JP2013514089A - 遺伝子発現の特異的阻害のためのダイサー基質剤及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多数の用語の一般的定義を当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and MolecularBiology
(2nd ed. 1994);Cambridge Dictionary of Science and
Technology (Walker ed., 1988);Glossary of genetics,
5thEd., R. Rieger et al., (eds.), Springer Verlag (1991);及びHale & Marham,Harper CollinsDictionary ofBiology (1991)。本明細書で使用される以下の用語は、特に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531 ;及びYing et
al., 2004, Gene, 342, 25-28参照)。一実施態様において、本発明のミクロRNAは、miRNA分子のセンス鎖(例えば第一の鎖)又はセンス領域と、アンチセンス鎖(例えば第二の鎖)又はアンチセンス領域との間、又はmiRNAのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子(例えば標的mRNA)との間に、部分的相補性(即ち100%未満の相補性)を有する。例えば、部分的相補性は、二本鎖核酸分子構造内の様々なミスマッチ又は非塩基対ヌクレオチド(例えばヌクレオチドバルジ等の1、2、3、4、5個又はそれ以上のミスマッチ又は非塩基対ヌクレオチド)を含んでもよく、これは、センス鎖又はセンス領域とmiRNAのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間、又はmiRNAのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。
A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照)。厳密な温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むであろう。50未満の塩基対の長さを有すると予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点(Tm)よりも5〜10℃低い必要があり、Tmは以下の等式に従って決定される。18未満の塩基対の長さのハイブリッドの場合、Tm(℃)=2(A+T塩基の#)+4(G+C塩基の#)。長さ18〜49塩基対のハイブリッドの場合、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)、式中、Nは、ハイブリッドの塩基数であり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である(l×SSCに関する[Na+]=0.165M)。例えば、ハイブリダイゼーション測定緩衝液は、表1に示される。
表1
Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975);Ausubelら(Current Protocols in MolecularBiology, Wiley Interscience, New
York, 2001);Berger and Kimmel (Antisense to Molecular
Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York);及びSambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New Yorkに記載されている。
表2 鎖位置に関する付番の慣習の記載
Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem.
Soc, 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 121:2323-2324
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J. Am. Chem. Soc,122(6):1001~1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc,
121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998);
Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 10506-10511 (1997);Das et al., J.
Chem. Soc, Perkin Trans., 1 : 197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc,
Perkin Trans., 1: 1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc,
122(32):7621-7632 (2000); O’Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002);
Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc, 117: 10434-10442 (1995);及び米国特許第6,218,108号)。塩基類似体は、普遍的塩基でもあり得る。
ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov l l;23(21):4363-70;Loakes et al.,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in
primers for DNA sequencing and PCR.Nucleic Acids Res. 1995 Jul l
l;23(13):2361-6;Loakes and Brown, 5-Nitroindole as an
universal base analogue.Nucleic Acids Res. 1994 Oct l l ;22(20):4039-43)。
Science 1991 Jul 12;253(5016): 191-4)。テトラループは、4つの無作為塩基からなる単純なモデルループ配列から期待されるものよりも高い、隣接二重鎖の融点(Tm)の上昇を与える。例えば、テトラループは、10mM NaHPO4中で、少なくとも2塩基対の長さの二重鎖を含むヘアピンに少なくとも55℃の融点を与え得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。RNAテトラループの例には、テトラループのUNCGファミリー(例えばUUCG)、テトラループのGNRAファミリー(例えばGAAA)、及びCUUGテトラループが挙げられる。(Woese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8467-71;Antaoet et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov l l;19(21):5901-5)。DNAテトラループの例には、テトラループのd(GNNA)ファミリー(例えばテトラループのd(GTTA)、d(GNRA)ファミリー、テトラループのd(GNAB)ファミリー、テトラループのd(CNNG)ファミリー、テトラループのd(TNCG)ファミリー(例えばd(TTCG))が挙げられる。(Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002.; SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th; NO.2; PAGE.731
(2000)。)
より長い25〜約30ヌクレオチドのdsRNA種(DsiRNAs)は、19〜23mer siRNA薬剤と比較して、効能及び作用持続時間の観点から予想外に有効なRNA阻害を与えることが以前に示された。dsRNA加工機構の根底にある理論に束縛されるものではないが、より長いdsRNA種は、細胞の原形質内でダイサー酵素の基質としての役割を果たすと考えられる。本発明のdsNAをより短いセグメントに切断することに加えて、ダイサーは、切断dsNAに由来する一本鎖切断生成物を、標的遺伝子の又は標的遺伝子に由来する原形質RNAの破壊に関与するRISC複合体に組み込むことを促進すると考えられる。以前の研究(Rossiら、米国特許出願第2007/0265220号)は、ダイサーによるdsRNA種(詳細には、DsiRNA薬剤)の切断性が、dsRNA種の増大された効能及び作用持続時間に対応することを示している。本発明は、少なくとも部分的に、ダイサー切断の部位に案内されるRNA阻害剤の設計を提供し、それによりダイサー切断生成物の好ましい種が生成される。
本発明の組成物は、前駆体分子であるdsNAを含有し、即ち本発明のdsNAは、インビボで加工されて、活性の小さい干渉核酸(siRNA)を生成する。dsNAはダイサーによって活性siRNAに加工され、活性siRNAはRISC中に組み込まれる。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により、1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNAであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*|EN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により、1〜10である。「E」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「I」=a不連続性、であり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜15、又は場合により、1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD|EN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNAであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDZN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDZN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで2’−O−メチルRNAモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧN*ΧΧΖΝ−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*|EN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「E」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチド、「I」=a不連続性であり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで2’−O−メチルRNAモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD|EN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで2’−O−メチルRNAモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*−5’
を含み、
式中「X」=RNAであり、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで2’−O−メチルRNAモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDZN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX−5’
を含み、
式中、「X」=RNAであり、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、0〜10個のRNAモノマーを含む場合によるオーバーハングドメインであり、−所定の実施態様では、「Y」は、場合により2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチドであり、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、場合により1〜30、又は場合により1〜15、又は場合により1〜10である。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、場合により0、1、2、3、4又は5である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖である。一実施態様において、上部鎖はセンス鎖であり、下部鎖はアンチセンス鎖である。代替的に、下部鎖はセンス鎖であり、上部鎖はアンチセンス鎖であり、ここで2’−O−メチルRNAモノマーが、今、上記の図に示した下部鎖ではなく上部鎖に沿って交互の残基に配置されている。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXDD−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDXXZN−5’
(式中、「X」=RNA、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい0〜10個のRNA単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい1〜4個のRNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチド、及び「N」=1〜50又はそれ以上であるが、1〜30であってもよく、又は1〜15であってもよく、又は1〜10であってもよい。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、0、1、2、3、4又は5であってもよい。)一実施態様においては、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。また、下の鎖はセンス鎖であり、上の鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXDD|EN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDXXZN−5’
(式中、「X」=RNA、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい0〜10個のRNA単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい1〜4個のRNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチド、及び「N」=1〜50又はそれ以上であるが、1〜30であってもよく、又は1〜15であってもよく、又は1〜10であってもよい。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、0、1、2、3、4又は5であってもよい。)一実施態様においては、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。また、下の鎖はセンス鎖であり、上の鎖はアンチセンス鎖である。
5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN *XXDDZN−3’
3’−YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDXX−5’
(式中、「X」=RNA、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい0〜10個のRNA単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい1〜4個のRNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチド、及び「N」=1〜50又はそれ以上であるが、1〜30であってもよく、又は1〜15であってもよく、又は1〜10であってもよい。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、0、1、2、3、4又は5であってもよい。)一実施態様においては、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。また、下の鎖はセンス鎖であり、上の鎖はアンチセンス鎖である。
3’−YXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
5’−XXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YXXXΜXXXXXXXXXXXXXXXXXXXΝ*XXZN−5’
5’−XXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
5’−XXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YXXXXXΜXXXXXXXXXXXXXXXXXΝ*XXZN−5’
5’−XXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YXXXXXXΜXXXXXXXXXXXXXXXXΝ*XXZN−5’
5’−XXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YXXXXXXXΜXXXXXXXXXXXXXXXΝ*XXZΝ−5’
5’−XXXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
3’−YXXXXXXXXΜXXXXXXXXXXXXXXΝ*XXZN−5’
(式中、「X」=RNA、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい0〜10個のRNA単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい1〜4個のRNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチド、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、1〜30であってもよく、又は1〜15であってもよく、又は1〜10であってもよい。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、0、1、2、3、4又は5であってもよく、「D」=「DNA」、「M」=鎖をアニーリングした時に他の相補鎖の対応する「M」残基と塩基対(水素結合)を形成しない核酸残基(RNA、DNA、又は非天然若しくは修飾核酸))。このような薬剤の任意の残基は2’−OメチルRNA単量体であってもよく、上述したように、下の(第二の)鎖の3’−末端残基から開始する2’−O−メチルRNA単量体の他の位置決めは、前記DsiRNAmm剤においても用いることができる。上記ミスマッチ構造について、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。
標的RNA配列:5’−. .AXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−EXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−..XAXXXXXXXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...AXXXXXXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−BXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XAXXXXXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XXAXXXXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XXXAXXXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XXXXAXXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XXXXXAXXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XXXXXXAXXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XXXXXXXAXXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
標的RNA配列:5’−...XXXXXXXXAXXXXXXXXXX...−3’
DsiRNAmmセンス鎖:5’−XXXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXN*DD−3’
DsiRNAmmアンチセンス鎖:3’−XXXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN−5’
(式中、「X」=RNA、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい0〜10個のRNA単量体で構成される任意のオーバーハングドメインであり、−特定の実施態様においては、「Y」は、2’−O−メチルRNA単量体であってもよい1〜4個のRNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「Z」=DNA、RNA又は修飾ヌクレオチド、「N」=1〜50又はそれ以上であるが、1〜30であってもよく、又は1〜15であってもよく、又は1〜10であってもよい。「N*」=0〜15又はそれ以上であるが、0、1、2、3、4又は5であってもよく、「D」=「DNA」、「p」=リン酸基、「E」=鎖をアニーリングした時に他の相補(標的)鎖の対応する「A」RNA残基と塩基対(水素結合)を形成しない、また、対応する「B」残基(「B」残基はRNA、DNA、又は非天然若しくは修飾核酸であってもよい)と塩基対を形成しなくてもよい核酸残基(RNA、DNA、又は非天然若しくは修飾核酸))。このような薬剤の任意の残基は2’−OメチルRNA単量体であってもよく、例えば、上述したように、下の(第二の)鎖の3’−末端残基から開始する2’−O−メチルRNA単量体の他の位置決め、又は本明細書で開示される2’−O−メチル及び/又は他の修飾の他のパターンは、前記DsiRNA剤においても用いることができる。
二重鎖RNAs(「dsRNAs」)の効果を阻害する1つの主要な要因は、ヌクレアーゼによるdsRNAs(例えば、siRNAs及びDsiRNAs)の分解である。3’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、DNAオリゴヌクレオチドのアンチセンスの3’−末端の修飾は、分解を防止するのに重要である(Ederら、1991)。RNアーゼ−Tファミリーヌクレアーゼは、siRNAsの制御及び分解に関与する3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有するいわゆるERI−Iとして同定された(Kennedyら、2004;Hongら、2005)。この遺伝子は、マウスにおけるThex1(NM_02067)又はヒトにおけるTHEX1(NM_153332)としても知られ、ヒストンmRNAの分解に関与し;また、siRNAsにおける3’−オーバーハングの分解を媒介するが、二重鎖RNAを分解しない(Yangら、2006)。従って、本発明のDsiRNAsを含むdsRNAの3’−末端の安定化が、安定性を改善すると予想することは合理的である。
例えば、交互に2’−O−メチル塩基を使用するパターンは、修飾されていないRNAと同等の能力を有することができ、血清において全く安定である(Choung ら、2006;Czaudernaら、2003)。
siRNA
siRNAによって媒介されるRNAiのプロセスは、細胞内における長いdsRNA分子の存在下で誘発される。RNAiの開始工程の際に、これらのdsRNA分子は、2種のRNアーゼIII様のドメインを含む酵素の保存されたファミリーであるDicerによって21〜23ヌクレオチド(nt)低分子干渉RNA二重鎖(siRNAs)に切断される(Bernsteinら、2001;Elbashirら、2001)。siRNAsは、19〜21塩基対の二重鎖領域及び各鎖上の2個のヌクレオチド3’オーバーハングによって特徴づけられる。RNAiのエフェクター工程の際に、siRNAsは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と呼ばれる多量体タンパク質複合体に組み込まれ、これらが、分解のための完全に相補的なmRNA基質を選択するためのガイドとしての役割を果たす。分解は、siRNAに対して相補的な領域内のmRNAのエンドヌクレアーゼ的切断によって開始される。更に正確に言うと、mRNAは、ガイドするsiRNAの5’末端から10位のヌクレオチドにて切断される(Elbashir et al.,2001 Genes and Dev.15:88−200;Nykanenら、2001 Cell 107:309−321;Martinez et al.,2002 Cell 110:563−574)。この切断に関与するエンドヌクレアーゼは、Argonaute2として同定された(Ago2;Liu et al.,Science、305:1437−41)。
大部分のヒトmiRNA(70%)−及びおそらくその他の哺乳類の大部分のmiRNA−は、イントロン及び/又はエキソンから転写され、約30%は遺伝子間領域に位置する(Rodriguez et al.,Genome Res.2004,14(10A),1902−1910)。ヒトおよび動物において、miRNAは、通常、RNAポリメラーゼIIによって(Farh et al.Science 2005,310(5755),1817−1821)、また、ある場合には、pol IIIによって転写される(Borchert et al.Nat.Struct.Mol.Biol.2006,13(12),1097−1101)。特定のウイルスのコードされたmiRNAは、RNAポリメラーゼIIIによって転写され(Pfeffer et al.Nat.Methods 2005,2(4),269−276;Andersson et al.J.Virol.2005,79(15),9556−9565)、いくつかは、ウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームに位置する(Pfeffer et al.Nat.Methods 2005,2(4),269−276;Samols et al.J.Virol.2005,79(14),9301−9305)。miRNAの転写は、大きなモノシストロン性、双シストロン性、又は多シストロン性の一次転写物(pri−miRNA)の産生をもたらす。単一のpri−miRNAは、長さが約200ヌクレオチド(nt)から数キロベース(kb)までの範囲であり、5’7−メチルグアノシン(m7)キャップ及び3’ポリ(A)テールの両方を有し得る。特徴的には、成熟したmiRNA配列は、pri−miRNA内の不完全なステム−ループ配列の領域に局在化される(Cullen,Mol.,Cell 2004,16(6),861−865)。
RNアーゼHは、DNA/RNA二重鎖におけるRNAの3’−OP結合を切断して、3’−ヒドロキシル及び5’−ホスフェート末端産物を産生するリボヌクレアーゼである。RNアーゼHは、非特異的エンドヌクレアーゼであり、酵素結合した二価の金属イオンによって補助される加水分解メカニズムを介してRNAの切断を触媒する。RNアーゼ Hファミリーのメンバーは、始原菌及び原核生物から真核細胞までのほとんど全ての微生物において見い出されている。DNA複製の際に、RNアーゼHは、岡崎フラグメントの生成をプライミングする役割を担うRNAプライマーを切断すると考えられているが; RNアーゼH酵素は、より般的には、十分な長さの任意のDNA:RNAハイブリッド配列(例えば、通常は、哺乳類における長さが4以上の塩基対のDNA:RNAハイブリッド配列)を切断するために用いることができる。
マイクロRNAs(miRNA)は、鋳型転写物の3’UTRに対する結合によって作用し、これにより、古典的なRNA干渉に関連があるが、異なるメカニズムによって鋳型転写物によってコードされるタンパク質の発現を阻害することが開示されている。具体的には、miRNAは、その安定性を減少させることによるのではなく、むしろ標的転写物の翻訳を減少することによって作用すると考えられる。天然に存在するmiRNAは、通常は、長さが約22ntである。これらは、約70ntの長さの小分子RNAとして公知のより大きな前駆体に由来すると考えられる。
特定の実施態様においては、本発明は、疾患又は障害を患っているか、又は発症する危険性のある被験者を治療するための方法に関する。このような実施態様においては、DsiRNAは、疾患又は障害を制御するための新規な治療薬として作用し得る。本発明の方法は、本発明の医薬組成物を患者(例えば、ヒト)に投与することを含み、その結果、標的RNAの発現、レベル及び/又は活性が減少する。標的RNAによってコードされるポリペプチドの発現、レベル及び/又は活性は、また本発明のDsiRNAによって減少させられる可能性がある。
無細胞系におけるRNAiを再現するインビトロアッセイを、DsiRNA構築物を評価するために用いてもよい。例えば、このようなアッセイは、標的RNAに対して向けられたDsiRNA薬剤で用いるために使用するために適合されたTuschl et al.,1999,Genes and Development,13,3191−3197及びZamore et al.,2000,Cell,101,25−33に開示されたシステム、及びTurbo Dicer(Genlantis)を含む市販のキットが含まれる。合胞性胞胚葉に由来するショウジョウバエ(Drosophila)抽出物が、インビトロでのRNAi活性を再構成するために用いられる。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いる適切なプラスミドからのインビトロでの転写を介して、又は化学的合成を介して生成する。センス及びアンチセンスDsiRNA鎖(例えば、各20μM)を緩衝液(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウム等)において、90℃で1分間、次いで37℃で1時間インキュベーションしてアニーリングさせ、次いで溶解緩衝液(例えば、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウム)で希釈する。アニーリングは、TBE緩衝液中のアガロースゲルによるゲル電気泳動によって観察することができ、臭化エチジウムで染色することができる。ショウジョウバエ可溶化液は、脱塩素化して溶解化した発酵させたモラセス寒 天上に収集したOregon Rハエからの0〜2時間齢胚を使用して調製する。可溶化液を遠心分離して、上清を単離する。アッセイは、DsiRNA(10nM終濃度)を含む、50%の可溶化液[vol/vol]、RNA(10〜50pM終濃度)及び10%[vol/vol]の溶解緩衝液を含む反応混合物を含む。また、反応混合物は、10mMクレアチンリン酸、10μg/mLのクレアチンホスホキナーゼ、100μm GTP、100μM UTP、100μM CTP、500μM ATP、5mM DTT、0.1U/μL RNasin(Promega)及び100μMのそれぞれのアミノ酸も含む。酢酸カリウムの終濃度は、100mMに調整する。反応は、氷上で予め組み立
てて、RNAを添加する前に25℃にて10分間事前に沈殿させ、次いで、更に25℃で60分間インキュベートする。4容積の 1.25×Passive Lysis BufferPromega)で反応を停止する。標的RNA切断は、RT−PCR解析又は当該技術分野において公知のその他の方法によってアッセイして、反応からDsiRNAを除いた対照反応と比較する。
本発明のDsiRNA剤は、細胞の中に(すなわち、細胞内に)直接導入してもよく;又は細胞外に空洞、間隙内に、微生物の循環内に導入し、経口的に導入してもよく、又は核酸を含む溶液に細胞若しくは微生物を浸すことによって導入してもよい。血管又は脈管外循環、血液又はリンパ系及び脳脊髄液は、核酸を導入してもよい部位である。
公知の通り、RNAi法は、種々の生物における多種多様の遺伝子に適用でき、開示された組成物及び方法を、これらの状況のそれぞれにおいて利用することができる。開示された組成物及び方法によって標的とし得る遺伝子の例には、細胞に対して天然である遺伝子である内因性遺伝子、又は通常、細胞に対して天然でない遺伝子が含まれる。限定されないが、これらの遺伝子には、癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ(Id)タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、脈管形成を誘導する分子を発現する遺伝子、細胞接着因子のための遺伝子、細胞表面受容体、転移に関与するタンパク質、プロテアーゼ、アポトーシス遺伝子、細胞周期調整遺伝子、EGF及びEGF受容体を発現する遺伝子、MDR1遺伝子のような多剤耐性遺伝子が含まれる。
特定の実施態様においては、本発明は、本発明のDsiRNA剤を含む医薬組成物を提供する。DsiRNA剤試料は、それが存在する場合に、試料の十分な部分が細胞に入り遺伝子サイレンシングを誘導することを可能にする任意の手段によって適切に製剤化し、細胞の環境に導入することができる。dsNAのための多くの製剤が当該技術分野において公知であり、dsNAが作用し得るようにそれが標的細胞に入ることができる限り使用することができる。例えば、米国特許出願公開第2004/0203145号(A1)及び第2005/0054598号(A1)を参照されたい。例えば、本発明のDsiRNA剤は、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル者構造及びカプシドのような緩衝溶液中に製剤化することができる。カチオン脂質を含むDsiRNA剤の製剤は、細胞へのDsiRNA薬剤のトランスフェクションを促進するために用いることができる。
例えば、リポフェクチン(米国特許第5,705,188号)のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体及びポリリジン(公開されたPCT国際出願WO 97/30731)のようなポリカチオン性分子を用いることができる。適切な脂質は、オリゴフェクトアミン、リポフェクトアミン(Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.,Boulder、Colo.)、又はFuGene6(Roche)が含まれ、これらのすべては、製造業者の説明書に従って用いることができる。
処方してもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
るであろう。更に、タンパク質、ポリペプチド又は抗体の治療上有効な量での被験者の治療は、単一の治療を含んでもよく、又は好ましくは、一連の治療を含んでもよい。
ができる。血漿中のdsNAのレベルは、標準的な方法によって、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
本発明は、全体的にあるいは部分的に、標的RNAの発現及び/又はこのような標的RNAの存在によって(例えば、ウイルス感染、ウイルスゲノムの標的RNAの存在、カプシド、宿主細胞成分等の状況において)起こる疾患又は障害の危険性のある(又は感受性の)被験者を治療する予防的及び治療的な方法の両方を提供する。
予防的及び治療的な処置の方法に関して、このような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られる知識に基づき、特異的に調整してもよく、又は改変してもよい。本明細書で用いられる場合、「薬理ゲノミクス」は、臨床開発における、及び市場での薬物に対する遺伝子配列決定、統計遺伝学及び遺伝子発現解析のようなゲノム技術の適用を意味する。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子がどのように彼又は彼女の薬物に対する反応を決定するか(例えば、患者の「薬物反応表現型」又は「薬物反応遺伝子型」)の研究を意味する。従って、本発明の他の態様は、その個体の薬物反応遺伝子型に従って、本発明の標的RNA分子又は標的RNAモジュレーターのいずれかでの個体の予防的又は治療的な処置に調整するための方法を提供する。薬理ゲノミクスにより、臨床医又は医師が治療から最も利益を得るであろう患者に対して予防的又は治療的な処置を標的にすること、及び毒性のある薬物に関連した副作用を受けるであろう患者の治療を回避することができる。
実施例1−方法
オリゴヌクレオチド合成、インビトロにおける使用
標準的な方法に従い、個々のRNA鎖を合成し、HPLCにより精製した(Integrated DNA Technologies、Coralville、Iowa)。全てのオリゴヌクレオチドは、HPLC解析による化学的純度及び質量分析解析による全長 鎖の純度に基づいて品質管理して切り離した。二重鎖RNAのDsiRNAsは、同量の各鎖を混合し、RNA緩衝液(IDT)中で100℃で一時的にに加熱し、次いで混合物を室温に冷却することにより、使用直前に調製した。
標準的な方法に従い、個々のRNA鎖を合成し、HPLCにより精製した(OligoFactory、Holliston、MA)。全てのオリゴヌクレオチドは、HPLC解析による化学的純度及び質量分析解析による全長鎖の純度に基づいて品質管理して切り離した。二重鎖RNAのDsiRNAsは、同量の各鎖を混合し、RNA緩衝液(IDT)中で100で一時的に加熱し、次いで混合物を室温に冷却することにより、使用直前に調製した。
Hela細胞をATCCから得、5%のCO2下、37℃で、10%のウシ胎児血清(HyClone)を補充したダルベッコの修飾イーグル培地(HyClone)に維持した。図7、9、12及び13のRNAトランスフェクションについては、記載したように、また、製造業者の説明書に従い、Lipofectamine(商標)RNAiMAX(Invitrogen)を用い、最終濃度0.1nMでDsiRNAsをトランスフェクトした。すなわち、各DsiRNAの0.02μMのストック溶液2.5μLを、46.5μLのOpti−MEMI(Invitrogen)及び1μLのLipofectamine(商標)RNAiMAXと混合した。得られた50μLの混合液を12ウェルプレートの個々のウェルに加え、室温で20分間インキュベートし、DsiRNA:Lipofectamine(商標)RNAiMAX複合体を形成させた。一方、Hela細胞をトリプシン処理し、367細胞/μLの最終濃度になるように培地に再懸濁した。最終的に、450μLの細胞懸濁液を各ウェルに加え(最終容積500μL)、プレートをインキュベータ中に24時間置いた。
細胞を2mLのPBSで一度洗浄し、総RNAをRNeasy Mini Kit(商標)(Qiagen)を用いて抽出して、30μLの最終容積において溶出した。1μgの総RNAを、製造業者の説明書に従って、Transcriptor 1st Strand cDNA Kit(商標)(Roche)及びランダムなヘキサマーを用いて逆転写させた。得られたcDNAの1/30(0.66μL)を、3.33μLのH2O 及び1μLのヒト遺伝子HPRT−1(受け入れ番号NM_000194)及びSFRS9(受け入れ番号NM_003769)遺伝子に特異的な2セットのプライマー及びプローブを含む3μMの混合物と共に、5μLのiQ(商標)Multiplex Powermix(Bio−Rad)と混合した:
Hu HPRTフォワードプライマーF517 GACTTTGCTTTCCTTGGTCAG
Hu HPRTリバースプライマーR591 GGCTTATATCCAACACTTCGTGGG
Hu HPRTプローブ P554Cy5−ATGGTCAAGGTCGCAAGCTTGCTGGT−IBFQ
Hu SFRS9フォワードプライマーF569 TGTGCAGAAGGATGGAGT
Hu SFRS9リバースプライマーR712 CTGGTGCTTCTCTCAGGATA
Hu SFRS9プローブ P644 HEX−TGGAATATGCCCTGCGTAAACTGGA−IBFQ
製造業者のプロトコール(Invitrogen、Carlsbad、CA)に従い、DsiRNAをInvivofectamine(商標)中に製剤化した。すなわち、簡潔には、N/グループのマウス及び使用するマウスの体重を測定し、次いで処理されるマウスの各グループに必要なDsiRNAの量を算出した。1mLのIVF−oligoは、10mg/kgの投薬量で、25g/マウスの4匹のマウスに十分であった。1mgのDsiRNAを、1mlのInvivofectamine(商標)に添加して、ローテーターで30分間、室温で混合した。製剤化したIVF− DsiRNAを希釈するために14mlの5%グルコースを用い、50kDaの分子量を分画する回転コンセントレータ(Amicon)に適用した。IVF−DsiRNAの容積が1ml未満になるまでスピンコンセントレータを4℃で〜2時間、4000rpmにて回転させた。回収したIVF− DsiRNAを、1mLの5%グルコースで希釈して、動物注射のために準備した。
動物を、ケタミン/キシラジンで腹腔内注射によって、外科的麻酔に供した。それぞれのマウスを、注射の前に体重測定した。製剤化したIVF−DsiRNAを、100μl/体重10gにて静脈注射した。24時間後に、マウスを、CO2吸入によって屠殺した。解析のための組織を収集して、2mLのRNAlater(商標)(Qiagen)を含む試験管に入れ、室温で30分間観点させ、4℃で一晩のインキュベーションした。組織は、使用まで−80℃にて貯蔵した。
約50〜100mgの組織を、Tissue Lyser(商標)(Qiagen)上にて1mlのQIAzol(商標)(Qiagen)中でホモジナイズした。次いで、製造業者のプロトコールに従って、総RNAを単離した。すなわち、0.2mLのクロロホルム(Sigma−Aldrich)をQIAzol(商標)可溶化液に加え、撹拌することによって、激しく混合した。4℃で15分間、14,000rpmで遠心した後、水相を集め、0.5mlのイソプロパノールと混合した。10 分間、14,000rpmで更に遠心した後、RNAペレットを75%のエタノールで一度洗浄して、短時間乾燥した。
単離したRNAを、100μlのRNアーゼを含まない水に再懸濁し、製造業者のプロトコールに従ってRNeasy(商標)total RNA preparation kit(Qiagen)又はSV 96 total RNA IsolationSystem(Promega)によるクリーンアップに供した。
製造業者の説明書にし従ってたがって、Transcriptor 1st Strand cDNA Kit(商標)(Roche)及びオリゴdTを使用して逆転写した。得られたcDNAの1/40(0.66μL)を、3.33μLのH2O及び1μLのマウス遺伝子HPRT−1(受け入れ番号NM_013556)及びKRAS(受け入れ番号NM_021284)遺伝子に特異的な2セットのプライマー及びプローブを含む3μMの混合物と共に、5μμLのIQ Multiplex Powermix(Bio−Rad)と混合した:
Mm HPRTフォワードプライマーF576 CAAACTTTGCTTTCCCTGGT
Mm HPRTリバースプライマーR664 CAACAAAGTCTGGCCTGTATC
Mm HPRTプローブP616 Cy5−TGGTTAAGGTTGCAAGCTTGCTGGTG−IBFQ
Mm KRASフォワードプライマーF275 CTTTGTGGATGAGTACGACC
Mm KRASリバースプライマーR390 CACTGTACTCCTCTTGACCT
Mm KRASプローブP297 FAM−ACGATAGAGGACTCCTACAGGAAACAAGT−IBFQ
C1000サーマルサイクラーを備えたCFX96 Real−time system(Bio−Rad)を、増幅反応のために使用した。PCR条件は、以下の通りだった: 95℃で3分間;次いで、95℃で10秒;55℃で1分間を40サイクル繰り返した。それぞれの試料を、三連で試験した。HPRTの実施例については、相対的なHPRT mRNAレベルをSFRS9 mRNAレベルで標準化し、トランスフェクション試薬プラス対照のミスマッチ二重鎖で処理したか、又は未処理の対照試料において得られたmRNAレベルと比較した。KRASの実施例については、相対的なKRAS mRNAレベルをHPRT−1 mRNAレベルで標準化し、5%グルコースで処理したマウスからの対照試料において得られたmRNAレベルと比較した。データは、Bio−Rad CFX Manager version1.0(インビトロ実施例)又は1.5(インビボ実施例)ソフトウェアを使用して解析した。
実施例2−一本鎖伸長を有するDsiRNA剤の効果
一本鎖伸長を有するDsiRNA剤を、配列特異的標的mRNAの阻害の効果について試験を行った。具体的には、KRAS−249M、及び5’一本鎖ガイド伸長を有するHPRT−標的DsiRNA二重鎖を、20mMの一定濃度でHeLa細胞にトランスフェクションし、24時間後にHPRT発現レベルを測定した(図7及び9)。トランスフェクションは二連で実施し、各二連を、三連でKRAS−249M及びHPRT発現についてqPCRによりアッセイした。
一本鎖伸長に相補的な短いオリゴヌクレオチドと組み合わせた一本鎖伸長を有するDsiRNA剤の効果
一本鎖伸長を有するDsiRNA剤を、一本鎖伸長と相補的な短いオリゴと組合せ、配列特異的標的mRNAの効果について試験した。具体的には、15ヌクレオチドの不連続な相補体を含む、15ヌクレオチド長の5’一本鎖ガイド伸長を有するKRAS−294M及びHPRT−標的DsiRNA二重鎖を、20nMの固定濃度でHeLa細胞に導入し、24時間後に、HPRTの発現レベルを測定した(図12及び13)。トランスフェクションを二連で実施し、各二連を、それぞれqPCRにより、KRAS−249の遺伝子発現及びHPRT発現について三連でアッセイした。
DNA二重鎖伸長を有するDsiRNA剤について、単一投与プロトコール又は繰り返し投与プロトコールのいずれか(例えば、インビボのフェクトアミンの10mg/kgの単回注射)における配列特異的標的mRNAのインビボにおける効果を調べた。肝臓、腎臓、脾臓及びリンパ腺組織におけるKRASの発現を、三連で実施するリアルタイムPCR(RT−PCR)により注射24時間後に測定し、KRASの発現を評価した。これらの条件下、一本鎖ガイド伸長DsiRNA剤は、調べた全ての組織においてKRAS標的遺伝子阻害の統計的に有意なレベルを示した。このような一本鎖ガイド伸長DsiRNAで処置された組織におけるKRASの阻害レベルの割合は、肝臓(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)、脾臓(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)、腎臓(1910%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)、及びリンパ腺(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)であった。従って、本発明の伸長されたDsiRNAsのインビボにおける効果は、多くの組織型にわたって証明された。
インビボにおいて特定標的遺伝子の遺伝子発現を低下させる、本発明の伸長されたDicer基質剤の能力の更なる証明は、マウス又は他の哺乳動物被験者への、全身(例えば、静脈腹腔注射)、又は組織への直接注射(例えば、目、脊髄/脳/中枢神経系等への注射)により、実施された。追加の標的RNAレベルの測定は、標準法(例えば、Trizol(登録商標)調製(グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム)に続くqRT−PCR)により、標的細胞により実施した(例えば、肝臓及び/又は腎臓細胞中のRNAレベルを、以下のマウスの注射に続いてアッセイし;眼細胞を、被験者の眼細胞への直接注射に続いてアッセイし;脊髄/脳/中枢神経系を被験者への脊髄/脳/中枢神経系への直接注射に続きアッセイした)。
脾臓においては、5’パッセンジャー伸長DsiRNA剤1371(PS3M)及び1339(PS10M)は、グルコースのみのコントロールに対して標準化した場合に、5’パッセンジャー伸長K249M及び1370(3M)を有しないDsiRNA剤と比較し、KRAS mRNA発現の阻害をも示した(図19〜21)。DsiRNA剤によるKRAS mRNAの発現の阻害は、5’パッセンジャー伸長DsiRNA剤1371(PS3M)及び1339(PS10M)を注射した動物の脾臓中で、少なくとも90〜95%であった。脾臓中の、5’パッセンジャー伸長DsiRNA剤1371(PS3M)及び1339(PS10M)の阻害の総計は、陰性コントロール、グルコースと比較して有意である、5’パッセンジャー伸長K249M及び1370(3M)を有しないDsiRNA剤のものと同程度であった。
本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、種々の置換及び改変を、本明細書に開示された本発明に行うことができることが、当業者には容易に明らかであろう。従って、このような更なる実施態様は、本発明及び以下の請求項の範囲内である。本発明は、RNAi活性を媒介するために改善された活性を有する核酸構築物を産生することに向けた本明細書に開示された化学的修飾の種々の組み合わせ及び/又は置換を試験することを当業者に教示する。このような改善された活性は、改善された安定性、生物学的利用能の改善、及び/又はRNAiを媒介する細胞反応の活性の改善を含む。従って、本明細書に開示された具体的態様は限定的でなく、当業者であれば、本明細書に開示された改変の特異的な組み合わせが改良されたRNAi活性を有するDsiRNA分子を同定することに向けて過度の実験なしで試験することができることを容易に認識することができる。
語のいずれと置換してもよい。用いられた用語及び表現は、記述の用語として使用され、限定的ではなく、このような用語及び表現の使用において示され、記載された特徴、又はその一部の任意の均等物を除外することは意図されないが、種々の改変が請求項の発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明を、好ましい態様によって具体的に開示したが、本明細書に開示される概念の随意の特徴、改変及び変形が当業者に
よって使用されてもよいこと、及びこのような改変及び変形は、明細書及び添付の特許請求の範囲によって定義されるとおり、本発明の範囲内であるものと考えられることを理解すべきである。
限り、又は状況によって明らかに否定することができない限り、任意の適切な順位で行うことができるか。本明細書に提供されるすべての例又は例示的な言語(例えば、「等の」)の使用は、他に請求されない限り、単に本発明をよりよく解釈することのみを意図し、本発明の範囲に対して限定を与えるというわけではない。明細書における言語は、本発明の実施に必須なものとして任意の請求されていない要素を示すものとして解釈すべきでない。
即座に当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予想し、本発明者らは、本発明について、本明細書に具体的に記述されたもの以外のその他のものが実施されることを意図する。従って、本発明には、準拠法によって可能にされるように、本願明細書に添付の特許請求の範囲に詳述された主題の全ての改変及び均等物が含まれる。更に、その全ての可能な変形の上記の要素のいずれの組み合わせも、本明細書に
おいて特に明記しない限り、又は状況によって明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。
Claims (85)
- 5’末端及び3’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と、5’末端及び3’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを有する単離された二本鎖核酸であって、前記5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを含み、かつ前記3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを含み:
前記第一の鎖が25〜30ヌクレオチド残基の長さを有し、5’末端ヌクレオチド(1位)から開始して、前記第一の鎖の1〜23位が少なくとも8個のリボヌクレオチドを含み;
前記第二の鎖が36〜66ヌクレオチド残基の長さを有し、3’末端ヌクレオチドから開始して、前記第一の鎖の1〜23位と対をなす位置に少なくとも8個のリボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成し;
前記第二の鎖の少なくとも3’末端ヌクレオチドが前記第一の鎖と対をなさず、また6個までの連続した3’末端ヌクレオチドが、前記第一の鎖と対をなさず、それにより1〜6ヌクレオチドの3’の一本鎖オーバーハングを形成し;
前記第二の鎖の5’末端が、前記第一の鎖と対をなさない10〜30個の連続したヌクレオチドを含み、それにより10〜30ヌクレオチドの一本鎖の5’オーバーハングを形成し;
前記第一の鎖と第二の鎖とが最大相補性に関して整合された際に、少なくとも第一の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなし、それにより前記第一の鎖と第二の鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成し;
前記第二の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された際に標的遺伝子発現を低減するように、前記第二の鎖の少なくとも19個のリボヌクレオチドの長さに沿って標的RNAに対して十分相補的である、単離された二本鎖核酸。 - 前記第一の鎖の24位から第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基までの間の及び前記第一の鎖の24位と第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基とを含む前記第一の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の不対3’末端ヌクレオチドを含まない、少なくとも10個の連続したヌクレオチド及び多くて15個の連続したヌクレオチドが、前記第一の鎖と対をなさず、それにより前記第二の鎖内に10〜15ヌクレオチドの一本鎖の5’オーバーハングを形成する、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖24位から第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基までに対応し及び従って塩基対をなす前記第二の鎖のヌクレオチドの間の及び該ヌクレオチドを含む前記第二の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖と第二の鎖との間の前記実質的に二重鎖の領域が、完全に二重鎖の領域を含み、前記完全に二重鎖の領域が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす第一の鎖の5’末端ヌクレオチドと3’末端ヌクレオチドとの間において不対塩基を有さない、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記実質的に二重鎖の領域が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす第一の鎖の5’末端ヌクレオチドと3’末端ヌクレオチドとの間に:1個の不対塩基対;2個の不対塩基対、3個の不対塩基対、4個の不対塩基対、及び5個の不対塩基対からなる群から選択される不対塩基対を含む、請求項5に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記不対塩基対が、連続又は不連続である、請求項6に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖が30ヌクレオチドまでの長さを有し、前記第一の鎖の3’から前記第一の鎖の23位までのヌクレオチドが:前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである、前記第一の鎖の24位から3’末端ヌクレオチド残基までの2、3、4、5及び6個のヌクレオチド残基からなる群から選択されるデオキシヌクレオチドを含む、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなす前記第一の鎖の前記デオキシリボヌクレオチドが、連続したデオキシリボヌクレオチドである、請求項8に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の24〜30位の二つ又はそれ以上の連続ヌクレオチド残基が、前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖が30ヌクレオチドまでの長さを有し:24位及び25位、25位及び26位、26位及び27位、27位及び28位、28位及び29位、並びに29位及び30位からなる群から選択される一対のデオキシリボヌクレオチドを含み、デオキシリボヌクレオチドの前記第一の鎖の対が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチド対と塩基対をなす、請求項10に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の1〜28位の前記8個又はそれ以上のリボヌクレオチドが、連続したリボヌクレオチドである、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の1〜28位の各ヌクレオチド残基が、前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすリボヌクレオチドである、請求項12に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の前記3’の一本鎖オーバーハングが:1〜4ヌクレオチド、1〜3ヌクレオチド(nucleoties)、1〜2ヌクレオチド、及び2ヌクレオチド長からなる群から選択される長さを有する、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’オーバーハングの前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項15に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記修飾ヌクレオチド残基が2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−ブリッジ、4’−(CH2)2−O−2’−ブリッジ、2’−LNA、2’−アミノ及び2’−O−(N−メチルカルバメート)からなる群から選択される、請求項15に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項15に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’オーバーハングが2ヌクレオチド長であり、前記第二の鎖の3’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端ヌクレオチド残基に対応する前記第二の鎖のヌクレオチド残基(1A位)から開始する前記第二の鎖が、前記第一の鎖の3’末端残基に対応する、前記第二の鎖の16A位から5’残基までの全位置に非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’末端における第一のヌクレオチド(1A位)から開始して、前記第二の鎖の3’末端から1A位、2A位及び3A位が修飾ヌクレオチドである、請求項13に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端ヌクレオチド残基に対応する前記第二の鎖のヌクレオチド残基(1A位)から開始する前記第二のオリゴヌクレオチド鎖が、1A位から15A位までに交互の修飾及び非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項14に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の前記5’の一本鎖オーバーハングが:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及び30ヌクレオチド長からなる群から選択される長さを有する、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の5’オーバーハングの前記ヌクレオチドがホスフェートバックボーン修飾を含む、請求項22に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記ホスフェートバックボーン修飾が、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、及びメチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ及び二環式フラノース類似体からなる群から選択される、請求項23に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の5’末端ヌクレオチド残基(1B位)から開始する前記第二の鎖が、2B位から、前記第一の鎖の3’末端残基に対応する前記第二の鎖の5’残基までのヌクレオチドの間にホスホロチオエートバックボーン修飾を含む、請求項24に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の5’オーバーハングが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項22に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の5’オーバーハングの前記ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記修飾ヌクレオチド残基が、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−ブリッジ、4’−(CH2)2−O−2’−ブリッジ、2’−LNA、2’−アミノ及び2’−O−(N−メチルカルバメート)からなる群から選択される、請求項27に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の5’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項27に記載の単離された二本鎖核酸。
- 第二の鎖の5’末端ヌクレオチド残基が2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項27に記載の単離された二本鎖核酸。
- 5’末端及び3’末端を有する第三のオリゴヌクレオチド鎖を更に含み:
前記第三の鎖が、10〜30ヌクレオチド残基の長さを有し;
前記第三の鎖の少なくとも10個の連続したヌクレオチド及び多くて30個の連続したヌクレオチドが、前記第二の鎖の5’末端と対をなす、請求項1のいずれかに記載の単離された二本鎖核酸。 - 前記第三の鎖がリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項31に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の5’オーバーハングの全ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項31に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第三の鎖の前記ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項31のいずれかに記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記修飾ヌクレオチド残基が、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−ブリッジ、4’−(CH2)2−O−2’−ブリッジ、2’−LNA、2’−アミノ及び2’−O−(N−メチルカルバメート)からなる群から選択される、請求項31に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第三の鎖の前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項31に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第三の鎖が、ホスフェートバックボーン修飾を含む、請求項31に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記ホスフェートバックボーン修飾が、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、及びメチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ及び二環式フラノース類似体からなる群から選択される、請求項37に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第三の鎖の5’末端ヌクレオチド残基(1C位)から開始する前記第三の鎖が、1C位と2C位とのヌクレオチドの間にホスホロチオエートバックボーン修飾を含む、請求項38に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二又は第一のオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドが、ダイサー切断の指向を案内する修飾ヌクレオチドで置換されている、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 第一の鎖が、第二の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも80%、90%、95%又は100%相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記標的RNAがKRASである、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸。
- 細胞内で標的遺伝子の発現を低減するための方法であって:
細胞を、参照dsRNAと比較して細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸と接触させることを含む、方法。 - 動物内で標的遺伝子の発現を低減するための方法であって:参照dsRNAと比較して動物の細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸で動物を処置することを含む、方法。
- 前記二本鎖核酸を化学的に又は酵素的に合成することを含む、請求項1に記載の二本鎖核酸の合成方法。
- 5’末端及び3’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と、5’末端及び3’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを含む単離された二本鎖核酸であって、前記5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを含み、かつ前記3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを含み:
前記第一の鎖が35〜60ヌクレオチド残基の長さを有し、5’末端ヌクレオチド(1位)から開始して、前記第一の鎖の1〜28位が少なくとも8個のリボヌクレオチドを含み;
前記第二の鎖が26〜36ヌクレオチド残基の長さを有し、3’末端ヌクレオチドから開始して、前記第一の鎖の1〜23位と対をなす位置に少なくとも8個のリボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成し;
前記第二の鎖の少なくとも3’末端ヌクレオチドが前記第一の鎖と対をなさず、また前記第二の鎖の6個までの連続した3’末端ヌクレオチドが、前記第一の鎖と対をなさず、それにより1〜6ヌクレオチドの3’の一本鎖オーバーハングを形成し;
前記第一の鎖の3’末端ヌクレオチドを含む10〜30個の連続したヌクレオチドが、前記第二の鎖の5’末端と対をなさず、それにより10〜30ヌクレオチドの一本鎖の3’オーバーハングを形成し;
前記第一の鎖と第二の鎖とが最大相補性に関して整合された際に、少なくとも第一の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなし、それにより前記第一の鎖と第二の鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成し;
前記第二の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された際に標的遺伝子発現を低減するように、前記第二の鎖の少なくとも19個のリボヌクレオチドの長さに沿って標的RNAに対して十分相補的である、単離された二本鎖核酸。 - 前記第一の鎖の24位から前記第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基までの間の及び前記第一の鎖の24位と第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基とを含む前記第一の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドが、前記第二の鎖と塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’末端ヌクレオチドを含む、少なくとも10個の連続したヌクレオチド及び多くて15個の連続したヌクレオチドが、前記第二の鎖の5’末端と対をなさず、それにより10〜15ヌクレオチドの一本鎖の3’オーバーハングを形成する、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖24位から第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基までに対応し及び従って塩基対をなす前記第二の鎖のヌクレオチドの間の及び該ヌクレオチドを含む前記第二の鎖の少なくとも一つのヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖と第二の鎖との間の前記実質的に二重鎖の領域が、完全に二重鎖の領域を含み、前記完全に二重鎖の領域が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす第一の鎖の5’末端ヌクレオチドと3’末端ヌクレオチドとの間において不対塩基を有さない、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記実質的に二重鎖の領域が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチドと対をなす第一の鎖の5’末端ヌクレオチドと3’末端ヌクレオチドとの間に;1個の不対塩基対;2個の不対塩基対、3個の不対塩基対、4個の不対塩基対、及び5個の不対塩基対からなる群から選択される不対塩基対を含む、請求項50に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記不対塩基対が、連続又は不連続である、請求項51に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖が66ヌクレオチドまでの長さを有し、前記第一の鎖の3’から前記第一の鎖の23位までのヌクレオチドが:前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである、前記第一の鎖の24位から3’末端ヌクレオチド残基までの2、3、4、5及び6個のヌクレオチド残基からなる群から選択されるデオキシヌクレオチドを含む、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記デオキシリボヌクレオチドが連続したデオキシリボヌクレオチドである、請求項53に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の24〜30位の二つ又はそれ以上の連続ヌクレオチド残基が、前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすデオキシリボヌクレオチドである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖が66ヌクレオチドまでの長さを有し:24位及び25位、25位及び26位、26位及び27位、27位及び28位、28位及び29位、並びに29位及び30位からなる群から選択される一対のデオキシリボヌクレオチドを含み、デオキシリボヌクレオチドの前記第一の鎖の対が、前記第二の鎖の対応するヌクレオチド対と塩基対をなす、請求項55に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の1〜28位の前記8個又はそれ以上のリボヌクレオチドが、連続したリボヌクレオチドである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の1〜28位の各ヌクレオチド残基が、前記第二の鎖のヌクレオチドと塩基対をなすリボヌクレオチドである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’オーバーハングが:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及び30ヌクレオチド長からなる群から選択される、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’オーバーハングが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’オーバーハングの全ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである、請求項60に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’オーバーハングの前記ヌクレオチドが、ホスフェートバックボーン修飾を含む、請求項59のいずれかに記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記ホスフェートバックボーン修飾が、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ロックト核酸、モルホリノ及び二環式フラノース類似体からなる群から選択される、請求項62に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基(1D位)から開始する前記第一の鎖が、1D位から、前記第一の鎖の3’オーバーハングと連続した前記第一の鎖の5’残基までのヌクレオチドの間にメチルホスホネートバックボーン修飾を含む、請求項63に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’末端ヌクレオチド残基(1D位)から開始する前記第一の鎖が、2D位から、前記第一の鎖の3’オーバーハングと連続した前記第一の鎖の5’残基までのヌクレオチドの間にメチルホスホネートバックボーン修飾を含む、請求項63に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項65に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’オーバーハングの前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記修飾ヌクレオチド残基が、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−ブリッジ、4’−(CH2)2−O−2’−ブリッジ、2’−LNA、2’−アミノ及び2’−O−(N−メチルカルバメート)からなる群から選択される、請求項67に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一の鎖の3’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項68に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の前記3’オーバーハングが:1〜4ヌクレオチド、1〜3ヌクレオチド(nucleoties)、1〜2ヌクレオチド、及び2ヌクレオチド長からなる群から選択される長さを有する、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’オーバーハングの前記ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項70のいずれかに記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記修飾ヌクレオチド残基が、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−ブリッジ、4’−(CH2)2−O−2’−ブリッジ、2’−LNA、2’−アミノ及び2’−O−(N−メチルカルバメート)からなる群から選択される、請求項71に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項72に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’オーバーハングが2ヌクレオチド長であり、前記第二の鎖の3’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端ヌクレオチド残基に対応する前記第二の鎖のヌクレオチド残基(1A位)から開始する前記第二の鎖が、前記第一の鎖の3’末端残基に対応する、前記第二の鎖の5’残基の16A位から最終の5’残基までの全位置に非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二の鎖の3’末端における第一のヌクレオチド(1A位)から開始して、前記第二の鎖の3’末端から1A位、2A位、及び3A位が修飾ヌクレオチドである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第一のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端ヌクレオチド残基に対応する前記第二の鎖のヌクレオチド残基(1A位)から開始する前記第二のオリゴヌクレオチド鎖が、1A位から15A位までに交互の修飾及び非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記第二又は第一のオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドが、ダイサー切断の指向を案内する修飾ヌクレオチドで置換されている、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 第一の鎖が、第二の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも80%、90%、95%又は100%相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 前記標的RNAがKRASである、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸。
- 細胞内で標的遺伝子の発現を低減するための方法であって:
細胞を、参照dsRNAと比較して細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸と接触させることを含む、方法。 - 動物内で標的遺伝子の発現を低減するための方法であって:参照dsRNAと比較して動物の細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の、請求項46に記載の単離された二本鎖核酸で動物を処置することを含む、方法。
- 対象の細胞内で標的遺伝子の発現を低減するための医薬組成物であって、参照dsRNAと比較して細胞内で標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の請求項46に記載の単離された二本鎖核酸と、薬学的に許容され得る担体とを含有する、医薬組成物。
- 前記二本鎖核酸を化学的に又は酵素的に合成することを含む、請求項67に記載の二本鎖核酸の合成方法。
- 図1〜6、8、11、14又は15のいずれか一つに示される、単離された二本鎖核酸。
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