CN111527206A

CN111527206A - 用于抑制靶标基因表达的包含二硫代磷酸酯键的核酸

Info

Publication number: CN111527206A
Application number: CN201880085033.7A
Authority: CN
Inventors: L·贝特格; J·豪普特曼; C·弗劳恩多夫; A·魏因格特纳
Original assignee: Silence Therapeutics GmbH
Current assignee: Silence Therapeutics GmbH
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2020-08-11
Also published as: EP3710585A1; US11873489B2; RU2020112641A; MA51707A; JP2021502411A; RU2020112641A3; AU2018363837A1; SG11202003082UA; US20200392495A1; IL274611A; KR20200098521A; JP7461886B2; CA3081910A1; WO2019092280A1; MX2020004898A; PH12020550244A1; BR112020009092A2

Abstract

本发明涉及产品和组合物以及它们的用途。特别地，本发明涉及干扰靶标基因表达或抑制靶标基因表达的核酸产品以及所述产品的治疗用途。

Description

用于抑制靶标基因表达的包含二硫代磷酸酯键的核酸

背景技术

已显示能够互补性结合表达的mRNA的双链RNA(dsRNA)能够通过已被称为RNA干扰(RNAi)的机理来阻断基因表达(Fire等,1998以及Elbashir等,2001)。短dsRNA在包括脊椎动物的许多生物体中引导基因特异性转录后沉默，并且已成为一种可用于研究基因功能的工具。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导，所述复合物是一种破坏与装载至RISC复合物中的沉默触发物同源的信使RNA的序列特异性多组分核酸酶。干扰RNA(iRNA)诸如siRNA、反义RNA和微小RNA是通过基因沉默，即通过使mRNA分子降解来抑制蛋白质的基因翻译以阻止形成蛋白质的寡核苷酸。对于在医学中的治疗应用来说，基因沉默剂正变得日益重要。

根据Watts和Corey,Journal of Pathology(2012；第226卷,第365-379页)，存在可用于设计核酸的算法，但所述算法都不是理想的。可能要采用各种实验方法来鉴定强力siRNA，因为算法不考虑诸如三级结构或RNA结合蛋白牵连的因素。因此，发现具有最小脱靶效应的强力核酸是一个复杂过程。对于这些高度带电荷分子的药物开发来说，必要的是它们可被经济地合成，分配至靶标组织中，进入细胞，并且在可接受的毒性限度内发挥功能。

然而，在避免由细胞核酸酶降解，同时维持功效和靶标特异性的情况下将核酸诸如RNA递送至细胞已被证明对于开发供治疗使用的核酸分子的领域中的人员来说具有挑战性。

因此，用于将寡核苷酸特别是双链siRNA在体内高效递送至细胞的手段正变得日益重要，并且要求特异性靶向以及实质性保护以免于遭受细胞外环境特别是血清蛋白质。一种实现特异性靶向的方法是使靶向性部分缀合于iRNA双链体剂。靶向性部分有助于使iRNA双链体剂靶向所需靶标部位，并且有需要设计适于所需受体位点的靶向性部分以使缀合的分子诸如通过胞吞作用被细胞摄取。

然而，迄今为止开发的靶向性配体并未总是转化至体内环境，并且对于更有效的受体特异性配体缀合的iRNA双链体剂以及用于其制备以达成体内递送寡核苷酸治疗剂、核酸和双链siRNA的方法存在明确需要。

并非仅阐述脂质递送系统，本发明阐述核酸自身的结构。已出乎意料地发现本发明的核酸具有增加的稳定性，从而防止所述核酸在进入细胞之前被降解。

发明内容

本发明提供了一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链和/或所述第二链包括在至少两个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。第一链可不包含在5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的任何核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

第一链和/或第二链可包括在至少两个末端3’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或第二链可包括在至少两个末端5’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

核酸可包含在第一链的3’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。核酸可包含在第二链的3’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。核酸可包含在第二链的5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键。

本发明的核酸还可包含在第一链上的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在第一链上的三个末端5’核苷酸中的每个核苷酸之间，和/或在第二链的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在第二链的三个5’核苷酸中的每个核苷酸之间的硫代磷酸酯键，此时在那个末端不存在二硫代磷酸酯键。

核酸的第一链和第二链可为单独链。核酸可包含含有第一链和第二链的单一链。

第一链和/或所述第二链的长度可各自为17-35个核苷酸，并且至少一个双链体区域可由17-25个核苷酸碱基对组成。

核酸可：a)在两个末端均是钝性末端；b)在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端；或c)在两个末端均具有突出部分。

第一链和/或第二链上的一个或多个核苷酸可被修饰以形成经修饰核苷酸。第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰。第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由至少第二修饰加以修饰，其中所述至少第二修饰不同于一个或多个奇数编号核苷酸上的修饰。一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸中的至少一者。

在本发明的核酸中，多个奇数编号核苷酸可被修饰。多个偶数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰。第一链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。第一链还可包含由第二不同修饰加以修饰的邻近核苷酸。

第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可由不同于第一链的奇数核苷酸上的修饰的修饰加以修饰，和/或第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由第一链的奇数核苷酸上的相同修饰加以修饰。第二链的一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸。第二链的多个奇数编号核苷酸可由共同修饰加以修饰，和/或多个偶数编号核苷酸可由存在于第一链奇数编号核苷酸上的相同修饰加以修饰。多个奇数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰，其中所述第二修饰不同于第一链奇数编号核苷酸上的修饰。

第二链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可为不同于第一链的奇数编号核苷酸上的修饰的第二修饰。

在本发明的核酸中，第一链中的奇数编号核苷酸中的每一个和第二链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用共同修饰加以修饰，并且第一链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用第二修饰加以修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的每一个可用第二修饰加以修饰。

本发明的核酸可具有第一链的相对于第二链的未修饰或以不同方式修饰的核苷酸，移位至少一个核苷酸的经修饰核苷酸。

第一链可包含SEQ ID NO:1的序列，和/或第二链可包含SEQ ID NO:2的序列。

一个或多个修饰可各自以及单独地选自由以下组成的组：3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧修饰、2'-氨基修饰、2'-烷基修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物修饰以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰，和/或经修饰核苷酸可为锁核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一者。至少一个修饰可为2'-O-甲基，和/或至少一个修饰可为2'-F。

本发明的核酸可与配体缀合。

除在相同末端或链处或在不同末端或链处的二硫代磷酸酯键之外，本发明的核酸也可包含在第一链和/或第二链的末端一个、两个或三个3’核苷酸和/或5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

作为第二方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链和/或所述第二链包括在至少两个末端3’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或所述第二链包括在至少两个末端5’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，并且其中所述核酸分子缀合于配体。

因此，用于本发明中的配体可包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分及其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述GalNAc部分缀合于如在任何先前方面定义的序列。接头可为二价或三价或四价分支结构。核苷酸可如本文所限定加以修饰。

配体可包括式I：

[S-X¹-P-X²]₃-A-X³- (I)

其中：

S代表糖，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；

X¹代表C₃-C₆亚烷基或(-CH₂-CH₂-O)_m(-CH₂)₂-，其中m是1、2或3；

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；

X²是亚烷基或式(-CH₂)_n-O-CH₂-亚烷基醚，其中n＝1-6；

A是分支单元；

X³代表桥接单元；

其中本发明的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地通过硫代磷酸酯)缀合于X³。

因此，本发明另外提供了一种具有以下结构中的一者的缀合核酸：

其中Z代表如本文之前所限定的核酸。

配体可包括：

本发明还提供了一种包含如本文定义的核酸或缀合核酸以及一种或多种生理上可接受的赋形剂的组合物。一种或多种赋形剂可为：

i)阳离子脂质或其药学上可接受的盐；

ii)类固醇；

iii)磷脂酰乙醇胺磷脂；

iv)PEG化脂质。

组合物中的阳离子脂质组分的含量可为脂质制剂的总脂质含量的约55mol％至约65mol％，优选地是脂质组合物的总脂质含量的约59mol％。

组合物可包含：具有以下结构的阳离子脂质：

具有以下结构的类固醇：

具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂；

以及具有以下结构的PEG化脂质；

还提供了一种用于治疗或预防疾病或病症和/或制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂的根据本发明的任何方面的核酸或缀合核酸。

本发明提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含根据本发明的任何方面的核酸或缀合核酸的组合物。核酸或缀合核酸可以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径向受试者施用。还包括了一种制备本发明的核酸或缀合核酸的方法。

具体实施方式

本发明涉及一种核酸及其组合物，所述核酸是双链的，并且针对靶标基因的表达的RNA转录物。这些核酸可用于治疗其中靶标基因产物的表达降低是合乎需要的多种疾病和病症。

本发明的第一方面涉及一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从待抑制的所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，并且其中所述第一链和/或所述第二链包括在至少两个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

任选地，第一链和/或第二链可包括在至少两个末端3’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或第二链可包括在至少两个末端5’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

任选地，第一链不包含在5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的任何核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，换句话说，它包含除在5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的任何核苷酸之间的二硫代磷酸酯键以外的键。

一相关方面是一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，其中所述核酸包含在所述第一链的3’末端的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，其中所述核酸包含各自在所述第二链的3’末端的两个末端核苷酸之间以及在所述第二链的5’末端的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，并且其中所述第一链包含在5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸之间的除二硫代磷酸酯以外的键。优选地，除二硫代磷酸酯以外的这个键联是磷酸酯或硫代磷酸酯，更优选地是(未取代)磷酸酯。优选地，两个链的核苷酸之间的除在第一链的3’末端的两个末端核苷酸之间的键联和在第二链的3’末端以及在第二链的5’末端的两个末端核苷酸之间的键联以外的所有键联都是未取代的磷酸酯键。

就核酸来说，其意指能够干扰基因表达的包含两个包含核苷酸的链的核酸。抑制可为完全的或部分的，并且以靶向方式导致基因表达的下调。核酸包含两个单独多核苷酸链；即第一链，其也可为引导链；以及第二链，其也可为过客链。第一链和第二链可为自身互补的同一多核苷酸分子的一部分，所述多核苷酸分子‘折叠'以形成双链分子。核酸可为siRNA分子。

核酸可包含核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、脱氧核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核苷酸类似物。核酸还可包含由第一链(在本领域中也被称为引导链)的全部或一部分和第二链(在本领域中也被称为过客链)的全部或一部分形成的双链核酸部分或双链体区域。双链体区域定义为以在第一链与第二链之间形成的第一碱基对开始，并且以在第一链与第二链之间形成的末个碱基对结束，包括所述第一碱基对和所述末个碱基对。

就双链体区域来说，其意指彼此通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或允许在互补或大致上互补的寡核苷酸链之间形成双链体的任何其他方式形成碱基对的两个互补或大致上互补寡核苷酸中的区域。举例来说，具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可与具有21个核苷酸单元的另一寡核苷酸进行碱基配对，但每个链上仅19个核苷酸是互补的或大致上互补的，以致“双链体区域”由19个碱基对组成。其余碱基对可以5′和3′突出部分形式，或以单链区域形式存在。此外，在双链体区域内，不要求100％互补性；在双链体区域内，大致上互补性是可允许的。大致上互补性是指各链之间的使得它们能够在生物条件下退火的互补性。用以凭经验确定两个链是否能够在生物条件下退火的技术在本领域中是熟知的。或者，可合成两个链，并且在生物条件下添加在一起以确定它们是否彼此退火。

形成至少一个双链体区域的第一链的部分和第二链的部分可为完全互补的，并且是至少部分地彼此互补的。

视核酸的长度而定，未必要求就第一链与第二链之间的碱基互补性而言的完全匹配。然而，第一链和第二链必须能够在生理条件下杂交。

第一链与第二链之间在至少一个双链体区域中的互补性可因为在任一链中都不存在核苷酸错配或额外/缺失的核苷酸而是完全的。或者，互补性可以不是完全的。互补性可为至少70％、75％、80％、85％、90％或95％。

第一链和第二链可各自包含含有至少15个连续核苷酸的互补性区域。

核酸涉及在第一链的全部或一部分与靶标核酸的一部分之间形成双链体区域。靶标核酸的与第一链形成双链体区域的部分是靶标核酸序列或简称为靶标序列，所述双链体区域定义为以在第一链与靶标序列之间形成的第一碱基对开始，并且以在第一链与靶标序列之间形成的末个碱基对结束，包括所述第一碱基对和所述末个碱基对。在第一链与第二链之间形成的双链体区域无需与在第一链与靶标序列之间形成的双链体区域相同。也就是说，第二链可具有与靶标序列不同的序列，然而，第一链必须能够与第二链和靶标序列两者形成双链体结构。

第一链与靶标序列之间的互补性可为完全的(在任一核酸中都无核苷酸错配或额外/缺失的核苷酸)。

第一链与靶标序列之间的互补性可以不是完全的。互补性可为约70％至约100％。更特别地，互补性可为至少70％、80％、85％、90％或95％或中间值。

第一链与靶标序列的互补序列之间的同一性可为约75％至约100％。更特别地，互补性可为至少75％、80％、85％、90％或95％或中间值，前提是核酸能够降低或抑制靶标基因的表达。

在第一链与靶标序列之间具有小于100％互补性的核酸可能够在与在第一链与靶标序列之间具有完全互补性的核酸相同的水平上使靶标基因的表达降低。或者，它可能够在是由具有完全互补性的核酸实现的表达水平的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的水平上使靶标基因的表达降低。

在另一方面，相较于在不存在可为核酸的抑制剂下观察到的水平，如本文所述的核酸可使细胞中靶标基因的表达降低至少10％。先前方面中的任一者的所有优选特征都也适用于这个方面。特别地，相比于在不存在抑制剂(其可为核酸)下观察到的靶标基因的表达，细胞中靶标基因的表达可被降低至90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或更小以及中间值。

核酸可包含长度各自为19-25个核苷酸的第一链和第二链。第一链和第二链可具有不同长度。

核酸的长度可为15-25个核苷酸对。核酸的长度可为17-23个核苷酸对。核酸的长度可为17-25个核苷酸对。核酸的长度可为23-24个核苷酸对。核酸的长度可为19-21个核苷酸对。核酸的长度可为21-23个核苷酸对。

核酸可包含由19-25个核苷酸碱基对组成的双链体区域。双链体区域可由17、18、19、20、21、22、23、24或25个可为连续的碱基对组成。

优选地，核酸介导RNA干扰。

在另一方面，相较于在不存在核酸或缀合核酸下观察到的表达，如所描述的核酸或缀合核酸可使其靶标转录物的表达降低至少15％。先前方面中的任一者的所有优选特征都也适用于这个方面。特别地，相比于在不存在核酸或缀合核酸下或在非沉默对照存在下观察到的靶标转录物的表达，靶标转录物的表达可被降低至至少以下给定％或小于以下给定％：90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或更小以及中间值。

在本发明的核酸中使用二硫代磷酸酯键使核酸分子群体的立体化学的变化降低，所述变化可由硫代磷酸酯键具有手性中心以及不能控制哪个非连接性氧被取代成硫所引起。二硫代磷酸酯的使用确保在那个键联中不存在手性中心，因此，视核酸分子中使用的二硫代磷酸酯和硫代磷酸酯键的数目而定，使核酸分子群体中的任何变化降低或消除。

此外，在不受理论束缚下，有可能可使用单一二硫代磷酸酯键而非两个硫代磷酸酯键，因此，使本发明的核酸内的“非天然”键的数目降低。

本发明的核酸还可包含在第一链上的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在第一链上的三个末端5’核苷酸中的每个核苷酸之间，和/或在第二链的三个3’末端核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在第二链的三个5’末端核苷酸中的每个核苷酸之间的硫代磷酸酯键，此时在那个末端不存在二硫代磷酸酯键。

本发明的核酸可包含硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键的混合物，所述混合物的实例在本文中阐述。本发明的核酸可在第一链和第二链中的每一个的3’末端包含二硫代磷酸酯。

核酸可在两个末端均是钝性末端；在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端；或在两个末端均具有突出部分。

如本文所用的“突出部分”具有它在本领域中的普通和惯用含义，即核酸的延伸超出双链核酸中的互补链的末端核苷酸的单链部分。术语“钝性末端”包括两个链在相同位置终止的双链核酸，无论一个或多个末端核苷酸是否是碱基配对的。第一链和第二链在钝性末端的末端核苷酸可为碱基配对的。第一链和第二链在钝性末端的末端核苷酸可为不配对的。第一链和第二链在钝性末端的两个末端核苷酸可为碱基配对的。第一链和第二链在钝性末端的两个末端核苷酸可为不配对的。

如本文所用的“未取代的磷酸酯”指示如通常在自然界中例如在天然DNA或RNA分子中在两个核苷酸之间所见的正常磷酸酯。这种磷酸酯可在本文中简单地指定为“磷酸酯”、“未取代的磷酸酯”或“磷酸二酯”。

核酸可在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端。核酸可在两个末端均具有突出部分。核酸可在两个末端均是钝性末端。核酸可在第一链的5'末端和第二链的3'末端，或在第一链的3'末端和第二链的5'末端是钝性末端。

核酸可在3'或5'末端包含突出部分。核酸可在第一链上具有3'突出部分。核酸可在第二链上具有3'突出部分。核酸可在第一链上具有5'突出部分。核酸可在第二链上具有5'突出部分。核酸可在第一链的5'末端与3'末端两者处均具有突出部分。核酸可在第二链的5'末端与3'末端两者处均具有突出部分。核酸可在第一链上具有5'突出部分，并且在第二链上具有3'突出部分。核酸可在第一链上具有3'突出部分，并且在第二链上具有5'突出部分。核酸可在第一链上具有3'突出部分，并且在第二链上具有3'突出部分。核酸可在第一链上具有5'突出部分，并且在第二链上具有5'突出部分。

在第二链或第一链的3'末端或5'末端的突出部分的长度可选自1、2、3、4和5个核苷酸。任选地，突出部分可由1或2个可经修饰或可未经修饰的核苷酸组成。

未修饰的多核苷酸，特别是核糖核苷酸，可倾向于由细胞核酸酶降解，因此，修饰/经修饰核苷酸可被包括在本发明的核酸中。所述修饰可有助于通过使核酸针对核酸酶更具抗性来使它们稳定。这种改进的抗性允许核酸持续更久时期在介导RNA干扰方面具有活性，并且当核酸将被用于治疗时是尤其合乎需要的。

本发明的核酸的第二链和/或第一链上的一个或多个核苷酸可被修饰。

对本发明的核酸的修饰通常提供一种在克服潜在局限性方面的强力工具，所述局限性包括但不限于为天然RNA分子所固有的体外和体内稳定性和生物可用度。本发明的核酸可由化学修饰加以修饰。经修饰核酸还可使在人中诱导干扰素活性的可能性最小。修饰还可使核酸向靶细胞的功能性递送增强。本发明的经修饰核酸可包含第一链或第二链中的任一者或两者的一个或多个经化学修饰核糖核苷酸。核糖核苷酸可包含对碱基、糖或磷酸部分的化学修饰。核糖核酸可通过用核酸或碱基的类似物进行取代或插入加以修饰。

本发明的核酸的一个或多个核苷酸可被修饰。核酸可包含至少一个经修饰核苷酸。经修饰核苷酸可在第一链上。经修饰核苷酸可在第二链中。经修饰核苷酸可在双链体区域中。经修饰核苷酸可在双链体区域外部，即在单链区域中。经修饰核苷酸可在第一链上，并且可在双链体区域外部。经修饰核苷酸可在第二链上，并且可在双链体区域外部。第一链的3’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。第二链的3’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。第一链的5’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。第二链的5’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。

本发明的核酸可具有1个经修饰核苷酸，或本发明的核酸可具有约2-4个经修饰核苷酸，或核酸可具有约4-6个经修饰核苷酸、约6-8个经修饰核苷酸、约8-10个经修饰核苷酸、约10-12个经修饰核苷酸、约12-14个经修饰核苷酸、约14-16个经修饰核苷酸、约16-18个经修饰核苷酸、约18-20个经修饰核苷酸、约20-22个经修饰核苷酸、约22-24个经修饰核苷酸、24-26个经修饰核苷酸或约26-28个经修饰核苷酸。在每种情况下，相较于相同但不具有所述经修饰核苷酸的核酸，包含所述经修饰核苷酸的核酸保留其活性的至少50％。相较于相同但不具有所述经修饰核苷酸的核酸，核酸可保留其活性的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或中间值，或可具有是不具有所述经修饰核苷酸的相同核苷酸的活性的超过100％的活性。

经修饰核苷酸可为嘌呤或嘧啶。至少半数嘌呤可被修饰。至少半数嘧啶可被修饰。所有嘌呤都可被修饰。所有嘧啶都可被修饰。经修饰核苷酸可选自由以下组成的组：3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2’修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物的核苷酸以及连接于胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷酸。

核酸可包含含有经修饰核苷酸的核苷酸，其中碱基选自2-氨基腺苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如5-溴尿苷)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、怀丁苷(wybutosine)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲基氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧基乙酸和2-硫代胞苷。碱基可为2,6-二氨基嘌呤核糖苷、吡啶-4-酮核糖苷、吡啶-2-酮核糖苷、苯基核糖苷、2,4,6-三甲氧基苯核糖苷、氨基苯基核糖苷、6-氮杂嘧啶核糖苷、丙炔核糖苷。

本文讨论的核酸包括未修饰RNA以及已被修饰例如以使功效改进的RNA，以及核苷替代物的聚合物。未修饰RNA是指其中核酸的组分即糖、碱基和磷酸部分与在自然界中存在的组分例如如天然地存在于人体中的组分相同或基本上相同的分子。如本文所用的经修饰核苷酸是指其中核苷酸的组分即糖、碱基和磷酸部分中的一个或多个不同于在自然界中存在的那个的核苷酸。尽管它们被称为经修饰核苷酸，但由于修饰，它们将当然包括不是核苷酸的分子，例如其中核糖磷酸骨架被允许在链之间进行杂交的非核糖磷酸构建体替换的多核苷酸分子，即经修饰核苷酸模拟核糖磷酸骨架。

以下描述的存在于核酸内的许多修饰将在多核苷酸分子内重复，诸如对碱基或磷酸部分的修饰，或磷酸部分的非连接性O。在一些情况下，修饰将存在于多核苷酸中所有可能的位置/核苷酸处，但在许多情况下，它将不会如此。修饰可仅存在于3′或5′末端位置处，可仅存在于末端区域中，诸如在末端核苷酸上的某一位置处或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可存在于双链区域、单链区域中或两者中。修饰可仅存在于本发明的核酸的双链区域中，或可仅存在于本发明的核酸的单链区域中。在非连接性O位置处的硫代磷酸酯修饰可仅存在于一个或两个末端处，可仅存在于末端区域中，例如在末端核苷酸上的某一位置处或在链的最后2、3、4或5个核苷酸中，或可存在于双链体中和/或单链区域中，特别是在末端。5′末端或3’末端可被磷酸化。

本发明的核酸的稳定性可通过在突出部分中包括特定碱基，或通过在单链突出部分中例如在5′或3′突出部分中或在两者中包括经修饰核苷酸来增加。嘌呤核苷酸可被包括在突出部分中。3′或5′突出部分中的碱基中的全部或一些可被修饰。修饰可包括在核糖的2′OH基团处使用修饰，使用脱氧核糖核苷酸而非核糖核苷酸，以及在磷酸酯基团中的修饰，诸如硫代磷酸酯修饰。突出部分无需与靶标序列同源。

在本发明的dsRNA剂的有义链、反义链或两个链处的5'或3'突出部分可被磷酸化。在一些实施方案中，突出部分区域含有两个在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的核苷酸，其中两个核苷酸可相同或不同。在一个实施方案中，突出部分存在于有义链、反义链或两个链的3'末端。在一个实施方案中，这个3'突出部分存在于反义链中。在一个实施方案中，这个3'突出部分存在于有义链中。

核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。然而，对核酸的化学修饰可赋予改进的性质，并且可致使寡核糖核苷酸对核酸酶更加稳定。

如本文所用的经修饰核酸可包括以下中的一个或多个：

(i)对非连接性磷酸氧中的一者或两者和/或对连接性磷酸氧(即使在本发明的核酸的5'和3'末端，也被称为连接性的)中的一个或多个的改变，例如替换；

(ii)对核糖的成分，例如对核糖上的2′羟基的改变，例如替换；

(iii)用“脱磷酸”接头对磷酸部分的替换；

(iv)对天然存在的碱基的修饰或替换；

(v)对核糖-磷酸骨架的替换或修饰；

(vi)对RNA的3′末端或5′末端的修饰，例如对末端磷酸酯基团的移除、修饰或替换，或使某一部分例如经荧光标记部分缀合于RNA的3′或5′末端。

术语替换、修饰、改变指示与天然存在的分子的差异。

以下更详细讨论特定修饰。

经修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在二硫代磷酸酯的情况下，两个非连接性氧均被硫替换。磷酸酯基团中的一个、每个或两个非连接性氧可独立地成为S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一者。

磷酸酯接头还可通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替换连接性氧加以修饰。替换可存在于末端氧处。用氮替换非连接性氧是可能的。

经修饰核苷酸可包括对糖基团的修饰。2′羟基(OH)可用许多不同“氧基”或“脱氧”取代基修饰或替换。

“氧基”-2′羟基修饰的实例包括烷氧基或芳基氧基(OR，例如R═H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2′羟基例如通过亚甲基桥连接于同一核糖的4′碳；O-胺(胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、多氨基)和氨基烷氧基O(CH2)n胺(例如胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、多氨基)。

“脱氧”修饰包括氢、卤基、氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-胺(胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、—NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；以及可任选地被例如氨基官能基取代的烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基。某些实施方案的其他取代基包括2′-甲氧基乙基、2′-OCH3、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基和2′-氟代。

糖基团还可含有一个或多个相比于核糖中相应碳的构型，具有相反立体化学构型的碳。因此，经修饰核苷酸可含有诸如阿拉伯糖的糖。

经修饰核苷酸还可包括在C—1′处缺乏核苷碱基的“无碱基”糖。这些无碱基糖还可在组成性糖原子中的一个或多个处含有修饰。

2′修饰可与一个或多个磷酸酯接头修饰(例如硫代磷酸酯)组合使用。

磷酸酯基团可单独地由非含磷连接头替换。

可替换磷酸酯基团的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、氧化乙烯接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧基甲基亚氨基。在某些实施方案中，替换可包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。

磷酸酯接头和核糖可由核酸酶抗性核苷酸替换。

实例包括吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。在某些实施方案中，可使用PNA替代物。

寡核苷酸的3′和5′末端可被修饰。所述修饰可在分子的3′末端或5′末端或两个末端。它们可包括对整个末端磷酸酯或对磷酸酯基团的原子中的一个或多个的修饰或替换。举例来说，寡核苷酸的3′和5′末端可缀合于其他功能性分子实体，诸如标记部分例如荧光团(例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)，或保护基(例如基于硫、硅、硼或酯)。功能性分子实体可通过磷酸酯基团和/或接头连接于糖。接头的末端原子可连接于或替换磷酸酯基团的连接性原子或糖的C-3′或C-5′O、N、S或C基团。或者，接头可连接于或替换核苷酸替代物(例如PNA)的末端原子。这些间隔体或接头可包括例如—(CH₂)_n—、—(CH₂)_nN—、—(CH₂)_nO—、—(CH₂)_nS—、—O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O—(例如n＝3或6)、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、氧基胺、氧基亚胺、硫醚、二硫醚、硫脲、磺酰胺或吗啉代、或生物素和荧光素试剂。3′末端可为—OH基团。

末端修饰的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素(psoralene)、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、得克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶、EDTA、亲脂性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六基)甘油、香叶基氧基己基、十六基甘油、龙脑(borneol)、薄荷醇(menthol)、1,3-丙二醇、十七基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、多氨基、烷基、取代的烷基、经放射性标记的标记、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如阿司匹林(aspirin)、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)。

末端修饰可由于许多原因而添加，包括用以调节活性或用以调节对降解的抗性。可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物对5′末端的修饰。本发明的核酸在第一链或第二链上可加以5′磷酸化，或在5′末端包括磷酰基类似物。5′-磷酸酯修饰包括可与RISC介导的基因沉默相容的那些。适合修饰包括：5′-单磷酸酯((HO)₂(O)P—O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)₂(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)₂(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)和任何经修饰或未修饰核苷酸帽结构(N—O-5′-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)₂(S)P—O-5′)；5′-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P—O-5′)、5′-硫代磷酸酯((HO)₂(O)P—S-5′)；氧/硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何额外组合(例如5′-α-硫代三磷酸酯、5′-γ-硫代三磷酸酯等)、5′-氨基磷酸酯((HO)2(O)P—NH-5′、(HO)(NH₂)(O)P—O-5′)、5′-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)—O-5′-、(OH)₂(O)P-5′-CH₂-)、5'乙烯基膦酸酯、5′-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH₂-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)—O-5′-)。

本发明的核酸可在第一链和/或第二链的末端中的一个或多个上包括一个或多个硫代磷酸酯修饰。任选地，第一链的每个或任一末端可包含一个或两个或三个经硫代磷酸酯修饰的核苷酸。任选地，第二链的每个或任一末端可包含一个或两个或三个经硫代磷酸酯修饰的核苷酸。任选地，第一链的两个末端以及第二链的5’末端可包含两个经硫代磷酸酯修饰的核苷酸。就经硫代磷酸酯修饰的核苷酸来说，其意指所述核苷酸与邻近核苷酸之间的键联包含硫代磷酸酯基团而非标准磷酸酯基团。

末端修饰还可用于监测分布，并且在所述情况下，待添加的基团可包括荧光团，例如荧光素或Alexa染料。末端修饰还可用于使摄取增强，可用于此的修饰包括胆固醇。末端修饰还可用于使RNA剂交联于另一部分。

腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是见于RNA中的最常见碱基。这些碱基可被修饰或替换以提供具有改进的性质的RNA。举例来说，核酸酶抗性寡核糖核苷酸可用这些碱基或用合成和天然核苷碱基(例如肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟苷或杀结核菌素(tubercidine))以及以上修饰中的任一者制备。或者，可采用以上碱基和“通用碱基”中的任一者的经取代或经修饰类似物。实例包括2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、8-卤基、氨基、硫醇、硫烷基、羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、3-脱氮杂-5-氮杂胞嘧啶、2-氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶、7-脱氮杂腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1,2,4-三唑、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N<4>-乙酰基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、N-甲基鸟嘌呤或O-烷基化碱基。

如本文所用，术语“非配对核苷酸类似物”意指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，所述非碱基配对部分包括但不限于：6脱氨基腺苷(水粉蕈素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其他实施方案中，它是脱氧核糖核苷酸。

如本文所用，术语“末端官能团”包括不限于卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。

某些部分可连接于第一链或第二链的5'末端，并且包括无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、对无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分的修饰，包括2′O烷基修饰；倒置无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分及其修饰、C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5′OMe核苷酸；以及核苷酸类似物，包括4′,5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃赤藓糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏式-呋喃戊糖基核苷酸；无环3′,4′-断核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸、5′-5′-倒置无碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；以及桥接或非桥接甲基膦酸酯和5′-巯基部分。

本发明的核酸可以一个或多个倒置核苷酸例如倒置胸苷或倒置腺嘌呤形式加以包括(例如参见Takei等,2002.JBC 277(26):23800-06)。

如本文所用，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“降低”意指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子(例如mRNA)的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基或肽的活性被降低至低于在不存在本发明的核酸下或关于与人转录物不具有已知同源性的siRNA分子(在本文中被称为非沉默对照)观察到的表达或水平或活性。所述对照可以与本发明的分子类似的方式加以缀合和修饰，并且通过相同途径递送至靶细胞中；举例来说，相比于在不存在抑制剂(其可为核酸)下或在非沉默对照(其可为非互补于靶标序列的核酸)存在下观察到的表达，表达可被降低至90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或更小。

本发明的核酸可包含无碱基核苷酸。如本文所用的术语“无碱基”是指缺乏碱基或在1'位具有其他化学基团而非碱基的部分，例如3',3'-连接或5',5'-连接的脱氧无碱基核糖衍生物。

核酸可包含在第二链和/或第一链上的一个或多个经修饰核苷酸。交替核苷酸可被修饰以形成经修饰核苷酸。

如本文所述的交替意指以规则方式相继发生。换句话说，交替意指重复依次发生。举例来说，如果一个核苷酸被修饰，那么下一连续核苷酸不被修饰，并且随后连续核苷酸被修饰，以此类推。一个核苷酸可用第一修饰加以修饰，下一连续核苷酸可用第二修饰加以修饰，并且随后连续核苷酸用所述第一修饰加以修饰，以此类推，其中所述第一修饰和所述第二修饰是不同的。

本发明的核酸的第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第一链按5’至3’编号，5’端核苷酸是第一链的1号核苷酸。如本文所述的术语“奇数编号”意指不可被二整除的编号。奇数编号的实例是1、3、5、7、9、11等。本发明的核酸的第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第一链按5’至3’编号。如本文所述的术语“偶数编号”意指可被二均等整除的编号。偶数编号的实例是2、4、6、8、10、12、14等。本发明的核酸的第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第二链按3'至5'编号，3’端核苷酸是第二链的1号核苷酸。本发明的核酸的第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第二链按3'至5'编号。

第一链和/或第二链上的一个或多个核苷酸可被修饰以形成经修饰核苷酸。第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰。第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由至少第二修饰加以修饰，其中所述至少第二修饰不同于一个或多个奇数核苷酸上的修饰。一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸中的至少一者。

在本发明的核酸中，第一链中的多个奇数编号核苷酸可被修饰。第一链中的多个偶数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰。第一链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。第一链还可包含由第二不同修饰加以修饰的邻近核苷酸。

第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可由不同于第一链上的奇数编号核苷酸的修饰的修饰加以修饰，和/或第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由第一链的奇数编号核苷酸的相同修饰加以修饰。第二链的一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸。第二链的多个奇数编号核苷酸可由共同修饰加以修饰，和/或多个偶数编号核苷酸可由存在于第一链奇数编号核苷酸上的相同修饰加以修饰。第二链上的多个奇数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰，其中所述第二修饰不同于第一链奇数编号核苷酸的修饰。

第二链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可为不同于第一链的奇数编号核苷酸的修饰的第二修饰。

在本发明的核酸中，第一链中的奇数编号核苷酸中的每一个和第二链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用共同修饰加以修饰，并且第一链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用第二修饰加以修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的每一个可用所述第二修饰加以修饰。

第一链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。第一链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。第一链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个可由共同修饰加以修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。第一链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可由共同修饰加以修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。

本发明的核酸可包括单链或双链构建体，所述构建体在链中的一者或两者中包含至少两个具有交替修饰的区域。这些交替区域可包含多达约12个核苷酸，但优选地包含约3至约10个核苷酸。交替核苷酸的区域可位于本发明的核酸的一个或两个链的末端。核酸可在每个末端(3'和5')包含具有交替核苷酸的4至约10个核苷酸，并且这些区域可由约5至约12个连续未修饰或以不同方式或以共同方式修饰的核苷酸分隔。

第一链的奇数编号核苷酸可被修饰，并且偶数编号核苷酸可用第二修饰加以修饰。第二链可包含用共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可与第一链的奇数编号核苷酸的修饰相同。第二链的一个或多个核苷酸还可用第二修饰加以修饰。一个或多个具有第二修饰的核苷酸可彼此邻近，并且邻近于具有与第一链的奇数编号核苷酸的修饰相同的修饰的核苷酸。第一链还可包含在3’末端以及在5’末端在两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。第二链可包含在5’末端在两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。第二链还可在5’末端缀合于配体。

本发明的核酸可包含含有用共同修饰加以修饰的邻近核苷酸的第一链。所述核苷酸中的一个或多个可邻近于一个或多个可用第二修饰加以修饰的核苷酸。一个或多个具有第二修饰的核苷酸可为邻近的。第二链可包含用共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可与第一链的一个或多个核苷酸的修饰中的一者相同。第二链的一个或多个核苷酸还可用第二修饰加以修饰。一个或多个具有第二修饰的核苷酸可为邻近的。第一链还可包含在5’末端以及在3’末端在两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。第二链可包含在3’末端在两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。第二链还可在5’末端缀合于配体。

在第一链上编号(在第一链上从5'至3'以及在第二链上从3'至5')为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的核苷酸可由修饰加以修饰。在第一链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由第二修饰加以修饰。在第二链上编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可由修饰加以修饰。在第二链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由第二修饰加以修饰。对于本发明的核酸，核苷酸在第一链上从5'至3'以及在第二链上从3'至5'加以编号。

在第一链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由修饰加以修饰。在第一链上编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可由第二修饰加以修饰。在第二链上编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可由修饰加以修饰。在第二链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由第二修饰加以修饰。

明显的是，如果第一链和/或第二链的长度短于25个核苷酸，诸如长度为19个核苷酸，那么不存在编号为20、21、22、23、24和25的核苷酸被修饰。技术熟练人员会了解以上描述相应地适用于较短链。

第一链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第二链上的具有共同修饰的经修饰核苷酸配对。第一链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第二链上的具有不同修饰的经修饰核苷酸配对。第一链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第二链上的未修饰核苷酸配对。第二链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第一链上的未修饰核苷酸配对。换句话说，可使两个链上的交替核苷酸对准，诸如(例如)第二链的交替区域中的所有修饰都与第一链中的相同修饰配对，或替代地，修饰可偏移一个核苷酸，其中一个链的交替区域中的共同修饰与另一链中的相异修饰(即第二或其他修饰)配对。另一选项是在链中的每一个中具有相异修饰。

相对于第二链上的经修饰核苷酸，第一链上的修饰可移位一个核苷酸，以使以共同方式修饰的核苷酸不彼此配对。

一个或多个修饰可各自以及单独地选自由以下组成的组：3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧修饰、2'-氨基修饰、2'-烷基修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物修饰以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰，和/或经修饰核苷酸可为锁核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一者。

至少一个修饰可为2'-O-甲基，和/或至少一个修饰可为2'-F。如本文所述的其他修饰可存在于第一链和/或第二链上。

本发明的核酸可在链末端中的一者或若干者处包含倒置RNA核苷酸。所述倒置核苷酸对核酸提供稳定性。优选地，核酸在链中的至少一者的3’末端中的一者或若干者处和/或在第二链的5’末端包含至少某一倒置核苷酸。更优选地，核酸在第二链的3’末端包含倒置核苷酸。最优选地，核酸在第二链的3’末端包含倒置RNA核苷酸，并且这个核苷酸优选地是倒置A。倒置核苷酸优选地不以突出部分形式，而是以与另一链中的相应核苷酸相对的方式存在于链的末端。具有这种修饰的核酸是稳定的，并且易于合成。

在整个发明描述中，“相同或共同修饰”意指对任何核苷酸进行的相同修饰，如A、G、C或U用诸如甲基或氟代的基团加以修饰。这不用于意指在相同核苷酸上具有相同添加物。举例来说，2′F-dU、2′F-dA、2′F-dC、2′F-dG全都被视为是相同或共同修饰，2'-OMe-rU、2'-OMe-rA；2'-OMe-rC；2'-OMe-rG也是如此。2’F修饰是不同于2’OMe修饰的修饰。

本发明的一些代表性经修饰核酸序列显示于实例中。这些实例意图是代表性的而非限制性的。

优选地，核酸可包含某一修饰以及第二或其他修饰，所述修饰各自以及单独地选自包含2'-O-甲基修饰和2'-F修饰的组。核酸可包含是可为第一修饰的2'-O-甲基(2’OMe)的修饰，以及是2'-F的第二修饰。本发明的核酸还可包括可存在于每个或两个链的每个或任何末端的末端1、2或3个核苷酸中或之间的硫代磷酸酯修饰和/或脱氧修饰。

本发明的核酸可缀合于配体以形成缀合物。

一些配体可具有内体溶解性质。内体溶解性配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质的运输。内体溶解性配体可为显示pH依赖性膜活性和致融合性的多阴离子肽或肽模拟物。内体溶解性组分可含有响应于pH变化而经受电荷变化或质子化的化学基团。内体溶解性组分可为线性的或分支的。

配体可包括例如用于增强摄取的治疗性修饰剂；例如用于监测分布的诊断化合物或报道基团；交联剂；以及核酸酶抗性赋予部分。一般性实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺和肽模拟物。配体可包括天然存在的物质，诸如蛋白质、碳水化合物或脂质。配体可为重组或合成分子。

配体还可包括靶向性基团，例如细胞或组织靶向剂。靶向性配体可为凝集素(lectin)、糖蛋白、脂质或蛋白质。

配体的其他实例包括染料、嵌入剂、交联剂、卟啉、多环芳烃、人工核酸内切酶或螯合剂、亲脂性分子、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG、MPEG、烷基、取代的烷基、经放射性标记的标记、酶、半抗原、运输/吸收促进剂、合成核糖核酸酶或咪唑簇。

配体可为蛋白质，例如糖蛋白或肽。配体还可为激素或激素受体。它们还可包括非肽种类，诸如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素或辅因子。

配体可为可例如通过破坏细胞的细胞骨架来使核酸向细胞中的摄取增加的物质诸如药物。

配体可通过使炎症性应答活化来使核酸向细胞中的摄取增加。所述配体包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β或γ干扰素。

配体可为脂质或基于脂质的分子。脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白质。优选地，基于脂质的配体结合人血清白蛋白(HSA)。脂质或基于脂质的分子可使缀合物对降解的抗性增加，使向靶细胞的靶向或运输增加，和/或可调整与血清蛋白质的结合。基于脂质的配体可用于调节缀合物与靶标组织的结合。

配体可为类固醇。优选地，配体是胆固醇或胆固醇衍生物。

配体可为由靶细胞摄取的部分例如维生素。示例性维生素包括维生素A、E、K以及B族维生素。维生素可被增殖细胞摄取，此可用于将核酸递送至细胞诸如恶性或非恶性肿瘤细胞。

配体可为细胞穿透剂，诸如螺旋细胞穿透剂。优选地，这种穿透剂是两亲性的。

配体可为肽或肽模拟物。肽模拟物是能够折叠成类似于天然肽的确定三维结构的分子。肽或肽模拟物配体可包括天然存在的肽或经修饰肽或两者。肽或肽模拟物可为细胞穿透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽。肽部分可为树枝状聚合物肽、受约束肽或交联肽。肽部分可包括疏水性膜易位序列。肽部分可为能够携带大型极性分子诸如肽、寡核苷酸和蛋白质跨越细胞膜的肽，例如来自HIV Tat蛋白的序列(GRKKRRQRRRPPQ)和来自果蝇触角足蛋白(Drosophila Antennapedia protein)的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK)。优选地，肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽。

配体可为能够穿透例如微生物细胞或哺乳动物细胞的细胞穿透肽。

配体可为药物代谢动力学调节剂。药物代谢动力学调节剂可为亲脂体、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。

当存在两种或更多种配体时，配体可全都具有相同性质，全都具有不同性质，或一些配体具有相同性质，而其他配体具有不同性质。举例来说，配体可具有靶向性质，具有内体溶解活性，或具有PK调节性质。在一优选实施方案中，所有配体都具有不同性质。

配体可在3’末端、5’末端和/或在内部位置处偶联于核酸。优选地，配体通过间插栓系物或接头偶联于核酸。

在一些实施方案中，核酸是双链核酸。在双链核酸中，配体可连接于一个或两个链。在一些实施方案中，双链核酸含有缀合于有义链的配体。在其他实施方案中，双链核酸含有缀合于反义链的配体。

配体可缀合于核酸分子的核苷碱基、糖部分或核苷间键联。与嘌呤核苷碱基或其衍生物的缀合可发生在包括环内和环外原子的任何位置处。与嘧啶核苷酸或其衍生物的缀合也可发生在任何位置处。与核苷的糖部分的缀合可发生在任何碳原子处。与核苷间键联的缀合可发生在含磷键的磷原子处，或在键合于磷原子的氧、氮或硫原子处。对于含有胺或酰胺的核苷间键联，缀合可发生在胺或酰胺的氮原子处，或关于邻近碳原子而发生。

配体通常是碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖或多糖。配体可通过接头缀合于核酸。接头可为单价、二价或三价分支接头。

用于将寡核苷酸特别是本发明的双链核酸在体内高效递送至细胞的手段是重要的，并且要求特异性靶向以及实质性保护以免于遭受细胞外环境特别是血清蛋白质。一种实现特异性靶向的方法是使靶向性部分或配体缀合于核酸。靶向性部分有助于使核酸靶向所需靶标部位，并且有需要缀合适于所需受体位点的靶向性部分以使缀合的分子诸如通过胞吞作用被细胞摄取。靶向性部分或配体可为能够靶向特定受体的任何部分或配体。

举例来说，无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)是一种高能力受体，其在肝细胞上是高度充足的。三触角簇糖苷的最初公开内容中的一者在美国专利号US 5,885,968中。具有三个GalNAc配体，并且包含磷酸酯基团的缀合物是已知的，并且描述于Dubber等(2003)中。ASGP-R对N-乙酰基-D-半乳糖基胺(GalNAc)的亲和力比对D-Gal的亲和力高50倍。

表达特异性识别糖基化蛋白质或其他寡糖的末端β-半乳糖基亚基(P.H.Weigel等,2002)的凝集素(无唾液酸糖蛋白受体；ASGPR)的肝细胞可用于通过使半乳糖或半乳糖胺共价偶联于药物物质来使药物靶向肝(Ishibashi,S.；等,J Biol.Chem.1994年11月11日；269(45):27803-6)。此外，结合亲和力可通过多价效应而显著增加，所述多价效应通过使靶向性单元重复来实现(Biessen EA，等,J Med Chem.1995年4月28日；38(9):1538-46)。

ASGPR是用于达成含有末端β-半乳糖基的糖蛋白的主动内体运输的介体，因此，ASGPR高度适于达成必须递送至细胞中的药物候选物如核酸的靶向递送(Akinc等)。

糖，也可被称为配体，可被选择来对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。特别地，受体在哺乳动物肝细胞的表面上，例如肝无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)。

糖可选自N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和海藻糖。糖可为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。

配体可包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分及其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述GalNAc部分缀合于如在任何先前方面定义的核酸。接头可为二价或三价或四价分支结构。核苷酸可如本文所限定加以修饰。

“GalNAc”是指2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常被称为N-乙酰基半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰基半乳糖胺”包括β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者。β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者可互换使用。优选地，本发明化合物包含β形式，即2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖。

配体可包含GalNAc。

配体可包括式I化合物：

[S-X¹-P-X²]₃-A-X³- (I)

其中：

S代表糖，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；

X²是亚烷基或式(-CH₂)_n-O-CH₂-亚烷基醚，其中n＝1-6；

A是分支单元；

X³代表桥接单元；

在式I中，分支单元“A”分成三支以接纳三个糖配体。分支单元共价连接于配体和核酸。分支单元可包括分支脂族基团，所述分支脂族基团包含选自烷基、酰胺基团、二硫醚基团、聚乙二醇基团、醚基团、硫醚基团和羟基氨基的基团。分支单元可包含选自烷基和醚基团的基团。

分支单元A可具有选自以下的结构：

其中每个A₁独立地代表O、S、C＝O或NH；并且

每个n独立地代表从1至20的整数。

分支单元可具有选自以下的结构：

其中每个A₁独立地代表O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地代表从1至20的整数。分支单元可具有选自以下的结构：

其中A₁是O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地代表从1至20的整数。分支单元可具有结构：

分支单元可具有结构：

分支单元可具有结构：

任选地，分支单元仅由碳原子组成。

“X³”部分是桥接单元。桥接单元是直链，并且共价结合于分支单元和核酸。

X³可选自-C₁-C₂₀亚烷基-、-C₂-C₂₀亚烯基-、式-(C₁-C₂₀亚烷基)–O–(C₁-C₂₀亚烷基)-亚烷基醚、-C(O)-C₁-C₂₀亚烷基-、-C₀-C₄亚烷基(Cy)C₀-C₄亚烷基-，其中Cy代表取代或未取代的5或6元亚环烷基、亚芳基、亚杂环基或亚杂芳基环，-C₁-C₄亚烷基-NHC(O)-C₁-C₄亚烷基-、-C₁-C₄亚烷基-C(O)NH-C₁-C₄亚烷基-、-C₁-C₄亚烷基-SC(O)-C₁-C₄亚烷基-、-C₁-C₄亚烷基-C(O)S-C₁-C₄亚烷基-、-C₁-C₄亚烷基-OC(O)-C₁-C₄亚烷基-、-C₁-C₄亚烷基-C(O)O-C₁-C₄亚烷基-和-C₁-C₆亚烷基-S-S-C₁-C₆亚烷基-。

X³可为式-(C₁-C₂₀亚烷基)–O–(C₁-C₂₀亚烷基)-亚烷基醚。X³可为式-(C₁-C₂₀亚烷基)–O–(C₄-C₂₀亚烷基)-亚烷基醚，其中所述(C₄-C₂₀亚烷基)连接于Z。X³可选自由以下组成的组：-CH₂-O-C₃H₆-、-CH₂-O-C₄H₈-、-CH₂-O-C₆H₁₂-和-CH₂-O-C₈H₁₆-，尤其是-CH₂-O-C₄H₈-、-CH₂-O-C₆H₁₂-和-CH₂-O-C₈H₁₆-，其中在每种情况下，-CH₂-基团连接于A。

配体可包括式(II)的化合物：

[S-X¹-P-X²]₃-A-X³ (II)

其中：

S代表糖；

X¹代表C₃-C₆亚烷基或乙二醇主干(-CH₂-CH₂-O)_m(-CH₂)₂-，其中m是1、2或3；

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；

X²是C₁-C₈亚烷基；

A是选自以下的分支单元：

X³是桥接单元；

分支单元A可具有结构：

分支单元A可具有结构：

其中X³连接于氮原子。

X³可为C₁-C₂₀亚烷基。优选地，X³选自由以下组成的组：-C₃H₆-、-C₄H₈-、-C₆H₁₂-和-C₈H₁₆-，尤其是-C₄H₈-、-C₆H₁₂-和-C₈H₁₆-。

配体可包括式(III)的化合物：

[S-X¹-P-X²]₃-A-X³ (III)

其中：

S代表糖；

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；

X²是式-C₃H₆-O-CH₂-亚烷基醚；

A是分支单元；

X³是具有选自由以下组成的组的式的亚烷基醚：-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-O-C₂H₄-、-CH₂-O-C₃H₆-、-CH₂-O-C₄H₈-、-CH₂-O-C₅H₁₀-、-CH₂-O-C₆H₁₂-、-CH₂-O-C₇H₁₄-和-CH₂-O-C₈H₁₆-，其中在每种情况下，-CH₂-基团连接于A，

分支单元可包括碳。优选地，分支单元是碳。

X³可选自由以下组成的组：-CH₂-O-C₄H₈-、-CH₂-O-C₅H₁₀-、-CH₂-O-C₆H₁₂-、-CH₂-O-C₇H₁₄-和-CH₂-O-C₈H₁₆-。优选地，X³选自由以下组成的组：-CH₂-O-C₄H₈-、-CH₂-O-C₆H₁₂-和-CH₂-O-C₈H₁₆。

对于以上方面中的任一者，P代表经修饰的磷酸酯基团。P可由以下表示：

其中Y¹和Y²各自独立地代表＝O、＝S、-O^-、-OH、-SH、-BH₃、-OCH₂CO₂、-OCH₂CO₂R^x、-OCH₂C(S)OR^x和–OR^x，其中R^x代表C₁-C₆烷基，并且其中

指示与化合物的其余部分的连接。

就经修饰的磷酸酯来说，其意指其中氧中的一个或多个被替换的磷酸酯基团。经修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在二硫代磷酸酯的情况下，两个非连接性氧均被硫替换。磷酸酯基团中的一个、每个或两个非连接性氧可独立地成为S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一者。

举例来说，Y¹可代表-OH，并且Y²可代表＝O或＝S；或

Y¹可代表-O^-，并且Y²可代表＝O或＝S；

Y¹可代表＝O，并且Y²可代表–CH₃、-SH、-OR^x或–BH₃

Y¹可代表＝S，并且Y²可代表–CH₃、OR^x或–SH。

技术熟练人员应了解，在某些情况下，在Y¹与Y²之间将存在离域。

优选地，经修饰的磷酸酯基团是硫代磷酸酯基团。硫代磷酸酯基团包括双硫代磷酸酯(即其中Y¹代表＝S，并且Y²代表–S^-)和单硫代磷酸酯(即其中Y¹代表-O^-，并且Y²代表＝S，或其中Y¹代表＝O，并且Y²代表–S^-)。优选地，P是单硫代磷酸酯。本发明者已发现具有替换磷酸酯基团的硫代磷酸酯基团的缀合物在体内具有改进的效能和作用持续时间。

P还可为乙基磷酸酯(即其中Y¹代表＝O，并且Y²代表OCH₂CH₃)。

对于以上方面中的任一者，糖可选自具有半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和果糖中的一个或多个的N-乙酰基。优选地，糖是两分子的N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。本发明化合物可具有3个配体，所述配体各自优选地是N-乙酰基半乳糖胺。

“GalNAc”是指2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常被称为N-乙酰基半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰基半乳糖胺”包括β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者。在某些实施方案中，β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者可互换使用。优选地，本发明化合物包含β形式，即2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖。

2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖

2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖

2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖

对于以上式(III)的化合物中的任一者，X¹可为乙二醇主干(-CH₂-CH₂-O)_m(-CH₂)₂-，其中m是1、2或3。X¹可为(-CH₂-CH₂-O)(-CH₂)₂-。X¹可为(-CH₂-CH₂-O)₂(-CH₂)₂-。X¹可为(-CH₂-CH₂-O)₃(-CH₂)₂-。优选地，X¹是(-CH₂-CH₂-O)₂(-CH₂)₂-。或者，X¹代表C₃-C₆亚烷基。X¹可为亚丙基。X¹可为亚丁基。X¹可为亚戊基。X¹可为亚己基。优选地，烷基是直链亚烷基。特别地，X¹可为亚丁基。

对于式(III)的化合物，X²代表式-C₃H₆-O-CH₂-亚烷基醚，即C₃烷氧基亚甲基或–CH₂CH₂CH₂OCH₂-。

其中Z代表如本文之前所限定的核酸。

式(I)、(II)或(III)配体可连接在第一(反义)链的3’末端，和/或连接在第二(有义)链的3’末端和/或5’末端中的任一者处。核酸可包含超过一个式(I)、(II)或(III)配体。然而，单一式(I)、(II)或(III)配体是优选的，因为单一所述配体足以达成核酸高效靶向靶细胞。

优选地，第一(反义)链的5’末端不连接于式(I)、(II)或(III)配体，因为在这个位置中的配体可潜在干扰核酸的生物活性。

相比于在3’末端具有相同配体的相同核酸，在链的5’末端具有单一式(I)、(II)或(III)配体的核酸得以可更容易，并且因此更廉价地合成。因此，优选地，具有式(I)、(II)或(III)中的任一者的单一配体共价连接于核酸的第二链的5’末端(与所述5’末端缀合)。

在一个实施方案中，核酸缀合于包含脂质的配体，并且更优选地缀合于包含胆固醇的配体。

本发明缀合物可包含如本文公开的任何核酸缀合于如本文公开的任何一个或多个配体。

本发明还涉及一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的缀合物，所述缀合物包含含有本发明的任何方面的核酸的核酸部分和至少一个配体部分，所述至少一个配体部分包含接头部分，优选地包含丝氨醇衍生接头部分，以及用于在体内靶向细胞，并且只缀合于一个或两个RNA链的3'和/或5'末端的靶向性配体，其中第一RNA链的5'末端未被缀合，其中：

(i)第二RNA链在5'末端缀合于所述靶向性配体，并且其中(a)第二RNA链还在3'末端缀合于所述靶向性配体，并且第一RNA链的3'末端未被缀合；或(b)第一RNA链在3'末端缀合于所述靶向性配体，并且第二RNA链的3'末端未被缀合；或(c)第二RNA链与第一RNA链两者均还在3'末端缀合于所述靶向性配体；或

(ii)第二RNA链与第一RNA链两者均在3'末端缀合于所述靶向性配体，并且第二RNA链的5'末端未被缀合。

在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)在5’末端缀合于靶向性配体，第一RNA链(即反义链)在3’末端缀合于靶向性配体，并且第二RNA链(即有义链)的3’末端未被缀合，以致形成具有如图16A中所示的示意结构的缀合物。

在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)在5’末端缀合于靶向性配体，第二RNA链(即有义链)还在3’末端缀合于靶向性配体，并且第一RNA链(即反义链)的3’末端未被缀合，以致形成具有如图16B中所示的示意结构的缀合物。

在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)与第一RNA链(即反义链)两者均在3’末端缀合于靶向性配体，并且第二RNA链(即有义链)的5’末端未被缀合，以致形成具有如图16C中所示的示意结构的缀合物。

在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)在5’末端缀合于靶向性配体，并且第二RNA链(即有义链)与第一RNA链(即反义链)两者均还在3’末端缀合于靶向性配体，以致形成具有如图16D中所示的示意结构的缀合物。

在以上实施方案中的任一者中，

指示使配体缀合于核酸部分的末端的接头；配体可为GalNAc部分诸如GalNAc；并且如16E中所示的示意结构代表核酸部分。

这些示意图不意图限制第一链或第二链中的核苷酸的数目，各图也不代表关于碱基的互补性的任何种类的限制或任何其他限制。

配体可为单体或多聚的(例如二聚的、三聚的等)。

适合地，配体是单体，因此含有单一靶向性配体部分，例如单一GalNAc部分。

或者，配体可为二聚配体，其中配体部分包含两个接头部分诸如丝氨醇衍生接头部分或非丝氨醇接头部分，各自连接于单一靶向性配体部分。

或者，配体可为三聚配体，其中配体部分包含三个接头部分诸如丝氨醇衍生接头部分或非丝氨醇接头部分，各自连接于单一靶向性配体部分。

两个或三个丝氨醇衍生接头部分可例如如下所示加以串联连接：

其中n是1或2，并且Y是S或O。

优选地，配体是单体。

适合地，缀合RNA链通过包括另一接头的接头部分缀合于靶向性配体，其中所述另一接头是或包含饱和、未分支或分支C_1-15烷基链，其中任选地，一个或多个碳(例如1、2或3个碳，适合地是1或2个碳，特别是1个碳)由选自O、N、S(O)_p的杂原子替换，其中p是0、1或2(例如CH₂基团用O，或用NH，或用S，或用SO₂替换，或在链的末端或在分支上的–CH₃基团用OH或用NH₂替换)，其中所述链任选地被一个或多个氧代基(例如1至3诸如1个基团)取代。

适合地，接头部分是丝氨醇衍生接头部分。

更适合地，另一接头包含饱和、未分支C_1-15烷基链，其中一个或多个碳(例如1、2或3个碳，适合地是1或2个碳，特别是1个碳)由氧原子替换。

更适合地，另一接头包含PEG链。

更适合地，另一接头包含饱和、未分支C_1-15烷基链。

更适合地，另一接头包含饱和、未分支C_1-6烷基链。

更适合地，另一接头包含饱和、未分支C₄或C₆烷基链，例如C₄烷基链。

在一实施方案中，

是式(V)连接部分：

其中n、Y和L₁如下所限定，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。

因此，在一实施方案中，靶向性配体部分是式(VI)连接部分：

适合地，

是式(XIV)连接部分：

其中n、Y、R₁和L如下所限定，L连接于靶向性配体例如GalNAc，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。

适合地，靶向性配体部分是式(IV)连接部分：

其中n、Y、R₁和L如下所限定，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。

适合地，

是式(VII)连接部分：

其中n、Y和L₂如下所限定，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。

适合地，靶向性配体部分是式(VIII)连接部分：

适合地，

是式(IX)连接部分：

其中F、Y和L如下所限定，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。

适合地，靶向性配体部分是式(IXa)连接部分：

适合地，L是：

在以上结构中的任一者中，适合地，配体选自GalNAc和半乳糖部分，尤其是GalNAc部分。或者，GalNAc可由另一靶向性配体例如糖替换。

在本发明的一实施方案中，第一RNA链是式(X)的化合物：

其中b是0或1；并且

第二RNA链是式(XI)的化合物：

其中：

c和d独立地是0或1；

Z₁和Z₂分别是第一RNA链和第二RNA链的RNA部分；

Y是O或S；

n是0、1、2或3；并且

L₁是连接至配体的接头；

并且其中b+c+d是2或3。

适合地，第一RNA链是式(XV)的化合物：

其中b是0或1；并且

第二RNA链是式(XVI)的化合物：

其中c和d独立地是0或1；

其中：

Z₁和Z₂分别是第一RNA链和第二RNA链的RNA部分；

Y是O或S；

R₁是H或甲基；

n是0、1、2或3；并且

在式(XV)和(XVI)中，L是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：

-(CH₂)_r-C(O)-，其中r＝2-12；

-(CH₂-CH₂-O)_s-CH₂-C(O)-，其中s＝1-5；

-(CH₂)_t-CO-NH-(CH₂)_t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；

-(CH₂)_u-CO-NH-(CH₂)_u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和

-(CH₂)_v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且

其中末端C(O)(如果存在)连接于NH基团；

并且其中b+c+d是2或3。

适合地，第一RNA链是式(XII)的化合物：

其中b是0或1；并且

第二RNA链是式(XIII)的化合物：

其中：

c和d独立地是0或1；

Z₁和Z₂分别是第一RNA链和第二RNA链的RNA部分；

Y是O或S；

n是0、1、2或3；并且

在式(XII)和(XIII)中，L₂是相同的或不同的，并且在由b、c和d加括号的部分中，是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：

n是0，并且L₂是：

并且末端OH基团不存在，以致形成以下部分：

其中

F是饱和、分支或未分支(诸如未分支)C_1-8烷基(例如C_1-6烷基)链，其中碳原子中的一者任选地用氧原子替换，前提是所述氧原子与另一杂原子(例如O或N原子)由至少2个碳原子分隔；

在式(XII)和(XIII)中，L是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：

-(CH₂)_r-C(O)-，其中r＝2-12；

-(CH₂-CH₂-O)_s-CH₂-C(O)-，其中s＝1-5；

-(CH₂)_t-CO-NH-(CH₂)_t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；

-(CH₂)_u-CO-NH-(CH₂)_u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和

-(CH₂)_v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且

其中末端C(O)(如果存在)连接于NH基团；

并且其中b+c+d是2或3。

在其中存在GalNAc的上式中的任一者中，GalNAc可被替代成任何其他靶向性配体诸如本文提及的那些。

适合地，b是0，c是1，并且d是1；b是1，c是0，并且d是1；b是1，c是1，并且d是0；或b是1，c是1，并且d是1。

更适合地，b是0，c是1，并且d是1；b是1，c是0，并且d是1；或b是1，c是1，并且d是1。

最适合地，b是0，c是1，并且d是1。

在一个实施方案中，Y是O。在另一实施方案中，Y是S。

在一个实施方案中，R₁是H或甲基。在一个实施方案中，R₁是H。在另一实施方案中，R₁是甲基。

在一个实施方案中，n是0、1、2或3。适合地，n是0。

在一个实施方案中，L选自由以下组成的组：

-(CH₂)_r-C(O)-，其中r＝2-12；

-(CH₂-CH₂-O)_s-CH₂-C(O)-，其中s＝1-5；

-(CH₂)_t-CO-NH-(CH₂)_t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；

-(CH₂)_u-CO-NH-(CH₂)_u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和

-(CH₂)_v-NH-C(O)-，其中v是2-12；

其中末端C(O)连接于NH基团。

适合地，L是-(CH₂)_r-C(O)-，其中r＝2-12。适合地，r＝2-6。更适合地，r＝4或6，例如4。

适合地，L是：

实例F部分包括(CH₂)_1-6，例如(CH₂)_1-4，例如CH₂、(CH₂)₄、(CH₂)₅或(CH₂)₆，或CH₂O(CH₂)_2-3例如CH₂O(CH₂)CH₃。

适合地，L₂是：

适合地，L₂是：

适合地，L₂是：

适合地，L₂是：

适合地，n是0，并且L₂是：

并且末端OH基团不存在，以致形成以下部分：

其中Y如在本文中其他地方所限定。

在由b、c和d加括号的部分内，L₂通常是相同的。在由b、c和d加括号的部分之间，L₂可相同或不同。在一实施方案中，由c加括号的部分中的L₂与由d加括号的部分中的L₂相同。在一实施方案中，由c加括号的部分中的L₂不与由d加括号的部分中的L₂相同。在一实施方案中，由b、c和d加括号的部分中的L₂是相同的，例如当接头部分是丝氨醇衍生接头部分时。

丝氨醇衍生接头部分可基于呈任何立体化学形式的丝氨醇，即由L-丝氨酸异构体、D-丝氨酸异构体、外消旋丝氨酸或异构体的其他组合衍生。在本发明的一优选方面，丝氨醇-GalNAc部分(SerGN)具有以下立体化学：

即基于由L-丝氨酸异构体衍生的(S)-丝氨醇-亚酰胺或(S)-丝氨醇丁二酸酯固体载体化构建单元。

在一个实施方案中，所靶向细胞是肝细胞。

作为另一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从待抑制的所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，并且其中所述第一链和/或所述第二链包括在至少两个末端3’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或所述第二链包括在至少两个末端5’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，并且其中所述核酸分子直接或通过接头间接缀合于配体。

核酸可缀合于如本文所述的配体。第一链和/或第二链的核苷酸可如本文所述加以修饰。

配体可为GalNAc。

可裂解连接基团是在细胞外部是稳定的，但在进入靶细胞中后被裂解的接头。裂解使接头固持在一起的两个部分释放。

在一优选实施方案中，本发明的核酸包含可裂解连接基团，相比于在受试者的血液中或在第二参考条件(其可例如被选择来模拟或代表见于血液或血清中的条件)下，在靶细胞中或在第一参考条件(其可例如被选择来模拟或代表细胞内条件)下，所述可裂解连接基团以至少10倍或更多倍，优选地以至少100倍更快地被裂解。

可裂解连接基团易感于裂解因素，例如pH、氧化还原电势、或存在降解性分子。降解性分子包括氧化性或还原性酶、还原剂(诸如硫醇)、酯酶、可创建酸性环境的内体或试剂、可通过充当广义酸来水解或降解酸可裂解连接基团的酶、肽酶和磷酸酶。

可裂解连接基团可为易感于pH的二硫键。

接头可包括可由特定酶裂解的可裂解连接基团。并入接头中的可裂解连接基团的类型可取决于靶细胞。举例来说，当肝细胞是靶标时，包括酯基团的接头是优选的。当靶细胞富含肽酶时，诸如肝细胞和滑膜细胞，可使用含有肽键的接头。

一般来说，候选可裂解连接基团的适合性可通过测试降解剂(或条件)使候选连接基团裂解的能力来评估。还将合乎需要的是还测试候选可裂解连接基团在血液中或当与其他非靶标组织接触时抵抗裂解的能力。在优选实施方案中，相较于血液或血清(或在被选择来模拟细胞外条件的体外条件下)，在细胞中(或在被选择来模拟细胞内条件的体外条件下)，可用候选化合物以至少2、4、10或100倍更快地被裂解。

在一个方面，可裂解连接基团可为氧化还原可裂解连接基团。氧化还原可裂解连接基团可为二硫连接基团。

在一个方面，连接基团可为基于磷酸酯的可裂解连接基团。优选实施方案是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-Ρ(O)(Η)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一优选实施方案是-O-P(O)(OH)-O-。

在一个方面，可裂解连接基团可为酸可裂解连接基团。优选地，酸可裂解连接基团在其中pH是6.5或更低的环境中被裂解，或由可充当广义酸的试剂诸如酶裂解。酸可裂解连接基团的实例包括但不限于腙、酯、以及氨基酸的酯。酸可裂解基团可具有通式-C＝NN-；C(O)O或-OC(O)。一优选实施方案是其中连接于酯(烷氧基)的氧的碳是芳基、取代的烷基、或叔烷基诸如二甲基戊基或叔丁基的连接基团。

在一个实施方案中，可裂解连接基团可为基于酯的可裂解连接基团。基于酯的可裂解连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。

在一个实施方案中，可裂解连接基团可为基于肽的可裂解连接基团。基于肽的可裂解连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的裂解基团通常限于在氨基酸之间形成，从而产生肽和蛋白质的肽键(即酰胺键)，并且不包括全体酰胺官能团。基于肽的可裂解连接基团具有通式–NHCHR^AC(O)NHCHR^BC(O)-，其中RA和RB是两个邻近氨基酸的R基团。

单链的合成

实例化合物可根据以下描述以及为本领域技术人员所知的方法合成。寡核苷酸链和接头构建单元的组装可例如通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。固相合成可从碱基或经修饰构建单元装载的lcaa CPG开始。亚磷酰胺合成偶联循环由以下组成：1)移除DMT，2)使用所需DMT掩蔽亚磷酰胺和活化剂进行链延伸，所述活化剂可为苯甲基硫基四唑(BTT)，3)对非延伸寡核苷酸链进行加帽，随后通过碘(如果需要磷酸二酯键)或EDITH(如果需要硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键)使P(III)氧化成P(V)，并且再次加帽(加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽)。在需要二硫代磷酸酯键的情况下，亚磷酰胺合成偶联循环由以下组成：1)移除DMT，2)使用所需DMT掩蔽硫代亚磷酰胺进行链延伸，3)对非延伸寡核苷酸链进行加帽，随后通过EDITH使P(III)氧化成P(V)，并且再次加帽(加帽/硫代/加帽)。对于三价树样GalNAc簇的柱上缀合，在使用必要三价分支亚酰胺ST41-phos的情况下应用相同亚磷酰胺合成循环，随后使用GalNAc亚酰胺ST23-phos进行另一轮合成循环。必要构建单元可商购获得，或以下描述合成。

所有最终单链产物都通过AEX-HPLC分析以证明它们的纯度。纯度以FLP％(全长产物％)给出，所述FLP％是在对最终产物的AEX-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。相应单链产物的身份通过LC-MS分析来证明。

对ST41的亚磷酰胺衍生物(ST41-phos)以及ST23的亚磷酰胺衍生物(ST23-phos)的合成可如WO2017/174657中所述进行：

ST41-phos：

ST23-phos：

双链的合成

为获得双链缀合物，将必要独个单链以60OD/mL的浓度溶解于H₂O中。两种独个寡核苷酸溶液可一起添加至反应容器中。为更易于进行反应监测，可进行滴定。第一链相比于第二链以过量25％添加，如通过在260nm下的紫外吸收所测定。将反应混合物例如加热至80℃，持续5分钟，接着缓慢冷却至室温。双链形成可通过离子对反相HPLC来监测。根据残余单链的UV面积，可计算第二链的需要量，并且添加至反应混合物中。再次将反应例如加热至80℃，并且缓慢冷却至室温。可重复这个程序直至检测到小于10％的残余单链。

如本文所述的核酸可与脂质一起以脂质体形式配制。这种制剂可在本领域中被描述为脂质复合物。具有脂质的组合物/脂质体可用于辅助本发明的核酸向靶细胞的递送。本文所述的脂质递送系统可被用作缀合配体的替代方案。当与脂质递送系统一起或与配体缀合物递送系统一起使用本发明的核酸时，可存在本文所述的修饰。

这种脂质复合物可包含脂质组合物，所述脂质组合物包含：

i)阳离子脂质或其药学上可接受的盐；

ii)类固醇；

iii)磷脂酰乙醇胺磷脂；

iv)PEG化脂质。

阳离子脂质可为氨基阳离子脂质。

阳离子脂质可具有式(XIX)：

或其药学上可接受的盐，其中：

X代表O、S或NH；

R¹和R²各自独立地代表C₄-C₂₂直链或支链烷基链或具有一个或多个双键的C₄-C₂₂直链或支链烯基链，其中所述烷基或烯基链任选地含有间插的酯、酰胺或二硫醚；

当X代表S或NH时，R³和R⁴各自独立地代表氢、甲基、乙基、单胺或多胺部分，或R³和R⁴一起形成杂环基环；

当X代表O时，R³和R⁴各自独立地代表氢、甲基、乙基、单胺或多胺部分，或R³和R⁴一起形成杂环基环，或R³代表氢，并且R⁴代表C(NH)(NH₂)。

阳离子脂质可具有式(XIXA)：

或其药学上可接受的盐。

阳离子脂质可具有式(XIXB)：

或其药学上可接受的盐。

阳离子脂质组分的含量可为组合物的总脂质含量的约55mol％至约65mol％。特别地，阳离子脂质组分是组合物的总脂质含量的约59mol％。

组合物还可包含类固醇。类固醇可为胆固醇。类固醇的含量可为脂质组合物的总脂质含量的约26mol％至约35mol％。更特别地，类固醇的含量可为脂质组合物的总脂质含量的约30mol％。

磷脂酰乙醇胺磷脂可选自由以下组成的组：1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLoPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二芥酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、1,2-二角鲨烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSQPE)和1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SLPE)。磷脂的含量可为组合物的总脂质含量的约10mol％。

PEG化脂质可选自由以下组成的组：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)和C16-神经酰胺-PEG。PEG化脂质的含量可为组合物的总脂质含量的约1至5mol％。

组合物中的阳离子脂质组分的含量可为脂质组合物的总脂质含量的约55mol％至约65mol％，优选地是脂质组合物的总脂质含量的约59mol％。

组合物可具有选自55:34:10:1；56:33:10:1；57:32:10:1；58:31:10:1；59:30:10:1；60:29:10:1；61:28:10:1；62:27:10:1；63:26:10:1；64:25:10:1；和65:24:10:1的组分i):ii):iii):iv)摩尔比。

组合物可包含具有以下结构的阳离子脂质：

具有以下结构的类固醇：

具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂：

以及具有以下结构的PEG化脂质：

中性脂质体组合物可由例如二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物可由二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油形成，而阴离子致融合脂质体可主要由二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一类型的脂质体组合物可由磷脂酰胆碱(PC)诸如(例如)大豆PC和卵PC形成。另一类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。

带正电荷的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-Ν,Ν,Ν-三甲基氯化铵(DOTMA)可用于形成自发地与核酸相互作用以形成脂质-核酸复合物的小型脂质体，所述复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷脂质融合。DOTMA类似物也可用于形成脂质体。

本文所述的脂质的衍生物和类似物也可用于形成脂质体。

含有核酸的脂质体可通过多种方法制备。在一个实例中，将脂质体的脂质组分溶解于清洁剂中，以致形成具有脂质组分的胶束。举例来说，脂质组分可为两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。清洁剂可具有高临界胶束浓度，并且可为非离子性的。示例性清洁剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡萄糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰基肌氨酸。接着将核酸制剂添加至包括脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与核酸相互作用，并且围绕核酸进行凝聚以形成脂质体。在凝聚之后，例如通过透析移除清洁剂以产生核酸的脂质体制剂。

必要时，可在凝聚反应期间添加(例如采用受控添加)有助于凝聚的载体化合物。举例来说，载体化合物可为除核酸以外的聚合物(例如精胺或亚精胺)。还可调整pH以有利于凝聚。

核酸制剂可包括表面活性剂。在一个实施方案中，核酸被配制成包括表面活性剂的乳液。

不是离子化的表面活性剂是非离子表面活性剂。实例包括非离子酯诸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯等，非离子链烷醇酰胺，以及醚诸如脂肪醇乙氧化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。

当溶解或分散于水中时携带负电荷的表面活性剂是阴离子表面活性剂。实例包括羧酸盐诸如肥皂、酰基乳酰乳酸盐、氨基酸的酰胺、硫酸的酯诸如硫酸烷基酯和乙氧基化硫酸烷基酯、磺酸盐诸如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和丁二酸酯磺酸盐、以及磷酸盐。

当溶解或分散于水中时携带正电荷的表面活性剂是阳离子表面活性剂。实例包括季铵盐和乙氧基化胺。

能够携带正电荷或负电荷的表面活性剂是两性表面活性剂。实例包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。

“胶束”在本文中定义为一种特定类型的分子组件，其中两亲性分子被安置在球形结构中以致分子的所有疏水性部分都向内定向，从而留下亲水性部分与周围水相接触。如果环境是疏水性的，那么存在相反排列。胶束可通过使核酸的水溶液、烷基碱金属硫酸盐和至少一种胶束形成性化合物混合来形成。

示例性胶束形成性化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油(borage oil)、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐以及它们的混合物。

苯酚和/或间甲酚可添加至混合胶束组合物中以充当稳定剂和防腐剂。等张剂诸如甘油可同样地添加。

核酸制剂可并入粒子诸如微粒中。微粒可通过喷雾干燥、冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥、或这些方法的组合来产生。

本发明还提供了包含本发明的核酸或缀合核酸的药物组合物。药物组合物可单独或与其他药剂组合用作药剂或诊断剂。举例来说，本发明的核酸或缀合核酸可与递送媒介物(例如脂质体)和赋形剂诸如载体、稀释剂组合。还可添加其他试剂诸如防腐剂和稳定剂。用于递送核酸或缀合核酸的方法在本领域中是已知的，并且在本领域技术人员的知识范围内。

本发明的核酸或缀合核酸还可与单独施用或例如以组合单位剂量形式同时施用的其他治疗性化合物组合施用。本发明还包括一种药物组合物，其包含存在于生理上/药学上可接受的赋形剂诸如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等中的本发明的核酸或缀合核酸。

药物组合物可被特别配制以用于以固体或液体形式施用。组合物可被配制以用于口服施用、胃肠外施用(包括例如皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射)、表面施加、阴道内或直肠内施用、舌下施用、经眼施用、经皮施用或经鼻施用。使用皮下或静脉内方法进行的递送是优选的。

本发明的药剂和药物组合物的剂量水平可由本领域技术人员通过常规实验确定。在一个实施方案中，单位剂量可含有约0.01mg/kg体重与约100mg/kg体重之间的核酸。或者，剂量可为10mg/kg体重至25mg/kg体重，或1mg/kg体重至10mg/kg体重，或0.05mg/kg体重至5mg/kg体重，或0.1mg/kg体重至5mg/kg体重，或0.1mg/kg体重至1mg/kg体重，或0.1mg/kg体重至0.5mg/kg体重，或0.5mg/kg体重至1mg/kg体重。剂量水平还可通过其他参数诸如(例如)体表面积计算。

药物组合物可为无菌可注射水性混悬液或溶液，或呈冻干形式。在一个实施方案中，药物组合物可包括冻干脂质复合物或脂质复合物的水性混悬液。脂质复合物优选地包含本发明的核酸。所述脂质复合物可用于在体外或在体内将本发明的核酸递送至靶细胞。

本发明的药物组合物和药剂可以药学上有效剂量向哺乳动物受试者施用。哺乳动物可选自人、狗、猫、马、牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。

本发明的另一方面涉及用于治疗或预防疾病或病症的本发明的一种核酸或缀合核酸或包含所述核酸或缀合核酸的药物组合物。本发明包括一种药物组合物，其包含存在于生理上/药学上可接受的赋形剂诸如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等中的本发明的一种或多种RNAi分子。

药物组合物可为无菌可注射水性混悬液或溶液，或呈冻干形式。

药学上可接受的组合物可包含治疗有效量的一种或多种根据本发明的任何实施方案中的核酸，所述核酸被单独采用或与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂一起配制。

可充当药学上可接受的载体的物质的实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格氏溶液(Ringer'ssolution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)增积剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清组分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；和(22)用于药物制剂中的其他无毒可相容物质。

稳定剂可为使核酸剂稳定的试剂，例如可与核酸复合的蛋白质、螯合剂(例如EDTA)、盐、RNA酶抑制剂和DNA酶抑制剂。

在一些情况下，可合乎需要的是减缓来自皮下或肌肉内注射的药物的吸收以延长药物的作用。这可通过使用具有不良水溶性的结晶或非晶物质的液体混悬液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，所述溶解速率转而可取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将药物溶解或混悬于油媒介物中来实现胃肠外施用的药物形式的延迟吸收。

本文所述的核酸可能够抑制细胞中靶标基因的表达。本文所述的核酸可能够部分地抑制细胞中靶标基因的表达。抑制可为完全的，即相较于在不存在本发明的核酸下的靶标基因表达的表达水平是0％。对靶标基因表达的抑制可为部分的，即它可为在不存在本发明的核酸下的靶标基因表达的15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。当在受试者诸如人受试者中使用时，抑制可持续4周、5周、6周、7周、8周、10周、11周、12周、13周、14周或多达3个月。核酸或包含核酸组合物的组合物可用于以一次、每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、或每八周方式进行使用。核酸可以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径进行使用。

相较于未处理细胞和/或受试者，在用本发明的核酸处理或接受本发明的核酸的细胞和/或受试者中，靶标基因表达可被抑制至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％。抑制水平可允许治疗与靶标基因表达或过度表达相关的疾病，或可允许对靶标基因产物的功能进行进一步探究。

靶标基因可为因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erkl/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JU基因、FOS基因、BCL-2基因、铁调素(hepcidin)、经活化蛋白C、周期素D(Cyclin D)基因、VEGF基因、EGFR基因、周期素A基因、周期素E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白(beta-catenin)基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素(survivin)基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I(topoisomerase I)基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因中的突变、p21(WAF l/CIPl)基因中的突变、p27(KIPl)基因中的突变、PPM ID基因中的突变、RAS基因中的突变、窖蛋白I(caveolin I)基因中的突变、MIB I基因中的突变、MTAI基因中的突变、M68基因中的突变、肿瘤抑制基因中的突变、以及p53肿瘤抑制基因中的突变。

本发明的另一方面涉及本发明的一种制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂的核酸或缀合核酸。

本发明中还包括一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含如本文所述的核酸或缀合核酸的药物组合物。核酸组合物可每周两次、每周一次、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、或每八周加以施用。核酸可以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径向受试者施用。

在一个实施方案中，向受试者施用初始剂量以及一次或多次维持剂量的核酸剂。相比于初始剂量，一次或多次维持剂量可为相同的或较低的，例如是初始剂量的一半小。维持剂量例如至多每2、5、10或30天一次加以施用。治疗方案可持续将视特定疾病的性质、其严重性以及患者的总体状况而变化的时期。

在一个实施方案中，组合物包括多个核酸剂种类。在另一实施方案中，关于天然存在的靶标序列，核酸剂种类具有与另一种类非重叠和非邻近的序列。在另一实施方案中，多个核酸剂种类对不同天然存在的靶标基因具有特异性。在另一实施方案中，核酸剂对等位基因具有特异性。

本发明的核酸或缀合核酸还可与单独施用或例如以组合单位剂量形式同时施用的其他治疗性化合物组合施用或使用。

本发明的核酸或缀合核酸可使用本领域中的常规方法产生，所述常规方法包括化学合成，或在体外(例如进行转录)或在体内表达核酸。举例来说，使用固相化学合成，或使用表达载体。在一个实施方案中，表达载体可在靶细胞中产生本发明的核酸。

用于合成本文所述的核酸的方法为本领域技术人员所知。

实例化合物根据为本领域技术人员所知的方法合成。寡核苷酸链和接头构建单元的组装可通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。流程1显示为在固相寡核苷酸合成期间组装三价GalNAc树样簇所需的三倍子亚酰胺C4xlt-phos和GalNAc亚酰胺(ST23-phos)。C4XLT-phos以及ST23-phos的合成可如WO2017/174657中所述进行。

流程1：用于三价树样GalNAc簇的柱上缀合的三倍子亚酰胺和GalNAc亚酰胺的结构。

树样GalNAc簇缀合的siRNA的寡核苷酸合成概述于图11中所示的流程2中。

如在实例化合物A0149(STS12009V15L4B)的情况下，寡核苷酸链组装可使用基底负载的载体例如5’DMT-2’FdU-丁二酸酯-lcaa-CPG加以开始。对于引入第一二硫代磷酸酯键，亚磷酰胺合成偶联循环由以下组成：1)移除DMT，2)使用所需DMT掩蔽硫代亚磷酰胺进行链延伸，3)对非延伸寡核苷酸链进行加帽，随后通过EDITH使P(III)氧化成P(V)，并且再次加帽(加帽/硫代/加帽)。之后，可使用标准DMT-亚磷酰胺以及视需要磷酸二酯还是硫代磷酸酯键而定的加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽重复合成循环，直至达到产物的全长。对于三价树样GalNAc簇的柱上缀合，可在使用必要三价分支亚酰胺C4XLT的情况下应用相同合成循环，随后使用GalNAc亚酰胺ST23进行另一轮合成循环。在完成此末个合成仪步骤后，寡核苷酸可从固体载体裂解，并且通过甲胺处理(如果存在二硫代磷酸酯键，那么在20mMDTT存在下)来从额外保护基释放。粗产物可接着通过AEX-HPLC，应用NaCl梯度加以纯化。来自IEX纯化的过量盐通过SEC移除以产生最终产物。

所有最终单链产物都可通过AEX-HPLC分析以证明它们的纯度。纯度可以FLP％(全长产物％)给出，所述FLP％是在对最终产物的AEX-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。相应单链产物(非经修饰或GalNAc缀合寡核苷酸)的身份可通过LC-MS分析来证明。

双链siRNA的双链体形成可通过等摩尔添加相应单链，以及加热至80℃实现。缓慢冷却至室温可导致形成完全双链。双链体形成可继之以IP-RP-HPLC(离子对反相HPLC)。双链纯度可以双链％给出，所述双链％是在IP-RP-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。

本发明还提供了一种根据本文所述的本发明的任何方面的核酸，其中第一RNA链具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，并且所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选地通过磷酸二酯键连接于第一链中的第二核苷酸。

在一个实施方案中，第一链可包括超过1个磷酸二酯键。

在一个实施方案中，第一链可包含在至少三个末端5’核苷酸与之间的磷酸二酯键。

在一个实施方案中，第一链可包含在至少四个末端5’核苷酸之间的磷酸二酯键。

在一个实施方案中，第一链可包括式(XVII)：

(vp)-N(po)[N(po)]_n-

(XVII)

其中‘(vp)-’是5’(E)-乙烯基膦酸酯，‘N’是核苷酸，‘po’是磷酸二酯键，并且n是1至(第一链中的核苷酸的总数–2)，优选地，其中n是1至(第一链中的核苷酸的总数-3)，更优选地，其中n是1至(第一链中的核苷酸的总数-4)。

在一个实施方案中，第一链可包括至少一个硫代磷酸酯(ps)键。

在一个实施方案中，第一链还可包含在两个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，或在三个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在一个实施方案中，第一链中的其他核苷酸之间的键联是磷酸二酯键。

在一个实施方案中，第一链可包括超过1个硫代磷酸酯键。

在另一实施方案中，第二链可包含在两个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，或在三个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在另一实施方案中，第二链可包含在两个末端5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，或在三个末端5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在一实施方案中，末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是RNA核苷酸。

末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是其中在5’末端的天然磷酸酯基团已用E-乙烯基膦酸酯替换的核苷酸，其中5’磷酸化链的末端核苷酸的桥接5’氧原子用甲炔基(-CH＝)替换：

在5’末端具有天然磷酸酯的核苷酸

在5’末端具有E-乙烯基膦酸酯的核苷酸

5’(E)乙烯基膦酸酯是5’磷酸酯模拟物。生物模拟物是能够执行与所模拟的原始分子相同的功能，并且在结构上极其类似于所述原始分子的分子。在本发明的情形下，5’(E)乙烯基膦酸酯模拟正常5’磷酸酯的功能，例如使得能够达成高效RISC装载。此外，由于其略微改变的结构，所以5’(E)乙烯基膦酸酯能够通过保护5’末端核苷酸免遭由酶诸如磷酸酶进行的脱磷酸而使它稳定。

本发明的一个方面是一种如本文公开的用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链在多个位置处包括经修饰核苷酸或未修饰核苷酸以促进由RISC对所述核酸的加工。

在一个方面，“促进由RISC进行的加工”意指核酸可由RISC加工，例如存在的任何修饰都将容许核酸由RISC加工，适合的是以致可发生siRNA活性。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

第二链上“对应于”第一链上某一位置的核苷酸适合地是与第一链上的那个核苷酸进行碱基配对的核苷酸。

在一个方面，第二链上对应于第一链的位置13的核苷酸是与第一链的位置13形成碱基对的核苷酸。

在一个方面，第二链上对应于第一链的位置11的核苷酸是与第一链的位置11形成碱基对的核苷酸。

在一个方面，第二链上对应于第一链的位置12的核苷酸是与第一链的位置12形成碱基对的核苷酸。

这个命名法可应用于第二链的其他位置。举例来说，在是双链，并且具有钝性末端的19聚体核酸中，第一链的位置13将与第二链的位置7配对。第一链的位置11将与第二链的位置9配对。这个命名法可应用于第二链的其他位置。

对应于第一链的位置13的核苷酸适合地是第二链的从双链区域的第一核苷酸起始，从第二链的3'开始计数的位置13。同样地，第二链的位置11适合地是从双链区域的第一核苷酸起始，从第二链的3'开始的第11核苷酸。这个命名法可应用于第二链的其他位置。

在一个方面，在部分互补的第一链和第二链的情况下，第二链上“对应于”第一链上某一位置的核苷酸可未必形成碱基对(如果那个位置是存在错配所处的位置)，但命名法的原则仍然适用。

优选的是第一链和第二链历经双链体区域是完全互补的(忽略任何突出部分区域)，并且在核酸的双链区域内不存在错配。

还优选的是：

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11和13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

在一个方面，第二链上对应于第一链的位置12的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。关于核酸的这个限制可与本文所述的任何其他限制一起得见。

因此，本发明的另一方面是一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11-13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50％的核苷酸包含2’O-甲基修饰，诸如第一链和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含2’O-甲基修饰，优选地测量为第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比。

一种如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50％的核苷酸包含天然存在的RNA修饰，诸如其中第一链和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含这种修饰，优选地测量为第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比。适合天然存在的修饰不仅包括2O’甲基，而且包括其他2’糖修饰，特别是产生DNA核苷酸的2’H修饰。

一种如本文公开的核酸，所述核酸包含在第一链和/或第二链上的至多20％，诸如至多15％诸如多于10％的具有不是2’O甲基修饰的2'修饰的核苷酸，优选地以第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比形式表示。

一种如本文公开的核酸，所述核酸包含在第一链和/或第二链的至多20％(诸如至多15％或至多10％)的2'氟代修饰，优选地以两个链的总核苷酸的百分比形式表示。

一种如本文公开的核酸，其中所有核苷酸都用2’O-甲基修饰加以修饰，例外之处是第一链的从5’末端开始的位置2和14以及第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸。优选地，不用2’O-甲基加以修饰的核苷酸在2’位用氟代加以修饰。

优选的是一种如本文公开的核酸，其中所述核酸的所有核苷酸都在糖的2’位被修饰。优选地，这些核苷酸用2’-氟代修饰加以修饰，其中所述修饰不是2’O-甲基修饰。

本发明的核酸可包含一个或多个在2’位用2’H加以修饰的核苷酸，因此在核酸内具有DNA核苷酸。本发明的核酸可在第一链的从第一链的5’末端开始计数的位置2和/或14处包含DNA核苷酸。核酸可包含在第二链上的对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的DNA核苷酸。

在一个方面，每个本发明的核酸存在至多一个DNA。

本发明的核酸可包含一个或多个LNA核苷酸。本发明的核酸可在第一链的从第一链的5’末端开始计数的位置2和/或14处包含LNA核苷酸。核酸可包含在第二链上的对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的LNA。

在一个方面，核酸在第一链上用交替2-O甲基修饰和2氟代修饰加以修饰，并且位置2和14(从5’末端起始)用2'氟代加以修饰。优选地，第二链在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸处用2’氟代修饰加以修饰。优选地，第二链在起始于互补(双链)区域的第一位置，从3’末端开始计数的位置11-13处用2’氟代修饰加以修饰，并且其余修饰是天然存在的修饰，优选地是2’O-甲基。

在一个方面，本发明的核酸在第二链的3’末端包含一个或多个使用5’-5’键联或3’-3’键联，优选地使用3’-3’键联的倒置核糖核苷酸，优选地，倒置腺嘌呤。

在一个方面，核酸包含一个或多个二硫代磷酸酯键，诸如1、2、3或4个二硫代磷酸酯键。优选地，存在多达4个二硫代磷酸酯键，在第一链和第二链的5’和3’末端各有一个。

核酸的所有特征都可与本文公开的本发明的所有其他方面组合。

特别地，优选的是作为siRNA分子的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且核酸包含以下中的一个或多个或全部：

(i)在第二链的3’末端的倒置核苷酸，优选地采用3’-3’键联；

(ii)一个或多个二硫代磷酸酯键；

(iii)对应于第一链的位置11或13的第二链核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，优选地，其中这些位置中的一者或两者包含2’氟代修饰；

(iv)核酸包含的全部核苷酸中的至少80％具有2’-O-甲基修饰；

(v)核酸包含至多20％的具有2’氟代修饰的核苷酸。

本发明还提供了一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸以及第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且至少90％的其余核苷酸是经2’-O甲基修饰的，或包含另一天然存在的2’修饰。

不具有突出部分的钝性双链19碱基核酸的特定优选实例是：

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7-9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。

一种如本文公开的核酸，所述核酸包含在第一链和/或第二链上的至多20％(诸如至多15％或至多10％)的2'氟代修饰，优选地以两个链的总核苷酸的百分比形式表示。

一种如本文公开的核酸，其中所有核苷酸都用2’O-甲基修饰加以修饰，例外之处是第一链的从5’末端开始的位置2和14以及第二链的从5’末端开始在位置7和/或9处的核苷酸。优选地，不用2’O-甲基加以修饰的核苷酸在2’位用氟代加以修饰。

一种如本文公开的核酸，其中所有核苷酸都用2’O-甲基修饰加以修饰，例外之处是第一链的从5’末端开始的位置2和14以及第二链的从5’末端开始在位置7-9处的核苷酸。优选地，不用2’O-甲基加以修饰的核苷酸在2’位用氟代加以修饰。

对于包含20碱基对双链体区域的核酸，第二链优选地在从双链体的5’末端开始计数的分别对应于第一链的位置13、12和11的核苷酸8或9或10处不具有2’O-甲基。

对于包含21碱基对双链体区域的核酸，第二链优选地在从双链体的5’末端开始计数的分别对应于第一链的位置13、12和11的核苷酸9或10或11处不具有2’O-甲基。

本发明还涉及本文公开的所有经修饰序列的未修饰序列。

本发明现将参考以下非限制性附图和实施例来描述，在所述附图和实施例中：

图1显示在末端位置处含有两个硫代磷酸酯(PS)、一个PS、两个二硫代磷酸酯(PS2)和一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定的结果；

图2显示在末端位置处含有两个PS、一个PS、两个PS2和一个PS2，在GalNAc部分中不具有PS的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定的结果；

图3显示在单独末端含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定的结果；

图4显示在单独末端含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物的活性；

图5显示在第二链5’末端以及在第二链3’末端各自含有一个PS2，在接头部分中不具有PS的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定的结果；

图6显示在第二链5’末端以及在第二链3’末端各自含有一个PS2，在GalNAc部分中不具有PS的GalNAc-siRNA缀合物的活性；

图7显示在不同siRNA末端含有PS2，以及GalNAc部分不具有内部PS的siRNA缀合物序列；

图8显示在不同siRNA末端具有PS2，以及GalNAc部分不具有内部PS的GalNAcsiRNA缀合物的血清稳定性；

图9显示在不同siRNA末端具有PS2，以及GalNAc部分不具有内部PS的GalNAcsiRNA缀合物的体外活性；

图10显示含有二硫代磷酸酯键的树样三价GalNAc缀合寡核苷酸的合成流程图；

图11显示含有二硫代磷酸酯键的其他树样三价GalNAc缀合寡核苷酸的合成流程图；

图12显示在不同siRNA末端具有PS2的GalNAc siRNA缀合物的体内mRNA降低活性；

图13显示在不同siRNA末端具有PS2的GalNAc siRNA缀合物的体内血清铁降低活性；

图14显示在不同siRNA末端具有PS2和PS，以及GalNAc部分具有或不具有内部PS的GalNAc siRNA缀合物的体外活性。

图15显示在第二链的5’和3’末端各自具有一个丝氨醇连接的GalNAc，以及具有末端二硫代磷酸酯的siRNA缀合物的活性。

图16显示通过接头与配体缀合的核酸的各种实施方案的图示。

实施例

实施例1

一般性程序

siRNA修饰：具有硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯键(PS2)的siRNA的合成。

实例化合物根据以下描述的方法以及为本领域技术人员所知的方法合成。寡核苷酸链和接头构建单元的组装通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。

寡核苷酸合成、脱保护和纯化遵循本领域中已知的标准程序。

所有寡核苷酸都使用标准亚磷酰胺化学在AKTA oligopilot合成仪上合成。根据制造商推荐程序使用可商购获得的固体载体以及2′O-甲基RNA亚磷酰胺、2′氟代、2′脱氧RNA亚磷酰胺(全都进行标准保护，ChemGenes，LinkTech)和硫代亚磷酰胺(AM Biotech，GlenResearch)。

ST41-phos：

ST23-phos：

辅助试剂从EMP Biotech购买。使用0.1M的亚磷酰胺的无水乙腈溶液进行合成，并且苯甲基硫基四唑(BTT)用作活化剂(0.3M乙腈溶液)。偶联时间是15分钟。应用加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽循环(加帽：Ac₂O/NMI/二甲基吡啶/乙腈，氧化剂：0.1M I₂于吡啶/H₂O中)。使用含50mM EDITH的乙腈来引入硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯。所有其他试剂和溶剂都可商购获得，并且以标准试剂品质加以使用。

DMT裂解通过用含3％二氯乙酸的甲苯处理实现。在完成程序化合成循环后，进行二乙胺(DEA)洗涤。所有寡核苷酸都以DMT去除模式合成。

单链通过40％甲胺水溶液处理来从CPG裂解去除。所得粗制寡核苷酸通过离子交换色谱法(Resource Q，6mL，GE Healthcare)，使用氯化钠梯度在AKTA Pure HPLC系统上纯化。将含有产物的级分合并，在尺寸排阻柱(Zetadex，EMP Biotech)上脱盐，并且冻干。

寡核苷酸的合成

所有单链寡核苷酸都根据以上以及在图10中所述的反应条件合成。

所有最终单链产物都通过AEX-HPLC分析以证明它们的纯度。纯度以FLP％(全长产物％)给出，所述FLP％是在对最终产物的AEX-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。相应单链产物(非经修饰、经氨基修饰前体或GalNAc缀合寡核苷酸)的身份通过LC-MS分析来证明。

表1：单链寡核苷酸

双链形成

将独个单链以60OD/mL的浓度溶解于H₂O中。将两种独个寡核苷酸溶液一起添加于反应容器中。为更易于进行反应监测，进行滴定。第一链相比于第二链以过量25％添加，如通过在260nm下的紫外吸收所测定。将反应混合物加热至80℃，持续5分钟，接着缓慢冷却至室温。双链形成通过离子对反相HPLC来监测。根据残余单链的UV面积，计算第二链的需要量，并且添加至反应混合物中。再次将反应加热至80℃，并且缓慢冷却至室温。重复这个程序直至检测到小于10％的残余单链。

表2：核酸缀合物

实施例2

在末端位置处含有两个PS(STS12009L4)、一个PS(STS12009V21L4)、两个PS2(STS12009V16L4)和一个PS2(STS12009V15L4)的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定。GalNAc缀合于第二链的5’末端，并且由四个PS在内部加以稳定。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯分别放置在第一链的5’末端、第一链的3’末端和第二链的3’末端。使5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS一起在37℃下孵育3天。提取RNA并在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析，并且结果显示于图1中。“UT”指示未处理样品，“FBS”指示FBS处理。“对照”指示具有不同序列的稳定化程度较小的GalNAc-siRNA缀合物。

序列阐述于表3中。

mA，mU，mC，mG-2'-OMc RNA

fA，fU，fC，fG-2'-F RNA

(ps)-硫代磷酸酯

(ps2)-二硫代磷酸酯

表3：在所有非缀合末端含有两个PS、一个PS、两个PS2和一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物。

实施例3

在末端位置处含有两个PS(STS12009L4、STS12009V20L50)、一个PS(STS12009V19L50)、两个PS2(STS12009V18L50)和一个PS2(STS12009V17L50)的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定。在变体V20、V19、V18和V17中，GalNAc缀合于第二链的5’末端，并且不含有任何PS。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯分别放置在第一链的5’末端、第一链的3’末端、第二链的5’末端和第二链的3’末端。STS12009L4在第一链的5’末端、第一链的3’末端和第二链的3’末端各自含有两个末端PS，而GalNAc连接于第二链5’末端，并且由四个内部PS加以稳定。使5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS一起在37℃下孵育3天。提取RNA，并且在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析。结果显示于图2中。“UT”指示未处理样品，“FBS”指示FBS处理。

序列阐述于表4中。

mA，mU，mC，mG-2′-OMe RNA

fA，fU，fC，fG-2′-F RNA

(ps)-硫代磷酸酯

(ps2)-二硫代磷酸酯

表4：在末端位置处含有两个PS、一个PS、两个PS2和一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物。

实施例4

在单独末端含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定。GalNAc缀合于第二链的5’末端，并且由四个PS在内部加以稳定。二硫代磷酸酯修饰放置在第一链的5’末端(STS12009V37L4)、第一链的3’末端(STS12009V36L4)和第二链的3’末端(STS12009V34L4)。所有其他非缀合末端都各自由两个末端PS加以稳定。STS12009L4在第一链的5’末端、第一链的3’末端和第二链的3’末端含有两个末端PS。使5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS一起在37℃下孵育3天。提取RNA，并且在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析。结果显示于图3中。“UT”指示未处理样品，“FBS”指示FBS处理。“对照”指示具有不同序列的稳定化程度较小的GalNAc-siRNA缀合物。

序列显示于表5中。

mA，mU，mC，mG-2′-OMe RNA

fA，fU，fC，fG-2′-F RNA

(ps)-硫代酵酸酯

(ps2)-二硫代磷酸酯

表5：在单独末端含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物。

实施例5

在单独末端含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物的活性。GalNAc缀合于第二链的5’末端，并且由四个PS在内部加以稳定。二硫代磷酸酯修饰放置在第一链的5’末端(STS12009V37L4)、第一链的3’末端(STS12009V36L4)和第二链的3’末端(STS12009V34L4)。所有其他非缀合末端都各自由两个末端PS加以稳定。STS12009L4在第一链的5’末端、第一链的3’末端和第二链的3’末端各自含有两个末端PS。在小鼠原代肝细胞的情况下进行实验。将细胞按照6孔在250,000个细胞的密度下接种，并且用100nM、10nM和1nM GalNAc-siRNA处理。用10nM GalNAc-siRNA和1μg/ml Atufect进行的转染充当对照。在24小时之后使细胞溶解，提取总RNA，并且通过Taqman qRT-PCR来测定Tmprss6和Pten mRNA水平。结果显示于图4中。每个棒条代表三个技术性重复测定的平均值±SD。序列如表5中所阐述。

实施例6

在第二链5’末端以及在第二链3’末端各自含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物(STS12009V40L50)的血清稳定性测定。GalNAc缀合于第二链的5’末端，并且不由任何内部PS加以稳定。STS12009L4在第一链的5’末端、第一链的3’末端和第二链的3’末端各自含有两个末端PS，GalNAc连接于第二链5’末端，并且由四个内部PS加以稳定。使5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS一起在37℃下孵育3天。提取RNA，并且在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析。结果显示于图5中。“UT”指示未处理样品，“FBS”指示FBS处理。

序列显示于表6中

mA，mU，mC，mG-2'-OMe RNA

fA，fU，fC，fG-2'-F RNA

(ps)-硫代磷酸酯

(ps2)-二硫代磷酸酯

表6：在第二链5’末端以及在第二链3’末端各自含有一个PS2，以及GalNAc接头不含有PS的GalNAc-siRNA缀合物(STS12009V40L50)。

实施例7

在第二链5’末端以及在第二链3’末端各自含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物(STS12009V40L50)的活性。GalNAc缀合于第二链的5’末端，并且不由任何内部PS加以稳定。STS12009L4在第一链的5’末端、第一链的3’末端和第二链的3’末端各自含有两个末端PS。在此处，GalNAc连接于第二链的5’末端，并且由四个内部PS加以稳定。在小鼠原代肝细胞的情况下进行实验。将细胞按照6孔在250,000个细胞的密度下接种，并且用100nM、10nM和1nMGalNAc-siRNA处理。针对荧光素酶的siRNA的GalNAc缀合物(“GalNAc-Luc”)充当对照。在24小时之后使细胞溶解，提取总RNA，并且通过Taqman qRT-PCR来测定Tmprss6和Pten mRNA水平。结果显示于图6中。每个棒条代表三个技术性重复测定的平均值±SD。序列如表6中所阐述。

实施例8

在末端位置中以及在GalNAc部分中具有硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和磷酸二酯的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定。GalNAc缀合于有义链的5’末端，并且在内部由四个PS加以稳定(STS12009L4)，或并非如此，那么使用磷酸二酯键作为替代(STS12009V54L50–V57L50)。二硫代磷酸酯修饰放置在双链体的除第一链5’末端之外的所有末端位置处(-V54L50)，仅放置在3’末端(-V55L50、-V57L50)，或仅放置在第二链的3’末端(-V56L50)。在某些设计中，磷酸二酯用于siRNA双链体的末端位置中(-V56L50、-V57L50)。

使5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS一起在37℃下孵育3天。提取RNA，并且在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析。“UT”指示未处理样品，“FBS”指示FBS处理。“对照”指示具有不同序列的稳定化程度较小的GalNAc-siRNA缀合物。

序列显示于图7中，并且结果显示于图8中。

实施例9

靶向Tmprss6，含有不同末端稳定化化学组成(硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯)的siRNA的GalNAc缀合物通过原代小鼠肝细胞中由受体介导的摄取来测试。GalNAc缀合于第二链的5’末端，并且在内部由四个PS加以稳定(STS12009L4)，或并非如此，那么使用磷酸二酯键作为替代(STS12009V54L50-V57L50)。二硫代磷酸酯修饰放置在双链体的除第一链5’末端之外的所有末端位置处(-V54L50)，仅放置在3’末端(-V55L50、-V57L50)，或仅放置在第二链的3’末端(-V56L50)。在某些设计中，磷酸二酯用于siRNA双链体的末端位置中(-V56L50、-V57L50)。

在小鼠原代肝细胞的情况下进行实验。将细胞按照96孔在20,000个细胞的密度下接种，并且用125nM至0.2nM GalNAc-siRNA处理。在24小时之后使细胞溶解，提取总RNA，并且通过Taqman qRT-PCR来测定Tmprss6和Pten mRNA水平。每个棒条代表三个技术性重复测定的平均值±SD。

序列显示于图7中，并且结果显示于图9中。

实施例10

靶向TMPRSS6，并且在一个或多个末端含有二硫代磷酸酯键的GalNAc缀合物在体内有效降低血清铁和TMPRSS6 mRNA水平。

STS12009L4和STS12009V34L4含有在内部由四个硫代磷酸酯键加以稳定的GalNAc部分。STS12009V54L50含有不具有内部硫代磷酸酯的GalNAc部分。在STS12009L4中，所有非缀合末端都各自由两个硫代磷酸酯加以稳定。在STS12009V34L4中，一个二硫代磷酸酯键存在于第二链的3’末端，而所有其他非缀合末端都各自用两个硫代磷酸酯加以稳定。在STS12009V54L50中，在第一链的3’末端，在第二链的5’末端，以及在第二链的3’末端，各自存在一个二硫代磷酸酯。第一链的5’末端由两个硫代磷酸酯加以稳定。这些siRNA缀合物显示以剂量依赖性方式使TMPRSS6 mRNA水平和血清铁水平降低。含有二硫代磷酸酯的缀合物STS12009V34L4和STS12009V54L50如同不含有二硫代磷酸酯的参照化合物一样具有活性。因此，硫代磷酸酯的数目可从十(STS12009L4)降低至八(STS12009V34L4)，并且进一步降低至二(STS12009V54L50)，而不损害活性。STS12009V57L50在第一链的3’末端以及在第二链的3’末端各自含有一个二硫代磷酸酯键。两个链的5’末端均含有磷酸二酯，并且接头部分不含有内部磷酸二酯。这个siRNA缀合物的体内活性强烈降低。

用3mg/kg、1mg/kg和0.3mg/kg GalNAc缀合物皮下处理C57BL/6雄性小鼠(n＝6)。在处理之后七天制备肝切片，从组织提取总RNA，并且通过TaqMan qRT-PCR来测定TMPRSS6和PTEN mRNA水平。此外，分析了血清铁水平。

序列显示于下表7中，并且结果显示于图12和图13中。

实施例11

具有末端二硫代磷酸酯的GalNAc缀合物在体外具有活性。

靶向TMPRSS6，并且含有不同末端稳定化化学组成(硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯)的siRNA的GalNAc缀合物通过原代小鼠肝细胞中由受体介导的摄取来测试。在X0027、X0346、X0347中，三触角GalNAc部分缀合于第二链的5’末端，并且在内部由四个PS加以稳定。在这个情况下，在第二链的5’末端不存在硫代磷酸酯。在X0214和X0345中，GalNAc部分不含有硫代磷酸酯，并且二硫代磷酸酯存在于第二链的5’末端。在X0214、X0345、X0346和X0347中，二硫代磷酸酯修饰存在于第一链和第二链的3’末端。第一链5’末端由两个硫代磷酸酯加以稳定(X0214、X0346)，或含有磷酸二酯键(X0345、X0347)。所有描述的缀合物都在体外使靶标mRNA水平降低。相较于X0345和X0347，X0214和X0346显示活性降低。这表明硫代磷酸酯在第一链的5’末端会负性影响体外siRNA活性。

在小鼠原代肝细胞的情况下进行实验。将细胞按照96孔在20,000个细胞的密度下接种，并且用0.1nM、1nM、10nM和100nM GalNAc-siRNA处理。在24小时之后使细胞溶解，提取总RNA，并且通过Taqman qRT-PCR来测定TMPRSS6和PTEN mRNA水平。每个棒条代表三个技术性重复测定的平均值±SD。

序列显示于下表7中，并且数据显示于图14中。

实施例12

在第二链的5’和3’末端各自具有一个丝氨醇连接的GalNAc，以及具有末端二硫代磷酸酯的siRNA缀合物在体外具有活性。

靶向TMPRSS6的GalNAc缀合siRNA通过原代小鼠肝细胞中由受体介导的摄取来测试。在X0454与X0456两者中，各有一个丝氨醇连接的GalNAc部分缀合于第二链的5’和3’末端。两种缀合物均在第一链的5’末端含有(E)-乙烯基膦酸酯。在第一链的5’末端不存在硫代磷酸酯。在X0454中，在第一链的3’末端以及在第二链的5’和3’末端，各自存在两个硫代磷酸酯。每个GalNAc部分含有一个硫代磷酸酯。在X0456中，在第一链的3’末端以及在第二链的5’和3’末端，各自在最后两个核苷酸之间存在一个二硫代磷酸酯。无不确定立体中心存在于X0456中。靶向荧光素酶的GalNAc缀合siRNA在125nM下用作非靶向对照，并且不使靶标mRNA水平降低。靶向TMPRSS6的缀合物均在体外使靶标mRNA水平降低。因此，二硫代磷酸酯可被应用于达成在第二链的两个末端均具有单一GalNac部分的siRNA的末端稳定化。

在小鼠原代肝细胞的情况下进行实验。将细胞按照96孔在20,000个细胞的密度下接种，并且用0.2nM、1nM、5nM、25nM和125nM GalNAc-siRNA处理。在24小时之后使细胞溶解，提取总RNA，并且通过Taqman qRT-PCR来测定TMPRSS6和ACTB mRNA水平。每个棒条代表三个技术性重复测定的平均值±SD。

序列显示于下表7中，并且数据显示于图15中。

发明声明

1.一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链和/或所述第二链包括在至少两个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

2.根据声明1所述的核酸，其中所述第一链不包含在5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的任何核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

3.根据声明1或2所述的核酸，所述核酸包含在所述第一链的3’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

4.根据声明1-3所述的核酸，所述核酸包含在所述第二链的3’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

5.根据声明1至4中任一项所述的核酸，所述核酸包含在所述第二链的5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的硫代磷酸酯键，或包含在所述第二链的5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

6.根据声明1至5中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含在所述第一链上的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在所述第一链上的三个末端5’核苷酸中的每个核苷酸之间，和/或在所述第二链的三个3’末端核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在所述第二链的三个5’核苷酸中的每个核苷酸之间的硫代磷酸酯键，此时在那个末端不存在二硫代磷酸酯键。

7.根据声明1至6中任一项所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链是单独链。

8.根据声明1至6中任一项所述的核酸，所述核酸包含含有所述第一链和所述第二链的单一链。

9.根据声明1至8中任一项所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链的长度各自为17-35个核苷酸。

10.如声明1至9中任一项所述的核酸，其中所述至少一个双链体区域由17-25个核苷酸碱基对组成。

11.如任何先前声明所述的核酸，所述核酸

a)在两个末端均是钝性末端；或

b)在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端；或

c)在两个末端均具有突出部分。

12.根据任何先前声明所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰核苷酸。

13.如声明12所述的核酸，其中所述第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个被修饰。

14.根据声明13所述的核酸，其中所述第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个由至少第二修饰加以修饰，其中所述至少第二修饰不同于如声明13所述的修饰。

15.如声明14所述的核酸，其中一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸中的至少一者。

16.如声明13至15中任一项所述的核酸，其中多个奇数编号核苷酸被修饰。

17.如声明14至16中任一项所述的核酸，其中多个偶数编号核苷酸由第二修饰加以修饰。

18.如声明12至17中任一项所述的核酸，其中所述第一链包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。

19.如声明13至18中任一项所述的核酸，其中所述第一链包含由不同于如声明13所述的修饰的第二修饰加以修饰的邻近核苷酸。

20.如声明13至19中任一项所述的核酸，其中所述第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个由不同于如声明13所述的修饰的修饰加以修饰。

21.根据声明13至19中任一项所述的核酸，其中所述第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个由如声明13所述的修饰加以修饰。

22.如声明20或21所述的核酸，其中所述第二链的一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸。

23.如声明20至22中任一项所述的核酸，其中所述第二链的多个奇数编号核苷酸由共同修饰加以修饰。

24.如声明20至23中任一项所述的核酸，其中多个偶数编号核苷酸由根据声明13所述的修饰加以修饰。

25.如声明20至24中任一项所述的核酸，其中多个奇数编号核苷酸由第二修饰加以修饰，其中所述第二修饰不同于如声明13所述的修饰。

26.如声明20至25中任一项所述的核酸，其中所述第二链包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。

27.如声明20至26中任一项所述的核酸，其中所述第二链包含由不同于如声明13所述的修饰的第二修饰加以修饰的邻近核苷酸。

28.根据声明12至27中任一项所述的核酸，其中所述第一链中的奇数编号核苷酸中的每一个和所述第二链中的偶数编号核苷酸中的每一个用共同修饰加以修饰。

29.如声明13至28中任一项所述的核酸，其中所述第一链中的偶数编号核苷酸中的每一个用第二修饰加以修饰，并且所述第二链中的奇数编号核苷酸中的每一个用第二修饰加以修饰。

30.根据声明20至29中任一项所述的核酸，其中相对于所述第二链的未修饰或以不同方式修饰的核苷酸，所述第一链的经修饰核苷酸移位至少一个核苷酸。

31.如声明1至30中任一项所述的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO:1的序列。

32.如声明1至30中任一项所述的核酸，其中所述第二链包含SEQ ID NO:2的序列。

33.根据声明8至32中任一项所述的核酸，其中所述一个或多个修饰各自以及单独地选自由以下组成的组：3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧修饰、2'-氨基修饰、2'-烷基修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物修饰以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰。

34.根据声明8至33中任一项所述的核酸，其中所述修饰是锁核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一者。

35.根据声明8至34中任一项所述的核酸，其中至少一个修饰是2'-O-甲基。

36.根据声明8至35中任一项所述的核酸，其中至少一个修饰是2'-F。

38.根据声明1至37中任一项所述的核酸，所述核酸与配体缀合。

39.根据声明1至38中任一项所述的核酸，所述核酸包含在所述第一链和/或所述第二链的末端一个、两个或三个3’核苷酸和/或5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，此时在那个末端不存在二硫代磷酸酯。

40.一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从待抑制的所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，并且其中所述第一链和/或所述第二链包括在至少两个末端3’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或所述第二链包括在至少两个末端5’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，并且其中所述核酸分子缀合于配体。

41.根据声明38至40中任一项所述的核酸，其中所述配体包含一个或多个GalNac配体及其衍生物。

42.根据声明38至41中任一项所述的核酸，其中所述配体包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNac)部分及其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述GalNac部分缀合于如任何先前声明中定义的序列。

43.如声明40所述的核酸，其中核苷酸如任何先前声明中所限定加以修饰。

44.如任何先前声明所述的核酸，其中所述配体包括式I：

[S-X¹-P-X²]₃-A-X³- (I)

其中：

S代表糖，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；

X²是亚烷基或式(-CH₂)_n-O-CH₂-亚烷基醚，其中n＝1-6；

A是分支单元；

X³代表桥接单元；

45.一种缀合核酸，所述缀合核酸具有以下结构中的一者

其中Z是根据声明1至39中任一项所述的核酸。

46.如任何先前声明所述的核酸，其中所述配体包括：

47.如声明1-27、31-32或39-43中任一项所述的核酸，其中所述第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且所述第二链上对应于所述第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。

48.如声明1–43或47中任一项所述的核酸，其中所述第一RNA链是式(XV)的化合物：

其中b是0或1；并且

所述第二RNA链是式(XVI)的化合物：

其中c和d独立地是0或1；

其中：

Z₁和Z₂分别是所述第一RNA链和所述第二RNA链的RNA部分；

Y是O或S；

R₁是H或甲基；

n是0、1、2或3；并且

-(CH₂)_q，其中q＝2-12；

-(CH₂)_r-C(O)-，其中r＝2-12；

-(CH₂-CH₂-O)_s-CH₂-C(O)-，其中s＝1-5；

-(CH₂)_t-CO-NH-(CH₂)_t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；

-(CH₂)_u-CO-NH-(CH₂)_u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和

-(CH₂)_v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且

其中末端C(O)(如果存在)连接于NH基团；

并且其中b+c+d是2或3。

49.如声明48所述的核酸，其中b是0，c是1，并且d是1。

50.如声明48所述的核酸，其中b是1，c是0，并且d是1。

51.如声明48所述的核酸，其中b是1，c是1，并且d是0。

52.如声明48所述的核酸，其中b是1，c是1，并且d是1。

53.如声明48-52中任一项所述的核酸，其中Y是O。

54.如声明48-52中任一项所述的核酸，其中Y是S。

55.如声明48-54中任一项所述的核酸，其中R₁是H。

56.如声明48-54中任一项所述的核酸，其中R₁是甲基。

57.如声明48-56中任一项所述的核酸，其中n是0。

58.如声明48-57中任一项所述的核酸，其中L是-(CH₂)_r-C(O)-，其中r＝2-12。

59.如声明58所述的核酸，其中r＝2-6。

60.如声明59所述的核酸，其中r＝4或6例如4。

61.一种组合物，所述组合物包含如任何先前声明中定义的核酸以及包含以下的制剂：

i)阳离子脂质或其药学上可接受的盐；

ii)类固醇；

iii)磷脂酰乙醇胺磷脂；

iv)PEG化脂质。

62.根据声明61所述的组合物，其中在所述制剂中，所述阳离子脂质组分的含量是脂质组合物的总脂质含量的约55mol％至约65mol％，优选地是脂质组合物的总脂质含量的约59mol％。

63.如声明62所述的组合物，其中所述制剂包含；

具有以下结构的阳离子脂质；

所述类固醇具有以下结构；

所述磷脂酰乙醇胺磷脂具有以下结构；

并且所述PEG化脂质具有以下结构；

64.一种组合物，所述组合物包含如任何先前声明所述的核酸或缀合核酸以及生理上可接受的赋形剂。

65.根据任何先前声明所述的核酸或缀合核酸，所述核酸或缀合核酸用于治疗疾病或病症。

66.根据任何先前声明所述的核酸或缀合核酸制造用于治疗疾病或病症的药剂的用途。

67.一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含根据任一先前声明所述的核酸或缀合核酸的组合物。

68.如声明67所述的方法，其中所述核酸或缀合核酸分子以皮下方式或静脉内方式向受试者施用。

69.一种制备如声明1至65中任一项所述的核酸或缀合核酸的方法。

表7序列表概述

索引

以“A”结束的序列(如在X0456A的情况下)是第一链序列，并且以“B”结束的序列(如在X0456B的情况下)是第二链序列。

mA，mU，mC，mG–2‘-OMe RNA

fA，fU，fC，fG–2‘-F RNA

(ps)–硫代磷酸酯

(ps2)–二硫代磷酸酯

(vp)-乙烯基-(E)-膦酸酯

以上所列的序列可与接头或配体诸如GalNAc或例如(ps)或(ps2)键一起公开。这些形成序列表中序列的任选但优选的部分。

本文中可使用以下缩写：

Claims

2.如权利要求1所述的核酸，其中所述第一链不包含在5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的任何核苷酸之间二硫代磷酸酯键。

3.如前述权利要求中任一项所述的核酸，所述核酸包含在所述第一链的3’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或包含在所述第二链的3’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键和/或在所述第二链的5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸中的每个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键。

4.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含在所述第一链上的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在所述第一链上的三个末端5’核苷酸中的每个核苷酸之间，和/或在所述第二链的三个3’末端核苷酸中的每个核苷酸之间和/或在所述第二链的三个5’核苷酸中的每个核苷酸之间的硫代磷酸酯键，此时在那个末端不存在二硫代磷酸酯键。

5.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链是单独链。

6.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述至少一个双链体区域由17-25个核苷酸碱基对组成。

7.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰核苷酸。

8.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸缀合于配体。

9.如权利要求8所述的核酸，其中所述配体包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分或其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述至少一个GalNAc部分或其衍生物缀合于所述核酸。

10.如权利要求8至9中任一项所述的核酸，其中所述核酸缀合于包括式(I)的化合物的配体：

[S-X¹-P-X²]₃-A-X³-(I)

其中：

S代表糖，优选地，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选地是未取代的磷酸酯；

X²是亚烷基或式(-CH₂)_n-O-CH₂-的亚烷基醚，其中n＝1-6；

A是分支单元；

X³代表桥接单元；

其中如权利要求1至7中任一项所限定的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选地通过未取代的磷酸酯缀合于X³。

11.如权利要求8至9中任一项所述的核酸，其中所述第一RNA链是式(X)的化合物：

其中b是0或1；并且

所述第二RNA链是式(XI)的化合物：

其中：

c和d独立地是0或1；

Z₁和Z₂分别是所述第一RNA链和所述第二RNA链的RNA部分；

Y是O或S，优选地是O；

n是0、1、2或3；并且

L₁是连接至配体的接头；并且

其中b+c+d是2或3。

12.一种用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，

其中所述核酸包含在所述第一链的3’末端的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，

其中所述核酸包含在所述第二链的3’末端的两个末端核苷酸之间以及在所述第二链的5’末端的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，并且

其中所述第一链包含在5’末端的两个、三个或四个末端核苷酸之间除二硫代磷酸酯以外的键。

13.如权利要求12所述的核酸，其中所述核酸缀合于包括式(I)的化合物的配体：

[S-X¹-P-X²]₃-A-X³-(I)

其中：

S代表糖，优选地，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选地是未取代的磷酸酯；

X²是亚烷基或式(-CH₂)_n-O-CH₂-的亚烷基醚，其中n＝1-6；

A是分支单元；

X³代表桥接单元；

其中如权利要求12中所限定的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯缀合于X³。

14.如权利要求12所述的核酸，其中所述核酸缀合于配体，其中所述第一RNA链是式(XV)的化合物：

其中b是0或1；并且

所述第二RNA链是式(XVI)的化合物：

其中c和d独立地是0或1；

其中：

Z₁和Z₂分别是所述第一RNA链和所述第二RNA链的RNA部分；

Y是O或S，优选地是O；

R₁是H或甲基；

n是0、1、2或3；并且

-(CH₂)_q，其中q＝2-12；

-(CH₂)_r-C(O)-，其中r＝2-12；

-(CH₂-CH₂-O)_s-CH₂-C(O)-，其中s＝1-5；

-(CH₂)_t-CO-NH-(CH₂)_t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；

-(CH₂)_u-CO-NH-(CH₂)_u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和

-(CH₂)_v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且

其中如果末端C(O)存在，则其连接于NH基团；

并且其中b+c+d是2或3。

15.如权利要求12至14中任一项所述的核酸，其中所述第一RNA链在其5’末端具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，并且其中所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选地通过磷酸二酯键连接于所述第一链中的第二核苷酸。

16.如权利要求12至15中任一项所述的核酸，其中所述第一链的核苷酸在奇数编号核苷酸上用第一修饰加以修饰，并且在偶数编号核苷酸上用第二修饰加以修饰，并且所述第二链的核苷酸在奇数编号核苷酸上用所述第二修饰加以修饰，并且在偶数编号核苷酸上用所述第一修饰加以修饰，其中所述第一链按5’至3’编号，最5’端核苷酸是所述第一链的1号核苷酸，并且所述第二链按3'至5'编号，最3’端核苷酸是所述第二链的1号核苷酸，其中所述第一修饰优选地是2’OMe，其中所述第二修饰优选地是2’氟代，并且其中所述核酸优选地在两个末端均是钝性末端。

17.如权利要求12至15中任一项所述的核酸，其中所述第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且所述第二链上对应于所述第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且优选地，其中其余核苷酸用2’OMe修饰加以修饰。

18.如权利要求12至17中任一项所述的核酸，其中两个链的核苷酸之间的除在所述第一链的3’末端的两个末端核苷酸之间的键和在所述第二链的3’末端以及在所述第二链的5’末端的两个末端核苷酸之间的键以外的所有键都是未取代的磷酸酯键。

19.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至18中任一项所述的核酸，并且任选地包含递送媒介物和/或生理上可接受的赋形剂和/或载体和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂，所述组合物用作药剂。

20.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至18中任一项所述的核酸，并且还包含递送媒介物，优选地为脂质体，和/或生理上可接受的赋形剂和/或载体和/或稀释剂。

21.如权利要求1至18中任一项所述的核酸或如权利要求20所述的药物组合物用于预防或治疗疾病、病症或综合征的用途。

22.一种预防或治疗疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含如权利要求1至18中任一项所述的核酸的组合物或根据权利要求19至20所述的组合物，优选地，其中所述核酸或所述组合物以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径向受试者施用。