JPWO2017115872A1 - プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する一本鎖核酸分子およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
上記のように、RAPSは2つの異なる作用を通じて、眼組織における炎症・血管新生に深く関与することが知られており、炎症・血管新生を伴う眼科疾患の治療戦略として、RAPSへの介入は重要な意味を持つと考えられる。
[1]プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する一本鎖核酸分子であって、
領域(X)、リンカー領域(Lx)および領域(Xc)のみからなり、
前記リンカー領域(Lx)が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記領域(X)および前記領域(Xc)の一方が、下記配列番号1から5:
(配列番号1) 5'- UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG -3'
(配列番号2) 5'- UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU -3'
(配列番号3) 5'- UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU -3'
(配列番号4) 5'- UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG -3'
(配列番号5) 5'- AUCAAACUCUGUGUAGAACUU -3'
で表されるプロレニン遺伝子の一部に相補的な配列、および下記配列番号6から11:
(配列番号6) 5'- UUCCAUUUCGGAAAACAACAG -3'
(配列番号7) 5'- AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA -3'
(配列番号8) 5'- UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA -3'
(配列番号9) 5'- UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC -3'
(配列番号10) 5'- AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA -3'
(配列番号11) 5'- UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU -3'
で表されるプロレニン受容体遺伝子の一部に相補的な配列から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列中の、連続する少なくとも18ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む発現抑制配列を含み、
他方が、該発現抑制配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
[2]領域(X)、リンカー領域(Lx)および領域(Xc)が、3’側から5’側にかけてこの順序で配置され、前記領域(X)の塩基数(X)および前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、下記式(1)または式(2)の条件を満たす、上記[1]記載の核酸分子。
X>Xc ・・・(1)
X=Xc ・・・(2)
[3]前記領域(X)の塩基数(X)および前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、下記式(3)の条件を満たす、上記[2]記載の核酸分子。
X−Xc=1、2または3 ・・・(3)
[4]前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、19塩基〜30塩基である、上記[1]から[3]のいずれかに記載の核酸分子。
[5]前記リンカー領域(Lx)が、下記式(I):で表わされる、上記[1]から[4]のいずれかに記載の核酸分子。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R3は、環A上のC-3、C-4、C-5またはC-6に結合する水素原子または置換基であり;
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
lは、1または2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC-2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域(Xc)および前記領域(X)は、それぞれ、-OR1-または-OR2-を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)である。
[6]前記リンカー領域(Lx)が、下記式(I-4a)または(I-6a)で表わされる、上記[1]から[5]のいずれかに記載の核酸分子。
[8]少なくとも1つの修飾された残基を含む、上記[1]から[7]のいずれかに記載の核酸分子。
[9]標識物質を含む、上記[1]から[8]のいずれか一項に記載の核酸分子。
[10]安定同位体を含む、上記[1]から[9]のいずれかに記載の核酸分子。
[11]塩基数の合計が、38塩基以上である、上記[1]から[10]のいずれかに記載の核酸分子。
[12]下記配列番号23から33で表されるいずれかの塩基配列からなる、上記[1]から[11]のいずれかに記載の核酸分子。
(配列番号23)
5’- CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG -3’
(配列番号24)
5’- GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU -3’
(配列番号25)
5’- GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU -3’
(配列番号26)
5’- CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG -3’
(配列番号27)
5’- GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU -3’
(配列番号28)
5’- GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG -3’
(配列番号29)
5’- GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA -3’
(配列番号30)
5’- CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA -3’
(配列番号31)
5’- CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC -3’
(配列番号32)
5’- GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA -3’
(配列番号33)
5’- GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU -3’
[13]上記[1]から[12]のいずれかに記載の核酸分子を含む、プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現抑制剤。
[14]上記[1]から[12]のいずれかに記載の核酸分子を含む医薬。
[15]上記[1]から[12]のいずれかに記載の核酸分子を含む、眼科疾患の治療剤。
[16]眼科疾患が、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎および加齢黄斑変性からなる群より選択される、上記[15]記載の剤。
[17]眼科疾患が、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、加齢黄斑変性、および緑内障からなる群より選択される、上記[15]記載の剤。
[18]プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する方法であって、上記[1]から[12]のいずれかに記載の核酸分子を使用することを特徴とする、方法。
[19]前記核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、上記[18]記載の方法。
[20]前記投与がin vitroで行われる、上記[19]記載の方法。
[21]プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現抑制における使用のための、上記[1]から[12]のいずれかに記載の核酸分子。
[22]プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現抑制剤の製造のための、上記[1]から[12]のいずれかに記載の核酸分子の使用。
(1)発現抑制配列および相補配列
本発明の核酸分子は、前述のように、プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する一本鎖核酸分子であって、下記配列番号1から5で表されるプロレニン遺伝子の一部に相補的な配列および下記配列番号6から11で表されるプロレニン受容体遺伝子の一部に相補的な配列から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列中、連続する少なくとも18ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列(「rヌクレオチド配列」という)を含む、プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現抑制配列を含むことを特徴とする。
(配列番号1) 5'- UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG -3'
(配列番号2) 5'- UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU -3'
(配列番号3) 5'- UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU -3'
(配列番号4) 5'- UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG -3'
(配列番号5) 5'- AUCAAACUCUGUGUAGAACUU -3'
(配列番号6) 5'- UUCCAUUUCGGAAAACAACAG -3'
(配列番号7) 5'- AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA -3'
(配列番号8) 5'- UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA -3'
(配列番号9) 5'- UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC -3'
(配列番号10) 5'- AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA -3'
(配列番号11) 5'- UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU -3'
(配列番号12) 5'- CCUAUCUUCGACAACAUCAUC -3'
(配列番号13) 5'- GGAAUUUCCACUAUAUCAACC -3'
(配列番号14) 5'- GGGAAUUUCCACUAUAUCAAC -3'
(配列番号15) 5'- CCUUCAUCCGAAAGUUCUACA -3'
(配列番号16) 5'- GUUCUACACAGAGUUUGAUCG -3'
(配列番号17) 5'- GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAU -3'
(配列番号18) 5'- GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGG -3'
(配列番号19) 5'- CCUAUAACCUUGCAUAUAAGU -3'
(配列番号20) 5'- CCCUAUAACCUUGCAUAUAAG -3'
(配列番号21) 5'- GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAG -3'
(配列番号22) 5'- GGGCUAAUAUGGAUACUAAAA -3'
本発明の核酸分子は、前記発現抑制配列を含む領域と、前記相補配列を含む領域とが、リンカー領域を介して間接的に連結している。前記発現抑制配列を含む領域と前記相補配列を含む領域との連結順序は、特に制限されず、例えば、前記発現抑制配列の5'末端側と、前記相補配列の3'末端側とがリンカー領域を介して連結してもよく、あるいは、前記発現抑制配列の3'末端側と前記相補配列の5'末端側とがリンカー領域を介して連結してもよい。好ましくは前者である。
(ヘアピン型一本鎖核酸分子)
好ましい一実施態様において、本発明の一本鎖核酸分子は、5'側領域および3'側領域が、互いにアニーリングして二本鎖構造(ステム構造)を形成する分子である。これは、shRNA(small hairpin RNAまたはshort hairpin RNA)の形態とも言える。shRNAは、ヘアピン構造をとっており、一般的に、一つのステム領域と一つのループ領域とを有する。
前記発現抑制配列を含む領域(X又はXcの一方)が前記リンカー領域(Lx)側に付加配列を有する場合、前記相補配列を含む領域(X又はXcの他方)も、前記リンカー領域(Lx)側に該付加配列と相補的な配列を含む。
X>Xc ・・・(1)
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2または3、
より好ましくは1または2 ・・・(4)
X=Xc ・・・(2)
前記核酸分子において、前記リンカー領域(Lx)を除くヌクレオチド数の合計は、下限が、例えば、36ヌクレオチドであり、好ましくは38ヌクレオチドである。その上限は、例えば、100ヌクレオチドであり、好ましくは80ヌクレオチドであり、より好ましくは60ヌクレオチドであり、さらに好ましくは50ヌクレオチドである。全長のヌクレオチド数の具体例は、例えば、36〜100ヌクレオチド、好ましくは38〜80ヌクレオチド、より好ましくは42〜60ヌクレオチド、さらに好ましくは42〜50ヌクレオチドである。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R3は、環A上のC-3、C-4、C-5またはC-6に結合する水素原子または置換基であり、
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換れていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
lは、1または2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC-2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域(Xc)および前記領域(X)は、それぞれ、-OR1-または-OR2-を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)である。
条件(1)
前記領域(Xc)は、-OR2-を介して、前記領域(X)は、-OR1-を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(2)
前記領域(Xc)は、-OR1-を介して、前記領域(X)は、-OR2-を介して、前記式(I)の構造と結合する。
(配列番号23)
5’- CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG -3’
(配列番号24)
5’- GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU -3’
(配列番号25)
5’- GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU -3’
(配列番号26)
5’- CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG -3’
(配列番号27)
5’- GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU -3’
(配列番号28)
5’- GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG -3’
(配列番号29)
5’- GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA -3’
(配列番号30)
5’- CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA -3’
(配列番号31)
5’- CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC -3’
(配列番号32)
5’- GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA -3’
(配列番号33)
5’- GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU -3’
(式中、Lxは前記いずれかのリンカー領域を表す。好ましくは、Lxは上記式(I)で表わされる構造を有し、より好ましくは、上記式(I-1)〜(I-9)のいずれかで表わされる構造を有し、さらに好ましくは、上記式(I-4a)又は(I-6a)で表わされる構造を有し、特に好ましくは、上記式(I-6a)で表わされる構造を有する。)
中でも、配列番号30〜32で表わされるヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸分子が特に好ましい。
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびウラシル(U)を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチミン(T)を有する。
本発明の核酸分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびH-ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、RNA Phosphoramidites(2’-O-TBDMSi、商品名、三千里製薬)、ACEアミダイトおよびTOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等があげられる。
本発明の核酸分子が、非修飾リボヌクレオチド残基のみで構成される場合、該核酸分子の前駆体として、該核酸分子を発現可能な状態でコードするベクター(本発明の発現ベクター)の形態で提供することもできる。本発明の発現ベクターは、前記本発明の核酸分子をコードするDNAを標的細胞内で機能的なプロモーターの制御下に含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記DNAと機能的に連結されたプロモーターを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。前記DNAを挿入するベクターは、特に制限されず、例えば、一般的なベクターが使用でき、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター等があげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクターがあげられる。該発現ベクターを、自体公知の遺伝子導入法を用いて、標的細胞(前記プロレニン遺伝子およびプロレニン受容体遺伝子を有する細胞)に導入することにより、該細胞内でのプロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制することができる。
本発明の発現抑制剤は、プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する製剤であって、前記本発明の核酸分子を有効成分とすることを特徴とする。
プロレニン-プロレニン受容体は、組織RAS活性化とRAS非依存的な細胞内シグナル活性化という異なる2つの作用(包括して「受容体結合プロレニン系(RAPS)」という)を通じて、眼組織における炎症・血管新生に深く関与している。従って、本発明の核酸分子を有効成分とする医薬は、RAPSを抑制することにより、RAPSが関与する眼科疾患(例えば、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、加齢黄斑変性等)の治療に有効である。また、本発明の核酸分子を有効成分とする医薬は、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、加齢黄斑変性、緑内障の治療に有効である。ここで「治療」とは、疾患の予防及び発症遅延、疾患の改善、並びに予後の改善の包含する意味で用いる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、アミノ酸などが挙げられる。
等張化剤としては、ソルビトール、グルコース、マンニトールなどの糖類、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール類、塩化ナトリウムなどの塩類、ホウ酸などが挙げられる。
溶解補助剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート(例えば、ポリソルベート80)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、チロキサポール、プルロニックなどの非イオン性界面活性剤、グリセリン、マクロゴールなどの多価アルコールなどが挙げられる。
防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムなどの第四級アンモニウム塩類、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、ソルビン酸およびその塩(ナトリウム塩、カリウム塩など)、チメロサール(商品名)、クロロブタノール、デヒドロ酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
粘性基剤としては、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどの水溶性高分子、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類などが挙げられる。
キレート剤としては、エデト酸ナトリウム、クエン酸などが挙げられる。
清涼化剤としては、l−メントール、ボルネオール、カンフル、ユーカリ油などが挙げられる。
pH調整剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸またはその塩(ホウ砂)、塩酸、クエン酸またはその塩(クエン酸ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム等)、リン酸またはその塩(リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等)、酢酸またはその塩(酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等)、酒石酸またはその塩(酒石酸ナトリウム等)等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられる。
本発明の医薬組成物がリポソーム製剤の場合、リポソーム構成成分に対する本発明の核酸分子のモル比は、通常1/100,000〜1/10,000である。また、リポソーム製剤中に含有される本発明の核酸分子を封入したリポソームの量は、リポソーム粒子が凝集しない程度で、かつ十分な薬効を発揮し得る量であれば特に制限はなく、通常10〜100mMである。
(1)一本鎖核酸分子の合成
以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、ABI3900核酸合成機(商品名、アプライドバイオシステムズ)により合成した。前記合成には、RNAアミダイトとして、EMMアミダイト(国際公開第2013/027843号)を用いた(以下、同様)。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、HPLCによる精製後、それぞれ凍結乾燥した。
PH-0001-h-p(配列番号23)
5'- CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
PH-0002-h-p(配列番号24)
5'- GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
PH-0003-h-p(配列番号25)
5'- GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
PH-0004-h-p(配列番号26)
5'- CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
PH-0005-h-p(配列番号27)
5'- GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
PH-0001-hmr-pr(配列番号28)
5'- GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
PH-0002-hmr-pr(配列番号29)
5'- GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
PH-0001-hm-pr(配列番号30)
5'- CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
PH-0002-hm-pr(配列番号31)
5'- CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
PH-0003-hm-pr(配列番号32)
5'- GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
PH-0001-h-pr(配列番号33)
5'- GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
前記各一本鎖核酸分子を、20μmol/Lとなるように、注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解した。
プロレニン遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号34) 5'- GCTTTCTCAGCCAGGACATC -3'
(配列番号35) 5'- TGGGAGATGATGTTGTCGAA -3'
プロレニン受容体遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号36) 5'- TCGTACCCTTTGGAGAATGC -3'
(配列番号37) 5'- GAGCCAACTGCAAAACAACA -3'
GAPDH遺伝子用プライマーセット
(配列番号38) 5'- GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC -3'
(配列番号39) 5'- TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG -3'
プロレニン遺伝子発現量の測定結果を図2、プロレニン受容体遺伝子発現量の測定結果を図3に示す。本発明の一本鎖核酸分子は、強い遺伝子発現抑制活性を示した。
ヒト、マウスおよびラットプロレニン受容体遺伝子の発現抑制配列を有する配列番号28および29で表される一本鎖核酸分子と、ヒトおよびマウスプロレニン受容体遺伝子の発現抑制配列を有する配列番号30〜32で表される一本鎖核酸分子について、ヒト、マウスおよびラット由来培養細胞におけるプロレニン受容体遺伝子の発現抑制効果を確認した。
細胞は、ヒト由来hTERT-RPE細胞(ATCC)、マウス由来Neuro-2a細胞(ECACC)、ラットRat-1細胞(ATCC)を使用した。培地は各々、10%FBSを含むDMEM/F12、E-MEM、DMEM培地(和光純薬)を使用した。培養条件は、37℃、5%CO2下とした。
ヒトプロレニン受容体遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号40) 5'- AGGCAGTGTCATTTCGTACC -3'
(配列番号41) 5'- GCCTTCCCTACCATATACACTC -3'
ヒトHPRT1遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号42) 5'- ACCCCACGAAGTGTTGGATA -3'
(配列番号43) 5'- AAGCAGATGGCCACAGAACT -3'
マウスプロレニン受容体遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号44) 5'- TGGTCGTTCTCCTGTTCTTTC -3'
(配列番号45) 5'- ACCCTGGCGATCTTAATATGC -3'
マウスHPRT1遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号46) 5'- CAAACTTTGCTTTCCCTGGT -3'
(配列番号47) 5'- CAAGGGCATATCCAACAACA -3'
ラットプロレニン受容体遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号48) 5'- TGTGGGCAACCTATTCCACC -3'
(配列番号49) 5'- AGCTGACGCAATGTGACTGA -3'
ラットHPRT1遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号50) 5'- GCAGACTTTGCTTTCCTTGG -3'
(配列番号51) 5'- TCCACTTTCGCTGATGACAC -3'
ヒトプロレニン受容体遺伝子発現量の測定結果を図4、マウスプロレニン受容体遺伝子の発現量の結果を図5、ラットプロレニン受容体遺伝子発現量の測定結果を図6に示す。各細胞において、本発明の一本鎖核酸分子はいずれも強い遺伝子発現抑制効果を示した。
ヒトプロレニン遺伝子の発現抑制配列を有する配列番号23から27で表される一本鎖核酸分子について、ヒト由来培養細胞におけるプロレニン遺伝子の発現抑制効果を確認した。
細胞は、ヒト由来hTERT-RPE細胞(ATCC)を使用した。培地は、10%FBSを含むDMEM/F12を使用した。培養条件は、37℃、5%CO2下とした。
ヒトHPRT1遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号42) 5’- ACCCCACGAAGTGTTGGATA -3’
(配列番号43) 5’- AAGCAGATGGCCACAGAACT -3’
結果を図7に示す。本発明の一本鎖核酸分子は、いずれも強い遺伝子発現抑制効果を示した。
ヒトおよびマウスプロレニン受容体遺伝子の発現抑制配列を有する配列番号30で表される一本鎖核酸分子、PH-0001-hm-prについて、LPS誘発ぶどう膜炎発症モデルマウスにおける炎症抑制効果を確認した。
前記一本鎖核酸分子を30、100、300μMとなるようにPBSに溶解した。溶解後、各濃度の一本鎖核酸分子溶液1μLを、33ゲージ注射針を用いてペントバルビタール麻酔下のマウス硝子体内に投与した。ネガティブコントロールとして、同量のPBSを用いた。各投与群において、6匹の雄マウス(C57BL/6J、6-8週齢)を使用した。一本鎖核酸分子投与24時間後、100μLのPBSに溶解したLPS(0.2mg)を腹腔内投与した。
LPS投与6時間後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、網膜を摘出し、TRIzol(Life technologies)を用い、添付のプロトコールに従いRNAを回収した。次に、GoScript Reverse Transcriptase Kit(Promega)を用い、添付のプロトコールに従って、前記RNAからcDNAを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記cDNAを鋳型としてPCRを行い、CCL2/MCP-1、ICAM-1、IL-6、TNF-α遺伝子の発現量および内部標準であるGapdh遺伝子の発現量を測定した。前記各遺伝子の発現量は、前記Gapdh遺伝子の発現量により補正した。
マウスCCL2/MCP-1遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号52) 5’- TTGGCTCAGCCAGATGCA -3’
(配列番号53) 5’- CCTACTCATTGGGATCATCTTGC -3’
マウスICAM-1遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号54) 5’- CCTGTTTCCTGGCTCTGAAG -3’
(配列番号55) 5’- GTCTGCTGAGACCCCTCTTG -3’
マウスIL-6遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号56) 5’- CACAGAGGATACCACTCCCAACA -3’
(配列番号57) 5’- TCCACGATTTCCCAGAGAAACA -3’
マウスTNFα遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号58) 5’- GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT -3’
(配列番号59) 5’- CGATCACCCCGAAGTTCAGTA -3’
マウスGapdh遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号60) 5’- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG -3’
(配列番号61) 5’- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3
(3)結果
結果を図8に示す。各群において、配列番号30で表される一本鎖核酸分子、PH-0001-hm-prは炎症性サイトカイン遺伝子発現に対して抑制効果を示した。すなわち、本発明の一本鎖核酸分子は、プロレニン受容体遺伝子発現の抑制を介して、ぶどう膜炎における炎症の発症を抑制することが示唆される。
ヒトおよびマウスプロレニン受容体遺伝子の発現抑制配列を有する配列番号30で表される一本鎖核酸分子について、ヌクレアーゼ耐性を確認した。また、ヒト由来培養細胞におけるプロレニン受容体タンパク質の発現抑制効果をイムノブロット分析により確認した。
0.5ユニットのミクロコッカスヌクレアーゼ(タカラバイオ)の存在下で、配列番号30で表される一本鎖核酸分子を37℃でインキュベートした。反応開始5、15、および30分後に反応溶液にEDTA溶液を加えて反応を停止させ、15% TBEゲルを用いて電気泳動を行い、ゲルをSYBR safe(Life Technologies)で染色した。コントロールとして、センス鎖が配列番号19で表される塩基配列、アンチセンス鎖が配列番号8で表される塩基配列である、二本鎖核酸分子((P)RR-siRNA)を用いた。
細胞は、ヒト網膜色素上皮細胞(RPE、hTERT-RPE1)(ATCC)を使用した。培地は10%FBS(Life Technologies)を含むDMEM/F12(和光純薬)を使用した。培養条件は、37℃、5%CO2下とした。
(配列番号62)
5’- UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-Lx-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU -3’
ヌクレアーゼ耐性の結果を図9A、イムノブロット分析によるプロレニン受容体タンパク質の発現抑制効果の結果を図9Bに示す。コントロール((P)RR-siRNA)は、ミクロコッカスヌクレアーゼによって5分後に完全に分解されたが、配列番号30で表される一本鎖核酸分子((P)RR-PshRNA)は、30分後でも分解されず、ヌクレアーゼ耐性を示した(図9 A)。また、イムノブロット分析の結果より、配列番号30で表される一本鎖核酸分子((P)RR-PshRNA)がプロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することが示された(図9 B)。
ヒトおよびマウスプロレニン受容体遺伝子の発現抑制配列を有する配列番号30で表される一本鎖核酸分子について、急性炎症抑制効果を確認した。急性炎症モデルマウスとしてLPS誘発ぶどう膜炎発症モデルマウスを用い、網膜血管に接着した白血球数および視神経乳頭に隣接する硝子体腔に浸潤した白血球数を測定した。また、当該一本鎖核酸分子が細胞応答を抑制する分子メカニズムを調べるために、炎症性サイトカイン遺伝子の発現量を測定した。さらに、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎モデルマウスでは、ユビキチン プロテアソーム系の活性化に起因して炎症性シグナルがロドプシンの分解を引き起こし、それにより視細胞外節が短くなることから、視細胞外節の長さの測定およびロドプシンのイムノブロット分析を行い、当該一本鎖核酸分子による視細胞の保護効果を調べた。
配列番号30で表される一本鎖核酸分子を100μMとなるようにPBSに溶解した。溶解後、一本鎖核酸分子溶液1μLを、33ゲージ注射針を用いてペントバルビタール麻酔下のマウス(C57BL/6J、6-8週齢)(CLEA Japan)の硝子体内に投与した。コントロールとして、PBSまたは100μMとなるようにPBSに溶解したControl-PshRNA(配列番号62)を同量用いた。投与24時間後、100μLのPBSに溶解した大腸菌由来のLPS(Sigma-Aldrich)(0.2mg)を、配列番号30で表される一本鎖核酸分子またはControl-PshRNAを投与したマウスの腹腔内に投与した。得られた硝子体を用いて、LPS投与6時間後に炎症性サイトカイン遺伝子の発現量の測定、LPS投与24時間後に網膜に接着した白血球および硝子体に浸潤した白血球の定量、ならびに視細胞外節の長さの測定およびロドプシンのイムノブロット分析を行った。
LPS投与6時間後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、網膜を摘出した。文献(Kanda, A., Noda, K., Saito, W. & Ishida, S. (Pro)renin receptor is associated with angiogenic activity in proliferative diabetic retinopathy. Diabetologia 55, 3104-3113, 2012)に記載の方法により、SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO)を用いて細胞から、TRIzol (Life Technologies)およびGoScrip Reverse Transcriptase (Promega)を用いて網膜組織から、トータルRNAを分離し、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成した。合成した前記cDNAを鋳型としてリアルタイム定量PCRを行い、IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1、およびTNF-α遺伝子の発現量を測定した。これらの遺伝子は、急性および慢性炎症モデルのいずれにも共通して関与することが知られている代表的な遺伝子である。また、プロレニン受容体遺伝子、および内部標準であるGapdh遺伝子の発現量を同様に測定した。前記各遺伝子の発現量は、前記Gapdh遺伝子の発現量により補正した。前記リアルタイム定量PCRは、試薬としてGoTaq qPCR Master Mix (Promega)、機器としてStepOne plus System (Life Technologies)を用いた。IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1、TNF-α、およびGapdh遺伝子のPCRには、実施例4で用いたプライマーセットと同じプライマーセットを用いた。プロレニン受容体遺伝子のPCRには、以下のプライマーセットを使用した。
プロレニン遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号63) 5'- CTGGTGGCGGGTGCTTTAG -3'
(配列番号64) 5'- GCTACGTCTGGGATTCGATCT -3'
文献(Kanda, A., Noda, K., Oike, Y. & Ishida, S. Angiopoietin-like protein 2 mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye. Lab Invest 92, 1553-1563, 2012)に記載の方法により、perfusion-labeling with fluorescein isothiocyanate (FITC)-coupled concanavalin A lectin(Con A; Vector Laboratories)を用い、網膜血管系および接着性白血球を撮影した。具体的には、LPS投与24時間後、麻酔下のマウスの胸腔を開き、左心室にカニューレを導入した。赤血球および非接着性白血球を除去するためにPBSを注入した後、FITC-conjugated Con Aをかん流させた。眼球を摘出後、網膜のフラットマウント標本を作製した。フラットマウント標本を蛍光顕微鏡(BZ-9000、キーエンス)下で可視化し、網膜あたりのCon A染色された接着性白血球の総数を数えた。
文献(Kanda, A., Noda, K., Oike, Y. & Ishida, S. Angiopoietin-like protein 2 mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye. Lab Invest 92, 1553-1563, 2012)に記載の方法により、硝子体腔に浸潤した白血球の数を調べた。具体的には、通常の方法により、網膜組織を固定してパラフィンに包埋した。厚さ5μmの切片を100μm間隔で3枚作製した。真ん中の切片は、視神経を通過するように作製した。全ての切片をHE(ヘマトキシリン・エオジン)染色し、硝子体腔内の細胞数を数えた。
視細胞外節の長さの測定は、以下のように行った。4%パラホルムアルデヒドを用いて4℃でマウスの眼球を固定後、パラフィンに包埋し、切片を作製した。切片をHE染色し、網膜後部の4点で視細胞外節の長さを測定した。視神経の両端の2点は、200 μmおよび500 μm離れていた。正常なマウス(Control)における視細胞外節の長さを1として、配列番号30で表される一本鎖核酸分子またはControl-PshRNAを投与したエンドトキシン誘発ぶどう膜炎マウスにおける視細胞外節の長さの相対値を求めた。
ロドプシンのイムノブロット分析は、プロテアーゼインヒビターカクテル(ロシュ)を含むSDSバッファーに網膜組織を溶解した点、ならびに一次抗体として抗ロドプシン抗体(メルクミリポア)、および抗βアクチン抗体(医学生物学研究所)を用いた点を除き、実施例5と同様の方法により行った。
網膜に接着した白血球の顕微鏡写真を図10 A-Dに示す(AおよびBはコントロールを投与、CおよびDは配列番号30で表される一本鎖核酸分子を投与)。矢印は、炎症を起こした網膜血管系に接着した白血球を示す。スケールバーは100μmである。網膜に接着した白血球の定量の結果を図10 Eに示す。配列番号30で表される一本鎖核酸分子は、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎の網膜における白血球接着を抑制した(図10 A-E)。
硝子体に浸潤した白血球の顕微鏡写真を図10 FおよびGに示す(Fはコントロールを投与、Gは配列番号30で表される一本鎖核酸分子を投与)。矢印は、浸潤した白血球を示す。スケールバーは30μmである。硝子体に浸潤した白血球の定量の結果を図10 Hに示す。視神経乳頭の前方への白血球浸潤は、配列番号30で表される一本鎖核酸分子の投与により減少した(図10 F-H)。
炎症性サイトカイン遺伝子の発現量の測定結果を図11に示す。IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1、およびTNF-α遺伝子発現量は、PBSまたはコントロール(Control-PshRNA)を投与したエンドトキシン誘発ぶどう膜炎(EIU)マウスにおける発現量の方が、未投与の正常なマウス(Control)における発現量よりも高かった(図11 A-D)。また、配列番号30で表される一本鎖核酸分子((P)RR-PshRNA)を投与したエンドトキシン誘発ぶどう膜炎マウスにおいては、これらの炎症性サイトカインおよびプロレニン受容体((P)RR/Atp6ap2)の発現が有意に減少した(図11 A-E)。
視細胞外節の長さの測定およびロドプシンのイムノブロット分析の結果を図12に示す(RPEは網膜色素上皮、OSは外節、ISは内節、ONLは外顆粒層、INLは内顆粒層である)。配列番号30で表される一本鎖核酸分子((P)RR-PshRNA)を投与したエンドトキシン誘発ぶどう膜炎(EIU)マウスにおいて、視細胞外節の長さの短縮が抑制され(図12 A-D)、ロドプシンの減少が抑制された(図12 E)。
近年、糖尿病網膜症は炎症性疾患と考えられている。したがって、ストレプトゾトシン誘発1型糖尿病モデルマウスを用い、配列番号30で表される一本鎖核酸分子について、慢性炎症抑制効果を確認した。炎症性サイトカイン遺伝子発現量の測定、および網膜血管に接着した白血球の定量を行った。
クエン酸溶液に溶解したストレプトゾトシン(Sigma)(60 mg/kg体重)を腹腔内注射により、4日間連続してマウス(C57BL/6J、6-8週齢)(CLEA Japan)に投与した。ストレプトゾトシン投与後7日目の血漿グルコース濃度が250 mg/dlを超えたマウスを糖尿病とみなし、以後の実験に用いた。ストレプトゾトシン投与2か月後、100μMとなるようにPBSに溶解した配列番号30で表される一本鎖核酸分子の溶液1μLを、33ゲージ注射針を用いてペントバルビタール麻酔下のマウス硝子体内に投与した。コントロールとして、PBSまたは100μMとなるようにPBSに溶解したControl-PshRNA(配列番号62)を同量用いた。投与24時間後に炎症性サイトカイン遺伝子の発現量を測定した。また、投与48時間後に網膜に接着した白血球の定量を行った。
実施例6と同様の方法により、IL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1、TNF-α、およびGapdh遺伝子の発現量を測定した。
実施例6と同様の方法により、網膜に接着した白血球の定量を行った。
網膜に接着した白血球の顕微鏡写真および白血球の定量の結果を図13 A-Dに示す(AおよびBはコントロールを投与、CおよびDは配列番号30で表される一本鎖核酸分子を投与)。スケールバーは100μmである。網膜に接着した白血球の定量の結果を図13 Eに示す。配列番号30で表される一本鎖核酸分子の投与により、白血球数が有意に減少した(図13 A-E)。
炎症性サイトカイン遺伝子の発現量の測定結果を図13 F-Iに示す(Controlは、PBSまたは核酸を未投与の正常なマウスにおける発現量を示す)。配列番号30で表される一本鎖核酸分子((P)RR-PshRNA)を投与した糖尿病マウスにおけるIL-6、CCL2/MCP-1、ICAM-1、およびTNF-α遺伝子の発現は、PBSまたはコントロール(Control-PshRNA)を投与した糖尿病マウスにおける発現と比べて有意に抑制された。
ヒトおよびマウスプロレニン受容体遺伝子の発現抑制配列を有する配列番号30で表される一本鎖核酸分子について、レーザー誘発CNVモデルマウスにおける血管新生抑制効果を確認した。
C57BL/6Jマウス(オス、6-8週齢)(CLEA Japan)の腹腔内にペントバルビタール(0.05mg/g体重)を注射して麻酔し、5%の塩酸フェニレフリンおよび5%トロピカミドを用いて瞳孔を拡張した。レーザー光凝固術は、ND:YAG 532-mn laser(Novus Spectra; Lumenis)を用いて、コンタクトレンズとしてのカバーグラスを用いたスリットランプデリバリーシステムにより行った。各眼に、視神経を囲む4つのレーザースポット照射を行い(180 mW、75 μm、100 ms)、CNV(脈絡膜血管新生)モデルマウスを作製した。レーザー光凝固術後すぐに、100μMとなるようにPBSに溶解した一本鎖核酸分子溶液1μLを、33ゲージ注射針を用いて硝子体内に投与した。コントロールとして、PBSまたは100μMとなるようにPBSに溶解したControl-PshRNA(配列番号62)を同量用いた。レーザー傷害の際に気泡が出現したことにより、ブルッフ膜の破裂を確認した。硝子体出血、網膜出血、網膜化出血している眼は、本試験から除外した。
レーザー光凝固術7日後に麻酔の過剰投与によりマウスを安楽死させ、眼球を摘出して4%パラホルムアルデヒドで1時間固定した。前眼部と神経網膜を除去後、放射状に4箇所を切開して、網膜色素上皮-脈絡膜の複合体を平坦にして脈絡膜フラットマウントを作製した。5%ヤギ血清、および1%トリトンX-100を含むPBSに脈絡膜フラットマウントを浸して室温で1時間インキュベートした後、蛍光標識したイソレクチン-B4とともに4℃で一晩インキュベートした。蛍光顕微鏡(Biorevo, Keyence)で脈絡膜フラットマウントを観察し、microscope software (BZ-II analyzer)を用いてCNVの面積を測定した。
CNVの面積の測定結果を図14A、CNVの顕微鏡写真を図14B-Dに示す。配列番号30で表される一本鎖核酸分子((P)RR-PshRNA)を投与した網膜におけるCNV面積は、PBSまたはコントロール(Control-PshRNA)と比べて有意に小さかった。
本出願は、日本でされた特願2015-257713(出願日:2015年12月29日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (21)
- プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する一本鎖核酸分子であって、
領域(X)、リンカー領域(Lx)および領域(Xc)のみからなり、
前記リンカー領域(Lx)が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記領域(X)および前記領域(Xc)の一方が、下記配列番号1から5:
(配列番号1) 5'- UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG -3'
(配列番号2) 5'- UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU -3'
(配列番号3) 5'- UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU -3'
(配列番号4) 5'- UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG -3'
(配列番号5) 5'- AUCAAACUCUGUGUAGAACUU -3'
で表されるプロレニン遺伝子の一部に相補的な配列、および下記配列番号6から11:
(配列番号6) 5'- UUCCAUUUCGGAAAACAACAG -3'
(配列番号7) 5'- AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA -3'
(配列番号8) 5'- UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA -3'
(配列番号9) 5'- UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC -3'
(配列番号10) 5'- AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA -3'
(配列番号11) 5'- UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU -3'
で表されるプロレニン受容体遺伝子の一部に相補的な配列から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列中の、連続する少なくとも18ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む発現抑制配列を含み、
他方が、該発現抑制配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。 - 領域(X)、リンカー領域(Lx)および領域(Xc)が、3’側から5’側にかけてこの順序で配置され、前記領域(X)の塩基数(X)および前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、下記式(1)または式(2)の条件を満たす、請求項1記載の核酸分子。
X>Xc ・・・(1)
X=Xc ・・・(2) - 前記領域(X)の塩基数(X)および前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、下記式(3)の条件を満たす、請求項2記載の核酸分子。
X−Xc=1、2または3 ・・・(3) - 前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、19塩基〜30塩基である、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記リンカー領域(Lx)が、下記式(I)で表わされる、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸分子。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R3は、環A上のC-3、C-4、C-5またはC-6に結合する水素原子または置換基であり;
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
lは、1または2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC-2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、前記領域(Xc)および前記領域(X)は、それぞれ、-OR1-または-OR2-を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)である。 - 前記リンカー領域(Lx)が、下記式(I-4a)または(I-6a)で表わされる、請求項1から5のいずれか一項に記載の核酸分子。
- RNA分子である、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 少なくとも1つの修飾された残基を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 標識物質を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 安定同位体を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 塩基数の合計が、38塩基以上である、請求項1から10のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 下記配列番号23から33で表されるいずれかの塩基配列からなる、請求項1から11のいずれか一項に記載の核酸分子。
(配列番号23)
5’- CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG -3’
(配列番号24)
5’- GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU -3’
(配列番号25)
5’- GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU -3’
(配列番号26)
5’- CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG -3’
(配列番号27)
5’- GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU -3’
(配列番号28)
5’- GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG -3’
(配列番号29)
5’- GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA -3’
(配列番号30)
5’- CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA -3’
(配列番号31)
5’- CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC -3’
(配列番号32)
5’- GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA -3’
(配列番号33)
5’- GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU -3’ - 請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現抑制剤。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸分子を含む医薬。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、眼科疾患の治療剤。
- 眼科疾患が、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、加齢黄斑変性および緑内障からなる群より選択される、請求項15記載の剤。
- プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する方法であって、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸分子を使用することを特徴とする、方法。
- 前記核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項17記載の方法。
- 前記投与がin vitroで行われる、請求項18記載の方法。
- プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現抑制における使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸分子。
- プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現抑制剤の製造のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
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