjugado com) extremidade 5' da segunda fita do ácido nucleico.
[0197] Em uma modalidade, o ácido nucleico é conjugado a um ligante que compreende um lipídeo e, mais preferencialmente, um ligante que compreende um colesterol.
[0198] Um conjugado da invenção pode compreender qualquer ácido nucleico, como divulgado neste documento, conjugado a qualquer ligante ou ligantes como divulgado neste documento.
[0199] A presente invenção também se refere a um conjugado para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, o referido conjugado compreendendo uma porção de ácido nucleico, compreendendo o ácido nucleico de qualquer aspecto da invenção e pelo menos uma porção de ligante, a referida porção de ligante, que é pelo menos uma, compreendendo uma porção ligante, preferencialmente uma porção ligante derivada de serinol, e um ligante de direcionamento para direcionamento in vivo de células, sendo conjugado exclusivamente às extremidades 3' e/ou 5' de uma ou ambas as fitas de RNA, em que a extremidade 5' da primeira fita de RNA não é conjugada, em que: (i) a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento, e em que (a) a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada; ou (b) a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA não é conjugada; ou (c) tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento; ou (ii) a segunda fita de RNA e a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada.
[0200] Em uma modalidade da presente invenção, a segunda fita de RNA (isto é, a fita de sentido) é conjugada na extremidade 5' a um ligante de direcionamento, a primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA (isto é, a fita de sentido) não é conjugada, de modo que um conjugado com a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 16A, é formado.
[0201] Em uma modalidade da presente invenção, a segunda fita de RNA (ou seja, a fita de sentido) é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento, a segunda fita de RNA (ou seja, a fita de sentido) também é conjugada na extremidade 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) não é conjugada, de modo que um conjugado com a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 16B, seja formado.
[0202] Em uma modalidade da presente invenção, tanto a segunda fita de RNA (ou seja, a fita de sentido) e a primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA (isto é, a fita de sentido) não é conjugada,
de modo que um conjugado com a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 16C, é formado.
[0203] Em uma modalidade da presente invenção, a segunda fita de RNA (ou seja, a fita de sentido) é conjugada na extremidade 5' ao ligante alvo e a segunda fita de RNA (ou seja, a fita de sentido) e a primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) também são conjugados nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento, de modo que um conjugado com a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 16D, seja formado.
[0204] Em qualquer uma das modalidades acima, >» indica o ligante que conjuga o ligante às extremidades da porção de ácido nucleico; o ligante pode ser uma fração de GalNAc tal como GalNAc; e a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 16E, representa a porção de ácido nucleico.
[0205] Estes diagramas esquemáticos não se destinam a limitar o número de nucleotídeos na primeira ou na segunda fita, nem representam qualquer tipo de limitação da complementaridade das bases ou qualquer outra limitação.
[0206] Os ligantes podem ser monoméricos ou multiméricos (por exemplo, diméricos, triméricos, etc.).
[0207] Adequadamente, os ligantes são monoméricos, contendo assim uma única fração do ligante de direcionamento, por exemplo, uma única fração de GalNAc.
[0208] Alternativamente, os ligantes podem ser ligantes diméricos em que as porções de ligante compreendem duas frações de ligante, tais como frações de ligante derivadas de serinol ou frações de ligante não serinol, cada uma ligada a uma única fração de ligante de direcionamento.
[0209] Os ligantes podem ser ligantes triméricos em que as porções de ligante compreendem três frações de ligante, tais como frações de ligante derivadas de serinol ou frações de ligante não serinol, cada uma ligada a uma única fração de ligante de direcionamento.
[0210] As duas ou três frações de ligante derivadas de serinol podem ser ligadas em série, por exemplo, como mostrado abaixo: Y s ele Loo
ANS OH HAN em que né 1ou2eYéSouoO.
[0211] Preferencialmente, os ligantes são monoméricos.
[0212] Adequadamente, as fitas de RNA conjugadas são conjugadas a um ligante de direcionamento por meio de uma fração ligante incluindo um ligante adicional, em que o ligante adicional é ou compreende uma cadeia de C1-15 alquil saturada, não ramiíificada ou ramificada, em que opcionalmente um ou mais carbonos (por exemplo 1, 2 ou 3 carbonos, adequadamente 1 ou 2, em particular 1) é/são substituído(s) por um heteroátomo selecionado dentre O, N, S(O),, em que p é 0, 1 ou 2 (por exemplo, um grupo CH>2 é substituído por O, ou por NH, ou por S, ou por SO2 ou um grupo —CH3 no terminal da cadeia ou em uma ramificação é substituído por OH ou por NH2), em que a referida cadeia é opcionalmente substituída por um ou mais grupos oxo (por exemplo 1 a 3, como 1 grupo).
[0213] Adequadamente, a fração de ligante é uma fração de ligante derivada de serinol.
[0214] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia de C1-15 alquil saturada e não ramificada, em que um ou mais carbonos (por exemplo 1, 2 ou 3 carbonos, adequadamente 1 ou 2, em particular 1) é/são substituídos por um átomo de oxigênio.
[0215] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia PEG.
[0216] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia C1-15 alquil saturada e não ramificada.
[0217] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia C1-6 alquil saturada e não ramificada.
[0218] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia Ca ou Cs alquil saturada, não ramiíficada, por exemplo, uma cadeia Ca alquil.
[0219] Em uma modalidade, vvuv é uma fração de ligação da fórmula (V):
Y Y ; | LN - tomo Lo—P—o+ OH du " (V) em que n, Y e L1 são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0220] Assim, em uma modalidade, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (VI):
Y Y | bo GalNAc tomo Lo—P—o—— OH du n (VI) em que n, Y e L1 são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0221] Adequadamente, vuv é uma fração de ligação da fórmula (XIV): *x Z / /
HN HN
Y Y | ho Ho onto qo R. OH R. ! no” XIV) em que n, Y, R: e L são definidos abaixo, L está conectado ao ligante de direcionamento, por exemplo, GalNAc e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0222] Adequadamente, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (IV):
JANO JAN nn nn
Y Y Ho lo, lo R de R: du | o (IV) em que n, Ye Ri e L são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0223] Adequadamente, uvvuv é uma fração de ligação da fórmula (VI):
Y Y - 1-od o ton du du n (VII) em que n, Y e L2> são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0224] Adequadamente, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (VIII):
Y Y GalNAc 1-ob o eo oa da du n (VII) em que n, Y e L2> são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0225] Adequadamente, uvv é uma fração de ligação da fórmula (IX):
Y 7 || ' LL O—P—oO— “AE ' HN—F OH (IX) em que F, Y e L são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0226] Adequadamente, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (IXa):
Y ha GalNAc—L, O—P—O0— NE ' HN—F OH (IXa) em que F, Y e L são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[0227] Adequadamente, L é:
ADD
[0228] Em qualquer uma das estruturas acima, adequadamente os ligantes são selecionados a partir de frações de GalNAc e galactose, especialmente frações de GalNAc. Alternativamente, o GalNAc pode ser substituído por outro ligante de direcionamento, por exemplo, um sacarídeo.
[0229] Em uma modalidade da invenção, a primeira fita de RNA é um composto da fórmula (X):
Y Y
5.3 ||| | Z—OoO+P—O—L, e o TH de oH n Px) em que bé 0 ou 1;e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XI):
Y Y Y Y 1 | 5 a || || H+To tomo LOoO—PA-O—Z O qo oo o H OH de OH OH n c n 9 (XI); em que: c e d são independentemente O ou 1; Z'1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; YéOousS,; né0o, 1,20U3;e L1: é um ligante ao qual um ligante está ligado; eemqueb+c+dé2ou3.
[0230] Adequadamente, a primeira fita de RNA é um composto da fórmula (XV): GalNAc. GalNAc
XY X
L L x x
NH NH
Y Y sa | Z——o+P—O oo o+H du Ri OH Ri n p (XV) em que bé 0 ou 1;e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XVI): GalNAc GalNAc GalNAc, GalNAc, Y Ú k kL / / N N
HN HN NH NH
Y Y Y Y | lh as || | HATO oo O PATO—2Z, OTP—-O OA oOTH R; OH R " du R; OH R, n n e º (XVI); em que c e d são independentemente O ou 1;
em que: Z'1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; YéOousS,; R1 é H ou metil; néo0,1,20U3;e L é igual ou diferente nas fórmulas (XV) e (XVI) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2),-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O0):-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2))-CO-NH-(CH2))-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)I)-CO-NH-(CH2).-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2))-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o C(O) terminal (se presente) está ligado ao grupo NH; eemqueb+c+dé2ou3,
[0231] Adequadamente, a primeira fita de RNA é um composto da fórmula (XII):
Y Y S7-Ã2o Loo oa, oT+H de du "Sb (XI) em que bé 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto da fórmula (XIII):
Y Y Y Y Ho A 120 o 2, Ão ou ol o, o+H && ds ds & n ce n d (XII);
em que: c e d são independentemente O ou 1; Z'1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; YéOousS; néo0,1,20U3;e L2 é igual ou diferente nas fórmulas (XII) e (XIII) e é igual ou diferente nas frações entre parênteses por b, c e d e é selecionado do grupo que consiste em: Ds Da Gana: p-N 2GaNao MN, 2GaiNne O.
SO ; x ;e * x ; ou nébeL>é: “No GalNãe Us MRE E e o grupo OH terminal está ausente, de modo que a seguinte fração é formada:
Y GalNAc—L, ol o me ' OH ; em que F é uma cadeia C16 alquil ramificada ou não ramíificada (como não ramificada) (por exemplo, alquil C16), em que um dos átomos de carbono é opcionalmente substituído por um átomo de oxigênio, desde que o referido átomo de oxigênio seja separado de outro heteroátomo (por exemplo, um átomo O ou N) por pelo menos 2 átomos de carbono; L é igual ou diferente nas fórmulas (XII) e (XIII) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)--C(O)-, em que r = 2-12;
-(CH2-CH2-O0):-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2))-CO-NH-(CH2):-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)I|-CO-NH-(CH2)|-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2))-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o C(O) terminal (se presente) está ligado ao grupo NH; eemqueb+c+dé2ou3.
[0232] Em qualquer uma das fórmulas acima, quando GalNAc está presente, o GalNAc pode ser substituído por qualquer outro ligante de direcionamento, como os mencionados neste documento.
[0233] Adequadamente, b é 0, cé Te dé 1; bé 1,cé 0e dé 1; bé 1, cé ledéO;oubé1,céledél.
[0234] Mais adequadamente, b é 0, cé 1edé 1;bé 1,cé 0edé1; oubé 1,céledé1.
[0235] Mais adequadamente, bé 0,cé 1e dé 1.
[0236] Em uma modalidade, Y é O. Em outra modalidade, Y é S.
[0237] Numa modalidade, R: é H ou metil. Em uma modalidade, R: é H. Em outra modalidade, R: é metil.
[0238] Numa modalidade, n é O, 1, 2 ou 3.Adequadamente, né O.
[0239] Numa modalidade, L é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)--C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O0):-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2))-CO-NH-(CH2))-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)IJ-CO-NH-(CH2).-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2))-NH-C(O)-, em que v é 2-12; em que o C(O) terminal está ligado ao grupo NH.
Adequadamente, L é -(CH2);-C(O)-, em que r = 2-12. Adequadamente, r = 2-6. Mais adequadamente, r = 4 ou 6, por exemplo, 4.
Adequadamente, L é: o
[0240] Frações F de exemplo incluem (CH2)1-6 por exemplo (CH2)14a por exemplo CH2, (CH2)a, (CH2)s ou (CH2)s, ou CH2O0(CH2)23, por exemplo CH2O0(CH2)CHs.
[0241] Adequadamente, L2 é:
H SO"
[0242] Adequadamente, L2 é:
H LT
[0243] Adequadamente, L2 é: Ab N GalNAc
SI
[0244] Adequadamente, L? é: o. AL D AO GalNAc
H Os
[0245] Adequadamente, né O e L2 é:
H ne e o grupo OH terminal está ausente, de modo que a seguinte fração é formada: GalNAc
X L—NH
Y prior OH ; em que Y é como definido em outra parte neste documento.
[0246] Dentro da fração entre colchetes por b, c e d, L2 é tipicamente o mesmo. Entre frações entre colchetes por b, c e d, L2 pode ser igual ou diferente. Em uma modalidade, L2 na fração entre colchetes por c é o mesmo que L2 fração entre colchetes em d. Em uma modalidade, L2 na fração entre colchetes por c não é o mesmo que L2 na fração entre colchetes por d. Numa modalidade, o L2 nas frações entre colchetes por b, c e d é o mesmo, por exemplo, quando a fração ligante é uma fração ligante derivada de serinol.
[0247] As frações de ligante derivadas de serinol podem ser baseadas em serinol em qualquer estereoquímica, ou seja, derivadas do isômero L-serina, D-serina, uma serina racêmica ou outra combinação de isômeros. Em um aspecto preferido da invenção, a fração serinol-GalNAc (SerGN) possui a seguinte estereoquímica: neo DNF, Po Ae MN or | Fono Nãe ? DMT À N >? 2x LSerina NON o Frações de ligador derivadas de Serinol 2NH o Blocos de construção de (S)-Serinol ou seja, é baseado em um bloco de construção suportado sólido (S)- serinol-amidita ou (S)-serinol-succinato derivado do isômero L-serina.
[0248] Numa modalidade, as células alvo são hepatócitos.
[0249] A invenção fornece como um outro aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrita a partir do referido gene alvo para ser inibida, em que a referida primeira e/ou segunda fita inclui uma ligação de fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos terminais 3' e/ou a segunda fita incluem uma ligação fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos terminais 5', e em que a molécula de ácido nucleico é conjugada direta ou indiretamente a um ligante através de um ligador.
[0250] O ácido nucleico pode ser conjugado a um ligante conforme descrito neste documento. Os nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita podem ser modificados, conforme descrito neste documento.
[0251] O ligante pode ser GalNAc.
[0252] Um grupo de ligação clivável é um ligante que é estável fora da célula, mas é clivado após a entrada na célula alvo. A clivagem libera as duas partes que o ligante está mantendo juntas.
[0253] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico da invenção compreende um grupo de ligação clivável que é clivado pelo menos 10 vezes ou mais, de preferência pelo menos 100 vezes mais rápido em uma célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionado para imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um sujeito ou sob uma segunda condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condições encontradas no sangue ou soro).
[0254] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou presença de moléculas degradantes. Moléculas degradantes incluem enzimas oxidativas ou redutoras, agentes redutores (como mercaptanos), esterases, endossomas ou agentes que podem criar um ambiente ácido, enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável ácido, agindo como um ácido geral, peptidases e fosfatases.
[0255] Um grupo de ligação clivável pode ser uma ligação dissulfeto, suscetível ao pH.
[0256] Um ligante pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima específica. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligante pode depender da célula alvo. Por exemplo, um ligante que inclui um grupo éster é preferido quando uma célula hepática é o alvo. Os ligantes que contêm ligações peptídicas podem ser usados ao direcionar células ricas em peptidases, como células hepáticas e sinoviócitos.
[0257] Em geral, a adequação de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente (ou condição) degradante de clivar o grupo de ligação candidato. Também será desejável testar o grupo de ligação clivável candidato quanto à capacidade de resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Em modalidades preferidas, os compostos candidatos úteis são clivados pelo menos 2, 4, 10 ou 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições intracelulares) em comparação com sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições extracelulares).
[0258] Em um aspecto, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável redox. O grupo de ligação clivável redox pode ser um grupo de ligação dissulfeto.
[0259] Em um aspecto, o grupo de ligação pode ser um grupo de ligação clivável à base de fosfato. As modalidades preferidas são -O-P(O)(OH)-O- , -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S- P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S- P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-- Uma modalidade preferida é -O-P(O)(OH)-O-.
[0260] Em um aspecto, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável ácido. De preferência, o grupos de ligação cliváveis ácidos são clivados em ambientes em que o pH é 6,5 ou inferior, ou são clivados por agentes como enzimas que podem atuar como um ácido geral. Exemplos de grupos de ligação cliváveis ácidos incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Grupos cliváveis ácidos podem ter a fórmula geral - C=NN-; C(0)O ou -OC(O). Uma modalidade preferida é um grupo de ligação em que o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcoxi) é um grupo aril, grupo alquil substituído ou grupo alquil terciário, como dimetil pentil ou t-butil.
[0261] Em uma modalidade, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável à base de éster. Exemplos de grupos de ligação cliváveis à base de éster incluem, mas não estão limitados a ésteres dos grupos alquileno, alquenileno e alquinileno.
[0262] Em uma modalidade, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável baseado em peptídeo. Grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeos são ligações peptídicas formadas entre aminoácidos para produzir oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeos etc) e polipeptídeos. O grupo de clivagem baseado em peptídeo é geralmente limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação amida) formada entre aminoácidos que produzem peptídeos e proteínas e não inclui todo o grupo funcional amida. Os grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeos possuem a fórmula geral - NHCHRAC(O)NHCHREC(O)-, onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes.
[0263] Síntese de fitas simples
[0264] Os compostos exemplares podem ser sintetizados de acordo com os métodos descritos abaixo e conhecidos pelo versado na técnica. A montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos ligantes pode, por exemplo, ser realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita. A síntese em fase sólida pode começar a partir de CPG Icaa carregado com blocos de construção modificados ou de base. O ciclo de acoplamento da síntese de fosforamidita consiste em 1) remoção de DMT, 2) alongamento da cadeia usando a fosforamidita mascarada com DMT e um ativador, que pode ser benziltiotetrazol (BTT), 3) capping de cadeias oligonucleotídicas não alongadas, seguido de oxidação da P(III) a P(V) por iodo (se for desejável ligação fosfodiéster) ou EDITH (se for desejável ligação fosforoticato ou fosforoditivato) e capping novamente (Cap/Ox/Cap ou Cap/Thio/Cap). No caso de uma ligação de fosforoditioato ser a desejada, o ciclo de acoplamento da síntese de fosforamidito consiste em 1) remoção da DMT, 2) alongamento da cadeia usando o tofosforamidito mascarado com DMT, 3)
capping de cadeias oligonucleotídicas não alongadas, seguido de oxidação da P(Il!l) para P(V) por EDITH e capping novamente (Cap/Thio/Cap). Para a conjugação na coluna de um cluster de GalNAc trivalente semelhante à árvore, o mesmo ciclo de síntese de fosforamidita foi aplicado com o uso do amidita ST41- fos de ramificação trivalente necessário, seguido de outra rodada do ciclo de síntese usando o amidita de GalNAc ST23-fos. Os blocos de construção necessários estão disponíveis comercialmente ou a síntese é descrita abaixo.
[0265] Todos os produtos finais de fita simples foram analisados por AEX-HPLC para provar sua pureza. A pureza é dada em %FLP (% de produto de comprimento total), que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise AEX-HPLC do produto final. A identidade dos respectivos produtos de fita simples foi comprovada por análise de LC-MS.
[0266] A síntese dos derivados de fosforamidita de ST41 (ST41-fos), bem como ST23 (ST23-fos) pode ser realizada conforme descrito em WO?2017/174657: ST41-phos: DMTN Oo Jd kh ME CA honor DMTN OS o ST41 - phos ST23-phos: OAc OAc dh À CA) AcO Mana EN ST23-phos Síntese de fitas duplas
[0267] A fim de obter os conjugados de fita dupla, fitas simples individuais necessárias são dissolvidas em uma concentração de 60 OD/mL em
H2O0. Ambas as soluções oligonucleotídicas individuais podem ser adicionadas juntas a um recipiente reacional. Para o monitoramento da reação, uma titulação pode ser realizada. A primeira fita é adicionada em excesso de 25% sobre a segunda fita, conforme determinado por absorção de UV a 260 nm. A mistura de reação é aquecida, por exemplo, a 80ºC durante 5 minutos e depois arrefecida lentamente à RT. A formação de fita dupla pode ser monitorada por HPLC de fase reversa de pareamento de íons. A partir da área UV da fita simples residual, a quantidade necessária da segunda fita pode ser calculada e adicionada à mistura de reação. A reação é aquecida, por exemplo, à 80ºC novamente e lentamente arrefecida à RT. Este procedimento pode ser repetido até que menos de 10% da fita simples residual seja detectado.
[0268] O ácido nucleico conforme descrito neste documento pode ser formulado com um lipídeo na forma de um lipossomo. Essa formulação pode ser descrita na técnica como um lipoplex. A composição com um lipídio/lipossoma pode ser utilizada para auxiliar na transmissão do ácido nucleico da invenção às células alvo. O sistema de transmissão de lipídios descrito neste documento pode ser usado como uma alternativa a um ligante conjugado. As modificações descritas neste documento podem estar presentes quando se utiliza o ácido nucleico da invenção com um sistema de transmissão de lipídios ou com um sistema de transmissão de conjugado de ligantes.
[0269] Tal lipoplex pode compreender uma composição lipídica compreendendo: i) um lipídio catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; ili) um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídio PEGuilado.
O lipídio catiônico pode ser um lipídio amino catiônico.
O lipídio catiônico pode ter a fórmula (XIX):
o o 1 R
NADA AN de NH, NH, dk (XIX) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que: X representa O, S ou NH; R' e R? representam cada um independentemente uma cadeia alquil C4-C22 linear ou ramíificada ou uma cadeia alquenil C4-C22 linear ou ramificada com uma ou mais ligações duplas, em que a cadeia alquil ou alquenil opcionalmente contém opcionalmente um éster, amida ou dissulfeto; quando X representa S ou NH, Rº e Rº representam cada um independentemente hidrogênio, metil, etil, uma fração mono- ou poliamina, ou Rº e Rº juntos formam um anel heterociclil; quando X representa O, Rº e Rº representam cada um independentemente hidrogênio, metil, etil, uma fração mono- ou poliamina, ou Rº e Rº juntos formam um anel heterociíclil ou Rº representa hidrogênio e Rº representa C(NH)(NH>2).
[0270] O lipídio catiônico pode ter a fórmula (XIXA): o o MODO EDS ESIOSIOSIODA, den NE ANANDA à oo (XIXA) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[0271] O lipídio catiônico pode ter a fórmula (XIXB): — — o o OIE DIOSIODIOD0A, A. Ás NENE AANAAOA ma o, (XIXB) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[0272] O conteúdo do componente lipídico catiônico pode ser de cerca de 55% molar a cerca de 65% molar do conteúdo lipídico total da composição. Em particular, o componente lipídico catiônico é cerca de 59% molar do conteúdo lipídico total da composição.
[0273] As composições podem ainda compreender um esteroide. O esteroide pode ser colesterol. O conteúdo do esteroide pode ser de cerca de 26% molar a cerca de 35% molar do conteúdo lipídico total da composição lipídica. Mais particularmente, o conteúdo de esteroide pode ser cerca de 30% molar do conteúdo lipídico total da composição lipídica.
[0274] O fosfolipídio de fosfatidiletanolamina pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2-diftananoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhyPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoil -sn- glicero-3-fosfoetanolamina = (DSPE), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLPE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE), 1,2- Dipalmitoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1,2-Dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLOPE), 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), 1,2-Dierucoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), 1,2-Disqualeoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DSQPE) e 1-Estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (SLPE) O teor do fosfolipídio pode ser de cerca de 10% molar do conteúdo lipídico geral da composição.
[0275] O lipídeo PEGuilado pode ser selecionado do grupo que consiste em 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietilenoglicol (DMG-PEG) e C16- Ceramida-PEG. O teor do lipídeo PEGuilado pode ser de cerca de 1 a 5% molar do conteúdo lipídico geral da composição.
[0276] O teor do componente lipídico catiônico na composição pode ser de cerca de 55% molar a cerca de 65% molar do teor lipídico geral da formulação lipídica, preferencialmente cerca de 59% molar do teor lipídico total da composição lipídica.
[0277] A composição pode ter uma razão molar dos componentes de i):ii):li):iv) selecionados dentre 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1;
59:30:10:1; / 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; e 65:24:10:1.
[0278] A composição pode compreender um lipídio catiônico tendo a estrutura TIAGO ; Lu fo AO o um esteroide tendo a estrutura ap Colesterol rol um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina tendo a estrutura Ad ANA q CT Dor, DS sds sd di dl o 9 DPhyPE e um lipídio PEGuilado tendo a estrutura
À
OO OCO P O o No A o SO O O MO n MPEG-2000-DMG
[0279] As composições de lipossomas neutros podem ser formadas a partir de, por exemplo, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). As composições de lipossomas aniônicos podem ser formadas a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, enquanto que os lipossomos fusogênicos aniônicos podem ser formados principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossômica pode ser formado a partir de fosfatidilcolina (PC), como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídio e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[0280] Um lipídio catiônico sintético carregado positivamente, cloreto de N-[1- (2,3-dioleiloxi)propil]-N,N N-trimetilamônio (DOTMA) pode ser usado para formar pequenos lipossomos que interagem espontaneamente com o ácido nucleico para formar complexos de ácidos nucleicos e lipídios que são capazes de se fundir com os lipídios carregados negativamente das membranas celulares das células de cultura de tecidos. Os análogos do DOTMA também podem ser utilizados para formar lipossomas.
[0281] Derivados e análogos de lipídios descritos neste documento também podem ser usados para formar lipossomas.
[0282] Um lipossoma contendo um ácido nucleico pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente lipídico de um lipossoma é dissolvido em um detergente, de modo a formar micelas com o componente lipídico. Por exemplo, o componente lipídico pode ser um lipídeo catiônico anfipático ou conjugado lipídico. O detergente pode ter uma alta concentração crítica de micelas e pode ser não iônico. Detergentes exemplares incluem colato, CHAPS, octilglucósido, desoxicolato e lauroil sarcosina. À preparação de ácido nucleico é então adicionada às micelas que incluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos no lipídio interagem com o ácido nucleico e condensam-se em torno do ácido nucleico para formar um lipossomo. Após a condensação, o detergente é removido, por exemplo, por diálise, para produzir uma preparação lipossômica de ácido nucleico.
[0283] Se necessário, um composto carreador que auxilia na condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, por adição controlada. Por exemplo, o composto carreador pode ser um polímero que não seja um ácido nucleico (por exemplo, espermina ou espermidina). O pH também pode ser ajustado para favorecer a condensação.
[0284] Formulações de ácido nucleico podem incluir um surfactante. Em uma modalidade, o ácido nucleico é formulado como uma emulsão que inclui um surfactante.
[0285] Um surfactante que não é ionizado é um surfactante não iônico. Exemplos incluem ésteres não iônicos, como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de gliceril etc., alcanolamidas não iônicas e éteres como etoxilatos de álcool graxo, álcoois propoxilados e polímeros em bloco etoxilados/propoxilados.
[0286] Um surfactante que carrega uma carga negativa quando dissolvido ou disperso em água é um surfactante aniônico. Exemplos incluem carboxilatos, como sabões, acil-lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico, como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos como alquilbenzeno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfossuccinatos e fosfatos.
[0287] Um surfactante que carrega uma carga positiva quando dissolvido ou disperso em água é um surfactante catiônico. Exemplos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas.
[0288] Um surfactante que tem a capacidade de transportar uma carga positiva ou negativa é um surfactante anfotérico. Exemplos incluem derivados do ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetainas e fosfatidas.
[0289] "Micelas" são definidas neste documento como um tipo particular de conjunto molecular no qual moléculas anfipáticas estão dispostas em uma estrutura esférica de modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas sejam direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa circundante. O arranjo inverso existe se o ambiente for hidrofóbico.
Uma micela pode ser formada misturando uma solução aquosa do ácido nucleico, um alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um composto formador de micela.
[0290] Exemplos de compostos formadores de micelas incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido lático, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, mono-oleína, monooleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de prímula, mentol, tri-hidroxi oxo colanilglicina e seus sais farmaceuticamente aceitáveis deste, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e seus análogos, éteres de polidocanol alquil e seus análogos, quenodesoxicolato, desoxicolato e suas misturas.
[0291] Fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados à composição micelar mista para atuar como estabilizador e conservante. Um agente isotônico como a glicerina pode ser adicionado.
[0292] Uma preparação de ácido nucleico pode ser incorporada em uma partícula tal como uma micropartícula. As micropartículas podem ser produzidas por secagem por pulverização, liofilização, evaporação, secagem em leito fluidizado, secagem a vácuo ou uma combinação desses métodos.
[0293] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção. As composições farmacêuticas podem ser usadas como medicamentos ou como agentes de diagnóstico, sozinhos ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção pode ser combinado com um veículo de transmissão (por exemplo, lipossomas) e excipientes, como transportadores, diluentes. Outros agentes, como conservantes e estabilizadores, também podem ser adicionados. Os métodos para a transmissão de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica e dentro do conhecimento do versado na técnica.
[0294] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção também pode ser administrado em combinação com outros compostos terapêuticos, administrados separadamente ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada. A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos conjugados de acordo com a presente invenção em um excipiente fisiologicamente/farmaceuticamente — aceitáve,. “como um estabilizador, conservante, diluente, tampão e semelhantes.
[0295] A composição farmacêutica pode ser especialmente formulada para administração na forma sólida ou líquida. A composição pode ser formulada para administração oral, administração parentérica (incluindo, por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou peridural), aplicação tópica, administração intravaginal ou intrarretal, administração sublingual, administração ocular, administração transdérmica ou administração nasal. A administração utilizando métodos subcutâneos ou intravenosos é preferida.
[0296] Os níveis de dosagem para o medicamento e as composições farmacêuticas da invenção podem ser determinados pelos versados na técnica por experimentação de rotina. Em uma modalidade, uma dose unitária pode conter entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg de peso corporal de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado. Alternativamente, a dose pode ser de 10 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, ou 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, ou 0,05 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg de peso corporal, ou 0,5 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Os níveis de dosagem também podem ser calculados através de outros parâmetros, como, por exemplo, área da superfície corporal.
[0297] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou solução aquosa injetável estéril, ou em uma forma liofiizada. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode compreender lipoplexos liofilizados ou uma suspensão aquosa de lipoplexos. Os lipoplexos compreendem preferencialmente um ácido nucleico da presente invenção. Tais lipoplexos podem ser utilizados para transmitir o ácido nucleico da invenção a uma célula alvo in vitro ou in vivo.
[0298] As composições farmacêuticas e medicamentos da presente invenção podem ser administrados a um sujeito mamífero em uma dose farmaceuticamente eficaz. O mamífero pode ser selecionado entre seres humanos, cães, gatos, cavalos, gado, porco, cabra, ovelha, camundongo, rato, hamster e porquinho-da-índia.
[0299] Um outro aspecto da invenção refere-se a um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio. A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais moléculas de RNAi de acordo com a presente invenção em um excipiente fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável, como um estabilizador, conservante, diluente, tampão e semelhantes.
[0300] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou solução aquosa injetável estéril, ou em uma forma liofilizada.
[0301] As — composições — farmaceuticamente —* aceitáveis — podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ácido nucleico em qualquer modalidade de acordo com a invenção, tomada isoladamente ou formulada com um ou mais carreadores, excipiente e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
[0302] Exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, como glicose, lactose e sacarose; (2) amidos, tais como o amido de milho e fécula de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes de lubrificação, tais como o estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, como manteiga de cacau e ceras de supositório; (9) óleos, como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, como o propileno glicol; (11) polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como o oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes tamponadores, tais como o hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, como polipeptídeos e aminoácidos (23) componente sérico, tais como albumina sérica, HDL e LDL; e (22) outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas.
[0303] Os estabilizadores podem ser agentes que estabilizam o agente de ácido nucleico, por exemplo uma proteína que pode complexar com o ácido nucleico, quelantes (por exemplo, EDTA), sais, inibidores de RNAse e inibidores de DNAse.
[0304] Em alguns casos, é desejável retardar a absorção do fármaco da injeção subcutânea ou intramuscular, a fim de prolongar o efeito de um fármaco. Isso pode ser alcançado pela utilização de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com baixa solubilidade em água. A taxa de absorção do fármaco depende de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Em alternativa, a absorção retardada de uma forma de fármaco administrada parentericamente é obtida por dissolução ou suspensão do fármaco em um veículo oleoso.
[0305] O ácido nucleico descrito neste documento pode ser capaz de inibir a expressão de um gene alvo em uma célula. O ácido nucleico descrito neste documento pode ser capaz de inibir parcialmente a expressão de um gene alvo em uma célula. A inibição pode ser completa, ou seja, 0% do nível de expressão de expressão gênica alvo na ausência do ácido nucleico da invenção. A inibição da expressão gênica alvo pode ser parcial, ou seja, pode ser 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% da expressão gênica alvo na ausência de um ácido nucleico da invenção. A inibição pode durar 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas ou até 3 meses, quando usada em um sujeito, como um sujeito humano. O ácido nucleico ou composição compreendendo a composição de ácido nucleico pode ser usado uma vez, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas ou a cada oito semanas. O ácido nucleico pode ser para uso subcutâneo, intravenoso ou usando qualquer outra via de aplicação, como oral, retal ou intraperitoneal.
[0306] Em células e/ou sujeitos tratados com ou recebendo o ácido nucleico da presente invenção, a expressão gênica alvo pode ser inibida em comparação com células e/ou sujeitos não tratados em pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100%. O nível de inibição pode permitir o tratamento de uma doença associada à expressão ou superexpressão do gene alvo, ou pode permitir uma investigação adicional sobre as funções do produto gênico alvo.
[0307] O gene alvo pode ser Fator VII, Eg5, POSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, gene beta PDGF, gene Erb-B, gene Src, gene CRK, gene GRB2, gene RAS, gene MEKK, gene JNK, gene RAF, gene Erkl/2, gene PCNA(p21), gene MYB, gene JU, gene FOS, gene BCL-2, hepcidina, proteína ativada C, gene ciclina D, gene VEGF, gene EGFR, gene ciclina A, gene ciclina E, Gene WNT-1, gene beta-catenina, gene c-MET, gene PKC, gene NFKB, gene STAT3, gene survivina, gene Her2/Neu, gene da topoisomerase |, gene alfa da topoisomerase Il, mutações no gene p73, mutações no gene p21(WAF I/CIPI), mutações no gene p27(KIPI), mutações no gene PPM ID, mutações no gene RAS, mutações no gene caveolina |, mutações no gene MIB |, mutações no gene MTAI, mutações no gene M68, mutações nos genes supressores de tumores e mutações no gene supressor de tumores p53.
[0308] Um outro aspecto da invenção refere-se a um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção na fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio.
[0309] Também está incluído na invenção um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, conforme descrito neste documento, a um indivíduo que necessite de tratamento. A composição de ácido nucleico pode ser administrada uma vez, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas ou a cada oito semanas. O ácido nucleico pode ser administrado ao sujeito por via subcutânea, intravenosa ou usando quaisquer outras vias de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal.
[0310] Em uma modalidade, é administrada a um sujeito uma dose inicial e uma ou mais doses de manutenção de um agente de ácido nucleico. À dose ou doses de manutenção podem ser iguais ou inferiores à dose inicial, por exemplo, metade a menos da dose inicial. As doses de manutenção são, por exemplo, administradas não mais que uma vez a cada 2, 5, 10 ou 30 dias. O regime de tratamento pode durar um período de tempo que varia dependendo da natureza da doença em particular, sua gravidade e a condição geral do paciente.
[0311] Em uma modalidade, a composição inclui uma pluralidade de espécies de agentes de ácidos nucleicos. Em outra modalidade, a espécie de agente de ácido nucleico possui sequências que não se sobrepõem e não são adjacentes a outra espécie em relação a uma sequência alvo de ocorrência natural. Em outra modalidade, a pluralidade de espécies de agentes de ácido nucleico é específica para diferentes genes alvo de ocorrência natural. Em outra modalidade, o agente de ácido nucleico é específico do alelo.
[0312] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção também pode ser administrado ou para uso em combinação com outros compostos terapêuticos, administrados separadamente ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada.
[0313] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção pode ser produzido usando métodos de rotina na técnica, incluindo síntese química ou expressão do ácido nucleico in vitro (por exemplo, transcrição "run-off") ou in vivo. Por exemplo, usando síntese química em fase sólida ou usando um vetor de expressão. Em uma modalidade, o vetor de expressão pode produzir o ácido nucleico da invenção em uma célula alvo.
[0314] Os métodos para a síntese do ácido nucleico descritos neste documento são conhecidos dos versados na técnica.
[0315] Os compostos exemplares foram sintetizados de acordo com os métodos conhecidos pelo versado na técnica. A montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos de construção de ligantes foi realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita. O Esquema 1 mostra a amidita tripla ("trebler") C4xlt-phos e a amidita GalNAc (ST23-phos) necessária para montar o cluster trivalente semelhante à árvore GalNAc durante a síntese de oligonucleotídeos em fase sólida. A síntese de C4XLT-phos, bem como ST23- phos, pode ser realizada conforme descrita em WO2017/174657.
DMTNIA A DMITRI AN hd A PE OCA A a ME OCO Ao e DMTIIAN No vY DMTI9AN No STKS Cca4xLT OAc oro AA oo Ao sT23
[0316] Esquema 1: Estruturas de amiditas triplas ("trebler") e amiditas GalNAc utilizadas na conjugação em coluna de clusters de GalNAc trivalentes semelhantes a árvores.
[0317] A síntese de oligonucleotídeos do siRNA conjugado com cluster de GalNAc semelhante à árvore é descrita no esquema 2 mostrado na Figura 11.
[0318] A montagem da cadeia de oligonucleotídeos pode ser iniciada usando suporte carregado com base, por exemplo, 5'DMT-2'FdU-succinato-lcaa- CPG como no composto exemplar A0149 (STS12009V15L4B). Para a introdução da primeira ligação do fosfoditioato, o ciclo de acoplamento da síntese de fosforamidita consistindo em 1) remoção da DMT, 2) alongamento da cadeia usando o tiofosfoamidito mascarado com DMT, 3) capping de cadeias oligonucleotídicas não alongadas, seguido de oxidação do P(III) a P(V) EDITH e novamente caping (Cap/Thio/Cap). Posteriormente, o ciclo de síntese pode ser repetido usando DMT-fosfoamiditas padrão e Cap/Ox/Cap ou Cap/Thio/Cap, dependendo se a ligação fosfodiéster ou fosforotioato é desejada até que o produto seja atingido por completo. Para a conjugação na coluna de um cluster de GalNAc trivalente semelhante à árvore, o mesmo ciclo de síntese pode ser aplicado com o uso da amidita C4XLT ramificada trivalente necessária, seguido de outra rodada do ciclo de síntese usando a amidita ST23 de GalNAc. Após a conclusão desta última etapa de sintetização, o oligonucleotídeo pode ser clivado do suporte sólido e libertado de grupos protetores adicionais por tratamento com metilamina (na presença de 20 mM DTT se houver ligações de fosforoditioato). O produto bruto pode ser então purificado por AEX-HPLC aplicando um gradiente de NaCl. O excesso de sal da purificação de IEX foi removido por SEC para produzir o produto final.
[0319] Todos os produtos finais de fita simples foram analisados por AEX-HPLC para provar sua pureza. A pureza é dada em %FLP (% de produto de comprimento total), que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise AEX-HPLC do produto final. A identidade dos respectivos produtos de fita simples (oligonucleotídeos conjugados com GalNAc ou não modificados) pode ser provada por análise por LC-MS.
[0320] A formação duplex do siRNA de fita dupla pode ser alcançada por adição equimolar das respectivas fitas simples e aquecimento a 80ºC. O arrefecimento lento para RT pode resultar na formação completa de fita dupla. A formação duplex pode ser seguida por IP-RP-HPLC (HPLC de fase reversa de emparelhamento de íons). A pureza da fita dupla é dada em % de fita dupla, que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise IP-RP-HPLC.
[0321] A invenção também fornece um ácido nucleico de acordo com qualquer aspecto da invenção descrita neste documento, em que a primeira fita de RNA possui um nucleotídeo terminal (E)-vinilfosfonato 5', e o nucleotídeo terminal (E)-vinilfosfonato 5' está ligado ao segundo nucleotídeo na primeira fita por uma ligação fosfodiéster.
[0322] Em uma modalidade, a primeira fita pode incluir mais de 1 ligação fosfodiéster.
[0323] Em uma modalidade, a primeira fita pode compreender ligações fosfodiéster entre pelo menos os três nucleotídeos terminais 5'.
[0324] Em uma modalidade, a primeira fita pode compreender ligações fosfodiéster entre pelo menos os quatro nucleotídeos terminais 5'.
[0325] Em uma modalidade, a primeira fita pode compreender a fórmula (XVII): (vp)-N(po)[N(po)]n- (XVII) onde '(vp) - é o (E)-vinilfosfonato 5', 'N' é um nucleotídeo, 'po' é uma ligação fosfodiéster e n é de 1 a (o número total de nucleotídeos na primeira fita - 2), preferencialmente em que n é de 1 a (o número total de nucleotídeos na primeira fita -3), mais preferencialmente em que n é de 1 a (o número total de nucleotídeos na primeira fita -4).
[0326] Em uma modalidade, a primeira fita pode incluir pelo menos uma ligação de fosforotioato (ps).
[0327] Em uma modalidade, a primeira fita pode ainda a compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos 3' terminais ou ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos 3' terminais.
[0328] Em uma modalidade, as ligações entre os outros nucleotídeos na primeira fita são ligações fosfodiéster.
[0329] Em uma modalidade, a primeira fita pode incluir mais de 1 ligação fosforotioato.
[0330] Ainda Em uma modalidade, a segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos 3' terminais ou ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos 3' terminais.
[0331] Em outra modalidade adicional a segunda fita pode compreender uma ligação fosforotioato entre os dois nucleotídeos terminais 5' ou ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais 5'.
[0332] Em uma modalidade, o nucleotídeo terminal (E)-vinilfosfonato 5' é um nucleotídeo RNA.
[0333] Um nucleotídeo terminal (E)-vinilfosfonato 5' é um nucleotídeo em que o grupo fosfato natural na extremidade 5' foi substituído por um E- vinilfosfonato, no qual o átomo de ponte de oxigênio 5' do nucleotídeo terminal da fita fosforilada 5' é substituído por um grupo metinil (-CH=):
[0334] Nucleotídeos com fosfato natural na extremidade 5' o o Pp? "Ol Pp Y Ox Base O OM: o=P-O" o ê
[0335] Nucleotídeo com um E-vinilfosfonato na extremidade 5' o. * DP. Base o OMe o=P-0 o z
[0336] O (E) vinilfosfonato 5' é um imitador de fosfato 5'. Uma imitação biológica é uma molécula capaz de desempenhar a mesma função e é estruturalmente muito semelhante à molécula original que está sendo imitada. No contexto da presente invenção, o (E) vinilfosfonato 5' imita a função de um fosfato 5' normal, por exemplo, permitindo carregamento eficiente de RISC. Além disso,
devido à sua estrutura ligeiramente alterada, o (E) vinilfosfonato 5' é capaz de estabilizar o nucleotídeo da extremidade 5', protegendo-o da desfosforilação por enzimas como as fosfatases.
[0337] Um aspecto da invenção é um ácido nucleico conforme divulgado neste documento para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene alvo, em que a referida primeira fita inclui nucleotídeos modificados ou nucleotídeos não modificados em uma pluralidade de posições para facilitar o processamento do ácido nucleico por RISC.
[0338] Em um aspecto, "facilitar o processamento por RISC" significa que o ácido nucleico pode ser processado por RISC, por exemplo, qualquer modificação presente permitirá que o ácido nucleico seja processado por RISC, adequadamente de modo que a atividade de siRNA possa ocorrer.
[0339] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 13 da primeira fita não é modificada com uma modificação O-metil 2'.
[0340] Um nucleotídeo na segunda fita que "corresponde a" uma posição na primeira fita é adequadamente o nucleotídeo que forma um par de bases com esse nucleotídeo na primeira fita.
[0341] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 13 da primeira fita é o nucleotídeo que forma um par de bases com a posição 13 da primeira fita.
[0342] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 11 da primeira fita é o nucleotídeo que forma um par de bases com a posição 11 da primeira fita.
[0343] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 12 da primeira fita é o nucleotídeo que forma um par de bases com a posição 12 da primeira fita.
[0344] Esta nomenclatura pode ser aplicada a outras posições da segunda fita. Por exemplo, em um ácido nucleico de 19-meros que é de fita dupla e de ponta cega, a posição 13 da primeira fita seria pareada com a posição 7 da segunda fita. A posição 11 da primeira fita seria pareada com a posição 9 da segunda fita. Esta nomenclatura pode ser aplicada a outras posições da segunda fita.
[0345] O nucleotídeo que corresponde à posição 13 da primeira fita é adequadamente a posição 13 da segunda fita, contando a partir de 3' da segunda fita, partindo do primeiro nucleotídeo da região de fita dupla. Da mesma forma, a posição 11 da segunda fita é adequadamente o 11º nucleotídeo a partir de 3' da segunda fita, iniciando no primeiro nucleotídeo da região de fita dupla. Esta nomenclatura pode ser aplicada a outras posições da segunda fita.
[0346] Em um aspecto, no caso de uma primeira e segunda fitas parcialmente complementares, o nucleotídeo na segunda fita que "corresponde a" uma posição na primeira fita pode não necessariamente formar um par de bases se essa posição for a posição em que há uma incompatibilidade, mas o princípio da nomenclatura ainda se aplica.
[0347] Uma primeira e segunda fita preferidas são totalmente complementares sobre a região duplex (ignorando quaisquer regiões overhang) e não há incompatibilidades dentro da região de fita dupla do ácido nucleico.
[0348] Também são preferidos:
[0349] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 11 da primeira fita não é modificada com uma modificação O-metil 2',
[0350] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11 e 13 da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[0351] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 12 da primeira fita não é modificado com uma modificação O-metil 2'. Esta limitação no ácido nucleico pode ser vista com qualquer outra limitação descrita neste documento.
[0352] Portanto, outro aspecto da invenção é um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11 - 13 da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[0353] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2'.
[0354] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13 ou 11-13 da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[0355] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2'.
[0356] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O-metil 2', como superior a 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85%, ou mais, da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O- metil 2', preferenciamente medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita.
[0357] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação de RNA que ocorre naturalmente, tal como em que mais de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85% ou mais da primeira e/ou segunda fitas compreendem essa modificação, de preferência medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita. Modificações apropriadas que ocorrem naturalmente incluem, bem como O-metil 2', outras modificações de açúcar 2', em particular uma modificação H 2' resultando em um nucleotídeo de DNA.
[0358] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, como não mais que 15%, como mais que 10%, de nucleotídeos que possuem modificações 2' que não são modificações O metil 2' na primeira e/ou segunda fita, de preferência como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fitas.
[0359] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, (como não mais que 15% ou não mais que 10%) de modificações de 2' fluoro na primeira e/ou segunda fita, preferencialmente como uma porcentagem do total de nucleotídeos de ambas as fitas.
[0360] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos são modificados com uma modificação O-metil 2', exceto as posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11 ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita. Preferencialmente, os nucleotídeos que não são modificados com O- metil 2' são modificados com fluoro na posição 2'.
[0361] É preferido um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos do ácido nucleico são modificados na posição 2' do açúcar. De preferência, estes nucleotídeos são modificados com uma modificação 2'-fluoro em que a modificação não é uma modificação O-metil
2.
[0362] Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados na posição 2' com um H 2' e, portanto, tendo um nucleotídeo de DNA dentro do ácido nucleico. Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender nucleotídeos de DNA nas posições 2 e/ou 14 da primeira fita contando a partir da extremidade 5' da primeira fita, Os ácidos nucleicos podem compreender nucleotídeos de DNA na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita.
[0363] Em um aspecto, não existe mais do que um DNA por ácido nucleico da invenção.
[0364] Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender um ou mais nucleotídeos de LNA. Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender nucleotídeos de LNA nas posições 2 e/ou 14 da primeira fita contando a partir da extremidade 5' da primeira fita. Os ácidos nucleicos podem compreender LNA na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita.
[0365] Em um aspecto, o ácido nucleico é modificado na primeira fita com modificações 2-O metil e modificações 2 fluoro alternadas, e as posições 2 e 14 (a partir da extremidade 5') são modificadas com 2' fluoro. Preferencialmente, a segunda fita é modificada com modificações de 2' fluoro nos nucleotídeos da segunda fita, que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 ou 13 ou 11-13 da primeira fita. De preferência, a segunda fita é modificada com modificações de 2' fluoro nas posições 11-13, contando a partir da extremidade 3', começando na primeira posição da região complementar (fita dupla), e as modificações restantes são modificações que ocorrem naturalmente, preferencialmente O-metil 2'.
[0366] Em um aspecto, o ácido nucleico da invenção compreende um ou mais ribonucleotídeos invertidos, preferencialmente uma adenina invertida, usando uma ligação 5'-5' ou uma ligação 3'-3', de preferência uma ligação 3'-3' na extremidade 3' da segunda fita.
[0367] Em um aspecto, o ácido nucleico compreende uma ou mais ligações de fosforoditioato, tais como ligações de 1, 2, 3 ou 4 fosforoditioato. De preferência, existem até 4 ligações de fosforoditioato, cada uma nas extremidades 5' e 3' da primeira e segunda fitas.
[0368] Todas as características dos ácidos nucleicos podem ser combinadas com todos os outros aspectos da invenção divulgados neste documento.
[0369] Em particular, são preferidos os ácidos nucleicos que são moléculas de SiRNA em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2, e o ácido nucleico compreende um ou mais ou todos do: (i) um nucleotídeo invertido, de preferência uma ligação 3'-3' na extremidade 3' da segunda fita; (ii) uma ou mais ligações fosforoditioato; (iii) o nucleotídeo da segunda fita correspondente à posição 11 ou 13 da primeira fita não é modificado com uma modificação O-metil 2', preferencialmente em que uma ou ambas as posições compreendem uma modificação 2' fluoro; (iv) o ácido nucleico compreende pelo menos 80% de todos os nucleotídeos possuindo uma modificação 2'-O-metil; (v) o ácido nucleico compreende não mais que 20% de nucleotídeos que possuem modificações de 2' fluoro.
[0370] Também é fornecido pela presente invenção um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7 - 9 da extremidade 5' da segunda fita é modificada com uma modificação de 2' fluoro e pelo menos 90% dos nucleotídeos restantes são modificados com 2'-O metil ou compreendem outra modificação 2' de que ocorre naturalmente.
[0371] Exemplos preferidos específicos, para um ácido nucleico de 19 bases de fita dupla cega, sem overhang, são:
[0372] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2' e o nucleotídeo na posição 7 da extremidade 5' da segunda fita não é modificada com uma modificação O-metil
2.
[0373] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2' e o nucleotídeo na posição 9 da extremidade 5' da segunda a fita não é modificada com uma modificação O- metil 2'
[0374] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na posição 7 e 9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação O-metil 2',
[0375] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2' e os nucleotídeos na posição 7 - 9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação O-metil 2',
[0376] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7-9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação 2' fluoro.
[0377] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação 2' fluoro e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7 - 9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[0378] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação 2' fluoro e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7-9 da extremidade 5' da segunda fita são modificados com uma modificação 2' fluoro.
[0379] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O-metil 2', como superior a 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85%, ou mais, da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O- metil 2', preferenciamente medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita.
[0380] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação de RNA que ocorre naturalmente, tal como em que mais de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85% ou mais da primeira e/ou segunda fitas compreendem essa modificação, de preferência medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita. Modificações apropriadas que ocorrem naturalmente incluem, bem como O-metil 2', outras modificações de açúcar 2', em particular uma modificação H 2' resultando em um nucleotídeo de DNA.
[0381] UM ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, como não mais que 15%, como mais que 10%, de nucleotídeos que possuem modificações 2' que não são modificações O metil 2' na primeira e/ou segunda fita, de preferência como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fitas.
[0382] UM ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, (como não mais que 15% ou não mais que
10%) de modificações de 2' fluoro na primeira e/ou segunda fita, preferencialmente como uma porcentagem do total de nucleotídeos de ambas as fitas.
[0383] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos são modificados com uma modificação O-metil 2', exceto as posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9 da extremidade 5' da segunda fita. Preferencialmente, os nucleotídeos que não são modificados com O-metil 2' são modificados com fluoro na posição 2'.
[0384] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos são modificados com uma modificação O-metil 2', exceto as posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos nas posições 7 - 9 da extremidade 5' da segunda fita. Preferencialmente, os nucleotídeos que não são modificados com O-metil 2' são modificados com fluoro na posição 2',
[0385] Para um ácido nucleico compreendendo uma região duplex de pares de bases, a segunda fita preferencialmente não possui um grupo O-metil 2' nos nucleotídeos 8 ou 9 ou 10 contados a partir da extremidade 5' do duplex correspondente às posições 13, 12 e 11 da primeira fita, respectivamente.
[0386] Para um ácido nucleico compreendendo uma região dúplex de 21 pares de bases, a segunda fita preferencialmente não possui um grupo O-metil 2' nos nucleotídeos 9 ou 10 ou 11 contando a partir da extremidade 5' do duplex correspondente às posições 13, 12 e 11 da primeira fita, respectivamente.
[0387] A presente invenção também se refere às sequências não modificadas de todas as sequências modificadas divulgadas neste documento.
[0388] A invenção será descrita agora tendo como referência as figuras e exemplos não limitativos a seguir, nos quais:
[0389] A Figura 1 mostra os resultados de um ensaio de estabilidade sérica de conjugados GalNAC-siRNA contendo dois fosforotioatos (PS), um PS, dois fosforoditioatos (PS2) e um PS2 nas posições terminais;
[0390] A Figura 2 mostra os resultados de um ensaio de estabilidade sérica de conjugados GalNAc-siRNA contendo dois PS, um PS, dois PS2 e um PS2 em posições terminais sem PS na fração GalNAc;
[0391] A Figura 3 mostra os resultados de um ensaio de estabilidade sérica de conjugados GalNAc-siRNA contendo um PS2 em extremidades individuais;
[0392] A Figura 4 mostra a atividade de conjugados GalNAc-siRNA contendo um PS2 em extremidades individuais;
[0393] A Figura 5 mostra os resultados do ensaio de estabilidade sérica de um conjugado GalNAC-siRNA contendo cada um PS2 na segunda extremidade 5' e na segunda extremidade 3' sem PS na fração ligante;
[0394] A Figura 6 mostra a atividade de um conjugado GalNAC-siRNA contendo cada um PS2 na segunda extremidade 5' e na segunda extremidade 3' sem PS na fração GalNAc;
[0395] A Figura 7 mostra sequências conjugadas de siRNA contendo PS2 em diferentes terminais de siRNA, juntamente com porções GalNAc sem PS interno;
[0396] A Figura 8 mostra a estabilidade sérica de conjugados GalNAc SIiRNA com PS2 em diferentes terminais siRNA, juntamente com porções GalNAc sem PS interno;
[0397] A Figura 9 mostra a atividade in vitro de conjugado GalNAc SIiRNA com PS2 em diferentes terminais siRNA, juntamente com porções GalNAc sem PS interno;
[0398] A Figura 10 mostra um diagrama de fluxo de síntese de oligonucleotídeos conjugados com GalNAc trivalentes semelhantes à árvore, contendo uma ligação de fosforoditioato;
[0399] A Figura 11 mostra um fluxograma de síntese de outros oligonucleotídeos conjugados com GalNAc trivalentes semelhantes à árvore contendo uma ligação de fosforoditioato;
[0400] A Figura 12 mostra a atividade de redução de mMRNA in vivo de conjugados de GalNAc siRNA com PS2 em diferentes terminais de siRNA;
[0401] A Figura 13 mostra a atividade de redução de ferro sérico in vivo dos conjugados de GalNAc siRNA com PS2 em diferentes terminais siRNA;
[0402] A Figura 14 mostra a atividade in vitro de conjugado GalNAc SiRNA com PS2 e PS em diferentes terminais siRNA, juntamente com frações GalNAc sem PS interno.
[0403] A Figura 15 mostra a atividade de conjugados de siRNA com cada GalNAc ligado ao serinol na extremidade 5' e 3' da segunda fita e com fosforoditioatos terminais.
[0404] A Figura 16 mostra representações esquemáticas de diversas modalidades de ácidos nucleicos conjugados com ligantes por meio de ligantes peptídicos.
[0405] Exemplos
[0406] Exemplo 1
[0407] Procedimentos Gerais
[0408] Modificação de siRNA: síntese de siRNA com ligações de fosforotioato (PS) ou fosforoditioato (PS2).
[0409] Os compostos exemplares foram sintetizados de acordo com os métodos descritos abaixo e métodos conhecidos do versado na técnica. À montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos de construção de ligantes peptídicos foi realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita.
[0410] A síntese, desproteção e purificação de oligonucleotídeos seguiram procedimentos padrão que são conhecidos na técnica.
[0411] Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados em um sintetizador oligopilot AKTA usando química padrão de fosforamidita. Suporte sólido disponível comercialmente e fosforamiditas de RNA 2'O-metil, 2'Fluoro, RNA fosforamiditas 2'Desoxi (toda a proteção padrão, ChemGenes, LinkTech) e tiofosfoarmiditas (AM Biotech, GlenResearch) foram utilizados de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante.
[0412] A síntese dos derivados de fosforamidita de ST41 (ST41-phos), bem como ST23 (ST23-phos) pode ser realizada conforme descrito em WO?2017/174657: ST41-phos: DMTN Oo Ad kh ME CA ahora DMTN OO o ST41 - phos ST23-phos: OAc OAc Ah À CA) AcO Ro Mono EN ST23-phos
[0413] Reagentes auxiliares foram adquiridos da EMP Biotech. A síntese foi realizada usando solução de 0,1 M fosforamidita em acetonitrila seca e benziltiotetrazol (BTT) foi usado como ativador (0,3 M em acetonitrila). O tempo de acoplamento foi de 15 min. Foi aplicado um ciclo Cap/OX/Cap ou Cap/Tio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/Lutidina/Acetonitrila, Oxidador: 0,1M |2 em piridina/H2O0). Os fosforotioatos e fosforoditioatos foram introduzidos utilizando 50 MM EDITH em acetonitrila. Todos os outros reagentes e solventes estavam disponíveis comercialmente e foram utilizados na qualidade padrão de reagente.
[0414] A clivagem por DMT foi obtida por tratamento com ácido dicloroacético a 3% em tolueno. Após a conclusão dos ciclos de síntese programados, foi realizada uma lavagem com dietilamina (DEA). Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados no modo DMT -off.
[0415] As fitas simples foram clivadas do CPG em tratamento com metilamina 40% aq. O oligonucleotídeo bruto resultante foi purificado por cromatografia de troca iônica (Recurso Q, 6 mL, GE Healthcare) em um sistema
AKTA Pure HPLC usando um gradiente de cloreto de sódio. As frações que contêm o produto foram agrupadas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão de tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e liofilizadas.
Síntese de Oligonucleotídeos
[0416] Todos os oligonucleotídeos de fita simples foram sintetizados de acordo com as condições de reação descritas acima e na Figura 10.
[0417] Todos os produtos finais de fita simples foram analisados por AEX-HPLC para provar sua pureza. A pureza é dada em %FLP (% de produto de comprimento total), que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise AEX-HPLC do produto final. A identidade dos respectivos produtos de fita simples (precursores não modificados, modificados por amino ou oligonucleotídeos conjugados com GalNAc) foi provada por análise por LC-MS.
Tabela 1: Oligonucleotídeos de fita simples Produto Nome — MV MWESH —%deFLP calc. encontrado (AEX-HPLC) A0126 STSI200944ºA G4161Da 64158Da — 928% A0127 —STS12009L4B 7642,0 Da 7641,8 Da 88,0% AO1I34 — STS12009L4A 6416,1 Da 6415,8 Da 91,3% A0141 STS12009L4B 7642,0 Da 7642,0 Da 88,1% AO148 —STS12009V15L4A 6416,1 Da 6416,1 Da 84,1% AO149 —STS12009V1I5L4B 7642,0 Da 7642,2 Da 88,7% AOI50 — STS12009V16L4A 6480,1 Da 6480,3 Da 82,8% AO151 STS12009V16L4B 7674,0 Da 7674,4 Da 77,9% A0I53 — STS12009V1I8L50B 7674,0Da 7674,1 Da 78,5% AOI54 —STS12009V21L4A 6384,1 Da 6383,5 Da 86,7% AOIS55 — STS12009V1I9L50B 7579,0Da 7577,8 Da 86,8% AOIS56 — STS12009V20L50B 7610,0Da 7609,9 Da 85,6% AOI64 — STS12009V21L4B 7626,0 Da 7625,8 Da 84,3% AOI67 —STS12009V1I7L50B 7610,0Da 7610,0 Da 84,7%
AO245 —STS12009V36L4A 6416,0 Da 6415,9 Da 91,5% AO246 —STS12009V37L4A 6416,0 Da 6415,7 Da 95,2% AO347 —STS12009V55L50B 7578,0Da 7577,9 Da 94,9% AO348 — STS12009V56L50º 6352,1 Da 6351,5 Da 95,1% AO349 —STS1I2009V57L50A 6384,1 Da 6383,9 Da 88,7% “ Formaçãodefitadupta ||| ASPIÓÓá Í
[0418] As fitas simples individuais foram dissolvidas em uma concentração de 60 OD/mL em H2O. Ambas as soluções oligonucleotídicas individuais podem ser adicionadas em conjunto a um recipiente reacional. Para facilitar o monitoramento da reação, foi realizada uma titulação. A primeira fita foi adicionada em excesso de 25% sobre a segunda fita, conforme determinado por absorção de UV a 260 nm. A mistura de reação foi aquecida a 80ºC durante 5 minutos e depois arrefecida lentamente a RT. A formação de fita dupla foi monitorada por HPLC de fase reversa de pareamento de íons. A partir da área UV da fita simples residual, a quantidade necessária da segunda fita foi calculada e adicionada à mistura reacional. A reação foi aquecida a 80ºC novamente e lentamente resfriada a RT. Este procedimento foi repetido até que menos de 10% da fita simples residual fosse detectada. Tabela 2: Conjugados de ácido nucleico Produto Matérias-pimas ——— Nome — — %defita dupla X0027 A0I26 —A0il27 STSI20004 934% X0063 AOD148 A0149 STS12009V15L4 > 99% X0064 AO1ISO AO0151 STS12009V16L4 97,9% X0065 AO1I54 AO0164 STS12009V21L4 > 99% X0067 AOD1I48 AO0167 STS12009V17L50 > 99% X0068 AOISO AO0153 STS12009V18L50 99,6% X0069 AO1I54 AO0155 STS12009V19L50 > 99% X0070 AO1I34 AO156 STS12009V20L50 99,7% X0118 AO1I3S4 AO0149 STS12009V34L4 94,3%
X0120 A0245 A0141 STS12009V36L4 94,6% X0121 AOD246 A0141 STS12009V37LA4 92,7% X0135 AO1I3A4 AO0167 STS12009V40L50 95,8% X0214 A0245 AO0167 STS12009V54L50 95,6% X0215 AO245 AO0347 STS12009V55L50 93,7% X0216 AO3SA4B8 A0347 STS12009V56L50 > 99% X0217 AO3A49 A0347 STS12009V57L50 97,3% Exemplo 2
[0419] Ensaio de estabilidade sérica de conjugados GalNAc-siRNA contendo dois PS (STS12009L4) um PS (STS12009V21L4), dois PS2 (STS12009V16L4) e um PS2 (STS12009V15L4) nas posições terminais. O GalNAc foi conjugado na extremidade 5' da segunda fita e é estabilizado internamente por quatro PS. Fosforotioatos e fosforoditioatos, respectivamente, foram colocados na extremidade 5' da primeira fita, extremidade 3' da primeira fita e extremidade 3' da segunda fita. Os conjugados GalNAC-siRNA de 5 uM foram incubados com 50% FBS por 3 dias a 37ºC. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida a 20% de TBE e os resultados são mostrados na Figura 1. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS. "Controle" indica um conjugado GalNAc-siRNA menos estabilizado de sequência diferente.
[0420] As sequências são apresentadas na Tabela 3. duplex ID sequência e química topo: primeira fita, parte inferior: segunda fita, ambos 5'- 3' STS12009L4 mA (ps) £fA (ps) MC £fCmA£GMA£AmGE£AmMA£GMCf£AMGEGMU (ps) £G(ps)mMA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUumC£fAmMCfCmU fGmC FUMU £CMU fUMC FUMGEG (ps) mU (ps) fU STS12009V21L4 mA (ps) FAmCfCmAfGMAf£AmGf£AmAfGmCfAmGf£GMUfG (ps) mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUumCfAmMCfCmMUfGmMC Ff UMU£CMU£fUMC FfUMGEGMU (ps) £fU STS12009V16L4 mA (ps2) £fA (ps2) MCfCmAfGMA£AmMG£AmAfGmCfAmMGEGMU (ps2) £G (ps2)mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUMCFAmMCfCmMUfGMCfUMU£CMUfUMCfUmMGFG (ps2)mU (ps2) fU STS12009V15L4 mA (ps2) fAamCfCmAfGmMAfAmGfAmAfGmCfAmGfGMUfG (ps2)mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUMmCfAmMCfCmMU fGmC FfUMU£CMU fUMC FfUMG£GMmU (ps2) fU MA, MU, mC, mG — 2-OMe RNA fA, fU, fC, fG—-2-F RNA (ps) — fosforotioato (ps2) - fosforoditioato Tabela 3: Conjugados GalNAC-siRNA contendo dois PS, um PS, dois
PS2 e um PS2 em todas as extremidades não conjugadas. Exemplo 3
[0421] Ensaio de estabilidade sérica de conjugados GalNAc-siRNA contendo dois PS (STS12009L4, STS12009V20L50), um PS (STS12009V19L50), dois PS2 (STS12009V18L50) e um PS2 (STS12009V17L50) nas posições terminais. Nas variantes -V20, -V19, -V18 e -V17, GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da segunda fita e não contém PS. Fosforotioatos e fosforoditioatos, respectivamente, foram colocados na extremidade 5' da primeira fita, extremidade 3' da primeira fita, extremidade 5' da segunda fita e extremidade 3' da segunda fita, STS12009L4 contém cada um dos dois terminais PS na extremidade 5' da primeira fita, na extremidade 3' da primeira fita e na extremidade 3' da segunda fita, enquanto GalNAc é anexado à extremidade 5' da segunda fita e estabilizado por quatro PS interno. Os conjugados GalNAc-siRNA de 5 uM foram incubados com 50% FBS por 3 dias a 37ºC. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida a 20% de TBE. Os resultados são mostrados na Figura 2. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS.
[0422] As sequências são apresentadas na Tabela 4. duplex ID sequência e química topo: primeira fita, parte inferior: segunda fita, ambos 5-3 STS12009L4 mA (ps) fA (ps) MCfCmMAfGmAfAmMGfAmAfGmMCfAmGÍGMU (ps) fG (ps) mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUMC£AmMC£CMU£GMC£UMU£CMU£UMC£UMGEG (ps) mU (ps) £fU STS12009V20L50 mA (ps) £A (ps) MCfCmAfGmAfAmMG£AmAfGmCfAmGfGMU (ps) fG (ps)mA [ST23)3 ST41 fU(ps)mC (ps) £fAmCfCmMUfGMCfUMU£CMUfUMCEUMEfFG (ps)mU (ps) fU STS12009V19L50 mA (ps) famCfCmAfGMAfAmMGf£AmMAf GMC £AmMGEGMU£G (ps)mA ST23)3 ST41 fU(ps)mMCfAmMCfCMUfGMCfUMUfCMUfUMCfUMGfEGMU (ps) fU STS12009V18L50 mA (ps2) fA (ps2) mCfCmAfGMAf£AmGf£AmAfGmCfAmGfGMU (ps2) fG (ps2)mA [ST23] 3 ST41 fU(ps2)mC(ps2) famCfCmMUfGmCfUMU£CMUf£UMCfUMGfG (ps2)mU(ps2) £fU STS12009V17L50 mA (ps2) famCfCmAfGmAfAmMGFAmAfGMCfAmGfGMUFG (ps2)mA [ST23] 3 ST41 fU(ps2)mMCfAmMCfCmMU£fGMCfUMU£CMUf£UMCfUMGÍGMU (ps2) £fU MA, mU, mC, mG — 2-OMe RNA fA, fU, fC, fG-2-F RNA (ps) — fosforotioato (ps2) - fosforoditioato Tabela 4: Conjugados GalNAcC-siRNA contendo dois PS, um PS, dois PS2 e um PS2 nas posições terminais.
Exemplo 4
[0423] Ensaio de estabilidade sérica de conjugados GalNAc-siRNA contendo um PS2 em extremidades individuais. O GalNAc foi conjugado na extremidade 5' da segunda fita e é estabilizado internamente por quatro PS. Modificações de fosforoditioato foram colocadas na extremidade 5' da primeira fita (STS12009V37LA4), na extremidade 3' da primeira fita (STS12009V36L4) e na extremidade 3' da segunda fita (STS12009V34L4). Todas as outras extremidades não conjugadas foram estabilizadas por cada um dos dois terminais PS. STS12009L4 contém dois terminais PS na extremidade 5' da primeira fita, extremidade 3' da primeira fita e extremidade 3' da segunda fita. Os conjugados GalNAC-siRNA de 5 uM foram incubados com 50% FBS por 3 dias a 37ºC. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida a 20% de TBE. Os resultados são mostrados na Figura 3. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS. "Controle" indica um conjugado GalNAC-siRNA menos estabilizado de sequência diferente.
[0424] As sequências são mostradas na Tabela 5. duplex ID sequência e química topo: primeira fita, parte inferior: segunda fita, ambos 5-3 STS12009L4 mA (ps) fA (ps) MCfCmAf£GMAfAmGfAmAfGmCfAmGfGMU (ps) fG (ps)mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUMCfAmMC Ff CmU f GMC FUMU Ff CMU Ff UMC FUMGFG (ps) mU (ps) fU STS12009V34L4 mA (ps) £fA (ps) MCfCMAf£GMA£AmGfAmAfGmCfAmGfGMU (ps) fG (ps) mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUMCfAmC Ff CmU f GMC Ff UMU Ff CmU Ff UMC E UMG FGmMU (ps2) £U STS12009V36L4 mA (ps) fA (ps) mCfCmAf£GMAf£AmGf£AmA£ GMC fAmMGEGMU£G (ps2)mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUMCfAmMCfCMU f GMC FUMU Ff CmMU FUMC FUMGFG (ps) mU (ps) fU STS12009V37L4 mA (ps2) fAamCfCmAfGMAfAMG£AmAfGMCfAmMGEGMU (ps) fG (ps)mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUuMmCfAmMC Ff CmU f GMC FUMU Ff CmMU Ff UMC EF UMG EG (ps) mU (ps) fU MA, mU, mC, mG — 2:-OMe RNA fA, fU, fC, f6-2-F RNA (ps) — fosforotioato (ps2) - fosforoditioato Tabela 5: Conjugados de GalNAcC-siRNA contendo um PS2 em extremidades individuais. Exemplo 5
[0425] Atividade de conjugados GalNAC-siRNA contendo um PS2 em extremidades individuais. O GalNAc foi conjugado na extremidade 5' da segunda fita e é estabilizado internamente por quatro PS. Modificações de fosforoditioato foram colocadas na extremidade 5' da primeira fita (STS12009V37L4), na extremidade 3' da primeira fita (STS12009V36L4) e na extremidade 3' da segunda fita (STS12009V34L4). Todas as outras extremidades não conjugadas foram estabilizadas por cada um dos dois terminais PS. STS12009L4 contém dois terminais PS na extremidade 5' da primeira fita, extremidade 3' da primeira fita e extremidade 3' da segunda fita. O experimento foi conduzido em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 250,000 células por 6 poços e tratadas com 100 nM, 10 nM e 1 nM GalNAc- SIRNA. Transfecções com 10 nM GalNAC-siRNA e 1 pg/ml Atufect serviram como controle. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de mRNA Tmprss6 e Pten foram determinados por Tagman gRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 4. Cada barra representa a média + DP de três repetições técnicas. As sequências são as apresentadas na Tabela 5.
Exemplo 6
[0426] Ensaio de estabilidade sérica de um conjugado GalNAc-siRNA (STS12009V40L50) contendo cada um PS2 na extremidade 5' da segunda fita e na extremidade 3' segunda fita. O GalNAc foi conjugado na extremidade 5' da segunda fita e não é estabilizado internamente por PS. STS12009L4 contém cada um dos dois terminais PS na extremidade 5' da primeira fita, na extremidade 3' da primeira fita e na extremidade 3' da segunda fita, GalNAc é anexado à extremidade 5' da segunda fita e estabilizado por quatro PS interno. Os conjugados GalNAC-siRNA de 5 uM foram incubados com 50% FBS por 3 dias a 37ºC. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida a 20% de TBE. Os resultados são mostrados na Figura 5. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS.
As sequências são mostradas na Tabela 6.
topo: primeira fita, parte inferior: segunda fita, ambos 5'-3' STS12009L4 mA (ps) fA (ps) MCfCmAfGMA£AmGf£AmAfGmCfAmGfGMU (ps) £G (ps )mA ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUuMmC£fAmMC£CmU£fGmC Ff UMU£CmMU£fUmC fUMGÉG (ps) mU (ps) £U STS12009V40L50 mA (ps) fA (ps) MCfCmMAfGMA£AmGfAmAfGmCfAmGfGMU (ps) £G (ps)mA ST23])3 ST41 fU(ps2)mMCfAmMCfCmMUf£GmMCfUmMU£CmMU£UmMCfUMGfGMU (ps2) £U MA, mU, mC, mG — 2-OMe RNA fA, fU, fC, f6-2-F RNA (ps) — fosforotioato (ps2) - fosforoditioato Tabela 6: Conjugado GalNAC-siRNA (STS12009V40L50) contendo cada um PS2 na extremidade 5' da segunda fita e na extremidade 3' da segunda fita, em combinação com um ligante peptídico GalNAc sem PS. Exemplo 7
[0427] Atividade de um conjugado GalNAC-siRNA (STS12009V40L50) contendo cada um PS2 na extremidade 5' da segunda fita e na extremidade 3' segunda fita. O GalNAc foi conjugado na extremidade 5' da segunda fita e não é estabilizado internamente por PS. STS12009L4 contém dois terminais PS na extremidade 5' da primeira fita, extremidade 3' da primeira fita e extremidade 3' da segunda fita. Aqui, GalNAc é anexado à extremidade 5' da segunda fita e estabilizado por quatro PS internos. O experimento foi conduzido em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 250,000 células por 6 poços e tratadas com 100 nM, 10 nM e 1 nM GalNAc- SIRNA. Um conjugado GalNAc de um siRNA contra luciferase ("GalNAc-Luc") serviu como controle. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de MRNA Tmprss6 e Pten foram determinados por Tagman gRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 6. Cada barra representa a média + DP de três repetições técnicas. As sequências são as apresentadas na Tabela 6. Exemplo 8
[0428] Ensaio de estabilidade sérica de conjugado de GalNAc-siRNA com fosforotioatos, fosforoditioatos e fosfodiésteres em posições terminais e na fração GalNAc. O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da cadeia sense e é estabilizado internamente por quatro PS (STS12009L4) ou não; então, são utilizadas ligações fosfodiéster (STS12009V54L50 - V57L50). Modificações de fosforoditioato foram colocadas em todas as posições terminais do duplex, exceto na extremidade 5' da primeira fita (-V54L50), somente nas extremidades 3' (- V55L50, -V57L50) ou na extremidade 3' da segunda fita somente (-V56L50). Em certos modelos, fosfodiésteres foram utilizados em posições terminais do siRNA duplex (-V56L50, -V57L50).
[0429] Os conjugados GalNAC-siRNA de 5 uM foram incubados com 50% FBS por 3 dias a 37ºC. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida a 20% de TBE. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS, "Controle" indica um conjugado GalNAC-siRNA menos estabilizado de sequência diferente.
[0430] As sequências são mostradas na Figura 7 e os resultados na Figura 8.
Exemplo 9
[0431] Os conjugados GalNAc de um siRNA direcionado aTmprss6 contendo diferentes químicas de estabilização de extremidade (fosforotioato, fosforoditioato, fosfodiéster) foram testados por absorção mediada por receptor em hepatócitos primários de camundongo. O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da segunda fita e é estabilizado internamente por quatro PS (STS12009L4) ou não; então, são utilizadas ligações fosfodiéster (STS12009V54L50 - V57L50). Modificações de fosforoditioato foram colocadas em todas as posições terminais do duplex, exceto na extremidade 5' da primeira fita (-V54L50), somente nas extremidades 3' (-V55L50, -V57L50) ou na extremidade 3' da segunda fita somente (-V56L50). Em certos modelos, fosfodiésteres foram utilizados em posições terminais do sSiRNA duplex (-V56L50, -V57L50).
[0432] O experimento foi conduzido em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 20,000 células por 96 poços e tratadas com 125 nM a 0,2 nM de GalNAC-siRNA. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de MRNA Tmprss6 e Pten foram determinados por Tagman gRT-PCR. Cada barra representa a média + DP de três repetições técnicas.
[0433] As sequências são mostradas na Figura 7 e os resultados na Figura 9.
[0434] Exemplo 10
[0435] Os conjugados de GalNAc direcionado a TMPRSSG6 e contendo ligações de fosforoditioato em um ou mais terminais reduzem efetivamente os níveis séricos de ferro e MRNA TMPRSSG in vivo.
[0436] STS12009L4 e STS12009V34L4 contêm uma fração GalNAc que é estabilizada internamente por quatro ligações de fosforoticato. STS12009V54L50 contém uma fração GalNAc sem fosforotioatos internos. No STS12009L4 todos os terminais não conjugados são estabilizados por cada dois fosforotioatos. No STS12009V34LA4, uma ligação de fosforoditioato está presente na extremidade 3' da segunda cadeia, enquanto todas as outras extremidades não conjugadas são estabilizadas com cada um dos dois fosforotioatos. No STS12009V54L50, cada fosforoditivcato está presente na extremidade 3' da primeira fita, na extremidade 5' da segunda fita e na extremidade 3' da segunda fita. A extremidade 5' da primeira fita é estabilizada por dois fosforotioatos. Esses conjugados de siRNA mostram redução dependente da dose dos níveis de MRNA TMPRSS6 e dos níveis séricos de ferro. Os conjugados STS12009V34L4 e STS12009V54L50 contendo fosforoditioato são tão ativos quanto o composto de referência que não contém fosforoditioatos. Portanto, o número de fosforotioatos pode ser reduzido de dez (STS12009L4) para oito (STS12009V34L4) e mais de dois (STS12009V54L50) sem comprometer a atividade. STS12009V57L50 contém cada ligação de fosforoditioato na extremidade 3' da primeira fita e na extremidade 3' da segunda fita. As extremidades 5' de ambas as fitas contêm fosfodiésteres e a fração ligante não contém fosfodiésteres. A atividade in vivo deste conjugado de siRNA é fortemente reduzida.
[0437] Camundongos —machos C57BL/6 (n=6) foram tratados subcutaneamente com 3 mg/kg, 1 mg/kg e 0,3 mg/kg de conjugado GalNAc. As secções hepáticas foram preparadas sete dias após o tratamento, o RNA total foi extraído do tecido e os níveis de MRNA TMPRSS6 e PTEN foram determinados por TaqMan gRT-PCR. Além disso, os níveis séricos de ferro foram analisados.
[0438] As sequências são mostradas na tabela 7 abaixo e os resultados nas Figuras 12 e 13.
Exemplo 11
[0439] Os conjugados GalNAc com fosforoditioatos terminais são ativos in vitro.
[0440] Os conjugados GalNAc de um siRNA direcionado a Tmprss6 contendo diferentes químicas de estabilização de extremidade (fosforotioato, fosforoditioato, fosfodiéster) foram testados por absorção mediada por receptor em hepatócitos primários de camundongo. Uma fração GalNAc triantenária foi conjugada com a extremidade 5' da segunda fita e é estabilizada internamente por quatro PS em X0027, X0346, X0347. Neste caso, não há fosforotioato na extremidade 5' da segunda fita. Em X0214 e X0345, a fração GalNAc não contém fosforotioatos e o fosforoditioato está presente na extremidade 5' da segunda fita. Em X0214, X0345, X0346 e X0347, modificações de fosforoditioato estão presentes nas extremidades 3' da primeira e da segunda fita. A extremidade 5' da primeira fita é estabilizada por dois fosforotioatos (X0214, X0346) ou contém ligações fosfodiéster (X0345, X0347). Todos os conjugados descritos reduzem os níveis de mMRNA alvo in vitro. X0214 e X0346 mostram atividade reduzida em comparação com X0345 e X0347. Isto sugere que os fosforotioatos na extremidade 5' da primeira cadeia afetam negativamente a atividade do siRNA in vitro.
[0441] O experimento foi conduzido em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 20,000 células por 96 poços e tratadas com 100 nM, 10 nM, 1 nM e 0,1NM GalNAcC-siRNA. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de MRNA Tmprss6 e PTEN foram determinados por Tagman gRT-PCR. Cada barra representa a média + DP de três repetições técnicas.
[0442] As sequências são mostradas na tabela 7 abaixo e os dados na Figura 14.
Exemplo 12
[0443] Os conjugados de siRNA com cada GalNAc ligado ao serinol nas extremidades 5' e 3' da segunda fita e com fosforoditioatos terminais são ativos in vitro.
[0444] Os siRNAs conjugados com GalNAc direcionados a TMPRSS6 foram testados por absorção mediada por receptor em hepatócitos primários de camundongo. Tanto em X0454 como em X0456, cada uma das frações GalNAc ligadas ao serinol foi conjugada com as extremidades 5' e 3' da segunda fita, Ambos os conjugados contêm (E) -vinilfosfonato na extremidade 5' da primeira fita. Não há fosforotioatos presentes na extremidade 5' da primeira fita. Em X0454, cada dois fosforotioatos estão presentes na extremidade 3' da primeira fita e nas extremidades 5' e 3' da segunda fita. Cada fração GalNAc contém um fosforotioato. Em X0456, cada um de fosforoditioato está presente entre os dois últimos nucleotídeos na extremidade 3' da primeira fita e nas extremidades 5' e 3' da segunda fita. Nenhum centro estereogênico indefinido está presente no X0456. Utilizou-se um sSiRNA conjugado com GalNAc direcionado à luciferase como controle não direcionado a 125 nM e não reduz os níveis de MRNA alvo. Os conjugados direcionados a TMPRSS6 reduzem os níveis de MRNA alvo in vitro. Assim, os fosforoditioatos podem ser aplicados para estabilização de extremidade de siRNAs com frações GalNac únicas em ambas as extremidades da segunda fita.
[0445] O experimento foi conduzido em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 20,000 células por 96 poços e tratadas com 0,2 nM, 1 nM, 5 nM, 25 nM e 125 nM GalNAcC-siRNA. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de MRNA TMPRSS6 e ACTB foram determinados por Tagman qgRT-PCR. Cada barra representa a média + DP de três repetições técnicas.
[0446] As sequências são mostradas na tabela 7 abaixo e os dados na
Figura 15.
Declarações da Invenção
1. Um ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene alvo, em que a referida primeira e/ou segunda fita inclui uma ligação fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos.
2. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 1, em que a primeira fita não compreende uma ligação fosforoditioato entre qualquer um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5'.
3. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração | ou 2, compreendendo uma ligação de fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita.
4. Um ácido nucleico de acordo com as declarações 1-3, compreendendo uma ligação fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da segunda fita.
5. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 4, compreendendo uma ligação fosforotioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5' da segunda fita ou uma ligação fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5' da segunda fita.
6. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 5, em que o ácido nucleico compreende uma ligação fosforotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 5' da segunda fita quando não há ligação fosforoditioato presente nessa extremidade.
7. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 6, em que a primeira fita e a segunda fita são fitas separadas.
8. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 6, que compreende uma fita simples que compreende a primeira fita e a segunda fita.
9. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 8, em que a referida primeira fita e/ou a referida segunda fita são de 17 a 35 nucleotídeos de comprimento.
10. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 9, em que pelo menos uma região duplex consiste em 17 a 25 pares de bases nucleotídicas.
11. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer declaração anterior, que a) possui extremidade cega nas duas extremidades; ou b) possui um overhang em uma extremidade e a uma extremidade cega na outra; ou Cc) possui um overhang nas duas extremidades.
12. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer declaração anterior, em que um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita são modificados para formar nucleotídeos modificados.
13. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 12, em que um ou mais dos nucleotídeos ímpares da primeira fita são modificados.
14. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 13, em que um ou mais dos nucleotídeos pares da primeira fita são modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modificação da declaração 13.
15. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 14, em que pelo menos um ou mais nucleotídeos pares modificados é adjacente a pelo menos um ou mais nucleotídeos ímpares modificados.
16. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações
13 a 15, em que uma pluralidade de nucleotídeos ímpares é modificada.
17. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 14 a 16, em que uma pluralidade de nucleotídeos pares é modificada por uma segunda modificação.
18. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 12 a 17, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum.
19. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 13 a 18, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação da declaração 13.
20. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 13 a 19, em que um ou mais dos nucleotídeos ímpares da segunda fita são modificados por uma modificação diferente da modificação da declaração 13.
21. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 13 a 19, em que um ou mais dos nucleotídeos pares da segunda fita são modificados pela modificação da declaração 13.
22. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 20 ou 21, em que pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos pares modificados da segunda fita é adjacente a um ou mais nucleotídeos ímpares modificados.
23. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações a 22, em que uma pluralidade de nucleotídeos ímpares da segunda fita é modificada por uma modificação comum.
24. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 20 a 23, em que uma pluralidade de nucleotídeos pares é modificada por uma modificação de acordo com a declaração 13.
25. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 20 a 24, em que uma pluralidade de nucleotídeos ímpares é modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação da declaração 13.
26. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações a 25, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum.
27. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 20 a 26, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação da declaração 13.
28. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 12 a 27, em que cada um dos nucleotídeos ímpares na primeira fita e cada um dos nucleotídeos pares na segunda fita são modificados com uma modificação comum.
29. Um ácido nucleico, de acordo com as declarações 13 a 28, em que cada um dos nucleotídeos pares é modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos ímpares é modificado na segunda fita com uma segunda modificação.
30. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 20 a 29, em que os nucleotídeos modificados da primeira fita são deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de forma diferente da segunda fita.
31. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 30, em que a primeira fita compreende uma sequência da SEQ ID NO: 1.
32. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 30, em que a segunda fita compreende uma sequência da SEQ ID NO: 2.
33. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 32, em que a modificação e/ou modificações são, cada uma, individualmente selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'-terminal, 2'-O-metil, uma modificação 2'-desoxi, um modificação 2'-amino, uma modificação 2'-alquil, uma modificação morfolino, uma modificação fosforamidato, modificação do grupo 5'- fosforotioato, uma modificação 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e um derivado de colesteril ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico.
34. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 33, em que a modificação é qualquer uma dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo.
35. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 34, em que pelo menos uma modificação é 2'-O-metil.
36. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 35, em que pelo menos uma modificação é 2'-F.
38. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 37, conjugado a um ligante.
39. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 38, compreendendo uma ligação fosforoticato entre um, dois ou três nucleotídeos 3' e/ou nucleotídeos 5' terminais da primeira e/ou da segunda fita, quando um fosforoditioato não está presente na extremidade.
40. Um ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene alvo a ser inibido, e em que a referida primeira e/ou segunda fita inclui uma ligação de fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos 3' terminais e/ou a segunda fita incluem uma ligação fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos 5' terminais, e em que a molécula de ácido nucleico é conjugada a um ligante.
41. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 38 a 40, em que o ligante compreende um ou mais ligantes de GalNac e seus derivados.
42. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 38 a 41, em que o ligante compreende (i) uma ou mais frações de N-acetil galactosamina (GalNac) e seus derivados, e (ii) um ligante peptídico, em que o ligante peptídico conjuga as frações GalNac a uma sequência conforme definido em qualquer declaração anterior.
43. Um ácido nucleico da declaração 40, em que os nucleotídeos são modificados conforme definido em qualquer uma das declarações anteriores.
44. Um ácido nucleico de qualquer declaração anterior, em que o ligante compreende a fórmula |: [S-X1-P-X2]3-A-X?- (1) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X' representa C3-Cs alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2,ou3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X? é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2))-O-CH2-, onde n=1-6; A é uma unidade de ramificação; X? representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a X? através de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato).
45. Um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes estruturas or oH OH no o oH | . o o " S ) , ido oH | É L ow SE—P— O ACHN- | é
Í fe) E o- o o
A 2a ! PS
A oH Ho oH
OH OI o Ho o AcHN o O
NHÃAC A o 7 osr-sº ' o o o=P-sº o oH
OH 9 LL” AcHN
O OH
O O o E o " Z-0-P-Oo o o-PzO Ss
OH Ho oH
OH OH o Ho. o ACHN o o NHAÃc bes PA ? o=p-sº k ? o=p-sº o oH o oH al ACHN
O OH o o o ÃO Oo " 72-00 so 9 o-P-o 1º
OH Ho OH
OH OH fo) Ho o AcCHN o. o NHAC ias 7 o=p-sº 9 À o =P-sº o OH
OH õ ad ACHN
O OH o o o q Z-O-—P-O o
IO T S O-P-O so '
oH Ho oH
OH OH o Ho. o ACHN o, o
RAE r. o=p-sº o Q o=P-sº [o] OoH o SO? oH o ACHN
O OH o o o 9 X 9 LON o-P-o o Ss so oH Ho oH OH OH o AcHN Ho o o o. NHÃo A " o=p-sº o & o=p-sº OH oH
P ACHN o SS O oH P o o o O o u 2-0-P-O $º o O-P-O so oH Ho oH OH OH o ACcHN Ho o o o NHAc DA o 1 o=P-sº ó 4 o: =p-sº oH oH ” ACHN o A o OH o o o o q Z-0-P-O o k u sº o—P-O
L Ff) oH Ho OH OH OH o ACcHN Ho o o fo) NHAc DA q o=P-sº o 5 o=P-s oH oH
P ACHN o Fº O OH P o o o o i o un u 2-01=0 O-P-O sº do em que Z é um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 39.
46. Um ácido nucleico de qualquer declaração anterior, em que o oH Ho K NX. H DIA ADRIANO o HAC o o2ºP=0 OH H " o vt
K
AA O NHAC Oo o o ss AA H So NOR Hi
H ligante compreende:
47. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1-27, 31-32 ou 3943, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação 2'-fluoro, e os nucleotídeos na segunda fita, que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita, são modificados com uma modificação 2'-fluoro.
48. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 43 ou 47, em que a primeira fita de RNA é um composto da fórmula (XV): GalNAC, GalNAC
L L X XY
NH NH Y o sa | l Z——o+P—O O—P—O o +H du R; du R, » XV) em que bé 0 ou 1;e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XVI):
GalNAc GalNAc GalNAc GalNAc, É é No Ne o Y Y o H ÍA o zo ALA: H n Ri OH Ri OH OH R: oH Ri n c d (XVI); em que c e d são independentemente O ou 1; em que: Z1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; YéOousS,; R1 é H ou metil; néoO, 1,20u3d3;e L é igual ou diferente nas fórmulas (XV) e (XVI) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)a, em que q = 2-12; -(CH2),-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O).--CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2))-CO-NH-(CH2))-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)I-CO-NH-(CH2)!-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2))-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o C(O) terminal (se presente) está ligado ao grupo NH; eemqueb+c+dé2ou3.
49. Um ácido nucleico da declaração 48, em que bé 0, cé 1e dé 1.
50. Um ácido nucleico da declaração 48, em que bé 1,cé 0edé 1.
51. Um ácido nucleico da declaração 48, em que bé 1, cé 1edéo.
52. Um ácido nucleico da declaração 48, em que bé 1,cé 1e dé.
53. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 48 - 52, em que Y é O.
54. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações
48 - 52, em que Y é S.
55. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 - 54, em que R1 é H.
56. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 - 54, em que R1 é metil.
57. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 48 - 56, em que né O.
58. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 48 a 57, em que L é - (CH2),C(O)-, em que r = 2-12.
59. Um ácido nucleico da declaração 58, em que r = 2-6,
60. Um ácido nucleico da declaração 59, em que r = 4 ou 6, por exemplo, 4.
61. Uma composição compreendendo um ácido nucleico como definido em qualquer declaração anterior e uma formulação compreendendo: i) um lipídio catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídio PEGuilado.
62. Uma composição de acordo com a declaração 61, em que na formulação o conteúdo do componente lipídico catiônico é de cerca de 55% molar a cerca de 65% molar do conteúdo lipídico geral da composição lipídica, preferencialmente cerca de 59% molar do lipídio total conteúdo da composição lipídica.
63. Uma composição de acordo com a declaração 62, em que a formulação compreende; um lipídio catiônico possuindo a estrutura; TIMER 5 O, Lo fe A o esteroide possui a estrutura; Colesterol 1 o fosfolipídio fosfatidiletanolamina possui a estrutura; And AAA q
CAE EN
FVAAÇATAXX 0 DPhyPE e o lipídio PEGuilado possui a estrutura; o DIANA mA o DEAIDADADADADRADOO ' n mPEG-2000-DMG
64. Uma composição que compreende um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, e um excipiente fisiologicamente aceitável.
65. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio.
66. Uso de um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, na fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio.
67. Um método para tratar uma doença ou distúrbio compreendendo a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, a um indivíduo que precisa de tratamento.
68. O método, de acordo com a declaração 67, em que o ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico conjugado é administrado ao sujeito por via subcutânea ou intravenosa.
69. Um processo para produzir um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 65.
Tabela 7 Tabela de sequência de resumo SEQ Contrapartida — de ID Nome Sequência (5-3) sequência não NO: modificada (5'-3') STS1200 AACCAGAAGAAG 1 AACCAGAAGAAGCAGGUGA 9L4A CAGGUGA STS1200 UCACCUGCUUC 2 UCACCUGCUUCUUCUGGUU 9L4B UUCUGGUU 3 STS1200 | mA(ps)fA(ps)I CIFCMAfGMAfAMGIAMAFftGmMCf | AACCAGAAGAAG 9L4A AmGIGMU(ps)G(ps)MA CAGGUGA ST23(ps)]3 ST41(ps)- STS1200 E (ps) (Ps) UCACCUGCUUC 4 fUMCIAMCICmMUFfGMCfUMUfemUfumCfuUmMEGf 9L4B UUCUGGUU G(ps)mU(ps)fU STS1200 | MmA(ps)YAMCICMAfGMAfAMGIAMAfGmMCfAm — | AACCAGAAGAAG 9V21L4A | GI(GMUÍG(ps)MA CAGGUGA ST23(ps)]3 ST41(ps)- STS1200 E (ps) (Ps) UCACCUGCUUC 6 fUMCIfAMCIfCmMUFfGmMCfUMUfemUfumCfUmMEGf 9V21L4B UUCUGGUU GmuU(ps)fU 7 STS1200 | mA(ps2)fA(ps2)M CfCMAfGMAfAMGIAMAfGm | AACCAGAAGAAG 9V16L4A | CIAMGIGMU(ps2)fG(ps2)MA CAGGUGA ST23(ps)]3 ST41(ps)- STS1200 E (ps) (Ps) UCACCUGCUUC 8 fUMCIAMCICmMUFfGmMCfUMUfemUfumCfuUmMEGf 9V16L4B UUCUGGUU G(ps2)mU(ps2)fU STS1200 | MmA(ps2)fAmCfCMAftGMAfAMGIAMAfGmMCfAm | AACCAGAAGAAG 9V15L4A | GIGMUÍG(ps2)JNA CAGGUGA [ST23(ps)]3 ST41(ps)- | UCACCUGCUUC
9V15L4B | fUMCfAMCIfCMUfGMCfUMUFComMUfUMEfUMEf | UUCUGGUU GmU(ps2)fU STS1200 " 9V20L50 MA(ps)fA(ps)M CFCMAfGMAfAMGIAMAfGmMCf | AACCAGAAGAAG A AmGIGmMU(ps)fG(ps)MA CAGGUGA STS1200 | [ST23]3 ST41-
UCACCUGCUUC 12 | 9V20L50 | fu(ps)MC(ps)fAmCfCmUftGmMCfUMUFCmMUfUM
UUCUGGUU B CfUmMGfG(ps)mMU(ps)fU STS1200 13 SV19LSO MA(ps)fAMCICMAfGMAtfAMGIAMAtGMCÍAm AACCAGAAGAAG A GIGMUÍG(ps)mMA CAGGUGA STS1200 | [8T23]3 ST41-
UCACCUGCUUC 14 9V19L50 | fU(ps)MCfAmCfcmMUfGMCfUMUFCMUfUMEfU
UUCUGGUU B mGIfGmU(ps)fU STS1200 9V18L50 mMA(ps2)fA(ps2)NCICMAfGMAfAMGIAMAfGm | AACCAGAAGAAG A CIfAMGIGMU(ps2)fG(ps2)MA CAGGUGA STS1200 16 9V18L50 [ST23]3ST41fU(ps2)MC(ps2)/AMCfomMUfGmMC | UCACCUGCUUC B fUMUfCmMUfuUMECfUMEfG(ps2)mMU(ps2)fU UUCUGGUU STS1200 7 9V17LSO MA(ps2)fAMCICMAfGMAfAMGIAMAfGMCfAm | AACCAGAAGAAG A GIGMUfG(ps2)nMA CAGGUGA STS1200 | [ST23]3 SsT41-
UCACCUGCUUC 18 9V17L50 | fuU(ps2)MCfAmMCfCMUfGMCfUMUfCMmMUfUMECf
UUCUGGUU B UmGIGmMU(ps2)fU 19 STS1200 | mA(ps)f/A(ps)M CIFCMAfGMAfAMGIAMAftGmCf | AACCAGAAGAAG 9V34L4A | AMGIGMU(ps)fG(ps)MA CAGGUGA ST23(ps)]3 ST41(ps)- STS1200 [ (ps)] (ps) UCACCUGCUUC fUMCfAMCICmMUfGmMCfUMUFfomUfuUMECfUMEf 9V34L4B UUCUGGUU GmU(ps2)fU STS1200 | mA(ps)fA(ps) IM CFCMAfGMAfAMGÍAMAÍfGMCf | AACCAGAAGAAG
9V36L4A | AMGIGMUÍG(ps2)MA CAGGUGA 22 STS1200 | [ST23(ps)]|3ST41(ps)ºJUMCfAMCfCmMUfGMCfU | UCACCUGCUUC 9V36L4B | MUfCmMUfUMCIUMGfÍG(ps)mU(ps)fU UUCUGGUU 23 STS1200 | MA(ps2)fAMCfCMAfGMATAMGIAMAfGMCfAm | AACCAGAAGAAG 9V37L4A | GfGmU(ps)fG(ps)MA CAGGUGA 24 STS1200 | [ST23(ps)]3ST41(ps)ºUMCfAMCIfCMUFfGMCfU | UCACCUGCUUC 9V37L4B | mUfcmUfuUMCfUMGEfG(ps)mMU(ps)fU UUCUGGUU STS1200 MA(ps)fA(ps)M CfCMAfGMAfAMGIAMAfGmMCf | AACCAGAAGAAG 9V40L50 A AmGIGmMU(ps)fG(ps)MA CAGGUGA STS1200 | [ST23]3 ST41-
UCACCUGCUUC 26 9V40L50 | fU(ps2)NCfAMCfomMUfGMCfUMUFCmMUfUMECf
UUCUGGUU B UmMGIGMU(ps2)fU STS1200 | mA (ps) fa (ps)
AACCAGAAGAAG 27 9V54L50 | MCfCmMAfGMAfAMGIAMAtGmMCfAMGÍGMUÍG
CAGGUGA A (ps2) mA STS1200 | [8T23]3 SsT41-
UCACCUGCUUC 28 9V54L50 | fU(ps2)MCfAmMCfCMUfGMCfUMUfCMmMUfUMECf
UUCUGGUU B UmMGIGMmU (ps2) fU STS1200 | mA (ps) fa (ps)
AACCAGAAGAAG 29 9V55L50 | MCfCmMAfGMAfAMGIAMAfGmMCIAMGIGMUÍG
CAGGUGA A (ps2) mA STS1200 | [S8T23]3 ST41-
UCACCUGCUUC 9V55L50 | fUMCfAMCIfCMUfGMCfUMUfomMUfuUMCfUMEtf
UUCUGGUU B GmU (ps2) fU STS1200 MATfAMCICMAFGMAfAMGÍIAMAtGMCfAMGÍG | AACCAGAAGAAG 31 9V56L50
A MUÍGMA CAGGUGA STS1200 | [S8T23]3 ST41-
UCACCUGCUUC 32 9V56L50 | fUMCfAMCIfCMUfGMCfUMUFfomMUfuUMCfUMEf
UUCUGGUU B GmU (ps2) fU MATAMCICMAFGMAfAMGIAMArGMCIAMGIG | AACCAGAAGAAG
9V57L50 | mUfG (ps2) mA CAGGUGA
A STS1200 | [8T23]3 ST41-
UCACCUGCUUC 34 9V57L50 | fUMCIAMCIfCMUfGMCfUMUFfCemMUfuUMECfUMEtf
UUCUGGUU B GmU (ps2) fU X0214A mA (ps) fA (ps) MC fC mA fG mA fA MG fA mA | AACCAGAAGAAG fG mC fA mG fG mU fG (ps2) mA CAGGUGA [ST23]3 ST41 fU (ps2) mC fA mC fc mU fG
UCACCUGCUUC 36 X0214B |mCfUumUfC mU fUumC fumG fe mU (ps2)
UUCUGGUU fu MA fA mC fC MA fG mA fA mG fA mA fG mC | AACCAGAAGAAG 37 XO0345A fA mG fG mU fG (ps2) mA CAGGUGA [ST23]3 ST41 fU (ps2) mC fA mC fC mU fG
UCACCUGCUUC 38 XO345B |mC fu mUfC mU fu mC fu mG fe mU (ps2)
UUCUGGUU fu 39 X0346A mA (ps) fA (ps) MC fC mA fG mA fA mG fA mA | AACCAGAAGAAG fG mC fA mG fG mU fG (ps2) mA CAGGUGA [ST23(ps)]3 ST41(ps) fU mC fA mC fC mU fG
UCACCUGCUUC 40 X0346B |mC fUmUfC mu fumC fumG fe mU (ps2)
UUCUGGUU fu MA fA mC fC MA fG mA fA mG fA mA fG mC | AACCAGAAGAAG 41 X0347A fA mG fG mU fG (ps2) mA CAGGUGA [ST23(ps)]3 ST41(ps) fU mC fA mC fC mU fG
UCACCUGCUUC 42 X0347B |mC fUmUfC mu fumC fumG fe mU (ps2)
UUCUGGUU fu MA (ps) fA (ps) MC fC mA fG mA fA MG fA mA | AACCAGAAGAAG 43 X0027A fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA CAGGUGA [ST23(ps)]3 ST41(ps) fU mC fA mC fC mU fG
UCACCUGCUUC 44 |X0027B |mCfUmUfCmUfumC fyumG fG (ps)muU
UUCUGGUU (ps) fU (vp)-mU fA mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG | UACCAGAAGAAG 45 XO454A mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA CAGGUGA
Ser(GN) (ps) mU (ps) mC (ps) mA mC mC mU (GN) (ps) (Ps) (Ps) UCACCUGCUUC 46 XO0454B |fGfCfUmUmC mUmU mC mU mG mG (ps)
UUCUGGUA mU (ps) mA (ps) Ser(GN) (vp)-mU fA mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG | UACCAGAAGAAG 47 X0456A mC fA mG fG mU fG (ps2) mA CAGGUGA Ser(GN) mU (ps2) MC mA mC mC mU fG fc X0456B UCACCUGCUUC 48 fu mU mC mU mMU mMC mU MG mG mU
UUCUGGUA (ps2) mA Ser(GN Chave Sequências que terminam com um "A" (como em X0O456A) são sequências da primeira fita e sequências que terminam com um "B" (como em X0456B) são sequências da segunda fita. MA, mU, mC, mG - RNA 2-OMe fA, fU, fC, fG - RNA 2:-F (ps) - fosforotioato (ps2) - fosforoditioato (vp) - Vinil-(E)-fosfonato As sequências listadas acima podem ser divulgadas com um ligante peptídico ou ligante, como ligações GalNAc ou (ps) ou (ps2), por exemplo. Estes formam uma parte opcional, mas preferida, da sequência da listagem de sequência. As seguintes abreviações podem ser usadas neste documento: ST23 OAc OAc
TA Aco Do ST41 “oO PESO o moOOOo Ser(GN oH . ” (GN) A op” Ho. O. NH o OX

Claims (22)

UT REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene alvo, em que a referida primeira e/ou segunda fita inclui uma ligação fosforoditioato entre pelo menos dois nucleotídeos.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira fita não compreende uma ligação fosforoditioato entre qualquer um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5'.
3. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende uma ligação fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita e/ou compreende uma ligação fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 3' da segunda fita e/ou uma ligação fosforoditioato entre cada um dos dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5' da segunda fita.
4. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma ligação fosforotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e/ou entre cada um dos três nucleotídeos 5' da segunda fita quando não há ligação fosforoditioato presente nessa extremidade.
5. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a primeira fita e a segunda fita são fitas separadas.
6. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma região duplex consiste em 17 a 25 pares de bases nucleotídicas.
7. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita são modificados, para formar nucleotídeos modificados.
8. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante.
9. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende (i) uma ou mais porções de N-acetil galactosamina (GalNAc) ou seus derivados, e (ii) um ligante peptídico, em que O ligante peptídico conjuga pelo menos uma porção de GalNAc, ou seu derivado, ao ácido nucleico.
10. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante compreendendo um composto de fórmula (!I): [S-X-P-X2;-AX- (1) em que: S representa um sacarídeo, preferencialmente em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; x representa C3-C; alquileno ou (-CH3-CH3-O)n(-CH2).- em que m é 1,2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado, preferencialmente um fosfato não substituído; X? é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2),-O- CH7z-, onde n = 1-6; A é uma unidade de ramificação; x representa uma unidade de formação de ponte;
em que um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, é conjugado a Xº através de um fosfato ou fosfato modificado, preferencialmente um fosfato não substituído.
11. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-9, caracterizado pelo fato de que a primeira fita de RNA é um composto de fórmula (X):
Y Y 7 -Ão oa, ol a, oO—H du de "PO em que bé 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XI):
Y Y Y Y Ho od, to] o22,-Ão Lou, ol o, OH du Ly du du n e n d (X); em que: c e d são independentemente O ou 1; Z, e Z, são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; YéOousS, preferencialmente O; né0oO, 1,20u3e L, é um ligante peptídico ao qual um ligante está ligado; e em que b + c + dé 20ou3.
12.Ácido nucleico para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene alvo, em que o ácido nucleico compreende ligações fosforoditioato entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita, em que o ácido nucleico compreende uma ligação fosforoditioato entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' e entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 5' da segunda fita, e em que a primeira fita compreende uma ligação diferente de fosforoditioato entre os dois, três ou quatro nucleotídeos terminais na extremidade 5'.
13. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante compreendendo um composto de fórmula (1): [S-X-P-X;-AX*- (1) em que: S representa um sacarídeo, preferencialmente em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X' representa C3-Cs alquileno ou (-CH7-CH2-O)n(-CH2)2- em que m é 1,2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado, preferencialmente um fosfato não substituído; Xº é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH>),-O- CH>7-, onde n = 1-6; A é uma unidade de ramificação; x representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12 é conjugado a Xº através de um fosfato ou fosfato modificado.
14. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante, em que a primeira fita de RNA é um composto de fórmula (XV): GalNACy GalNAC
L L ue Je Y o sa ||| | Z——o+P—O oO—P—o OH da R, du R, » XV) em que bé 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XVI): GalNAc GalNAc GalNAc GalNAc
Ú Ú X X / / x N
HN HN NH NH o Y Y o Il has | | Ho O—P— O OPA Oz, —Oo+P—o oO—P—o OH ko de / Ro da da RA de e q (XVI); em que c e d são independentemente O ou 1; em que: Z, e Z7 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; YéOousS, preferencialmente O; R: é H ou metil; néoO, 1,20u3e L é igual ou diferente nas fórmulas (XV) e (XVI) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)a, em que q = 2-12; -(CH2),-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O).-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2)-CO-NH-(CH2).-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5;
-(CH2).-CO-NH-(CH2),-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -“(CH2).-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o C(O) terminal, se presente, está ligado ao grupo NH; eemqueb+c+dé2ou3.
15. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a primeira fita de RNA tem um nucleotídeo 5' terminal de (E)-vinilfosfonato na sua extremidade 5' e em que o nucleotídeo 5' terminal (E)-vinilfosfonato está preferencialmente ligado ao segundo nucleotídeo na primeira fita por uma ligação fosfodiéster.
16. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por uma primeira modificação nos nucleotídeos de numeração ímpar e modificados com uma segunda modificação nos nucleotídeos de numeração par, e os nucleotídeos da segunda fita são modificados nos nucleotídeos de numeração ímpar com a segunda modificação e modificados com a primeira modificação nos nucleotídeos de numeração par, em que a primeira fita é numerada de 5' a 3', sendo o nucleotídeo mais extremo em 5' o nucleotídeo número 1 da primeira fita e a segunda fita é numerada de 3'a 5', sendo o nucleotídeo mais extremo em 3' o nucleotídeo de número 1 da segunda fita, em que a primeira modificação é preferencialmente 2'/OMe, em que a segunda modificação é preferencialmente 2' fluoro, e em que o ácido nucleico é preferencialmente de extremidade cega nas duas extremidades.
17. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação 2'- fluoro, e os nucleotídeos na segunda fita, que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita, são modificados com uma modificação 2'-fluoro e preferencialmente em que os nucleotídeos restantes são modificados com uma modificação 2'OMe.
18. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que todas as ligações entre os nucleotídeos de ambas as fitas, exceto a ligação entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' da primeira fita e as ligações entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3' e na extremidade 5' da segunda fita, são ligações fosfato não substituídas.
19. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e, opcionalmente, um veículo de administação e/ou um excipiente fisiologicamente aceitável e/ou um carreador e/ou um diluente e/ou um tampão e/ou um conservante para uso como um medicamento.
20. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e, compreende ainda, um veículo de administração, preferencialmente lipossomas e/ou um excipiente fisiologicamente aceitável e/ou um carreador e/ou um diluente.
21. Uso de um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou de uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é para prevenção ou tratamento de uma doença, distúrbio ou síndrome.
22. Método para prevenir ou tratar uma doença, distúrbio ou síndrome, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 20, a um indivíduo em necessidade de tratamento, preferencialmente em que o ácido nucleico ou a composição é administrada ao sujeito por via subcutânea, intravenosa ou usando quaisquer outras vias de aplicação, como oral, retal ou intraperitoneal.
STS12 —“STS12 STS12 —STS12 009L4 — 009V21L4 OO9V1I6L4 OOIVI5LA Controle NA e) nn nO nn E 5 E 5 E 5 25 E Figura 1 STS12009 STS12009 STS12009 STS12009 STS12009 4 V20L50 V19L50 VIS8L5SO V17L50 nn nn nn nn nO 5 g5 E5 E 5 E 5 E Figura 2
STS12 STS12 STSI2 STS12 009L4 009V34L4 009V36L4 OO9V37L4 Controle nn nn on On a) kk o E mo E o Ex fes) x o = uu >= uu = u >= uu = uu % nd TUM e 0 o O qua = .—. Figura 3 12 TMPRSS6/PTEN 1 <
Z É 08 =
E = 06 &
Z
F É 94 =
Ê 02 o = = = = = = = = = = = = Fu = sz 3 = = e [2/7 [2/2 /2 | 2 [2[/ 2 | 2 | 2 [E | a | a a |/ 2/22 8g|& |" |8|&| "| 8/8 |" 8|8|- [8/2 8/32/88 z 8/88 EFISIS|S E) ES UT STS12009L4 STS12009V34L4 | STS12009V36LA | STS12009V37L4 10 nM siRNA GN- | GN- 1 ug/mL AtuFECT TTR | Luc Figura 4
STS12009 —STS12009 La V40L50 nn nn rm mn Mm mn =" à — u Figura 5 12 TMPRSS6/PTEN 1 <q - É o8 ú & 0.6 & po & É 04 = | o.2 o z=/=/|/s=/=/ =| =|: ce Ee E / E /E8|/É|3 8/ja/ "7/8/8772 Ss - 2 oO = &
S UT | STS12009L4 |STS12009V40L50 Figura 6 duplex ID sequência e química topo: primeira fita, parte inferior: segunda fita, ambos 5'-3' STS12009L4 mA (ps) £A (ps) mCf£CmAf£GMA£AmGfAmAfGMCfAmGfGMU (ps) £G (ps)mA [ST23(ps)]3 ST41 (ps) fUMC£AmCfCMU£GMmCfUMUfCMU£UMCfUMGfG (ps) MU (ps) fU STS12009V54L50 mA (ps) fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmMCfAmGfGMUfG (ps2)mA [ST23] 3 ST41 £U(ps2)mCf£AmCfCMUfGMCfEUMU£CMUf£UmMCfUMGfGMU (ps2) £U STS12009V55L50 mA (ps) f£A(ps)mCfCMmAfGMA£AmGfAmAfGMCfAmMGEGMUf£G (ps2) mA [ST23]3 ST41 fUMCf£AmMCfCMUfGMCfUMU£CMUfUMC FUMGEGMU (ps2) £U STS12009V56L50 mA£AmCfCMAfGMA£AmGfAmMA£GMC fAmMGfGMU£GMA [ST23]3 ST41 fUMC£AmMCfCMUfGMCfUMU£CMUfUMCfUMGEGMU (ps2) £fU STS12009V57L50 mAf£AmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGMUfG (ps2) mA [ST23] 3 ST41 fUMCfAmCfCMUfGMCfUMU£fCMUfUmC fUMGfGMU (ps2) £U mA, mU, mC, mG — 2-OMe RNA fA, fU, fC, 16 — 2-F RNA (ps) — fosforotioato (ps2) - fosforoditioato Figura 7 STS12009 STS12009 STS12009 STS12009 STS12009 4 V54L50 V55L50 V56L50 V57L50 Controle
UT FBS UT FBS UT FBS UT FBS UT FBS UT FBS - =. — . . — Figura 8
WUZO & o = Wu >= Wus & Oo u Fa WuSZ o Wugz, O WUZO &S o — Wu > nus 8 o e Wusz e Wugz, O WUZO &S o — WU 8 > Wnus 8 Oo e Wusz o WugZ, O WUZO & o — Wu >= Wnus 8 Oo e Wusz o Wugz, O WU Z'O Wu SD Oo Nus & ug É Wusz E WU SZ)
o o o o La Lu o o (1=3N) yYNHW NAL d/9SSHdWL Figura 9 x = co ow D 2 —. — —. —. = Er ES 2 E 98% = 286 Es Zon 2 - 55º . axo - á so ZzZ2o0 - & so Fo ES EA” o oe > oOe >3 oUº2 - sIS E 2 $8EÊ 2 So 2 80E 2 EX e é 83 RF 805 RF STE RR E o o o 8 020 8 Som oO = õ E o << à od0ço E o£Oo É eÊOo É Fo E io Eo3 DD ses > Es 5 so > fes E f&5 E £&£$5 É =8 a Css e 2a e “É & Ê EX O 2 o "a o 2 -) 2 E : E " E -) > 96 RR Di 2 Ss 2 a E <º o o e o o 2 o 2 Nº E > 2 2? 2 E z z 2 2 E o o 2 2 o E < 2 z 2 e E > ? 2 2 E o o o o 2 E É É õ5 2 2 o E 2 > < 3 < E E E Oo 2 2 o E O o 2 É E E = < E vv & < < SÊ 2 2 o 5 E 2 - 2 -) é , = = S z 8 Z | - | | Ft o r mm 2 ms 3) r TE x 2 2 | o õ $ TRT O. 3 q | Rh RR E | E E RE, PF ni o = O) TST E o oiã&« ô a Tê - . 21]. Es o 1 |) 2 8 2 2 QE nm E O Sos ni O mo ão Figura 10
D $ R E É s x ' E a xs) EO 5 % =o 38 =o =e Z Pp os o oo ooo PP se 8$ 82 ge, sê EE EO [ES SE ãs SAESÕS SEL 2 82 2 SEBAE SG ES " ash SaE SE 8 S S8808 SS SS 52 2 FáGSO LLo CHo ET + OZ ENE eai = ani ra 2 & ê z 7 o & - Ê AA 2 2 2 ? z z 2 2 ' É ê ê F ê Êâ Ê & 2 2 - 3 3 Ss 3 Hi ? Ê 2 Ê o 8 ê â ê É ê 2 z Ê o o O É ê € ã ' 2 ? 2 E > g z E 2 o o à o É É 2 EN 2 2 e 3 3 3 > z E 2 t d g E 7 e 3 g z z 2 2 2 S $ 2 a E É Hd 2 < S ? ? 2 2 8 3 g g 2 E o à Z 2 : : : g ' É E t E 2 2 2 S 11º Ô Z E g 2 z E € 233: E g r 20% & z z So % É Z < o s P É É 2 2 E 2 E E g 8 o = o fr) E j o E ôkE ER e oh O 2 | E Í t t À bo oo da -. 232 é 232 aos Figura 11
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WU E o Wuor Q NU 00) Wnuo 5& e o q Oo al kl o o WNHUW NILd/9SSHdWL Figura 14
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