KR20180086263A - 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자 및 이의 용도 - Google Patents

프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)를 포함하는, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자로서, 상기 링커 영역(Lx)은 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중의 적어도 하나를 포함하는 비-뉴클레오티드 구조를 갖고, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중의 하나는 서열번호 1 내지 5로 나타내어지는 프로레닌 유전자의 일부에 상보성인 서열, 및 서열번호 6 내지 11로 나타내어지는 프로레닌 수용체 유전자의 일부에 상보성인 서열로부터 선택되는 임의의 뉴클레오티드 서열 중의 적어도 18개 연속 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 억제 서열을 포함하는, 핵산 분자를 제공한다.

Description

프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자 및 이의 용도
본 발명은 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자, 이를 함유하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
레닌-안지오텐신 시스템(RAS)는 주로 혈압의 조절 및 전해질 밸런스의 유지에 관여하고(순환 RAS), 기관의 국소 부분에서 세포의 분화 및 증식, 조직 수복 등의 역할을 담당한다(조직 RAS). 당뇨병 망막증 및 맥락막 혈관신생에서, 조직 RAS의 활성화는, 안지오텐신 유형 1 수용체를 통해 신호 경로를 자극하고 VEGF, MCP-1, ICAM-1 등의 염증-관련 분자의 발현을 유도하기 때문에, 혈관 병태에 관여한다.
단지 레닌의 불활성 전구체인 것으로 생각되는 프로레닌은 레닌 및 프로레닌과 공통의 막관통형 수용체(ATP6AP2; ATPase, H+ 수송, 리소좀 액세서리 단백질 2, 또한 본 명세서에서 "프로레닌 수용체"로서 기재됨)과 결합함으로써 안지오텐신에 결합하는 능력을 획득하고, 조직 RAS의 활성화를 유발하는 동시에, 프로레닌 수용체에 의해 매개된 세포내 신호로서 ERK의 활성화를 유발하고, 이에 의해 또한 VEGF 및 MCP-1을 유도한다. 프로레닌-프로레닌 수용체에 의한 이들 조직 RAS 활성화 및 RAS-비의존적 세포내 신호전달 활성화는 수용체-연관 프로레닌 시스템(RAPS)로서 총칭된다.
상기한 바와 같이, RAPS는 2개의 상이한 작용을 통해 안 조직의 염증 및 혈관신생에 깊이 관여하는 것으로 공지되어 있고, 염증 또는 혈관신생에 수반되는 안과 질환의 치료 전략으로서 RAPS에서의 개입은 중요한 의미를 갖는 것으로 생각된다.
유전자 발현을 억제하는 기술로서, 예를 들면, RNA 간섭(RNAi)가 공지되어 있다. RNA 간섭에 의한 유전자의 발현 억제는, 예를 들면, 짧은 이본쇄 RNA 분자를 세포 등에 투여함으로써 실시하는 것이 일반적이다. 상기 이본쇄 RNA 분자는 통상 siRNA(작은 간섭 RNA)로서 불리운다. 다양한 유전자의 연구는 siRNA를 사용하여 수행되어 왔지만, 이들은 혈중 불안정성 및 면역 반응에 의한 부작용의 가능성 등의 문제와 연관되어 있고, 보다 효과적인 핵산 분자의 제공이 요망되고 있다.
최근에, 본 발명자들은 siRNA를 대체하는 보다 효과적인 일본쇄 핵산 분자를 새롭게 개발하고 있다(특허 문헌 1, 2 및 비특허 문헌 1).
[문헌 목록]
[특허 문헌]
특허 문헌 1: 국제공개공보 제WO 2012/005368호
특허 문헌 2: 국제공개공보 제WO 2012/017919호
[비특허 문헌]
비특허 문헌 1: Hamasaki et al., PLoS ONE, 7(8), e42655, doi:10.1371, 2012
본 발명은, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현이 관여하는 질환의 치료에 효과적인 핵산 분자, 및 이를 사용한 의약의 제공을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자 내의 특정 부분 서열을 표적화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 영역 및 이의 상보성 쇄 서열을 함유하는 영역을 특정 링커를 사용하여 연결시킨 일본쇄 핵산 분자가 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 현저히 억제하고, 또한 포도막염 동물 모델에서 병태를 개선시키는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 하기에 제시된 바와 같다.
[1] 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)를 포함하는, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자로서,
상기 링커 영역(Lx)은 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중의 적어도 하나를 포함하는 비-뉴클레오티드 구조를 갖고,
상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중의 하나는 하기 서열번호 1 내지 5:
(서열번호 1) 5'-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
(서열번호 2) 5'-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
(서열번호 3) 5'-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
(서열번호 4) 5'-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
(서열번호 5) 5'-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
로 나타내어지는 프로레닌 유전자의 일부에 상보성인 서열, 및 하기 서열번호 6 내지 11:
(서열번호 6) 5'-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
(서열번호 7) 5'-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
(서열번호 8) 5'-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
(서열번호 9) 5'-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
(서열번호 10) 5'-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
(서열번호 11) 5'-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
로 나타내어지는 프로레닌 수용체 유전자의 일부에 상보성인 서열로부터 선택되는 임의의 뉴클레오티드 서열 중의 적어도 18개 연속 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 억제 서열을 포함하고,
다른 것은 상기 발현 억제 서열과 상보성인 뉴클레오티드를 포함하는, 핵산 분자.
[2] 상기 [1]에 있어서, 상기 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)가 3'-측으로부터 5'-측으로 이러한 순서로 배치되고, 상기 영역(X)의 염기 수(X) 및 상기 영역(Xc)의 염기 수(Xc)가 하기 수학식 1 또는 2의 조건을 만족시키는, 핵산 분자:
수학식 1
X>Xc ···(1)
수학식 2
X=Xc ···(2)
[3] 상기 [2]에 있어서, 상기 영역(X)의 염기 수(X) 및 상기 영역(Xc)의 염기 수(Xc)가 하기 수학식 3의 조건을 만족시키는, 핵산 분자:
수학식 3
X-Xc=1, 2 또는 3 ···(3)
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중의 어느 하나에 있어서, 상기 영역(Xc)의 염기 수(Xc)가 19 내지 30인, 핵산 분자.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중의 어느 하나에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)가 하기 화학식 I로 나타내어지는, 핵산 분자:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이고;
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O 또는 S이고;
R3은 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환체이고,
L1은 n개의 원자로 이루어진 알킬렌 쇄이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나,
L1은 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄이고,
단, Y1이 NH, O 또는 S인 경우, L1에서 Y1에 결합하는 원자는 탄소이고, L1에서 OR1에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않고;
L2는 m개의 원자로 이루어진 알킬렌 쇄이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc로 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나,
L2는 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄이고,
단, Y2가 NH, O 또는 S인 경우, L2에서 Y2에 결합하는 원자는 탄소이고, L2에서 OR2에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않고;
Ra, Rb, Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 치환체 또는 보호 그룹이고;
l은 1 또는 2이고;
m은 0 내지 30 범위의 정수이고;
n은 0 내지 30 범위의 정수이고;
환 A에서, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자는 질소, 산소 또는 황으로 치환될 수 있고,
상기 환 A는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유할 수 있고,
상기 영역(Xc) 및 (X)는 각각 -OR1- 또는 -OR2-를 통해 상기 링커 영역(Lx)에 결합하고,
여기서, R1 및 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 이들이 존재하는 경우, R1 및 R2는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조(I)이다.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중의 어느 하나에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)가 하기 화학식 I-4a 또는 I-6a로 나타내어지는, 핵산 분자:
[화학식 I-4a]
Figure pct00002
[화학식 I-6a]
Figure pct00003
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중의 어느 하나에 있어서, RNA 분자인, 핵산 분자.
[8] 상기 [1] 내지 [7] 중의 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함하는, 핵산 분자.
[9] 상기 [1] 내지 [8] 중의 어느 하나에 있어서, 표지 물질을 포함하는, 핵산 분자.
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중의 어느 하나에 있어서, 안정한 동위체를 포함하는, 핵산 분자.
[11] 상기 [1] 내지 [10] 중의 어느 하나에 있어서, 염기 수의 합계가 38 이상인, 핵산 분자.
[12] 상기 [1] 내지 [11] 중의 어느 하나에 있어서, 하기 서열번호 23 내지 33 중의 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열로 이루어진, 핵산 분자:
(서열번호 23)
5'-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
(서열번호 24)
5'-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
(서열번호 25)
5'-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
(서열번호 26)
5'-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
(서열번호 27)
5'- GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
(서열번호 28)
5'-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
(서열번호 29)
5'-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
(서열번호 30)
5'-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
(서열번호 31)
5'-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
(서열번호 32)
5'-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
(서열번호 33)
5'-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
[13] 상기 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 따르는 핵산 분자를 포함하는, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제제.
[14] 상기 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 따르는 핵산 분자를 포함하는 의약.
[15] 상기 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 따르는 핵산 분자를 포함하는, 안과 질환을 위한 치료제.
[16] 상기 [15]에 있어서, 상기 안과 질환이 당뇨병 망막증, 포도막염 및 연령-관련 황반 변성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 치료제.
[17] 상기 [15]에 있어서, 상기 안과 질환이 당뇨병 망막증, 포도막염, 연령-관련 황반 변성 및 녹내장으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 치료제.
[18] 상기 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 따르는 핵산 분자를 사용하는 것을 포함하는, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 방법.
[19] 상기 [18] 있어서, 상기 핵산 분자를 세포, 조직 또는 기관에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
[20] 상기 [19]에 있어서, 상기 투여가 시험관 내에서 수행되는, 방법.
[21] 상기 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 있어서, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제에 사용하기 위한, 핵산 분자.
[22] 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제제의 제조를 위한, 상기 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 따르는 핵산 분자의 용도.
본 발명의 핵산 분자에 따르면, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 생체내에서 현저히 억제할 수 있다. 따라서, 당해 핵산 분자는 수용체-연관된 프로레닌 시스템(RAPS)가 관여하는 질환, 예를 들면, 당뇨병 망막증, 포도막염, 연령-관련 황반 변성 등의 안과 질환의 치료를 위한 치료약의 유망한 후보일 수 있다. 또한, 당해 분자는 당뇨병 망막증, 포도막염, 연령-관련 황반 변성, 녹내장 등의 안과 질환을 위한 치료약의 유망한 후보일 수 있다.
도 1은 본 발명의 핵산 분자의 예를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 프로레닌 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 인간 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 마우스 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 랫트 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 인간 프로레닌 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 CCL2/MCP-1, ICAM-1, IL-6, TNF-α 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 일본쇄 핵산 분자의 뉴클레아제 내성(A), 및 일본쇄 핵산 분자에 의한 프로레닌 수용체 단백질에 대한 발현 억제 효과(B)를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 유리체의 현미경 사진(A-D, F, G) 및 백혈구 수를 나태내는 그래프(E, H)를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 염증성 사이토킨 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 망막의 현미경 사진(A-C), 광수용체 외부 세그먼트 길이의 상대치를 나타내는 그래프(D), 및 로돕신의 면역블롯 분석 결과(E)를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 실시예에서 유리체의 현미경 사진(A-D), 백혈구 수를 나타내는 그래프(E), 및 염증성 사이토킨 유전자의 발현 양의 상대치를 나타내는 그래프(F-I)를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 실시예에서 CNV의 면적 측정 결과를 나타내는 그래프(A) 및 CNV의 현미경 사진(B-D)을 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어는 당해 기술분야에서 통상 사용되는 의미로 사용될 수 있다.
1. 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하기 위한 핵산 분자
(1) 발현 억제 서열 및 상보성 서열
본 발명의 핵산 분자는, 상술한 바와 같이, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자로서, 하기 서열번호 1 내지 5로 나타내어지는 프로레닌 유전자의 일부에 상보성인 서열 및 하기 서열번호 6 내지 11로 나타내어지는 프로레닌 수용체 유전자의 일부에 상보성인 서열로부터 선택되는 임의의 뉴클레오티드 서열에서 적어도 18개 연속 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열("r 뉴클레오티드 서열"로서 지칭됨)을 포함하는 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(서열번호 1) 5'-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
(서열번호 2) 5'-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
(서열번호 3) 5'-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
(서열번호 4) 5'-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
(서열번호 5) 5'-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
(서열번호 6) 5'-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
(서열번호 7) 5'-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
(서열번호 8) 5'-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
(서열번호 9) 5'-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
(서열번호 10) 5'-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
(서열번호 11) 5'-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
상기 발현 억제 서열은, 예를 들면, 상기 r 뉴클레오티드 서열로 이루어진 서열, 또는 상기 r 뉴클레오티드 서열을 함유하는 서열일 수 있다. 상기 발현 억제 서열이 r 뉴클레오티드 서열을 함유하는 서열인 경우, 하나 이상의 뉴클레오티드가 r 뉴클레오티드 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 부가된다. 이 경우, 발현 억제 서열은 전체로서 표적인 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자에 상보성이다(여기서, "상보성"은 후술하는 상보성 서열에 대해 정의된 바와 같다). 한편, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자 중의 발현 억제 서열을 함유하는 영역(X 또는 Xc) 내의 발현 억제 서열 이외의 뉴클레오티드(서열)은 표적 유전자에 대하여 상보성인 것을 필요로 하지 않는다.
상기 발현 억제 서열의 길이는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 18 내지 32 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 19 내지 30 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 19, 20, 21 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명에서, 예를 들면, 염기 수의 수치 범위는 이 범위에 속하는 모든 양의 정수를 개시한다. 예를 들면, "1 내지 4 염기"의 기재는 "1, 2, 3, 4 염기"의 임의의 개시를 의미한다(이하, 동일).
본 발명의 일본쇄 핵산 분자는 상기 발현 억제 서열과 어닐링 가능한 상보성 서열을 추가로 함유한다.
상기 상보성 서열은, 표적 세포 내의 생리학적 조건하에서 상기 발현 억제 서열에 어닐링 가능하면, 반드시 완전 상보성일 필요는 없다. 즉, 상기 상보성 서열은 상기 발현 억제 서열과 중첩하는 영역에서 100% 상보성을 갖는 서열일 수 있다. 예를 들면, 이는 90% 내지 100%, 93% 내지 100%, 95% 내지 100%, 98% 내지 100%, 99% 내지 100% 등의 상보성을 갖는 서열일 수 있다.
상기 발현 억제 서열이 서열번호 n(n-1-11)에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중의 r 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우, 상기 상보성 서열은 하기 서열번호 n+1로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 중의 r 뉴클레오티드 서열에 대해 상보성인 서열("s 뉴클레오티드 서열"로 지칭됨)을 포함한다:
(서열번호 12) 5'-CCUAUCUUCGACAACAUCAUC-3'
(서열번호 13) 5'-GGAAUUUCCACUAUAUCAACC-3'
(서열번호 14) 5'-GGGAAUUUCCACUAUAUCAAC-3'
(서열번호 15) 5'-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACA-3'
(서열번호 16) 5'-GUUCUACACAGAGUUUGAUCG-3'
(서열번호 17) 5'-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAU-3'
(서열번호 18) 5'-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGG-3'
(서열번호 19) 5'-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGU-3'
(서열번호 20) 5'-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAG-3'
(서열번호 21) 5'-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAG-3'
(서열번호 22) 5'-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAA-3'
상기 상보성 서열은, 예를 들면, 상기 s 뉴클레오티드 서열로 이루어진 서열 또는 상기 s 뉴클레오티드 서열을 함유하는 서열일 수도 있다.
상기 상보성 서열의 길이는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 18 내지 32 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 19 내지 30 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 19, 20, 21 뉴클레오티드 길이이다.
상기 발현 억제 서열 및 상기 상보성 서열은 각각, 예를 들면, 리보뉴클레오티드 잔기 단독으로 이루어진 RNA 분자일 수도 있거나, 리보뉴클레오티드 잔기 이외에 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 함유하는 RNA 분자일 수도 있다. 우라실(U) 잔기가 데옥시리보뉴클레오티드 잔기로 치환되는 경우, 이는 dT 또는 dU에 의해 임의로 치환된다.
(2) 일본쇄 핵산 분자
본 발명의 핵산 분자에서, 상기 발현 억제 서열을 함유하는 영역 및 상기 상보성 서열을 함유하는 영역은 링커 영역을 통해 간접적으로 연결된다. 상기 발현 억제 서열을 함유하는 영역과 상기 상보성 서열을 함유하는 영역의 연결 순서는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 발현 억제 서열의 5'-말단 측 및 상기 상보성 서열의 3'-말단 측이 링커 영역을 통해 연결될 수 있거나, 상기 발현 억제 서열의 3'-말단 측 및 상기 상보성 서열의 5'-말단 측이 링커 영역을 통해 연결될 수 있다. 바람직하게는 전자이다.
상기 링커 영역은, 예를 들면, 뉴클레오티드 잔기로 구성될 수 있고, 비-뉴클레오티드 잔기로 구성될 수 있거나, 뉴클레오티드 잔기 및 비-뉴클레오티드 잔기 둘 다로 구성될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 링커 영역은 비-뉴클레오티드 잔기로 구성된다.
본 발명의 일본쇄 핵산 분자의 구체적 예를 이하에 예시하지만, 본 발명은 이들로 제한되지 않는다.
(헤어핀형 일본쇄 핵산 분자)
바람직한 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 일본쇄 핵산 분자는 5'-측 영역 및 3'-측 영역이 서로 어닐링하여 이본쇄 구조(스템 구조)를 형성하는 분자이다. 이는 또한 shRNA(작은 헤어핀 RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA)의 형태로도 언급될 수 있다. shRNA는 헤어핀 구조를 갖고, 일반적으로 하나의 스템 영역 및 하나의 루프 영역을 갖는다.
이러한 형태의 핵산 분자는 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc) 단독을 포함하고, 상보성 구조를 갖는 상기 영역(X)와 상기 영역(Xc)가 상기 링커 영역(Lx)를 통해 연결된 구조를 갖는다. 구체적으로, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중의 하나는 상기 발현 억제 서열을 함유하고, 다른 하나는 상기 상보성 서열을 함유한다. 따라서, 이들은 분자내 어닐링에 의해 상기 영역(X)와 상기 영역(Xc) 사이에서 스템 구조를 형성할 수 있고, 상기 링커 영역(Lx)은 루프 구조로 된다.
상기 핵산 분자는 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)을 5'-측으로부터 3'-측으로 이러한 순서에 걸쳐 가질 수 있거나, 3'-측으로부터 5'-측으로 이러한 순서로 가질 수 있다. 바람직하게는 전자이다. 상기 발현 억제 서열은 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중의 어느 하나에 배치될 수 있지만, 상기 상보성 서열의 하류측, 즉 상기 상보성 서열보다 3'-측에 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 핵산 분자가 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)를 5'-측으로부터 3'-측으로 이러한 순서로 갖는 경우, 상기 발현 억제 서열은 상기 영역(X)에 배치되는 것이 바람직하다.
이러한 형태의 핵산 분자의 한 가지 실시형태는 도 1의 모식도에 제시된다. 도 1(A)는 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이고, 도 1(B)는 상기 핵산 분자가 상기 분자 내에 이중쇄를 형성하는 것을 나타내는 모식도이다. 도 1(B)에 제시된 바와 같이, 상기 핵산 분자는 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)의 사이에 이중쇄를 형성하고, 상기 Lx 영역은 이의 길이에 따라 루프 구조를 갖는다. 도 1은 상기 영역의 순서 및 이중쇄를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 단지 나타내고, 예를 들면, 각 영역의 길이, 상기 링커 영역(Lx)의 형상 등은 이들로 제한되지 않는다.
상기 핵산 분자에서, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X) 중의 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 않는다. 각 영역의 길이의 예는 하기에 제시되어 있지만, 본 발명은 이들로 제한되지 않는다.
상기 영역(X) 중의 뉴클레오티드 수의 하한은, 예를 들면, 19, 바람직하게는 20이다. 이의 상한은, 예를 들면, 50, 바람직하게는 30, 보다 바람직하게는 25이다. 상기 영역(X) 중의 뉴클레오티드 수의 구체적 예는 19 내지 50, 바람직하게는 19 내지 30, 보다 바람직하게는 19 내지 25이다.
상기 영역(Xc) 중의 뉴클레오티드 수의 하한은, 예를 들면, 19, 바람직하게는 20이다. 이의 상한은, 예를 들면, 50, 바람직하게는 30, 보다 바람직하게는 25이다. 상기 영역(Xc) 중의 뉴클레이티드 수의 구체적 예는 19 내지 50, 바람직하게는 19 내지 30, 보다 바람직하게는 19 내지 25이다.
상기 발현 억제 서열을 함유하는 영역(X 또는 Xc)는 상기 발현 억제 서열 단독으로 구성될 수 있거나, 상기 발현 억제 서열을 함유할 수도 있다. 상기 발현 억제 서열 중의 뉴클레오티드 수는 상기 언급한 바와 같다. 상기 발현 억제 서열을 함유하는 영역은 상기 발현 억제 서열의 5'-측 및/또는 3'-측에 부가 서열을 추가로 가질 수 있다. 부가 서열은 상기 링커 영역(Lx) 측에 부가되는 것이 바람직하다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자가 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)를 5'-측으로부터 3'-측으로 이러한 순서로 갖는 경우, 상기 발현 억제 서열은 상기 영역(X) 내에 배치되는 것이 바람직하고, 이 경우에, 부가 서열은 상기 발현 억제 서열의 5'-측에 부가된다. 상기 부가 서열 중의 뉴클레오티드 수는, 예를 들면, 1 내지 31 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 21 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1 내지 11 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드이다.
상기 발현 억제 서열을 함유하는 영역(X 또는 Xc 중의 하나)이 상기 링커 영역(Lx) 측에 부가 서열을 갖는 경우, 상기 상보성 서열을 함유하는 영역(X 또는 Xc의 다른 하나)은 상기 링커 영역(Lx) 측에 당해 부가 서열과 상보성인 서열을 또한 함유한다.
상기 영역(X)의 뉴클레오티드 수(X)와 상기 영역(Xc)의 뉴클레오티드 수(Xc)의 관계는, 예를 들면, 하기 (1) 또는 (2)의 조건을 만족한다. 전자의 경우, 구체적으로, 예를 들면, 하기 (4)의 조건을 만족한다. 예를 들면, 도 1(B)에 모식적으로 제시된 핵산 분자는 하기 (1)의 조건을 만족하는 것이다:
[수학식 1]
X>Xc ···(1)
X-Xc=1 내지 10, 바람직하게는 1, 2 또는 3,
보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(4)
[수학식 2]
X=Xc ···(2)
상기 링커 영역(Lx)는 자체의 영역 내에서 자체-어닐링을 생성하지 않는 구조인 것이 바람직하다.
상기 링커 영역(Lx)가 상기 언급한 바와 같은 뉴클레오티드 잔기를 함유하는 경우, 이의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들면, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)가 이중쇄를 형성하는 것을 가능하게 하는 길이를 갖는 것이 바람직하다. 상기 링커 영역(Lx) 중의 뉴클레오티드 수의 하한은, 예를 들면, 1, 바람직하게는 2, 보다 바람직하게는 3이고, 이의 상한은, 예를 들면, 100, 바람직하게는 80, 보다 바람직하게는 50이다.
상기 핵산 분자의 전장은 특별히 제한되지 않는다. 상기 핵산 분자에서, 상기 뉴클레오티드 수의 합계(전장의 뉴클레오티드 수)의 하한은, 상기 링커 영역(Lx)가 뉴클레오티드 잔기를 함유하는 경우, 예를 들면, 38, 바람직하게는 42, 보다 바람직하게는 50, 추가로 바람직하게는 51, 특히 바람직하게는 52이고, 이의 상한은, 예를 들면, 300, 바람직하게는 200, 보다 바람직하게는 150, 추가로 바람직하게는 100, 특히 바람직하게는 80이다.
상기 핵산 분자에서, 상기 링커 영역(Lx)을 제외한 뉴클레오티드 수의 합계의 하한은, 예를 들면, 36, 바람직하게는 38이다. 이의 상한은, 예를 들면, 100, 바람직하게는 80, 보다 바람직하게는 60, 추가로 바람직하게는 50이다. 뉴클레오티드 수의 전장의 구체적 예는, 예를 들면, 36 내지 100, 바람직하게는 38 내지 80, 보다 바람직하게는 42 내지 60, 추가로 바람직하게는 42 내지 50이다.
보다 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 일본쇄 핵산 분자는 비-뉴클레오티드 구조의 상기 링커 영역(Lx)을 갖는다.
상기 비-뉴클레오티드 구조는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜, 피롤리딘 골격, 피페리딘 골격 등이 언급될 수 있다. 상기 폴리알킬렌 글리콜로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 언급할 수 있다.
상기 피롤리딘 골격으로서는, 예를 들면, 피롤리딘의 5-원 환을 구성하는 하나 이상의 탄소가 치환된 피롤리딘 유도체를 언급할 수 있다. 탄소가 치환되는 경우, 예를 들면, C-2 탄소 이외의 탄소 원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소는, 예를 들면, 질소, 산소 또는 황으로 치환될 수도 있다. 상기 피롤리딘 골격은 또한, 예를 들면, 피롤리딘의 5-원 환 내에, 예를 들면, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유할 수도 있다. 상기 피롤리딘 골격에서, 피롤리딘의 5-원 환을 구성하는 탄소 및 질소는, 예를 들면, 수소 또는 하기 치환체에 결합할 수 있다. 상기 링커 영역(Lx)은 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)에, 예를 들면, 상기 피롤리딘 골격의 임의의 그룹을 통해 결합할 수 있다. 이는 상기 5-원 환 중의 임의 하나의 탄소 원자 또는 질소, 바람직하게는 상기 5-원 환의 2-위치 탄소(C-2) 또는 질소이다. 상기 피롤리딘 골격의 예는 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 포함한다. 상기 프롤린 골격 및 프롤리놀 골격 등은 또한, 예를 들면, 생체내 물질 및 이의 환원체에 존재하는 물질이기 때문에, 안전성에서도 우수하다.
상기 피페리딘 골격으로서는, 예를 들면, 피페리딘의 6-원 환을 구성하는 하나 이상의 탄소가 치환되는 피페리딘 유도체의 골격을 언급할 수 있다. 탄소가 치환되는 경우, 예를 들면, C-2 탄소 이외의 탄소 원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소는, 예를 들면, 질소, 산소 또는 황으로 치환될 수 있다. 상기 피페리딘 골격은 또한, 예를 들면, 피페리딘의 6-원 환 내에, 예를 들면, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유할 수 있다. 상기 피페리딘 골격에서, 피페리딘의 6-원 환을 구성하는 탄소 및 질소는, 예를 들면, 수소 그룹 또는 후술하는 치환체에 결합할 수 있다. 상기 링커 영역(Lx)은 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)에, 예를 들면, 상기 피페리딘 골격의 임의의 그룹을 통해 결합할 수 있다. 이는 상기 6-원 환의 임의의 하나의 탄소 원자 또는 질소, 보다 바람직하게는 상기 6-원 환의 2-위치 탄소(C-2) 또는 질소이다.
상기 링커 영역은, 예를 들면, 상기 비-뉴클레오티드 구조를 갖는 비-뉴클레오티드 잔기 단독으로 구성될 수 있거나, 상기 비-뉴클레오티드 구조를 갖는 비-뉴클레오티드 잔기 및 뉴클레오티드 잔기를 함유할 수도 있다.
상기 링커 영역은, 예를 들면, 하기 화학식 I로 나타내어진다.
[화학식 I]
Figure pct00004
상기 화학식 I에서, 예를 들면,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이고;
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O 또는 S이고;
R3은 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환체이고,
L1은 n개의 원자로 이루어진 알킬렌 쇄이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나,
L1은 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄이고,
단, Y1이 NH, O 또는 S인 경우, L1에서 Y1에 결합하는 원자는 탄소이고, L1에서 OR1에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않고;
L2는 m개의 원자로 이루어진 알킬렌 쇄이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc로 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나,
L2는 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄이고,
단, Y2가 NH, O 또는 S인 경우, L2에서 Y2에 결합하는 원자는 탄소이고, L2에서 OR2에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않고;
Ra, Rb, Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 치환체 또는 보호 그룹이고;
l은 1 또는 2이고;
m은 0 내지 30 범위의 정수이고;
n은 0 내지 30 범위의 정수이고;
환 A에서, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자는 질소, 산소 또는 황으로 치환될 수 있고,
상기 환 A는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유할 수 있고,
상기 영역(Xc) 및 (X)는 각각 -OR1- 또는 -OR2-를 통해 상기 링커 영역(Lx)에 결합하고,
여기서, R1 및 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 이들이 존재하는 경우, R1 및 R2는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조(I)이다.
상기 화학식 I에서, 예를 들면, X1 및 X2는 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이다. 상기 화학식 I에서, "X1이 H2이다"는, X1이 결합하는 탄소 원자와 함께 X1이 CH2(메틸렌 그룹)를 형성하는 것을 의미한다. X2에 대해서도 동일하다.
상기 화학식 I에서, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O 또는 S이다.
상기 화학식 I에서, 환 A에서, l은 1 또는 2이다. l이 1인 경우, 환 A는 5-원 환, 예를 들면, 상기 피롤리딘 골격이다. 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들면, 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등이고, 이들의 2가의 구조가 예시된다. l이 2인 경우, 환 A는 6-원 환, 예를 들면, 상기 피페리딘 골격이다. 환 A에서, 환 A 상의 C-2 이외의 하나의 탄소 원자는 질소, 산소 또는 황으로 치환될 수 있다. 환 A는, 환 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유할 수 있다. 환 A는, 예를 들면, L형 또는 D형이다.
상기 화학식 I에서, R3은 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환체이다. R3가 상기 치환체인 경우, 치환체 R3은 1개 또는 복수개일 수 있거나 부재할 수 있고, 복수의 경우, 동일하거나 상이할 수 있다.
치환체 R3은, 예를 들면, 할로겐, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4 또는 옥소 그룹(=O) 등이다.
예를 들면, R4 및 R5는 각각 독립적으로 치환체 또는 보호 그룹이고, 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 치환체의 예는 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클릴알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 포함한다. 이하 동일하다. 치환체 R3은 이들 열거된 치환체일 수 있다.
상기 보호 그룹은, 예를 들면, 반응성이 높은 관능기를 불활성화시키는 관능기이다. 보호 그룹의 예는 공지된 보호 그룹을 포함한다. 상기 보호 그룹과 관련하여, 예를 들면, 문헌[참조: J.F.W. McOmie, "Protecting Groups in Organic Chemistry", Prenum Press, London and New York, 1973]의 기재를 본원에서 원용할 수 있다. 상기 보호 그룹은 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 3급-부틸디메틸실릴 그룹(TBDMS), 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸 그룹(ACE), 트리이소프로필실릴옥시메틸 그룹(TOM), 1-(2-시아노에톡시)에틸 그룹(CEE), 2-시아노에톡시메틸 그룹(CEM), 톨릴설포닐에톡시메틸 그룹(TEM), 및 디메톡시트리틸 그룹(DMTr)을 포함한다. R3가 OR4인 경우, 상기 보호 그룹은 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 TBDMS 그룹, ACE 그룹, TOM 그룹, CEE 그룹, CEM 그룹 및 TEM 그룹을 포함한다. 이하 동일하다.
상기 화학식 I에서, L1은 n개의 원자로 구성된 알킬렌 쇄이다. 상기 알킬렌 탄소 원자(들) 상의 수소 원자(들)는, 예를 들면, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 또는, L1은 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄일 수 있다. 상기 폴리에테르 쇄는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜이다. Y1이 NH, O 또는 S인 경우, L1 중의 Y1에 결합하는 원자는 탄소이고, L1 중의 OR1에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않는다. 즉, 예를 들면, Y1이 O인 경우, 이 산소 원자 및 L1 중의 산소 원자는 서로 인접하지 않고, OR1 중의 산소 원자 및 L1 중의 산소 원자는 서로 인접하지 않는다.
상기 화학식 I에서, L2는 m개의 원자로 구성된 알킬렌 쇄이다. 상기 알킬렌 탄소 원자(들) 상의 수소 원자(들)는, 예를 들면, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 또는, L2는 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄일 수 있다. Y2가 NH, O 또는 S인 경우, L2 중의 Y2에 결합하는 원자는 탄소이고, L2 중의 OR2에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않는다. 즉, 예를 들면, Y2가 O인 경우, 이 산소 원자 및 L2 중의 산소 원자는 서로 인접하지 않고, OR2 중의 산소 원자 및 L2 중의 산소 원자는 서로 인접하지 않는다.
L1의 n 및 L2의 m은 특별히 제한되지 않고, 이들 각각의 하한은, 예를 들면, 0일 수 있고, 이들의 상한은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, n 및 m은 상기 링커 영역(Lx)의 목적하는 길이에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 제조 비용, 수율 등의 관점에서, n 및 m은 각각 바람직하게는 0 내지 30, 보다 바람직하게는 0 내지 20, 및 보다 바람직하게는 0 내지 15이다. n 및 m은 동일(n=m)하거나 상이할 수 있다. n+m은, 예를 들면, 0 내지 30, 바람직하게는 0 내지 20, 및 보다 바람직하게는 0 내지 15이다.
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 예를 들면, 각각 독립적으로 치환체 또는 보호 그룹이다. 상기 치환체 및 상기 보호 그룹의 예는 상술한 것들과 동일하다.
상기 화학식 I에서, 수소 원자는, 예를 들면, 각각 독립적으로 할로겐, 예를 들면, Cl, Br, F 또는 I로 치환될 수 있다.
상기 영역(Xc) 및 (X)는 상기 링커 영역에 각각 -OR1- 또는 -OR2-를 통해 연결된다. R1 및 R2는 존재하거나 부재할 수 있다. R1 및 R2가 존재하는 경우, R1 및 R2는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 화학식 I로 나타내어지는 구조이다. R1 및/또는 R2가 상기 뉴클레오티드 잔기인 경우, 상기 링커 영역(Lx)은, 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 잔기 R1 및/또는 R2를 제외한 상기 화학식 I의 구조를 갖는 상기 비-뉴클레오티드 잔기, 및 상기 뉴클레오티드 잔기(들)로 구성된다. R1 및/또는 R2가 상기 화학식 I로 나타내어지는 구조인 경우, 상기 링커 영역(Lx)의 구조는, 예를 들면, 상기 화학식 I의 구조를 갖는 상기 비-뉴클레오티드 잔기가 2개 이상 서로 연결되는 구조이다. 상기 화학식 I의 구조의 수는, 예를 들면, 1, 2, 3 또는 4일 수 있다. 링커 영역(Lx)이 복수의 상기 구조를 포함하는 경우, 상기 화학식 I의 구조는 직접 연결되는 것이 바람직하다. 한편, R1 및 R2가 부재하는 경우, 상기 링커 영역(Lx)는 상기 화학식 I의 구조를 갖는 상기 비-뉴클레오티드 잔기 단독으로 구성된다.
상기 영역(Xc) 및 (X)와 상기 -OR1- 및 -OR2-와의 조합은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 하기 임의의 조건일 수 있다:
조건 (1):
상기 영역(Xc) 및 (X)는 각각 -OR2- 및 -OR1-을 통해 상기 화학식 I의 구조에 연결된다.
조건 (2)
상기 영역(Xc) 및 (X)는 각각 -OR1- 및 -OR2-를 통해 상기 화학식 I의 구조에 연결된다.
상기 화학식 I의 구조의 예는 하기 화학식 (I-1) 내지 (I-9)의 구조를 포함한다. 하기 화학식에서, n 및 m은 상기 화학식 I과 동일하다. 하기 화학식에서, q는 0 내지 10의 정수이다.
Figure pct00005
상기 화학식 (I-1) 내지 (I-9)에서, n, m 및 q는 특별히 제한되지 않고, 상기 기재된 바와 같다. 이의 구체적 예는 상기 화학식 (I-1)(n=8), 상기 화학식 (I-2)(n=3), 상기 화학식 (I-3)(n=4 또는 8), 상기 화학식 (I-4)(n=7 또는 8), 상기 화학식 (I-5)(n=3 및 m=4), 상기 화학식 (I-6)(n=8 및 m=4, n=5 및 m=4), 상기 화학식 (I-7)(n=8 및 m=4), 상기 화학식 (I-8)(n=5 및 m=4, n=8 및 m=4), 및 상기 화학식 (I-9)(q=1 및 m=4)이다. 상기 화학식 (I-4)의 한 가지 실시형태(n=8)은 하기 화학식 (I-4a)에 제시되어 있고, 상기 화학식 (I-6)의 한 가지 실시형태(n=5, m=4)는 하기 화학식 (I-6a)에 제시되어 있다.
[화학식 I-4a]
Figure pct00006
[화학식 I-6a]
Figure pct00007
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 하기 임의의 구조식을 갖는다.
(서열번호 23)
5'-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
(서열번호 24)
5'-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
(서열번호 25)
5'-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
(서열번호 26)
5'-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
(서열번호 27)
5'-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
(서열번호 28)
5'-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
(서열번호 29)
5'-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
(서열번호 30)
5'-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
(서열번호 31)
5'-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
(서열번호 32)
5'-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
(서열번호 33)
5'-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
상기 구조식에서, Lx는 임의의 상기 링커 영역이다. 바람직하게는, Lx는 상기 화학식 I의 구조, 보다 바람직하게는 상기 화학식 (I-1) 내지 (I-9)의 임의의 구조, 추가로 바람직하게는 상기 화학식 (I-4a) 또는 (I-6a)의 구조, 특히 바람직하게는 상기 화학식 (I-6a)의 구조를 갖는다.
이들 중에서, 서열번호 30 내지 32에 제시된 뉴클레오티드 서열로 구성된 일본쇄 핵산 분자가 특히 바람직하다.
본 발명의 핵산 분자의 구성 단위는 특별히 제한되지 않고, 뉴클레오티드 잔기를 언급할 수 있다. 상기 뉴클레오티드 잔기의 예는 리보뉴클레오티드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 변형되지 않은 것(비변형된 뉴클레오티드 잔기) 또는 변형된 것(변형된 뉴클레오티드 잔기)일 수 있다. 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기를 포함하도록 본 발명의 핵산 분자를 구성함으로써, 예를 들면, 뉴클레아제에 대한 핵산 분자의 내성을 향상시킬 수 있고, 이에 의해 핵산 분자의 안정성을 향상시킬 수 있다. 추가로, 본 발명의 핵산 분자는, 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 잔기 이외에, 비-뉴클레오티드 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에서, 상기 링커 이외의 영역 각각의 구성 단위는 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 잔기이다. 상기 영역 각각은, 예를 들면, 하기 잔기 (1) 내지 (3) 중의 어느 하나로 구성된다:
(1) 비변형된 뉴클레오티드 잔기(들)
(2) 변형된 뉴클레오티드 잔기(들)
(3) 비변형된 뉴클레오티드 잔기(들) 및 변형된 뉴클레오티드 잔기(들).
본 발명의 핵산 분자에서, 상기 링커 영역의 구성 단위는 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 상기 뉴클레오티드 잔기 및 상기 비-뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 상기 링커 영역은, 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 잔기 단독, 상기 비-뉴클레오티드 잔기 단독, 또는 상기 뉴클레오티드 잔기 및 상기 비-뉴클레오티드 잔기 둘 다로 구성될 수 있다. 상기 링커 영역은, 예를 들면, 하기 잔기 (1) 내지 (7) 중의 어느 하나로 구성된다:
(1) 비변형된 뉴클레오티드 잔기(들)
(2) 변형된 뉴클레오티드 잔기(들)
(3) 비변형된 뉴클레오티드 잔기(들) 및 변형된 뉴클레오티드 잔기(들)
(4) 비-뉴클레오티드 잔기(들)
(5) 비-뉴클레오티드 잔기(들) 및 변형된 뉴클레오티드 잔기(들)
(6) 비-뉴클레오티드 잔기(들) 및 변형된 뉴클레오티드 잔기(들)
(7) 비-뉴클레오티드 잔기(들), 비변형된 뉴클레오티드 잔기(들), 및 변형된 뉴클레오티드 잔기(들).
본 발명의 핵산 분자의 예는 상기 뉴클레오티드 잔기 단독으로 구성된 분자; 및 상기 뉴클레오티드 잔기 이외에 상기 비-뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자에서, 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 잔기는, 상기 기재된 바와 같이, 상기 비변형된 뉴클레오티드 잔기 단독; 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기 단독; 또는 상기 비변형된 뉴클레오티드 잔기(들) 및 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기(들) 둘 다일 수 있다. 상기 핵산 분자가 상기 비변형된 뉴클레오티드 잔기(들) 및 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기(들) 둘 다를 포함하는 경우, 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기(들)의 수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 내지 수개", 구체적으로, 예를 들면, 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4, 보다 바람직하게는 1 내지 3, 및 가장 바람직하게는 1 또는 2이다. 본 발명의 핵산 분자가 상기 비-뉴클레오티드 잔기(들)을 포함하는 경우, 상기 비-뉴클레오티드 잔기(들)의 수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 내지 수개", 구체적으로, 예를 들면, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1, 2 또는 3이다.
상기 핵산 분자가, 예를 들면, 상기 비변형된 리보뉴클레오티드 잔기 이외에 상기 변형된 리보뉴클레오티드 잔기(들)를 포함하는 경우, 상기 변형된 리보뉴클레오티드 잔기(들)의 수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 내지 수개", 구체적으로, 예를 들면, 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4, 보다 바람직하게는 1 내지 3, 및 가장 바람직하게는 1 또는 2이다. 상기 비변형된 리보뉴클레오티드 잔기와 대조적으로 상기 변형된 리보뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 리보스 잔기를 데옥시리보스 잔기로 치환시켜 수득한 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기일 수 있다. 상기 핵산 분자가, 예를 들면, 상기 비변형된 리보뉴클레오티드 잔기(들) 이외에 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기(들)를 포함하는 경우, 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기(들)의 수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 내지 수개", 구체적으로, 예를 들면, 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4, 보다 바람직하게는 1 내지 3, 및 가장 바람직하게는 1 또는 2이다.
본 발명의 핵산 분자는, 예를 들면, 표지 물질을 포함할 수 있고, 상기 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 형광 물질, 염료, 동위체 등일 수 있다. 상기 표지 물질의 예는, 예를 들면, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 염료 및 Cy5 염료 등의 형광단을 포함한다. 상기 염료의 예는 알렉사 488 등의 알렉사(Alexa) 염료를 포함한다. 상기 동위체의 예는 안정한 동위체 및 방사성 동위체를 포함한다. 이들 중에서, 안정한 동위체가 바람직하다. 예를 들면, 상기 안정한 동위체는 방사선 노출의 위험이 낮고 전용 시설을 필요로 하지 않는다. 따라서, 안정한 동위체는 취급성이 우수하고 비용 감소에 기여할 수 있다. 더욱이, 예를 들면, 상기 안정한 동위체는 이에 의해 표지된 화합물의 물성을 변화시키지 않고, 따라서 트레이서로서 우수한 성질을 갖는다. 상기 안정한 동위체는 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S 및 36S를 포함한다.
2. 일본쇄 핵산 분자를 구성하는 뉴클레오티드 잔기
상기 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 당, 염기 및 포스페이트를 이의 성분으로 포함한다. 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같은 리보뉴클레오티드 잔기 또는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기일 수 있다. 상기 리보뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 당으로서 리보스 잔기; 염기로서 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 또는 우라실(U)을 갖는다. 상기 데옥시리보스 잔기는, 예를 들면, 당으로서 데옥시리보스 잔기; 및 염기로서 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 또는 티민(T)을 갖는다.
상기 뉴클레오티드 잔기는 비변형된 뉴클레오티드 잔기 또는 변형된 뉴클레오티드 잔기일 수 있다. 상기 비변형된 뉴클레오티드 잔기의 상기 성분들은, 예를 들면, 천연-존재 뉴클레오티드 잔기의 성분과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 바람직하게는, 상기 성분은 인체에서 천연에 존재하는 뉴클레오티드 잔기의 성분과 동일하거나 실질적으로 동일하다.
상기 변형된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 상기 비변형된 뉴클레오티드 잔기를 변형시켜 수득한 뉴클레오티드 잔기이다. 예를 들면, 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기는, 상기 비변형된 뉴클레오티드 잔기의 임의 성분이 변형되도록 하는 것일 수 있다. 본 발명에서, "변형"은, 예를 들면, 상기 임의 성분의 치환, 부가 및/또는 결실; 및 상기 성분(들)에서 원자(들) 및/또는 관능기(들)의 치환, 부가 및/또는 결실을 의미한다. 이는 또한 "변형"으로 지칭될 수 있다. 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기의 예는 천연-존재 뉴클레오티드 잔기 및 인공-변형된 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 상기 천연-유래된 변형된 뉴클레오티드 잔기와 관련하여, 예를 들면, 문헌[참조: Limbach et al. (Limbach et al., 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res. 22: pp. 2183 to 2196)]을 참조할 수 있다. 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 상기 뉴클레오티드의 대체물의 잔기일 수 있다.
상기 뉴클레오티드 잔기의 변형의 예는 리보스-포스페이트 골격(이하 "리보포스페이트 골격"으로 지칭됨)의 변형을 포함한다.
상기 리보포스페이트 골격에서, 예를 들면, 리보스 잔기는 변형될 수 있다. 상기 리보스 잔기에서, 예를 들면, 2'-위치 탄소는 변형될 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, 2'-위치 탄소에 결합된 하이드록실 그룹은 수소 또는 불소 등의 할로겐으로 치환될 수 있다. 상기 2'-위치 탄소에 결합된 하이드록실 그룹을 수소로 치환함으로써 리보스 잔기를 데옥시리보스로 치환할 수 있다. 상기 리보스 잔기는, 예를 들면, 이의 입체이성체로 치환될 수 있고, 예를 들면, 아라비노즈 잔기로 치환될 수 있다.
상기 리보포스페이트 골격은, 예를 들면, 비-리보스 잔기를 갖는 비-리보포스페이트 골격 및/또는 비-포스페이트로 치환될 수 있다. 상기 비-리보포스페이트 골격은, 예를 들면, 비하전되도록 변형된 상기 리보포스페이트 골격일 수 있다. 상기 뉴클레오티드에서 리보포스페이트 골격을 상기 비-리보포스페이트 골격으로 치환시켜 수득한 대체물의 예는 모르폴리노, 사이클로부틸 및 피롤리딘을 포함한다. 상기 대체물의 다른 예는 인공 핵산 단량체 잔기를 포함한다. 이의 구체적 예는 PAN(펩티드 핵산), LNA(Locked 핵산) 및 ENA(2'-O,4'-C-에틸렌브릿지된 핵산)을 포함한다. 이들 중에서, PNA가 바람직하다.
상기 리보포스페이트 골격에서, 예를 들면, 포스페이트 그룹은 변형시킬 수 있다. 상기 리보포스페이트 골격에서, 당 잔기에 가장 인접하는 포스페이트 그룹은 "α-포스페이트 그룹"으로 불리운다. 상기 α-포스페이트 그룹은 음으로 하전되고, 전하는, 당 잔기에 연결되지 않은 2개의 산소 위에 균일하게 분포한다. 상기 α-포스페이트 그룹 중의 4개 산소 원자 중에서, 뉴클레오티드 잔기 사이의 포스포디에스테르 결합에서 당 잔기에 연결되지 않은 2개의 산소 원자는 이하 "비-결합 산소"로서 지칭된다. 한편, 상기 뉴클레오티드 잔기 사이의 포스포디에스테르 결합에서 당 잔기에 연결되는 2개의 산소 원자는 이하 "결합 산소"로서 지칭된다. 예를 들면, 상기 α-포스페이트 그룹은 하전되지 않도록 변형시키거나 상기 비-결합 산소 사이의 전하 분포를 비대칭적으로 되게 하도록 변형시키는 것이 바람직하다.
상기 포스페이트 그룹에서, 예를 들면, 상기 비-결합 산소(들)는 치환될 수 있다. 상기 산소(들)는, 예를 들면, S(황), Se(셀레늄), B(붕소), C(탄소), H(수소), N(질소) 및 OR(R은 알킬 그룹 또는 아릴 그룹이다)로부터 선택된 임의의 원자로 치환될 수 있고, S에 의한 치환이 바람직하다. 상기 비-결합 산소는, 예를 들면, 둘 다 치환되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 비-결합 산소 둘 다가 S로 치환된다. 상기 변형된 포스페이트 그룹의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 특히, 상기 2개의 비-결합 산소 둘 다가 S로 치환되는 포스포로디티오에이트가 바람직하다.
상기 포스페이트 그룹에서, 예를 들면, 상기 결합 산소(들)는 치환될 수 있다. 상기 산소(들)는, 예를 들면, S(황), C(탄소) 및 N(질소)로부터 선택된 임의의 원자로 치환될 수 있다. 상기 변형된 포스페이트 그룹의 예는 N에 의한 치환으로부터 발생하는 브릿지된 포스포로아미데이트; 치환 S로부터 발생하는 브릿지된 포스포로티오에이트; 및 치환 C로부터 발생하는 브릿지된 메틸렌포스포네이트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 결합 산소(들)의 치환은, 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자의 적어도 하나의 5'-말단 뉴클레오티드 잔기 및 3'-말단 뉴클레오티드 잔기에서 수행된다. 치환이 5'-측에서 수행되는 경우, C에 의한 치환이 바람직하다. 치환이 3'-측에서 수행되는 경우, N에 의한 치환이 바람직하다.
상기 포스페이트 그룹은, 예를 들면, 상기 포스페이트-비함유 링커로 치환될 수 있다. 상기 링커는 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조, 메틸렌옥시메틸이미노 등을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 메틸렌카보닐아미노 그룹 및 메틸렌메틸이미노 그룹을 함유할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에서, 3'-말단의 뉴클레오티드 잔기 및 5'-말단의 뉴클레오티드 잔기 중의 적어도 하나는 변형될 수 있다. 예를 들면, 3'-말단 및 5'-말단 중의 어느 하나에서 뉴클레오티드 잔기는 변형될 수 있거나, 3'-말단 및 5'-말단 둘 다에서 뉴클레오티드 잔기는 변형될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같고, 말단(들)에서 포스페이트 그룹(들)을 변형시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 전체 상기 포스페이트 그룹은 변형될 수 있거나, 상기 포스페이트 그룹 중의 하나 이상의 원자가 변형될 수 있다. 전자의 경우, 예를 들면, 전체 포스페이트 그룹이 치환되거나 결실될 수 있다.
말단(들)에서 상기 뉴클레오티드 잔기(들)의 변형은, 예를 들면, 임의의 기타 분자의 부가일 수 있다. 상기 기타 분자의 예는 상기한 바와 같은 표지 물질 및 보호 그룹 등의 기능성 분자를 포함한다. 상기 보호 그룹의 예는 S(황), Si(규소), B(붕소) 및 에스테르-함유 그룹을 포함한다. 상기 표지 물질 등의 기능성 분자는, 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자의 검출 등에 사용될 수 있다.
상기 기타 분자는, 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 잔기의 포스페이트 그룹에 부가될 수 있거나, 스페이서를 통해 상기 포스페이트 그룹 또는 상기 당 잔기에 부가될 수 있다. 예를 들면, 상기 스페이서 그룹의 말단 원자는 상기 포스페이트 그룹의 상기 결합 산소 또는 당 잔기의 O, N, S 또는 C 중의 어느 하나에 부가 또는 치환될 수 있다. 상기 당 잔기 중의 결합 부위는, 예를 들면, 3'-위치의 C, 5'-위치의 C 또는 이들에 결합된 임의의 원자가 바람직하다. 예를 들면, 상기 스페이서는 또한 PNA 등의 상기 뉴클레오티드 대체물의 말단 원자에 부가 또는 치환될 수 있다.
상기 스페이서는 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH, 비염기성 당, 아미드, 카복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에테르, 디설파이드, 티오우레아, 설폰아미드 및 모르폴린 및 또한 비오틴 시약 및 형광 시약을 포함한다. 상기 화학식에서, n은 양의 정수이고, n=3 또는 6이 바람직하다.
말단에 부가되는 상기 분자의 다른 예는 염료, 인터칼레이트제(예: 아크리딘), 가교결합제(예: 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예: 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예: EDTA), 친유성 담체(예: 콜레스테롤, 콜린산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 그룹, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 그룹, 팔미트산, 미리스트산, 03-(올레오일)리토콜린산, 03-(올레오일)콜린산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사티인), 펩티드 복합체(예: 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예: PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사선표지된 마커, 효소, 합텐(예: 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예: 아스피린, 비타민 E, 엽산), 및 합성 리보뉴클레아제(예: 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 복합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체)를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자에서, 상기 5'-말단은, 예를 들면, 인산 그룹 또는 인산 그룹 유사체에 의해 변형될 수 있다. 상기 인산 그룹의 예는 5'-모노포스페이트((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비-메틸화, 7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp); 임의의 변형되거나 비변형된 뉴클레오티드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트: (HO)2(S)P-O-5'); 5'-디티오포스페이트(포스포로디티오에이트: (HO)(HS)(S)P-O-5'); 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P-S-5'); 황 치환된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트(예: 5'-α-티오트리포스페이트, 5'-γ-티오트리포스페이트 등); 5'-포스포르아미데이트((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'); 5'-알킬포스포네이트(예: RP(OH)(O)-O-5', (OH)2(O)P-5'-CH2, 여기서 R은 알킬(예: 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등)이다); 및 5'-알킬에테르포스포네이트(예: RP(OH)(O)-O-5', 여기서 R은 알킬에테르(예: 메톡시메틸, 에톡시메틸 등)이다)를 포함한다.
상기 뉴클레오티드 잔기에서, 상기 염기는 특별히 제한되지 않는다. 상기 염기는, 예를 들면, 천연 염기 또는 비-천연 염기일 수 있다. 상기 염기는, 예를 들면, 천연-유래 염기 또는 합성 염기일 수 있다. 상기 염기로서는, 예를 들면, 통상의 염기, 이의 변형된 유사체 등이 사용될 수 있다.
상기 염기의 예는 퓨린 염기, 예를 들면, 아데닌 및 구아닌; 및 피리미딘 염기, 예를 들면, 시토신, 우라실 및 티민을 포함한다. 상기 염기의 기타 예는 이노신, 티민, 크산틴, 하이포크산틴, 누불라린, 이소구아니신 및 투베르시딘을 포함한다. 상기 염기의 예는 또한 2-아미노아데닌, 알킬 유도체, 예를 들면, 6-메틸화 퓨린; 알킬 유도체, 예를 들면, 2-프로필화 퓨린; 5-할로우라실 및 5-할로시토신; 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신; 6-아조우라실, 6-아조시토신 및 6-아조티민; 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노알릴우라실; 8-할로겐화, 아민화, 티올화, 티오알킬화, 하이드록실화 및 기타 8-치환된 퓨린; 5-트리플루오로메틸화 및 기타 5-치환된 피리미딘; 7-메틸구아닌; 5-치환된 피리미딘; 6-아자피리미딘; N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린(2-아미노프로필아데닌 포함); 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신; 디하이드로우라실; 3-데아자-5-아자시토신; 2-아미노퓨린; 5-알킬우라실; 7-알킬구아닌; 5-알킬시토신; 7-데아자아데닌; N6,N6-디메틸아데닌; 2,6-디아미노퓨린; 5-아미노-알릴-우라실; N3-메틸우라실; 치환된 1,2,4-트리아졸; 2-피리디논; 5-니트로인돌; 3-니트로피롤; 5-메톡시우라실; 우라실-5-옥시아세트산; 5-메톡시카보닐메틸우라실; 5-메틸-2-티오우라실; 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우라실; 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실; 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우라실; 3-메틸시토신; 5-메틸시토신; N4-아세틸시토신; 2-티오시토신; N6-메틸아데닌; N6-이소펜틸아데닌; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌; N-메틸구아닌; 및 O-알킬화 염기를 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 예는 미국 특허 제3,687,808호 및 문헌[참조: "Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering", pp. 858 to 859, edited by Kroschwitz J. I, John Wiley & Sons, 1990, and Englisch et al, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, vol. 30, p. 613]에 기재된 것들을 포함한다.
상기 변형된 뉴클레오티드 잔기의 다른 예는 염기를 갖지 않는 것들, 즉 무염기성 리보포스페이트 골격을 갖는 것들을 포함한다. 추가로, 상기 변형된 뉴클레오티드 잔기로서는, 예를 들면, 미국 가출원 제60/465,665호(출원일: April 25, 2003) 및 국제 특허 출원 제PCT/US04/07070호(출원일: March 8, 2004)에 기재된 것들을 사용할 수 있고, 이들 문헌은 참조로서 본원에 원용된다.
3. 본 발명의 핵산 분자의 합성 방법
본 발명의 핵산 분자를 합성하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 통상 공지된 방법을 사용할 수 있다. 상기 합성 방법의 예는 유전자 공학적 수법에 따르는 합성 방법 및 화학적 합성 방법을 포함한다. 유전자 공학적 수법의 예는 시험관내 전사를 이용하는 합성 방법; 벡터를 사용하는 방법; PCR 카세트를 사용하여 수행된 방법 등을 포함한다. 상기 벡터는 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 플라스미드 등의 비-바이러스 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 화학적 합성 방법은 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 포스포르아미다이트 방법 및 H-포스포네이트 방법을 포함한다. 상기 화학적 합성 방법은, 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 자동화 핵산 합성기를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 화학적 합성 방법에서, 아미다이트가 일반적으로 사용된다. 상기 아미다이트는 특별히 제한되지 않는다. 상업적으로 이용가능한 아미다이트의 예는 RNA 포르포르아미다이트(2'-O-TBDMSi, 상표명, Samchully Pharm. Co., Ltd.), ACE 아미다이트 및 TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, 및 TEM 아미다이트 등을 포함한다.
4. 발현 벡터
본 발명의 핵산 분자가 비-변형된 리보뉴클레오티드 잔기 만으로 구성되는 경우, 이는 핵산 분자의 전구체로서 핵산 분자를 발현가능한 상태로 코딩하는 벡터(본 발명의 발현 벡터)의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 상기 핵산 분자를 코딩하는 DNA를 표적 세포 내에 기능적 프로모터의 조절하에 특징적으로 함유한다. 본 발명의 발현 벡터는 상기 DNA와 기능적으로 연결된 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하고, 기타 구성은 제한되는 것은 아니다. 상기 DNA를 삽입하는 벡터는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 일반적 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다. 상기 비-바이러스 벡터는, 예를 들면, 플라스미드 벡터이다. 발현 벡터를 자체 공지된 유전자 도입 방법을 사용하여 표적 세포(상기 프로레닌 유전자 및 프로레닌 수용체 유전자를 갖는 세포) 내로 도입함으로써 세포 내에서 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
5. 발현 억제제
본 발명의 발현 억제제는 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 제제이고, 본 발명의 상기 핵산 분자를 활성 성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 억제제는, 예를 들면, 상기 프로레닌 유전자 및 프로레닌 수용체 유전자가 존재하는 대상에게 상기 핵산 분자를 단독으로 또는 약리학적으로 허용되는 담체와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 상기 투여 단계는, 예를 들면, 상기 핵산 분자를 상기 투여 대상체와 접촉시킴으로써 수행된다. 상기 투여 대상체의 예는 또한 인간, 비인간 동물, 예를 들면, 비인간 포유동물, 즉 인간을 제외한 포유동물의 세포, 조직 및 기관을 포함한다. 상기 투여는, 예를 들면, 생체내 또는 시험관내에서 수행할 수 있다.
6. 안과 질환을 위한 치료제
프로레닌-프로레닌 수용체는 조직 RAS 활성화 및 RAS-독립적 세포내 신호전달 활성화의 상이한 2개 작용(포괄적으로 「수용체-연관 프로레닌 시스템(RAPS)」로서 지칭됨)을 통해 안 조직에서 염증 및 혈관신생에 깊게 관여한다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자를 활성 성분으로 함유하는 의약은 RAPS를 억제하기 때문에 RAPS가 관여하는 안과 질환(예를 들면, 당뇨병 망막증, 포도막염, 연령-관련 황반 변성 등)의 치료에 효과적이다. 또한, 본 발명의 핵산 분자를 활성 성분으로 함유하는 의약은 당뇨병 망막증, 포도막염, 연령-관련 황반 변성 또는 녹내장의 치료에 효과적이다. 여기서 "치료"는 질환의 예방 및 발증 지연, 질환의 개선, 및 예후의 개선을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 의약으로서는, 유효량의 본 발명의 핵산 분자를 단독으로 사용할 수 있거나, 또한 임의의 담체, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체의 예는 당, 전분 등의 부형제, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈 등의 결합제, 전분, 카복시메틸셀룰로즈 등의 붕해제, 마그네슘 스테아레이트, 아에로겔 등의 윤활제, 시트르산, 멘톨 등의 방향제, 나트륨 벤조에이트, 아황산나트륨 등의 보존제, 시트르산, 나트륨 시트레이트 등의 안정화제, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리식염수 등의 희석제, 베이스 왁스 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
표적 세포 내로 본 발명의 핵산 분자의 도입을 촉진하기 위해, 본 발명의 약제는 핵산 도입용 시약을 추가로 포함할 수 있다. 핵산 도입용 시약으로서는 아텔로콜라겐, 리포좀; 나노입자; 리포펙틴, 리포펙타민, DOGS(트랜스펙탐), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, 폴리브렌 또는 폴리(에틸렌이민)(PEI) 등의 양이온성 지질 등을 사용할 수 있다.
한 가지 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약제는, 본 발명의 핵산 분자가 리포좀 내에 캡슐화된 약제학적 조성물일 수 있다. 리포좀은 하나 이상의 지질 이중층에 의해 포위된 내부 상을 갖는 미세 폐쇄 소포이고, 통상 수용성 물질을 내부 상 내에 및 지용성 물질을 지질 이중층 내에 보유할 수 있다. 본원에서, 용어 "캡슐화된"이 사용되는 경우, 본 발명의 핵산 분자는 리포좀의 내부 상 내에 또는 지질 이중층 내에 보유될 수 있다. 본 발명에 사용되는 리포좀은 단층 필름 또는 다층 필름일 수 있다. 리포좀의 입자 크기는, 예를 들면, 10 내지 1000nm, 바람직하게는 50 내지 300nm의 범위 내에서 적절히 선택할 수 있다. 표적 조직으로의 전달 효율을 고려하여, 입자 크기는, 예를 들면, 200nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하일 수 있다.
핵산 등의 수용성 화합물을 리포좀 내로 캡슐화하는 방법은 지질 필름 방법(vortex 방법), 역상 증발 방법, 계면활성제 제거 방법, 동결-해동 방법, 리모트 로딩 방법 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않고, 임의의 공지된 방법을 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 약제는 포유동물의 눈에 국소 투여할 수 있다. 특히, 눈에 주입하는 것이 바람직하다.
안 국소 투여에 적합한 제제는 점안제(수성 점안제, 비-수성 점안제, 점안 현탁제, 점안 에멀젼 등), 연고제, 로션제, 크림제 등을 포함한다. 본 발명의 제제가 점안제인 경우, 기제를 적절히 사용할 수 있다. 점안제용으로 사용되는 기제는 인산염 완충액, 행크 완충액, 생리식염수, 관류액, 인공 누액 등을 포함한다.
본 발명의 약제가 안 국소 투여용 제제인 경우, 예를 들면, 완충제, 등장화제, 가용화제, 방부제, 점성 기제, 킬레이트제, 청량제, pH 조절제, 항산화제 등을 적절히 선택하여 첨가할 수 있다.
완충제의 예는 인산염 완충제, 붕산 완충제, 시트레이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 아미노산 등을 포함한다.
등장화제의 예는 솔비톨, 글루코즈, 만니톨 등의 당류, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 등의 다가 알콜, 염화나트륨 등의 염, 붕산 등을 포함한다.
가용화제의 예는 솔비탄 폴리옥시에틸렌 모노올레에이트(예: 폴리솔베이트 80), 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 타일옥사폴, 풀루론산 등의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤, 마크로골 등의 다가 알콜 등을 포함한다.
방부제의 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 세틸 피리디늄 클로라이드 등의 4급 암모늄 염, 메틸 p-하이드록시벤조에이트, 에틸 파라하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 부틸 p-하이드록시벤조에이트 등의 파라옥시벤조에이트, 벤질 알콜, 소르브산 및 이의 염(나트륨 염, 칼륨 염 등), 티메로살(상표명), 클로로부탄올, 나트륨 데하이드로아세테이트 등을 포함한다.
점성 기제의 예는 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(비닐 알콜) 등의 수용성 고분자, 하이드록시에틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 등의 셀룰로즈 등을 포함한다.
킬레이트제의 예는 나트륨 에데테이트, 시트르산 등을 포함한다.
청량제의 예는 1-멘톨, 보르네올, 캄포르, 유칼립투스 오일 등을 포함한다.
pH 조절제의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 붕산 또는 이의 염(borax), 염산, 시트르산 또는 이의 염(나트륨 시트레이트, 나트륨 디하이드로겐 시트레이트 등), 인산 또는 이의 염(인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨 등), 아세트산 또는 이의 염(나트륨 아세테이트, 암모늄 아세테이트 등), 타르타르산 또는 이의 염(나트륨 타르트레이트 등) 등을 포함한다.
항산화제의 예는 아황산나트륨, 건조 아황산나트륨, 피로아황산나트륨, 혼합 토코페롤 농축물 등을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물 중의 본 발명의 핵산 분자의 함유량은, 예를 들면, 전체 약제학적 조성물의 약 0.1 내지 100wt%이다.
본 발명의 약제학적 조성물이 리포좀 제제인 경우, 피로좀 구성성분에 대한 본 발명의 핵산 분자의 몰 비는 일반적으로 1/100,000 내지 1/10,000이다. 리포좀 제제 내에 함유된 본 발명의 핵산 분자를 캡슐화하는 리포좀의 함유량은, 리포좀 입자가 응집하지 않고 충분한 효력이 발휘될 수 있는 양이면 특별히 제한되지 않고, 통상 10 내지 100mM이다.
본 발명의 약제의 용량은, 투여 목적, 투여 방법, 안 표면 질환의 종류, 병변 크기, 투여 대상체의 상황(성별, 연령, 체중 등)에 따라 상이하다. 본 발명의 약제가 성인의 눈에 주입되는 경우, 통상 본 발명의 핵산의 단일 용량으로서 통상 0.01 내지 1000㎍, 바람직하게는 0.05 내지 100㎍, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50㎍를 1일 1회 내지 10회, 바람직하게는 5 내지 10회 투여하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명은 실시예 등에 의해 상세히 기재될 것이다. 그러나, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아님에 유의해야 한다.
[실시예]
(실시예 1) HCC1954 세포에서 일본쇄 핵산 분자에 의한 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자 발현 억제 효과
(1) 일본쇄 핵산 분자의 합성
하기 제시된 일본쇄 핵산 분자를, 포스포르아미다이트 방법에 기초하여 ABI3900 핵산 합성기(상품명, Applied Biosystems)에 의해 합성했다. 상기 합성법에서, EMM 아미다이트(WO 2013/027843)를 RNA 아미다이트로서 사용했다(이하 동일). 상기 아미다이트는 통상의 방법에 의해 탈보호시켰다. 합성된 일본쇄 핵산 분자는 HPLC에 의해 정제하고, 각각 동결-건조시켰다.
일본쇄 핵산 분자로서, 상기 서열번호 1 내지 5에 제시된 프로레닌 유전자 발현 억제 서열을 갖는 일본쇄 핵산 분자(PH-0001-h-p, PH-0002-h-p, PH-0003-h-p, PH-0004-h-p, PH-0005-h-p), 및 상기 서열번호 6 내지 11에 제시된 프로레닌 수용체 유전자 발현 억제 서열을 갖는 일본쇄 핵산 분자(PH-0001-hmr-pr, PH-0002-hmr-pr, PH-0001-hm-pr, PH-0002-hm-pr, PH-0003-hm-pr, PH-0001-h-pr)를 각각 상기 언급한 바와 같이 합성했다. 각각의 일본쇄 핵산 분자에서, Lx는 링커 영역 Lx이고, L-프롤린 디아미드 아미다이트를 사용하여 하기 구조식을 수득했다. 각각의 서열에서, 하선부는 인간 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자 발현 억제 서열이다.
PH-0001-h-p (서열번호 23)
5'-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
PH-0002-h-p (서열번호 24)
5'-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
PH-0003-h-p (서열번호 25)
5'-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
PH-0004-h-p (서열번호 26)
5'-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
PH-0005-h-p (서열번호 27)
5'-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
PH-0001-hmr-pr (서열번호 28)
5'-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
PH-0002-hmr-pr (서열번호 29)
5'-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
PH-0001-hm-pr (서열번호 30)
5'-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
PH-0002-hm-pr (서열번호 31)
5'-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
PH-0003-hm-pr (서열번호 32)
5'-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
PH-0001-h-pr (서열번호 33)
5'-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
Figure pct00008
(2) 프로레닌 유전자 및 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 측정
상기 각각의 일본쇄 핵산 분자를 20μmol/L로 되도록 주사용 증류수(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)에 용해시켰다.
세포로서는 HCC1954 세포(ATCC)를 사용했다. 배지로서는 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640(Invitrogen)을 사용했다. 배양 조건은 37℃, 5% CO2였다.
우선, 세포를 24-웰 플레이트에 1×104 세포/400μL 배지/웰로 파종하고, 24시간 동안 배양했다. 이어서, 세포는 형질감염 시약 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 상기 형질감염 시약에 부착된 프로토콜에 따라 상기 일본쇄 핵산 분자로 형질감염시켰다. 구체적으로, 형질감염은 다음과 같이 웰당 조성물을 설정하여 수행했다. 하기 조성물에서, (A)는 상기 형질감염 시약이고, (B)는 Opti-MEM(Invitrogen)이고, (C)는 상기 언급된 20μmol/L 일본쇄 핵산 분자 용액이다. 상기 웰 중의 상기 일본쇄 핵산 분자의 최종 농도는 10nmol/L로 설정했다.
[표 1]
(웰당 조성: μL)
배양된 브로쓰 400
(A) + (B) 50
(B) + (C) 50
500
형질감염 후, 상기 웰 중의 세포를 24시간 동안 배양하고, 이어서 ISOGENII(NIPPON GENE)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 RNA를 수집했다. 이어서, Transcription First Strand cDNA 합성 키트(Roche)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 상기 RNA로부터 cDNA를 합성했다. 이어서, 하기 제시된 바와 같이, 상기 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하고, 프로레닌 유전자의 발현 양, 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양 및 내부 표준인 GAPDH 유전자의 발현 양을 측정했다. 상기 프로레닌 유전자의 발현 양 및 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양은 상기 GAPDH 유전자의 발현 양에 의해 보정했다.
상기 PCR은 시약으로서 LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche) 및 장치로서 LightCycler 480(Roche)을 사용하여 수행했다. 상기 프로레닌 유전자, 프로레닌 수용체 유전자 및 GAPDH 유전자는 각각 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다.
프로레닌 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 34) 5'-GCTTTCTCAGCCAGGACATC-3'
(서열번호 35) 5'-TGGGAGATGATGTTGTCGAA-3'
프로레닌 수용체 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 36) 5'-TCGTACCCTTTGGAGAATGC-3'
(서열번호 37) 5'-GAGCCAACTGCAAAACAACA-3'
GAPDH 유전자를 위한 프라이머 세트
(서열번호 38) 5'-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3'
(서열번호 39) 5'-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3'
대조군으로서, 상기 일본쇄 핵산 분자 용액(C)를 첨가하지 않고 상기 (A) 및 상기 (B)를 (A) 및 (B)의 합계가 100μL로 되도록 첨가한 것을 제외하고는 상기와 동일한 형질감염 수법으로 처리한 세포에 관하여, 유전자의 발현 양을 또한 측정했다(mock).
보정 후의 프로레닌 유전자의 발현 양 및 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양에 대하여, 대조군(mock)의 세포에서 발현 양을 1로 하여 각 일본쇄 핵산 분자를 도입한 세포에서의 상대치를 측정했다.
(3) 결과
프로레닌 유전자 발현 양의 측정 결과는 도 2에 제시되어 있고, 프로레닌 수용체 유전자 발현 양의 측정 결과는 도 3에 제시되어 있다. 본 발명의 일본쇄 핵산 분자는 강력한 유전자 발현 억제 활성을 나타냈다.
(실시예 2) 프로레닌 수용체 유전자의 발현에 대한 억제 효과
인간, 마우스 또는 랫트 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제 서열을 갖는 서열번호 28 및 29에 제시된 일본쇄 핵산 분자, 및 인간 또는 마우스 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제 서열을 갖는 서열번호 30 내지 32에 제시된 일본쇄 핵산 분자에 대해 인간, 마우스 및 랫트로부터 유래된 배양 세포에서 프로레닌 수용체 유전자의 발현에 대한 억제 효과를 확인했다.
(1) 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 측정
세포로서는 인간-유래된 hTERT-RPE 세포(ATCC), 마우스-유래된 Neuro-2a 세포(ECACC), 랫트 Rat-1 세포(ATCC)를 사용했다. 각 배지로서는 각각 10% FBS를 함유하는 DMEM/F12, E-MEM, DMEM 배지(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 사용했다. 배양 조건은 37℃, 5% CO2였다.
우선, 세포를 96-웰 플레이트에 1×104 세포/80μL 배지/웰로 파종하고, 24시간 동안 배양했다. 이어서, 형질감염 시약 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 상기 형질감염 시약에 부착된 프로토콜에 따라 세포를 상기 일본쇄 핵산 분자로 형질감염시켰다. 구체적으로, 형질감염은 다음과 같이 웰당 조성을 설정하여 수행했다. 하기 조성에서, (A)는 상기 형질감염 시약이고, (B)는 Opti-MEM(Invitrogen)이고, (C)는 상기 언급한 20μmol/L 일본쇄 핵산 분자 용액이다. 상기 웰 중의 상기 일본쇄 핵산 분자의 최종 농도는 0.5nmol/L로 설정했다.
[표 2]
(웰당 조성: μL)
배양된 브로쓰 80
(A) + (B) 10
(B) + (C) 10
100
형질감염 후, 상기 웰 중의 세포를 24시간 동안 배양하고, SuperPrep Cell Lysis & RT(TOYOBO)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 cDNA를 RNA로부터 합성했다. 이어서, 하기 제시된 바와 같이, 상기 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하고, 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양 및 내부 표준 HPRT1 유전자의 발현 양을 측정했다. 상기 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양은 상기 언급한 HPRT1 유전자의 발현 양에 의해 보정했다.
상기 PCR에서, 시약으로서 GoTaq qPCR Master Mix(Promega)를 사용했고, 장치로서 StepOne Plus(Life Techonologies)를 사용했다. 프로레닌 수용체 유전자 및 HPRT1 유전자는 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다.
인간 프로레닌 수용체 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 40) 5'-AGGCAGTGTCATTTCGTACC-3'
(서열번호 41) 5'-GCCTTCCCTACCATATACACTC-3'
HPRT1 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 42) 5'-ACCCCACGAAGTGTTGGATA-3'
(서열번호 43) 5'-AAGCAGATGGCCACAGAACT-3'
마우스 프로레닌 수용체 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 44) 5'-TGGTCGTTCTCCTGTTCTTTC-3'
(서열번호 45) 5'-ACCCTGGCGATCTTAATATGC-3'
마우스 HPRT1 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 46) 5'-CAAACTTTGCTTTCCCTGGT-3'
(서열번호 47) 5'-CAAGGGCATATCCAACAACA-3'
랫트 프로레닌 수용체 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 48) 5'-TGTGGGCAACCTATTCCACC-3'
(서열번호 49) 5'-AGCTGACGCAATGTGACTGA-3'
랫트 HPRT1 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 50) 5'-GCAGACTTTGCTTTCCTTGG-3'
(서열번호 51) 5'-TCCACTTTCGCTGATGACAC-3'
대조군으로서, 상기 RNA 용액(C)을 첨가하지 않고 상기 (A) 및 (B)를 (A) 및 (B)의 합계가 20μL로 되도록 첨가한 것을 제외하고는 상기와 동일한 형질감염 수법으로 처리한 세포에 대하여, 유전자의 발현 양을 또한 측정했다(mock).
보정된 프로레닌 유전자의 발현 양에 대하여, 대조군(mock)의 세포에서의 발현 양을 1로 하여 각 일본쇄 핵산 분자를 도입한 세포에서의 발현 양을 측정했다.
(2) 결과
인간 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 측정 결과는 도 4에 제시되어 있고, 마우스 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 결과는 도 5에 제시되어 있고, 랫트 프로레닌 수용체 유전자의 발현 양의 측정 결과는 도 6에 제시되어 있다. 각 세포에서, 본 발명의 일본쇄 핵산 분자는 강력한 유전자 발현 억제 효과를 나타냈다.
(실시예 3) 프로레닌 유전자의 발현에 대한 억제 효과
인간 프로레닌 유전자의 발현 억제 서열을 갖는 서열번호 23 내지 27에 제시된 일본쇄 핵산 분자에 대해 인간-유래된 배양 세포에서 프로레닌 유전자에 대한 발현 억제 효과를 확인했다.
(1) 프로레닌 유전자의 발현 양의 측정
세포로서는 인간-유래된 hTERT-RPE 세포(ATCC)를 사용했다. 배지로서는 10% FBS를 함유하는 DMEM/F12를 사용했다. 배양 조건은 37℃, 5% CO2였다.
우선, 세포를 24-웰 플레이트에서 2×104 세포/400μL 배지/웰로 파종하고, 24시간 동안 배양했다. 이어서, 형질감염 시약 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)을 사용하여 상기 형질감염 시약에 부착된 프로토콜에 따라 세포를 상기 일본쇄 핵산 분자로 형질감염시켰다. 구체적으로, 형질감염은 웰당 조성을 다음과 같이 설정함으로써 수행했다. 하기 조성에서, (A)는 상기 형질감염 시약이고, (B)는 Opti-MEM(Invitrogen)이고, (C)는 상기 언급된 20μmol/L 일본쇄 핵산 분자 용액이다. 상기 웰 중의 상기 일본쇄 핵산 분자의 최종 농도는 0.5nmol/L로 설정했다.
[표 3]
(웰당 조성: μL)
배양 브로쓰 400
(A) + (B) 50
(B) + (C) 50
500
형질감염 후, 상기 웰 중의 세포를 24시간 동안 배양하고, ISOGENII(NIPPON GENE)를 사용하여 부착된 프로토콜에 따라 RNA를 수집했다. 이어서, GoScript Reverse Transcriptase Kit(Promega)를 사용하여 부착된 프로토콜에 따라 상기 RNA로부터 cDNA를 합성했다. 이어서, 하기 제시된 바와 같이, 주형으로서 상기 합성된 cDNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 프로레닌 유전자의 발현 양 및 내부 표준으로서 HPRT1 유전자의 발현 양을 측정했다. 프로레닌 유전자의 상기 발현 양은 상기 HPRT1 유전자의 발현 양에 의해 보정했다.
상기 PCR에서, 시약으로서 GoTaq qPCR Master Mix(Promega) 및 THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(TOYOBO)를 사용했고, 장치로서 StepOne Plus(Life Techonologies)를 사용했다. 상기 프로레닌 유전자의 발현 양을 측정하기 위해, Taqman Assay(Life Techonologies)를 사용했고, HPRT1 유전자는 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다.
인간 HPRT1 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 42) 5'-ACCCCACGAAGTGTTGGATA-3'
(서열번호 43) 5'-AAGCAGATGGCCACAGAACT-3'
대조군으로서, 상기 일본쇄 핵산 분자 용액(C)을 첨가하지 않고 상기 (A) 및 상기 (B)를 (A) 및 (B)의 합계 양이 100μL로 되도록 첨가한 것을 제외하고는 상기와 동일한 형질감염 수법으로 처리한 세포에 대하여, 유전자의 발현 양을 또한 측정했다(mock).
보정후 프로레닌 유전자의 발현 양에 대해, 대조군(mock)의 세포에서의 발현 양을 1로 하여 각각의 일본쇄 핵산 분자를 도입한 세포에서의 발현 양의 상대치를 측정했다.
(2) 결과
결과는 도 7에 제시되어 있다. 본 발명의 일본쇄 핵산 분자는 강력한 유전자 발현 억제 효과를 나타냈다.
(실시예 4) 내독소-유도된 포도막염을 발증한 모델 마우스에서 염증 억제 효과
PH-0001-hm-pr, 인간 및 마우스 프로레닌 수용체 유전자의 발현의 억제 서열을 갖는 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자에 대해 LPS-유도된 포도막염을 발증한 모델 마우스에서 염증 억제 효과를 확인했다.
(1) 내독소-유도된 포도막염 모델 마우스에 대한 일본쇄 핵산 분자의 투여
상기 일본쇄 핵산 분자를 30, 100, 300μM로 되도록 PBS에 용해시켰다. 용해 후, 각 농도의 일본쇄 핵산 분자 용액(1μL)을 33게이지 주사 바늘을 사용하여 펜토바비탈 마취하의 마우스에게 유리체내 투여했다. 음성 대조군으로서, 동일한 양의 PBS를 사용했다. 각 투여 그룹에서, 6마리 암컷 마우스(C57BL/6J, 6- 내지 8-주령)를 사용했다. 일본쇄 핵산 분자의 투여 24시간 후, 100μL의 PBS에 용해시킨 LPS(0.2mg)를 복강내 투여했다.
(2) 염증성 사이토킨 유전자의 발현 양의 측정
LPS 투여 6시간 후, 마우스를 경추 파열에 의해 안락사시키고, 망막을 단리하고, TRIzol(Life technologies)을 사용하여 부착된 프로토콜에 따라 RNA를 수집했다. 이어서, GoScript Reverse Transcriptase Kit(Promega)를 사용하여 부착된 프로토콜에 따라 cDNA를 상기 RNA로부터 합성했다. 이어서, 하기 제시된 바와 같이, 상기 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하고, CCL2/MCP-1, ICAM-1, IL-6, TNF-α 유전자의 발현 양 및 내부 표준으로서 Gapdh 유전자의 발현 양을 측정했다. 각 유전자의 상기 발현 양은 상기 Gapdh 유전자의 발현 양에 의해 보정했다.
상기 PCR에서, GoTaq qPCR Master Mix(Promega)를 시약으로 사용하고, StepOne Plus(Life Techonologies)를 장치로서 사용했다. 각 유전자의 PCR에서, 하기 프라이머 세트를 사용했다.
마우스 CCL2/MCP-1 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 52) 5'-TTGGCTCAGCCAGATGCA-3'
(서열번호 53) 5'-CCTACTCATTGGGATCATCTTGC-3'
마우스 ICAM-1 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 54) 5'-CCTGTTTCCTGGCTCTGAAG-3'
(서열번호 55) 5'-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3'
마우스 IL-6 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 56) 5'-CACAGAGGATACCACTCCCAACA-3'
(서열번호 57) 5'-TCCACGATTTCCCAGAGAAACA-3'
마우스 TNFα 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 58) 5'-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3'
(서열번호 59) 5'-CGATCACCCCGAAGTTCAGTA-3'
마우스 Gapdh 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 60) 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'
(서열번호 61) 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3
보정후 각 유전자의 발현 양에 대하여, 음성 대조군 그룹(PBS 투여 그룹)에서의 발현 양을 1로 하여 각 투여 그룹에서의 발현 양의 상대치를 측정했다.
(3) 결과
결과는 도 8에 제시되어 있다. 각 그룹에서, 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자로서의 PH-0001-hm-pr는 염증성 사이토킨 유전자의 발현에 대해 억제 효과를 나타냈다. 즉, 본 발명의 일본쇄 핵산 분자는 프로레닌 수용체 유전자의 발현의 억제를 통해 포도막염에서 염증의 발증을 억제하는 것을 시사한다.
(실시예 5) 뉴클레아제 내성 및 프로레닌 수용체 단백질에 대한 발현 억제 효과
인간 및 마우스 프로레닌 수용체 유전자의 발현의 억제 서열을 갖는 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자에 대해 뉴클레아제 내성을 확인했다. 또한, 인간-유래된 배양 세포에서 프로레닌 수용체 단백질에 대한 발현 억제 효과를 면역블롯 분석에 의해 확인했다.
(1) 뉴클레아제 내성
서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자를 0.5 단위의 마이크로콕쿠스 뉴클레아제(Takara Bio Inc.)의 존재하에 37℃에서 배양했다. 반응 개시 5, 15 및 30분 후에, EDTA 용액을 반응 용액에 첨가하여 반응을 정지시키고, 15% TBE 겔을 사용하여 전기영동을 수행하고, 겔을 SYBR safe(Life Technologies)로 염색했다. 대조군으로서, 센스 쇄가 서열번호 19에 제시된 염기 서열이고 안티센스 쇄가 서열번호 8에 제시된 염기 서열인 이본쇄 핵산 분자((P)RR-siRNA)를 사용했다.
(2) 프로레닌 수용체 단백질에 대한 발현 억제 효과
세포로서는 인간 망막 색소 상피 세포(RPE, hTERT-RPE1)(ATCC)를 사용했다. 배지로서는 10% FBS(Life Technologies)를 함유하는 DMEM/F12(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 사용했다. 배양 조건은 37℃, 5% CO2였다.
서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자(1nM)을 형질감염 시약 Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life Technologies)을 사용하여 첨부 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 24시간 동안 배양했다. 배양 개시 3, 6, 12, 18 및 24시간 후, 세포를 수집했다. 면역블롯 분석은 다음과 같이 수행했다. 수집된 세포는 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 SDS 완충액에 용해시키고, 10% 겔을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리하고, PVDF 막(Merck Millipore)로 옮겼다. 5% 스킴 밀크를 함유하는 TBS에 침지시켜 막을 차단시키고, 일차 항체와 반응시켰다. 일차 항체로서는 항-프로레닌 수용체 항체(Sigma-Aldrich) 및 항-베타 액틴 항체(Medical & Biological Laboratories)를 사용했다. 화학발광 검출을 위한 이차 항체로서, 항-마우스 또는 항-래빗 IgG 항체 퍼옥시다제 접합체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 사용했다. 신호의 검출을 위해, 증강된 화학발광(Western Lightning Ultra)을 사용했다. 대조군으로서, 하기 구조식을 갖는 일본쇄 핵산 분자를 사용했고, 여기서 Lx는 상기 화학식 I-6a의 구조를 갖는다.
(서열번호 62)
5'-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-Lx-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3'
(3) 결과
뉴클레아제 내성의 결과는 도 9A에 제시되어 있고, 면역블롯 분석에 의한 프로레닌 수용체 단백질에 대한 발현 억제 효과는 도 9B에 제시되어 있다. 대조군((P)RR-siRNA)은 마이크로콕쿠스 뉴클레아제에 의해 5분 후에 완전히 분해되었지만, 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자((P)RR-PshRNA)는 30분 후에도 분해되지 않고 뉴클레아제 내성을 나타냈다(도 9A). 또한, 면역블롯 분석의 결과는 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자((P)RR-PshRNA)가 프로레닌 수용체 단백질의 발현을 억제하는 것을 나타낸다(도 9B).
(실시예 6) 내독소-유도된 포도막염 모델 마우스에서 급성 염증 억제 효과
인간 및 마우스 프로레닌 수용체 유전자의 발현의 억제 서열을 갖는 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자에 대해 급성 염증 억제 효과를 확인했다. 급성 염증 모델 마우스로서 LPS-유도된 포도막염 모델 마우스를 사용하여, 망막 혈관에 부착된 백혈구 수 및 시신경 유두에 인접하는 유리체 강에 침윤하는 백혈구 수를 측정했다. 또한, 일본쇄 핵산 분자가 세포 반응을 억제하는 분자 메카니즘을 조사하기 위해, 염증성 사이토킨 유전자의 발현 양을 측정했다. 추가로, 내독소-유도된 포도막염 모델 마우스에서, 유비퀴틴 프로테아좀 시스템의 활성화에 기인하여 염증성 신호가 로돕신의 분해를 유도하고, 이는 광수용체 외부 세그먼트를 단축시킨다. 따라서, 광수용체 외부 세그먼트의 길이의 측정 및 로돕신의 면역블롯 분석을 수행하여, 일본쇄 핵산 분자에 의한 광수용체에 대한 보호 효과를 조사했다.
(1) 내독소-유도된 포도막염 모델 마우스에 대한 일본쇄 핵산 분자의 투여
서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자를 100μM로 되도록 PBS에 용해시켰다. 용해 후, 일본쇄 핵산 분자 용액(1μL)를, 33게이지 주사 바늘을 사용하여 펜토바비탈 마취하의 마우스(C57BL/6J, 6- 내지 8-주령)(CLEA Japan)에게 유리체내 투여했다. 대조군으로서, PBS, 또는 PBS에 100μM로 되도록 용해시킨 Control-PshRNA(서열번호 62)의 동일한 양을 사용했다. 투여 24시간 후, 100μL의 PBS에 용해시킨 에스케리키아 콜라이-유도된 LPS(Sigma-Aldrich)(0.2mg)를, 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자 또는 Control-PshRNA를 투여한 마우스에게 유리체내 투여했다. 수득된 유리체를 사용하여, LPS 투여 6시간 후에 염증성 사이토킨 유전자의 발현 양을 측정했다. LPS 투여 24시간 후, 망막에 부착된 백혈구 및 유리체 내로 침윤된 백혈구를 정량화하고, 추가로 광수용체 외부 세그먼트의 길이를 측정하고, 로돕신을 사용한 면역블롯 분석을 수행했다.
(2) 실시간 정량적 PCR에 의한 염증성 사이토킨 유전자 발현 양의 측정
LPS 투여 6시간 후, 마우스를 경추 파열에 의해 안락사시키고, 망막을 단리했다. 문헌[참조: Kanda, A., Noda, K., Saito, W. & Ishida, S. (Pro)renin receptor is associated with angiogenic activity in proliferative diabetic retinopathy. Diabetologia 55, 3104-3113, 2012]에 기재된 방법에 의해, qPCR(TOYOBO)용의 SuperPrep Cell Lysis & RT Kit를 사용하여 세포로부터, 및 TRIzol(Life Technologies) 및 GoScrip Reverse Transcriptase(Promega)를 사용하여 망막 조직으로부터 전체 단백질을 분리하고, 올리고 dT 프라이머를 사용하여 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성했다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여, 실시간 정량적 PCR을 수행하고, IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1 및 tNF-α의 발현 양을 측정했다. 이들 유전자는 급성 및 만성 염증 모델 둘 다에 공통적으로 관여하는 것으로 공지되어 있는 대표적 유전자이다. 또한, 프로레닌 수용체 유전자 및 내부 표준 Gapdh 유전자의 발현 양을 유사하게 측정했다. 상기 각 유전자의 발현 양은 상기 Gapdh 유전자의 발현 양에 의해 보정했다. 상기 실시간 정량적 PCR에서, 시약으로서 GoTaq qPCR Master Mix(Promega)를 사용했고, StepOne 플러스 시스템(Life Technologies)을 장치로서 사용했다. 실시예 4와 동일한 프라이머 세트를 IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1, TNF-α 및 Gapdh 유전자의 PCR에 사용했다. 하기 프라이머 세트를 프로레닌 수용체 유전자의 PCR에 사용했다.
프로레닌 유전자를 위한 PCR 프라이머 세트
(서열번호 63) 5'-CTGGTGGCGGGTGCTTTAG-3'
(서열번호 64) 5'-GCTACGTCTGGGATTCGATCT-3'
(3) 망막에 부착된 백혈구의 정량
문헌[참조: Kanda, A., Noda, K., Oike, Y. & Ishida, S. Angiopoietin-like protein 2 mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye. Lab Invest 92, 1553-1563, 2012]에 기재된 방법에 따라, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-커플링된 콘카나발린 A 렉틴(Con A; Vector Laboratories)에 의한 관류-표지화를 사용하여 망막 혈관 시스템 및 부착 백혈구를 촬영했다. 구체적으로, LPS 투여 24시간 후, 마취하의 마우스의 흉강을 개방하고, 좌심실에 캐뉼라를 도입했다. 적혈구 및 비-부착성 백혈구를 제거하기 위해 PBS를 주입한 후, RITC-접합된 Con A를 관류시켰다. 안구를 제거한 후, 망막의 평탄한 마운트 시료를 제조했다. 평탄한 마운트 시료를 형광 현미경(BZ-9000, Keyence)하에 가시화하고, 망막당 Con A-염색된 부착 백혈구의 총수를 계수했다.
(4) 유리체 침윤 백혈구의 정량
문헌[참조: Kanda, A., Noda, K., Oike, Y. & Ishida, S. Angiopoietin-like protein 2 mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye. Lab Invest 92, 1553-1563, 2012]에 기재된 방법에 의해, 유리체 강으로 침윤하는 백혈구의 수를 계수했다. 구체적으로, 통상의 방법에 의해 망막 조직을 고정시키고 파라핀에 매립했다. 3개의 5㎛ 절편을 100㎛ 간격으로 제조했다. 중간 절편은 시신경을 통해 통과하도록 제조했다. 전체 절편을 HE(헤마톡실린-에오신)으로 염색하고, 유리체 강 내의 세포 수를 계수했다.
(5) 광수용체 외부 세그먼트의 길이의 측정 및 로돕신의 면역블롯 분석
광수용체 외부 세그먼트의 길이는 다음과 같이 측정했다. 4% 파라-포름알데히드를 사용하여 4℃에서 마우스의 안구를 고정시킨 후, 파라핀에 매립시키고, 절편을 제조했다. 절편을 HE로 염색하고, 망막 후부의 4개 포인트에서 광수용체 외부 세그먼트의 길이를 측정했다. 시신경의 양 말단에서 2개 포인트는 200㎛ 및 500㎛ 떨어져 있었다. 정상 마우스(대조군)에서 광수용체 외부 세그먼트의 길이를 1로 하여, 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자 또는 Control-PshRNA를 투여한 내독소-유도된 포도막염 마우스에서 광수용체 외부 세그먼트의 길이의 상대치를 측정했다. 로돕신의 면역블롯 분석은 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 SDS 완충액에 망막 조직을 용해시키는 점 및 항-로돕신 항체(Merck Millipore) 및 항-β 액틴 항체(Medical & Biological Laboratories)를 일차 항체로서 사용하는 점을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 수행했다.
(6) 결과
망막에 부착된 백혈구의 현미경 사진은 도 10A-D에 제시되어 있다(A 및 B: 대조군의 투여, C 및 D: 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자의 투여). 화살표는, 염증을 갖는 망막 혈관 시스템에 부착된 백혈구를 나타낸다. 스케일 바는 100㎛이다. 망막에 부착된 백혈구의 정량화 결과는 도 10E에 제시되어 있다. 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자는 내독소-유도된 포도막염을 갖는 망막에서 백혈구 부착을 억제시켰다(도 10A-E).
유리체에 침윤하는 백혈구의 현미경 사진은 도 10F 및 G에 제시되어 있다(F: 대조군의 투여, G: 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자의 투여). 화살표는 침윤하는 백혈구를 나타낸다. 스케일 바는 30㎛이다. 유리체에 침윤하는 백혈구의 정량 결과는 도 10H에 제시되어 있다. 시신경 유도의 전방으로의 백혈구 침윤은 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자의 투여에 의해 감소했다(도 10F-H).
염증성 사이토킨 유전자의 발현 양의 측정 결과는 도 11에 제시되어 있다. IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1 및 TNF-α 유전자의 발현 양은 투여 없는 정상 마우스(대조군)보다 PBS 또는 대조군(Control-PshRNA)를 투여한 내독소-유도된 포도막염(EIU) 마우스에서 더욱 높았다(도 11A-D). 또한, 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자((P)RR-PshRNA)를 투여한 내독소-유도된 포도막염 마우스에서, 염증성 사이토킨 및 프로레닌 수용체((P)RR/Atp6ap2)의 발현은 유의적으로 감소했다(도 11A-E).
광수용체 외부 세그먼트의 길이의 측정 및 로돕신의 면역블롯 분석의 결과는 도 12에 제시되어 있다(RPE는 망막 색소 상피이고, OS는 외부 세그먼트이고, IS는 내부 세그먼트이고, ONL은 외부 핵 층이고, INL은 내부 핵 층이다). 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자((P)RR-PshRNA)를 투여한 내독소-유도된 포도막염(EIU) 마우스에서, 광수용체 외부 세그먼트의 길이의 감소가 억제되었고(도 12A-D), 로돕신의 감소가 억제되었다(도 12E).
(실시예 7) 스트렙토조토신-유도된 유형 1 당뇨병 모델 마우스에서 만성 염증 억제 효과
최근, 당뇨병 막막증은 염증성 질환인 것으로 고려된다. 따라서, 스트렙토조토신-유도된 유형 1 당뇨병 모델 마우스를 사용하여, 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자의 만성 염증 억제 효과를 확인했다. 염증성 사이토킨 유전자의 발현 양의 측정 및 망막 혈관에 부착된 백혈구의 정량화를 수행했다.
(1) 스트렙토조토신-유도된 유형 1 당뇨병 모델 마우스에게 일본쇄 핵산 분자의 투여
시트르산 용액에 용해시킨 스트렙토조토신(Sigma)(60mg/체중 kg)을 복강내 주사에 의해 4일 동안 연속 마우스(C57BL/6J, 6- 내지 8-주령)(CLEA Japan)에게 투여했다. 스트렙토조토신 투여후 7일째에 혈장 글루코즈 농도가 250mg/dl을 초과하는 마우스를 당뇨병으로 간주하고, 이후의 실험에 사용했다. 스트렙토조토신 투여 2개월 후, 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자를 100μM로 되도록 PBS에 용해시키고, 용액(1mL)을 33게이지 주사 바늘을 사용하여 펜토바비탈 마취하의 마우스에게 유리체내 투여했다. 대조군으로서, PBS, 또는 100μM로 되도록 PBS에 용해시킨 Control-PshRNA(서열번호 62)의 동일 양을 사용했다. 투여 24시간 후, 염증성 사이토킨 유전자의 발현 양을 측정했다. 또한, 투여 48시간 후에 망막에 부착된 백혈구를 정량했다.
(2) 실시간 정량 PCR에 의한 염증성 사이토킨 유전자 발현 양의 측정
실시예 6과 유사한 방법에 의해, IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1, TNF-α 및 Gapdh 유전자의 발현 양을 측정했다.
(3) 망막에 부착된 백혈구의 정량
실시예 6과 유사한 방법에 의해, 망막에 부착된 백혈구를 정량했다.
(4) 결과
망막에 부착된 백혈구의 현미경 사진은 도 13A-D에 제시되어 있다(A 및 B: 대조군의 투여, C 및 D: 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자의 투여). 스케일 바는 100㎛이다. 망막에 부착된 백혈구의 정량의 결과는 도 13E에 제시되어 있다. 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자의 투여는 백혈구 수를 유의적으로 감소시켰다(도 13A-E).
염증성 사이토킨의 발현 양의 측정 결과는 도 13F-I에 제시되어 있다(대조군은 PBS 또는 핵산을 투여하지 않은 정상 마우스의 발현 양이다). 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자((P)RR-PshRNA)를 투여한 당뇨병 마우스에서 IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1 및 TNF-α 유전자의 발현은 PBS 또는 대조군(Control-PshRNA)를 투여한 당뇨병 마우스의 발현과 비교하여 유의적으로 억제되었다.
(실시예 8) 레이저-유도된 CNV 모델 마우스에서 혈관신생 억제 효과
인간 및 마우스 프로레닌 수용체 유전자를 갖는 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자의 혈관신생 억제 효과를 레이저-유도된 CNV 모델 마우스에서 확인했다.
(1) 레이저-유도된 CNV(맥락막 혈관신생) 모델 마우스에게 일본쇄 핵산 분자의 투여
C57BL/6J 마우스(암컷, 6- 내지 8-주령)(CLEA Japan)를 펜토바비탈(0.05mg/체중 g)의 복강내 주사에 의해 마취시키고, 5% 페닐에프린 하이드로클로라이드 및 5% 트로피카미드를 사용하여 동공을 확장시켰다. 레이저 광응고는 ND:YAG 532-mn 레이저(Novus Spectra; Lumenis)를 사용하여 슬릿 램프 전달 시스템에 의해 수행했다. 각 눈은 시신경을 포위하는 4개 레이저 스팟을 조사하고(180mW, 75㎛, 100ms) CNV(맥락막 혈관신생) 모델 마우스를 생성했다. 레이저 광응고 직후, 100μM로 되도록 PBS에 용해시켜 수득한 일본쇄 핵산 분자 용액(1μL)를 33게이지 주사 바늘을 사용하여 유리체내 투여했다. 대조군으로서, PBS, 또는 100μM로 되도록 PBS에 용해시킨 Control-PshRNA(서열번호 62)의 동일 양을 사용했다. 레이저 손상 동안 기포의 출현에 의해 브루히(Bruch) 막의 파열을 확인했다. 유리체 출혈, 망막 출혈 또는 망막하 출혈을 갖는 눈은 본 실험으로부터 제외했다.
(2) 레이저-유도된 CNV의 정량
레이저 광응고 7일 후에 마취의 과잉투여에 의해 마우스를 안락사시키고, 안구를 제거하여 4% 파라-포름알데히드에서 1시간 동안 고정시켰다. 전방 안 세그먼트 및 신경 망막의 제거 후, 4개 부위를 방사상으로 절개하여, 망막 색소 상피-맥락막 복합체를 평탄하게 하여 맥락막 평탄한 마운트를 제조했다. 5% 염소 혈청 및 1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS에 맥락막 평탄한 마운트를 침지하고, 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 형광-표지된 이소렉틴-B4와 함께 4℃에서 밤새 배양했다. 형광 현미경(Biorevo, Keyence)하에 맥락막 평탄한 마운트를 관찰하고, 현미경 소프트웨어(BZ-II 분석기)를 사용하여 CNV의 면적을 측정했다.
(3) 결과
CNV 면적의 측정은 도 14A에 제시되어 있고, CNV의 현미경 사진은 도 14B-D에 제시되어 있다. 서열번호 30에 제시된 일본쇄 핵산 분자((P)RR-PshRNA)를 투여한 망막에서 CNV 면적은 PBS 또는 대조군(Control-PshRNA)와 비교하여 유의적으로 작았다.
본 발명은 예시적 실시형태를 참조로 하여 기재되었지만, 본 발명은 상기 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 당해 기술분야의 숙련가에게 명백한 다양한 변화는, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고도, 본 발명의 구성 및 상세에서 이루어질 수 있다.
본원에서 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 그 안에 개시된 정도까지, 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.
[산업상 이용가능성]
본 발명의 일본쇄 핵산 분자에 따르면, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현에 의해 유발된 질환, 예를 들면, 포도막염, 당뇨병 망막증 등의 치료제로서 효과적이다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제2015-257713호(출원일: 2015년 12월 29일)을 기초로 하고, 이의 내용은 본 명세서에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY TOKYO MEDICAL UNIVERSITY BONAC CORPORATION <120> SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE INHIBITING EXPRESSION OF PRORENIN GENE OR PRORENIN RECEPTOR GENE, AND USE THEREOF <130> IPA180691-JP <150> JP 2015-257713 <151> 2015-12-29 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibitory sequence <400> 1 ugauguuguc gaagauaggg g 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibitory sequence <400> 2 uugauauagu ggaaauuccc u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibitory sequence <400> 3 ugauauagug gaaauucccu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibitory sequence <400> 4 uagaacuuuc ggaugaaggu g 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibitory sequence <400> 5 aucaaacucu guguagaacu u 21 <210> 6 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inhibitory sequence <400> 19 ccuauaaccu ugcauauaag u 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence to expression inhibitory sequence <400> 20 cccuauaacc uugcauauaa g 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence to expression inhibitory sequence <400> 21 ggagaaugca guuccuuuua g 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence to expression inhibitory sequence <400> 22 gggcuaauau ggauacuaaa a 21 <210> 23 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 23 ccuaucuucg acaacaucau cccgggauga uguugucgaa gauagggg 48 <210> 24 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 24 ggaauuucca cuauaucaac cccgggguug auauagugga aauucccu 48 <210> 25 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 25 gggaauuucc acuauaucaa cccggguuga uauaguggaa auucccuu 48 <210> 26 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 26 ccuucauccg aaaguucuac accgguguag aacuuucgga ugaaggug 48 <210> 27 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 27 guucuacaca gaguuugauc gccggcgauc aaacucugug uagaacuu 48 <210> 28 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 28 guuguuuucc gaaauggaaa uccggauuuc cauuucggaa aacaacag 48 <210> 29 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 29 guuuuccgaa auggaaauug gccggccaau uuccauuucg gaaaacaa 48 <210> 30 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 30 ccuauaaccu ugcauauaag uccggacuua uaugcaaggu uauaggga 48 <210> 31 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 31 cccuauaacc uugcauauaa gccggcuuau augcaagguu auagggac 48 <210> 32 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 32 ggagaaugca guuccuuuua gccggcuaaa aggaacugca uucuccaa 48 <210> 33 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 33 gggcuaauau ggauacuaaa accgguuuua guauccauau uagcccau 48 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gctttctcag ccaggacatc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tgggagatga tgttgtcgaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tcgtaccctt tggagaatgc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gagccaactg caaaacaaca 20 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ggagaaggct ggggctcatt tgc 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tggccagggg tgctaagcag ttg 23 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 aggcagtgtc atttcgtacc 20 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gccttcccta ccatatacac tc 22 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 accccacgaa gtgttggata 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 aagcagatgg ccacagaact 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tggtcgttct cctgttcttt c 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 accctggcga tcttaatatg c 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 caaactttgc tttccctggt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 caagggcata tccaacaaca 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tgtgggcaac ctattccacc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 agctgacgca atgtgactga 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gcagactttg ctttccttgg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 tccactttcg ctgatgacac 20 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ttggctcagc cagatgca 18 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 cctactcatt gggatcatct tgc 23 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 cctgtttcct ggctctgaag 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gtctgctgag acccctcttg 20 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 cacagaggat accactccca aca 23 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 tccacgattt cccagagaaa ca 22 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ggtgcctatg tctcagcctc tt 22 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 cgatcacccc gaagttcagt a 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 tgtagaccat gtagttgagg tca 23 <210> 62 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded nucleic acid molecule <400> 62 uacuauucga cacgcgaagu uccggaacuu cgcgugucga auaguauu 48 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 ctggtggcgg gtgctttag 19 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gctacgtctg ggattcgatc t 21

Claims (21)

  1. 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)를 포함하는, 프로레닌 유전자(prorenin gene) 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자로서,
    상기 링커 영역(Lx)은 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중의 적어도 하나를 포함하는 비-뉴클레오티드 구조를 갖고,
    상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중의 하나는 하기 서열번호 1 내지 5:
    (서열번호 1) 5'-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
    (서열번호 2) 5'-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
    (서열번호 3) 5'-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
    (서열번호 4) 5'-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
    (서열번호 5) 5'-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
    로 나타내어지는 프로레닌 유전자의 일부에 상보성인 서열, 및 하기 서열번호 6 내지 11:
    (서열번호 6) 5'-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
    (서열번호 7) 5'-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
    (서열번호 8) 5'-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
    (서열번호 9) 5'-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
    (서열번호 10) 5'-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
    (서열번호 11) 5'-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
    로 나타내어지는 프로레닌 수용체 유전자의 일부에 상보성인 서열로부터 선택되는 임의의 뉴클레오티드 서열 중의 적어도 18개 연속 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 억제 서열을 포함하고,
    다른 것은 상기 발현 억제 서열과 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)가 3'-측으로부터 5'-측으로 이러한 순서로 배치되고, 상기 영역(X)의 염기 수(X) 및 상기 영역(Xc)의 염기 수(Xc)가 하기 수학식 1 또는 2의 조건을 만족시키는, 핵산 분자:
    수학식 1
    X>Xc ···(1)
    수학식 2
    X=Xc ···(2)
  3. 제2항에 있어서, 상기 영역(X)의 염기 수(X) 및 상기 영역(Xc)의 염기 수(Xc)가 하기 수학식 3의 조건을 만족시키는, 핵산 분자:
    수학식 3
    X-Xc=1, 2 또는 3 ···(3)
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 영역(Xc)의 염기 수(Xc)가 19 내지 30인, 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)가 하기 화학식 I로 나타내어지는, 핵산 분자:
    화학식 I
    Figure pct00009

    상기 화학식 I에서,
    X1 및 X2는 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이고;
    Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O 또는 S이고;
    R3은 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환체이고,
    L1은 n개의 원자로 이루어진 알킬렌 쇄이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나,
    L1은 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄이고,
    단, Y1이 NH, O 또는 S인 경우, L1에서 Y1에 결합하는 원자는 탄소이고, L1에서 OR1에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않고;
    L2는 m개의 원자로 이루어진 알킬렌 쇄이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc로 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나,
    L2는 상기 알킬렌 쇄 상의 적어도 하나의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시켜 수득한 폴리에테르 쇄이고,
    단, Y2가 NH, O 또는 S인 경우, L2에서 Y2에 결합하는 원자는 탄소이고, L2에서 OR2에 결합하는 원자는 탄소이고, 산소 원자는 서로 인접하지 않고;
    Ra, Rb, Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 치환체 또는 보호 그룹이고;
    l은 1 또는 2이고;
    m은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    n은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    환 A에서, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자는 질소, 산소 또는 황으로 치환될 수 있고,
    상기 환 A는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유할 수 있고,
    상기 영역(Xc) 및 (X)는 각각 -OR1- 또는 -OR2-를 통해 상기 링커 영역(Lx)에 결합하고,
    여기서, R1 및 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 이들이 존재하는 경우, R1 및 R2는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조(I)이다.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)가 하기 화학식 I-4a 또는 I-6a로 나타내어지는, 핵산 분자:
    화학식 I-4a
    Figure pct00010

    화학식 I-6a
    Figure pct00011
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, RNA 분자인, 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함하는, 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지 물질(labeling substance)을 포함하는, 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 안정한 동위체(isotope)를 포함하는, 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 염기 수의 합계가 38 이상인, 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 하기 서열번호 23 내지 33 중의 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열로 이루어진, 핵산 분자:
    (서열번호 23)
    5'-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3'
    (서열번호 24)
    5'-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3'
    (서열번호 25)
    5'-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3'
    (서열번호 26)
    5'-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3'
    (서열번호 27)
    5'- GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3'
    (서열번호 28)
    5'-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3'
    (서열번호 29)
    5'-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3'
    (서열번호 30)
    5'-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3'
    (서열번호 31)
    5'-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3'
    (서열번호 32)
    5'-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3'
    (서열번호 33)
    5'-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3'
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 분자를 포함하는, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제제.
  14. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 분자를 포함하는 의약.
  15. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 분자를 포함하는, 안과 질환을 위한 치료제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 안과 질환이 당뇨병 망막증, 포도막염, 연령-관련 황반 변성 및 녹내장으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 치료제.
  17. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 분자를 사용하는 것을 포함하는, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 핵산 분자를 세포, 조직 또는 기관에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 투여가 시험관 내에서 수행되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제에 사용하기 위한, 핵산 분자.
  21. 프로레닌 유전자 또는 프로레닌 수용체 유전자의 발현 억제제의 제조를 위한, 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 분자의 용도.
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