KR20120029002A - 신규한 형태의 간섭 ｒｎａ 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산에 관한 것으로, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며, 상기 이중가닥 구조는 블런트 말단(blunt end)이다.

Description

신규한 형태의 간섭 ＲＮＡ 분자{Further novel forms of interfeing RNA molecules}
본 발명은 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산, 리보핵산의 용도, 리보핵산을 각각 포함하는 세포 및 생물, 리보핵산을 함유하는 조성물, 리보핵산을 함유하는 약제학적 조성물 및 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법에 관한 것으로, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하다.
RNA-매개 간섭(RNAi)은 서열에서 사일런스 유전자에 상동인 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의해 개시된 전사 후 유전자 사일런싱(silencing) 작용기전이다(Fire(1999), Trends Genet 15, 358-63, Tuschl, 등. (1999), Genes Dev 13, 3191-7, Waterhouse, 등.(2001), Nature 411, 834-42, Elbashir, 등.(2001), Nature 411, 494-8, 검토를 위해서는 Sharp(2001), Genes Dev 15, 485-90, Barstead(2001), Curr Opin Chem Biol 5, 63-6 참고). RNAi는 식물(Baulcombe (1999), Curr Opin Plant Biol 2, 109-13), 선충류(Montgomery, 등. (1998), Proc Natl Acad Sci USA 95, 15502-7), 초파리(Drosophila)(Kennerdell, 등. (1998), Cell 95, 1017-26, Kennerdell, 등. (2000), Nat Biotechnol 18, 896-8)를 포함한 수많은 생물에서 유전자 기능을 평가하기 위해 광범위하게 사용되어져 왔다. 선충류 C. 엘레간스(C. elegans)의 경우, 게놈의 약 1/3이 이미 RNAi에 의해 기능분석되어져 왔다(Kim (2001), Curr Biol 11, R85-7, Maeda, 등. (2001), Curr Biol 11, 171-6).
최근까지 포유류 세포내의 RNAi는 초기 마우스 발생을 제외하고는 일반적으로 적용할 수 없었다(Wianny, 등. (2000), Nat Cell Biol 2, 70-5). 포유류 세포내로 21-nt 이중가닥 형질감염은 유전자 발현을 방해하며 긴 dsRNA에 의해 일반적으로 얻어지는 서열독립적 인터페론-유도 항바이러스 반응을 유도하지 않는다는 발견은 분화된 포유류 세포에 새로운 적용을 가능하게 하였다(Elbashir 등.)(2001), Nature 411, 494-8). 흥미롭게도 이들 작은 간섭성 RNA(siRNAs)는 분화된 포유류 세포에서 잠재적인 우회 작용기전을 시사하는 긴 dsRNA로부터의 가공산물과 유사하다. 초기 dsRNA 처리에 필요한 다수의 RNAse III 패밀리 Dicer 복합체가 확인되었다(Bernstein, 등. (2001), Nature 409, 363-6, Billy, 등. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98, 14428-33). 변형되지 않은 리보올리고뉴클레오티드를 사용시 이전에 직면했던 문제중의 하나는 세포 또는 심지어는 혈청-함유 배지에서의 급속한 퇴화였다(Wickstrom (1986), J Biochem Biophys Methods 13, 97-102, Cazenave, 등. (1987), Nucleic Acids Res 15, 10507-21). 형질감염된 siRNA에 의해 유도된 각각의 녹 다운(knock down)이 표현형을 변화시키도록 충분히 길게 유지될 수 있는지 여부는 특정 유전자 기능 및 사용된 에세이 계에 따라 다르다.
본 발명이 해결하고자 하는 근본적인 문제는 살아있는 세포로서 생화학적 환경에서 안정성이며 활성인 합성 간섭 RNA 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 1요지에 있어서 상기 문제는 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산에 의해 해결되는 바, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며, 또 상기 이중가닥 구조는 비점착성 말단(blunt end)이다.
본 발명의 제 2요지에 있어서 상기 문제는 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산에 의해 해결되는 바, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며, 또 상기 첫번째 스트레치 및/또는 두번째 스트레치는 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
본 발명의 제 1요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 첫번째 스트레치 및/두번째 스트레치는 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
본 발명의 제 1요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 이중가닥 구조는 이중가닥의 양쪽 측면상에서 비점착성 말단(blunt end)이다.
본 발명의 제 1요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥의 5'-말단 및 두번째 가닥의 3'-말단에 의해 한정되는 이중가닥 구조상에서 비점착성 말단(blunt end)이다.
본 발명의 제 1요지 및 제 2요지에 따른 핵산의 또 다른 구체예로서, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥의 3'-말단 및 두번째 가닥의 5'-말단에 의해 한정되는 이중가닥 구조상에서 비점착성 말단(blunt end)이다.
본 발명의 제 3요지에 있어서 상기 문제는 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산에 의해 해결되는 바, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며, 또 상기 두개 가닥 중의 적어도 하나는 5'-말단에서 적어도 한개 뉴클레오티드의 오버행(overhang)을 갖는다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 오버행은 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레어티드를 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 한개의 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 핵산은 2'-위치에서 NH2-변형을 갖는 전화된 abasic 부위 및 뉴클레오티드를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 변형을 갖는다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 적어도 한개의 가닥은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레어티드로 구성되는 3'-말단에서 적어도 한개 뉴클레오티드의 오버행을 갖는다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 다른 바람직한 구체예로서, 상기 첫번째 스트레치 및/두번째 스트레치는 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 이중가닥 구조는 17 내지 21 뉴클레오티드의 길이, 바람직하게는 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 구체예로서, 5'-말단에서 상기 오버행은 두번째 가닥상에 있다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 첫번째 가닥은 오버행, 바람직하게는 5'-말단에서 오버행을 또한 포함한다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 구체예로서, 첫번째 가닥의 3'-말단은 오버행을 포함한다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 5'-말단에서 상기 오버행은 첫번째 가닥상에 있다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 두번째 가닥은 오버행, 바람직하게는 5'-말단에서 오버행을 또한 포함한다.
본 발명의 제 3요지에 따른 핵산의 구체예로서, 첫번째 가닥의 3'-말단은 오버행을 포함한다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 핵산의 적어도 한개의 뉴클레오티드는 2'-위치에서 변형을 갖으며, 상기 변형은 바람직하게는 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕시 및 알킬을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 4요지에 있어서 상기 문제는 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산에 의해 해결되는 바, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며,
상기에서, 첫번째 가닥 및/또는 두번째 가닥은 2'-위치에서 변형을 갖는 다수의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함하며, 상기 가닥내의 각각의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 측면위치한 뉴클레오티드 그룹에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면상에 측면위치하며, 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 상기 측면위치한 뉴클레오티드는 변형되지 않는 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 변형과 상이한 변형을 갖는 뉴클레오티드이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 핵산은 본 발명의 제 1, 2 또는 3요지에 따른 핵산이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 첫번째 가닥 및/또는 두번째 가닥은 상기 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 첫번째 가닥은 상기 다수의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함한다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 또 다른 구체예로서, 상기 두번째 가닥은 상기 다수의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함한다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 변형된 뉴클레오티드 그룹 및/또는 측면위치한 뉴클레오티드 그룹은 1개 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 그룹으로부터 선택된 다수의 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 특정된 임의의 범위와 관련하여, 각 범위는 상기 범위를 한정하는 두자리 숫자를 비롯해 범위를 한정하는데 사용된 각각의 숫자간의 임의의 개별적인 정수를 나타내는 것임을 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 상기 그룹은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 5개의 뉴클레오티드, 6개의 뉴클레오티드, 7개의 뉴클레오티드, 8개의 뉴클레오티드, 9개의 뉴클레오티드 및 10개의 뉴클레오티드를 포함한다
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 첫번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드의 패턴은 상기 두번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드의 패턴과 동일하다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 첫번째 가닥의 패턴은 상기 두번째 가닥의 패턴과 일직선으로 되어 있다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 첫번째 가닥의 패턴은 상기 두번째 가닥의 패턴과 관련된 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 옮겨진다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 변형은 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕시 및 알킬을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 이중가닥은 비점착성 말단(blunt end)이다.
*본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 이중가닥은 양쪽 측면상에서 비점착성 말단(blunt end)이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 이중가닥은 첫번째 가닥의 5'-말단 및 두번째 가닥의 3'-말단에 의해 한정되는 이중가닥 구조의 측면상에서 비점착성 말단(blunt end)이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 또 다른 구체예로서, 상기 이중가닥은 첫번째 가닥의 3'-말단 및 두번째 가닥의 5'-말단에 의해 한정되는 이중가닥 구조의 측면상에서 비점착성 말단(blunt end)이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 두개 가닥의 적어도 하나는 5'-말단에서 적어도 한개의 뉴클레오티드의 오버행을 갖는다.
*본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 오버행은 적어도 한개의 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 가닥의 적어도 하나는 3'-말단에서 적어도 한개의 뉴클레오티드의 오버행을 갖는다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 이중가닥 구조의 길이는 약 17 내지 21, 더 바람직하게는 18 또는 19개 염기 길이이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 이중가닥 구조의 길이는 약 17 내지 21, 더 바람직하게는 18 또는 19개 염기 길이이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 첫번째 가닥 및/또는 두번째 가닥의 길이는 서로 독립적으로 약 15 내지 23개 염기, 17 내지 21개 염기 및 18 또는 19개 염기 길이의 범위를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 첫번째 가닥과 표적 핵산사이의 상보성은 완벽하다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 첫번째 가닥과 표적 핵산사이에 형성된 이중가닥은 상기 이중가닥을 형성하는 상기 첫번째 가닥과 표적 핵산사이에 한개의 미스매치(mismatch) 또는 두개의 미스매치(mismatch)가 존재하는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 첫번째 가닥 및 두번째 가닥 모두는 각각 적어도 한개의 변형된 뉴클레오티드 그룹 및 적어도 한개의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 포함하며, 상기에서 각각의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 적어도 한개의 뉴클레오티드를 포함하며,각각의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹은 두번째 가닥상의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹과 일직선으로 되어 있는 첫번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 갖는 적어도 한개의 뉴클레오티드를 포함하며, 첫번째 가닥의 가장 말단 5’뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 그룹의 뉴클에오티드이며, 두번째 가닥의 가장 말단 3’뉴클레오티드는 측면 뉴클레오티드 그룹의 뉴클레오티드이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 변형된 뉴클레오티드의 각 그룹은 단일 뉴클레오티드 및/또는 단일 뉴클레오티드로 구성되는 측면위치한 뉴클레오티드의 각 그룹으로 구성된다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 첫번째 가닥상에서 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 뉴클레오티드에 대해 3’방향으로 배열된 변형되지 않는 뉴클레오티드이며, 두번째 가닥상에서 변형된 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 뉴클레오티드는 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 뉴클레오티드에 대해 5’방향으로 배열된 변형된 뉴클레오티드이다.
본 발명의 제 4요지에 따른 핵산의 또 다른 구체예로서, 상기 첫번째 가닥은 8내지 9, 바람직하게는 9 내지 11개의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함하며, 상기 두번째 가닥은 7 내지 9, 바람직하게는 8 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함한다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 표적 유전자는 구조 유전자, 하우스키핑 유전자, 전사인자, 운동성 인자, 세포주기 인자, 세포주기 억제제, 효소, 성장인자, 사이토키닌 및 종양 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 상기 첫번째 가닥 및 두번째 가닥은 루프 구조에 의해 연결된다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 루프 구조는 비-핵산 중합체로 구성된다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 상기 비-핵산 중합체는 폴리에틸렌 그리콜이다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 루프 구조는 핵산으로 구성된다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 구체예로서, 첫번째 가닥의 5'-말단은 두번째 가닥의 3'-말단에 연결되어 있다.
본 발명의 모든 요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 첫번째 가닥의 3'-말단은 두번째 가닥의 5'-말단에 연결되어 있다.
본 발명의 제 5요지에 있어서 상기 문제는 표적 확인을 위해 본 발명의 요지에 따른 핵산의 사용에 의해 해결된다.
본 발명의 제 6요지에 있어서 상기 문제는 의약의 제조를 위해 본 발명의 요지에 따른 핵산의 사용에 의해 해결된다.
본 발명의 제 6요지에 따른 사용의 바람직한 구체예로서, 상기 의약은 교모세포증, 전립선암, 유방암, 폐암, 간암, 대장암, 체장암 및 백혈병, 당뇨, 비만, 보혈관 질환 및 대사성 질환을 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환이나 상태의 치료를 위해서이다.
본 발명의 제 7요지에 있어서 상기 문제는 본 발명의 요지에 따른 핵산을 함유하는 세포, 바람직하게는 녹다운(knockdown) 세포에 의해 해결된다.
본 발명의 제 8요지에 있어서 상기 문제는 본 발명의 요지에 따른 핵산을 함유하는 생물, 바람직하게는 녹다운(knockdown) 생물에 의해 해결된다.
본 발명의 제 9요지에 있어서 상기 문제는 본 발명의 요지에 따른 핵산을 함유하는 조성물에 의해 해결된다.
본 발명의 제 10요지에 있어서 상기 문제는 본 발명의 요지에 따른 핵산을 함유하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체에 의해 해결된다.
본 발명의 제 11요지에 있어서 상기 문제는 본 발명의 요지에 따른 리보핵산을 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 세포 또는 세포의 유도체로 도입함으로써 상기 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법에 의해 해결되며, 상기 표적 유전자는 본 발명의 요지에 따른 핵산의 표적 유전자이다.
본 발명은 생화학적 에세이 또는 세포환경과 같이 생물학적 계에서 일반적으로 실시되는 반응조건하에서 안정성일 뿐 아니라 매우 활성이며 특이적인 작은 간섭 RNA가 고안될 수 있다는 놀라운 발견을 토대로 한다. Tuschl 등(국제 특허 출원 WO 01/75164)과 같은 선행 기술에 개시되어 있는 다양한 간섭 RNA는 21 내지 23개 뉴클레오티드 길이 및 이중가닥의 3’말단에서의 변형을 제공한다. 이하, RNAi로 불리는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한 간섭 RNA의 안정성 문제는 초기에 생각했던것처럼 엑소뉴클레아제보다 엔도뉴클레아제의 공격에 존재한다는 것을 본 발명자들은 놀랍게도 발견하였다.
따라서, 본 발명은 새로운 형태의 간섭 RNA에 관한 것이다. RNAi는 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산으로 구성된다. 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥에 의해 형성된다. 상기 첫번째 가닥은 이하, 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치로도 불리는 인접하는 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하며, 이 첫번째 스트레치는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적이다. 상기 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 스트레치를 또한 포함하며 상기 두번째 스트레치는 표적 핵산과 적어도 부분적으로 동일하다. 이 리보핵산의 기본적인 구조는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 상기 첫번째 가닥 및 두번째 가닥은 바람직하게는 서로 잡종교배되어 이중가닥 구조를 형성한다. 상기 잡종교배는 Watson Crick 염기 쌍에 의해 일반적으로 발생한다. 그러나, 상기 핵산은 길이에 있어서 상기 이중가닥 구조에 반드시 한정되는 것은 아니다. RNAi를 형성하는 임의의 각각의 가닥 및/또는 각각의 말단에 추가의 뉴클레오티드가 추가될 수 있다. 첫번째 스트레치 및 두번째 스트레치의 특정 서열에 따라, 잡종교배 또는 염기 쌍은 반드시 완전하거나 완벽하지 않는 바, 이는 미스매치(mismatch)로 인하여 첫번째 및 두번째가 100% 염기 쌍을 이루는 것은 아니다는 의미이다. 이중가닥내에 하나 이상의 미스매치(mismatch)가 또한 있을 것이다. 상기 미스매치(mismatch)가 바람직하게는 15, 16 또는 17개의 매치된 뉴클레오티드의 스트레치 외부에 놓이면, RNAi 활성에 아무런 영향을 미치지 않는다. 상기 미스매치(mismatch)가 15개 미만의 인접하는 매치된 뉴클레오티드를 만들도록 놓인다면, 상기 RNAi 분자는 17개의 매치된 뉴클레오티드 이중가닥과 비교할 때 상기 RNAi 분자는 주어진 표적에 대해 mRNA 하향조절에 있어 감소된 활성을 나타낸다. 간섭 리보핵산의 작용방법에 따라, 일반적으로 표적 핵산 서열 또는 표적 핵산은 단일 가닥 RNA, 더 바람직하게는 mRNA이다. 그러한 잡종교배는 Watson Crick 염기 쌍에 의해 가장 발생하기 쉬우나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 표적 핵산 서열에 대한 상기 첫번째 서열의 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 가닥 및 특히 첫번째 스트레치의 상보성의 정도는 가장 높게는 100% 및 가장 낮게는 80% , 바람직하게는 80-100%, 더 바람직하게는 85-100%, 가장 바람직하게는 90-100%이다. 최적 상보성은 95-100%인거 같다. 이러한 의미에서 상보성은 예를들면, 80%-100%와 같이 상술한 범위의 뉴클레오티드는 특정 범위에 따라 Watson Crick 염기 쌍에 의해 뉴클레오티드의 범위가 완벽하다는 것을 의미한다. 상기 첫번째 스트레치의 뉴클레오티드와 표적 RNA간의 상보성은 18-19개 뉴클레오티드를 가져야 하며, 심지어는 두 서열 특정 오버행을 갖는 17개 뉴클레오티드 미만의 스트레치는 RNAi 매개에 있어서 기능적이지 않다. 따라서, 19개 뉴클레오티드 또는 염기 쌍의 길이를 갖는 이중가닥을 고려할 때 17개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 최소 상보성은 두개 뉴클레오티드의 미스매치(mismatch)를 허용할 것이다. 20개 뉴클레오티드 또는 염기 쌍으로 구성된 이중가닥의 경우, 17개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 상보성은 허용가능할 것이며 기능적으로 활성이다. 동일한 것이 총 17개 상보적 뉴클레오티드 또는 염기쌍과 함께 21개 뉴클레오티드 또는 염기쌍의 이중가닥에 적용된다. 기본적으로, 이중가닥의 길이에 요구되는 상보성의 정도는 본원에 개시된 바와 같이 이중가닥 구조 또는 첫번째 가닥의 첫번째 스트레치 및 표적 핵산의 복합체에 의해 형성된 복합체의 녹는 온도를 토대로 할 수 있다.
본 발명의 모든 리보핵산은 예를들면, 국제특허출원 WO 99/32619, WO 00/44895 및 WO 01/75164에 개시된 바와 같은 RNA 매개 간섭을 유발 또는 관여하는데 적절하다.
본 발명에 따라 고안될 수 있는 간섭 리보핵산 분자의 첫번째 방법은 표적 핵산에 상보적인 18 또는 19개 뉴클레오티드 스트레치의 최적 길이를 갖는 것이다. 18 또는 19개 뉴클레오티드의 상기 최적길이는 사용된 RNAi내의 이중가닥 구조의 길이라는 것 또한 본 발명내이다. 이 필요한 길이는 예를들면, 국제특허출원 WO 01/75164와 같은 선행기술의 기술적 기법과는 명확히 다르다. 본 발명 및 선행기술에 기술된 바에 따른 임의의 추가 고안은 상기 특징적인 길이 즉, 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 리보핵산과 함께 실현될 수 있다.
고안될 수 있는 간섭 리보핵산 분자의 두번째 방법은 이하 유리 5’OH 기로도 불리는 유리 5’히드록시 기를 첫번째 가닥에서 갖는 것이다. 유리 5’OH 기는 첫번째 가닥을 형성하는 가장 말단 뉴클레오티드가 존재하므로 특히, 말단 변형에 의해 변형되지 않음을 의미한다. 일반적으로, 두번째 가닥의 5’히드록시 기 말단은 변형되지 않는 방식으로 또한 각각 존재한다. 더 바람직한 구체예로서, 첫번째 가닥 및 첫번째 스트레치의 3'-말단 또한 이하 유리 3’OH 기로도 불리는 유리 OH 기가 존재하도록 각각 변형되지 않으며, 상기에서 5’말단 뉴클레오티드의 고안은 상술한 임의의 구체예 중 하나이다. 바람직하게는, 그러한 유리 OH 기는 각각 두번째 가닥 및 두번째 스트레치의 3'-말단에 또한 존재한다. 본 발명에 따라 상술된 리보핵산의 다른 구체예로서, 각각 첫번째 가닥 및 첫번째 스트레치의 3'-말단 및/또는 각각 두번째 가닥 및 두번째 스트레치의 3'-말단은 3’말단에서 말단 변형을 갖을 수 있다.
본원에 사용된 용어 유리 5’OH 기 및 3’OH 기는 각각 폴리뉴클레오티드의 5’말단 및 3’말단에서 각각의 가장 말단 뉴클레오티드가 OH 기를 나타내는 것을 의미한다. 그러한 OH 기는 뉴클레오티드의 당 잔기로부터, 더 바람직하게는 5’OH 기의 경우 5’위치로부터 및 3’OH 기의 경우 3’위치로부터, 또는 각각의 말단 뉴클레오티드의 당 잔기에 부착된 인산기로부터 생길 수 있다. 상기 인산기는 원칙적으로 뉴클레오티드 당 잔기의 임의의 OH 기에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인산기는 이하 유리 5’또는 3’OH 기로 불리는 유리 5’OH 기의 경우 당 잔기의 5’OH 기 및/또는 유리 3’OH 기의 경우 당 잔기의 3’OH 기에 부착된다.
본원에 개시된 RNAi에 대한 임의의 고안 방법 또는 RNAi에 대한 임의의 구체예에 있어서, 용어 말단 변형은 첫번째 및/또는 두번째 가닥의 뉴클레오티드 5’또는 3’최 말단에 부가된 화학적 실체를 의미한다. 그러한 말단 변형의 예는 전화(데옥시)된 염기서열, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 메톡시, 이미다졸, 카복실레이트, 티오에이트, C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬, OCF3 , OCN, O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 특히, 유럽 특허 EP 0 586 520 B1 또는 EP 0 618 925 B1에 개시된 폴리알킬아미노 또는 치환된 실릴을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 알킬 또는“알킬”을 포함하는 임의의 용어는 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 6 및 더 바람직하게는 1 내지 2개 C 원자를 포함하는 임의의 탄소원자 사슬을 의미한다.
다른 말단 변형은 비오틴 기이다. 그러한 비오틴 기는 바람직하게는 첫번째 및/또는 두번째 가닥의 뉴클레오티드 5’또는 3’최 말단 또는 양쪽 말단 모두에 부착될 수 있다. 더 바람직한 구체예로서, 상기 비오틴 기는 폴리펩티드 또는 단백질과 결합한다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질이 상술한 임의의 다른 말단 변형을 통해 부착되는 것 또한 본 발명의 범위에 속한다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 핵산 분자에 추가의 특징을 부여할 것이다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 다른 분자에 리간드로서 작용할 것이다. 상기 다른 분자가 수용체일 경우 수용체의 기능 및 활성은 결합 리간드에 의해 활성화될 것이다. 상기 수용체는 본 발명의 핵산 분자에 결합된 리간드의 효과적인 형질감염을 허용하는 내재화 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 결합될 리간드의 예는 VEGF이며 대응하는 수용체는 VEGF 수용체이다.
상이한 종류의 말단 변형을 갖는 본 발명의 RNAi의 가능한 다양한 구체예는 하기 표 1에 나타나 있다.
Figure pat00001
본원에서 개시된 바와 같은 다양한 말단 변형은 바람직하게는 리보핵산 뉴클레오티드의 리보스 잔기에 위치해 있다. 더 구체적으로는, 상기 말단 변형은 변형된 뉴클레오티드가 말단 뉴클레오티드일 경우 2’OH, 3’OH, 5’OH 위치(이에 한정되지 않음)를 포함한 리보스 잔기의 임의의 OH 기에 부착 또는 대체될 수 있다. 전화된 abasic은 뉴클레오티드, 핵염기 잔기를 갖지 않는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이다. 화합물의 종류는 Sternberger 등.(2002), Antisense. Nucl. Ac. Drug Dev. in press에 개시되어 있다.
상술한 임의의 말단 변형은 표 1에 도시된 RNAi의 다양한 구체예와 함께 사용될 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 바람직하게는 5’말단에서 말단변형을 갖는 것에 의해 센스가닥이 불활성화되는 본원에 개시된 임의의 RNAi 형태 또는 구체예가 특히 이롭다. 이는 본원에 개시된 리보핵산의 두번째 가닥에 대응하는 센스 가닥의 불활성화로부터 발생하며, 그러지 않을 경우 세포에서 관련되지 않은 단일 가닥 RNA를 방해할 것이다. 따라서, 세포 전사물의 발현 및 더 구체적으로는 번역 패턴이 특히 영향을 받는다. 이 영향은 오프(off)-표적 효과로 불린다. 표 1과 관련하여 구체예 7 및 8은 변형이 RNAi(두번째 가닥임)의 표적 비 특이적 부분의 불활성화를 초래하여 본 발명에 따른 RNAi가 각각 특정 리보핵산과 단백질을 녹다운(knock down)하는데 사용될 세포내 또는 유사한 시스템에서 단일 가닥 RNA와 함께 두번째 가닥의 임의의 비 특이적 상호작용을 감소시키므로 상기 의미에서 특히 이롭다.
본 발명에 따른 세번째 방법은 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산을 고안하는 것으로, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며, 상기 이중가닥 구조는 비점착성 말단(blunt end)이다. 본원에서 용어 이중가닥 구조는 이중가닥(duplex)으로 또한 불린다. RNAi의 고안은 3’오버행을 개시하는 국제특허출원 WO 01/75164에 기재된 바와 같은 Tuschl 등의 RNAi의 고안과는 명확하게 상이하다. 본원에서 오버행은 한개 가닥의 적어도 하나의 말단이 대향가닥으로도 불리는 이중가닥 구조를 형성하는 다른 가닥의 대응하는 말단보다 더 긴 이중가닥 구조를 의미한다. 바람직하게는, 상기 첫번째 스트레치는 첫번째 가닥과 동일하며, 두번째 스트레치는 두번째 가닥과 동일하다.
비점착성 말단(blunt end)의 RNAi의 효율성 및 각각의 리보핵산의 첫번째 또는 두번째 가닥 또는 양쪽 모두의 말단 변형의 이점을 고려할 때, 두 고안 원칙을 조합하는 것이 바람직하다. 즉, 표 1에 나타난 바와 같은 임의의 말단 변형을 갖는 비점착성 말단(blunt end)의 RNAi를 갖는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 네번째 방법은 리보핵산의 5’말단에서 오버행을 갖는 것이다. 더 구체적으로 상기 오버행은 원칙적으로 본 발명에 따른 리보핵산의 첫번째 가닥 및 두번째 가닥 중 하나에 또는 양쪽 모두에 존재할 것이다. 상기 오버행의 길이는 짧게는 한개 뉴클레오티드 길이는 2 내지 8개 뉴클레오티드, 바람직하게는 2, 4, 6 또는 8개 뉴클레오티드의 길이이다. 5’오버행이 본 발명에 따른 리보핵산의 첫번째 가닥 및/또는 두번째 가닥상에 위치할 것이라는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 상기 오버행을 형성하는 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 이들의 연속일 것이다.
상기 오버행은 바람직하게는 적어도 한개의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하며, 상기 한개의 데옥시리보뉴클레오티드는 바람직하게는 5'-최 말단이다. 리보핵산의 각각의 대향가닥의 3'-말단이 오버행, 더 바람직하게는 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 갖지 않는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 본 발명의 리보핵산은 표 1에 표시된 말단 변형 도식 및/또는 본원에 개시된 말단 변형을 포함할 것이다.
본 발명에 따른 간섭 리보핵산 고안의 다섯번째 방법은 본 발명에 따른 리보핵산의 적어도 한개의 가닥상에, 더 구체적으로는 인접하는 뉴클레오티드의 한개의 스트레치상에 특정 패턴의 변형된 뉴클레오티드를 형성하는 것이다. 상기 뉴클레오티드 변형의 종류는 본원에 개시된 바와 같이 간섭 RNA를 고안하기 위한 다른 방법에서 논의된 것과 동일하며, 더 구체적으로는 본원에 개시된 변형의 종류 또는 본 발명에 따른 리보핵산을 형성하는 적어도 한개의 뉴클레오티드의 리보스 잔기에서 전화된 abasic, 메톡시 또는 아미노 등과 같은 말단 변형이다. 상기 뉴클레오티드의 변형은 본원에 개시된 임의 형태의 변형, 더 구체적으로는 말단 변형이 반드시 말단 뉴클레오티드에 위치해 있지 않다는 특이성을 갖는 말단 변형으로 본원에 개시된 종류의 변형일 수 있다. 상기 변형은 비-말단 뉴클레오티드에서 발생한다. 그러한 조건하에서 상기 변형은 바람직하게는 변형될 뉴클레오티드의 리보스 잔기 및 더 바람직하게는 리보스 잔기의 2’위치에 부착된다.
본원에 따라 고안된 임의의 리보핵산이 본원에 개시된 임의의 다른 고안 방법에 의한 본 발명에 따른 리보핵산이 갖는 특징을 또한 갖는 것 또한 본 발명의 범위에 속한다. 따라서, 변형된 뉴클레오티드 패턴을 갖는 간섭 리보핵산은 말단 변형, 말단 변형 도식을 갖을 수 있고 비점착성 말단(blunt end)이거나 또는 5’오버행 또는 두개 이상의 이들 요소 또는 특징의 임의의 조합을 가질 수 있다.
말단 변형 또는 변형 패턴으로 제시되는 상술한 변형과는 별도로, 상기 리보핵산 백본(backbone)은 뉴클레오티드간에 상이한 링크(link)를 형성함으로써 더 변형될 수 있다. 그러한 상이한 링크는 유럽특허 EP 0 586 520 B1 및 EP 0 618 925 B1에 개시되어 있다. 특히 흥미로운 것은 리보올리고뉴클레오티드에 대해 높은 뉴클레아제 내성을 갖는 것으로 나타난 리보핵산 백본의 내부 변형이다. 바람직한 구체예로서, 변형된 뉴클레오티드의 변형은 뉴클레오티드의 리보스 잔기의 2'-OH 기의 메톡시화이다.
바람직한 구체예로서, 두 가닥, 더 구체적으로는 첫번째 스트레치 및 두번째 스트레치 모두 각각 상기 가닥 및 스트레치를 형성하는 이러한 형태의 뉴클레오티드의 변형을 나타낸다. 그러나, 각각의 첫번째 가닥 및 첫번째 스트레치 또는 각각의 두번째 가닥 및 두번째 스트레치가 이러한 특정 패턴의 뉴클레오티드의 변형을 나타내는 것 또한 본 발명의 범위에 속한다. 본원에서, 용어 변형된 뉴클레오티드 그룹 또는 측면위치한 뉴클레오티드 그룹은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 나타낼 수 있다.
인접하는 뉴클레오티드의 스트레치를 고려할 때, 스트레치를 형성하는 뉴클레오티드의 변형 패턴은 표준 포스포로디에스테르 결합 또는 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 결합을 통해 서로 공유결합으로 연결되는 단일 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹이 그러한 형태의 변형을 나타내도록 실현될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드 그룹으로도 불리는 그러한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹이 상기 스트레치의 5'-말단 또는 3'-말단을 형성하지 않을 경우, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹은 전의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹의 변형을 갖지 않는 뉴클레오티드의 양쪽 측면 뒤에 온다. 그러나, 이러한 형태의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹은 상이한 변형을 가질 수 있다는 것을 알아야 한다. 이러한 형태의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹은 이하 측면위치하는 뉴클레오티드 그룹으로 또한 불린다. 변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드 그룹의 서열 및 비변형되거나 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형되거나 상이하게 변형된 뉴클레오티드 그룹의 서열은 한번 또는 여러번 반복될 것이다. 바람직하게는, 상기 서열은 한번 이상 반복된다. 명확성의 이유로, 상기 패턴은 하기에서 더 상세하게 개시되며, 변형된 뉴클레오티드 그룹 또는 비변형된 뉴클레오티드 그룹으로 불리는 각각의 상기 그룹은 단일 뉴클레오티드를 실질적으로 포함할 것이다. 본원에 사용된 비변형된 뉴클레오티드는 각각의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 뉴클레오티드에서 상술한 임의의 변형을 갖지 않거나 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 그룹 중의 한개와는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오티드를 의미한다.
그러한 비변형 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드의 변형과는 다른 방식으로 실질적으로 변형되는 비변형 뉴클레오티드의 변형은 상기 비변형 뉴클레오티드를 형성하는 다양한 뉴클레오티드 또는 측면위치한 다양한 뉴클레오티드 그룹과 동일하거나 또는 심지어는 상이할 수 있음은 본 발명의 범위에 속한다.
변형 및 비변형 뉴클레오티드의 패턴은 가닥 또는 스트레치의 5'-말단 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 그룹 또는 비변형 뉴클레오티드 그룹의 사용에 의해 개시되도록 하는 것이다. 그러나, 다른 구체예로서 상기 5'-말단 뉴클레오티드는 비변형 뉴클레오티드 그룹에 의해 형성되는 것이 또한 가능하다.
이러한 형태의 패턴은 간섭 RNA의 첫번째 스트레치 또는 두번째 스트레치 중의 하나 또는 두개 스트레치상에서 실시될 수 있다. siRNA 이중가닥의 표적 상보적 가닥상의 5’인산염은 siRNA 기능에 필요한데, 이는 세포가 유리 5’OH(인산화될 수 있음)를 통해 siRNA의 진위를 점검하며 그러한 진짜 siRNA만이 표적 RNA 파괴를지시함을 보여준다(Nykanen, 등. (2001), Cell 107, 309-21).
바람직하게는, 상기 첫번째 스트레치는 변형 및 비변형 뉴클레오티드 그룹 즉, 변형된 뉴클레오티드 그룹 및 측면위치한 뉴클레오티드 그룹의 패턴 형태를 나타내는 반면, 두번째 스트레치는 이러한 형태의 패턴을 나타내지 않는다. 이는 상기 첫번째 스트레치가 RNA의 간섭 현상의 기초가 되는 표적-비특이적 퇴화과정에 있어서 실제적으로 더욱 중요한 스트레치에서 특이성의 이유로 상기 두번째 스트레치가 화학적으로 변형될 수 있어 RNA 간섭을 매개하는데 있어서 기능적이지 않다는 점에 있어서 유용할 것이다.
그러나, 상기 첫번째 스트레치 및 두번째 스트레치 모두가 이러한 형태의 패턴을 갖는다는 것 또한 본 발명의 범위에 속한다. 바람직하게는, 변형 및 비변형 패턴은 첫번째 스트레치 및 두번째 스트레치 모두에 있어서 동일하다.
바람직한 구체예로서, 상기 두번째 스트레치를 형성하며 첫번째 스트레치의 변형된 뉴클레오티드 그룹에 대응하는 뉴클레오티드 그룹 또한 변형되는 반면, 두번째 스트레치의 비변형 뉴클레오티드 그룹 또는 두번째 스트레치를 형성하는 비변형 뉴클레오티드 그룹은 첫번째 스트레치의 비변형 뉴클레오티드 그룹 또는 첫번째 스트레치를 형성하는 비변형 뉴클레오티드 그룹에 대응한다. 이러한 가능성은 도 2a에 개략적으로 도시되어 있다. 다르게는, 각각의 두번째 스트레치 및 두번째 가닥의 변형 패턴과 관련된 각각의 첫번째 스트레치 및 첫번째 가닥의 변형 패턴의 상 변동이 있다. 바람직하게는, 상기 변동은 첫번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드 그룹이 두번째 가닥의 비변형 뉴클레오티드 그룹에 대응하게 하는 것이며 역으로도 또한 같다. 이러한 가능성은 도 2b에 나타나 있다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 변형 패턴의 상 변동은 완전하지 않지만 중복되는 것 또한 본 발명의 범위에 속한다.
바람직한 구체예로서, 각각의 가닥 및 스트레치의 말단에서 두번째 뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드 그룹의 개시이다. 바람직하게는, 비변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드 그룹은 첫번째 및 두번째 가닥, 심지어 더 바람직하게는 첫번째 가닥의 5'-말단에 위치한다. 다른 바람직한 구체예로서, 비변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드 그룹은 첫번째 가닥 및 첫번째 스트레치의 5'-말단에 위치한다. 바람직한 구체예로서, 상기 패턴은 교대되는 단일 변형 및 비변형 뉴클레오티드로 구성된다.
다른 바람직한 구체예로서, 간섭 리보핵산은 두개 가닥을 포함하며, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 및 비변형된 뉴클레오티드 바람직하게는, 2'-O-메틸 변형되지 않은 뉴클레오티드는 매 두번째 뉴클레오티드가 각각 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 및 비변형된 뉴클레오티드임을 의미하는 교대하는 방식으로 양쪽 가닥상에 통합된다. 이는 첫번째 가닥상에서 1개의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 다음에 비변형된 뉴클레오티드가 오고, 이어 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드가 오는 것을 의미한다. 2'-O-메틸 변형 및 비변형의 동일한 서열은 두번째 가닥상에 존재하며, 바람직하게는 두번째 가닥상의 비변형된 뉴클레오티드와 함께 첫번째 가닥 염기 쌍위의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드의 상 변동이 있으며 역으로도 또한 같다. 이 특이한 배열 즉, 양쪽 가닥상의 2'-O-메틸 변형 및 비변형 뉴클레오티드의 염기 쌍은 짧은 간섭 리보핵산 즉, 짧은 염기 쌍의 이중가닥 리보핵산의 경우 특히 바람직한데, 그 이유는 그러한 이중가닥, 바람직하게는 짧은 이중가닥을 불안정하게 하는 두개 염기 쌍 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 사이에 특정 반발작용이 존재하기 때문으로 추정되나 본 발명자들은 그러한 이론에 한정되기를 바라지 않는다. 상기 특이한 배열에 있어서, 안티센스 가닥이 5’말단에서 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드로 개시된다면 바람직한 바, 상기에서 연속하는 두번째 뉴클레오티드가 비변형이며, 세번째, 다섯번째, 일곱번째 등의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인 반면, 두번째, 네번째, 여섯번째, 여덟번째 등의 뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드이다. 임의의 변형을 포함하지 않는 안티센스 가닥의 5’말단에서 상기 두번째 및 경우에 따라 네번째, 여섯번째, 여덟번째 및/또는 유사한 위치가 중요할 것으로 보인 반면, 5’최 말단 뉴클레오티드 즉, 안티센스 가닥의 첫번째 5’ 말단 뉴클레오티드는 안티센스 가닥에서 첫번째, 경우에 따라 세번째, 다섯번째 및 유사한 위치가 변형될 수 있는 것과 같은 임의의 고르지 않는 위치에서 그러한 변형을 나타낼 것이다. 다른 구체예로서, 각각의 변형 및 비변형된 뉴클레오티드의 변형 및 비변형은 본원에 개시된 임의의 것이 될 것이다.
이중가닥(duplex)으로도 불리는 핵산의 이중가닥 구조는 각각의 첫번째 가닥 및 두번째 가닥에 의해 또는 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 및 두번째 스트레치에 의해 형성되나 이에 한정되지 않는다. 첫번째 스트레치 및 두번째 스트레치의 길이는 일반적으로 약 15 내지 23, 바람직하게는 17 내지 21 및 더 바람직하게는 18 내지 19개 염기 길이이다. 이와 관련하여, 30개 미만 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 21개 미만 뉴클레오티드 길이는 인터페론 반응을 전개하기 위한 RNA 간섭 및 인터페론 반응을 기본적으로 나타낼 수 있는 임의의 생물학적 계를 유발하지 않는다. 그 이유는 30개 염기 쌍보다 긴 이중가닥 RNA가 결합하여 단백질 키나아제 PKR 및 2’, 5'-올리고아데닐레이트 합성효소를 활성화할 때 세포는 깊은 생리학적 변화를 경험하기 때문이다. 활성화된 PKR은 eIF2a의 인산화를 통해 번역을 방해하며, 활성화된 2’, 5'-AS는 mRNA 퇴화를 유발한다. 이러한 효과는 표적 확인 및 동물 모델에서 바람직하지 않은 바, 그 이유는 이들이 표현형에 대한 표적 특이적 녹다운의 효과를 억제하기 때문이다.
간섭 리보핵산 고안의 여섯번째 방법에 따르면, 상기 리보핵산은 이중가닥 구조를 포함하며, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 상기 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 두번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며, 첫번째 가닥의 한개 말단 및 두번째 가닥의 한개 말단은 루프 구조에 의해 연결된다.
구체예로서, 상기 루프 구조는 비핵산 중합체로 구성된다. 그러한 비핵산 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 또는 유사한 중합체일 수 있다. 상기 비핵산 중합체는 원칙적으로 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않으며 연결될 두 가닥이 실질적으로 서로 잡종교배할 수 있도록 하는 중합체를 포함하는 그룹으로부터 선택될 것이다. 그러한 잡종교배를 허용하기 위해, 서로 잡종교배하는 두 스트레치를 연결하는 분자 및 분자의 잔기는 두 스트레치가 밀접하게 및 잡종교배를 허용하는 삼차원 방향에서 접촉되도록 특정 분자구조 또는 분자의 굴곡(bending)을 허용하는 분자 가요성을 가져야 한다. 그러한 분자 또는 잔기는 사실상 힌지(hinge)로서 작용한다. 원칙적으로 상기 요구조건에 따르는 임의의 분자는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜외에 아미노산 기제 분자가 사용될 수 있다. 그러한 아미노산 기제 분자는 동종 중합체 또는 이종중합체일 것이다. 두 스트레치를 아주 근접하여 잡종교배하기 위해 필요로 하는 힌지의 발생을 허용하는 7개 글리신 잔기로 구성되는 동종폴리머가 유용한 예이다. 이 글리신 기제 힌지는 Guan K. L. 및 Dixon J. E.(1991), Anal Biochem. 192, 262에 개시되어 있다. 다른 구체예로서, 상기 힌지는 당해 기술에 공지된 크라운 에테르에 의해 형성될 수 있다.
다른 구체예로서, 상기 루프는 핵산으로 구성된다. 본원에 사용된 LNA는 Elayadi 및 Corey(2001)Curr Opin Investig Drugs. 2(4):558-61. 참고; Orum 및 Wengel (2001) Curr Opin Mol Ther. 3(3):239-43에 개시되어 있으며, PNA는 핵산으로 간주되며 루프 형성 중합체로 또한 사용될 것이다. 기본적으로, 첫번째 가닥의 5'-말단은 두번째 가닥의 3'-말단에 연결될 것이다. 다르게는, 첫번째 가닥의 3'-말단은 두번째 가닥의 5'-말단에 연결될 것이다. 상기 루프 구조를 형성하는 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 중요하지 않는 것으로 간주된다. 그러나, 그러한 루프를 형성하는 뉴클레오티드의 길이는 입체적 이유에 있어서 중요한 것 같다. 따라서, 4개 뉴클레오티드의 최소 길이가 필요한 루프 구조를 형성하는데 적절한 것 같다. 원칙적으로, 힌지 또는 잡종교배될 두 스트레치 사이의 연결을 형성하는 뉴클레오티드의 최대 수는 제한되지 않는다. 그러나, 폴리뉴클레오티드가 길수록 2차 및 3차 구조가 형성되기 쉬우므로 필요한 스트레치의 방향이 영향을 받는다. 바람직하게는, 힌지를 형성하는 뉴클레오티드의 최대 수는 약 12개 뉴클레오티드이다. 상술한 임의의 고안은 본 발명의 여섯번째 방법과 결합 즉, 루프구조 또는 유사 구조를 통해 백 폴딩(루프)이 일어날 수 있는 방식으로 두 가닥을 공유결합으로 연결시킴으로써 결합될 수 있다.
상기 루프가 안티센스 가닥의 3’즉, 본 발명에 따른 핵산의 첫번째 가닥에 위치한다면 이러한 형태의 RNAi의 활성화는 안티센스 가닥의 루프 5’의 위치와 비교할 때 더 높다. 따라서, 안티센스 가닥과 센스 가닥 즉, 첫번째 가닥과 두번째 가닥과 관련된 루프의 특정 배열은 중요하며, 이것은 방향과는 아무 관련이 없다고 한 종래기술과 대조적이다. 그러나, 이는 본원에 제시된 실험결과를 고려할 때 사실이 아닌 것 같다. 선행 기술에 나타난 것은 비 루프 연결 RNAi가 발생하는 과정중에 임의의 RNAi가 가공된다는 전제를 토대로 한다. 그러나, 이러한 경우 안티센스의 루프 3’위치를 갖는 그러한 구조들의 활성이 증가됨을 명확히 설명할 수 없었다. 지금까지 이러한 유형의 작은 간섭 RNAi의 5’→ 3’방향으로의 바람직한 배열은 두번째 가닥 - 루프 - 첫번째 가닥이다. 각각의 작제물은 적절한 벡터 시스템으로 통합될 것이다. 바람직하게는, 상기 벡터는 RNAi의 발현에 대한 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 상기 각각의 프로모터는 pol III이며 더 바람직하게는, 상기 프로모터는 Good 등. (1997) Gene Ther, 4, 45-54에 개시된 바와 같은 U6, H1, 7SK이다.
간섭 RNA 개념에 대한 일반적인 적용가능성 및 mRNA와 같은 코딩 뉴클레오티드에 대한 녹다운 또는 녹아웃때문에 그러한 RNA를 생성하는 임의의 유전자는 본 발명에 따른 임의의 리보핵산 분자의 사용에 의해 그 발현에서 변형될 것이다. 이러한 기본적이며 일반적으로 적용가능한 작용기전때문에, 이를 기초로 하는 임의의 적용은 실시 가능하며 이는 유전자의 녹다운 또는 녹아웃을 의미한다. 바람직한 적용은 표적 확인용 리보핵산의 사용이다. 본원에서 사용된 표적 확인은 DNA, RNA 또는 단백질 분자가 직접적으로 생물학적 과정에 직접적으로 관여, 바람직하게는 질환 또는 비 표준 조건에 관련된 과정에 관여함으로써 신규한 치료 화합물의 개발에 있어서 적절한 표적임을 입증하는 과정을 의미한다. 서열 동종성 연구는 유전자를 표적 균으로 성공적으로 분류해왔다. 이들 표적이 질환에 중요한 역할을 하며 지속적인 약물 개발에 사용되도록 해독하는 막대한 작업은 효과적인 방식으로 해결될 필요가 있다. 따라서, 유전자 발현의 녹다운은, 표현형에 있어서 상당한 효과를 보기 위해 50-100%까지, 바람직하게는 90%까지 감소되어야 한다. 유전자에 따른 다른 경우에 있어서, 적어도 20%의 녹다운이 표현형을 나타내는데 충분할 것이다. 표현형은 비 기능 RNAi 분자를 함유하는 세포를 기능적인 RNAi 분자를 함유하는 세포와 비교함으로써 정의된다. 이는 상기 단백질 기능이 부분적으로만 억제되는 조건하에서 중요한 판독을 제공할 것이다. 일반적으로 mRNA 감소 정도 및 표현형에서의 변화의 정도 사이에 선형 상관관계는 없다. 일부 단백질에 있어서 단백질의 약 20% 감소는 표현형에서의 변화를 나타내는데 충분한 반면, 다른 유전자 및 mRNA의 경우는 남아있는 단백질이 적어도 5 내지 10%이면 관찰된 표현형을 유지하는데 충분함을 알아야 한다.
본 발명에 따른 리보핵산 분자의 다른 용도는 약제의 제조를 위한 용도 또는 약제로서의 용도이다. 그러한 약제는 유전자 및 유전자 산물이 질병의 징후, 원인 또는 진행에 연결되는 임의의 암의 형태와 같은 질환 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 그러한 약제는 유전자 산물의 존재 또는 과잉발현이 병리적인 표현형을 유발하는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 상기 질환은 기능의 획득을 특징으로 하며 대응하는 생물학적으로 활성인 RNAi를 적용 또는 투여함으로써 치료될 수 있다. 본원에 개시된 리보핵산을 포함하는 약제에 의해 치료될 질환 또는 상태는 암, 심장질환, 대사성 질환, 피부과 질환, 염증성 질환, 면역계 질환 및 자가면역 질환을 포함하는 그룹으로부터 선택될 것이다. 다양한 형태의 암은 충실성 종양 및 교모세포증, 전립선 암, 유방암, 폐암, 간암, 췌장암 및 백혈병과 같은 조혈계의 종양을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 대사성 질환은 비만 및 당뇨병을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 피부과 질환은 건선을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 요지에 있어서 본 발명에 따른 리보핵산 분자는 진단으로, 바람직하게는 상술한 질환 및 상태와 관련된 특정 질환을 진단하는데 사용될 것이다. 그러한 진단은 본 발명에 따른 리보핵산 분자를, 바람직하게는 세포를 함유하는 샘플에 적용하여 샘플의 발현 형태에서 발생하는 변화를 관찰함을 토대로 할 것이다. 바람직하게는, 그러한 샘플은 치료될 상기 질환이나 상태 또는 질환의 경향이 나타날 것으로 추측되는 개체로부터의 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 핵산의 다른 적용은 약제학적으로 활성인 화합물의 스크리닝 및/또는 최적화를 유발함에 있어서 이들의 용도이다. 후자는 작은 분자와 같은 후보 약물의 효과를 검사 또는 측정하고 본원에 개시된 원칙을 기초로 고안된 특이적 RNAi를 투여할 때 관찰되는 효과를 상기 후보 약물에 의해 나타난 효과와 비교함으로써 실시된다. 그렇게 함으로써 오프-표적 효과를 갖는 후보 약물은 검사과정으로부터 제거될 것인 반면, 유사 또는 동일한 표현형을 나타내는 이들 후보 약물은 관련성이 높은 화합물 또는 심지어는 약제학적 활성 화합물 그 자체일 수 있다. 이러한 방법에서, 상기 매우 특이적 RNAi 분자는 후보 약물이 측정되는 것에 대해 표준검사법으로 작용한다.
또 다른 요지에 있어서 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 리보핵산을 함유하는 세포, 바람직하게는 녹다운 세포에 관한 것이다. 그러한 세포는 바람직하게는 조직으로부터 분리되거나 또는 조직내에 함유된 세포이거나 또는 바람직하게는 생물내에 함유되지 않은 기관이다. 상기 세포는 바람직하게는 리보핵산에 의해 치료될 질환 또는 상태에 관여하는 세포이다. 이러한 유형의 녹다운 세포는 기능적 관계를 밝히고 하류 표적을 측정하기 위해 mRNA 또는 단백질을 토대로 하는 발현 프로파일을 생성하는데 사용될 수 있다.
또 다른 요지에 있어서 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 리보핵산을 함유하는 생물에 관한 것이다. 바람직하게는 그러한 생물은 척추동물 생물 및 더 바람직하게는 상기 척추동물 생물은 포유류이다. 본원에 사용된 포유류는 원숭이, 개, 고양이, 양, 돼지, 기니피그, 토끼, 마우스, 쥐 및 사람을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 요지에 있어서 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 리보핵산을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 그러한 조성물은 효과적인 리보핵산과 결합되거나 또는 그로부터 분리된 음성 및 양성 대조용을 포함한다. 그러한 조성물은 용매, 바람직하게는 완충액을 추가로 포함할 수 있다.
다른 요지에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 리보핵산을 함유하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체에 관한 것이다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 공지되어 있으며 희석제, 완충액 등을 포함한다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 활성인 화합물을 더 포함할 수 있다. 치료될 상기 질환이나 상태가 본 발명에 따른 리보핵산 분자를 사용할 경우 상기 질환이나 상태의 치료와 관련하여 이미 사용되고 있는 리보핵산 분자가 바람직하다. 본 발명에 따른 리보핵산 분자의 상이한 작용방법 및 선행기술에 따른 상기 질환 및 상태를 치료하기 위한 약제때문에 상승효과가 발생할 것이다.
도 1은 본원에 사용된 용어를 정의하는 개략도를 도시한다. 두 가닥중 위의 것은 첫번째 가닥 및 mRNA와 같은 표적 리보핵산의 안티센스 가닥이다. 두번째 가닥은 그 서열에서 표적 핵산에 본질적으로 대응하므로써 센스 가닥을 형성하는 가닥이다. 첫번째 가닥 및 두번째 가닥 모두 일반적으로 Watson Crick 염기 쌍을 통해 이중가닥 구조를 형성한다.
도 2a 내지 도 2c는 이하 변형의 패턴으로 또한 불리는 변형 및 비변형 뉴클레오티드 그룹의 패턴을 갖는 본원의 리보핵산 분자의 일부 구체예를 도시한다. 뉴클레오티드의 변형된 그룹은 이하 변형된 뉴클레오티드 그룹으로 또한 불린다. 비변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드 그룹은 이하 측면위치한 뉴클레오티드 그룹으로 불리며, 하나 또는 몇개의 변형을 또한 가질 수 있지만 변형된 뉴클레오티드그룹을 형성하는 뉴클레오티드의 변형과는 상이하다. 도2a에서 첫번째 가닥 및 두번째 가닥상의 상기 변형된 뉴클레오티드 그룹 및 측면위치한 뉴클레오티드 그룹은 스트레치의 대응하는 부분위에 위치해 있으므로 서로 정렬(첫번째 가닥상의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 두번째 가닥상의 변형된 뉴클레오티드 그룹과 정렬되며, 첫번째 가닥상의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹은 두번째 가닥상의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹과 정열된다)되는 반면, 도 2b에서 첫번째 가닥상에 나타나는 패턴은 두번째 가닥상에 또한 나타나지만, 첫번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드 그룹이 두번째 가닥의 비변형된 뉴클레오티드 그룹과 함께 염기 쌍을 이루는 변동이 있으므로 그 결과 첫번째 가닥상의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 두번째 가닥상의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹과 정열된다. 도 2c에서 변형 및 비변형된 뉴클레오티드 그룹의 다른 가능한 배열이 나타난다. 첫번째 가닥의 패턴은 두번째 가닥의 패턴과는 독립적이고 또 두 패턴 모두 염기 쌍에 의해 한정된 이중가닥 구조의 상대적인 위치에서 서로 부분적으로 중복되는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 다른 구체예에서, 이 중복의 정도는 각각의 스트레치 및 가닥의 길이에 걸쳐서 다양할 수 있다.
도 3a 내지 도 3c는 상이한 말단 보호기를 갖는 RNAi 분자를 사용한 녹다운 실험의 결과를 도시한다. 더 구체적으로 도 3a는 다양한 형태의 말단 보호된 RNAi 분자가 PTEN mRNA의 녹다운상에서 기능적임을 도시한다.
도 3b는 도 3a에 도시된 실험결과에 사용된 상이한 RNAi 분자의 서열을 도시한다. 도 3c는 변형된 RNAi 분자로 처리한 후, PTEN 특이적 안티센스 작제물과 비교한 PTEN 단백질의 면역블럿 분석의 결과를 도시한다.
도 4a 내지 도 4b는 RNAi 분자의 3’오버행이 RNA 간섭에 중요하지 않음을 도시한다. 더 구체적으로, 도 4a는 상이한 RNAi 분자의 용량 반응 곡선을 도시하며 도 4b는 도 4a에 도시된 실험결과에 사용된 RNAi 분자의 서열을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5b는 RNAi 분자의 이중가닥의 길이는 적어도 18-19개 뉴클레오티드이어야 함을 도시한다. 더 구체적으로, 도 5b는 용량 반응 곡선으로 도 5a에 도시된 실험결과에 사용된 PTEN 특이적 RNAi 분자의 서열을 도시한다.
도 6a 내지 도 6b은 19개 뉴클레오티드 길이를 갖는 RNAi 분자내의 4개 말단 미스매치(mismatch) 뉴클레오티드는 Akt1 녹다운 매개에 있어서 여전히 기능적임을 도시한다. 더 구체적으로, 도 6b는 도 6a에 도시된 실험결과에 사용된 RNAi 분자의 서열을 도시한다.
도 7a 내지 도 7c은 siRNA내의 이중가닥 길이 필요조건 및 변이허용에 관한 결과를 도시한다. 도7a는 사용된 다양한 작제물(왼쪽 패널) 및 siRNA 분자의 표시된 양(오른쪽 패널)으로 사용된 p110α의 발현과 관련된 HeLa 세포에서 Akt1 mRNA 발현의 억제에 대한 각각의 영향을 도시한다. 미스매치(mismatch) siRNA 분자내의 뉴클레오티드 변화는 화살표로 표시된다; 3’데옥시뉴클레오티드는 대문자로 표시된다. 도 7b는 다양한 PTEN 특이적 siRNA(왼쪽 패널), siRNA의 다양한 양(오른쪽 패널)에서 PTEN/p110α 비율로 발현된 HeLa 세포에서 PTEN mRNA 발현의 억제를 도시하며, 도 7c는 PTEN 특이적 siRNA(30nM)를 사용한 PTEN 단백질 발현의 억제를 나타내는 웨스턴 블럿 분석 및 대조용으로 p110α를 사용하여 48시간 및 96시간 후 각각의 미스매치(mismatch) siRNA를 도시한다.
도 8a 내지 도 8b은 2'-O- 메틸화에 의해 RNAi 분자에 부여된 혈청내의 안정성에 관한 연구 결과를 도시하는 바, 말단 변형은 RNAi 분자 안정성에 이로운 효과가 없다. 더 구체적으로, 도 8a는 우태혈청으로 배양될 도 8b에 도시된 다양한 RNAi 분자의 겔 전기영동의 결과를 도시한다.
도 9a 내지 도 9c는 활성의 상실을 초래하는 아미노 말단 변형을 도시한다. 도 9b는 PTEN/p110α 발현율로 발현된 도 9a에 도시된 실험결과에 사용된 특정 RNAi 분자를 도시한다. 도 9c는 도 9a에 도시된 결과로부터 추론가능한 고안 원칙을 도시한다. 도 9c에 사용된 바와 같이, 용어 기능적의 의미는 실시예에 개시된 바와 같이 특정 에세이 계에서 기능적으로 활성임을 말하며 “기능적이지 않음”은 상기 계에서 기능적으로 활성이 아님을 의미한다.
도 10a 내지 도 10c는 2'-O- 알킬(메틸) 변형은 RNAi 분자를 안정화할 뿐 아니라 이들의 활성 감소를 초래함을 도시한다. 더 구체적으로, 도 10c는 도 10a에서 용량 반응 곡선으로 도시된 실험결과에 사용된 RNAi 분자의 서열을 도시한다. 도 10b는 우태혈청에서 2시간 배양될 도 10c에 도시된 다양한 RNAi 분자의 겔 전기영동의 결과를 도시한다.
도 11a 내지 도 11c는 용량 반응 곡선으로 상기 실험결과를 그래프로 나타내는 도 11a 및 상기 실험에 사용된 특정 RNAi 분자의 서열을 도시하는 도 11c와 함께 2'-O- 메틸 변형을 갖는 RNAi 분자의 효능에 관한 실험결과를 도시한다. 도 11b는 우태혈청에서 2시간 배양될 도 11에 도시된 다양한 RNAi 분자의 겔 전기영동의 결과를 도시한다.
도 12a 내지 도 12d는 교차하는 2'-O- 메틸 변형은 비변형 형태와 비교할 때 변형된 RNAi 분자의 활성을 초래함을 도시한다. 더 구체적으로, 도 12b는 도 12a에 도시된 실험결과에 사용된 RNAi 분자의 서열을 도시한다. 도 12c는 혈청에서 2시간 배양 후 상기 RNAi 분자의 안정성을 도시하는 반면, 도 12d는 상이한 RNAi 분자를 HeLa 세포에 적용할 때 PTEN 단백질에 대한 면역블럿을 도시한다. 교차하는 변형을 갖는 RNAi 분자는 엔도뉴클레아제 퇴화에 대해 안정하며 PTEN 단백질 녹다운 매개에 있어서 활성이다.
도 13은 PTEN 단백질 녹다운의 시간 과정을 측정하기 위한 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시한다. 양이온 지질을 사용하여 2'-O- 메틸 변형된 RNAi 분자 대 비변형된 RNAi 분자로 세포를 72시간동안 연속적으로 감염시켰다. 단백질 용해물을 제조하고 48시간 및 120시간 후 면역블럿에 의해 분석하였다. 96시간 및 120시간 시점에서 상기 세포를 유출시켜 다시 플레이트에 놓고 RNAi 분자의 부재하에서 추가로 24시간 및 48시간동안 배양하였다.
도 14는 변형된 RNAi 분자 대 비변형된 RNAi 분자를 교대로 연속적으로 사용하여 PTEN의 단백질 녹다운을 나타내는 웨스턴 블럿을 도시한다. 형질감염은 5시간동안만 실시하였으며 형질감염 시약없이 새로운 배지를 부가하였다. 표시된 RNAi 분자에 의한 형질감염 72시간 및 96시간 후 면역블럿에 의해 용해물을 분석하였다.
도 15a 내지 도 15d는 별개의 2'-O- 메틸 리보뉴클레오티드 변형을 갖는 siRNA 분자가 혈청내에서 증가된 안정성을 나타내며 HeLa 세포내의 단백질 녹다운을 매개함을 도시한다. 더 구체적으로, 도 15a는 사용된 다양한 siRNA 분자 작제물(왼쪽 패널)을 나타내며, 2'-O- 메틸 리보뉴클레오티드 변형은 밑줄쳐져 있으며 서열에서 진하게 표시되어 있다. 변형된 siRNA 분자의 표시된 양에 의해 형질감염된 HeLa 세포에서 PTEN mRNA 발현의 억제는 PTEN/p110α 비율로 발현되며 오른쪽 패널상에 표시된다. 도 15b는 왼쪽 패널상에서 사용된 다양한 siRNA 작제물을 도시하며 오른쪽 패널상에서 혈청에서 배양 후 변형 및 비변형된 siRNA 분자의 PAA 겔 전기영동을 도시한다; 2'-O- 메틸 리보뉴클레오티드를 갖는 다양한 작제물은 밑줄쳐져 굵게 표시되어 있다. 도 15c는 도 15a 및 15b에 각각 도시되어진 다양한 siRNA 작제물(30nM)을 사용한 PTEN 단백질 발현의 억제를 도시하는 SDS-PAGE 기제 면역블럿을 도시한다. 또한, p110α를 대조용으로 사용하였다. 마지막으로, 도 15d는 연장된 단백질 녹다운 즉, 별개의 2'-O- 메틸 리보뉴클레오티드 변형을 갖는 siRNA 분자(30nM)를 투여한 지 48시간 및 128시간 후 PTEN 단백질 발현의 억제를 나타내는 면역블럿이다. 도 15c와 같이, p110α를 대조용으로 사용하였다.
도 16a 내지 도 16c는 Akt1 및 p110β mRNA에 특이적인 별개의 2'-O- 메틸 리보뉴클레오티드 변형을 갖는 siRNA 분자가 혈청내에서 증가된 안정성을 나타내며 HeLa 세포내의 단백질 녹다운을 매개함을 도시한다. 더 구체적으로, 도 16a는 왼쪽 패널상에서 사용된 다양한 작제물을 도시하며 2'-O- 메틸 리보뉴클레오티드는 밑줄쳐져 굵게 표시되어 있다. 혈청내에서 배양된 후 표시된 siRNA 분자의 보전성은 오른쪽 패널에 도시되어 있다. 도 16b는 상기 세포를 표시된 siRNA(30nM)에 의해 형질감염시킬 때 대조용으로 사용된 Akt1, Akt2 및 Akt 인산화 및 p110의 면역블럿을 도시한다. 도 16c는 밑줄로 굵게 표시된 2'-O- 메틸 변형을 갖는 다양한 p110β 특이적 siRNA 작제물(왼쪽 패널) 및 상기 siRNA 작제물에 의한 하류 키나아제 Akt1의 인산화를 억제하는 면역블럿 분석의 결과(오른쪽 패널)를 도시한다.
도 17a 내지 도 17b는 용량 반응 곡선으로 헤어핀 구조를 갖는 다양한 RNAi 분자의 효능을 도시하며 도 17b는 도 17a에 도시된 결과를 나타내는 상기 RNAi 분자의 구조를 도시한다. 상이한 루프를 갖는 합성 siRNA는 p110β, Akt1 및 AKt2 발현을 억제하는데 있어서 기능적이다. siRNA내의 p110β mRNA 발현의 억제는 HeLa 세포를 형질감염시켰다(17A). 표시된 siRNA의 형질감염 24시간 후 p110β mRNA 발현 수준에 대해 샘플을 병행하여 분석하였다. 형질감염된 2분자 siRNA(3’TT 오버행을 갖는 21mer, 분자 1AB) 또는 루프 구조를 갖는 단분자 siRNA가 개략적으로 도시된다. 안티센스 서열과 관련된 루프의 위치(HIV 유래된 pA-루프; (A)12-루프)는 3B, 4B에 대하여 3A, 4A에서 역전된다. 2AB siRNA 분자는 21mer 이중가닥에서 6개 미스매치(mismatch)를 함유하며 비처리된 샘플과 함께 음성 대조용으로 작용한다. RNA를 제조하여 실시간 RT-PCR(Taqman) 분석처리 하였다. p110α의 mRNA 수준에 대한 p110β mRNA 수준이 도시되어 있으며, 이는 내부 참고자료로 작용한다. 각각의 바는 삼중 형질감염(± 표준편차)을 나타낸다. HeLa 세포는 성장배지의 표시 농도에서 siRNA에 의해 50% 콘플루언시에서 형질감염시켰다.
도 18a 내지 도 18c는 용량 반응 곡선으로 분자내 및 분자간 루프 구조를 갖는 다양한 RNAi 분자의 효능을 도시한다. siRNA내의 Akt1 mRNA 발현의 억제는 HeLa 세포를 형질감염시켰다(18A). 표시된 siRNA의 형질감염 24시간 후 Akt1 및 Akt2 mRNA 발현 수준에 대해 샘플을 병행하여 분석하였다. 상이한 루프(A-루프; GAGA-루프 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)-연결) 및 이들의 추정되는 이차적 구조는 개략적으로 도시되어 있다. 상기 siRNA 분자 9A는 Akt2에 대해 특이적이며 음성 대조용으로 작용한다. 10A 및 10B는 자가 상보적 서열을 함유하지 않으며 조합에서 형질감염된다. p110β의 mRNA 수준에 관련된 Akt1 mRNA 수준이 도시되어 있으며, 이는 내부 대조용으로 작용한다. HeLa 세포내의 Akt2 mRNA 발현의 억제는 표시된 siRNA 분자에 의해 형질감염시켰다. p110β의 mRNA 수준에 대한 Akt2 mRNA 수준이 도시되어 있다. Akt1 특이적 분자 7A는 음성 대조용으로 작용한다.
도 18c는 Akt1 및 Akt2 발현을 특이적으로 감소시키는 상이한 루프를 갖는 합성 siRNA의 기능성을 나타내는 Akt 단백질에 대한 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. Akt1 및 AKt2 단백질 발현의 억제는 면역블럿에 의해 분석하였다. 표시된 헤어핀 siRNA(20nM)의 형질감염 48시간 후 상기 세포를 채취하였다. 세포 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분리하였으며 항-p110 항체, 항 AKt 1/2를 사용한 면역블럿에 의해 분석하였다. Akt1의 인산화된 형태에 특이적인 항체를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다. 대조용으로 사용되는 p110α의 위치, PI 3-키나아제의 다른 촉매 서브유닛 및 Akt1, Akt2 및 인산화된 Akt(P*- Akt)는 왼쪽에 표시되어 있다.
도 19는 이하 아미노 변형으로 또한 불리며, 3'-OH 말단 뉴클레오티드 또는 5’말단 뉴클레오티드에서 존재할 수 있는 NH2 변형을 도시한다. 당 잔기의 OH 기에 차례로 부착되는 상기 아미노기는 1 내지 8, 바람직하게는 6개 C 원자의 알킬 사슬을 포함하는 알킬 기를 통해 인산염에 부착되는 바, 상기에서 인산 기에 인접한 두번째 C 원자는 그에 부착된 CH2OH 기를 갖는다. 다르게는, 상기 링커는 에테르에 의해 형성될 수 있으며, 상기 에테르는 두개 알코올로 구성되는 바, 그 중 하나는 아미노 알코올이며 다른 하나는 에테르 기의 형성에 관여하는 한개의 알코올 기를 갖는 디알코올이며 다른 하나는 C 원자, 바람직하게는 인산기에 대하여 두번째 C 원자에 위치한 OH 기이다.
실시예 1: 합성 이중가닥 RNAi 분자의 용량 반응
* 본 실시예에서는 NH2 말단 보호기의 이중가닥 RNAi 분자의 활성에 대한 영향을 조사하였다. 합성 siRNA는 Biospring(Frankfurt, Germany)로부터 구입하였다. 상기 리보-올리고뉴클레오티드를 RNase를 갖지 않는 TE에 재현탁시켜 최종 농도가 50μM로 되게 하였다. 이분자 siRNA 분자일 경우, 동일한 분량(100μM)으로 조합하여 최종 농도가 50μM로 되게 하였다. 분자간 이중가닥의 형성을 위해, 상기 siRNA를 어닐링 완충액(25mM NaCl; 5mM MgCl2)중의 50℃에서 2분간 배양하고 실온으로 냉각시켰다. 형질감염은 올리고펙타민, 리포펙타민(Life Technologies), NC388(Ribozyme Pharmaceutical, Inc., Boulder, CO) 또는 FuGene 5(Roche)과 같은 다양한 양이온성 지질을 사용하여 제조자 지시에 따라 96-웰 또는 10cm 플레이트(30% 내지 50% 콘플루언시에서)에서 실시하였다. RNAi 분자는 무혈청 배지중의 어닐링된 RNAi 및 지질의 예비형성된 5x 농축된 복합체를 완전 배지내의 세포에 부가함으로써 형질감염시켰다. 96 웰 포멧으로 형질감염하기 15-18시간전에 웰당 2500개 HeLa 세포를 플레이트에 놓았다.
96-웰에 놓인 세포당 형질감염된 총 부피는 100㎕이었으며, 10cm 플레이트내의 세포에 대해서는 10ml였다. 최종 지질 농도는 세포 밀도에 따라 0.8 내지 1.2㎍/ml였다; 상기 RNAi 농도는 각 실험에 표시되어 있다.
37℃에서 30분간 방치하여 복합체가 형성되게 하였다. 복합체를 세포에 부가하여 지질 및 RNAi의 최종 1x 농도를 수득하였다. 형질감염 후 실시된 분석에 따라, 단백질 추출용 표준 세포 용해 완충액(Klippel, A., Escobedo, J. A., Hirano, M. 및 Williams, L. T.(1994). Mol Cell Biol 14, 2675-2685) 또는 RNA 분리 키트에 따른 RNA 분리용 변성 완충액(Invitek, Berlin(Germany))을 사용하여 RNA 분석인 경우 형질감염된지 24 내지 48시간 후에 또 웨스턴 블럿에 의한 단백질 분석인 경우 형질감염된지 48 내지 72시간 후에 세포를 용해시켰다.
Taqman 분석에 의한 RNA 수준의 상대량의 측정
형질감염된지 24시간 후, 96-웰에서 형질감염된 세포의 RNA를 분리시키고 Invisorb RNA HTS 96 키트(InVitek GmbH, Berlin)를 사용하여 정제하였다. PTEN mRNA 발현의 억제는 300nM PTEN 5’프라이머 CACCGCCAAATTTAACTGCAGA, 300nM PTEN 3’프라이머 AAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGT 및 40nM의 β-액틴 5’프라이머 GTTTGAGACCTTCAACACCCCA와 40nM의 β-액틴 3’프라이머 GACCAGACGCATACACGGACA 및 100nM의 β-액틴 Taqman 탐침 Vic-CCATGTACGTACCCATCCAGGCTCTG-Tamra 조합한 100nM의 PTEN Taqman 탐침 Fam-TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA-Tamra를 사용한 실시간 RT-PCR(Taqman) 분석에 의해 검출하였다. Akt 프라이머 및 탐침은 Sternberger 등(Sternberger, a.a.O.)에서 측정하였으며 제조자 지시(Applied Biosystem; Amplicon Set의 용도)에 따라 사용하였다. 또한, 상기 프라이머 및 탐침은 소프트웨어 프로그램 Primer Express(Applied Biosystem)를 사용하여 고안할 수 있다. 상기 반응은 50㎕에서 실시하였으며 하기 조건하에서 제조자의 지시에 따라 ABI PRISM 7700 서열 검출기(Applied Biosystem)로 평가하였다: 48℃에서 30분간, 95℃에서 10분간 이후에 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분간 40주기.
RNA 녹다운은 지질 캐리어 농도 1.0㎍/ml에서 5'-말단의 NH2 및 전화된 abasic 기에 의해 변형되거나 변형되지 않은 21nt 긴 siRNA 이중가닥 분자에 의해 형질감염된 HeLa 세포의 실시간 RT-PCR 분석에 의해 도시되었다.
세포 추출물의 제조 및 면역블럿팅 . 세포를 냉각된 인산염-완충 식염수로 2회 세척하고 20mM 트리스(pH 7.5), 137mM NaCl, 15% (vol/vol) 글리세롤, 1% (vol/vol) Nonidet O-40(NP-40), 2mM 페닐메틸술포닐 플루오르화물, ml당 10mg 아프로티닌, 20mM 루펩틴, 2mM 벤즈아미딘, 1mM 바나듐산염 나트륨, 25mM β-글리콜 포스페이트, 50mM NaF 및 10mM NaPPi를 함유하는 4℃의 용해 완충액에서 용해시켰다. 용해물은 14,000 x g에서 5분간 원심분리에 의해 제거하고 동일한 양의 단백질을 함유하는 동분량의 세포 추출물은 웨스턴 블럿팅에 의해 단백질 발현에 대해 분석하였다: 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 니트로셀룰로오스 여과기(Schleicher & Schuell)로 옮겼다. 여과기는 5%(wt/vol) 건조된 우유를 함유하는 TBST 완충액(10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 0.05%(vol/vol) 트윈 20, 0.5%(wt/vol) 아지드화 나트륨)으로 차단하였다. 각각의 항체는 적절히 희석하여 TBST로 부가하였다. 결합된 항체는 TBST중의 항-마우스 또는 항-토끼 결합된 꽃양배추 퍼옥시다아제(Transduction Laboratories)를 사용하여 검출하고 세척하며, SuperSignal Wes Dura(Pierce) 또는 ECL(Amersham) 화학발광 기질(c.f. Sternberger 등.(2002). Antisense . Nucl . Ac . Drug Dev . in press.)을 사용하여 현상하였다.
항체. 쥐의 단일클론성 항-p110 항체 U3A 및 쥐의 단일클론성 항-p85 항체 N7B는 개시되어 있다(Klippel 등., 1994, aaO). 토끼의 다클론성 항-Akt 및 항-인산 Akt(S473) 항체는 Cell Signaling Technology로부터 수득하였다. 쥐의 단일클론성 항-PTEN 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 수득하였다. 하기 서열(ucuccuuTTGTTTCTGcuaacga)을 갖는 PTEN 53 특이적 안티센스 분자 즉, geneBloc는 Sternberg 등[Sternberger, supra]에 개시되어 있으며, 상기에서 소문자로 표시된 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드인 반면, 대문자로 표시된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 이 안티센스 분자는 TT없이 RNAi 1A와 또한 동일하다.
상기 결과는 도 3a에 도시되어 있으며, PTEN의 mRNA에 관련된 각각의 RNAi 분자는 도 3b에 도시되어 있다. 소문자로 된 상기 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드를 나타내는 반면, 대문자는 데옥시리보뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 NH2는 리보뉴클레오티드의 3'-위치가 아미노기에 의해 변형됨을 의미한다. 여기에 사용된 RNAi 분자 및 본원에 개시된 다른 실시예는 또한 작은간섭 RNA 분자 siRNA로 또한 불린다. 본원에 함유된 임의의 숫자에 있어서 상부 가닥은 간섭 RNA 분자의 안티센스 또는 첫번째 가닥인 반면, 하부 가닥은 센스 또는 두번째 가닥이다.
도 3a로부터 알 수 있듯이, 아미노 변형과 같은 아미노 말단 변형 및 핵산의 말단 OH 기의 전화된 abasic 변형은 상기 변형이 안티센스 가닥의 3’말단에 위치할 때 비변형된 말단만큼 강력하다(도 8a; 8b 참조). 따라서, 안정화시키는 화학적 변형 또는 다른 이로운 특성(전달)은 3’OH에 위치할 때 특히, 3’OH가 오버행잉 뉴클레오티드상에 위치할 때 활성의 손실없이 허용될 것이다.
도 3c에 도시된 실험을 위해, 상술한 바와 같은 유사한 조건을 사용하였다. RNAi의 첫번째 가닥 및 두번째 가닥은 리보스 잔기의 3'-위치에서 NH2 기에 의해 또는 상기 위치에서 전화된 abasic에 의해 변형된다. 첫번째 작제물은 siRNA-NH2(3A3B)로, 두번째 작제물은 siRNA-iB(4A4B)로 지정하였다. 두 분자의 서열은 도 3b에 도시되어 있다. 용어 3A3B는 안티센스 가닥으로서 가닥 3A 및 센스 가닥으로서 3B로 구성된 간섭 리보핵산을 의미한다. 비교를 위해, GB53(Steinberger 등., supra)으로 나타낸 PTEN mRNA에 대해 유도된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 이 후자 실험의 특별함은 하기와 같다.
도 3c에 도시된 바와 같이, 도 3b에 도시된 말단 보호된 RNAi 분자는 PTEN 단백질 녹다운을 생성하는데 기능적이다.
이 실시예로부터 PTEN 단백질을 녹다운하는데 RNAi 분자를 활성이게 하는 양쪽 말단 보호기를 취할 수 있다. 이 억제는 안티센스 작제물을 갖는 억제만큼 효과적이지만 사용된 저 농도에서는 이미 매우 강력한 안티센스 기술에 비해 훨씬 효과적이다.
실시예 2: 생체내에서 RNAi 이중가닥 활성에 대한 오버행 요건
PTEN mRNA 표적 간섭 RNAi 분자가 상이하게 고안된 것을 제외하고는 실험방법은 실시예 1에 나타난 것과 동일하다. 상기 결과는 도 4a에 나타낸 데어터를 만들기 위해 사용된 간섭 RNAi 분자의 특정 서열 및 변형을 나타내는 도 4b와 함께 용량 반응 곡선으로 도 4a에 도시되어 있다. 명명은 예를들면, RNAi 18은 안티센스 가닥으로서 가닥 18A 및 센스 가닥으로서 18B로 구성되는 식으로 하였다.
HeLA 세포에서 PTEN mRNA를 녹다운하는 이들의 활성에 대해 비점착성 말단(blunt end) 분자를 3'-오버행(RNAi 18) 및 5'-오버행(RNAi 30 및 RNAi 31)을 갖는 분자와 비교하였다. 비점착성 말단(blunt end) 분자(RNAi 28) 및 5'-오버행을 갖는 분자의 활성은 3'-오버행을 갖는 분자의 활성과 필적한다. 이는 3'-오버행은 RNAi 활성에 있어서 필수적이 아니라는 것을 나타낸다.
실시예 3: 생체내에서 RNAi 활성에 대한 간섭 RNA 분자의 이중가닥 길이 요건
간섭 RNA 분자가 Akt1의 mRNA에 대해 유도된 것을 제외하고는 본 실험방법은 실시예 1에 나타난 것과 동일하다. RNAi 분자의 특이성을 나타내기 위한 음성 대조용은 p110 mRNA였다. 상기 실험결과는 도 5b에 도시된 사용된 간섭 RNAi 분자의 특수성과 함께 도 5a에 도시되어 있다. 도 7a의 왼쪽 패널에 도시된 추가 siRNA 작제물을 사용하여 유사한 실험을 실시하였으며, 상기에서 화살표는 미스매치(mismatch)를 나타내며 데옥시리보뉴클레오티드는 대문자로 표시되었다. 지시양의 siRNA 분자에 의해 형질감염된 HeLa 세포에서 Akt1 mRNA 발현의 억제는 도 7a의 오른쪽 패널에 도시되어 있다.
상이한 RNAi 분자에 의해 형질감염된 HeLa 세포로부터 Akt RNA에 관한 Taqman 분석은 siRNA 분자의 이중가닥은 활성을 나타내기 위해서는 17개 염기 쌍보다 길어야 하는 반면, 17개 염기 쌍의 긴 이중가닥을 갖는 분자 또는 더 짧은 분자는 서열 -특이적 오버행을 부가하더라도 기능적이지 않다는 것을 보여주었다. 성공적으로 실험된 가장 짧은 RNAi 분자는 18 내지 19개 뉴클레오티드 길이 또는 염기 쌍 길이였다. RNAi 51로 불리는 간섭 RNA 분자 51A/51B의 고안은 국제 특허 출원 WO 01/75164에 개시된 것에 대응한다. 상기 RNA 분자 51A/51B는 17개 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하며 Akt1 mRNA의 퇴화에서 명확히 감소된 활성을 갖는다.
도 7a에 도시된 바와 같이, 19nt 긴 이중가닥은 3'-오버행(비교분자 1AB, 2AB, 3AB, 4AB)의 특성(데속시- 또는 리보뉴클레오티드)과 관계없이 Akt1 mRNA 양을 감소시키는데 매우 효과적이다. 상기 17개 뉴클레오티드 긴 siRNA(분자 5AB)는 극적으로 감소된 침묵 활성을 나타내어 활성 siRNA 이중가닥은 적어도 18nt이거나 더 길어야 한다는 상술된 사항을 확증하였다. 임의의 이론에 제한됨없이, 이 결과는 두개의 상이한 필요조건에 의해 역학적으로 설명될 수 있다. 첫째, siRNA의 안티센스와 표적 mRNA간의 18nt의 최소 염기 쌍은 필수적이며 둘째, RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)내로의 통합은 siRNA 이중가닥의 최소 길이를 필요로 한다. 이를 해결하기 위해, 야생형 서열에 관련된 한개 및 두개 말단 돌연변이(CG 및 UA 역위)를 갖는 19nt 긴 siRNA 이중가닥 분자를 합성하였다(분자 6AB 및 7AB). 두개 분자, 심지어는 표적 mRNA에 대해 단지 15nt 염기 쌍의 스트레치를 갖는 분자는 Akt1 mRNA 수준을 유도하는데 있어서 기능적이었다. 따라서, 표적 mRNA를 갖는 안티센스 siRNA의 염기 쌍이 아닌 이중가닥 길이 그 자체가 기능적인 siRNA의 최소 길이를 결정하는 것처럼 보인다는 결론에 도달할 수 있었다. 이는 이중가닥 나선의 길이가 RISC 복합체내로 통합하는데 중요한 결정인자임을 시사한다. siRNA 이중가닥의 말단에 도입된 미스매치(mismatch)는 RNA 간섭에 거의 영향을 미치지 않는다.
실험결과를 고려할 때, 최적 RNAi 매개 간섭을 위한 최소한의 필요조건은 비점착성 말단(blunt end) 또는 5'-오버행 또는 본원에 개시된 임의의 다른 형태와 같은 RNAi 분자의 추가 고안과 관계없지만 일반적으로 RNAi 분자에 적용가능한 18 또는 19개 뉴클레오티드의 이중가닥 길이이다. 그러나, 상기 RNAi 분자의 특정 고안은 상기 분자에 다른 이점을 부가 할 수 있는 바 예를들면, 증가된 효능 및 증가된 안정성이다.
실시예 4: 생체내에서 RNAi 에 대한 표적- 안티센스 상동 요건
이 실험은 실시예 1에 도시된 실험과 유사하게 실시하였으며, 상기에서 RNAi는 Akt1에 대해 특이적이다. 또한, PTEN 특이적 간섭 RNA 분자를 고안하여 음성 대조용으로 사용하였다. 상기 결과는 도 6a 및 6b에 도시되어 있다. 기본적으로, 도 7b(오른쪽 패널) 및 도 7c에 각각 도시된 결과와 함께 도 7b에 도시된 바와 같이 추가 siRNA 분자를 사용하여 동일한 실험을 실시하였다.
기능적 siRNA 분자에 대해 18개 또는 18개 뉴클레오티드 이상의 최소 이중가닥 길이가 확립되었으므로, 본 발명자들은 활성을 침묵시키기 위해 표적 mRNA와 siRNA 사이에 얼마나 많은 미스매치(mismatch) 뉴클레오티드가 필요한 것인지에 대해 의문을 가졌다. Akt1 RNA에 대한 Taqman 분석에 의해 나타난 바와 같이, 표적 RNA, 이 경우에서는 Akt1,에 완벽하게 일치하는 19 내지 15개 뉴클레오티드의 스트레치는 RNAi 활성을 매개하는데 충분하다. PTEN 특이적 RNAi 분자는 Akt1의 RNA 양을 감소시키지 않으므로 이 방법의 특이성을 확증하였다. 임의의 또는 양쪽 가닥의 말단에서 하나 또는 두개 뉴클레오티드의 미스매치(mismatch)는 기능적이며 표적 RNA와 RNAi간의 15nt 상동 스트레치는 유전자 침묵에 충분하다는 것을 시사한다. 이들 데이터를 통해 비특이적 유전자 침묵은 관련되지 않은 표적에 비특이적 결합을 통한 우연에 의해 발생할 수 있다는 결론에 이를 수 있었다. 이는 15 내지 17개 일치 염기 쌍의 스트레치는 단일 유전자에 대해 특이적이지 않으며 복합성 및 게놈의 크기 및 척추동물의 전사물을 고려할 때 우연에 의해 발생할 수 있다는 이해를 토대로 한다. 상술한 실험과는 별도로 미스매치(mismatch)의 위치 또한 연속적으로 분석하였다. 이를 위해, PTEN mRNA에 대해 유도된 19 nt 긴 무딘 siRNA를 사용하였다. 한개 siRNA 가닥에서의 서열변화는 다른 가닥에서의 상보성 변화에 의해 보상되어 이중가닥 형성의 방해를 피하였다. 도 7b 및 7c에 도시된 바와 같이, 분자 중심에서 오직 한 부분의 돌연변이를 갖는 siRNA는 mRNA를 사용하는 능력 및 단백질 발현 수준에 있어서 심하게 손상되었다. 이 결과는 RNA 기계가 이중가닥의 중심내의 표적 mRNA와 siRNA간의 완전 및 불완전 염기 쌍사이에서 매우 차이가 있음을 나타낸다. 표적 및 siRNA간의 완전한 상보성에 대한 이 극도의 의존성은 초파리(Drosophila) 계에서 RNAi 간섭에 대해 이미 개시되었지만, HeLa 와 같은 포유류 계와 관련하여서는 아직 아니다.
이러한 관찰을 토대로 본 발명은 두 가지 방법에 의해 siRNA의 오프-표적 문제를 줄였다. 첫째로, 최소 필요조건(18-19 nt)에 대해 siRNA 분자의 분자길이를 줄임으로써 오프-표적에 대한 상동성의 기회를 줄인다. 두번째로, 관련되지 않은 표적 RNA에 대해 센스 가닥의 우연한 상보성에 의해 유발되는 원하지 않은 RNA 침묵을 막는 센스 가닥의 불활성화에 의해서이다(실시예 6 참조).
실시예 5: 혈청내의 변형된 RNAi 분자의 안정성
올리고뉴클레오티드를 사람 혈청에서 15분 및 2시간동안 배양시키고 미처리 대조용과 함께 10% 폴리아크릴아미드 겔상에 채워넣었다. 결과는 도 8a에 도시되어 있다. 사용된 다양한 RNAi 분자가 나타나 있으며 더 상세한 것은 도 8b에 개시되어 있다.
2'-O-메틸기(RNAi 분자 79A79B 및 28A28B)에 의해 변형된 모든 뉴클레오티드를 갖는 RNA 분자의 RNAi 이중가닥은 혈청에서 높은 안정성을 갖는다는 것을 이 실시예로부터 알 수 있다. 무딘 이중가닥은 오버행을 갖는 이중가닥 분자보다 더 안정하다는 것 또한 알 수 있다. 이로부터 말단 보호기(예를들면, iB 또는 아미노)는 혈청에서 안정성을 증가시키지 않는다는 결론을 도출할 수 있다.
또한, 본원 출원이전의 선행기술에 대한 이해와 다르게 엑소뉴클레아제보다 엔도뉴클레아제가 RNAi 분자의 보호에 있어서 더 중요하다고 결론을 내릴 수 있다.
이러한 견해에서, 본원에 개시된 RNAi 분자의 다양한 변형 또는 고안외에, 뉴클레오티드에 대한 다른 또는 추가적 변형은 엔도뉴클레아제 기능을 억제하기 위해 완전하거나 또는 부분적인 RNAi 분자의 포스포로티오에이트 백본(backbone)의 사용이 될 것이다. 완전한 포스포로티오에이트 백본은 임의의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기를 나타내는 것을 의미하는 반면, 부분적인 포스포로티오에이트 백본은 RNAi 분자를 형성하는 모든 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 변형을 갖는 것은 아님을 의미한다. 이 변형은 RNAi 분자의 추가 고안에 관계없이 RNAi 분자의 수명을 증가시키는데 적절하다. 이와 관련하여, 부분적이거나 또는 완전한 포스포로티오에이트 변형된 RNAi는 본원에 개시된 바와 같이 또는 공지된 선행기술의 임의의 고안에서와 같이 간섭 RNA 분자의 고안을 위한 상이한 방법과 관련하여 실시될 수 있는 본 발명에 영향을 받는다.
실시예 6: 5’및 3’ 말단상의 NH 2 말단 보호기에 의한 센스 가닥의 불활성화
표적 핵산 서열이 PTEN mRNA인 실시예 1과 관련하여 개시된 실험과 유사하게 실험을 실시하였다. HeLa 세포의 농도는 웰당 2,000세포이다. PTEN의 RNA는 상이하게 변형된 RNAi 분자의 형질감염 후에 Taqman 에세이에서 분석하였다. 사용된 상이한 간섭 RNA 분자는 도 9b에 도시되어 있는 반면, 실험결과는 도 9a에 도시되어 있다.
도 8a에 도시되어 다양한 RNAi 분자의 용량 반응 곡선으로부터 알 수 있는 바와 같이, RNAi 분자는 센스 가닥 즉, 두번째 가닥이 양쪽 말단상에서 아미노기에 의해 변형될 때 기능적이다. 특히 효과적인 것은 RNAi 분자 20A26B, 18A26B 및 28A26B이다. 가장 낮은 활성은 이중가닥의 모든 4개 말단상에서(Tuschl은 18AB임) 말단 변형에 대응하는 RNAi 분자 28A26B에 의해 나타난다.
그러나, RNAi 활성은 안티센스 가닥 즉, 첫번째 가닥이 5’말단에서 유리 OH 기를 방출하는 3’말단에서만 변형될 때 또한 달성된다(RNAi 작제물 22A26B; 20A26B). 상기 안티센스 가닥이 5’및 3’말단상에서 아미노기와 함께 변형될 때 활성은 없다. 이는 임의의 안티센스 가닥의 말단 및 더 구체적으로는 안티센스의 5’말단은 변형없이 유지되어야 한다는 결론에 이르게 한다. 또한, NH2 말단 변형은 5’및 3’말단상의 센스 가닥을 불활성화하는데 사용될 수 있으므로 RNAi 분자의 임의의 의료적 사용뿐만 아니라 표적 확인에 이로운 RNAi 분자의 특이성을 상당히 증가시키는 다른 기능적인 센스 가닥에 의해 매개되는 오프-표적 효과를 감소시킨다는 것은 매우 언급할만 하다.
이 실험 결과의 일반화는 도 9c에 도시되어 있다. 기능적으로 활성인 RNAi는 따라서 안티센스 가닥에서 아미노 변형을 갖지 않거나 또는 안티센스 가닥의 3’말단에서만 아미노 변형을 갖고, 안티센스 가닥의 양쪽 말단에서 아미노 변형은 기능적이지 않는 즉, 표적 mRNA의 녹다운을 초래하지 않는다.
실시예 7: 엔도뉴클레아제 보호를 위한 RNAi 분자의 2'-O- 메틸 변형에 대한 효과
RNA의 녹다운은 도 10a에 나타난 바와 같이 PTEN mRNA에 대해 유도된 RNAi 이중가닥 분자에 의해 형질감염된 HeLa 세포에 대한 실시간 RT-PCR 분석을 이용하여 또한 보여진다. 실험방법은 실시예 1과 기본적으로 동일하다. RNAi 분자의 구조를 조사하고 도 10a에 도시된 이들의 용량 반응은 도 10c에 나타나 있다. 굵게 인쇄된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 갖는 뉴클레어티드이다.
내부 2'-O-알킬기가 RNAi 활성을 감소시킨다는 것은 도 10a의 다양한 RNAi 분자에 대해 표시된 용량 반응 곡선에 의해 설명된다. 바람직하게는, 그러한 2'-O-알킬기는 2'-O-메틸 또는 2'-O-에틸기이다. 그러나, 2'-O-알킬 변형과의 결합에서 변형되지 않은 뉴클레오티드를 갖는 분자는 중요한 활성을 나타낸다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 안티센스 가닥이 모두 2'-O-메틸기로 변형되고 센스 가닥이 변형되지 않을 때(비교하면, RNAi 분자 79A28B) 활성이 존재하지 않는다. 도 10b에 도시된 바와 같이 혈청내의 다양한 RNAi 분자의 배양과 같은 안정성 실험의 결과를 고려할 때, 2'-O-알킬 변형은 퇴화에 대해 RNAi 분자를 안정화시킴을 보여준다. 그러나 이 명백히 이로운 효과는 2'-O-알킬 변형이 감소된 녹다운 활성을 일반적으로 초래한다는 효과에 의해 적어도 어느 정도 상쇄된다. 따라서, RNAi 분자의 고안은 활성에 대해 안정성 균형을 유지해야 하는 것으로 이는 본 출원에 개시된 바와 같이 다양한 고안 원칙을 알고 있는 것이 중요하다.
실시예 8: 혈청에서 RNAi 분자의 안정성에 대한 내부 2'-O- 메틸 변형의 블럭의 효과
이 연구와 관련한 실험방법은 실시예 1에 도시된 것과 동일하다. 상이한 용량의 RNAi 분자에 의해 형질감염된 HeLa 세포의 2000 세포/웰의 밀도에서 실시간 RT-PCR에 의해 PTEN RNA를 또 분석하였다. RNAi 분자를 두시간 동안 혈청에서 배양시키고 10% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하였다. 실험결과는 도 11a 내지 11c에 각각 도시되어 있으며, 상기에서 도 11a는 11c에 도시된 다양한 RNAi 분자의 용량 반응을 나타내며, 도 11b는 11c에 도시된 RNAi 분자의 일부를 사용한 안정성 실험의 결과를 나타낸다. 도 11c에 굵게 표시된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 리보스 잔기의 2'-O-메틸 변형의 존재에서 변형을 수반하는 뉴클레오티드임을 알아야 한다.
비변형된 RNAi 분자에 의한 용량 의존성 억제가 존재한다. 중심부 9 뉴클레오티드의 2'-O-메틸 변형은 혈청에서 RNAi를 안정하게 하며 PTEN mRNA의 퇴화를 유도하는 간섭 현상을 매개하는 의미에서 이중가닥의 활성도를 허용한다. 센스 가닥의 총 변형은 혈청에서 RNAi 분자를 안정하게 하며 특정 활성도를 허용한다.
5 뉴클레오티드와 2'-O-메틸 변형이 교대되는 불록은 상기 RNAi 분자를 혈청에서 안정하게 하며, 도시된 바와 같이 두시간 동안 혈청에서 RNAi 이중가닥을 배양시키고 10% 폴리아크릴아미드 겔상에 샘플을 적재함으로써 PTEN RNA에 대한 활성도를 허용한다. 도 11b에 도시된 바와 같이, 가닥 80A 및 80B를 포함하는 이중가닥은 혈청에서 두시간동안 배양된 후 강하게 퇴화된다. 가닥 82A 및 82B로 구성되는 이중가닥 구조는 안티센스 가닥을 포함하는 첫번째 가닥의 5'-말단은 5'-말단 뉴클레오티드에서 변형되서는 안된다는 결과를 확증하였다(82A82B를 역 기원된 81A81B와 비교). 이는 또한 혈청에서 활성이며 안정한 가닥 86A 및 86B로 구성된 이중가닥을 갖는 수득된 결과에 의해 확인되었다. 안티센스 가닥의 5’말단에서 비변형된 블럭을 갖는 분자는 더 활성이며, 상기에서 5’말단 OH 기는 바람직하게는 유도되지 않는다.
뉴클레오티드의 2'-O-메틸 변형의 상이한 변형 패턴을 사용하여 추가 실험을 실시하였다. 실험결과는 도 12a 내지 12c에 도시되어 있으며 그 내용은 실시예 9에서 논의되어 있다.
실시예 9: RNAi 분자의 혈청 안정성에 대한 교대되는 내부 2'-O- 알킬 변형의 효과
이 연구를 실시하기 위한 실험은 표적 핵산이 PTEN mRNA인 실시예 1 및 8의 연구와 관련하여 사용된 실험과 동일하다. HeLa 세포는 도 12b에 도시된 상이한 RNAi에 의해 감염시켰으며, RNA 녹다운은 용량-의존성 방식에서 PTEN RNA에 대한 실시간 RT-PCR을 사용하여 입증하였다(도 12a). 37℃의 혈청에서 15분 및 두시간 후의 다양한 RNAi 분자의 안정성은 도 12c에 도시되어 있으며, p110에 대한 웨스턴 블럿 및 다양한 RNAi 분자의 표적-단백질로서 PTEN은 실험된 RNAi 분자가 도 12c 및 도 12d의 실험과 동일한 RNAi 분자와 함께 도 12d에 도시되어 있다.
도 12a 및 도 12c에 도시된 바와 같이, 비변형된 뉴클레오티드와 교대하는 2'-O-메틸기로 변형된 뉴클레오티드는 혈청내에서 RNAi 분자를 안정하게 하며 표적 mRNA를 방해하는 점에서 RNAi 분자가 여전히 활성이게 한다. 혈청에서 RNAi 이중가닥 분자의 15분 및 두시간동안의 배양은 비변형 이중가닥 및 5'-위치 10개 뉴클레오티드가 비변형된 이중가닥을 퇴화시킨다.
도 12b에 나타내어진 RNAi 분자에서 다양한 변형 및 비변형 뉴클레오티드가 실현되었다. RNAi 분자 94A1/94B1은 변형된 뉴클레오티드가 첫번째 가닥의 5’말단에 위치한 비변형 뉴클레오티드를 갖는 비변형 뉴클레오티드에 의해 측면위치한 구조를 포함한다. 가닥 94A2 및 94B2로 구성되는 상기 RNAi 분자는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드 및 비변형된 뉴클레오티드가 마주보게 위치해 있는 다른 실시예이다. 이와 반대로, 가닥 94A1 및 94B2로 구성되는 RNAi 분자는 동일한 변형 및 비변형된 뉴클레오티드 패턴을 갖는다. 그러나, 상의 변동이 존재하여 변형된 뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드와 함께 염기 쌍을 형성한다. 가닥 94A1과 94B1 및 가닥 94A2와 94B2로 구성된 상기 두 RNAi 분자는 서로 상이하여 첫번째 경우, 첫번째 가닥은 비변형된 뉴클레오티드로 시작하며 두번째 가닥의 대응하는 첫번째 뉴클레오티드 즉, 두번째 가닥의 3’말단에서의 뉴클레오티드는 94A2와 94B2로 구성된 RNAi 분자에서 이에 마주보는 배열을 갖는 비변형된 뉴클레오티드로 시작한다.
또한, 도 12b에 도시된 바와 같이 교대적으로 변형된 RNAi 분자는 두번째 5’ 및 두번째 3’말단 뉴클레오티드가 변형되지 않을 때만 도 12d에 도시된 바와 같이 PTEN 단백질 녹다운의 매개에 기능적이다(94A294B1 및 94A294B2 참조). 이들 두 데이터는 가장 안정하며 가장 활성인 RNAi 분자가 교대하는 2’알킬 변형 및 비변형된 뉴클레오티드 잔기를 갖는다는 것을 보여주었다. 이들 분자는 혈청에서 안정하여 증가된 또는 쉬운 조작을 허용하는 비변형된 RNAi 분자와 비교할 때 매우 유사한 mRNA 감소를 나타냄을 주목해야 한다.
실시예 10: 내적으로 변형된 RNAi 분자에 의해 매개되는 기능적 단백질 녹다운
이 실험 방법은 실시예 1과 유사하다.
도 12b에 도시된 바와 같이, 교대적으로 변형된 RNAi 분자에 의한 형질감염 후(48, 72 및 120 시간) 다양한 시점에서 채취한 HeLa 세포에 대해 웨스턴 블럿을 실시하였다. 96시간의 시점에서 세포를 분열시키고 분열된 세포의 절반을 플레이트에 다시 놓았다는 것을 주목해야 한다. 다양한 RNAi 분자의 총 40nM를 상기 세포에 적용하였다. 세포는 실시예 1에 개시된 바와 같이 양이온성 지질로 72시간동안 연속적으로 형질감염시켰다; 이어 형질감염 시약의 부재하에서 다시 플레이트에 놓았다.
형질감염은 올리고펙타민, 리포펙타민(Life Technologies), NC388, L8(Atugen, Berlin)과 같은 다양한 양이온성 지질을 사용하여 96-웰 또는 10-cm 플레이트(30% 내지 505 콘플루언시)에서 실시하였으며, RNAi는 siRNA의 예비형성된 5x 농축된 복합체 및 무혈청 배지의 지질을 완전 배지내의 세포에 부가함으로써 형질감염시켰다. 총 형질감염 부피는 96-웰에 놓인 세포에 대해 100㎕이며 10cm 플레이트내의 세포에 대해서는 10ml이었다. 최종 지질 농도는 세포 밀도에 따라 0.8 내지 1.2㎍/ml이었다; siRNA의 농도는 각 실험에 나타나 있다.
웨스턴 블럿 분석의 결과는 도 13a에 도시되어 있다. 이 도면으로부터 취할 수 있는 바와 같이, 94A2B1 및 94A2B2 버전의 변형된 RNAi 분자는 비변형된 분자와 같이 더 오래 지속하는 PTEN 단백질 녹다운을 얻었다. 94A1B1 및 94A1B2 버전의 분자와 함께 도 12에서 또한 보여지는 단백질 녹다운의 결핍은 이 실험에서 확인되었다. 비변형된 분자(80AB)는 상기 세포가 연속적으로 형질감염되지 않을 때 오래 지속하는 단백질 녹다운을 지지하는데 있어서 강력하지 않다.
실시예 11: RNAi 분자의 교차하는 2'-O- 메틸 변형을 갖는 지속적인 PTEN 단백질 녹다운
이 실험은 형질감염 배지를 새로운 배지로 대체한 지 5시간 후 형질감염을 종결한 것을 제외하고는 실시예 10과 유사하다. 실시예 1에 개시된 바와 같이 1㎍ RNAi/ml 양이온성 지질의 스톡 용액을 사용하여 각각의 RNAi 분자에 대해 40nM 농도가 실현되도록 방법을 약간 변형시켰다. 형질감염 5시간 후 상기 배지를 버리고 새로운 EMEM를 부가하였다. 상기 세포를 72시간 후 분열시켜 세포의 반은 용해시키고 나머지 반은 새로운 플레이트에 놓아 24시간 후(형질감염 96시간 후)에 용해시켰다. 상이한 3개 RNAi 분자(80AB, 94A1/B2, 94A2/B1)를 사용한 웨스턴 블럿 분석의 결과는 도 14에 도시되어 있다. 양성 대조용으로 도 14에서 사용된 미처리된 세포는 각각 72시간 및 96시간 후 PTEN의 발현을 나타냈다. 다양한 RNAi 분자의 구조적 특이성을 고려할 때, 단백질 녹다운은 비변형된 RNAi 분자(80AB와 같은) 및 RNAi 분자 94A1/B2와 비교할 때 세포분열 및 다시 플레이트에 놓은 후 96시간에 걸쳐서 94A2/B1의 교차하는 분자와 함께 지속하는 것을 도 14로부터 알 수 있다.
도 15a에 도시된 바와 같이 siRNA 작제물을 사용하여 추가의 실험을 실시하였다. 실험 계에 투여된 siRNA 작제물의 다양한 농도에서 PTEN/p110α mRNA 퇴화의 비율로 도시된 실험결과로부터, 2'-O-메틸 잔기로 구성되는 하나 또는 두 가닥 모두를 갖는 siRNA 분자는 포유류 계에서 RNA 간섭을 유도할 수 없음을 알 수 있다(도 15a, 분자 V2, V5, V6). 그러나, 가닥의 일부분만이 변형될 때 활성도 감소가 덜 나타났다. 흥미롭게도, 비변형된 안티센스 가닥(본 명세서에 달리 표시되지 않은 한 상부 가닥임) 및 완전하게 변형된 센스 가닥은 그 반대의 경우와 비교할 때 상당히 더 활성이었다(도 5a, 분자 V5 및 V6). 이 결과는 siRNA의 안티센스 가닥은 변형에 더욱 중요하며 민감하다는 것을 시사한다. PTEN mRNA를 유도하는 가장 효과적인 분자는 양쪽 가닥위의 교대하는 위치(도 15a, 분자 V10, V12)상의 비변형된 또는 변형된 5’말단을 방치하는 변형 스트레치만을 갖는다.
뉴클레아제 내성을 실험하기 위해, 상이한 siRNA 버전을 PAA 겔 전기영동 후 혈청에서 배양시켰다. 결과는 도 15b에 도시되어 있다(다양한 서열을 갖는 오른쪽 패널은 도 15b의 왼쪽 패널상에 나타나 있다). 초기에 표시된 바와 같이, 비변형된 리보뉴클레오티드를 갖는 비점착성 말단(blunt end)의 siRNA 분자는 매우 빠르게 퇴화되는 반면 2'-O-메틸 뉴클레오티드로의 완전한 치환은 혈청 유도된 뉴클레아제에 대한 내성을 매개하였다(도 15b, 분자 AB를 V1과 비교). 부분적인 2'-O-메틸 변형을 갖는 siRNA 분자는 비변형된 siRNA 분자와 비교할 때 증가된 안정성을 또한 나타냈다. 특히, 양쪽 가닥상의 교대하는 변형을 갖는 분자는 불안정성에 있어서 상당히 증가됨을 보여주었다(도 15b, 분자 V13, V14, V15 및 V12). 더 중요하게는, 이들 세개 분자의 HeLa 세포내로 형질감염은 도 15c(길이 6, 9 및 10)에 도시된 바와 같이 PTEN 단백질 발현의 하향 조절을 초래한다. 이 RNA 간섭 활성 에세이 경우, 안티센스 가닥의 가장 5’말단 뉴클레오티드(분자 V15 및 V12)로 시작하는 매 두번째 뉴클레오티드에서 변형된 분자에 대한 예기치 못한 선택이 관찰되었다. 안티센스 가닥의 가장 5’말단에서 두번째 뉴클레오티드로 시작하는 변형을 함유하는 분자는 더 안정하지만 유전자 침묵에 있어서 강하게 감소된 활성을 갖는다(분자 V13, V14). 이 결과는 siRNA 이중가닥에서 관련된 효소 및 정확한 뉴클레오티드간의 매우 특이적 상호작용을 나타낸다. 본원에 나타난 데이터와 함께 siRNA 이중가닥내의 특별히 선택된 위치에서 2'-O-메틸 변형은 뉴클레아제 내성을 증가시킬 수 있으며 RNAi를 반드시 완전하게 제거하지 않는다는 것을 입증하였다.
합성 siRNA의 증가된 안정성은 생체내 적용을 첫째로 암시하지만, 특정 변형이 세포 배양 계에서 연장된 단백질 녹다운을 초래할 수 있을지 여부에 대해 또한 분석하였다. 이에 따라, HeLa 세포를 PTEN 특이적 siRNA의 상이한 버전을 사용하여 6시간 동안 일시적으로 형질감염시켰다. 지질 siRNA 복합체를 이어 세척하고 PTEN 단백질 녹다운을 48시간 및 120시간 후에 분석하였다. 매우 일시적인 녹다운을 초래하는 이 시간동안에 형질감염되지 않은 세포의 빠른 성장때문에 siRNA의 연속적인 형질감염없는 녹다운 실험이 복잡하지만, 본 발명자들은 개시된 2'-O-메틸 변형에 의해 안정된 siRNA 분자를 갖는 연장된 PTEN 단백질 녹다운을 입증할 수 있었다. 형질감염 48시간 후, 비변형된 siRNA(AB)는 PTEN 단백질 수준에서 가장 큰 감소를 나타냈지만, 형질감염 120시간 후에서 PTEN 단백질 발현의 감소는 교대하는 2'-O-메틸 변형에 의해 안정된 siRNA와 함께 더 우세하였다(도 15d, 레인 2와 레인 4, 6 및 7을 비교).
결과로부터, 바람직하게는 교대하는 변형의 개시 뉴클레오티드 위치가 중요한 것같다는 것을 또한 알 수 있다. 좀 더 상세하게 이 선호도를 실험하기 위해 두 개의 추가적인 siRNA를 합성하였는 바, 한개는 키나아제 Akt1에 대해 특이적이며 다른 한개는 PI(3-) 카나아제의 두개 촉매 서브유닛중 하나인 p110β에 대해 특이적이다. 특정 작제물은 도 16a에 도시되어 있다. 매 두번째 다른 뉴클레오티드상의 2'-O-메틸 변형을 갖거나 또는 임의의 변형이 없는 19nt 긴 siRNA 이중가닥만을 사용하였음을 알 수 있다. 표적으로 Akt1을 사용하여 포스포-Akt 수준의 극적인 감소뿐만 아니라 효과적인 단백질 녹다운은 무딘, 비변형된 siRNA에서 관찰되었다(도 16a, 오른쪽 패널). 매 두번째 다른 뉴클레오티드상의 변형을 갖는 상이한 버전의 뉴클레오티드로부터 오직 한개만이 효과적으로 RNAi를 매개하였다(도 16a, 분자 V5). 이 siRNA 분자는 가장 5’말단 및 3’뉴클레오티드에서 변형되는 안티센스 가닥을 함유하였다. 가장 말단 위치에서 비변형된 뉴클레오티드로 시작되는 센스 가닥은 양쪽 가닥의 변형 및 비변형된 뉴클레오티드가 서로 마주보는 구조를 초래한다. 예견한 바와 같이, 이 분자는 도 16b(분자 V5)에 도시된 바와 같이 혈청 유도된 뉴클레아제에 대해 또한 보호한다.
흥미롭게도, 안티센스 가닥의 두번째 뉴클레오티드에서 변형 개시부를 갖는 매우 유사한 19nt 긴 siRNA 분자(V4)는 사용된 특정 에세이에서 RNA 간섭 활성을 나타내지 않았다. 안티센스 가닥의 변형된 뉴클레오티드가 센스가닥상의 변형된 뉴클레오티드와 마주보는 버전 V6는 이 실험에서 또한 비활성이었다. p110β에 대해 특이적인 19nt 긴 siRNA 분자의 동일한 계열은 도 16c에 도시된 바와 같이 이러한 관찰을 확증하였다. 또한, Akt 인산화 감소에 의해 표시된 바와 같이 유사하게 변형된 siRNA 분자(V5)는 가장 활성이며, 이는 감소된 p110β 수준때문에 감소된 P(I)-3 키나아제 활성을 암시한다. 21mer siRNA를 사용한 PTEN 녹다운 실험에서 동일한 구조가 활성이기 때문에 분자 V6의 감소된 활성은 감소된 이중가닥 안정성에 의해 설명될 수 있을 것이다. 각각 마주보는 양쪽 가닥상의 2'-O-메틸 변형이 핵산 이중가닥의 안정성을 감소시킬 것으로 공지되어 있지만, siRNA 분자 V4 및 V5(도 16b 및 16c)간의 활성도의 차이는 변형 및 비변형된 뉴클레오티드 염기 쌍의 수가 일치하기 때문에 이중가닥 안정성에서의 차이에 기인하지 않을 것이다. 활성도에서의 이 차이는 표적 mRNA의 퇴화에 관여하는 상호작용 단백질내의 특이적 필요조건에 기인할 것이다. 안티센스 가닥의 가장 말단 뉴클레오티드는 사일런싱 활성도가 상당히 손상된 2'-OH 기에서 변형될 수 있음을 이 실험으로부터 알 수 있다.
실시예 12: RNA 간섭 매개에 있어서 기능적인 상이한 루프 구조
RNAi 분자 바람직하게는, 자가 상보적 구조를 갖는 합성 RNAi 분자가 표준 이중가닥 siRNA 분자와 같이 유전자 발현을 효과적으로 억제할 수 있는지를 실험하기 위해, HeLa 세포를 p110β 특이적 합성 siRNA에 의해 형질감염시켰다. 형질감염은 올리고펙타민, 리포펙타민(Life Technologies)와 같은 다양한 양이온성 지질을 사용하여 96웰 또는 10-cm 플레이트(30% 내지 50% 콘플루언시에서)에서 실시하였으며, GeneBlocs은 GB의 예비 형성된 5x 농축된 복합체 및 무혈청 배지내의 지질을 완전배지내의 세포에 부가함으로써 형질감염시켰다. 총 형질감염 부피는 96-웰에 놓인 세포에 대해서는 100㎕이며 10-cm 플레이트내의 세포에 대해서는 10ml였다. 최종 지질 농도는 세포 밀도에 따라 0.8 내지 1.2㎍/ml였으며; RNAi 분자 농도는 각 실험에 나타나 있다.
용량 의존성 적정농도는 표준 2분자의 이중가닥 21mer 및 실시간 PCR(Taqman)에 의해 분석된 바와 같은 대응하는 단분자성 분자에 의해 이루어지는 mRNA 녹다운의 효과에 있어서 현저한 차이가 없었다(도 17a). 두개의 상이한 루프구조 (A)12 루프 및 HIV 유도된 pA-루프를 병행하여 실험하여 유사한 결과를 얻었다. 안티센스 서열의 상대적 위치 및 루프 구조의 비교는 루프에 대해 3’위치한 안티센스 서열을 갖는 향상된 녹다운 효과를 나타냈다(도 17b; 작제물 3A, 3B 및 4A, 4B의 비교).
실시예 13: 상이한 분자내 헤어핀 루프 및 분자사이의 “ 버블 ”의 효능에 관한 연구
mRNA 및 단백질 발현의 억제에 대한 상이한 루프 구조의 영향에 대해 실험하였다. 실험을 위해 Akt1 및 Akt2를 표적으로 선택하였다. 실험방법은 실시예 12에 개시된 방법과 유사하였다.
두드러지게는, 도 18a에 도시된 Akt1 mRNA뿐만 아니라 도 18c에 도시된 Akt1 단백질 수준의 감소는 실험된 루프 구조와 완전히 별개이다(분자 5a, 6A, 7A, 8A 비교)(실험된 RNAi 분자의 구조는 막대 도표의 아래에 항상 도시되어 있다). 루프로서 폴리에틸렌 글리콜 링커(PEG)와 같은 다소 비생리적인 구조를 함유하는 분자도 효과적으로 Akt1 발현을 억제하는 바, 이는 루프의 크기 및 뉴클레오티드 서열은 중요하지 않음을 나타낸다(도 18a; 분자 8A). Akt2(9A)에 특이적인 합성 siRNA 분자는 특이성을 조절하기 위해 사용하였으며 도 15a에 도시된 바와 같이 Akt1 수준에 대해 아무런 효과도 없었다. 그러나, 이 분자는 Akt2 발현을 효과적으로 침묵시켰다(도 18b; 도 18c). 루프 구조를 갖는 자가-상보적 RNA 분자는 생리적인 잡종교배 조건하의 단분자 또는 2분자 구조에서 이중가닥으로 연결할 수 있다(도 18b, 루프 또는 버블 구조). 상기 siRNA 분자가 분자내 루프 또는 분자사이의 버블의 조절을 통해 기능을 발휘하는지 여부의 문제를 해결하기 위해, 분자 자체에 대해 뒤로 접을 수 없는 두 분자를 형질감염시켰다. 이들 작제물은 Akt1- 및 Akt2-특이적 서열을 동일한 분자내에 함유하며(도 18b, 작제물 10A, 10B), 2분자 이중가닥(버블)을 형성하기 위해 제한되도록 고안하였다. 놀랍게도, 이 분자는 양쪽 가닥의 어닐링 후 형질감염될 때 단백질 녹다운뿐만 아니라 Akt1 및 Akt2 mRNA 녹다운을 효과적으로 매개하였다.
루프 및 버블 구조가 RNA 처리 효소 예를들면, Dicer에 대해 실제로 기질인지 여부는 이 시점에서 명확하지 않다. 패디슨(Paddison) 등에 의한 최근 연구는 siRNA를 함유하는 헤어핀은 이중가닥 siRNA보다 Dicer 활성도에 더 의존함을 시사하였다. 그러나, PEG 분자를 사용한 RNA 간섭 활성도를 입증하는 이들 데이터는 연결 서열이 관련없음을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> atugen AG <120> Further novel forms of interfering RNA molecules <130> A 19014 PCT <160> 174 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 1A (Fig 3B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 1 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 1B (Fig. 3B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 2 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 3A (Fig. 3B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 3 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> 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<223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 5AMM (Fig. 3B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 7 cucauuuucu uugugcucac gtt 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 5BMM (Fig. 3B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 8 cgugagcaca aagaaaauga gtt 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 18A (Fig. 4B, 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 9 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 18B (Fig. 4B, 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 10 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 19A(MM) (Fig. 4B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 11 cucauuuucu uugugcucac gtt 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 19B(MM) (Fig. 4B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 12 cgugagcaca aagaaaauga gtt 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 28A Fig. 4B, 8B, 9C, 10C) <400> 13 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 28B (Fig. 4B, 8B, 9C, 10C) <400> 14 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 29A(MM) (Fig. 4B) <400> 15 cucauuuucu uugugcucac g 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 29B(MM) (Fig. 4B) <400> 16 cgugagcaca aagaaaauga g 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 30A (Fig. 4B, 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (3)..(23) <223> RNA <400> 17 ttcuccuuuu guuucugcua acg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 30B (Fig. 4B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (3)..(23) <223> RNA <400> 18 ttcguuagca gaaacaaaag gag 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 31A(MM) (Fig. 4B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (3)..(23) <223> RNA <400> 19 ttcucauuuu cuuugugcuc acg 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 31B(MM) (Fig. 4B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (3)..(23) <223> RNA <400> 20 ttcgugagca caaagaaaau gag 23 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 51A (Fig. 5B) <400> 21 ucuugaugua cuccccucgu u 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 51B (Fig. 5B) <400> 22 cgaggggagu acaucaagau u 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 53A (Fig. 5B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 23 ucuugaugua cuccccucgu u 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 53B (Fig. 5B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 24 cgaggggagu acaucaagac c 21 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 55A (Fig. 5A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> DNA <400> 25 cuugauguac uccccucgu 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 55B (Fig. 5B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> DNA <400> 26 gaggggagua caucaagac 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 57A (Fig. 5B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 27 ucuugaugua cuccccucgt t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 57B (Fig. 5B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 28 cgaggggagu acaucaagac c 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 51A (Fig. 6B) <400> 29 ucuugaugua cuccccucgu u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 51B (Fig. 6B) <400> 30 cgaggggagu acaucaagau u 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 70A (Fig. 6B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 31 ucuugaugua cuccccucgt t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 70B (Fig. 6B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 32 cgaggggagu acaucaagat t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 71A (Fig. 6B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 33 acuugaugua cuccccucct t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 71B (Fig. 6B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 34 ggaggggagu acaucaagut t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 72A (Fig. 6B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 35 aguugaugua cuccccugct t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 72B (Fig. 6B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 36 gcaggggagu acaucaacut t 21 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 1A (Fig. 7A) <400> 37 ucuugaugua cuccccucgu u 21 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 1B (Fig. 7A) <400> 38 cgaggggagu acaucaagau u 21 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 2A (Fig. 7A) <400> 39 ucuugaugua cuccccucgu u 21 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 2B (Fig. 7A) <400> 40 cgaggggagu acaucaagac c 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 3A (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 41 ucuugaugua cuccccucgt t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 3B (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 42 cgaggggagu acaucaagac c 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 4A (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 43 ucuugaugua cuccccucgt t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 4B (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 44 cgaggggagu acaucaagat t 21 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 5A (Fig. 7A) <400> 45 cuugauguac uccccucgu 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 5B (Fig. 7A) <400> 46 gaggggagua caucaagac 19 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 6A (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 47 acuugaugua cuccccucct t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt 1 6B (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 48 ggaggggagu acaucaagut t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 7A (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 49 aguugaugua cuccccugct t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1 7B (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 50 gcaggggagu acaucaacut t 21 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTEN 1A (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 51 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTEN 1B (Fig. 7A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 52 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA (Fig. 7B) <400> 53 uccuuuuguu ucugcuaac 19 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB (Fig. 7B) <400> 54 guuagcagaa acaaaagga 19 <210> 55 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM1 (Fig. 7B) <400> 55 uccuuuucuu ucugcuaac 19 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM1 (complementary sequence, Fig. 7B) <400> 56 guuagcagaa agaaaagga 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM2 (Fig. 7B) <400> 57 uccuuuucuu ugugcuaac 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM2 (complementary sequence, Fig. 7B) <400> 58 guuagcacaa agaaaagga 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM3 (Fig. 7B) <400> 59 uccuuuucuu ugugguaac 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM3 (complementary sequence, Fig. 7B) <400> 60 guuaccacaa agaaaagga 19 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM4 (Fig. 7B) <400> 61 uccuauucuu ugugguaac 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENMM4 (complementary sequence, Fig. 7B) <400> 62 guuaccacaa agaauagga 19 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 24A (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 63 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 24B (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> attached to inverted abasic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> attached to inverted abasic <400> 64 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 26A (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> NH2-modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 65 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 26B (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> NH2-modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 66 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 79A (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O-methyl modified RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 67 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 79B (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O-methyl modified RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 68 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 30B (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (3)..(23) <223> RNA <400> 69 ttcguuagca gaaacaaaag gag 23 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 3A (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 70 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 3B (Fig. 8B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 71 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 26A (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> NH2-modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 72 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 24A (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> attached to inverted abasic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> attached to inverted abasic <400> 73 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 22A (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> attached to inverted abasic <400> 74 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 20A (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 75 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 30A (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (3)..(23) <223> RNA <400> 76 ttcuccuuuu guuucugcua acg 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 26B (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> NH2-modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> NH2-modified <400> 77 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 18A (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 78 cuccuuuugu uucugcuaac gtt 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 18B (Fig. 9B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> DNA <400> 79 cguuagcaga aacaaaagga gtt 23 <210> 80 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 28A (Fig. 9B) <400> 80 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 29A (Fig. 10C) <400> 81 cuccuuuucu uugugcuaac g 21 <210> 82 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 29B (Fig. 10C) <400> 82 cguuagcaca aacaaaagga g 21 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 73A (Fig. 10C) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(19) <223> 2'-O-methyl modified <400> 83 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 84 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 73B (Fig. 10C) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(19) <223> 2'-O-methyl modified <400> 84 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 74A (Fig. 10C) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(17) <223> 2'-O-methyl modified <400> 85 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 74B (Fig. 10C) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(17) <223> 2'-O-methyl modified <400> 86 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 87 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 75A (Fig. 10C) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> 2'-O-methyl modified <400> 87 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 88 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 75B (Fig. 10C) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> 2'-O-methyl modified <400> 88 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 89 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 79A (Fig. 10C) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 89 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 90 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 79B (Fig. 10C, 11C) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 90 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 91 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 80A (Fig. 11C) <400> 91 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 92 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 80B (Fig. 11C) <400> 92 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 81A (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 2'-O-methyl modified <400> 93 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 81B (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 2'-O-methyl modified <400> 94 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 82A (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 95 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 96 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 82B (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 96 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 97 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 83A (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> 2'-O-methyl modified <400> 97 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 86A (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (6)..(10) <223> 2'-O-methyl modified <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 98 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 99 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 86B (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(11) <223> 2'-O-methyl modified <220> <221> misc_feature <222> (17)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 99 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 75A (Fig. 11C) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> 2'-O-methyl modified <400> 100 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 101 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 28A (Fig. 12B) <400> 101 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 28B (Fig. 12B) <400> 102 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 103 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 79A (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 103 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 104 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 79B (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 104 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 81A (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 2'-O-methyl modified <400> 105 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 106 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 81B (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 2'-O-methyl modified <400> 106 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 82A (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 107 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 82B (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 108 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 86A (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> 2'-O-methyl modified <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 109 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 110 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 86B (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(11) <223> 2'-O-methyl modified <220> <221> misc_feature <222> (18)..(21) <223> 2'-O-methyl modified <400> 110 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94A1 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 a re 2'-O methyl ribonucleotides <400> 111 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94B1 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 a re 2'-O methyl ribonucleotides <400> 112 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94A1 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 a re 2'-O methyl ribonucleotides <400> 113 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 114 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94B2 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 114 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94A2 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 115 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94B1 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 ar e 2'-O methyl ribonucleotides <400> 116 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94A2 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 117 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> 94B2 (Fig. 12B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 118 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA (Fig. 15A,B) <400> 119 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB (Fig. 15A,B) <400> 120 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENAMM (Fig. 15A) <400> 121 cucauuuucu uugugcucac g 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENBMM (Fig. 15A) <400> 122 cgugagcaca aagaaaauga g 21 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V1 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 123 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V1 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 124 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V2 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(19) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 125 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V2 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(19) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 126 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V3 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(17) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 127 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V3 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(17) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 128 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V4 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 129 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V4 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 130 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V5 (Fig. 15A) <400> 131 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V5 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 132 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V6 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 133 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V6 (Fig. 15A) <400> 134 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 135 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V7 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 135 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 136 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V7 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 136 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 137 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V8 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 137 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 138 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V8 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 138 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V9 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 139 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 140 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V9 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 140 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V10 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (6)..(10) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 141 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V10 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(12) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (17)..(21) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 142 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V11 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> 2'-O methyl ribonucleotides <400> 143 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V11 (Fig. 15A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> PTENB V11 (Fig. 15) <400> 144 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 145 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V12 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 145 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V12 (Fig. 15A,B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 146 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 147 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V13 (Fig. 15B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 ar e 2'-O methyl ribonucleotides <400> 147 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 148 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V13 (Fig. 15B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 ar e 2'-O methyl ribonucleotides <400> 148 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 149 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V14 (Fig. 15B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 ar e 2'-O methyl ribonucleotides <400> 149 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 150 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V14 (Fig. 15B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 150 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 151 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENA V15 (Fig. 15B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 151 cuccuuuugu uucugcuaac g 21 <210> 152 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> PTENB V15 (Fig. 15B) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 ar e 2'-O methyl ribonucleotides <400> 152 cguuagcaga aacaaaagga g 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1A V1 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 153 ucuugaugua cuccccucgt t 21 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1B V1 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 154 cgaggggagu acaucaagat t 21 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1A V2 (Fig. 16A) <400> 155 ucuugaugua cuccccucg 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1B V2 (Fig. 16A) <400> 156 cgaggggagu acaucaaga 19 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1A V3 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 a re 2'-O methyl ribonucleotides <400> 157 ucuugaugua cuccccucg 19 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1B V3 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 a re 2'-O methyl ribonucleotides <400> 158 cgaggggagu acaucaaga 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> AKt1A V4 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 a re 2'-O methyl ribonucleotides <400> 159 ucuugaugua cuccccucg 19 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1B V4 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 160 cgaggggagu acaucaaga 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1A V5 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 161 ucuugaugua cuccccucg 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1B V5 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 a re 2'-O methyl ribonucleotides <400> 162 cgaggggagu acaucaaga 19 <210> 163 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1A V6 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 163 ucuugaugua cuccccucg 19 <210> 164 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> Akt1B V6 (Fig. 16A) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 164 cgaggggagu acaucaaga 19 <210> 165 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V2 (Fig. 16C) <400> 165 aauuccagug guucauucc 19 <210> 166 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V2 (complementary sequence, Fig. 16C) <400> 166 ggaaugaacc acuggaauu 19 <210> 167 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V3 (Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 and 18 are 2' -O methyl ribonucleotides <400> 167 aauuccagug guucauucc 19 <210> 168 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V3 (complementary sequence, Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 and 18 are 2' -O methyl ribonucleotides <400> 168 ggaaugaacc acuggaauu 19 <210> 169 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V4 (Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 and 18 are 2' -O methyl ribonucleotides <400> 169 aauuccagug guucauucc 19 <210> 170 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V4 (complementary sequence, Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 18 and 21 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 170 ggaaugaacc acuggaauu 19 <210> 171 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V5 (Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 171 aauuccagug guucauucc 19 <210> 172 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V5 (complementary sequence, Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 and 18 are 2' -O methyl ribonucleotides <400> 172 ggaaugaacc acuggaauu 19 <210> 173 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V6 (Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 173 aauuccagug guucauucc 19 <210> 174 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNAi <220> <221> misc_feature <223> P110b V6 (complementary sequence, Fig. 16C) <220> <221> misc_feature <223> nucleotides on positions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 are 2'-O methyl ribonucleotides <400> 174 ggaaugaacc acuggaauu 19

Claims (46)

  1. 이중가닥 구조로 구성된 리보핵산에 있어서,
    상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥 및 두번째 가닥을 포함하며, 상기에서 첫번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 첫번째 스트레치를 포함하며 상기 첫번째 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 두번째 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 두번째 스트레치를 포함하며 상기 스트레치는 적어도 부분적으로 표적 핵산과 동일하며,
    상기 첫번째 가닥 및/또는 두번째 가닥은 2'-위치에서 변형을 갖는 다수의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함하며, 상기에서 가닥내의 각각의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 측면위치한 뉴클레오티드 그룹에 의해 한쪽 또는 양쪽 면에 측면위치하며, 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 측면위치한 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 비변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 리보핵산.
  2. 제1항에 있어서, 첫번째 가닥 및/또는 두번째 가닥이 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 리보핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 첫번째 가닥은 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 리보핵산.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 두번째 가닥은 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 리보핵산.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 그룹 및/또는 측면위치한 뉴클레오티드의 그룹은 1개 뉴클레오티드 내지 10개 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 수의 뉴클레오티드를 포함하는 리보핵산.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 첫번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드의 패턴은 두번째 가닥의 변형된 뉴클레오티드의 패턴과 동일한 리보핵산.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 가닥의 패턴은 상기 두번째 가닥의 패턴과 정렬하는 리보핵산.
  8. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 가닥의 패턴은 두번째 가닥의 패턴과 관련된 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 위치가 변경되는 리보핵산.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕시 및 알킬로 구성된 그룹으로부터 선택된 리보핵산.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중가닥 구조는 비점착성 말단(blunt end)인 리보핵산.
  11. 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중가닥 구조는 양쪽 측면상에서 비점착성 말단(blunt end)인 리보핵산.
  12. 제 1항 내지 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥의 5’-말단 및 두번째 가닥의 3’-말단에 의해 한정되는 이중가닥 구조위의 측면상에서 비점착성 말단(blunt end)인 리보핵산.
  13. 제 1항 내지 제 12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중가닥 구조는 첫번째 가닥의 3’-말단 및 두번째 가닥의 5’-말단에 의해 한정되는 이중가닥 구조위의 측면상에서 비점착성 말단(blunt end)인 리보핵산.
  14. 제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 두개 가닥중 적어도 하나는 5’-말단에서 한개 이상의 뉴클레오티드의 오버행을 갖는 리보핵산.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 오버행은 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 한개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 리보핵산.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 전화된 abasic인 뉴클레오티드 및 2’-위치에서 NH2 변형을 갖는 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형을 갖는 리보핵산.
  17. 제 14항 내지 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 5’-말단의 오버행은 두번째 가닥상에 있는 리보핵산.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 첫번째 가닥은 5’-말단에서 오버행을 포함하는 것을 특징으로 하는 리보핵산.
  19. 제 14항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, 5’-말단의 오버행은 첫번째 가닥상에 있는 리보핵산.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 두번째 가닥은 5’-말단에서 오버행을 포함하는 것을 특징으로 하는 리보핵산.
  21. 제 14항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 한개의 가닥은 3’-말단에서 한개 이상의 뉴클레오티드의 오버행을 갖는 리보핵산.
  22. 제 21항에 있어서, 3’-말단의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 리보핵산.
  23. 제 14항 내지 제 22항중 어느 한 항에 있어서, 첫번째 가닥의 3’-말단은 오버행을 포함하는 리보핵산.
  24. 제 1항 내지 제 23항중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중가닥의 길이는 약 17 내지 21 및 더 바람직하게는 18 또는 19개 염기 길이를 갖는 리보핵산.
  25. 제 1항 내지 제 24항중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 가닥 및/또는 두번째 가닥의 길이는 약 15 내지 23개 염기, 17 내지 21개 염기 및 18 또는 19개 염기 길이의 범위로 구성된 그룹으로부터 선택된 각각으로부터 독립된 리보핵산.
  26. 제 1항 내지 제 25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 가닥 및 표적 핵산간의 상보성이 완벽한 리보핵산.
  27. 제 1항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 가닥 및 표적 핵산사이에 형성된 이중가닥은 상기 이중가닥 구조를 형성하는 상기 첫번째 가닥과 표적 핵산간의 한개의 미스매치 또는 두개의 미스매치가 존재하는 적어도 15개 뉴클레오티드를 포함하는 리보핵산.
  28. 제 1항 내지 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 첫번째 가닥 및 두번째 가닥은 한개 이상의 변형된 뉴클레오티드 그룹 및 한개 이상의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 각각 포함하며, 각각의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하며 각 측면위치한 뉴클레오티드 그룹은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하며, 첫번째 가닥의 각각의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 두번째 가닥상의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹과 정렬되며, 첫번째 가닥의 최말단 5’뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 그룹의 뉴클레오티드이며, 두번째 가닥의 최말단 3’뉴클레오티드는 측면위치한 뉴클레오티드 그룹의 뉴클레오티드인 리보핵산.
  29. 제 28항에 있어서, 각각의 변형된 뉴클레오티드 그룹은 단일 뉴클레오티드로 구성되며 및/또는 각각의 측면위치한 뉴클레오티드 그룹은 단일 뉴클레오티드로 구성되는 리보핵산.
  30. 제 29항에 있어서, 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 첫번째 가닥상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 뉴클레오티드에 대하여 3’방향으로 정렬되어 있는 비변형된 뉴클레오티드이며, 변형된 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 두번째 가닥상의 뉴클레오티드는 측면위치한 뉴클레오티드 그룹을 형성하는 뉴클레오티드에 대하여 5’방향으로 정렬되어 있는 변형된 뉴클레오티드인 리보핵산.
  31. 제 28항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 가닥은 8 내지 12, 바람직하게는 9 내지 11개의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함하며, 상기 두번째 가닥은 7 내지 11, 바람직하게는 8 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드 그룹을 포함하는 리보핵산.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자는 구조 유전자, 하우스키핑 유전자, 전사 인자, 운동성 인자, 세포주기 인자, 세포주기 억제제, 효소, 성장인자, 사이토키닌 및 종양 억제제로 구성된 그룹으로부터 선택된 리보핵산.
  33. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 가닥 및 두번째 가닥은 루프 구조에 의해 연결되는 리보핵산.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 루프 구조는 비-핵산 중합체로 구성되는 리보핵산.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 비-핵산 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 리보핵산.
  36. 제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루프 구조는 핵산으로 구성되는 리보핵산.
  37. 제 33항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 첫번째 가닥의 5’-말단은 두번째 가닥의 3’-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 리보핵산.
  38. 제 33항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 첫번째 가닥의 3’-말단은 두번째 가닥의 5’-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 리보핵산.
  39. 표적 확인을 위한 제 1항 내지 제 38항중 어느 한 항에 따른 리보핵산의 용도.
  40. 의약 제조를 위한 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 리보핵산의 용도.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 의약은 교모세포증, 전립선 암, 유방암, 폐암, 간암, 췌장암 및 백혈병, 비만, 당뇨병, 심혈관계 질환 및 대사성 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환 또는 상태의 치료를 위한 용도.
  42. 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 리보핵산을 함유하는 세포, 바람직하게는 녹다운 세포.
  43. 제 1항 내지 제 38항중 어느 한 항에 따른 리보핵산을 함유하는 생물, 바람작하게는 녹다운 생물.
  44. 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 리보핵산을 함유하는 조성물.
  45. 제 1항 내지 제 38항중 어느 한 항에 따른 리보핵산 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물.
  46. 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양의 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 리보핵산을 세포내로 도입하는 것을 포함하며, 상기 표적 유전자는 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 리보핵산의 표적 유전자인 세포내의 표적 유전자 또는 그 유도체의 발현을 억제하는 방법.
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