JP5986928B2

JP5986928B2 - 遺伝子発現の特異的阻害のためのダイサー基質剤及び方法

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Publication number: JP5986928B2
Application number: JP2012544487A
Authority: JP
Inventors: ボブ，デールブラウン，
Original assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2016-09-06
Anticipated expiration: 2030-06-25
Also published as: WO2011075188A1; CA2784252C; EP2513334B1; EP2756845A1; JP2015198657A; JP2013514089A; AU2010332246B2; EP2756845B1; CA2784252A1; EP2513334A4; AU2010332246A1; EP2513334A1

Description

本願は、２００９年１２月１８日に出願された米国特許出願第１２／６４２，３７１号（８４０１７ＵＳ）及び２０１０年２月１１日に出願された米国特許出願第１２／７０４，２５６号（８３１０１ＵＳ）の一部継続出願である。上記出願の全ての教示は、参照により本出願に組み入れられる。

２５〜３５個のヌクレオチド長の鎖を有する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤は、哺乳動物細胞における標的遺伝子発現の効果的阻害剤として開示されている（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願公開第２００５／０２４４８５８号及び第２００５／０２７７６１０号）。このような長さのｄｓＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のダイサー酵素により加工され、この物質は「ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）剤」と命名された。ＤｓｉＲＮＡ剤の特定の修飾構造は既に開示されている（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号）。

本発明は、少なくとも部分的に、アンチセンス鎖の５’末端、又はセンス鎖の３’末端、又はセンス鎖の５’末端のいずれかに一本鎖ヌクレオチド領域を所有する、長さ２５〜３０ヌクレオチドの範囲内の鎖長を有する二本鎖核酸薬剤が、有効なＲＮＡ干渉薬剤であるという驚くべき発見に基づいている。一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡの一本鎖領域内の一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド及び／又はホスフェートバックボーン修飾の包含は、そのような修飾ＤｓｉＲＮＡ分子に所定の利点を付与し得、その利点には、例えば向上された有効性（向上された効能及び／又は改善された効果の持続を含む）、ＤＮＡ−結合分子のための認識ドメインの表示、及び一本鎖ヌクレオチド領域に関連した他の特性が含まれる。

従って、所定の態様において、本発明は、以前記載されているＲＮＡ阻害剤よりも長時間（ダイサー切断事象の位置のより正確な案内（direction）による））、向上された有効性を所有するＲＮＡ阻害剤を提供することにより、向上された有効性、送達、薬物動態、薬力学及び生体内分布特性、並びに、例えば首尾良く調製され、特定の受容体を標的とし、活性薬物分子及び／又はペイロードに取り付けられ、別の活性核酸分子に取り付けられ、検出分子に取り付けられ、（例えば多数の）安定化修飾を所有する、等の改善された能力を所有するｄｓＲＮＡ含有薬剤の生成を可能にする。

一態様において、本発明は、５’末端及び３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と、５’末端及び３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを有する単離された二本鎖核酸であって、各５’末端が５’末端ヌクレオチドを有し、かつ各３’末端が３’末端ヌクレオチドを有し、第一の鎖が２５〜３０ヌクレオチド残基の長さを有し、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、第一の鎖の１〜２３位が少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；第二の鎖が３６〜６６ヌクレオチド残基の長さを有し、３’末端ヌクレオチドから開始して、第一の鎖の１〜２３位と対をなす位置に少なくとも８個のリボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成し；第二の鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチド、及び３’末端の６個までの連続したヌクレオチドが、第一の鎖と対をなさずに、１〜６ヌクレオチドの３’の一本鎖オーバーハングを形成し；第二の鎖の不対３’末端ヌクレオチドを含まない、少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて３０個の連続したヌクレオチドは、第一の鎖と対をなさず、それにより第二の鎖内に１０〜３０ヌクレオチド一本鎖の５’オーバーハングを形成し；第一の鎖の５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドは、各々、第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなし、対応する第二の鎖ヌクレオチドは、各々、第二の鎖の３’の一本鎖オーバーハング及び第二の鎖の５’オーバーハングと連続しており、それにより第一の鎖と第二の鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成し；第二の鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された際に標的遺伝子発現を低減するように、第二の鎖の少なくとも１９リボヌクレオチドの長さに沿って標的ＲＮＡに対して十分相補的である、単離された二本鎖核酸を提供する。

別の態様において、本発明は、５’末端及び３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と、５’末端及び３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを有する単離された二本鎖核酸であって、各５’末端が５’末端ヌクレオチドを有し、かつ各３’末端が３’末端ヌクレオチドを有し、第一の鎖が３５〜６０ヌクレオチド残基の長さを有し、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、第一の鎖の１〜２８位が少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；第二の鎖が２６〜３６ヌクレオチド残基の長さを有し、３’末端ヌクレオチドから開始して、第一の鎖の１〜２３位と対をなす位置に少なくとも８個のリボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成し；第二の鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドと、及び３’末端の６個までの連続ヌクレオチドが、第一の鎖と対をなさずに、１〜６ヌクレオチドの３’の一本鎖オーバーハングを形成し；第一の鎖の３’末端ヌクレオチドを含む少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて３０個の連続したヌクレオチドが、第二の鎖の５’末端と対をなさず、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖の３’オーバーハングを形成し；第一の鎖の５’末端ヌクレオチドが、第二の鎖の３’の一本鎖オーバーハングと連続した第二の鎖のヌクレオチドと対をなし、かつ第二の鎖の５’末端ヌクレオチドが、第一の鎖の３’オーバーハングと連続した第一の鎖のヌクレオチドと対をなし、それにより第一の鎖と第二の鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成し；第二の鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された際に標的遺伝子発現を低減するように、第二の鎖の少なくとも１９リボヌクレオチドの長さに沿って標的ＲＮＡに対して十分相補的である、単離された二本鎖核酸を提供する。

別の態様において、本発明は、５’末端及び３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と、５’末端及び３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを有する単離された二本鎖核酸であって、各５’末端が５’末端ヌクレオチドを有し、かつ各３’末端が３’末端ヌクレオチドを有し、第一の鎖が３５〜６６ヌクレオチド残基の長さを有し、第一の鎖の５’の一本鎖オーバーハングと連続した５’末端ヌクレオチド（１Ｆ位）から開始して、第一の鎖の１Ｆ〜２８Ｆ位が少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；第二の鎖は、２５〜３６ヌクレオチド残基の長さを有し、かつ、第一の鎖の１Ｆ〜２３Ｆ位と対をなす位置に少なくとも８リボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成し；第一の鎖の３’末端ヌクレオチド及び第二の鎖の５’末端ヌクレオチドは、平滑末端を形成し；第一の鎖の５’末端ヌクレオチドを含む、少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて３０個の連続したヌクレオチドは、第二の鎖の３’末端と対をなさず、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖の５’オーバーハングを形成し；第二の鎖の３’末端ヌクレオチドは、第一の鎖の５’の一本鎖オーバーハングと連続した第一の鎖のヌクレオチドと対をなし、かつ、第一の鎖の３’末端ヌクレオチドは第二の鎖の５’末端ヌクレオチドと対をなし、それにより第一の鎖と第二の鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成し；第二の鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された際に標的遺伝子発現を低減するように、第二の鎖の少なくとも１９リボヌクレオチドの長さに沿って標的ＲＮＡに対して十分相補的である、単離された二本鎖核酸を提供する。

追加の態様において、本発明は、図１〜６、８、１１、１４又は１５のいずれか一つに示す単離された二本鎖核酸を提供する。

一態様において、本発明は、参照ｄｓＲＮＡと比較して、細胞内で標的遺伝子の発現を低減させるのに有効な量の、本明細書に記載する単離された二本鎖核酸を、細胞と接触させる工程を含む、細胞内で標的遺伝子の発現を低減させる方法を提供する。

別の態様において、本発明は、参照ｄｓＲＮＡと比較して、動物の細胞内で標的遺伝子の発現を低減させるのに有効な量の本明細書に記載する単離された二本鎖核酸で動物を処置することを含む、動物において標的遺伝子の発現を低減させる方法を提供する。

一態様において、本発明は、参照ｄｓＲＮＡと比較して、標的遺伝子の発現を低減させるのに有効な量の本明細書に記載する単離された二本鎖核酸と、薬学的に許容され得る担体とを含有する、対象の細胞内で標的遺伝子の発現を低減させる医薬組成物を提供する。

更なる別の態様において、本発明は、二本鎖核酸を化学的に又は酵素的に合成することを含む、本明細書に記載する二本鎖核酸の合成方法を提供する。

尚別の態様において、本発明は、本明細書に記載する二本鎖核酸と、その使用のための指示書とを含むキットを提供する。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様、請求項１の単離された二本鎖核酸において、第一の鎖の２４位から第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基までの間の及び第一の鎖の２４位と第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基とを含む第一の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様、請求項１の単離された二本鎖核酸において、第二の鎖の不対３’末端ヌクレオチドを含まない、少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて１５個の連続したヌクレオチドは、第一の鎖と対をなさず、それにより第二の鎖内に１０〜１５ヌクレオチドの一本鎖の５’オーバーハングを形成する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖は、３０ヌクレオチドまでの長さを有し、かつ第一の鎖の３’から第一の鎖の２３位のヌクレオチドは、第一の鎖の２４位から３’末端ヌクレオチド残基までに、第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなす２、３、４、５及び６個のデオキシヌクレオチド残基を含む。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’の一本鎖オーバーハングは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’オーバーハングのヌクレオチドは、ホスフェートバックボーン修飾を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、ホスフェートバックボーン修飾は、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル及びメチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ又は二環式フラノース類似体である。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’末端ヌクレオチド残基（１Ｂ位）から開始する第二の鎖は、第一の鎖の３’末端残基に対応する第二の鎖の２Ｂ位と５’残基とのヌクレオチドの間にホスホロチオエートバックボーン修飾を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’オーバーハングは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’オーバーハングの全ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’オーバーハングの全ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’オーバーハングのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ又は２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’オーバーハングの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’末端ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、単離された二本鎖核酸は、５’末端及び３’末端を有する第三のオリゴヌクレオチド鎖を更に含み、第三の鎖は、１０〜３０ヌクレオチド残基の長さを有し；第三の鎖の少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて３０個の連続したヌクレオチドは、第二の鎖の５’末端と対をなす。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第三の鎖は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の５’オーバーハングの全ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第三の鎖のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第三の鎖の修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第三の鎖の全ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第三の鎖は、ホスフェートバックボーン修飾を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、ホスフェートバックボーン修飾は、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル及びメチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ又は二環式フラノース類似体である。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第三の鎖の５’末端ヌクレオチド残基（１ｃ位）から開始する第三の鎖は、１ｃ位と２ｃ位とのヌクレオチドの間にホスホロチオエートバックボーン修飾を含む。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’末端ヌクレオチドを含む、少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて１５個の連続したヌクレオチドは、第二の鎖の５’末端と対をなさず、それにより１０〜１５ヌクレオチドの一本鎖の３’オーバーハングを形成する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖は、６６ヌクレオチドまでの長さを有し、かつ第一の鎖の３’から第一の鎖の２３位のヌクレオチドは、第一の鎖の２４位から３’末端ヌクレオチド残基までに、デオキシリボヌクレオチド、２、３、４、５又は６個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、デオキシリボヌクレオチドは、連続したデオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の２４〜３０位の二つ又はそれ以上の連続ヌクレオチド残基は、第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖は、６６ヌクレオチドまでの長さを有し、２４位及び２５位、２５位及び２６位、２６位及び２７位、２７位及び２８位、２８位及び２９位又は２９位及び３０位に一対のデオキシリボヌクレオチドを含み、デオキシリボヌクレオチドの第一の対は、第二の鎖の対応するヌクレオチド対と塩基対をなす。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様、請求項６７の単離された二本鎖核酸において、第一の鎖の３’オーバーハングは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’オーバーハングは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’オーバーハングの全ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’オーバーハングのヌクレオチドは、ホスフェートバックボーン修飾を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、ホスフェートバックボーン修飾は、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ又は二環式フラノース類似体である。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基（１^Ｄ位）から開始する第一の鎖は、１^Ｄ位のヌクレオチドと、第一の鎖の３’オーバーハングと連続した第一の鎖の５’残基のヌクレオチドとの間に、メチルホスホネートバックボーン修飾を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖３’末端ヌクレオチド残基（１^Ｄ位）から開始する第一の鎖は、２^Ｄ位のヌクレオチドと、第一の鎖の３’オーバーハングと連続した第一の鎖の５’残基のヌクレオチドとの間に、メチルホスホネートバックボーン修飾を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’末端ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’オーバーハングのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ又は２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の３’オーバーハングの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖又は第二の鎖の少なくとも８個のリボヌクレオチドは、連続的である。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖は、少なくとも９、１０、１１、１２個及び２５個までのリボヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、リボヌクレオチドは、連続的である。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖２４位から第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基までに対応し及び従って塩基対をなす第二の鎖のヌクレオチドの間の及び該ヌクレオチドを含む第二の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖と第二の鎖との間の実質的に二重鎖の領域は、第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす、第一の鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に不対塩基を有さない完全に二重鎖の領域を有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、実質的に二重鎖の領域は、第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす、第一の鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に；１つの不対塩基対；二つの不対塩基対、３つの不対塩基対、４つの不対塩基対、及び５つの不対塩基対を有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、不対塩基対は、連続し又は連続していない。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなす第一の鎖のデオキシリボヌクレオチドは、連続したデオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖２４位と第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基との間の及び第一の鎖２４位と第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基とを含む第一の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドは、第二の鎖と塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の２４〜３０位の二つ又はそれ以上の連続ヌクレオチド残基は、第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖は、３０ヌクレオチドまでの長さを有し、２４位及び２５位、２５位及び２６位、２６位及び２７位、２７位及び２８位、２８位及び２９位又は２９位及び３０位に一対のデオキシリボヌクレオチドを含み、デオキシリボヌクレオチドの第一の鎖の対は、第二の鎖の対応するヌクレオチド対と塩基対をなす。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖の１〜２８位の８個又はそれ以上のリボヌクレオチドは、連続したリボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一のオリゴヌクレオチド鎖の１〜２８位の各ヌクレオチド残基は、第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすリボヌクレオチドである。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の３’の一本鎖オーバーハングは、１〜４ヌクレオチド、１〜３ヌクレオチド（nucleoties）、１〜２ヌクレオチド又は２ヌクレオチド長の長さを有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の３’オーバーハングのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ又は２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の３’オーバーハングの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の３’オーバーハングの全ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の３’オーバーハングは、２ヌクレオチドの長さを有し、第二の鎖の３’オーバーハングの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖及び第二の鎖の一方又は両方は、５’ホスフェートを有する。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対応する第二の鎖のヌクレオチド残基（１^Ａ位）から開始する第二の鎖は、第一の鎖の３’末端残基に対応する第二の鎖の１６^Ａ位から５’残基までの全位置に非修飾ヌクレオチド残基を含む。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖の３’末端における第一のヌクレオチド（１^Ａ位）から開始して、第二の鎖の３’末端から１^Ａ、２^Ａ及び３^Ａ位は、修飾ヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対応する第二の鎖のヌクレオチド残基（１^Ａ位）から開始する第二のオリゴヌクレオチド鎖は、１^Ａ位から１５^Ａ位までに交互の修飾ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基を含む。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二のオリゴヌクレオチド鎖又は第一のオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドは、ダイサー切断の指向を案内する修飾ヌクレオチドで置換されている。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第一の鎖は、第二の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％相補的なヌクレオチド配列を有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、哺乳動物細胞内でダイサーによって内因的に切断される。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、哺乳動物細胞内で内因的に切断されて、標的遺伝子発現を低減する１９〜２３ヌクレオチド長の二本鎖核酸を生成する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、インビトロで哺乳動物細胞内の標的遺伝子発現を（％で表して）少なくとも１０％、少なくとも５０％又は少なくとも８０〜９０％の量、低減する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、哺乳動物細胞内に導入された際、デオキシリボヌクレオチド−デオキシリボヌクレオチド塩基対を所有しない参照ｄｓＲＮＡと比較して、標的遺伝子発現を低減する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、哺乳動物細胞内に導入された際、１ｎＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満又は１０ｐＭ未満の濃度で細胞内にトランスフェクトされた場合、標的遺伝子発現を少なくとも７０％低減する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸のリボヌクレオチド残基の少なくとも５０％は、非修飾リボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、第二の鎖のリボヌクレオチド残基の少なくとも５０％は、非修飾リボヌクレオチドである。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、標的ＲＮＡは、ＫＲＡＳである。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、適当な対照ＤｓｉＲＮＡと比較した際に、向上された薬物動態を所有する。

上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、適当な対照ＤｓｉＲＮＡと比較した際に、向上された薬力学を所有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、適当な対照ＤｓｉＲＮＡと比較した際に、低下された毒性を所有する。上記のいずれかの態様の様々な実施態様において、二本鎖核酸は、適当な対照ＤｓｉＲＮＡと比較した際に、向上された細胞内取り込みを所有する。

例示的な一本鎖延長ダイサー基質の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。図１Ａにおいて、パネルＡは、一本鎖延長部を有さないＤｓｉＲＮＡを示す。パネルＢは、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＣは、一本鎖延長領域に対して相補的な短いオリゴ（「不連続相補体」；図示すように不連続３’パッセンジャー相補体）を有する、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＤは、パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＥは、パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対において、上部鎖はパッセンジャー鎖であり、下部鎖はガイド鎖である。白色＝ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド）。図１Ｂは、例示的な一本鎖延長ダイサー基質のヌクレオチド修飾及び修飾のパターンを示す。パネルＡは、一本鎖延長部を有さないＤｓｉＲＮＡを示す。パネルＢは、ガイド鎖の５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）を有する「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＣは、一本鎖延長領域に対して相補的な短いオリゴ（「不連続相補体」；図示すように不連続３’パッセンジャー相補体）を有する、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＤは、パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対において、上部鎖はパッセンジャー鎖であり、下部鎖はガイド鎖である。青色＝リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）；灰色＝デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド）。小矢印＝ダイサー切断部位；大矢印＝不連続性。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ａ位）；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ｂ位）。Ｃ＝一本鎖延長領域に対して相補的な短いオリゴの５’末端ヌクレオチドから開始する位置（１^Ｃ位）；Ｄ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ｄ位）；Ｅ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ｅ位）；Ｆ＝第一の鎖の５’の一本鎖オーバーハングと連続した５’末端ヌクレオチドから開始する位置（１^Ｆ位）。小矢印は、予想されるダイサー切断部位を示し；大矢印は、不連続性を示す。同上。同上。ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０〜１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ａ位）；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ｂ位）。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０〜１５ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ａ位）；Ｄ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基から開始する位置。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１３０１Ｐにより示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ；ＤＰ１３３９Ｇ；ＤＰ１３７１Ｇ；及びＤＰ１３３８Ｇにより示される修飾パターンを有するガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。加えて、ＤＰ１３０１Ｐにより示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ；ＤＰ１３３９Ｇ；ＤＰ１３７１Ｇ；及びＤＰ１３３８Ｇにより示される修飾パターンを有するガイド鎖と、ＤＰ１３７２Ｐ及びＤＰ１３７３Ｐにより示される修飾パターンを有する「不連続３’パッセンジャー相補体」鎖とを有する一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。ＤＰ１３７０Ｇにより示される修飾を有するガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１ＸＸＸＧにより示される修飾パターンを有するガイド鎖と、ＤＰ１ＹＹＸＰ；ＤＰ１ＹｘｘＰ；及びＤＰ１ＹｘｘＰにより示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖とを有する一本鎖パッセンジャー延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。ＤＰ１３０１Ｐにより示される修飾を有するパッセンジャー鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。ガイド鎖の１〜１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する、ＫＲＡＳ−２４９Ｍを標的とする例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の配列、構造、及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示されるパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号：１５）；ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号：１６）；ＤＰ１３４０Ｇ（配列番号：１７）；ＤＰ１３４１Ｇ（配列番号：１８）；及びＤＰ１３４２Ｇ（配列番号：１８）により示されるガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成され、試験された。ＤＰ１３０１Ｐにより示されるパッセンジャー（passender）とＤＰ１３３６Ｇにより示されるガイド鎖とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。不連続相補体の修飾パターンの記載を、右側に表示した。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。ＤＰ１３３６Ｇは、配列番号：１４である。図５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＫＲＡＳ−２４９Ｍの発現量（fold expression）を示す柱状グラフ。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。ガイド鎖の１〜１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する、ＨＰＲＴ１を標的とする例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の配列、構造、及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１００１Ｐ（配列番号：１９）により示されるパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３５０Ｇ（配列番号：２１）；ＤＰ１３５１Ｇ（配列番号：２２）；ＤＰ１３５２Ｇ（配列番号：２２）；ＤＰ１３５３Ｇ（配列番号：２３）；ＤＰ１３５４Ｇ（配列番号：２４）；及びＤＰ１３５５Ｇ（配列番号：２４）により示されるガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成され、試験された。ＤＰ１００１Ｐにより示されるパッセンジャー（passender）と、ＤＰ１００２Ｇにより示されるガイド鎖とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。不連続相補体の修飾パターンの記載を、右側に表示した。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。ＤＰ１００２Ｇは、配列番号：２０である。図７に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＨＰＲＴ１の発現量を示す柱状グラフ。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。ＫＲＡＳ−２４９Ｍ又はＨＰＲＴ１を標的とする一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤（パッセンジャー＋ガイド鎖）上のダイサー活性を示すゲルの画像。処理：２ｈ＠３７ＣＴｕｒｂｏダイサー（１Ｕ／反応物）。ゲル：１８％Ｔｒｉｓ９０’＠１０Ｗ。負荷：（１μｌ５０μＭ＋５０μｌ緩衝液及び負荷１０μｌ）又は（５μｌ反応物＋２０μｌ緩衝液及び負荷１０μｌ）。１〜１６ヌクレオチド長であり、５’ガイド鎖延長部と塩基対をなす、ガイド鎖延長部（「不連続相補体」）を相補する例示的な短いオリゴの配列及び構造。ＤＰ１３６５Ｐ（配列番号：２５）；ＤＰ１３６６Ｐ（配列番号：２５）；ＤＰ１３６７Ｐ（配列番号：２６）；ＤＰ１３６８Ｐ（配列番号：２５）；及びＤＰ１３６９Ｐ（配列番号：２５）により示される不連続相補体を有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成され、試験された。不連続相補体の修飾パターンの記載を、右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。それぞれのヌクレオチド対における下部の鎖は、配列番号：２７である。図７に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖と、図１０に示した不連続相補体とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＫＲＡＳ−２４９Ｍの発現量を示す柱状グラフ。使用した不連続相補体を、５’ガイド一本鎖延長部（ｌ．−ｒ．ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’ＯＭｅＲＮＡ）を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤に対応する３つの棒グラフの各セットの上方に表示する。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。図７に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖と、図１０に示した不連続相補体とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＨＰＲＴ１の発現量を示す柱状グラフ。使用した不連続相補体を、５’ガイド一本鎖延長部（ｌ．−ｒ．ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’ＯＭｅＲＮＡ）を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤に対応する３つの棒グラフの各セットの上方に表示する。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。インビボでの実験における例示的な一本鎖延長ダイサー基質の構造及び予想されるダイサー−仲介加工（実験条件：処理：１０ｍｇ／ｋｇ１回の注入；標的：ＫＲＡＳ；トランスフェクション：インビボフェクタミン；組織：肝臓）。パネルＡは、一本鎖延長部を有さない負対照に使用される修飾パターンを示す。パネルＢは、一本鎖延長部を有さない正対照ＤｓｉＲＮＡに使用される修飾パターンを示す。パネルＣは、一本鎖延長部を有さない試験ＤｓｉＲＮＡに使用される修飾パターンを示す。パネルＤは、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する、試験「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤に使用される修飾パターンを示す。パネルＥは、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する、試験「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤に使用される修飾パターンを示す。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対において、上部鎖はパッセンジャー鎖であり、下部鎖はガイド鎖である。青色＝リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）；灰色＝デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド）。小矢印＝ダイサー切断部位；大矢印＝不連続性。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１^Ａ位）；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基から開始する位置。小矢印は、予想されるダイサー切断部位を示し；大矢印は、不連続性を示す。ガイド鎖の１〜１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する、ＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ１を標的とする例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の配列、構造、及び予想されるダイサー−仲介加工。ガイド鎖延長部（「不連続相補体」）を相補する例示的な短いオリゴの配列及び構造は、５’ガイド鎖延長部配列と塩基対をなすよう示される。ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号：１５）、ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号：１６）、ＤＰ１３３９Ｇ（配列番号：１６）、ＤＰ１３７１Ｇ（配列番号：１６）、及びＤＰ１３５２Ｇにより示される修飾パターンを有するガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。加えて、ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号：１５）、ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号：１３）、ＤＰ１３３９Ｇ（配列番号：１６）、ＤＰ１３７１Ｇ（配列番号：１６）、及びＤＰ１３５２Ｇ（配列番号：２２）により示される修飾パターンを有するガイド鎖と；ＤＰ１３７２Ｐ（配列番号：２８）及びＤＰ１３７３Ｐ（配列番号：２８）により示される修飾パターンを有する「不連続相補体」鎖とを有する一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示される修飾を有するパッセンジャー鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を参照として使用し、ＤＰ１３７０Ｇ（配列番号：１３）により示される修飾を有するガイド鎖を参照として使用した。パッセンジャー鎖、ガイド鎖、及び不連続相補体の用量を右側に表示する。不連続相補体の修飾パターンの記載も、右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す配列番号：２８は、配列番号：２９と対形成する。ＤＰ１３７０Ｇは、配列番号：１４である。。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した個々の動物の肝臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、肝臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の肝臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、肝臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の肝臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示すグラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、肝臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した個々の動物の脾臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、脾臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の脾臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、脾臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の脾臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示すグラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、脾臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した個々の動物の腎臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、腎臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の腎臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、腎臓サンプルを分析した。図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の腎臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示すグラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、腎臓サンプルを分析した

本発明は、細胞を、細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の単離された二本鎖核酸と接触させることを含む、細胞内で標的遺伝子の発現を低減するための組成物及び方法を提供する。本発明のｄｓＮＡｓは、アンチセンス鎖の５’末端又はセンス鎖の３’末端のいずれかに一本鎖ヌクレオチド領域を所有し、有効なＲＮＡ干渉薬剤である（殆どの実施態様では、一本鎖延長部は、少なくとも一つの修飾ヌクレオチド及び／又はホスフェートバックボーン修飾を含む）。驚くべきことに、本明細書に示すように、一本鎖延長ダイサー−基質ｓｉＲＮＡｓ（ＤｓｉＲＮＡｓ）は、対応するＤｓｉＲＮＡｓと比較した場合に有効なＲＮＡ阻害剤であった。

一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が有効性の低下を有さないという驚くべき発見により、そのような一本鎖ＤＮＡ−延長ドメインを含まない対応する長さのｄｓＲＮＡ薬剤と比較した場合、有効な状態を維持する一方で、例えば追加の及び／又は別個の官能基に対するＤｓｉＲＮＡｓの取り付け、安定化修飾（例えばＰＳ−ＮＡ部分）、又は更なる機能性の追加、及び／若しくは例えばそれらの薬剤の薬物動態、薬力学若しくは生体内分布を向上させることが可能な他の修飾形態の包含／パターン化のためのより大きい空間を提供するＤｓｉＲＮＡｓの生成が可能となる。

ダイサー−加工後のｓｉＲＮＡ薬剤の活性を同様の長さのｄｓＲＮＡ二重鎖よりも高いレベルに維持するとともに、ＤｓｉＲＮＡ含有ｄｓＮＡ二重鎖の５’ガイド鎖、３’パッセンジャー鎖又は５’パッセンジャー鎖のいずれかを伸長することによる、新たに発見された能力により提供される利点は、本明細書に提示する結果により強調される。ＤｓｉＲＮＡ薬剤の５’ガイド鎖、３’パッセンジャー鎖又は５’パッセンジャー鎖のいずれかを、対応するＲＮＡサイレンシング活性の低下を観察することなく延長する能力はまた、所定の官能基をそれらの薬剤に取り付けることを可能にし得、このことは、それらの官能基がより緊密な立体配置内に存在する場合、ＲＮＡサイレンシング活性を妨げる能力により不可能である。

加えて、一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤は、一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡｓの一本鎖領域と塩基対をなす、例えばガイド鎖の５’の一本鎖延長領域と塩基対をなす第三の短い（１〜１６ヌクレオチド長）オリゴヌクレオチドを含んでもよい。第三のオリゴは、一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤の使用の以下の利点を提供する：（ａ）一本鎖延長部を安定化する（特定の理論に束縛されず、単一の鎖延長ＤｓｉＲＮＡは、急速に分解し得る）及び（ｂ）標的分子（又は他の活性薬剤）を取り付けることが可能な独立した実体を提供し、該標的分子は次に（標的分子の一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡに対する直接的な取り付けと対比して）アニーリングを介して、一本鎖鎖延長ＤｓｉＲＮＡに連結され得る。

定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多数の用語の一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and MolecularBiology
(2nd ed. 1994)；Cambridge Dictionary of Science and
Technology (Walker ed., 1988)；Glossary of genetics,
5thEd., R. Rieger et al., (eds.), Springer Verlag (1991)；及びHale & Marham,Harper CollinsDictionary ofBiology (1991)。本明細書で使用される以下の用語は、特に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。

本明細書で使用される用語「核酸」は、一本鎖−又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、また所定の場合において、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、合成、天然に存在する及び天然に存在しない、既知のヌクレオチド類似体又は修飾バックボーン残基若しくは結合を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、当技術分野で認識されるように、天然塩基（基準）及び当技術分野にて既知の修飾塩基を含むように使用される。それらの塩基は、概してヌクレオチド糖部分の１’位に位置している。ヌクレオチドは、概して塩基、糖及びホスフェート基を含む。ヌクレオチドは、糖、ホスフェート及び／又は塩基部分において非修飾又は修飾されていてもよい（交換可能にヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非−天然ヌクレオチド、非−基準ヌクレオチド及びその他とも称される；例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるＵｓｍａｎ及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、前出；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ、前出、を参照）。Limbach et al, Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994に概略されているように、当技術分野にて既知の修飾核酸塩基の数個の例が存在する。核酸分子中に導入され得る塩基修飾のいくつかの非限定的な例には、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、プロピン及び他が挙げられる（Burgin et al., Biochemistry 35: 14090, 1996;Uhlman & Peyman、前出）。本態様において「修飾塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらの等価物を意味する。

本明細書で使用される「二本鎖核酸」又は「ｄｓＮＡ」は、二重鎖を形成する二つのオリゴヌクレオチド鎖を含む分子である。ｄｓＮＡは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。本発明の二本鎖ＮＡｓは、ＲＮＡ干渉経路におけるタンパク質及びタンパク質複合体、例えばダイサー及びＲＩＳＣの基質である。本発明のｄｓＮＡの一つの形態の例示的な構造を、図１Ａ、パネルＢに示し、そのような構造は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）として機能することが可能な領域内のＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ薬剤の第二の鎖の推定されるダイサー切断部位の５’位に位置する一本鎖領域と、を特徴的に含む。本発明のｄｓＮＡの他の形態の例示的な構造を図１Ａ、パネルＣに示し、そのような構造は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）して機能することが可能な領域内のＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ薬剤の第一の鎖の推定ダイサー切断部位の３’位に位置する一本鎖領域と、を特徴的に含む。更なる実施態様において、本発明は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）して機能することが可能な領域内のＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ薬剤の第二の鎖の推定ダイサー切断部位の３’位に位置する、少なくとも一つの修飾ヌクレオチド及び／又はホスフェートバックボーン修飾を含む一本鎖領域と、を特徴的に含む構造を提供する。代替的な実施態様では、本発明は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）して機能することが可能なＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ薬剤の第一の鎖の推定ダイサー切断部位の５’位に位置する、少なくとも一つの修飾ヌクレオチド及び／又はホスフェートバックボーン修飾を含む一本鎖領域と、を特徴的に含む構造を提供する。

所定の実施態様において、本発明のＤｓｉＲＮＡｓは、ダイサー酵素切断部位（一つ又は複数）に直に隣接する部位において、デオキシリボヌクレオチド残基を所有し得る。例えば、図２に示す全部のＤｓｉＲＮＡｓ、及び図３に示す６つめ、７つめ、８つめ、９つめ、１０個め、１１個め及び１２個めのＤｓｉＲＮＡｓにおいて、デオキシリボヌクレオチドは、（第一の鎖の５’末端残基を１位として開始して）２４位、及び２４位の３’側の位置（例えば２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０等）に見出すことができる。デオキシリボヌクレオチドはまた、第一の鎖の２０位に相補的なヌクレオチドにて開始する第二の鎖上に配置されてもよく、また、このヌクレオチドの５’方向に位置する第二の鎖上の位置に配置されてもよい。それ故、本発明の所定の有効なＤｓｉＲＮＡｓは、そのようなＤｓｉＲＮＡｓの第一の鎖、第二の鎖及び／又は両方の鎖内へのデオキシリボヌクレオチドの導入の開始前に、１９個の二重鎖のリボヌクレオチドのみ所有する。

本明細書で使用される「二重鎖」は、二つの一本鎖核酸の相互作用により形成される二重の螺旋構造を指す。本発明によれば、二重鎖は、センス及びアンチセンス、又は標的及びアンチセンスである第一の鎖及び第二の鎖を含んでもよい。二重鎖は、一般に、互いに関連して逆平行に配向された二つの一本鎖核酸の間の、塩基の対での水素結合、即ち「塩基対形成」により形成される。本明細書で使用される用語「二重鎖」は、鎖の整合された対が相補的である場合、それらがＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対であり得るように整合する、第一の鎖及び第二の鎖の領域を指す。用語「二重鎖」は、５’又は３’末端一本鎖ヌクレオチドを含む一つ又はそれ以上の一本鎖ヌクレオチドを含まない。用語「二重鎖」は、完全に（１００％）塩基対をなし得る整合された第一の鎖及び第二の鎖の領域と、第一の鎖の５’末端ヌクレオチドと第一の鎖の３’末端ヌクレオチドとが第二の鎖の対応するヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対をなす限りにおいて、１、２、３、４又は５個の不対塩基を含む整合された第一の鎖及び第二の鎖の領域とを含む。本明細書で使用される「完全に二重鎖の」は、対をなす５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間の全ヌクレオチドが塩基対をなすことを指す。本明細書で使用される「実質的に二重鎖の」は、第一の鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に１、２、３、４、５個の不対塩基対（連続又は不連続）が存在するような、鎖同士の間の二重鎖を指す。

二重鎖間の対形成は、概してＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成により生じ、例えばグアニン（Ｇ）は、ＤＮＡ及びＲＮＡ中のシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し（それ故、グアニンデオキシリボヌクレオチドの同族ヌクレオチドは、シトシンデオキシリボヌクレオチドであり、またその逆である）、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、またＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する。塩基対が形成され得る条件としては、生理学的又は生物学的に関連した条件（例えば細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）が挙げられる。更に、二重鎖は、隣接するヌクレオチド間の積み重ね相互作用により安定化される。本明細書で使用される二重鎖は、塩基対形成又は積み重ね相互作用によって確立又は維持され得る。二重鎖は、実質的に相補的な又は完全に相補的であり得る二つの相補的な核酸鎖により形成される（下記参照）。

本明細書で使用される「に対応する」又は「に対応している」は、第二の鎖が１〜６ヌクレオチド長の３’の一本鎖オーバーハングを含むように第一の鎖の１位が前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなした際に、前記第二の鎖のヌクレオチド残基が第一の鎖の残基と整合するように、二重鎖に整合された第一の鎖及び第二の鎖の塩基を指す。「に対応する」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対の形成を介した対形成を必要とせず、整合された及び不対の第一の鎖／第二の鎖のヌクレオチドと、整合された及び塩基対をなす第一の鎖／第二の鎖のヌクレオチドとの両方を含む。

「相補的な」又は「相補性」は、核酸が、伝統的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ又はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成のいずれかにより、別の一核酸配列と水素結合を形成できることを意味する。本開示の核酸分子を参照して、核酸分子のその相補的な配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えばＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、当技術分野にて周知である（例えばTurner, et al., CSH Symp. Quant.Biol. LII, pp. 123-133, 1987；Frier, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377, 1986；Turner, et al., J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785, 1987を参照）。パーセント相補性は、第二の核酸配列と水素結合（例えばＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成）を形成できる核酸分子中の連続的な残基の百分率を示す（例えば１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と塩基対をなす第一のオリゴヌクレオチド中の全部の１０ヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドは、各々、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補性である）。パーセント相補性が少なくとも所定の百分率であることを決定するには、第二の核酸配列と水素結合を形成できる（例えばＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成）核酸分子中の連続的な残基の百分率を計算し、最も近い整数に四捨五入する（例えば、２３ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と塩基対をなす第一のオリゴヌクレオチド中の全２３ヌクレオチドのうちの１２、１３、１４、１５、１６又は１７ヌクレオチドは、各々、５２％、５７％、６１％、６５％、７０％及び７４％を表し；各々、少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％及び７０％相補性を有する）。本明細書で使用される「実質的に相補的な」は、それらが生物学的条件条件下でハイブリダイズ可能な、鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は更には１００％の相補性を有する。加えて、二つの鎖が生物学的条件条件下でハイブリダイズ可能であるか否かを、それらのヌクレオチド配列を調べることにより決定する技術は、当技術分野にて周知である。

アンチセンス鎖に関連して本明細書で使用される「３’領域」は、対応するセンス鎖の１〜１９、１〜２０又は１〜２１位と整合するアンチセンス鎖のヌクレオチドに対して３’方向（アンチセンス鎖上で）である、アンチセンス鎖の連続ヌクレオチドを指す。疑念を避けるために、アンチセンス鎖を指す際、「３’領域」は、推定アルゴノート２（Ａｇｏ２）切断部位に対して３’方向（５’方向である標的ＲＮＡ上のヌクレオチドに対応するアンチセンス鎖上の）における、アンチセンス鎖と、その同族標的ＲＮＡとの間で形成された二重鎖内のアンチセンスヌクレオチドを包含するものとする。

本発明の薬剤の第一の鎖及び第二の鎖（センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、二重鎖の領域内で完全に相補的である必要はない。一実施態様において、アンチセンス鎖のＲＮＡ配列は、一つ又はそれ以上のミスマッチ（１、２、３、４又は５個の連続又は不連続）を含み、即ち本発明による単離された二本鎖核酸の二重鎖のセンス鎖に関連してミスマッチされ、一つ又はそれ以上の（１、２、３、４又は５個の連続又は不連続）修飾ヌクレオチド（塩基類似体）を含む。例示的な実施態様では、そのようなミスマッチは、上記に定義したアンチセンス鎖のＲＮＡ配列の３’領域内に生じる。一態様において、２、３、４又は５個のミスマッチ、又は塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列がハイブリダイズされた際、標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖内の３’側である、アンチセンス鎖のＲＮＡ配列内に組み込まれる。

ミスマッチ又は低下された熱力学的安定性（詳細には、ｓｉＲＮＡｓのセンス領域の３’−末端残基／アンチセンス領域の５’−末端残基又はその近辺における）の使用は、おそらくは、ｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入により生じるある巻き戻しの律速段階に影響を与えることによって、アンチセンス鎖のＲＩＳＣ中への進入を促進し又は進入に有利に働くことが提案されている。それ故、末端塩基組成物は活性２１ｍｅｒｓｉＲＮＡ二重鎖を選択するための設計アルゴリズムに含まれている（Ｕｉ−Ｔｅｉら、２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４）。

本発明のＤｓｉＲＮＡ薬剤にそのようなミスマッチを含ませることにより、それらの薬剤が天然に存在するｍｉＲＮＡｓと類似した阻害効果を発揮することを可能にし得、また場合により、天然に存在するｍｉＲＮＡ標的ＲＮＡｓ（例えば標的転写産物の３’ＵＴＲ領域）のみではく、それに対する天然に存在する拮抗性ｍｉＲＮＡの存在が知られていないＲＮＡ配列に対して指向させることができる。例えば、ｍｉＲＮＡｓと類似し及び／又はｍｉＲＮＡｓとして機能するよう設計された、ミスマッチ塩基対を所有する本発明のＤｓｉＲＮＡｓを合成して、天然に存在するｍｉＲＮＡｓにより標的とされない可能性がある遺伝子／転写産物内の反復配列を標的とすることができる（例えば、Ｎｏｔｃｈ内の個々の反復が核酸レベルで互いに異なり得る（例えば縮重されている）が、対応する完全なマッチｓｉＲＮＡ薬剤と比較して、ミスマッチを容認し、またより雑多な阻害効果を容認するｍｉＲＮＡ機構を介して有効に標的とすることができる）。そのような実施態様では、阻害効果を発揮するために、ミスマッチ含有ＤｓｉＲＮＡ薬剤に関する標的ＲＮＡ切断は、必要であり得又は不必要であり得る。

一実施態様において、本発明の二本鎖核酸分子は、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、又はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として機能する。「ミクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡ切断、翻訳、抑制／阻害又は異質染色質サイレンシングのいずれかによって標的メッセンジャーＲＮＡの発現を調節する小二本鎖ＲＮＡを意味する（例えばAmbros, 2004, Nature, 431, 350-355;Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297；Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9； He
et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531 ；及びYing et
al., 2004, Gene, 342, 25-28参照）。一実施態様において、本発明のミクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖（例えば第一の鎖）又はセンス領域と、アンチセンス鎖（例えば第二の鎖）又はアンチセンス領域との間、又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子（例えば標的ｍＲＮＡ）との間に、部分的相補性（即ち１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、二本鎖核酸分子構造内の様々なミスマッチ又は非塩基対ヌクレオチド（例えばヌクレオチドバルジ等の１、２、３、４、５個又はそれ以上のミスマッチ又は非塩基対ヌクレオチド）を含んでもよく、これは、センス鎖又はセンス領域とｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間、又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。

多数の塩基に亘って塩基対をなす一本鎖核酸は、「ハイブリダイズ」していると言われる。ハイブリダイゼーションは、一般に、生理学的又は生物学的に関連した条件（例えば細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）下で測定される。ハイブリダイゼーション条件は、概して、一価陽イオン及び生物学的に許容され得る緩衝液を含み、二価陽イオン、複合体陽イオン、例えばグルコン酸カリウム由来のグルコン酸塩、ショ糖等の無電荷種、及びサンプル中の水の活性を低減する不活性ポリマー、例えばＰＥＧを含んでも又は含まなくてもよい。そのような条件は、その下で塩基対が形成され得る条件を含む。

ハイブリダイゼーションは、二重鎖を形成している一本鎖核酸の解離に必要な温度、即ち（融点；Ｔｍ）により測定される。ハイブリダイゼーション条件はまた、その下で塩基対が形成され得る条件である。様々な厳密性条件を使用してハイブリダイゼーションを測定することができる（例えばWahl, G. M. and S. L.Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel,
A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照）。厳密な温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。５０未満の塩基対の長さを有すると予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低い必要があり、Ｔｍは以下の等式に従って決定される。１８未満の塩基対の長さのハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さ１８〜４９塩基対のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎは、ハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（ｌ×ＳＳＣに関する［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。例えば、ハイブリダイゼーション測定緩衝液は、表１に示される。
表１

ハイブリダイゼーション条件の有用な変動は、当業者に容易に明かであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis(Science 196: 180, 1977)；
Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975);Ausubelら(Current Protocols in MolecularBiology, Wiley Interscience, New
York, 2001)；Berger and Kimmel (Antisense to Molecular
Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；及びSambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New Yorkに記載されている。

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば２’修飾を有するヌクレオチド、合成塩基類似体等）又はそれらの組み合わせを含んでもよい。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、向上された細胞取り込み、及びヌクレアーゼの存在下の改善された安定性等の特性により、天然形態よりも好ましい場合がある。

本発明の所定のｄｓＮＡｓは、キメラｄｓＮＡｓである。本発明の文脈において、「キメラｄｓＮＡｓ」又は「キメラ」は、各々が少なくとも一つのヌクレオチドから構成される、二つ又はそれ以上の化学的に区別される領域を含むｄｓＮＡｓである。これらのｄｓＮＡｓは、一般に、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）分子を形成するリボヌクレオチド（場合により修飾リボヌクレオチドを含む）を主に含む少なくとも一つの領域を含んでいる。このＤｓｉＲＮＡ領域は、例えば従来のホスフェート結合又は修飾ホスフェート結合（例えばホスホロチオエート）を介して、一本鎖ヌクレオチド領域（「一本鎖延長領域」）を含む第二の領域に共有結合し、この第二の領域は、一つ又はそれ以上の有益な特性を付与する（例えば、有効性の増大、例えば効能及び／又はＤｓｉＲＮＡ活性の持続時間の増大、認識ドメイン又は特定の位置に対するキメラｄｓＮＡのターゲティングの手段としての機能、例えば培養液中の細胞又は対象に投与された際、官能基、ペイロード、検出／検出可能部分の取り付けを改善するための延長領域としての機能、より望ましい修飾及び／又はそのような修飾の改善された空間を可能にする延長領域としての機能等）。この第二の領域は、修飾若しくは合成ヌクレオチド、及び／又は修飾若しくは合成デオキシリボヌクレオチドも含み得る。

本明細書で使用される用語「リボヌクレオチド」は、天然及び合成の、非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分に対する変更、塩基部分に対する変更、及び／又はオリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチド間の結合に対する変更を含む。本明細書で使用される用語「リボヌクレオチド」は、詳細には、リボース環の２’位に単一のプロトン基を所有するヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチドを除外する。

本明細書で使用される用語「デオキシリボヌクレオチド」は、天然及び合成の、非修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分に対する変更、塩基部分に対する変更、及び／又はオリゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変更を含む。本明細書で使用される用語「デオキシリボヌクレオチド」は、ｄｓＮＡ薬剤のダイサー切断を可能としない、例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−修飾リボヌクレオチド残基等の修飾リボヌクレオチドも含み、これらは、それらの残基の結合部にダイサー切断が起こることを可能としない。

本明細書で使用される用語「ＰＳ−ＮＡ」は、ホスホロチオエート−修飾ヌクレオチド残基を指す。従って用語「ＰＳ−ＮＡ」は、ホスホロチオエート−修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡｓ」）及びホスホロチオエート−修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡｓ」）の両方を包含する。

所定の実施態様において、本発明のキメラＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ薬剤は、少なくとも２３ヌクレオチド長の少なくとも一つの二重鎖領域を含み、該二重鎖領域内で全ヌクレオチドの少なくとも５０％が非修飾リボヌクレオチドである。本明細書で使用される用語「非修飾リボヌクレオチド」は、リボース糖の２’位にヒドロキシル（−ＯＨ）基を所有するリボヌクレオチドを指す。

所定の実施態様において、本発明のキメラＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ薬剤は、第一の鎖上の推定ダイサー切断部位の３’側、及び第二の鎖上の推定ダイサー切断部位の５’側に位置する、少なくとも２塩基対のヌクレオチド長の長さを有する少なくとも一つの領域を含み、この少なくとも２塩基対のヌクレオチド長の領域内の全ヌクレオチドの５０％は、非修飾デオキシリボヌクレオチドである。本明細書で使用される用語「非修飾デオキシリボヌクレオチド」は、リボース糖の２’位に単一のプロトンを所有するリボヌクレオチドを指す。

本明細書で使用されるアンチセンス鎖、ガイド鎖及び第二のオリゴヌクレオチドは、本発明による所定のダイサー基質分子の同一の鎖を指し；一方、センス鎖、パッセンジャー鎖、及び第一のオリゴヌクレオチドは、所定のダイサー基質の同一の鎖を指す。

本明細書で使用される「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、必ずしもその完全長に亘って相補的ではないが、少なくとも標的ＲＮＡとハイブリダイズする必要がある。

本明細書で使用される「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、必ずしもアンチセンス鎖の完全長に亘って相補的ではないが、少なくともアンチセンス鎖とハイブリッドを形成することが可能である必要があり、それ故アンチセンス鎖との二重鎖形成が可能である必要がある。

本明細書で使用される「ガイド鎖」は、標的ＲＮＡの配列に対して十分相補的な配列を有してＲＮＡ干渉をもたらす、ｄｓＮＡ又はｄｓＮＡ含有分子の一本鎖核酸分子を指す。ダイサーによってｄｓＮＡ又はｄｓＮＡ含有分子が切断された後、ＲＩＳＣと関連して残留したガイド鎖の断片が、ＲＩＳＣ複合体の構成成分として標的ＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣによる標的ＲＮＡの切断を促進する。ガイド鎖は、アンチセンス鎖である。

本明細書で使用される「標的ＲＮＡ」は、標的切断又は立体妨害等の、アンチセンス鎖により案内される調節に付されるＲＮＡを指す。標的ＲＮＡは、例えばウイルスゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレ−ｍＲＮＡ又は非コード化ＲＮＡであり得る。好ましい標的は、ＡｐｏＢ、Ｂｃｌ２、Ｈｉｆ−ｌａｌｐｈａ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、又はＨａ．ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ若しくはＮ−ｒａｓ等のｐ２１ｒａｓのような、疾病関連のタンパク質をコードするｍＲＮＡ等のｍＲＮＡである。

本明細書で使用される「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖の配列に対して相補的な配列を有する、ｄｓＮＡ又はｄｓＮＡ含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を指す。パッセンジャー鎖は、センス鎖である。

本明細書で使用される「ダイサー」は、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はプレ−ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常３’末端上に二塩基オーバーハングを有する約１９〜２５ヌクレオチド長の二本鎖核酸断片に切断する、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼを指す。本発明のｄｓＮＡｓに関連して、本発明のｄｓＮＡのｄｓＲＮＡ領域により形成される二重鎖はダイサーにより認識され、二重鎖の少なくとも一つの鎖上においてダイサー基質である。ダイサーはＲＮＡ干渉経路の第一のステップを触媒し、これは結果として標的ＲＮＡの分解をもたらす。ヒトダイサーのタンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩデータベースにてアクセッションナンバーＮＰ＿０８５１２４で提供されている。

ダイサー「切断」は、以下のように測定される（例えばCollingwood et al., Oligonucleotides 18: 187-200 (2008)参照）。ダイサー切断アッセイにおいて、ＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）を２０μＬの２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、２００ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＭｇＣ１_２中で、１単位の組み換えヒトダイサー（ストラタジーン、カリフォルニア州ラホーヤ（LaJolla））と共に３７℃で１８〜２４時間インキュベートする。ＰｅｒｆｏｒｍａＳＲ９６−ウェルプレート（エッジバイオシステムズ、メリーランド州ゲイザースバーグ）を使用してサンプルを脱塩する。ダイサーを用いたエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析法（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）の二重鎖ＲＮＡｓ前−及び後処理を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ加工ソフトウェア及びＰａｒａｄｉｇｍＭＳ４ＨＰＬＣ（ＭｉｃｈｒｏｍＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、カリフォルニア州オーバーン）からなるＯｌｉｇｏＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ、ニュージャージー州プリンストン；Ｈａｉｌら、２００４）を使用して行う。このアッセイでは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は更には１００％のダイサー基質ｄｓＲＮＡ、（即ち２５〜３５ｂｐｄｓＲＮＡ、好ましくは２６〜３０ｂｐｄｓＲＮＡ、場合により本明細書に記載するように延長）がより短いｄｓＲＮＡ（例えば１９〜２３ｂｐｄｓＲＮＡ、好ましくは２１〜２３ｂｐｄｓＲＮＡ）に切断されるダイサー切断が起こる。

本明細書で使用される「ダイサー切断部位」は、ダイサーがｄｓＲＮＡを切断する部位を指す（例えば、本発明のｄｓＮＡのｄｓＲＮＡ領域）。ダイサーは、一般に、ｄｓＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖の両方を切断する二つのＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む。ＲＮａｓｅＩＩＩドメインとＰＡＺドメインとの間の平均距離は、ダイサーが生成する短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、この距離は変更することができる（ＭａｃｒａｅＩら（２００６）。「Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer」。Science 311 (5758): 195-8。）例えば図２に示すように、ダイサーは、２ヌクレオチド３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を所有する本発明の所定の二本鎖核酸を、アンチセンス鎖の３’末端から２１ｓｔと２２ｎｄヌクレオチドとの間の部位において、及びセンス鎖の５’末端から２１ｓｔと２２ｎｄヌクレオチドとの間の対応する部位において切断して、除去すると推定される。図２に示したものとは異なるｄｓＮＡ分子の推定される及び／又は一般的なダイサー切断部位は、Ｍａｃｒａｅらに記載されているものを含む、当技術分野にて認められている方法により同様に同定することができる。図２に示したダイサー切断事象は２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡを生成するが、ｄｓＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ）のダイサー切断は、１９〜２３ヌクレオチド長の長さのダイサー−加工ｓｉＲＮＡの生成をもたらし得ることに注目される。実際に、以下により詳細に記載される本発明の一態様では、二本鎖ＤＮＡ領域は、一般に非優先の１９ｍｅｒｓｉＲＮＡの一般的なダイサー切除を案内する目的で、ｄｓＮＡ中に含められる。

本明細書で使用される「オーバーハング」は、ｄｓＮＡの５’末端又は３’末端のいずれかに２つ又は４つの遊離末端を有する二重鎖の状況において、不対ヌクレオチドを指す。

所定の実施態様において、オーバーハングは、アンチセンス鎖又はセンス鎖上の３’又は５’オーバーハングである。

本明細書で使用される「標的」は、その発現又は活性が変更される任意の核酸配列を指す。特定の実施態様において、標的は、ＲＩＳＣ複合体内のアンチセンス鎖である一本鎖核酸と二重鎖をなすＲＮＡを指す。アンチセンス鎖に対する標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、ＲＩＳＣ複合体による加工をもたらす。その結果、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡによりコードされるＲＮＡ又はタンパク質の発現が低減される。

本明細書で使用される用語「ＲＮＡ加工」は、以下により詳細に記載される、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＲＮａｓｅＨ経路の構成成分（例えばドローシャ、ダイサー、アルゴノート２又は他のＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨ）により行われる加工活性を指す（下記の「ＲＮＡ加工」セクション参照）。この用語は、ＲＮＡの５’キャッピングの転写後加工、及び非−ＲＩＳＣ−又は非−ＲＮａｓｅＨ−仲介プロセスを介したＲＮＡの分解とは明確に区別される。そのＲＮＡの「分解」は、例えば脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）、及び／又は数個のエンド−又はエキソ−ヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＴｌ、ＲＮａｓｅＡ（１、２、３、４／５）、オリゴオリゴヌクレオチダーゼ等）のいずれかによる、ＲＮＡの本体の一部又は全部のヌクレアーゼ消化等のいくつかの形態をとることができる。

本明細書で使用される「参照」は、基準又は対照を意味する。当業者に明かなように、適切な参照は、１つの要素の効果を決定ために、その１つの要素のみが変更されている。

本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、フラノース環又はホスフェート基に対する一つ又はそれ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシンモノホスフェート、グアノシンモノホスフェート、ウリジンモノホスフェート及びシチジンモノホスフェートを含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシンモノホスフェート、デオキシグアノシンモノホスフェート、デオキシチミジンモノホスフェート及びデオキシシチジンモノホスフェートを含有するデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾は、ヌクレオチドを修飾する酵素、例えばメチルトランスフェラーゼによる修飾から生じる天然に存在するものを含む。修飾ヌクレオチドは、合成又は天然に存在しないヌクレオチドも含む。ヌクレオチド内の合成又は天然に存在しない修飾には、２’修飾、例えば２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）又は塩基類似体を含むものが挙げられる。本開示にて記載される２’−修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は、修飾又は非修飾であってもよい２’−ＮＨ_２又は２’−Ｏ−ＮＨ_２を意味する。そのような修飾基は、例えばＥｃｋｓｔｅｉｎら、米国特許第５，６７２，６９５号及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら、米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。

用語「インビトロでの」は、その技術分野にて認識されている意味を有し、例えば精製試薬又は抽出物、例えば細胞抽出物に関与する。用語「インビボでの」もその技術分野にて認識されている意味を有し、例えば生細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株、及び／又は生物中の細胞を含む。

本開示の核酸分子を参照して、ｄｓＮＡのいずれかの鎖上の所定の位置におけるヌクレオチドは、特定され得る。図１〜３を参照して、本発明のＤｓｉＲＮＡｓの位置を表示すための慣習は、表２に示される。
表２鎖位置に関する付番の慣習の記載

本開示の核酸分子を参照して、修飾はｄｓＮＡの鎖上のパターンにて存在し得る。本明細書で使用される「交互の位置」は、規定されたｄｓＮＡ鎖長に亘って、一つ置きのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、又は各修飾ヌクレオチドの間に非修飾ヌクレオチド（例えば、非修飾リボヌクレオチド）が存在するパターンを指す（例えば５’−ΜΝΜΝΜΝ−３’；３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’；式中、Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書に記載する任意の位置付番慣習に従って５’又は３’末端のいずれかの第一のヌクレオチド位置から開始する（所定の実施態様では、１位は、本発明のＤｓｉＲＮＡ薬剤の推定ダイサー切断事象の後、鎖の末端残基を参照して指定され；それ故、１位は、常に本発明の加工前薬剤の３’末端又は５’末端残基を構成するわけではない）。交互の位置の修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の完全長を延びてもよいが、所定の実施態様では、各々が少なくとも２、３、４、５、６又は７個の修飾ヌクレオチドを含有する少なくとも４、６、８、１０、１２、１４個のヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「交互の位置の対」は、規定されたｄｓＮＡ鎖長に亘って、二つの連続修飾ヌクレオチドが、二つの連続非修飾ヌクレオチドにより分離されているパターンを指す（例えば５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’；３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’；式中、Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書に記載する任意の位置付番慣習に従って５’又は３’末端のいずれかの第一のヌクレオチドの位置から開始する。交互の位置の修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の完全長を延びてもよいが、好ましくは、各々が少なくとも４、６、８、１０、１２又は１４修飾ヌクレオチドを含有する少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８ヌクレオチドを含む。上記の修飾パターンは例示であり、本発明の範囲の限定を意図するものではないことが強調される。

本明細書で使用される「塩基類似体」は、核酸二重鎖内に組み込まれることができる修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の１’位（又は、核酸二重鎖に組み込まれることができるヌクレオチド糖部分置換物（substitution）内の等価な位置）に位置する複素環部分を指す。本発明のｄｓＮＡｓでは、塩基類似体は、概して、通常の塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を除外したプリン又はピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡｓ内の他の塩基又は塩基類似体と二重鎖をなすことができる。塩基類似体は、本発明の化合物及び方法に有用なもの、例えば参照により本明細書に組み込まれるＢｅｎｎｅｒに付与された米国特許第５，４３２，２７２号及び米国特許第６，００１，９８３号、並びにＭａｎｏｈａｒａｎに付与された米国特許公開第２００８０２１３８９１号に開示されているものを含む。塩基の非限定的な例には、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、Ι−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、ｌ−−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）及びピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、及び３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミダゾピリジニル、９−メチル−イミダゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、及びそれらの構造的誘導体が挙げられる（Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994);Berger et al.,
Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem.
Soc, 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 121:2323-2324
(1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc, 118:8182-8183 (1996); Morales et al.,
J. Am. Chem. Soc,122(6):1001~1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc,
121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998);
Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 10506-10511 (1997);Das et al., J.
Chem. Soc, Perkin Trans., 1 : 197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc,
Perkin Trans., 1: 1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc,
122(32):7621-7632 (2000); O’Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002);
Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc, 117: 10434-10442 (1995)；及び米国特許第６，２１８，１０８号）。塩基類似体は、普遍的塩基でもあり得る。

本明細書で使用される「普遍的塩基」は、核酸二重鎖内に存在する場合、二重螺旋構造（例えば、ホスフェートバックボーンの構造）を変更することなく、二つ以上の塩基タイプの反対側に位置することができる、修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の１’位に位置するか又ヌクレオチド糖部分置換物内の等価な位置に位置する複素環部分を指す。加えて、普遍的塩基は、その内部に普遍的塩基が存在する一本鎖核酸の、標的核酸と二重鎖をなす能力を破壊しない。普遍的塩基を含有する一本鎖核酸の、標的核酸と二重鎖をなす能力は、当業者に明かな方法によりアッセイすることができる（例えばＵＶ吸光度、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性等）。加えて、融点（Ｔｍ）は核酸二重鎖の安定性と相関するため、二重鎖形成が観察される条件、例えば温度を変更して、二重鎖の安定性又は形成を決定することができる。標的核酸とまさに相補的な参照一本鎖核酸と比較すると、普遍的塩基を含有する一本鎖核酸は、相補的な核酸と共に形成された二重鎖よりも低いＴｍを有する二重鎖を標的核酸と共に形成する。しかしながら、単一のミスマッチを生成するために普遍的塩基が塩基と代替されている参照一本鎖核酸と比較すると、普遍的塩基を含有する一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を有する核酸と共に形成された二重鎖よりも高いＴｍを有する二重鎖を標的核酸と共に形成する。

いくつかの普遍的塩基は、塩基対形成条件下で、普遍的塩基と、塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）の全部との間で水素結合を形成することにより塩基対形成が可能である。普遍的塩基は、単一の相補的な塩基のみと塩基対を形成する塩基ではない。二重鎖では、普遍的塩基は水素結合を形成しない場合があり、又は、反対側の二重鎖の鎖上の、普遍的塩基の反対側のＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ、及びＵの各々と一つの水素結合を形成し、又は二つ以上の水素結合を形成する。好ましくは、普遍的塩基は、反対側の二重鎖の鎖上の、普遍的塩基の反対側の塩基と相互作用しない。二重鎖では、普遍的塩基間の塩基対形成は、ホスフェートバックボーンの二重螺旋構造を変更することなく生じる。普遍的塩基は、積み重ね相互作用により同一核酸鎖上の隣接ヌクレオチド内の塩基とも相互作用し得る。そのような積み重ね相互作用は、特に普遍的塩基が、反対側の二重鎖の鎖上の、普遍的塩基の反対側に位置する塩基と任意の水素結合を形成しない状況において二重鎖を安定化する。普遍的−結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／又は１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙらに付与された米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号；Van Aerschot et al., 5-nitroindazole nucleoside analogue as
ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov l l;23(21):4363-70；Loakes et al.,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in
primers for DNA sequencing and PCR.Nucleic Acids Res. 1995 Jul l
l;23(13):2361-6；Loakes and Brown, 5-Nitroindole as an
universal base analogue.Nucleic Acids Res. 1994 Oct l l ;22(20):4039-43）。

本明細書で使用される「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接した相補的な領域が、相補的な領域の間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成又はＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成から除外されるようにハイブリダイズする、核酸の一本鎖から形成された構造を指す。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例は、ヘアピン、ステムループ又は延長ループ等の構造で存在する不対ヌクレオチドを含む。

本明細書で使用される、ｄｓＲＮＡの文脈における「延長ループ」は、一本鎖ループと、更にループに隣接した１、２、３、４、５、６個又は２０個までの塩基対又は二重鎖とを指す。延長ループでは、ループの５’側に隣接するヌクレオチドが、ループの３’側に隣接するヌクレオチドと二重鎖を形成する。延長ループは、ヘアピン又はステムループを形成してもよい。

本明細書で使用される、ｄｓＲＮＡの文脈における「テトラループ」は、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋハイブリダイズヌクレオチドの安定性に寄与する、安定な二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を指す。理論に制限されるものではないが、テトラループは、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を積み重ね相互作用により安定化し得る。加えて、テトラループ内の４つのヌクレオチド間の相互作用には、非−Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、積み重ね相互作用、水素結合及び接触相互作用が挙げられるがこれらに限定されない（Cheong et al., Nature 1990 Aug 16;346(6285):680-2; Heus and Pardi,
Science 1991 Jul 12;253(5016): 191-4）。テトラループは、４つの無作為塩基からなる単純なモデルループ配列から期待されるものよりも高い、隣接二重鎖の融点（Ｔｍ）の上昇を与える。例えば、テトラループは、１０ｍＭＮａＨＰＯ_４中で、少なくとも２塩基対の長さの二重鎖を含むヘアピンに少なくとも５５℃の融点を与え得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。ＲＮＡテトラループの例には、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えばＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えばＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる。（Woese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8467-71；Antaoet et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov l l;19(21):5901-5)。ＤＮＡテトラループの例には、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えばテトラループのｄ（ＧＴＴＡ）、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えばｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。（Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002.； SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th; NO.2; PAGE.731
(2000)。）

本明細書で使用される「増大する」又は「向上させる」は、アッセイにて参照と比較して少なくとも５％、正に変更することを意味する。変更は、アッセイにて参照と比較して５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％又は更には１００％であってもよい。「ダイサー切断を向上させる」とは、ある量のｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子のダイサーによる加工が、より大量のダイサー切断ｄｓＲＮＡ生成物をもたらし、又は本開示のインビボ若しくはインビトロでのアッセイにおいて、ダイサー切断反応が同一の量の参照ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子の加工と比較してより急速に起こり、又はダイサー切断がｄｓＮＡ内の特定の、好ましい部位に指向され、及び／若しくは切断生成物の好ましい集団のより高い普及をもたらす（例えば、本明細書に記載するＤＮＡ残基を含めることにより）ことを意味する。一実施態様において、ｄｓＮＡ分子の向上された又は増大されたダイサー切断は、適切な参照ｄｓＮＡ分子で観察されたレベルよりも高い。別の実施態様では、ｄｓＮＡ分子の向上された又は増大されたダイサー切断は、不活性又は弱毒化分子で観察されたレベルよりも高い。

本明細書で使用される「低減する」は、アッセイにて参照と比較して少なくとも５％、負に変更することを意味する。変更は、アッセイにて参照と比較して５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％又は更には１００％であってもよい。「低減された発現」とは、本開示のインビボ又はインビトロでのアッセイにおいて、遺伝子の発現、又は一つ若しくはそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベル、又は標的遺伝子によりコードされる一つ若しくはそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベル若しくは活性が、核酸分子（例えばｄｓＲＮＡ分子又はｄｓＲＮＡ含有分子）の不在下で観察されたレベルよりも低いことを意味する。一実施態様において、ｄｓＮＡ分子による阻害、下方調節又は低減は、不活性又は弱毒化分子の存在下で観察されたレベルよりも低い。別の実施態様では、ｄｓＮＡ分子による阻害、下方調節又は低減は、例えばスクランブル配列又はミスマッチを有するｄｓＮＡ分子の存在下で観察されたレベルよりも低い。別の実施態様では、本開示の核酸分子による遺伝子発現の阻害、下方調節又は低減は、核酸分子の不在下よりも核酸分子の存在下でより高い。

本明細書で使用される「細胞」は、原核生物（例えば細菌）及び真核生物（例えば哺乳動物又は植物）細胞の両方を含むことを意味する。細胞は、細胞又は生殖系列起源であってもよく、全能性又は多能性であってもよく、分裂又は非分裂であってもよい。細胞はまた、配偶子又は胚、幹細胞又は完全に分化した細胞から誘導され又はそれらを含んでもよい。それ故、用語「細胞」は、その通常の生物学的条件を維持することを意味し、例えば、鳥、植物、及び例えば、ヒト、雌牛、羊、類人猿、猿、豚、犬及び猫を含む哺乳動物等の任意の生物中に存在してもよい。所定の態様において、用語「細胞」は、詳細には、一つ又はそれ以上の単離された本開示のｄｓＮＡ分子を含む、ヒト細胞等の哺乳動物細胞を指す。特定の態様では、細胞は、標的核酸のＲＮＡ干渉をもたらすｄｓＲＮＡｓ又はｄｓＲＮＡ含有分子を所有し、またＲＮＡｉに必要なタンパク質及びタンパク質複合体、例えばダイサー及びＲＩＳＣを含む。

本明細書で使用される「動物」は、哺乳動物、特にヒトを含む多細胞、真核生物を意味する。本発明の方法は、一般に、有効量の、本明細書の式の構造を有する薬剤等の本明細書の薬剤を、それを必要とする哺乳動物、特にヒトを含む対象（例えば動物、ヒト）に投与することを含む。そのような処置は、疾病若しくはその徴候に苦しむ、又は疾病若しくはその徴候を有する、又は疾病若しくはその徴候に罹りやすい、又は疾病若しくはその徴候の危険性を有する対象、特にヒトに好適に投与されるであろう。

「薬学的に許容され得る担体」とは、本開示の核酸分子の所望の活性に最も好適である物理学的位置内での該核酸分子の有効な分布を可能にする組成物又は製剤を意味する。

本発明は、真核生物細胞内で標的遺伝子の発現を低減することが可能な、同一の薬剤中に二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）二重鎖及びＤＮＡ含有延長領域−殆どの実施態様においてｄｓＤＮＡ二重鎖−の両方を含有する組成物と、それらを調製する方法とに関する。ｄｓＲＮＡ領域の鎖の一つは、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの破壊を案内できる、約１５〜約２２ヌクレオチドの範囲の長さのヌクレオチド配列の領域を含む。それらの薬剤のｄｓＤＮＡ二重鎖領域は、標的ＲＮＡと必ずしも相補的ではなく、従ってその場合、標的ＲＮＡの破壊を案内できるヌクレオチド配列の領域の標的ＲＮＡハイブリダイゼーションを向上させない。本発明の二本鎖ＮＡｓは、化学的に結合された鎖を所有してもよく、又は、場合により第一の鎖及び第二の鎖と結合するテトラループを含む延長ループも所有し得る。いくつかの実施態様では、テトラループを含有する延長ループは、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、又は両方に存在する。

一実施態様において、本発明のｄｓＮＡは、長さ１８〜３０ｎｔｓ（例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０ｎｔｓ）の二本鎖ＲＮＡ二重鎖領域を含む。

本発明による「延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤は、「ガイド延長」（ダイサー基質中にアンチセンス鎖を加えるのに必要な、２６〜３０塩基アンチセンス配列に加えて分子上に存在するアンチセンス鎖の５’末端におけるヌクレオチド領域）又は「パッセンジャー延長」（ダイサー基質中にセンス鎖を加えるのに必要な、２５〜３０塩基センス配列に加えて場合により分子上に存在するセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチド領域；又はダイサー基質中にセンス鎖を加えるのに必要な、２５〜３０塩基配列に加えて場合によりセンス鎖上に存在するセンス鎖の５’末端におけるヌクレオチド領域）のいずれかに分類され得る。従って、本明細書で使用される用語「延長された」は、１〜６個の一本鎖ヌクレオチドのアンチセンス（又は第二の鎖若しくはガイド鎖）３’オーバーハングを指すことを意味せず；本明細書で使用される「延長された」は、ダイサー基質分子の反対側の末端、即ち５’延長アンチセンス鎖を指し、ここで延長領域は１０〜３０、好ましくは１０〜１５ヌクレオチド長であり、又は３’延長センス鎖を指し、ここで延長領域は１０〜３０、好ましくは１０〜１５ヌクレオチド長である。５’延長アンチセンス鎖は一本鎖であってもよく、場合によりアンチセンス鎖の５’延長一本鎖領域に対して相補的な、好ましくは完全に（１００％）相補的な第三の核酸分子と二重鎖をなし得る。従って、いくつかの実施態様では、即ち第三の核酸分子が存在する場合、アンチセンス鎖の５’延長領域は一本鎖ではなく、二重鎖又は二本鎖領域である。好ましくは本発明によれば、５’延長アンチセンス領域に対して相補的な第三の核酸分子、即ちセンス領域は、同族５’延長アンチセンス領域が存在しない限り存在しない。

本発明のＤｓｉＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ薬剤は、延長された第二の鎖（例えばアンチセンス）５’領域又は延長された第一の鎖（例えばセンス）３’領域を有さないＤｓｉＲＮＡｓに対して、薬剤の以下の特性を高めることができる：インビトロでの有効性（例えば効能及び効果の持続時間）、インビボでの有効性（例えば効能、効果の持続時間、薬物動態、薬力学、細胞内取り込み、低下された毒性）。所定の実施態様において、第二の鎖の５’延長領域又は第一の鎖の３’延長領域は、場合によりアプタマー又はその断片等の追加の薬剤（又はその断片）；各々が配列非選択的に又は配列特異的に第二の鎖の５’延長ヌクレオチド領域又は第一の鎖の３’延長領域に結合できる天然の又は外因的に導入される部分のための結合部位（例えば「デコイ」結合部位）が提供されてもよい（例えば、本発明の薬剤の第二の鎖の５’延長ヌクレオチド領域は、一つ又はそれ以上の転写因子認識配列を含むように設計することができ、及び／又は第二の鎖の５’延長ヌクレオチド領域は、プローブ、マーカー等のための配列特異的な認識ドメインを提供することができる）。

本明細書で使用される用語「薬物動態」は、それによって薬物が身体により吸収、分布、代謝及び排除される過程を指す。本発明の所定の実施態様では、５’延長第二の鎖ｐｒ３’延長第一の鎖ＤｓｉＲＮＡ薬剤の、適切な対照ＤｓｉＲＮＡに対して向上された薬物動態は、それらの薬剤の増大された吸収及び／若しくは分布、並びに／又は、それらの薬剤が投与された対象からの、第二の鎖の５’延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤若しくは第一の鎖の３’延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤の遅延された代謝及び／若しくは排除を指す。

本明細書で使用される用語「薬力学」は、生命体に対する薬物の作用又は効果を指す。本発明の所定の実施態様では、適切な対照ＤｓｉＲＮＡに対する、第二の鎖の５’延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤又は第一の鎖の３’延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤の向上された薬力学は、それらの薬剤が投与された対象に対する、各々、第二の鎖の５’延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤又は第一の鎖の３’延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤の、適切な対照ＤｓｉＲＮＡに対して増大された（例えばより強力な、又はより延長された）作用又は効果を指す。

本明細書で使用される用語「安定化」は、選択された環境内（例えば細胞又は生物内）での向上された薬剤持続の状態を指す。所定の実施態様において、本発明の第二の鎖の５’延長ＤｓｉＲＮＡ又は第一の鎖の３’延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤は、適切な対照ＤｓｉＲＮＡに対して向上された安定性を有する。そのような向上された安定性は、分解酵素（例えばヌクレアーゼ）又は他の薬剤に対するそれらの薬剤の向上された持続により達成され得る。

１０〜３０、好ましくは１０〜３１５ヌクレオチドの、場合による第三の核酸センス分子が分子中に存在する、本発明による５’アンチセンス延長ダイサー基質に関して上述された特性に加えて、この第三のセンス分子は、分子全体を安定化し、及び／又は、例えば効能を増大させ、作用若しくは効果を延長し、薬力学若しくは薬理学的効果を向上させ、及び／又はアプタマー若しくはその断片等の追加の薬剤（若しくはその一部分）；ダイサー基質中に加わるときに、第三の分子に結合し及びかくして第三の分子により支持される、天然の又は外因的に導入される部分（例えば標識）のための結合部位（例えば「デコイ」結合部位）を提供する等、別の利点を付与するよう機能し得る。

ＤｓｉＲＮＡ設計／合成
より長い２５〜約３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ種（ＤｓｉＲＮＡｓ）は、１９〜２３ｍｅｒｓｉＲＮＡ薬剤と比較して、効能及び作用持続時間の観点から予想外に有効なＲＮＡ阻害を与えることが以前に示された。ｄｓＲＮＡ加工機構の根底にある理論に束縛されるものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種は、細胞の原形質内でダイサー酵素の基質としての役割を果たすと考えられる。本発明のｄｓＮＡをより短いセグメントに切断することに加えて、ダイサーは、切断ｄｓＮＡに由来する一本鎖切断生成物を、標的遺伝子の又は標的遺伝子に由来する原形質ＲＮＡの破壊に関与するＲＩＳＣ複合体に組み込むことを促進すると考えられる。以前の研究（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願第２００７／０２６５２２０号）は、ダイサーによるｄｓＲＮＡ種（詳細には、ＤｓｉＲＮＡ薬剤）の切断性が、ｄｓＲＮＡ種の増大された効能及び作用持続時間に対応することを示している。本発明は、少なくとも部分的に、ダイサー切断の部位に案内されるＲＮＡ阻害剤の設計を提供し、それによりダイサー切断生成物の好ましい種が生成される。

ＤｓｉＲＮＡ加工のモデルにおいて、ダイサー酵素はＤｓｉＲＮＡ薬剤に結合し、１９〜２３位のヌクレオチドにおけるＤｓｉＲＮＡの切断をもたらし、ＤｓｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス鎖のダイサーＰＡＺドメイン−関連３’オーバーハング配列から除去される。このダイサー切断事象は、パッセンジャー（センス）鎖の３’末端及びガイド（アンチセンス）鎖の５’末端に位置していたそれらの二重鎖の核酸の切断をもたらす。ＤｓｉＲＮＡの切断は、一般に、各末端に２−塩基オーバーハングを有する１９ｍｅｒ二重鎖を与える。今、図２にモデリングするように、このダイサー切断事象は、ＲＩＳＣ構成成分としての標的ｍＲＮＡの配列特異的な阻害を案内することが可能な２１〜２３ヌクレオチドのガイド（アンチセンス）鎖を生成する（又は、より長いガイド鎖の３’オーバーハングが存在する所定の場合では２４〜２７ヌクレオチドのガイド鎖がダイサー切断により生じる）。

本発明のＤｓｉＲＮＡ薬剤の第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、二重鎖の領域内において完全に相補的である必要はない。一実施態様において、センス鎖の３’−末端は、一つ又はそれ以上のミスマッチを含む。一態様において、約二つのミスマッチがセンス鎖の３’末端に組み込まれる。別の実施態様では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、２５〜６６の範囲内のヌクレオチド長の二つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡ分子であり、互いにアニールされた場合、センス鎖の３’−末端（アンチセンス鎖の５’−末端）上に二つのヌクレオチドミスマッチを有する。ミスマッチの使用又は熱力学的安定性の低下（詳細には３’−センス／５’−アンチセンス位における）は、おそらくは、ｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入により生じるある巻き戻しの律速段階に影響を与えることによって、アンチセンス鎖のＲＩＳＣ中への進入を促進し又は進入に有利に働くことが提案されている（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａら、２００３）。それ故、末端塩基組成物は活性２１ｍｅｒｓｉＲＮＡ二重鎖を選択するための設計アルゴリズムに含まれている（Ｕｉ−Ｔｅｉら、２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４）。本実施態様のｄｓＲＮＡ領域のダイサー切断により、ミスマッチを含む小さい末端部−末端配列は、アンチセンス鎖と不対のまま残留するか（３’−オーバーハングの一部となる）、又は最終的な２１−ｍｅｒｓｉＲＮＡから完全に切断されるであろう。従って、これらの特定の「ミスマッチ」形態は、ＲＩＳＣの最終的なＲＮＡ構成成分におけるミスマッチとして存続しない。ダイサー基質のセンス鎖の３’−末端における塩基ミスマッチ又はセグメントの不安定化が、おそらくはダイサーによる加工を促進することにより、ＲＮＡｉ内の合成二重鎖の効能を改善したことの発見は、２５〜３０ｍｅｒｄｓＲＮＡｓ（本明細書で「ＤｓｉＲＮＡｓ」とも称される；Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願第２００５／０２７７６１０号、米国特許出願第２００５／０２４４８５８号及び米国特許出願第２００７／０２６５２２０号）の設計及び使用を記載している過去の業績における驚くべき発見であった。ミスマッチを所有する薬剤の、例示的なミスマッチ又はゆらぎ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ及びＩ：Ｃである。それらの薬剤の塩基対強度は、例えばグアニン及びアデニンヌクレオチドの２−アミノ−又は２，６−ジアミノ修飾を含む、それらの薬剤のヌクレオチドの修飾によっても減弱され得る。

ＤｓｉＲＮＡ薬剤組成物の例示的な構造
本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＮＡを含有し、即ち本発明のｄｓＮＡは、インビボで加工されて、活性の小さい干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を生成する。ｄｓＮＡはダイサーによって活性ｓｉＲＮＡに加工され、活性ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ中に組み込まれる。

一態様において、本発明は、少なくとも８個の連続リボヌクレオチドを有する第一の鎖又は第二の鎖を有する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用の組成物を提供する。所定の実施態様において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又はそれ以上（例えば鎖の２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、２６又はそれ以上、完全長まで）のリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合）を有する。所定の実施態様において、リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドは連続的である。

一態様において、本発明は、二本鎖核酸の領域内に一つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを所有する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用の組成物を提供し、前記一つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドは、推定センス鎖ダイサー切断部位の３’側に位置し、また対応して推定アンチセンス鎖ダイサー切断部位の５’側に位置する。一実施態様において、パッセンジャー鎖の２４位からパッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基までと対応する、及びそれ故パッセンジャー鎖の２４位からパッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基までと塩基対をなす、ガイド鎖ヌクレオチドの間の及びガイド鎖ヌクレオチドを含む、ガイド鎖の少なくとも一つのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、二本鎖核酸は、推定センス鎖ダイサー切断部位の３’に、対応して推定アンチセンス鎖ダイサー切断部位の５’に位置する二本鎖核酸の領域内に、塩基対をなす一つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを所有する。

所定の実施態様において、本発明のＤｓｉＲＮＡ薬剤は、以下のいずれかの例示的な構造を有してもよい：

一つのそのような実施態様において、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊Ｚ_Ｎ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により、１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

関連した実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

別のそのような実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊｜Ｅ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊Ｚ_Ｎ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により、１〜１０である。「Ｅ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｉ」＝ａ不連続性、であり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜１５、又は場合により、１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

関連した実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ｜Ｅ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

別のそのような実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊Ｚ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

関連した実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤＺ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

追加の実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤＺ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

別のそのような実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊Ｚ_Ｎ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。

別のそのような実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ_Ｎ＊ΧΧΖ_Ν−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。

一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、今上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。

上記に示したいずれかの構造において、センス鎖又はアンチセンス鎖のどちらかの５’末端は、場合によりホスフェート基を含む。

別のそのような実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊｜Ｅ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊Ｚ_Ｎ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｅ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチド、「Ｉ」＝ａ不連続性であり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。

関連した実施態様において、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ｜Ｅ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。

別のそのような実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊Ｚ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊−５’
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。

関連した実施態様では、ＤｓｉＲＮＡは：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤＺ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸ−５’
を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、０〜１０個のＲＮＡモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Ｙ」は、場合により２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチドであり、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、場合により１〜３０、又は場合により１〜１５、又は場合により１〜１０である。「Ｎ^＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、場合により０、１、２、３、４又は５である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。

一実施態様においては、伸長したＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒ切断の特定の方向を介して機能するように具現化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むものを提供する。このような分子の例示的な構造を以下に示す：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤＸＸＺ_Ｎ−５’
（式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい０〜１０個のＲＮＡ単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい１〜４個のＲＮＡ単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、１〜３０であってもよく、又は１〜１５であってもよく、又は１〜１０であってもよい。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、０、１、２、３、４又は５であってもよい。）一実施態様においては、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。また、下の鎖はセンス鎖であり、上の鎖はアンチセンス鎖である。

上記構造は、その主なプロセシング後形態として最小の２１量体二重鎖を切断することをＤｉｃｅｒに強要するように具現化される。上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施態様においては、アンチセンス鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基における２個のデオキシリボヌクレオチド残基の位置は、オフターゲット効果を低下させる可能性がある（以前の研究は、オフターゲット効果を低下させるためのアンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から２番目の位置に２’−Ｏ−メチル修飾を示した。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２２３４２７号を参照されたい。）

関連実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＤＤ｜Ｅ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤＸＸＺ_Ｎ−５’
（式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい０〜１０個のＲＮＡ単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい１〜４個のＲＮＡ単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、１〜３０であってもよく、又は１〜１５であってもよく、又は１〜１０であってもよい。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、０、１、２、３、４又は５であってもよい。）一実施態様においては、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。また、下の鎖はセンス鎖であり、上の鎖はアンチセンス鎖である。

関連実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ ^＊ＸＸＤＤＺ_Ｎ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤＸＸ−５’
（式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい０〜１０個のＲＮＡ単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい１〜４個のＲＮＡ単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、１〜３０であってもよく、又は１〜１５であってもよく、又は１〜１０であってもよい。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、０、１、２、３、４又は５であってもよい。）一実施態様においては、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。また、下の鎖はセンス鎖であり、上の鎖はアンチセンス鎖である。

上記構造のいずれかにおいて、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端にはリン酸基を含んでいてもよい。

一実施態様においては、本発明は、第２の鎖の対応するヌクレオチドと対を形成する第１の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドの間に対を形成しない塩基を有しない、完全な二重鎖領域を含む、第１の鎖及び第２の鎖の間に二本鎖領域を実質的に有する二重鎖核酸を提供する。他の実施態様においては、本発明は、第２の鎖の対応するヌクレオチドと対を形成する第１の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドの間に、１組の対を形成しない塩基対、２組の対を形成しない塩基対、３個の対を形成しない塩基対、４個の対を形成しない塩基対、及び５個の対を形成しない塩基対を含む、実質的に二重鎖領域を有する二重鎖核酸を提供する。一実施態様においては、対を形成しない塩基対は連続的である。他の実施態様においては、対を形成しない塩基対は非連続的である。

本明細書で用いられる場合、「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」は、ＤｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖の１、２、３又は４個のミスマッチ塩基対を含む「ミスマッチ寛容領域」を有するＤｓｉＲＮＡを意味し、このようなミスマッチは、ＤｓｉＲＮＡの二重鎖領域のいずれかの末端の２組の末端塩基対の間に位置する部位におけるＤｓｉＲＮＡ内に位置する（従って含んでいない）。ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の突出するＡｇｏ２切断部位の位置に関連して本明細書において定義される「ミスマッチ寛容領域」内に位置する。ミスマッチ寛容領域は、標的鎖の突出するＡｇｏ２切断部位の「上流」に位置する。この関連における「上流」は、ＤｓｉＲＮＡ二重鎖の最も５’−部分であると考えられ、ここで、５’は、ＤｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の方向を意味する。従って、ミスマッチ寛容領域は、標的核酸の突出するＡｇｏ２切断部位に対応するセンス（パッセンジャー）鎖上の塩基の上流であり；又はＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖に言及する場合、ミスマッチ寛容領域は、標的核酸の突出するＡｇｏ２切断部位に対して相補的である塩基の下流に位置する、すなわち、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の最も３’−部分（アンチセンス鎖の１位がアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである場合）としても記述することができる。

一実施態様においては、例えば、ミスマッチ寛容領域は、二重鎖のセンス鎖の５’末端で開始するヌクレオチドから番号付けをした場合に、塩基対３〜９の間に位置し、含まれる。従って、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右方向に伸長したＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の３、４、５、６、７、８又は９位のいずれかに単一のミスマッチ塩基対を有する（ここで、１位がセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、９位が、センス鎖配列に対応する標的ＲＮＡ配列の突出するＡｇｏ２切断部位のすぐ５’であるセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施態様においては、センス鎖の３、４、５、６、７、８又は９位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンスの対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて破壊され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で同様に破壊される）。他の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて破壊され、それにもかかわらず、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で維持される）。

上述したようなミスマッチ寛容領域（ミスマッチ領域）内に１個のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の３、４、５、６、７、８又は９位のいずれかにおいてミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は３個追加のミスマッチ塩基対を更に含んでいてもよい。好ましい実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２又は３個の追加のミスマッチ塩基対は、センス鎖の３、４、５、６、７、８及び／又は９位に（また、アンチセンス鎖の対応する残基に）存在する。１個の追加のミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する一実施態様においては、センス鎖の２個のミスマッチ塩基対は、例えば、センス鎖の４位及び６位の両方のヌクレオチドに存在し得る（また、ミスマッチはアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基に存在する）。

２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤においては、ミスマッチは連続的に（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置に）存在し得る。また、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、４及び５位でなく、３及び６位にミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、センス鎖の３及び６位のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の２個の残基（センス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置する、０、１、２、３、４又は５個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

３個のミスマッチ塩基対を有する、特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って３個連続で）存在し得る。また、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、５、６及び７位でなく、３、４及び８位にミスマッチヌクレオトドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、センス鎖の３及び４位のミスマッチ残基はお互いに隣接しているが、センス鎖の４及び８位のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の３個の残基（センス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２、３又は４個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

４個のミスマッチ塩基対を有する、特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）存在し得る。また、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、４及び６位でなく、３、５、７及び８位にミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、センス鎖の７及び８位のミスマッチ残基はお互いに隣接しているが、センス鎖の３及び５位のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在する−同様に、センス鎖の５及び７位のミスマッチ残基も、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の４個の残基（センス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２又は３個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

他の実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、左方向に伸長したＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１位のいずれかに単一のミスマッチ塩基対を有するミスマッチ寛容領域を含む（１位はアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１３位はアンチセンス配列と十分に相補的な標的ＲＮＡ配列の突出するＡｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖内のすぐ３’（下流）であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関してアンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内でミスマッチ塩基対にて破壊され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で同様に破壊される）。他の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内でミスマッチ塩基対にて破壊され、それにもかかわらず、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で維持される）。

上述したようなミスマッチ寛容領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１位のいずれかにミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は３個の追加のミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。好ましい実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２又は３個の追加のミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１位に（また、センス鎖の対応する残基に）存在する。１個の追加のミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する一実施態様においては、アンチセンス鎖の２個のミスマッチ塩基対は、例えば、アンチセンス鎖の１４位及び１８位の両方のヌクレオチドに存在し得る（ミスマッチは、またセンス鎖の対応するヌクレオチド残基に存在する）。

２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤においては、ミスマッチは連続的に（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続的位置に）存在し得る。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列との塩基対を形成するヌクレオチドにより散在し得る（例えば、１４及び１５位でなく、１３及び１６位にミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の１３及び１６位のミスマッチ残基が、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって散在している）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のアンチセンス鎖の２個の残基（センス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置する０、１、２、３、４、５、６又は７個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

３個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）存在し得る。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１５、１６及び１７位ではなく、１３、１４及び１８位においてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の１３及び１４位のミスマッチ残基は、お互いに隣接するが、アンチセンス鎖の１４及び１８位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって散在し得る。）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の３個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２、３、４、５又は６個のマッチする塩基対と一緒に存在する。

４個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に存在し得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１４及び１６位においてではなく、１３、１５、１７及び１８位においてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖の１７及び１８位のミスマッチ残基はお互いに隣接するが、アンチセンス鎖の１３及び１５位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基にマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在し、同様に、アンチセンス鎖の１５及び１７位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在し得る）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２、３、４又は５個のマッチする塩基対と一緒に存在する。

更なる実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、左方向に伸長したＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９位の任意の位置において単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有する（１位はアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１１位は、アンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的ＲＮＡ配列の突出するＡｇｏ２切断初のアンチセンス鎖内においてすぐ３’（下流）であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。特定の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関してアンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９位のいずれかにおいてミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンスのミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基配列を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内でミスマッチ塩基対にて破壊され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で同様に破壊される）。他の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、この同じアンチセンス鎖ヌクレオチド塩基は、その対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内でミスマッチ塩基対によって破壊され、それにもかかわらず、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で維持される）。

上述のように、ミスマッチ寛容領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９位にミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は３個の追加のミスマッチ塩基対を更に含んでいてもよい。好ましい実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれら１、２又は３個の追加のミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８及び／又は１９位に（及びセンス鎖の対応する残基に）存在する。ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に１個の追加のミスマッチ塩基対が存在する一実施態様においては、アンチセンス鎖の２個のミスマッチ塩基対は、例えば、アンチセンス鎖の１４位及び１８位の両方のヌクレオチドに存在し得る（ミスマッチは、またセンス鎖の対応するヌクレオチド残基に存在し得る）。

２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤においては、ミスマッチは連続的に（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続的位置に）存在し得る。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１３及び１４位でなく、１２及び１５位にミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の１２及び１５位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって散在する。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の２個の残基（センス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対間に位置する、０、１、２、３、４、５、６又は７個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

３個のミスマッチ塩基対を有する、特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）存在し得る。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１５、１６及び１７位でなく、１３、１４及び１８位にミスマッチヌクレオトドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の１３及び１４位のミスマッチ残基はお互いに隣接しているが、アンチセンス鎖の１４及び１８位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の３個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２、３、４、５又は６個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

４個のミスマッチ塩基対を有する、特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）存在し得る。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１４及び１６位でなく、１３、１５、１７及び１８位にミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の１７及び１８位のミスマッチ残基はお互いに隣接しているが、アンチセンス鎖の１３及び１５位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在する−同様に、アンチセンス鎖の１５及び１７位のミスマッチ残基も、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２、３、４又は５個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

更なる実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、左方向に伸長したＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３位のいずれかに単一のミスマッチ塩基対を有する（１位はアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１５位はアンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的ＲＮＡ配列の突出するＡｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖内のすぐ３’（下流）であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関してアンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内でミスマッチ塩基対にて破壊され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で同様に破壊される）。他の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、この同じアンチセンス鎖ヌクレオチドは、その対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内でミスマッチ塩基対にて破壊され、それにもかかわらず、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間で維持される）。

上述したようなミスマッチ寛容領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３位のいずれかにミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は３個の追加のミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。好ましい実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２又は３個の追加のミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２及び／又は２３位に（また、センス鎖の対応する残基に）存在する。１個の追加のミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する一実施態様においては、アンチセンス鎖の２個のミスマッチ塩基対は、例えば、アンチセンス鎖の１６位及び２０位の両方のヌクレオチドに存在し得る（ミスマッチは、またセンス鎖の対応するヌクレオチド残基に存在する）。

２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤においては、ミスマッチは連続的に（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続的位置に）存在し得る。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドにより散在し得る（例えば、１７、１８及び１９位でなく、１６及び２０位にミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の１６及び２０位のミスマッチ残基が、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって散在している）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のアンチセンス鎖の２個の残基（センス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置する０、１、２、３、４、５、６又は７個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

３個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）存在し得る。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１８、１９及び２０位ではなく、１６、１７及び２１位においてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の１６及び１７位におけるミスマッチ残基は、お互いに隣接するが、アンチセンス鎖の１７及び２１位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって散在し得る。）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の３個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２、３、４、５又は６個のマッチする塩基対と一緒に存在する。

４個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは連続的に存在し得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）。また、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１８及び２０位においてではなく、１７、１９、２１及び２２位においてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖の２１及び２２位のミスマッチ残基はお互いに隣接するが、アンチセンス鎖の１７及び１９位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在し、同様に、アンチセンス鎖の１９及び２１位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在し得る）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２、３、４又は５個のマッチする塩基対と一緒に存在する。

明瞭さの理由により、上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤内のミスマッチヌクレオチド残基の位置は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端残基に関して番号付けされている。アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域（ミスマッチ領域）内に位置する番号付けは、アンチセンス鎖の５’末端付近の変異により、突出するＡｇｏ２切断部位に移動し得る。従って、アンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの中の好ましいミスマッチ部位の位置は、突出するＡｇｏ２切断部位に対する、このようなミスマッチの近くを許容されるとして同定することもできる。従って、好ましい一実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的ＲＮＡ配列の突出するＡｇｏ２切断部位のすぐ５’（上流）に位置するセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、突出するＡｇｏ２切断部位の２ヌクレオチド５’（上流）、突出するＡｇｏ２切断部位の３ヌクレオチド５’（上流）、突出するＡｇｏ２切断部位の４ヌクレオチド５’（上流）、突出するＡｇｏ２切断部位の５ヌクレオチド５’（上流）、突出するＡｇｏ２切断部位の６ヌクレオチド５’（上流）、突出するＡｇｏ２切断部位の７ヌクレオチド５’（上流）、突出するＡｇｏ２切断部位の８ヌクレオチド５’（上流）、突出するＡｇｏ２切断部位の９ヌクレオチド５’（上流）に位置するセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。

単一のミスマッチを含む、５’でガイドする単一鎖の伸長したＤｓｉＲＮＡｓ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）の例には、以下の構造が含まれる。（このようなミスマッチ含有構造は、以下に示す他の例示的なＤｓｉＲＮＡ構造にも組み込まれる）。

５’−ＸＸ^ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸ_ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
５’−ＸＸＸ^ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸ_ΜＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ν＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
５’−ＸＸＸＸ^ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸ_ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
５’−ＸＸＸＸＸ^ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸ_ΜＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ν＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
５’−ＸＸＸＸＸＸ^ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸ_ΜＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ν＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
５’−ＸＸＸＸＸＸＸ^ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸ_ΜＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ν＊ＸＸＺ_Ν−５’
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸ^ＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸ_ΜＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ν＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
（式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい０〜１０個のＲＮＡ単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい１〜４個のＲＮＡ単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチド、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、１〜３０であってもよく、又は１〜１５であってもよく、又は１〜１０であってもよい。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、０、１、２、３、４又は５であってもよく、「Ｄ」＝「ＤＮＡ」、「Ｍ」＝鎖をアニーリングした時に他の相補鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は非天然若しくは修飾核酸））。このような薬剤の任意の残基は２’−ＯメチルＲＮＡ単量体であってもよく、上述したように、下の（第二の）鎖の３’−末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体の他の位置決めは、前記ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤においても用いることができる。上記ミスマッチ構造について、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。

特定の実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの２本の鎖内にミスマッチ塩基対として必ずしも存在するのでない標的ＲＮＡ配列に関して存在するミスマッチを含んでいてもよく−従って、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第一及び第二の鎖の間に完全な相補性を有していてもよく、更に標的ＲＮＡに関してミスマッチ残基を有していてもよい（ここで、特定の実施態様においては、有効性及び／又は効能及び／又は効果の期間を促進するのに有利である）。ミスマッチがアンチセンス鎖及び標的ＲＮＡの間に存在する特定の実施態様においては、ミスマッチの位置は、標的領域の突出するＡｇｏ２切断部位の５’に位置するセンス鎖の配列に対応する位置においてアンチセンス鎖内に位置し−例えば、標的配列の突出するＡｇｏ２切断部位に相補的であるアンチセンス残基の３’に対してアンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基である。

標的配列に関して単一のミスマッチ残基を有する例示的な２５／２７量体のＤｓｉＲＮＡｓには、以下の構造が含まれる。
標的ＲＮＡ配列：５’−. ．ＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．ＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ_Ｎ＊ＸＸＺ_Ｎ−５’
（式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい０〜１０個のＲＮＡ単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Ｙ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であってもよい１〜４個のＲＮＡ単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチド、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上であるが、１〜３０であってもよく、又は１〜１５であってもよく、又は１〜１０であってもよい。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上であるが、０、１、２、３、４又は５であってもよく、「Ｄ」＝「ＤＮＡ」、「ｐ」＝リン酸基、「Ｅ」＝鎖をアニーリングした時に他の相補（標的）鎖の対応する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対（水素結合）を形成しない、また、対応する「Ｂ」残基（「Ｂ」残基はＲＮＡ、ＤＮＡ、又は非天然若しくは修飾核酸であってもよい）と塩基対を形成しなくてもよい核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は非天然若しくは修飾核酸））。このような薬剤の任意の残基は２’−ＯメチルＲＮＡ単量体であってもよく、例えば、上述したように、下の（第二の）鎖の３’−末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体の他の位置決め、又は本明細書で開示される２’−Ｏ−メチル及び／又は他の修飾の他のパターンは、前記ＤｓｉＲＮＡ剤においても用いることができる。

上記に例示した構造に加え、本発明のＤｓｉＲＮＡｓは、標的ＲＮＡ再列と更なるミスマッチを形成する１、２又は３個の更なる残基を有していてもよい。このようなミスマッチは連続的であっても、標的ＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在していてもよい。マッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在する場合、ミスマッチ残基は、このようなミスマッチ形成残基の間に１、２、３、４、５、６、７又は８個の塩基対を形成したヌクレオチド間隔で、単一の鎖内でお互いに離れていてもよい。

上述したＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドについてのＤｓｉＲＮＡｓ内の好ましい位置（更に、対応するセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチを形成しても、しなくてもよい）は、ＤｓｉＲＮＡ内の突出するＡｇｏ２切断部位に対して相補的であるアンチセンス鎖配列の３’（下流）に位置するアンチセンス鎖領域内にある。従って、好ましい一実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置（標的ＲＮＡ配列に関する）は、対応する標的ＲＮＡ配列の突出するＡｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖配列内のすぐ３’（下流）に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖（標的ＲＮＡ配列に関する）のミスマッチヌクレオチドは、対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の２ヌクレオチド５’（上流）、対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の３ヌクレオチド５’（上流）、対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の４ヌクレオチド５’（上流）、対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の５ヌクレオチド５’（上流）、対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の６ヌクレオチド５’（上流）、対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の７ヌクレオチド５’（上流）、対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の８ヌクレオチド５’（上流）、又は対応する、突出するＡｇｏ２切断部位の９ヌクレオチド５’（上流）、に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。

アンチセンスの２個のミスマッチを形成するヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡ剤においては（ここで、ミスマッチを形成するヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成する）、ミスマッチは連続的に存在し得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続的位置において）。また、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１４及び１５位でなく、１３及び１６位にミスマッチを形成するヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡについては、センス鎖の１３及び１６位（５’末端から開始し）のミスマッチ残基は、標的ＲＮＡ配列の対応する残基とマッチする塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応する標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対塩基対を形成するアンチセンス鎖の２個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ形成塩基対（標的ＲＮＡ配列に関して）の間に位置する、０、１、２、３、４又は５個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

３個のミスマッチ（標的ＲＮＡ配列に関して形成されるミスマッチ）を形成する塩基対を有するＤｓｉＲＮＡ剤については、ミスマッチ形成ヌクレオチドは連続的に存在し得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）。また、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１５、１６及び１７位でなく、１３、１４及び１８位にミスマッチを形成するヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡについては、アンチセンス鎖の１３及び１４位のミスマッチ残基はお互いに隣接するが、アンチセンス鎖の１４及び１８位のミスマッチ形成残基は、標的ＲＮＡ配列の対応する残基とマッチする塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応する標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対塩基対を形成するアンチセンス鎖の３個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ形成塩基対の間に位置する、０、１、２、３又は４個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

４個のミスマッチ（標的ＲＮＡ配列に関して形成されるミスマッチ）を形成する塩基対を有するＤｓｉＲＮＡ剤については、ミスマッチ形成ヌクレオチドは連続的に存在し得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）。また、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列とマッチする塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、１４及び１６位でなく、１３、１５、１７及び１８位にミスマッチを形成するヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡについては、アンチセンス鎖の１７及び１８位のミスマッチを形成する残基はお互いに隣接しているが、アンチセンス鎖の１３及び１５位のミスマッチを形成する残基は、標的ＲＮＡ配列の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在する−同様に、アンチセンス鎖の１５及び１７位のミスマッチ残基も、標的ＲＮＡ配列の対応する残基とマッチする塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応する標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４個の残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容領域内に位置する）は、これらのミスマッチを形成する塩基対のいずれか２個の間に位置する０、１、２又は３個のマッチする塩基対と一緒に存在し得る。

ＤｓｉＲＮＡｍｍ及びＤｓｉＲＮＡ剤の特定の構造を例示するために、上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ及び他のＤｓｉＲＮＡの構造を開示する。上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ及びＤｓｉＲＮＡの構造の設計は、例えば、後述するような（例えば、ミスマッチを含むＤｓｉＲＮＡｍｍ）、伸長したＤｓｉＲＮＡ剤のＤｓｉＲＮＡｍｍ形態を生成するために適合され得る。上記で例示されるように、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間に単一のミスマッチ（又は２、３若しくは４個のミスマッチ）を有するが、ＤｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖との間に完全な相補性を保持し得るＤｓｉＲＮＡｓを設計することもできる。

以下に例示するＤｓｉＲＮＡ剤は、これらの二重鎖及び／又は標的ＲＮＡ整列構造内に挿入欠失（ｉｎ／ｄｅｌ）構造を有する点に更に留意されたい。従って、本発明のＤｓｉＲＮＡｓは、例えば、標的ＲＮＡ配列と比較してアンチセンス鎖配列、及び／又はセンス鎖配列と比較してアンチセンス鎖配列中にｉｎ／ｄｅｌのバリエーションを有するように設計することができ、このようなｉｎ／ｄｅｌヌクレオチドの配置のための好ましい位置は、ミスマッチ及び／又はミスマッチを形成する塩基対の位置について上述した位置に対応する。

特定の実施態様においては、上記構造のいずれかの「Ｄ」残基は、少なくとも１個のＰＳ−ＤＮＡ又はＰＳ−ＲＮＡを含む。上記構造の「Ｄ」残基は、Ｄｉｃｅｒ切断を素対する少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。

一実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基長を有するセンス鎖、２塩基の３’−オーバーハングを有する４２ヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖（また、従って、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する）、センス鎖の２４及び２５位に位置するデオキシリボヌクレオチド（センス鎖の５’において１位から番号受け）、及びアンチセンス鎖の同種ヌクレオチドと対形成した各塩基を有する非対称構造を有する。５’オーバーハングは、修飾ヌクレオチド、好ましくは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及び／又はリン酸骨格修飾、好ましくはホスホロチオエートを含む。

他の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤は、４０塩基長を有するセンス鎖、２塩基の３’−オーバーハングを有する２７基ヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖（また、従って、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する）、センス鎖の２４及び２５位に位置するデオキシリボヌクレオチド（センス鎖の５’において１位から番号受け）、及びアンチセンス鎖の同種ヌクレオチドと対形成した各塩基を有する構造を有する。３’オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリン酸骨格修飾、好ましくはメチルホスホネートを含む。

ＤｓｉＲＮＡｓの修飾
二重鎖ＲＮＡｓ（「ｄｓＲＮＡｓ」）の効果を阻害する１つの主要な要因は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡｓ（例えば、ｓｉＲＮＡｓ及びＤｓｉＲＮＡｓ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアンチセンスの３’−末端の修飾は、分解を防止するのに重要である（Ｅｄｅｒら、１９９１）。ＲＮアーゼ−Ｔファミリーヌクレアーゼは、ｓｉＲＮＡｓの制御及び分解に関与する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するいわゆるＥＲＩ−Ｉとして同定された（Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００４；Ｈｏｎｇら、２００５）。この遺伝子は、マウスにおけるＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）又はヒトにおけるＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）としても知られ、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し；また、ｓｉＲＮＡｓにおける３’−オーバーハングの分解を媒介するが、二重鎖ＲＮＡを分解しない（Ｙａｎｇら、２００６）。従って、本発明のＤｓｉＲＮＡｓを含むｄｓＲＮＡの３’−末端の安定化が、安定性を改善すると予想することは合理的である。

ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、ｐ−体中の５’→３’エキソヌクレアーゼであり、ｍｉＲＮＡにより標的とされるｍＲＮＡの分解に関与しており（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌら、２００５）、ｓｉＲＮＡによる内部切断によって方向付けられるように開始する分解を完了することに関与している。ＸＲＮ２（ＮＭ＿０１２２５５）は、各ＲＮＡプロセシングに関与する、異なる５’→３’エキソヌクレアーゼである。これまでは、ｓｉＲＮＡｓ及びｍｉＲＮＡの分解又はプロセシングに関与していないが、これらは、両者とも、ＲＮＡを分解し得る公知のヌクレアーゼであり、これらを考慮することも重要である。

ＲＮアーゼＡは、ＲＮＡｓを分解する哺乳動物における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。これはｓｓＲＮＡに特異的であり、ピリミジン塩基の３’−末端で切断する。ＲＮアーゼＡ切断によるＳｉＲＮＡ分解産物は、血清におけるインキュベーション後、質量分析によって検出することができる（Ｔｕｒｎｅｒら、２００７）。３’−オーバーハングは、ＲＮアーゼ分解に対するｓｉＲＮＡｓの感受性を増強する。血清からのＲＮアーゼＡの喪失は、ｓｉＲＮＡｓの分解を減少させ；この分解はある程度の配列優先度を示し、末端にポリＡ／Ｕ配列を有する配列に対して低下している（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌら、２００６）。これは、二重鎖のより低い安定領域が「呼吸し」、ＲＮアーゼＡによる分解を利用できる一過性の一本鎖種を提供し得る可能性を示唆する。ＲＮアーゼ阻害剤を血清に添加し、ｓｉＲＮＡの長寿命及び能力を改善し得る（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌら、２００７）。

２１量体においては、ホスホロチオエート又はボラノホスフェート修飾は、ヌクレオシド間ホスフェート結合を直接的に安定化する。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡは、高度にヌクレアーゼ耐性であり、サイレンシング薬剤として強力であり、比較的無毒である。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡは、標準的な化学的合成法を用いて製造することができず、その代わりにインビトロにおける転写（ＩＶＴ）によって製造される（Ｈａｌｌら、２００４及びＨａｌｌら、２００６）。ＲＮＡサイレンシング活性を保持するＲＮＡ二重鎖内でこのような修飾を用いる能力が制限され得るにもかかわらず、ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は、任意の所望の位置にてＲＮＡ二重鎖において容易に配置することができ、標準的な化学的合成法を用いて製造することができる。

特定の実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’単一鎖伸長領域は、少なくとも１個のホスホロチオエート骨格修飾を有する。ある実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’単一鎖伸長領域のあらゆる結合は、ホスホロチオエート骨格修飾を有する。ある実施態様においては、ガイド鎖の末端５’ヌクレオチドの結合を除き、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域のあらゆる結合はホスホロチオエート骨格修飾を有する。特定の実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’単一鎖伸長領域は、少なくとも１個のメチルホスホネート骨格を有する。ある実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域及又はパッセンジャー鎖の３’単一鎖伸長領域は、メチルホスホネート骨格修飾を有する。ある実施態様においては、パッセンジャー鎖の３’単一鎖伸長領域のあらゆる結合は、ガイド鎖の末端５’ヌクレオチドを除き、ホスホロチオエート骨格修飾を有する。

しかし、ＰＳ修飾は、用量依存的毒性を示し、ほとんどの研究者は、ｓｉＲＮＡｓにおける限定的な組み込みを推奨し、歴史的には、ヌクレアーゼからの保護が最も重要である場合、３’末端を選択することに注意されたい（Ｈａｒｂｏｒｔｈら、２００３；Ｃｈｉｕ及びＲａｎａ（２００３）；Ｂｒａａｓｃｈら、２００３；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら、２００３）。より広範なＰＳ修飾は、強力なＲＮＡｉ活性と適合し得る；しかし、糖修飾（例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）の使用が優れているであろう（Ｃｈｏｕｎｇら、２００６）。

様々な置換をリボースの２’−位置にて配置することができ、これは、一般に二重鎖安定性（Ｔｍ）を上昇させ、ヌクレアーゼ耐性を非常に改善することができる。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、哺乳動物リボソームＲＮＡ及び転移ＲＮＡにおいて見い出される天然に存在する修飾である。ｓｉＲＮＡｓにおける２’− Ｏ−メチル修飾は公知であるが、二重鎖内の修飾された塩基の正確な位置は、能力を保持するために重要であり、ＲＮＡの２’−Ｏ−メチルＲＮＡでの完全な置換は、ｓｉＲＮＡを不活性化するだろう。
例えば、交互に２’−Ｏ−メチル塩基を使用するパターンは、修飾されていないＲＮＡと同等の能力を有することができ、血清において全く安定である（Ｃｈｏｕｎｇら、２００６；Ｃｚａｕｄｅｒｎａら、２００３）。

また、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）機能と相性がよく；これは、最も一般的には、ピリミジン部位に配置され（試薬コスト及び利用能のため）、プリン位置における２’−Ｏ−メチル修飾と組み合わせることができ；２’−Ｆプリンを利用でき、用いることもできる。かなりの程度まで修飾された、この種の二重鎖はインビトロにおけるＲＮＡｉの強力なトリガーであり得（Ａｌｌｅｒｓｏｎら、２００５；Ｐｒａｋａｓｈら、２００５；Ｋｒａｙｎａｃｋ及びＢａｋｅｒ（２００６）、性能を改善し、作用期間を拡張し得る（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、２００５ａ；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、２００５ｂ）。高度に強力な、交互に２’−Ｆ及び２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を含むヌクレアーゼ安定な、平滑な１９量体二重鎖がＡｌｌｅｒｓｏｎによって教示されている。この設計においては、交互の２’−Ｏ−Ｍｅ残基が、Ｃｚａｕｄｅｒｎａによって使用されるものと同一のパターンで位置するが、残りのＲＮＡ残基は、２’−Ｆ修飾された塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙによって使用される高度に強力な、ヌクレアーゼ耐性のｓｉＲＮＡは、インビボで高度に強力な、ヌクレアーゼ耐性のｓｉＲＮＡを使用した。２’−Ｏ−ＭｅＲＮＡ及び２’−ＦＲＮＡに加え、この二重鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、反転した脱塩基残基及びび３’末端ＰＳヌクレオシド間結合を含む。広範な修飾は、一定の利益を有するが、二重鎖のより限定された修飾も、インビボの性能を改善することができ、より単純であり、製造コストが低い。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら（２００４）は、インビボで二重鎖を使用して、大部分が２個の２’−Ｏ−ＭｅＲＮＡ塩基及び限定された３’末端ＰＳヌクレオシド間結合を有するＲＮＡであった。

ロックド核酸（ＬＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）を安定化するために用いることができる、種々の種類の２’−修飾である。能力を保持するＬＮＡ組み込みのパターンは、２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｆ塩基よりも制限されるので、限定された修飾が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈら、２００３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら、２００３；Ｅｌｍｅｎら、２００５）。限定された組み込みでさえ、ＬＮＡ修飾の使用は、インビボでのｄｓＲＮＡ性能を改善することができ、またオフターゲット効果プロフィールを変化させ、又は改善し得る（Ｍｏｏｋら、２００７）。

細胞又は生きている動物に導入された合成核酸は、「外来である」と認識され、免疫応答を引き起こし得る。免疫刺激は、オフターゲット効果の主要なクラスを構成し、これは、実験結果を劇的に変え、更に細胞死を引き起こし得る。選定性の免疫系は、これらの反応を介在するＤＮＡ及びＲＮＡと特異的に相互作用する受容体分子のコレクションを含み、そのいくつかは原形質に位置し、そのいくつかはエンドソームにある（Ｍａｒｑｕｅｓ及びＷｉｌｌｉａｍ、２００５；Ｓｃｈｌｅｅら、２００６）。カチオン性脂質又はリポソームによるｓｉＲＮＡｓの送達は、細胞質及びエンドソームの両方の区画にｓｉＲＮＡをさらし、インビトロ及びインビボで１型インターフェロン（ＩＦＮ）反応を引き起こす危険性を最大にする（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、２００５ｂ；Ｓｉｏｕｄ及びＳｏｒｅｎｓｅｎ（２００３）；Ｓｉｏｕｄ、２００５；Ｍａら２００５）。細胞内で転写されたＲＮＡは、あまり免疫原性がなく（Ｒｏｂｂｉｎｓら、２００６）、脂質をベースとする方法を用いて送達された場合に免疫原性である合成ＲＮＡは、機械的手段によって細胞に導入された場合に、インビボでさえ、免疫刺激を避けることができる（Ｈｅｉｄｅｌら、２００４）。しかし、脂質をベースとする送達方法は、便利で、有効で、かつ広く使用されている。全てのタイプの細胞が存在し、免疫応答を発生する危険性が最高である、免疫応答を防止するためのいくつかの一般的な戦略が、特にインビボの適用のために必要である。化学修飾ＲＮＡの使用は、これらの問題のほとんど、又は全てを解決し得る。

特定の配列モチーフは、他のものよりも明らかに免疫原性であるが、一般の先天性の免疫系の受容体は、特定の塩基修飾の有無を区別するように思われ、これは、原核生物のＲＮＡにおいてよりも哺乳動物ＲＮＡにおいてより共通に見いだされるる。例えば、シュードウリジン、Ｎ６−メチル−Ａ及び２’−Ｏ−メチル修飾塩基は、「自己」として認識され、合成ＲＮＡにおけるこれらの残基の包含は、免疫検出を避けるのに役立ち得る（Ｋａｒｉｋｏら、２００５）。修飾されていないＲＮＡとして強い免疫賦活性である配列の広範な２’−修飾は、マウスに静脈内に投与された場合に、免疫応答を遮断し得る（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、２００５ｂ）。しかし、広範な修飾は、免疫検出を逃れるために必要ではなく、ｓｉＲＮＡ二重鎖の単一の鎖におけるわずか２個の２’−Ｏ−メチル塩基の置換は、インビトロ及びインビボの両方における１型ＩＦＮ反応を遮断するために十分であり得；修飾Ｕ及びＧ塩基が最も有効である（Ｊｕｄｇｅら、２００６）。更なる利益として、２’−Ｏ−メチル塩基の選択的な組み込みは、オフターゲット効果の大きさを小さくすることができる（Ｊａｃｋｓｏｎら、２００６）。従って、２’−Ｏ−メチル塩基の使用は、免疫応答を遮断する手段としてインビボでの適用が意図される全てのｄｓＲＮＡについて考慮されるべきであり、ヌクレアーゼ安定性を改善し、オフターゲット効果の可能性を減少させる更なる利益を有する。

細胞死は、免疫刺激により引き起こされ得るが、細胞生存度を評価することは、IFN反応の誘導をモニターするための適切な方法ではない。ＩＦＮ反応は、細胞死を伴わずに存在し得、細胞死は、ＩＦＮ誘発の非存在下での標的ノックダウンにより生じ得る（例えば、標的にされた遺伝子が細胞生存にとって必須である場合）。関連したサイトカインは、培地内で直接測定することができ、このようなアッセイをルーチンで行うようにする様々な市販のキットが存在する。多数の異なる免疫エフェクター分子を測定することができるが、スクリーニング目的のためには、通常、トランスフェクションの４及び２４時間後におけるＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６のレベルを試験することで十分である。カチオン性脂質は、任意の核酸積荷の非存在下で特定の細胞における免疫応答を誘発し得るので、「トランスフェクション試薬のみのコントロール」を含むことが重要である。ＩＦＮ経路誘導のためにコントロールを含ませることを、細胞培養研究のために考慮すべきである。ＩＦＮ反応を誘発する危険性が最高である、インビボで核酸を投与する場合はいつでも、免疫刺激について試験することが必須である。

修飾によって、ＤｓｉＲＮＡ剤がＤｉｃｅｒのための基質として役に立つことを妨げない限り、修飾を本発明のＤｓｉＲＮＡ薬剤に包含させることができる。実際に、本発明の１つの意外な発見は、アンチセンス鎖の５’単一鎖伸長ヌクレオチド領域又はセンス鎖の３’単一鎖伸長ヌクレオチド領域は、前述のＤｓｉＲＮＡ分子に付着することができ、ＲＮＡｉの有効性及び期間の延長をもたらすということであり、ただし、このような伸長は、Ｄｉｃｅｒプロセシングを妨げない伸長分子の領域において実施される（例えば、センス鎖のＤｉｃｅｒ切断部位の３’／アンチセンス鎖のＤｉｃｅｒ切断部位の５’）ことを条件とする。一実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒプロセシングを増強する１以上の修飾が実施される。第二の実施態様においては、より有効なＲＮＡｉ生成をもたらす１以上の修飾が実施される。第三の実施態様においては、より大きなＲＮＡｉ効果を支持する１以上の修飾が実施される。第四の実施態様においては、細胞に送達されるそれぞれのＤｓｉＲＮＡ剤分子あたりより大きな能力をもたらす１以上の修飾が実施される。修飾は、３’末端領域、５’末端領域において、３’末端及び５’末端領域の両方において、又はある例においては、配列内の種々の位置において組み込むことができる。上記で言及した制限に留意して、任意の修飾の数及び組み合わせをＤｓｉＲＮＡ剤に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、これらは同じであっても、又は異なっていてもよい。塩基、糖部分、ホスフェート骨格及びこれらの組み合わせに対する修飾が想定される。いずれの５’末端をリン酸化することもできる。

ホスフェート骨格について想定される修飾の例には、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、及びアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、二環式フラノース類似体等を含むホスホネートが含まれる。糖部分について想定される修飾の例には、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、アミノ及びデオキシ修飾のような２’−アルキルピリミジン等が含まれる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら、２００３を参照されたい）。塩基群について想定される修飾の例には、無塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾されたピリミジン、４‐チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル及び５−（３−アミノアリル）−ウラシル等が含まれる。ロックド核酸又はＬＮＡのものも組み込むことができる。その他の多くの修飾が公知であり、上記の基準を満たす限り、用いることができる。修飾の例は、米国特許第５，６８４，１４３号、第５，８５８，９８８号及び第６，２９１，４３８号に、並びに米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５号（Ａ１）においても開示されている。その他の修飾は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２０００）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉら、（２０００）、Ｓｔｅｉｎら（２００１）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖらに開示されている。

想定される１以上の修飾は、いずれの鎖にも組み込むことができる。ＤｓｉＲＮＡ剤における修飾の配置は、ＤｓｉＲＮＡ剤の特徴に大いに影響を及ぼすことができ、より優れた能力及び安定性を与えること、毒性を減少させること、Ｄｉｃｅｒプロセシングを増強すること、及び免疫応答を最小化することを含む。一実施態様においては、アンチセンス鎖若しくはセンス鎖又は両方の鎖は、１以上の２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを有する。他の実施態様においては、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。他の実施態様においては、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドで構成される３’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖は、また、追加の２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを含み得る。

特定の実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域、パッセンジャー鎖の３’単一鎖伸長領域、又はパッセンジャー鎖の５’単一鎖伸長領域は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであってもよい、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを有する。ある実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’単一鎖伸長領域のあらゆるヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであってもよい、修飾リボヌクレオチドである。特定の実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖臨調領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであってもよい、少なくとも１個の修飾オリゴヌクレオチドを有する。ある実施態様においては、ガイド鎖の５’単一鎖伸長領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであってもよい、修飾リボヌクレオチドである。

本発明の特定の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒによるそのプロセシングを増強する１以上の特性を有する。これらの実施態様によれば、ＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされて活性なｓｉＲＮＡ及び以下の特性の少なくとも１を生じるように、十分な長さを有する：（ｉ）例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤は、非対称であるアンチセンス鎖上の３’オーバーハングを有し、及び（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒ結合の方向及び活性なｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡ領域のプロセシングを方向付けるために、センス鎖上に修飾された３’末端を有する。このような特定の実施態様においては、Ｄｉｃｅｒ酵素切断の突出する部位に対して３’であるセンス鎖の領域及びＤｉｃｅｒ酵素切断の突出する部位の５’であるアンチセンス鎖の対応する領域における１以上の塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在は、Ｄｉｃｅｒ酵素切断の適切な方向性のために、このような分子を正しい位置に配置するためにも役に立ち得る。

特定の実施態様においては、５’単一鎖アンチセンス伸長領域（５’アンチセンス伸長）又は３’単一鎖センス伸長領域（３’センス伸長）の長さは、１〜３０ヌクレオチドであり、１〜１５ヌクレオチドであってもよく、好ましくは１０〜１５ヌクレオチドであり、更に好ましくは１１〜１５ヌクレオチドである。従って、本発明の単一鎖伸長ＤｓｉＲＮＡは、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、又はそれ以上）のヌクレオチドである、アンチセンス／ガイド鎖の５’末端において、又はセンス／パッセンジャー鎖の３’末端において、単一鎖伸長領域を有する。

ある実施態様においては、二重鎖核酸中の最も長い鎖は３６〜６６ヌクレオチドを含む。一実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端がセンス鎖の３’末端に突出し、アンチセンス鎖の３’末端がセンス鎖の５’末端に突出するような構造を有する。特定の実施態様においては、アンチセンス鎖の５’オーバーハングは１〜３０ヌクレオチドであり、１０〜３０ヌクレオチドであってもよく、例えば１５ヌクレオチドである。他の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端がアンチセンス鎖の５’末端に突出し、アンチセンス鎖の３’末端がセンス鎖の５’末端に突出するような構造を有する。特定の実施態様においては、センス鎖の３’オーバーハングは１〜３０ヌクレオチドであり、１０〜３０ヌクレオチドであってもよく、例えば１５ヌクレオチドである。特定の実施態様においては、アンチセンス鎖の３’オーバーハングは１〜１０ヌクレオチドであり、１〜６ヌクレオチドであってもよく、好ましくは１〜４ヌクレオチドであり、例えば２ヌクレオチドである。他の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端がアンチセンス鎖の３’末端に突出するような構造を有する。特定の実施態様においては、センス鎖の５’オーバーハングは４〜３０ヌクレオチドであり、１０〜３０ヌクレオチドであってもよく、例えば１５ヌクレオチドである。センス及びアンチセンス鎖の両方は、５’ホスフェートを有していてもよい。

特定の実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡのセンス鎖は、２５ヌクレオチド〜３０又はそれ以上のヌクレオチド（例えば、センス鎖は２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又はそれ以上の長さ）のヌクレオチドを有する）の全長を有する。特定の実施態様においては、センス鎖の長さは２５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド長であり、２６〜３０ヌクレオチド長であってもよく、２７〜３０ヌクレオチド長であってもよい。関連実施態様においては、アンチセンス鎖は、３６〜６６又はそれ以上のヌクレオチド（例えば、センス鎖は２３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６又はそれ以上（例えば、６７、２８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０又はそれ以上の長さ）のヌクレオチドを有する）の全長を有する。このような特定の実施態様においては、アンチセンス鎖は３７〜５７ヌクレオチド長、又は３７〜５２ヌクレオチド長、又は３７〜４７ヌクレオチド長、又は４２〜６２ヌクレオチド長、又は４２〜５７ヌクレオチド長、又は４２〜４７ヌクレオチド長の長さを有する。

特定の実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡのセンス鎖は、２５ヌクレオチド〜６０又はそれ以上のヌクレオチド（例えば、センス鎖は２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０又はそれ以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０又はそれ以上の長さ）のヌクレオチドを有する）の全長を有する。特定の実施態様においては、センス鎖の長さは２５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド長であり、３５〜５５ヌクレオチド長であってもよく、４０〜５５ヌクレオチド長であってもよく、４０〜６０ヌクレオチド長であってもよく、４５〜６０ヌクレオチド長であってもよい。関連実施態様においては、アンチセンス鎖は、２５〜３６又はそれ以上のヌクレオチド（例えば、センス鎖は２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６又はそれ以上（例えば、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又はそれ以上の長さ）のヌクレオチドを有する）の全長を有する。このような特定の実施態様においては、アンチセンス鎖は２７〜３２ヌクレオチド長を有する。

特定の実施態様においては、Ｄｉｃｅｒ酵素切断の突出する部位の３’であるセンス鎖の領域における、またＤｉｃｅｒ酵素切断の突出する部位の５’であるアンチセンス鎖の対応する領域における１以上の塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在は、このような分子のＤｉｃｅｒ酵素切断をもたらすように役に立ち得る。本発明の特定の例示された薬剤は、センス鎖の５’末端にて位置１から計数するときに２４位より３’に位置するセンス鎖デオキシリボヌクレオチド、およびアンチセンス鎖の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対形成するセンス鎖のデオキシリボヌクレオチドのこの位置２４又はより３’を有するが、ある実施態様においては、例えば、センス鎖の２０位におけるデオキシリボヌクレオチド残基の包含を介して、より短い産物、例えば１９量体又は２０量体を切断するようにＤｉｃｅｒを方向付けることも可能である。このような２０位のデオキシリボヌクレオチド塩基は、アンチセンス鎖の対応するデオキシリボヌクレオチドと対形成し、これにより、最も一般的なＤｉｃｅｒ産物として１９量体のＤｉｃｅｒを媒介した切除に方向づける（アンチセンス鎖は、また、更にアンチセンス鎖のＤｉｃｅｒ切断に方向付けるために、このような実施態様におけるセンス鎖の２０位のデオキシリボヌクレオチド残基と塩基対を形成するアンチセンス残基のすぐ３’に１個又は２個のデオキシリボヌクレオチド残基を含んでいてもよいことに留意されたい）。このような実施態様においては、二重鎖ＤＮＡ領域（Ｄｉｃｅｒ切断を遮断する修飾核酸を含む）は、通常は好ましくないＤｉｃｅｒ切断産物の長さであるものを生成するようにＤｉｃｅｒ切断に方向付けるために、１個又は２個の塩基対を超える長さ（例えば、３〜５又はそれ以上の塩基対）を通常は有するであろう。２１位に存在するセンス鎖の第１のデオキシリボヌクレオチド残基の位置で（センス鎖の５’末端にて１位からセンス鎖を調査する場合に）、２０量体のｓｉＲＮＡｓのＤｉｃｅｒ切除に方向付けるために、平行アプローチを採用してもよい。

特定の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する適切な修飾因子によってＤｉｃｅｒプロセシングについて修飾され、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖修飾を介してＤｉｃｅｒ結合およびプロセシングの向きを方向付けるように設計される。適切な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドのようなヌクレオチド、及び蛍光分子のような立体障害型分子を含む。アシクロヌクレオチドは、２−ヒドロキシエトキシメチル基を、通常ｄＮＭＰｓに存在する２’−デオキシリボフラノシル糖と置換する。その他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のモノホスフェートヌクレオチドを含む。一実施態様においては、デオキシリボヌクレオチドは修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子が利用される場合、１〜３種のヌクレオチド修飾因子又は２種のヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドと置換される。立体障害型分子が利用される場合、これらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに付着される。従って、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにより変化しない。他の実施態様においては、本発明は、アンチセンス鎖のＤｉｃｅｒプロセシングの向きを方向付けるために、ＤｓｉＲＮＡ剤における２個のＤＮＡ塩基を置換することを想定する。本発明の更なる実施態様においては、２個の末端ＤＮＡ塩基は、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端で二重鎖の平滑末端を形成するセンス鎖の３’末端上の２個のリボヌクレオチドと置換され、２個のヌクレオチドＲＮＡオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に位置する。これは、平滑末端上のＤＮＡ及びオーバーハング末端上のＲＮＡ塩基と非対称の構成である。本発明の特定の実施態様においては、センス鎖の３’末端の最後から２番目および最後の位置の修飾されたヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド）は、アンチセンス鎖の対応する修飾ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド）（場合により、センス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端にて平滑末端を有する本発明のＤｓｉＲＮＡ剤におけるアンチセンス鎖の５’末端の最後から２番目及び最後の残基）と塩基対形成する。

本発明のＤｓｉＲＮＡ剤のセンス及びアンチセンス鎖は、細胞の原形質において見い出される条件のような、生物学的条件下でアニーリングされる。更に、ＤｓｉＲＮＡ剤の、特にアンチセンス鎖の、配列の１つの領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接した２１ヌクレオチドの領域内にあり、標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に対して、このような標的ＲＮＡとアニーリングし、及び／又はレベルを低下させるほど十分に相補的である。

本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の突出しりＤｉｃｅｒ切断部位の３’及びアンチセンス鎖の突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’に位置するセンス及びアンチセンス鎖の任意の位置に位置する１以上のデオキシリボヌクレオチド塩基対を有していてもよい。特定の実施態様においては、センス鎖の２４〜２７位（センス鎖の５’ 末端にて１位から開始）の１、２、３又は４個全てがデオキシリボヌクレオチドであり、各デオキシリボヌクレオチドが、アンチセンス鎖の対応するデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。特定の実施態様においては、アンチセンス鎖の５’領域のデオキシリボヌクレオチド（例えば、所定のＤｓｉＲＮＡ分子について突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’に位置するアンチセンス鎖の領域）は、ＤｓｉＲＮＡ剤が方向づけられる標的ＲＮＡに対して相補的でない。関連実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤の突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’に位置するアンチセンス鎖の全ての領域は、ＤｓｉＲＮＡ薬剤が方向づけられる標的ＲＮＡに対して相補的でない。特定の実施態様においては、アンチセンス鎖のデオキシリボヌクレオチド又はＤｓｉＲＮＡ剤の突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’に位置するアンチセンス鎖の全ての領域は、アンチセンス鎖がアンチセンス鎖と標的ＲＮＡとの間のアニーリングが可能な十分な条件下で標的ＲＮＡにアニーリングされる場合に標的ＲＮＡに対するＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のアニーリングを増強するほど、標的ＲＮＡに対して十分に相補的でない（例えば、ＤＮＡ拡張領域を欠く「コア」アンチセンス鎖配列は、同じ「コア」アンチセンス鎖配列もＤＮＡ伸長領域の配列で伸長したので、標的ＲＮＡに同程度によくアニーリングされる）。

ＤｓｉＲＮＡ剤は、また、以下の更なる１以上の特性を有してもよい：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１量体から右又は左に変化を有する、（ｂ）鎖は、完全に相補的でなくてもよく、すなわち、鎖は、単純なミスマッチ対形成を含んでいてもよく、及び（ｃ）ロックド核酸のような塩基修飾がセンス鎖の５’末端に含まれてもよい。「典型的な」２１量体ｓｉＲＮＡは、従来の技術を用いて設計される。１つの技術において、種々の部位を平行して、又は１種の試薬が有効であろうことが望まれる同じ標的に特異的ないくつかの異なるｓｉＲＮＡ二重鎖特異的を含むプールにおいて、共通に試験を行なう（Ｊｉた、２００３）。その他の技術は、活性なＲＮＡｉエフェクター分子を得る可能性を増大させるために、設計則およびアルゴリズムを用いる（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａら、２００３；Ｕｉ−Ｔｅｉら、２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４；Ｋｒｏｌら、２００４；Ｙｕａｎら、２００４；Ｂｏｅｓｅら、２００５）。ｓｉＲＮＡの高スループット選択も開発されている（米国特許出願公開第２００５／００４２６４１号（Ａ１））。潜在的な標的部位は、また、二次構造予測によって解析することができる（Ｈｅａｌｅら、２００５）。次いで、この２１量体を用い、２１量体の５’末端上の３〜９個の更なるヌクレオチドを含むように右シフトを設計する。これらの更なるヌクレオチドの配列は、任意の配列を有していてもよい。一実施態様においては、付加されるリボヌクレオチドは標的遺伝子の配列をベースとする。本実施態様においてさえ、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡとの間の完全な相補性は、必要でない。

本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることは必要でない。これらは、生物学的条件下でアニーリングするように、また、標的配列と十分に相補的なｓｉＲＮＡを産生するＤｉｃｅｒのための基質を提供するように、実質的に相補的であることを必要とするのみである。ロックド核酸（又はＬＮＡのもの）は当業者に周知である（Ｅｌｍａｎら、２００５；Ｋｕｒｒｅｃｋら、２００２；Ｃｒｉｎｅｌｌｉら、２００２；Ｂｒａａｓｃｈ及びＣｏｒｅｙ、２００１；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄら、２０００；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、２０００）。一実施態様においては、ＬＮＡは、センス鎖の５’末端にて組み込まれる。他の実施態様においては、ＬＮＡは、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングを含むように設計二重鎖中のセンス鎖の５’末端にて組み込まれる。

特定の実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２７塩基対長を有し、アンチセンス鎖が２塩基の３’−オーバーハングを有する２９塩基対の長さを有する、非対称構造を有する。このような薬剤は、１〜４個のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の３’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の３’領域）を有していてもよく、その少なくとも１つは、アンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。他の実施態様においては、センス鎖は２８塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖は、２塩基の３’− オーバーハングを有する３０塩基対の長さを有する。このような薬剤は、１〜５個のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の３’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の３’領域）を有していてもよく、その少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。更なる実施態様においては、センス鎖は２９塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖は、２塩基の３’−オーバーハングを有する３１塩基対の長さを有する。このような薬剤は、１〜６個のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の３’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の３’領域）を有していてもよく、その少なくとも１つは、アンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。更なる実施態様においては、センス鎖は、３０塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖は、２塩基の３’−オーバーハングを有する３２塩基対の長さを有する。このような薬剤は、１〜７個のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の３’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の３’領域）を有していてもよく、その少なくとも１つは、アンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。他の実施態様においては、センス鎖は３１塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖は、２塩基の３’−オーバーハングを有する３３塩基対の長さを有する。このような薬剤は、１〜８個のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の３’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の３’領域）を有していてもよく、その少なくとも１つは、アンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。更なる実施態様においては、センス鎖は３２塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖は２塩基の３’−オーバーハングをもつ３４塩基対の長さを有する。このような薬剤は、１〜９個のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の３’ 末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の３’領域）を有していてもよく、その少なくとも１つは、アンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。更なる特定の実施態様においては、センス鎖は３３塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖は、２塩基の３’−オーバーハングを有する３５塩基対の長さを有する。このような薬剤は、１〜１０個のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の３’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の３’領域）を有していてもよく、その少なくとも１つは、アンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、突出するＤｉｃｅｒ切断部位の５’領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。更に他の実施態様においては、これらのＤｓｉＲＮＡ薬剤のいずれもが、リボヌクレオチドのうちの２個に代え、センス鎖の３’末端にて２個のデオキシリボヌクレオチドを更に含む非対称構造を有し；これらの２個のデオキシリボヌクレオチドは、アンチセンス鎖の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成していてもよい。

２個の別々のオリゴヌクレオチドを含む特定のＤｓｉＲＮＡ剤組成物を、第３の構造によって連結することができる。第３の構造は、ＤｓｉＲＮＡ薬剤に対するＤｉｃｅｒ活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの定方向破壊を妨げないであろう。一実施態様においては、第３の構造は化学的連結基であってもよい。多くの適切な化学的連結基が当該技術分野において公知であり、用いることができる。また、第３の構造は、ｄｓＮＡ組成物を構成する２個のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりヘアピン構造が生じるような様式で、ＤｓｉＲＮＡ薬剤の２個のオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドであってもよい。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ薬剤に対するＤｉｃｅｒ活性を遮断せず、標的ＲＮＡの定方向破壊を妨げないであろう。

特定の実施態様においては、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングを増強するいくつかの特性を有する。このような態様によれば、ＤｓｉＲＮＡ薬剤は、ＤｉｃｅｒによってプロセスされてｓｉＲＮＡ及び以下の特性の少なくとも１つを生じるように、十分な長さを有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ薬剤は非対称であり、例えば、センス鎖上に３’オーバーハングを有し、（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ薬剤は、Ｄｉｃｅｒ結合の向き及びｄｓＲＮＡ領域の活性なｓｉＲＮＡへのプロセシングを方向づけるように、アンチセンス鎖上に修飾された３’末端を有する。これらの実施態様によれば、ＤｓｉＲＮＡ剤中の最も長い鎖は、２５〜４３ヌクレオチドを含む。一実施態様においては、センス鎖は２５〜３９ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は２６〜４３ヌクレオチドを含む。得られるｄｓＮＡは、センス鎖の３’末端にオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングは、１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。アンチセンス又はセンス鎖は、５’ホスフェートを有していてもよい。

特定の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する適切な修飾因子によってＤｉｃｅｒプロセシングのために修飾され、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒ結合およびプロセシングの向きを方向付けるように設計されている。適切な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドのようなヌクレオチド、及び蛍光分子のような立体障害型分子を含む。アシクロヌクレオチドは、２− ヒドロキシエトキシメチル基を、通常ｄＮＭＰｓに存在する２’−デオキシリボフラノシル糖と置換する。その他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のモノホスフェートヌクレオチドを含んでいてもよい。一実施態様においては、デオキシリボヌクレオチドは修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子が利用される場合、１〜３種のヌクレオチド修飾因子又は２種のヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドに置換される。立体障害型分子が利用される場合、これらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに付着される。従って、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにより変化しない。他の実施態様においては、本発明は、Ｄｉｃｅｒプロセシングの向きを方向付けるために、ｄｓＮＡ中の２個のＤＮＡ塩基を置換することを想定する。更なる実施態様においては、２個の末端ＤＮＡ塩基は、アンチセンス鎖の５’末端お及びセンス鎖の３’末端で二重鎖の平滑末端を形成する３’末端上の２個のリボヌクレオチドと置換され、２個のヌクレオチドＲＮＡオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に位置する。これは、平滑末端上のＤＮＡ及びオーバーハング末端上のＲＮＡ塩基と非対称の構成である。

他の特定の実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に位置する適切な修飾因子によってＤｉｃｅｒプロセシングのために修飾され、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒ結合及びプロセシングの向きを方向づけるように設計されている。適切な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドのようなヌクレオチド、及び蛍光分子のような立体障害型分子を含む。アシクロヌクレオチドは、２−ヒドロキシエトキシメチル基を、通常ｄＮＭＰｓに存在する２’−デオキシリボフラノシル糖と置換する。その他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ −３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のモノホスフェートヌクレオチドを含んでいてもよい。一実施態様においては、デオキシリボヌクレオチドは修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子が利用される場合、１〜３種のヌクレオチド修飾因子又は２ヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドに置換される。立体障害型分子が利用される場合、これらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに付着される。従って、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにより変化しない。他の実施態様においては、本発明は、Ｄｉｃｅｒプロセシングの向きを方向付けるために、ＤｓｉＲＮＡ剤中の２個のＤＮＡ塩基を置換することを想定する。更なる実施態様においては、２つの末端ＤＮＡ塩基は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端で二重鎖の平滑末端を形成する３’末端上の２個のリボヌクレオチドに置換され、２個のヌクレオチドＲＮＡオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に位置する。これは、また平滑末端上のＤＮＡ及びオーバーハング末端上のＲＮＡ塩基と非対称の構成である。

センス及びアンチセンス鎖は、細胞の原形質において見いだされる条件のような生物学的条件下でアニーリングされる。更に、ＤｓｉＲＮＡ剤の、特にアンチセンス鎖の、配列の１つの領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接しＲＮＡ干渉を方向付けるほど、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。

更に、ＤｓｉＲＮＡ薬剤構造は、Ｄｉｃｅｒの切断により産生されるオリゴヌクレオチドセグメントが遺伝子発現を阻害するのに最も有効であるオリゴヌクレオチドの部分であるであろうことを保証するように最適化することができる。たとえば、本発明の一実施態様においては、遺伝子発現を阻害するであろうことが予想される２１〜２２塩基対の断片がアンチセンス鎖の３’末端に位置する、２７〜３５塩基対のオリゴヌクレオチドのＤｓｉＲＮＡ剤構造が合成される。アンチセンス鎖の５’末端に位置する残りの塩基は、Ｄｉｃｅｒによって切断され、廃棄されるであろう。この切断された部分は、相同的（すなわち、標的配列の配列に基づき）又は非相同的であること、並びに核酸鎖を伸長するために付加することができる。意外なことに、本発明において同定されたように、このような伸長は、塩基対形成したＤＮＡ残基で実施することができ（二重鎖ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長）、対応する二重鎖ＲＮＡ：ＲＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ剤よりも改善された有効性又は効果の期間を有する伸長ＤｓｉＲＮＡ剤をもたらす。

米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号は、２７量体のＤｓｉＲＮＡｓが、化学的修飾の非存在でさえ、相当する２１量体のｓｉＲＮＡ組成物を上回る血清中における改良された安定性を示すことを開示している。米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号において、及び本明細書の実施例において開示されたようなパターンの、アンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチルＲＮＡの包含などのＤｓｉＲＮＡ薬剤の修飾は、５’ホスフェートの付加と対にした場合に、ＤｓｉＲＮＡ薬剤の安定性を改善し得る。合成ＲＮＡ二重鎖における全ての鎖に対する５’−ホスフェートの付加は、ヌクレアーゼ安定性の程度をある程度制限させるための、安価かつ生理的な方法であろう。

本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の化学的修飾パターンは、このような薬剤の有効性を増強するように設計されている。従って、このような修飾は、ＤｓｉＲＮＡ薬剤の能力を減少させることを回避するように；ＤｓｉＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒプロセシングの妨害を回避するように；ＤｓｉＲＮＡ剤の生体液における安定性を改善する（ヌクレアーゼ感受性を減少させる）ように；又は選定性の免疫系による検出を遮断し、もしくは避けるように設計されている。このような修飾は、また毒性になることを回避し、並びに本発明の本ＤｓｉＲＮＡ剤を製造の際の費用又は容易さへの影響を増大させことを回避するように設計されている。

ＲＮＡプロセシング
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉのプロセスは、細胞内における長いｄｓＲＮＡ分子の存在下で誘発される。ＲＮＡｉの開始工程の際に、これらのｄｓＲＮＡ分子は、２種のＲＮアーゼＩＩＩ様のドメインを含む酵素の保存されたファミリーであるＤｉｃｅｒによって２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）低分子干渉ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡｓ）に切断される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１）。ｓｉＲＮＡｓは、１９〜２１塩基対の二重鎖領域及び各鎖上の２個のヌクレオチド３’オーバーハングによって特徴づけられる。ＲＮＡｉのエフェクター工程の際に、ｓｉＲＮＡｓは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多量体タンパク質複合体に組み込まれ、これらが、分解のための完全に相補的なｍＲＮＡ基質を選択するためのガイドとしての役割を果たす。分解は、ｓｉＲＮＡに対して相補的な領域内のｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断によって開始される。更に正確に言うと、ｍＲＮＡは、ガイドするｓｉＲＮＡの５’末端から１０位のヌクレオチドにて切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．１５：８８−２００；Ｎｙｋａｎｅｎら、２００１Ｃｅｌｌ１０７：３０９−３２１；Ｍａｒｔｉｎｅｚｅｔａｌ．，２００２Ｃｅｌｌ１１０：５６３−５７４）。この切断に関与するエンドヌクレアーゼは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２として同定された（Ａｇｏ２；Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５：１４３７−４１）。

ｍｉＲＮＡ
大部分のヒトｍｉＲＮＡ（７０％）−及びおそらくその他の哺乳類の大部分のｍｉＲＮＡ−は、イントロン及び／又はエキソンから転写され、約３０％は遺伝子間領域に位置する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．２００４，１４（１０Ａ），１９０２−１９１０）。ヒトおよび動物において、ｍｉＲＮＡは、通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって（Ｆａｒｈｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５，３１０（５７５５），１８１７−１８２１）、また、ある場合には、ｐｏｌＩＩＩによって転写される（Ｂｏｒｃｈｅｒｔｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６，１３（１２），１０９７−１１０１）。特定のウイルスのコードされたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され（Ｐｆｅｆｆｅｒｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００５，２（４），２６９−２７６；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５，７９（１５），９５５６−９５６５）、いくつかは、ウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームに位置する（Ｐｆｅｆｆｅｒｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００５，２（４），２６９−２７６；Ｓａｍｏｌｓｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５，７９（１４），９３０１−９３０５）。ｍｉＲＮＡの転写は、大きなモノシストロン性、双シストロン性、又は多シストロン性の一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の産生をもたらす。単一のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、長さが約２００ヌクレオチド（ｎｔ）から数キロベース（ｋｂ）までの範囲であり、５’７−メチルグアノシン（ｍ７）キャップ及び３’ポリ（Ａ）テールの両方を有し得る。特徴的には、成熟したｍｉＲＮＡ配列は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内の不完全なステム−ループ配列の領域に局在化される（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍｏｌ．，Ｃｅｌｌ２００４，１６（６），８６１−８６５）。

核内でのｍｉＲＮＡ成熟の第１工程は、ＲＮアーゼＩＩＩＤｒｏｓｈａ−ＤＧＣＲ８核マイクロプロセッサ複合体によるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの認識及び切断であり、これにより、５’末端にてモノホスフェート及び３’末端にてヒドロキシル基を有する２−ｎｔオーバーハングを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる、〜７０ｎｔのヘアピンを含む前駆体分子を放出する（Ｃａｉｅｔａｌ．ＲＮＡ２００４，１０（１２），１９５７−１９６６；Ｌｅｅｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２００３，４２５（６９５６），４１５−４１９；ＫｉｍＮａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，６（５），３７６−３８５）。次の工程は、キャリアータンパク質であるエクスポーチン−５による核から原形質へのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの核輸送である（Ｙｉｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．２００３，１７（２４），３０１１−３０１６，Ｂｏｈｎｓａｃｋｅｔａｌ．ＲＮＡ２００４，１０（２），１８５−１９１）。エクスポーチン−５及びその補因子ＲａｎのＧＴＰ結合した形態は、共に、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの特徴である２ヌクレオチド３’オーバーハング及び隣接するステムを認識し、結合する（Ｂａｓｙｕｋｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００３，３１（２２），６５９３−６５９７，ＺａｍｏｒｅＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００１，８（６），１１５８−１１６０）。原形質において、ＧＴＰ加水分解により、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの放出をもたらし、次いでこれが細胞エンドヌクレアーゼＩＩＩ酵素Ｄｉｃｅｒによって処理される（Ｂｏｈｎｓａｃｋら）。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するｓｉＲＮＡｓを生成する際のその役割について、最初に認識された。Ｄｉｃｅｒは、その補因子ＴＲＢＰ（トランス活性化領域結合タンパク質；Ｃｈｅｎｄｒｉｍａｔａｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２００５，４３６（７０５１），７４０−７４４）及びＰＡＣＴ（インターフェロン誘導性二重鎖−ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ活性化因子；Ｌｅｅｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．２００６，２５（３），５２２−５３２）と協力して作用する。これらの酵素は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの塩基にて３’の２個のヌクレオチドオーバーハングにて結合し、末端ループを除去し、５’モノホスフェート、３’の２個のヌクレオチドオーバーハング及び３’ヒドロキシル基を有する両末端有数ｒ、約２１ｎｔのｍｉＲＮＡ二重鎖中間体をもたらす。次いで、その５末端がエネルギー的にあまり安定でないｍｉＲＮＡガイド鎖が、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）に組み込まれるために選択され、それと同時に、「パッセンジャー」鎖は、放出され、分解される（Ｍａｎｉａｔａｋｉｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．２００５，１９（２４），２９７９−２９９０；Ｈａｍｍｏｎｄｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２０００，４０４（６７７５），２９３−２９６）。ＲＩＳＣの組成は、十分に定義されないままであるが、重要な成分は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）タンパク質ファミリーのメンバーである（Ｍａｎｉａｔａｋｉｅｔａｌ．；Ｍｅｉｓｔｅｒｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００４，１５（２），１８５−１９７）。

次いで、成熟したｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣは相補的ｍＲＮＡ種に方向付けられる。標的ｍＲＮＡがＲＩＳＣを備えたｍｉＲＮＡに対して完全な相補性を有する場合、ｍＲＮＡは切断され、分解されるであろう（Ｚｅｎｇｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００３，１００（１７），９７７９−９７８４；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２，２９７（５５８９），２０５６−２０６０）。しかし、哺乳動物細胞において最も共通の状況として、ｍｉＲＮＡは、不完全な相補性を有するｍＲＮＡを標的とし、これらの翻訳を抑制し、対応するタンパク質の発現の減少をもたらす（Ｙｅｋｔａｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００４，３０４（５６７０），５９４−５９６；Ｏｌｓｅｎｅｔａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２１６（２），６７１−６８０）。ｍｉＲＮＡの５’領域、特にシード領域と呼ばれるｍｉＲＮＡの（５’末端にて位置１から開始し）ヌクレオチド２〜７又は８におけるｍｉＲＮＡと標的配列との間のマッチはｍｉＲＮＡターゲティングにとって本質的に重要であり、このシードマッチは、またｍｉＲＮＡターゲティングのコンピュータ予測においても広く用いられる重要な原理になった（Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ２００５，１２０（１），１５−２０；Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅｅｔａｌ．ＰＬｏＳＢｉｏｌ．２００５，３（３），ｅ８５）。ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ二重鎖のｍｉＲＮＡ制御は、主に３’ＵＴＲにおける複数の相補部位を介して媒介されるが、これには多くの例外がある。ｍｉＲＮＡは、また５’ＵＴＲ及び／又はｍＲＮＡのコード領域にも結合し得、同様の結果をもたらす（Ｌｙｔｌｅｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００７，１０４（２３），９６６７−９６７２）。

ＲＮアーゼＨ
ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖におけるＲＮＡの３’−ＯＰ結合を切断して、３’−ヒドロキシル及び５’−ホスフェート末端産物を産生するリボヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨは、非特異的エンドヌクレアーゼであり、酵素結合した二価の金属イオンによって補助される加水分解メカニズムを介してＲＮＡの切断を触媒する。ＲＮアーゼＨファミリーのメンバーは、始原菌及び原核生物から真核細胞までのほとんど全ての微生物において見い出されている。ＤＮＡ複製の際に、ＲＮアーゼＨは、岡崎フラグメントの生成をプライミングする役割を担うＲＮＡプライマーを切断すると考えられているが；ＲＮアーゼＨ酵素は、より般的には、十分な長さの任意のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド配列（例えば、通常は、哺乳類における長さが４以上の塩基対のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド配列）を切断するために用いることができる。

マイクロＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ様治療薬
マイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡ）は、鋳型転写物の３’ＵＴＲに対する結合によって作用し、これにより、古典的なＲＮＡ干渉に関連があるが、異なるメカニズムによって鋳型転写物によってコードされるタンパク質の発現を阻害することが開示されている。具体的には、ｍｉＲＮＡは、その安定性を減少させることによるのではなく、むしろ標的転写物の翻訳を減少することによって作用すると考えられる。天然に存在するｍｉＲＮＡは、通常は、長さが約２２ｎｔである。これらは、約７０ｎｔの長さの小分子ＲＮＡとして公知のより大きな前駆体に由来すると考えられる。

３’ＵＴＲ内に（又は標的転写物のその他の場所、例えば、ノッチ又はノッチファミリーの転写物の、繰り返しエレメントにおいて）結合し、翻訳を阻害する、ｓｉＲＮＡｓのような、また、より具体的にはｍｉＲＮＡなどの干渉薬剤は、ｓｉＲＮＡ／鋳型（ｍｉＲＮＡ／鋳型）二重鎖における多数のミスマッチを許容し、特に二重鎖の中心領域内のミスマッチを許容し得る。実際に、インビトロにおける翻訳を阻害することが示されたｍｉＲＮＡのように、天然に存在するｓｔＲＮＡｓは、このようなミスマッチをしばしば示すので、いくつかのミスマッチが望ましく、又は必要とされ得るという証拠がある（Ｚｅｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，９：１−２０）。例えば、標的転写物とハイブリダイズした場合に、このようなｍｉＲＮＡは、しばしば、ミスマッチの領域によって分離された完全に相補的な２つのストレッチを含む。このようなハイブリダイズした複合体は、一般に、ヌクレオチド対を含む完全な相補性の（二重鎖部分）、及び少なくとも単一のミスマッチ塩基対の２つの領域を含み、これは、例えば、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｕ：Ｕ、Ｕ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｇ：−、Ａ：−、Ｕ：−、Ｃ：−等であってもよい。このようなミスマッチのヌクレオチドは、特に直列に存在する場合（例えば、２、３又は４個のヌクレオチドのミスマッチの領域）、このようなバルジのいずれかに隣接して位置する二重鎖部分を分離するバルジを形成し得る。種々の構造が可能である。例えば、ｍｉＲＮＡは、複数の非同一（ミスマッチ）の領域を含んでいてもよい。同一でない（ミスマッチ）の領域は、標的およびｍｉＲＮＡの両方が対を形成しないヌクレオチドを含むという意味で、対称形であることは必要ない。例えば、１本の鎖のみが対を形成しないヌクレオチドを含む構造が開示されている。（Ｚｅｎｇら）。通常は、ｍｉＲＮＡ剤内の完全な相補性のストレッチは、長さが少なくとも５ヌクレオチド、例えば長さが６、７又はそれ以上のヌクレオチドであるが、ミスマッチの領域は、例えば、長さが１、２、３、又は４ヌクレオチドでもよい。

一般に、任意の特定のｓｉＲＮＡは：（ｉ）標的転写物の安定性が減少し、ｓｉＲＮＡ及び標的の間の完全な相補性がしばしば好まれる「古典的な」ｓｉＲＮＡ経路を介して、及び更に（ｉｉ）標的転写物の翻訳が阻害される「他の」経路（一般に、動物におけるｍｉＲＮＡ経路として特徴づけられる）によって、両方で遺伝子発現を阻害するように機能し得る。一般に、単一の転写物が、その古典的及び代わりの経路のための標的として役に立つことができる領域を含み得るが、メカニズム（ｉ）を介して特定のｓｉＲＮＡによって標的にされる転写物は、メカニズム（ｉｉ）を介して標的にされる転写物とは異なるであろう。（「古典的」及び「代わりの」という用語は、単に便宜のために用いられ、一般に、動物細胞におけるこのようなメカニズムの発見の歴史的タイミングを反映すると考えられるが、重要性、有効性又はいずれのメカニズムのその他の特徴を反映しない点に留意されたい）。ｓｉＲＮＡ設計の１つの共通の目標は、メカニズム（ｉ）を介して、優れた特異性で単一の転写物を標的にし、メカニズム（ｉｉ）を介して潜在的に誘発されるこれらの効果を含むオフターゲット効果を最小にすることであった。しかし、天然に存在するｍｉＲＮＡの活性を模倣する目的のため、又は対応するｍｉＲＮＡが現在公知でない標的ＲＮＡに対して向けられた薬剤を創造することのいずれかのために、このようなミスマッチに寛容であり、実際は、おそらく増強されるこのようなミスマッチを含むＤｓｉＲＮＡ薬剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ薬剤）の阻害性及び／又は治療的有効性／能力により、設計によってミスマッチ残基を有するＲＮＡ干渉薬剤を提供することが本発明の目標の一つである。

ミスマッチヌクレオチドについてのｍｉＲＮＡ剤の寛容性（また、実際には、細胞内での上記メカニズム（ｉｉ）の存在および天自然な使用）は、メカニズム（ｉ）を介して作用する完全に相補的なｓｉＲＮＡｓの「古典的な」使用に対して有利であり、及び／又はこれにより拡張される様式でのｍｉＲＮＡの使用を示唆する。ｍｉＲＮＡは、天然に存在する分子であるので、治療的薬としてｍｉＲＮＡに適用する際に異なる利点がある可能性がある。ｍｉＲＮＡは、数億年のこれらの機能の進化の「微調整」からも利益を得る。従って、配列特異的「オフターゲット」効果は、天然に存在するｍｉＲＮＡで、又は天然に存在するｍｉＲＮＡを模倣するように設計された本発明の特定の合成ＤｓｉＲＮＡｓ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤）での拡張により、問題とならないはずである。更に、ｍｉＲＮＡは、遺伝子の群の発現を調整するように進化しており、駆動の上方制御及び下方制御の両方を操作し（特定の例においては、複数の標的ＲＮＡに無差別に作用する単一のｍｉＲＮＡで、細胞内で同時に両方の機能を実施する）、複雑な細胞機能を正確に調整することができる。天然に存在するｍｉＲＮＡのこのような置換は、正常な増殖、アポトーシス、細胞周期及び１以上のｍｉＲＮＡの下方制御によって影響を受けるその他の細胞の機能を回復する試みにおいて、合成ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ擬態（例えば、特定のＤｓｉＲＮＡｍｍｓ）を病気の組織に導入することを含み得る。特定の例においては、これらのｍｉＲＮＡで調節される経路の再活性化により、有意な治療反応を生じた（例えば、心肥大での１つの研究において、ｍｉＲＮＡ発現カセットのアデノウイルスが媒介する送達によるｍｉＲ−１３３の過剰発現は、アゴニストで誘導される心肥大から動物を保護したが、相反的に、アンタゴミアによる野生型マウスにおけるｍｉＲ−１３３の減少は、肥大マーカーの増大をもたらした（Ｃａｒｅｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：６１３−６１８）。

現在まで、６００を超えるｍｉＲＮＡがヒトゲノム内でコードされることが同定されており、このようなｍｉＲＮＡは、核および原形質内でのタンパク質の組み合わせによって発現し、プロセシングされる。ｍｉＲＮＡは、脊椎動物内で高度に保存されており、全ての哺乳動物遺伝子の約２％を含む。各ｍｉＲＮＡが、複数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は数十から何百もの異なる遺伝子の発現十を調節すると思われるので、ｍｉＲＮＡは、「マスタースイッチ」として機能して、効率的に複数の細胞経路およびプロセスを調節し、連繋することができる。複数の遺伝子の発現を連繋することにより、ｍｉＲＮＡは、胚発生、免疫、炎症、並びに細胞の成長及び増殖において重要な役割を果たす。

発現及び機能研究は、特異的ｍｉＲＮＡの発現の変化が多様なヒト疾患に重要であることを示唆する。あがってきた証拠は、疾患細胞及び組織への特異的ｍｉＲＮＡの導入により、好ましい治療的反応を誘発し得ることを示す（Ｐａｐｐａｓｅｔａｌ．，ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＴｈｅｒＴａｒｇｅｔｓ．１２：１１５−２７）。ｍｉＲＮＡ療法の将来性は、腫瘍抑制因子としての特定のｍｉＲＮＡの明らかな役割のため、おそらく癌において最も大きい。癌のためのｍｉＲＮＡに基づいた治療のための理論的根拠は、たとえば、少なくとも部分的には、以下の観察によって支持される：

（１）ｍｉＲＮＡは、正常組織と比較した場合に、疾患組織において、変化したレベルにてしばしば誤って調節され、発現する。多数の研究は、これらの対応する正常組織と比較して、癌組織において変化したｍｉＲＮＡのレベルを示していた。多くの場合、発現の変化は、特定のｍｉＲＮＡの発現の増加又は減少を引き起こす遺伝的な突然変異の結果である。独特のｍｉＲＮＡ発現サインを有する疾患は、診断及び予後マーカーとして利用することができ、本発明のＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ）剤で標的にすることができる。

（２）誤って調節されたｍｉＲＮＡは、癌遺伝子又は腫瘍抑制因子として機能することによって、癌発症に寄与する。癌遺伝子は、その過剰発現又は不適切な活性化が腫瘍形成を引き起こす遺伝子として定義される。腫瘍抑制因子は、癌性になることから細胞を維持するために必要とされる遺伝子であり；腫瘍抑制因子の下方制御又は不活性化は、癌の共通の誘導因子である。このような標的は、特定の癌に対して分子基盤に特異的に作用し得るので、両タイプの遺伝子は好ましい薬物標的となる。発癌性ｍｉＲＮＡの例は、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−１７−９２であり；ｌｅｔ−７は、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡの例である。

（３）ｍｉＲＮＡの投与は、前臨床動物試験において、腫瘍増殖成長を遮断し、又は減少させることによって、治療的反応を誘発する。科学文献は、ｍｉＲＮＡ機能を修復することにより、インビトロにおける、更に動物モデルにおける癌細胞の増殖を防止することができ、又は減少させることができることを証明する概念実証研究を提供する。十分に特徴づけられた例は、乳癌及び肺癌についてのモデルにおけるｌｅｔ−７の抗腫瘍活性である。ｌｅｔ−７を模倣するように設計されている本発明のＤｓｉＲＮＡｓ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍｓ）は、このような癌を標的とするために用いることができ、治療的リード化合物（例えば、前臨床動物モデルにおいて腫瘍量を減少させることができる薬剤）をスクリーニングするために、同等の天然に存在するｍｉＲＮＡが公知でない（例えば、ノッチ又はその他の転写物内の繰り返し）標的ＲＮＡに対して方向付けられる新たなＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ）剤を生成するために、本明細書に開示したＤｓｉＲＮＡ設計パラメーターを用いることも可能である。

（４）所定のｍｉＲＮＡは、複数の細胞経路を制御し、その結果、優れた治療的活性を有し得る。これらの生物学に基づき、ｍｉＲＮＡは、ゲノムの「マスタースイッチ」として機能し、複数の遺伝子産物を調節し、複数の経路を連繋し得る。ｍｉＲＮＡによって調節される遺伝子は、従来の癌遺伝子及び腫瘍抑制因子をコードする遺伝子を含み、これらの多くは、医薬品工業による薬物標的として個々に追跡されている。従って、ｍｉＲＮＡ療法は、複数の疾患及び／又は癌関連遺伝子を標的にすることによってｓｉＲＮＡｓ及びリード化合物のそ形態より優れた活性を有し得る。ｍｉＲＮＡの誤った制御が腫瘍形成のプロセスの初期の事象ことが多いという観察を考慮すると、失われたｍｉＲＮＡを置換するｍｉＲＮＡ治療は、最適な療法である可能性がある。

（５）ｍｉＲＮＡは天然の分子であり、従って、あまり特異的な副作用を誘発しにくい。何百万年の進化も、ｍｉＲＮＡの調節ネットワークを発達させることを補助し、標的メッセンジャーＲＮＡとｍｉＲＮＡとの相互作用を微調整した。従って、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ誘導体（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡを模倣するように設計されたＤｓｉＲＮＡｓ）は、適当な状況において適用された場合に、もしあってもほとんど配列特異的「オフターゲット」効果を有さないであろう。

ｓｉＲＮＡｓ及びｍｉＲＮＡの物理的特徴は類似している。従って、ｓｉＲＮＡｓ（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡｓ）を送達するのに有効である技術は、同様に、合成ｍｉＲＮＡ（例えば、本発明の特定のＤｓｉＲＮＡｍｍｓ）を送達するのにも有効である。

ＤｓｉＲＮＡ剤の抱合及び送達
特定の実施態様においては、本発明は、疾患又は障害を患っているか、又は発症する危険性のある被験者を治療するための方法に関する。このような実施態様においては、ＤｓｉＲＮＡは、疾患又は障害を制御するための新規な治療薬として作用し得る。本発明の方法は、本発明の医薬組成物を患者（例えば、ヒト）に投与することを含み、その結果、標的ＲＮＡの発現、レベル及び／又は活性が減少する。標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現、レベル及び／又は活性は、また本発明のＤｓｉＲＮＡによって減少させられる可能性がある。

疾患又は障害の治療において、ＤｓｉＲＮＡは、疾患若しくは障害を示すか、又は関連する細胞又は組織と接触させることができる。例えば、標的ＲＮＡ配列の全て又は一部と実質的に同一のＤｓｉＲＮＡを、疾患を患っている、疾患に関連した、若しくは感染した細胞と、インビボ若しくはインビトロで接触させても、又は導入してもよい。同様に、標的ＲＮＡ配列の全て又は一部と実質的に同一のＤｓｉＲＮＡを、疾患又は障害を患っているか、又は発症する危険性のある被験者に直接投与してもよい。

本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の治療的使用は、複数の異なるＤｓｉＲＮＡ剤配列を含むＤｓｉＲＮＡ剤の製剤の使用を含み得る。たとえば２以上、３以上、４以上、５以上の、本明細書に開示した薬剤を組み合わせて、例えば、１以上の標的ＲＮＡの複数の異なる領域を標的とする製剤を製造することができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ薬剤は、またＤｓｉＲＮＡ薬剤の鎖が標的ＲＮＡの２つ以上の領域を独立して標的とするように構築してもよい。標的核酸分子の１つ以上の領域を標的とする多機能性ＤｓｉＲＮＡ分子の使用により、ＲＮＡレベル及び発現の強力な阻害をもたらされることが予想される。例えば、本発明の単一の多機能性ＤｓｉＲＮＡ構築物は、標的核酸分子の保存された領域及び可変領域を標的とすることができ、これにより、単一の標的遺伝子によってコードされる、例えばウイルスの異なる株変異体又はスプライス変異の下方制御又は阻害が可能となる。

本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、他の部分（例えば、ペプチド等の非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素、コレステロール等）に抱合（例えば、そのセンス又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端にて）してもよく、縫合しなくてもよい。このようにしてＤｓｉＲＮＡ薬剤を修飾することにより、対応する、縫合していないＤｓｉＲＮＡ薬剤と比較して、生じるＤｓｉＲＮＡ薬剤誘導体の細胞の取り込みが改善され、又は細胞の標的活性を増強し得、細胞におけるＤｓｉＲＮＡ薬剤誘導体を追跡するために有用であり、又は対応する抱合していないＤｓｉＲＮＡ薬剤と比較して、ＤｓｉＲＮＡ薬剤誘導体の安定性を改善し得る。

ＤｓｉＲＮＡ活性を評価するためのＲＮＡｉインビトロアッセイ
無細胞系におけるＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを、ＤｓｉＲＮＡ構築物を評価するために用いてもよい。例えば、このようなアッセイは、標的ＲＮＡに対して向けられたＤｓｉＲＮＡ薬剤で用いるために使用するために適合されたＴｕｓｃｈｌｅｔａｌ．，１９９９，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７及びＺａｍｏｒｅｅｔａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３に開示されたシステム、及びＴｕｒｂｏＤｉｃｅｒ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）を含む市販のキットが含まれる。合胞性胞胚葉に由来するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）抽出物が、インビトロでのＲＮＡｉ活性を再構成するために用いられる。標的ＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる適切なプラスミドからのインビトロでの転写を介して、又は化学的合成を介して生成する。センス及びアンチセンスＤｓｉＲＮＡ鎖（例えば、各２０μＭ）を緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム等）において、９０℃で１分間、次いで３７℃で１時間インキュベーションしてアニーリングさせ、次いで溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングは、ＴＢＥ緩衝液中のアガロースゲルによるゲル電気泳動によって観察することができ、臭化エチジウムで染色することができる。ショウジョウバエ可溶化液は、脱塩素化して溶解化した発酵させたモラセス寒天上に収集したＯｒｅｇｏｎＲハエからの０〜２時間齢胚を使用して調製する。可溶化液を遠心分離して、上清を単離する。アッセイは、ＤｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ終濃度）を含む、５０％の可溶化液［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ終濃度）及び１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］の溶解緩衝液を含む反応混合物を含む。また、反応混合物は、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、１００μｍＧＴＰ、１００μＭＵＴＰ、１００μＭＣＴＰ、５００μＭＡＴＰ、５ｍＭＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び１００μＭのそれぞれのアミノ酸も含む。酢酸カリウムの終濃度は、１００ｍＭに調整する。反応は、氷上で予め組み立
てて、RNAを添加する前に２５℃にて１０分間事前に沈殿させ、次いで、更に２５℃で６０分間インキュベートする。４容積の１．２５×ＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒＰｒｏｍｅｇａ）で反応を停止する。標的ＲＮＡ切断は、ＲＴ−ＰＣＲ解析又は当該技術分野において公知のその他の方法によってアッセイして、反応からＤｓｉＲＮＡを除いた対照反応と比較する。

また、アッセイのための内部標識された標的ＲＮＡは、［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下においてインビトロでの転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによってＧ５０セファデックスカラム上に通し、更に精製することなく標的ＲＮＡとして用いる。場合により、標的ＲＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、５’−３２Ｐ末端標識させる。アッセイは、上述の通りに実施し、標的ＲＮＡと、ＲＮＡｉによって生成する特異的ＲＮＡ切断産物とをゲルのオートラジオグラフで視覚化する。切断の割合は、ＤｓｉＲＮＡ及びアッセイによって生成する切断産物のない対照反応からの無処置の対照ＲＮＡ又はＲＮＡを示すバンドの、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量化によって測定する。

核酸、ベクター及び宿主細胞を導入する方法
本発明のDsiRNA剤は、細胞の中に（すなわち、細胞内に）直接導入してもよく；又は細胞外に空洞、間隙内に、微生物の循環内に導入し、経口的に導入してもよく、又は核酸を含む溶液に細胞若しくは微生物を浸すことによって導入してもよい。血管又は脈管外循環、血液又はリンパ系及び脳脊髄液は、核酸を導入してもよい部位である。

本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、核酸を含む溶液注射、核酸によって覆われた粒子による照射、核酸の溶液に細胞若しくはは微生物を浸漬すること、又は核酸の存在下にで細胞膜エレクトロポレーションを含む当該技術分野において公知の核酸送達方法を用いて導入することができる。脂質を介する担体輸送、化学的担体輸送及びリン酸カルシウムのようなカチオン性リポソームトランスフェクション等の、核酸を細胞に導入するために当該技術分野において公知のその他の方法を用いてもよい。核酸は、以下の活性の１以上を実施する、その他の成分と一緒に導入してもよい：細胞による核酸取り込みを増強する、又はその他の標的ＲＮＡの阻害を増大する。

標的RNAを有する細胞は、生殖系列又は体細胞から、全能性又は多能性、分裂してもいても、又は分裂していなくても、甲状腺実質又は上皮、不死化され、又は形質転換されていても、又はその他でもよい。細胞は、幹細胞又は分化した細胞であってもよい。分化した細胞タイプには、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血球、骨髄巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、塩基好性、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌又は外分泌腺の細胞が含まれる。

特定の標的ＲＮＡ配列及び送達されるＤｓｉＲＮＡ剤の材料の用量に依存し、このプロセスは、標的ＲＮＡに対して部分的又は完全な機能喪失をもたらし得る。標的とされた細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％以上のＲＮＡレベル若しくは発現（ＲＮＡ発現又はコードされるポリペプチド発現）の減少又は喪失が例示される。標的ＲＮＡレベル又は発現の阻害は、ＲＮＡ又はＲＮＡでコードされるタンパク質のレベルの非存在（又は観察可能な減少）を意味する。特異性は、その他の細胞の遺伝子に対して明らかな効果を伴わずに標的ＲＮＡを阻害する能力を意味する。阻害の結果は、細胞又は微生物の外部特性の検査によって（下記の実施例に示すように）、又はＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、その他の免疫アッセイ及び蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）のような生化学的な技術によって確認することができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤による標的ＲＮＡ配列の阻害は、また、インビボ又はインビトロのいずれかで、癌治療については腫瘍サイズ等の測定可能な表現型、ウイルス感染疾患についてはウイルスの負荷／力価、その他により、このようなＤｓｉＲＮＡ薬剤の投与の効果に基づいて測定することができる。ウイルス感染疾患については、ウイルスの負荷又は力価の減少は、細胞、組織又は被験者に対する本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の投与を介して達成することができる、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上の減少を含むことができ、対数条件、例えば、ウイルスの負荷又は力価の１０倍、１００倍、１０００倍、１０^５倍、１０６倍、１０^７倍の減少により測定される。

細胞系又は微生物全体におけるRNAによって媒介される阻害については、そのタンパク質産物が容易にアッセイされるリポーター又は薬物耐性遺伝子の発現を測定することができる。このようなリポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）及びその誘導体が含まれる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーを利用できる。アッセイに依存し、遺伝子発現の量の定量化により、本発明によって治療されない細胞と比較して、10%、33%、50%、90%、95%又は99%より優れた阻害の程度を決定することができる。

より低用量の注射用材料及びＲＮＡサイレンシング剤の投与の後により長時間、より小さな細胞の画分（例えば、標的にされた細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％又は９５％）における阻害を生じ得る。細胞における遺伝子発現の定量化は、標的ＲＮＡの蓄積又は標的タンパク質の翻訳のレベルにて、類似の阻害の量を示し得る。一例として、阻害の効率は、細胞内での遺伝子産物の量を評価することによって決定してもよく；ＲＮＡは、阻害性ＤｓｉＲＮＡについて用いた領域の外側のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出してもよく、又は翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して生じる抗体で検出してもよい。

ＤｓｉＲＮＡ剤は、細胞あたり少なくとも１コピーの送達が可能な量で導入してもよい。高用量の材料（例えば、細胞あたりの少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー）は、より有効な阻害を生じ；低用量は、また特異的適用のために有用であり得る。

ＲＮＡ干渉をベースとする療法
公知の通り、RNAi法は、種々の生物における多種多様の遺伝子に適用でき、開示された組成物及び方法を、これらの状況のそれぞれにおいて利用することができる。開示された組成物及び方法によって標的とし得る遺伝子の例には、細胞に対して天然である遺伝子である内因性遺伝子、又は通常、細胞に対して天然でない遺伝子が含まれる。限定されないが、これらの遺伝子には、癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ（Ｉｄ）タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、脈管形成を誘導する分子を発現する遺伝子、細胞接着因子のための遺伝子、細胞表面受容体、転移に関与するタンパク質、プロテアーゼ、アポトーシス遺伝子、細胞周期調整遺伝子、ＥＧＦ及びＥＧＦ受容体を発現する遺伝子、ＭＤＲ１遺伝子のような多剤耐性遺伝子が含まれる。

より具体的には、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞タンパク質（例えば、核、細胞質、膜貫通又は膜会合タンパク質）のアミノ酸配列を特定することができる。他の実施態様においては、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質（例えば、細胞外マトリックスタンパク質又は分泌タンパク質）のアミノ酸配列を特定することができる。本明細書で用いられる場合、タンパク質の「アミノ酸配列を特定する」という表現、ｍＲＮＡ配列が遺伝子暗号の規則に従ってアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。タンパク質の以下のクラスを説明の目的のために挙げる：発生タンパク質（例えば、細胞接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、Ｗｉｎｇｅｄヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカイン及びこれらの受容体、成長／分化因子、及びこれらの受容体、神経伝達物質及びこれらの受容体）；癌遺伝子でコードされるタンパク質（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭＩ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３及びＹＥＳ）；腫瘍抑制因子タンパク質（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、ＲＢＩ、ＴＰ５３及びＷＴＩ）；及び酵素（例えば、ＡＣＣシンターゼ及びオキシダーゼ、ＡＣＰデサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミルグルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリイナーゼ（ｄｅｘｔｒｉｉｎａｓｅｓ）、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合したデンプンシンターゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘルニセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポオキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節剤シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯｓ、トポイソメラーゼおよびキシラナーゼ）。

一態様においては、本発明の標的ｍＲＮＡ分子は、病的状態と関連するタンパク質のアミノ酸配列を特定する。例えば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（例えば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝達又は感染の維持に関与するウイルスタンパク質）、又は宿主への病原体の侵入、病原体若しくは宿主による薬物代謝、病原体ゲノムの複製若しくは組込み、宿主における感染の確立若しくは伝播、又は病原体の次世代の構築を促進する宿主タンパク質であってもよい。病原体には、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスを含むレトロウイルスのようなＲＮＡウイルス、又はアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、細胞拡大ウイルス、ヘパドナウイルスもしくはその他のようなＤＮＡウイルスが含まれる。更なる病原体には、細菌、真菌、蠕虫、住血吸虫及びトリパノゾームが含まれる。その他の種類の病原体には、哺乳動物転位因子を含み得る。また、タンパク質は、腫瘍関連タンパク質又は自己免疫疾患関連タンパク質であってもよい。

標的遺伝子は、任意の微生物に由来しても、又は含まれていてもよい。生物は、植物、動物、原虫、細菌、ウイルス又は真菌であってもよい。例えば、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい。

医薬組成物
特定の実施態様においては、本発明は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を提供する。ＤｓｉＲＮＡ剤試料は、それが存在する場合に、試料の十分な部分が細胞に入り遺伝子サイレンシングを誘導することを可能にする任意の手段によって適切に製剤化し、細胞の環境に導入することができる。ｄｓＮＡのための多くの製剤が当該技術分野において公知であり、ｄｓＮＡが作用し得るようにそれが標的細胞に入ることができる限り使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５号（Ａ１）及び第２００５／００５４５９８号（Ａ１）を参照されたい。例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル者構造及びカプシドのような緩衝溶液中に製剤化することができる。カチオン脂質を含むＤｓｉＲＮＡ剤の製剤は、細胞へのＤｓｉＲＮＡ薬剤のトランスフェクションを促進するために用いることができる。
例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体及びポリリジン（公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ９７／３０７３１）のようなポリカチオン性分子を用いることができる。適切な脂質は、オリゴフェクトアミン、リポフェクトアミン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（ＲｉｂｏｚｙｍｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏ．）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれ、これらのすべては、製造業者の説明書に従って用いることができる。

このような組成物は、通常は核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品投与において適合である生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌薬、等張薬及び吸収遅延剤等を含む。追加の活性化合物も、組成物に組み入れることができる。

医薬組成物は、その意図された投与の経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。非経口的、皮内若しくは皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含んでもよい：注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又はその他の合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌物質；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝液、及び塩化ナトリウム又はブドウ糖のような張性調整剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は多回投与バイアルに封入することができる。

注射可能な使用に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。静脈内の投与については、適切な担体には、生理食塩水、静菌性水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ．ＴＭ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、簡単な注射可能性である程度に液体であるべきである。これは、製造条件及び貯蔵下で安定であるべきであり、細菌及び真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体のポリエチレングリコール等）およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合に必要とされる粒径の維持によって、また表面活性物質の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成し得る。多くの場合に、組成物中に、等張化剤、例えば、マニトール（manitol）、ソルビトール、塩化ナトリウムのような糖累、多価アルコールを含むことが好ましいだろう。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによって実施することができる。

無菌の注射可能な溶液は、必要に応じてろ過滅菌後に、上記に列挙した成分の１種又は組み合わせで、適切な溶媒において必要とされる量で活性化合物を組み入れることによって調製することができる。一般に、分散剤は、活性化合物を無菌の媒体に組み入れることによって調製され、これには、基本的な分散媒及び上記に列挙したものからの必要とされるその他の成分を含む。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これによって、以前に滅菌ろ過された溶液から活性成分及び任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。

経口組成物は、一般に不活性な希釈剤又は食用の担体を含む。経口治療的投与の目的のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組み入れることができ、錠剤、トローチ又はカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いられる。経口組成物は、また口内洗浄液として液体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性の結合剤及び／又は補助材料は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含んでいてもよい：微晶質セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンのような結合剤；デンプン又はラクトース、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ又はトウモロコシデンプンのような崩壊剤等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローツのような潤滑剤；コロイド性二酸化ケイ素のような流動促進剤；ショ糖又はサッカリンのような甘味料；又はハッカ、サリチル酸メチル又はオレンジ香味料のような香味薬。

吸入による投与のためには、化合物は、エアゾール噴霧の形態で、適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素を含む加圧容器若しくはディスペンサー、又はネブライザーから送達される。このような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に開示されたものが含まれる。

また、全身投与は、経粘膜又は経皮手段によることができる。経粘膜又は経皮的投与のためには、浸透するバリアに対して適当な透過剤を製剤中に用いる。このような浸透剤は、一般に当該技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与のために、洗浄剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体含む。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐薬を使用することによって達成し得る。経皮投与のためには、活性化合物を当該技術分野において一般に公知の軟膏、膏薬、ゲル又はクリームに製剤化する。

また、化合物は、直腸送達のための坐薬（たとえば、カカオ脂および他のグリセリドのような従来の座薬基剤と共に）又は保持浣腸の形態で調製することができる。

化合物は、またＭｃＣａｆｆｒｅｙｅｔａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学的なトランスフェクション）；Ｘｉａｅｔａｌ．（２００２），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルスを媒介した送達）；又はＰｕｔｎａｍ（１９９６），Ａｍ．Ｊ．ＨｅａｌｔｈＳｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍａｔＡｍ．Ｊ．ＨｅａｌｔｈＳｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）に開示された方法を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において公知のトランスフェクション又はまたは感染を使用する方法によって投与することができる。

また、化合物は、ＤＮＡワクチン等の核酸薬剤の投与に適した任意の方法によって投与することができる。これらの方法は、遺伝子銃、バイオインジェクション及び皮膚パッチ、並びに針のない方法（たとえば米国特許第６，１９４，３８９号に開示された微小粒子ＤＮＡワクチン技術、及び米国特許第６，１６８，５８７号に開示したような粉末形状ワクチンによる哺乳動物の経皮の針なしワクチン接種を含む。更に、Ｈａｍａｊｉｍａｅｔａｌ．１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０に記載されているように、鼻腔内送達も可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に記載されているような）及びマイクロカプセル化も使用することができる。また、生物分解可能な標的可能な微小粒子送達系を用いることができる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に記載されているような）。

一実施態様においては、一つの態様において、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御された放出製剤のような、体からの迅速除去から化合物を保護するであろう担体と共に調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生物分解性の、生物学的適合性を有するポリマーを用いることができる。このような製剤は、標準的な技術を用いて調製することができる。材料は、またＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。また、リポソーム型懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的とされるリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として用いることもできる。これらは、当業者に公知の方法にしたがって調製することができる（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に開示されているとおり）。

このような化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％にとって致命的な用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％にとって治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性及び治療効果の用量比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いてもよいが、非感染細胞への潜在的損傷を最小化し、これにより、副作用を減少させるために、感染した組織の部位にこのような化合物をターゲットする送達系を設計するように注意するべきである。

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを用い、ヒトに使用するための投薬量の範囲を製剤化する際に用いることができる。このような化合物の投薬量は、好ましくはほとんど毒性がないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態及び利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変更してもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物については、治療的に有効な用量は、初めに細胞培養アッセイから推測することができる。用量は、細胞培養において決定されるように、ＩＣ_５０を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症状の半分最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を達成するように動物モデルにおいて
処方してもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。

本明細書で定義されるように、核酸分子の治療上有効な量（すなわち、有効な投薬量）は、選択される核酸に依存する。例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤をコードするプラスミドが選択される場合、約１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単一用量量を投与してもよく；ある実施態様においては、１０、３０、１００若しくは１０００ｐｇ又は１０、３０、１００若しくは１０００ｎｇ、又は１０、３０、１００若しくは１０００μｇ、又は１０、３０、１００又は１０００ｍｇを投与してもよい。ある実施態様においては、1〜5gの組成物を投与してもよい。組成物は、１日当たり１回又は複数回〜１週当たり1回又は複数回投与してもよく；一日おきに一回を含む。当業者であれば、疾患又は障害の重症度、以前の治療、被験者の全体的な健康及び／又は年齢、並びにその他の存在する疾患を含むが、限定されない、一定の要因が被験者を効率的に治療するために必要とされる投薬量及びタイミングに影響を与え得ることを認識す
るであろう。更に、タンパク質、ポリペプチド又は抗体の治療上有効な量での被験者の治療は、単一の治療を含んでもよく、又は好ましくは、一連の治療を含んでもよい。

ＤｓｉＲＮＡ剤を細胞の環境に導入する方法は、細胞のタイプ及びその環境の構成に依存するであろうことを認識することができる。例えば、細胞が液体内で見い出される場合に、１つの好ましい製剤は、リポフェクトアミン中のような脂質製剤であり、ＤｓｉＲＮＡ剤は、細胞の液体環境に直接添加してもよい。脂質製剤は、また静脈内、筋肉内若しくは腹腔内注射によるか、又は経口によるか、又は吸入若しくは当該技術分野において公知であるその他の方法等によって動物に投与することができる。製剤が哺乳類及びより具体的にはヒトのような動物への投与に適するとき、製剤は、また薬学的に許容される。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、用いることができる。ある場合には、卵母細胞での研究と同様に、緩衝液又は生理食塩水溶液中にＤｓｉＲＮＡ剤を製剤化して、細胞に製剤化したＤｓｉＲＮＡ薬剤を直接注射することが好ましいであろう。ＤｓｉＲＮＡ剤二重鎖の直接注射を行ってもよい。ｄｓＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤）を導入する適切な方法については、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５号（Ａ１）を参照されたい。

ＤｓｉＲＮＡ薬剤の適切な量を導入しなければならず、これらの量は、標準的な方法を用いて経験的に決定することができる。通常は、細胞の環境における個々のＤｓｉＲＮＡ剤種の有効な濃度は、約５０ナノモル以下、１０ナノモル以下であるか、又は約１ナノモル以下の濃度の組成物を用いることができる。他の実施態様においては、方法は約２００ピコモル以下の濃度を用い、更に約５０ピコモル以下、約２０ピコモル以下、約１０ピコモル以下、約５ピコモル以下の濃度を多くの環境において用いることができる。

本発明の方法は、その中で細胞が生きることができる任意の細胞外マトリックスへのＤｓｉＲＮＡ剤組成物の添加によって実施することができ、ただしＤｓｉＲＮＡ剤組成物は、ＤｓｉＲＮＡ剤の十分な量が細胞に入ってその効果を及ぼすことができるように製剤化される。例えば、本発明の方法は、液体培養若しくは細胞増殖培地のような液体中で、組織外植体において、又は哺乳類及び特にヒトのような動物を含む生物全体において存在する細胞で用いるために受け入れられる。

標的ＲＮＡのレベル又は活性は、現在当該技術分野において公知、又は後で開発される任意の適切な方法によって測定することができる。標的ＲＮＡ及び／又は標的ＲＮＡの発現を測定するために使用される方法は、標的ＲＮＡの性質に依存することを認識することができる。例えば、標的ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、「発現」という用語は、標的ＲＮＡに由来するタンパク質又はＲＮＡ／転写物をいうことができる。このような場合には、標的ＲＮＡの発現は、標的ＲＮＡに対応するＲＮＡの量又はそのタンパク質の量を測定することによって決定し得る。タンパク質は、染色又は免疫ブロットのようなタンパク質アッセイ法によって、又はタンパク質が測定することができる反応を触媒する場合、反応速度を測定することによって測定することができる。このような方法の全ては、当該技術分野において公知であり、使用することができる。標的ＲＮＡレベルが測定される場合、ＲＮＡレベルを検出するための任意の当該技術分野で認識される方法を使用することができる（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等）。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤でウイルスＲＮＡを標的とする際に、また、インビトロ又はインビボのいずれかの、被験体、組織における、細胞での、又は細胞抽出物における標的ウイルスのレベルの減少におけるＤｓｉＲＮＡ薬剤の有効性の測定を使用して、標的ウイルスＲＮＡレベルの減少の程度を決定することができることも予想される。上記の測定のいずれも、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物又は任意のその他の適切な供与材料で実施することができる。

標的ＲＮＡの発現が減少されたかどうかの決定は、ＲＮＡレベルの変化を確実に検出できる任意の適切な方法による。通常は、決定は、そのＤｓｉＲＮＡ薬剤の少なくとも一部が原形質に入るように消化されていないＤｓｉＲＮＡを細胞の環境に導入すること、次いで標的ＲＮＡのレベルを測定することによって実施される。同じ測定を同一の未処置の細胞で行い、それぞれの測定から得られる結果を比較する。

DsiRNA剤は、DsiRNA薬剤の薬理学的に有効な量及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化することができる。薬理学的又は治療的に有効な量は、意図された薬理学的、治療的又は予防的結果を生じるために有効なDsiRNA剤の量を意味する。「薬理学的に有効な量」及び「治療上有効な量」又は単に「有効量」という表現は、意図された薬理学的、治療的又は予防的結果をもたらすのに有効なRNAの量をいう。例えば、疾患又は障害と関連する測定可能なパラメーターの少なくとも20%の減少がある場合に、所定の臨床的治療が有効であるとみなされる場合、その疾患又は障害の治療のための薬物の治療上有効な量は、少なくともそのパラメーターの20%の減少を遂行するために必要な量である。

適切に製剤化された本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経直腸、経膣及び局所的（頬側及び舌下を含む）投与を含む非経口的経路等によって当該技術分野において公知の任意の手段によって投与することができる。ある実施態様においては、医薬組成物は、静脈内又は内部非経口的注入若しくは注射によって投与される。

一般に、ｄｓＮＡの適切な投薬量単位は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲、又は１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．０１〜２０マイクログラムの範囲、又は１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．０１〜１０マイクログラムの範囲、又は１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．１０〜５マイクログラムの範囲、又は１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．１〜２．５マイクログラムの範囲である。ｄｓＮＡを含む医薬組成物は、１日１回投与することができる。しかし、治療的薬剤は、また１日の全体にわたって適切な間隔にて投与される２、３、４、５、６回以上のサブ用量を含む投薬量単位で投薬してもよい。その場合、各サブ用量に含まれるｄｓＮＡは、合計で１日の投薬量単位を達成するために、対応してより少なくなければならない。投薬量単位は、例えば、数日の期間にわたってｄｓＮＡの持続性及び一貫した放出を提供する従来の持効性製剤を用い、数日にわたって単一用量のために調合することができる。持効性製剤は、当該技術分野において周知である。この実施態様においては、投薬量単位は、対応する複数の１日量を含む。製剤に関係なく、医薬組成物は、治療される動物又はヒトにおける標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量のｄｓＮＡを含まなければならない。組成物は、ｄｓＮＡの複数の単位の合計が共に十分な用量を含むような方法で構成することができる。

ヒトのために適した投薬量範囲を製剤化するために、細胞培養アッセイ及び動物試験からデータを得ることができる。本発明の組成物の投薬量は、毒性がほとんどないED₅₀（公知の方法により決定する通り）を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される投薬形態及び利用される投与経路に依存し、この範囲内で変更してもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物については、治療的に有効な用量は、初めに細胞培養アッセイから推測することができる。用量は、細胞培養において決定されるように、IC₅₀を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症状の半分最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を達成するように動物モデルにおいて処方してもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いること
ができる。血漿中のdsNAのレベルは、標準的な方法によって、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。

医薬組成物は、投与のための説明書と共に、キット、容器、パック又はディスペンサーに含めることができる。

治療法
本発明は、全体的にあるいは部分的に、標的RNAの発現及び／又はこのような標的RNAの存在によって（例えば、ウイルス感染、ウイルスゲノムの標的RNAの存在、カプシド、宿主細胞成分等の状況において）起こる疾患又は障害の危険性のある（又は感受性の）被験者を治療する予防的及び治療的な方法の両方を提供する。

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、疾患又は障害、疾患又は障害の症状又は疾患についての素因を治療し、治癒し、軽減し、解放し、変化させ、直し、寛解させ、改善し、又は影響を及ぼすための目的で、患者に対する治療的薬剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ薬剤又はベクター又はこれをコードする導入遺伝子）の適用若しくは投与又は疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症候又は疾患若しくは障害への素因を有する患者から単離された組織若しくは細胞系に対するの治療薬の適用若しくは投与として定義される。

一態様においては、本発明は、治療薬（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤又はベクター又はこれを導コードする導入遺伝子）を被験者に投与することにより、被験者において、上記の通りの疾患又は障害を予防するための方法を提供する。疾患の危険性のある被験者は、例えば、本明細書において記述されるような、診断若しくは予後のアッセイのいずれか又は組み合わせによって同定することができる。予防的薬剤の投与は、例えば、被験体におけるウイルス粒子の検出又は疾患若しくは障害に特徴的な症候の出現の前に行うことができ、その結果、疾患又は障害は、防止され、又はその進行が遅れる。

本発明の他の態様は、被験者を治療的に処置する、すなわち、疾患又は障害の症状の発病を変化させる方法に関する。これらの方法は、インビトロで（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤と共に細胞を培養することによって）、又は、インビボで（例えば、被験者にＤｓｉＲＮＡ剤を投与することによって）実施することができる。
予防的及び治療的な処置の方法に関して、このような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られる知識に基づき、特異的に調整してもよく、又は改変してもよい。本明細書で用いられる場合、「薬理ゲノミクス」は、臨床開発における、及び市場での薬物に対する遺伝子配列決定、統計遺伝学及び遺伝子発現解析のようなゲノム技術の適用を意味する。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子がどのように彼又は彼女の薬物に対する反応を決定するか（例えば、患者の「薬物反応表現型」又は「薬物反応遺伝子型」）の研究を意味する。従って、本発明の他の態様は、その個体の薬物反応遺伝子型に従って、本発明の標的ＲＮＡ分子又は標的ＲＮＡモジュレーターのいずれかでの個体の予防的又は治療的な処置に調整するための方法を提供する。薬理ゲノミクスにより、臨床医又は医師が治療から最も利益を得るであろう患者に対して予防的又は治療的な処置を標的にすること、及び毒性のある薬物に関連した副作用を受けるであろう患者の治療を回避することができる。

治療剤は、適切な動物モデルにおいて試験することができる。例えば、本明細書において開示されたＤｓｉＲＮＡ剤（又は発現ベクター又はこれをコードする導入遺伝子）を動物モデルにおいて用い、前記薬剤での治療の有効性、毒性又は副作用を判定することができる。又は、治療剤を動物モデルにおいて用い、このような薬剤の作用機構を決定することができる。例えば、薬剤を動物モデルにおいて用い、このような薬剤での治療の有効性、毒性又は副作用を判定することができる。又は、薬剤を動物モデルにおいて用い、このような薬剤の作用メカニズムを決定することができる。

本発明の実施には、特に明記しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学の従来の技術を使用し、これらは、当該技術分野の技術内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，１９８２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄＥｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄＥｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９２），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｅｒｉｏｄｉｃｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；ＧｕｔｈｒｉｅａｎｄＦｉｎｋ，１９９１；ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；ＪａｋｏｂｙａｎｄＰａｓｔａｎ，１９７９；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；ＣｕｌｔｕｒｅＯｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅｔｒｅａｔｉｓｅ，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓｅｄｓ．，１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ａｎｄ１５５（Ｗｕｅｔａｌ．ｅｄｓ．），ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒａｎｄＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；ＨａｎｄｂｏｏｋＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎｅｔａｌ．，ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅｚｅｂｒａｆｉｓｈｂｏｏｋ．Ａｇｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙｕｓｅｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ），（４ｔｈＥｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆＯｒｅｇｏｎＰｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照されたい。

特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、共通に、本発明が属する当業者によって理解するのと同じ意味を有する。本明細書において開示されたものに類似又は均等な方法及び材料は、本発明の実施又は試験において用いることができるが、適切な方法及び材料は、後述する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許及びその他の参照文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するだろう。更に、材料、方法及び実施例は、説明のためのみであり、限定することを意図するものではない。

本発明は、以下の実施例を参照することにより説明され、これらは実例として提供され、いずれの様式においても本発明を限定するとして意図されない。当該技術分野において周知の標準的技術又は以下に具体的に記述した技術を利用した。
実施例１−方法
オリゴヌクレオチド合成、インビトロにおける使用
標準的な方法に従い、個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣにより精製した（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）。全てのオリゴヌクレオチドは、HPLC解析による化学的純度及び質量分析解析による全長鎖の純度に基づいて品質管理して切り離した。二重鎖ＲＮＡのＤｓｉＲＮＡｓは、同量の各鎖を混合し、ＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で１００℃で一時的にに加熱し、次いで混合物を室温に冷却することにより、使用直前に調製した。

オリゴヌクレオチド合成、インビボにおける使用
標準的な方法に従い、個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣにより精製した（ＯｌｉｇｏＦａｃｔｏｒｙ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）。全てのオリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣ解析による化学的純度及び質量分析解析による全長鎖の純度に基づいて品質管理して切り離した。二重鎖ＲＮＡのＤｓｉＲＮＡｓは、同量の各鎖を混合し、ＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で１００で一時的に加熱し、次いで混合物を室温に冷却することにより、使用直前に調製した。

細胞培養及びＲＮＡトランスフェクション
Ｈｅｌａ細胞をＡＴＣＣから得、５％のＣＯ_２下、３７℃で、１０％のウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）に維持した。図７、９、１２及び１３のＲＮＡトランスフェクションについては、記載したように、また、製造業者の説明書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、最終濃度０．１ｎＭでＤｓｉＲＮＡｓをトランスフェクトした。すなわち、各ＤｓｉＲＮＡの０．０２μＭのストック溶液２．５μＬを、４６．５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと混合した。得られた５０μＬの混合液を１２ウェルプレートの個々のウェルに加え、室温で２０分間インキュベートし、ＤｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。一方、Ｈｅｌａ細胞をトリプシン処理し、３６７細胞／μＬの最終濃度になるように培地に再懸濁した。最終的に、４５０μＬの細胞懸濁液を各ウェルに加え（最終容積５００μＬ）、プレートをインキュベータ中に２４時間置いた。

インビトロにおける、ＲＮＡ分離及び解析
細胞を２ｍＬのＰＢＳで一度洗浄し、総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出して、３０μＬの最終容積において溶出した。１μｇの総ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ１^ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＫｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びランダムなヘキサマーを用いて逆転写させた。得られたｃＤＮＡの１／３０（０．６６μＬ）を、３．３３μＬのＨ_２Ｏ及び１μＬのヒト遺伝子ＨＰＲＴ−１（受け入れ番号ＮＭ＿０００１９４）及びＳＦＲＳ９（受け入れ番号ＮＭ＿００３７６９）遺伝子に特異的な２セットのプライマー及びプローブを含む３μＭの混合物と共に、５μＬのｉＱ（商標）ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した：
ＨｕＨＰＲＴフォワードプライマーＦ５１７ＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧ（配列番号：１）
ＨｕＨＰＲＴリバースプライマーＲ５９１ＧＧＣＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号：２）
ＨｕＨＰＲＴプローブＰ５５４Ｃｙ５−ＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴ−ＩＢＦＱ（配列番号：３）
ＨｕＳＦＲＳ９フォワードプライマーＦ５６９ＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴ（配列番号：４）
ＨｕＳＦＲＳ９リバースプライマーＲ７１２ＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＡＴＡ（配列番号：５）
ＨｕＳＦＲＳ９プローブＰ６４４ＨＥＸ−ＴＧＧＡＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＧＡ−ＩＢＦＱ（配列番号：６）

インビボにおける試料調製及び注射
製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従い、ＤｓｉＲＮＡをＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）中に製剤化した。すなわち、簡潔には、Ｎ／グループのマウス及び使用するマウスの体重を測定し、次いで処理されるマウスの各グループに必要なＤｓｉＲＮＡの量を算出した。１ｍＬのＩＶＦ−ｏｌｉｇｏは、１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で、２５ｇ／マウスの４匹のマウスに十分であった。１ｍｇのＤｓｉＲＮＡを、１ｍｌのＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）に添加して、ローテーターで３０分間、室温で混合した。製剤化したＩＶＦ− ＤｓｉＲＮＡを希釈するために１４ｍｌの５％グルコースを用い、５０ｋＤａの分子量を分画する回転コンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ）に適用した。ＩＶＦ−ＤｓｉＲＮＡの容積が１ｍｌ未満になるまでスピンコンセントレータを４℃で〜２時間、４０００ｒｐｍにて回転させた。回収したＩＶＦ− ＤｓｉＲＮＡを、１ｍＬの５％グルコースで希釈して、動物注射のために準備した。

動物の注射及び組織収集
動物を、ケタミン／キシラジンで腹腔内注射によって、外科的麻酔に供した。それぞれのマウスを、注射の前に体重測定した。製剤化したＩＶＦ−ＤｓｉＲＮＡを、１００μｌ／体重１０ｇにて静脈注射した。２４時間後に、マウスを、ＣＯ_２吸入によって屠殺した。解析のための組織を収集して、２ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を含む試験管に入れ、室温で３０分間観点させ、４℃で一晩のインキュベーションした。組織は、使用まで−８０℃にて貯蔵した。

組織ＲＮＡ調製及び定量
約５０〜１００ｍｇの組織を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）上にて１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）中でホモジナイズした。次いで、製造業者のプロトコールに従って、総ＲＮＡを単離した。すなわち、０．２ｍＬのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＱＩＡｚｏｌ（商標）可溶化液に加え、撹拌することによって、激しく混合した。４℃で１５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心した後、水相を集め、０．５ｍｌのイソプロパノールと混合した。１０分間、１４，０００ｒｐｍで更に遠心した後、ＲＮＡペレットを７５％のエタノールで一度洗浄して、短時間乾燥した。
単離したＲＮＡを、１００μｌのＲＮアーゼを含まない水に再懸濁し、製造業者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ（商標）ｔｏｔａｌＲＮＡｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）又はＳＶ９６ｔｏｔａｌＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるクリーンアップに供した。

インビトロにおける第一の鎖ｃＣＮＡ合成
製造業者の説明書にし従ってたがって、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ１^ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＫｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びオリゴｄＴを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡの１／４０（０．６６μＬ）を、３．３３μＬのＨ_２Ｏ及び１μＬのマウス遺伝子ＨＰＲＴ−１（受け入れ番号ＮＭ＿０１３５５６）及びＫＲＡＳ（受け入れ番号ＮＭ＿０２１２８４）遺伝子に特異的な２セットのプライマー及びプローブを含む３μＭの混合物と共に、５μμＬのＩＱＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した：
ＭｍＨＰＲＴフォワードプライマーＦ５７６ＣＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴ（配列番号：７）
ＭｍＨＰＲＴリバースプライマーＲ６６４ＣＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号：８）
ＭｍＨＰＲＴプローブＰ６１６Ｃｙ５−ＴＧＧＴＴＡＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧ−ＩＢＦＱ（配列番号：９）
ＭｍＫＲＡＳフォワードプライマーＦ２７５ＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧＴＡＣＧＡＣＣ（配列番号：１０）
ＭｍＫＲＡＳリバースプライマーＲ３９０ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号：１１）
ＭｍＫＲＡＳプローブＰ２９７ＦＡＭ−ＡＣＧＡＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴ−ＩＢＦＱ（配列番号：１２）

定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｃ１０００サーマルサイクラーを備えたＣＦＸ９６Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、増幅反応のために使用した。ＰＣＲ条件は、以下の通りだった：９５℃で３分間；次いで、９５℃で１０秒；５５℃で１分間を４０サイクル繰り返した。それぞれの試料を、三連で試験した。ＨＰＲＴの実施例については、相対的なＨＰＲＴｍＲＮＡレベルをＳＦＲＳ９ｍＲＮＡレベルで標準化し、トランスフェクション試薬プラス対照のミスマッチ二重鎖で処理したか、又は未処理の対照試料において得られたｍＲＮＡレベルと比較した。ＫＲＡＳの実施例については、相対的なＫＲＡＳｍＲＮＡレベルをＨＰＲＴ−１ｍＲＮＡレベルで標準化し、５％グルコースで処理したマウスからの対照試料において得られたｍＲＮＡレベルと比較した。データは、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸＭａｎａｇｅｒｖｅｒｓｉｏｎ１．０（インビトロ実施例）又は１．５（インビボ実施例）ソフトウェアを使用して解析した。
実施例２−一本鎖伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤の効果
一本鎖伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤を、配列特異的標的ｍＲＮＡの阻害の効果について試験を行った。具体的には、ＫＲＡＳ−２４９Ｍ、及び５’一本鎖ガイド伸長を有するＨＰＲＴ−標的ＤｓｉＲＮＡ二重鎖を、２０ｍＭの一定濃度でＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、２４時間後にＨＰＲＴ発現レベルを測定した（図７及び９）。トランスフェクションは二連で実施し、各二連を、三連でＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ発現についてｑＰＣＲによりアッセイした。

この条件下（０．１ｎＭ二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子の発現は、二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥ、ＤＮＡ１５ＰＳ、ＲＮＡ１５ＰＳ、並びにＲＮＡ１５ＰＳ−２’ＯＭＥによって６０〜８５％低下した。比較すると、一本鎖ガイド伸長を有しない二重鎖は、ＫＲＡＳ−２９遺伝子発現を約９０％減少させた。従って、一本鎖ガイド伸長を有する二重鎖は、一本鎖ガイド伸長を有しない二重鎖としてＫＲＡＳ−２４９のサイレンシングに有効であった。全ての一本鎖伸長二重鎖は、一本鎖伸長領域内にホスホロチオエート骨格の修飾を含んでいた。１０ヌクレオチドの一本鎖ガイド伸長を有する二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現が約７５〜８５％低下した。１５ヌクレオチドの一本鎖ガイド伸長を有する、二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子の発現は６０〜７０％低下した。一般に、５’ガイド伸長内に存在するヌクレオチドにもかかわらず、１０ヌクレオチドのガイド伸長を有する二重鎖は、１５ヌクレオチドのガイド伸長を有する二重鎖よりも、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる。特に、デオキシリボヌクレオチドを含むガイド伸長を有する二重鎖のサイレンシング活性は、リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む二重鎖と比較し、１５ヌクレオチドの増加した長さに対し、より感受性であった。ＫＲＡＳ−２４９の遺伝子発現を標的とする実験において用いられた、Ｄｉｃｅｒによる５’ガイド鎖伸長二重鎖の処理は、インビトロアッセイにおいても見出された。

同様に、同じ条件下（０．１ｎＭ二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＨＰＲＴ１遺伝子発現は、二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥ、ＤＮＡ１５ＰＳ、ＲＮＡ１５ＰＳ及びＲＮＡ１５ＰＳ−２’−ＯＭＥにより、約６５〜８５％低下した（図９）。比較すると、一本鎖ガイド伸長を有していない二重鎖は、ＨＰＲＴ１遺伝子発現を約９０％低下させた。従って、一本鎖ガイド伸長を有する二重鎖は、一本鎖ガイド伸長を有しない二重鎖と同じくらい、ＨＰＲＴ１のサイレンシングに効果がある。全ての一本鎖伸長二重鎖は、一本鎖伸長領域内に、ホスホロチオエート骨格修飾を含んでいた。１０ヌクレオチドの一本鎖ガイド伸長を有する二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９の遺伝子発現は約８０〜８５％低下した。１５ヌクレオチドの一本鎖ガイド伸長を有する二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９の遺伝子発現は６０〜８０％低下した。一般に、一般に、５’ガイド伸長内に存在するヌクレオチドにもかかわらず、１０ヌクレオチドのガイド伸長を有する二重鎖は、１５ヌクレオチドのガイド伸長を有する二重鎖よりも、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる。特に、デオキシリボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むガイド伸長を有する二重鎖のサイレンシング活性は、リボヌクレオチドを含む二重鎖と比較し、１５ヌクレオチドの増加した長さに対し、より感受性であった。ＨＰＲＴ１の遺伝子発現を標的とする実験において用いられた、Ｄｉｃｅｒによる５’ガイド鎖伸長二重鎖の処理は、インビトロアッセイにおいても見出された（図１０）。

一本鎖ガイド伸長を有する二重鎖は、一本鎖ガイド伸長を有しない二重鎖と同じくらい、ＫＲＡＳ−２４９及びＨＰＲＴ１、それぞれのサイレンシングにおいて効果があるので、この発見は、効果を喪失することなく一本鎖ガイド伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤の修飾を可能にする。

実施例３
一本鎖伸長に相補的な短いオリゴヌクレオチドと組み合わせた一本鎖伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤の効果
一本鎖伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤を、一本鎖伸長と相補的な短いオリゴと組合せ、配列特異的標的ｍＲＮＡの効果について試験した。具体的には、１５ヌクレオチドの不連続な相補体を含む、１５ヌクレオチド長の５’一本鎖ガイド伸長を有するＫＲＡＳ−２９４Ｍ及びＨＰＲＴ−標的ＤｓｉＲＮＡ二重鎖を、２０ｎＭの固定濃度でＨｅＬａ細胞に導入し、２４時間後に、ＨＰＲＴの発現レベルを測定した（図１２及び１３）。トランスフェクションを二連で実施し、各二連を、それぞれｑＰＣＲにより、ＫＲＡＳ−２４９の遺伝子発現及びＨＰＲＴ発現について三連でアッセイした。

これらの条件下（０．１ｎＭの二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子の発現は、不連続な相補体ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＤＮＡ１５、ＰＳ−２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５及び２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５の存在下、二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４０）、ＲＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）、ＲＮＡ１５ＰＡＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）により、約１５〜６０％低下した（図１２）。一本鎖ガイド伸長を有しない二重鎖は、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子の発現を約８５％低下させた。全ての一本鎖伸長二重鎖は、一本鎖伸長領域内にホスホロチオエート骨格の修飾を含んでいた。一般に、不連続な相補体の存在にもかかわらず、リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドガイド伸長を有する二重鎖は、デオキシリボヌクレオチドガイド伸長を有する二重鎖よりも、ＫＲＡＳ標的遺伝子の発現を減少させる。二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４０）、ＲＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）、ＲＮＡ１５ＰＡＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）については、遺伝子発現の低下は、２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５不連続相補体を含むか含まない場合とで同程度であった。

同様に、同じ条件下（０．１ｎＭの二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＨＰＲＴ１遺伝子の発現は、不連続な相補体ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＤＮＡ１５、ＰＳ−２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５及び２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５の存在下、二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１００１＋１３５３）、ＲＮＡ１５ＰＳ（１００１＋１３５４）、ＲＮＡ１５ＰＡＳ−２’−ＯＭＥ（１００１＋１３５５）により、約３０〜８５％低下した（図１３）。一本鎖ガイド伸長を有しない二重鎖は、ＨＰＲＴ１遺伝子の発現を約９０％低下させた。全ての一本鎖伸長二重鎖は、一本鎖伸長領域内にホスホロチオエート骨格の修飾を含んでいた。一般に、不連続な相補体の存在にもかかわらず、リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドガイド伸長を有する二重鎖は、デオキシリボヌクレオチドガイド伸長を有する二重鎖よりも、ＫＲＡＳ標的遺伝子の発現を減少させる。二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）及びＲＮＡ１５ＰＡＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）は、不連続な相補体ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＲＮＡ１５、ＰＳ−２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５、２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５の存在下、任意の不連続な相補体を有しない、同じ二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）及びＲＮＡ１５ＰＡＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）と比較し、遺伝子発現の低下が増強されることが示された。

実施例４−ＤｓｉＲＮＡ剤のインビボにおける効果
ＤＮＡ二重鎖伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤について、単一投与プロトコール又は繰り返し投与プロトコールのいずれか（例えば、インビボのフェクトアミンの１０ｍｇ／ｋｇの単回注射）における配列特異的標的ｍＲＮＡのインビボにおける効果を調べた。肝臓、腎臓、脾臓及びリンパ腺組織におけるＫＲＡＳの発現を、三連で実施するリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により注射２４時間後に測定し、ＫＲＡＳの発現を評価した。これらの条件下、一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤は、調べた全ての組織においてＫＲＡＳ標的遺伝子阻害の統計的に有意なレベルを示した。このような一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡで処置された組織におけるＫＲＡＳの阻害レベルの割合は、肝臓（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）、脾臓（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）、腎臓（１９１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）、及びリンパ腺（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）であった。従って、本発明の伸長されたＤｓｉＲＮＡｓのインビボにおける効果は、多くの組織型にわたって証明された。
インビボにおいて特定標的遺伝子の遺伝子発現を低下させる、本発明の伸長されたＤｉｃｅｒ基質剤の能力の更なる証明は、マウス又は他の哺乳動物被験者への、全身（例えば、静脈腹腔注射）、又は組織への直接注射（例えば、目、脊髄／脳／中枢神経系等への注射）により、実施された。追加の標的ＲＮＡレベルの測定は、標準法（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）調製（グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム）に続くｑＲＴ−ＰＣＲ）により、標的細胞により実施した（例えば、肝臓及び／又は腎臓細胞中のＲＮＡレベルを、以下のマウスの注射に続いてアッセイし；眼細胞を、被験者の眼細胞への直接注射に続いてアッセイし；脊髄／脳／中枢神経系を被験者への脊髄／脳／中枢神経系への直接注射に続きアッセイした）。

このような任意の更なるインビボ実験において、本発明の伸長されたＤｉｃｅｒ基質剤（例えば、ガイド５’伸長又はパッセンジャー３’伸長ＤｓｉＲＮＡ）は、本発明の伸長されたＤｉｃｅｒ基質剤を投与した場合に、適切なコントロール（例えば、媒体単独のコントロール、ランダムな二重鎖コントロール、種々の標的ＲＮＡコントロールに向けられた二重鎖等）と比較し、ＲＮＡレベルの統計的に有意な低下が観察されれば、効果的なインビボ剤であると考えることができる。このような比較に割り当てられるｐ−値（例えば、対応のない片側Ｔ−検定（１ｔａｉｌｅｄ，ｕｎｐａｉｒｅｄＴ−ｔｅｓｔ）により生成）は０．０５未満であり、本発明の伸長されたＤｉｃｅｒ基質剤（例えば、ガイド５’伸長又はパッセンジャー３’伸長ＤｓｉＲＮＡ剤）は、効果的なＲＮＡ干渉剤であると考えられた。また、効果的なＲＮＡ干渉剤として本発明の拡張Ｄｉｃｅｒ基質剤を分類するために、ｐ−値のしきい値を設定することができ、例えば、０．０１、０．００１等で、より厳格なフィルタリングを提供するために、より堅牢な違いを識別し、及び／又は複数の仮説検定等を調整する。効果的及び非効果的な伸長されたＤｉｃｅｒ基質剤を区別するために、絶対的な活性レベルの限界を設定することもできる。例えば、特定の実施態様においては、本発明の効果的なＤｉｃｅｒ基質剤は、インビボにおける標的ＲＮＡレベルの統計的に有意な低下だけでなく、適切なコントロールと比較し、試験を行った組織又は細胞において、標的ＲＮＡの少なくとも約１０％の低下、約１５％の低下、少なくとも約２０％の低下、約２５％の低下、少なくとも約２０％の低下、約２５％の低下、約３０％の低下等を発揮する。従って、本発明の伸長されたＤｉｃｅｒ基質剤（例えば、ガイド５’伸長及びパッセンジャー３’伸長ＤｓｉＲＮＡ剤）のインビトロにおける更なる有効性試験を実施した。

一本鎖伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤（図１４及び１５）は、肝臓、脾臓及び腎臓において、インビボで配列特異的標的ＫＲＡＳｍＲＮＡの発現を効果的に阻害した。肝臓においては、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）は、グルコースのみのコントロールに対して標準化した場合に、５’パッセンジャー伸長Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）を有しないＤｓｉＲＮＡ剤と比較し、ＫＲＡＳｍＲＮＡ発現の阻害を示した（図１６〜１８）。ＤｓｉＲＮＡ剤によるＫＲＡＳｍＲＮＡの阻害は、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）を注射した動物の肝臓中で、少なくとも７５〜９０％であった。肝臓中の、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）の阻害の総計は、陰性コントロール、グルコースと比較して有意である、５’パッセンジャー伸長Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）を有しないＤｓｉＲＮＡ剤のものと同程度であった。
脾臓においては、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）は、グルコースのみのコントロールに対して標準化した場合に、５’パッセンジャー伸長Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）を有しないＤｓｉＲＮＡ剤と比較し、ＫＲＡＳｍＲＮＡ発現の阻害をも示した（図１９〜２１）。ＤｓｉＲＮＡ剤によるＫＲＡＳｍＲＮＡの発現の阻害は、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）を注射した動物の脾臓中で、少なくとも９０〜９５％であった。脾臓中の、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）の阻害の総計は、陰性コントロール、グルコースと比較して有意である、５’パッセンジャー伸長Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）を有しないＤｓｉＲＮＡ剤のものと同程度であった。

腎臓においては、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）は、グルコースのみのコントロールに対して標準化した場合に、５’パッセンジャー伸長Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）を有しないＤｓｉＲＮＡと比較し、ＫＲＡＳｍＲＮＡ発現の阻害を示した（図２２〜２４）。ＤｓｉＲＮＡ剤によるＫＲＡＳｍＲＮＡの発現の阻害は、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）を注射した動物の腎臓中で、少なくとも２０〜４０％であった。それにもかかわらず、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）の阻害の総計は、５’パッセンジャー伸長Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）を有しないＤｓｉＲＮＡ剤のものと同程度であった。これらの実験において、５’パッセンジャー伸長Ｍ９７Ｍを有さず、ＫＲＡＳに対して配列特異的でないＤｓｉＲＮＡ剤が陽性コントロールとして用いられた。

一本鎖ガイド伸長を有するＤｓｉＲＮＡは、インビボでＫＲＡＳのサイレンシングに、一本鎖伸長を有しないＤｓｉＲＮＡ剤と同等に効果的であり、この発見は、インビボで効果を喪失することなく、一本鎖ガイド伸長を有するＤｓｉＲＮＡ剤の修飾を可能にする。

本明細書において言及した全ての特許及び刊行物は、本発明が属する技術分野における当業者の技術のレベルを示す。本開示において引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照により個々にその全体が援用されたのと同様に参照により本明細書に組み入れられる。

当業者であれば、本発明が目的を実行し、言及される目標及び利点、並びにその中に固有のものを得るのに十分に適することを容易に認識するであろう。好ましい実施態様の現在の代表として本明細書に開示された方法及び組成物は例示的であり、本発明の範囲についての限界として意図されない。その中の変形及びその他の用途が当業者に思い浮かぶであろうし、それは、本発明の精神内に包含され、請求項の範囲によって定義される。
本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、種々の置換及び改変を、本明細書に開示された本発明に行うことができることが、当業者には容易に明らかであろう。従って、このような更なる実施態様は、本発明及び以下の請求項の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介するために改善された活性を有する核酸構築物を産生することに向けた本明細書に開示された化学的修飾の種々の組み合わせ及び／又は置換を試験することを当業者に教示する。このような改善された活性は、改善された安定性、生物学的利用能の改善、及び／又はＲＮＡｉを媒介する細胞反応の活性の改善を含む。従って、本明細書に開示された具体的態様は限定的でなく、当業者であれば、本明細書に開示された改変の特異的な組み合わせが改良されたＲＮＡｉ活性を有するＤｓｉＲＮＡ分子を同定することに向けて過度の実験なしで試験することができることを容易に認識することができる。

本明細書に適切に実例として記述された本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素又は要素類、限定又は限定類なく実施することができる。従って、例えば、本明細書におけるそれぞれの例において、「含む」、「本質的にからなる」及び「からなる」という用語のいずれも、その他の２つの用
語のいずれと置換してもよい。用いられた用語及び表現は、記述の用語として使用され、限定的ではなく、このような用語及び表現の使用において示され、記載された特徴、又はその一部の任意の均等物を除外することは意図されないが、種々の改変が請求項の発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明を、好ましい態様によって具体的に開示したが、本明細書に開示される概念の随意の特徴、改変及び変形が当業者に
よって使用されてもよいこと、及びこのような改変及び変形は、明細書及び添付の特許請求の範囲によって定義されるとおり、本発明の範囲内であるものと考えられることを理解すべきである。

更に、本発明の特徴又は態様は、マーカッシュ群又は変形例のその他の群に関して記載されており、当業者であれば、本発明が、マーカッシュ群又はその他の群のメンバーの任意の個々メンバー又はサブグループに関して、これにより記載されることを認識するであろう。

「一つの」及び「該」、並びに本明細書に記述される状況における（特に、以下の特許請求の範囲の状況における）同様の指示物は、他に本発明において記載されるか、又は状況によって明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈される。「含む」、「有する」、「含む」及び「含む」は、特に明記しない限り、制限のない用語として解釈される（すなわち、「含むが、限定されない」ことを意味する）ものと解釈される。本明細書におけるある値の範囲の説明は、特に明記しない限り、範囲内に入るそれぞれ値について個々に言及するのを簡略する方法として役に立つことを単に意図し、それぞれの別々の値は、それがあたかも本明細書に詳述されるかのように、本明細書内に組み入れられる。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書において特に明記しない
限り、又は状況によって明らかに否定することができない限り、任意の適切な順位で行うことができるか。本明細書に提供されるすべての例又は例示的な言語（例えば、「等の」）の使用は、他に請求されない限り、単に本発明をよりよく解釈することのみを意図し、本発明の範囲に対して限定を与えるというわけではない。明細書における言語は、本発明の実施に必須なものとして任意の請求されていない要素を示すものとして解釈すべきでない。

本発明を実施するための発明者が知っている最良の形態を含む本発明の態実施様が、本明細書に開示されている。これらの実施態様の変形は、前述の記載を読み込むと、
即座に当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予想し、本発明者らは、本発明について、本明細書に具体的に記述されたもの以外のその他のものが実施されることを意図する。従って、本発明には、準拠法によって可能にされるように、本願明細書に添付の特許請求の範囲に詳述された主題の全ての改変及び均等物が含まれる。更に、その全ての可能な変形の上記の要素のいずれの組み合わせも、本明細書に
おいて特に明記しない限り、又は状況によって明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。

Claims

５’末端及び３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と、５’末端及び３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを有する単離された二本鎖核酸であって、前記５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを含み、かつ前記３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを含み：
前記第一の鎖が２５〜３０ヌクレオチド残基の長さを有し、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、前記第一の鎖の１〜２３位が少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；
前記第二の鎖が３６〜６６ヌクレオチド残基の長さを有し、３’末端ヌクレオチドから開始して、前記第一の鎖の１〜２３位と対をなす位置に少なくとも８個のリボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成し；
前記第二の鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが前記第一の鎖と対をなさず、また６個までの連続した３’末端ヌクレオチドが、前記第一の鎖と対をなさず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’の一本鎖オーバーハングを形成し；
前記第二の鎖の５’末端が、前記第一の鎖と対をなさない１０〜３０個の連続したヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖の５’オーバーハングを形成し；
前記第一の鎖と第二の鎖とが最大相補性に関して整合された際に、少なくとも第一の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドが前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなし、それにより前記第一の鎖と第二の鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成し；
前記第二の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された際に標的遺伝子発現を低減するように、前記第二の鎖の少なくとも１９個のリボヌクレオチドの長さに沿って標的ＲＮＡに対して十分相補的である、単離された二本鎖核酸。
前記第一の鎖の２４位から第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基までの間の及び前記第一の鎖の２４位と第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基とを含む前記第一の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の不対３’末端ヌクレオチドを含まない、少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて１５個の連続したヌクレオチドが、前記第一の鎖と対をなさず、それにより前記第二の鎖内に１０〜１５ヌクレオチドの一本鎖の５’オーバーハングを形成する、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一の鎖２４位から第一の鎖の３’末端ヌクレオチド残基までに対応し及び従って塩基対をなす前記第二の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一の鎖と第二の鎖との間の前記実質的に二重鎖の領域が、完全に二重鎖の領域を含み、前記完全に二重鎖の領域が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす第一の鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間において不対塩基を有さない、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記実質的に二重鎖の領域が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす第一の鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に：１個の不対塩基対；２個の不対塩基対、３個の不対塩基対、４個の不対塩基対、及び５個の不対塩基対からなる群から選択される不対塩基対を含む、請求項５に記載の単離された二本鎖核酸。
前記不対塩基対が、連続又は不連続である、請求項６に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一の鎖が３０ヌクレオチドまでの長さを有し、前記第一の鎖の３’から前記第一の鎖の２３位までのヌクレオチドが：前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである、前記第一の鎖の２４位から３’末端ヌクレオチド残基までの２、３、４、５及び６個のヌクレオチド残基からなる群から選択されるデオキシヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなす前記第一の鎖の前記デオキシリボヌクレオチドが、連続したデオキシリボヌクレオチドである、請求項８に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一の鎖の２４〜３０位の二つ又はそれ以上の連続ヌクレオチド残基が、前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一の鎖が３０ヌクレオチドまでの長さを有し：２４位及び２５位、２５位及び２６位、２６位及び２７位、２７位及び２８位、２８位及び２９位、並びに２９位及び３０位からなる群から選択される一対のデオキシリボヌクレオチドを含み、デオキシリボヌクレオチドの前記第一の鎖の対が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチド対と塩基対をなす、請求項１０に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一の鎖の１〜２３位の前記８個又はそれ以上のリボヌクレオチドが、連続したリボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の１〜２３位の各ヌクレオチド残基が、前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすリボヌクレオチドである、請求項１２に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の前記３’の一本鎖オーバーハングが：１〜４ヌクレオチド、１〜３ヌクレオチド、１〜２ヌクレオチド、及び２ヌクレオチド長からなる群から選択される長さを有する、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の３’オーバーハングの前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記修飾ヌクレオチド残基が２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群から選択される、請求項１５に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項１５に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の３’オーバーハングが２ヌクレオチド長であり、前記第二の鎖の３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対応する前記第二の鎖のヌクレオチド残基を１^Ａ位としたとき、前記第二の鎖が、１６^Ａ位から前記第一の鎖の３’末端残基に対応する前記第二の鎖のヌクレオチド残基までの全位置に非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の３’末端における第一のヌクレオチドから開始して、前記第二の鎖の３’末端から第一位、第二位及び第三位が修飾ヌクレオチドである、請求項１３に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対応する前記第二の鎖のヌクレオチド残基を１^Ａ位としたとき、前記第二のオリゴヌクレオチド鎖が、１^Ａ位から１５^Ａ位までに交互の修飾及び非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１４に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の前記５’の一本鎖オーバーハングが：１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０ヌクレオチド長からなる群から選択される長さを有する、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の５’オーバーハングの前記ヌクレオチドがホスフェートバックボーン修飾を含む、請求項２２に記載の単離された二本鎖核酸。
前記ホスフェートバックボーン修飾が、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、及びメチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ及び二環式フラノース類似体からなる群から選択される、請求項２３に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の５’末端ヌクレオチド残基（１^Ｂ位）から開始する前記第二の鎖が、２^Ｂ位から、前記第一の鎖の３’末端残基に対応する前記第二の鎖の５’残基までのヌクレオチドの間にホスホロチオエートバックボーン修飾を含む、請求項２４に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の５’オーバーハングが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の５’オーバーハングの前記ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記修飾ヌクレオチド残基が、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群から選択される、請求項２７に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の５’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項２７に記載の単離された二本鎖核酸。
第二の鎖の５’末端ヌクレオチド残基が２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項２７に記載の単離された二本鎖核酸。
５’末端及び３’末端を有する第三のオリゴヌクレオチド鎖を更に含み：
前記第三の鎖が、１０〜３０ヌクレオチド残基の長さを有し；
前記第三の鎖の少なくとも１０個の連続したヌクレオチド及び多くて３０個の連続したヌクレオチドが、前記第二の鎖の５’末端と対をなす、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第三の鎖がリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二の鎖の５’オーバーハングの全ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項３１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第三の鎖の前記ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記修飾ヌクレオチド残基が、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群から選択される、請求項３１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第三の鎖の前記修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項３１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第三の鎖が、ホスフェートバックボーン修飾を含む、請求項３１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記ホスフェートバックボーン修飾が、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、及びメチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ及び二環式フラノース類似体からなる群から選択される、請求項３７に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第三の鎖の５’末端ヌクレオチド残基（１^Ｃ位）から開始する前記第三の鎖が、１^Ｃ位と２^Ｃ位とのヌクレオチドの間にホスホロチオエートバックボーン修飾を含む、請求項３８に記載の単離された二本鎖核酸。
前記第二又は第一のオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドが、ダイサー切断の指向を案内する修飾ヌクレオチドで置換されている、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
第一の鎖が、第二の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
前記標的ＲＮＡがＫＲＡＳである、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
細胞内で標的遺伝子の発現を低減するための方法であって：
細胞を、参照ｄｓＲＮＡと比較して細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸とインビトロで接触させることを含む、方法。
動物（ヒトを除く）内で標的遺伝子の発現を低減するための方法であって：参照ｄｓＲＮＡと比較して動物の細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸で動物を処置することを含む、方法。
前記二本鎖核酸を化学的に又は酵素的に合成することを含む、請求項１に記載の二本鎖核酸の合成方法。