ES2727078T3

ES2727078T3 - Moléculas de ácido ribonucleico pequeño de interferencia mejoradas

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Publication number: ES2727078T3
Application number: ES15711195T
Authority: ES
Inventors: Oommen Varghese; Oommen Oommen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2019-10-14
Anticipated expiration: 2035-03-20
Also published as: EP3119887B1; DK3119887T3; EP3119887A1; US20170137808A1; WO2015140330A1

Abstract

Una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un no-ribonucleótido, donde dicha cadena no codificante tiene un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de dicha cadena codificante y donde una porción de doble cadena de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una longitud de al menos 19 pares de base.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de ácido ribonucleico pequeño de interferencia mejoradas

Campo técnico

Las presentes realizaciones se refieren generalmente a moléculas de ARN pequeño de interferencia (ARNip) y, en particular, a moléculas de ARNip que tienen características mejoradas por lo que respecta a la penetración celular.

Antecedentes

Desde el descubrimiento del ARN sintético pequeño de interferencia (ARNip), denominado a veces en la técnica ARN corto de interferencia o ARN silenciador, como una potente molécula de silenciamiento génico en células de mamíferos, han surgido los fármacos basados en ARNip como una prometedora tecnología para tratar diversas enfermedades. La interferencia de ARN (ARNi) es una vía endógena para el silenciamiento génico posttranscipcional que utiliza la disminución (knockdown) específica de secuencias de las secuencias de ARNm diana, lo cual hace que el ARNi sea más específico que los fármacos tradicionales. En esta tecnología de ARNi, se incorpora RNA de doble cadena corto (19-meros a 21 -meros) en un complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), lo cual tiene como resultado la degradación de una cadena, denominada cadena codificante o pasajera, y la incorporación de la otra cadena, denominada cadena no codificante o guía, en el complejo RISC. Este complejo RISC activado se une al ARNm de una manera específica de secuencia, con el resultado de la disminución de la expresión génica. La potencia de este método ha sido tan profunda que supera a otras tecnologías de silenciamiento génico existentes.

Con el fin de trasladar la tecnología ARNi al ámbito clínico, deben abordarse varios desafíos. Los aspectos clave son (1) el suministro celular de dichas moléculas de ARNip terapéuticas en las concentraciones deseadas; (2) incorporación selectiva de cadena no codificante en el complejo RISC para minimizar los efectos no deseados fuera de diana; y (3) minimizar la activación inmune.

Está perfectamente establecido que el ARNip, al ser una molécula grande con carga negativa, generalmente, no pasa la membrana plasmática de las células, la barrera biológica que limita su potencial terapéutico. Por lo tanto, se está llevando a cabo una exhaustiva investigación para identificar los vehículos de administración que superan esta barrera celular sin inducir una toxicidad significativa. El ARNip desnudo puede inducir un efecto terapéutico in vivo, aunque requiere una inyección intravenosa de alta presión (conocida como hidrodinámica) para que penetren las moléculas de ARNip en las células. El suministro localizado de ARNip desnudo sigue siendo un objetivo a perseguir como una atractiva alternativa, especialmente a la vista de que se está llevando a cabo una gran cantidad de ensayos clínicos.

Un segundo importante desafío sigue siendo la preferencia de selección de la cadena no codificante deseada con respecto la cadena codificante dentro de la maquinaria de ARNi. Las proteínas específicas del complejo RISC se unen selectivamente al extremo 5' termodinámicamente más estable del ARNip, regulando así este proceso de selección. Para mejorar la selección de cadena no codificante, se han seguido varios enfoques, como, por ejemplo, el desarrollo de ARN asimétrico reduciendo la longitud de la cadena codificante, regulando la asimetría termodinámica a través de la incorporación selectiva de modificación química desestabilizadora, como por ejemplo ácidos nucleicos desbloqueados, bicatenarios desestabilizados internamente, y bloqueando la fosforilación del extremo 5' de la cadena codificante utilizando modificaciones 5'-0-metilo.

La patente estadounidense US 2009/0208564 describe el diseño de moléculas de ARNip asimétricas donde la longitud de la cadena codificante o pasajera se reduce de los 21 -meros convencionales a 12-17-meros. Dicha asimetría reduce el efecto fuera de diana y mejora la actividad de ARNi.

La patente europea EP 1 407 044 (patente internacional WO0244321) describe moléculas de ARNbc aisladas capaces de interferencia con el ARN específico de diana, en las que cada cadena de ARN tiene una longitud de 19 a 23 nucleótidos y donde al menos una cadena tiene un saliente 3' de 1 a 3 nucleótidos. Las moléculas de ARNbc de la patente EP 1407044 requieren la presencia de un vehículo para la transfección.

La patente EP 1486 564 describe un método para la selección específica de moléculas de ARNbc capaces de interferencia de ARN y que tienen una eficiencia mejorada a través de una mayor estabilidad en suero. Las secuencias de las cadenas simples de la molécula de ARNbc se seleccionan de modo que en cada extremo de la molécula de ARNbc el último par de nucleótidos complementarios sea G-C o al menos dos de los últimos cuatro pares de nucleótidos complementarios sean pares G-C, donde la molécula de ARNbc tiene un saliente de 1 a 4 nucleótidos desapareados.

La patente estadounidense US 2012/0041049 describe moléculas de ARNbc aisladas que poseen secuencias ricas en G/C en el extremo 5' de la cadena pasajera o en el extremo 3' de la cadena guía, lo cual tiene como resultado una mayor estabilidad en suero y una mayor eficiencia de disminución.

El único suministro de ARNip sin vehículo se describe en los documentos US2004/0198640, US 2009/0209626 y WO 2010/033247, donde los nucleótidos de las moléculas de ARNip se modifican ampliamente con grupos hidrófobos.

Otras moléculas de ARNip se describen en Caplan et al., PNAS, 98, 17, 9742-9747 (2001); Kim et al., Nature Biotechnology, 23, 2, 222-226 (2005); Bolcato-Bellmin y otros, PNAS, 104, 41, 16050-16055 (2007); Mok et al., Nature Materials, 9, 272-278 (2010); Schmitz y Chu, Silence, 2, 1, 1 -10 (201 1); Wu et al., Nucleic Acids Research, 1 -10 (2013); Zhongping et al., Human Gene Therapy, 23, 5, 521-532 (2012); patentes internacionales WO03/012052; WO2005/014782; WO2005/079533; WO2006/128739; WO2010/080129; y WO 2011/072082.

Una importante área de investigación dentro del campo de la tecnología ARNi es identificar el reactivo de transfección más biocompatible. El problema técnico es la necesidad inevitable de sistemas de vehículos como polímeros catiónicos, partículas de virus o modificaciones hidrófobas de nucleótidos para el suministro celular. Hasta la fecha, no existen informes de suministro celular de moléculas de ARNi bioactivas que no requieran un agente complejante u otros estímulos externos como agente de transfección.

Sumario

Un objetivo general es proporcionar una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena mejorada.

Un objetivo particular es proporcionar una molécula de ARNip de doble cadena que tiene un diseño que promueve la captación celular sin la necesidad de ningún agente de transfección.

Estos y otros objetivos quedan satisfechos con las realizaciones tal como se definen en el presente documento. La invención proporciona una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de 4 a 8 nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un no-ribonucleótido, donde dicha cadena no codificante tiene un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de dicha cadena codificante y donde una porción de doble cadena de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una longitud de al menos 19 pares de base.

La divulgación proporciona una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena. La molécula de ARNip de doble cadena puede comprender una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de 4 a 8 nucleótidos. La cadena no codificante puede tener un saliente 3' que es más corto que el saliente 3' de la cadena codificante.

La molécula de ARNip de doble cadena puede ser administrada y captada por las células sin el uso de ningún otro agente o reactivo. Las moléculas de ARNip de doble cadena pueden ser recogidas por las células en ausencia de un agente de transfección, reactivo y/o vector. Las moléculas de ARNip de doble cadena pueden ser recogidas por células con o sin el uso de un vehículo. Las moléculas de ARNip de doble cadena pueden ser captadas por las células en ausencia de cualquier modificación hidrófoba de la molécula de ARNip de doble cadena.

La molécula de ácido ribonucleico pequeño (ARNip) de doble cadena puede comprender una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de 4 a 8 nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un no -ribonucleótido (p.ej., un desoxinucleótido) y donde la cadena no codificante tiene un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de la cadena codificante.

La molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena puede comprender una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de 4 a 8 nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un no ribonucleótido (p.ej., un desoxinucleótido) y donde dicha cadena no codificante tiene un saliente 3' de 2 nucleótidos.

La cadena codificante puede tener un saliente 3' de 4 a 8 nucleótidos, 4 a 7 nucleótidos, 4 a 6 nucleótidos, 4 a 5 nucleótidos, 5 a 8 nucleótidos, 5 a 7 nucleótidos, 5 a 6 nucleótidos, 6 a 8 nucleótidos, 6 a 7 nucleótidos o 7 a 8 nucleótidos. Preferentemente, la cadena codificante tiene un saliente 3' de 4, 5, 6, 7 u 8 nucleótidos. Los más preferentemente, la cadena codificante tiene un saliente 3' de 5 nucleótidos.

La cadena no codificante puede tener un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, 2 a 8 nucleótidos, 2 a 7 nucleótidos, 2 a 6 nucleótidos, 2 a 5 nucleótidos, 2 a 4 nucleótidos, 2 a 3 nucleótidos, 3 a 8 nucleótidos, 3 a 7 nucleótidos, 3 a 6 nucleótidos, 3 a 5 nucleótidos, 3 a 4 nucleótidos, 4 a 8 nucleótidos, 4 a 7 nucleótidos, 4 a 6 nucleótidos, 4 a 5 nucleótidos, 5 a 8 nucleótidos, 6 a 8 nucleótidos, 6 a 7 nucleótidos o 7 a 8 nucleótidos. Preferentemente, la cadena no codificante tiene un saliente 3' de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleótidos. Más preferentemente, la cadena no codificante tiene un saliente 3' de 2 nucleótidos.

La cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena puede no tener un saliente 3' y tener en cambio un extremo romo.

Las personas expertas en la materia apreciarán que los salientes 3' de las cadenas codificantes y no codificante pueden ser cualquier combinación de las longitudes de saliente descritas. En la Tabla 1 a continuación, se proporcionan ejemplos de combinaciones preferentes:

Tabla 1

El saliente 3' de la cadena codificante y/o el saliente 3' de la cadena no codificante pueden comprender uno o más nucleótidos que no son ribonucleótidos (es decir, no ribonucleótidos). El saliente 3' de cadena codificante puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 no ribonucleótidos. Preferentemente, todos los nucleótidos en el saliente 3' de la cadena codificante son no ribonucleótidos. El saliente 3' de la cadena no codificante puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 no ribonucleótidos. Preferentemente, todos los nucleótidos del saliente 3' de la cadena no codificante son no ribonucleótidos.

El uno o más no ribonucleótidos en el saliente 3' de la cadena codificante y/o el saliente 3' de la cadena no codificante pueden incluir uno o más desoxinucleótidos. El uno o más desoxinucleótidos pueden ser cualquier desoxinucleótido o combinación de al menos dos desoxinucleótidos, como desoxitimidina (dT), desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG) o desoxicitosina (dC).

Todos los nucleótidos del saliente 3' de la cadena codificante y/o no codificante pueden ser desoxinucleótidos. Por ejemplo, todos los desoxinucleótidos podrían ser dT, todos podrían ser dA, todos podrían ser dG o todos podrían ser dC. Alternativamente, todos los desoxinucleótidos podrían ser desoxinucleótidos de purina, es decir, dG y/o dA o todos podrían ser desoxinucleótidos de pirimidina, es decir, dT y/o dC. Alternativamente, se podría utilizar una mezcla de desoxinucleótidos de purina y pirimidina, como una mezcla de dA, dG, dT y/o dC.

Entre los ejemplos de salientes 3' para la cadena codificante se incluyen: dT4, dA4, dG4, dC4, dTs, dAs, dGs, dC5, dT6, dA6, dG6, dC6, dT7, dA7, dG7, dC7, dTa, dAs, dGa y dCs; preferentemente dT5, dA5, dG5, dC5, dT6, dA6, dG6, dC6, dT7, dA7, dG7, dC7, dTs, dAs, dGs y dCs; preferentemente dT5, dA5, dG5, dC5, dT6, dA6, dG6, dC6, dT7, dA7, dG7y dC7 ; preferentemente dT5, dA5, dG5, dC5, dT6, dA6, dG6y dC6; o preferentemente dT5, dA5, dG5y dC5. Alternativamente, se puede incluir una combinación de diferentes desoxinucleótidos en el saliente 3' de la cadena codificante.

Entre los ejemplos de los salientes 3' para la cadena no codificante se incluyen: dT2, dA2, dG2, dC2, dT3, dA3, dG3, dC3, dT4, dA4, dG4, dC4, dT5, dA5, dGsy dCs; preferentemente dT2, dA2, dG2, dC2, dT5, dA5, dGsy dCs; o preferentemente dT2, dA2, dG2, dC2. Alternativamente, se puede incluir una combinación de diferentes desoxinucleótidos en el saliente 3' de la cadena no codificante.

Las personas expertas en la materia apreciarán que los salientes en 3' de las cadenas codificante y no codificante pueden ser cualquier combinación de los salientes que se han descrito. En la Tabla 2, a continuación, se proporcionan ejemplos de combinaciones preferentes:

Tabla 2

Alternativamente, el uno o más no ribonucleótidos en el saliente 3' de la cadena codificante y/o no codificante pueden incluir uno o más nucleótidos modificados, por ejemplo, uno o más didesoxinucleótidos o uno o más nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden tener modificaciones en el azúcar ribosa, la cadena principal de fosfato y/o la nucleobase. Entre los ejemplos no exhaustivos de modificaciones de ribosa se incluyen análogos de modificaciones donde 2'-OH se reemplaza por h, SH, SR, R, OR, CI, Br, I, F, CN, NH2, NHR, NR2, guanidina, donde R es un grupo arilo opcionalmente sustituido, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o grupo alquinilo C2-C6. Otros análogos de nucleótidos y modificaciones de nucleótidos que pueden utilizarse de acuerdo con las realizaciones se divulgan en el párrafo [0017] de la patente europea EP 1407044. La molécula de ARNip de doble cadena puede comprender o no un nucleótido modificado con ortoéster.

Uno o más de los nucleótidos del saliente 3' de la cadena codificante y/o no codificante pueden ser ribonucleótido. El(los) ribonucleótido(s) puede(n) ser riboadenosina (rA), riboguanosina (rG), ribouracilo (rU) y/o ribocitosina (rC).

Los nucleótidos de la molécula de ARNip de doble cadena pueden o no modificarse con grupos hidrófobos (p. ej., colesterol). La molécula de ARNip de doble cadena puede o no estar conjugada con otra u otras moléculas.

La molécula de ARNip de doble cadena puede tener una porción de doble cadena con una longitud de al menos 19 pares de bases. La región de doble cadena puede ser de 19 a 30 pares de bases, de 19 a 27 pares de bases, de 19 a 24 pares de bases o de 19 a 21 pares de bases. Por ejemplo, la región de doble cadena puede ser 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 pares de bases.

Si la molécula de ARNip de doble cadena tiene una porción de doble cadena de 19 pares de bases, la cadena codificante tiene preferentemente una longitud total de 23 a 27 nucleótidos. La cadena no codificante puede tener entonces una longitud total de 19 nucleótidos si tiene un extremo romo o, preferentemente, de 21 a 24 nucleótidos, como 21 nucleótidos, con un saliente de 3' de dos a cinco, como por ejemplo de dos nucleótidos. Preferentemente, la porción de doble cadena es de 19 pares de bases, la cadena codificante es de 24 pares de bases y la cadena no codificante es de 21 pares de bases.

La porción de doble cadena de la molécula de ARNip puede comprender o no uno o más desapareamientos entre un nucleótido en la cadena codificante y el nucleótido opuesto en la cadena no codificante.

La invención proporciona además un método de transfección celular que comprende el contacto (in vitro) de una célula que se va a transfectar con una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena de la invención.

La etapa de contacto puede comprender el contacto de la célula que se va a transfectar con la molécula de ARNip de doble cadena en ausencia de un agente de transfección. La etapa de contacto puede comprender poner en contacto la célula que se va a transfectar con la molécula de ARNip de doble cadena en ausencia de un reactivo de transfección. La etapa de contacto puede comprender poner en contacto la célula que se va a transfectar con la molécula de ARNip de doble cadena en ausencia de un reactivo que facilita la entrada de ARNip en una célula y/o la liberación del ARNip desde el endosoma en el citosol. La etapa de contacto puede comprender poner en contacto la célula que se va a transfectar con la molécula de ARNip de doble cadena en ausencia de un agente catiónico. La etapa de contacto puede comprender poner en contacto la célula que se va a transfectar por la molécula de ARNip de doble cadena en ausencia de un péptido de penetración en células catiónicas (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La invención proporciona un método de interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula que comprende el contacto in vitro de dicha célula con un ARN pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena en ausencia de un agente catiónico, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde al menos una porción de dicha cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ARN diana.

La invención proporciona además un método de interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula que comprende el contacto in vitro de la célula con una molécula de ARNip de doble cadena de la invención, donde al menos una porción de una cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de cadena doble tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ARN diana.

La etapa de contacto puede comprender el contacto de la célula que se va a transfectar con la molécula de ARNip de doble cadena en presencia o ausencia de un vehículo, p.ej., un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege a la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

El vehículo puede ser un vehículo viral o un vehículo no viral. Entre los vehículos virales se incluyen un vector lentiviral o un vector adenoviral para el suministro de una construcción basada en ADN que codifica la molécula de ARNip de doble cadena. Los vehículos (o vectores) de ARNip no virales incluyen la formación de complejos de la molécula de ARNip de doble cadena con un agente catiónico, como pueda ser un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) y poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina). Preferentemente, el vehículo no es un agente catiónico. Preferentemente, el vehículo no es un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) y poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

El vehículo puede ser una molécula pequeña (p.ej., colesterol, ácido biliar y/o lípido), polímero, proteína (p.ej., un anticuerpo) y/o aptámero (p.ej., ARN) que está conjugado con la molécula de ARNip de doble cadena. El vehículo puede ser una formulación en nanopartículas utilizada para encapsular la molécula de ARNip de doble cadena. El vehículo puede ser una modificación de la molécula de ARNip de doble cadena con un ligando dirigido (p.ej., un anticuerpo), un péptido, una molécula pequeña (p.ej., ácido fólico y/o biotina) o un polímero presente en la matriz extracelular (p.ej., ácido hialurónico y/o sulfato de condroitina) o una modificación hidrófoba de la molécula de ARNip de doble cadena (p.ej., utilizando colesterol y/o a-tocoferol). Preferentemente, el vehículo no es una modificación hidrófoba de la molécula de ARNip de doble cadena (p.ej., utilizando colesterol y/o a-tocoferol).

La secuencia de la cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena se selecciona, en la porción de doble cadena o al menos una porción de la misma, para que sea complementaria y capaz de hibridarse con una secuencia de ARN o ADN diana, preferentemente una secuencia de ARNm diana. La secuencia de la cadena codificante se selecciona para que sea complementaria de la cadena no codificante y forme pares de bases entre los nucleótidos en las correspondientes cadenas en la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

La secuencia de la molécula de ARNip de doble cadena tiene preferentemente una identidad suficiente para una secuencia de nucleótidos diana para mediar ARNi específico de diana. Preferentemente, la secuencia de la porción de doble cadena tiene una identidad con la secuencia de nucleótidos diana deseada de al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % y lo más preferentemente 100 %. Preferentemente, la secuencia de la porción de doble cadena tiene identidad con la secuencia de nucleótidos diana deseada en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos (contiguos).

La invención proporciona además una molécula de ARNip de doble cadena de la invención para su uso como un medicamento.

La invención proporciona una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena para su uso en el tratamiento de una enfermedad a través de la disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde3 dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos, donde al menos una porción de una cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de dicha secuencia de ARN diana y donde dicha molécula de ARNip de doble cadena se administra a un paciente en ausencia de un agente catiónico.

La invención proporciona además una molécula de ARNip de doble cadena de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediante la disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana, donde al menos una porción de una cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de dicha secuencia de ARN diana. La secuencia de la cadena no codificante se selecciona, en la porción de doble cadena o al menos una porción de la misma, para ser complementaria y capaz de hibridarse con una secuencia de ARN o ADN diana, preferentemente una secuencia de ARNm diana. La secuencia de la cadena codificante se selecciona para que sea complementaria de la cadena no codificante y forme pares de bases entre los nucleótidos de las cadenas correspondientes en la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

La secuencia de la molécula de ARNip de doble cadena tiene preferentemente una identidad suficiente con una secuencia de nucleótidos diana para mediar ARNi específico de diana. Preferentemente, la secuencia de la porción de doble cadena tiene una identidad con la secuencia de nucleótidos diana deseada de al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % y lo más preferentemente el 100 %. Preferentemente, la secuencia de la porción de doble cadena tiene identidad con la secuencia de nucleótidos diana deseada en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos (contiguos).

La molécula de ARNip de doble cadena se puede usar para tratar una o más de las enfermedades y/o trastornos seleccionados de trastornos genéticos, cáncer (p.ej., mediante el silenciamiento génico regulado al alza diferencialmente en células tumorales y/o genes que participan en la división celular), VIH, otras infecciones virales (p.ej., infección causada por hepatitis A, hepatitis B, virus del herpes simple tipo 2, gripe, sarampión y/o virus sincitial respiratorio), enfermedades neurodegenerativas (p.ej., enfermedad de Parkinson y/o enfermedades de poliglutamina como la enfermedad de Huntington), enfermedades oculares (p.ej., degeneración macular) e insuficiencia hepática. Las terapias posibles antivirales en las que se utiliza la molécula de ARNip de doble cadena incluyen una o más de las siguientes: tratamiento microbicida tópico para tratar infección por el virus herpes simple tipo 2, inhibición de la expresión de genes virales en células cancerosas, disminución de receptores hospedadores y/o co-receptores para el VIH, el silenciamiento génico de hepatitis A y/o hepatitis B, el silenciamiento de la expresión del gen de la gripe e inhibición de la replicación viral del sarampión. Los posibles tratamientos para las enfermedades neurodegenerativas incluyen el tratamiento de enfermedades con poliglutamina, como la enfermedad de Huntington.

Un paciente tratado con la molécula de ARNip de doble cadena puede recibir la molécula de ARNip de doble cadena en combinación con otras formas de tratamiento para el trastorno en cuestión, incluido el tratamiento con fármacos generalmente utilizados para el tratamiento del trastorno. Los fármacos pueden administrarse en una o varias unidades de dosificación.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARNip de doble cadena de la invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable. El diluyente farmacéuticamente aceptable puede ser solución salina, una solución tamponada (p.ej., una solución acuosa tamponada) u otro excipiente.

La divulgación proporciona además una célula transfectada con una molécula de ARNip de doble cadena de la invención o una secuencia de nucleótidos que codifica dicha molécula de ARNip de doble cadena.

La invención proporciona además una composición de transfección celular que comprende una molécula de ARNip de doble cadena, donde la molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde la composición no comprende un agente catiónico. La composición puede no comprender un agente para facilitar la liberación de dicho ARNip desde el endosoma al citosol de una célula. La composición puede no comprender un agente para facilitar la entrada del ARNip en una célula. La composición puede no comprender un reactivo de transfección. La composición puede no comprender un agente catiónico. La composición puede no comprender un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La composición de transfección celular puede o no comprender un vehículo, p.ej., un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

El vehículo puede ser un vehículo viral o un vehículo no viral. Entre los vehículos virales se incluyen un vector lentiviral o un vector adenoviral para suministrar una construcción basada en ADN que codifica la molécula de ARNip de doble cadena. Los vehículos (o vectores) de ARNip no virales incluyen la formación de complejos de la molécula de ARNip de doble cadena con un agente catiónico, como pueda ser un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) y poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina). Preferentemente, el vehículo no es un agente catiónico. Preferentemente, el vehículo no es un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) y poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

El vehículo puede ser una molécula pequeña (p.ej., colesterol, ácido biliar y/o lípido), polímero, proteína (p. ej., un anticuerpo) y/o aptámero (p.ej., ARN) que está conjugado con la molécula de ARNip de doble cadena. El vehículo puede ser una formulación en nanopartículas utilizada para encapsular la molécula de ARNip de doble cadena. El vehículo puede ser una modificación de la molécula de ARNip de doble cadena con un ligando dirigido (p.ej., un anticuerpo), un péptido, una molécula pequeña (p.ej., ácido fólico y/o biotina) o un polímero presente en la matriz extracelular (p.ej., ácido hialurónico) y/o sulfato de condroitina) o una modificación hidrófoba de la molécula de ARNip de doble cadena (p.ej., utilizando colesterol y/o a-tocoferol). Preferentemente, el vehículo no es una modificación hidrófoba de la molécula de ARNip de doble cadena (p.ej., utilizando colesterol y/o a-tocoferol).

La cadena no codificante del ARNip de doble cadena puede tener un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de la cadena codificante. La molécula de ARNip de doble cadena puede ser cualquier molécula de ARNip de doble cadena de la invención.

La divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARNip de doble cadena y un diluyente farmacéuticamente aceptable, donde la molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de nucleótidos. La composición farmacéutica puede no comprender un agente para facilitar la liberación del ARNip del endosoma en el citosol de una célula. La composición farmacéutica puede no comprender un agente para facilitar la entrada del ARNip en una célula. La composición farmacéutica puede no comprender un agente catiónico. La composición farmacéutica puede no comprender un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La composición farmacéutica puede comprender o no un vehículo, p.ej., un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege a la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

El diluyente farmacéuticamente aceptable puede ser solución salina, una solución tamponada (p.ej., una solución acuosa tamponada) u otro excipiente.

La cadena no codificante del ARNip de doble cadena puede tener un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de dicha cadena codificante. La molécula de ARNip de doble cadena puede ser cualquier molécula de ARNip de doble cadena de la invención.

La divulgación proporciona además un método de transfección celular que comprende el contacto (in vitro) de una célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena, donde la molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde la molécula de ARNip de doble cadena se transfecta en el citosol de dicha célula. La etapa de contacto (in vitro) de la célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un agente para facilitar la liberación del ARNip del endosoma en el citosol de dicha célula. La etapa de contacto (in vitro) de la célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un agente para facilitar la entrada de la molécula de ARNip en la célula. La etapa de contacto (in vitro) de la célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un agente catiónico. La etapa de contacto (in vitro) de la célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La célula puede ponerse en contacto con la molécula de ARNip de doble cadena en presencia o ausencia de un vehículo, p.ej., un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

La divulgación proporciona además una célula que se puede obtener a través de los métodos de la invención. Por lo tanto, la célula puede comprender una molécula de ARNip de doble cadena, tal como se describe en el presente documento.

La divulgación proporciona además un método de interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula que comprende el contacto (in vitro) de dicha célula con una molécula de ARNip de doble cadena, donde la molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde al menos al menos una porción de la cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ARN diana.

La etapa de contacto (in vitro) de la célula con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un agente para facilitar la liberación de dicho ARNip desde el endosoma al citosol de dicha célula. La etapa de contacto (in vitro) de la célula con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un agente para facilitar la entrada de la molécula de ARNip de doble cadena en la célula. La etapa de contacto (in vitro) de la célula con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un agente catiónico. La etapa de contacto (in vitro) de la célula con una molécula de ARNip de doble cadena se puede realizar en ausencia de un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La secuencia de la cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena se selecciona, en la porción de doble cadena o al menos una porción de la misma, para que sea complementaria y capaz de hibridarse con una secuencia de ARN o ADN diana, preferentemente una secuencia de ARNm diana. La secuencia de la cadena codificante se selecciona para que sea complementaria de la cadena no codificante y forme pares de bases entre los nucleótidos de las cadenas correspondientes de la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

La célula puede ponerse en contacto con la molécula de ARNip de doble cadena en presencia o ausencia de un vehículo, p.ej., un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege a la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

La cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena puede tener un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de dicha cadena codificante. La molécula de ARNip de doble cadena puede ser cualquier molécula de ARNip de doble cadena de la invención.

La divulgación proporciona además el uso de una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena para la interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula (in vitro), donde la molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde el saliente 3' facilita la liberación del ARNip desde el endosoma hacia el citosol de dicha célula.

El uso de una molécula de ARNip de doble cadena para la interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula (in vitro) puede ser en ausencia de un agente para facilitar la liberación de dicho ARNip desde el endosoma al citosol de dicha célula. El uso de una molécula de ARNip de doble cadena para la interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula (in vitro) puede ser en ausencia de un agente para facilitar la entrada del ARNip en la célula. El uso de una molécula de ARNip de doble cadena para la interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula (in vitro) puede ser en ausencia de un agente catiónico. El uso de una molécula de ARNip de doble cadena para la interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula (in vitro) puede ser en ausencia de un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p. ej., ejemplo polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

Con el fin de mediar la interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula, al menos una porción de la cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ARN diana.

La secuencia de la cadena no codificante se selecciona, en la porción de doble cadena o al menos una porción de la misma, para ser complementaria y capaz de hibridarse con una secuencia de ARN o ADN diana, preferentemente una secuencia de ARNm diana. La secuencia de la cadena codificante se selecciona para que sea complementaria de la cadena no codificante y forme pares de bases entre los nucleótidos de las cadenas correspondientes de la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

La molécula de ARNip de doble cadena se puede utilizar con o sin un vehículo, p.ej., un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege a la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

El vehículo puede ser un vehículo viral o un vehículo no viral. Entre los vehículos virales se incluyen un vector lentiviral o un vector adenoviral para el suministro de una construcción basada en ADN que codifica la molécula de ARNip de doble cadena. Los vehículos (o vectores) de ARNip no virales incluyen la formación de complejos de la molécula de ARNip de doble cadena con un agente catiónico como pueda ser un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) y poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina). Preferentemente, el vehículo no es un agente catiónico. Preferentemente, el vehículo no es un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) y poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La divulgación proporciona además una molécula de ARNip de doble cadena para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediante la disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana, donde la molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos, donde al menos una porción de la cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ARN diana.

La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un agente para facilitar la liberación de dicho ARNip desde el endosoma al citosol de una célula del paciente. La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un agente para facilitar la entrada del ARNip en una célula del paciente. La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un agente catiónico. La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La secuencia de la cadena no codificante se selecciona, en la porción de doble cadena o al menos una porción de la misma, para que sea complementaria y capaz de hibridarse con una secuencia de ARN o ADN diana, preferentemente una secuencia de ARNm diana. La secuencia de la cadena codificante se selecciona para que sea complementaria de la cadena no codificante y forme pares de bases entre los nucleótidos de las cadenas correspondientes de la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar con o sin un vehículo, p.ej., un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege a la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

La cadena no codificante del ARNip de doble cadena puede tener un saliente 3' que es más corto que el saliente 3' de dicha cadena codificante. La molécula de ARNip de doble cadena puede ser cualquier molécula de ARNip de doble cadena de la invención.

La molécula de ARNip de doble cadena se puede usar para tratar una o más de las enfermedades y/o trastornos seleccionados entre trastornos genéticos, cáncer (p.ej., por silenciamiento génico regulado al alza diferencialmente en células tumorales y/o genes que participan en la división celular), VIH, otras infecciones virales (p.ej., infección causada por hepatitis A, hepatitis B, virus del herpes simple tipo 2, influenza, sarampión y/o virus sincitial respiratorio), enfermedades neurodegenerativas (p.ej., enfermedad de Parkinson y/o enfermedades de poliglutamina como la enfermedad de Huntington), enfermedades oculares (p.ej., degeneración macular) e insuficiencia hepática. Las terapias posibles antivirales que utilizan la molécula de ARNip de doble cadena incluyen uno o más de los siguientes: tratamiento microbicida tópi

expresión de genes virales en células cancerosas, disminución de receptores del huésped y/o co-receptores para el VIH, el silenciamiento de los genes de la hepatitis A y/o la hepatitis B, el silenciamiento de la expresión del gen de la gripe e inhibición de la replicación viral del sarampión. Los posibles tratamientos para las enfermedades neurodegenerativas incluyen el tratamiento de enfermedades con poliglutamina, como la enfermedad de Huntington. Un paciente tratado con la molécula de ARNip de doble cadena puede recibir la molécula de ARNip de doble cadena en combinación con otras formas de tratamiento para el trastorno en cuestión, incluido el tratamiento con fármacos generalmente utilizados para el tratamiento del trastorno. Los medicamentos pueden administrarse en una o varias unidades de dosificación.

La divulgación proporciona además un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad que comprende la administración de una molécula de ARNip de doble cadena al paciente, donde la molécula de ARNip de doble cadena proporciona una desactivación específica de secuencia de una secuencia de ARN diana en el paciente, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde al menos una porción de una cadena sin codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de dicha secuencia de ARN diana.

La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un agente para facilitar la liberación del ARNip del endosoma al citosol de una célula de dicho paciente. La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un agente para facilitar la entrada del ARNip en una célula del paciente. La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un agente catiónico. La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente en ausencia de un péptido catiónico penetrante en células (CPP); un dendrímero o polímero catiónico, p.ej., polietilenimina (PEI) o poli-D,L-lactida-co-glicolida (PLGA); y/o un lípido catiónico (p.ej., lipofectamina).

La secuencia de la cadena no codificante se selecciona, en la porción de doble cadena o al menos una porción de la misma, para ser complementaria y capaz de hibridarse con una secuencia de ARN o ADN diana, preferentemente una secuencia de ARNm diana. La secuencia de la cadena codificante se selecciona para ser complementaria de la cadena no codificante y formar pares de bases entre los nucleótidos de las cadenas correspondientes de la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

La secuencia de la molécula de ARNip de doble cadena tiene preferentemente una identidad suficiente con una secuencia de nucleótidos diana para mediar ARNi específico de diana. Preferentemente, la secuencia de la porción de doble cadena tiene una identidad con la secuencia de nucleótidos diana deseada de al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % y lo más preferentemente el 100 %. Preferentemente, la secuencia de la porción de doble cadena tiene identidad con la secuencia de nucleótidos diana deseada en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos (contiguos).

La molécula de ARNip de doble cadena se puede administrar al paciente con o sin un vehículo, por ejemplo, un agente o una formulación. Preferentemente, el vehículo promueve la acumulación de la molécula de ARNip de doble cadena en un sitio diana y/o protege a la molécula de ARNip de doble cadena de interacciones no deseadas con componentes del medio biológico y/o protege la molécula de ARNip de doble cadena del metabolismo y/o la degradación.

El vehículo puede ser una molécula pequeña (p.ej., colesterol, ácido biliar y/o lípido), polímero, proteína (p.ej., un anticuerpo) y/o aptámero (p.ej., ARN) que está conjugado con la molécula de ARNip de doble cadena. El vehículo puede ser una formulación en nanopartículas utilizada para encapsular la molécula de ARNip de doble cadena.

El vehículo puede ser una modificación de la molécula de ARNip de doble cadena con un ligando dirigido (p.ej., un anticuerpo), un péptido, una molécula pequeña (p.ej., ácido fólico y/o biotina) o un polímero presente en la matriz extracelular (p.ej., ácido hialurónico y/o sulfato de condroitina) o una modificación hidrófoba de la molécula de ARNip de doble cadena (p.ej., utilizando colesterol y/o a-tocoferol). Preferentemente, el vehículo no es una modificación hidrófoba de la molécula de ARNip de doble cadena (p.ej., utilizando colesterol y/o a-tocoferol).

La cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena puede tener un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de dicha cadena codificante. La molécula de ARNip de doble cadena puede ser cualquier molécula de ARNip de doble cadena de la invención. La molécula de ARNip de doble cadena se puede usar para tratar una o más de las enfermedades y/o trastornos seleccionados entre trastornos genéticos, cáncer (p.ej., por silenciamiento de genes regulados al laza diferencialmente en células tumorales y/o genes que participan en la división celular), VIH, otras infecciones virales (p.ej., infección por hepatitis A, hepatitis B, virus del herpes simple tipo 2, gripe, sarampión y/o virus sincitial respiratorio), enfermedades neurodegenerativas (p.ej., enfermedad de Parkinson y/o poliglutamina, como la enfermedad de Huntington), enfermedades oculares (por ejemplo, degeneración macular) e insuficiencia hepática.

Las posibles terapias antivirales en las que se utiliza la molécula de ARNip de doble cadena incluyen uno o más de las siguientes: tratamiento microbicida tópi

expresión de genes virales en células cancerosas, disminución de receptores hospedadores y/o co-receptores para el VIH, silenciamiento de los genes de hepatitis A y/o hepatitis B, silenciamiento de la expresión del gen de la gripe e inhibición de la replicación viral del sarampión. Los posibles tratamientos para las enfermedades neurodegenerativas incluyen el tratamiento de enfermedades con poliglutamina, como la enfermedad de Huntington.

Un paciente tratado con la molécula de ARNip de doble cadena puede recibir la molécula de ARNip de doble cadena en combinación con otras formas de tratamiento para el trastorno en cuestión, incluyendo el tratamiento con fármacos generalmente utilizados para el tratamiento del trastorno. Los medicamentos pueden administrarse en una o varias unidades de dosificación.

La divulgación proporciona además una molécula de ARNip de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante. La cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un desoxinucleótido.

La divulgación proporciona además un método de transfección celular que comprende el contacto una célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con lo anterior.

La divulgación proporciona además un método de interferencia de ARN específico de diana en una célula. El método comprende el contacto de la célula con una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con lo anterior. Al menos una porción de una cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ARN diana.

La invención proporciona además una molécula de ARNip de doble cadena de la invención para su uso como un medicamento y una molécula de ARNip de doble cadena de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad por disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana. Al menos una porción de una cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ARN diana.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARNip de doble cadena de la invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

La divulgación proporciona además una célula transfectada con una molécula de ARNip de doble cadena de la invención. La divulgación proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de ARNip de doble cadena.

La divulgación proporciona además un método de transfección celular que comprende el contacto, en ausencia de cualquier agente de transfección, una célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante. La cadena codificante tiene un saliente 3' de al menos cuatro nucleótidos.

Las moléculas de ARNip de doble cadena de las realizaciones tienen características mejoradas por lo que se refiere a la captación celular, escape endosómico y aumento de la actividad de disminución de genes.

Las moléculas de ARNip de doble cadena de la invención median la disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana. El % de reducción de la secuencia de ARN diana puede ser al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %, en comparación con el nivel normal de expresión de la secuencia de ARN diana. El % de disminución de la secuencia de ARN diana con una molécula de ARNip de doble cadena de la invención puede ser al menos 1,5 veces, al menos 1,75 veces, al menos 2 veces, al menos 2,25 veces, al menos 2,5 veces, a al menos 2,75 veces, al menos 3 veces, al menos 3,25 veces, al menos 3,5 veces, al menos 3,75 veces o al menos 4 veces el nivel de disminución alcanzado por un ARNip canónico, es decir, una molécula de ARNip que tiene una región de doble cadena idéntica a la región de doble cadena del ARNip de la invención con un saliente 3' de cadena codificante de 2 nucleótidos y un saliente 3' de cadena no codificante de 2 nucleótidos (p.ej. un saliente 3' de cadena codificante de dT2 y un saliente 3' de cadena no codificante de dT2). El % de disminución de un ARN diana puede determinarse por PCR en tiempo real (RT-PCR).

La divulgación proporciona además un kit que comprende una molécula de ARNip de doble cadena o una composición de la invención. El kit puede ser adecuado o destinado a realizar un método de la invención. El kit puede comprender además uno o más agentes o reactivos adicionales para realizar una o más de las etapas de los métodos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones, junto con otros objetos y ventajas de las mismas, pueden entenderse mejor haciendo referencia a la siguiente descripción tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:

Las Figs. 1A-1C ilustran varias realizaciones de moléculas de ARNip de doble cadena.

La Fig. 2A es un diagrama que muestra la disminución del gen GAPDH en células MG63 transfectadas con ARNcp que tienen diferentes longitudes de salientes 3', concretamente, dT2, dTs, dTa, as (dTs), bl (dTs) y (dTs)2, con o sin CQ o MATra-si (M). Se analizó el porcentaje de disminución de GAPDH por RT-PCR ( P <0,005). La Fig. 2B es un diagrama que muestra la disminución del gen GAPDH en células MG63 con diferentes secuencias de ARNcp con o sin CQ.

La Fig. 3A es un diagrama que muestra experimentos de transfección sin vehículo utilizando ARNip dT2 y ARNcp (dTsy dAs) en MG63, HOB, HCT116, queratinocitos humanos primarios y células primarias de fibroblastos humanos. Se determinó porcentaje de disminución de GAPDH mediante experimentos de RT-PCR (*** P <0,0001).

La Fig. 3B ilustra un gráfico del curso del tiempo que muestra la cinética de captación de Cy3-ARNcp (50 nM) según se determina a partir de la citometría de flujo utilizando células MG63 en presencia o ausencia de ODN2006600 nM (pre-incubado durante 1 h).

La Fig. 3C ilustra el histograma de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) que presenta la captación de Cy3-ARNcp (50 nM) en células MG63, HOB, HCT116, HEK293 y MC3T3 tras 24 h de incubación. Las células de control sin tratar se muestran en gris.

La Fig. 4 es un diagrama que muestra que la captación celular de ARNcp es un proceso dependiente de la energía. Las células HCT116, HOB y Mg 63 se transfectaron con dTsy dAs a 4 °C o 37 °C. Las células también se transfectaron con ARNip de control negativo y las células que se dejaron sin tratar se tomaron como controles y se analizó el porcentaje de disminución de GAPDH mediante RT-PCR (*** P <0,0001).

La Fig. 5 ilustra la proliferación celular evaluada por el ensayo MTS, 24 h después de la transfección. Las células MG63 se transfectaron con secuencias de ARNip que tenían diferentes longitudes de saliente y ARNip de control negativo (NC) a 50 nM y 100 nM, respectivamente, con (wM) o sin MATra-si (woM). Los pocillos de control (C) se dejaron sin tratar y la viabilidad celular en las células de control se definió como 1.

La Fig. 6A-6C ilustra los efectos inmunoestimulantes del ARNcp. Se midió el nivel de expresión de mRNA de IFN-a (Fig. 6A), IFN-p (Fig. 6B) e IFN-y (Fig. 6C) por RT-PCR a las 24 h post-transfección con 50 o 100 nM de ARNip con diferentes longitudes de saliente y control negativo (NC), tal como se indica en las figuras. Los experimentos de transfección se realizaron en células MG63 con (wM) o sin MATra-si (woM). Los niveles de expresión se normalizaron a los de la p-actina. La expresión relativa de IFN se definió como 1 en las células de control (C).

La Fig. 7(A) muestra la disminución dependiente de la dosis de ARNip normal (dT2) y ARNip (dT5) (ARNcp). La concentración de ARNcp 50 nM mostró la mayor disminución del 80 %, que no aumentó con la concentración más alta; (B) Imágenes confocales de células MG63 tratadas con ARNip normal (dT2) que muestran una distribución localizada en endosoma; y (C) utilizando ARNcp (dT5) que muestra la localización perinuclear dentro del citosol.

Fig. 8 Silenciamiento génico duradero y eficaz inducido por ARNcp (dT5) en células MG63. Las células se transfectaron con ARNip desordenad (dT5) (C), ARNip canónico (dT2) con o sin MATra (M) y ARNcp (dT5) dirigidos a GAPDH y CTNNB1 a una concentración de 50 nM. Al cabo de 24, 48 y 72 h, se midió la expresión de ARNm de (A) GAp Dh y (B) CTNNB1 utilizando RT-PCR y se analizaron los niveles de proteína adicionalmente aplicando transferencia de Western; Se utilizó p-actina como control de carga.

La Fig. 9 ilustra los experimentos de disminución de GFP. Fig. 9A control de células MG63que expresan GFP. Fig. 9B células ^mG63 que expresan GFP tratadas con GFP-ARNip 50 nM. Fig. 9C células M^g63 que expresan GFP tratadas con 50 nM GFP-ARNcp.

La Fig. 10 ilustra la conjugación de ARNip modificado con aldehído con hialuronano modificado con hidrazida o el ensayo de electroforesis en gel de HA (A) que confirma el conjugado de hidrazida aldehído-HA siARN. La primera calle corresponde al ARNip normal dT2 (ARNip); la segunda calle corresponde a ARNip (dT5) (ARNcp) de GAPDH modificado con aldehído; la tercera calle muestra una conjugación eficiente de ARNip (dT5) GAPDH modificado con aldehído con HA por enlace de hidrazona (HA-ARNcp). (B) análisis de qPCR que muestra una disminución eficaz de genes tras la conjugación con HA. SiRNA Normal (dT2) con reactivo de transfección (lipofectamina) se muestra en la primera barra (ARNip-Lipo), seguido de ARNcp (dT5) y HA-ARNcp (dT5) conjugados a concentraciones de 50 y 100 nM.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere a moléculas de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena que poseen una secuencia pequeña de ADN/ARN (saliente) en el extremo 3' de la cadena codificante, también conocida como cadena pasajera. El ARNip de doble cadena de las presentes realizaciones despliega una captación celular sin vehículo única, escape endosómico y una mayor actividad de disminución contra el gen diana de interés. Como consecuencia, la molécula de ARNip de doble cadena también se denomina ARNip o ARNcp penetrante en célula en el presente documento.

La presente divulgación se refiere también a un método de producción de una molécula de ARNip de doble cadena con un saliente 3' en la cadena codificante, un método de transfección celular, un método de interferencia de ARN (ARNi) específico de diana y composiciones farmacéuticas con moléculas de ARNip de doble cadena de acuerdo con la presente divulgación.

Por lo tanto, la divulgación proporciona una molécula de ARNip de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante. La cadena codificante de la molécula de ARNip tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos. En una realización, al menos uno de estos cuatro a ocho nucleótidos es un desoxinucleótido.

Por lo tanto, la presente divulgación se basa en el sorprendente hallazgo de que tener un saliente 3' de longitud específica y que comprende preferentemente uno o más desoxinucleótidos en la cadena codificante o pasajera permite que la molécula de ARNip de doble cadena sea captada por las células sin necesidad de añadir ningún vehículo ni agente de transfección. La molécula de ARNip de doble cadena con el saliente 3' particular en la cadena codificante tiene además características mejoradas por lo que se refiere al escape endosómico y aumento de la actividad de disminución en comparación con las moléculas de ARNip de la técnica anterior.

El al menos un desoxinucleótido del saliente 3' podría ser cualquier desoxinucleótido o combinación de al menos dos desoxinucleótidos, como la desoxitimidina (dT), la desoxiadenosina (dA), la desoxiguanosina (dG) o la desoxicitosina (dC).

En una realización en particular, los cuatro a ocho nucleótidos del saliente 3' de la cadena codificante son preferentemente desoxinucleótidos. En dicho enfoque, todos los desoxinucleótidos podrían ser dT, todos podrían ser dA, todos podrían ser dG o todos podrían ser dC. Alternativamente, todos los desoxinucleótidos podrían ser desoxinucleótidos de purina, es decir, dG y/o dA o todos podrían ser desoxinucleótidos de pirimidina, es decir, dT y/o dC. En otro enfoque más, se podría utilizar una mezcla de purina y desoxinucleótidos de pirimidina, como por ejemplo una mezcla de dA, dG, dT y/o dC.

Entre los ejemplos no exhaustivos de salientes 3 para la cadena codificante se incluyen dT4, dA4, dG4, dC4, dTs, dAs, dGs, dCs, dT6, dA6, dG6, dC6, dT7, dA7, dG7, dC7, dT8, dA8, dG8y dC8, preferentemente dTs, dAs, dGs, dCs, dT6, dA6, dG6, dC6, dT7, dA7, dG7, dC7, dT8, dA8, dG8 y dC8, más preferentemente dTs, dAs, dGs, dCs, dT6, dA6, dG6, dC6, dT7, dA7, dG7 y dC7, como dTs, dAs, dG s, dCs, dTs, dA6, dG6 y dC6 o dTs, dAs, dGs y dCs. Aunque actualmente es preferente utilizar solo desoxinucleótidos en el saliente 3' de la cadena codificante, una porción de los cuatro a ocho nucleótidos podría ser ribonucleótidos y/o nucleótidos modificados. Los ribonucleótidos incluyen riboadenosina (rA), riboguanosina (rG), ribouracilo (rU) y ribocitosina (rC). Los nucleótidos modificados pueden tener modificaciones en el azúcar ribosa, la cadena principal de fosfato y/o la nucleobase. Entre los ejemplos no exhaustivos de modificaciones de ribosa se incluyen análogos de modificaciones donde el 2'-OH se reemplaza por h, SH, SR, R, OR, CI, Br, I, F, CN, NH2, NHR, NR2, guanidina, donde R es un grupo arilo opcionalmente sustituido, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o grupo alquinilo C2-C6. Otros análogos de nucleótidos y modificaciones de nucleótidos que pueden utilizarse de acuerdo con las realizaciones se divulgan en el párrafo [0017] de la patente europea EP 1407044.

En una realización en particular, la cadena codificante tiene un saliente 3' de cinco a ocho nucleótidos. Los datos experimentales tal como se presentan en el presente documento muestran que un saliente 3' de la cadena codificante con cinco u ocho nucleótidos tiene características mejoradas en comparación con los salientes 3' de la técnica anterior que generalmente incluyen menos nucleótidos, como, por ejemplo, dos nucleótidos. El saliente 3' consiste preferentemente en cinco u ocho desoxinucleótidos.

Una realización en particular implica una cadena codificante de la molécula de ARNip de doble cadena que tiene un saliente 3' de cinco nucleótidos. Entre los ejemplos no exhaustivos, pero sí preferentes, se incluyen un saliente 3' con cinco desoxinucleótidos, como, por ejemplo, seleccionados del grupo que consiste en dTs, dAs, dGs, dCs. Entre los diferentes salientes 3' con cinco desoxinucleótidos, dTs y dAs fueron los mejores candidatos, tal como se muestra en los ejemplos presentados.

En una realización, también la cadena no codificante o guía de la molécula de ARNip de doble cadena tiene un saliente 3'. En dicho caso, el saliente 3' de la cadena no codificante tiene preferentemente al menos dos nucleótidos. En una realización en particular, el saliente 3' de la cadena no codificante tiene preferentemente de dos a cinco nucleótidos. Una realización actualmente preferente es tener un saliente 3' de la cadena no codificante con dos nucleótidos.

En una realización, al menos un nucleótido del saliente 3' de la cadena no codificante es un desoxinucleótido. En una realización en particular, todos de los al menos dos, preferentemente dos a cinco y más preferentemente dos, nucleótidos en el saliente 3' de la cadena no codificante son desoxinucleótidos. En tal caso, el saliente 3' de la cadena no codificante podría seleccionarse por ejemplo de un grupo que consiste en dT2, dA2, dG2, dC2, dT3, dA3, dG3, dC3, dT4, dA4, dG4, dC4, dTs, dAs, dGs y dCs. En una realización en particular, el grupo consiste en dT2, dA2, dG2, dC2, dTs, dAs, dGs y dCs o preferentemente consiste en dT2, dA2, dG2, dc2. También es posible una combinación de diferentes dexonucleótidos dentro del saliente 3' de la cadena no codificante.

Aunque los desoxinucleótidos se incluyen preferentemente en el saliente 3' de la cadena no codificante, todos o al menos una porción de los nucleótidos podrían ser ribonucleótidos y/o nucleótidos modificados, tal como se ha explicado para la cadena codificante.

En otra realización, la cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena no tiene ningún saliente 3', sino que tiene un extremo romo.

La molécula de ARNip de doble cadena según las realizaciones tiene preferentemente una porción de doble cadena o bicatenaria con una longitud de al menos 19 pares de bases. Por ejemplo, la porción de doble cadena podría ser de 19 a 30 pares de bases, preferentemente de 19 a 24 pares de bases, como 19, 20, 21, 22, 23 o 24 pares de bases.

Si la molécula de ARNip de doble cadena tiene una porción de doble cadena de 19 pares de bases, la cadena codificante tiene preferentemente una longitud total de 23 a 27 nucleótidos. La cadena no codificante podría tener una longitud total de 19 nucleótidos si tiene un extremo romo o, preferentemente, de 21 a 24 nucleótidos, como, por ejemplo, 21 nucleótidos, con un saliente de 3' de dos a cinco, como, por ejemplo, dos nucleótidos.

Las Figs. 1A-1C ilustra diferentes realizaciones de la molécula de doble cadena 100, 200, 300. En la Fig. 1A, la molécula de doble cadena 100 tiene una cadena codificante 110 con un saliente 3' 115 de cuatro a ocho nucleótidos y una cadena no codificante 120con un saliente 3' 125 de dos nucleótidos. La Fig. 1B ilustra una molécula de ARNip de doble cadena 200 donde la cadena codificante 210 tiene el mismo saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos que la Fig. 1B, mientras que la cadena no codificante 220 tiene un saliente 3' de dos a cinco nucleótidos. La Fig. 1 C ilustra una realización de la molécula de ARNip de doble cadena300, en la que la cadena no codificante 320 tiene un extremo romo. La cadena codificante 320 tiene un saliente 3' 325 de cuatro a ocho nucleótidos de longitud.

En las Figs. 1A-1C, los números de referencia 130, 230, 330 se refieren a la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena 100, 200, 300.

Este diseño de la molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se puede aplicar a cualquier molécula de ARNip de doble cadena. Esto significa que la molécula de ARNip de doble cadena puede tener cualquier secuencia de nucleótidos en la porción de doble cadena. En general, la secuencia de la cadena no codificante se selecciona, en la porción de doble cadena o al menos una porción de la misma, para que sea complementaria y capaz de hibridarse con una secuencia de ARN o ADN diana, preferentemente una secuencia de ARNm diana. La secuencia de la cadena codificante se selecciona entonces para que sea complementaria de la cadena no codificante y forme pares de bases entre los nucleótidos de las cadenas correspondientes de la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

La secuencia de la molécula de ARNip de doble cadena tiene preferentemente una identidad suficiente con una secuencia de nucleótidos diana para mediar ARNi específico de diana. Preferentemente, la secuencia tiene una identidad de al menos el 50 %, en particular de al menos el 70 % de la secuencia de nucleótidos diana deseada en la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena. Más preferentemente, la identidad es al menos 85 %, como, por ejemplo, al menos 90 % o 95 % y lo más preferentemente 100 % en la porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena.

En otras realizaciones más, la cadena codificante de la molécula de ARNip de doble cadena puede contener marcadores en el extremo 5' para detección con fines analíticos, en particular, de diagnóstico. El “marcador" puede ser cualquier entidad química que permita la detección de la molécula de ARNip de doble cadena a través de medios físicos, químicos y/o biológicos. Entre los ejemplos de marcadores integrados en el extremo 5' de la cadena del codificante se incluyen cromóforos, fluoróforos o moléculas radiactivas.

La divulgación proporciona además un método para preparar una molécula de ARNip de doble cadena de las realizaciones. El método generalmente comprende la síntesis de una cadena codificante (ARN) que tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un desoxinucleótido y una cadena no codificante (ARN). La cadena codificante y la cadena no codificante son capaces de hibridarse en una porción de doble cadena de la molécula de ARNip de doble cadena. Preferentemente, el método comprende también peinar la cadena codificante y la cadena no codificante en condiciones que permitan la hibridación para formar la molécula de ARNip de doble cadena.

Los métodos para sintetizar cadenas de ARN son muy conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la química de la fosforamidita, la química del H-fosfonato y la extensión de la cadena enzimática. Las cadenas codificante y no codificante también pueden prepararse por transcripción enzimática a partir de plantillas de ADN.

La divulgación proporciona además un método de transfección celular. El método comprende el contacto de una célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con las realizaciones.

Las moléculas de ARNip de doble cadena de las realizaciones tienen propiedades mejoradas de penetración en la célula en comparación con las moléculas de ARNip de la técnica anterior. Por lo tanto, las moléculas de ARNip de doble cadena de la presente invención no necesitan en general ningún agente de transfección para transfectar la célula e introducir así la molécula de ARNip de doble cadena en la célula. Por lo tanto, la captación de las moléculas de ARNip de doble cadena de las realizaciones por las células puede tener lugar sin la necesidad de diversos agentes de transfección.

El agente de transfección, tal como se utiliza en el presente documento incluye varios vehículos tradicionalmente empleados dentro del área de ARNi cuando se intenta introducir moléculas de ARNip en células. Entre los ejemplos de dichos vehículos se incluyen vehículos liposomales; virus como vehículos, es decir, transducción viral; vehículos químicos, como el uso de fosfato de calcio para formar un precipitado con el ARNip que pueden ser absorbidos por la célula, vehículos orgánicos altamente ramificados, conocidos como dendrímeros y polímeros catiónicos, como DEAE-dextrano o polietilenimina (PEI); nanopartículas; etc.

El agente de transfección, tal como se utiliza en el presente documento, incluye además diversas moléculas dirigidas que podrían conjugarse o formar complejo con el ARNip y que podrían dirigirse a receptores específicos en la superficie celular. Entre los ejemplos de dichos vehículos se incluyen ácido fólico; biotina anticuerpo; biopolímeros, como el ácido hialurónico; péptidos; proteínas; etc.

El agente de transfección puede incluir además técnicas o métodos para introducir el ARNip en la célula, incluyendo inyección de dirección; electroporación; sonoporación; transfección óptica; fusión de protoplastos; impalefección; suministro hidrodinámico; magnetofección; bombardeo de partículas y nucleofección.

Por lo tanto, la transfección de células y la disminución de genes utilizando las moléculas de ARNip de doble cadena de las realizaciones no requieren el uso de ningún agente de transfección. Las moléculas de ARNip de doble cadena de acuerdo con las realizaciones de la presente invención pueden ser administradas y ser captadas por las propias células, en ausencia de cualquier vehículo de administración, vector, modificación hidrófoba, etc. de las moléculas de ARNip de doble cadena.

Por lo tanto, en una realización, el contacto de la célula comprende poner en contacto la célula que se va a transfectar con la molécula de ARNip de doble cadena en ausencia de un agente de transfección.

En una realización en particular, la célula o las células que se van a transfectar pueden estar alojadas in vitro en un medio de cultivo celular en una placa de Petri, un vaso de cultivo o un pocillo, etc. En tal caso, pueden añadirse simplemente las moléculas de ARNip de doble cadena al medio de cultivo celular o las células podrían añadirse a una solución, como pueda ser una solución salina, una solución tamponada o un medio de cultivo celular, que comprende las moléculas de ARNip de doble cadena.

Por lo tanto, en una realización, el contacto de la célula comprende poner en contacto in vitro la célula que se va a transfectar con la molécula de ARNip de doble cadena, preferentemente en ausencia de un agente de transfección. Puede administrarse la molécula de ARNip de doble cadena a un organismo en el que se desea la disminución de ARNi y gen. El organismo podría ser, por ejemplo, un animal, como por ejemplo un mamífero, incluyendo un ser humano, un hongo, un microorganismo o una planta.

La molécula de ARNip de doble cadena puede proporcionarse entonces, preferentemente, como una composición que comprende, además de la molécula de ARNip de doble cadena, un diluyente, como pueda ser una solución salina o una solución tamponada, como una solución acuosa tamponada.

La divulgación proporciona además un método de ARNi específico de diana en una célula. El método comprende el contacto de la célula con una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con las realizaciones. En tal caso, al menos una porción de una cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ARN diana.

Por lo tanto, la cadena no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada para permitir que la cadena no codificante se una e hibride con la secuencia de ARN diana. Como consecuencia de esta hibridación, la secuencia de ARN diana se unirá a un complejo RISC activado de una manera específica de secuencia, dando como resultado ARNi.

La secuencia de ARN diana es preferentemente una secuencia de ARNm diana para conseguir de ese modo la inhibición o reducción, como por ejemplo la disminución, de la expresión génica con respecto al gen que codifica el ARNm.

El método comprende preferentemente poner en contacto la célula con la molécula de ARNip de doble cadena en ausencia de un agente de transfección.

En un ejemplo, el contacto de la célula comprende poner en contacto la célula in vitro con la molécula de ARNip de doble cadena.

En otro ejemplo, el contacto de la célula comprende administrar la molécula de ARNip de doble cadena a un organismo para conseguir el ARNi específico de diana en el organismo.

La molécula de ARNip de doble cadena se administra preferentemente al organismo dentro de un diluyente y como una composición. La composición puede estar en forma de solución, por ejemplo, una solución inyectable, una crema, pomada, comprimido, suspensión o similares. La composición se puede administrar de cualquier manera adecuada, por ejemplo, por inyección, por aplicación oral, tópica, nasal, rectal, etc. El diluyente puede ser cualquier diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado.

La invención proporciona además una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento. La invención proporciona además una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, inhibición o prevención de una enfermedad a través de la disminución específica de secuencia (ARNi) de una secuencia de ARN diana. En tal caso, al menos una porción de un soporte no codificante de la molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ARN diana.

La enfermedad puede ser cualquier enfermedad, trastorno o afección médica que pueda tratarse, inhibirse o prevenirse mediante el ARNi y, más particularmente, evitando la expresión de un gen diana en el organismo. Por ejemplo, el gen diana puede ser un gen asociado a un patógeno, p.ej., un gen viral, un gen asociado a un tumor o un gen asociado a una enfermedad autoinmune. El gen diana también puede ser un gen heterólogo expresado en una célula recombinante o un organismo alterado genéticamente. Al inhibir la función de dicho gen, se pueden obtener beneficios terapéuticos en el campo agrícola o en el campo de la medicina o la medicina veterinaria.

Los trastornos en los cuales el tratamiento con la molécula de ARNip de doble cadena sería una opción incluyen por ejemplo trastornos genéticos, cáncer, VIH, otras infecciones virales, Parkinson, medicina regenerativa, enfermedades oculares.

Un paciente tratado con ARNip puede recibir la molécula de ARNip de doble cadena en combinación con otras formas de tratamiento del trastorno en cuestión, incluyendo el tratamiento con fármacos generalmente utilizados para el tratamiento del trastorno. Los medicamentos pueden administrarse en una o varias unidades de dosificación. Es posible explotar ARNi en terapia. Entre las primeras aplicaciones para llegar a ensayos clínicos se pueden citar en el tratamiento de la degeneración macular y el virus sincitial respiratorio. Se ha demostrado asimismo la eficacia de ARNi también para revertir la insuficiencia hepática inducida.

Entre las posibles terapias antivirales se incluyen tratamientos con microbicidas tópicos en los que se utiliza ARNi para tratar la infección de virus herpes simple tipo 2 y la inhibición de la expresión de genes virales en células cancerosas, la disminución de los receptores hospedadores y los receptores del VIH, el silenciamiento de los genes de hepatitis A y hepatitis B, el silenciamiento de la expresión génica de la gripe y la inhibición de la replicación viral del sarampión. También se han propuesto posibles tratamientos para las enfermedades neurodegenerativas, con particular atención en las enfermedades de poliglutamina, como la enfermedad de Huntington.

El ARNi también es una prometedora forma de tratar los cánceres a través del silenciamiento de los genes regulados al alza diferencialmente en células tumorales o genes que participan en la división celular.

La ruta de ARNi suele explotarse en biología experimental para estudiar la función de los genes en cultivos celulares e in vivo en organismos modelo. Las moléculas de ARNip de doble cadena se sintetizan con una secuencia complementaria para un gen de interés y se introducen en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético exógeno, y activa la ruta del ARNi. Mediante el uso de este mecanismo, los investigadores pueden causar una drástica disminución de la expresión de un gen dirigido. El estudio de los efectos de esta disminución puede demostrar el papel fisiológico del producto genético. Dado que es posible que el ARNi no elimine totalmente la expresión del gen, a veces se hace referencia a esta técnica como "disminución" (knockdown), para distinguirla de los procedimientos "desactivación" (knockout) en los que se elimina por completo la expresión de un gen.

En la mayoría de las aplicaciones genómicas funcionales de ARNi en animales se ha empleado C. elegans y Drosophila, ya que estos son los organismos modelo comunes en los que el ARNi es más efectivo.

Los enfoques para el diseño de bibliotecas de ARNi de todo el genoma pueden requerir más sofisticación que el diseño de un solo ARNip para un conjunto definido de condiciones experimentales. Frecuentemente, se utilizan redes neuronales artificiales para diseñar bibliotecas de ARNip y para predecir su eficacia probable en la disminución de genes. El rastreo genómico masivo se contempla de forma generalizada como un prometedor método para la anotación del genoma y ha desencadenado el desarrollo de métodos de rastreo de alto rendimiento basados en micromatrices.

La genómica funcional en la que se utiliza ARNi es una técnica particularmente atractiva para cartografía genómica y la anotación en plantas ya que muchas plantas son poliploides, lo cual presenta desafíos sustanciales para los métodos de ingeniería genética más tradicionales. Por ejemplo, se ha utilizado con éxito ARNi para estudios de genómica funcional en trigo del pan (que es hexaploide), así como en sistemas de modelos de plantas más comunes, Arabidopsis y maíz.

Se ha utilizado ARNi para aplicaciones en biotecnología y está a punto de comercializarse en otros.

Se ha utilizado ARNi para diseñar genéticamente plantas para producir niveles más bajos de toxinas vegetales naturales. Dichas técnicas aprovechan el fenotipo de ARNi estable y heredable en la reserva de plantas. Las semillas de algodón son ricas en proteínas dietéticas, pero contienen naturalmente el producto terpenoide tóxico gosipol, que las hace inadecuadas para el consumo humano. Se ha utilizado ARNi para producir reservas de algodón cuyas semillas contienen niveles reducidos de delta-cadineno sintasa, una enzima clave en la producción de gosipol, sin afectar la producción de enzimas en otras partes de la planta, donde el gosipol es importante en sí para prevenir el daño contra las plagas de las plantas. Se ha dedicado un esfuerzo similar en la reducción del producto natural cianogénico linamarina en plantas de mandioca.

Se está desarrollando ARNi como un insecticida, empleando varios enfoques, incluyendo ingeniería genética y aplicación tópica. Las células en el intestino medio de muchas larvas absorben las moléculas y ayudan a difundir la señal en todo el cuerpo del insecto.

Se han preparado cultivos transgénicos para expresar pequeños fragmentos de ARN, cuidadosamente seleccionados para silenciar genes cruciales en plagas diana. Existen ARN que afectan solo a los insectos que tienen secuencias genéticas específicas.

Alternativamente, se puede suministrar ARNbc sin ingeniería genética. Un enfoque es añadirlo al agua de riego. Las moléculas quedan absorbidas en el sistema vascular de las plantas y los insectos venenosos se alimentan de ellas. Otro enfoque implica rociar ARN como un pesticida convencional. Esto permitiría una adaptación más rápida a la resistencia.

La investigación de ARNi a escala genómica se basa en la tecnología de rastreo de alto rendimiento (HTS). La tecnología ARNi HTS permite rastrear la pérdida de función de todo el genoma y su uso está muy extendido para identificar genes asociados con fenotipos específicos. Esta tecnología ha sido aclamada como la segunda ola genómica, después de la primera ola genómica de la micromatriz de expresión génica y las plataformas de descubrimiento de polimorfismos de un solo nucleótido. Una de las principales ventajas del rastro de ARNi a escala genómica es su capacidad para interrogar simultáneamente a miles de genes. Con la capacidad de generar una gran cantidad de datos por experimento, el rastreo de ARNi a escala genómica ha llevado a una tasa de generación de datos de explosión.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable. Entre los ejemplos no exhaustivos de diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina, soluciones tamponadas, incluyendo soluciones acuosas tamponadas u otros excipientes.

La divulgación proporciona además una célula transfectada con una molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la invención. La divulgación proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de ARNip de doble cadena.

En el segundo caso, la secuencia de nucleótidos se puede proporcionar como un casete de expresión que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos para permitir la expresión de la cadena no codificante y la cadena codificante de la molécula de ARNip de doble cadena en la célula. El casete de expresión podría estar en forma de ADN desnudo o incluirse en un vector, como por ejemplo un plásmido.

La divulgación proporciona además un método de transfección celular que comprende el contacto, en ausencia de cualquier agente de transfección, de una célula que se va a transfectar con una molécula de ARNip de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante. En esta realización, la cadena codificante tiene un saliente 3' de al menos cuatro nucleótidos.

En una realización, el saliente 3' tiene al menos cinco nucleótidos, como por ejemplo al menos cinco ribonucleótidos, al menos cinco desoxinucleótidos o una combinación de ribo- y desoxinucleótidos.

En otra realización, el saliente 3' tiene al menos cinco nucleótidos, como por ejemplo al menos cinco ribonucleótidos, al menos cinco desoxinucleótidos o una combinación de ribo- y desoxinucleótidos donde los 2'-hidroxi de los ribonucleótidos se modifican/reemplazan con grupos hidrófobos (alquilo) ) e hidrófilos (amina, tiol) perfectamente conocidos en el campo.

En otra realización, se modifica la cadena principal de fosfato de los salientes 3' de ARNip con otras moléculas de cadena principal conocidas en el campo, como por ejemplo fósforotioatos.

La modificación/remplazamiento de grupos 2'-hidroxi y/o cadena principal de fosfato que se ha mencionado podría aplicarse a otras realizaciones divulgadas en el presente documento.

La divulgación puede definirse además en el siguiente conjunto de cláusulas numeradas:

1. Una molécula ácido ribonucleico pequeño de interferencia, ARNip, de doble cadena (100, 200, 300) que comprende una cadena de RNA codificante (110, 210, 310) y una cadena de RNA no codificante (120, 220, 320), donde dicha cadena codificante (110, 210, 310) tiene un saliente 3' (115, 215, 315) de cuatro a ocho nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un desoxinucleótido.

2. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 1, donde dichos cuatro a ocho nucleótidos en su totalidad de dicho saliente 3' son desoxinucleótidos.

3. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 1 o 2, donde dicha cadena codificante (110, 210, 310) tiene un saliente 3' (115, 215, 315) de cinco a ocho nucleótidos.

4. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 3, donde dicha cadena codificante (110, 210, 310) tiene un saliente 3' (115, 215, 315) de cinco nucleótidos.

5. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 4, donde dicha cadena codificante (110, 210, 310) tiene un saliente 3' (115, 215, 315) seleccionado de un grupo que consiste en dTs, dA5, dGs o dC5, donde dT representa desoxitimidina, dA representa desoxiadenosina, dG representa desoxiguanosina y dC representa desoxicitosina.

6. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 5, donde dicha cadena no codificante (120, 220) tiene un saliente 3' (125, 225) de al menos dos nucleótidos.

7. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 6, donde dicha cadena no codificante (120, 220) tiene un saliente 3' (125, 225) de dos a cinco nucleótidos.

8. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 6 o 7, donde dicha cadena no codificante (120) tiene un saliente 3' (125) de dos nucleótidos.

9. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 6-8, en la que al menos un nucleótido en dicho saliente 3' (125, 225) de dicha cadena no codificante (120, 220) es un desoxinucleótido. 10. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 9, en la que dichos al menos dos nucleótidos en su totalidad en dicho saliente 3' (125, 225) de dicha cadena no codificante (120, 220) son desoxinucleótidos.

11. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la cláusula 10, donde dicha cadena no codificante (120, 220) tiene un saliente 3' (125, 225) seleccionado de un grupo que consiste en dT2, dA2, dG2, dC2, dT5, dA 5, dG5 o dC5, donde dT representa desoxitimidina, dA representa desoxiadenosina, dG representa desoxiguanosina y dC representa desoxicitosina.

12. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 11, donde una porción de doble cadena (130, 230, 330) de dicha molécula de ARNip de doble cadena (100, 200, 300) tiene una longitud de Al menos 19 pares de bases.

13. Un método de transfección celular que comprende el contacto de una célula que se va a transfectar con una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia, ARNip, de doble cadena (100, 200, 300) de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 12.

14. El método de transfección celular de acuerdo con la cláusula 13, donde el contacto de dicha célula comprende poner contacto dicha célula que se va a transfectar con dicha molécula de ARNip de doble cadena (100, 200, 300) en ausencia de un agente de transfección.

15. El método de transfección celular de acuerdo con la cláusula 13 o 14, donde el contacto de dicha célula comprende poner en contacto dicha célula in vitro que se va a transfectar con molécula de ARNip de doble cadena (100, 200, 300).

16. Un método de interferencia de ácido ribonucleico, ARN, específico de diana en una célula que comprende el contacto de dicha célula con una molécula de ARN pequeño de interferencia de doble cadena, ARNip, (100, 200, 300) de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 12, donde al menos una porción de una cadena no codificante (120, 220, 320) de dicha molécula de ARNip de doble cadena (100, 200, 300) tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ARN diana.

17. Una molécula (100, 200, 300) de ácido ribonucleico pequeño de interferencia, ARNip, de doble cadena (100, 200, 300), de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 12 para su uso como medicamento.

18. Una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia, de doble cadena (100, 200, 300), de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 12 para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediante la disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana, donde al menos una porción de una cadena no codificante (120, 220, 320) de dicha molécula de ARNip de doble cadena (100, 200, 300) tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de dicha secuencia de ARN diana.

19. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia, de doble cadena, ARNip, (100, 200, 300) de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 12 y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

20. Una célula transfectada con una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia, ARNip, de doble cadena (100, 200, 300) de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1 a 12 o una secuencia de nucleótidos que codifica dicha molécula de ARNip de doble cadena (100, 200, 300).

21. Un método de transfección celular que comprende el contacto, en ausencia de cualquier agente de transfección, de una célula que se va a transfectar con una molécula de ácido ribonucleico de doble cadena pequeño, ARNip, (100, 200, 300) que comprende una cadena de ARN codificante (110, 210, 310) y una cadena de ARN no codificante (120, 220, 320), donde dicha cadena codificante (1 10, 210, 310) tiene un saliente 3' (115, 215, 315) de al menos cuatro nucleótidos.

Ejemplos

Materiales y métodos

Todas las secuencias de ARNip utilizadas en los ejemplos de la presente invención fueron purificadas por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y adquiridas de Sigma-Aldrich, Suecia. Se resuspendieron los bicatenarios liofilizados en agua desprovista de ARNasa a concentraciones de stock de 100 pM y se utilizaron como tales.

Se utilizaron las siguientes secuencias en los ejemplos:

Secuencias de ARNip de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) canónicas, abreviadas en el presente documento como dT2:

Codificante: 5'-CCG AGC CAC AUC GCU CAG A dTdT-3' (SEC ID NO: 1)

No codificante: 5'-UCU GAG CGA UGU GGC UCG G dTdT-3' (SEC ID NO: 2)

Tabla 3 - Secuencias de ARNi de GAPDH

Secuencias de GFP-ARNip:

Codificante 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUdTdT-3' (SEC ID NO: 13)

No codificante 5'-AACUUCAGGGUCAGCUUGCdTdT-3' (SEC ID NO: 14)

Secuencias de GFP-ARNcp:

Codificante 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUdTdTdTdTdT-3' (SEQ ID NO: 15)

No codificante 5'-AACUUCAGGGUCAGCUUGCdTdT-3' (SEC ID NO: 14)

Secuencias de ARNip de p-catenina

Codificante 5'-GUA GCU GAU AUU GAU GGA C dTdT-3' (SEC ID N°: 16)

No codificante 5'-GUC CAU CAA UAU CAG CUA C dTdT-3' (SEC ID N°: 17)

Secuencias de ARNcp p-catenina

Codificante 5'-GUA GCU GAU AUU GAU GGA C dTdTdTdTdT-3' (SEC ID NO: 18)

No codificante 5'-GUC CAU UAU CAG CUA C dTdT-3' (SEC ID NO: 17)

Secuencias de ARNcp de GAPDH modificadas con aldehído

Codificante: 5'-CCG AGC CAC AUC GCU CAG A dTdTdTdTdTU -3' (SEQ ID NO: 19)

No codificante: 5'-UCU GAG CGA UGU GGC UCG G dTdT-3' (SEC ID NO: 2).

Los ARNip de control negativo (secuencia desordenada) fue: Stealth RNAi™ ARNip Control negativo Lo GC (Invitrogen, número de parte: NC: 12935-200).

Estudios de fusión térmica

Se llevaron a cabo estudios de desnaturalización térmica de ARNip en tampón fosfato, pH 7,0, que contenía KCI 140 mM. Se supervisó la absorbancia de UV a 260 nM en el intervalo de temperatura de 40 a 95 °C utilizando un espectrofotómetro Lambda 35 UV-Vis equipado con un programador de temperatura Peltier con una velocidad de calentamiento de 0,5 °C/min. Se desnaturalizaron las muestras (1 pM de ARN) a 90 °C durante 3 minutos, seguido de enfriamiento lento a 27 °C antes de las mediciones. Se obtuvieron los valores de Tm a partir del máximo de los primeros derivados de las curvas de fusión. Todos los valores de Tm dados son los promedios de tres conjuntos independientes de experimentos (intervalo de error de ± 0,3 °C).

Ajuste de asimetría termodinámica

El ARNip canónico (19 pb 2 salientes) con la asimetría termodinámica deseada se suele identificar mediante el uso de métodos computacionales, que pueden no predecir perfectamente el ARNip altamente funcional. Estos métodos no se pueden aplicar en ciertos casos, como las mutaciones puntuales dirigidas o las isoformas empalmadas alternativamente con exones únicos, ya que solo se podría obtener un número limitado de ARNip pertinente. Por lo tanto, se buscaron secuencias de ARNip con la asimetría termodinámica del extremo 5' deseada que sería aplicable a cualquier secuencia de ARNip sin modificaciones químicas. Para conseguir este objetivo, se extendió la longitud de saliente del extremo 3' de la cadena codificante de dos nucleótidos (nt) a cinco u ocho. Se planteó la hipótesis de que esta extensión de cadena (cola móvil) en un extremo (saliente 3' de la cadena codificante) del bicatenario de ARNip podría inducir desestabilización termodinámica, lo cual podría facilitar el desenrollamiento selectivo dependiente de ATP y reclutamiento RISC de la cadena deseada.

Los estudios de fusión de ARNip revelaron claramente que el aumento de la longitud del saliente utilizando cinco repeticiones de dT (dTs) tuvo como resultado una caída de Tm de aproximadamente 0,5 °C, mientras que un saliente con ocho dTs (dTa) dio como resultado una caída de 1,5 °C (en comparación con el ARNip canónico). La incorporación del saliente dTs en ambos extremos (dTsMes decir, la extensión del extremo 3' de las cadenas codificante y no codificante) tuvo como resultado una caída de Tm de ~1 °C. Estos resultados indican claramente la desestabilización simétrica que resulta en el desenrollamiento de ambos extremos (que corresponde a una disminución de Tm de 0,5 °C desde cada extremo).

Al cambiar el tipo nt de pirimidinas a purinas, se observó una mayor caída de Tm de -1,5 °C con cinco salientes de dA (dA5) y en ~2 °C con cinco salientes de dG (dG5) (véase Tabla 3 para detalles de secuencias). Este cambio es presumiblemente el resultado de la estructura de cadena simple más ordenada de dA5 y dG5 en comparación con dT5. También se probaron otras modificaciones de nt y sus características de fusión se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 - Desnaturalización térmica de ARNi ue tiene una lon itud de saliente 3'diferente

Cultivo de células y transfección

Para todos los experimentos con células, a no ser que se indique lo contrario, se sembraron las células a una densidad de 35.000 células en una placa de cultivo de células de 24 pocillos que contenía medio esencial mínimo a (a-MEM) (Sigma-Aldrich, Haverhill, Reino Unido) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 100 U/pl de penicilina, 100 mg/pl de estreptomicina y suero bovino fetal al 10 % (inactivado por calor, Sigma-Aldrich) a 37 °C con 5 % de CO2 hasta que se alcanzó confluencia.

Se aislaron células primarias de osteoblasto humano (HOB) aisladas de hueso trabecular humano [1, 2] y se aislaron queratinocitos y fibroblastos de tejido cutáneo de donantes humanos sanos. Se obtuvieron líneas celulares MG63 (línea celular de osteosarcoma humano), HCT1 16 (línea celular de cáncer de colon humano), HEK293 (células 293 de riñón embrionario humano), C2C12 (línea celular de mioblasto de ratón) y líneas celulares MC3T3 (línea de células precursoras de osteoblasto de ratón) de la Colección Norteamericana de cultivos tipo, ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). Se cultivaron las células hasta alcanzar la confluencia. Los experimentos con células humanas fueron aprobados por el comité de ética local (aprobación ética no. Ups 03-561).

Al 70 % de confluencia, un día antes de la transfección, se sembraron las células a una densidad de 35. 000 células en una placa de cultivo de células de 24 pocillos para lograr una confluencia del 60-80 % el día de la transfección. Se transfectaron los ARNip penetrantes de células (ARNcp) de diferentes longitudes a concentraciones de 50 nM con un reactivo de transfección asistida por imán (MATra-si) para ARNip (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Brevemente, se mezcló el ARNip con un reactivo MATra-si compuesto de nanopartículas súper magnéticas de óxido de hierro y se incubó durante 20 min. Se formó un complejo que se añadió a las células a transfectar. Se aplicó una fuerza magnética fuerte debajo de las células durante 15 min. Esto obligó al complejo a ser atraído hacia las células por el campo magnético y como resultado, el ARNip se administró directamente en el citosol. Para experimentos de transfección sin vehículo, los ARNcp se agregaron simplemente a las líneas celulares MG63, HOB, HCT1 16, fibroblastos y queratinocitos a concentraciones de 50 nM. Las células también se transfectaron con ARNip de control negativo (secuencia desordenada) y las células que se dejaron sin tratar se tomaron como controles. Cada transfección se realizó por triplicado. Después de la transfección, las células se incubaron durante 24 horas.

Para los experimentos que implican cloroquina (CQ) del agente lisosomotrópico, se neutralizó primero CQ a pH 7,4 utilizando NaOH 1 M antes de su uso. Se transfectaron las células MG63 con dT2, dTs, dTa, (dTs)2, como (dTs) y bl(dT5) ARNip en presencia o ausencia de 100 pM CQ o utilizando MATra-si y se incubaron durante 24 h. Se realizaron experimentos similares para otros ARNcp, concretamente, dAs, dTs, dGs, (dTs)2, rAsy dC5. Para el experimento de control, las células se dejaron sin tratar o se transfectaron con ARNip de control negativo (secuencia desordenada). Se realizó cada experimento de transfección por triplicado.

Total de muestras de ARN

Después de realizar los experimentos de transfección durante 24 h, 48 h, 72 h respectivamente, se aisló el ARN total de las células por adición de 500 pl de tampón de lisis (Qiagen, Alemania), seguido de homogeneización de los lisados de células utilizando QIAshredder (Qiagen, Alemania). Se extrajo el ARN de los lisados celulares con RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania). Se trató todas las muestras de ARN con DNasa utilizando TURBO-DNA free (Ambion, Estados Unidos). Se utilizó Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) para confirmar la alta calidad de todas las muestras de ARN, lo cual notifica un número de integridad del ARN (RIN) que tiene en cuenta la traza completa de ARN electroforético producida en el análisis. Un RIN mayor o igual a siete indica que el ARN es adecuado para aplicaciones de alta rigurosidad.

Se utilizó NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) para determinar las concentraciones, con las relaciones OD 260/280 resultantes entre 1,95-2,03.

Experimento de RT-PCR en tiempo real

Se realizó por triplicado la síntesis de ADMc utilizando transcripción inversa de RNA total empleando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Estados Unidos), añadiendo control sin matriz para asegurar una falta de señal en el fondo del ensayo. Se incubaron las reacciones en un sistema de PCR de ciclo térmico rápido de Applied Biosystems 9800 de 96 pocillos a 37 °C durante 60 min, seguido de 95 °C durante 5 min. Se llevaron a cabo las reacciones de PCR en tiempo real con 10 pl de 2x TaqMan® Universal PCR Master Mix, sin AmpErase® UNG (Applied Biosystems, Estados Unidos), 9 pl de ADNc diluido y 1 pl de la mezcla de ensayo específica del gen TaqMan en un volumen de reacción final de 20 pl. Se seleccionó el gen de referencia beta-actina (ACTB) (Applied Biosystems, Estados Unidos) como control para la normalización de los datos de TaqMan. El ensayo incluyó un control sin matriz, una curva estándar de cinco puntos de dilución en serie (en etapas de 3 veces) de la mezcla de ADNc. Las sondas específicas para IFN-a (Hs01022060_m1), IFN-p (Hs01077958_s1), IFN-y (Hs00985251_m1), ACTB (Hs01060665_g1) y G^aP^dH (Hs02758991_g1) fueron adquiridas desde Biosystems. La amplificación se llevó a cabo utilizando el sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems, Estados Unidos) utilizando un programa de 40 ciclos. El software 7500 calcula automáticamente los valores de Ct (ciclo umbral) sin procesar. Se analizaron más a fondo los datos de las muestras con un valor de Ct igual o inferior a 35. Se normalizaron las muestras en relación con el control endógeno y se calcularon las diferencias en número de umbral ciclo utilizando el método de cuantificación comparativa 2-ññCT (también denominado método AACT), comúnmente utilizado para analizar la eficacia de la disminución de genes inducida por ARNip.

Las fórmulas utilizadas para calcular la disminución de genes fueron las siguientes:

En primer lugar, se calculó el ACT como el umbral ciclo medio para el gen diana menos los umbrales ciclo medios para los controles ACTB endógenos, cada uno de ellos realizado por triplicado: ACT = CT (gen diana) - CT (control endógeno). En segundo lugar, se calculó el AACT como el ACT de la diana menos el ACT del control negativo (NC): AACT = ACT (diana) -ACT (NC). A continuación, se calculó el porcentaje de disminución de gen diana como: doble cambio = 2-AA T, y después, el porcentaje de disminución: = 100 x (1 cambio 1 vez).

Análisis de transferencia Western: Transcurridas 48 horas tras la transfección, se lavaron las células dos veces con PBS enfriado con hielo y se lisaron en tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, con NaCl 150 mM, Igepal CA-630 al 1,0 % (NP-40), 0,5 % desoxicolato de sodio, 0,1 % SDS y 10,0 % cóctel inhibidor de proteasa de Sigma-Aldrich®). Se incubaron los lisados en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 20 minutos para recoger el sobrenadante. Se utilizó el reactivo Coomassie Plus: Better Bradford Assay™ (Thermo Scientific) para medir las concentraciones de proteínas. A continuación, se separaron 20 |jg de proteína soluble por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilo (Millipore). Se utilizaron anticuerpos primarios contra GAPDH (dilución 1: 1000), p-catenina (dilución 1: 1000; SIGMA-A^lD^rICH®), B-actina (1: 1000; Cell Signaling Technology®) para sondear las bandas de jproteína. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con anticonejo-HRP (dilución 1: 3000; R&D Systems®) para detectar los anticuerpos primarios, seguido de la visualización de la proteína diana con sustrato HRP quimioluminiscente de transferencia (ECL) EMD de Millipore Immobilon™. Se obtuvieron imágenes utilizando el sistema de tratamiento de imágenes modo dual Fc LI-COR Odyssey® (LI COR ® Biosciences) y el software Image Studio.

Análisis estadístico

Se aplicó el análisis t/Student para determinar las diferencias estadísticas entre pares de grupos. Se utilizó el análisis de varianza de dos vías (ANOVA) para evaluar la importancia estadística para las comparaciones dentro de los grupos. Se consideró estadísticamente significativo una p <0,05 (dos caras). Los datos se analizaron utilizando el paquete de software Graph Pad Prism (versión 6.0).

Actividad ARNi del ARNip asimétrico

A continuación, se exploró si la desestabilización selectiva podría influir en la actividad del ARNi ya que el reclutamiento selectivo de la cadena en RISC podría mejorar esta actividad. Para abordar esta idea, se aplicó un ensayo basado en células con células de osteosarcoma humano (MG63) en el que los componentes celulares estaban presentes en concentraciones fisiológicamente relevantes. Como diana de gen modelo, se eligió el gen constitutivo GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) y se midió la actividad de ARNi utilizando RT-PCR cuantitativa con p-actina como patrón interno. Se llevaron a cabo los experimentos de transfección con reactivo de transfección asistida por imán (MATra-si) ya que este método conlleva una toxicidad reducida y no se basa en el mecanismo de endocitosis convencional generalmente observado con reactivos a base de polímeros catiónicos/ lípidos.

Estos experimentos demostraron que un aumento en la longitud de saliente de cinco u ocho nt tuvo realmente como resultado una actividad de silenciamiento génico superior (80 % de reducción de genes) en comparación con el ARNip canónico (60 % de reducción de genes; Fig. 2A). Este aumento del 20 % se atribuyó a la asimetría termodinámica del ARNcp que resultó en un reclutamiento preferente de la cadena no codificante para RISC en comparación con el ARNip canónico. Cabe destacar que, cuando se analizó el ARNip simétrico (dTs)2, se observó un aumento del 10 % en la actividad (reducción del 70 % del gen) en comparación con el ARNip canónico. Aunque esta actividad fue más baja que el ARNcp, tal como se había anticipado, la mejora probablemente se deba a un desenrrollamiento más fácil de este ARNip con respecto al ARNip canónico.

ARNip penetrante de células

Se llevaron a cabo experimentos de transfección sin vehículo utilizando ARNip con diferentes longitudes de saliente (dT2, dTs, dTay (dTs)2). Sorprendentemente, estos experimentos demostraron que la secuencia de ARNip modificada con dTs tuvo como resultado un 80 % de reducción de genes (similar a la transfección basada en MATrasi) mientras que los ARNip modificados con dT2 y dTs presentaron solo valores modestos de reducción de 28 % y 50 %, respectivamente (fig. 2A). La modificación simétrica (dT5)2, por otro lado, tuvo como resultado un 65 % de reducción de genes, lo cual fue comparable con los resultados con la técnica basada en MATra-si (70%). Este hallazgo señaló que un diseño de ARNip con una longitud de saliente de 5 nt (dT5) sirvió para realizar todas las etapas importantes para un fármaco basado en ARNip, desde la captación celular hasta el escape endosómico hasta el reclutamiento selectivo de RISC.

Para confirmar mejor la selectividad en el reclutamiento de RISC como resultado de una modificación específica en el extremo 3', se analizó GAPDH-ARNip donde se incorporaron nt dT5 en el extremo 3' de la cadena no codificante como (dT5). Esta modificación tuvo como resultado un fuerte descenso en la disminución de ARNm (20 %), lo cual validó la hipótesis de los autores de la invención. Cabe destacar que cuando se analizó el ARNip de extremo romo, bl(dT5), donde se eliminó el 3'-dT2 presente en la cadena no codificante al tiempo que se retenía el dT5 en el extremo 3' de la cadena codificante (Tabla-3), se observó una disminución del 20 % en la actividad (60 % de disminución de genes). Estos resultados revelan los parámetros críticos para el reclutamiento de ARNip en RISC.

Por lo tanto, los autores de la invención diseñaron el ARNip con el diseño de saliente de 5 nt como ARNip o ARNcp penetrante en la célula. La captación celular de ARNcp también se confirmó mediante la realización de experimentos de transfección utilizando ARNcp marcado con Cy3.

Asimismo, los autores de la invención realizaron un estudio de gradiente de concentración de ARNip y ARNcp (10 nM-100 nM) para determinar la concentración óptima de ARNip para el estudio de transfección. Se observó la máxima disminución de genes (28 % para ARNip canónico y 80 % para ARNcc dTs) a la concentración de 50 nM al cabo de 24 h de incubación, lo cual no aumentó más al aumentar la concentración a 100 nM (Fig. 7A). Este experimento también demostró la disminución de genes dependiente de la concentración utilizando ARNcp.

Este intrigante resultado planteó varias preguntas importantes. (1) ¿Es este fenómeno el resultado de una mejor captación celular o de una liberación prematura desde el compartimento endosómico, la región sensible de la célula donde el ARN generalmente está atrapado y degradado? (2) ¿Es específico para salientes con una desoxirribosa o ribosa nt? (3) ¿Es específico para los salientes de un tipo nt en particular (A, T, G o C)? (4) ¿Es específico para una secuencia de ARNip en particular? (5) ¿Es un proceso dependiente de la energía? (6) ¿Dichas modificaciones inducen citotoxicidad o activación inmune? Finalmente, (7) ¿es aplicable a todos los tipos de células?

Se realizaron una serie de experimentos para abordar estas importantes preguntas. Se repitió el experimento de transfección sin vehículo en presencia de cloroquina, un agente lisosomotrópico conocido por romper el endosoma celular. Para nuestra sorpresa, este experimento arrojó pruebas convincentes de que las células captan todos los tipos de ARNip (incluyendo el ARNip canónico) pero los secuestran en el endosoma. Allí, las moléculas de ARNip pierden su actividad, con la excepción de ARNip que lleva el saliente de 5 nt (Fig. 2A).

A continuación, se analizaron diferentes secuencias de purina y pirimidina en repeticiones de 5 nt. La ventaja de utilizar dichas repeticiones es minimizar la posibilidad de homología de secuencia dentro de la secuencia de ARNip (evitando estructuras secundarias) y también limitar la activación inmune que es específica para las repeticiones de dinucleótidos (p.ej., CpG). Entre los diferentes candidatos de 5 nt analizados, el ARNip con salientes de dAs y dTs demostró la máxima actividad de ARNi (Fig. 2B). Cabe de destacar que el análogo de la ribosa rA5 mostró solo un 60 % de reducción, en comparación con dA5 (80 %), lo cual indica la presencia de una polarización enzimática específica para la desoxirribosa sobre los nucleótidos de la ribosa dentro del complejo RISC. Este resultado también podría derivase de las diferencias en la degradación enzimática del ADN monocatenario frente al ARN monocatenario.

Para validar aún más los resultados, los autores de la invención probaron la eficacia de disminución de genes de otro gen CTNNB1 (p-catenina), que se expresa en células MG63. Se realizó un experimento en el transcurso del tiempo (24, 48 y 72 h) dirigiéndonos a CTNNB1 y GAPDH en células MG63 y se cuantificaron los niveles de ARNm y proteína aplicando experimentos de qRT-PCR y transferencia de Western respectivamente (Fig. 8). Estos experimentos confirmaron que el ARNcp tenía una mayor eficiencia de disminución de genes durante más de 72 horas sin ningún reactivo de transfección en comparación con el de ARNip canónico con reactivo de transfección (Fig. 8A, 8B). Este resultado también fue profundo en el nivel de proteína, lo cual mostró una eliminación completa de las proteínas CTNNB1 y GAPDH a las 48 h, con niveles de expresión menores al cabo de 24 y 72 h.

Versatilidad de la actividad ARNi de ARNcp

A continuación, los autores de la invención se centraron en la eficiencia de la transfección del ARNcp en diferentes tipos de células ya que la transfección con diferentes vehículos generalmente funciona de manera eficiente para las células cancerosas de rápida división, pero no para las células primarias difíciles de transfectar. Para analizar el sistema de transfección con diferentes tipos de células, se eligieron osteoblastos primarios humanos (HOB) como células primarias modelo; y células de carcinoma de colon humano (HCT116) y MG63 como células cancerosas modelo. Estos experimentos demostraron claramente que el ARNcp tuvo como resultado una eficacia de disminución de 3 a 4 veces mayor en comparación con el ARNip canónico (Fig. 3A). Este diseño único de ARN conservó una capacidad de disminución de genes idéntica (80 %) en diferentes tipos de células, incluso cuando los ARNip canónicos presentaron una actividad limitada en las células primarias (Fig. 3A).

Para cuantificar la captación celular en diferentes células, se realizaron experimentos de citometría de flujo con diferentes tipos de células utilizando el ARNcp marcado con Cy3, donde se incorporó Cy3 en el extremo 5' de la cadena codificante con el saliente 3'-dT5. Estos experimentos confirmaron la captación celular casi cuantitativa en casi todas las células analizadas (Fig. 3C). Este ARNcp modificado con Cy3 también presentó un 80 % de disminución de genes en células MG63, lo cual indica que el bloqueo de la 5'-fosforilación de la cadena codificante (inhibiendo el reclutamiento de codificante en RISC) no mejoró aún más la actividad de ARNi (no se muestran los datos). También verificó que se toleraba bien la modificación hidrófoba en el extremo 5' de la cadena codificante en ARNcp sin ninguna pérdida de actividad.

Estos experimentos demostraron que el ARNcp con cinco salientes de nucleótidos sirve para realizar todas las etapas bioquímicas necesarias para la actividad de ARNi. Estas etapas incluyen, (1) captación celular, (2) escape endosómico y (3) reclutamiento selectivo de RISC. Estos resultados se indican en las Figs. 2 y 3.

La captación celular de ARNcp es un proceso dependiente de la energía

Para determinar si la captación celular de ARNcp es un proceso de endocitosis dependiente de la energía, se realizaron los experimentos de transfección a 4 °C y 37 °C. Brevemente, se colocaron en placas las células HCT116, HOB y MG63 y se incubaron con ARNcp (dTs o dA5 o secuencia de ARNip desordenadas) a 4 °C o 37 °C durante 4 h. Al cabo de 4 h, el medio se reemplazó con medio reciente y se incubaron las células durante 24 h más. Se utilizaron como controles las células sin tratar. Se realizó por triplicado cada transfección. Estos experimentos demostraron claramente que la captación celular de ARNcp es un proceso dependiente de la energía. La captación celular utilizando estas secuencias de ARNip se redujo en casi un 30% cuando se realizaron los experimentos a 4 °C, véase Fig. 4.

Mecanismo de penetración celular del ARNcp

A continuación, se investigó si tuvo lugar el mecanismo de captación celular de ARNcp por endocitosis. Se realizaron los experimentos de transfección con ARNcp modificado con dTs a 4 °C y se observó una actividad de ARNi más baja (50 % de disminución de genes) en comparación con la actividad a 37 °C (80 %), lo cual indica un proceso de endocitosis dependiente de la energía para la captación celular (Fig. 4). Este resultado indicó la presencia de un receptor de superficie celular ubicuo, exquisitamente sensible, que se unió e internalizó ARN de doble cadena. Tras la endocitosis, el saliente de 5 nt de longitud participó en un mecanismo de escape endosómico desconocido que promovió el transporte de citosol del ARN. Este mecanismo único fue independiente del tipo nt ya que cada secuencia de ARNip con una longitud de 5 nt presentó una eficacia idéntica en comparación con una transfección basada en cloroquina (Fig. 2B). Un posible candidato para este tipo de receptor es el receptor de tipo Toll (TLR)-3 altamente regulado al alza que junto con TLR7, TLR8 o TLR9 se ha relacionado con el reconocimiento de ARN extracelular y para iniciar la activación inmune innata de ARN virales y sintéticos. TLR-7, -8 y -9, se unen selectivamente a secuencias de ADN o ARN monocatenarios con TLR-7 y -8 se unen preferentemente a secuencias ricas en U y G, mientras que TLR-9 se unen a las repeticiones de CpG nt. TLR3, por otra parte, se une no específicamente al bicatenario de ARN de 21 meros tras la dimerización del receptor para formar un complejo 2: 1 TLR3-ARN. Este receptor se expresa de forma ubicua en la superficie celular y dentro de los compartimentos endolisosómicos de casi todos los tipos de células de mamíferos.

Los experimentos de citometría de flujo demostraron una captación celular eficiente de ARNcp

Para determinar la cantidad de captación celular de ARNcp por citometría de flujo, se utilizó ARNcp marcado con Cy3 (Tabla 3) para los experimentos de transfección utilizando diferentes tipos de células (MG63, HOB, HCT116, HEK293 y MC3T3). Se sembraron las células a una densidad de 1 x 105 células por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. A continuación, se transfectaron las células con 50 nM Cy3-ARNcp, dejando sin tratar los pocillos de control. Tras la transfección, las células se incubaron durante 24 horas más a 37 °C, se tripsinizaron y se lavaron con PBS que contenía EDTA 2 mM y albúmina de suero humano al 0,5 %. Se suspendieron las células en PBS y se sometieron a análisis de fluorescencia en una plataforma BioVis FACSCanto II (BD Biosciences), laboratorio de SciLife. Se analizaron las imágenes utilizando el software FlowJo (versión 7.6; TreeStar, Ashland, OR). Estos experimentos demostraron que el ARNcp marcado con Cy3 fue captado cuantitativamente por todas las células, véase Fig. 3C.

Para determinar la cinética de la captación celular de ARNcp, se repitieron los experimentos de FACS, tal como se mencionó anteriormente utilizando células MG63, donde se trató Cy3-ARNcp en diferentes puntos temporales. Brevemente, se añadió Cy3-ARNcp (50 nM) a las células, seguido de incubación durante 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 3 h y 4 h, respectivamente. A continuación, se tripsinizaron las células y se analizaron por FACS, tal como se ha mencionado anteriormente. Estos experimentos demostraron que la captación celular se inició al cabo de 1 h y terminó en las siguientes 2 h (Fig. 3B).

Para realizar estudios de bloqueo de TLR3, se incubaron células MG63 sembradas con ODN2006 marcado con 3'-FITC 600 nM durante 1 h, seguido de la adición de ARNcp 50 nM. Se incubaron las células durante 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 3 h y 4 h adicionales, respectivamente, se tripsinizaron y se analizaron por análisis FACS, tal como se mencionó anteriormente. Estos experimentos demostraron que la captación celular de ARNcp no es análoga al ARN viral u otro ARN de doble cadena más grande. La adición de ODN2006, generalmente, inhibe la captación celular de ARN viral, lo cual no se observó con el ARNcp (Fig. 3B).

Para verificar si el mecanismo de captación del ARNcp era análogo al ARN viral y el ARN polirriboinosínico: ácido polirribotidílico o poli (1:C), se llevaron a cabo estudios de bloqueo utilizando la secuencia de ADN de cadena simple de Btype ODN2006 que comparte un receptor de captación común. Este oligo modificado con fosforotioato sintético, aunque inicialmente identificado como agonista de TLR9, bloquea la captación celular de ARN viral y poli (1:C) al competir preferentemente con el receptor de captación de ARN común. Se llevó a cabo el experimento de bloqueo pre-incubando las células con ODN2006 marcado con FITC durante 1 h, seguido de la adición de ARNcp marcado con Cy3. Se supervisaron los estudios de bloqueo y la captación celular por análisis FACS en diferentes puntos temporales durante hasta 4 h. Como experimento de control, se llevó a cabo la cinética de captación en ausencia de ODN2006 marcado con FITC. Cabe destacar que estos experimentos demostraron que el ARNcp no siguió el mismo mecanismo que el RNA viral o poli (1:C); la adición de FITC-ODN2006 no inhibió la captación de ARNcp (Fig. 3B). Además, a diferencia de poli (1:C), que presentó una cinética de captación rápida (en 5 min), la captación celular de ARNcp se inició al cabo de aproximadamente 1 h de incubación a 37 °C, lo cual se completó posteriormente en las 2 h siguientes. Estos experimentos verificaron la participación de un mecanismo de captación alternativo e indicaron la presencia de un receptor ubicuo de captura de ARN que requirió ~ 1 h de tiempo de maduración antes de que pudiera iniciarse el proceso de endocitosis.

Ensayo de proliferación celular indicador de la ausencia de citotoxicidad del ARNcp

Se evaluó la proliferación celular por ensayo de reactivos MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna): Se sembraron células MG63 fueron a una densidad de 35.000 células en placas de cultivo de 24 pocillos y se cultivaron durante 24 horas, tal como se ha mencionado anteriormente. Se transfectaron las células con concentraciones de 50 nM o 100 nM de ARNcp y ARNip de control negativo con o sin MATra-si, al mismo tiempo que se dejaban sin tratar los pocillos de control. Cada experimento de transfección se realizó por triplicado. Después de la transfección, se incubaron las células durante 24 horas a 37 °C. Se evaluaron Las células viables según el ensayo MTS, aplicando el ensayo de proliferación celular CellTiter 96®AQueousOne Solution (Promega, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se cuantificó la reducción enzimática en MTS en formazan mediante un lector de placas ELISA (Thermo Scientific) a 490 nM. Este experimento demuestra que todos los ARNip modificados con diferentes longitudes de saliente no indujeron ninguna citotoxicidad (Fig. 5).

Por lo tanto, se investigó el papel de la topografía de ARNip en la activación inmunitaria y la toxicidad celular ya que se ha notificado que el aumento de la longitud del ARN causa toxicidad al aumentar la expresión de interferón (IFN)-p. Se realizaron estudios de toxicidad aplicando el ensayo MTS con dos concentraciones de ARNip de GAPDH (50 y 100 nM) con diferentes longitudes de saliente (dT2, dTsy dT8) en células MG63 y HOB y se compararon con la secuencia de ARNip desordenada (Fig. 5). Estos experimentos demostraron claramente que los salientes de diferentes longitudes no imponen toxicidad en las células cancerosas o células primarias en altas concentraciones (100 nM). Sin embargo, la transfección basada en MATRA-SI tuvo como resultado una toxicidad ligeramente mayor en comparación con los experimentos sin vehículo a concentraciones de ARNip de 100 nM, lo cual se debe claramente a la mayor cantidad de agente de transfección, en consonancia con observaciones previas sobre la toxicidad del vehículo.

El ensayo de interferón no demostró ninguna activación inmune de ARN modificado

Se transfectaron células MG63 con concentraciones de 50 nM o 100 nM de ARNcp y ARNip de control negativo con 0 sin MATra-si, tal como se ha mencionado anteriormente. Se dejaron sin tratar los pocillos de control. Se llevó a cabo cada experimento de transfección por triplicado. Al cabo de 24 h, se analizaron las inducciones de interferón a través de experimentos de RT-PCR utilizando cebadores específicos para el interferón a, p y ^y. Estos experimentos demostraron que los ARNip modificados con diferentes longitudes de saliente no desencadenan una reacción inmune (Fig. 6).

Por lo tanto, debido a que el estrés celular se origina principalmente a partir de la maduración del complejo ARN-TLR en el endosoma o la activación de RIG-1 en el citoplasma, los autores de la invención investigaron la activación inmune y la respuesta de IFN utilizando ARNcp y una secuencia desordenada. Se analizaron los niveles de IFN tipo 1 (IFN-a y p) y tipo II (IFN-^y) a través de RT-PCR cuantitativa. IFN-a, p y ^yson activados por el ARNip en diferentes células, in vitro e in vivo. Debe advertirse que las células MG63 son de 300 a 500 veces más sensibles a la inducción de IFN-p que otros tipos de células como HeLa. En estos experimentos, ARNcp no demostró ninguna respuesta de IFN significativa en comparación con el control de células solas o la secuencia desordenada (Fig. 6). Este hallazgo se debe presumiblemente a la rápida liberación del ARNcp desde el compartimento del endolisosoma, lo cual evita la maduración de TLR, que es una etapa clave para iniciar la respuesta de IFN mediada por TLR.

Microscopio de fluorescencia

Se llevaron a cabo experimentos de captación celular colocando en placas células (1 x 104) en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos. A una confluencia del 70 %, se transfectaron las células con 50 nM de Cy3-ARNcp y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Se dejaron sin tratar los pozos de control. Cada transfección se realizó por triplicado. Para evaluar la distribución del ARNcp marcado con fluorescencia, se fijaron las células con metanolacetona y se lavaron con PBS. Se montaron los portaobjetos utilizando un medio de montaje Vectashield que contenía 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Labs, Burlingame, CA) para teñir los núcleos de las células. Las imágenes se capturaron con un microscopio Axiolmager Z1 equipado con un Apotome (Carl Zeiss AB, Estocolmo, Suecia).

Disminución de GFP en células MG-63

Se sembraron células MG63 que expresaban constitutivamente proteína fluorescente verde (GFP) (1 x 104) en un portaobjetos de cámara de 8 pocilios. Al cabo de 24 h, se transfectaron las células con 50 nM de GFP-ARNcp o GFP-ARNip, tal como se ha mencionado anteriormente. Se llevó a cabo cada transfección por triplicado. Los pozos de control se dejaron sin tratar. Las células se incubaron a continuación durante 48 h.

Para evaluar la disminución de genes (niveles de GFP), se fijaron las células con metanol-acetona y se lavaron con PBS. Se montaron los portaobjetos utilizando un medio de montaje Vectashield que contenía DAPI para teñir los núcleos en todas las muestras. Se capturaron imágenes con un microscopio Axiolmager Z1 equipado con un Apotome (Carl Zeiss AB, Estocolmo, Suecia).

Tras la incubación de estas células MG63 que expresan GFP con GFP-ARNcp (50 nM), se observó una disminución casi completa de la fluorescencia verde en 48 h (Fig. 9C). En cambio, con el control GFP-SiRNA, por otro lado, se pudo observar la expresión de GFP (Fig. 9B), lo cual ilustra la propiedad única de ARNcp.

Conjugación de hialuronano-ARNcp y evaluación in vitro

Los autores de la invención exploraron el método de conjugación de HA-ARNcp que explota los enlaces de hidrazona. Para este fin, se incorporó el nucleósido de uracilo en el extremo 3' de la cadena codificante del ARNcp modificado de la invención (véase las secuencias de ARNcp de GAPDH modificadas con aldehído antes mencionadas). Se oxidó el riboazúcar del nucleótido terminal utilizando peryodato de sodio (NalO4) para obtener el ARNcp modificado con aldehido. Para este fin, se tomaron 50 pl (50 nmoles) de 100 pM ARNcp en un tubo estéril Eppendorf y se añadieron a la solución 5 pl de 50 nMol de peryodato de sodio (NalO4). Después de esto, se purificó ARNcp utilizando precipitación con etanol y se purificó adicionalmente por desalinización en columna y se liofilizó. Se volvió a suspender el ARNcp purificado en agua sin ARNasa y se mezcló con 50 pl de HA modificado con hidrazida (200 nmoles con una modificación del 10 %) y se incubó durante 1 h. Se verificó la conjugación llevando a cabo la electroforesis en gel utilizando un gel de poliacrilamida al 20 % (Fig. 10A).

Para realizar la evaluación funcional del conjugado HA-ARNcp, se seleccionaron líneas celulares C2C12. Se seleccionó ARNip para dirigirse al gen constitutivo GAPDH. Se evaluaron los niveles de disminución de genes por análisis de qPCR.

Después de una cuidadosa optimización, fue posible desarrollar un conjugado de HA-ARNcp, tal como se pudo demostrar a través del ensayo de electroforesis en gel (Figura 10A). El producto conjugado, dado su alto peso molecular, se movió lentamente en el gel en comparación con el ARNip o ARNcp sin conjugar. La comparación de la disminución de genes entre diferentes grupos demostró también que la estrategia de conjugación no es perjudicial para su bioactividad (Figura 10B). El conjugado de HA-ARNcp a concentraciones tanto de 50 como de 100 nM dio una disminución de genes similar en comparación con el control ARNip-Lipo. Este resultado es contrario a la observación general de los conjugados de HA-ARNip que no muestran la destrucción de genes sin usar un polímero catiónico como PEI (Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1201 - 1209).

Conclusiones

La molécula de ARNip de doble cadena de la invención, ARNcp, representa el primer ejemplo de suministro celular sin agente de transfección de ARNip activo utilizando nucleótidos sin modificar. Sobre la base de los hallazgos presentados, cualquier molécula de ARNip, independientemente de la secuencia, puede transformarse en un fármaco auto-suministrable incorporando nucleótidos desoxi como A o T. Este diseño de ARN demostró una captación celular y escape endosómico eficientes con una bioactividad 3 veces mayor que el ARNip convencional cuando se utilizó sin ninguna molécula vehículo. Se demostró dicha eficacia en células cancerosas y osteoblastos humanos primarios difíciles de transfectar. Otros hallazgos más indicaron que la mayor bioactividad de este diseño de ARNip se deriva presumiblemente de la selección preferencial de cadenas dentro del complejo RISC, que es el resultado de la desestabilización selectiva del extremo 5' - Fin de la cadena no codificante. Este ARNcp tampoco indujo ninguna de la toxicidad o inmunogenicidad asociada con moléculas de ARNip más grandes.

Referencias

[1] Grundberg et al., PLoS genetics 7, e1001279 (201 1).

[2] Grundberg et al., Genome research 19, 1942 (2009).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos, de los cuales al menos un nucleótido es un no-ribonucleótido, donde dicha cadena no codificante tiene un saliente 3' que es más corto que dicho saliente 3' de dicha cadena codificante y donde una porción de doble cadena de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una longitud de al menos 19 pares de base.

2. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha cadena no codificante tiene un saliente 3' de al menos dos nucleótidos, o donde dicha cadena no codificante tiene un saliente 3' de dos a cinco nucleótidos.

3. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el noribonucleótido es un desoxinucleótido.

4. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde todos los nucleótidos mencionados en dicho saliente 3' de la cadena codificante son no-ribonucleótidos, o donde todos los no riblonucleótidos en el saliente 3' de la cadena codificante son desoxinucleótidos.

5. La molécula de ARNip de doble cadena de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde al menos un nucleótido en dicho saliente 3' de dicha cadena no codificante es un no-ribonucleótido, opcionalmente, donde al menos un no-ribonucleótido en dicho saliente 3' de dicha cadena no codificante es un desoxinucleótido.

6. Una composición de transfección de célula que comprende una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde dicha composición no comprende un agente catiónico.

7. Una composición de transfección de células que comprende una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, donde dicha composición comprende un vehículo.

9. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde dicha composición es una composición farmacéutica que comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable.

10. Un método de interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula que comprende el contacto in vitro de dicha célula con una molécula de ARN pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena en ausencia de un agente catiónico, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos y donde al menos una porción de dicha cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN diana.

11. Un método de interferencia de ácido ribonucleico (ARN) específico de diana en una célula que comprende el contacto in vitro de dicha célula con una molécula de ARN pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y donde al menos una porción de dicha cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementara de la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ARN diana.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, donde se pone en contacto dicha célula con dicha molécula de ARNip de doble cadena en presencia de un vehículo.

13. Una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena para su uso en el tratamiento de una enfermedad por disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena comprende una cadena de ARN codificante y una cadena de ARN no codificante, donde dicha cadena codificante tiene un saliente 3' de cuatro a ocho nucleótidos, donde al menos una porción de una cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de dicha doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de nucleótidos de dicha secuencia de ARN diana o donde dicha molécula de ARNip de doble cadena se administra a un sujeto en ausencia de un agente catiónico.

14. Una molécula de ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip) de doble cadena para su uso en el tratamiento de una enfermedad por disminución específica de secuencia de una secuencia de ARN diana, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y donde al menos una porción de una cadena no codificante de dicha molécula de ARNip de doble cadena tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de nucleótidos de dicha secuencia de ARN diana.

15. La molécula de ácido ribonucleico (ARNip) pequeño de interferencia de doble cadena para su uso de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde dicha molécula de ARNip de doble cadena se administra con un vehículo.