KR20130137160A - 내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제 - Google Patents

내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제

Info

Publication number
KR20130137160A
KR20130137160A KR1020137007266A KR20137007266A KR20130137160A KR 20130137160 A KR20130137160 A KR 20130137160A KR 1020137007266 A KR1020137007266 A KR 1020137007266A KR 20137007266 A KR20137007266 A KR 20137007266A KR 20130137160 A KR20130137160 A KR 20130137160A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rna
nucleotide
molecule
homo sapiens
nucleotides
Prior art date
Application number
KR1020137007266A
Other languages
English (en)
Inventor
리 림
기욤 코른
아론 윌링햄
리홍 자오
Original Assignee
머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 filed Critical 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Publication of KR20130137160A publication Critical patent/KR20130137160A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/332—Abasic residue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

해당 분자의 뉴클레오티드 부분과 공유적으로 연결된 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서를 포함하는 단일-가닥 RNA 분자가 제공된다. 이러한 단일-가닥 RNA 분자는 RNA 간섭 메카니즘을 통해 유전자 발현을 억제할 수 있는 가이드(guide) 또는 안티센스(antisense) 가닥으로서 기능하고, 따라서 단일-가닥 RNAi 작용제를 나타낸다. 이러한 단일-가닥 RNAi 분자는 다양한 치료, 진단, 표적 확인, 게놈 발견, 유전자 조작, 및 약물유전체학 용도를 위한 방법에서 사용될 수 있다.

Description

내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제{SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2010년 8월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 61/376,471을 우선권으로 청구하고, 이는 이에 의해 본원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
RNA 간섭 (RNAi) 경로는 유전자 조절의 진화적으로 보존된 방식이다. RNAi 프로세스는 다양한 외인성 또는 내인성 출처 (예를 들어, 실험적인 도입, 바이러스 감염)로부터 생산된 이중-가닥 RNA (dsRNA)에 의해 개시된다. dsRNA가 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 뉴클레오티드 20-25개의 소형-간섭 RNA (siRNA) 이중체(duplex)가 생성된다. 그 후, 이러한 이중체가 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC) 상에 로딩되고, RISC가 활성화되기 전에, 이중체의 패신저(passenger)/센스(sense) 가닥이 제거된다. 단일한 가이드(guide)/안티센스(antisense) 가닥은 여전히 RISC와 회합된 상태이고, 표적 mRNA의 절단을 지시한다. 따라서, 이중체화된 siRNA가 연구 및 핵산-기반 치료학 둘 모두를 위한 중요한 도구가 되어 왔다.
RNAi 유전자 침묵화는 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA 분자를 통해 발생할 수 있다. 최근 10년 동안, 단일-가닥 안티센스 siRNA가 거의 siRNA 이중체만큼 강력하다는 것이 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Schwarz et al., 2002, Mol. Cell. 10:537-548]; [Martinez et al., 2002, Cell 110:563-574]; [Amarzguioui et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:589-595]; 및 [Holen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:2401-2407] 참조). 유전자 침묵화를 위해, 이중체화 버젼과 대조적으로, 단일-가닥 RNA 분자를 사용하는 것에 이점이 있다. 이들의 낮은 분자량은 이들을 세포막을 가로지르기 더 쉽게 만들 수 있다. 또한 단일-가닥 RNA 분자는 질량 및 부피가 이중체화 siRNA의 절반이어서, 제작 비용 장점에 관련된다. 따라서, 단일-가닥 RNAi 분자에 적절한 새롭고 유리한 디자인 특색을 제제화하는 것에 대한 관심이 여전히 높다.
발명의 개요
본 개시내용은 (a) 2개 이상의 뉴클레오티드 부분을 포함하는 핵산 부분, 및 (b) 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하고, 이때 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 분자의 2개의 뉴클레오티드 부분을 공유적으로 연결하는 내부 ("말단"에 반대되는 것으로서)의 스페이서(spacer) 부분을 포함하는 단일-가닥 RNA 분자를 제공한다. 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자의 뉴클레오티드 부분들은 서로에 대해 상보적이지 않고, 따라서 상기 부분들은 염기쌍을 형성하지 않는다. 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 RNA 간섭 메카니즘을 통해 유전자 발현을 억제할 수 있는 가이드 또는 안티센스 가닥으로서 기능하고, 따라서 단일-가닥 RNAi 작용제를 나타낸다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 구조이고, 표적 RNA에 대한 RNA 간섭을 매개한다. 단일-가닥 RNAi 분자는 (a) 제1 뉴클레오티드 부분 (N1) 및 제2 뉴클레오티드 부분 (N2)을 포함하는 핵산 부분이며, 여기서 상기 핵산 부분이 표적 RNA와 염기 쌍을 이룰 수 있는 8개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 핵산 부분 내의 뉴클레오티드의 총 개수가 뉴클레오티드 8개 내지 26개인 핵산 부분; 및 (b) 제1 뉴클레오티드 부분과 제2 뉴클레오티드 부분을 공유적으로 연결하는 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S1)을 적어도 포함하는 내부의 스페이서 부분을 포함한다. 제1 뉴클레오티드 부분과 제2 뉴클레오티드 부분은 자가 상보적이지 않다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드의 총 개수 (예를 들어, 8개 내지 26개)는 분자의 뉴클레오티드 부분들 사이에 분포되고, 이때 각각의 뉴클레오티드 부분은 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 제1 뉴클레오티드 부분 (N1) 및 제2 뉴클레오티드 부분 (N2)으로 지칭되는 2개의 뉴클레오티드 부분을 함유한다. 본 발명의 RNAi 분자의 제1 및 제2 뉴클레오티드 부분은 분자의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분에 공유적으로 부착된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 1개를 초과하는 뉴클레오티드 부분 (예를 들어, 각각 제3 (N3), 제4 (N4) 또는 제5 (N5) 뉴클레오티드 부분으로 지칭되는 3개, 4개 또는 5개)을 함유한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분은 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S1)으로 지칭되는 오직 1개의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 함유한다. 본 발명의 RNAi 분자의 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S1)은 단일-가닥 분자의 별개의 뉴클레오티드 부분 내에 각각 위치하는 2개의 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 치환체에 공유적으로 부착된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분은 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (예를 들어, 각각 제2 (S2), 제3 (S3) 또는 제4 (S4) 비-뉴클레오티드 스페이서 부분으로 지칭되는 2개, 3개 또는 4개)을 함유한다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 세포 내의 RNA 표적 부위에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 천연-발생 miRNA의 가이드 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 따라서 miRNA 모방체로서 기능한다. 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체는 상응하는 천연-발생 miRNA를 기초로 디자인되고, 이때 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 천연-발생 miRNA 가이드 가닥 서열의 2개의 인접한 뉴클레오티드 사이에 위치하거나, 또는 천연-발생 miRNA 가이드 가닥 서열의 1개 내지 약 12개의 내부 (즉, 비-말단) 뉴클레오티드를 치환한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 단일-가닥 siRNA 또는 이중체 siRNA의 가이드/안티센스 가닥의 유사체이고, 이때 단일-가닥 RNAi 분자는 상응하는 단일-가닥 siRNA 또는 상응하는 이중체 siRNA의 가이드 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성인 서열을 포함한다. 상응하는 단일-가닥 siRNA 또는 이중체 siRNA는 RNAi 메카니즘을 통해 유전자 발현을 억제하는 것으로 공지되어 있을 수 있다. 이러한 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 단일-가닥 siRNA 모방체를 나타낸다. 본 발명의 단일-가닥 siRNA 모방체는 상응하는 siRNA를 기초로 디자인되고, 이때 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 siRNA 가이드 가닥 서열의 2개의 인접한 뉴클레오티드 사이에 위치하거나, 또는 상응하는 siRNA 가이드 가닥 서열의 1개 내지 약 4개의 뉴클레오티드를 치환한다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 백본, 당, 염기 또는 뉴클레오시드 내에서의 치환 또는 변형을 포함하여 치환, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 및 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 치환 또는 변형된 단일-가닥 RNAi 분자의 사용은 더 낮은 용량에서의 소정의 치료 효과의 달성을 가능하게 할 수 있는데, 이는 이러한 분자가 대상체 또는 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈청) 내에서의 반감기가 증가되도록 디자인될 수 있기 때문이다. 또한, 특정 세포 또는 조직을 표적으로 함으로써 또는 단일-가닥 RNAi 분자의 세포 흡수(uptake)를 개선함으로써 단일-가닥 RNAi 분자의 생체이용률을 개선하기 위해 특정 치환 또는 변형이 사용될 수 있다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분은 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함할 수 있다. 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 추가로 치환될 수 있는 임의의 지방족 또는 방향족 화학적 기를 포함할 수 있고, 이때 상기 스페이서 부분은 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 스페이서 부분은 단일-가닥 RNAi 분자에 추가적인 관능성을 제공하는 화학적 모이어티(moiety)로 치환될 수 있다. 예를 들어, 관심 표적 분자에 특이적으로 결합하고/하거나 분자의 세포 전달을 용이하게 하는/강화하는 모이어티로 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 치환될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 임의 치환될 수 있는, 바람직하게는 탄소수 1 내지 20의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬을 포함한다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 다양한 치료, 진단, 표적 확인, 게놈 발견, 유전자 조작, 및 약물유전체학 용도를 위한 방법에서 사용될 수 있는 유용한 시약이다. 따라서, 본 발명은 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자를 포함하는 조성물, 및 세포 또는 생물 내의 1개 이상의 상응하는 표적 mRNA의 발현을 억제하는 방법을 추가로 포함한다. 본 개시내용은 인간 세포, 조직 또는 개체가 포함되는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 및 단일-가닥 RNAi 분자 조성물을 제공한다.
도 1은 RT-qPCR 검정을 사용하여 C3 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 VAMP3 표적 발현의 억제 정도를 나타낸다. 이러한 유사체들의 구조 및 서열은 하기의 표 2에서 구체적으로 기술된다. miR-124 유사체의 개략도에서, 5' 포스페이트를 나타내는 5' 말단에 위치하는 흑색 원을 제외한 원은 뉴클레오티드를 나타낸다. 백색 원은 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 개략도의 3' 말단에 위치하는 흑색 원은 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 나타내고, "3"은 C3 스페이서의 위치를 나타낸다. "124(21)-8p-16rrr" 유사체의 개략도에서, 내부의 3개의 흑색 원은 변형되지 않은 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 그래프 내의 더 긴 막대는 더 큰 녹다운(knockdown)을 가리키고, 이중 막대는 생물학적 복제물들을 가리킨다.
도 2는 RT-qPCR 검정을 사용하여 C6 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 VAMP3 표적 발현의 억제 정도를 나타낸다. 이러한 유사체들의 구조 및 서열은 하기의 표 2에서 구체적으로 기술된다. miR-124 유사체의 개략도에서, 5' 포스페이트를 나타내는 5' 말단에 위치하는 흑색 원을 제외한 원은 뉴클레오티드를 나타낸다. 백색 원은 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 개략도의 3' 말단에 위치하는 흑색 원은 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 나타내고, "6"은 C6 스페이서의 위치를 나타낸다. "124(21)-8p-16rrr" 유사체의 개략도에서, 내부의 3개의 흑색 원은 변형되지 않은 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 그래프 내의 더 긴 막대는 더 큰 녹다운을 가리키고, 이중 막대는 생물학적 복제물들을 가리킨다.
도 3은 도 1 및 2에서 시험된 유사체들의 부분집합에 대한 VAMP3 발현의 용량-의존적 반응을 나타낸다. VAMP3 발현이 y축을 따라 도시된다. 왼쪽의 최저 용량 내지 오른쪽의 최고 용량의 범위로, 시험된 miR-124 유사체 (구조 및 서열에 대해 하기의 표 2 참조)의 용량이 x축을 따라 도시된다.
도 4는 miR-124의 시드(seed) 영역에 매칭(matching)되는 2개의 표적 부위를 보유하는 공동-형질감염된 루시퍼라제 리포터의 녹다운을 측정하는 리포터 검정을 사용하여 C3 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 억제 정도를 나타낸다. 이러한 유사체들의 구조 및 서열은 하기의 표 2에서 구체적으로 기술된다. miR-124 유사체의 개략도에서, 5' 포스페이트를 나타내는 5' 말단에 위치하는 흑색 원을 제외한 원은 뉴클레오티드를 나타낸다. 백색 원은 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 개략도의 3' 말단에 위치하는 흑색 원은 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 나타내고, "3"은 C3 스페이서의 위치를 나타낸다. "124(21)-8p-16rrr" 유사체의 개략도에서, 내부의 3개의 흑색 원은 변형되지 않은 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 그래프의 이중 막대는 생물학적 복제물들을 가리키고, 더 긴 막대는 더 큰 억제를 가리킨다.
도 5는 miR-124의 시드 영역에 매칭되는 2개의 표적 부위를 보유하는 공동-형질감염된 루시퍼라제 리포터의 녹다운을 측정하는 리포터 검정을 사용하여 C6 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 억제 정도를 나타낸다. 이러한 유사체들의 구조 및 서열은 하기의 표 2에서 구체적으로 기술된다. miR-124 유사체의 개략도에서, 5' 포스페이트를 나타내는 5' 말단에 위치하는 흑색 원을 제외한 원은 뉴클레오티드를 나타낸다. 백색 원은 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드를 나타낸다. 개략도의 3' 말단에 위치하는 흑색 원은 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 나타내고, "6"은 C6 스페이서의 위치를 나타낸다. "124(21)-8p-16rrr" 유사체의 개략도에서, 내부의 3개의 흑색 원은 변형되지 않은 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 이중 막대는 생물학적 복제물들을 가리키고, 더 긴 막대는 더 큰 억제를 가리킨다.
도 6a 및 6b는 도 3에서 시험된 단일-가닥 miR-124 유사체들의 부분집합에 대한 2개의 상이한 루시퍼라제 리포터의 표적 발현 억제의 용량-의존적 반응을 나타낸다. 도 6a에서, 제시된 억제 활성은 miR-124 시드 영역에 대한 2개의 매치(match)가 있는 루시퍼라제 리포터에 대한 것으로, 시험된 유사체의 miRNA 활성을 나타낸다. 도 6b에서, 제시된 억제 활성은 miR-124에 대한 2개의 전장(full-length) 매치가 있는 루시퍼라제 리포터에 대한 것으로, 시험된 유사체의 siRNA 활성을 나타낸다.
도 7은 2가지 상이한 농도 (100 nM 및 10 nM)에서 스페이서가 없는 상응하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 ("485")에 대해 위치 15 ("485 c3@pos15"), 16 ("485 c3@pos16"), 17 ("485 c3@pos17"), 18 ("485 c3@pos185"), 또는 19 ("485 c3@pos19") (올리고의 5'에 관련된 위치)에서 C3 스페이서가 혼입된 ApoB-표적화 단일 가닥 (가이드 가닥) 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 ApoB mRNA의 녹다운을 비교한다. 이러한 단일 가닥 분자 모두가 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오티드 둘 모두에서의 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 5' 포스페이트, 및 3' 말단에서의 2개의 2'-O-메틸 뉴클레오티드로 구성된다.
도 8 및 9는 2가지 농도 (100 nM 및 10 nM)에서 위치 18 (도 8) 또는 위치 19 (도 9)에 C3 스페이서가 있는, ApoB를 표적으로 하는 30개의 상이한 단일 가닥 서열을 사용하여 ApoB mRNA 녹다운을 비교한다. 단일 가닥이 표적으로 하는 ApoB mRNA 내의 위치에 의해 단일 가닥이 x축에 기록된다. 이러한 단일 가닥 분자 모두가 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오티드 둘 모두에서의 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 5' 포스페이트, 및 3' 말단에서의 2개의 2'-O-메틸 뉴클레오티드로 구성된다.
도 10은 도 8 및 9에서 시험된 30개의 상이한 ApoB 표적 부위 각각을 표적으로 하는 단일 가닥 분자들을 사용하여 100 nM 농도에서의 ApoB mRNA 녹다운을 비교한다 - C3 스페이서가 없는 단일 가닥 ("올-플루(all-flu)-p"), 위치 18에 C3 스페이서가 있는 단일 가닥 ("올-플루-c3-18-p"), 및 위치 19에 C3 스페이서가 있는 단일 가닥 ("올-플루-c3-19-p"). 이러한 단일 가닥 분자 모두가 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오티드 둘 모두에서의 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 5' 포스페이트, 및 3' 말단에서의 2개의 2'-O-메틸 뉴클레오티드로 구성된다.
발명의 상세한 설명
A. 용어 및 정의
본 출원에서 사용되는 경우에 하기의 전문 용어 및 정의가 적용된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 경우에, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 내용이 명확하게 달리 구술하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포(a cell)"에 대한 언급이 2개 이상의 세포의 조합을 포함하는 것 등이다.
달리 지시되지 않는 한, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위, 또는 정수 범위는 인용된 범위 내의 임의의 정수값을 포함하는 것으로, 그리고 적합한 경우에는 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
숫자와 관련하여 본원에서 사용되는 경우의 "약" 또는 "대략적으로"는 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 다른 방식으로 명백하지 않은 한 일반적으로 이러한 숫자의 어느 한쪽 방향으로의 5％ 범위 (초과 또는 미만)에 속하는 숫자를 포함하는 것으로 이해된다 (이같은 숫자가 가능한 값의 100％를 초과할 경우는 제외). 범위가 언급되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 다른 방식으로 명백하지 않은 한 종점이 이러한 범위 내에 포함된다.
본원에서 사용되는 경우에, "포함되는(including)" (및 그의 임의의 형태, 예컨대 "포함된다"), "포함하는(comprising)" (및 그의 임의의 형태, 예컨대 "포함한다"), "갖는(having)" (및 그의 임의의 형태, 예컨대 "가지다"), 또는 "함유하는(containing)" (및 그의 임의의 형태, 예컨대 "함유한다")이라는 용어는 포괄적이고, 제한이 없으며(open-ended), 열거되지 않은 추가적인 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 경우의 "유사체"는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 모 화합물 또는 분자 (예를 들어, 뉴클레오티드, 천연-발생 miRNA)와 구조적으로 유사하지만 조성 면에서 약간 상이한 화합물 또는 분자 (예를 들어, 1개의 원자 또는 관능기가 상이하거나, 부가되거나, 제거됨)를 지칭한다. 유사체는 원래의 모 화합물 또는 분자와 화학적 또는 물리적 성질이 상이할 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 생물학적 또는 화학적 활성이 개선되거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 유사체가 더욱 친수성일 수 있거나 또는 모 화합물/분자의 활성이 변경될 수 있다. 유사체는 원래의 모 화합물/분자의 천연 발생 또는 비-천연 발생 변이체 (예를 들어, 화학적으로 변형된 또는 재조합 변이체)일 수 있다. RNA 유사체의 예는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 RNA 분자이다. 뉴클레오티드 유사체는, 당업계에서 일반적으로 인지되는 바와 같이, 당, 염기 또는 뉴클레오시드에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
본원에서 사용되는 경우에, "모방체"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 기준 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태의 목적을 위한 기준 분자는 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유하지 않는 천연-발생 miRNA 분자 또는 단일-가닥 siRNA 분자일 수 있다. 모방체는 기준 분자의 능력 내인 생물학적, 생리학적 및/또는 화학적 기능 중 하나 이상 또는 이러한 기능 모두를 수행할 수 있다. 모방체와 기준 분자가 기능적 등가물일 필요는 없지만, 모방체는 하나 이상의 기능을 수행할 수 있어야 하고, 공유된 기능(들)을 나타내는데 적절한 파라미터 또는 검정을 사용하여 측정 및 비교했을 때 기준 분자의 활성의 적어도 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 또는 90％ 이상을 나타내야 한다. 기준 RNAi 분자와 구조적으로 상이한 본 개시내용의 RNAi 분자를 기술할 때, 용어 "유사체"와 "모방체"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"뉴클레오티드"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 인지되는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 뉴클레오티드는 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결, 예를 들어, 포스페이트를 포함한다. 염기는 당업계에 주지된 바와 같이 천연 염기 (표준), 변형된 염기, 또는 염기 유사체일 수 있다. 이같은 염기는 일반적으로 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에 위치한다. 추가적으로, 뉴클레오티드는 변형되지 않거나 또는 당, 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있다 (뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 및 비-표준 뉴클레오티드로 상호교환가능하게 지칭되기도 함); 예를 들어, 미국 출원 번호12/064,014 참조.
본원에서 사용되는 경우의 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 뉴클레오티드들의 사슬을 지칭한다. "핵산" 및 "핵산 분자"는 뉴클레오티드들의 중합체이다. 따라서, "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하다. 당업자는 핵산이 단량체성 뉴클레오티드들로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식이 있다. 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 더 가수분해될 수 있다.
"뉴클레오티드들의 연속적인 신장물"은 일련의 연속적인 2개 이상의 뉴클레오티드를 의미한다. 신장물 내의 뉴클레오티드들을 연결하는 결합은 포스포디에스테르 결합이다.
본원에서 사용되는 경우의 "RNA"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 1개 이상의 리보푸라노시드 잔기, 예컨대 리보뉴클레오티드를 포함하는 분자를 지칭한다. "리보뉴클레오티드"라는 용어는 β-D-리보푸라노스 모이어티의 2' 위치에 히드록실 기가 있는 뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 용어는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 단리된 RNA 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA, 또는 내부의 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연-발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 지칭한다. 이같은 변경은, 예를 들어, RNA 분자의 하나 이상의 비-말단 뉴클레오티드에서, 비-뉴클레오티드 물질이 부가되는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-천연 발생 뉴클레오티드, 화학적으로 합성 및/또는 변형된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변경된 RNA는 "변형된 RNA" 또는 "RNA 유사체"로 지칭된다.
본원에서 사용되는 경우의 "피리미딘"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 표준 피리미딘 염기인 우라실, 티미딘 및 시토신이 포함되는 통상적인 피리미딘 염기를 지칭한다. 또한, 용어 피리미딘은 비-표준 피리미딘 염기 또는 산, 예컨대 5-메틸우라실, 2-티오-5-메틸우라실, 4-티오우라실, 슈도우라실, 디히드로우라실, 오로테이트, 5-메틸시토신 등, 뿐만 아니라 화학적으로 변형된 염기 또는 "범용(universal) 염기"를 포괄하는 것으로 생각되고, 이들은 본 개시내용의 핵산 분자 내에서 표준 피리미딘을 치환하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우의 "퓨린"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 표준 퓨린 염기인 아데닌 및 구아닌이 포함되는 통상적인 퓨린 염기를 지칭한다. 또한, 용어 "퓨린"은 비-표준 퓨린 염기 또는 산, 예컨대 N2-메틸구아닌, 이노신, 디아미노퓨린 등, 뿐만 아니라 화학적으로 변형된 염기 또는 "범용 염기"를 포괄하는 것으로 생각되고, 이들은 본원에서 표준 퓨린을 치환하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, "염기 쌍"은 2개의 뉴클레오티드, 뉴클레오티드와 변형된 뉴클레오티드, 2개의 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 유사체, 2개의 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티, 또는 2개의 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티 간에 형성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 치환체는 세포성 RNAi 기구의 성분과 회합할 수 있는 임의의 화학적 모이어티, 예를 들어, PAZ 도메인, PIWI 도메인, 및/또는 RISC와 회합된 기타 아르고노트(Argonaute) 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 전통적인 왓슨-크릭 염기 쌍이 아닌 염기 쌍은 또한 "비-정규 염기 쌍"으로 이해되고, 이는 플립형(flipped) 미스매치, 단일 수소 결합 미스매치, 트랜스-유형 미스매치, 삼중 염기 상호작용, 및 사중 염기 상호작용이 포함되는, 임의의 비-왓슨 크릭 염기 쌍, 예컨대 미스매치 및/또는 워블(wobble) 염기 쌍을 의미한다. 이같은 비-정규 염기 쌍의 비제한적인 예로는 AC 역전(reverse) 후그스틴(Hoogsteen), AC 워블, AU 역전 후그스틴, GU 워블, AA N7 아미노, CC 2-카르보닐-아미노(H1)-N3-아미노(H2), GA 전단형(sheared), UC 4-카르보닐-아미노, UU 이미노-카르보닐, AC 역전 워블, AU 후그스틴, AU 역전 왓슨 크릭, CG 역전 왓슨 크릭, GC N3-아미노-아미노 N3, AA N1-아미노 대칭형, AA N7-아미노 대칭형, GA N7-N1 아미노-카르보닐, GA+ 카르보닐-아미노 N7-N1, GG N1-카르보닐 대칭형, GG N3-아미노 대칭형, CC 카르보닐-아미노 대칭형, CC N3-아미노 대칭형, UU 2-카르보닐-이미노 대칭형, UU 4-카르보닐-이미노 대칭형, AA 아미노-N3, AA N1-아미노, AC 아미노 2-카르보닐, AC N3-아미노, AC N7-아미노, AU 아미노-4-카르보닐, AU N1-이미노, AU N3-이미노, AU N7-이미노, CC 카르보닐-아미노, GA 아미노-N1, GA 아미노-N7, GA 카르보닐-아미노, GA N3-아미노, GC 아미노-N3, GC 카르보닐-아미노, GC N3-아미노, GC N7-아미노, GG 아미노-N7, GG 카르보닐-이미노, GG N7-아미노, GU 아미노-2-카르보닐, GU 카르보닐-이미노, GU 이미노-2-카르보닐, GU N7-이미노, 프사이(psi)U 이미노-2-카르보닐, UC 4-카르보닐-아미노, UC 이미노-카르보닐, UU 이미노-4-카르보닐, AC C2-H-N3, GA 카르보닐-C2-H, UU 이미노-4-카르보닐 2 카르보닐-C5-H, AC 아미노(A) N3(C)-카르보닐, GC 이미노 아미노-카르보닐, G프사이 이미노-2-카르보닐 아미노-2-카르보닐, 및 GU 이미노 아미노-2-카르보닐 염기 쌍이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 경우에, "상보적" (또는 "상보성")이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 전통적인 왓슨-크릭 또는 본원에 기술된 바와 같은 비-전통적인 다른 유형의 결합에 의한 1개의 핵산 서열과 또 다른 핵산 서열 간의 수소 결합(들)의 형성 또는 존재를 지칭한다. 예시적인 본 발명의 핵산 분자와 관련하여, 본 발명의 단일-가닥 RNAi와 RNA 표적 서열 사이에서 상보성이 발견될 수 있다. 핵산 분자와 그의 상보적인 서열에 대한 결합 자유 에너지는 핵산의 관련 기능, 예를 들어, RNAi 활성이 진행되도록 허용하는데 충분하다. 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지의 측정은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133]; [Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377]; [Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785] 참조).
본원에서 사용되는 경우에, 제1 핵산 분자 (예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자)와 제2 핵산 분자 (예를 들어, 표적 RNA 서열) 사이의 "완벽하게 상보적인" (또는 "완벽한 상보성")이라는 용어는 제1 핵산 서열의 모든 연속적인 잔기가 제2 핵산 서열 내의 동일한 개수의 연속적인 잔기와 수소 결합을 이룰 것임을 의미한다. 예를 들어, 2개 이상의 완벽하게 상보적인 핵산 가닥들은 뉴클레오티드 개수가 동일할 수 있거나 (즉, 길이가 동일하고, 오버행(overhang)이 있는 또는 오버행이 없는 1개의 이중 가닥 영역을 형성함), 또는 뉴클레오티드 개수가 상이할 수 있다 (예를 들어, 1개의 가닥이 더 짧을 수 있지만 제2 가닥 내에 완전하게 함유될 수 있음). 예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에 뉴클레오티드가 1개뿐인 제1 뉴클레오티드 부분 및 10개의 연속적인 뉴클레오티드의 제2 뉴클레오티드 부분이 있고, 이때 분자의 제2 뉴클레오티드 부분 내의 10개의 뉴클레오티드 모두가 RNA 표적 서열과 염기 쌍을 이루면, 이러한 RNAi 분자는 RNA 표적 서열과 완벽하게 상보적이다. 제1 뉴클레오티드 부분 내에 포함된 단일 뉴클레오티드는 상보성 정도를 결정할 때 포함되지 않는데, 뉴클레오티드들의 연속적인 사슬의 내에 있지 않기 때문이다. 그러나, 이러한 예에서, 제1 뉴클레오티드 부분이 2개의 뉴클레오티드를 함유하는 경우에는, 제1 뉴클레오티드 부분 내의 2개의 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드 부분 내의 10개의 뉴클레오티드가 RNA 표적 서열과 염기 쌍을 이루면 RNAi 분자가 RNA 표적 서열에 완벽하게 상보적이다.
상보적 핵산 분자에 쌍을 잘못 이룬 염기 - 즉, 전통적인 왓슨-크릭 염기 쌍 (즉, 수소 결합을 형성함) 또는 비-전통적인 다른 유형의 염기 쌍을 형성할 수 없는 염기 (즉, 수소 결합이 아닌 비-전통적인 힘에 의해 형성되거나 함께 유지되는 "미스매치" 염기)가 있을 수 있다. 제1 핵산 분자 (예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자)와 제2 핵산 분자 (예를 들어, 표적 RNA 서열) 사이의 "부분적으로 상보적인" (또는 "부분적 상보성")이라는 용어는 다양한 미스매치 또는 염기 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이를 초과하는 개수의 미스매치 또는 염기 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드)가 뉴클레오티드 서열들 사이에서 발생하고, 이는 예를 들어 팽출(bulge) 또는 루프를 초래할 수 있다는 것을 가리킨다. 이같은 부분적인 상보성은 수반되는 뉴클레오티드의 총 개수와 관련하여 염기 쌍을 이룬 뉴클레오티드의 개수에 의해 결정되는 상보성 백분율 (％), 예를 들어, 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 등으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 제1 핵산 분자에 10개의 뉴클레오티드가 있을 수 있고, 제2 핵산 분자에 10개의 뉴클레오티드가 있을 수 있으며, 그러면 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자 사이에 뉴클레오티드 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개가 염기 쌍을 이루는 것 (연속적인 이중-가닥 영역을 형성할 수 있거나 그렇지 않을 수 있음)은 각각 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 100％ 상보성을 나타낼 수 있다. 본 발명과 관련하여, 이같은 부분적인 상보성은 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 그의 기능, 예를 들어 서열 특이적 RNAi를 매개하는 능력을 유지하는 정도로 허용된다.
제1 핵산 분자가 제2 핵산에 대해 "실질적으로 상보적"일 수 있다. "실질적으로 상보적"은 제1 핵산 서열 (예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자)이 제2 핵산 서열 (예를 들어, RNA 표적 서열)에 대해 적어도 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 상보적이라는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 경우에, 제1 핵산 분자는 제2 핵산 분자에 대해 "부분적으로 상보적" 및 "실질적으로 상보적" 둘 모두일 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, "상동성인" (또는 "상동성")이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는, 전형적으로 서열 분석 프로그램 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268]; [Karlin and Altschul, 1993, PNAS 90:5873-5877])에 의해 또는 육안 검사에 의해 결정된 바와 같은, 기준 핵산 서열의 동일한 뉴클레오티드에 매칭된 대상 핵산 서열의 뉴클레오티드의 개수를 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우의 "완벽한 상동성" (또는 "완벽하게 상동성인")이라는 용어는 기준 서열과 대상 핵산 서열 간의 완전한 (100％) 상동성 또는 "동일성"을 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우에, "실질적으로 상동성인" (또는 "실질적인 상동성")이라는 용어는 대상 서열이 기준 서열 내의 동일한 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드들과 적어도 50％ (예를 들어, 적어도 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％) 상동성인 뉴클레오티드들을 공유한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 경우의 "화학적 변형"이라는 구절은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 예시적인 본 발명의 핵산 분자와 관련하여, 이러한 용어는 천연 RNA의 뉴클레오티드와 상이한, 뉴클레오티드의 화학 구조의 임의의 변형을 지칭한다. 용어 "화학적 변형"은 본원에 기술된 바와 같은 또는 당업계에 다른 방식으로 공지된 바와 같은, 당, 염기, 또는 뉴클레오티드간 연결에서의 천연 RNA의 부가, 치환 또는 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용어 "화학적 변형"은 특정 생물학적 시스템에서 천연적으로 발생하는 특정 형태의 RNA, 예를 들어 2'-O-메틸 변형 또는 이노신 변형을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 경우의 "변형된 뉴클레오티드"라는 구절은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는, 당업계에서 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이, 변형되지 않은 (또는 천연) 뉴클레오티드의 염기, 당 및/또는 포스페이트의 화학 구조에서의 변형을 함유하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드의 비제한적인 예가 본원 및 미국 출원 번호12/064,014에 기술되어 있다.
"변형 백분율"은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 용어는 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자 내의 변형된 뉴클레오티드의 개수를 지칭한다. 화학적 변형의 정도는 당업자에게 주지된 다양한 인자 (예를 들어, 표적 RNA, 표적을 벗어난(off-target) 침묵화, 엔도뉴클레아제 분해 정도)에 좌우될 것이다.
"포스포로티오에이트"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 산소 원자 대신 하나 이상의 황 원자를 포함하는 뉴클레오티드간 포스페이트 연결을 지칭한다. 따라서, 용어 포스포로티오에이트는 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드간 연결 둘 모두를 지칭한다.
본원에서 사용되는 경우에, "잠금 핵산" (LNA)이라는 용어는 화학식 I의 구조를 갖는다.
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서, X 및 Y는 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -CH2-, 또는 -CH- (이중 결합의 일부인 경우), -CH2-O-, CH2-S-, CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2-, 및 CH2-CH- (이중 결합의 일부인 경우), -CH=CH-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R은 수소 및 C1 -4-알킬로부터 선택되고; Z 및 Z*는 뉴클레오티드간 연결, 말단 기 또는 보호기로부터 독립적으로 선택되고; B는 천연 또는 비-천연 핵염기를 구성하고; 비대칭 기는 어느 한쪽 방향으로 확인될 수 있다.
화학식 I의 4개의 키랄 중심은, 제시된 바와 같이, 고정된 형상이지만, 이들의 배위가 고정될 필요는 없다. 따라서, 키랄 중심이 상이한 배위, 예컨대 화학식 II (하기)에서 표시된 것들로 확인될 수 있다. 따라서, 화학식 1 내의 각각의 키랄 중심이 R 또는 S 배위로 존재할 수 있다. 문헌 [IUPAC 1974 Recommendations, Section E, Fundamental Stereochemistry]에 R (오른쪽(rectus)) 및 S (왼쪽(sinister))의 정의가 기술되어 있다: 문헌 [Pure Appl. Chem. 45, 13-30 (1976)] 및 ["Nomenclature of Organic Chemistry" Pergamon, New York, 1979]에서 규칙들을 확인할 수 있다.
말단 기는 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록시, Prot-O-, Act-O-, 메르캅토, Prot-S-, Act-S-, C1 -6-알킬티오, 아미노, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, 모노- 또는 디(C1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C1 -6-알콕시, 임의로 치환된 C1 -6-알킬, 임의로 치환된 C2 -6-알케닐, 임의로 치환된 C2 -6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C2 -6-알키닐, 임의로 치환된 C2 -6-알키닐옥시, 모노포스페이트, 모노티오포스페이트, 디포스페이트, 디티오포스페이트, 트리포스페이트, 트리티오포스페이트, DNA 인터칼레이터(intercalator), 광화학적으로 활성인 기, 열화학적으로 활성인 기, 킬레이팅(chelating) 기, 리포터 기, 리간드, 카르복시, 술포노, 히드록시메틸, Prot-O-CH2-, Act-O-CH2-, 아미노메틸, Prot-N(RH)-CH2-, Act-N(RH)-CH2-, 카르복시 메틸, 술포노메틸로부터 독립적으로 선택되고, 이때 Prot는 각각 -OH, -SH, 및 -NH(RH)에 대한 보호기이고, Act는 각각 -OH, -SH, 및 -NH(RH)에 대한 활성화 기이며, RH는 수소 및 C1 -6-알킬로부터 선택된다.
히드록실 치환기의 보호기는 치환된 트리틸, 예컨대 4,4'-디메톡시트리틸옥시 (DMT), 4-모노메톡시트리틸옥시 (MMT), 및 트리틸옥시, 임의로 치환된 9-(9-페닐)잔테닐옥시 (픽실), 임의로 치환된 메톡시테트라히드로-피라닐옥시 (mthp), 실릴옥시 예컨대 트리메틸실릴옥시 (TMS), 트리이소실릴옥시 (TIPS)7 tert-부틸디메틸실릴옥시 (TBDMS), 트리에틸실릴옥시, 및 페닐디메틸실릴옥시, tert-부틸에테르, 아세탈 (2개의 히드록시 기 포함), 아실옥시 예컨대 아세틸 또는 할로겐-치환 아세틸을 포함한다.
"Act"는 각각 -OH, -SH, 및 -NH(RH)에 대한 활성화 기를 나타낸다. 이같은 활성화 기는, 예를 들어, 임의로 치환된 O-포스포르아미다이트, 임의로 치환된 O-포스포르트리에스테르, 임의로 치환된 O-포스포르디에스테르, 임의로 치환된 H-포스포네이트, 및 임의로 치환된 O-포스포네이트로부터 선택된다.
B는 아데닌, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐-6-플루오로우라실, 5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌, 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로부터 선택된 천연 또는 비-천연 핵염기를 구성한다.
바람직하게는, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에서 사용된 잠금 핵산 (LNA)은 화학식 II 중 임의의 것에 따른 LNA 구조를 포함한다.
<화학식 IIA>
Figure pct00002
<화학식 IIB>
Figure pct00003
<화학식 IIC>
Figure pct00004
상기 식에서, Y는 -O-, -S-, -NH-, 또는 N(RH)이고; Z 및 Z*는 뉴클레오티드간 연결, 말단 기 또는 보호기 중에서 독립적으로 선택되고; B는 천연 또는 비-천연 핵염기를 구성한다. 이러한 예시적인 LNA 단량체 등, 뿐만 아니라 그의 제조가 WO 99/14226 및 후출원, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 및 WO 2003/006475에 기술되어 있고, 이들 모두의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
"범용 염기"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 각각의 표준 DNA/RNA 염기를 거의 구별하지 않으면서 이와 염기 쌍을 형성하고 세포내 효소에 의해 인지되는 뉴클레오티드 염기 유사체를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Loakes et al., 1997, J. Mol. Bio. 270:426-435] 참조. 범용 염기의 비제한적인 예로는 C-페닐, C-나프틸 및 기타 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카르복스아미드, 및 니트로아졸 유도체 예컨대 3'-니트로피롤 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 및 6-니트로인돌 (당업계에 공지된 바와 같음)이 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Loakes, 2001, Nucleic Acids Res. 29:2437] 참조.
본원에서 사용되는 경우에, "RNA 간섭" (본원에서 "RNAi"로 또한 칭해짐)이라는 구절은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 세포 내에서 유전자 발현을 억제하거나, 감소시키거나 또는 하향-조절하고, 짧은 간섭 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, miRNA, shRNA)에 의해 매개되는 생물학적 프로세스를 지칭한다 (예를 들어 문헌 [Zamore and Haley, 2005, Science 309:1519-1524]; [Vaughn and Martienssen, 2005, Science 309:1525-1526]; [Zamore et al., 2000, Cell 101:25-33]; [Bass, 2001, Nature 411:428-429]; [Elbashir et al., 2001, Nature 411:494-498]; 및 크로이처(Kreutzer) 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 00/44895; 제르니카-괴츠(Zernicka-Goetz) 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 01/36646; 파이어(Fire)의 국제 PCT 공개 번호 WO 99/32619; 플라에팅크(Plaetinck) 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 00/01846; 멜로(Mello) 및 파이어(Fire)의 국제 PCT 공개 번호 WO 01/29058; 데샹-데파이예트(Deschamps-Depaillette)의 국제 PCT 공개 번호 WO 99/07409; 및 리(Li) 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 00/44914; 문헌 [Allshire, 2002, Science 297:1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science 297:1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science 297:2215-2218]; 및 [Hall et al., 2002, Science 297:2232-2237]; [Hutvagner and Zamore, 2002, Science 297:2056-60]; [McManus et al., 2002, RNA 8:842-850]; [Reinhart et al., 2002, Gene & Dev. 16:1616-1626]; 및 [Reinhart & Bartel, 2002, Science 297:1831] 참조). 추가적으로, 용어 "RNA 간섭" (또는 "RNAi")은 서열-특이적 RNA 간섭을 기술하는데 사용되는 다른 용어들, 예컨대 번역후 유전자 침묵화, 번역 억제, 전사 억제, 또는 후생유전학과 등가이도록 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 전사후 수준 또는 전사전 수준에서 후생유전학적으로 유전자를 침묵시키는데 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자에 의한 유전자 발현의 후생유전학적 조정이 염색질 구조 또는 메틸화 패턴의 변형으로부터 초래되어 유전자 발현을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Verdel et al., 2004, Science 303:672-676]; [Pal-Bhadra et al., 2004, Science 303:669-672]; [Allshire, 2002, Science 297:1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science 297:1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science 297:2215-2218]; 및 [Hall et al., 2002, Science 297:2232-2237] 참조). 또 다른 비제한적인 예에서, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자에 의한 유전자 발현의 조정이 당업계에 공지된 바와 같이 번역 억제를 통해 또는 RISC를 통해 RNA (코딩 또는 비-코딩 RNA)의 절단으로부터 초래될 수 있거나, 또는 조정이 전사 억제로부터 초래될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology 1:216-222] 참조).
본원에서 사용되는 경우의 "억제하다", "하향 조절하다", "감소시킨다" 또는 "녹다운시킨다"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 이들의 의미를 지칭한다. 예시적인 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자와 관련하여, 일반적으로 이러한 용어는 (i) 유전자 또는 표적 서열의 발현 및/또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 RNA 분자의 수준, 및/또는 (ii) 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 부재 하에 관찰되는 것 미만으로 감소되는 것을 지칭한다. 하향 조절은 전사후 침묵화, 예컨대 RNAi-매개 절단과 또한 회합될 수 있거나, 또는 DNA 메틸화 패턴 또는 DNA 염색질 구조에서의 변경에 의한 것일 수 있다. RNAi 작용제로의 억제, 하향-조절, 감소 또는 녹다운은 불활성 분자, 약화된 분자, 스크램블(scrambled) 서열이 있는 RNAi 작용제, 또는 미스매치가 있는 RNAi 작용제와 관련될 수 있다. "유전자 침묵화"라는 구절은 세포 내의 내인성 표적 유전자의 표적화된 억제를 통한 부분적인 또는 완전한 기능 상실을 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 표적 유전자의 발현의 RNAi, "녹다운", "억제, "하향-조절" 또는 "감소"와 상호교환가능하게 사용된다.
억제 정도를 결정하기 위해, 시험 샘플 (예를 들어, 표적 유전자(들) 또는 표적 서열(들)을 발현하는 관심 생물로부터의 생물학적 샘플 또는 표적 유전자/서열을 발현하는 배양물 내의 세포의 샘플)을 표적 유전자 또는 서열의 발현을 침묵시키거나, 감소시키거나 또는 억제하는 RNAi 분자와 접촉시킬 수 있다. 시험 샘플 내의 표적 유전자/서열의 발현을 RNAi 분자와 접촉되지 않은 대조군 샘플 (예를 들어, 표적 유전자/서열을 발현하는 관심 생물로부터의 생물학적 샘플 또는 표적 유전자/서열을 발현하는 배양물 내의 세포의 샘플) 내의 표적 유전자/서열의 발현과 비교한다. 대조군 샘플 (즉, 표적 유전자/서열을 발현하는 샘플)에 100％의 값이 할당된다. 대조군 샘플에 비교하여 시험 샘플의 값이 약 95％, 90％, 85％, 80％, 75％, 70％, 65％, 60％, 55％, 50％, 45％, 40％, 35％, 30％, 25％, 20％, 또는 10％일 때 표적 유전자/서열의 발현의 침묵화, 억제 또는 감소가 달성된다. 적절한 검정에는, 예를 들어, 당업자에게 공지된 기술을 사용하는 단백질 또는 mRNA 수준의 검사, 예컨대 도트(dot) 블롯, 노던(Northern) 블롯, 계내 혼성화, ELISA, 마이크로어레이 혼성화, 면역침전, 효소 기능, 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 표현형 검정이 포함된다.
"개선된 RNAi 활성"이라는 구절은 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 측정된 RNAi 활성에서의 증가를 일반적으로 지칭하고, 이때 RNAi 활성은 RNAi 작용제의 RNAi를 매개하는 능력 및 RNAi 작용제의 안정성 중 하나 또는 둘 모두를 반영한다.
본원에서 사용되는 경우의 "조정하다"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 조정을 초래하는 분자의 부재 하에 관찰되는 것보다 발현, 수준 또는 활성이 더 크거나 또는 더 작도록, 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 RNA 분자 (코딩 또는 비-코딩)의 수준, 또는 하나 이상의 RNA 분자 또는 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 상향 조절 또는 하향 조절되는 경우를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "조정"은 예를 들어 유전자 발현에 대해 일부 실시양태에서는 억제를 지칭할 수 있고, 다른 실시양태에서는 강화 또는 상향 조절을 지칭할 수 있다.
"RNAi 작용제" 또는 "RNAi 분자"라는 용어는 서열-특이적 방식으로 RNA 간섭 ("RNAi") 또는 유전자 침묵화를 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제하거나 하향 조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. RNAi 작용제는 자가-상보적인 센스 (패신저) 및 안티센스 (가이드) 가닥을 포함하는 이중-가닥 핵산 분자일 수 있고, 이때 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부분 내의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. RNAi 작용제는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이론에 한정되는 것을 원치 않으면서, RNAi 작용제는 표적 mRNA의 전사후 절단 또는 전사전 또는 번역전 메카니즘을 포함하는 다수의 메카니즘 중 하나 이상에 의해 작용할 수 있다.
"단일-가닥 RNAi" 또는 "ssRNAi" 작용제 또는 분자라는 용어는 표적 핵산 분자 또는 그의 일부분 내의 뉴클레오티드 서열에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 가닥의 핵산-유래 분자인 RNAi 작용제이다. 단일-가닥 RNAi 작용제가 이와 함께 염기 쌍을 형성하는 제2 뉴클레오티드 서열이 존재하지 않는다. 단일-가닥 RNAi 분자는 말단 끝부분 중 하나 또는 둘 모두에 위치하는 말단 포스페이트 기, 예컨대 5'-포스페이트 또는 5', 3'-디포스페이트를 추가로 포함할 수 있다. ssRNAi 분자/작용제는 miRNA 또는 miRNA 모방체를 포함할 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 작용제는 RISC 내로 로딩되거나 또는 다른 방식으로 RISC와 회합될 수 있고, RNAi 메카니즘을 통해 유전자 침묵화에 참여할 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 치환, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 및 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 또는 모든 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태는 백본, 당, 염기 또는 뉴클레오시드 내에 치환 또는 변형을 포함하는 단일-가닥 RNAi 분자를 포함한다.
"miRNA" 또는 "마이크로RNA"라는 용어는 본원에서 당업계에서의 그의 일반적인 의미에 따라 사용되고, 포유동물이 포함되는 다양한 진핵생물에서 발현되고 RNA-기반 유전자 조절에서 수반되는, 단백질을 코딩하지 않는 소형 RNA 분자를 지칭한다. 완전하게 프로세싱된 성숙형 miRNA는 길이가 뉴클레오티드 약 15개 내지 약 30개이다. 공지된 내인성 miRNA 종의 대표적인 세트가 문헌 [Griffith-Jones et al., Nucleic Acids Research, 2004, 32:D109-D111] 및 [Griffith-Jones et al., Nucleic Acids Research, 2006, 34:D 140-D144]에서 기술되고 월드 와이드 웹 상에서 웰컴 트러스트 생어 인스티튜트(Wellcome Trust Sanger Institute)의 웹사이트에서 접근가능한 공개적으로 입수가능한 miRBase 서열 데이터베이스에 기술되어 있다. miRBase 서열 데이터베이스에서 공개적으로 입수가능한 완전하게 프로세싱된 성숙형 miRNA들이 각각 본원에 참고로 포함된다. 대표적인 miRNA 세트가 하기의 표 1에서 본원에 또한 포함된다. 각각의 성숙형 miRNA는 miRNA의 표적인 하나 이상의 메신저 RNA (mRNA) 분자에 부분적으로 상보적이고, 이에 의해 표적과 관련된 유전자의 발현을 조절한다.
본원에서 사용되는 경우에, 용어 "miRNA 모방체"는 세포 내의 천연-발생 miRNA의 모방체인 단일-가닥 RNA 분자를 지칭한다. 전형적으로 miRNA 모방체는 상응하는 내인성 miRNA를 기초로 디자인된다. miRNA 모방체는 상응하는 천연-발생 miRNA에 의해 또한 조절되는 표적 mRNA의 발현을 조정할 수 있다. miRNA 모방체이기도 한 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 RISC 내로 로딩되거나 또는 다른 방식으로 RISC와 회합될 수 있고, RNAi 메카니즘을 통해 유전자 침묵화에 참여할 수 있다. 본 발명의 miRNA 모방체는 치환, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 및 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 miRNA 모방체는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 또는 모든 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태는 백본, 당, 염기 또는 뉴클레오시드 내에 치환 또는 변형을 포함하는 miRNA 모방체를 포함한다. 세포 내의 천연-발생 miRNA는 본원에서 "상응하는 miRNA", "내인성 miRNA", 또는 "천연-발생 miRNA"로 지칭된다. 세포에 제공되는 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체는 상응하는 천연-발생 miRNA도 표적으로 하는 하나 이상의 표적 mRNA를 표적으로 하는 것으로 또한 이해된다. 세포에 도입된 본 발명의 miRNA 모방체가 적합한 조건 하에 천연-발생 miRNA와 같이 기능할 수 있는 것으로 예상된다.
본원에서 사용되는 경우에, "시드 영역" (본원에서 "시드 서열"로 또한 지칭됨)이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 천연-발생 성숙형 miRNA, 예컨대 본 출원의 출원일 현재 공개적으로 입수가능한 miRBase 서열 데이터베이스 (http://www.mirbase.org/)에 열거된 것들로부터 선택된 것 및/또는 표 1에 열거된 것들로부터 선택된 것의 5'-말단의 뉴클레오티드 위치 1 내지 10 이내의 6개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 지칭한다. 위치 1 내지 8의 시드 서열 뉴클레오티드가 표 1의 서열들에서 대문자로 표시된다. 천연-발생 miRNA에서, 전형적으로 시드 영역은 이러한 miRNA가 결합하여 유전자 조절을 제공할 수 있는 표적 mRNA 서열을 결정한다. 따라서, 다중 천연-발생 miRNA들이 시드 영역을 공유할 수 있거나 또는 시드 영역에서 실질적인 상동성을 공유할 수 있고, 이러한 miRNA들은 동일한 miRNA 패밀리의 구성원이다.
"siRNA" (또한 "짧은 간섭 RNA" 또는 "소형 간섭 RNA")라는 용어에는 당업계에서 받아들여지는 그의 통상적인 의미가 주어지고, 뉴클레오티드 약 1개 내지 약 4개의 3' 오버행을 포함할 수 있거나 그렇지 않을 수 있고 RNA 간섭을 매개하는 상보적인 RNA 올리고뉴클레오티드들의 이중체 (센스 및 안티센스 가닥)을 일반적으로 지칭한다.
본원에서 사용되는 경우에, "siRNA 모방체" 또는 "단일-가닥 siRNA 모방체"라는 용어는 상응하는 siRNA (단일 또는 이중 가닥)의 가이드 또는 안티센스 가닥의 모방체인 단일-가닥 RNAi 분자를 지칭한다. siRNA 모방체는 상응하는 siRNA에 의해서도 조절되는 표적 RNA의 발현을 조정할 수 있고, 따라서 RISC 내로 로딩되거나 또는 다른 방식으로 RISC와 회합될 수 있고, RNAi 메카니즘을 통해 유전자 침묵화에 참여한다. 본 발명의 단일-가닥 siRNA 모방체는 치환, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 및 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 siRNA 모방체는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 또는 모든 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태는 백본, 당, 염기 또는 뉴클레오시드 내에 치환 또는 변형을 포함하는 siRNA 모방체를 포함한다.
본원에서 사용되는 경우의 "유전자"라는 용어는, 특히 RNAi 작용제에 대한 "표적 유전자"의 문맥에서, 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 폴리펩티드 생산에 필요한 부분적인 길이 또는 전체 길이의 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 표적 유전자는 핵산 서열의 UTR (즉, 비번역 영역) 또는 비-코딩 영역을 또한 포함할 수 있다. 유전자 또는 표적 유전자는 기능성 RNA (fRNA) 또는 비-코딩 RNA (ncRNA), 예컨대 소형 일시적 RNA (stRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵소체 RNA (snRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA) 및 이들의 전구체 RNA를 또한 코딩할 수 있다. 이같은 비-코딩 RNA는 기능성 또는 조절성 세포 프로세스에서 수반되는 fRNA 또는 ncRNA의 활성을 조정하는 것에서 RNA 간섭에 대한 표적 핵산 분자로서의 역할을 할 수 있다. 따라서, 질환에 이르는 비정상적인 fRNA 또는 ncRNA 활성이 본 발명의 RNAi 작용제에 의해 조정될 수 있다. fRNA 및 ncRNA를 표적으로 하는 RNAi 작용제는 세포 프로세스 예컨대 유전적 각인, 전사, 번역 또는 핵산 프로세싱 (예를 들어, 아미노전이(transamination), 메틸화 등)에 개입하는 것에 의해 대상체, 생물 또는 세포의 유전자형 또는 표현형을 조작하거나 변경시키는데 또한 사용될 수 있다. 표적 유전자는 세포로부터 유래된 유전자, 내인성 유전자, 트랜스진, 또는 세포 감염 후에 세포 내에 존재하는 병원체, 예를 들어, 바이러스의 유전자와 같은 외인성 유전자일 수 있다. 표적 유전자를 함유하는 세포는 임의의 생물, 예를 들어 식물, 동물, 원생동물, 바이러스, 박테리아 또는 진균으로부터 유래될 수 있거나 또는 이들 내에 함유될 수 있다. 식물의 비제한적인 예로는 단자엽식물, 쌍자엽식물 또는 겉씨 식물이 포함된다. 동물의 비제한적인 예로는 척추동물 또는 무척추동물이 포함된다. 진균의 비제한적인 예로는 곰팡이 또는 효모가 포함된다. 리뷰를 위해, 예를 들어 문헌 [Snyder and Gerstein, 2003, Science 300:258-260]을 참조한다.
본원에서 사용되는 경우의 "표적 부위", "표적 서열", 및 "표적 영역"이라는 구절은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어들은 "표적화"되는, 예를 들어, 자신의 가이드/안티센스 영역 내에 이러한 표적 서열에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적인 서열을 함유하는 RNAi 분자에 의해 매개되는 절단에 대해 표적화되는 표적 핵산 분자 (예를 들어, mRNA) 내의 서열을 지칭한다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에 대한 "표적 부위"는 단일-가닥 RNAi 작용제에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적인 핵산 서열을 지칭한다. 표적 부위는 표적 RNA의 코딩 영역 또는 비-코딩 (즉, 비번역) 영역 내에 있을 수 있다. 표적 부위는 내인성 miRNA (단일-가닥 RNAi 분자가 이에 대한 모방체임)에 대한 표적 부위일 수 있고, 이러한 경우에 "표적 부위"는 "miRNA 표적 부위" 또는 "상응하는 miRNA 표적 부위"로 또한 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우의 "센스 영역"이라는 구절은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 RNAi 분자의 안티센스 영역에 대한 상보성이 있는 RNAi 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 또한, RNAi 분자의 센스 영역은 표적 핵산 서열과의 상동성 또는 서열 동일성이 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. RNAi 분자의 센스 영역은 센스 가닥 또는 패신저 가닥으로 또한 지칭된다.
본원에서 사용되는 경우의 "안티센스 영역"이라는 구절은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 표적 핵산 서열에 대한 상보성이 있는 RNAi 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 또한, RNAi 분자의 안티센스 영역은 RNAi 분자의 센스 영역에 대한 상보성이 있는 핵산 서열을 임의적으로 포함할 수 있다. RNAi 분자의 안티센스 영역은 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로 또한 지칭된다.
본원에서 사용되는 경우에, "스페이서"라는 용어는 2개의 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티를 연결할 수 있는 임의의 화학적 기(들)을 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 경우에, "스페이서"는 전통적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 2개의 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티를 연결할 수 있다. 전형적으로 스페이서는 각각의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 치환체에 공유적으로 결합되고 백본 (즉, 상보적인 하이브리드를 형성하는 핵염기들)을 형성하는 뉴클레오티드간 연결 이외의 것인 유기 엔티티(entity)이다.
본원에서 사용되는 경우에, "알킬"이라는 용어는 특정 개수의 탄소 원자가 있는 포화 지방족 탄화수소 기 (분지형 및 직쇄형 둘 모두)를 포함하도록 의도된다. 용어 "알킬"은 비-방향족 시클로알킬 기를 또한 지칭한다. 바람직하게는, 알킬 기에는 1 내지 20개의 탄소가 있다 (즉, C1-C20). 예를 들어, "C1-C10 알킬"에서와 같은 C1-C10은 선형, 분지형 또는 고리형 배열 (즉, 시클로알킬)로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 탄소가 있는 기를 포함하는 것으로 정의된다. "시클로알킬"이라는 용어는 특정 개수의 탄소 원자가 있는 단환식 포화 지방족 탄화수소 기를 의미한다. 예를 들어, "알킬"에는 구체적으로 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸, i-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등, 뿐만 아니라 시클로프로필, 메틸-시클로프로필, 2,2-디메틸-시클로부틸, 2-에틸-시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함되는 시클로알킬이 포함된다. 지시되는 경우에, 알킬 기가 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, "알케닐"이라는 용어는 2개 이상의 탄소 원자 및 1개 이상의 탄소 대 탄소 이중 결합을 함유하는 직선형 또는 분지형의 비-방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 용어 "알케닐"은 비-방향족 시클로알케닐 기를 또한 지칭한다. 바람직하게는, 알케닐 기에는 1개 내지 20개의 탄소가 있다 (즉, C1-C20). 알케닐 기에는, 예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 부테닐 및 시클로헥세닐이 포함된다. 지시되는 경우에, 알케닐 기는 이중 결합들을 함유할 수 있고 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, "알키닐"이라는 용어는 2개 이상의 탄소 원자 및 1개 이상의 탄소 대 탄소 삼중 결합을 함유하는 직선형 또는 분지형의 비-방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 용어 "알키닐"은 비-방향족 시클로알키닐 기를 또한 지칭한다. 3개 이하의 탄소-탄소 삼중 결합이 존재할 수 있다. 바람직하게는, 알키닐 기에는 1개 내지 20개의 탄소가 있다 (즉, C1-C20). 알키닐 기에는, 예를 들어, 에티닐, 프로피닐, 부티닐 및 시클로옥티닐이 포함된다. 지시되는 경우에, 알키닐 기는 삼중 결합들을 함유할 수 있고 치환될 수 있다.
화학적 기와 관련하여 본원에서 사용되는 경우의 "지방족"이라는 용어는 방향족 고리를 함유하지 않는 탄소 및 수소로 구성되는 유기 기를 지칭한다. 지방족 구조는 고리형일 수 있고/있거나 포화될 수 있다. 직쇄, 분지쇄 또는 비-방향족 고리에서 탄소 원자들이 함께 연결될 수 있다. 이들은 단일 결합 (알칸), 이중 결합 (알켄) 또는 삼중 결합 (알킨)에 의해 또한 연결될 수 있다. 수소에 더하여, 다른 원소가 탄소 사슬에 결합될 수 있거나 또는 사슬 내의 탄소를 치환할 수 있고, 가장 통상적인 것은 산소, 질소, 황 및 염소이다.
화학적 기와 관련하여 본원에서 사용되는 경우의 "방향족"이라는 용어는 하기의 구체적인 특성이 있는 공유적으로 결합된 원자들의 세트를 함유하는 유기 기를 지칭한다: (1) 편재화되지 않은 공액 π 시스템, 가장 통상적으로는, 교대되는 단일 및 이중 결합의 배열; (2) 모든 기여 원자가 동일한 평면에 있는 동일평면성 구조; (3) 하나 이상의 고리 내에 배열된 기여 원자; 및 (4) 짝수이지만 4의 배수는 아닌 다수의 편재화되지 않은 π 전자. 방향족 구조는 탄화수소 단독으로 구성될 수 있다 (예를 들어, 아릴). 기타 원소가 방향족 구조의 탄소에 결합되거나 또는 이를 치환할 수 잇고, 가장 통상적인 것은 산소, 질소, 황 및 염소이다 (예를 들어, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴).
지방족 또는 방향족 유기 구조 (예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴)와 관련하여 사용되는 경우의 "치환된"이라는 용어는 탄소 사슬에 결합된 추가적인 화학적 모이어티 및/또는 관능기의 존재를 지칭한다. 예를 들어, 치환된 탄화수소 사슬에는 헤테로원자 (예를 들어, N, O, 또는 S)가 이에 결합된 탄화수소 사슬이 포함될 수 있다. 치환된 탄화수소 사슬에는 헤테로원자로 중단된 탄화수소 사슬이 또한 포함될 수 있다. 치환되는 경우에, 치환된 기(들)는 바람직하게는 히드록실, 할로겐, 시아노, C1-C4 알콕시, =O, =S, NO2, SH, NH2, 또는 NR1R2 [상기 식에서, R1 및 R2 는 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이다]이다. 치환된 알킬에는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG")이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 에틸렌 옥시드의 올리고머 또는 중합체가 포함된다.
"비-뉴클레오티드" 또는 "비-핵산"이라는 용어는 뉴클레오티드가 아닌 임의의 화학 분자, 모이어티, 기 또는 화합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 경우에, "치환체 비-뉴클레오티드 모이어티" (또는 "비-뉴클레오티드 치환체 모이어티")라는 용어는 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자 내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환할 수 있는 화학적 모이어티를 지칭한다. 전형적으로 치환체 비-뉴클레오티드 모이어티는 비-전통적인 염기-쌍 형성 (즉, 전통적인 수소 결합을 형성하지 않음)을 허용하는 것들이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 치환체 비-뉴클레오티드 모이어티는 PAZ 도메인, PIWI 도메인, 및/또는 RISC와 회합된 기타 아르고노트 단백질 도메인이 예를 들어 포함되는, 세포성 RNAi 기구의 하나 이상의 성분과 회합하거나 또는 다른 방식으로 상호작용할 수 있는 것들이다.
본원에서의 특정 실시양태에서, "합성"이라는 용어는 세포에서 천연적으로 생산되지 않는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 전형적으로 합성이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 단리될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용되는 경우의 "단리된"이라는 용어는 천연에서 발견되는 바와 같은 임의의 동일한 서열의 핵산 분자와 상이한 물리적 형태로 존재하는 핵산 분자를 지칭한다. "단리된"은 핵산이 그의 천연 환경으로부터 물리적으로 제거되는 것을 금지하지는 않지만, 이를 필요로 하지는 않는다. 예를 들어, 천연에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 경우에 핵산을 "단리된" 것이라고 할 수 있다. 천연에서 발견되지 않는 순도 (이때 순도는 다른 서열의 핵산의 존재와 관련하여, 단백질의 존재와 관련하여, 지질의 존재와 관련하여, 또는 생물학적 세포의 임의의 다른 성분의 존재와 관련하여 판단될 수 있다)로 존재하는 경우에, 또는 생물의 게놈 내의 다른 면에서는 동일한 서열에 플랭킹(flanking)된 서열이 핵산에 결여되는 경우에, 또는 천연에서는 동일하게 존재하지 않는 서열을 핵산이 보유하는 경우에, 핵산을 "단리된" 것이라고 할 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 시험관 내에서 합성되는 것에 의해 단리될 수 있다. 그러나, 단리된 핵산들이 그 후에 함께 혼합 또는 풀링(pooling)될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 경우에, "내인성"은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 것이거나 이들 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우에, "내인성 miRNA"는 포유동물, 예를 들어, 인간이 포함되는 세포, 조직, 생물 내의 천연-발생 miRNA이다. 일반적으로 "외인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입된 또는 그의 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 경우의 "발현"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 특정 뉴클레오티드 서열의 그의 프로모터에 의해 구동되는 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
일부 실시양태에서, 세포가 특정 miRNA 를 내인성으로 발현하는지 여부 또는 이같은 발현이 특정 조건 하에 또는 세포가 특정 질환 상태에 있을 때 영향을 받는지 여부를 아는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포를 함유하는 샘플을 관심 유전자의 발현 수준을 지시하는 하나 이상의 마커 유전자 또는 mRNA 또는 기타 분석물의 존재에 대해 검정하는 것이 방법에 포함된다. 결과적으로, 일부 실시양태에서, 방법은 샘플에 대해 RNA 프로파일을 생성시키는 단계를 포함한다. "RNA 프로파일" 또는 "유전자 발현 프로파일"이라는 용어는 샘플 내의 하나 이상의 유전자 또는 유전 마커 (예를 들어, 하나 이상의 마커를 식별하는 다수의 핵산 프로브)에 대한 발현 패턴에 관한 데이터 세트를 지칭한다.
"~할 수 있는"은 RNAi 활성이 적절한 생체내 또는 시험관내 검정 또는 방법에 의해 측정될 때, 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분(들)이 없는 상응하는 단일-가닥 RNAi 분자에 의해 달성되는 녹다운 효과와 비교하여 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 표적 서열에 대한 적어도 5％ 이상의 녹다운 효과를 나타낸다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 동일한 표적에 대한 상응하는 RNAi 분자 (예를 들어, 천연-발생 miRNA 또는 이전에 확인된 siRNA 가이드 가닥)보다 표적의 25％ 이상, 35％ 이상, 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 99％ 이상, 또는 심지어 100％ 이상 (즉, 동일하거나 더욱 강력한 RNAi 활성)의 녹다운을 달성할 수 있다.
"벡터"는 삽입된 절편의 복제 또는 발현을 일으키도록 또 다른 핵산 절편이 작동적으로 삽입될 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바큘로바이러스, 백미드(bacmid), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 뿐만 아니라 기타 박테리아, 효모 또는 바이러스 벡터이다. "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스(cis)-작용 요소를 포함한다; 발현을 위한 기타 요소가 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터에는 당업계에 공지된 모든 것들, 예컨대 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드형(naked)이거나 또는 리포솜 내에 함유됨), 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)가 포함된다.
본원에서 사용되는 경우의 "조성물" 또는 "제제"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 세포 또는 인간이 예를 들어 포함되는 대상체 내로의 투여, 예를 들어, 전신 또는 국소 투여에 적절한 형태로 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 내에 있는 것과 같은 조성물 또는 제제를 지칭한다. 적절한 형태는, 부분적으로, 용도 또는 진입 경로, 예를 들어, 경구, 경피, 흡입 또는 주사에 좌우된다. 이같은 형태는 조성물 또는 제제가 표적 세포 (즉, 음으로 하전된 핵산이 전달되는데 적절한 세포)에 도달하는 것을 방지하지 않아야 한다. 예를 들어, 혈류 내로 주사되는 조성물은 가용성이어야 한다. 기타 요인들이 당업계에 공지되어 있고, 조성물 또는 제제가 그의 효과를 발휘하는 것을 방지하는 형태 및 독성과 같은 고려사항이 이에 포함된다. 본원에서 사용되는 경우에, 제약 제제는 인간 및 수의학 용도를 위한 제제를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자와 함께 제제화하기에 적절한 작용제의 비제한적인 예로는 지질 나노입자 (예를 들어 문헌 [Semple et al., 2010, Nat Biotechnol. 28(2):172-6] 참조); P-당단백질 억제제 (예컨대 플루로닉(Pluronic) P85); 지속 방출 전달을 위한 생분해성 중합체, 예컨대 폴리 (DL-락티드-코글리콜리드) 마이크로스피어 (문헌 Emerich, DF et al, 1999, Cell Transplant 8:47-58]); 및 로딩된 나노입자, 예컨대 폴리부틸시아노아크릴레이트로 제조된 것이 포함된다. 본 발명의 핵산 분자를 위한 전달 전략의 기타 비제한적인 예로는 문헌 [Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci. 87:1308-1315]; [Tyler et al., 1999, FEBS Lett. 421:280-284]; [Pardridge et al., 1995, PNAS USA. 92:5592-5596]; [Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15:73-107]; [Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26:4910-4916]; 및 [Tyler et al., 1999, PNAS 96:7053-7058]에 기술된 물질이 포함된다. "제약상 허용되는 조성물" 또는 "제약상 허용되는 제제"는 본 발명의 핵산 분자가 그의 원하는 활성에 가장 적절한 신체 위치로 효과적으로 분포되게 하는 조성물 또는 제제를 지칭할 수 있다.
"환자", "대상체", "개체" 등의 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기술된 방법에 따를 수 있는 임의의 동물 또는 그의 세포 또는 조직 (시험관내 또는 계내)을 지칭한다. 전형적으로 이들은 본 개시내용의 단일-가닥 RNA 분자의 공여자 또는 수용자인 생물을 지칭한다. 특정한 비제한적인 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 포유동물 또는 포유동물 세포이다. 기타 비제한적인 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간 또는 인간 세포이다.
본원에서 사용되는 경우에, 용어 "치료 유효량"은 이것이 투여되는 대상체 (예를 들어, 포유동물 또는 인간)에서 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 증상이 없는 시기의 빈도 또는 기간에서의 증가, 또는 질환으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 초래하는데 충분한 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 양을 의미한다. 당업자는 대상체의 크기, 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인을 기초로 이같은 치료 유효량을 결정할 수 있다. 예를 들어, 개별적으로, 다른 약물과 조합하여, 또는 다른 약물과 함께, 치료 유효량의 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가, 예를 들어 대상체에서 종양 크기를 감소시키기 위해 또는 다른 방식으로 특정 장애와 연관된 증상을 호전시키기 위해, 치료에 적절한 조건 하에 특정 세포에 투여하는 것에 의해 또는 대상체에게 치료 유효량으로 사용 또는 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우의 "치료적"이라는 용어는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 억제, 완화 또는 근절에 의해 수득된다. 본원에서 사용되는 경우의 "치료"는 치료적 처치, 뿐만 아니라 질환 또는 장애에 대한 예방적 또는 억제성 조치를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "치료"는 질환 또는 장애의 발병 이전 또는 이후에 작용제를 투여하는 것에 의해 질환 또는 장애의 모든 징후를 방지하거나 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 예로서, 질환 증상에 대항하기 위해 질환의 임상 소견 이후에 작용제를 투여하는 것이 용어 "치료"에 또한 포함된다.
본원에서 사용되는 경우의 "비경구"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 소화관을 통하는 것 이외의 방식으로 분자, 약물, 작용제 또는 화합물을 투여하는 방법 또는 기술을 지칭하고, 피부표면(epicutaneous), 피하, 혈관내 (예를 들어, 정맥내), 근육내, 또는 경막내 주사 또는 주입 기술 등이 이에 포함된다.
본원에서 사용되는 경우에 "전신 투여"라는 구절은 당업계에서 일반적으로 받아들여지는 그의 의미를 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 혈류 내의 약물의 생체내 전신 흡수 또는 축적에 이어지는 몸 전체에 걸친 분포를 지칭한다.
본 발명의 기타 목적, 특색 및 장점이 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 예가, 본 발명의 구체적인 실시양태를 지시하기는 하지만, 설명으로써만 제공되고, 이는 본 발명의 취지 및 범주 내의 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문임을 이해하여야 한다.
B. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자
본 개시내용은 분자의 2개의 뉴클레오티드 부분을 함께 연결하는 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서를 포함하는 단일-가닥 RNA 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물이 아니라, 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서에 의해 분리된 1개를 초과하는 뉴클레오티드 부분을 포함하고, 이때 뉴클레오티드 부분은 1개 이상의 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 RNA 간섭 메카니즘을 통해 유전자 발현을 억제할 수 있는 가이드 또는 안티센스 가닥으로서 기능하고, 따라서 RNAi 작용제를 나타낸다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 세포 내의 하나 이상의 RNA 표적 부위에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 (a) 2개 이상의 뉴클레오티드 부분으로 분리된 핵산 부분, 및 (b) 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하고, 이때 비-뉴클레오티드 스페이서 부분(들)이 각각 분자의 별개의 뉴클레오티드 부분 내에 있는 2개의 뉴클레오티드를 공유적으로 연결하는 내부 ("말단"에 반대되는 것으로서)의 스페이서 부분을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 구조이다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분은 비-뉴클레오티드 스페이서 부분에 의해 분리되고, 이때 각각의 뉴클레오티드 부분은 1개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다.
본 발명의 각각의 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 제1 뉴클레오티드 부분 (N1) (예를 들어, 5'-뉴클레오티드 부분) 및 제2 뉴클레오티드 부분 (N2) (예를 들어, 3'-뉴클레오티드 부분)의 2개 이상의 뉴클레오티드 부분을 함유한다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 2개를 초과하는 뉴클레오티드 부분 (예를 들어, 제3 뉴클레오티드 부분 (N3), 제4 뉴클레오티드 부분 (N4) 등)을 포함할 수 있다. 본 발명의 RNAi 분자의 각각의 뉴클레오티드 부분 내에서, 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 모이어티는 포스포디에스테르 결합 및/또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 연결된다. 중요하게, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분들은 서로에 대해 상보적이지 않고, 따라서 상기 부분들은 유의한 염기 쌍을 형성하지 않는다.
본 발명의 각각의 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분은 본원에서 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분으로 지칭되는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S1)을 함유한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 1개의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 함유한다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분은 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (예를 들어, 제2 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S2), 제3 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S3) 등)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 2개의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 함유한다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 뉴클레오티드 부분의 개수는 분자 내의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분의 개수에 의존적이고, 반대의 경우도 마찬가지이다. 예를 들어, 단일-가닥 RNAi 분자가 2개의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 함유하면, 하기와 같이, 분자는 일반적으로 3개의 뉴클레오티드 부분을 함유할 것이다: 5'-(제1 뉴클레오티드 부분)-(제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분)-(제2 뉴클레오티드 부분)-(제2 비-뉴클레오티드 스페이서 부분)-(제3 뉴클레오티드 부분)-3'. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 각각의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유할 수 있다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 구조이고, 표적 RNA에 대한 RNA 간섭을 매개한다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 (a) 제1 뉴클레오티드 부분 (N1) 및 제2 뉴클레오티드 부분 (N2)을 포함하는 핵산 부분이며, 여기서 상기 핵산 부분이 표적 RNA 내의 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있는 8개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 핵산 부분 내의 뉴클레오티드의 총 개수가 뉴클레오티드 8개 내지 26개인 핵산 부분; 및 (b) 제1 뉴클레오티드 부분과 제2 뉴클레오티드 부분을 공유적으로 연결하는 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S1)을 적어도 포함하는 내부의 스페이서 부분을 포함할 수 있다. 제1 뉴클레오티드 부분과 제2 뉴클레오티드 부분은 자가 상보적이지 않다. 모두 핵산 부분 내에 위치하는, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 모든 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 내지 26개)는 분자의 뉴클레오티드 부분들 사이에 분포하고, 이때 각각의 뉴클레오티드 부분은 1개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 부분 사이에 분포된 총 8개 내지 26개의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티)를 함유하는 핵산 부분을 포함하고, 이때 분자 내의 8개 이상 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)의 뉴클레오티드가 표적 RNA 내의 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 총 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 이때 이러한 뉴클레오티드 중 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개가 표적 RNA와 염기 쌍을 이룬다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 총 15개 내지 21개 (예를 들어, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개)의 뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 총 18개 내지 20개 (예를 들어, 18개, 19개 또는 20개)의 뉴클레오티드를 함유한다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 총 19개 또는 20개의 뉴클레오티드를 함유한다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분들을 구성하는 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 모이어티 또는 이들의 조합의 총 개수는 다수의 방식으로 분자의 이러한 부분들 사이에 분포된다. 예를 들어, 오직 1개의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 및 2개의 뉴클레오티드 부분 (즉, 제1 뉴클레오티드 부분 및 제2 뉴클레오티드 부분)을 포함하는 단일-가닥 RNAi 분자에 총 12개의 뉴클레오티드가 있을 수 있다. 분자의 제1 뉴클레오티드 부분이 (예를 들어, 분자의 5'-말단에서) 단일 뉴클레오티드를 함유하면, 분자의 제2 뉴클레오티드 부분은 11개의 연속적인 뉴클레오티드를 함유할 것이다. 별법적으로, 분자의 제1 뉴클레오티드 부분이 5개의 연속적인 뉴클레오티드를 함유하면, 분자의 제2 뉴클레오티드 부분은 7개의 연속적인 뉴클레오티드를 함유할 것이다. 각각의 예에서, 분자 내의 뉴클레오티드의 총 개수는 12개이다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분들 내의 뉴클레오티드들은 서로에 대해 상보적이지 않고, 따라서 상기 부분들이 실질적인 염기 쌍을 형성할 수 없다. 분자의 각각의 뉴클레오티드 부분 내에서, 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 모이어티들은 포스포디에스테르 결합 및/또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 연결된다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 8개 이상의 뉴클레오티드가 표적 RNA 내의 표적 서열과 염기 쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 천연-발생 RNA 표적 부위가 포함되는 RNA 표적 부위에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적인, 연속적인 뉴클레오티드들의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 모든 연속적인 뉴클레오티드가 표적 RNA 내의 표적 서열과 염기 쌍을 이룬다 (즉, 완벽하게 상보적이다). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 연속적인 뉴클레오티드들의 50％ 이상이 표적 RNA 내의 표적 서열과 염기 쌍을 이룬다 (즉, 실질적으로 상보적이다). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 8개, 9개, 10개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 뉴클레오티드가 표적 RNA 내의 표적 서열과 염기 쌍을 이룬다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 (a) 제1 뉴클레오티드 부분 (N1) 및 제2 뉴클레오티드 부분 (N2)의 2개의 뉴클레오티드 부분; 및 (b) 1개의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S1)을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 구조이고; 이때 올리고뉴클레오티드는 총 8개 내지 26개의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티)를 함유하고; 분자의 뉴클레오티드 중 8개 이상이 표적 RNA 내의 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있다. 이러한 실시양태의 단일-가닥 RNAi 분자의 2개의 뉴클레오티드 부분은, 요약하자면, 다양한 방식 (상기 기술된 바와 같음)으로 2개의 뉴클레오티드 부분 사이에 분포된 8개 내지 26개 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 모이어티 또는 이들의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 1개의 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 (예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 이를 초과하는 개수)를 함유한다. 스페이서 부분은 단일-가닥 RNAi 분자의 제1 뉴클레오티드 부분과 제2 뉴클레오티드 부분을 연결한다. 따라서, 스페이서 부분은 분자의 제1 뉴클레오티드 부분의 3'-말단 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티 및 분자의 제2 뉴클레오티드 부분의 5'-말단 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티 둘 모두에 공유적으로 연결된다. 분자의 스페이서 부분은 전통적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 뉴클레오티드 부분의 포스페이트 백본에 공유적으로 (즉, 2개의 연결된 뉴클레오티드의 유리 포스페이트를 통해) 연결될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 천연-발생 miRNA의 가이드 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성인 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 따라서 miRNA 모방체로서 기능한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 단일-가닥 siRNA 또는 이중체 siRNA의 가이드/안티센스 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성인 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 따라서 siRNA 모방체로서 기능한다. 이러한 단일-가닥 siRNA 또는 이중체 siRNA는 RNAi 메카니즘을 통해 유전자 발현을 억제하는 것으로 공지되어 있을 수 있다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 천연-발생 miRNA의 유사체인 경우, 이러한 천연-발생 miRNA는 본원에서 "상응하는 miRNA"로 지칭되고, 이러한 단일-가닥 RNAi 분자는 상응하는 miRNA의 모방체를 나타낸다. 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체는 상응하는 천연-발생 miRNA를 기초로 디자인되고, 이때 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 miRNA 가이드 가닥 서열의 2개의 뉴클레오티드 사이에 삽입되거나, 또는 miRNA 가이드 가닥 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드를 치환한다. 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체는 miRBase 데이터베이스에서 공개적으로 입수가능하고/하거나 하기 표 1 (서열 1-1090)에 포함된 성숙형 miRNA 서열의 유사체일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 단일-가닥 RNAi 분자는 miRNA 모방체를 나타내고, 이때 이러한 RNAi 분자는 2개 이상의 뉴클레오티드 부분의 핵산 부분, 및 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하는 내부의 스페이서 부분을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 분자의 핵산 부분이 오직 2개의 뉴클레오티드 부분 (즉, 제1 뉴클레오티드 부분 및 제2 뉴클레오티드 부분)만 함유하면, 오직 1개의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 존재할 것이다. 분자의 핵산 부분이 3개의 뉴클레오티드 부분을 함유하면, 2개의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 존재할 것이다. 각각의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 (예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 이를 초과하는 개수)를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 miRNA 모방체의 핵산 부분은 8개 내지 26개 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 모이어티 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 이때 8개 이상의 뉴클레오티드가 천연-발생 miRNA 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있다. 본 발명의 miRNA 모방체의 핵산 부분 내의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 천연-발생 miRNA 가이드 가닥 뉴클레오티드 서열에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 천연-발생 miRNA의 시드 서열의 전체 또는 일부과 동일한 (또는 완벽하게 상동성인) 5개 내지 8개 (즉, 5개, 6개, 7개 또는 8개)의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분 내의 8개의 연속적인 뉴클레오티드 서열이 천연-발생 miRNA (하기 표 I 참조)의 시드 영역 전체 또는 그의 일부분과 동일하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 miRNA 모방체에는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 및 2개의 뉴클레오티드 부분이 있고, 이때 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 상응하는 천연-발생 miRNA 서열의 2개의 뉴클레오티드 사이에 삽입되어, 전장 천연-발생 miRNA를 2개의 별개의 뉴클레오티드 부분으로 분리한다. 또 다른 실시양태에서, 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 본 발명의 miRNA 모방체 내에 존재하여, miRNA 모방체의 핵산 부분이 2개를 초과하는 뉴클레오티드 부분으로 분리된다. 이같은 경우에, miRNA 모방체의 총 뉴클레오티드 서열이 상응하는 천연-발생 miRNA 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상동성이다. 이러한 실시양태에서의 천연-발생 miRNA와 miRNA 모방체 사이의 차이는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분의 존재이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 miRNA 모방체는 천연-발생 miRNA 가이드 가닥 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드를 치환하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함한다. 예를 들어, 먼저 1개 이상의 뉴클레오티드가 천연-발생 miRNA 가이드 가닥 서열로부터 결실되어, 서열 내에 갭(gap)을 남기고 2개 이상의 별개의 뉴클레오티드 부분이 생산되게 할 수 있다. 그 후, 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 갭 내로 삽입되어, 별개의 뉴클레오티드 부분들을 공유적으로 연결한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 상응하는 천연-발생 miRNA 서열 (서열 1-1090 참조)의 1개 내지 12개 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개)의 뉴클레오티드를 대신하는 miRNA 모방체를 나타낸다. miRNA 모방체는 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체는 천연-발생 miRNA 뉴클레오티드 서열의 1개 내지 4개 (예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 뉴클레오티드 대신에 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체는 상응하는 miRNA 뉴클레오티드 서열의 1개 또는 2개의 뉴클레오티드 대신에 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함한다. 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 miRNA 가이드 가닥 서열로부터의 1개 이상의 뉴클레오티드의 제거로부터 초래된 갭에 다리를 놓아, 분자의 뉴클레오티드 부분들의 포스페이트 백본에 전통적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 연결된다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 이중체 또는 단일-가닥 siRNA의 가이드 또는 안티센스 가닥의 유사체를 또한 나타낼 수 있다. 이중체 또는 단일-가닥 siRNA는 RNAi 메카니즘을 통해 표적 유전자 발현을 억제하는 것으로 또는 표적 유전자 발현을 억제하는 잠재력이 있는 것으로 공지되어 있을 수 있다. 이같은 시나리오에서, siRNA 대응물, 특히 siRNA (단일- 또는 이중-가닥)의 가이드 가닥은 본원에서 "상응하는 siRNA" 또는 "상응하는 siRNA 가이드 가닥"으로 지칭되고, 단일-가닥 RNAi 분자는 상응하는 siRNA 가이드 가닥의 모방체 (즉, "단일-가닥 siRNA 모방체")를 나타낸다. 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 상응하는 siRNA뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열 내에 삽입함으로써 또는 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드를 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분으로 치환함으로써 상응하는 siRNA의 뉴클레오티드 서열을 기초로 단일-가닥 siRNA 모방체가 디자인된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 siRNA 모방체를 나타내고, 이때 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분은 2개 이상의 뉴클레오티드 부분을 포함하고, 내부의 스페이서 부분은 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, RNAi 분자의 핵산 부분이 오직 2개의 뉴클레오티드 부분 (즉, 제1 뉴클레오티드 부분 및 제2 뉴클레오티드 부분)을 함유하면, 오직 1개의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 존재할 것이다. RNAi 분자의 핵산 부분이 3개의 뉴클레오티드 부분을 함유하면, 2개의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 존재할 것이다. 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 (예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 이를 초과하는 개수)를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, siRNA 모방체의 핵산 부분은 8개 내지 26개 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)의 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 모이어티 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 이때 8개 이상의 뉴클레오티드가 RNA 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있다. 본 발명의 siRNA 모방체의 핵산 부분은 상응하는 siRNA 가이드 가닥 뉴클레오티드 서열에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성인 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 siRNA 모방체에는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 및 2개의 뉴클레오티드 부분이 있고, 이때 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열의 2개의 인접한 뉴클레오티드 사이에 삽입되어, 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열을 2개의 별개의 뉴클레오티드 부분으로 분리한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siRNA 모방체에 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 존재하여, 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열이 2개를 초과하는 뉴클레오티드 부분으로 분리된다. 이같은 경우에, siRNA 모방체의 총 뉴클레오티드 서열이 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상동성이다. 이러한 실시양태에서의 siRNA와 siRNA 모방체 사이의 차이는 비-뉴클레오티드 스페이서 영역(들)의 존재이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siRNA 모방체는 상응하는 siRNA 가이드 가닥 뉴클레오티드 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드를 치환하는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함한다. 예를 들어, 먼저 1개 이상의 뉴클레오티드가 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열로부터 결실되어, 서열 내에 갭을 남기고 2개 이상의 별개의 뉴클레오티드 부분이 생산되게 할 수 있다. 그 후, 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 갭 내로 삽입되어, 별개의 뉴클레오티드 부분들을 연결한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하고, 이때 상기 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열의 1개 내지 4개 (예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 뉴클레오티드를 대신하는 siRNA 모방체를 나타낸다. siRNA 모방체는 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 함유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하고, 이때 상기 비-뉴클레오티드 스페이서 부분이 상응하는 siRNA 뉴클레오티드 서열의 1개 또는 2개의 뉴클레오티드를 대신하는 siRNA 모방체를 나타낸다. 비-뉴클레오티드 스페이서 부분(들)은 siRNA 가이드 가닥 서열로부터의 1개 이상의 뉴클레오티드의 제거로부터 초래된 갭에 다리를 놓아, 분자의 뉴클레오티드 부분의 포스페이트 백본에 전통적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 연결된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 천연-발생 RNA 표적이 포함되는 특정 RNA 표적의 발현을 녹다운시키는 목적으로 신규로(de novo) 디자인될 수 있다. 이러한 시나리오에서, 표적 유전자가 먼저 선택된다. 그 후, 당업자가 유전자 침묵화를 위해 단일-가닥 RNAi 분자로 표적화하기 위한 상기 유전자의 일부분 (즉, 표적 부위), 일반적으로는 길이가 뉴클레오티드 약 8개 내지 약 26개인 일부분을 확인한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 기술된 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 확인된 표적 부위 서열에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적이고, 상응하는 표적 부위 서열의 상보물에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성이다. 이러한 시나리오에서의 단일-가닥 RNAi 분자의 대응물 서열 (즉, 표적 부위 서열의 상보물인 뉴클레오티드 서열)은 본원에서 "상응하는 표적 부위 서열의 상보물"로 지칭된다. 이러한 단일-가닥 RNAi 분자는 상기 실시양태들 중 하나 이상에서 기술된 바와 같이 2개 이상의 뉴클레오티드 부분 및 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함한다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 RNA 간섭 결과를 일으킬 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체의 경우에, 이러한 분자는 상응하는 천연-발생 miRNA에 의해 또한 조절되는 표적 mRNA의 발현을 조정할 수 있다.
본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자는 말단 끝부분 중 하나 또는 둘 모두에 위치하는 말단 포스페이트 기, 예컨대 5'-포스페이트 또는 5', 3'-디포스페이트를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 치환, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 및 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정한 기타 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상의 리보뉴클레오티드 또는 모든 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태는 백본, 당, 염기 또는 뉴클레오시드 내에 치환 또는 변형을 포함하는 단일-가닥 RNAi 분자를 포함한다.
본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분(들)은, 특히 생성된 RNAi 분자 내의 뉴클레오티드의 총 개수가 단일-가닥 RNAi 분자가 그의 유사체인 상응하는 RNAi 작용제 (예를 들어, 천연-발생 miRNA; 유전자 녹다운 역량이 있는 siRNA의 가이드 가닥)와 비교하여 감소되는 경우에, 엔도뉴클레아제에 대한 단일-가닥 RNAi 분자의 감수성을 감소시킨다. 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분(들)은 엑소뉴클레아제의 손상을 또한 제한할 수 있어, 궁극적으로는 단일-가닥 RNAi 작용제의 통합성을 보존하는 것을 돕는다. 스페이서 부분은 하나 이상의 관심 모이어티 (예를 들어, 세포 전달을 용이하게 하는 화학적 모이어티)를 RNAi 분자에 연결하기 위한 쉽게 접근가능한 영역을 또한 나타낸다. 따라서, 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 활성이 스페이서 부분이 없는 상응하는 단일-가닥 RNAi 분자 (예를 들어, 천연-발생 miRNA; 유전자 녹다운 역량이 있는 이전에 확인된 siRNA의 가이드 가닥)에 비교하여 다소 감소되더라도 (예를 들어, 약 20％, 또는 30％ 또는 심지어 40％ 미만만큼), 분자의 개선된 안정성 또는 전달로 인해 유사체의 전체적인 활성이 그의 대응물의 활성보다 더 클 수 있다. 추가적으로, 더 짧은 RNA 가닥에 대해 합성 수율이 일반적으로 더 높기 때문에, 치료 용도와 관련된 대규모 합성 비용이 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자를 사용하여 또한 실질적으로 감소될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 화학식 III으로 표현 또는 도시될 수 있다.
<화학식 III>
5' N1 - S1 - N2 3'
상기 식에서, 제1 뉴클레오티드 부분을 나타내는 N1은 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물로 이루어지고; 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 나타내는 S1은 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서로 이루어지며; 제2 뉴클레오티드 부분을 나타내는 N2는 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물로 이루어진다. N1 및 N2 내의 뉴클레오티드의 총 개수는 뉴클레오티드 8개 내지 26개 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)이고, 분자의 8개 이상의 뉴클레오티드가 표적 RNA 내의 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있다. N1 및 N2 내의 "뉴클레오티드(들)"은 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티, 또는 이들의 조합이다. 한 실시양태에서, 개별적으로, N1 및 N2는 1개 내지 25개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 이때 N1 및 N2의 합은 뉴클레오티드 8개 내지 26개 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)이다. N1 및 N2는 자가 상보적이지 않고, 따라서 서로와 실질적으로 염기 쌍을 이루는 것에 참여할 수 없다. 분자의 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물 내에서, 뉴클레오티드들은 포스포디에스테르 결합 및/또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 연결된다. 스페이서 부분 (S1)은 제1 뉴클레오티드 부분 (N1)의 3'-말단 뉴클레오티드 및 분자의 제2 뉴클레오티드 부분 (N2)의 5'-말단 뉴클레오티드에 공유적으로 부착된다. 예를 들어, 스페이서 부분은 포스포디에스테르 결합에 의해 인접한 뉴클레오티드들의 유리 포스페이트 기에 부착된 1개 이상의 포스포르아미다이트 스페이서를 포함할 수 있다. 분자의 스페이서 부분 (S1)은 단일 비-뉴클레오티드 스페이서 또는 함께 연결된 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서로 이루어질 수 있다. 분자의 S1 부분 내에 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서가 있으면, 스페이서들이 동일할 수 있거나 (즉, 구조가 동일함), 또는 상이할 수 있다 (즉, 구조가 상이함). 2개의 비-뉴클레오티드 스페이서가 분자의 S1 부분 내에서 연결되는 경우, 각각의 스페이서는 분자의 N1 및 N2 부분 내의 1개의 뉴클레오티드에 공유적으로 각각 부착된다. 3개의 비-뉴클레오티드 스페이서가 올리고뉴클레오티드의 S1 부분 내에서 연속적으로 연결되면, 내부의 (제2) 스페이서는 분자의 N1 및 N2 부분 중 하나와 공유 결합을 형성하지 않는다. 대신, 이러한 내부의 스페이서는 제1 스페이서와 제3 스페이서에 공유적으로 부착되어, 이들을 함께 연결한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 화학식 IV로 표현 또는 도시될 수 있다.
<화학식 IV>
5' N1 - S1 - N2 - S2 - N3 3'
상기 식에서, 제1 뉴클레오티드 부분을 나타내는 N1은 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물로 이루어지고; 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 나타내는 S1은 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서로 이루어지고; 제2 뉴클레오티드 부분을 나타내는 N2는 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물로 이루어지고; 제2 비-뉴클레오티드 내부 스페이서 부분을 나타내는 S2는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서로 이루어지며; 제3 뉴클레오티드 부분을 나타내는 N3은 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물로 이루어진다. 한 실시양태에서, N1, N2, 및 N3 내의 뉴클레오티드의 총 개수는 뉴클레오티드 8개 내지 약 26개 (예를 들어, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)이고, 분자의 8개 이상의 뉴클레오티드가 표적 RNA 내의 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있다. N1, N2 및 N3 내의 "뉴클레오티드(들)"은 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티, 또는 이들의 조합이다. 한 실시양태에서, 개별적으로, 뉴클레오티드 부분들 (N1, N2, N3)은 1개 내지 24개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 이때 분자 내의 뉴클레오티드의 합은 뉴클레오티드 8개 내지 26개이다. RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분들은 자가 상보적이지 않고, 따라서 서로와 실질적으로 염기 쌍을 이루는 것에 참여할 수 없다. 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물 각각 내에서, 뉴클레오티드들은 포스포디에스테르 결합 및/또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 연결된다. 스페이서 부분들은 분자의 뉴클레오티드 부분들의 말단 뉴클레오티드에 공유적으로 부착된다. 한 실시양태에서, 스페이서 부분은 포스포디에스테르 결합에 의해 인접한 뉴클레오티드들의 유리 포스페이트 기에 부착된 1개 이상의 포스포르아미다이트 스페이서를 포함한다. 분자의 각각의 스페이서 부분은 단일 비-뉴클레오티드 스페이서 또는 함께 연결된 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서로 이루어질 수 있다. 분자의 스페이서 부분 내에 1개를 초과하는 비-뉴클레오티드 스페이서가 있으면, 스페이서들이 동일할 수 있거나 (즉, 구조가 동일함), 또는 상이할 수 있다 (즉, 구조가 상이함). 2개의 비-뉴클레오티드 스페이서가 분자의 스페이서 부분 내에서 연결되는 경우, 각각의 스페이서는 분자의 인접한 뉴클레오티드 부분들 내의 말단 뉴클레오티드에 공유적으로 각각 부착된다. 3개의 비-뉴클레오티드 스페이서가 분자의 스페이서 부분 내에서 연속적으로 연결되면, 내부의 (제2) 스페이서는 분자의 뉴클레오티드 부분과 공유 결합을 형성하지 않는다. 대신, 이러한 내부의 스페이서는 제1 스페이서와 제3 스페이서에 공유적으로 부착되어, 이들을 함께 연결한다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에 기술된 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분 (예를 들어, 화학식 III 및/또는 IV에서 기술된 바와 같은 N1, N2, 또는 N3)은 뉴클레오티드 1개 내지 20개 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개), 뉴클레오티드 5개 내지 20개 (예를 들어, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개), 뉴클레오티드 10개 내지 20개 (예를 들어, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개), 뉴클레오티드 13개 내지 20개 (예를 들어, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개), 뉴클레오티드 5개 내지 15개 (예를 들어, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개), 또는 뉴클레오티드 1개 내지 14개 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개 또는 14)개로 이루어진 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분의 길이는 18개의 연속적인 뉴클레오티드, 19개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 20개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분의 길이는 13개의 연속적인 뉴클레오티드, 14개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 15개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 18개일 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 19개일 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 20개일 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 21개일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 식 중 N1이 18개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지고; S1이 비-뉴클레오티드 스페이서로 이루어지고; N2가 2개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 화학식 III으로 표현된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 식 중 N1이 19개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지고; S1이 비-뉴클레오티드 스페이서로 이루어지고; N2가 1개의 뉴클레오티드로 이루어지는 화학식 III으로 표현된다. 이러한 실시양태들에서, S1은 C3- 또는 C6-알킬 스페이서일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분 (예를 들어, 화학식 III 및/또는 IV에서 기술된 바와 같은 N1, N2, 또는 N3)은 RNA 표적 영역에 실질적으로 또는 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 10개 이상 (예를 들어, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 등)의 서열을 포함하는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물이다. 또 다른 측면에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분은 RNA 표적 영역에 실질적으로 또는 부분적으로 상보적인 5개 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 부분에서, 분자의 상기 뉴클레오티드 부분은 1개 내지 20개의 뉴클레오티드, 5개 내지 20개의 뉴클레오티드, 10개 내지 20개의 뉴클레오티드, 13개 내지 20개의 뉴클레오티드, 5개 내지 15개의 뉴클레오티드, 또는 1개 내지 14개의 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물이다. 또 다른 측면에서, 상기 뉴클레오티드 부분은 길이 면에서 18개, 19개 또는 20개의 연속적인 뉴클레오티드이다. 추가적인 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 부분은 길이 면에서 13개, 14개 또는 15개의 연속적인 뉴클레오티드이다. 또 다른 측면에서, 상기 뉴클레오티드 부분의 길이는 18개의 연속적인 뉴클레오티드, 19개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 20개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 측면에서, 상기 뉴클레오티드 부분의 길이는 13개의 연속적인 뉴클레오티드, 14개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 15개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 18개일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 19개일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 20개일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 부분의 길이는 뉴클레오티드 21개일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분은 천연-발생 miRNA 서열의 시드 서열의 전체 또는 일부와 동일한 (또는 완벽하게 상동성인) 5개 내지 8개 (예를 들어, 5개, 6개, 7개 또는 8개)의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 천연-발생 miRNA 서열은 하기 표 1에 상술된 서열이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분 내의 6-뉴클레오티드 서열이 표 1로부터 선택된 천연-발생 miRNA 서열이 포함되는 천연-발생 miRNA 서열의 시드 영역 전체 또는 그의 일부분과 동일하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 화학식 III 또는 화학식 IV로 표현 또는 도시될 수 있다. 화학식 III 및 화학식 IV는 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 특정 예를 나타낸다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명에 포함되는 추가적인 예로는 3개를 초과하는 뉴클레오티드 부분이 있는 RNAi 분자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 천연-발생 내인성 miRNA에 또는 siRNA의 가이드 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 핵산 부분 내의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 RNA 표적 서열 내의 표적 부위에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 뉴클레오티드 부분은 천연-발생 내인성 miRNA 또는 siRNA의 가이드 가닥의 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상동성이고/이거나 RNA 표적 서열 내의 표적 부위에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 상보적이다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분은 적어도 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함한다. 상기 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 2개 이상의 뉴클레오티드에 공유적으로 결합되고 따라서 이들을 연결하는 화학적 기, 전형적으로는 유기 엔티티를 포함한다. 이러한 2개의 뉴클레오티드는 분자의 별개의 뉴클레오티드 부분들 내에 있다. RNA 표적 서열과 전통적인 또는 비-전통적인 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하고/하거나 RNAi를 매개하는 분자의 능력에 심하게 영향을 미치지 않는 한, 비-뉴클레오티드 스페이서 부분의 길이는 특별히 한정되지 않는다. 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 전통적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 2개의 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티를 연결할 수 있다. 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드를 스페이서에 연결하는 비-포스포디에스테르-기반 커넥터를 포함하는 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는, 예를 들어, 펩티드-기반 커넥터, 예컨대 올리고 펩티드 핵산 (PNA)의 단위들을 연결하는 것을 포함한다 (문헌 [Boffa et al., 2000, Gene Ther. Mol. Biol. 5:47-53] 참조).
본원에서 제공되는 바와 같은 또는 다른 방식으로 당업계에 공지된 다양한 비-뉴클레오티드 모이어티가 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 내부의 스페이서 부분 내에 포함된 비-뉴클레오티드 스페이서는 전통적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-포스포디에스테르 커넥터에 의해 2개의 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 치환체 모이어티를 연결할 수 있는 임의의 비-핵산 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 전형적으로 지방족 또는 방향족 유기 엔티티이고, 올리고뉴클레오티드의 백본 (즉, 상보적인 하이브리드를 형성하는 핵염기들)을 형성하는 뉴클레오티드간 연결 이외의 것이다.
비-뉴클레오티드 스페이서의 비제한적인 예로는 하기의 것들이 포함된다: 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리히드로카본, 또는 기타 중합체성 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 예컨대 2개 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위가 있는 것). 구체적인 예로는 문헌 [Seela and Kaiser, 1990, Nucleic Acids Res. 18:6353]; [Seela and Kaiser, 1987, Nucleic Acids Res. 15:3113]; [Cload and Schepartz, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:6324]; [Richardson and Schepartz, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:5109]; [Ma et al., 1993, Nucleic Acids Res. 27:2585]; [Ma et al., 1993, Biochemistry 32:1751]; [Durand et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18:6353]; [McCurdy et al., 1991, Nucleosides & Nucleotides 70:287]; [Jaschke et al., 1993, Tetrahedron Lett. 34:301]; [Ono et al., 1991, Biochemistry 30:9914] 등에 기술된 것들이 포함된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 스페이서는 탄소 1개 내지 20개 (즉, C1 내지 C20), 바람직하게는 탄소 1개 내지 12개 (즉, C1 내지 C12)의 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬이다. 탄화수소 사슬은 추가적인 화학 및/또는 관능 기 (예를 들어, 관심 표적 분자에 특이적으로 결합하는 모이어티)로 치환될 수 있다.
단일-가닥 RNAi 분자에 추가적인 기능성을 제공하는 (예를 들어, 관심 표적 분자에 특이적으로 결합하고/하거나 분자의 세포 전달을 촉진/강화하는) 화학적 모이어티가 스페이서의 일부분일 수 있거나 또는 이에 공유적으로 부착 또는 연결될 수 있다 (예를 들어, 치환될 수 있다). 예를 들어, RNAi 분자 화합물을 세포막을 가로질러 전달하는 것, 약동학을 변경시키는 것 및/또는 본 발명의 RNAi 분자의 국소화를 조정하는 것에 도움이 됨으로써 추가적인 관능기가 단일-가닥 RNAi 분자에 치료 활성을 부여할 수 있다.
비-뉴클레오티드 스페이서 자체 내에 혼입되고/되거나 이에 공유적으로 부착될 수 있고 본 개시내용에 의해 구상되는 특정한 접합체 분자의 예는 소형 분자, 지질 또는 친지성 물질, 테르펜, 인지질, 항체, 독소, 콜레스테롤, 단백질 결합제 (예를 들어, 세포 흡수를 용이하게 할 수 있는 세포 수용체에 대한 리간드), 비타민, 음으로 하전된 중합체 및 기타 중합체, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민), 펩티드, 호르몬, 탄수화물, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리아민, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0196781 및 미국 특허 공개 번호 2006/0293271 (이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)에 예를 들어 기술된 것들이다. 이러한 화합물들은 혈청의 존재 또는 부재 하에 상이한 조직들로부터 유래하는 다수의 세포 유형 내로의 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 전달 및/또는 국소화를 개선할 것으로 예상된다 (설렌저(Sullenger) 및 체흐(Cech)의 미국 5,854,038 참조). 예를 들어, 접합체 구성원은 나프록센, 니트로인돌 (또는 스태킹(stacking) 상호작용에 기여하는 또 다른 접합체), 폴레이트, 이부프로펜 또는 C5 피리미딘 링커일 수 있다. 다른 실시양태에서, 접합체 구성원은 글리세리드 지질 접합체 (예를 들어, 디알킬 글리세리드 유도체), 비타민 E 접합체 또는 티오-콜레스테롤이다. 또 다른 실시양태에서, 접합체 분자는 단일-가닥 RNAi 분자에 접합되는 경우에 표적 세포 내로의 분자의 전달을 용이하게 하거나 또는 생물학적 샘플과 접촉될 때 다른 방식으로 분자의 전달, 안정성 또는 활성을 강화하는 기능을 하는 펩티드이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 사용하기 위한 예시적인 펩티드 접합체 구성원에는 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0040882 및 2006/0014289, 및 미국 특허 가출원 번호 60/939,578 (모두 본원에 참고로 포함됨)에 예를 들어 개술된 바와 같은 펩티드 PN27, PN28, PN29, PN58, PN61, PN73, PN158, PN159, PN173, PN182, PN202, PN204, PN250, PN361, PN365, PN404, PN453, 및 PN509가 포함된다.
한 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 모이어티를 포함한다. 표적 분자는 임의의 관심 분자일 수 있다. 예를 들어, 표적 분자가 단백질의 리간드-결합 도메인일 수 있고, 이에 의해 천연-발생 리간드와 단백질의 상호작용을 방지하거나 이와 경쟁한다. 이는 비-제한적인 예이고, 당업자는 당업계에 일반적으로 공지된 기술을 사용하여 기타 실시양태가 쉽게 생성될 수 있다는 것을 인지할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Gold et al, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:163]; [Brody and Gold, 2000, J. Biotechnol. 74:5]; [Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:100]; [Kusser, J., 2000, Biotechnol. 74:21]; [Hermann and Patel, 2000, Science 257:820]; 및 [Jayasena, 1999, Clinical Chem. 45:1628] 참조). 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 스페이서 부분은 세포 전달과 연관된 성질을 강화하기 위해 화학적 관능기를 RNAi 분자에 도입하는데 또한 편리하게 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자의 스페이서 영역을 통해 부착된 접합체 분자 또는 관능성 화학적 모이어티는 상기 RNAi 분자를 특이적인 세포 유형, 예컨대 간세포에 투여하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체 (ASGPr) (문헌 [Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429])가 간세포에 독특하고, 분지형 갈락토스-말단 당단백질, 예컨대 아시알로오로소뮤코이드 (ASOR)에 결합한다. 이같은 당단백질 또는 합성 당접합체(glycoconjugate)가 수용체에 결합하는 것은 올리고당 사슬의 분지화 정도에 강하게 의존적인 친화도로 일어나고, 예를 들어, 3안테나 구조는 2안테나 또는 1안테나 사슬보다 더 강한 친화도로 결합된다 (문헌 [Baenziger and Fiete, 1980, Cell 22: 611]; [Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:939]). 문헌 [Lee and Lee, 1987, Glycoconjugate J. 4:317]에서, 갈락토스에 비교하여 수용체에 대한 친화도가 더 높은 N-아세틸-D-갈락토스아민을 탄수화물 모이어티로 사용는 것을 통해 이러한 높은 특이성이 수득되었다. 이러한 "클러스터링(clustering) 효과"가 만노실-말단 당단백질 또는 당접합체의 결합 및 섭취에 대해 또한 기술되었다 (문헌 [Ponpipom et al., 1981, J. Med. Chem. 24: 1388]). 갈락토스 및 갈락토스아민을 기반으로 하는 접합체를 외인성 화합물을 세포막을 가로질러 전달하는데 사용하는 것은 표적화된 전달 접근법을 간 질환의 치료에 제공할 수 있다. 생체접합체(bioconjugate)의 사용은 치료에 필요한 치료 화합물의 필요 용량에서의 감소를 또한 제공할 수 있다. 또한, 치료적 생체이용률, 약력학, 및 약동학 파라미터가 본 개시내용의 생체접합체의 사용을 통해 조정될 수 있다.
본원에 기술된 접합체 분자는 생분해성인 비-핵산 링커를 통해 단일-가닥 RNAi 분자에 부착될 수 있다. 이러한 문맥에서 사용되는 경우의 "생분해성 링커"라는 용어는 하나의 분자를 또 다른 분자에 연결하는, 예를 들어, 접합체 분자를 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에 연결하는 생분해성 링커로서 디자인된 비-핵산 링커 분자를 지칭한다. 생분해성 링커는 그의 안정성이 특정 목적, 예컨대 특정 조직 또는 세포 유형으로의 전달을 위해 조정될 수 있도록 디자인된다. 본원에서 사용되는 경우에, "생분해성"이라는 용어는 생물학적 시스템에서의 분해, 예를 들어, 효소적 분해 또는 화학적 분해를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하는 내부의 스페이서 부분을 포함하고, 이때 상기 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (예를 들어, 화학식 III 및 IV에서의 S1 또는 S2)은 C3, C6, C9 및 C12 지방족 스페이서로 이루어진 군으로부터 선택된 비-뉴클레오티드 스페이서를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. "C" 뒤의 숫자는 코어 스페이서 구조 내의 탄소 원자의 개수를 가리킨다 (예를 들어, 추가적인 화학적 모이어티로 치환되지 않은 경우). 상기 스페이서는 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기일 수 있다. 상기 스페이서는 포스포르아미다이트 모이어티를 또한 함유하여 분자의 뉴클레오티드 부분의 포스페이트 백본으로의 공유결합 연결을 용이하게 할 수 있다. 한 실시양태에서, 스페이서 (S) 부분은 C3 포스포르아미다이트 스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 C6 포스포르아미다이트 스페이서이다. 추가적인 실시양태에서, C3, C6, C9, 또는 C12 스페이서가 (예를 들어, 표적화 모이어티로) 임의로 치환된다.
본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분 내의 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두가 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 또는 적절한 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 파괴된 가닥 내로의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 다양한 공지된 당, 염기 및 백본 변형, 및 LNA 단량체 단위의 혼입이 유의하게 혈청 안정성을 강화하고 표적 녹다운 또는 발현 조절 효과를 연장할 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 다양한 화학적 변형을 다양한 정도로 기능적으로 수용할 수 있고, 이와 상용성이다. 예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자의 리보뉴클레오티드의 5％ 내지 100％가 변형될 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 리보뉴클레오티드의 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 100％가 화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 뉴클레오티드 유사체 잔기로 교체된다). 당, 염기 및/또는 백본에 대한 기능적으로 상용성인 화학적 변형에 의해 또는 적절한 뉴클레오티드 유사체 잔기를 포함하는 것에 의해 부여되는 개선된 성질은 생체 내에서의 이러한 단일-가닥 RNAi 분자의 용도, 예를 들어, 치료제로서 또는 기능성 게놈 도구로서 사용하는 것에 특히 중요하다.
추가적인 측면에서, 본원에서의 실시양태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 내인성 RNA 표적이 포함되는 RNA 표적에 대한 RNAi에 참여할 수 있다. 한 실시양태에서, 내인성 RNA 표적은 천연-발생 miRNA의 표적이다. RNA 표적의 억제는 miRNA-의존적 RNA 간섭이 포함되는 표준 RNA-특이적 간섭 메카니즘을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, miRNA 표적의 억제는 상응하는 내인성 miRNA가 이와 상호작용을 하는 비번역 mRNA 영역과의 상호작용 (예를 들어, 염기 쌍을 이룸, 결합 등)에 의한 것일 수 있고, 이는 하나 이상의 하류 유전자의 번역 조절을 일으킨다. 별법적으로, miRNA 표적의 억제는 miRNA 모방체인 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에 의한 miRNA 표적의 결합이 비번역 miRNA 표적의 절단을 초래하는 siRNA-유사 간섭 메카니즘을 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에 의한 (비-코딩 비번역 영역보다는) 서열 코딩 영역 내의 mRNA 표적의 결합이 mRNA 표적 코딩 서열의 절단을 초래하는 siRNA-유사 간섭 메카니즘을 통해 mRNA 표적을 또한 억제할 수 있다.
C. 치환 및/또는 변형된 단일-가닥 RNAi 분자
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자 내로의 치환 및 변형된 뉴클레오티드의 도입은 외인성으로 전달되는 천연 RNA 분자 (즉, 표준 뉴클레오티드를 가짐)에 고유한 생체내 안정성 및 생체이용률의 잠재적인 제한사항을 극복하기 위한 도구를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 치환 또는 변형된 단일-가닥 RNAi 분자의 사용은 더 낮은 용량에서 소정의 치료학적 효과의 달성을 가능하게 할 수 있는데, 이러한 분자가 대상체 또는 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈청)에서의 반감기가 증가되도록 디자인될 수 있기 때문이다. 또한, 특정 치환 또는 변형이 특정 세포 또는 조직을 표적으로 함으로써 또는 단일-가닥 RNAi 분자의 세포 흡수를 개선함으로써 단일-가닥 RNAi 분자의 생체이용률을 개선하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 활성이 동일한 구조의 변형되지 않은 또는 치환되지 않은 RNAi 분자에 비교하여 다소 감소되더라도 (예를 들어, 약 20％, 또는 30％ 또는 심지어 40％ 미만만큼), 분자의 개선된 안정성 또는 전달로 인해 치환 또는 변형된 RNAi 분자의 전체적인 활성이 그의 천연 대응물의 것보다 더 클 수 있다. 치환 및/또는 변형된 단일-가닥 RNAi 분자는 예를 들어 인간에서 인터페론 반응을 활성화시킬 가능성을 또한 최소화할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 뉴클레오티드 위치의 약 5％ 내지 약 95％에서 리보뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 리보뉴클레오티드 중 1개 내지 모두 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개 또는 27개)가 변형될 수 있다.
관련 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단일-가닥 RNAi 분자는 하나 이상의 천연 또는 합성 비-표준 뉴클레오시드를 포함한다. 관련 실시양태에서, 비-표준 뉴클레오시드는 하나 이상의 데옥시우리딘, L- 또는 D-잠금 핵산 (LNA) 분자 (예를 들어, 5-메틸우리딘 LNA) 또는 치환된 LNA (예를 들어, 피렌을 가짐), 또는 범용-결합 뉴클레오티드, 또는 G 클램프(clamp), 또는 그의 임의의 조합이다. 특정 실시양태에서, 범용-결합 뉴클레오티드는 C-페닐, C-나프틸, 이노신, 아졸 카르복사미드, 1-β-D-리보푸라노실-4-니트로 인돌, 1-β-D-리보푸라노실-5-니트로인돌, 1-β-D-리보푸라노실-6-니트로인돌, 또는 1-β-D-리보푸라노실-3-니트로피롤이다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자 내에 존재할 수 있는 치환 또는 변형된 뉴클레오티드는 천연 또는 표준 리보뉴클레오티드와 유사한 특징이 있는 변형 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 노던 형상의 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥 RNAi 분자를 특색으로 하고 (예를 들어, 문헌 [Northern pseudorotation cycle, Saenger, Springer-Verlag ed., 1984] 참조), 이는 적어도 siRNA 분자에 적용되는 경우에, RNAi를 매개하는 역량을 유지하면서 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 잠재적으로 부여하는 것으로 공지되어 있다. 예시적인 노던 형상 뉴클레오티드에는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오티드), 2'-메톡시에틸 (MOE) 뉴클레오티드, 2'-메틸-티오-에틸, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-클로로 뉴클레오티드, 2'-아지도 뉴클레오티드, 5-메틸우리딘, 또는 2'-O- 메틸 뉴클레오티드)가 포함된다. 임의의 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 치환 또는 변형된 뉴클레오티드는 G 클램프 (예를 들어, 구아닌에 대한 추가적인 수소 결합을 형성하는 시토신 유사체, 예컨대 9-(아미노에톡시)페녹사진)일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lin and Mateucci, 1998, J. Am. Chem. Soc. 720:8531] 참조.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 5'-말단 끝부분이 인산화된다. 본원에 기술된 단일-가닥 RNAi 분자의 실시양태 중 어느 하나에서, 분자는 말단 포스페이트 기, 예컨대 5'-포스페이트 (문헌 [Martinez et al., 2002, Cell 110:563]; [Schwarz et al., 2002, Mole. Cell 70:537] 참조) 또는 5'3'-디포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 분자의 말단 끝부분에 하나 이상의 5'- 및/또는 3'-캡(cap) 구조를 포함한다. "캡 구조"는 올리고뉴클레오티드의 끝부분 내로 도입된 화학적 변형을 의미한다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 매툴릭-아다믹(Matulic-Adamic) 등의 미국 5,998,203 참조). 이러한 말단 변형은 특정 핵산 분자를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호할 수 있고, 전달 및/또는 세포성 국소화에서 특정한 장점을 부여할 수 있다. 비-제한적인 예에서, 적절한 5'-캡은 역위 무염기성(abasic) 잔기 (모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드; 카르보시클릭 뉴클레오티드; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 연결; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비-시클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 비-시클릭 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 비-시클릭 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 3'-3'-역위 무염기성 모이어티; 3'-2'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 3'-2'-역위 무염기성 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포르아미데이트; 헥실포스페이트; 아미노헥실 포스페이트; 3'-포스페이트; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 가교 및/또는 비-가교 메틸포스포네이트 모이어티를 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
또 다른 비제한적인 예에서, 적절한 3'-캡은 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보시클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트; 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실 포스페이트; 히드록시프로필 포스페이트; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비-시클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 5'-5'-역위 무염기성 모이어티; 5'-포스포르아미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 가교 및/또는 비-가교 5'-포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트, 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토 모이어티를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 더 상세한 내용은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49:1925]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모르폴리노, 아미데이트, 카르바메이트, 카르복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 술포네이트, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈 또는 알킬실릴 치환이 예를 들어 포함되는 포스페이트 백본 변형을 포함하는 변형된 단일-가닥 RNAi 분자를 특색으로 한다. 올리고뉴클레오티드 백본 변형의 리뷰를 위해, 문헌 [Hunziker and Leumann, 1995, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, Modern Synthetic Methods, VCH, 331]; [Mesmaeker et al., 1994, ACS 24-39]을 참조한다.
추가적인 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)의 2'-당 치환, 예컨대 2'-데옥시, 2'-O-2-메톡시에틸, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-할로겐 (예를 들어, 2'-플루오로), 2'-O-알릴 등, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝부분에 말단 캡 치환기, 예를 들어, 알킬, 무염기성, 데옥시 무염기성, 글리세릴, 디뉴클레오티드, 비-시클릭 뉴클레오티드, 역위 데옥시뉴클레오티드 모이어티, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 5'-말단-말단 리보뉴클레오티드는 2'-당 치환을 갖는다.
다른 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 리보실, 2'-데옥시리보실, 테트로푸라노실 (예를 들어, L-α-트레오푸라노실), 헥소피라노실 (예를 들어, β-알로피라노실, β-알트로피라노실 및 β-글루코피라노실), 펜토피라노실 (예를 들어, β-리보피라노실, α-릭소피라노실, β-크실로피라노실 및 α-아라비노피라노실), 카르보시클릭 유사체, 피라노스, 푸라노스, 모르폴리노, 또는 이들의 유사체 또는 유도체의 임의의 조합이 포함되는 1개 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)의 치환을 당 백본 내에 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개)의 변형된 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 독립적으로 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 알킬 포스포네이트, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트, 키랄 포스포네이트, 포스포포노아세테이트, 티오포스포노아세테이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트, 보라노포스페이트 연결, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
단일-가닥 RNAi 분자는 분자의 3'-말단 끝부분, 5'-말단 끝부분, 또는 3'-말단과 5'-말단 끝부분 둘 모두에 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에는 3'-말단 끝부분의 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 예컨대 포스포로티오에이트 연결이 있다. 예시적인 단일-가닥 RNAi 분자는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이를 초과하는 개수의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 추가적인 예시적인 단일-가닥 RNAi 분자는, 예를 들어, 분자의 5'-말단 끝부분에 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 또 다른 예시적인 단일-가닥 RNAi 분자에서, 1개 이상의 피리미딘 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 있을 수 있다. 추가적인 예시적인 단일-가닥 RNAi 분자에서, 1개 이상의 퓨린 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 있을 수 있다.
본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자에서 유용한 다수의 예시적인 변형된 뉴클레오티드 염기 또는 그의 유사체에는 5-메틸시토신; 5-히드록시메틸시토신; 잔틴; 하이포잔틴; 2-아미노아데닌; 아데닌 및 구아닌의 6-메틸, 2-프로필 또는 기타 알킬 유도체; 8-치환 아데닌 및 구아닌 (예를 들어, 8-아자, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 등); 7-메틸, 7-데아자, 및 3-데아자 아데닌 및 구아닌; 2-티오우라실; 2-티오티민; 2-티오시토신; 5-메틸, 5-프로피닐, 5-할로 (예를 들어, 5-브로모 또는 5-플루오로), 5-트리플루오로메틸, 또는 기타 5-치환 우라실 및 시토신; 및 6-아조우라실이 포함된다. 추가적인 유용한 뉴클레오티드 염기를 문헌 [Kurreck, 2003, Eur. J. Biochem. 270:1628]; [Herdewijn, 2000, Guide Nucleic Acid Develop. 10:297]; [Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pp. 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]; 미국 특허 3,687,808, 및 유사한 참고문헌에서 확인할 수 있고, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.
특정한 치환 또는 변형된 뉴클레오티드 염기 모이어티가 또한 구상된다. 여기에는 5-치환 피리미딘; 6-아자피리미딘; 및 N-2, N-6, 또는 O-6 치환 퓨린 (예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신)이 포함된다. 추가로, 예를 들어, 5-메틸우리딘 및 5-메틸시토신 치환이 핵산 이중체 안정성을 증가시키는 것으로 공지되어 있고, 이는 변형 또는 치환된 단일-가닥 RNAi 분자에 원하는 뉴클레아제 저항성을 제공하는 2'-당 변형 (예를 들어, 2'-O-메틸 또는 2'-메톡시에틸) 또는 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트)과 조합될 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 1개 이상의 피리미딘이 이환식 당 형태의 잠금 핵산 (LNA)이다. 관련된 실시양태에서, 이러한 LNA는 5-메틸우리딘 LNA 또는 2-티오-5-메틸우리딘 LNA와 같이 염기 치환을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 피리미딘 뉴클레오시드의 리보스 또는 뉴클레오시드간 연결이 임의적으로 변형될 수 있다.
임의의 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 치환 또는 변형된 뉴클레오티드가 G 클램프 (예를 들어, 구아닌에 대한 추가적인 수소 결합을 형성하는 시토신 유사체, 예컨대 9-(아미노에톡시) 페녹사진)일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lin and Mateucci, 1998, Nucleic Acids Res. 19:3111] 참조.
임의의 본원에 기술된 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자가 다중 유형의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 리보티미딘 또는 2-티오리보티미딘을 갖는 단일-가닥 RNAi 분자가 1개 이상의 LNA, 2'-메톡시, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 포스포로티오에이트 연결, 역위 염기 말단 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 특정한 예시적인 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상 또는 모든 우리딘이 리보티미딘으로 치환된 우리딘을 포함할 수 있고, 약 75％ 이하의 LNA 치환을 가질 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상 또는 모든 우리딘이 리보티미딘으로 치환된 우리딘을 포함할 수 있고, 약 25％ 이하의 2'-메톡시 치환을 가질 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자는 1개 이상 또는 모든 우리딘이 리보티미딘으로 치환된 우리딘을 포함할 수 있고, 약 100％ 이하의 2'-플루오로 치환을 가질 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 범용 염기 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥 RNAi 분자를 또한 제공한다. 본원에서 사용되는 경우의 "범용 염기"라는 용어는 1개를 초과하는 유형의 뉴클레오티드와 염기 쌍 또는 수소 결합된 뉴클레오티드 쌍을 형성하는 뉴클레오티드 염기 유사체를 지칭한다. 범용 염기의 비제한적인 예로는 C-페닐, C-나프틸 및 기타 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카르복스아미드, 및 니트로아졸 유도체 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 및 6-니트로인돌 (당업계에 공지된 바와 같음)이 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Loakes, 2001, Nucleic Acids Research 29:2437-2447] 참조). 특정 측면에서, 본원에 개시된 단일-가닥 RNAi 분자는 생성된 RNAi 분자가 여전히 그의 내인성 표적 중 하나 이상을 조정할 수 있는 한 약 1개 내지 약 10개의 범용 염기 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
D. 단일-가닥 RNAi 분자의 합성
예시적인 본 개시내용의 분자를 당업자에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 RNAi 분자는 화학적으로 합성되거나, 재조합에 의해 생산되거나 (예를 들어, 플라스미드에 의해 코딩됨), 또는 그의 조합일 수 있다.
올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 개별적인 연속적인 신장물 (예를 들어, 특정한 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드가 결여된 올리고뉴클레오티드의 일부분)을 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여, 예를 들어, 문헌 [Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymol. 211:3]; 톰프슨(Thompson) 등의 PCT 공개 번호 WO 99/54459; 문헌 [Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:2677]; [Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74:59]; [Brennan et al., 1998, Biotechnol. Bioeng. 67:33]; 및 브레난(Brennan)의 미국 특허 번호 6,001,311에 기술된 바와 같이 합성한다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 통상적인 핵산 보호 및 커플링 기, 예컨대 5'-말단의 디메톡시트리틸, 및 3'-말단의 포스포르아미다이트를 이용한다. 본 개시내용의 특정한 단일-가닥 RNAi 분자가 포함되는, 변형이 없는 RNA의 합성이 문헌 [Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:7845]; [Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18:5433]; 및 [Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:2677]; 및 [Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74:59]에 기술된 바와 같은 절차를 사용하여 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분들을 별도로 합성하여, 합성 후에, 예를 들어, 결찰에 의해 비-뉴클레오티드 스페이서 부분과 함께 연결할 수 있다 (문헌 [Moore et al., 1992, Science 256:9923]; 드레이퍼(Draper) 등의 PCT 공개 번호 WO 93/23569; 문헌 [Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:4247]; [Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides 16:951]; [Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8:204]). 추가적인 실시양태에서, 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 뉴클레오티드 부분이 1개 이상의 연속적인 RNA 신장물을 코딩하고 숙주 세포 내에서의 그의 발현을 지시하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA) 벡터에 의해 발현되는 단일 또는 다중 전사 생성물로서 제조될 수 있다. 그 후, 뉴클레오티드 부분들을 단리하고, 결찰에 의해 비-뉴클레오티드 스페이서 부분과 연결한다.
일부 실시양태에서, pol III을 기초로 하는 구축물이 본 발명의 핵산 분자를 발현하는데 사용된다. 진핵생물 RNA 폴리머라제 I (pol I), RNA 폴리머라제 II (pol II), 또는 RNA 폴리머라제 III (pol III)에 대한 프로모터로부터 단일-가닥 RNAi 분자 서열의 전사가 구동될 수 있다. (예를 들어, 톰프슨의 미국 특허 번호 5,902,880 및 6,146,886 참조). (문헌 [Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345]; [McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 399]; [Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5]; [Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15]; [Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41]; [Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531-4]; [Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6]; [Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9]; [Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222-1225]; [Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259]; [Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45]를 또한 참조한다). pol II 또는 pol III 프로모터로부터의 전사물은 모든 세포에서 높은 수준으로 발현된다; 소정의 세포 유형에서의 소정의 pol II 프로모터의 수준은 근처에 존재하는 유전자 조절 서열 (인핸서, 사일런서(silencer) 등)의 성질에 좌우된다. 원핵생물 RNA 폴리머라제 프로모터가 또한 사용되고, 단 이러한 원핵생물 RNA 폴리머라제 효소는 적합한 세포에서 발현된다 (문헌 [Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 87, 6743-7]; [Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72]; [Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66]; [Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37]). 여러 연구원들이 이같은 프로모터로부터 발현된 핵산 분자가 포유동물 세포에서 기능할 수 있다는 것을 입증하였다 (예를 들어 문헌 [Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15]; [Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 89, 10802-6]; [Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9]; [Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 90, 6340-4]; [L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8]; [Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 90, 8000-4]; [Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259]; [Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566]). 더욱 구체적으로, U6 소형 핵 (snRNA), 전달 RNA (tRNA) 및 아데노바이러스 VA RNA를 코딩하는 유전자로부터 유래된 것들과 같은 전사 단위가 높은 농도의 원하는 RNA 분자를 생성시키는데 유용하다 (문헌 [Thompson et al., 상기 문헌]; [Couture and Stinchcomb, 1996, 상기 문헌]; [Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830]; 눈베르그(Noonberg) 등의 미국 특허 번호 5,624,803; 문헌 [Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45]; 베이겔만(Beigelman) 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 96/18736). 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터 (예컨대 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터), 또는 바이러스 RNA 벡터 (레트로바이러스 또는 알파바이러스 벡터)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 포유동물 세포 내로의 도입을 위한 다양한 벡터 내로 상기 전사 단위들이 혼입될 수 있다 (리뷰를 위해 문헌 [Couture and Stinchcomb, 1996, 상기 문헌]을 참조한다).
치환 또는 변형 (염기, 당, 포스페이트, 또는 그의 임의의 조합)을 갖는 핵산 분자를 화학적으로 합성하는 것이 혈청 리보뉴클레아제에 의한 분해에 대한 저항성을 부여할 수 있고, 이는 증가된 효능 및 기타 약리학적 및 치료적 이점에 이를 수 있다. 예를 들어, 엑스타인(Eckstein) 등의 PCT 공개 번호 WO 92/07065; 문헌 [Perrault et al., 1990, Nature 344:565]; [Pieken et al., 1991, Science 253:314]; [Usman and Cedergren, 1992, Trends in Biochem. Sci. 77:334]; [Usman et al., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31:163]; [Beigelman et al., 1995, J. Biol Chem. 270:25702]; [Burlina et al., 1997, Bioorg. Med. Chem. 5:1999]; [Karpeisky et al., 1998, Tetrahedron Lett. 39:1131]; [Earnshaw and Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences) 48:39]; [Verma and Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem. 67:99]; [Herdewijn, 2000, Guide Nucleic Acid Drug Dev. 10:291]; [Kurreck, 2003, Eur. J. Biochem. 270:1628]; [Dorsett and Tuschl, 2004, Nature Rev. Drug Discov. 3:318]; 로시(Rossi) 등의 PCT 공개 번호 WO 91/03162; 우스만(Usman) 등의 PCT 공개 번호 WO 93/15187; 베이겔만 등의 PCT 공개 번호 WO 97/26270; 울프(Woolf) 등의 PCT 공개 번호 WO 98/13526; 스프로트(Sproat)의 미국 특허 번호 5,334,711; 우스만 등의 미국 특허 번호 5,627,053; 베이겔만 등의 미국 특허 번호 5,716,824; 오트보스(Otvos) 등의 미국 특허 번호 5,767,264; 골드(Gold) 등의 미국 특허 번호 6,300,074 참조. 각각의 상기 참고문헌은 본원에 기술된 단일-가닥 RNAi 분자에서 사용될 수 있는, 핵산 분자의 염기, 포스페이트, 또는 당 모이어티에 대한 다양한 치환 및 화학적 변형을 개시한다.
E. 단일-가닥 RNAi 분자를 디자인하는 방법
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 RNAi 메카니즘을 통해 표적 서열의 발현을 억제할 수 있다. 한 실시양태에서, 원하는 녹다운 기능을 보유하는 이전에 확인된 RNAi 작용제 (예를 들어, siRNA, miRNA)를 기초로 단일-가닥 RNAi 분자를 디자인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 miRNA 모방체이면, 이는 상응하는 천연-발생 miRNA 분자 (표 1 참조) 또는 그의 유사체 (예를 들어, 화학적으로 변형된 형태)로부터 유래된다. 본 출원의 출원일 현재, 다양한 종에 대해 내인성인 3000개를 초과하는 miRNA 분자를 공개적으로 입수가능한 데이터베이스에서 확인할 수 있다 (예를 들어, 월드 와이드 웹 상에서 웰컴 트러스트 생어 인스티튜트의 웹사이트에서 접근가능한, 문헌 [Griffith-Jones et al., 2004, Nucleic Acids Research 32:D109-D111] 및 [Griffith-Jones et al., 2006, Nucleic Acids Research 34:D 140-D144]에 기술된 바와 같은 공개적으로 입수가능한 miRBase 서열 데이터베이스 참조). 본원에서의 표 1은 1090개의 성숙형 인간 miRNA 서열 (서열 1-1090)의 목록을 함유한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 선택된 표적 서열의 발현을 억제하는 것으로 또는 표적 mRNA 서열의 발현을 억제하는 잠재력이 있는 것으로 공지된 이전에 확인된 siRNA로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 이전에 확인된 RNAi 분자 (즉, 기준 RNAi 분자)로부터 유래된 단일-가닥 RNAi 분자를 이러한 기준 RNAi 분자의 가이드 가닥 내에 1개 이상의 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 도입하는 것에 의해 디자인할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 특정 표적 서열의 발현을 녹다운시키는 목적을 위해 단일-가닥 RNAi 분자가 신규로 디자인될 수 있다 (즉, 공지된 RNAi 작용제를 기초로 하지 않음).
소정의 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 RNAi 활성을 공지된 방법, 예컨대 파이어 등의 PCT 공개 번호 WO99/32619에 일반적으로 기술된 것을 사용하여, 그리고 하기의 실시예 섹션에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서는 하나 이상의 리포터 유전자, 예컨대 루시퍼라제, 클로람페니콜 (CAT), 또는 β-갈락토시다제에 작동가능하게 융합되고 그의 발현을 변경시킬 수 있는 구성적 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 또는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터를 포함하고, 차례로 상기 리포터 유전자가 테스트될 ssRNAi에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 표적 서열의 일부분에 인-프레임(in-frame)으로 작동가능하게 연결되어 있는 하나 이상의 리포터 유전자 구축물을 사용하는 것에 의해 더욱 효과적인 단일-가닥 RNAi 분자 디자인을 선택하는 방법을 제공한다. 이러한 리포터 유전자 발현 구축물들은 하나 이상의 ssRNAi 분자 및 대조군 (예를 들어, 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유하지 않는 상응하는 miRNA 모방체)과 공동-형질감염될 수 있다. ssRNAi 분자로 형질감염된 세포에서의 측정된 리포터 유전자 활성과 음성 대조군으로 형질감염된 세포 (즉, ssRNAi 분자로 형질감염되지 않은 세포) 및 양성 대조군으로 형질감염된 세포 (예를 들어, 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유하지 않는 상응하는 miRNA 모방체로 형질감염된 세포)에서의 활성을 비교함으로써 표적 mRNA의 RNAi를 매개하는 소정의 ssRNAi 분자의 능력을 결정할 수 있다. 자신의 상응하는 RNAi 분자, 예를 들어, 내부의 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유하지 않는 것의 활성의 적어도 20％ 이상, 바람직하게는 적어도 40％ 이상, 또는 60％ 이상, 또는 80％ 이상이 있는 ssRNAi 분자를 선택한다.
당업자는, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 또는 일반적으로 당업계에 공지된 동물 모델에서, 어떤 분자가 RNAi를 매개하는 능력을 유지하면서 개선된 성질 (예를 들어, 약동학 프로파일, 생체이용률, 안정성)을 보유하는지를 결정하기 위해 다양한 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유하는 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자를 스크리닝할 수 있다. 유사하게, 당업자는 어떤 RNAi 분자-접합체 복합체가 RNAi를 매개하는 능력을 유지하면서 개선된 성질을 보유하는지를 결정하기 위해 다양한 접합체가 있는 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자를 또한 스크리닝할 수 있다.
F. 조성물 및 사용 방법
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 바람직하게는 세포 RNAi 경로에 참여할 수 있거나 또는 동일하거나 관련된 경로(들)을 다른 방식으로 조정할 수 있고 병리학적 또는 질환 상태와 연관된 표적 유전자의 억제를 초래하는 RNAi 작용제이다. miRNA 모방체를 나타내는 단일-가닥 RNA 분자의 경우에, 감소된 수준 또는 다른 방식으로 적절하지 않게 낮은 수준이 병리학적 또는 질환 상태와 연관되는 상응하는 천연-발생 miRNA를 보충하거나 대신하도록 ssRNAi 분자가 디자인된다. 따라서 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 다양한 치료, 진단, 표적 확인, 게놈 발견, 유전자 조작, 및 약물유전체학 용도를 위한 방법에서 사용될 수 있는 유용한 시약이다.
본 발명의 단일-가닥 RNA 분자는 표적 서열에 대한 RNAi를 매개하기 위해 세포, 조직, 생물, 시험관내 시스템 또는 생체내 시스템으로 도입될 수 있다. 이러한 표적 서열은 내인성 표적 유전자 또는 서열일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 원하지 않는 단백질 생산을 특징으로 하는 질환에 걸린 생물을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
miRNA 모방체인 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자의 경우에, 표적 서열은 상응하는 천연-발생 miRNA의 표적이다. 이같은 경우에, 단일-가닥 miRNA 모방체는 유전자의 발현 수준이 상응하는 천연-발생 miRNA와 연관되거나 또는 다른 방식으로 이에 의해 조절되는 다수의 유전자, 예를 들어, 그의 mRNA 표적의 하류의 유전자를 조절할 수 있다. 특정한 천연-발생 miRNA의 비정상적인 발현 수준이 과다증식성, 혈관신생성 또는 염증성 질환, 상태, 또는 유해 상태를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 인간 질병에서 연루되었기 때문에, 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체가 유용한 치료 기회를 제공할 수 있다. 이러한 정황에서, 하나 이상의 연관된 질환 증상의 중증도 또는 재발의 방지, 경감 또는 감소가 달성될 수 있도록 본 개시내용의 단일-가닥 miRNA 모방체는 그의 상응하는 내인성 miRNA의 하나 이상의 하류 유전자의 발현을 조절 (예를 들어, 녹다운 또는 상향-조절)할 수 있다. 별법적으로, 질환 또는 기타 유해 상태의 결과로서 하나 이상의 표적 mRNA의 발현이 반드시 감소되거나 정상보다 낮은 수준이지는 않은 다양한 별개의 질환 모델들에 대해, 그럼에도 불구하고, 외인성 miRNA 모방체, 예컨대 하나 이상의 본 발명의 단일-가닥 miRNA 모방체를 도입하는 것이 질환 경로와 연관된 유전자의 발현 수준에 영향을 미치는 것에 의해 치료 결과를 초래할 수 있다.
표적 유전자의 코딩 영역을 표적으로 하고, 이러한 유전자의 발현을 억제하고, 따라서 단백질 생산을 감소시키는 것에서 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 또한 siRNA 분자와 유사하게 작용할 수 있다. 단일-가닥 RNAi 분자의 도입이 없었다면 생산되었을 단백질은 병리학적 또는 질환 상태 (예를 들어, 암)과 연관될 수 있다.
본원에서의 이러한 개시내용에 따라, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자, 그의 조성물, 및 세포 또는 생물에서 하나 이상의 상응하는 표적 mRNA의 발현을 억제하기 위한 방법이 제공된다. 본 개시내용은 인간 세포, 조직 또는 개체가 포함되는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 단일-가닥 RNAi 분자 조성물을 제공한다.
(i) 제약 조성물 및 제제
본 개시내용은 제약상 유효량의 원하는 RNAi 분자를 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 내에 포함하는 보관 또는 투여용으로 제조된 단일-가닥 RNAi 분자 조성물을 포함한다. 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자 조성물은 제약상 허용되는 제제로서 효과적으로 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 제제는 대상체에서의 질환 상태 또는 기타 유해 상태를 예방하거나, 그의 발생 또는 중증도를 변경시키거나, 또는 치료한다 (하나 이상의 증상(들)을 검출가능하거나 측정가능한 정도로 경감시킨다). 따라서, 제약 조성물 또는 제제는 세포 또는 대상체 예컨대 인간 내로의 투여 (예를 들어, 전신 투여)에 적절한 형태의 조성물 또는 제제를 지칭한다. 본 개시내용의 제약 조성물은 내부에 함유된 단일-가닥 RNAi 분자(들)이 대상체에게의 투여 시 생체이용가능하게 하도록 제제화된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 보존제, 항산화제, 안정화제, 염료, 향미제, 또는 이들의 임의의 조합을 임의적으로 포함할 수 있다. 예시적인 보존제에는 벤조산나트륨, p-히드록시벤조산의 에스테르, 소르브산이 포함된다. 제약상 허용되는 제제는 상기 화합물들의 염, 예를 들어, 산 부가염, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 아세트산, 또는 벤젠 술폰산의 염을 포함한다. 치료 용도를 위한 허용가능한 담체 또는 희석제가 제약 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro edit., 21st Edition, 2005]에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자를 함유하는 수성 현탁액이 적절한 부형제, 예컨대 현탁화제 또는 분산 또는 습윤화제와 혼합되어 제조될 수 있다. 예시적인 현탁화제에는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드로프로필-메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이 포함된다. 대표적인 분산 또는 습윤화제에는 천연-발생 포스파티드 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀), 에틸렌 옥시드와 헥시톨 및 지방산으로부터 유래된 부분적인 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트), 또는 에틸렌 옥시드와 헥시톨 무수물 및 지방산으로부터 유래된 부분적인 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 수성 현탁액은 하나 이상의 보존제 (예를 들어, 에틸 또는 w-프로필-p-히드록시벤조에이트), 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 또는 하나 이상의 감미제 (예를 들어, 수크로스, 사카린)를 임의적으로 함유할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 분산 또는 습윤화제, 현탁화제 및 임의적인 하나 이상의 보존제, 착색제, 향미제 또는 감미제와의 혼합물 내의 단일-가닥 RNAi 분자에 물을 첨가함으로써 하나 이상의 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자를 포함하는 수성 현탁액의 제조에 적절한 분산성 분말 및 과립을 제조할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, ssRNAi를, 예를 들어, 식물성 오일 (예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일, 또는 코코넛 오일) 또는 미네랄 오일 (예를 들어, 액체 파라핀)에 현탁시킴으로써 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자가 유성 현탁액 또는 에멀젼 (예를 들어, 수중유)으로서 제제화될 수 있다. 적절한 유화제는 천연-발생 검 (예를 들어, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검), 천연-발생 포스파티드 (예를 들어, 대두, 레시틴, 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 에스테르 또는 부분적인 에스테르), 무수물 (예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트), 또는 부분적인 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 유성 현탁액 또는 에멀젼은 증점제, 예컨대 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 임의적으로 함유할 수 있다. 관련 실시양태에서, 맛좋은 경구 제제를 제공하기 위해 감미제 및 향미제가 임의적으로 첨가될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항산화제, 예컨대 아스코르브산을 임의적으로 첨가하는 것에 의해 이러한 조성물들을 보존할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 단일-가닥 RNAi 분자를 감미제 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글루코스 또는 수크로스)와 함께 시럽 또는 엘릭시르로서 제제화할 수 있다. 이같은 제제는 완화제, 보존제, 향미제, 착색제 또는 이들의 임의의 조합을 또한 함유할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자를 포함하는 제약 조성물은 주사가능한 멸균 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 주사가능한 멸균 제제는 또한 비경구적으로 허용되는 비-독성 희석제 또는 용매 내의 주사가능한 멸균 용액 또는 현탁액 (예를 들어, 1,3-부탄디올 내의 용액)일 수 있다. 본 개시내용의 조성물에서 유용한 예시적인 허용되는 비히클 및 용매에는 물, 링거 용액, 또는 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 임의의 무자극(bland) 고정 오일을 사용할 수 있다. 또한, 지방산 예컨대 올레산이 비경구 제제의 제조에서 사용된다.
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 직접적으로 투여될 수 있거나, 또는 예를 들어 양이온성 지질과 복합체를 이룰 수 있거나 또는 리포솜 내에 포장될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 문헌 [Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139]; [Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995]; [Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol. 16:129-140]; [Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-192]; 및 [Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser. 752:184-192]에 핵산 분자의 전달 방법이 기술되어 있다. 베이겔만 등의 미국 특허 번호 6,395,713 및 설리반(Sullivan) 등의 PCT WO 94/02595에 핵산 분자의 전달을 위한 일반적인 방법이 추가로 기술되어 있다. 이러한 프로토콜들을 사실상 모든 핵산 분자의 전달에 이용할 수 있다. 리포솜 내의 캡슐화, 이온영동법에 의한 것, 또는 생분해성 중합체, 히드로겔, 시클로텍스트린 (예를 들어, 문헌 [Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074]; [왕(Wang) 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 03/47518 및 WO 03/46185 참조), 폴리(락트-코-글리콜)산 (PLGA) 및 PLCA 마이크로스피어 (예를 들어 미국 특허 6,447,796 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2002130430 참조), 생분해성 나노캡슐, 및 생접착성 마이크로스피어와 같은 다른 비히클 내로의 혼입에 의한 것, 또는 단백질성 벡터 (오헤어(O'Hare) 및 노르만드(Normand)의 국제 PCT 공개 번호 WO 00/53722)에 의한 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 핵산 분자를 세포에 투여할 수 있다.
( ii ) 담체 /전달 시스템
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 단일-가닥 RNAi 분자를 함유하는 담체 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 담체 시스템은 지질-기반 담체 시스템, 양이온성 지질, 또는 리포솜 핵산 복합체, 리포솜, 미셀, 비로솜, 지질 나노입자 또는 이들의 혼합물이다. 다른 실시양태에서, 담체 시스템은 중합체-기반 담체 시스템 예컨대 양이온성 중합체-핵산 복합체이다. 추가적인 실시양태에서, 담체 시스템은 시클로덱스트린-기반 담체 시스템 예컨대 시클로덱스트린 중합체-핵산 복합체이다. 추가적인 실시양태에서, 담체 시스템은 단백질-기반 담체 시스템 예컨대 양이온성 펩티드-핵산 복합체이다. 바람직하게는, 담체 시스템은 액체 나노입자 ("LNP") 제제이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 미국 특허 출원 번호 11/353,630, 11/586,102, 61/189,295, 61/204,878, 61/235,476, 61/249,807, 및 61/298,022에 기술된 바와 같은 지질 나노입자 조성물과 함께 제제화된다. 특정한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 ssRNAi 분자는 40/48/2/10 비율의 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-C-DMA/DSPC 또는 40/48/2/10 비율의 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC를 포함하는 지질 나노입자 조성물과 함께 제제화된다. 특정한 다른 실시양태에서, 본 발명은 미국 특허 출원 번호 61/189,295, 61/204,878, 61/235,476, 61/249,807, 및 61/298,022에 기술된 양이온성 지질 제제 중 임의의 것과 함께 제제화된 본 발명의 ssRNAi 분자를 포함하는 조성물을 특색으로 한다.
본 개시내용의 특정 실시양태 내에서, 임의적으로는 제약상 허용되는 담체, 예컨대 희석제, 안정화제, 완충제 등과 함께 제제화된, 관능성 모이어티와 조합되거나 복합체를 이루거나 접합된 하나 이상의 단일-가닥 RNAi 분자의 존재 또는 투여를 특색으로 하는 제약 조성물 및 방법이 제공된다. 이같은 접합체 및/또는 복합체는 생물학적 시스템, 예컨대 세포 내로의 RNAi 분자의 전달을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 접합체 및 복합체는 치료 화합물을 세포막을 가로질러 전달하는 것, 약동학을 변경시키는 것, 및/또는 본 발명의 핵산 분자의 국소화를 조정하는 것에 의해 치료 활성을 부여할 수 있다. 이같은 접합체의 비제한적인 예가 미국 공개 번호 US 2008/0152661 A1 및 US 2004/0162260 A1 (예를 들어, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG 등) 및 미국 특허 출원 번호 10/427,160 및 10/201,394; 및 미국 특허 번호 6,528,631; 6,335,434; 6,235,886; 6,153,737; 5,214,136; 및 5,138,045에 기술되어 있다.
본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자는 뉴클레오티드 중 하나 이상 상에, 말단 및/또는 내부 위치(들)에서, 및/또는 분자의 스페이서 부분 상에 접합체 구성원을 포함할 수 있다. 접합체 구성원은, 예를 들어, 친지성 물질, 테르펜, 단백질 결합제, 비타민, 탄수화물, 또는 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 접합체 구성원은 나프록센, 니트로인돌 (또는 스태킹 상호작용에 기여하는 또 다른 접합체), 폴레이트, 이부프로펜 또는 C5 피리미딘 링커일 수 있다. 다른 실시양태에서, 접합체 구성원은 글리세리드 지질 접합체 (예를 들어, 디알킬 글리세리드 유도체), 비타민 E 접합체 또는 티오-콜레스테롤이다. 다양한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자에 공유적으로 부착될 수 있다. 부착된 PEG는 임의의 분자량일 수 있고, 바람직하게는 약 100 내지 약 50,000 달톤 (Da)이다.
본 개시내용의 특정 실시양태에서, 임의적으로는 제약상 허용되는 담체, 예컨대 희석제, 안정화제, 완충제 등과 함께 제제화된, 폴리펩티드 또는 펩티드와 조합되거나 복합체를 이루거나 접합된 하나 이상의 단일-가닥 RNAi 분자의 존재 또는 투여를 특색으로 하는 제약 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 내로의 하나 이상의 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 전달을 강화하기 위해 또는 생물학적 샘플과 접촉될 때 다른 방식으로 분자의 안정성 또는 활성을 강화하기 위해 펩티드 접합체 파트너가 사용된다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 사용하기 위한 예시적인 펩티드 접합체 구성원에는 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0040882 및 2006/0014289, 및 미국 특허 가출원 번호 60/939,578 (모두 본원에 참고로 포함됨)에 예를 들어 기술된 바와 같은 펩티드 PN27, PN28, PN29, PN58, PN61, PN73, PN158, PN159, PN173, PN182, PN202, PN204, PN250, PN361, PN365, PN404, PN453, 및 PN509가 포함된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자를 특이적인 세포 유형, 예컨대 간세포에 투여하는데 적절한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체 (ASGPr) (문헌 [Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429])가 간세포에 독특하고, 분지형 갈락토스-말단 당단백질, 예컨대 아시알로오로소뮤코이드 (ASOR)에 결합한다. 이같은 당단백질 또는 합성 당접합체가 수용체에 결합하는 것은 올리고당 사슬의 분지화 정도에 강하게 의존적인 친화도로 일어나고, 예를 들어, 3안테나 구조는 2안테나 또는 1안테나 사슬보다 더 강한 친화도로 결합된다 (문헌 [Baenziger and Fiete, 1980, Cell 22: 611]; [Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:939]). 문헌 [Lee and Lee, 1987, Glycoconjugate J. 4:317]에서, 갈락토스에 비교하여 수용체에 대한 친화도가 더 높은 N-아세틸-D-갈락토스아민을 탄수화물 모이어티로 사용는 것을 통해 이러한 높은 특이성이 수득되었다. 이러한 "클러스터링 효과"가 만노실-말단 당단백질 또는 당접합체의 결합 및 섭취에 대해 또한 기술되었다 (문헌 [Ponpipom et al., 1981, J. Med. Chem. 24: 1388]). 갈락토스 및 갈락토스아민을 기반으로 하는 접합체를 외인성 화합물을 세포막을 가로질러 전달하는데 사용하는 것은 표적화된 전달 접근법을 간 질환의 치료에 제공할 수 있다. 생체접합체의 사용은 치료에 필요한 치료 화합물의 필요 용량에서의 감소를 또한 제공할 수 있다. 또한, 치료적 생체이용률, 약력학, 및 약동학 파라미터가 본 개시내용의 생체접합체의 사용을 통해 조정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자가 폴리펩티드에 접합될 수 있고, 하나 이상의 비-양이온성 지질 또는 비-양이온성 지질과 양이온성 지질의 조합물과 혼합되어, RNAi 분자의 세포내 전달을 표적 세포를 지질 없이 네이키드(naked) RNAi 분자와 접촉시키는 것으로부터 초래되는 전달과 비교하여 강화시키는 조성물이 형성될 수 있다. 본 개시내용의 더욱 상세한 측면에서, 단일-가닥 RNAi 분자 및 폴리펩티드를 포함하는 혼합물, 복합체 또는 접합체가 임의적으로 양이온성 지질, 예컨대 리포펙틴(Lipofectine)™과 조합될 수 있다 (예를 들어, 이와 혼합되거나 복합체를 이룰 수 있다). 폴리펩티드, 단일-가닥 RNAi 분자 및 양이온성 지질로 구성되는 이러한 조성물을 생산하기 위해, 먼저 RNAi 분자 및 폴리펩티드가 적절한 배지 예컨대 세포 배양 배지에서 함께 혼합될 수 있고, 그 후에 양이온성 지질이 혼합물에 첨가되어 RNAi 분자/전달 펩티드/양이온성 지질 조성물이 형성된다. 임의적으로는, 펩티드 및 양이온성 지질이 적절한 배지 예컨대 세포 배양 배지에서 먼저 혼합될 수 있고, 이어서 단일-가닥 RNAi 분자가 첨가되어 RNAi 분자/전달 펩티드/양이온성 지질 조성물이 형성된다.
본 개시내용은 폴리(에틸렌 글리콜) 지질을 함유하는 표면-변형 리포솜 (PEG-변형, 또는 장기(long)-순환 리포솜 또는 스텔스(stealth) 리포솜)을 포함하는 단일-가닥 RNAi 분자 조성물의 사용을 또한 특색으로 한다. 이러한 제제는 표적 조직에서의 약물 축적 증가를 제공할 수 있다 (문헌 [Lasic et al., 1995, Chem. Rev. 95:2601]; [Ishiwata et al., 1995, Chem. Pharm. Bull. 43:1005]). 이같은 리포솜은, 아마도 혈관이 신생된 표적 조직에서의 혈관외유출 및 포착에 의해, 종양에서 선택적으로 축적되는 것으로 나타났다 (문헌 [Lasic et al., 1995, Science 267:1215]; [Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta 1238:86]). 장기-순환 리포솜은 단핵 포식세포 시스템 (MPS)의 조직에 축적되는 것으로 공지된 통상적인 양이온성 리포솜과 비교하여 핵산 분자의 약동학 및 약력학을 강화한다 (문헌 [Liu et al., 1995, J. Biol. Chem. 42:24864]; 최(Choi) 등의 PCT 공개 번호 WO 96/10391; 안셀(Ansell) 등의 PCT 공개 번호 WO 96/10390; 홀랜드(Holland) 등의 PCT 공개 번호 WO 96/10392). 장기-순환 리포솜은, 이론적으로는, 간 및 지라와 같이 대사적으로 공격적인 MPS 조직에서의 축적을 막는 것으로 인해, 양이온성 리포솜과 비교하여 뉴클레아제 분해로부터의 추가적인 보호를 또한 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 RNAi 분자는 또한 폴리에틸렌이민 및 그의 유도체, 예컨대 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토스아민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토스아민 (PEI-PEG-트리GAL) 유도체와 함께 제제화될 수 있거나 또는 이와 복합체를 이룰 수 있다. 한 실시양태에서, 미국 특허 출원 공개 번호 20030077829에 기술된 바와 같이 본 발명의 핵산 분자가 제제화된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 막 파괴제 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 20010007666에 기술된 것들과 복합체를 이룬다. 또 다른 실시양태에서, 막 파괴제 또는 파괴제들 및 RNAi 분자가 양이온성 지질 또는 헬퍼 지질 분자, 예컨대 미국 특허 번호 6,235,310에 기술된 지질과 또한 복합체를 이룬다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자는 미국 특허 출원 공개 번호 2003077829; 20050287551; 20050164220; 20050191627; 20050118594; 20050153919; 20050085486; 및 20030158133; 및 국제 PCT 공개 번호 WO 00/03683 및 WO 02/087541에 기술된 바와 같은 전달 시스템과 복합체를 이룬다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜 제제는 미국 특허 번호 6,858,224; 6,534,484; 6,287,591; 6,835,395; 6,586,410; 6,858,225; 6,815,432; 6,586,001; 6,120,798; 6,977,223; 6,998,115; 5,981,501; 5,976,567; 5,705,385; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0019912; 2006/0019258; 2006/0008909; 2005/0255153; 2005/0079212; 2005/0008689; 2003/0077829, 2005/0064595, 2005/0175682, 2005/0118253; 2004/0071654; 2005/0244504; 2005/0265961 및 2003/0077829에 기술된 화합물 및 조성물과 함께 제제화되거나 이와 복합체를 이룬 본 발명의 RNAi 분자를 포함한다.
본 개시내용은 단일-가닥 RNAi 분자 나노입자를 제조하는 방법을 또한 특색으로 한다. 멜라민 유도체를 함유하는 제1 용액을 HCl과 같은 산이 첨가된 유기 용매 예컨대 디메틸 술폭시드 또는 디메틸 포름아미드에 용해시킨다. HCl의 농도는 멜라민 유도체 1몰에 대해 약 3.3몰의 HCl일 것이다. 그 후, 제1 용액을 극성 또는 친수성 용매 (예를 들어, 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA), 또는 트리(히드록시메틸) 아미노메탄 (TRIS), 또는 그의 조합물을 예를 들어 함유하는 수성 완충제 용액)에 용해 또는 현탁된 핵산을 포함하는 제2 용액과 혼합한다. 이러한 혼합물이 제1 에멀젼을 형성한다. 혼합은 임의의 표준 기술을 사용하여, 예를 들어, 초음파처리, 와동으로 또는 마이크로플루이다이저(microfluidizer)에서 실행될 수 있다. 생성된 핵산 입자를 정제할 수 있고, 크기-배제 크로마토그래피 또는 투석 또는 둘 모두를 사용하여 유기 용매를 제거할 수 있다. 그 후, 복합체를 이룬 핵산 나노입자를 수성 용액 내에 폴리아르기닌 또는 Gln-Asn 중합체 또는 둘 모두를 함유하는 수성 용액과 혼합한다. 각각의 중합체의 바람직한 분자량은 약 5000 내지 약 15,000 달톤이다. 이는 폴리아르기닌 및 Gln-Asn 중합체 및 멜라민 유도체와 복합체를 이룬 핵산의 나노입자를 함유하는 용액을 형성한다. 혼합 단계는 평균적으로 직경이 약 200 나노미터 미만인 나노입자를 생산하면서 핵산의 전단(shearing)을 최소화하는 방식으로 수행된다. 폴리아르기닌이 핵산의 마이너 그루브(minor groove) 내의 포스페이트 기의 음전하와 복합체를 이루고, 폴리아르기닌이 삼량체성 핵산 복합체를 감싸는 것으로 여겨진다. 폴리아르기닌의 어느 한쪽 말단에서, 기타 모이어티, 예컨대 TAT 폴리펩티드, 만노스 또는 갈락토스가 중합체에 공유적으로 결합되어, 핵산 복합체가 특이적인 조직, 예컨대 갈락토스가 사용되는 경우의 간에 결합하는 것을 지시할 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, 핵산의 염기와 수소 결합하는 것을 통해 Gln-Asn 중합체가 핵산의 메이저 그루브(major groove) 내의 핵산 복합체와 복합체를 이루는 것으로 여겨진다. 폴리아르기닌 및 Gln-Asn 중합체는 20개의 염기 쌍이 있는 핵산 1몰 당 2몰의 농도로 존재하여야 한다. 이러한 농도는 20개를 초과하는 염기 쌍이 있는 핵산에 대해 비례적으로 증가되어야 한다. 예를 들어, 핵산에 25개의 염기 쌍이 있으면, 이러한 중합체의 농도는 이중-가닥 핵산 1몰 당 2.5 - 3몰이어야 한다. 생성된 나노입자를 표준 수단 예컨대 크기 배제 크로마토그래피에 이어지는 투석에 의해 정제할 수 있다. 그 후, 정제된, 복합체를 이룬 나노입자를 당업계에 주지된 기술을 사용하여 동결건조시킬 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태는 단일-가닥 RNAi 분자를 포함하는 100 나노미터 (nm) 미만의 나노입자를 제공한다.
( iii ) 치료
본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자 (임의적으로 치환 또는 변형 또는 접합됨), 그의 조성물, 및 본 개시내용의 방법을 사용하는 치료에 순응할 수 있는 대상체 (예를 들어, 포유동물, 인간)에는 과다증식성 (예를 들어, 암), 혈관신생성, 대사성 또는 염증성 (예를 들어, 관절염) 질환 또는 장애 또는 상태를 포함하여, 표적 유전자 또는 서열의 비정상적인 발현 수준에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 하나 이상의 질환 또는 상태를 앓고 있는 대상체, 표적 유전자/서열의 비정상적인 수준에 의해 야기되거나 이와 연관되는 질환이 발달될 위험에 처한 대상체, 또는 상응하는 ssRNAi 분자에 의해 매개되는 RNAi의 수준을 보충하거나 증가시키는 것에 의한 치료를 따를 수 있는 대상체가 포함된다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 레트로바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 코로나바이러스, 뿐만 아니라 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스, 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스가 포함되는 호흡기 바이러스가 포함되는 광범위한 표적 바이러스의 치료에서 유용하다.
다른 예에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 예를 들어 과다증식성 장애의 증상을 치료 또는 예방하는 치료 도구로서 유용하다. 예시적인 과다증식성 장애에는 신생물, 암종, 육종, 종양, 또는 암이 포함된다. 더욱 예시적인 과다증식성 장애에는 구강암, 인후두암, 후두암, 식도암, 인두암, 비인두암, 구인두암, 위장관암, 위장 기질 종양 (GIST), 소장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 항문암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁암, 외음부암, 질암, 요로암, 방광암, 신장암, 부신피질암, 섬세포 암종, 담낭암, 위암, 전립선암, 난소암, 자궁내막암, 영양막 종양, 고환암, 음경암, 골암, 골육종, 간암, 간외 담관암, 피부암, 기저 세포 암종 (BCC), 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 뇌암, 흑색종, 카포시 육종, 안암, 두경부암, 두경부의 편평세포 암종, 흉선종, 흉선 암종, 갑상선 암종, 부갑상선암, 히펠-린도우(Hippel-Lindau) 증후군, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, T-세포 림프종, 다발 골수종, 악성 흉막 중피종, 바렛 선암종, 윌름 종양 등이 포함된다. 다른 예에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 예를 들어 염증성 장애의 증상을 치료 또는 예방하기 위해 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 조절하는 치료 도구로서 유용하다. 예시적인 염증성 장애에는 진성 당뇨병, 류마티스 관절염, 염증이 있는 윤활 내막(synovial lining)에서의 판누스 성장, 콜라겐-유도 관절염, 척추관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 뇌척수염, 염증성 장 질환, 크론병, 건선 또는 건선성 관절염, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루푸스, 이식편-대-숙주 질환, 아테롬성동맥경화증, 및 알레르기가 포함된다.
본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자, 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 기타 예시적인 장애에는 대사 장애, 심장 질환, 폐 질환, 혈관신생, 허혈 장애, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 사구체신염, 당뇨병, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 만성 기관지염, 림프관형성, 및 아테롬성동맥경화증이 포함된다.
추가적인 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 표적 유전자-연관 질환 또는 상태를 제어하기 위해 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자와 함께 제제화되거나 또는 이와 동조적으로 투여되는 하나 이상의 제2 또는 보조 활성제와 조합된 유효량의 하나 이상의 단일-가닥 RNAi 분자를 포함하는 조합 제제 및 방법이 제공된다. 이러한 조합 제제 및 동조 치료 방법에서의 유용한 보조 치료제에는, 예를 들어, 효소성 핵산 분자, 알로스테릭 핵산 분자, 가이드, 디코이(decoy), 또는 앱타머 핵산 분자, 항체 예컨대 모노클로날 항체, 소형 분자 및 기타 유기 또는 무기 화합물 (금속, 염 및 이온이 포함됨), 및 하나 이상의 표적 유전자-연관 질환 또는 상태를 치료하는 것에 대해 지시된 기타 약물 및 활성제 (암을 치료하는데 사용되는 화학요법제, 스테로이드, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID) 등이 포함됨)가 포함된다. 예시적인 화학요법제에는 알킬화제 (예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 부술판, 니트로스우레아, 질소 머스타드, 우라무스틴, 테모졸로미드), 항대사물질 (예를 들어, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 시타라빈), 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀), 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신), 블레오마이신, 미토마이신, 악티노마이신, 히드록시우레아, 토포이소머라제 억제제 (예를 들어, 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 에토포시드, 테니포시드), 모노클로날 항체 (예를 들어, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 젬투주맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 트라스투주맙), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈), 시클로포스파미드, 프레드니손, 류코보린, 옥살리플라틴이 포함된다.
본 개시내용의 동조 투여 방법을 실행하기 위해, 단일-가닥 RNAi 분자가 본원에 기술되었거나 당업계에 공지된 하나 이상의 제2 또는 보조 치료제와 함께 동조 치료 프로토콜에서 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 동조 투여는 임의의 순서로 행해질 수 있고, 오직 1개의 활성 치료제 또는 둘 모두의 (또는 모든) 활성 치료제가 개별적으로 또는 총괄적으로 이들의 생물학적 활성을 발휘하는 기간이 있을 수 있다. 모든 이같은 동조 치료 방법의 특징적인 측면은 조성물 내에 존재하는 단일-가닥 RNAi 분자(들)이 약간의 유리한 임상 반응을 이끌어낸다는 것이고, 이는 제2 치료제가 제공하는 제2 임상 반응과 함께일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 본원에서 구상되는 바와 같은 제2 치료제와 단일-가닥 RNAi 분자의 동조 투여는 정제된 단일-가닥 RNAi 분자 및 제2 치료제 단독 중 하나 또는 둘 모두가 이끌어 내는 치료 반응 너머로 강화된 (예를 들어, 상승작용성) 치료 반응을 산출할 수 있다.
제약상 유효 용량은 질환 상태를 예방하거나, 그의 발생을 억제하거나 또는 치료 (증상을 어느 정도, 바람직하게는 모든 증상을 경감시킴)하는데 필요한 용량이다. 제약상 유효 용량은 질환의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 대상체의 유형, 치료가 고려되는 특정 대상체의 신체 특성 (예를 들어, 나이, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이), 동반 투약, 배설 속도, 약물 조합, 치료법을 받는 특정 질환의 중증도, 및 의학 업계의 당업자가 인지할 기타 요인에 좌우된다. 예를 들어, 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자의 효능에 따라 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 140 ㎎/kg 체중/일의 활성 성분인 양이 투여될 수 있다 (약 0.5 ㎎ 내지 약 7 g/환자/일). 단일 투여 형태가 생산되도록 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 변한다. 단위 투여 형태는 일반적으로 약 1 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 활성 성분을 함유한다.
단일-가닥 RNAi 분자를 포함하는 제제, 또는 하나 이상의 추가적인 성분, 예컨대 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 아주반트, 유화제, 완충제, 안정화제, 보존제 등을 더 포함하는 제제의 투여를 포함하여, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 핵산 분자가 세포 또는 생물에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 단일-가닥 RNAi 분자, 및/또는 폴리펩티드가 리포솜 내에 캡슐화되거나, 이온영동법에 의해 투여되거나, 또는 다른 비히클, 예컨대 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 생접착성 마이크로스피어, 또는 단백질성 벡터 내로 혼입된다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53722 참조). 별법적으로, 핵산/펩티드/비히클 조합물이 직접적인 주사에 의해 또는 주입 펌프를 사용하는 것에 의해 국소적으로 전달될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 분자의 직접적인 주사는, 피하이든, 근육내이든 또는 피내이든, 표준 바늘 및 주사기 방법을 사용하여, 또는 무침 기술, 예컨대 문헌 [Conroy et al., 1999, Clin. Cancer Res. 5:2330] 및 PCT 공개 번호 WO 99/31262에 기술된 것에 의해 일어날 수 있다.
표적 유전자 발현과 연관된 장애를 치료 또는 예방하는데 충분한 양의 단일-가닥 RNAi 분자가 있는 본 개시내용의 제제는, 예를 들어, 국소 (예를 들어, 크림, 연고, 피부 패치, 점안액, 점이액) 적용 또는 투여에 적절하다. 기타 투여 경로에는 경구, 비경구, 설하, 방광 세척, 질, 직장, 장, 좌제, 비강, 및 흡입이 포함된다. 본원에서 사용되는 경우에, "비경구"라는 용어는 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 복강내, 복막내, 관절내, 안내 또는 눈뒤, 이내, 경막내, 강내, 체강내, 척수내, 폐내 또는 경폐, 활액막내, 및 요도내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본 개시내용의 조성물은 당업계에 공지된 기타 화합물과 함께 또는 이러한 화합물 없이 경구 투여용 정제, 캡슐 또는 엘릭시르, 직장 투여용 좌제, 주사가능한 투여를 위한 멸균 용액 또는 현탁액으로서 제제화되어 사용될 수도 있다. 인간이 아닌 동물에게 투여하기 위해, 조성물을 동물 사료 또는 식수에 첨가할 수도 있다. 동물이 치료적으로 적합한 양의 조성물을 그의 식이와 함께 섭취하도록 동물 사료 및 식수 조성물을 제제화하는 것이 편리할 수 있다. 사료 또는 식수에 첨가하기 위한 프리믹스(premix)로서 조성물을 제시하는 것이 또한 편리할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자, 예컨대 단일-가닥 RNAi 분자를 전달하는 추가적인 방법이, 예를 들어, 문헌 [Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci 87:1308]; [Tyler et al., 1999, FEBS Lett. 421:2m]; [Pardridge et al., 1995, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:5592]; [Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev. 15:73]; [Aldrian-Herrada et al. 1998, Nucleic Acids Res. 26:4910]; [Tyler et al., 1999, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:7053]; [Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio. 2:139]; ["Delivery Strategies for Guide Oligonucleotide Therapeutics", ed. Akhtar, 1995], [Maurer et al., 1999 Mol. Membr. Biol. 16:129]; [Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser. 752:184]에 기술되어 있다. 생체내 및 치료 용도에 더하여, 당업자는 본 개시내용의 단일-가닥 RNAi 분자가 광범위한 시험관내 용도에서, 예컨대 과학 및 상업적 연구 (예를 들어, 생리학적 경로의 해명, 약물 발견 및 개발), 및 의학 및 수의학 진단법에서 유용하다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 미국 특허, 미국 특허 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원, 비-특허 간행물, 도면, 및 웹사이트는 명백하게 전문이 본원에 참고로 포함된다.
표 1은 특정한 내인성 인간 miRNA 서열들을 열거하고, 여기서 확증 또는 추정된 시드 서열이 대문자로 표시된다. 표 1의 모든 miRNA 서열은 5' → 3' 방향으로 제시된다. 기타 본 발명의 miRNA 서열들을 miRBase 데이터베이스에서 확인할 수 있고, 그의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 1
단일 가닥 miR-124 유사체에 의한 VAMP3 발현의 억제
RT - qPCR 검정 - HCT-116 세포를 10％ 소 태아 혈청 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 맥코이(McCoy) 5A 배지 (미디어테크 인크.(Mediatech Inc.))에서 배양하였다. 이러한 세포들을 형질감염 24시간 전에 6000개의 세포/웰의 밀도로 96웰 배양 플레이트에 플레이팅하였다.
도 1 및 2의 데이터에 대해서는 10 nM, 도 3의 데이터에 대해서는 12-포인트 적정 곡선을 따라 30 nM에서 0.01 nM로 하향되는 범위인 최종 miRNA 농도로 옵티-MEM I 감소형 혈청 배지(Opti-MEM I Reduced Serum Media) (깁코(Gibco)) 및 리포펙타민(Lipofectamine) RNAiMax (인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 형질감염을 수행하였다.
형질감염 24시간 후, 세포를 포스페이트-완충 염수로 세척하고, 택맨® 유전자 발현 세포-대-CT™ 키트(TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ Kit) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)/앰비온(Ambion))를 사용하여 프로세싱하여, RNA를 추출하고, cDNA를 합성하고, ABI 프리즘 7900HT 서열 검출기(ABI Prism 7900HT Sequence Detector) 상에서 VAMP3-특이적 프로브 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다.
역전사 조건은 하기와 같았다: 37℃에서 60분, 이어서 95℃에서 5분. RT-qPCR 조건은 하기와 같았다: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 이어서, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 사이클 40회. GUSB mRNA 수준을 데이터 표준화에 사용하였다. 비-표적화 대조군-처리 세포에서 측정된 VAMP3 cDNA에 비교하여 실험적으로 처리된 세포에서 측정된 VAMP3 cDNA에서의 2배 변화로서 VAMP3 녹다운을 계산하였다.
리포터 검정 - HCT-116 세포를 10％ 소 태아 혈청 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 맥코이 5A 배지 (미디어테크 인크.)에서 배양하였다. 이러한 세포들을 형질감염 24시간 전에 25,000개의 세포/웰의 밀도로 96웰 배양 플레이트에 플레이팅하였다.
도 4 및 5의 데이터에 대해서는 10 nM, 도 6의 데이터에 대해서는 6-포인트 적정 곡선을 따라 30 nM에서 0.01 nM로 하향되는 범위인 최종 miRNA 농도로 옵티-MEM I 감소형 혈청 배지 (깁코) 및 리포펙타민 2000 (인비트로젠)을 사용하여 형질감염을 수행하였다. miR-124에 대한 시드 매치 (2x; 도 6a) 또는 miR-124에 대한 전장 매치 (2xFL; 도 6b)의 직렬식 반복물로 이루어지는 클로닝된 표적 삽입물을 함유하는 siCHECK2 벡터 (진스크립트(Genscript))와 miRNA를 공동-형질감염시켰다.
형질감염 24시간 후, 형질감염 배지를 신선한 성장 배지로 교체하였다. 형질감염 48시간 후, 세포를 용해시키고, 반딧불이- 및 레닐라(Renilla)-루시퍼라제 활성 둘 모두를 왈락 인비전 2103 멀티레이블 리더(Wallac EnVision 2103 Multilabel Reader) (퍼킨엘머(PerkinElmer)) 상에서 듀얼-글로™ 루시퍼라제 검정 시스템 (Dual-Glo™ Luciferase Assay System) (프로메가(Promega))를 사용하여 측정하였다. 반딧불이-루시퍼라제 활성을 사용하여 레닐라-루시퍼라제 활성을 표준화하였고, 비-표적화 대조군-처리 세포와 비교하여 실험적으로 처리된 세포에서의 레닐라-루시퍼라제 신호의 2배 변화로서 최종 데이터를 계산하였다.
올리고뉴클레오티드 합성 - 상업적으로 입수가능한 포스포르아미다이트를 사용하여 당업계에 주지된 프로토콜 (고체상 합성)을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, 역상 고체상 추출 (SPE)에 의해 정제하였다. 켐진스(ChemGenes)로부터 C3 (C33H43N2O5P) 및 C6 (C36H49N2O5P) 포스포르아미다이트를 구입하였다.
간략하게, 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같은 절차를 사용하여 (예를 들어, 미국 20090176725로 공개된 미국 출원 번호 12/064,014 참조), 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 자동 고체상 합성기 상에서 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성하였다. 합성 칼럼에 제1 뉴클레오시드 잔기 (천연 잔기 또는 화학적으로 변형된 잔기)로 유도체화된 고체 지지체를 충전하였다. 산 불안정성 5'-O-디메톡시트리틸 기의 탈트리틸화로 5'-히드록실이 방출되는 것에 의해 합성이 개시되었다. 아세토니트릴 내의 적절한 활성화제 및 적절하게 보호된 포스포르아미다이트를 동시에 합성 칼럼에 전달하여, 아미다이트를 5'-히드록실에 커플링시켰다. 그 후, 칼럼을 용매, 예컨대 아세토니트릴로 세척하였다. 산화 용액, 예컨대 아이오딘 용액을 컬럼을 통과하도록 펌핑하여, 포스파이트 트리에스테르 연결 P(III)을 그의 포스포트리에스테르 P(V) 유사체로 산화시켰다. 2,6-루티딘 및 N-메틸이미다졸의 존재 하에 아세트산 무수물과 같은 시약을 사용하여 미반응 5'-히드록실 기를 캡핑(capping)하였다. 다음 포스포르아미다이트 혼입을 위한 탈트리틸화 단계로 신장 사이클을 재개하였다. 원하는 서열이 합성될 때까지 이러한 프로세스를 반복하였다. 최종 5'-말단 보호기 (트리틸 또는 5'-O-디메톡시트리틸)로 합성이 종결되었다.
합성 완료 시, 고체 지지체 및 회합된 올리고뉴클레오티드를 아르곤 압력 또는 진공 하에 건조시켰다. 수성 염기를 첨가하고, 혼합물을 가열하여 숙시닐 연결의 절단, 시아노에틸 포스페이트 보호기의 제거 및 고리바깥쪽의 아민 보호의 탈보호를 일으켰다.
하기의 프로세스를 리보뉴클레오티드를 함유하지 않는 단일 가닥 상에서 수행하였다. 고체 지지체를 수성 염기로 처리한 후, 혼합물을 여과하여, 고체 지지체를 탈보호된 조 합성 물질로부터 분리하였다. 그 후, 고체 지지체를 DMSO로 헹구고, 이를 여과물과 합쳤다. 생성된 염기성 용액은 5' 말단 위치 상에 남아 있도록 5'-O-디메톡시트리틸 기의 유지를 허용한다 (트리틸-온(on)).
리보뉴클레오티드를 함유하는 단일 가닥에 대해, 하기의 프로세스를 수행하였다. 고체 지지체를 수성 염기로 처리한 후, 혼합물을 여과하여, 고체 지지체를 탈보호된 조 합성 물질로부터 분리하였다. 그 후, 고체 지지체를 디메틸술폭시드 (DMSO)로 헹구고, 이를 여과물과 합쳤다. 플루오라이드 시약, 예컨대 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 혼합물에 첨가하고, 용액을 가열하였다. 적절한 완충제로 반응을 켄칭(quenching)하여, 최종 5' 말단 위치에 5'-O-디메톡시트리틸 기가 있는 조 단일 가닥의 용액을 제공하였다.
각각의 조 단일 가닥의 트리틸-온 용액을 크로마토그래피 정제, 예컨대 SPE RPC 정제를 사용하여 정제하였다. 트리틸 기의 소수성 성질은 원하는 전장 올리고가 트리틸화되지 않은 말단절단된 실패 서열보다 더 강하게 유지되게 한다. 실패 서열을 적절한 용매, 예컨대 낮은 백분율의 아세토니트릴로 수지로부터 선적으로 세척하였다. 그 후, 유지된 올리고뉴클레오티드를 트리플루오로아세트산로 칼럼 상에서 탈트리틸화시켜, 산 불안정성 트리틸 기를 제거하였다. 잔류 산을 칼럼으로부터 세척하고, 염 교환을 수행하고, 물질의 최종 탈염을 시작하였다. 수성-유기 용매로 전장 올리고를 정제된 형태로 회수하였다. 그 후, 최종 생성물을 순도 (HPLC), 신원 (말디(Maldi)-TOF MS), 및 수율 (UV A260)에 대해 분석하였다. 올리고들을 동결건조 또는 진공 응축을 통해 건조시켰다.
결과 - 가닥을 따라 있는 다양한 위치에서 1개의 뉴클레오티드를 치환하는 C3 스페이서 또는 2개의 뉴클레오티드를 치환하는 C6 스페이서를 포함하는 단일-가닥 miR-124 유사체가 공지된 표적인 VAMP3의 발현을 억제하는 능력을 시험하였다.
이러한 연구에서 사용된 miR-124의 패신저 가닥 서열은 5'-GCAUUCACCGCGUGCCUUAAAU-3' (서열 1091)이고, 가이드 가닥 서열은 5'-UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA-3' (서열 1092)이다. 시험된 miR-124 유사체, 뿐만 아니라 대조군 분자가 표 2 및 하기에서 기술된다.
Figure pct00028
Figure pct00029
표 2의 모든 단일-가닥 분자는 5' 포스페이트 캡을 함유한다.
"G/P"는 이중 가닥 miR-124를 나타내고, 이때 이러한 이중체는 패신저 및 가이드 가닥의 3' 끝부분 상에 2개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. G/P 이중체의 가이드 가닥의 길이는 뉴클레오티드 22개이다.
서열 1093-1124는 단일-가닥 miR-124 가이드 가닥의 유사체를 나타낸다. 각각의 이러한 분자는 22-뉴클레오티드 G/P miR-124 가이드 가닥 내에 존재하는 5'-우라실 뉴클레오티드가 없는, G/P 이중체 내에 존재하는 miR-124 가이드 가닥의 21-뉴클레오티드 버젼이다. 3' 아데노신 및 인접한 시토신 (존재하는 경우)을 제외한 이러한 21량체 유사체 내의 모든 뉴클레오티드가 리보스 모이어티 상에서 2'-플루오로로 화학적으로 변형된다 (표 2에서 이탤릭체 뉴클레오티드로 도시됨). 3' 아데노신 및 인접한 시토신 (존재하는 경우)은 리보스 모이어티 상에서 2'-O-메틸로 화학적으로 변형된다 (표 2에서 밑줄친 뉴클레오티드로 도시됨). 마지막으로, miR-124 가이드 가닥의 21량체 유사체는 가닥을 따라 있는 다양한 표시된 위치에서 1개의 뉴클레오티드를 치환하는 C3-스페이서 ("c3스페이서" 유사체) 또는 2개의 뉴클레오티드를 치환하는 C6-스페이서 ("c6스페이서del2" 유사체)를 함유한다. 예를 들어 "21-8p-c3스페이서-20"은 21-뉴클레오티드 miR-124 가이드 가닥 내의 위치 20에서의 뉴클레오티드 대신에 위치 19 및 위치 21의 뉴클레오티드들을 연결하는 에틸렌 글리콜 스페이서를 함유하는 21량체 miR-124 가이드 가닥 유사체를 나타낸다. 또 다른 예로서, "21-8p-c6스페이서del2-19"로 표지된 유사체는 21-뉴클레오티드 miR-124 가이드 가닥 내의 위치 19 및 20에서의 뉴클레오티드들 대신에 위치 18 및 21의 뉴클레오티드들을 연결하는 헥산 스페이서를 함유하는 21량체 miR-124 가이드 가닥 유사체를 나타낸다. 21-뉴클레오티드 miR-124 가이드 가닥 유사체들 중 일부는 표 2에 언급된 바와 같이 첨부 도면들에서 명칭이 상이하다. 예를 들어, 서열 1116으로 표시되는 21량체 miR-124 가이드 가닥 유사체는 도 1 및 3에서는 "21-8p-c6스페이서del2-15"로, 도 2에서는 "c6del2pos15스페이서"로 칭해진다.
"UC3"은 화학적으로 변형된 비-표적화 이중체를 나타낸다.
"124(21)-8p-16rrr"은 miR-124 가이드 가닥의 21-뉴클레오티드 버전의 유사체를 나타낸다. 이러한 분자는 내부의 스페이서를 함유하지 않는다. RNA인 뉴클레오티드 16-18 및 2'-O-메틸로 변형된 뉴클레오티드 21 및 22를 제외하고는, 모든 뉴클레오티드가 2'-플루오로로 변형된다.
"124(21)-8p"는 뉴클레오티드 1-20이 2'-플루오로로 변형되고 뉴클레오티드 20 및 21이 2'-O-메틸로 변형된, miR-124 가이드의 21-뉴클레오티드 버젼을 나타낸다. "124(21)-8p"는 도 1에서의 이러한 유사체의 명칭이고, "G-올 플루오로"는 도 2에서의 이러한 유사체의 명칭이며, "pG-플루오로"는 도 4에서의 이러한 유사체의 명칭이다.
"miR-124"는 G/P 이중체의 단일-가닥 가이드 가닥이다. 이는 뉴클레오티드 22개의 길이이고, 변형되지 않은 것이다.
"C6delpos15스페이서/P"는 가이드 가닥이 "21-8p-c6스페이서del2-15" (서열 1116)의 구조이고 패신저 가닥이 22-뉴클레오티드 miR-124 패신저 가닥 (서열 1091)인 이중-가닥 miR-124 이중체이다.
도 1 및 2는 상기 기술된 RT-qPCR 검정을 사용하여 표 2에 기술된 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 VAMP3 표적 발현의 억제 정도를 나타낸다. 도 1은 C3 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 억제 정도를 나타낸다. 도 2는 C6 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 억제 정도를 나타낸다. 각각의 도면에서의 더 긴 막대는 VAMP3의 더 큰 녹다운을 가리킨다. 이중 막대는 지시된 핵산 분자로 형질감염된 세포들의 별개의 웰 (2개의 별개의 플레이트 상에 있음)로부터의 데이터를 각각 나타내는 생물학적 복제물들을 가리킨다. 스페이서는 miR-124 유사체의 위치 19에서, 그리고 그의 위치 15 근방에서 가장 잘 허용되는 것으로 보인다.
도 3의 그래프는 도 1 및 2에서 시험된 유사체들 (서열에 대해 표 2 참조)의 부분집합에 대한 VAMP3 발현의 용량-의존적 반응을 도시한다. VAMP3 발현이 y축을 따라 도시되고, 따라서 이러한 축을 따라 있는 더 낮은 값의 데이터 포인트는 더 큰 VAMP3 발현 녹다운을 가리킨다. 왼쪽의 최저 용량 내지 오른쪽의 최고 용량의 범위로, 시험된 miR-124 유사체의 용량이 x축을 따라 도시된다. 이중 가닥 버전 (G/P 및 c6del2pos15스페이서/P)이 단일-가닥 유사체보다 더 강력하지만, 단일-가닥 "G-올 플루오로" 유사체 (내부의 스페이서가 없고, 뉴클레오티드 1-20이 2'-플루오로이고, 뉴클레오티드 20 및 21이 2'-O-메틸임)가 위치 15 (c3pos15스페이서) 또는 위치 19 (c3pos19스페이서)를 교체하는 C3 스페이서를 갖는 필적하는 단일-가닥 유사체와 거의 동일하게 거동한다는 것을 주목할 가치가 있다.
도 4 및 5는 miR-124의 시드 영역에 매칭되는 2개의 표적 부위를 보유하는 공동-형질감염된 루시퍼라제 리포터의 녹다운을 측정하는, 도 1 및 2에서 시험된 동일한 단일-가닥 miR-124 유사체들의 스크린으로부터의 데이터를 나타낸다. 따라서, 이러한 검정으로부터의 데이터는 시험된 유사체의 miRNA 활성을 나타낸다. 도 4는 C3 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 억제 정도를 나타낸다. 도 5는 C6 스페이서를 함유하는 단일-가닥 miR-124 유사체에 의한 억제 정도를 나타낸다. 이중 막대는 지시된 분자로 형질감염된 세포들의 별개의 웰 (2개의 별개의 플레이트 상에 있음)로부터의 데이터를 각각 나타내는 생물학적 복제물들을 가리킨다. 또 다시, 더 긴 막대가 더 큰 억제를 가리켜서, 위치 19에서, 또는 위치 15 근방에서 스페이서를 함유하는 유사체가 녹다운 활성이 가장 크다는 것을 나타낸다.
도 6의 그래프들은 도 3에서 시험된 유사체들의 부분집합에 대한 2개의 상이한 루시퍼라제 리포터의 표적 발현 억제의 용량-의존적 반응을 나타낸다. 도 6a에서, 제시된 억제 활성은 miR-124 시드 영역에 대한 2개의 매치가 있는 루시퍼라제 리포터에 대한 것이다. 따라서, 이는 시험된 유사체의 miRNA 활성을 나타낸다. 도 6b에서, 제시된 억제 활성은 miR-124에 대한 2개의 전장 매치가 있는 루시퍼라제 리포터에 대한 것이고, 따라서 시험된 유사체의 siRNA 활성을 나타낸다. A 및 B 둘 모두에서, G/P 곡선은 전적으로 RNA로 이루어진 miR-124 이중체에 의한 활성을 나타낸다. pG-플루오로/P쇼트 곡선은 올-RNA(all-RNA) 패신저 가닥과 이중체를 이룬 2'-플루오로 뉴클레오티드로 주로 변형된 가이드 가닥에 의한 활성을 나타낸다. pG-플루오로 곡선은 2'-플루오로 뉴클레오티드로 주로 변형된 단일-가닥 miR-124 가이드 가닥 유사체의 활성을 나타낸다. c3pos14 및 c3pos19 곡선은 위치 14 ("c3pos14") 또는 위치 19 ("c3pos19")를 치환하는 3-탄소 스페이서 (C3-스페이서)를 함유하는 것에 의해서만 pG-플루오로와 상이한 pG-플루오로의 유사체의 활성을 나타낸다. 모든 단일-가닥 유사체가 시드 매치만 있는 리포터에 대해 어느 한쪽 이중체보다 낮은 효능을 나타내지만, 이들은 모든 농도에 걸쳐 서로에 대해 효과적으로 등가이고, 최고 농도에서 이중체와 유사한 활성을 나타낸다 (도 6a). 전장 매치가 있는 리포터에 대해, 올-RNA 이중체 ("G/P")가 여전히 가장 강력한 수행자였지만, 스페이서를 함유하는 단일-가닥 유사체의 활성이 2'-플루오로 가이드 가닥이 있는 이중체 ("pG-플루오로/P쇼트") 및 단일-가닥 ("pG-플루오로")만큼 또는 이보다 더 강했다.
실시예 2
ApoB mRNA의 단일-가닥 RNAi 녹다운
RT - qPCR 검정 (1차 스크린 및 용량-반응 곡선) - Hepa1-6 세포를 10％ 소 태아 혈청, 1％ 페니실린-스트렙토마이신 및 1％ 중탄산나트륨이 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 배양하였다. 이러한 세포들을 형질감염 24시간 전에 3000개의 세포/웰의 밀도로 96웰 배양 플레이트에 플레이팅하였다.
옵티-MEM I 감소형 혈청 배지 및 리포펙타민 RNAiMAX를 제조사의 지침에 따라 사용하여 형질감염을 수행하였다. 최종 단일-가닥 siRNA 농도는 100 nM 및 10 nM였다.
형질감염 24시간 후, 세포를 포스페이트-완충 염수로 세척하고, 택맨 유전자 발현 세포-대-CT™ 키트를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 프로세싱하여, RNA를 추출하고, cDNA를 합성하고, ABI 프리즘 7900HT 서열 검출기 상에서 ApoB-특이적 택맨 프라이머/프로브 세트를 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다.
역전사 조건은 하기와 같았다: 37℃에서 60분, 이어서 95℃에서 5분. RT-qPCR 조건은 하기와 같았다: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 이어서, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 사이클 40회. GADPH mRNA 수준을 데이터 표준화에 사용하였다.
비-표적화 대조군-처리 세포에서 측정된 ApoB cDNA에 비교하여 실험적으로 처리된 세포에서 측정된 ApoB cDNA에서의 2배 변화로서 ApoB 녹다운을 계산하였다.
결과 - 2가지 상이한 농도 (100 nM 및 10 nM)에서 C3 스페이서가 위치 15, 16, 17, 18, 또는 19 (올리고의 5'에 관련된 위치)에서 혼입된 단일 가닥 (가이드 가닥) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 ApoB mRNA 녹다운을 측정하였다. 결과가 도 7에서 제시된다. 시험된 단일 가닥 분자 모두가 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오티드 둘 모두에서의 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드 및 5' 포스페이트로 구성된다. 각각의 분자의 2개의 3' 말단 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다. 단일 가닥 분자 "485" (도 7 참조; 5'-UUAAGAGAAGCCUUACUGGUU-3' (서열 1135))는 C3 스페이서를 함유하지 않는 21-뉴클레오티드 분자이고, 뉴클레오티드 위치 485에서 ApoB mRNA를 표적으로 한다. 위치 15 ("485 c3@pos15"; 서열 1136), 16 ("485 c3@pos16"; 서열 1137), 17 ("485 c3@pos17"; 서열 1138), 18 ("485 c3@pos18"; 서열 1139) 또는 19 ("485 c3@pos19"; 서열 1140)에서 분자 485 내로 C3 스페이서가 혼입된다 (즉, 스페이서가 485 분자의 지시된 뉴클레오티드를 대신한다). 예를 들어, 신호 가닥 분자 "485 c3@pos15"는 5'-UUAAGAGAAGCCUU(C3-스페이서)CUGGUU-3'; 서열 1136)으로 표현된다. 도 7에 제시된 바와 같이, 위치 18 또는 19에서 C3 스페이서를 포함하는 것은 둘 모두 2가지 상이한 농도 (100 nM 및 10 nM)에서 잘 허용되고 mRNA 녹다운을 개선한다. 이러한 데이터는 단일 가닥 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드의 3' 끝부분에서의 비-뉴클레오티드 C3 탄소 스페이서의 혼입이 mRNA 녹다운의 효능을 개선한다는 것을 가리킨다 (도 7).
단일 가닥 내의 C3 스페이서의 혼입이 더욱 광범위하게 적용가능한지 여부를 평가하기 위해, 각각 위치 18 (도 8) 또는 위치 19 (도 9)에 C3 스페이서가 있는, ApoB를 표적으로 하는 30개의 상이한 단일 가닥 서열을 2가지 농도 (100 nM 및 10 nM)에서 평가하였다. 도 8 및 9에서, 단일-가닥 분자는 이들이 표적으로 하는 ApoB mRNA 내의 위치로 기록된다. 시험된 단일-가닥 분자 모두가 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오티드 둘 모두에서의 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드 및 5' 포스페이트로 구성된다. 각각의 분자의 2개의 3' 말단 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다. 도 8 및 9에서 평가된 단일 가닥 RNAi 분자들의 서열 식별물 (서열 번호)이 표 3에서 열거된다.
Figure pct00030
도 8 및 9에서, C3 스페이서가 없는 상응하는 단일-가닥 분자에 대해 데이터를 표준화하였다. 단일-가닥 대조군 (C3 스페이서가 없음)과 등가인 녹다운 양이 0에서 중앙에 있는 한편, 양성 값은 C3 스페이서의 혼입이 mRNA 녹다운에서의 개선을 부여한다는 것을 가리킨다. 음성 값은 C3 스페이서를 포함하는 것의 해로운 효과를 가리킨다. 시험관내 검정으로의 실험 변동으로 인해, +0.5를 초과하거나 -0.5 미만인 값만 유의한 것으로 간주된다는 것을 주지한다. 예를 들어, 도 8에서 제시된 녹다운에서의 차이가 0.5 미만이기 때문에, 위치 18에서 ApoB 분자 485 내에 C3 스페이서가 포함되는 것은 단일 가닥 대조군에 비해 유의한 개선이 없다. 그러나, 위치 19에서 동일한 단일 가닥 가이드 분자 내에 C3 스페이서가 포함되는 것은 녹다운에서의 유의한 개선이 있다 (도 9 참조). 전체적으로, 위치 19에서 C3 스페이서가 포함되는 것이 선호되는데, 이는 이러한 위치에서의 혼입이 시험된 30개의 상이한 서열 중 대다수 (73％)에 대해 mRNA 녹다운의 효능을 개선하는 것 같기 때문이다.
도 10에서, 도 8 및 9에서 시험된 30개의 상이한 ApoB 표적 부위 각각을 표적으로 하는 단일 가닥 분자들을 사용하여 100 nM 농도에서의 ApoB mRNA 녹다운을 비교하였다 - C3 스페이서가 없는 단일 가닥 ("올-플루-p"), 위치 18에 C3 스페이서가 있는 단일 가닥 ("올-플루-c3-18-p"), 및 위치 19에 C3 스페이서가 있는 단일 가닥 ("올-플루-c3-19-p"). 시험된 단일 가닥 분자 모두가 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오티드 둘 모두에서의 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드 및 5' 포스페이트로 구성된다. 각각의 분자의 2개의 3' 말단 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다. 도 10에서 평가된 단일 가닥 RNAi 분자들의 서열 식별물 (서열 번호)이 표 3에서 열거된다. 도 10은 상이한 단일 가닥 분자들에 대한 전체적인 mRNA 녹다운 효능에서의 범위를 나타낸다. 예를 들어, ApoB 표적 부위 485를 표적으로 하는 단일 가닥 분자가 최대로 효과적인 한편, ApoB 표적 부위 780 또는 10219를 표적으로 하는 것들과 같은 다른 것들은 mRNA 녹다운이 제한된다. 30개의 상이한 서열들 각각에 대해, 도 10에 제시된 mRNA 녹다운은 C3 스페이서를 함유하지 않는 상응하는 가닥 ("올-플루-p")에 대해 표준화되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Merck Sharp & Dohme, Corp. Lim, Lee Chorn, Guillaume Willingham, Aarron Zhao, Lihong <120> Single-Stranded RNAi Agents Containing an Internal, Non-Nucleic Acid Spacer <130> SIR-MIS-00133 <150> 61/376,471 <151> 2010-08-24 <160> 1227 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 cuauacaauc uacugucuuu c 21 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 cuguacagcc uccuagcuuu cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 ugagguagua gguugugugg uu 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 cuauacaacc uacugccuuc cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 uagaguuaca cccugggagu ua 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 agagguagua gguugcauag uu 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 cuauacgacc ugcugccuuu cu 22 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 cuauacggcc uccuagcuuu cc 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 cuauacaauc uauugccuuc cc 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 cuauacaguc uacugucuuu cc 22 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 caggccauau ugugcugccu ca 22 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ccaguauuaa cugugcugcu ga 22 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 acugcaguga aggcacuugu ag 22 <210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 uaaggugcau cuagugcaga uag 23 <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 acugcccuaa gugcuccuuc ugg 23 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 aguuuugcau aguugcacua ca 22 <210> 24 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23 <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 aguuuugcag guuugcaucc agc 23 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 aguuuugcag guuugcauuu ca 22 <210> 28 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 29 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 acugcauuau gagcacuuaa ag 22 <210> 30 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 caacaccagu cgaugggcug u 21 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 aguucuucag uggcaagcuu ua 22 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 gggguuccug gggaugggau uu 22 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 aucacauugc cagggauuuc c 21 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 ugccuacuga gcugauauca gu 22 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 uggcucaguu cagcaggaac ag 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 ugccuacuga gcugaaacac ag 22 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 aggcggagac uugggcaauu g 21 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 cauugcacuu gucucggucu ga 22 <210> 41 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 uucaaguaau ccaggauagg cu 22 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 ccuauucuug guuacuugca cg 22 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 uucaaguaau ucaggauagg u 21 <210> 44 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 ccuguucucc auuacuuggc uc 22 <210> 45 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 agggcuuagc ugcuugugag ca 22 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 uucacagugg cuaaguuccg c 21 <210> 47 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 aaggagcuca cagucuauug ag 22 <210> 48 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 cacuagauug ugagcuccug ga 22 <210> 49 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 acugauuucu uuugguguuc ag 22 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 52 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 cuuucagucg gauguuugca gc 22 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 aggcaagaug cuggcauagc u 21 <210> 54 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 ugcuaugcca acauauugcc au 22 <210> 55 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 uauugcacau uacuaaguug ca 22 <210> 56 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 caauuuagug ugugugauau uu 22 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 gugcauugua guugcauugc a 21 <210> 58 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 caauguuucc acagugcauc ac 22 <210> 59 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 59 agguugggau cgguugcaau gcu 23 <210> 60 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 60 uauugcacuu gucccggccu gu 22 <210> 61 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 ggguggggau uuguugcauu ac 22 <210> 62 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 63 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 acugcugagc uagcacuucc cg 22 <210> 64 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 uucaacgggu auuuauugag ca 22 <210> 65 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23 <210> 66 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 aaucaugugc agugccaaua ug 22 <210> 67 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 ugagguagua aguuguauug uu 22 <210> 68 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 aacccguaga uccgaucuug ug 22 <210> 69 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 caagcucgcu ucuauggguc ug 22 <210> 70 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 71 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 71 caagcuugua ucuauaggua ug 22 <210> 72 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 72 caguuaucac agugcugaug cu 22 <210> 73 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 73 uacaguacug ugauaacuga a 21 <210> 74 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 74 gcugguuuca uauggugguu uaga 24 <210> 75 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 75 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23 <210> 76 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 76 cugguuucac augguggcuu ag 22 <210> 77 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 77 agcuucuuua cagugcugcc uug 23 <210> 78 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 78 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 79 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 79 ucaaaugcuc agacuccugu ggu 23 <210> 80 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 80 acggauguuu gagcaugugc ua 22 <210> 81 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 81 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 82 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 82 cugcaaugua agcacuucuu ac 22 <210> 83 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 agcagcauug uacagggcua uca 23 <210> 84 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 ccaauauuac ugugcugcuu ua 22 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 86 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 cugccaauuc cauaggucac ag 22 <210> 87 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 87 uagguaguuu cauguuguug gg 22 <210> 88 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 uucaccaccu ucuccaccca gc 22 <210> 89 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 gguccagagg ggagauaggu uc 22 <210> 90 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 91 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 acaguagucu gcacauuggu ua 22 <210> 92 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 auaagacgag caaaaagcuu gu 22 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 cuuuuugcgg ucugggcuug c 21 <210> 94 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 aagcccuuac cccaaaaagu au 22 <210> 95 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 95 aaaguucuga gacacuccga cu 22 <210> 96 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 ucagugcacu acagaacuuu gu 22 <210> 97 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 98 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 cugggagaag gcuguuuacu cu 22 <210> 99 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 99 uguaaacauc cccgacugga ag 22 <210> 100 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 100 cuuucaguca gauguuugcu gc 22 <210> 101 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 101 ucuacagugc acgugucucc ag 22 <210> 102 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 102 ggagacgcgg cccuguugga gu 22 <210> 103 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 103 guguguggaa augcuucugc 20 <210> 104 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 104 uggaagacua gugauuuugu ugu 23 <210> 105 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 105 caacaaauca cagucugcca ua 22 <210> 106 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 106 caacaaaucc cagucuaccu aa 22 <210> 107 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 107 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 108 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 108 caaauucgua ucuaggggaa ua 22 <210> 109 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 109 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 110 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 110 acagauucga uucuagggga au 22 <210> 111 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 111 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 112 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 112 caaucagcaa guauacugcc cu 22 <210> 113 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 113 aacauucaac gcugucggug agu 23 <210> 114 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 114 accacugacc guugacugua cc 22 <210> 115 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 115 aacauucauu gcugucggug ggu 23 <210> 116 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 116 aacauucaac cugucgguga gu 22 <210> 117 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 117 aaccaucgac cguugagugg ac 22 <210> 118 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 118 uuuggcaaug guagaacuca cacu 24 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 119 ugguucuaga cuugccaacu a 21 <210> 120 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 120 uauggcacug guagaauuca cu 22 <210> 121 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 121 gugaauuacc gaagggccau aa 22 <210> 122 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 122 ggcuacaaca caggacccgg gc 22 <210> 123 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 123 ucgugucuug uguugcagcc gg 22 <210> 124 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 124 cggcaacaag aaacugccug ag 22 <210> 125 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 125 cccaguguuu agacuaucug uuc 23 <210> 126 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 126 gugaaauguu uaggaccacu ag 22 <210> 127 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 127 uucccuuugu cauccuaugc cu 22 <210> 128 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 128 uccuucauuc caccggaguc ug 22 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 129 gauuucagug gagugaaguu c 21 <210> 130 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 130 cugugcgugu gacagcggcu ga 22 <210> 131 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 131 uucccuuugu cauccuucgc cu 22 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 132 uaacagucuc cagucacggc c 21 <210> 133 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 133 accaucgacc guugauugua cc 22 <210> 134 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 134 ugccugucua cacuugcugu gc 22 <210> 135 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 135 acagcaggca cagacaggca gu 22 <210> 136 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 136 augaccuaug aauugacaga c 21 <210> 137 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 137 uaaucucagc uggcaacugu ga 22 <210> 138 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 138 uacugcauca ggaacugauu gga 23 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 139 uugugcuuga ucuaaccaug u 21 <210> 140 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 140 augguuccgu caagcaccau gg 22 <210> 141 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 141 caugguucug ucaagcaccg cg 22 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 142 ugauugucca aacgcaauuc u 21 <210> 143 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 143 agaguugagu cuggacgucc cg 22 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 144 ccacaccgua ucugacacuu u 21 <210> 145 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 145 accuggcaua caauguagau uu 22 <210> 146 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 146 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 147 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 147 cucaguagcc aguguagauc cu 22 <210> 148 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 148 agcuacaucu ggcuacuggg u 21 <210> 149 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 149 cguguauuug acaagcugag uu 22 <210> 150 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 150 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 151 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 151 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 152 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 152 aaaauggugc ccuagugacu aca 23 <210> 153 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 153 caucuuacug ggcagcauug ga 22 <210> 154 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 154 uaauacugcc ugguaaugau ga 22 <210> 155 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 155 ugagguagua guuuguacag uu 22 <210> 156 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 156 cuguacaggc cacugccuug c 21 <210> 157 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 157 ugagguagua guuugugcug uu 22 <210> 158 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 158 cugcgcaagc uacugccuug cu 22 <210> 159 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 159 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 160 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 160 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 161 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 161 cgaaucauua uuugcugcuc ua 22 <210> 162 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 162 uggguuccug gcaugcugau uu 22 <210> 163 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 163 aucacauugc cagggauuac c 21 <210> 164 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 164 agagcuuagc ugauugguga ac 22 <210> 165 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 165 uucacagugg cuaaguucug c 21 <210> 166 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 166 uguaaacauc cuacacucag cu 22 <210> 167 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 167 cugggaggug gauguuuacu uc 22 <210> 168 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 168 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 169 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 169 aacgccauua ucacacuaaa ua 22 <210> 170 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 170 cguguucaca gcggaccuug au 22 <210> 171 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 171 uaaggcacgc ggugaaugcc 20 <210> 172 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 172 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 173 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 173 acggguuagg cucuugggag cu 22 <210> 174 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 174 ucacagugaa ccggucucuu u 21 <210> 175 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 175 uucacauugu gcuacugucu gc 22 <210> 176 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 176 cagugcaaug uuaaaagggc au 22 <210> 177 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 177 accguggcuu ucgauuguua cu 22 <210> 178 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 178 uaacagucua cagccauggu cg 22 <210> 179 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 179 uuuggucccc uucaaccagc ug 22 <210> 180 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 180 uauggcuuuu uauuccuaug uga 23 <210> 181 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 181 uauagggauu ggagccgugg cg 22 <210> 182 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 182 uuauugcuua agaauacgcg uag 23 <210> 183 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 183 agcugguguu gugaaucagg ccg 23 <210> 184 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 184 gcuauuucac gacaccaggg uu 22 <210> 185 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 185 cagugguuuu acccuauggu ag 22 <210> 186 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 186 uaccacaggg uagaaccacg g 21 <210> 187 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 187 caucuuccag uacaguguug ga 22 <210> 188 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 188 uaacacuguc ugguaaagau gg 22 <210> 189 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 189 cauaaaguag aaagcacuac u 21 <210> 190 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 190 uguaguguuu ccuacuuuau gga 23 <210> 191 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 191 ggugcagugc ugcaucucug gu 22 <210> 192 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 192 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 193 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 193 ggauaucauc auauacugua ag 22 <210> 194 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 194 uacaguauag augauguacu 20 <210> 195 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 195 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23 <210> 196 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 196 ggauuccugg aaauacuguu cu 22 <210> 197 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 197 ucagugcaug acagaacuug g 21 <210> 198 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 198 uugcauaguc acaaaaguga uc 22 <210> 199 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 199 caacggaauc ccaaaagcag cug 23 <210> 200 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 200 gcugcgcuug gauuucgucc cc 22 <210> 201 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 201 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 202 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 202 auaaagcuag auaaccgaaa gu 22 <210> 203 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 203 ucccugagac ccuuuaaccu guga 24 <210> 204 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 204 acaggugagg uucuugggag cc 22 <210> 205 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 205 ucacaaguca ggcucuuggg ac 22 <210> 206 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 206 cauuauuacu uuugguacgc g 21 <210> 207 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 207 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 208 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 208 cugaagcuca gagggcucug au 22 <210> 209 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 209 ucggauccgu cugagcuugg cu 22 <210> 210 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 210 aagcccuuac cccaaaaagc au 22 <210> 211 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 211 ugugacuggu ugaccagagg gg 22 <210> 212 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 212 acuccauuug uuuugaugau gga 23 <210> 213 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 213 caucaucguc ucaaaugagu cu 22 <210> 214 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 214 gcuacuucac aacaccaggg cc 22 <210> 215 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 215 ugagaacuga auuccauggg uu 22 <210> 216 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 216 ccucugaaau ucaguucuuc ag 22 <210> 217 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 217 ucuggcuccg ugucuucacu ccc 23 <210> 218 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 218 agggagggac gggggcugug c 21 <210> 219 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 219 ucucccaacc cuuguaccag ug 22 <210> 220 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 220 cugguacagg ccugggggac ag 22 <210> 221 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 221 uagguuaucc guguugccuu cg 22 <210> 222 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 222 aaucauacac gguugaccua uu 22 <210> 223 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 223 uggacggaga acugauaagg gu 22 <210> 224 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 224 uggagagaaa ggcaguuccu ga 22 <210> 225 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 225 aggggcuggc uuuccucugg uc 22 <210> 226 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 226 caaagaauuc uccuuuuggg cu 22 <210> 227 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 227 gcccaaaggu gaauuuuuug gg 22 <210> 228 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 228 caucccuugc augguggagg g 21 <210> 229 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 229 cucccacaug caggguuugc a 21 <210> 230 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 230 ugauauguuu gauauauuag gu 22 <210> 231 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 231 ugggucuuug cgggcgagau ga 22 <210> 232 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 232 aacuggccua caaaguccca gu 22 <210> 233 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 233 uguaacagca acuccaugug ga 22 <210> 234 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 234 uagcagcaca gaaauauugg c 21 <210> 235 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 235 ccaauauugg cugugcugcu cc 22 <210> 236 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 236 uggaauguaa ggaagugugu gg 22 <210> 237 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 237 aaaagcuggg uugagagggc ga 22 <210> 238 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 238 cgucuuaccc agcaguguuu gg 22 <210> 239 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 239 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 240 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 240 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23 <210> 241 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 241 cuccuacaua uuagcauuaa ca 22 <210> 242 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 242 ccaguggggc ugcuguuauc ug 22 <210> 243 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 243 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 244 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 244 ccgcacugug gguacuugcu gc 22 <210> 245 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 245 ugaccgauuu cuccuggugu uc 22 <210> 246 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 246 uagcaccauu ugaaaucggu ua 22 <210> 247 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 247 cugggagagg guuguuuacu cc 22 <210> 248 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 248 caucuuaccg gacagugcug ga 22 <210> 249 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 249 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 <210> 250 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 250 acuuaaacgu ggauguacuu gcu 23 <210> 251 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 251 uaagugcuuc cauguuuugg uga 23 <210> 252 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 252 agaauugugg cuggacaucu gu 22 <210> 253 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 253 uaggcagugu cauuagcuga uug 23 <210> 254 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 254 caaucacuaa cuccacugcc au 22 <210> 255 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 255 aggcagugua guuagcugau ugc 23 <210> 256 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 256 aaucacuaac cacacggcca gg 22 <210> 257 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 257 ugguuuaccg ucccacauac au 22 <210> 258 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 258 uaugugggau gguaaaccgc uu 22 <210> 259 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 259 cagugcaaua guauugucaa agc 23 <210> 260 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 260 cacccguaga accgaccuug cg 22 <210> 261 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 261 caagcucgug ucuguggguc cg 22 <210> 262 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 262 agggcccccc cucaauccug u 21 <210> 263 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 263 gaggguuggg uggaggcucu cc 22 <210> 264 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 264 acucuuuccc uguugcacua c 21 <210> 265 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 265 cagugcaaug augaaagggc au 22 <210> 266 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 266 uguaaacauc cuugacugga ag 22 <210> 267 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 267 cuuucagucg gauguuuaca gc 22 <210> 268 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 268 ccuauucuug auuacuuguu uc 22 <210> 269 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 269 uuaucagaau cuccaggggu ac 22 <210> 270 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 270 ucccccaggu gugauucuga uuu 23 <210> 271 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 271 aauccuugga accuaggugu gagu 24 <210> 272 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 272 aacacaccua uucaaggauu ca 22 <210> 273 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 273 cggguggauc acgaugcaau uu 22 <210> 274 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 274 aauugcacgg uauccaucug ua 22 <210> 275 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 275 uaaugccccu aaaaauccuu au 22 <210> 276 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 276 agggacuuuc aggggcagcu gu 22 <210> 277 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 277 acuuuaacau ggaagugcuu uc 22 <210> 278 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 278 uaagugcuuc cauguuuuag uag 23 <210> 279 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 279 uuuaacaugg ggguaccugc ug 22 <210> 280 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 280 uaagugcuuc cauguuucag ugg 23 <210> 281 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 281 acuuuaacau ggaggcacuu gc 22 <210> 282 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 282 uaagugcuuc cauguuugag ugu 23 <210> 283 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 283 acuguugcua auaugcaacu cu 22 <210> 284 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 284 aauugcacuu uagcaauggu ga 22 <210> 285 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 285 aacauagagg aaauuccacg u 21 <210> 286 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 286 agaucgaccg uguuauauuc gc 22 <210> 287 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 287 aauaauacau gguugaucuu u 21 <210> 288 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 288 gccugcuggg guggaaccug gu 22 <210> 289 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 289 acucaaacug ugggggcacu 20 <210> 290 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 290 aagugccgcc aucuuuugag ugu 23 <210> 291 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 291 aaagugcugc gacauuugag cgu 23 <210> 292 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 292 acucaaaaug ggggcgcuuu cc 22 <210> 293 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 293 gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23 <210> 294 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 294 uuauaauaca accugauaag ug 22 <210> 295 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 295 cuuaucagau uguauuguaa uu 22 <210> 296 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 296 uuuguucguu cggcucgcgu ga 22 <210> 297 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 297 guagauucuc cuucuaugag ua 22 <210> 298 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 298 aucauagagg aaaauccacg u 21 <210> 299 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 299 agagguugcc cuuggugaau uc 22 <210> 300 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 300 aucacacaaa ggcaacuuuu gu 22 <210> 301 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 301 cuccugacuc cagguccugu gu 22 <210> 302 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 302 acuggacuug gagucagaag g 21 <210> 303 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 303 ugguagacua uggaacguag g 21 <210> 304 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 304 uauguaacau gguccacuaa cu 22 <210> 305 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 305 ugguugacca uagaacaugc gc 22 <210> 306 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 306 uauguaauau gguccacauc uu 22 <210> 307 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 307 uauacaaggg caagcucucu gu 22 <210> 308 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 308 gaaguuguuc gugguggauu cg 22 <210> 309 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 309 agaucagaag gugauugugg cu 22 <210> 310 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 310 uuauaaagca augagacuga uu 22 <210> 311 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 311 uccgucucag uuacuuuaua gc 22 <210> 312 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 312 ucucugggcc ugugucuuag gc 22 <210> 313 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 313 gcaaagcaca cggccugcag aga 23 <210> 314 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 314 cuggcccucu cugcccuucc gu 22 <210> 315 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 315 aggggugcua ucugugauug a 21 <210> 316 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 316 ucucacacag aaaucgcacc cgu 23 <210> 317 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 317 gaacggcuuc auacaggagu u 21 <210> 318 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 318 cuccuauaug augccuuucu uc 22 <210> 319 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 319 aggugguccg uggcgcguuc gc 22 <210> 320 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 320 cacauuacac ggucgaccuc u 21 <210> 321 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 321 ccucugggcc cuuccuccag 20 <210> 322 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 322 ucgaggagcu cacagucuag u 21 <210> 323 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 323 cuagacugaa gcuccuugag g 21 <210> 324 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 324 uauggcuuuu cauuccuaug uga 23 <210> 325 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 325 auguagggcu aaaagccaug gg 22 <210> 326 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 326 aaguucuguu auacacucag gc 22 <210> 327 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 327 ucagugcauc acagaacuuu gu 22 <210> 328 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 328 cuagguaugg ucccagggau cc 22 <210> 329 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 329 gccccugggc cuauccuaga a 21 <210> 330 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 330 cgcauccccu agggcauugg ugu 23 <210> 331 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 331 acugccccag gugcugcugg 20 <210> 332 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 332 aacaauaucc uggugcugag ug 22 <210> 333 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 333 uccagcauca gugauuuugu ug 22 <210> 334 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 334 ucccuguccu ccaggagcuc acg 23 <210> 335 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 335 ugagcgccuc gacgacagag ccg 23 <210> 336 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 336 ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23 <210> 337 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 337 uuuuucauua uugcuccuga cc 22 <210> 338 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 338 uuuggucccc uucaaccagc ua 22 <210> 339 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 339 ccuaguaggu guccaguaag ugu 23 <210> 340 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 340 gcugacuccu aguccagggc uc 22 <210> 341 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 341 ugucugcccg caugccugcc ucu 23 <210> 342 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 342 auuccuagaa auuguucaua 20 <210> 343 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 343 uagguaguuu ccuguuguug gg 22 <210> 344 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 344 ucgacagcac gacacugccu uc 22 <210> 345 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 345 acuggacuua gggucagaag gc 22 <210> 346 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 346 ugaggggcag agagcgagac uuu 23 <210> 347 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 347 agcucggucu gaggccccuc agu 23 <210> 348 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 348 cagcagcaau ucauguuuug aa 22 <210> 349 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 349 caaaacguga ggcgcugcua u 21 <210> 350 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 350 aaugacacga ucacucccgu uga 23 <210> 351 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 351 aucgggaaug ucguguccgc cc 22 <210> 352 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 352 uaaggugcau cuagugcagu uag 23 <210> 353 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 353 ugcccuaaau gccccuucug gc 22 <210> 354 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 354 caaagugcuc auagugcagg uag 23 <210> 355 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 355 acuguaguau gggcacuucc ag 22 <210> 356 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 356 uugcauaugu aggauguccc au 22 <210> 357 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 357 uaauacuguc ugguaaaacc gu 22 <210> 358 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 358 uggcagugua uuguuagcug gu 22 <210> 359 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 359 uuuugcgaug uguuccuaau au 22 <210> 360 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 360 ugucuugcag gccgucaugc a 21 <210> 361 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 361 caggucgucu ugcagggcuu cu 22 <210> 362 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 362 aucaugaugg gcuccucggu gu 22 <210> 363 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 363 aacacaccug guuaaccucu uu 22 <210> 364 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 364 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 365 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 365 aacuguuugc agaggaaacu ga 22 <210> 366 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 366 cucaucugca aagaaguaag ug 22 <210> 367 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 367 agguuacccg agcaacuuug cau 23 <210> 368 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 368 gaauguugcu cggugaaccc cu 22 <210> 369 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 369 acuucaccug guccacuagc cgu 23 <210> 370 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 370 aauauaacac agauggccug u 21 <210> 371 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 371 aucauagagg aaaauccaug uu 22 <210> 372 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 372 aagacgggag gaaagaaggg ag 22 <210> 373 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 373 ucacuccucu ccucccgucu u 21 <210> 374 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 374 ucaggcucag uccccucccg au 22 <210> 375 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 375 agaggcuggc cgugaugaau uc 22 <210> 376 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 376 gucauacacg gcucuccucu cu 22 <210> 377 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 377 uccuguacug agcugccccg ag 22 <210> 378 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 378 cggggcagcu caguacagga u 21 <210> 379 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 379 aaucauacag ggacauccag uu 22 <210> 380 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 380 cccagauaau ggcacucuca a 21 <210> 381 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 381 uugaaaggcu auuucuuggu c 21 <210> 382 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 382 gugacaucac auauacggca gc 22 <210> 383 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 383 ccauggaucu ccaggugggu 20 <210> 384 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 384 caaccuggag gacuccaugc ug 22 <210> 385 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 385 aguggggaac ccuuccauga gg 22 <210> 386 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 386 cuuaugcaag auucccuucu ac 22 <210> 387 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 387 gugucuuuug cucugcaguc a 21 <210> 388 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 388 ugagaacuga auuccauagg cu 22 <210> 389 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 389 ugcccugugg acucaguucu gg 22 <210> 390 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 390 uuccuaugca uauacuucuu ug 22 <210> 391 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 391 agagguauag ggcaugggaa 20 <210> 392 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 392 aggaccugcg ggacaagauu cuu 23 <210> 393 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 393 uuguacaugg uaggcuuuca uu 22 <210> 394 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 394 ugaaggucua cugugugcca gg 22 <210> 395 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 395 ucuuggagua ggucauuggg ugg 23 <210> 396 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 396 cuggauggcu ccuccauguc u 21 <210> 397 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 397 ugaaacauac acgggaaacc uc 22 <210> 398 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 398 aaacaaacau ggugcacuuc uu 22 <210> 399 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 399 ugaguauuac auggccaauc uc 22 <210> 400 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 400 cgggguuuug agggcgagau ga 22 <210> 401 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 401 aacuggcccu caaagucccg cu 22 <210> 402 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 402 cagcagcaca cugugguuug u 21 <210> 403 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 403 caaaccacac ugugguguua ga 22 <210> 404 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 404 aacauucauu guugucggug ggu 23 <210> 405 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 405 cacucagccu ugagggcacu uuc 23 <210> 406 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 406 aagugcuguc auagcugagg uc 22 <210> 407 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 407 uuucaagcca gggggcguuu uuc 23 <210> 408 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 408 aaagugcuuc cuuuuugagg g 21 <210> 409 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 409 uucuccaaaa gaaagcacuu ucug 24 <210> 410 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 410 gagugccuuc uuuuggagcg uu 22 <210> 411 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 411 uucuccaaaa gggagcacuu uc 22 <210> 412 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 412 aagugccucc uuuuagagug uu 22 <210> 413 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 413 aagugcuucc uuuuagaggg uu 22 <210> 414 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 414 cucuagaggg aagcgcuuuc ug 22 <210> 415 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 415 aaagugcauc uuuuuagagg au 22 <210> 416 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 416 cuccagaggg aaguacuuuc u 21 <210> 417 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 417 aaagugcuuc ccuuuggacu gu 22 <210> 418 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 418 cucuugaggg aagcacuuuc ugu 23 <210> 419 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 419 gaaagugcuu ccuuuuagag gc 22 <210> 420 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 420 aaagugcauc cuuuuagagg uu 22 <210> 421 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 421 cuccagaggg augcacuuuc u 21 <210> 422 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 422 gaaggcgcuu cccuuuagag cg 22 <210> 423 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 423 gaacgcgcuu cccuauagag ggu 23 <210> 424 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 424 cucuagaggg aagcacuuuc uc 22 <210> 425 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 425 gaaagcgcuu cucuuuagag g 21 <210> 426 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 426 aaagugcuuc cuuuuagagg g 21 <210> 427 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 427 caaagcgcuc cccuuuagag gu 22 <210> 428 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 428 cucuagaggg aagcacuuuc ug 22 <210> 429 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 429 aaagugcuuc cuuuuagagg gu 22 <210> 430 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 430 ucucuggagg gaagcacuuu cug 23 <210> 431 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 431 caaagcgcuu cucuuuagag ugu 23 <210> 432 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 432 cuacaaaggg aagcacuuuc uc 22 <210> 433 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 433 gaaggcgcuu cccuuuggag u 21 <210> 434 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 434 ccucuagaug gaagcacugu cu 22 <210> 435 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 435 aucgugcauc ccuuuagagu gu 22 <210> 436 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 436 caaagugccu cccuuuagag ug 22 <210> 437 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 437 aacgcacuuc ccuuuagagu gu 22 <210> 438 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 438 cuacaaaggg aagcccuuuc 20 <210> 439 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 439 aaagugcuuc ucuuuggugg gu 22 <210> 440 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 440 ucgugcaucc cuuuagagug uu 22 <210> 441 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 441 acaaagugcu ucccuuuaga gugu 24 <210> 442 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 442 aucuggaggu aagaagcacu uu 22 <210> 443 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 443 ugcuuccuuu cagagggu 18 <210> 444 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 444 aaagcgcuuc ccuucagagu g 21 <210> 445 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 445 cugcaaaggg aagcccuuuc 20 <210> 446 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 446 gaaagcgcuu cccuuugcug ga 22 <210> 447 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 447 caaagcgcuu cccuuuggag c 21 <210> 448 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 448 aucgugcauc cuuuuagagu gu 22 <210> 449 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 449 acaaagugcu ucccuuuaga gu 22 <210> 450 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 450 aaaaugguuc ccuuuagagu gu 22 <210> 451 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 451 aaagugcauc cuuuuagagu gu 22 <210> 452 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 452 uucucgagga aagaagcacu uuc 23 <210> 453 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 453 uuaagacuug cagugauguu u 21 <210> 454 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 454 aacaucacag caagucugug cu 22 <210> 455 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 455 uaauccuugc uaccugggug aga 23 <210> 456 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 456 augcaccugg gcaaggauuc ug 22 <210> 457 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 457 aauccuuugu cccuggguga ga 22 <210> 458 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 458 aaugcacccg ggcaaggauu cu 22 <210> 459 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 459 auccuugcua ucugggugcu a 21 <210> 460 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 460 aaugcaccug ggcaaggauu ca 22 <210> 461 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 461 uagcagcggg aacaguucug cag 23 <210> 462 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 462 agacccuggu cugcacucua uc 22 <210> 463 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 463 gggagccagg aaguauugau gu 22 <210> 464 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 464 cgucaacacu ugcugguuuc cu 22 <210> 465 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 465 uucacaggga ggugucau 18 <210> 466 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 466 uaaauuucac cuuucugaga agg 23 <210> 467 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 467 uaaggcaccc uucugaguag a 21 <210> 468 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 468 uuuugcaccu uuuggaguga a 21 <210> 469 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 469 uacuccagag ggcgucacuc aug 23 <210> 470 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 470 ugauuguagc cuuuuggagu aga 23 <210> 471 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 471 uacugcagac aguggcaauc a 21 <210> 472 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 472 ugauugguac gucugugggu ag 22 <210> 473 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 473 uacucaggag aguggcaauc ac 22 <210> 474 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 474 auugacacuu cugugaguag a 21 <210> 475 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 475 caugccuuga guguaggacc gu 22 <210> 476 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 476 ccucccacac ccaaggcuug ca 22 <210> 477 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 477 uaugugccuu uggacuacau cg 22 <210> 478 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 478 gcaguccaug ggcauauaca c 21 <210> 479 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 479 ggagaaauua uccuuggugu gu 22 <210> 480 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 480 auucugcauu uuuagcaagu uc 22 <210> 481 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 481 ucaguaaaug uuuauuagau ga 22 <210> 482 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 482 ucagcaaaca uuuauugugu gc 22 <210> 483 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 483 aaucguacag ggucauccac uu 22 <210> 484 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 484 gcgacccacu cuugguuucc a 21 <210> 485 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 485 aacaggugac ugguuagaca a 21 <210> 486 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 486 aaaacgguga gauuuuguuu u 21 <210> 487 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 487 gcuaguccug acucagccag u 21 <210> 488 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 488 agggacggga cgcggugcag ug 22 <210> 489 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 489 uauugcacuc gucccggccu cc 22 <210> 490 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 490 aggguaagcu gaaccucuga u 21 <210> 491 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 491 gaugagcuca uuguaauaug ag 22 <210> 492 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 492 auauuaccau uagcucaucu uu 22 <210> 493 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 493 guuugcacgg gugggccuug ucu 23 <210> 494 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 494 ugagcugcug uaccaaaau 19 <210> 495 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 495 uaaaguaaau augcaccaaa a 21 <210> 496 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 496 caaaguuuaa gauccuugaa gu 22 <210> 497 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 497 aaaguagcug uaccauuugc 20 <210> 498 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 498 agguugacau acguuuccc 19 <210> 499 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 499 aggcacggug ucagcaggc 19 <210> 500 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 500 gggcgccugu gaucccaac 19 <210> 501 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 501 aguauguucu uccaggacag aac 23 <210> 502 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 502 auguauaaau guauacacac 20 <210> 503 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 503 gaaaucaagc gugggugaga cc 22 <210> 504 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 504 gcgacccaua cuugguuuca g 21 <210> 505 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 505 aguuaaugaa uccuggaaag u 21 <210> 506 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 506 cgaaaacagc aauuaccuuu gc 22 <210> 507 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 507 ugaguuggcc aucugaguga g 21 <210> 508 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 508 guccgcucgg cgguggccca 20 <210> 509 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 509 cugaagugau guguaacuga ucag 24 <210> 510 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 510 ugagugugug ugugugagug ugu 23 <210> 511 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 511 cacgcucaug cacacaccca ca 22 <210> 512 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 512 gagccaguug gacaggagc 19 <210> 513 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 513 auucuaauuu cuccacgucu uu 22 <210> 514 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 514 aagaugugga aaaauuggaa uc 22 <210> 515 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 515 uagauaaaau auugguaccu g 21 <210> 516 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 516 cuucuugugc ucuaggauug u 21 <210> 517 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 517 uucauuuggu auaaaccgcg auu 23 <210> 518 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 518 uugagaauga ugaaucauua gg 22 <210> 519 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 519 ucuuguguuc ucuagaucag u 21 <210> 520 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 520 uuacaguugu ucaaccaguu acu 23 <210> 521 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 521 uaacugguug aacaacugaa cc 22 <210> 522 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 522 caaagaggaa ggucccauua c 21 <210> 523 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 523 uuaugguuug ccugggacug ag 22 <210> 524 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 524 ugggcguauc uguaugcua 19 <210> 525 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 525 caaaacuggc aauuacuuuu gc 22 <210> 526 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 526 uaugcauugu auuuuuaggu cc 22 <210> 527 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 527 uuuccauagg ugaugaguca c 21 <210> 528 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 528 aaaaguaauu gugguuuugg cc 22 <210> 529 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 529 caagaaccuc aguugcuuuu gu 22 <210> 530 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 530 uuggccacaa uggguuagaa c 21 <210> 531 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 531 ugagaaccac gucugcucug ag 22 <210> 532 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 532 ucagaacaaa ugccgguucc caga 24 <210> 533 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 533 agugccugag ggaguaagag ccc 23 <210> 534 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 534 ugucuuacuc ccucaggcac au 22 <210> 535 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 535 gagcuuauuc auaaaagugc ag 22 <210> 536 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 536 uaauuuuaug uauaagcuag u 21 <210> 537 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 537 agaccauggg uucucauugu 20 <210> 538 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 538 uugugucaau augcgaugau gu 22 <210> 539 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 539 aggcaccagc caggcauugc ucagc 25 <210> 540 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 540 ugucucugcu gggguuucu 19 <210> 541 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 541 gaagugugcc gugguguguc u 21 <210> 542 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 542 aagccugccc ggcuccucgg g 21 <210> 543 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 543 ugugucacuc gaugaccacu gu 22 <210> 544 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 544 uacgucaucg uugucaucgu ca 22 <210> 545 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 545 guugugucag uuuaucaaac 20 <210> 546 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 546 aaaaguaauu gcgaguuuua cc 22 <210> 547 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 547 acuuacagac aagagccuug cuc 23 <210> 548 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 548 uggucuagga uuguuggagg ag 22 <210> 549 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 549 gacacgggcg acagcugcgg ccc 23 <210> 550 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 550 cacacacugc aauuacuuuu gc 22 <210> 551 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 551 aggcugcgga auucaggac 19 <210> 552 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 552 uaaaucccau ggugccuucu ccu 23 <210> 553 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 553 aaacuacuga aaaucaaaga u 21 <210> 554 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 554 guucaaaucc agaucuauaa c 21 <210> 555 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 555 agggguggug uugggacagc uccgu 25 <210> 556 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 556 aggguguuuc ucucaucucu 20 <210> 557 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 557 ugagcuaaau gugugcuggg a 21 <210> 558 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 558 gcgaggaccc cucggggucu gac 23 <210> 559 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 559 gcugggcagg gcuucugagc uccuu 25 <210> 560 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 560 aggaauguuc cuucuuugcc 20 <210> 561 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 561 gaacgccugu ucuugccagg ugg 23 <210> 562 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 562 gggggucccc ggugcucgga uc 22 <210> 563 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 563 uccgagccug ggucucccuc uu 22 <210> 564 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 564 acucaaaacc cuucagugac uu 22 <210> 565 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 565 agucauugga ggguuugagc ag 22 <210> 566 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 566 aaaaguaauu gcgguuuuug cc 22 <210> 567 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 567 caaaaaucuc aauuacuuuu gc 22 <210> 568 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 568 agacuuccca uuugaaggug gc 22 <210> 569 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 569 aaacucuacu uguccuucug agu 23 <210> 570 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 570 gaccuggaca uguuugugcc cagu 24 <210> 571 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 571 auggagauag auauagaaau 20 <210> 572 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 572 ggcuagcaac agcgcuuacc u 21 <210> 573 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 573 acagucugcu gagguuggag c 21 <210> 574 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 574 aucccuugca ggggcuguug ggu 23 <210> 575 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 575 uaguaccagu accuuguguu ca 22 <210> 576 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 576 cacaagguau ugguauuacc u 21 <210> 577 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 577 agggggaaag uucuauaguc c 21 <210> 578 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 578 gacuauagaa cuuucccccu ca 22 <210> 579 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 579 agcugucuga aaaugucuu 19 <210> 580 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 580 gugagucucu aagaaaagag ga 22 <210> 581 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 581 augcugacau auuuacuaga gg 22 <210> 582 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 582 ucuaguaaga guggcagucg a 21 <210> 583 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 583 uggguuuacg uugggagaac u 21 <210> 584 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 584 guucucccaa cguaagccca gc 22 <210> 585 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 585 aguauucugu accagggaag gu 22 <210> 586 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 586 agaccuggcc cagaccucag c 21 <210> 587 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 587 gugcauugcu guugcauugc 20 <210> 588 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 588 cagugccucg gcagugcagc cc 22 <210> 589 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 589 gugucugcuu ccuguggga 19 <210> 590 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 590 cuaauaguau cuaccacaau aaa 23 <210> 591 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 591 aaccagcacc ccaacuuugg ac 22 <210> 592 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 592 acuugggcac ugaaacaaug ucc 23 <210> 593 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 593 ugugcuugcu cgucccgccc gca 23 <210> 594 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 594 acugggggcu uucgggcucu gcgu 24 <210> 595 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 595 agggaucgcg ggcggguggc ggccu 25 <210> 596 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 596 aucgcugcgg uugcgagcgc ugu 23 <210> 597 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 597 augauccagg aaccugccuc u 21 <210> 598 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 598 aaagacauag gauagaguca ccuc 24 <210> 599 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 599 gucccucucc aaaugugucu ug 22 <210> 600 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 600 acuuguaugc uagcucaggu ag 22 <210> 601 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 601 aguguggcuu ucuuagagc 19 <210> 602 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 602 ucuaggcugg uacugcuga 19 <210> 603 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 603 aagcagcugc cucugaggc 19 <210> 604 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 604 guggcugcac ucacuuccuu c 21 <210> 605 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 605 aagugugcag ggcacuggu 19 <210> 606 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 606 aaaccugugu uguucaagag uc 22 <210> 607 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 607 aggaggcagc gcucucagga c 21 <210> 608 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 608 uuuaggauaa gcuugacuuu ug 22 <210> 609 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 609 aauggcgcca cuaggguugu g 21 <210> 610 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 610 aaaaguaauu gugguuuuug cc 22 <210> 611 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 611 caaaaaccac aguuucuuuu gc 22 <210> 612 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 612 ugccuggguc ucuggccugc gcgu 24 <210> 613 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 613 ucccacguug uggcccagca g 21 <210> 614 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 614 aggcggggcg ccgcgggacc gc 22 <210> 615 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 615 aggcagugua uuguuagcug gc 22 <210> 616 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 616 cagccacaac uacccugcca cu 22 <210> 617 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 617 guguugaaac aaucucuacu g 21 <210> 618 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 618 uaguagaccg uauagcguac g 21 <210> 619 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 619 uauguaacac gguccacuaa cc 22 <210> 620 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 620 uggugggccg cagaacaugu gc 22 <210> 621 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 621 uaugucugcu gaccaucacc uu 22 <210> 622 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 622 auaauacaug guuaaccucu uu 22 <210> 623 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 623 aauauuauac agucaaccuc u 21 <210> 624 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 624 ugacaacuau ggaugagcuc u 21 <210> 625 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 625 ggcagguucu cacccucucu agg 23 <210> 626 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 626 ggcggaggga aguagguccg uuggu 25 <210> 627 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 627 cuugguucag ggaggguccc ca 22 <210> 628 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 628 uacccauugc auaucggagu ug 22 <210> 629 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 629 aucaacagac auuaauuggg cgc 23 <210> 630 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 630 ucggggauca ucaugucacg aga 23 <210> 631 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 631 ugugacagau ugauaacuga aa 22 <210> 632 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 632 uuugugaccu gguccacuaa cc 22 <210> 633 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 633 caagucuuau uugagcaccu guu 23 <210> 634 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 634 aggaagcccu ggaggggcug gag 23 <210> 635 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 635 uccgguucuc agggcuccac c 21 <210> 636 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 636 ugucacucgg cucggcccac uac 23 <210> 637 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 637 ugcaccaugg uugucugagc aug 23 <210> 638 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 638 ucugcucaua ccccaugguu ucu 23 <210> 639 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 639 gugaggacuc gggaggugg 19 <210> 640 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 640 ccccaccucc ucucuccuca g 21 <210> 641 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 641 aaaagcuggg uugagagggc aa 22 <210> 642 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 642 aaaagcuggg uugagagggu 20 <210> 643 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 643 uuagggcccu ggcuccaucu cc 22 <210> 644 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 644 cuccguuugc cuguuucgcu g 21 <210> 645 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 645 ucaaaacuga ggggcauuuu cu 22 <210> 646 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 646 cuuggcaccu agcaagcacu ca 22 <210> 647 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 647 uugcagcugc cugggaguga cuuc 24 <210> 648 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 648 acccuaucaa uauugucucu gc 22 <210> 649 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 649 uagugcaaua uugcuuauag ggu 23 <210> 650 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 650 agaggauacc cuuuguaugu u 21 <210> 651 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 651 uaggcagugu auugcuagcg gcugu 25 <210> 652 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 652 uugcuaguug cacuccucuc ugu 23 <210> 653 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 653 ucuacaaagg aaagcgcuuu cu 22 <210> 654 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 654 ugagaccucu ggguucugag cu 22 <210> 655 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 655 cugggaucuc cggggucuug guu 23 <210> 656 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 656 acuccagccc cacagccuca gc 22 <210> 657 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 657 ggggcugggg ccggggccga gc 22 <210> 658 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 658 caguaacaaa gauucauccu ugu 23 <210> 659 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 659 gucccugagu guauguggug 20 <210> 660 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 660 uucauucggc uguccagaug ua 22 <210> 661 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 661 auuugugcuu ggcucuguca c 21 <210> 662 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 662 gcagcagggu gaaacugaca ca 22 <210> 663 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 663 gcaggugcuc acuuguccuc cu 22 <210> 664 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 664 gcagagugca aacaauuuug ac 22 <210> 665 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 665 uggaggagaa ggaaggugau g 21 <210> 666 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 666 uccaguacca cgugucaggg cca 23 <210> 667 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 667 uggugcggag agggcccaca gug 23 <210> 668 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 668 cuguaugccc ucaccgcuca 20 <210> 669 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 669 agcagaagca gggagguucu ccca 24 <210> 670 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 670 ugcaacgaac cugagccacu ga 22 <210> 671 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 671 uauacaaggg cagacucucu cu 22 <210> 672 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 672 cgggucggag uuagcucaag cgg 23 <210> 673 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 673 cgcgggugcu uacugacccu u 21 <210> 674 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 674 cacugugucc uuucugcgua g 21 <210> 675 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 675 ccaccaccgu gucugacacu u 21 <210> 676 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 676 uuuugcaaua uguuccugaa ua 22 <210> 677 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 677 uugggaucau uuugcaucca ua 22 <210> 678 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 678 cugcccuggc ccgagggacc ga 22 <210> 679 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 679 uacuuggaaa ggcaucaguu g 21 <210> 680 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 680 ugcaacuuac cugagucauu ga 22 <210> 681 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 681 acacagggcu guugugaaga cu 22 <210> 682 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 682 uacucaaaaa gcugucaguc a 21 <210> 683 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 683 gacugacacc ucuuugggug aa 22 <210> 684 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 684 cacuggcucc uuucugggua ga 22 <210> 685 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 685 aaaggauucu gcugucgguc ccacu 25 <210> 686 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 686 uggugggcac agaaucugga cu 22 <210> 687 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 687 uuaauaucgg acaaccauug u 21 <210> 688 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 688 uauaccucag uuuuaucagg ug 22 <210> 689 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 689 ccuggaaaca cugagguugu g 21 <210> 690 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 690 uggauuucuu ugugaaucac ca 22 <210> 691 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 691 uggugguuua caaaguaauu ca 22 <210> 692 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 692 aaggagcuua caaucuagcu ggg 23 <210> 693 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 693 caacuagacu gugagcuucu ag 22 <210> 694 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 694 gugugcggaa augcuucugc ua 22 <210> 695 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 695 ugauauguuu gauauugggu u 21 <210> 696 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 696 ugcggggcua gggcuaacag ca 22 <210> 697 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 697 cuguugccac uaaccucaac cu 22 <210> 698 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 698 uccauuacac uacccugccu cu 22 <210> 699 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 699 aggcagcggg guguagugga ua 22 <210> 700 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 700 guagaggaga uggcgcaggg 20 <210> 701 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 701 uccucuucuc ccuccuccca g 21 <210> 702 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 702 gugaacgggc gccaucccga gg 22 <210> 703 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 703 accaggaggc ugaggccccu 20 <210> 704 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 704 gcaggaacuu gugagucucc u 21 <210> 705 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 705 aaacauucgc ggugcacuuc uu 22 <210> 706 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 706 auauaauaca accugcuaag ug 22 <210> 707 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 707 cuuagcaggu uguauuauca uu 22 <210> 708 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 708 cggcucuggg ucugugggga 20 <210> 709 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 709 cagugcaaug auauugucaa agc 23 <210> 710 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 710 aaaucucugc aggcaaaugu ga 22 <210> 711 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 711 auaagacgaa caaaagguuu gu 22 <210> 712 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 712 ggggagcugu ggaagcagua 20 <210> 713 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 713 cuagugaggg acagaaccag gauuc 25 <210> 714 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 714 gcagcagaga auaggacuac guc 23 <210> 715 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 715 agagucuugu gaugucuugc 20 <210> 716 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 716 uacugcagac guggcaauca ug 22 <210> 717 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 717 ugugcgcagg gagaccucuc cc 22 <210> 718 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 718 ugucuacuac uggagacacu gg 22 <210> 719 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 719 ccaguuaccg cuuccgcuac cgc 23 <210> 720 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 720 acaguagagg gaggaaucgc ag 22 <210> 721 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 721 auccgcgcuc ugacucucug cc 22 <210> 722 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 722 ugcccuuaaa ggugaaccca gu 22 <210> 723 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 723 uggggagcug aggcucuggg ggug 24 <210> 724 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 724 aaggcagggc ccccgcuccc c 21 <210> 725 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 725 cacccggcug ugugcacaug ugc 23 <210> 726 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 726 ucuucucugu uuuggccaug ug 22 <210> 727 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 727 cugacuguug ccguccucca g 21 <210> 728 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 728 aaauuauugu acaucggaug ag 22 <210> 729 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 729 auguaugugu gcaugugcau g 21 <210> 730 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 730 uugcucacug uucuucccua g 21 <210> 731 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 731 aagcauucuu ucauugguug g 21 <210> 732 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 732 uuuccggcuc gcgugggugu gu 22 <210> 733 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 733 ccgucgccgc cacccgagcc g 21 <210> 734 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 734 gagggucuug ggagggaugu gac 23 <210> 735 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 735 cacuguaggu gauggugaga gugggca 27 <210> 736 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 736 ccugcagcga cuugauggcu ucc 23 <210> 737 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 737 guggguacgg cccagugggg gg 22 <210> 738 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 738 ugagccccug ugccgccccc ag 22 <210> 739 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 739 gugagggcau gcaggccugg augggg 26 <210> 740 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 740 ucaccagccc uguguucccu ag 22 <210> 741 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 741 cgugccaccc uuuuccccag 20 <210> 742 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 742 gugggcgggg gcaggugugu g 21 <210> 743 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 743 ucacaccugc cucgcccccc 20 <210> 744 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 744 cucucaccac ugcccuccca cag 23 <210> 745 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 745 gugucugggc ggacagcugc 20 <210> 746 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 746 ugagcccugu ccucccgcag 20 <210> 747 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 747 ucggccugac cacccacccc ac 22 <210> 748 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 748 ccucuucccc uugucucucc ag 22 <210> 749 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 749 uccuucugcu ccguccccca g 21 <210> 750 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 750 cuuccucguc ugucugcccc 20 <210> 751 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 751 cuccugagcc auucugagcc uc 22 <210> 752 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 752 agccugauua aacacaugcu cuga 24 <210> 753 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 753 gugccagcug caguggggga g 21 <210> 754 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 754 cccggagcca ggaugcagcu c 21 <210> 755 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 755 gguggcccgg ccgugccuga gg 22 <210> 756 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 756 ucguggccug gucuccauua u 21 <210> 757 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 757 ucugcagggu uugcuuugag 20 <210> 758 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 758 uguucaugua gauguuuaag c 21 <210> 759 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 759 uggcagggag gcugggaggg g 21 <210> 760 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 760 ucagcuggcc cucauuuc 18 <210> 761 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 761 ucacuguuca gacaggcgga 20 <210> 762 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 762 aaaaacugag acuacuuuug ca 22 <210> 763 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 763 aaaaguaauu gcggucuuug gu 22 <210> 764 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 764 ucugggcaac aaagugagac cu 22 <210> 765 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 765 ugcaggacca agaugagccc u 21 <210> 766 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 766 ugcuggauca gugguucgag uc 22 <210> 767 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 767 uggaguccag gaaucugcau uuu 23 <210> 768 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 768 uggauuuuug gaucaggga 19 <210> 769 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 769 uggcccugac ugaagaccag cagu 24 <210> 770 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 770 aaaaguacuu gcggauuuug cu 22 <210> 771 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 771 uggguggucu ggagauuugu gc 22 <210> 772 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 772 ugugagguug gcauuguugu cu 22 <210> 773 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 773 uuaggccgca gaucugggug a 21 <210> 774 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 774 uucaaguaau ucaggug 17 <210> 775 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 775 uucuggaauu cugugugagg ga 22 <210> 776 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 776 aaaaguauuu gcggguuuug uc 22 <210> 777 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 777 uugggacaua cuuaugcuaa a 21 <210> 778 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 778 uuuagagacg gggucuugcu cu 22 <210> 779 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 779 uuugaggcua cagugagaug ug 22 <210> 780 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 780 uuuucaacuc uaaugggaga ga 22 <210> 781 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 781 aacuggauca auuauaggag ug 22 <210> 782 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 782 aaaaacugua auuacuuuu 19 <210> 783 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 783 aaguaguugg uuuguaugag augguu 26 <210> 784 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 784 aagugaucua aaggccuaca u 21 <210> 785 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 785 aauggauuuu uggagcagg 19 <210> 786 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 786 acccgucccg uucguccccg ga 22 <210> 787 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 787 accuucuugu auaagcacug ugcuaaa 27 <210> 788 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 788 acgcccuucc cccccuucuu ca 22 <210> 789 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 789 acggugcugg auguggccuu u 21 <210> 790 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 790 acucuagcug ccaaaggcgc u 21 <210> 791 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 791 agagaagaag aucagccugc a 21 <210> 792 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 792 agccuggaag cuggagccug cagu 24 <210> 793 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 793 aggaugagca aagaaaguag auu 23 <210> 794 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 794 aggcauugac uucucacuag cu 22 <210> 795 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 795 agugaaugau ggguucugac c 21 <210> 796 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 796 aguuaggauu aggucgugga a 21 <210> 797 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 797 auauaugaug acuuagcuuu u 21 <210> 798 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 798 aucccaccuc ugccacca 18 <210> 799 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 799 aaaacuguaa uuacuuuugu ac 22 <210> 800 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 800 auggauaagg cuuuggcuu 19 <210> 801 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 801 augggugaau uuguagaagg au 22 <210> 802 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 802 augguacccu ggcauacuga gu 22 <210> 803 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 803 caaaaguaau uguggauuuu gu 22 <210> 804 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 804 caaagguauu ugugguuuuu g 21 <210> 805 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 805 caggaugugg ucaaguguug uu 22 <210> 806 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 806 ccaaaacugc aguuacuuuu gc 22 <210> 807 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 807 ccucagggcu guagaacagg gcu 23 <210> 808 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 808 ccuguugaag uguaaucccc a 21 <210> 809 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 809 cgggcguggu gguggggg 18 <210> 810 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 810 cuggacugag ccgugcuacu gg 22 <210> 811 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 811 cuggagauau ggaagagcug ugu 23 <210> 812 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 812 gaugaugaug gcagcaaauu cugaaa 26 <210> 813 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 813 gggcgacaaa gcaagacucu uucuu 25 <210> 814 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 814 gucccuguuc aggcgcca 18 <210> 815 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 815 aaaaguaauc gcgguuuuug uc 22 <210> 816 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 816 gugggggaga ggcuguc 17 <210> 817 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 817 uaaagagccc uguggagaca 20 <210> 818 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 818 uaagugcuuc caugcuu 17 <210> 819 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 819 uaauugcuuc cauguuu 17 <210> 820 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 820 uacguagaua uauauguauu uu 22 <210> 821 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 821 uagcaaaaac ugcaguuacu uu 22 <210> 822 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 822 aaaaguaauu gcggauuuug cc 22 <210> 823 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 823 uaguacugug cauaucaucu au 22 <210> 824 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 824 ucauauugcu ucuuucu 17 <210> 825 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 825 ucccuguucg ggcgcca 17 <210> 826 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 826 ucgccuccuc cucuccc 17 <210> 827 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 827 ucguuugccu uuuucugcuu 20 <210> 828 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 828 ucuauacaga cccuggcuuu uc 22 <210> 829 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 829 uggacugccc ugaucuggag a 21 <210> 830 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 830 ugggaacggg uuccggcaga cgcug 25 <210> 831 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 831 agaaggaaau ugaauucauu ua 22 <210> 832 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 832 cggaugagca aagaaagugg uu 22 <210> 833 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 833 ucccaccgcu gccaccc 17 <210> 834 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 834 gcaugggugg uucagugg 18 <210> 835 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 835 acuggcuagg gaaaaugauu ggau 24 <210> 836 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 836 uauucauuua uccccagccu aca 23 <210> 837 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 837 acguuggcuc ugguggug 18 <210> 838 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 838 acucggcgug gcgucggucg ug 22 <210> 839 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 839 uucacaagga ggugucauuu au 22 <210> 840 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 840 uucucaagga ggugucguuu au 22 <210> 841 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 841 cagggaggug aaugugau 18 <210> 842 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 842 gaugaugcug cugaugcug 19 <210> 843 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 843 ucucgcuggg gccucca 17 <210> 844 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 844 uaggacacau ggucuacuuc u 21 <210> 845 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 845 ccagacagaa uucuaugcac uuuc 24 <210> 846 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 846 cucggcgcgg ggcgcgggcu cc 22 <210> 847 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 847 gcccuccgcc cgugcacccc g 21 <210> 848 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 848 gcccgcgugu ggagccaggu gu 22 <210> 849 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 849 aaaaccgucu aguuacaguu gu 22 <210> 850 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 850 cggcccgggc ugcugcuguu ccu 23 <210> 851 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 851 uccugcgcgu cccagaugcc c 21 <210> 852 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 852 ucauagcccu guacaaugcu gcu 23 <210> 853 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 853 aaaagcuggg uugagagga 19 <210> 854 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 854 uccagugccc uccucucc 18 <210> 855 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 855 auugaucauc gacacuucga acgcaau 27 <210> 856 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 856 ugaggcagua gauugaau 18 <210> 857 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 857 cggcggggac ggcgauuggu c 21 <210> 858 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 858 ugagugccgg ugccugcccu g 21 <210> 859 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 859 cgcaggggcc gggugcucac cg 22 <210> 860 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 860 ccaguccugu gccugccgcc u 21 <210> 861 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 861 ugaguaccgc caugucuguu ggg 23 <210> 862 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 862 caccaggcau uguggucucc 20 <210> 863 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 863 uacccagagc augcagugug aa 22 <210> 864 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 864 ucugcccccu ccgcugcugc ca 22 <210> 865 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 865 cccugugccc ggcccacuuc ug 22 <210> 866 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 866 ggaggggucc cgcacuggga gg 22 <210> 867 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 867 accuugccuu gcugcccggg cc 22 <210> 868 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 868 ccccagggcg acgcggcggg 20 <210> 869 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 869 ucaggccagg cacaguggcu ca 22 <210> 870 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 870 accgugcaaa gguagcaua 19 <210> 871 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 871 cccccacaac cgcgcuugac uagcu 25 <210> 872 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 872 ccuccugccc uccuugcugu 20 <210> 873 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 873 cucccacugc uucacuugac ua 22 <210> 874 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 874 uguuuugaua acaguaaugu 20 <210> 875 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 875 guguuaauua aaccucuauu uac 23 <210> 876 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 876 cuguaauaua aauuuaauuu auu 23 <210> 877 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 877 uuggggaaac ggccgcugag ug 22 <210> 878 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 878 uagucccuuc cuugaagcgg uc 22 <210> 879 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 879 cgagccucaa gcaagggacu u 21 <210> 880 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 880 agcuuccaug acuccugaug ga 22 <210> 881 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 881 caucagaauu cauggaggcu ag 22 <210> 882 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 882 gguucuuagc auaggagguc u 21 <210> 883 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 883 ccucccaugc caagaacucc c 21 <210> 884 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 884 uguucucuuu gccaaggaca g 21 <210> 885 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 885 gcuggugcaa aaguaauggc gg 22 <210> 886 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 886 ucugcaagug ucagaggcga gg 22 <210> 887 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 887 ugacagcgcc cugccuggcu c 21 <210> 888 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 888 gagagcagug uguguugccu gg 22 <210> 889 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 889 gggacccagg gagagacgua ag 22 <210> 890 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 890 cuuccgcccc gccgggcguc g 21 <210> 891 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 891 ggggccuggc ggugggcgg 19 <210> 892 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 892 guuagggcca acaucucuug g 21 <210> 893 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 893 auauggguuu acuaguuggu 20 <210> 894 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 894 ugccuggaac auaguaggga cu 22 <210> 895 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 895 auaggacuca uauagugcca g 21 <210> 896 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 896 ugugacugca uuaugaaaau ucu 23 <210> 897 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 897 uggcuuuuaa cuuugauggc 20 <210> 898 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 898 cacagcaagu guagacaggc a 21 <210> 899 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 899 uaaauagagu aggcaaagga ca 22 <210> 900 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 900 guugggacaa gaggacgguc uu 22 <210> 901 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 901 cagagaauug uuuaauc 17 <210> 902 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 902 uucgcgggcg aaggcaaagu c 21 <210> 903 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 903 auggccaaaa cugcaguuau uuu 23 <210> 904 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 904 uagaggaagc uguggagaga 20 <210> 905 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 905 ugagggacag augccagaag ca 22 <210> 906 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 906 caucuggcau ccgucacaca ga 22 <210> 907 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 907 aucagggcuu guggaauggg aag 23 <210> 908 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 908 ucuggcaagu aaaaaacucu cau 23 <210> 909 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 909 gcaguagugu agagauuggu uu 22 <210> 910 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 910 uacccagucu ccggugcagc c 21 <210> 911 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 911 gcugcaccgg agacugggua a 21 <210> 912 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 912 ucgaggacug guggaagggc cuu 23 <210> 913 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 913 uggguagaga aggagcucag agga 24 <210> 914 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 914 uaaagaacuc uuaaaaccca au 22 <210> 915 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 915 acuggacuug gaggcagaa 19 <210> 916 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 916 ugauggauaa aagacuacau auu 23 <210> 917 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 917 ugccuaggcu gagacugcag ug 22 <210> 918 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 918 auacacauac acgcaacaca cau 23 <210> 919 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 919 cugacugaau agguaggguc auu 23 <210> 920 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 920 accugagguu gugcauuucu aa 22 <210> 921 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 921 ucuguagccu gggagcaaug gggu 24 <210> 922 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 922 uguggacagu gagguagagg gagu 24 <210> 923 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 923 uaggagcuca acagaugccu guu 23 <210> 924 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 924 agcuuuuggg aauucaggua gu 22 <210> 925 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 925 caaaagugau cgugguuuuu g 21 <210> 926 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 926 gagggcgggu ggaggagga 19 <210> 927 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 927 aaggccuuuc ugaaccuuca ga 22 <210> 928 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 928 auaacauugu aaagcgcuuc uuucg 25 <210> 929 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 929 caaagacugc aauuacuuuu gcg 23 <210> 930 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 930 aggggaccaa agagauauau ag 22 <210> 931 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 931 auauaccugu ucggucucuu ua 22 <210> 932 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 932 agauauuuug aguguuugga auug 24 <210> 933 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 933 ggcgacaaaa cgagacccug uc 22 <210> 934 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 934 caugcuagga uagaaagaau gg 22 <210> 935 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 935 gguugggcag ugaggagggu guga 24 <210> 936 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 936 agcuacaguu acuuuugcac ca 22 <210> 937 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 937 uggaaaaaac uggugugugc uu 22 <210> 938 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 938 uuuguaugga uaugugugug uau 23 <210> 939 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 939 cuggggagau ccucgagguu gg 22 <210> 940 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 940 gguggggcaa ugggaucagg u 21 <210> 941 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 941 uguguuagaa uaggggcaau aa 22 <210> 942 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 942 ggggaaagcg aguagggaca uuu 23 <210> 943 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 943 gauaucagcu caguaggcac cg 22 <210> 944 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 944 cagaagggga guugggagca ga 22 <210> 945 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 945 ccaggcucug cagugggaac u 21 <210> 946 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 946 aaagaucugg aagugggaga ca 22 <210> 947 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 947 uucagccagg cuagugcagu cu 22 <210> 948 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 948 aagggcuucc ucucugcagg ac 22 <210> 949 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 949 uaggauuaca agugucggcc ac 22 <210> 950 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 950 agagcugaga cuagaaagcc ca 22 <210> 951 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 951 cugauaagaa cagaggccca gau 23 <210> 952 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 952 uuagggagua gaaggguggg gag 23 <210> 953 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 953 uauaaaauga gggcaguaag ac 22 <210> 954 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 954 ugugacuuua agggaaaugg cg 22 <210> 955 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 955 agguggaugc aaugugaccu ca 22 <210> 956 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 956 cgcagacaau gccuacuggc cua 23 <210> 957 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 957 aucccaccac ugccaccau 19 <210> 958 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 958 aggauuucag aaauacuggu gu 22 <210> 959 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 959 gaguucuaca gucagac 17 <210> 960 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 960 uaggacugug cuuggcacau ag 22 <210> 961 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 961 cugggguucu gagacagaca gu 22 <210> 962 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 962 agauguaugg aaucuguaua uauc 24 <210> 963 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 963 ugggguuuug caguccuua 19 <210> 964 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 964 aaaggaggaa auaggcaggc ca 22 <210> 965 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 965 gggaugguag accggugacg ugc 23 <210> 966 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 966 agguuguccg uggugaguuc gca 23 <210> 967 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 967 cccaauacac ggucgaccuc uu 22 <210> 968 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 968 uagugaguua gagaugcaga gcc 23 <210> 969 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 969 cggggagaga acgcagugac gu 22 <210> 970 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 970 acuggccugg gacuaccgg 19 <210> 971 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 971 ugcacggcac uggggacacg u 21 <210> 972 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 972 ggggcgcggc cggaucg 17 <210> 973 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 973 agaaggggug aaauuuaaac gu 22 <210> 974 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 974 cuuccagacg cuccgcccca cgucg 25 <210> 975 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 975 uggggcggag cuuccggagg cc 22 <210> 976 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 976 aaaaguaacu gcgguuuuug ccu 23 <210> 977 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 977 aucgggcccu cggcgccgg 19 <210> 978 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 978 gcuucuguag uguaguc 17 <210> 979 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 979 gccucucucg gagucgcucg ga 22 <210> 980 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 980 ugaggggccu cagaccgagc uuuu 24 <210> 981 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 981 agaagaaggc ggucggucug cgg 23 <210> 982 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 982 ucaacaaaau cacugaugcu gga 23 <210> 983 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 983 ucagcaccag gauauuguug gag 23 <210> 984 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 984 caggcgucug ucuacguggc uu 22 <210> 985 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 985 ucacgcggag agauggcuuu g 21 <210> 986 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 986 uuggccaugg ggcugcgcgg 20 <210> 987 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 987 agaggcuuug ugcggauacg ggg 23 <210> 988 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 988 cccuuggguc ugauggggua g 21 <210> 989 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 989 aaagcugggu ugagaagg 18 <210> 990 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 990 uguggaaggu agacggccag aga 23 <210> 991 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 991 uggaagguag acggccagag ag 22 <210> 992 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 992 uggggacgua gcuggccaga cag 23 <210> 993 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 993 ucugggaggu uguagcagug gaa 23 <210> 994 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 994 uccugcguag gaucugagga gu 22 <210> 995 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 995 ggccagccac caggagggcu g 21 <210> 996 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 996 cgcgccgggc ccggguu 17 <210> 997 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 997 cggggcggca ggggccuc 18 <210> 998 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 998 uaaaaacugc aauuacuuuc a 21 <210> 999 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 999 ggaggcgcag gcucggaaag gcg 23 <210> 1000 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1000 guggaguccu ggggaaugga ga 22 <210> 1001 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1001 agggacugcc uuaggagaaa guu 23 <210> 1002 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1002 caccuugcgc uacucagguc ug 22 <210> 1003 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1003 gggauaugaa gaaaaau 17 <210> 1004 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1004 uucucaagag ggaggcaauc au 22 <210> 1005 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1005 auugacaccu cugugagugg a 21 <210> 1006 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1006 uggaagggag aagagcuuua au 22 <210> 1007 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1007 gaacccauga gguugaggcu gcagu 25 <210> 1008 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1008 cagugcaaug uuuuccuu 18 <210> 1009 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1009 augugggcuc aggcuca 17 <210> 1010 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1010 ugccuuccug ucugug 16 <210> 1011 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1011 acuggacuug gagucagaag agugg 25 <210> 1012 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1012 cagccugaca ggaacag 17 <210> 1013 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1013 gggagucuac agcaggg 17 <210> 1014 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1014 ucccacuacu ucacuuguga 20 <210> 1015 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1015 gcuggugaca ugagaggc 18 <210> 1016 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1016 cugggacagg aggaggaggc ag 22 <210> 1017 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1017 ugggagcugg acuacuuc 18 <210> 1018 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1018 ccggcauguc cagggca 17 <210> 1019 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1019 ccaguguggc ucagcgag 18 <210> 1020 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1020 uucugagcug aggacag 17 <210> 1021 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1021 ccuagacacc uccaguuc 18 <210> 1022 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1022 uggagagaaa ggcagua 17 <210> 1023 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1023 cuggagucua ggauucca 18 <210> 1024 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1024 aauguuuuuu ccuguuucc 19 <210> 1025 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1025 ucccuggagu uucuucuu 18 <210> 1026 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1026 gcagcauuca uguccc 16 <210> 1027 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1027 gaaagagagc ugagugug 18 <210> 1028 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1028 ggccuuguuc cugucccca 19 <210> 1029 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1029 agcccccugg ccccaaaccc 20 <210> 1030 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1030 ccgcuuucug agcuggac 18 <210> 1031 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1031 ggugaggcua gcuggug 17 <210> 1032 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1032 cucugggaaa ugggacag 18 <210> 1033 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1033 cacugugggu acaugcu 17 <210> 1034 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1034 ucccugagca aagccac 17 <210> 1035 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1035 gggauucugu agcuuccu 18 <210> 1036 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1036 acauugccag ggaguuu 17 <210> 1037 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1037 cugugggcuc agcgcguggg g 21 <210> 1038 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1038 uuagcggugg accgcccugc g 21 <210> 1039 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1039 cagccccaca gccucaga 18 <210> 1040 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1040 cccugagacc cuaaccuuaa 20 <210> 1041 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1041 aucugaccug augaaggu 18 <210> 1042 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1042 ccagaggugg ggacugag 18 <210> 1043 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1043 ccccgccacc gccuugg 17 <210> 1044 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1044 caguuggguc uaggggucag ga 22 <210> 1045 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1045 cuuggggcau ggaguccca 19 <210> 1046 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1046 agggcauguc cagggggu 18 <210> 1047 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1047 ccugagaaaa gggccaa 17 <210> 1048 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1048 gccuggagcu acuccaccau cuc 23 <210> 1049 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1049 caguguucag agaugga 17 <210> 1050 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1050 ggccacugag ucagcacca 19 <210> 1051 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1051 uugcacuugu cucaguga 18 <210> 1052 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1052 uguuccucug ucucccagac 20 <210> 1053 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1053 ggcuugcaug ggggacugg 19 <210> 1054 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1054 aggaaacagg gaccca 16 <210> 1055 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1055 cugugggcuc agcucuggg 19 <210> 1056 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1056 cuaggaggcc uuggcc 16 <210> 1057 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1057 uccagcucgg uggcac 16 <210> 1058 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1058 gacauucaga cuaccug 17 <210> 1059 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1059 auccccagau acaauggaca a 21 <210> 1060 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1060 ggcuccuccu cucaggaugu g 21 <210> 1061 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1061 gcaggcacag acagcccugg c 21 <210> 1062 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1062 auucuaagug ccuuggcc 18 <210> 1063 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1063 acucagucau ggucauu 17 <210> 1064 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1064 ucagggaguc aggggagggc 20 <210> 1065 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1065 gggggaagaa aaggugggg 19 <210> 1066 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1066 cauucaacua gugauugu 18 <210> 1067 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1067 guguucucug auggacag 18 <210> 1068 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1068 cucagugacu caugugc 17 <210> 1069 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1069 ccaauuacca cuucuuu 17 <210> 1070 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1070 cagcaguccc ucccccug 18 <210> 1071 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1071 gggucccggg gagggggg 18 <210> 1072 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1072 gcaguucuga gcacaguaca c 21 <210> 1073 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1073 cucuccuccc ggcuuc 16 <210> 1074 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1074 cuaggggguu ugcccuug 18 <210> 1075 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1075 gaguguaguu cugagcagag c 21 <210> 1076 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1076 uaaaauuugc auccagga 18 <210> 1077 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1077 gcggcgaguc cgacucau 18 <210> 1078 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1078 uggggcucag cgaguuu 17 <210> 1079 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1079 gggcucacau caccccau 18 <210> 1080 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1080 accccacucc ugguacc 17 <210> 1081 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1081 ucucccuuga gggcacuuu 19 <210> 1082 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1082 uugucugcug aguuucc 17 <210> 1083 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1083 ccccugggcc ggccuugg 18 <210> 1084 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1084 gcauugugca gggcuauca 19 <210> 1085 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1085 ugcccuccuu ucuucccuc 19 <210> 1086 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1086 uucagcagga acagcu 16 <210> 1087 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1087 ccugagaccc uaguuccac 19 <210> 1088 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1088 ccucagauca gagccuugc 19 <210> 1089 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1089 aauccuugcu accugggu 18 <210> 1090 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1090 ccaguuuucc caggauu 17 <210> 1091 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> ribose <400> 1091 gcauucaccg cgugccuuaa au 22 <210> 1092 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> ribose <400> 1092 uuaaggcacg cggugaaugc ca 22 <210> 1093 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1093 uaaggcacgc ggugaaugca 20 <210> 1094 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1094 uaaggcacgc ggugaaugca 20 <210> 1095 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1095 uaaggcacgc ggugaaucca 20 <210> 1096 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1096 uaaggcacgc ggugaagcca 20 <210> 1097 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1097 uaaggcacgc ggugaugcca 20 <210> 1098 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1098 uaaggcacgc ggugaugcca 20 <210> 1099 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1099 uaaggcacgc gguaaugcca 20 <210> 1100 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1100 uaaggcacgc gggaaugcca 20 <210> 1101 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1101 uaaggcacgc gugaaugcca 20 <210> 1102 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1102 uaaggcacgc gugaaugcca 20 <210> 1103 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1103 uaaggcacgg gugaaugcca 20 <210> 1104 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1104 uaaggcaccg gugaaugcca 20 <210> 1105 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1105 uaaggcagcg gugaaugcca 20 <210> 1106 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1106 uaaggccgcg gugaaugcca 20 <210> 1107 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1107 uaaggacgcg gugaaugcca 20 <210> 1108 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1108 uaagcacgcg gugaaugcca 20 <210> 1109 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1109 uaagcacgcg gugaaugcca 20 <210> 1110 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1110 uaggcacgcg gugaaugcca 20 <210> 1111 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1111 uaggcacgcg gugaaugcca 20 <210> 1112 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1112 uaaggcacgc ggugaauga 19 <210> 1113 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1113 uaaggcacgc ggugaauca 19 <210> 1114 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1114 uaaggcacgc ggugaacca 19 <210> 1115 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1115 uaaggcacgc ggugagcca 19 <210> 1116 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1116 uaaggcacgc ggugugcca 19 <210> 1117 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1117 uaaggcacgc gguaugcca 19 <210> 1118 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1118 uaaggcacgc ggaaugcca 19 <210> 1119 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1119 uaaggcacgc ggaaugcca 19 <210> 1120 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1120 uaaggcacgc ugaaugcca 19 <210> 1121 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1121 uaaggcacgg ugaaugcca 19 <210> 1122 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1122 uaaggcacgg ugaaugcca 19 <210> 1123 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1123 uaaggcacgg ugaaugcca 19 <210> 1124 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> C6-spacer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl <400> 1124 uaaggcgcgg ugaaugcca 19 <210> 1125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides modified or unmodified as described <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic <400> 1125 guaugaccga cuacgcguat t 21 <210> 1126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> ribose <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1126 uacgcguagu cggucauacu u 21 <210> 1127 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> ribose <400> 1127 uuaaggcacg cggugaaugc ca 22 <210> 1128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> ribose <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1128 uaaggcacgc ggugaaugcc a 21 <210> 1129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1129 uaaggcacgc ggugaaugcc a 21 <210> 1130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides modified or unmodified as described <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> deoxy <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic <400> 1130 aggucaucca ugacaacuut t 21 <210> 1131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> ribose <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1131 aaguugucau ggaugaccuu u 21 <210> 1132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides modified or unmodified as described <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribose <400> 1132 uccagauugu ccgcaacuat t 21 <210> 1133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides modifed or unmodified as described <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribose <400> 1133 uaguugcgga caaucuggat t 21 <210> 1134 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> ribose <400> 1134 gcauucaccg cgugccuuaa u 21 <210> 1135 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1135 uuaagagaag ccuuacuggu u 21 <210> 1136 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1136 uuaagagaag ccuucugguu 20 <210> 1137 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1137 uuaagagaag ccuuaugguu 20 <210> 1138 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1138 uuaagagaag ccuuacgguu 20 <210> 1139 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1139 uuaagagaag ccuuacuguu 20 <210> 1140 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1140 uuaagagaag ccuuacuguu 20 <210> 1141 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1141 uuucaauugu augugagguu 20 <210> 1142 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1142 auggauuccu ucaggacguu 20 <210> 1143 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1143 uuacuuugac agucauacuu 20 <210> 1144 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1144 uuugggacga auguaugcuu 20 <210> 1145 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1145 uuagaauagu ugaggaacuu 20 <210> 1146 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1146 auuggcuguu agaaugcguu 20 <210> 1147 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1147 ucuccauuca uuccuaucuu 20 <210> 1148 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1148 uuugcuucau uauaggaguu 20 <210> 1149 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1149 uuuugcuuca uuauaggguu 20 <210> 1150 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1150 ugaggacuug agggcugcuu 20 <210> 1151 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1151 aaauuuguua guuagagguu 20 <210> 1152 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1152 gcugcacucc uucugcuguu 20 <210> 1153 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1153 ucaaauucua uuaucucuuu 20 <210> 1154 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1154 aaccuugaua ucuuugaguu 20 <210> 1155 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1155 acaucauuau cuguaaucuu 20 <210> 1156 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1156 ugcagcaagc ugcugaaguu 20 <210> 1157 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1157 uugaucuaaa ugcauugguu 20 <210> 1158 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1158 aacaaaguau uugacacguu 20 <210> 1159 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1159 uccuauacug gcuucuaguu 20 <210> 1160 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1160 uuaagagaag ccuucugguu 20 <210> 1161 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1161 aaucaaauga uugcuuuuuu 20 <210> 1162 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1162 uucaguguga ugacacuguu 20 <210> 1163 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1163 ugguauucag ugugaugcuu 20 <210> 1164 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1164 uugguauuca gugugauauu 20 <210> 1165 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1165 uucccucuaa uuuguacguu 20 <210> 1166 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1166 ugguauuucc auuaagucuu 20 <210> 1167 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1167 aagcugaacu ugugaucauu 20 <210> 1168 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1168 ugauuaaucu ugauuuccuu 20 <210> 1169 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1169 uuuauaguag ucuacaaguu 20 <210> 1170 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1170 uuucaauugu augugagauu 20 <210> 1171 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1171 auggauuccu ucaggacuuu 20 <210> 1172 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1172 uuacuuugac agucauacuu 20 <210> 1173 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1173 uuugggacga auguaugcuu 20 <210> 1174 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1174 uuagaauagu ugaggaaguu 20 <210> 1175 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1175 auuggcuguu agaaugcuuu 20 <210> 1176 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1176 ucuccauuca uuccuauauu 20 <210> 1177 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1177 uuugcuucau uauaggaguu 20 <210> 1178 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1178 uuuugcuuca uuauaggauu 20 <210> 1179 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1179 ugaggacuug agggcugguu 20 <210> 1180 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1180 aaauuuguua guuagagauu 20 <210> 1181 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1181 gcugcacucc uucugcuuuu 20 <210> 1182 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1182 ucaaauucua uuaucucauu 20 <210> 1183 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1183 aaccuugaua ucuuugacuu 20 <210> 1184 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1184 acaucauuau cuguaauuuu 20 <210> 1185 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1185 ugcagcaagc ugcugaauuu 20 <210> 1186 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1186 uugaucuaaa ugcauuguuu 20 <210> 1187 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1187 uugaucuaaa ugcauuguuu 20 <210> 1188 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1188 uccuauacug gcuucuauuu 20 <210> 1189 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1189 auuucaggaa uuguuaaauu 20 <210> 1190 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1190 aaucaaauga uugcuuuguu 20 <210> 1191 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1191 uucaguguga ugacacuuuu 20 <210> 1192 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1192 ugguauucag ugugaugauu 20 <210> 1193 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1193 uugguauuca gugugauguu 20 <210> 1194 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1194 uucccucuaa uuuguacuuu 20 <210> 1195 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1195 ugguauuucc auuaaguuuu 20 <210> 1196 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1196 aagcugaacu ugugaucauu 20 <210> 1197 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1197 ugauuaaucu ugauuucuuu 20 <210> 1198 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> C3-spacer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 2'-O-methyl <400> 1198 uuuauaguag ucuacaaauu 20 <210> 1199 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1199 uuucaauugu augugagagu u 21 <210> 1200 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1200 auggauuccu ucaggacugu u 21 <210> 1201 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1201 uuacuuugac agucauaccu u 21 <210> 1202 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1202 uuugggacga auguaugccu u 21 <210> 1203 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1203 uuagaauagu ugaggaagcu u 21 <210> 1204 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (2)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 2'-O-methyl <400> 1204 auuggcuguu agaaugcugu u 21 <210> 1205 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1205 ucuccauuca uuccuauacu u 21 <210> 1206 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1206 uuugcuucau uauaggaggu u 21 <210> 1207 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1207 uuuugcuuca uuauaggagu u 21 <210> 1208 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1208 ugaggacuug agggcuggcu u 21 <210> 1209 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1209 aaauuuguua guuagagagu u 21 <210> 1210 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1210 gcugcacucc uucugcuugu u 21 <210> 1211 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1211 ucaaauucua uuaucucauu u 21 <210> 1212 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1212 aaccuugaua ucuuugacgu u 21 <210> 1213 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1213 acaucauuau cuguaauucu u 21 <210> 1214 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1214 ugcagcaagc ugcugaaugu u 21 <210> 1215 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1215 uugaucuaaa ugcauugugu u 21 <210> 1216 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1216 aacaaaguau uugacacggu u 21 <210> 1217 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1217 uccuauacug gcuucuaugu u 21 <210> 1218 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1218 auuucaggaa uuguuaaagu u 21 <210> 1219 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1219 aaucaaauga uugcuuuguu u 21 <210> 1220 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1220 uucaguguga ugacacuugu u 21 <210> 1221 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1221 ugguauucag ugugaugacu u 21 <210> 1222 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1222 uugguauuca gugugaugau u 21 <210> 1223 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1223 uucccucuaa uuuguacugu u 21 <210> 1224 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1224 ugguauuucc auuaaguucu u 21 <210> 1225 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1225 aagcugaacu ugugaucaau u 21 <210> 1226 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1226 ugauuaaucu ugauuucucu u 21 <210> 1227 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 1227 uuuauaguag ucuacaaagu u 21

Claims (22)

  1. (a) 자가 상보적이지 않은 제1 뉴클레오티드 부분 (N1) 및 제2 뉴클레오티드 부분 (N2)을 포함하는 핵산 부분이며, 여기서 상기 핵산 부분이 표적 RNA의 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있는 8개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 핵산 부분 내의 뉴클레오티드의 총 개수가 뉴클레오티드 8개 내지 26개인 핵산 부분; 및
    (i) 제1 뉴클레오티드 부분과 제2 뉴클레오티드 부분을 공유적으로 연결하는 제1 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S1)을 적어도 포함하는 내부의 스페이서 부분
    을 포함하는, 표적 RNA에 대한 RNA 간섭을 매개하는 단일-가닥 RNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 하기의 구조를 포함하는 분자.
    5' N1 - S1 - N2 3'
    상기 식에서,
    (a) N1은 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물을 함유하고;
    (b) S1은 N1과 N2를 공유적으로 연결하는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 스페이서를 함유하며;
    (c) N2는 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 연속적인 신장물을 함유한다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, S1이 지방족 또는 방향족 유기 기인 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, S1이 임의로 치환된 C1-C12 알킬 사슬인 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 알킬 사슬이 콜레스테롤로 임의로 치환된 것인 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, S1이 C3 알킬, C6 알킬, 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, N1이 뉴클레오티드 13개 내지 20개의 길이인 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 부분 내의 뉴클레오티드의 총 개수가 뉴클레오티드 약 19개 내지 약 21개인 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 부위가 표적 RNA의 비번역 영역 내에 있는 것인 분자.
  10. 제9항에 있어서, 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있는 8개 이상의 뉴클레오티드가 천연-발생 내인성 miRNA 뉴클레오티드 서열의 시드(seed) 서열의 전체 또는 일부인 분자.
  11. 제10항에 있어서, S1이 천연-발생 내인성 miRNA 뉴클레오티드 서열의 1개 내지 4개의 내부 뉴클레오티드를 대신하는 것인 분자.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 분자의 핵산 부분이 천연-발생 내인성 miRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 50％ 이상 상동성인 분자.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 부위가 표적 RNA의 유전자 코딩 영역 내에 있는 것인 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 분자의 핵산 부분이 표적 부위에 대해 90％ 이상 상보적인 것인 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 부분이 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 부분이 제3 뉴클레오티드 부분 (N3)을 추가로 포함하고, 내부의 스페이서 부분이 제2 비-뉴클레오티드 스페이서 부분 (S2)을 추가로 포함하는 것인 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오티드가 변형된 당을 갖는 것인 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 것인 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-말단, 3'-말단, 또는 5'- 및 3'-말단 둘 모두에 말단 캡(cap)을 갖는 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 단일-가닥 RNA 분자, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 리포솜, 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 생접착성 마이크로스피어, 또는 단백질성 벡터를 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내의 내인성 RNA 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
KR1020137007266A 2010-08-24 2011-08-19 내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제 KR20130137160A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37647110P 2010-08-24 2010-08-24
US61/376,471 2010-08-24
PCT/US2011/048338 WO2012027206A1 (en) 2010-08-24 2011-08-19 SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130137160A true KR20130137160A (ko) 2013-12-16

Family

ID=45723747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137007266A KR20130137160A (ko) 2010-08-24 2011-08-19 내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제

Country Status (6)

Country Link
US (3) US9243246B2 (ko)
EP (2) EP3372684B1 (ko)
JP (5) JP6106085B2 (ko)
KR (1) KR20130137160A (ko)
CN (1) CN103140582A (ko)
WO (1) WO2012027206A1 (ko)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US8748405B2 (en) * 2007-01-26 2014-06-10 City Of Hope Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases
US9096850B2 (en) 2009-08-24 2015-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. Segmented micro RNA mimetics
JP6106085B2 (ja) * 2010-08-24 2017-03-29 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 内部非核酸スペーサーを含む一本鎖ＲＮＡｉ剤
DK2632472T3 (en) 2010-10-29 2018-03-19 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA)
BR112013012319A2 (pt) 2010-12-15 2019-09-24 Miragen Therapeutics inibidores de micro rna compreendendo nucleotídeos bloqueados
EP2763703B1 (en) 2011-10-06 2018-02-14 Miragen Therapeutics, Inc. Control of whole body energy homeostasis by microrna regulation
EP3358013B1 (en) * 2012-05-02 2020-06-24 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
US9334498B2 (en) 2012-05-10 2016-05-10 Uab Research Foundation Methods and compositions for modulating MIR-204 activity
US20140378526A1 (en) * 2012-05-11 2014-12-25 City Of Hope Design of nucleic acid binding molecules with non-watson crick and non-canonical pairing based on artificial mutation consensus sequences to counter escape mutations
LT2852602T (lt) * 2012-05-21 2020-10-26 Agilent Technologies, Inc. Oligonukleotidų konjugavimo būdas
WO2013182553A2 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh CELL ENGINEERING USING RNAs
WO2013192576A2 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Miragen Therapeutics Oligonucleotide-based inhibitors comprising locked nucleic acid motif
KR102298475B1 (ko) 2013-10-04 2021-09-06 노파르티스 아게 ＲＮＡ 간섭에 사용하기 위한 ＲＮＡｉ 작용제를 위한 3' 말단 캡
JP6546161B2 (ja) * 2013-10-04 2019-07-17 ノバルティス アーゲー Ｂ型肝炎ウイルスを治療するための有機化合物
CN104560992B (zh) * 2013-10-10 2018-01-02 复旦大学附属妇产科医院 一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染和宫颈癌的微小rna
KR101696704B1 (ko) * 2013-12-17 2017-01-16 주식회사 인코드젠 오프-타겟을 막기 위해 변형된 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도
WO2015106255A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 City Of Hope Multivalent oligonucleotide assemblies
CN103924002B (zh) * 2014-05-04 2016-01-20 山东大学 血清中的microRNA作为肝癌诊断标志物的应用
CN111996254A (zh) * 2014-06-12 2020-11-27 东丽株式会社 前列腺癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
CN107636003A (zh) 2015-01-20 2018-01-26 米拉根医疗股份有限公司 miR‑92抑制剂及其用途
KR20180039162A (ko) 2015-08-20 2018-04-17 아소시아시온 센트로 데 인베스티가시온 코오페라티바 엔 비오시엔시아스-시스 비오구네 간 질환 및 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
TWI685500B (zh) * 2015-10-13 2020-02-21 長庚大學 以微核酸-５２０ｂ（ｍｉＲ-５２０ｂ）序列作爲抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移及其醫藥組成物之用途
US20190194655A1 (en) * 2015-12-08 2019-06-27 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs having an auxiliary moiety non-bioreversibly linked to an internucleoside phosphate or phosphorothioate
US11365415B2 (en) * 2016-04-14 2022-06-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of miR-223-3p as a cancer therapeutic and method for treating cancer using the same
CN105861728A (zh) * 2016-06-12 2016-08-17 上海市第十人民医院 循环miRNA作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用
CN107630015B (zh) * 2016-07-19 2021-03-09 上海市东方医院 一种稳定的dna-rna双链结构
JP2019532027A (ja) 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
JP2019535839A (ja) 2016-11-29 2019-12-12 ピュアテック ヘルス エルエルシー 治療剤の送達のためのエクソソーム
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
KR102193874B1 (ko) * 2018-05-31 2020-12-23 고려대학교 산학협력단 마이크로rna를 억제하는 변형 핵산 및 이의 용도
US11535899B2 (en) 2018-08-10 2022-12-27 Toray Industries, Inc. Kit, device and method for detecting prostate cancer
CN109706239A (zh) * 2018-09-26 2019-05-03 南京市妇幼保健院 一种miR-1976在防治细菌性阴道病中的应用
US11879125B2 (en) 2022-03-16 2024-01-23 Empirico Inc. GalNAc compositions for improving siRNA bioavailability
CN114767703B (zh) * 2022-06-20 2022-09-02 山东恺悌生物制品有限公司 miR-4311模拟物在制备肺癌治疗药物中的应用

Family Cites Families (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
WO1991003162A1 (en) 1989-08-31 1991-03-21 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5495009A (en) 1989-10-24 1996-02-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs containing thioformacetal linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5962219A (en) 1990-06-11 1999-10-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-selex
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
US6469158B1 (en) 1992-05-14 2002-10-22 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
EP0642589A4 (en) 1992-05-11 1997-05-21 Ribozyme Pharm Inc METHOD AND REAGENT TO INHIBIT VIRAL REPLICATION.
US5977343A (en) 1992-05-14 1999-11-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
WO2002081494A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
US5804683A (en) 1992-05-14 1998-09-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Deprotection of RNA with alkylamine
JPH08501928A (ja) 1992-07-02 1996-03-05 ハイブライドン インコーポレイテッド 治療剤としての自己安定化オリゴヌクレオチド
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
US6174868B1 (en) 1992-09-10 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis C virus-associated diseases
US6235886B1 (en) 1993-09-03 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of synthesis and use
US5767264A (en) 1993-01-22 1998-06-16 Mta Zozponti Kemiai Kutato Intezet Oligodeoxynucleotides containing 5-alkyl, 5-(1-alkenyl)- and 5-(1-alkynl) pyrimidines
WO1994016736A1 (en) 1993-01-22 1994-08-04 University Research Corporation Localization of therapeutic agents
US6410322B1 (en) 1993-07-27 2002-06-25 Hybridon Inc Antisense oligonucleotide inhibition of vascular endothelial growth factor expression
EP0748382B1 (en) 1993-09-02 2002-11-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5861288A (en) 1993-10-18 1999-01-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Catalytic DNA
ES2127948T3 (es) 1993-10-27 1999-05-01 Ribozyme Pharm Inc Oligonucleotidos modificados en la posicion 2'-amido y 2'-peptido.
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5587471A (en) 1994-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of making oligonucleotide libraries
US5902880A (en) 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US6447796B1 (en) 1994-05-16 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres
US6146886A (en) 1994-08-19 2000-11-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5716824A (en) 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
AU4412096A (en) 1994-12-13 1996-07-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
WO2002096927A2 (en) 2001-05-29 2002-12-05 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Ribozyme based treatment of female reproductive diseases
TW520293B (en) 1995-11-22 2003-02-11 Univ Johns Hopkins Med Delivery system to enhance cellular uptake of biomolecules
DE69637256T2 (de) 1996-01-16 2008-06-19 Sirna Therapeutics, Inc., Boulder Synthese von Methoxynukleoside und enzymatische Nukleisäure Moleküle
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6248878B1 (en) 1996-12-24 2001-06-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside analogs
WO1998028317A2 (en) 1996-12-24 1998-07-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of nucleosides and polynucleotides
US6001311A (en) 1997-02-05 1999-12-14 Protogene Laboratories, Inc. Apparatus for diverse chemical synthesis using two-dimensional array
US6235310B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Valentis, Inc. Methods of delivery using cationic lipids and helper lipids
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
WO1998058630A1 (en) 1997-06-23 1998-12-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposome-entrapped polynucleotide composition and method
US6395713B1 (en) 1997-07-23 2002-05-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions for the delivery of negatively charged molecules
TW589189B (en) 1997-08-04 2004-06-01 Scras Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis
DE04020014T1 (de) 1997-09-12 2006-01-26 Exiqon A/S Bi-zyklische - Nukleosid,Nnukleotid und Oligonukleotid-Analoga
CA2315256A1 (en) 1997-12-16 1999-06-24 Valentis, Inc. Needle-free injection of formulated nucleic acid molecules
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
CA2317549C (en) 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
US6410328B1 (en) 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
CA2326823A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
WO1999055857A2 (en) 1998-04-29 1999-11-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU3096800A (en) 1998-10-26 2000-05-15 Intervu, Inc. Audience management for interactive network events
EP2314700A1 (en) 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
JP2002537828A (ja) 1999-03-10 2002-11-12 フォゲン リミティド 細胞への物質のデリバリー
ATE465168T1 (de) 1999-03-18 2010-05-15 Exiqon As Xylo-lna analoge
EP1163250B1 (en) 1999-03-24 2006-07-12 Exiqon A/S Improved synthesis of ¬2.2.1|bicyclo nucleosides
NZ514348A (en) 1999-05-04 2004-05-28 Exiqon As L-ribo-LNA analogues
HUP0202177A3 (en) 1999-07-14 2004-05-28 Alza Corp Mountain View Neutral lipopolymer and liposomal compositions containing same
WO2001016312A2 (en) 1999-08-31 2001-03-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based modulators of gene expression
JP2003511016A (ja) 1999-10-04 2003-03-25 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチドを補充する高親和性ｒｎアーゼｈの設計
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
US6602857B1 (en) 2000-01-18 2003-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2005019453A2 (en) 2001-05-18 2005-03-03 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US6401406B1 (en) 2000-02-11 2002-06-11 Domald K. Komara Retainment device for concrete block inspection plates
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
WO2005041859A2 (en) 2003-04-30 2005-05-12 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery.
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
IL151928A0 (en) 2000-03-30 2003-04-10 Whitehead Biomedical Inst Rna sequence-specific mediators of rna interference
US20030190635A1 (en) 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
US6613567B1 (en) 2000-09-15 2003-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Her-2 expression
DK1334109T3 (da) 2000-10-04 2006-10-09 Santaris Pharma As Forbedret syntese af purin-blokerede nukleinsyre-analoger
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
JP2004536027A (ja) 2000-12-01 2004-12-02 ジョーンズ・ホプキンス・ユニーバーシティー グリコシル化／ガラクトシル化ペプチドの接合体、二官能性リンカー、およびヌクレオチドのモノマー／ポリマー、および関連する組成物および使用方法
ES2215494T5 (es) 2000-12-01 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Moléculas de RNA pequeñas que median la interferencia de RNA
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US20050164220A1 (en) 2001-03-19 2005-07-28 Decode Genetics Ehf. Susceptibility gene for human stroke: method of treatment
WO2004028341A2 (en) 2001-03-19 2004-04-08 Decode Genetics Ehf. Susceptibility gene for human stroke; methods of treatment
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
WO2003070896A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2004097020A2 (en) 2003-04-25 2004-11-11 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase gene expression
US20040019001A1 (en) 2002-02-20 2004-01-29 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of protein typrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering RNA
US20030130186A1 (en) 2001-07-20 2003-07-10 Chandra Vargeese Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003070884A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003072705A2 (en) 2002-02-20 2003-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of cyclin d1 gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
US20030125241A1 (en) 2001-05-18 2003-07-03 Margit Wissenbach Therapeutic uses of LNA-modified oligonucleotides in infectious diseases
WO2003070197A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TGF-BETA AND TGF-BETA RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP2415486B1 (en) 2001-05-18 2017-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003072590A1 (en) 2002-02-20 2003-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
WO2003070743A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF G72 AND D-AMINO ACID OXIDASE (DAAO) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003070912A2 (en) 2001-06-06 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20030175950A1 (en) 2001-05-29 2003-09-18 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of HIV gene expression using short interfering RNA
WO2003070917A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of myc and myb genes or genes of their respective pathways
US20050196781A1 (en) 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of STAT3 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070910A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated INHIBITION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) AND VEGF RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003070972A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2005078097A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (Multifunctional siNA)
AU2002328792A1 (en) 2001-07-12 2003-01-29 Santaris Pharma A/S Method for preparation of lna phosphoramidites
JP2004536614A (ja) 2001-08-01 2004-12-09 ユニバーシティ オブ ユタ Ｐｄｅ３環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼのアイソフォーム選択的な阻害剤および活性化剤
US20050191627A1 (en) 2001-09-28 2005-09-01 Incyte Corporation Enzymes
MXPA04004056A (es) * 2001-10-29 2004-09-10 Univ Mcgill Oligonucleotidos que contienen enlazador aciclico y usos de los mismos.
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7141540B2 (en) 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
AU2002357860A1 (en) 2001-12-14 2003-06-30 Incyte Genomics, Inc. Enzymes
EP1472265A4 (en) 2002-02-20 2005-06-15 Sirna Therapeutics Inc INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENERATED BY RNA INTERFERENCE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
ATE519774T1 (de) 2002-02-20 2011-08-15 Sirna Therapeutics Inc Durch eine störung der rna vermittelte inhibierung der genexpression des hepatitis c virus (hcv) mit kurzer, störender nukleinsäure (short interfering nucleic acid, sina)
AU2003213005A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROTEIN KINASE C ALPHA (PKC-ALPHA) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003106476A1 (en) 2002-02-20 2003-12-24 Sirna Therapeutics, Inc Nucleic acid mediated inhibition of enterococcus infection and cytolysin toxin activity
JP2005517433A (ja) 2002-02-20 2005-06-16 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＴＮＦおよびＴＮＦレセプタースーパーファミリー遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
US8232383B2 (en) 2002-02-20 2012-07-31 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003213057A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Incoporated Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
AU2003215161A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TELOMERASE GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003070966A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7935812B2 (en) 2002-02-20 2011-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003213119A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF BCL2 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
NZ546807A (en) 2002-03-27 2007-03-30 Aegera Therapeutics Inc Antisense IAP nucleobase oligomers and uses thereof
ES2550609T3 (es) * 2002-07-10 2015-11-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Interferencia de ARN mediante de moléculas de ARN de cadena sencilla
PT1527176E (pt) 2002-08-05 2007-04-30 Atugen Ag Novas formas de muléculas de arn de interferência
AU2003261449A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-25 Compositions for rna interference and methods of use thereof
US20040029275A1 (en) * 2002-08-10 2004-02-12 David Brown Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US8133903B2 (en) 2003-10-21 2012-03-13 Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor—UCLA Medical Center Methods of use of inhibitors of phosphodiesterases and modulators of nitric oxide, reactive oxygen species, and metalloproteinases in the treatment of peyronie's disease, arteriosclerosis and other fibrotic diseases
AU2003291682A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US7816337B2 (en) 2003-02-18 2010-10-19 Roche Madison Inc. Reversible attachment of a membrane active polymer to a polynucleotide
US6977223B2 (en) 2003-03-07 2005-12-20 Massachusetts Institute Of Technology Three dimensional microfabrication
EP1608733B1 (en) 2003-04-02 2011-12-07 Dharmacon, Inc. Modified polynucleotides for use in rna interference
ES2559828T3 (es) 2003-07-16 2016-02-16 Protiva Biotherapeutics Inc. ARN de interferencia encapsulado en lípidos
NZ581166A (en) 2003-09-15 2011-06-30 Protiva Biotherapeutics Inc Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
JP2007505606A (ja) 2003-09-16 2007-03-15 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用したＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）発現のＲＮＡ干渉媒介性抑制
NZ576775A (en) * 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
US7943179B2 (en) 2003-09-23 2011-05-17 Massachusetts Institute Of Technology pH triggerable polymeric particles
CA2539752A1 (en) 2003-09-29 2005-04-07 Topigen Pharmaceutique Inc. Oligonucleotide compositions and methods for treating disease including inflammatory conditions
WO2005045034A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2005040379A2 (en) 2003-10-23 2005-05-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF RAS GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
MXPA06006892A (es) 2003-12-19 2008-02-13 Novartis Vaccines & Diagnostic Formulaciones para transfeccion celular de arn de interferencia corta, composiciones relacionadas y metodos de elaboracion y uso.
EP2700720A3 (en) 2004-03-15 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNASE H
MXPA06012076A (es) 2004-04-20 2007-01-25 Nastech Pharm Co Metodos y composiciones para mejorar el suministro de arn bicatenario o un acido nucleico hibrido bicatenario para regular la expresion genetica en celulas de mamifero.
US20060040882A1 (en) 2004-05-04 2006-02-23 Lishan Chen Compostions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells
EP1750673B1 (en) 2004-05-17 2009-12-02 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Liposomal formulations comprising dihydrosphingomyelin and methods of use thereof
US20060019258A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for detection of small interfering RNA and micro-RNA
US20060142228A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Ambion, Inc. Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference
EA201201356A1 (ru) * 2005-01-07 2013-07-30 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиция для лечения респираторных синцитиальных вирусов
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
WO2007086881A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
WO2006102970A2 (en) * 2005-03-08 2006-10-05 Qiagen Gmbh Modified short interfering rna
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
US20090176725A1 (en) 2005-08-17 2009-07-09 Sirna Therapeutics Inc. Chemically modified short interfering nucleic acid molecules that mediate rna interference
CA2619876A1 (en) 2005-08-17 2007-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified short interfering nucleic acid molecules that mediate rna interference
CN102614528B (zh) 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US20080311040A1 (en) * 2007-03-06 2008-12-18 Flagship Ventures METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED THERAPEUTIC EFFECTS WITH siRNA
WO2008115387A2 (en) * 2007-03-15 2008-09-25 University Hospitals Of Cleveland Screening, diagnosing, treating and prognosis of pathophysiologic states by rna regulation
JP5726520B2 (ja) 2007-05-22 2015-06-03 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 治療剤のためのｕｎａオリゴマー
CN101821390A (zh) * 2007-06-14 2010-09-01 米尔克斯治疗有限责任公司 用于调节靶rna活性的寡核苷酸
CA2701845A1 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel sirna structures
EP2231195B1 (en) 2007-12-04 2017-03-29 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
US8507455B2 (en) 2007-12-04 2013-08-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Folate conjugates
US20110218334A1 (en) * 2008-07-11 2011-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PHOSPHOROTHIOATE OLIGONUCLEOTIDES AND NON-NUCLEOSIDIC PHOSPHOROTHIOATES AS DELIVERY AGENTS FOR iRNA AGENTS
AU2009288078B2 (en) * 2008-09-02 2014-10-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Synthetic methods and derivatives of triphosphate oligonucleotides
WO2010048585A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
CA2752694A1 (en) * 2009-02-10 2010-08-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synthetic rna-based agonists of tlr7
EP2669290A1 (en) * 2009-03-02 2013-12-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Nucleic Acid Chemical Modifications
US9096850B2 (en) * 2009-08-24 2015-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. Segmented micro RNA mimetics
WO2011031520A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
US10913767B2 (en) * 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
JP6106085B2 (ja) * 2010-08-24 2017-03-29 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 内部非核酸スペーサーを含む一本鎖ＲＮＡｉ剤
EP2640400A4 (en) 2010-11-19 2016-01-20 Sirna Therapeutics Inc POLYMERIC POLYMERS (AMIDE) FOR THE ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES
EP4141116A1 (en) 2011-11-18 2023-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
EP3358013B1 (en) 2012-05-02 2020-06-24 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions

Also Published As

Publication number Publication date
EP3372684A1 (en) 2018-09-12
JP2017079776A (ja) 2017-05-18
EP2609198B1 (en) 2018-02-21
US20180080024A1 (en) 2018-03-22
EP2609198B8 (en) 2018-03-28
US9845466B2 (en) 2017-12-19
EP3372684B1 (en) 2020-10-07
JP2020074788A (ja) 2020-05-21
JP2013535982A (ja) 2013-09-19
JP6106085B2 (ja) 2017-03-29
WO2012027206A1 (en) 2012-03-01
US20160222381A1 (en) 2016-08-04
US20130171242A1 (en) 2013-07-04
JP2023100832A (ja) 2023-07-19
JP2022037070A (ja) 2022-03-08
US9243246B2 (en) 2016-01-26
US10584335B2 (en) 2020-03-10
EP2609198A1 (en) 2013-07-03
CN103140582A (zh) 2013-06-05
EP2609198A4 (en) 2014-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022037070A (ja) 内部非核酸スペーサーを含む一本鎖ＲＮＡｉ剤
JP5876637B2 (ja) ニックまたはギャップの入った核酸分子およびそれらの使用
EP1737879B1 (en) Aptamer-mediated intracellular delivery of therapeutic oligonucleotides
KR20080066987A (ko) ｓｉＲＮＡ에 대한 전달 운반체로서의 펩티드-다이서 기질ＲＮＡ 접합체들
JP2010503382A (ja) 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
WO2011028550A1 (en) Segmented micro rna mimetics
WO2008109369A2 (en) Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
JP2008514647A (ja) 二本鎖リボ核酸によって炎症性疾患を治療する方法
JP2010519908A (ja) Ｈｉｆ１ａ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2010519907A (ja) Ｖｅｇｆファミリー遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2011530289A (ja) Ｐｌｋ１遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2010519906A (ja) Ｅｒｂｂファミリー遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2010519911A (ja) Ｍｙｃ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
WO2012027467A1 (en) RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
JP2010519912A (ja) Ｒａｓ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2011530288A (ja) Ｂｉｒｃ５遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2010519910A (ja) Ｂｃｌ２遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2010519905A (ja) Ａｋｔ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
WO2008109375A9 (en) Nucleic acid compounds for inhibiting pik3c gene expression and uses thereof
JP2009504190A (ja) Ｒｎａ干渉を媒介する化学修飾低分子干渉核酸分子
WO2008109354A1 (en) Nucleic acid compounds for inhibiting il18 gene expression and uses thereof
WO2009156853A2 (en) Compounds, compositions, and methods useful for modulating the expression of histone deacetylase (hdac) gene expression and/or activity
WO2008109356A1 (en) Nucleic acid compounds for inhibiting tnfsf13b gene expression and uses thereof
JP2009509566A (ja) 低分子干渉核酸を用いた、ｒｎａ干渉によって媒介される、インフルエンザウイルス遺伝子発現の阻害

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid