CN108473988A - 抑制肾素原基因或肾素原受体基因表达的单链核酸分子及其用途 - Google Patents

抑制肾素原基因或肾素原受体基因表达的单链核酸分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达的单链核酸分子，其中所述核酸分子的特征在于所述核酸分子仅包括区域(X)、连接子区域(Lx)、和区域(Xc)；所述连接子区域(Lx)具有包括吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少之一的非核苷酸结构；所述区域(X)和所述区域(Xc)的至少之一包括在任意的由SEQ ID NO:1至5表示的肾素原基因表达抑制序列、和由SEQ ID NO:6至11表示的肾素原受体基因表达抑制序列中的至少18个连续碱基的碱基序列。

Description

抑制肾素原基因或肾素原受体基因表达的单链核酸分子及其 用途
技术领域
本发明涉及抑制肾素原基因或肾素原受体基因表达的单链核酸分子，包含其的组合物及其用途。
背景技术
肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)主要参与血压的控制和电解质平衡的维持(循环RAS)，并在器官局部起到细胞分化增殖和组织修复等作用(组织RAS)。在糖尿病性视网膜病和脉络膜新生血管形成中，由于组织RAS的活化刺激经由血管紧张素1型受体的信号通路，其与血管病变相关并诱导VEGF、MCP-1和ICAM-1等炎症相关分子的表达。
肾素原，其被认为仅仅是肾素的无活性前体，与肾素和肾素原的常见跨膜型受体(ATP6AP2；ATPase，H+转运，溶酶体辅助蛋白2，本说明书中也称作“肾素原受体”)结合，从而获得与血管紧张素原结合的能力，引起组织RAS的活化，同时引起作为由肾素原受体介导的细胞内信号的ERK的活化，进而还诱导VEGF和MCP-1。通过肾素原-肾素原受体的这些组织RAS活化和RAS非依赖性细胞内信号传导活化统称为受体相关的肾素原系统(RAPS)。
如上所述，已知RAPS通过两种不同的作用深入参与眼组织的炎症和血管发生，且作为伴有炎症或血管发生的眼科疾病的治疗策略，RAPS中的介入被认为具有重要的意义。
作为抑制基因表达的技术，例如，RNA干扰(RNAi)是已知的。通过RNA干扰来抑制基因表达通常例如通过将短的双链RNA分子投与至细胞等来进行。前述双链RNA分子通常称为siRNA(小干扰RNA)。虽然已经进行了通过使用siRNA对各种基因的研究，但它们与可能的血液不稳定性和由于免疫应答引起的副作用等的问题相关，并且已期望提供更有效的核酸分子。
近年来，本发明人已经新开发了替代siRNA的更有效的单链核酸分子(专利文献1、2，非专利文献1)。
文献列表
[专利文献]
专利文献1：国际公开第2012/005368号
专利文献2：国际公开第2012/017919号
[非专利文献]
非专利文献1：Hamasaki等人,PLoS ONE,7(8),e42655,doi:10.1371,2012
发明内容
发明要解决的问题
本发明旨在提供对于涉及肾素原基因或肾素原受体基因表达的疾病的治疗有效的核酸分子，及使用其的药物。
用于解决问题的方案
本发明人已发现，其中包含靶向肾素原基因或肾素原受体基因内的特定部分序列的核苷酸序列的区域和包含其互补链序列的区域使用特定连接子连接的单链核酸分子显著地抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达，而且还改善葡萄膜炎动物模型中的病理，这导致本发明的完成。
因此，本发明如下所示。
[1]一种单链核酸分子，其抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达，其仅包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，
其中所述连接子区域(Lx)具有包括吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少之一的非核苷酸结构，和
所述区域(X)和所述区域(Xc)之一包括表达抑制序列，所述表达抑制序列包括在选自与由下列SEQ ID NO:1至5表示的肾素原基因的一部分互补的序列、和与由下列SEQ IDNO:6至11表示的肾素原受体基因的一部分互补的序列的任意核苷酸序列中的由至少18个连续核苷酸组成的核苷酸序列：
(SEQ ID NO:1)5’-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID NO:2)5’-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID NO:3)5’-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID NO:4)5’-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID NO:5)5’-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID NO:6)5’-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID NO:7)5’-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID NO:8)5’-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID NO:9)5’-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID NO:10)5’-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID NO:11)5’-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’，和
另一者包括与所述表达抑制序列互补的核苷酸序列。
[2]根据上述[1]所述的核酸分子，其中从3’侧到5’侧依次设置所述区域(X)、所述连接子区域(Lx)和所述区域(Xc)，和前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Xc)的碱基数(Xc)满足下述式(1)或式(2)的条件：
X>Xc...(1)
X＝Xc...(2)。
[3]根据上述[2]所述的核酸分子，前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Xc)的碱基数(Xc)满足下述式(3)的条件：
X-Xc＝1、2或3...(3)。
[4]根据上述[1]至[3]任一项所述的核酸分子，其中前述区域(Xc)的碱基数(Xc)为19–30。
[5]根据上述[1]至[4]任一项所述的核酸分子，其中前述连接子区域(Lx)由以下式(I)表示：
其中，
X1和X2各自独立地为H2、O、S、或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R3为键合至环A上的C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基，
L1为由n个原子组成的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为由m个原子构成的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
在环A中，前述环A上的除C-2以外的一个碳原子可被氮、氧或硫取代，
前述环A可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，
前述区域(Xc)和(X)各自通过-OR1-或-OR2-与前述连接子区域(Lx)连接，
其中R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I)。
[6]根据上述[1]至[5]任一项所述的核酸分子，其中前述连接子区域(Lx)由以下式(I-4a)或(I-6a)表示：
[7]根据上述[1]至[6]任一项所述的核酸分子，其为RNA分子。
[8]根据上述[1]至[7]任一项所述的核酸分子，其包括至少一个修饰的残基。
[9]根据上述[1]至[8]任一项所述的核酸分子，其包括标记物质。
[10]根据上述[1]至[9]任一项所述的核酸分子，其包括稳定同位素。
[11]根据上述[1]至[10]任一项所述的核酸分子，其中碱基数的合计为38以上。
[12]根据上述[1]至[11]任一项所述的核酸分子，其由任意的下列SEQ ID NO:23至33表示的碱基序列组成：
(SEQ ID NO:23)
5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID NO:24)
5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID NO:25)
5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID NO:26)
5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID NO:27)
5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID NO:28)
5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID NO:29)
5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID NO:30)
5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID NO:31)
5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID NO:32)
5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID NO:33)
5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’。
[13]一种肾素原基因或肾素原受体基因的表达的抑制剂，其包括根据上述[1]至[12]任一项所述的核酸分子。
[14]一种药物，其包括根据上述[1]至[12]任一项所述的核酸分子。
[15]一种眼科疾病的治疗剂，其包括根据上述[1]至[12]任一项所述的核酸分子。
[16]根据上述[15]所述的治疗剂，其中所述眼科疾病选自由糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎和年龄相关性黄斑变性组成的组。
[17]根据上述[15]所述的治疗剂，其中所述眼科疾病选自由糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性和青光眼组成的组。
[18]一种抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达的方法，其包括使用根据上述[1]至[12]任一项所述的核酸分子。
[19]根据上述[18]所述的方法，其包括将前述核酸分子投与至细胞、组织或器官的步骤。
[20]根据上述[19]所述的方法，其中前述投与在体外进行。
[21]根据上述[1]至[12]任一项所述的核酸分子，其用于抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达。
[22]根据上述[1]至[12]任一项所述的核酸分子用于制造肾素原基因或肾素原受体基因的表达的抑制剂的用途。
发明的效果
根据本发明的核酸分子，肾素原基因或肾素原受体基因的表达可以在体内显著地抑制。因此，核酸分子可为用于涉及受体相关的肾素原系统(RAPS)的疾病，例如诸如糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎和年龄相关性黄斑变性等的眼科疾病的治疗药的有希望的候选物。另外，该分子可为诸如糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性和青光眼等的眼科疾病的治疗药的有希望的候选物。
附图说明
图1示出说明本发明的核酸分子的实例的示意图。
图2为示出本发明实施例中肾素原基因的表达量的相对值的图。
图3为示出本发明实施例中肾素原受体基因的表达量的相对值的图。
图4为示出本发明实施例中人肾素原受体基因的表达量的相对值的图。
图5为示出本发明实施例中小鼠肾素原受体基因的表达量的相对值的图。
图6为示出本发明实施例中大鼠肾素原受体基因的表达量的相对值的图。
图7为示出本发明实施例中人肾素原基因的表达量的相对值的图。
图8为示出本发明实施例中CCL2/MCP-1、ICAM-1、IL-6、TNF-α基因的表达量的相对值的图。
图9示出本发明实施例中单链核酸分子的核酸酶抗性(A)和通过单链核酸分子的肾素原受体蛋白的表达抑制效果(B)。
图10示出本发明实施例中玻璃体的显微照片(A-D、F、G)和示出白细胞数的图(E、H)。
图11为示出本发明实施例中炎性细胞因子基因的表达量的相对值的图。
图12示出本发明实施例中视网膜的显微照片(A-C)，示出感光细胞外节段(photoreceptor outer segment)的长度的相对值的图(D)，和视紫质的免疫印迹分析结果(E)。
图13示出本发明实施例中玻璃体的显微照片(A-D)，示出白细胞数的图(E)和示出炎性细胞因子基因的表达量的相对值的图(F-I)。
图14示出本发明实施例中示出CNV的面积的测量结果的图(A)和CNV的显微照片(B-D)。
具体实施方式
除非另外说明，否则在本说明书中所用的术语意指本领域中其通常所指的含义。
1.肾素原基因或肾素原受体基因的表达抑制用核酸分子
(1)表达抑制序列和互补序列
本发明的核酸分子，如上所述，为抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达的单链核酸分子，且其特征在于包括肾素原基因或肾素原受体基因的表达抑制序列，所述表达抑制序列包括在选自与由下列SEQ ID NO:1至5表示的肾素原基因的一部分互补的序列、和与由下列SEQ ID NO:6至11表示的肾素原受体基因的一部分互补的序列的任意核苷酸序列中的由至少18个连续核苷酸组成的核苷酸序列(将称为“r核苷酸序列”)：
(SEQ ID NO:1)5’-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID NO:2)5’-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID NO:3)5’-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID NO:4)5’-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID NO:5)5’-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID NO:6)5’-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID NO:7)5’-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID NO:8)5’-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID NO:9)5’-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID NO:10)5’-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID NO:11)5’-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’
前述表达抑制序列可为例如由前述r核苷酸序列构成的序列，或包含前述r核苷酸序列的序列。当前述表达抑制序列为包含r核苷酸序列的序列时，一个或多个核苷酸添加至r核苷酸序列的5’-末端和/或3’-末端。在该情况下，表达抑制序列作为整体与待靶向的肾素原基因或肾素原受体基因互补(这里，“互补”如后述的互补序列所定义)。另一方面，如下所述，本发明的核酸分子中在包含表达抑制序列的区域(X或Xc)中除表达抑制序列以外的核苷酸(序列)不要求与靶基因互补。
前述表达抑制序列的长度不特别限定，例如为18至32核苷酸长度，优选19至30核苷酸长度，更优选19、20、21核苷酸长度。本发明中，例如，碱基数的数值范围公开了属于该范围的所有正整数。例如，“1至4个碱基”的记载意指公开了任意的“1、2、3、4个碱基”(以下相同)。
本发明的单链核酸分子还包含可与前述表达抑制序列退火的互补序列。
前述互补序列不必为完全互补，只要其可以在靶细胞中的生理条件下与前述表达抑制序列退火即可。即，前述互补序列可为在与前述表达抑制序列重叠的区域中具有100％互补性的序列。可选地，其可具有例如90％-100％、93％-100％、95％-100％、98％-100％或99％-100％等的互补性。
当前述表达抑制序列具有在SEQ ID NO:n(n＝1-11)中所示的核苷酸序列中的r核苷酸序列时，前述互补序列包括与在下述SEQ ID NO:n+11中所示的核苷酸序列中的r核苷酸序列互补的序列(将称为“s核苷酸序列”)：
(SEQ ID NO:12)5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUC-3’
(SEQ ID NO:13)5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACC-3’
(SEQ ID NO:14)5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAAC-3’
(SEQ ID NO:15)5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACA-3’
(SEQ ID NO:16)5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCG-3’
(SEQ ID NO:17)5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAU-3’
(SEQ ID NO:18)5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGG-3’
(SEQ ID NO:19)5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGU-3’
(SEQ ID NO:20)5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAG-3’
(SEQ ID NO:21)5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAG-3’
(SEQ ID NO:22)5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAA-3’
前述互补序列可为例如由前述s核苷酸序列构成的序列，或包含前述s核苷酸序列的序列。
前述互补序列的长度不特别限定，例如为18至32核苷酸长度，优选19至30核苷酸长度，更优选19、20、21核苷酸长度。
前述表达抑制序列和前述互补序列可各自为例如单独由核糖核苷酸残基组成的RNA分子，或除核糖核苷酸残基以外还包含脱氧核糖核苷酸残基的RNA分子。当尿嘧啶(U)残基被脱氧核糖核苷酸残基取代时，其任选地被dT或dU取代。
(2)单链核酸分子
本发明的核酸分子中，包含前述表达抑制序列的区域和包含前述互补序列的区域经连接子区域间接连接。包含前述表达抑制序列的区域和包含前述互补序列的区域的连接顺序不特别限定，例如前述表达抑制序列的5’-末端侧和前述互补序列的3’-末端侧可经连接子区域连接，或者前述表达抑制序列的3’-末端侧和前述互补序列的5’-末端侧可经连接子区域连接。优选的是前者。
前述连接子区域可由例如核苷酸残基构成，可由非核苷酸残基构成，或者可由核苷酸残基和非核苷酸残基两者构成。优选地，前述连接子区域由非核苷酸残基构成。
尽管在下文示出本发明的单链核酸分子的具体实例，但本发明不限于此。
(发夹型单链核酸分子)
在优选的一个实施方案中，本发明的单链核酸分子为其中5’侧区域和3’侧区域互相退火形成双链结构(茎结构)的分子。这也可以说是shRNA(小发夹RNA或短发夹RNA)的形式。shRNA具有发夹结构且通常具有一个茎区域和一个环区域。
本形式的核酸分子仅包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，且具有其中具有互补结构的前述区域(X)和前述区域(Xc)经前述连接子区域(Lx)连接的结构。具体而言，前述区域(X)和前述区域(Xc)之一包含前述表达抑制序列，另一者包含前述互补序列。因此，它们可以在前述区域(X)和前述区域(Xc)之间通过分子内退火形成茎结构，前述连接子区域(Lx)成为环结构。
前述核酸分子可从5’侧至3’侧依次、或从3’侧至5’侧依次具有前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(X)。优选的是前者。尽管前述表达抑制序列可设置在任意的前述区域(X)和前述区域(Xc)中，但其优选设置在前述互补序列的下游侧，即，前述互补序列的3’侧。因此，当前述核酸分子从5’侧至3’侧依次具有前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(X)时，前述表达抑制序列优选设置在前述区域(X)中。
本形式的核酸分子的一个实施方案示于图1的示意图中。图1(A)为各区域的顺序的概述的示意图，图1(B)为示出前述核酸分子在前述分子中形成双链的示意图。如图1(B)所示，前述核酸分子在前述区域(Xc)和前述区域(X)之间形成双链，前述Lx区域根据其长度具有环结构。图1仅示出前述区域的顺序和形成双链的各区域的位置关系，例如各区域的长度、和前述连接子区域(Lx)的形状等不限于此。
在前述核酸分子中，各前述区域(Xc)和前述区域(X)中的核苷酸数不特别限定。尽管下文示出各区域的长度，但本发明不限于此。
前述区域(X)中核苷酸数的下限为例如19、优选20。其上限为例如50、优选30、更优选25。前述区域(X)的核苷酸数的具体实例为19-50，优选19-30，更优选19-25。
前述区域(Xc)中的核苷酸数的下限为例如19、优选20。其上限为例如50、优选30、更优选25。具体地，前述区域(Xc)的核苷酸数为例如19-50，优选19-30，更优选19-25。
包含前述表达抑制序列(X或Xc)的区域可由前述表达抑制序列单独构成，或者可包含前述表达抑制序列。前述表达抑制序列的核苷酸数如上所述。包含前述表达抑制序列的区域还可在前述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧具有附加序列。附加序列优选添加至前述连接子区域(Lx)侧。如上所述，当本发明的核酸分子从5’侧至3’侧依次具有前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(X)时，前述表达抑制序列优选设置在前述区域(X)中，并在此情况下，将附加序列添加至前述表达抑制序列的5’侧。前述附加序列的核苷酸数为例如1-31个核苷酸，优选1-21个核苷酸，更优选1-11个核苷酸，特别优选1、2、3、4、5或6个核苷酸。
当包含前述表达抑制序列(X和Xc之一)的区域在前述连接子区域(Lx)侧具有附加序列时，包含前述互补序列的区域(X和Xc的另一者)还包含与前述连接子区域(Lx)侧的附加序列互补的序列。
前述区域(X)中的核苷酸数(X)与前述区域(Xc)中的核苷酸数(Xc)之间的关系满足例如下述(1)或(2)的条件。在前者的情况下，具体地，其满足例如下述(4)的条件。例如，示意性示于图1(B)的核酸分子满足下述(1)的条件：
X>Xc…(1)
X-Xc＝1-10，优选1、2或3，
更优选1或2…(4)
X＝Xc…(2)
前述连接子区域(Lx)优选为在其自体的区域内部中无自身退火的结构。
当前述区域(Lx)包含如上所述的核苷酸残基时，其长度不特别限定。前述连接子区域(Lx)优选具有例如允许前述区域(X)和前述区域(Xc)形成双链的长度。前述连接子区域(Lx)的核苷酸数的下限为例如1、优选2、更优选3，且其上限为例如100、优选80、更优选50。
前述核酸分子的全长不特别限定。在前述核酸分子中，当前述连接子区域(Lx)包含核苷酸残基时前述核苷酸数的合计(全长核苷酸数)的下限为例如38，优选42，更优选50，更加优选51，特别优选52，其上限为例如300，优选200，更优选150，更加优选100，特别优选80。
在前述核酸分子中，不包括前述连接子区域(Lx)的核苷酸数的合计的下限为例如36，优选38。其上限为例如100，优选80，更优选60，更加优选50。核苷酸数的全长的具体实例为例如36-100，优选38-80，更优选42-60，进一步优选42-50。
在更优选的实施方案中，本发明的单链核酸分子具有含非核苷酸结构的前述连接子区域(Lx)。
前述非核苷酸结构不特别限定，可提及例如聚亚烷基二醇、吡咯烷骨架和哌啶骨架等。作为前述聚亚烷基二醇，可提及例如聚乙二醇。
作为前述吡咯烷骨架，例如，可提及其中一个或多个构成哌啶5元环的碳被取代的吡咯烷衍生物的骨架。当碳被取代时，其优选为例如除C-2碳以外的碳原子。前述碳可例如被氮、氧或硫取代。前述吡咯烷骨架还可包含例如，在吡咯烷5元环中，例如碳-碳双键或碳-氮双键。在前述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷5元环的碳和氮可键合至例如氢或下述取代基。前述连接子区域(Lx)可经前述吡咯烷骨架的任意基团键合至例如前述区域(X)和前述区域(Xc)。其为前述5元环的任意一个碳原子或氮，优选前述5元环的2位碳(C-2)或氮。前述吡咯烷骨架的实例包括脯氨酸骨架和脯氨醇骨架等。前述脯氨酸骨架和脯氨醇骨架等还在安全性方面优异，这是由于它们例如是存在于活生物体中的物质及其还原剂。
作为前述哌啶骨架，例如，可提及其中一个或多个构成哌啶6元环的碳被取代的哌啶衍生物的骨架。当碳被取代时，其优选为例如除C-2碳以外的碳原子。前述碳可例如被氮、氧或硫取代。前述哌啶骨架还可包含例如，在哌啶6元环中，例如碳-碳双键或碳-氮双键。在前述哌啶骨架中，构成哌啶6元环的碳和氮可键合至例如氢基或下述取代基。前述连接子区域(Lx)可经前述哌啶骨架的任意基团键合至例如前述区域(X)和前述区域(Xc)。其为前述6元环的任意一个碳原子或氮，更优选前述6元环的2位碳(C-2)或氮。
前述连接子区域可仅由例如具有前述非核苷酸结构的非核苷酸残基构成，或可包含具有前述非核苷酸结构的非核苷酸残基和核苷酸残基。
前述连接子区域例如由下式(I)表示：
在前述式(I)中，例如，
X1和X2各自独立地为H2、O、S、或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R3为键合至环A上的C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基，
L1为由n个原子组成的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为由m个原子构成的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
在环A中，前述环A上的除C-2以外的一个碳原子可被氮、氧或硫取代，
前述环A可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，
前述区域(Xc)和(X)各自通过-OR1-或-OR2-与前述连接子区域(Lx)连接，
其中R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I)。
在前述式(I)中，例如，X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH。在前述式(I)中，“X1为H2”意指X1和X1键合至的碳原子共同形成CH2(亚甲基)。这同样适用于X2。
在前述式(I)中，Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O、或S。
在前述式(I)中，环A中，l是1或2。当l＝1时，环A是5元环，例如，前述的吡咯烷骨架。前述吡咯烷骨架为例如脯氨酸骨架或脯氨醇骨架等，并示例为其二价结构。当l＝2时，环A是6元环，例如，前述的哌啶骨架。在环A中，环A上除C-2之外的一个碳原子可以由氮、氧或硫取代。环A可以在环A中含有碳-碳双键或碳-氮双键。环A例如为L型或D型。
在前述式(I)中，R3为键合至环A上的C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基。当R3为前述取代基时，取代基R3可以是一个或多个，或可以不存在，当其为多个时，它们可以相同或不同。
取代基R3为例如卤素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4、或氧基(＝O)等。
R4和R5各自独立地为例如取代基或保护基，并且可以是相同的或不同的。前述取代基的实例包括卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。下文中同样适用。取代基R3可为这些列出的取代基。
前述保护基为例如使高反应性官能团失活的官能团。保护基的实例包括已知的保护基。关于前述保护基，例如，可以在本文中并入文献(J.F.W.McOmie,“Protecting Groupsin Organic Chemistry”,Prenum Press,London and New York,1973)中的描述。前述保护基不特别限定，并且其实例包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、甲苯基磺酰基乙氧基甲基(TEM)和二甲氧基三苯甲基(DMTr)。当R3为OR4时，前述保护基不特别限定，且其实例包括TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基。这同样适用于下文。
在前述式(I)中，L1是由n个原子构成的亚烷基链。一个(或多个)前述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可被或可不被例如OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代。可选地，L1可为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。前述聚醚链为，例如聚乙二醇。当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻。即，例如，当Y1为O时，该氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻，OR1中的氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻。
在前述式(I)中，L2为由m个原子构成的亚烷基链。一个(或多个)前述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可被或可不被例如OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代。可选地，L2可为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻。即，例如，当Y2为O时，该氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻，OR2中的氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻。
L1的n和L2的m不特别限定，例如它们各自的下限可为0，其上限不特别限定。例如，n和m可根据前述连接子区域(Lx)的期望的长度适合地设定。例如，从制造成本和产量等的观点，n和m各自优选0至30，更优选0至20，并更加优选0至15。n和m可相同(n＝m)或不同。n+m为例如0至30，优选0至20，更优选0至15。
例如，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地是取代基或保护基。前述取代基和前述保护基的实例如上文所述。
在前述式(I)中，氢原子例如各自独立地可用例如Cl、Br、F、或I等卤素取代。
前述区域(Xc)和(X)分别通过-OR1-或-OR2-与前述连接子区域(Lx)连接。R1和R2可存在或可不存在。当R1和R2存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或由前述式(I)表示的结构。当R1和/或R2为前述核苷酸残基时，前述连接子区域(Lx)由例如具有不包括核苷酸残基R1和/或R2的前述式(I)的结构的前述非核苷酸残基、和一个(或多个)前述核苷酸残基构成。当R1和/或R2为由前述式(I)表示的结构时，前述连接子区域(Lx)的结构为例如两个以上的具有前述式(I)的结构的前述非核苷酸残基彼此连接的结构。前述式(I)的结构数可为例如1、2、3或4。当连接子区域(Lx)包括多个前述结构时，前述(I)的结构优选直接连接。另一方面，当R1和R2不存在时，前述连接子区域(Lx)仅由具有前述式(I)的结构的前述非核苷酸残基构成。
前述区域(Xc)和(X)与-OR1-和-OR2-的组合不特别限定，且可为例如任何下述条件：
条件(1)
前述区域(Xc)和(X)分别通过-OR2-和-OR1-与前述式(I)的结构连接。
条件(2)
前述区域(Xc)和(X)分别通过-OR1-和-OR2-与前述式(I)的结构连接。
前述式(I)的结构的实例包括下式(I-1)至(I-9)的结构。在下式中，n和m与前述式(I)相同。下式中，q为0-10的整数。
在前述式(I-1)至(I-9)中，n、m和q不特别限定，且如上所述。其具体实例包括前述式(I-1)、其中n＝8，前述(I-2)、其中n＝3，前述式(I-3)、其中n＝4或8，前述(I-4)、其中n＝7或8，前述式(I-5)、其中n＝3并且m＝4、前述(I-6)、其中n＝8并且m＝4、n＝5并且m＝4，前述式(I-7)、其中n＝8并且m＝4、前述(I-8)、其中n＝5并且m＝4、n＝8并且m＝4，和前述式(I-9)、q＝1并且m＝4。前述式(I-4)的一个实施方案(n＝8)示于下式(I-4a)，和前述式(I-6)的一个实施方案(n＝5,m＝4)示于下式(I-6a)。
在特别优选的实施方案中，本发明的核酸分子具有任意的下述结构式。
(SEQ ID NO:23)
5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID NO:24)
5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID NO:25)
5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID NO:26)
5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID NO:27)
5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID NO:28)
5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID NO:29)
5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID NO:30)
5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID NO:31)
5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID NO:32)
5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID NO:33)
5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’
其中Lx为任意的前述连接子区域。优选地，Lx具有上述式(I)的结构，更优选地，具有任意的上述式(I-1)-(I-9)的结构，更加优选地，具有上述式(I-4a)或(I-6a)的结构，特别优选地，具有上述式(I-6a)的结构。
其中，特别优选由SEQ ID NO:30至32中所示的核苷酸序列构成的单链核酸分子。
本发明的核酸分子的构成单元不特别限定且可提及核苷酸残基。前述核苷酸残基的实例包括核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。前述核苷酸残基可为例如未经修饰的(未修饰的核苷酸残基)或已经修饰的(修饰的核苷酸残基)。通过构造本发明的核酸分子以包括前述修饰的核苷酸残基，例如可改进核酸分子对核酸酶的抗性，从而使核酸分子的稳定性得到改进。此外，本发明的核酸分子另外可包括例如除前述核苷酸残基以外的非核苷酸残基。
在本发明的核酸分子中，除前述连接子以外的区域各自的构成单元优选前述核苷酸残基。前述区域各自由例如下列残基(1)至(3)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
在本发明的核酸分子中，前述连接子区域的构成单元不特别限定，且其实例包括前述核苷酸残基和前述非核苷酸残基。前述连接子区域可仅由例如前述核苷酸残基构成，仅由前述非核苷酸残基构成，或由前述核苷酸残基和前述非核苷酸残基二者构成。前述连接子区域由例如下列残基(1)至(7)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(4)一个(或多个)非核苷酸残基
(5)一个(或多个)非核苷酸残基和未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(6)一个(或多个)非核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(7)一个(或多个)非核苷酸残基、未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
本发明的核酸分子的实例包括仅由前述核苷酸残基构成的分子；包括除了前述核苷酸残基以外的前述一个(或多个)非核苷酸残基的分子。在本发明的核酸分子中，例如如上所述，前述核苷酸残基可仅为前述未修饰的核苷酸残基；仅为前述修饰的核苷酸残基；或者为前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者。当前述核酸分子包括前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者时，前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如“1个至几个”，具体例如1至5个、优选1至4个、更优选1至3个、最优选1或2个。当本发明的核酸分子包括前述一个(或多个)非核苷酸残基时，前述一个(或多个)非核苷酸残基的个数不特别限定，且为例如“1个至几个”，具体例如1至8个，1至6个，1至4个，1、2或3个。
当前述核酸分子除了前述未修饰的核糖核苷酸残基以外包括例如前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基时，前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如"1至几个"，具体例如1至5个、优选1至4个、更优选1至3个、最优选1或2个。前述修饰的核糖核苷酸残基与前述未修饰的核糖核苷酸残基相比可为例如通过用脱氧核糖残基取代核糖残基获得的前述脱氧核糖核苷酸残基。当前述核酸分子除前述未修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基以外包括例如前述一个(或多个)脱氧核糖核苷酸残基时，前述一个(或多个)脱氧核糖核苷酸残基的数量不特别限定，并为例如"1至几个"，具体例如1至5个、优选1至4个、更优选1至3个、最优选1或2个。
本发明的核酸分子可包括例如标记物质，并可用前述标记物质标记。前述标记物质不特别限定，并可为例如荧光物质、染料或同位素等。前述标记物质的实例包括：荧光团如芘、TAMRA、荧光素、Cy3染料和Cy5染料。前述染料的实例包括Alexa染料如Alexa 488。前述同位素的实例包括稳定同位素和放射性同位素。其中，优选稳定同位素。例如，前述稳定同位素具有低辐射暴露风险且它们不需要专用设备。因此，稳定同位素的可操作性优异，且可以有助于减少成本。此外，例如，前述稳定同位素不改变被其标记的化合物的物理性质，因而具有优异的作为示踪物的性质。前述稳定同位素不特别限定，其实例包括2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S和36S。
2.构成单链核酸分子的核苷酸残基
前述的核苷酸残基例如包含糖、碱基和磷酸作为其组分。如上所述，前述核苷酸残基可为例如核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基。前述核糖核苷酸残基具有例如核糖残基作为糖；以及腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)作为碱基。前述脱氧核糖残基具有例如脱氧核糖残基作为糖；以及腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)作为碱基。
前述核苷酸残基可为未修饰的核苷酸残基或修饰的核苷酸残基。前述未修饰的核苷酸残基的前述组分例如与天然存在的核苷酸残基的组分相同或实质上相同。优选地，所述组分与人体内天然存在的核苷酸残基的组分相同或实质上相同。
前述修饰的核苷酸残基为例如通过修饰前述未修饰的核苷酸残基获得的核苷酸残基。例如，前述修饰的核苷酸残基可为前述未修饰的核苷酸残基的任意组分被修饰的核苷酸残基。本发明中，“修饰”意指例如任意前述组分的取代、添加和/或缺失；和一种(或多种)前述组分中的一个(或多个)原子和/或一个(或多个)官能团的取代、添加和/或缺失。其还可称为“改变”。前述修饰的核苷酸残基的实例包括天然存在的核苷酸残基和人工修饰的核苷酸残基。关于前述天然来源的修饰的核苷酸残基，可参考例如Limbach等人(Limbach等人，1994,Summary:the modified nucleosides of RNA,Nucleic Acids Res.22：2183至2196页)。前述修饰的核苷酸残基可以例如是前述核苷酸的代替物的残基。
前述核苷酸残基的修饰的实例包括核糖-磷酸骨架(下文中称作"核糖磷酸(ribophosphate)骨架")的修饰。
在前述核糖磷酸骨架中，例如核糖残基可被修饰。在前述核糖残基中，例如，2’位碳可被修饰。具体地，例如键合至2’位碳的羟基可被氢或卤素如氟取代。通过用氢取代键合至前述2’位碳的羟基，可用脱氧核糖取代核糖残基。前述核糖残基可例如用其立体异构体取代，并且可用例如阿拉伯糖残基取代。
前述核糖磷酸骨架可被例如具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架取代。前述非核糖磷酸骨架可为例如被修饰为不带电的前述核糖磷酸骨架。前述核苷酸中通过用前述非核糖磷酸骨架取代核糖磷酸骨架获得的代替物的实例包括吗啉基、环丁基和吡咯烷。前述代替物的其他实例包括人工核酸单体残基。其具体实例包括PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)和ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥联的核酸(Ethylenebridged Nucleic Acids))。其中，优选PNA。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，磷酸基可被修饰。在前述核糖磷酸骨架中，与糖残基最邻接的磷酸基称为“α-磷酸基”。前述α-磷酸基带负电，电荷均匀分布在不与糖残基相连的两个氧原子上。在前述α-磷酸基的四个氧原子中，核苷酸残基之间的磷酸二酯键中不与糖残基相连的两个氧原子在下文中称作"非结合(non-linking)氧"。另一方面，前述核苷酸残基之间的磷酸二酯键中与糖残基相连的两个氧原子在下文中称作"结合氧"。例如，前述α-磷酸基优选修饰成不带电，或使前述非结合氧之间的电荷分布非对称。
在前述磷酸基中，例如一个(或多个)前述非结合氧可被取代。一个(或多个)前述氧可由选自S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氢)、N(氮)和OR(R为烷基或芳基)的任意原子取代，且优选由S取代。优选前述非结合氧例如均被取代，更优选非结合氧均由S取代。前述修饰的磷酸基的实例包括硫代磷酸基(phosphorothioate)、二硫代磷酸基、硒酸磷酸基(phosphoroselenates)、硼酸磷酸基(boranophosphates)、硼酸磷酸酯基、氢膦酸基(hydrogen phosphonates)、氨基磷酸基、烷基或芳基膦酸基和磷酸三酯基。特别地，优选其中前述两个非结合氧均由S取代的二硫代磷酸基。
在前述磷酸基中，例如一个(或多个)前述非结合氧可被取代。一个(或多个)前述氧由例如选自S(硫)、C(碳)和N(氮)的任意原子取代。前述修饰的磷酸基的实例包括：由被N取代产生的桥接的氨基磷酸基；由被S取代产生的桥接的硫代磷酸基；和由被C取代产生的桥接的亚甲基膦酸基。优选一个(或多个)前述结合氧的取代在例如本发明的核酸分子的5’末端核苷酸残基和3’末端核苷酸残基的至少之一中进行。当取代在5’侧进行时，优选用C取代。当取代在3’侧进行时，优选用N取代。
前述磷酸基可被例如前述无磷酸基的连接子取代。前述连接子可包含硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺胺、硫甲缩醛(thioformacetal)、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼或亚甲氧基甲基亚氨基等。优选地，连接子可包含亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
在本发明的核酸分子中，例如，3’末端核苷酸残基和5’末端核苷酸残基的至少之一可被修饰。例如，3’末端和5’末端任一处的核苷酸残基可被修饰，或3’末端和5’末端两处的核苷酸残基均可被修饰。前述修饰可为例如如上所述，并优选修饰一端(或两端)的一个(或多个)磷酸基。例如，整个前述磷酸基可被修饰，或者前述磷酸基的一个或多个原子可被修饰。在前一种情况下，例如整个磷酸基可被取代或删除。
前述一端(或两端)的一个(或多个)核苷酸残基的修饰可为例如任何其他分子的添加。前述其他分子的实例包括功能性分子例如如上所述的标记物质和保护基。前述保护基的实例包括S(硫)、Si(硅)、B(硼)和含酯基团。功能性分子如前述标记物质可用于例如本发明的核酸分子的检测等。
前述其他分子可例如添加至前述核苷酸残基的磷酸基或可经间隔子添加至前述磷酸基或前述糖残基。例如，前述间隔子的末端原子可添加至或取代前述磷酸基团的任一个前述结合氧，或者糖残基的O、N、S或C。前述糖残基的结合位点优选为例如3’-位C、5’-位C或与之结合的任意原子。例如，前述间隔子还可添加至或取代前述核苷酸代替物如PNA的末端原子。
前述间隔子不特别限定，其实例包括-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、脱碱基糖(abasic sugars)、酰胺、羧基、胺、羟基胺(oxyamine)、羟基亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺胺和吗啉代，以及生物素试剂和荧光素试剂。在前述式中，n为正整数，且优选n＝3或6。
要添加至末端的前述分子的其他实例包括染料、嵌入剂(如吖啶)、交联剂(如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、特沙弗林(texaphyrin)、赛普弗林(sapphyrin))、多环芳烃(如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切酶(如EDTA)、亲脂性载体(如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基(geranyloxyhexyl group)、十六烷基甘油、茨醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或噻吩嗪)、肽复合物(如触足(Antennapedia)肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(如生物素)、转运/吸收促进剂(如阿司匹林、维生素E、叶酸)、和合成核糖核酸酶(如咪唑、二咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合物、四氮杂大环(tetraazamacrocycles)的Eu3+复合物)。
本发明的核酸分子中，前述5’末端可以例如通过磷酸基或磷酸基类似物修饰。前述磷酸基的实例包括5’-单磷酸((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化，7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)；任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸(硫代磷酸：(HO)2(S)P-O-5’)；5’-二硫代磷酸(二硫代磷酸：(HO)(HS)(S)P-O-5’)；5’-硫代磷酸((HO)2(O)P-S-5’)；硫取代的单磷酸、二磷酸和三磷酸(如5’-α-硫代三磷酸、和5’-γ-硫代三磷酸等)；5’-氨基磷酸((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)；5’-烷基磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2，其中R为烷基(如甲基、乙基、异丙基或丙基等))；和5’-烷基醚磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’，其中R为烷基醚(如甲氧基甲基或乙氧基甲基等))。
在前述的核苷酸残基中，前述的碱基不作具体限定。前述的碱基可以例如是天然碱基或非天然碱基。前述碱基可为例如天然来源的碱基或合成碱基。作为前述的碱基，例如，可以使用常见的碱基、和其修饰的类似物等。
前述碱基的实例包括：嘌呤碱基如腺嘌呤和鸟嘌呤；和嘧啶碱基如胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。前述碱基的其他实例包括肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟苷(isoguanisine)和杀结核菌素(tubercidine)。前述碱基的实例还包括：2-氨基腺嘌呤、烷基衍生物如6-甲基化嘌呤；烷基衍生物如2-丙基化嘌呤；5-卤代脲嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基脲嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮脲嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-脲嘧啶(假脲嘧啶)、4-硫代脲嘧啶、5-卤代脲嘧啶、5-(2-氨基丙基)脲嘧啶、5-氨基烯丙基脲嘧啶；8-卤化、胺化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其它8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其它5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮嘧啶；N-2、N-6和O-6取代嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基脲嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢脲嘧啶；3-脱氮-5-氮胞嘧啶；2-氨基嘌呤；5-烷基脲嘧啶；7-烷基鸟嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-脱氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-脲嘧啶；N3-甲基脲嘧啶；取代的1,2,4-三唑；2-吡咯烷酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基脲嘧啶；脲嘧啶-5-氧乙酸；5-甲氧基羰基甲基脲嘧啶；5-甲基-2-硫代脲嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代脲嘧啶；5-甲基氨基甲基-2-硫代脲嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)脲嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰胞嘧啶；2-硫代胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；和O-烷基化碱基。嘌呤和嘧啶的实例包括美国专利第3,687,808号、“Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering”,858至859页,Kroschwitz J.I编,John Wiley&Sons,1990,和Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,vol.30,p.613所公开的那些物质。
前述修饰的核苷酸残基的其它实例包括不具有碱基的那些核苷酸残基，即具有无碱基的核糖磷酸骨架的那些核苷酸残基。此外，作为前述修饰的核苷酸残基，可使用例如美国临时申请60/465,665号(提交日期：2003年4月25日)和国际申请PCT/US04/07070号(提交日期：2004年3月8日)中记载的那些并将这些文献引入于此以作参考。
3.本发明的核酸分子的合成方法
用于合成本发明的核酸分子的方法不特别限定，并且可以使用常规已知方法。前述合成方法的实例包括根据遗传工程步骤的合成方法和化学合成法。遗传工程步骤的实例包括：利用体外转录的合成法；使用载体的方法；和使用PCR盒进行的方法等。前述载体不特别限定，其实例包括非病毒载体如质粒和病毒载体。前述化学合成法不特别限定，其实例包括亚磷酰胺法和H-膦酸酯法等。前述化学合成法可例如使用商购可得的自动核酸合成仪进行。在前述化学合成方法中，通常使用亚酰胺(amidite)。前述亚酰胺不特别限定。商购可得的亚酰胺的实例包括RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm Co.,Ltd.)、ACE亚酰胺、TOM亚酰胺、CEE亚酰胺、CEM亚酰胺和TEM亚酰胺等。
4.表达载体
当本发明的核酸分子仅由非修饰的核糖核苷酸残基构成时，其还可以以在可表达状态下编码该核酸分子的载体(本发明的表达载体)的形式提供作为该核酸分子的前体。本发明的表达载体特征性地在功能性启动子的调控下在靶细胞中包含编码前述本发明的核酸分子的DNA。本发明的表达载体的特征在于其包含功能性连接至前述DNA的启动子，且决不限制其它构造。待插入有前述DNA的载体不特别限定，例如可使用通用载体如病毒载体和非病毒载体等。前述非病毒载体为例如质粒载体。可以通过使用本身已知的转基因方法将表达载体导入靶细胞(具有前述肾素原基因和肾素原受体基因的细胞)中来抑制肾素原基因或肾素原受体基因在细胞中的表达。
5.表达抑制剂
本发明的表达抑制剂为抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达的制剂，且其特征在于包含本发明的前述核酸分子作为活性成分。
本发明的表达抑制剂包括将前述核酸分子单独或与药学上可接受的载体一起投与至例如存在前述肾素原基因和肾素原受体基因的对象的工序。前述投与工序通过例如使前述核酸分子与前述投与对象接触来进行。前述投与对象的实例还包括人、非人动物如非人哺乳动物、即除人以外的哺乳动物的细胞、组织和器官。前述投与可例如在体内或体外进行。
6.眼科疾病的治疗剂
肾素原-肾素原受体通过组织RAS活化和RAS非依赖性的细胞内信号传导活化两种不同的作用(统称为受体相关肾素原系统(RAPS))深入参与眼组织中的炎症和血管生成。因此，包含本发明的核酸分子作为活性成分的药物，由于其抑制RAPS而有效治疗涉及RAPS的眼科疾病(如，糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性等)。另外，包含本发明的核酸分子作为活性成分的药物，有效治疗糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性或青光眼。这里的“治疗”用于意指涵盖疾病发作的预防和延迟、疾病的改善和预后的改善。
作为本发明的药物，有效量的本发明的核酸分子可以单独使用，或者还可与例如药学上可接受的载体等任何载体一起配制为药物组合物。
药学上可接受的载体的实例包括，但不限于，赋形剂如蔗糖和淀粉等，粘合剂如纤维素和甲基纤维素等，崩解剂如淀粉和羧甲基纤维素等，润滑剂如硬脂酸镁和气凝胶等，风味剂如柠檬酸和薄荷醇等，防腐剂如苯甲酸钠和亚硫酸氢钠等，稳定剂如柠檬酸和柠檬酸钠等，悬浮剂如甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等，分散剂如表面活性剂等，稀释剂如水和生理盐水等，以及基蜡等。
为了促进本发明的核酸分子导入靶细胞，本发明的药物可进一步包括核酸导入用试剂。阳离子脂质如缺端胶原(atelocollagen)；脂质体；纳米颗粒；Lipofectin、Lipofectamine、DOGS(Transfectam)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、聚凝胶(polybrene)或聚(乙烯亚胺)(PEI)等可用作核酸导入用试剂。
在优选的实施方案中，本发明的药物可为其中本发明的核酸分子包封在脂质体中的药物组合物。脂质体是具有由一个或多个脂双层包封的内相的显微闭合囊泡，并且通常可以保持内相中的水溶性物质和脂双层中的亲脂性物质。这里，当使用术语“包封”时，本发明的核酸分子可以保持在脂质体的内相或脂质双层中。用于本发明的脂质体可为单层膜或多层膜。脂质体的粒径可以在例如10-1000nm、优选50-300nm的范围内适当地选择。考虑到向靶组织的递送效率，粒径可以为例如200nm以下，优选100nm以下。
将水溶性化合物如核酸包封入脂质体的方法包括脂质膜法(涡旋法)、反相蒸发法、表面活性剂除去法、冻融法和遥控装载法(remote loading method)等，但不限于此，并可适当地选择任何已知的方法。
本发明的药物可以局部投与至哺乳动物的眼部。特别地，期望灌输于眼中。
适用于眼部局部投与的制剂包括滴眼剂(水性滴眼剂、非水性滴眼剂、滴眼剂悬浮液、滴眼剂乳液等)、软膏剂、洗剂和霜剂等。当本发明的试剂为滴眼剂时，可以适当地使用基剂(base)。用于滴眼剂的基剂包括磷酸缓冲液、Hank’s缓冲液、生理盐水、灌注液和人工泪液等。
当本发明的药物为眼部局部投与用制剂时，例如缓冲剂、等渗剂、增溶剂、防腐剂、粘性基剂(viscosity base)、螯合剂、清凉剂、pH调整剂和抗氧化剂等可以酌情选择并添加。
缓冲剂的实例包括磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、酒石酸缓冲剂、醋酸缓冲剂和氨基酸等。
等渗剂的实例包括如山梨糖醇、葡萄糖和甘露糖醇等多糖类，如甘油和丙二醇等多元醇类，如氯化钠等盐类，和硼酸等。
增溶剂的实例包括如失水山梨糖醇聚氧乙烯单油酸酯(如聚山梨醇酯80)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、泰洛沙泊(Tyloxapol)、和普朗尼克(pluronic)等非离子性表面活性剂，如甘油和聚乙二醇(macrogol)等多元醇类，等等。
防腐剂的实例包括如苯扎氯铵、苄索氯铵、和氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)等季铵盐类，如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯等对羟基苯甲酸酯类，苄醇，山梨酸及其盐(钠盐和钾盐等)，硫柳汞(thimerosal)(商品名)，氯丁醇，和脱氢醋酸钠等。
粘性基剂的实例包括如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和聚(乙烯醇)等水溶性聚合物，如羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠等纤维素类，等等。
螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸钠和柠檬酸等。
清凉剂的实例包括l-薄荷醇、茨醇、莰酮和桉叶油等。
pH调整剂的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、硼酸或其盐(硼砂)、盐酸、柠檬酸或其盐(柠檬酸钠、柠檬酸二氢钠等)、磷酸或其盐(磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)、醋酸或其盐(醋酸钠、醋酸铵等)、和酒石酸或其盐(酒石酸钠等)等。
抗氧化剂的实例包括亚硫酸氢钠、干燥的亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠(sodiumpyrrosulfite)、和混合的生育酚浓缩物等。
本发明的药物组合物中本发明核酸分子的含量为例如药物组合物总体的约0.1-100重量％。
当本发明的药物组合物为脂质体制剂时，本发明的核酸分子与脂质体构成成分的摩尔比为通常1/100,000-1/10,000。脂质体制剂中含有的包封本发明的核酸分子的脂质体的含量不特别限定，只要其为不使脂质体颗粒聚集并可发挥充分的药效的量即可，并且为通常10-100mM。
本发明的药物的剂量根据投与目的、投与方法、眼表面疾病的种类、病变的大小、投与对象的状况(性别、年龄和体重等)而变化。当本发明的药物灌输入成人的眼中时，优选以通常0.01-1000μg、优选0.05-100μg、更优选0.1-50μg作为本发明核酸的单一剂量，每日一次至10次、优选5-10次投与。
下文中，将参考实施例等详细描述本发明。然而，要注意的是本发明决不受限于此。
实施例
(实施例1)HCC1954细胞中单链核酸分子的肾素原基因或肾素原受体基因表达抑制效果
(1)单链核酸分子的合成
以下示出的单链核酸分子基于亚磷酰胺法通过ABI3900核酸合成仪(商品名，Applied Biosystems)合成。在前述合成中，EMM亚酰胺(国际公开第2013/027843号)用作RNA亚酰胺(下文相同)。前述亚酰胺通过常规方法脱保护。合成的单链核酸分子通过HPLC纯化并分别冷冻干燥。
作为单链核酸分子，示于前述SEQ ID NO:1至5的具有肾素原基因表达抑制序列的单链核酸分子(PH-0001-h-p、PH-0002-h-p、PH-0003-h-p、PH-0004-h-p、PH-0005-h-p)，和示于前述SEQ ID NO:6至11的具有肾素原受体基因表达抑制序列的单链核酸分子(PH-0001-hmr-pr、PH-0002-hmr-pr、PH-0001-hm-pr、PH-0002-hm-pr、PH-0003-hm-pr、PH-0001-h-pr)各自如上所述合成。在各单链核酸分子中，Lx为连接子区域Lx，并使用L-脯氨酸二酰胺酰亚胺得到下列结构式。在各序列中，下划线部为人肾素原基因或肾素原受体基因表达抑制序列。
PH-0001-h-p(SEQ ID NO:23)
5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
PH-0002-h-p(SEQ ID NO:24)
5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
PH-0003-h-p(SEQ ID NO:25)
5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
PH-0004-h-p(SEQ ID NO:26)
5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
PH-0005-h-p(SEQ ID NO:27)
5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
PH-0001-hmr-pr(SEQ ID NO:28)
5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
PH-0002-hmr-pr(SEQ ID NO:29)
5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
PH-0001-hm-pr(SEQ ID NO:30)
5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
PH-0002-hm-pr(SEQ ID NO:31)
5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
PH-0003-hm-pr(SEQ ID NO:32)
5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
PH-0001-h-pr(SEQ ID NO:33)
5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’
(2)肾素原基因和肾素原受体基因的表达量的测定
将前述各单链核酸分子溶解在注射用蒸馏水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.)中至20μmol/L。
作为细胞，使用HCC1954细胞(ATCC)。作为培养基，使用包含10％FBS的RPMI-1640(Invitrogen)。培养条件为37℃，5％CO2。
细胞首先以1×104个细胞/400μL培养基/孔接种在24孔板中并培养24小时。其后，将细胞用前述单链核酸分子使用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)，根据前述转染试剂所附的方案转染。具体地，通过如下设定每孔的组成来进行转染。在下列组成中，(A)为前述转染试剂，(B)为Opti-MEM(Invitrogen)，(C)为20μmol/L的上述单链核酸分子溶液。前述孔中前述单链核酸分子的终浓度设定至10nmol/L。
表1
转染后，培养前述孔中的细胞24小时，然后，使用ISOGENII(NIPPON GENE)根据随其提供的方案收集RNA。随后，使用转录第一链cDNA合成试剂盒(Roche)，根据随其提供的方案，从前述RNA合成cDNA。然后，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，测定肾素原基因的表达量、肾素原受体基因的表达量和内标GAPDH基因的表达量。前述肾素原基因的表达量和肾素原受体基因的表达量相对于前述GAPDH基因归一化。
使用LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche)作为试剂并使用LightCycler 480(Roche)作为仪器(下文相同)，进行前述PCR。前述肾素原基因、肾素原受体基因和GAPDH基因分别使用下列引物集扩增。
肾素原基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:34)5’-GCTTTCTCAGCCAGGACATC-3’
(SEQ ID NO:35)5’-TGGGAGATGATGTTGTCGAA-3’
肾素原受体基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:36)5’-TCGTACCCTTTGGAGAATGC-3’
(SEQ ID NO:37)5’-GAGCCAACTGCAAAACAACA-3’
GAPDH基因用引物集
(SEQ ID NO:38)5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’
(SEQ ID NO:39)5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’
作为对照，对于除未加入前述单链核酸分子溶液(C)、加入前述(A)和前述(B)以使(A)和(B)的总量为100μL之外进行了如上述的相同转染过程的细胞，还测定基因的表达量(模拟(mock))。
对于归一化后的肾素原基因的表达量和肾素原受体基因的表达量，基于设定为1的对照(模拟)的细胞中的表达量，确定引入有各单链核酸分子的细胞中的表达量的相对值。
(3)结果
肾素原基因表达量的测定结果示于图2，肾素原受体基因表达量的测定结果示于图3。本发明的单链核酸分子显示强的基因表达抑制活性。
(实施例2)肾素原受体基因的表达抑制效果
确认SEQ ID NO:28和29中示出的且具有人、小鼠或大鼠肾素原受体基因的表达抑制序列的单链核酸分子，和SEQ ID NO:30至32中示出的且具有人或小鼠肾素原受体基因的表达抑制序列的单链核酸分子，在源自人、小鼠和大鼠的培养细胞中对肾素原受体基因表达的抑制效果。
(1)肾素原受体基因的表达量的测定
作为细胞，使用人源hTERT-RPE细胞(ATCC)、小鼠源Neuro-2a细胞(ECACC)、大鼠Rat-1细胞(ATCC)。作为各培养基，使用含10％FBS的DMEM/F12、E-MEM、DMEM培养基(WakoPure Chemical Industries,Ltd.)。培养条件为37℃，5％CO2。
细胞首先以1×104个细胞/80μL培养基/孔接种在96孔板中并培养24小时。其后，将细胞用前述单链核酸分子使用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)，根据前述转染试剂所附的方案转染。具体地，通过如下设定每孔的组成来进行转染。在下列组成中，(A)为前述转染试剂，(B)为Opti-MEM(Invitrogen)，(C)为20μmol/L的上述单链核酸分子溶液。前述孔中前述单链核酸分子的终浓度设定至0.5nmol/L。
表2
转染后，培养前述孔中的细胞24小时，使用SuperPrep Cell Lysis&RT(TOYOBO)根据所附方案从RNA合成cDNA。然后，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，测定肾素原受体基因的表达量和内标HPRT1基因的表达量。前述肾素原受体基因的表达量相对于上述HPRT1基因归一化。
在前述PCR中，GoTaq qPCR Master Mix(Promega)用作试剂，StepOne Plus(LifeTechonologies)用作仪器。肾素原受体基因和HPRT1基因使用下列引物集扩增。
人肾素原受体基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:40)5’-AGGCAGTGTCATTTCGTACC-3’
(SEQ ID NO:41)5’-GCCTTCCCTACCATATACACTC-3’
人HPRT1基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:42)5’-ACCCCACGAAGTGTTGGATA-3’
(SEQ ID NO:43)5’-AAGCAGATGGCCACAGAACT-3’
小鼠肾素原受体基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:44)5’-TGGTCGTTCTCCTGTTCTTTC-3’
(SEQ ID NO:45)5’-ACCCTGGCGATCTTAATATGC-3’
小鼠HPRT1基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:46)5’-CAAACTTTGCTTTCCCTGGT-3’
(SEQ ID NO:47)5’-CAAGGGCATATCCAACAACA-3’
大鼠肾素原受体基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:48)5’-TGTGGGCAACCTATTCCACC-3’
(SEQ ID NO:49)5’-AGCTGACGCAATGTGACTGA-3’
大鼠HPRT1基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:50)5’-GCAGACTTTGCTTTCCTTGG-3’
(SEQ ID NO:51)5’-TCCACTTTCGCTGATGACAC-3’
作为对照，对于除未加入前述单链核酸分子溶液(C)、加入前述(A)和(B)以使(A)和(B)的总量为20μL之外进行了如上述的相同转染过程的细胞，还测定基因的表达量(模拟)。
对于归一化后的肾素原基因的表达量，基于作为1的对照(模拟)的细胞中的表达量，确定引入有各单链核酸分子的细胞中的表达量的相对值。
(2)结果
人肾素原受体基因表达量的测定结果示于图4，小鼠肾素原受体基因表达量的测定结果示于图5，大鼠肾素原受体基因表达量的测定结果示于图6。各细胞中，本发明的单链核酸分子显示强的基因表达抑制效果。
(实施例3)肾素原基因的表达抑制效果
确认SEQ ID NO:23至27中示出的且具有人肾素原基因的表达抑制序列的单链核酸分子在人源培养细胞中对肾素原受体基因表达的抑制效果。
(1)肾素原基因表达量的测定
作为细胞，使用人源hTERT-RPE细胞(ATCC)。作为培养基，使用含10％FBS的DMEM/F12。培养条件为37℃，5％CO2。
细胞首先以2×104个细胞/400μL培养基/孔接种在24孔板中并培养24小时。其后，将细胞用前述单链核酸分子使用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)，根据前述转染试剂所附的方案转染。具体地，通过如下设定每孔的组成来进行转染。在下列组成中，(A)为前述转染试剂，(B)为Opti-MEM(Invitrogen)，(C)为20μmol/L的上述单链核酸分子溶液。前述孔中前述单链核酸分子的终浓度设定至0.5nmol/L。
表3
转染后，培养前述孔中的细胞24小时，使用ISOGENII(NIPPON GENE)根据所附方案收集RNA。使用GoScript反转录酶试剂盒(Promega)，根据所附方案从前述RNA合成cDNA。然后，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，测定肾素原基因的表达量和作为内标的HPRT1基因的表达量。前述肾素原基因的表达量相对于前述HPRT1基因归一化。
在前述PCR中，GoTaq qPCR Master Mix(Promega)和THUNDERBIRD Probe qPCRMix(TOYOBO)用作试剂，StepOne Plus(Life Techonologies)用作仪器。对于前述肾素原基因的表达量的测定，使用Taqman Assay(Life Techonologies)并使用下列引物集扩增HPRT1基因。
人HPRT1基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:42)5’-ACCCCACGAAGTGTTGGATA-3’
(SEQ ID NO:43)5’-AAGCAGATGGCCACAGAACT-3’
作为对照，对于除未加入前述单链核酸分子溶液(C)、加入前述(A)和前述(B)以使(A)和(B)的总量为100μL之外进行了如上述的相同转染过程的细胞，还测定基因的表达量(模拟)。
对于归一化后的肾素原基因的表达量，基于设定为1的对照(模拟)的细胞中的表达量，确定引入有各单链核酸分子的细胞中的表达量的相对值。
(2)结果
结果示于图7。本发明的单链核酸分子显示强的基因表达抑制效果。
(实施例4)发展内毒素诱发的葡萄膜炎的模型小鼠的炎症抑制效果
确认PH-0001-hm-pr，即SEQ ID NO:30中示出的具有人和小鼠肾素原受体基因的表达抑制序列的单链核酸分子的发展LPS诱发的葡萄膜炎的模型小鼠的炎症抑制效果。
(1)单链核酸分子向内毒素诱发的葡萄膜炎的模型小鼠的投与
将前述单链核酸分子溶解于PBS中至30、100、300μM。溶解后，各浓度下的单链核酸分子溶液(1μL)在戊巴比妥麻醉下使用33号注射针向小鼠经玻璃体内投与。作为阴性对照，使用相同量的PBS。在各投与组中，使用6只雄性小鼠(C57BL/6J，6至8周龄)。在单链核酸分子投与24小时后，腹腔内投与溶解在100μL的PBS中的LPS(0.2mg)。
(2)炎性细胞因子基因表达量的测定
LPS投与后6小时，将小鼠通过颈脱位法处死，分离视网膜，并使用TRIzol(Lifetechnologies)根据所附方案收集RNA。然后，使用GoScript反转录酶试剂盒(Promega)根据所附方案从前述RNA合成cDNA。接着，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，测定CCL2/MCP-1、ICAM-1、IL-6、TNF-α基因的表达量和作为内标的Gapdh基因的表达量。前述各基因的表达量相对于前述Gapdh基因归一化。
在前述PCR中，GoTaq qPCR Master Mix(Promega)用作试剂，StepOne Plus(LifeTechonologies)用作仪器。在各基因的PCR中，使用下列引物集。小鼠CCL2/MCP-1基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:52)5’-TTGGCTCAGCCAGATGCA-3’
(SEQ ID NO:53)5’-CCTACTCATTGGGATCATCTTGC-3’
小鼠ICAM-1基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:54)5’-CCTGTTTCCTGGCTCTGAAG-3’
(SEQ ID NO:55)5’-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3’
小鼠IL-6基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:56)5’-CACAGAGGATACCACTCCCAACA-3’
(SEQ ID NO:57)5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAACA-3’
小鼠TNFα基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:58)5’-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’
(SEQ ID NO:59)5’-CGATCACCCCGAAGTTCAGTA-3’
小鼠Gapdh基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:60)5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’
(SEQ ID NO:61)5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3
对于归一化后的各基因的表达量，基于设定为1的阴性对照组(PBS投与组)中的表达量，确定各投与组中表达量的相对值。
(3)结果
结果如图8所示。在各组中，SEQ ID NO:30中示出的作为单链核酸分子的PH-0001-hm-pr示出对炎性细胞因子基因的表达抑制效果。即，表明本发明的单链核酸分子通过肾素原受体基因的表达抑制来抑制葡萄膜炎中的炎症发作。
(实施例5)核酸酶抗性和对肾素原受体蛋白的表达抑制效果
确认SEQ ID NO:30中示出的且具有人和小鼠肾素原受体基因的表达抑制序列的单链核酸分子的核酸酶抗性。另外，人源培养细胞中对肾素原受体蛋白的表达抑制效果通过免疫印迹分析来确认。
(1)核酸酶抗性
SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子在0.5单位的微球菌核酸酶(Takara BioInc.)的存在下在37℃下温育。在反应开始后的5、15和30分钟，向反应溶液添加EDTA溶液从而终止反应，使用15％TBE凝胶进行电泳，并将凝胶用SYBR safe(Life Technologies)染色。作为对照，使用双链核酸分子((P)RR-siRNA)，其中正义链为SEQ ID NO:19中示出的碱基序列，反义链为SEQ ID NO:8中示出的碱基序列。
(2)对肾素原受体蛋白的表达抑制效果
作为细胞，使用人视网膜色素上皮细胞(RPE,hTERT-RPE1)(ATCC)。作为培养基，使用含10％FBS(Life Technologies)的DMEM/F12(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)。培养条件为37℃，5％CO2。
SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子(1nM)使用转染试剂LipofectamineRNAiMAX试剂(Life Technologies)并根据所附方案转染。转染后，培养细胞24小时。培养开始后的3、6、12、18和24小时，收集细胞。如下进行免疫印迹分析。将收集的细胞在含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的SDS缓冲液中裂解，并将蛋白质通过SDS-PAGE使用10％凝胶分离并转移至PVDF膜(Merck Millipore)。膜通过浸渍在含5％脱脂乳的TBS中来封闭，并与一抗反应。作为一抗，使用抗肾素原受体抗体(Sigma-Aldrich)和抗-β肌动蛋白抗体(Medical&Biological Laboratories)。作为化学发光检测用二抗，使用抗小鼠或抗兔IgG抗体过氧化物酶缀合物(Jackson ImmunoResearch Laboratories)。为了检测信号，使用增强的化学发光(Western Lightning Ultra)。作为对照，使用具有下列结构式的单链核酸分子(对照-PshRNA)，其中Lx具有前述式(I-6a)的结构。
(SEQ ID NO:62)
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-Lx-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3’
(3)结果
核酸酶抗性的结果示于图9A，免疫印迹分析对肾素原受体蛋白的表达抑制效果的结果示于图9B。对照((P)RR-siRNA)在5分钟后被微球菌核酸酶完全降解，而SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子((P)RR-PshRNA)甚至在30分钟后也未被降解且显示核酸酶抗性(图9A)。另外，免疫印迹分析的结果显示，SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子((P)RR-PshRNA)抑制肾素原受体蛋白的表达(图9B)。
(实施例6)内毒素诱发的葡萄膜炎模型小鼠中的急性炎症抑制效果
确认SEQ ID NO:30中示出的且具有人和小鼠肾素原受体基因的表达抑制序列的单链核酸分子的急性炎症抑制效果。使用LPS诱发的葡萄膜炎模型小鼠作为急性炎症模型小鼠，测定粘附于视网膜血管的白细胞数和浸润于与视神经盘相邻的玻璃体腔内的白细胞数。另外，为了研究单链核酸分子抑制细胞应答的的分子机理，测定炎性细胞因子基因的表达量。此外，在内毒素诱发的葡萄膜炎模型小鼠中，由于遍在蛋白酶体体系的活化，炎症信号诱导视紫质降解，这缩短了感光细胞外节段。因此，进行感光细胞外节段的长度的测定和视紫质的免疫印迹分析来研究单链核酸分子对感光细胞的保护效果。
(1)单链核酸分子向内毒素诱发的葡萄膜炎模型小鼠的投与
将SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子溶解于PBS至100μM。溶解后，单链核酸分子溶液(1μL)在戊巴比妥麻醉下使用33号注射针向小鼠(C57BL/6J，6至8周龄)(CLEAJapan)经玻璃体内投与。作为对照，使用相同量的PBS或溶解于PBS至100μM的对照-PshRNA(SEQ ID NO:62)。投与后24小时，将溶解于100μL的PBS的大肠杆菌来源的LPS(Sigma-Aldrich)(0.2mg)腹腔内投与至已投与有SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子或对照-PshRNA的小鼠。使用所得玻璃体，在LPS投与后6小时测定炎性细胞因子基因的表达量。LPS投与后24小时，将粘附于视网膜的白细胞和浸润于玻璃体中的白细胞定量，以及测定感光细胞外节段的长度并进行视紫质的免疫印迹分析。
(2)通过实时定量PCR的炎性细胞因子基因表达量的测定
LPS投与后6小时，将小鼠通过颈脱位法处死，并分离视网膜。通过文献(Kanda,A.,Noda,K.,Saito,W.&Ishida,S.(Pro)renin receptor is associated with angiogenicactivity in proliferative diabetic retinopathy.Diabetologia 55,3104-3113,2012)中记述的方法，通过使用qPCR用SuperPrep细胞裂解和RT试剂盒(TOYOBO)从细胞中分离总RNA并使用TRIzol(Life Technologies)和GoScrip反转录酶(Promega)从视网膜组织中分离总RNA，并使用低聚dT引物通过进行反转录反应合成cDNA。使用前述合成的cDNA作为模板，进行实时定量PCR，并测定IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1和tNF-α基因的表达量。这些基因为已知通常参与急性和慢性炎症模型两者的相应的基因。另外，类似地测定肾素原受体基因和内标Gapdh基因的表达量。将前述基因各自的表达量相对于前述Gapdh基因的表达量归一化。在前述实时定量PCR中，将GoTaqqPCR Master Mix(Promega)用作试剂并将StepOneplus System(Life Technologies)用作仪器。将与实施例4中相同的引物集用于IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1、TNF-α和Gapdh基因的PCR。将下列引物集用于肾素原受体基因的PCR。
肾素原基因用PCR引物集
(SEQ ID NO:63)5’-CTGGTGGCGGGTGCTTTAG-3’
(SEQ ID NO:64)5’-GCTACGTCTGGGATTCGATCT-3’
(3)粘附于视网膜的白细胞的定量
根据文献(Kanda,A.,Noda,K.,Oike,Y.&Ishida,S.Angiopoietin-like protein2mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye.Lab Invest 92,1553-1563,2012)中记述的方法，使用借助异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的伴刀豆球蛋白A凝集素(Con A；Vector Laboratories)的灌注标记来拍摄视网膜血管系统和粘附的白细胞。具体而言，LPS投与后24小时，在麻醉下打开小鼠的胸腔并将插管导入左心室。在注射PBS以除去红细胞和非粘附的白细胞之后，灌注FITC-缀合的Con A。摘除眼球后，制备视网膜的铺片(flat mount)标本。在荧光显微镜(BZ-9000,Keyence)下目视观察铺片标本并计数每视网膜中的Con A染色的粘附白细胞的总数。
(4)玻璃体浸润的白细胞的定量
通过文献(Kanda,A.,Noda,K.,Oike,Y.&Ishida,S.Angiopoietin-like protein2mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye.Lab Invest 92,1553-1563,2012)中记述的方法，计数浸润于玻璃体腔内的白细胞数。具体而言，通过一般方法将视网膜组织固定并包埋在石蜡中。以100μm的间隔准备三个5μm的切片。中间的切片制成穿过视神经。将所有的切片用HE(苏木精-伊红)染色并计数玻璃体腔内的细胞数。
(5)感光细胞外节段的长度的测定和视紫质的免疫印迹分析
感光细胞外节段的长度如下测定。在4℃下使用4％的多聚甲醛固定小鼠的眼球后，将其包埋在石蜡中并制备切片。将切片用HE染色，并在后部视网膜上以4个点测定感光细胞外节段的长度。在视神经两端处的两个点距离200μm和500μm。基于设定为1的正常小鼠(对照)中感光细胞外节段的长度，测定投与有SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子或对照-PshRNA的内毒素诱发的葡萄膜炎小鼠中感光细胞外节段的长度的相对值。视紫质的免疫印迹分析，除了视网膜组织在含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的SDS缓冲液中裂解、抗视紫质抗体(Merck Millipore)和抗-β肌动蛋白抗体(Medical&BiologicalLaboratories)用作一抗以外，通过与实施例5类似的方法进行。
(6)结果
粘附于视网膜的白细胞的显微照片示于图10A-D(A和B：对照投与，C和D：SEQ IDNO:30中示出的单链核酸分子的投与)。箭头表示粘附于有炎症的视网膜血管系统的白细胞。比例尺为100μm。粘附于视网膜的白细胞的定量结果示于图10E。SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子抑制内毒素诱发的葡萄膜炎的视网膜中的白细胞粘附(图10A-E)。
浸润于玻璃体中的白细胞的显微照片示于图10F和G(F：对照投与，G：SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子的投与)。箭头表示浸润的白细胞。比例尺为30μm。浸润于玻璃体中的白细胞的定量结果示于图10H。视神经盘前方的白细胞浸润通过SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子的投与而减少(图10F-H)。
炎性细胞因子基因的表达量的测定结果示于图11。IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1和TNF-α基因的表达量在投与有PBS或对照(对照-PshRNA)的内毒素诱发的葡萄膜炎(EIU)小鼠中高于未投与的正常小鼠(对照)(图11A-D)。另外，在投与有SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子((P)RR-PshRNA)的内毒素诱发的葡萄膜炎小鼠中，炎性细胞因子和肾素原受体((P)RR/Atp6ap2)的表达显著降低(图11A-E)。
感光细胞外节段的长度的测定和视紫质的免疫印迹分析的结果示于图12(RPE为视网膜色素上皮细胞，OS为外节段，IS为内节段，ONL为外核层，INL为内核层)。在投与有SEQID NO:30中示出的单链核酸分子((P)RR-PshRNA)的内毒素诱发的葡萄膜炎小鼠中，抑制了感光细胞外节段的长度缩短(图12A-D)，并抑制了视紫质的减少(图12E)。
(实施例7)链脲佐菌素诱发的1型糖尿病模型小鼠中的慢性炎症抑制效果
近年来，糖尿病性视网膜病被认为是炎性疾病。因此，使用链脲佐菌素诱发的1型糖尿病模型小鼠，确认SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子的慢性炎症抑制效果。进行炎性细胞因子基因的表达量的测定和粘附于视网膜血管的白细胞的定量。
(1)链核酸分子向链脲佐菌素诱发的1型糖尿病模型小鼠的投与
溶解于柠檬酸溶液的链脲佐菌素(Sigma)(60mg/kg体重)通过腹腔内注射向小鼠(C57BL/6J，6至8周龄)(CLEA Japan)连续投与4天。链脲佐菌素投与后第7天血浆葡萄糖浓度超过250mg/dl的小鼠视为患糖尿病的并用于后续实验。自链脲佐菌素投与起2个月后，将SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子溶解于PBS至100μM，并将溶液(1μL)在戊巴比妥麻醉下使用33号注射针向小鼠经玻璃体内投与。作为对照，使用相同量的PBS或溶解于PBS至100μM的对照-PshRNA(SEQ ID NO:62)。投与后24小时，测定炎性细胞因子基因的表达量。另外，定量投与后48小时的粘附于视网膜的白细胞。
(2)通过实时定量PCR的炎性细胞因子基因表达量的测定
通过与实施例6类似的方法，测定IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1、TNF-α和Gapdh基因的表达量。
(3)粘附于视网膜的白细胞的定量
通过与实施例6类似的方法，定量粘附于视网膜的白细胞。
(4)结果
粘附于视网膜的白细胞的显微照片示于图13A-D(A和B：对照投与，C和D：SEQ IDNO:30中示出的单链核酸分子的投与)。比例尺为100μm。粘附于视网膜的白细胞的定量结果示于图13E。SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子的投与显著降低白细胞数(图13A-E)。
炎性细胞因子基因的表达量的测定结果示于图13F-I(对照为未投与PBS或核酸的正常小鼠的表达量)。与投与PBS或对照(对照-PshRNA)的糖尿病小鼠相比，投与有SEQ IDNO:30中示出的单链核酸分子((P)RR-PshRNA)的糖尿病小鼠中IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1和TNF-α基因的表达显著抑制。
(实施例8)激光诱发的CNV模型小鼠中的血管生成抑制效果
在激光诱发的CNV模型小鼠中确认SEQ ID NO:30中示出的且具有人和小鼠肾素原受体基因的表达抑制序列的单链核酸分子的血管生成抑制效果。
(1)单链核酸分子向激光诱发的CNV(脉络膜新生血管形成)模型小鼠的投与
C57BL/6J小鼠(雄性，6至8周龄)(CLEA Japan)通过腹腔内注射戊巴比妥(0.05mg/g体重)来麻醉，并用5％的盐酸去氧肾上腺素和5％的托吡卡胺扩张瞳孔。激光光凝固术(laser photocoagulation)通过使用ND:YAG 532-mn激光(Novus Spectra；Lumenis)使用盖玻片作为接触镜片利用裂隙灯递送系统来进行。各眼在视神经周围用四个激光光斑照射(180mW，75μm，100ms)并建立CNV(脉络膜新生血管形成)模型小鼠。在激光光凝固术后即刻，将通过溶解于PBS至100μM而得的单链核酸分子溶液(1μL)使用33号注射针经玻璃体内投与。作为对照，使用相同量的PBS或溶解于PBS至100μM的对照-PshRNA(SEQ ID NO:62)。通过激光损伤期间气泡的出现确认布鲁赫氏膜(Bruch membrane)的破裂。将玻璃体出血、视网膜出血或视网膜下出血的眼从本试验中排除。
(2)激光诱发的CNV的定量
在激光光凝固术后7天通过麻醉过量来处死小鼠，将眼球摘除并用4％多聚甲醛固定1小时。除去眼前节(anterior ocular segment)和神经视网膜后，径向切开四个部位以平坦化视网膜色素上皮-脉络膜复合体，从而制备脉络膜铺片。将脉络膜铺片浸渍在含5％山羊血清和1％Triton X-100的PBS中并在室温下温育1小时，之后在4℃下与荧光标记的同工凝集素-B4一起温育过夜。在荧光显微镜(Biorevo,Keyence)下观察脉络膜铺片，并使用显微镜软件(BZ-II分析器)测定CNV的面积。
(3)结果
CNV面积的测定结果示于图14A，CNV的显微照片示于图14B-D。投与有SEQ ID NO:30中示出的单链核酸分子((P)RR-PshRNA)的视网膜中的CNV面积，与投与有PBS或对照(对照-PshRNA)的相比，显著小。
尽管以上参考说明性实施方案描述了本发明，但是本发明决不限于此。对于本领域技术人员而言显而易见的各种变化可以在不偏离本发明的范围下在本发明的构成和细节中进行。
本文所引用的包括专利和专利申请在内的任何出版物中公开的内容，以为它们已经在此公开的程度将其全部内容引入以作参考。
产业上的可利用性
根据本发明的单链核酸分子，可以抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达。因此，本发明作为如葡萄膜炎和糖尿病性视网膜病等由肾素原基因或肾素原受体基因的表达引起的疾病的治疗剂是有效的。
本申请基于日本提交的专利申请No.2015-257713(提交日期：2015年12月29日)，将其内容完整地并入本文。
序列表
<110> 国立大学法人北海道大学
学校法人东京医科大学
株式会社博纳克
<120> 抑制肾素原基因或肾素原受体基因表达的单链核酸分子及其用途
<130> 092542
<150> JP 2015-257713
<151> 2015-12-29
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 1
ugauguuguc gaagauaggg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 2
uugauauagu ggaaauuccc u 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 3
ugauauagug gaaauucccu u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 4
uagaacuuuc ggaugaaggu g 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 5
aucaaacucu guguagaacu u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 6
uuccauuucg gaaaacaaca g 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 7
aauuuccauu ucggaaaaca a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 8
uuauaugcaa gguuauaggg a 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 9
uauaugcaag guuauaggga c 21
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<211> 21
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<220>
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aaaaggaacu gcauucucca a 21
<210> 11
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列
<400> 11
uuaguaucca uauuagccca u 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 12
ccuaucuucg acaacaucau c 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 13
ggaauuucca cuauaucaac c 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 14
gggaauuucc acuauaucaa c 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 15
ccuucauccg aaaguucuac a 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 16
guucuacaca gaguuugauc g 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 17
guuguuuucc gaaauggaaa u 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 18
guuuuccgaa auggaaauug g 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 19
ccuauaaccu ugcauauaag u 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 20
cccuauaacc uugcauauaa g 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 21
ggagaaugca guuccuuuua g 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达抑制序列的互补序列
<400> 22
gggcuaauau ggauacuaaa a 21
<210> 23
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 23
ccuaucuucg acaacaucau cccgggauga uguugucgaa gauagggg 48
<210> 24
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 24
ggaauuucca cuauaucaac cccgggguug auauagugga aauucccu 48
<210> 25
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 25
gggaauuucc acuauaucaa cccggguuga uauaguggaa auucccuu 48
<210> 26
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 26
ccuucauccg aaaguucuac accgguguag aacuuucgga ugaaggug 48
<210> 27
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 27
guucuacaca gaguuugauc gccggcgauc aaacucugug uagaacuu 48
<210> 28
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 28
guuguuuucc gaaauggaaa uccggauuuc cauuucggaa aacaacag 48
<210> 29
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 29
guuuuccgaa auggaaauug gccggccaau uuccauuucg gaaaacaa 48
<210> 30
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 30
ccuauaaccu ugcauauaag uccggacuua uaugcaaggu uauaggga 48
<210> 31
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 31
cccuauaacc uugcauauaa gccggcuuau augcaagguu auagggac 48
<210> 32
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 32
ggagaaugca guuccuuuua gccggcuaaa aggaacugca uucuccaa 48
<210> 33
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 33
gggcuaauau ggauacuaaa accgguuuua guauccauau uagcccau 48
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
gctttctcag ccaggacatc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
tgggagatga tgttgtcgaa 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
tcgtaccctt tggagaatgc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
gagccaactg caaaacaaca 20
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ggagaaggct ggggctcatt tgc 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
tggccagggg tgctaagcag ttg 23
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
aggcagtgtc atttcgtacc 20
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
gccttcccta ccatatacac tc 22
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
accccacgaa gtgttggata 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
aagcagatgg ccacagaact 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
tggtcgttct cctgttcttt c 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
accctggcga tcttaatatg c 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
caaactttgc tttccctggt 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
caagggcata tccaacaaca 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
tgtgggcaac ctattccacc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
agctgacgca atgtgactga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
gcagactttg ctttccttgg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
tccactttcg ctgatgacac 20
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
ttggctcagc cagatgca 18
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
cctactcatt gggatcatct tgc 23
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
cctgtttcct ggctctgaag 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
gtctgctgag acccctcttg 20
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
cacagaggat accactccca aca 23
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
tccacgattt cccagagaaa ca 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
ggtgcctatg tctcagcctc tt 22
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
cgatcacccc gaagttcagt a 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 62
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链核酸分子
<400> 62
uacuauucga cacgcgaagu uccggaacuu cgcgugucga auaguauu 48
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
ctggtggcgg gtgctttag 19
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
gctacgtctg ggattcgatc t 21

Claims (21)

1.一种单链核酸分子，其抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达，其仅包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，
其中所述连接子区域(Lx)具有包括吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少之一的非核苷酸结构，和
所述区域(X)和所述区域(Xc)之一包括表达抑制序列，所述表达抑制序列包括在选自与由下列SEQ ID NO:1至5表示的肾素原基因的一部分互补的序列、和与由下列SEQ ID NO:6至11表示的肾素原受体基因的一部分互补的序列的任意核苷酸序列中的由至少18个连续核苷酸组成的核苷酸序列：
(SEQ ID NO:1)5’-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID NO:2)5’-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID NO:3)5’-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID NO:4)5’-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID NO:5)5’-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID NO:6)5’-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID NO:7)5’-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID NO:8)5’-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID NO:9)5’-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID NO:10)5’-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID NO:11)5’-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’，和
另一者包括与所述表达抑制序列互补的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中从3’侧到5’侧依次设置所述区域(X)、所述连接子区域(Lx)和所述区域(Xc)，和所述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Xc)的碱基数(Xc)满足下述式(1)或式(2)的条件：
X>Xc...(1)
X＝Xc...(2)。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)和所述区域(Xc)的碱基数(Xc)满足下述式(3)的条件：
X-Xc＝1、2或3...(3)。
4.根据权利要求1至3任一项所述的核酸分子，其中所述区域(Xc)的碱基数(Xc)为19-30。
5.根据权利要求1至4任一项所述的核酸分子，其中所述连接子区域(Lx)由以下式(I)表示：
其中，
X1和X2各自独立地为H2、O、S、或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R3为键合至环A上的C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基，
L1为由n个原子组成的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代所述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为由m个原子构成的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代所述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
在环A中，所述环A上的除C-2以外的一个碳原子可被氮、氧或硫取代，
所述环A可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，
所述区域(Xc)和(X)各自通过-OR1-或-OR2-与所述连接子区域(Lx)连接，
其中R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或所述结构(I)。
6.根据权利要求1至5任一项所述的核酸分子，其中所述连接子区域(Lx)由以下式(I-4a)或(I-6a)表示：
7.根据权利要求1至6任一项所述的核酸分子，其为RNA分子。
8.根据权利要求1至7任一项所述的核酸分子，其包括至少一个修饰的残基。
9.根据权利要求1至8任一项所述的核酸分子，其包括标记物质。
10.根据权利要求1至9任一项所述的核酸分子，其包括稳定同位素。
11.根据权利要求1至10任一项所述的核酸分子，其中碱基数的合计为38以上。
12.根据权利要求1至11任一项所述的核酸分子，其由任意的下列SEQ ID NO:23至33表示的碱基序列组成：
(SEQ ID NO:23)5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID NO:24)5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID NO:25)5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID NO:26)5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID NO:27)5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID NO:28)5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID NO:29)5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID NO:30)5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID NO:31)5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID NO:32)5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID NO:33)5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’。
13.一种肾素原基因或肾素原受体基因的表达的抑制剂，其包括根据权利要求1至12任一项所述的核酸分子。
14.一种药物，其包括根据权利要求1至12任一项所述的核酸分子。
15.一种眼科疾病的治疗剂，其包括根据权利要求1至12任一项所述的核酸分子。
16.根据权利要求15所述的治疗剂，其中所述眼科疾病选自由糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性和青光眼组成的组。
17.一种抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达的方法，其包括使用根据权利要求1至12任一项所述的核酸分子。
18.根据权利要求17所述的方法，其包括将所述核酸分子投与至细胞、组织或器官的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述投与在体外进行。
20.根据权利要求1至12任一项所述的核酸分子，其用于抑制肾素原基因或肾素原受体基因的表达。
21.根据权利要求1至12任一项所述的核酸分子用于制造肾素原基因或肾素原受体基因的表达的抑制剂的用途。
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