JP6283859B2 - ペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子、ペリオスチン遺伝子の発現抑制方法、およびその用途 - Google Patents
ペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子、ペリオスチン遺伝子の発現抑制方法、およびその用途 Download PDFInfo
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Description
(as1)配列番号1〜19のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
(as2)前記(as1)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
(as3)前記(as1)の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
本発明の発現抑制核酸分子(以下、「本発明の核酸分子」ともいう)は、前述のように、発現抑制用の核酸分子であり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制配列として、下記(as1)、(as2)または(as3)のヌクレオチドを含むことを特徴とする。
(as1)配列番号1〜19のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
(as2)前記(as1)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
(as3)前記(as1)の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
NI−0079(配列番号1)
5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC-3’
NI−0080(配列番号2)
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NI−0085(配列番号7)
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NI−0086(配列番号8)
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5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC-3’
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NI−0091(配列番号11)
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NI−0099(配列番号19)
5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG-3’
TT 5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC(N)n-3’
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TT 5’-GAAGUAUUUCUUUUUGGUG(N)n-3’
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TT 5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC(N)n-3’
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TT 5’-GAUGCCAAGCCUAAUUGGG(N)n-3’
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AG 5’-UGAUUCGAGCACAAUUAAC(N)n-3’
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UC 5’-UACUGUUAUACUGUCACCG(N)n-3’
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AU 5’-UAAGCACACGGUCAAUGAC(N)n-3’
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GU 5’-UAAUUGGGCUACCAGGUCG(N)n-3’
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GU 5’-AUCCUUUCUAGGACACCUC(N)n-3’
NI−0099(配列番号38)
CU 5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG(N)n-3’
(s1)前記(as1)の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
(s2)前記(as2)の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
(s3)前記(as3)の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
NI−0079(配列番号39)
5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU-3’
NI−0080(配列番号40)
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NI−0081(配列番号41)
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NI−0092(配列番号50)
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NI−0095(配列番号53)
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NI−0096(配列番号54)
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NI−0097(配列番号55)
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NI−0098(配列番号56)
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NI−0099(配列番号57)
5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA-3’
NI−0079(配列番号58)
5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU(N)n-3’ TT
NI−0080(配列番号59)
5’-CACCAAAAAGAAAUACUUC(N)n-3’ TT
NI−0081(配列番号60)
5’-CAUCCAUGGGAACCAGAUU(N)n-3’ TT
NI−0082(配列番号61)
5’-CCACGAGGUGUCCUAGAAA(N)n-3’ TT
NI−0083(配列番号62)
5’-UCCUGAUUCUGCCAAACAA(N)n-3’ TT
NI−0084(配列番号63)
5’-CUGCCAAACAAGUUAUUGA(N)n-3’ TT
NI−0085(配列番号64)
5’-CCAAACAAGUUAUUGAGCU(N)n-3’ TT
NI−0086(配列番号65)
5’-GCUGGCUGGAAAACAGCAA(N)n-3’ TT
NI−0087(配列番号66)
5’-GCUGGAAAACAGCAAACCA(N)n-3’ TT
NI−0088(配列番号67)
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NI−0091(配列番号68)
5’-GUUAAUUGUGCUCGAAUCA(N)n-3’ UC
NI−0092(配列番号69)
5’-CGGUGACAGUAUAACAGUA(N)n-3’ AA
NI−0093(配列番号70)
5’-GUCAUUGACCGUGUGCUUA(N)n-3’ CA
NI−0094(配列番号71)
5’-CGACCUGGUAGCCCAAUUA(N)n-3’ GG
NI−0095(配列番号72)
5’-CCUAAAUCAACGAUCUGAU(N)n-3’ UU
NI−0096(配列番号73)
5’-GAGUCACUAAUAUCCUGAA(N)n-3’ GA
NI−0097(配列番号74)
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NI−0098(配列番号75)
5’-GAGGUGUCCUAGAAAGGAU(N)n-3’ CA
NI−0099(配列番号76)
5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA(N)n-3’ CC
本発明の核酸分子が二本鎖核酸分子の場合、二本の一本鎖核酸を含み、一方の一本鎖核酸が前記発現抑制配列を有していればよい。前記二本鎖核酸分子は、例えば、いわゆるsiRNA、またはsiRNAの前駆体等があげられる。前記二本鎖核酸分子は、例えば、一方の一本鎖核酸、すなわち、そのアンチセンス鎖が、前記発現抑制配列を有し、他方の一本鎖核酸、すなわち、そのセンス鎖が、前記相補配列を有することが好ましい。前記アンチセンス鎖は、例えば、前記発現抑制配列からなる一本鎖核酸でもよいし、前記発現抑制配列を含む一本鎖核酸でもよい。前記センス鎖は、例えば、前記相補配列からなる一本鎖核酸でもよいし、前記相補配列を含む一本鎖核酸でもよい。
本発明の核酸分子が一本鎖核酸分子の場合、前記発現抑制配列を有していればよく、その他の形態は、特に制限されない。
前記一本鎖核酸分子の第1形態として、5’側領域および3’側領域が互いにアニーリングして、二本鎖構造(ステム構造)を形成する分子があげられる。これは、shRNA(small hairpin RNAまたはshort hairpin RNA)の形態とも言える。shRNAは、ヘアピン構造をとっており、一般的に、一つのステム領域と一つのループ領域とを有する。
X>Xc ・・・(3)
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2または3、
より好ましくは1または2 ・・・(11)
X=Xc ・・・(5)
前記一本鎖核酸分子の第2形態として、5’側領域および3’側領域が、それぞれ別個に分子内アニーリングして、2つの二本鎖構造(ステム構造)を形成する分子があげられる。これは、例えば、国際公開WO2012/005368号公報およびWO2012/017979の開示を援用できる。
Z=X+Y ・・・(1)
Z≧Xc+Yc ・・・(2)
X=Y ・・・(19)
X<Y ・・・(20)
X>Y ・・・(21)
(a)下記式(3)および(4)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(3)
Y=Yc ・・・(4)
(b)下記式(5)および(6)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(5)
Y>Yc ・・・(6)
(c)下記式(7)および(8)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(7)
Y>Yc ・・・(8)
(d)下記式(9)および(10)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(9)
Y=Yc ・・・(10)
(a)下記式(11)および(12)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2、3または4、
より好ましくは1、2または3 ・・・(11)
Y−Yc=0 ・・・(12)
(b)下記式(13)および(14)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(13)
Y−Yc=1〜10、好ましくは1、2、3または4、
より好ましくは1、2または3 ・・・(14)
(c)下記式(15)および(16)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2または3、
より好ましくは1または2 ・・・(15)
Y−Yc=1〜10、好ましくは1、2または3、
より好ましくは1または2 ・・・(16)
(d)下記式(17)および(18)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(17)
Y−Yc=0 ・・・(18)
前記一本鎖核酸分子の第3形態として、前記リンカー領域が、非ヌクレオチド構造である分子があげられる。これは、例えば、国際公開WO2012/005368号公報およびWO2012/017979の開示を援用できる。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5またはC−6に結合する水素原子または置換基であり、
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換れていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
lは、1または2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域(Xc)および前記領域(X)は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
前記領域(Yc)および前記領域(Y)は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー領域(Ly)に結合し、
ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)である。
条件(1)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR1−を介して、前記領域(Y)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(2)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR2−を介して、前記領域(Y)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(3)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR1−を介して、前記領域(Y)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(4)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR2−を介して、前記領域(Y)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸分子をコードするDNAを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記DNAを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現ベクターは、例えば、ベクターに発現可能なように前記DNAが挿入されている。前記DNAを挿入するベクターは、特に制限されず、例えば、一般的なベクターが使用でき、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター等があげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクターがあげられる。
本発明の組成物は、本発明の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。
本発明の抑制方法は、前述のように、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の発現抑制核酸分子、前記本発明の組成物または前記眼疾患用医薬を使用することを特徴とする。本発明の抑制方法は、本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の眼疾患の治療方法は、前述のように、本発明の発現抑制核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、眼疾患の治療に、本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明が対象とする眼疾患は、例えば、前述の通りであって、増殖糖尿病網膜症等の網膜症、加齢黄斑変性症等の黄斑変性症等があげられる。
本発明の発現抑制核酸分子は、ペリオスチン遺伝子の発現またはペリオスチンタンパク質の機能の抑制のための核酸分子、または、眼疾患の治療のための核酸分子である。また、本発明の発現抑制核酸分子は、ペリオスチン遺伝子の発現抑制剤または眼疾患用医薬の製造のための核酸分子である。
siRNAを合成し、in vitroにおけるヒトペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のsiRNAとして、下記配列の二本鎖RNAを合成した。各二本鎖RNAにおいて、上の配列がセンス鎖、下の配列がアンチセンス鎖とした。センス鎖の3’末端のオーバーハングおよびアンチセンス鎖の3’末端のオーバーハングは、いずれも、n=2であり、TTとした。
細胞は、ヒト網膜色素上皮細胞株ARPE−19(American Type Culture Collection:ATCC)を使用した。培養条件は、37℃、5%CO2とした。培地は、10%FBSを含むDMEM(Invitrogen)を使用した。
5’-TGCCCAGCAGTTTTGCCCAT-3’ (配列番号79)
5’-CGTTGCTCTCCAAACCTCTA-3’ (配列番号80)
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’ (配列番号81)
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(配列番号82)
これらの結果を、図5に示す。図5は、ペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図5に示すように、前記実施例の二本鎖RNAは、コントロール(−およびmock)およびネガティブコントロールよりも低い値を示したことから、いずれも発現抑制活性を有することが確認できた。中でも、NI−0079、NI-0082、NI−0083、NI−0084、NI−0085は、極めて強い発現抑制活性を示した。
脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization:CNV)のモデルマウスを使用して、本発明の核酸分子により、新生血管および繊維性増殖組織の形成が抑制されることを確認した。
実施例のsiRNAとして、前記実施例1のNI−0079を使用した。また、実施例の一本鎖核酸分子として、以下に示すNK−0144およびPK−0076を使用した。NK−0144およびPK−0076において、前記siRNAのアンチセンス鎖と共通する配列番号1のas1ヌクレオチドを下線で示す。
ケタラール(登録商標)注射液(50mg/mL)とセラクタール(登録商標)2%注射液とを、体積比9:1で混合し、この混合液を、カルシウムおよびマグネシウム未添加のPBS(−)で5倍希釈した。得られた麻酔用希釈液を、170μL/匹の条件でマウス(C57BL/6JJcl、オス、6−8週齢、日本クレア)の腹腔に、シリンジで注射し、全身麻酔した。前記マウスに、ミドリン(登録商標)P 1滴を点眼し、散瞳し、続いて、コンタクトレンズ用の角膜装着補助剤であるスコピゾル眼科溶液 1滴を点眼した。そして、麻酔下のマウスの眼に、下記条件でレーザーを照射した。
機器
ZEISS 30 SL−M
設定
power:100mW
spot size:75μm
duration:0.1sec、4shots/眼
レーザー照射を行った日および照射7日目のマウスに、ミドリン(登録商標)P 1滴を点眼し、散瞳し、続いて、前記麻酔用希釈液を、前述と同様の条件で前記マウスに注射し、全身麻酔した。そして、0.1nmol/μLに調製した前記核酸分子を、0.1nmol/eyeとなるように、前記マウスの硝子体内に注入した。前記注入は、33G針付きハミルトンシリンジ(♯701)を使用し、手術用顕微鏡で眼球内を観察しながら行った。そして、前記マウスに、抗菌点眼薬クラビット点眼液(商品名)0.5% 1滴を点眼した。
前記核酸分子を投与した前記マウスを、遮光条件下、所定期間(21日間)飼育した後、過麻酔により安楽死させた。前記マウスから、眼球を摘出し、4%PFA(パラホルムアルデヒド)で1時間、固定処理した。固定した眼球から、脈絡膜を採取し、前記PBS(−)に浸漬した。そして、前記脈絡膜に対して、常法にしたがって、Flat Mount免疫染色を行い、イソレクチンB4およびコラーゲンI型を染色した。蛍光顕微鏡を用いて、イソレクチンB4の染色による新生血管の形成確認およびコラーゲンI型の染色による線維性増殖組織の形成確認を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、立体構築画像から、新生血管および線維性増殖組織の体積を定量化した。定量化には、定量化ソフトとしてNIS−Elemenを使用した。
siRNAを合成し、in vitroにおけるヒトペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。
一本鎖核酸分子を合成し、in vitroにおけるヒトペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。
siRNAを合成し、in vitroにおけるマウスペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。
Claims (17)
- 下記(1)、(2)、または(3)の核酸分子を含むことを特徴とする、ペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子。
(1)下記NI−0079、NI−0082、NI−0083、NI−0084、NI−0085、NI−0087、NI−0091、NI−0092、NI−0093、NI−0094、NI−0095、NI−0097、NI−0098、またはNI−0099の二本鎖核酸分子であり、
各二本鎖核酸分子において、下の配列がペリオスチン遺伝子の発現抑制配列を含むアンチセンス鎖であり、上の配列が、前記発現抑制配列とアニーリングする相補配列を含むセンス鎖である二本鎖核酸分子
(2)下記NK−0144、NK−0147、またはNK−0148の一本鎖核酸分子
(3)下記PK−0076、PK−0079、またはPK−0080の一本鎖核酸分子であり、
各一本鎖核酸分子において、リンカーLxおよびLyは、下記式(I−8a)で表される一本鎖核酸分子
- 前記発現抑制配列が、さらに、オーバーハング配列を有し、
前記ヌクレオチドの3’末端に、前記オーバーハング配列が付加されている、請求項1記載の発現抑制核酸分子。 - 前記相補配列が、さらに、オーバーハング配列を有し、
前記ヌクレオチドの3’末端に、前記オーバーハング配列が付加されている、請求項1または2記載の発現抑制核酸分子。 - 前記オーバーハング配列が、1〜3塩基長である、請求項2または3記載の発現抑制核酸分子。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする、組成物。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする、眼疾患用医薬。
- 前記眼疾患が、網膜症、黄斑変性症、翼状片、結膜炎、眼内血管新生および眼の線維瘢痕からなる群から選択された少なくとも1つの疾患である、請求項6記載の眼疾患用医薬。
- 前記網膜症が、増殖糖尿病網膜症または増殖性硝子体網膜症である、請求項7記載の眼疾患用医薬。
- ペリオスチン遺伝子の発現を抑制する方法であって、
ヒトを除く非ヒト動物に、請求項1から4のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を使用することを特徴とする抑制方法。 - 前記発現抑制核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項9記載の抑制方法。
- 前記発現抑制核酸分子を、in vivoまたはin vitroで投与する、請求項9または10記載の抑制方法。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を、ヒトを除く非ヒト動物に投与する工程を含むことを特徴とする、眼疾患の治療方法。
- 前記眼疾患が、網膜症、黄斑変性症、翼状片、結膜炎、眼内血管新生および眼の線維瘢痕からなる群から選択された少なくとも1つの疾患である、請求項12記載の治療方法。
- 前記網膜症が、増殖糖尿病網膜症または増殖性硝子体網膜症である、請求項13記載の治療方法。
- 眼疾患の治療のために使用する請求項1から4のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
- 前記眼疾患が、網膜症、黄斑変性症、翼状片、結膜炎、眼内血管新生および眼の線維瘢痕からなる群から選択された少なくとも1つの疾患である、請求項15記載の発現抑制核酸分子。
- 前記網膜症が、増殖糖尿病網膜症または増殖性硝子体網膜症である、請求項16記載の発現抑制核酸分子。
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