KR20160112375A - siRNA의 암 표적화된 전달을 위한 비타민 기반 나노입자 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 siRNA의 암 표적화된 전달을 위한 비타민 기반 나노입자 복합체와 그 용도, 및 상기 복합체와 siRNA를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 비타민 기반 나노입자 복합체는 암세포에 대한 높은 특이성을 가지므로 암세포 특이적으로 siRNA를 전달함으로써 약리적 효과를 높일 수 있으며, 생체적합성이 높은 비타민을 이용함으로써 세포독성이 거의 없으며, 우수한 세포전달능 및 유전자 발현 억제효과를 가지므로 암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

siRNA의 암 표적화된 전달을 위한 비타민 기반 나노입자 복합체 및 이의 용도{Vitamin-based nanoassembled complex for cancer-specific siRNA delivery and use thereof}

본 발명은 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 비타민 기반 나노입자 복합체와 그 용도, 및 상기 복합체와 siRNA를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

안티센스 RNA(antisense RNA)가 상보적인 서열의 표적 mRNA를 인식하고 결합하여 mRNA의 발현을 억제하는 현상인 RNA간섭(RNA interference; RNAi)은 질병을 제어할 수 있는 유전자치료를 위한 기술로서 널리 연구되어왔다. RNA간섭 현상을 이용한 유전자치료제 개발에 가장 널리 연구되어오고 있는 siRNA(small interfering RNA)는 약 19~21개의 핵산으로 구성된 짧은 이중가닥의 RNA로서, 세포 내에서 RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합하여 상보적인 염기서열을 가진 mRNA를 특이적으로 인식하고 분해를 유도함으로써 특정 유전자가 단백질로 발현되는 것을 억제한다. siRNA는 특정 유전자에 대한 특이성이 높아 선택적 발현억제가 가능하고, 안티센스 올리고핵산에 비하여 적은 양으로도 유전자발현을 저해할 수 있기 때문에 세포독성이 적어 유전자 발현억제 수단 및 유전자 치료제로 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러나 siRNA는 생체 내에서 핵산분해효소(nuclease)에 의해 쉽게 분해되어 짧은 반감기를 가지는 불안정성, 인산기를 가지고 있어 생체 내에서 음전하를 띠고 있기 때문에 세포막을 통해 세포질로 전달되는데 용이하지 않다는 큰 단점을 가지고 있다. 이러한 문제들을 해결하기 위해 siRNA에 대한 다양한 화학적 변형(chemical modification)을 통해 siRNA의 체내 안정성을 높이기 위한 연구와 siRNA를 체내로 안정하고 효율적으로 전달하고자 하는 전달 시스템에 대한 연구가 많이 수행되고 있다.

siRNA를 이용한 유전자치료제 개발에 있어서 가장 큰 문제인 siRNA 전달 시스템은 크게 바이러스를 이용한 시스템과 비바이러스성 전달체로 나눌 수 있다. 바이러스 벡터를 이용한 siRNA 전달체는 유전자의 전달효율이 뛰어나지만 전달하는 유전자의 크기에 제한이 있으며, 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 인해 면역반응을 유발할 수 있어 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제점이 있다. 이러한 바이러스성 siRNA 전달체의 문제점을 보완하기 위해 개발되어온 비바이러스성 전달체로는 양이온성 지질과 양이온성 고분자들이 가장 많이 연구되어왔으며, 바이러스 입자와 유사하게 만든 SNALP(stable nucleic acid-lipid particle), PEI(polyethylenimine) 등이 높은 siRNA 전달효율을 보임으로써 널리 사용되고 있다.

또한 최근에는 특정 세포 또는 조직으로 siRNA를 전달하기 위해 표적 지향성을 가진 리간드(펩타이드, 단백질, 항체, 다당류 등)를 접합시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이는 siRNA의 체내 안정성 증가, 부작용 감소 및 높은 약리효과를 나타낼 수 있다.

한편, 비타민(vitamins)은 필수적인 생체분자로서, 정상세포에 비하여 다양한 암세포의 표면에 과발현되어 있다고 보고되어왔다. 이에 따라 비타민을 이용하여 암세포에 특이적으로 핵산 또는 약물을 전달하기 위한 전달체 개발이 이루어지고 있다. 예를 들면, 엽산(비타민 B₉) 수용체는 다양한 암세포에 과발현되어 있어 암세포의 엽산수용체를 타겟으로하여 엽산을 결합시킨 유전자 전달 벡터 개발연구가 보고된바 있고, 암세포에 약물을 특이적으로 전달하기 위해 비타민 B₂가 결합된 dendrimer platform 개발이 보고된 바 있으며, 가장 최근에는 암세포를 타겟팅하는 비타민 B₆가 결합된 핵산 전달체를 이용하여 암 치료 효능이 확인된바 있다. 따라서 암세포 특이적 핵산 또는 약물 전달능이 향상된 새로운 전달체의 개발이 매우 주요한 관심사가 되고 있으나, 아직 이에 대한 연구가 더욱 필요한 실정이다.

본 발명자들은, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 비타민 B가 결합된 비타민 기반 나노입자 복합체의 siRNA의 세포내 유입 촉진 및 표적 유전자의 발현 억제를 확인하였으며 암세포 및 종양 특이적인 siRNA 전달능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 siRNA의 암 표적화된 전달을 위한 비타민 기반 나노입자 복합체 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 비타민 기반 나노입자 복합체 및 상기 복합체에 결합된 siRNA를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [구조식 1]로 이루어진, 비타민 기반 나노입자 복합체를 제공한다.

[구조식 1]

A1-L-A2

A1은 종양 세포에 특이적으로 결합하는 비타민 B이고,

A2는 화학식 1로 표시되는 양이온성 지질이고,

L은 A1과 A2간의 링커를 나타낸다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예로, 상기 비타민 B는 비타민 B₂, B₆, 및 B₇으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 링커는 아마이드(amide), 카르밤산(carbamate), 및 트리아졸(triazole)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 복합체는 화학식 2 내지 화학식 4로 표시되는 것일 수 있다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 복합체는 하이드로겔 형태인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 비타민 기반 나노입자 복합체 및 상기 복합체에 결합된 siRNA를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 복합체와 siRNA는 5:1 내지 15:1의 N/P ratio로 결합되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 암 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명의 비타민 기반 나노입자 복합체는 암세포에 대한 높은 특이성을 가지므로 암세포 특이적으로 siRNA를 전달함으로써 약리적 효과를 높일 수 있으며, 생체적합성이 높은 비타민을 이용함으로써 세포독성이 거의 없으며, 우수한 세포전달능 및 유전자 발현 억제효과를 가지므로 암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, 본 발명의 실시예 2에서 합성한 VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 및 VB7의 화학식을 나타낸 것이다.
도 2는, Vitagel의 세포독성을 검증하기 위해 MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에 N/P ratio 7.5:1 또는 12.5:1 조건으로 형성된 VBs(VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, VB7)/VEGF-siRNA 결합체를 트랜스펙션한 후 WST-1 assay를 수행한 결과이다.
도 3은, VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 및 VB7의 siRNA 결합능을 검증하기 위해 gel retardation assay를 수행한 결과이다.
도 4A는, VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 및 VB7을 증류수에 용해시켜 하이드로겔 형성 여부를 확인한 결과이고, 도 4B 내지 도 4K는, 형성된 하이드로겔 또는 하이드로겔/VEGF-siRNA 결합체를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 결과이다.
도 5는, VB/siRNA 결합체의 세포 유입효율을 검증하기 위해 MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에 VBs(VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 또는 VB7)/Fl-VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 후 cellular uptake assay를 수행한 결과이다.
도 6은, VB/siRNA 결합체의 세포 유입효율을 검증하기 위해 VBs(VB2, VB4, VB6, 또는 VB7)/Fl-VEGF-siRNA 결합체를 사람 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 트랜스펙션 한 후 공초점현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은, VB/siRNA 결합체의 세포 유입 기전을 확인하기 위해 사람 유방암 세포주인 MCF7을 대사 억제제(metabolic inhibitors) 및 엔도사이토시스 억제제(endocytic inhibitor)들과 각각 예비배양한 후 VB7을 이용하여 F1-VEGF-siRNA를 트랜스펙션 한 후 cellular uptake assay를 수행한 결과이다.
도 8은, Vitagel을 이용한 siRNA 전달 효율을 검증하기 위해 MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에 VBs(VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 또는 VB7)를 이용해 VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 후 ELISA 측정을 통해 세포 배양 배지 내 VEGF 단백질의 감소 여부 확인한 결과이다.
도 9는, 혈청을 함유한 배지에서 VB/siRNA 결합체의 안정성을 검증하기 위해 60% FBS가 함유된 배지에서 각각의 VB2, VB5, VB6, 또는 VB7과 VEGF-siRNA 결합체를 37℃에서 각각 0, 30, 90분 동안 배양한 후에 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 수행한 결과이다.
도 10A는, Vitagel의 siRNA 전달효율 검증을 위해 MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에 VB2, VB6, 또는 VB7을 이용하여 VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 후 RT-PCR을 통해 VEGF mRNA의 감소여부를 확인한 결과이며, 도 10B는, ex vivo 실험을 통해 종양 특이적인 VB7의 siRNA 전달효율을 검증한 결과이다.

본 발명은 생체적합분자인 비타민 B에서 유도된 암 특이적 siRNA 전달능을 가지는 비타민 기반 나노입자 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.

이에, 본 발명은 하기 [구조식 1]로 이루어진, 비타민 기반 나노입자 복합체를 제공한다.

[구조식 1]

A1-L-A2

A1은 종양 세포에 특이적으로 결합하는 비타민 B이고, A2는 화학식 1로 표시되는 양이온성 지질이고, L은 A1과 A2간의 링커를 나타낸다.

[화학식 1]

본 발명에서 사용되는 용어, "암"이란, 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)과 동일한 의미로도 사용되며, 고체 종양 및 혈액 종양(blood born tumor)을 포함하되 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA(small interfering RNA)"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법, 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

본 발명의 상기 비타민 B는 비타민 B₂-B₇으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 B₂, B₆, 및 B₇으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 링커는 아마이드(amide), 카르밤산(carbamate), 및 트리아졸(triazole)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 비타민 기반 나노입자 복합체는 화학식 2 내지 화학식 4로 표시되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 하이드로겔 형태일 수 있다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

본 발명의 실시예에서는 상기 비타민 기반 나노입자 복합체를 합성하여 세포독성, 세포 이입효율, 및 암세포 특이적 siRNA 전달능 등을 검증함으로써 siRNA 전달체로써 비타민 기반 나노입자 복합체의 이용가능성을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 비타민 B₂-B₇이 각각 결합된 비타민 기반 나노입자 복합체인 vitagel VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 및 VB7을 합성하였으며, VEGF-siRNA와 반응시켜 결합체를 형성한 후 다양한 세포주에 트랜스펙션하여 세포독성이 거의 유발되지 않음을 확인하였다(실시예 2 및 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 실시예 2에서 합성한 각 vitagel들의 siRNA와 결합능을 검증한 결과 VB4를 제외한 VB2, VB3, VB5, VB6, 및 VB7의 경우에 각각 5, 7, 7, 6, 및 4의 N/P ratio 이상에서 siRNA와 결합할 수 있음을 확인하였고, 또한 VB4를 제외한 VB2, VB3, VB5, VB6, 및 VB7은 증류수에 용해시켰을 때 하이드로겔을 형성함을 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 각 vitagels 중에서 VB2, VB6, 또는 VB7과 siRNA결합체의 경우 높은 세포 유입효율을 보이며, 정상세포주에 비하여 암세포에서 더 높은 세포 유입효율을 보임을 확인하였다. 이러한 VB2, VB6, 또는 VB7의 높은 세포 유입효율은 초록 형광을 나타내는 F1-VEGF-siRNA를 이용하여 트랜스펙션 한 후 공초점 현미경으로 관찰함으로써 다시 한 번 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, VB7을 이용한 drug inhibitory assay를 통해 클라트린(clathrin) 매개 엔도사이토시스(endocytosis)와 마크로피노사이토시스(macropinocytosis)가 VBs/siRNA 결합체의 세포내 유입 경로일 수 있음을 확인하였다(실시예 7 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 다양한 세포주에 Vitagel을 통해 VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 후 VEGF의 발현량을 확인함으로써 vitagel이 높은 siRNA 전달능을 가지며, 혈청의 존재하에서도 VB/siRNA 결합체가 안정하게 존재함을 확인하였다. 또한 세포수준에서 가장 높은 siRNA 전달능을 보인 VB7으로 동물실험을 수행함으로써 종양 특이적으로 siRNA를 전달함을 확인하였다(실시예 8 내지 10 참조).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 비타민 기반 나노입자 복합체 및 상기 복합체에 결합된 siRNA를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 비타민 기반 나노입자 복합체 및 상기 복합체에 결합된 siRNA를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 시약준비

본 실시예에서 사용한 모든 화학물질(chemical)은 Sigma-Aldrich, Fluka, TCI, Lancaster, Proligo, 또는 Glen Research에서 구입하였으며, 추가적인 정제과정 없이 사용하였다.

1-2. siRNA 서열

본 발명의 실시예에서 사용한 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 발현을 저해하는 VEGF-siRNA의 서열은 하기 표 1과 같으며, M-biotech(South korea)에서 구입하였다.

siRNA	서열
Antisense strand(AS) VEGF-siRNA	5'-GAU CUC AUC AGG GUA CUC CdTdT-3'
Sense strand(SS) VEGF-siRNA	5'-GGA GUA CCC UGA UGA GAU CdTdT-3'
Fluorescein-tagged AS VEGF-siRNA	5'-5,6-FAMGAU CUC AUC AGG GUA CUC CdTdT-3'
Scrambled AS VEGF-siRNA	5'-AAA UUC CCG CGU UAC GCG UdTdT-3'
Scrambled SS VEGF-siRNA	5'-ACG CGU AAC GCG GGA AUU UdTdT-3'

1-3. 하이드로겔 형성

Vitagel VB2, VB3, VB5, VB6, 및 VB7을 각각 1.8, 3.0, 3.0, 2.0, 및 0.5 중량비(wt%)로 하여 증류수에 녹인 후 80℃까지 가열하였다. 이후 상온(room temperature)에서 식히면서 움직이지 않도록 고정시켰다. 각 용기를 위아래로 흔들어 하이드로겔(hydrogel)이 형성되었는지 확인하였고, 모든 VB 하이드로겔은 적어도 4주 동안은 상온에서 안정하였다.

1-4. 세포배양(cell culture)

본 발명의 실시예에서 사용된 모든 세포 즉, HeLa(사람 자궁경부암 유래 세포주), MCF7(사람 유방암 유래 세포주), Huh7(사람 간암 유래 세포주), MDA-MB-231(사람 유방암 유래 세포주), 및 MRC5(정상 폐 섬유아세포주)는 10% FBS(fetal bovine serum) 또는 FCS(fetal calf serum), 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/㎖, 및 페니실린(penicillin) 100 U/㎖이 포함된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지 또는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 상기 세포배양에 필요한 배지 및 시약들은 Hyclone-Themo Scientific(Logan, UT)에서 구입하였으며, 하기 실시예에서 트랜스펙션 수행시 사용한 Opti-MEM 배지는 Invitrogen-Gibco (Carlsbad, CA)에서 구입하였다.

1-5. 세포 유입효율 분석(Cellular uptake assay)

실시예 1-3의 방법으로 배양한 모든 세포주에 혈청이 제거된 배지로 vitagel(VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 또는 VB7)을 이용하여 F1-VEGF-siRNA를 트랜스펙션(transfection) 하였으며, 대조군으로 트랜스펙션 시약을 사용하지 않고 F1-VEGF-siRNA를 단독으로 처리하거나 lipofectamine 2000을 사용하여 F1-VEGF-siRNA를 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션 6시간 후 배지를 제거하고 세포를 DPBS(1 x 330 ㎕/well)으로 수세한 후 트립신(trypsin, 150 ㎕/well)을 3분간 세포에 처리하였다. DPBS(150 ㎕/well)를 well에 추가로 넣어준 후 트립신에 의해 부유된 세포들을 모두 회수하여 3000~4000 rpm에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 원심분리에 의해 모아진 세포 펠렛에 DPBS(300 ㎕/e-tube)를 넣고 1분 동안 voltexing하여 세포 펠렛 풀어주며 수세한 후 다시 3000~4000 rpm에서 원심분리하였다. DPBS를 모두 제거한 후 상기와 같은 수세과정을 총 3번 반복한 후 각 세포 펠렛에 lysis buffer(70 ㎕/well)를 넣고 25℃에서 20분 동안 voltexing한 후 3000~4000 rpm에서 원심분리하였다. 이후 상층액(50 ㎕/e-tube)을 검은 폴리스티렌(polystyrene) 재질의 96well 플레이트의 각 well에 옮긴 후 VICTOR multilabel plate reader(PerkinElmer)를 이용하여 485/535 nm에서 흡광도를 측정하였다.

1-6. Drug inhibition assay

사람 유방암 세포주인 MCF-7을 혈청이 포함되지 않은 MEM 배지와 37℃, CO₂ 조건하에서 아지드화나트륨(NaN₃, 0.1%)/2-디옥시글루코스(2-deoxyglucose, 50 mM), 제니스테인(genistein, 200 mM), 또는 아밀로라이드(amiloride, 200 ㎍/㎖)와 1시간 동안 예비배양하거나 메틸-베타-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin, 5 mM) 또는 클로르프로마진(chlorpromazine, 10 ㎍/㎖)과 15분 동안 예비배양 하였다. 이후 DPBS로 세포를 수세한 후 VB7를 이용하여 F1-VEGF-siRNA(100 nM)를 트랜스펙션(몰비 1:500)하였다. 3시간 후 세포를 다시 DPBS로 수세하고 트립신을 처리하여 플레이트에서 세포를 떼어낸 후 실시예 1-5와 동일한 과정을 통해 흡광도를 측정하여 형광강도(fluorescence intensity)를 측정하였다.

1-7. WST-1 분석(세포 생존능 분석)

Vitagels와 VEGF-siRNA(100 nM)를 혼합(몰비= 300:1 또는 500:1 또는 N/P ratio=7.5:1 또는 12.5:1)하여 세포에 트랜스펙션하고 37℃, CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS(3 x 100 ㎍/well)로 세포를 수세한 다음 페놀레드(phenol red)가 포함되지 않은 배지에 1 mg/㎖의 WST-1를 넣고 용해시킨 WST-1 시약(100 ㎕)을 각 well에 넣어주고 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 UVM 340 microplate reader(ASYS)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

1-8. VEGF ELISA

실시예 1-3의 방법으로 배양한 모든 세포주에 혈청이 제거된 배지로 vitagel(VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 또는 VB7)을 이용하여 VEGF-siRNA를 트랜스펙션 하였으며, 대조군으로 트랜스펙션 시약을 사용하지 않고 VEGF-siRNA를 단독으로 처리하거나 lipofectamine 2000을 사용하여 VEGF-siRNA를 트랜스펙션 하였다. 37℃, CO₂ 조건하에서 6시간 동안 배양한 후 DPBS(3 x 330 ㎕/well)로 세포를 수세하고 10% FBS 또는 FCS가 포함된 DMEM 또는 RPMI 배지(330 ㎕/well)를 넣고 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 배지를 모아 QIA51 VEGF ELISA Kit(Human, Calbiochem)를 이용하여 배지내의 VEGF 양을 측정하였다.

1-9. 중합효소연쇄반응

VEGF-siRNA가 트랜스펙션된 세포를 PBS(phosphate buffered saline)으로 수세한 후 TRIzol(Invitrogen) 1 ㎖을 처리하여 세포를 용해시킨 후 total RNA를 분리하였다. RNA 1 ㎍에 대하여 Improm-IITM Reverse Transcription System(Promega)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 역전사중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)을 수행하여 cDNA를 합성하였다. VEGF mRNA 증폭을 위해, 하기 표 2의 VEGF 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 각 샘플간 mRNA 양을 보정하기 위해 하기 표 2의 GAPDH 특이적 프라이머를 사용하여 함께 증폭하였다. PCR 산물에서 VEGF mRNA 양은 EtBr(ethidium bromide)이 첨가된 1.5% 아가로오즈 겔(agarose gel)을 이용해 전기영동(100V, 30분)을 수행하여 확인하였다.

프라이머(primer)	방향	서열
VEGF	Forward(순방향)	5′-atgaactttctgctgtcttgggt-3′
	Reverse(역방향)	5′-tcaccgcctcggcttgtcaca-3′
GAPDH	Forward(순방향)	5′-gagtcaacggatttggtcgt-3′
	Reverse(역방향)	5′-ttgattttggagggatctcg-3′

1-10. Ex Vivo imaging

사람 유방암 세포주인 MDA-MB-231(5 x 10⁶ cells/mouse)을 암컷 BALB/c nu/nu 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하에 주입하여 종양이 형성되도록 하였다. 세포주입 2일 후 각 마우스를 무작위로 두 그룹 즉, F1-VEGF-siRNA를 단독으로 주입하는 그룹 또는 몰비 500:1로 VB7를 이용하여 F1-VEGF-siRNA(siRNA: 0.1 mg/kg)를 주입하는 그룹으로 나누었다. siRNA는 이미징으로 시각화하기 위해 녹색형광을 나타내도록 플루오로세인(fluorescein) 유도체인 5,6-FAM과 연결된 siRNA를 사용하였다. 첫 번째 그룹에는 F1-VEGF-siRNA를 단독으로 꼬리정맥으로 투여하였고, 두 번째 그룹은 VB7과 혼합된 VB7/F1-VEGF-siRNA 결합체를 꼬리정맥으로 주입하였다. 1시간 후 각 마우스를 경추탈골법으로 안락사시키고 장기를 적출한 후 IVIS (PerkinElmer, USA)를 이용하여 바로 형광 이미지를 촬영하였다.

실시예 2. VBs(vitamin-based cationic clickable bolaamphiphiles) 합성

본 발명에서는 아마이드(amide), 카르밤산(carbamate), 및 트리아졸(triazole) 연결기를 통해 비타민 B₂-B₇이 결합된 VBs(vitamin-based cationic clickable bolaamphiphiles, vitagels)을 합성하였으며, 상기 VBs는 양이온의 극성을 띠는 아미노 헤드기(amino head group)과 소수성 체인(hydrophobic chain)으로 구성되어있으며, 도 1에 그 화학구조를 나타내었다. Acetylenated 비타민 B 유도체들을 양이온성 지질(cationic lipid)의 아자이드(azide) 유도체와 결합시켜 각각의 전구체 VB2', VB3', VB5', VB6', VB7'을 합성하였다. 또한 비타민 B₄의 아데닌(adenine)과 양이온성 지질의 카르복실산(carboxylic acid) 유도체와의 결합을 통해 전구체 VB4'를 합성하였다. 이후 전구체들의 보호기(protecting group)를 떼어냄으로써 각각의 vitagel VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 및 VB7을 얻을 수 있었다.

실시예 3. Vitagels의 세포독성 검증

실시예 2의 방법으로 합성된 vitagels의 세포독성을 검증하기 위해 각각 다른 N/P ratio(7.5:1 또는 12.5:1) 또는 몰비(300:1 또는 500:1) 조건으로 VBs(VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 또는 VB7)와 VEGF-siRNA를 혼합한 후 MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에 트랜스펙션 하였으며, 실시예 1-7의 방법에 따라 WST-1 assay를 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 5가지 세포주 모두에서 VB2 내지 VB7을 처리한 경우 모두 세포생존능(cell viability)이 대략 85% 이상인 것으로 보아 세포독성이 유도되지 않음을 확인하였다. 또한 모든 VB의 경우 siRNA를 단독으로 세포에 처리한 경우(Nat(-))와 세포생존능이 유사하게 나타났으며, 특히 시중에 트랜스펙션 시약(transfection reagent)로서 널리 상용화되고 있는 lipofectamine 2000을 사용하여 siRNA를 트랜스펙션한 경우(Nat(+))보다 세포생존능이 높게 나타났다. 따라서 상기 vitagels 모두 세포독성이 낮아 생체적합성이 매우 높은 물질임을 확인하였다.

실시예 4. Vltagels의 siRNA 결합능 검증

각 VBs의 siRNA와의 결합능을 검증하기 위해 gel retardation assay를 수행하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Vitagel VB2, VB3, VB5, VB6, 및 VB7의 경우 각각 N/P ratio 5, 7, 7, 6, 및 4 이상부터 siRNA와 결합체를 형성하였으나, VB4는 N/P ratio 8까지도 siRNA와 결합체를 형성하지 않음을 확인하였다.

실시예 5. Vitagels의 하이드로겔 형성 확인

실시예 1-3의 방법으로 VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 및 VB7의 하이드로겔 형성능을 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, vitagel VB2와 VB7은 투명한 하이드로겔을 형성하였고, 반면에 VB3, VB5, 및 VB6는 불투명한 하이드로겔을 형성하였다. 반면에 VB4는 낮은 농도에서도 수용액에 용해되지 않음을 확인하였다.

또한 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM)을 이용하여 siRNA가 존재하거나 존재하지 않을 때 vitagel의 하이드로겔에 의해 형성된 다공성의 초분자적 구조를 관찰하였다. 그 결과, 도 4B 및 도 4D 내지 도4G에 나타낸 바와 같이, siRNA가 존재하지 않는 각각의 VB2, VB3, VB5, VB6, 및 VB7의 다공성 겔은 조직의 세포외 기질과 유사하게 길게 늘어나있고 얽힌 나선형의 나노섬유가 관찰되었다. 대조적으로, 도 4C 및 도 4H 내지 도 4K에 나타낸 바와 같이, 각각의 VB2, VB3, VB5, VB6, 또는 VB7과 siRNA의 결합체(몰비 500:1)로 이루어진 다공성 겔은 나노섬유로 응축된 작은 파티클의 siRNA가 관찰되었다. 상기 vitagel의 TEM 이미지를 통해 vitagel이 siRNA와의 효율적인 결합체 형성과 전달을 위해 얇은 판 모양의 구조(lamellar-type structure)를 이루는 것을 확인하였다.

상기 실시예 4 및 실시예 5의 유사한 결과를 통해 vitagels의 초분자적 하이드로겔화(supramolecular hydrogelation)가 siRNA와 vitagel의 결합체 형성에 도움을 줄 수 있는 폴리머와 유사한 구조적 특성을 제공하는 것을 알 수 있다.

실시예 6. 세포수준에서 siRNA의 유입효율 검증

6-1. siRNA의 세포 유입효율 분석

세포수준에서 VBs/siRNA 결합체가 세포 내로 잘 유입되는지 검증하기 위해 초록 형광을 나타내는 fluorescein-tagged vascular endothelial growth factor(VEGF) siRNA(Fl-VEGF-siRNA)를 이용하여 실시예 1-5의 방법으로 각각 MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에서 cellular uptake assay를 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, vitagel(VB2, VB6, 또는 VB7)/Fl-VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 경우 N/P rario 7.5:1 및 12.5:1에서 정상 세포주인 MRC5보다 암세포주(HeLa, MCF7, Huh7, MDA-MB-231)에서 이입효율이 2배 내지 3배 더 높은 것을 확인하였다. 또한 N/P ratio가 7.5:1인 경우에 비해 12.5:1일 때 세포 유입 효율이 더 높게 나타났다. 게다가 몰비 500:1(N/P ratio=12.5:1)로 VB7/Fl-VEGF-siRNA 결합체를 트랜스펙션 한 경우에는 같은 농도의 siRNA를 사용하였을 때 lipofectamine 2000을 사용한 경우와 거의 유사한 세포 유입효율을 나타내었다. 대조적으로, VB3, VB5, 및 VB4를 이용하여 Fl-VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 경우에는 세포 유입효율에 있어서 정상세포주와 암세포주에 대한 선택성(selectivility)을 보이지 않았다.

6-2. 공초점현미경 이미지 분석

vitagels/siRNA 결합체의 세포 이입효율을 형광을 통한 이미지로 관찰하기 위해, 몰비 500:1로 혼합한 VBs(VB2, VB4, VB6, 또는 VB7)/Fl-VEGF-siRNA(100 nM) 결합체를 MDA-MB-231에 트랜스펙션 한 후 공초점현미경(confocal microscope)을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Fl-VEGF-siRNA를 단독으로 세포에 처리한 경우(Nat(-))에는 siRNA가 세포내로 전달되지 않은 것을 확인하였다. 반면에, 실시예 6-1의 결과와 유사하게 VB2, VB6, VB7을 이용하여 siRNA를 트랜스펙션한 경우 VB4를 이용한 경우에 비하여 세포내 이입 효율이 더 뛰어남을 확인하였다. VB4는 다른 vitagel들과 화학적인 구조가 유사함에도 불구하고 siRNA 전달효율에 차이를 나타내는 것으로 보아 실시예 5에서 얻은 결과처럼 하이드로겔 형성능이 VB의 siRNA 결합과 이입효율에 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

또한, lipofectamine 2000을 이용하여 siRNA를 트랜스펙션한 경우(Nat(+))에는 대부분의 미립자로 이루어진 캐리어(particulate carrier)와 유사하게 siRNA가 세포의 엔도좀(endosome)에 punctuate 형태로 축적되어있고, 세포의 세포질뿐만 아니라 핵에서도 관찰되었다. 반면에 Vitagel을 이용한 경우에는 폴리머기반 나노물질을 트랜스펙션 시약으로 사용하는 경우와 유사하게 siRNA가 엔도좀에 축적되어있지 않고, 세포질에 퍼져있는 형태를 나타내었다.

실시예 7. Vitagel / siRNA 결합체의 세포내 유입 기전 검증

Vitagel VB7에 의한 Fl-VEGF-siRNA의 세포내 유입 기전을 알아보기 위해 실시예 1-6의 방법으로 사람 유방암 세포주인 MCF7를 대사 억제제(metabolic inhibitors) 및 엔도사이토시스 억제제(endocytic inhibitor)와 예비배양한 후 실시예 1-5의 방법으로 cellular uptake assay를 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, VB7을 이용하여 Fl-VEGF-siRNA를 트랜스펙션 한 경우(VB7/Fl-VEGF-siRNA)의 세포 유입효율을 100%로 보았을 때 세포를 트랜스펙션 전 아지드화나트륨(NaN₃)/2-디옥시글루코스(2-deoxyglucose; 2-DOG)와 예비배양한 경우에는 VB7/Fl-VEGF-siRNA의 세포 유입효율이 약 76%정도 감소하였다. 이는 VB7/Fl-VEGF-siRNA의 세포 유입이 에너지 의존적 과정임을 의미한다. 세포를 methyl-β-cyclodextrin(M-b-CD)와 예비배양한 경우에는 VB7/Fl-VEGF-siRNA의 세포 유입효율이 약 45% 정도 감소하였다. 이는 세포내 유입이 클라트린(clathrin)과 포낭(caveolae) 매개 경로에 의존적임을 의미한다. 보다 구체적으로 상기 두가지 경로를 검증하기 위해 세포를 클로르프로마진(chlorpromazine; Chlor)과 예비배양한 경우 VB7/Fl-VEGF-siRNA의 이입효율이 약 68% 정도 크게 감소하였다. 이를 통해 클라트린(clathrin) 매개 엔도사이토시스(endocytosis)가 VB7/siRNA의 내재화 경로중 하나임을 알 수 있다. 반면 genistein과의 예비배양은 VB7/Fl-VEGF-siRNA의 세포 이입효율에 영향을 미치지 않았으므로 세포내 유입이 포낭(caveolae) 매개 엔도사이토시스 경로를 통해 일어나지 않음을 의미한다. 마지막으로 아밀로라이드(amilorides)와 예비배양한 경우에는 VB7/Fl-VEGF-siRNA의 세포 유입효율이 약 64% 감소하였다. 이를 통해 마크로피노사이토시스(macropinocytosis)가 siRNA/VB7의 내재화경로 중 하나일 수 있음을 확인하였다.

실시예 8. Vitagels에 의한 siRNA의 전달효율 검증

Vitagels에 의한 siRNA 전달효율을 검증하기 위해 MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에 VBs(VB2, VB3, VB4, VB5, VB6, 또는 VB7)를 이용하여 VEGF-siRNA를 트랜스펙션(N/P ratio= 12.5:1 또는 몰비=500:1)하였다. 24시간 이후 VEGF-siRNA의 전달효율을 검증하기 위해 실시예 1-8의 방법으로 세포에서 방출된 배지 내 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 단백질 양을 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, VB2, VB6, 및 VB7을 이용하여 VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 경우 암세포주(HeLa, MCF7, Huh7, MDA-MB-231)에서 VEGF의 발현이 각각 75%, 65%, 및 85%정도 감소함을 확인하였고, VB7을 이용하여 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 경우 VEGF의 발현이 감소하지 않은 것으로 보아 상기 VEGF의 발현 감소는 VEGF 특이적 siRNA의 기능에 의한 것임을 확인하였다. 반면 정상세포주인 MRC5에서는 동일한 조건에서 VEGF의 발현이 28%, 30%, 및 35% 정도 감소하였다. 상기 결과를 통해 비타민 B2, B6, 및 B7 유도체를 기반으로 한 LMWGs(low-molecular-weight hydrogelators, vitagels)의 siRNA 전달효율을 확인하였고, 상기 조건에서 정상세포에 비하여 암세포주에서 약 2 내지 3배 siRNA 전달효율이 높음을 확인하였다.

실시예 9. FBS 함유 배지에서 siRNA 결합체의 안정성 검증

우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 함유 배지에서 Vitagel/siRNA 결합체의 안정성을 검증하기 위해 60% FBS가 함유된 배지에서 각각의 VB2, VB5, VB6, 또는 VB7과 siRNA결합체를 37℃에서 각각 0, 30, 90분 동안 배양한 후에 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 수행하였다. 또한 온전한 siRNA를 Vitagel/siRNA 결합체로부터 분리시키기 위해 헤파린(heparin)을 처리하였다. 그러나 헤파린을 처리한 경우 온전한 siRNA가 검출되지 않았다.

전기영동 수행 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 VB2, VB5, VB6, 및 VB7의 경우 모두 혈청 존재시 siRNA 분해(enzymatic degradation)를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 10. 동물수준에서 Vitagels에 의한 siRNA의 전달효율 검증

10-1. RT-PCR을 통한 vitagel 매개 siRNA의 전달효율 확인

실시예 1-9의 방법으로 RT-PCR 및 PCR 수행 후 아가로오즈 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 수행함으로써 VB2, VB6 및 VB7에 의한 siRNA 전달 효율을 다시 한 번 검증하였다. MRC5, HeLa, MCF7, Huh7, 및 MDA-MB-231 세포주에 VB2, VB6, 또는 VB7를 이용하여 VEGF-siRNA(100 nM의)를 트랜스펙션(N/P ratio= 12.5:1)하였다.

각 세포주에서 VEGF mRNA양을 확인한 결과, 도 10A에 나타낸 바와 같이, 각 샘플간의 GAPDH mRNA의 양은 거의 동일하였으며, VEGF-siRNA만을 단독으로 처리한 경우(Nat(-))에는 VEGF mRNA양이 아무것도 처리하지 않은 세포(CTL)의 mRNA와 동일하였다. 반면에 VB2, VB6, 또는 VB7을 이용하여 VEGF-siRNA를 트랜스펙션한 경우에는 VEGF mRNA가 현저히 감소하였으며, 특히 VB7을 이용한 경우에는 lipofectamine 2000을 이용하여 트랜스펙션한 경우(Nat(+))와 거의 유사한 VEGF silencing 효과를 보였다.

10-2. Ex Vivo 실험을 통한 VB에 매개 siRNA의 전달효율 확인

상기 실시예 10-1의 결과를 통해 세포수준에서 VB7을 이용하였을 때 가장 높은 VEGF silencing 효과를 확인하였으므로 siRNA 전달체로써 VB7의 이용가능성을 평가하기 위해 실시예 1-10의 방법으로 동물실험을 수행한 후 ex vivo imaging system(IVIS spectrum, PerkinElmer, USA)를 이용하여 형광이미지를 촬영하였다. 주요 장기(간, 비장, 신장)의 형광세기는 각 장기의 무게로 보정하였으며, 3시간 이내에 종양내의 VB7에 의한 siRNA 유입효율을 다른 주요 장기들과 비교하였다.

그 결과, 도 10B에 나타낸 바와 같이, i부터 iv까지 각각 간, 비장, 신장, 종양을 관찰하였을 때 Fl-VEGF-siRNA를 단독으로 주입한 경우와 달리 VB7을 이용하여 상기 siRNA를 주입한 경우에는 종양에 특이적으로 siRNA가 전달되었음을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

1. 하기 [구조식 1]로 이루어진, 비타민 기반 나노입자 복합체.
   [구조식 1]
   A1-L-A2
   A1은 종양 세포에 특이적으로 결합하는 비타민 B이고,
   A2는 화학식 1로 표시되는 양이온성 지질이고,
   L은 A1과 A2간의 링커를 나타낸다.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 비타민 B는 B₂, B₆, 및 B₇으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 비타민 기반 나노입자 복합체.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 링커는 아마이드(amide), 카르밤산(carbamate), 및 트리아졸(triazole)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 비타민 기반 나노입자 복합체.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 복합체는 화학식 2 내지 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는, 비타민 기반 나노입자 복합체.
   [화학식 2]
   

   

   
   [화학식 3]
   

   

   
   [화학식 4]
   

   

   
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 복합체는 하이드로겔 형태인 것을 특징으로 하는, 비타민 기반 나노입자 복합체.
   
6. 제 1 항의 나노입자 복합체 및 상기 복합체에 결합된 siRNA를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 복합체와 siRNA는 5:1 내지 15:1의 N/P ratio로 결합되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.

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