WO2016104775A1 - 遺伝子発現制御のための天然型ｍｉＲＮＡおよびその用途 - Google Patents

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絵里子 青木
安彦 吉田
志織 加藤
忠明 大木
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the present invention relates to a natural miRNA that suppresses gene expression and its use.
  • Micro RNA is known as a nucleic acid molecule that suppresses gene expression, and has been reported to suppress transcription of a protein encoded by the gene through, for example, the following generation process. That is, first, a miRNA transcript (Pri-miRNA) having a cap structure at the 5 'end and poly (A) at the 3' end is generated in the nucleus. The Pri-miRNA is cleaved by RNase (Drosha) to generate a miRNA precursor (Pre-miRNA). The Pre-miRNA has a hairpin structure having a loop region and a stem region.
  • Pri-miRNA miRNA transcript having a cap structure at the 5 'end and poly (A) at the 3' end is generated in the nucleus.
  • the Pri-miRNA is cleaved by RNase (Drosha) to generate a miRNA precursor (Pre-miRNA).
  • the Pre-miRNA has a hairpin structure having a loop region and a stem region.
  • This Pre-miRNA moves out of the nucleus, and then is degraded by cytoplasmic RNase (Dicer) to cut out double-stranded miRNA (mature miRNA) having a 1 to 4 base overhang at the 3 'end.
  • double-stranded miRNAs one strand is called a guide strand, the other strand is called a passenger strand, and the guide strand binds to a complex similar to RNA-induced Silencing Complex (RISC).
  • RISC RNA-induced Silencing Complex
  • the miRNA / RISC complex binds to the 3 'untranslated region (3'UTR) of a specific mRNA, thereby suppressing protein translation from the mRNA.
  • the miRNA for example, there is a method using a double-stranded mature miRNA or pre-miRNA.
  • a double-stranded mature miRNA or pre-miRNA it is necessary to anneal two single-stranded nucleic acid molecules before use, and autoimmunity may be generated by TLR3 or the like that recognizes the double strand.
  • TLR3 the number of nucleotides is increased, synthesis is not easy and disadvantageous in terms of cost, and there are also problems of intracellular migration and pharmacokinetics.
  • an object of the present invention is to provide a new natural miRNA using the structure of a mature miRNA.
  • the “natural miRNA” includes a guide strand and a passenger strand of a naturally occurring mature miRNA and has the same activity as that of the mature miRNA (ie, target gene expression suppressing activity). Means a single-stranded nucleic acid molecule having no artificial constituents in parts other than the guide strand and passenger strand.
  • the natural miRNA of the present invention comprises: A single-stranded nucleic acid having an X region and a Y region, The 3 ′ end of the X region and the 5 ′ end of the Y region are linked via a linker region having a non-nucleotide structure,
  • the X region comprises (a) a guide strand sequence or (b) a passenger strand sequence of a mature miRNA, In the case of (a), the Y region includes a passenger strand sequence of the mature miRNA, In the case of (b), the Y region includes a guide strand sequence of the mature miRNA, The guide strand sequence and the passenger strand sequence form a double strand structure.
  • composition of the present invention is a composition for suppressing gene expression, and contains the natural miRNA of the present invention.
  • composition of the present invention is a pharmaceutical composition, characterized in that it contains the natural miRNA of the present invention.
  • the expression suppression method of the present invention is a method of suppressing the expression of a target gene, characterized by using the natural miRNA of the present invention.
  • the method for treating a disease of the present invention includes a step of administering the natural miRNA of the present invention to a patient, and the guide strand sequence in the natural miRNA suppresses the expression of a gene involved in the disease. It is characterized by being the guide strand arrangement
  • the natural miRNA of the present invention can be easily synthesized at low cost and can suppress the translation of the protein encoded by the gene.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a natural miRNA.
  • FIG. 2 is a graph showing the relative value of the amount of AXL mRNA in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative value of the amount of AXL mRNA in Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the relative value of the amount of AXL mRNA in Example 3.
  • FIG. 5 is a graph showing the relative value of the amount of HMGA2 mRNA in Example 4.
  • FIG. 6 is a graph showing the relative value of the amount of COL1A1 mRNA in Example 5.
  • FIG. 7 is a graph showing the relative value of the amount of AXL mRNA in Example 6.
  • FIG. 8 is a graph showing the relative value of the amount of HMGA2 mRNA in Example 7.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a natural miRNA.
  • FIG. 2 is a graph showing the relative value of the amount of AXL mRNA in Example 1.
  • FIG. 9 is a graph showing the relative values of the amount of COL1A1 mRNA in Example 8.
  • FIG. 10 is a graph showing the relative value of the amount of AXL mRNA in Example 9.
  • FIG. 11 is a graph showing the relative value of COL1A1 mRNA amount in Example 10.
  • FIG. 12 is a graph showing the relative values of the amount of COL1A1 mRNA in Example 11.
  • FIG. 13 is a graph showing the relative value of COL1A1 mRNA amount in Example 11.
  • Natural miRNA The natural miRNA of the present invention, as described above, A single-stranded nucleic acid having an X region and a Y region, The 3 ′ end of the X region and the 5 ′ end of the Y region are linked via a linker region having a non-nucleotide structure,
  • the X region comprises (a) a guide strand sequence or (b) a passenger strand sequence of a mature miRNA,
  • the Y region includes a passenger strand sequence of the mature miRNA
  • the Y region includes a guide strand sequence of the mature miRNA
  • the guide strand sequence and the passenger strand sequence form a double strand structure.
  • the X region includes a guide sequence (a) or a passenger strand sequence (b) is not necessarily limited.
  • the guide strand sequence and the passenger strand sequence include a naturally occurring pre-miRNA and They are arranged in the same direction (ie, 5 ′ ⁇ 3 ′ direction or 3 ′ ⁇ 5 ′ direction). That is, when naturally occurring pre-miRNAs are arranged in the order of guide strand-loop region-passenger strand from the 5 ′ direction, the natural miRNA of the present invention may contain a guide strand sequence in the X region.
  • the natural miRNA of the present invention has a passenger strand sequence in the X region. It is preferable to include.
  • miR-34a and let-7a preferably contain a guide strand sequence in the X region
  • miR-29b preferably contains a passenger strand sequence in the X region.
  • the natural miRNA of the present invention can suppress the expression of a target gene, for example.
  • Expression suppression means, for example, suppression of translation of the target gene, that is, suppression of translation of a protein encoded by the target gene, and more specifically, suppression of translation of the protein from mRNA of the target gene.
  • the suppression of the expression of the target gene can be achieved, for example, by reducing the production amount of the transcription product from the target gene, reducing the activity of the transcription product, reducing the production amount of the translation product from the target gene, or activity of the translation product. It can be confirmed by decrease of Examples of the protein include a mature protein or a precursor protein before undergoing processing or post-translational modification.
  • the natural miRNA of the present invention is a single-stranded nucleic acid molecule, it can be produced at low cost without the need for annealing two single strands like, for example, a mature miRNA. Furthermore, since the natural miRNA of the present invention is a single-stranded nucleic acid molecule, it can be prevented from being recognized by, for example, TLR3, RIG-I, MDA5, etc. involved in autoimmunity.
  • the natural miRNA of the present invention is based on pre-miRNA having a relatively long nucleotide loop because the guide strand sequence and the passenger strand sequence are linked via a non-nucleotide structure linker molecule. Compared to single-stranded nucleic acid molecules, they can be synthesized easily and inexpensively, and are excellent in pharmacokinetics and intracellular migration.
  • FIG. 1 shows an outline of the positional relationship between the X region and the Y region in the natural miRNA of the present invention.
  • FIG. 1 is schematic, and for example, the length, shape, and the like of each region are not limited.
  • the X region is disposed on the 5 ′ side
  • the Y region is disposed on the 3 ′ side
  • the 'terminal is linked via a non-nucleotide structure linker region (indicated by “P” in the figure).
  • the X region includes a guide strand sequence or passenger strand sequence of any mature miRNA, and when the X region includes the guide strand sequence, the Y region is a passenger of the mature miRNA.
  • the Y region includes the guide strand sequence of the mature miRNA. Therefore, the X region and the Y region include the guide strand sequence and the passenger.
  • Intramolecular annealing also called self-annealing
  • the natural miRNA of the present invention forms a double-stranded structure in the intramolecularly annealed region.
  • the natural miRNA of the present invention is a linear single-stranded nucleic acid molecule in which the 5 'end and 3' end are unlinked.
  • the 5 'end is preferably a non-phosphate group in order to maintain unbonded both ends.
  • the X region includes a guide strand sequence (passenger strand sequence) of mature miRNA as described above.
  • the Y region includes a passenger strand sequence (guide strand sequence) of the mature miRNA.
  • the guide strand and passenger strand sequence of mature miRNA are registered in various databases (for example, http://www.mirbase.org/ etc.). Therefore, for example, the X region and the Y region can be set based on information of these known mature miRNAs.
  • the guide strand of the mature miRNA is a strand that is incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC) Argonaute (Ago) protein and binds to the target mRNA.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the mature miRNA passenger strand is finally the RISC.
  • the X region includes the guide strand sequence will be described in detail as an example. However, those skilled in the art will understand from the following description that the X region includes the passenger strand sequence. The structure of natural miRNA can be easily understood.
  • the X region may consist of, for example, only the guide strand sequence or may have an additional sequence.
  • the X region is composed of, for example, the guide strand sequence and the additional sequence, and the additional sequence is linked to the 3 ′ end of the guide strand sequence, for example.
  • the Y region when the guide strand sequence and the passenger sequence are aligned, when the guide strand has an overhang on the 3 ′ end side, the Y region is on the 5 ′ end side of the passenger strand. A sequence complementary to the sequence of the overhang is included.
  • the X region includes an additional sequence
  • the Y region includes a sequence complementary to the additional sequence of the X region when the X region and the Y region are aligned.
  • the additional sequence of the X region is linked to the 3 ′ end of the guide strand sequence
  • the complementary sequence is linked to the 5 ′ end of the passenger strand sequence.
  • the complementary sequence may not be completely complementary as long as it can form a double-stranded structure continuous to the double strand of the guide strand sequence and the passenger sequence.
  • the Y region may consist only of the passenger sequence and a sequence complementary to the additional sequence of the X region, or may have an overhang that does not form a pair with the X region. That is, in the natural miRNA of the present invention, for example, when the Y region and the X region are aligned, the Y region may have an overhang at the 3 ′ end.
  • the overhang of the Y region is, for example, a terminal base that the Y region has more than the X region when the Y region and the X region are aligned.
  • the length (O) of the overhang can be expressed by the following formula, for example.
  • Overhang length (O) [total number of bases in Y region (Y)] ⁇ [total number of bases in X region (X)]
  • an artificial overhang is further added to the 3 ′ end of the passenger strand in the Y region. There is often no need to add a hang.
  • the length of each region is not particularly limited.
  • the conditions are exemplified below, but the natural miRNA of the present invention is not limited to these descriptions.
  • the numerical range of bases discloses all positive integers belonging to the range.
  • the description “1 to 4 bases” means “1, 2, 3, 4 bases”. (Hereinafter the same).
  • the length of the guide strand sequence is not particularly limited, and for example, the length of the guide strand sequence in the reported mature miRNA can be exemplified.
  • the lower limit is, for example, 19 base lengths and 20 base lengths
  • the upper limit is, for example, 25 base lengths, 24 base lengths
  • the range is, for example, 19-25 base lengths, 20-24 base lengths It is.
  • the length of the additional sequence in the X region is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 0 base length, 1 base length, 2 base length, and the upper limit is, for example, 7 base length, 5 base length, 4
  • the base length is 3 base length, and the range is, for example, 0 to 7 base length, 0 to 5 base length, 1 to 5 base length, 1 to 4 base length, 2 to 3 base length, 3 to 5 base length is there.
  • the length of the additional sequence is preferably 3 to 7 bases, more preferably 3 to 5 bases.
  • the base sequence of the additional sequence in the X region is not particularly limited.
  • the length of the additional sequence is 3 bases, for example, UAA, UGG, UCC, CAA, CGG, CCC and the like can be mentioned.
  • the additional sequence has a length of 4 bases, examples include UAAU, UUAA, UUGG, UUUU, and the like.
  • the additional sequence has a length of 5 bases, for example, UAAUU, UCCGG, UUUU, UUUUA, UUUAU, UUAUU, UAUUU, UUUAA, UUAUU, UAUUU, UUAUU, UAUAU, AUUAU, AUUAU, AUUAU , AUUAA, AUUUU, CUUAA, CUUUU, GUUAA, GUUUU, and the like.
  • the length of the additional sequence is 7 bases long, for example, UAAUUAA, UCCGGGCC and the like can be mentioned.
  • the base sequence of the additional sequence and the base sequence of a sequence complementary to the additional sequence are preferably AU-rich.
  • the length of the X region is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 19 base length, 21 base length, 23 base length, and the upper limit is, for example, 35 base length, 30 base length, 28 base length, 26
  • the range is, for example, 19-35 base length, 19-30 base length, 21-28 base length, 23-26 base length.
  • the length of the overhang in the Y region is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 0 base length, 1 base length, and the upper limit is For example, the length is 4 bases or 3 bases, and the range is, for example, 0 to 4 bases, 1 to 3 bases or 2 bases.
  • the arrangement of the overhang is not particularly limited, and examples thereof include UU, CU, GC, UA, AA, CC, UG, CG, AU, and TT from the 3 'side.
  • the overhang is TT, resistance to RNase can be added.
  • the length of the Y region is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 19 base length, 21 base length, 23 base length, and the upper limit is, for example, 37 base length, 32 base length, 30 base length, 28
  • the range is, for example, 19-37 base length, 19-32 base length, 21-37 base length, 21-30 base length, 23-28 base length.
  • the total length (T) of the natural miRNA of the present invention is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 38 base length, 42 base length, 46 base length, and the upper limit is, for example, 72 base length, 62 base length, The length is 58 base length, 54 base length, and the range is, for example, 38-72 base length, 40-68 base length, 38-62 base length, 42-58 base length, 46-54 base length.
  • the type of the mature miRNA is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of the target gene.
  • Examples of the mature miRNA include hsa-miR-34a (miRBase Accession No. MI0000268), hsa-let-7a (miRBase Accession No. MI0000060), hsa-let-7f (miRBase Accession No. MI0000067), and hsa-miR.
  • Examples include mature miRNAs such as -150 (miRBase Accession No. MI0000479) and hsa-miR-29b (miRBase Accession No. MI0000105).
  • hsa-miR-34a (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2) UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU / CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU hsa-let-7a (SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4) UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU / CUAUACAAUCUACUGUCUUUC hsa-let-7f (SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6) UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU / CUAUACAAUCUAUUGCCUUCCC hsa-miR-150 (SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8) UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG / CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG hsa-miR-29b (SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 9) GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA / UAGCACCAUUUGAAAUCA
  • the guide chain of miR-34a targets, for example, AXL, MET, CDK4, CDK6, SIRT1, CCND1, SIRT1, BCL-2, etc., and suppresses the expression of these target genes, for example, lung cancer, colon cancer, gastric cancer It can prevent or treat diseases such as liver cancer and breast cancer.
  • the guide strand of let-7a targets, for example, HMGA2 (high mobility group AT-hook 2), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4 and the like, and by suppressing the expression of these target genes, for example, lung cancer and colon Can prevent or treat diseases such as cancer, stomach cancer, liver cancer and breast cancer.
  • the guide strand of let-7f targets, for example, HMGA2 (high mobility group AT-hook 2), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4, etc., and by suppressing the expression of these target genes, for example, lung cancer and colon Can prevent or treat diseases such as cancer, stomach cancer, liver cancer and breast cancer.
  • the guide chain of miR-29b targets, for example, COL1A1, MCL1, DNMT3A, DNMT3B, TCL1A, TGFb3, etc., and suppresses the expression of these target genes, for example, lung cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, breast cancer Diseases such as pulmonary fibrosis and liver fibrosis can be prevented or treated.
  • the structural unit of the natural miRNA of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include nucleotide residues.
  • the nucleotide residue include a ribonucleotide residue and a deoxyribonucleotide residue.
  • the nucleotide residue is preferably, for example, a ribonucleotide residue.
  • the nucleotide residue include an unmodified unmodified nucleotide residue and a modified modified nucleotide residue.
  • the natural miRNA of the present invention can improve nuclease resistance and stability, for example, by including the modified nucleotide residue.
  • the natural miRNA of the present invention may further contain a non-nucleotide residue in addition to the nucleotide residue, for example.
  • the natural miRNA of the present invention includes, for example, the modified ribonucleotide residue in addition to the unmodified ribonucleotide residue
  • the number of the modified ribonucleotide residue is not particularly limited. Specifically, it is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the modified ribonucleotide residue relative to the unmodified ribonucleotide residue may be, for example, the deoxyribonucleotide residue in which a ribose residue is replaced with a deoxyribose residue.
  • the natural miRNA of the present invention includes, for example, the deoxyribonucleotide residue in addition to the unmodified ribonucleotide residue
  • the number of the deoxyribonucleotide residue is not particularly limited. For example, “1 or several Specifically, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the nucleotide residue includes, for example, a sugar, a base and a phosphate as constituent elements.
  • the ribonucleotide residue has, for example, a ribose residue as a sugar, and has adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and U (uracil) as bases
  • the deoxyribose residue is For example, it has a deoxyribose residue as a sugar and has adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T) as bases.
  • each component is the same or substantially the same as, for example, naturally occurring, specifically, for example, the same or substantially the same as that naturally occurring in the human body. Are identical.
  • the modified nucleotide residue may be modified, for example, with any component of the unmodified nucleotide residue.
  • Examples of the modified nucleotide residue include naturally occurring nucleotide residues, artificially modified nucleotide residues, and the like.
  • the modified nucleotide residue may be, for example, a residue of a substitute for the unmodified nucleotide.
  • the substitute include artificial nucleic acid monomer residues. Specific examples include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acid), and the like.
  • the base is not particularly limited.
  • the base may be, for example, a natural base or a non-natural base.
  • the base may be, for example, naturally derived or a synthetic product.
  • As the base for example, a general base or a modified analog thereof can be used.
  • the linker region having a non-nucleotide structure preferably includes at least one selected from the group consisting of amino acid residues, polyamine residues, and polycarboxylic acid residues.
  • the linker region may or may not contain residues other than amino acid residues, polyamine residues, and polycarboxylic acid residues.
  • the linker region may include any of a polycarboxylic acid residue, a terephthalic acid residue, or an amino acid residue.
  • polyamine refers to any compound containing a plurality (two or three or more) amino groups.
  • the “amino group” is not limited to —NH 2 group but also includes imino group (—NH—).
  • the polyamine is not particularly limited, and examples thereof include 1,4-diaminobenzene, 1,3-diaminobenzene, 1,2-diaminobenzene and the like.
  • polycarboxylic acid refers to any compound containing a plurality (two or three or more) of carboxy groups. In the present invention, the polycarboxylic acid is not particularly limited.
  • amino acid refers to any organic compound containing one or more amino groups and carboxy groups in the molecule, as will be described later.
  • amino group is not limited to —NH 2 group but also includes imino group (—NH—).
  • the amino acid residue may be a combination of a plurality of amino acid residues.
  • an amino acid residue in which a plurality of amino acid residues are linked refers to, for example, a residue containing a peptide structure. More specifically, the amino acid residue in which the plurality of amino acid residues are linked is, for example, an amino acid residue represented by chemical formula (I) described later, wherein a chemical formula (Ia) described later is a peptide (for example, glycine dimer or An amino acid residue that is a glycine trimer or the like.
  • the amino acid residue may be a glycine residue, a terephthalic acid amide residue, a proline residue or a lysine residue.
  • the amino acid residue may be a modified amino acid residue or an amino acid derivative.
  • the linker region is represented, for example, by the following chemical formula (I-0).
  • Q 11 and Q 12 are each independently a single bond, CH 2 (methylene group), NH (imino group), C ⁇ O (carbonyl group), C ⁇ S (thiocarbonyl group), C ⁇ NH (imino Methylene group), O, or S;
  • Q 1 and Q 2 are each independently a single bond, CH 2 (methylene group), NH (imino group), C ⁇ O (carbonyl group), C ⁇ S (thiocarbonyl group), C ⁇ NH (imino Methylene group), O, or S;
  • Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S;
  • L 1 is an alkylene chain having n carbon atoms, and a hydrogen atom on the alkylene carbon atom is substituted with OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or SR a May not be substituted, or L 1 is a polyether chain in which one or more carbon atom
  • L 2 is a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom
  • Y 2 is NH, O or S
  • the atom of L 2 bonded to Y 2 is carbon
  • the atom of L 2 bonded to OR 2 is carbon
  • oxygen atoms are not adjacent to each other
  • R a , R b , R c and R d are each independently a substituent or a protecting group
  • m is an integer ranging from 0 to 30
  • n is an integer ranging from 0 to 30
  • the X region and the Y region are each bonded to the linker residue via —OR 1 — or —OR 2 —;
  • R 1 and R 2 may or may not be present, and when present, R 1 and R 2 are each independently a nucleotide residue or the structure (I-0).
  • A is an arbitrary atomic group.
  • the combination of the bond between the X region and the Y region and —OR 1 — and —OR 2 — is not particularly limited, and examples thereof include any of the following conditions.
  • Condition (1) The X region is bonded to the structure of the formula (I) through —OR 2 —, and the Y region is bonded through —OR 1 —.
  • Condition (2) The X region is bonded to the structure of the formula (I) through —OR 1 — and the Y region is bonded through —OR 2 —.
  • Q 11 may be C ⁇ O (carbonyl group) and Q 1 may be NH (imino group). Further, for example, Q 11 may be NH (imino group) and Q 1 may be C ⁇ O (carbonyl group). Further, for example, Q 12 may be C ⁇ O (carbonyl group) and Q 2 may be NH (imino group). Further, for example, Q 12 may be NH (imino group) and Q 2 may be C ⁇ O (carbonyl group).
  • Q 11 and Q 12 may each be, for example, a carbonyl group.
  • Q 1 and Q 2 are each preferably an imino group.
  • the structure of the following chemical formula (I ⁇ ) is more preferably represented by the following chemical formula (I ⁇ 2).
  • R 100 is an arbitrary substituent and may or may not be present. When present, one or a plurality of R 100 may be present, and in the case of a plurality, R 100 may be the same as or different from each other.
  • R 100 examples include the substituents described below for R a , R b , R c, and R d , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, Amino, carboxy, sulfo, nitro, carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl , Silyl, silyloxyalkyl, pyrrolyl, imidazolyl and the like. More preferably, the structure of the chemical formula (I ⁇ 2) is represented by the following chemical formula (I ⁇ 3).
  • the linker residue of the chemical formula (I-0) is a carboxylic acid amide residue. It can also be said that it is a carboxylic acid residue.
  • the “TPA” structure in the examples described later can be said to be a terephthalic acid amide residue, but it can also be said to be a terephthalic acid residue represented by the chemical formula (I ⁇ 3).
  • Q 11 and Q 12 may each be an imino group.
  • Q 1 and Q 2 are each preferably a carbonyl group.
  • the structure represented by the following chemical formula (I ⁇ ) is more preferably represented by the following chemical formula (I ⁇ 2).
  • R 100 is an arbitrary substituent and may or may not be present. When present, one or a plurality of R 100 may be present, and in the case of a plurality, R 100 may be the same as or different from each other. Specifically, for example, it is the same as R 100 in the chemical formula (I ⁇ 2). More preferably, the structure of the chemical formula (I ⁇ 2) is represented by the following chemical formula (I ⁇ 3).
  • the linker residue is an amino acid residue
  • the amino acid residue is represented, for example, by the following chemical formula (I).
  • the structure of the following chemical formula (I) is an example of a structure represented by the chemical formula (I-0).
  • X 1 , X 2 , Y 1 , Y 2 , L 1 and L 2 are the same as described above.
  • the complementary sequence to the sequence of the microRNA binds to the amino acid residue via —OR 1 — or —OR 2 —, respectively.
  • R 1 and R 2 may or may not be present, and when present, R 1 and R 2 are each independently a nucleotide residue or the structure (I);
  • A is an arbitrary atomic group, provided that the following chemical formula (Ia) is an amino acid or a peptide.
  • the atomic group A in the chemical formula (I), (I ⁇ ) or (Ia) is, for example, a chain group, an alicyclic group, an aromatic group, a heteroaromatic group, or a heteroalicyclic group. It may or may not include at least one selected from the group consisting of formula atomic groups.
  • the chain atomic group is not particularly limited, and examples thereof include alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl and the like.
  • the alicyclic atomic group is not particularly limited, and examples thereof include cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl and the like.
  • the aromatic atomic group is not particularly limited, and examples thereof include aryl, arylalkyl, alkylaryl, condensed ring aryl, condensed ring arylalkyl, and condensed ring alkylaryl.
  • the heteroaromatic atomic group is not particularly limited, and examples thereof include heteroaryl, heteroarylalkyl, alkylheteroaryl, fused ring heteroaryl, fused ring heteroarylalkyl, and fused ring alkylheteroaryl. .
  • each atomic group may or may not further have a substituent or a protecting group.
  • substituents or protecting groups they may be the same or different.
  • substituents include the substituents exemplified for the above R a , R b , R c and R d , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, amino, carboxy, sulfo, nitro Carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl, Examples include pyrrolyl and
  • amino acid refers to any organic compound containing at least one amino group and one carboxy group in the molecule, as described above.
  • the “amino group” is not limited to —NH 2 group but also includes imino group (—NH—).
  • imino group —NH—
  • proline, hydroxyproline and the like do not contain an —NH 2 group in the molecule but an imino group (—NH—), and are included in the definition of “amino acid” in the present invention.
  • the “amino acid” may be a natural amino acid or an artificial amino acid as described later.
  • a compound represented by the following chemical formula (Ia2) or (Ia3) also includes an amino group and a carboxy group in the molecule, and thus is included in the definition of “amino acid” in the present invention. Therefore, for example, in the chemical formula (I), the structure in which the atomic group A is represented by the following chemical formula (A2) or chemical formula (A2a) is included in the definition of “amino acid residue” in the present invention. Further, for example, the “TPA” structure in Examples described later is also included in the definition of “amino acid residue” in the present invention.
  • “peptide” refers to an organic compound having a structure in which two or more amino acids are bound by peptide bonds.
  • the peptide bond may have an acid amide structure or an acid imide structure.
  • the amino group explicitly shown in the chemical formula (Ia) may be any amino group.
  • the carboxy group clearly shown in the chemical formula (Ia) may be any carboxy group.
  • the amino acid may be a natural amino acid or an artificial amino acid as described above, for example.
  • “natural amino acid” refers to an amino acid having a naturally occurring structure or an optical isomer thereof.
  • the method for producing the natural amino acid is not particularly limited, and for example, it may be extracted from nature or synthesized.
  • “artificial amino acid” refers to an amino acid having a structure that does not exist in nature. That is, the artificial amino acid refers to a carboxylic acid derivative containing an amino acid, that is, an amino group (an organic compound containing one or more amino groups and carboxy groups in the molecule) and having a structure that does not exist in nature.
  • the artificial amino acid preferably does not include a heterocycle.
  • the amino acid may be, for example, an amino acid constituting a protein.
  • the amino acids include glycine, ⁇ -alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, cystine, glutamine, glutamic acid, histidine, isoleucine, leucine, lysine, hydroxylysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tyrosine, valine, At least selected from the group consisting of proline, 4-hydroxyproline, tryptophan, ⁇ -alanine, 1-amino-2-carboxycyclopentane, aminobenzoic acid, aminopyridinecarboxylic acid, and an amino acid represented by the following chemical formula (Ia2)
  • substituents examples include the substituents exemplified for the above R a , R b , R c and R d , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, amino, carboxy, sulfo, nitro Carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl, Examples include pyrrolyl and imidazolyl.
  • the protecting group is, for example, the same as the protecting group exemplified for R a , R b , R c and R d .
  • an amino acid that is not a peptide of the chemical formula (Ia) has an isomer such as an optical isomer, a geometric isomer, or a stereoisomer, any isomer may be used.
  • R 100 is an arbitrary substituent and may or may not be present. When present, one or a plurality of R 100 may be present, and in the case of a plurality, R 100 may be the same as or different from each other.
  • R 100 examples include the substituents exemplified for R a , R b , R c and R d , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, amino, Carboxy, sulfo, nitro, carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl Silyloxyalkyl, pyrrolyl, imidazolyl and the like.
  • the structure of the chemical formula (Ia2) may be, for example, the following chemical formula (Ia3).
  • the structure of the chemical formula (Ia) is the chemical formula (Ia2)
  • the structure of the atomic group A in the chemical formula (I) is represented by the following chemical formula (A2).
  • R 100 in the following chemical formula (A2) is the same as R 100 in the chemical formula (Ia2).
  • the structure of the chemical formula (Ia) is the chemical formula (Ia3)
  • the structure of the atomic group A in the chemical formula (I) is represented by the following chemical formula (A2a).
  • Examples of the structure of the chemical formula (I) include the following chemical formulas (I-1) to (I-7).
  • n and m are the chemical formulas Same as (I).
  • n and m are not particularly limited and are as described above.
  • the structure is shown in the following chemical formulas (I-1a), (I-1b), (I-4a), (I-6a) and (I-7a).
  • the linker region is represented, for example, by the following formula (II).
  • X 1 and X 2 are each independently H 2 , O, S or NH; Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S; R 3 is a hydrogen atom or substituent bonded to C-3, C-4, C-5 or C-6 on ring A; L 1 is an alkylene chain of n atoms, substituted where hydrogen atoms on the alkylene carbon atoms are, OH, OR a, NH 2 , NHR a, with NR a R b, SH, or SR a May or may not be substituted, or L 1 is a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom, However, when Y 1 is NH, O or S, the atom of L 1 bonded to Y 1 is carbon, the atom of L 1 bonded to OR 1 is carbon, and oxygen atoms are not adjacent to each other; L 2 is an alkylene chain of n atoms,
  • the ring A may contain a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond
  • the X region and the Y region are each bonded to the non-nucleotide structure via —OR 1 — or —OR 2 —;
  • R 1 and R 2 may or may not be present, and when present, R 1 and R 2 are each independently a nucleotide residue or the structure (II).
  • X 1 and X 2 are each independently, for example, H 2 , O, S or NH.
  • X 1 being H 2 means that X 1 forms CH 2 (methylene group) together with the carbon atom to which X 1 is bonded. The same is true for X 2.
  • Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S.
  • l 1 or 2.
  • ring A is a 5-membered ring, for example, the pyrrolidine skeleton.
  • the pyrrolidine skeleton include a proline skeleton and a prolinol skeleton, and examples thereof include a bivalent structure.
  • ring A is a 6-membered ring, for example, the piperidine skeleton.
  • one carbon atom other than C-2 on ring A may be substituted with nitrogen, oxygen or sulfur.
  • Ring A may contain a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond in ring A.
  • Ring A may be, for example, either L-type or D-type.
  • R 3 is a hydrogen atom or a substituent bonded to C-3, C-4, C-5 or C-6 on the ring A.
  • R 3 is the above-described substituent, the substituent R 3 may be one, plural, or absent, and when plural, it may be the same or different.
  • the substituent R 3 is, for example, halogen, OH, OR 4 , NH 2 , NHR 4 , NR 4 R 5 , SH, SR 4 or an oxo group ( ⁇ O).
  • R 4 and R 5 are, for example, each independently a substituent or a protecting group, and may be the same or different.
  • substituents include halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, heterocyclylalkenyl. , Heterocyclylalkyl, heteroarylalkyl, silyl, silyloxyalkyl and the like. The same applies hereinafter.
  • the substituent R 3 may be any of these listed substituents.
  • the protecting group is, for example, a functional group that converts a highly reactive functional group into an inert state, and includes known protecting groups.
  • the description of the literature J. F. W. McOmie, “Protecting Groups in Organic Chemistry” Prenum Press, London and New York, 1973) can be used as the protecting group.
  • the protective group is not particularly limited, and examples thereof include tert-butyldimethylsilyl group (TBDMS), bis (2-acetoxyethyloxy) methyl group (ACE), triisopropylsilyloxymethyl group (TOM), 1- (2 -Cyanoethoxy) ethyl group (CEE), 2-cyanoethoxymethyl group (CEM), tolylsulfonylethoxymethyl group (TEM), dimethoxytrityl group (DMTr) and the like.
  • TBDMS tert-butyldimethylsilyl group
  • ACE (2-acetoxyethyloxy) methyl group
  • TOM triisopropylsilyloxymethyl group
  • CEE 2-Cyanoethoxymethyl group
  • CEM 2-cyanoethoxymethyl group
  • TEM dimethoxytrityl group
  • DMTr dimethoxytrityl group
  • R 3 is OR 4
  • the protecting group is not particularly
  • L 1 is an alkylene chain composed of n atoms.
  • the hydrogen atom on the alkylene carbon atom may be substituted with, for example, OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or SR a , or may not be substituted.
  • L 1 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom.
  • the polyether chain is, for example, polyethylene glycol.
  • L 2 is an alkylene chain composed of m atoms.
  • the hydrogen atom on the alkylene carbon atom may be substituted with, for example, OH, OR c , NH 2 , NHR c , NR c R d , SH or SR c , or may not be substituted.
  • L 2 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom.
  • Y 2 is NH, O or S
  • the L 2 atom bonded to Y 2 is carbon
  • the L 2 atom bonded to OR 2 is carbon
  • oxygen atoms are not adjacent to each other. That is, for example, when Y 2 is O, the oxygen atom and the oxygen atom of L 2 are not adjacent, and the oxygen atom of OR 2 and the oxygen atom of L 2 are not adjacent.
  • N in L 1 and m in L 2 are not particularly limited, and the lower limit is, for example, 0, and the upper limit is not particularly limited.
  • n and m can be appropriately set according to the desired length of the non-nucleotide structure, for example.
  • n and m are each preferably 0 to 30, more preferably 0 to 20, and still more preferably 0 to 15 from the viewpoint of production cost and yield.
  • n + m is, for example, 0 to 30, preferably 0 to 20, and more preferably 0 to 15.
  • R a , R b , R c and R d are, for example, each independently a substituent or a protecting group.
  • the substituent and the protecting group are the same as described above, for example.
  • hydrogen atoms may be independently substituted with halogens such as Cl, Br, F and I, for example.
  • the X region and the Y region are bonded to the non-nucleotide structure via, for example, —OR 1 — or —OR 2 —, respectively.
  • R 1 and R 2 may or may not exist.
  • R 1 and R 2 are each independently a nucleotide residue or the structure of formula (II).
  • the non-nucleotide structure is, for example, the non-nucleotide residue having the structure of the formula (II) excluding the nucleotide residue R 1 and / or R 2 , And the nucleotide residues.
  • the non-nucleotide structure is, for example, a structure in which two or more of the non-nucleotide residues having the structure of the formula (II) are linked. Become.
  • the structure of formula (II) may include, for example, 1, 2, 3 or 4.
  • the structure (II) may be directly linked or may be bonded via the nucleotide residue.
  • R 1 and R 2 are not present, the non-nucleotide structure is formed only from the non-nucleotide residue consisting of the structure of the formula (II), for example.
  • the combination of the bond between the X region and the Y region and —OR 1 — and —OR 2 — is not particularly limited, and examples thereof include any of the following conditions.
  • Condition (1) The X region is bonded to the structure of the formula (II) through —OR 2 — and the Y region is bonded through —OR 1 —.
  • Condition (2) The X region is bonded to the structure of the formula (II) through —OR 1 —, and the Y region is bonded through —OR 2 —.
  • Examples of the structure of the formula (II) include the following formulas (II-1) to (II-9).
  • n and m are the same as the formula (II).
  • q is an integer of 0 to 10.
  • n, m and q are not particularly limited and are as described above.
  • alkyl includes, for example, a linear or branched alkyl group.
  • the number of carbon atoms of the alkyl is not particularly limited, and is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 6, and more preferably 1 to 4.
  • alkyl group examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, Examples thereof include n-octyl, n-nonyl, n-decyl and the like.
  • Preferred examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl and the like.
  • alkenyl includes, for example, linear or branched alkenyl.
  • alkenyl include those having one or more double bonds in the alkyl.
  • the number of carbon atoms of the alkenyl is not particularly limited, and is the same as, for example, the alkyl, preferably 2 to 8.
  • alkenyl include vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1,3-butadienyl, 3-methyl-2-butenyl and the like.
  • alkynyl includes, for example, linear or branched alkynyl.
  • alkynyl include those having one or more triple bonds in the alkyl.
  • the number of carbon atoms of the alkynyl is not particularly limited, and is the same as, for example, the alkyl, preferably 2 to 8.
  • examples of the alkynyl include ethynyl, propynyl, butynyl and the like.
  • the alkynyl may further have one or more double bonds, for example.
  • aryl includes, for example, a monocyclic aromatic hydrocarbon group and a polycyclic aromatic hydrocarbon group.
  • the monocyclic aromatic hydrocarbon group include phenyl and the like.
  • the polycyclic aromatic hydrocarbon group include 1-naphthyl, 2-naphthyl, 1-anthryl, 2-anthryl, 9-anthryl, 1-phenanthryl, 2-phenanthryl, 3-phenanthryl, 4-phenanthryl, 9- And phenanthryl.
  • Preferable examples include naphthyl such as phenyl, 1-naphthyl and 2-naphthyl.
  • heteroaryl includes, for example, a monocyclic aromatic heterocyclic group and a condensed aromatic heterocyclic group.
  • heteroaryl include furyl (eg, 2-furyl, 3-furyl), thienyl (eg, 2-thienyl, 3-thienyl), pyrrolyl (eg, 1-pyrrolyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl), Imidazolyl (eg, 1-imidazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl), pyrazolyl (eg, 1-pyrazolyl, 3-pyrazolyl, 4-pyrazolyl), triazolyl (eg, 1,2,4-triazol-1-yl, 1,2,4-triazol-3-yl, 1,2,4-triazol-4-yl), tetrazolyl (eg 1-tetrazolyl, 2-tetrazolyl, 5-tetrazolyl), oxazolyl (eg 2-
  • cycloalkyl is, for example, a cyclic saturated hydrocarbon group, and the number of carbons is, for example, 3-15.
  • the cycloalkyl include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, a bridged cyclic hydrocarbon group, a spiro hydrocarbon group, and the like, preferably cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl. And a bridged cyclic hydrocarbon group.
  • the “bridged cyclic hydrocarbon group” includes, for example, bicyclo [2.1.0] pentyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, bicyclo [2.2.2] octyl and bicyclo [3. 2.1] octyl, tricyclo [2.2.1.0] heptyl, bicyclo [3.3.1] nonane, 1-adamantyl, 2-adamantyl and the like.
  • examples of the “spiro hydrocarbon group” include spiro [3.4] octyl and the like.
  • cycloalkenyl includes, for example, a cyclic unsaturated aliphatic hydrocarbon group, and has, for example, 3 to 7 carbon atoms.
  • examples of the cycloalkenyl include cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl and the like, and preferably cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl and the like.
  • the cycloalkenyl includes, for example, a bridged cyclic hydrocarbon group and a spiro hydrocarbon group having an unsaturated bond in the ring.
  • arylalkyl includes, for example, benzyl, 2-phenethyl, naphthalenylmethyl and the like
  • cycloalkylalkyl or “cyclylalkyl” includes, for example, cyclohexylmethyl, adamantylmethyl and the like.
  • hydroxyalkyl include hydroxymethyl and 2-hydroxyethyl.
  • alkoxy includes, for example, the alkyl-O— group, and examples thereof include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, and n-butoxy.
  • Alkoxyalkyl includes, for example, Examples thereof include methoxymethyl and the like, and “aminoalkyl” includes, for example, 2-aminoethyl and the like.
  • heterocyclyl is, for example, 1-pyrrolinyl, 2-pyrrolinyl, 3-pyrrolinyl, 1-pyrrolidinyl, 2-pyrrolidinyl, 3-pyrrolidinyl, pyrrolidinone, 1-imidazolinyl, 2-imidazolinyl, 4-imidazolinyl, 1 -Imidazolidinyl, 2-imidazolidinyl, 4-imidazolidinyl, imidazolidinone, 1-pyrazolinyl, 3-pyrazolinyl, 4-pyrazolinyl, 1-pyrazolidinyl, 3-pyrazolidinyl, 4-pyrazolidinyl, piperidinone, piperidinyl, 2-piperidinyl 4-piperidinyl, 1-piperazinyl, 2-piperazinyl, piperazinone, 2-morpholinyl, 3-morpholinyl, morpholino, tetrahydropyranyl, tetra
  • heterocyclylalkyl includes, for example, piperidinylmethyl, piperazinylmethyl and the like
  • heterocyclylalkenyl includes, for example, 2-piperidinylethenyl and the like
  • heteroarylalkyl Examples include pyridylmethyl and quinolin-3-ylmethyl.
  • sil includes a group represented by the chemical formula R 3 Si—, and R can be independently selected from the above alkyl, aryl and cycloalkyl, for example, trimethylsilyl group, tert-butyldimethylsilyl
  • R can be independently selected from the above alkyl, aryl and cycloalkyl, for example, trimethylsilyl group, tert-butyldimethylsilyl
  • the “silyloxy” includes, for example, a trimethylsilyloxy group, and the “silyloxyalkyl” includes, for example, trimethylsilyloxymethyl.
  • alkylene includes, for example, methylene, ethylene, propylene and the like.
  • the various groups described above may be substituted.
  • substituents include hydroxy, carboxy, sulfo, halogen, alkyl halide (haloalkyl, eg, CF 3 , CH 2 CF 3 , CH 2 CCl 3 ), nitro, nitroso, cyano, alkyl (eg, methyl, ethyl).
  • alkenyl eg, vinyl
  • alkynyl eg, ethynyl
  • cycloalkyl eg, cyclopropyl, adamantyl
  • cycloalkylalkyl eg, cyclohexylmethyl, adamantylmethyl
  • cycloalkenyl eg, : Cyclopropenyl
  • cyclylalkyl hydroxyalkyl (eg, hydroxymethyl, hydroxyethyl), alkoxyalkyl (eg, methoxymethyl, ethoxymethyl, ethoxyethyl), aryl (eg, phenyl, naphthyl), arylalkyl
  • alkenyl eg, vinyl
  • alkynyl eg, ethynyl
  • cycloalkyl eg, cyclopropyl, adamantyl
  • cycloalkylalkyl e
  • the natural miRNA of the present invention may contain, for example, a labeling substance and may be labeled with the labeling substance.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances, dyes, isotopes and the like.
  • the labeling substance include fluorophores such as pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, and Cy5 dye, and examples of the dye include Alexa dye such as Alexa488.
  • the isotope include a stable isotope and a radioactive isotope, and preferably a stable isotope.
  • the stable isotope does not change the physical properties of the labeled compound, for example, and is excellent in properties as a tracer.
  • the stable isotope is not particularly limited, and examples thereof include 2 H, 13 C, 15 N, 17 O, 18 O, 33 S, 34 S, and 36 S.
  • the natural miRNA of the present invention can suppress the expression of the target gene. Therefore, the natural miRNA of the present invention can be used as a therapeutic agent for diseases caused by genes, for example.
  • the natural miRNA of the present invention has a guide strand sequence of a mature miRNA that suppresses the expression of a gene involved in the disease
  • the disease can be treated, for example, by suppressing the expression of the target gene.
  • “treatment” includes, for example, the meanings of preventing the disease, improving the disease, and improving the prognosis.
  • the disease is not particularly limited, and for example, the expression suppression sequence can be appropriately set according to the target disease.
  • Examples of the disease include breast cancer, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, uterine body cancer, cervical cancer, and ovarian cancer.
  • diseases such as osteosarcoma, cancer such as leukemia, pulmonary fibrosis, liver fibrosis and the like.
  • the method of using the natural miRNA of the present invention is not particularly limited, and for example, the natural miRNA may be administered to an administration subject having the target gene.
  • Examples of the administration target include cells, tissues or organs.
  • Examples of the administration subject include non-human animals such as humans and non-human mammals other than humans.
  • the administration may be, for example, in vivo or in vitro.
  • the cells are not particularly limited, and examples thereof include various cultured cells such as HeLa cells, 293 cells, NIH3T3 cells, and COS cells, stem cells such as ES cells and hematopoietic stem cells, and cells isolated from living bodies such as primary cultured cells. can give.
  • the target gene to be subject to expression suppression is not particularly limited, and a desired gene can be set. And as above-mentioned, what is necessary is just to select the said mature miRNA according to the kind of said target gene.
  • the natural miRNA of the present invention can suppress the expression of the target gene as described above, it is useful, for example, as a research tool for pharmaceuticals, diagnostic agents, agricultural chemicals, agriculture, medicine, life sciences and the like. .
  • the method for synthesizing the natural miRNA of the present invention is not particularly limited, and conventionally known methods for producing nucleic acids can be employed.
  • the synthesis method include a synthesis method using a genetic engineering technique, a chemical synthesis method, and the like.
  • genetic engineering techniques include in vitro transcription synthesis, a method using a vector, and a method using a PCR cassette.
  • the vector is not particularly limited, and examples thereof include non-viral vectors such as plasmids and viral vectors.
  • the chemical synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include a phosphoramidite method and an H-phosphonate method. In the chemical synthesis method, for example, a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used.
  • amidite is generally used.
  • the amidite is not particularly limited, and examples of commercially available amidites include RNA Phosphoramidates (2′-O-TBDMSi, trade name, Michisato Pharmaceutical), ACE amidite, TOM amidite, CEE amidite, CEM amidite, TEM amidite, and the like. Can be given.
  • the composition for suppressing expression of the present invention is a composition for suppressing the expression of a target gene, and includes the natural miRNA of the present invention.
  • the composition of the present invention is characterized by including the natural miRNA of the present invention, and other configurations are not limited at all.
  • the expression suppressing composition of the present invention can also be referred to as an expression suppressing reagent, for example.
  • expression of the target gene can be suppressed by administration to a subject in which the target gene exists.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is characterized by including the natural miRNA of the present invention.
  • the composition of the present invention is characterized by containing the natural miRNA of the present invention, and other configurations are not limited at all.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be referred to as a pharmaceutical product, for example.
  • treatment includes, for example, the meanings of prevention of the above-mentioned diseases, improvement of the diseases, and improvement of the prognosis.
  • the disease to be treated is not particularly limited, and examples thereof include diseases caused by gene expression.
  • a gene causing the disease is set as the target gene, and further, a guide strand sequence of the mature miRNA may be selected according to the target gene.
  • composition The method for using the expression-suppressing composition and pharmaceutical composition (hereinafter referred to as composition) of the present invention is not particularly limited.
  • the natural miRNA is administered to a subject having the target gene. That's fine.
  • Examples of the administration target include cells, tissues or organs.
  • Examples of the administration subject include non-human animals such as humans and non-human mammals other than humans.
  • the administration may be, for example, in vivo or in vitro.
  • the cells are not particularly limited, and examples thereof include various cultured cells such as HeLa cells, 293 cells, NIH3T3 cells, and COS cells, stem cells such as ES cells and hematopoietic stem cells, and cells isolated from living bodies such as primary cultured cells. can give.
  • the administration method is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the administration subject, for example.
  • the administration subject is a cultured cell
  • examples thereof include a method using a transfection reagent and an electroporation method.
  • composition of the present invention may contain, for example, only the natural miRNA of the present invention, or may contain other additives.
  • the additive is not particularly limited, and for example, a pharmaceutically acceptable additive is preferable.
  • the type of the additive is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on, for example, the type of administration target.
  • the natural miRNA may form a complex with the additive, for example.
  • the additive can also be referred to as a complexing agent, for example.
  • the complex formation for example, the natural miRNA can be efficiently delivered.
  • the complexing agent is not particularly limited, and examples thereof include a polymer, cyclodextrin, adamantine and the like.
  • examples of the cyclodextrin include a linear cyclodextrin copolymer and a linear oxidized cyclodextrin copolymer.
  • Examples of the additive include a carrier, a binding substance to a target cell, a condensing agent, a fusing agent, an excipient, and the like.
  • the expression suppression method of the present invention is a method of suppressing the expression of a target gene, and is characterized by using the natural miRNA of the present invention.
  • the expression suppression method of the present invention is characterized by using the natural miRNA of the present invention, and other steps and conditions are not limited at all.
  • the mechanism for suppressing the expression of the target gene is not particularly limited, and examples thereof include expression suppression by mature miRNA.
  • the expression suppression method of the present invention includes, for example, a step of administering the natural miRNA to a subject in which the target gene is present.
  • the natural miRNA is brought into contact with the administration subject.
  • the administration subject include cells, tissues, and organs.
  • the administration subject include non-human animals such as humans and non-human mammals other than humans.
  • the administration may be, for example, in vivo or in vitro.
  • the natural miRNA may be administered alone, or the composition of the present invention containing the natural miRNA may be administered.
  • the administration method is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on, for example, the type of administration target.
  • the treatment method of the disease of the present invention comprises the step of administering the natural miRNA of the present invention to a patient, wherein the guide strand sequence in the natural miRNA is used for the disease. It is a guide strand sequence of mature miRNA that suppresses the expression of the gene involved.
  • the therapeutic method of the present invention is characterized by using the natural miRNA of the present invention, and other steps and conditions are not limited at all.
  • the expression suppression method of the present invention can be used.
  • the administration method is not particularly limited, and may be, for example, oral administration or parenteral administration.
  • the use of the present invention is the use of the natural miRNA of the present invention for suppressing the expression of the target gene.
  • the single-stranded nucleic acid of the present invention is a single-stranded nucleic acid for use in the treatment of diseases, and the single-stranded nucleic acid is the natural miRNA of the present invention, and the guide strand in the natural miRNA
  • the sequence is a guide strand sequence of a mature miRNA that suppresses the expression of a gene involved in the disease.
  • Example 1 Based on the sequence information of the miR-34a guide strand and passenger strand (miRBase Accession No. MI0000268), various natural miRNAs of the present invention having different base lengths of additional sequences (spacers) are synthesized and introduced into cultured cells. Then, the expression suppression effect of the target gene AXL mRNA was examined.
  • a double-stranded human mature miR-34a (NI-0208) consisting of the following guide strand (SEQ ID NO: 1) and passenger strand (SEQ ID NO: 2), and A single-stranded natural miR-34a (NM-0004) was synthesized in which the guide strand and the passenger strand were linked via the sequence of the loop region of pre-miR-34a.
  • a double-stranded RNA (NI-0000) composed of a sequence not complementary to all sequences registered on the nucleic acid database and a sequence complementary thereto was synthesized.
  • an asterisk indicates a base that is non-complementary to the corresponding guide strand base.
  • NM-0004 SEQ ID NO: 11
  • SEQ ID NO: 12 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UGUGAGCAAUAGUAAGGAAGcaaucagcaaguauacugcccu-3 ' NI-0208
  • SEQ ID NO: 12 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU -3 '/ 5'-caaucagcaaguauacugcccu-3' NI-0000
  • SEQ ID NO: 12 / SEQ ID NO: 13 5'-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3 '/ 5'-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3'
  • a natural miRNA of an example an X region consisting of the guide strand (SEQ ID NO: 1) and an additional sequence (0, 3, 5 or 7 bases long), and the 5 'end of the passenger strand, A natural miR-34a was synthesized in which an overhang portion and a Y region having a sequence completely complementary to the additional sequence were linked via a non-nucleotide structure of a proline derivative represented by the following formula.
  • the non-nucleotide structure of the proline derivative represented by the following formula was introduced by using L-proline diamide amidite (see WO2012 / 017919).
  • an asterisk indicates a base that is non-complementary to the corresponding guide strand base.
  • the number after “spacer” indicates the base length of the additional sequence in the X region.
  • the underlined portion is the guide strand sequence, and the lower case letters are the passenger strand sequence.
  • [P] represents the non-nucleotide structure of the proline derivative.
  • PH-0036 (SEQ ID NO: 14) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU- [P] -Acaaucagcaaguauacugcccu-3 ' PH-0038 (SEQ ID NO: 15) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UCC- [P] -GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 ' PH-0066 (SEQ ID NO: 16) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UCCGG- [P] -CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 ' PH-0068 (SEQ ID NO: 17) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UCCGGCC- [P] -GGCCGG
  • RNA was dissolved in distilled water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) so as to be 2 ⁇ mol / L to prepare an RNA solution.
  • H1299 cells As cells, H1299 cells (ATCC) were used.
  • the medium used was RPMI Medium 1640 (Life Technologies) containing 10% FBS.
  • the culture conditions were 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cells were cultured in the above-mentioned medium, and the culture solution was dispensed into a 24-well plate in a volume of 400 ⁇ L at 4 ⁇ 10 4 cells / well.
  • the RNA was transfected using (A) transfection reagent Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) according to the protocol attached to the transfection reagent. Specifically, the composition per well was set as follows, and transfection was performed. In the following composition, (B) is Opti-MEM (Life Technologies), (C) is 2 ⁇ mol / L of the RNA solution, and 98.5 ⁇ L of both were added. In the well, the final concentration of RNA was 1 nmol / L.
  • PCR was performed using the synthesized cDNA as a template, and the expression level of the AXL gene and the expression level of the GAPDH gene as an internal standard were measured. The expression level of the AXL gene was corrected by the expression level of the GAPDH gene.
  • LightCycler 480 SYBR Green I Master (trade name, Roche) was used as a reagent
  • LightCycler 480 Instrument II (trade name, Roche) was used as a device (hereinafter the same).
  • the following primer sets were used for amplification of the AXL gene and GAPDH gene, respectively.
  • PCR primer set for AXL gene (SEQ ID NO: 18) 5'-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3 ' (SEQ ID NO: 19) 5'-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3 ' GAPDH gene primer set (SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 ' (SEQ ID NO: 21) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3 '
  • the gene expression level was also measured for cells in which only 100 ⁇ L of the solution (B) was added to the culture solution ( ⁇ ).
  • the RNA solution was not added, and the cells treated in the same manner except that (A) 1.5 ⁇ L and (B) were added in total 100 ⁇ L were also used for gene expression. The amount was measured (mock).
  • the expression level in the cells of the control ( ⁇ ) was taken as 1, and the relative value of the expression level in the cells into which each RNA was introduced was determined.
  • Example 2 Next, in the natural miR-34a (PH-0036) of Example 1, the non-nucleotide structure of the linker region was modified, and the effect of suppressing the expression of AXL mRNA was similarly examined.
  • linker region of PH-0036 is A molecule (KH-0006) substituted with a non-nucleotide structure of a lysine derivative of the formula:
  • GlyGly in the chemical formula (G2) is an atomic group represented by the following chemical formula (GlyGly), provided that the terminal carbonyl carbon in the chemical formula (GlyGly) is bonded to the N atom in the chemical formula (G2).
  • the terminal nitrogen atom in the following chemical formula (GlyGly) is bonded to the carbonyl carbon of the chemical formula (G2).
  • the non-nucleotide structure of the lysine derivative is L-lysinamide amidite (see WO2013 / 103146)
  • the non-nucleotide structure of the glycine derivative is glycineamide amidite (see WO2013 / 103146)
  • the non-nucleotide structure of the glycylglycine derivative was introduced by using glycylglycinamide amidite (see WO2013 / 133221) and the non-nucleotide structure of the terephthalic acid derivative by using terephthalic acid amidite (see WO2013 / 133221), respectively.
  • [K] is the non-nucleotide structure of the lysine derivative
  • [Gly] is the non-nucleotide structure of the glycine derivative
  • [GlyGly] is the non-nucleotide structure of the glycylglycine derivative
  • [TP] is the above-described sequence.
  • the non-nucleotide structure of a terephthalic acid derivative is shown respectively.
  • each linker is an X region, and in the X region, the underlined portion is the guide strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3′-side region of each linker is Y region, where the lower case letter is the passenger strand sequence.
  • Example 3 Next, the effect of introducing an additional sequence into the X region of XH-0015 having a non-nucleotide structure linker region of a terephthalic acid derivative used in Example 2 was examined.
  • the structure and sequence of the natural miR-34a used are shown below.
  • an asterisk indicates a base that is non-complementary to the corresponding guide strand base.
  • “Spacer” indicates that the X region includes an additional sequence.
  • [TP] represents the non-nucleotide structure of the terephthalic acid derivative.
  • XH-0015 (SEQ ID NO: 14) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU- [TP] -Acaaucagcaaguauacugcccu-3 '
  • XH-0024 (SEQ ID NO: 15) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UCC- [TP] -GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 '
  • H1299 cells (ATCC) were transfected with each RNA, and the expression level of AXL mRNA was determined. As a result, as shown in FIG. 4, even when an additional sequence was added to the X region, the effect of suppressing the expression of AXL mRNA was maintained.
  • Example 4 Based on the sequence information (miRBase Accession No. MI0000060) of the guide strand and passenger strand of mature let-7a, various natural miRNAs of the present invention having different non-nucleotide structures in the linker region were synthesized and introduced into cultured cells. The effect of suppressing the expression of the target gene, HMGA2 mRNA, was examined. As for those using a linker having a non-nucleotide structure of a proline derivative, those having an additional sequence introduced into the X region were also synthesized.
  • NI-0205 a double-stranded human mature let-7a (NI-0205) consisting of the following guide strand (SEQ ID NO: 3) and passenger strand (SEQ ID NO: 4), and A single-stranded natural let-7a (NM-0003) was synthesized in which the guide strand and the passenger strand were linked via the sequence of the loop region of pre-let-7a.
  • the NI-0000 was used as a negative control.
  • an asterisk indicates a base that is non-complementary to the corresponding guide strand base.
  • NM-0003 SEQ ID NO: 22
  • NI-0205 SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4
  • an X region consisting of the guide strand (SEQ ID NO: 3) and an additional sequence (0, 3 bases long), and an overhang portion of the guide strand and the addition at the 5 ′ end of the passenger strand Y region having a sequence completely complementary to the sequence is selected from the above-mentioned proline derivative ([P]), lysine derivative ([K]), glycine derivative ([Gly]), glycylglycine derivative ([GlyGly]) or terephthal
  • Various natural let-7a linked through a linker of an acid derivative ([TP]) were synthesized.
  • each non-nucleotide structure was introduced in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • spacer indicates that the X region contains an additional sequence.
  • [P] is the non-nucleotide structure of the proline derivative
  • [K] is the non-nucleotide structure of the lysine derivative
  • [Gly] is the non-nucleotide structure of the glycine derivative
  • [GlyGly] is the glycyl
  • the non-nucleotide structure of the glycine derivative and [TP] indicate the non-nucleotide structure of the terephthalic acid derivative, respectively.
  • each linker is an X region, and in the X region, the underlined portion is the guide strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3′-side region of each linker is Y region, where the lower case letter is the passenger strand sequence.
  • RNA was dissolved in distilled water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) so as to be 0.2 ⁇ mol / L to prepare an RNA solution.
  • A549 cells (DS Pharma Biomedical) were used.
  • DMEM fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were cultured in the above-mentioned medium, and the culture solution was dispensed into a 24-well plate in a volume of 400 ⁇ L at 4 ⁇ 10 4 cells / well.
  • the RNA was transfected using (A) transfection reagent Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) according to the protocol attached to the transfection reagent. Specifically, the composition per well was set as follows, and transfection was performed. In the following composition, (B) is Opti-MEM (Life Technologies), (C) is 0.2 ⁇ mol / L of the RNA solution, and 98.5 ⁇ L of both were added. In the well, the final concentration of RNA was 0.1 nmol / L.
  • PCR was performed using the synthesized cDNA as a template, and the expression level of the HMGA2 gene and the expression level of the GAPDH gene as an internal standard were measured.
  • LightCycler 480 SYBR Green I Master (trade name, Roche) was used as a reagent
  • LightCycler 480 Instrument II (trade name, Roche) was used as a device (hereinafter the same).
  • the following primer sets were used for amplification of the HMGA2 gene and GAPDH gene, respectively.
  • PCR primer set for HMGA2 gene (SEQ ID NO: 25) 5'-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3 ' (SEQ ID NO: 26) 5′-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3 ′ GAPDH gene primer set (SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 ' (SEQ ID NO: 21) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3 '
  • the gene expression level was also measured for cells in which only 100 ⁇ L of the solution (B) was added to the culture solution ( ⁇ ).
  • the RNA solution was not added, and the cells treated in the same manner except that (A) 1.5 ⁇ L and (B) were added in total 100 ⁇ L were also used for gene expression. The amount was measured (mock).
  • the expression level in the control ( ⁇ ) cells was taken as 1, and the relative value of the expression level in the cells into which each RNA was introduced was determined.
  • Example 5 Based on the sequence information of the miR-29b guide strand and passenger strand (miRBase Accession No. MI0000105), various natural miRNAs of the present invention having different non-nucleotide structures in the linker region were synthesized and introduced into cultured cells. Then, the expression suppression effect of the target gene COL1A1 mRNA was examined. As for those using a linker having a non-nucleotide structure of a proline derivative, those having an additional sequence introduced into the X region were also synthesized.
  • NI-0210 double-stranded human mature miR-29b consisting of a guide strand (SEQ ID NO: 9) and a passenger strand (SEQ ID NO: 10) shown below, and A single-stranded natural miR-29b (NM-0005) was synthesized in which the guide strand and the passenger strand were linked via the sequence of the loop region of pre-miR-29b.
  • the NI-0000 was used as a negative control.
  • an asterisk indicates a base that is non-complementary to the corresponding guide strand base.
  • the underlined portion is the guide strand sequence, and the lower case letters are the passenger strand sequence.
  • NM-0005 SEQ ID NO: 27
  • NI-0210 SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 9
  • an X region consisting of the passenger strand (SEQ ID NO: 10) and an additional sequence (0, 3 bases long), and an overhang portion of the passenger strand and the addition at the 5 ′ end of the guide strand Y region having a sequence completely complementary to the sequence is selected from the above-mentioned proline derivative ([P]), lysine derivative ([K]), glycine derivative ([Gly]), glycylglycine derivative ([GlyGly]) or terephthal
  • Various natural miR-29b linked via an acid derivative ([TP]) linker were synthesized.
  • each non-nucleotide structure was introduced in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • an asterisk indicates a base that is non-complementary to the corresponding guide strand base.
  • “Spacer” indicates that the X region includes an additional sequence.
  • [P] is the non-nucleotide structure of the proline derivative
  • [K] is the non-nucleotide structure of the lysine derivative
  • [Gly] is the non-nucleotide structure of the glycine derivative
  • [GlyGly] is the glycyl
  • the non-nucleotide structure of the glycine derivative and [TP] indicate the non-nucleotide structure of the terephthalic acid derivative, respectively.
  • the 5 ′ region of each linker is an X region, and in the X region, the lower case letter is the passenger strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3 ′ region of each linker is the Y region.
  • the underlined portion in the Y region is the guide strand sequence.
  • PH-0040 (SEQ ID NO: 28) 5'-gcugguuucauauggugguuuaga- [P] -UC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' KH-0008 (SEQ ID NO: 28) 5'-gcugguuucauauggugguuuaga- [K] -UC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' XH-0017 (SEQ ID NO: 28) 5'-gcugguuucauauggugguuuaga- [Gly] -UC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' XH-0019 (SEQ ID NO: 28) 5'-gcugguuucauauggugguuuaga- [GlyGly] -UC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' XH-0021 (SEQ ID NO: 28
  • RNA was dissolved in distilled water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) so as to be 2 ⁇ mol / L to prepare an RNA solution.
  • A549 cells (DS Pharma Biomedical) were used.
  • DMEM fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were cultured in the above-mentioned medium, and the culture solution was dispensed into a 24-well plate in a volume of 400 ⁇ L at 4 ⁇ 10 4 cells / well.
  • the RNA was transfected using (A) transfection reagent Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) according to the protocol attached to the transfection reagent. Specifically, the composition per well was set as follows, and transfection was performed. In the following composition, (B) is Opti-MEM (Life Technologies), (C) is 2 ⁇ mol / L of the RNA solution, and 98.5 ⁇ L of both were added. In the well, the final concentration of RNA was 1 nmol / L.
  • PCR was performed using the synthesized cDNA as a template, and the expression level of the COL1A1 gene and the expression level of the GAPDH gene as an internal standard were measured.
  • LightCycler 480 SYBR Green I Master (trade name, Roche) was used as a reagent
  • LightCycler 480 Instrument II (trade name, Roche) was used as a device (hereinafter the same).
  • the following primer sets were used for the amplification of the COL1A1 gene and the GAPDH gene, respectively.
  • PCR primer set for COL1A1 gene (SEQ ID NO: 30) 5'-CCCAAGGACAAGAGGCATGT-3 ' (SEQ ID NO: 31) 5'-CCGCCATACTCGAACTGGAA-3 ' GAPDH gene primer set (SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 ' (SEQ ID NO: 21) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3 '
  • the gene expression level was also measured for cells in which only 100 ⁇ L of the solution (B) was added to the culture solution ( ⁇ ).
  • the RNA solution was not added, and the cells treated in the same manner except that (A) 1.5 ⁇ L and (B) were added in total 100 ⁇ L were also used for gene expression. The amount was measured (mock).
  • the expression level in the cells of the control ( ⁇ ) was set to 1, and the relative value of the expression level in the cells into which each RNA was introduced was determined.
  • Example 6 Various natural miRNAs of the present invention that differ in the non-nucleotide structure of the linker region and the base length of the additional sequence in the X region based on the sequence information of the miR-34a guide strand and passenger strand (miRBase Accession No. MI0000268) was introduced into cultured cells, and the effect of suppressing the expression of the target gene, AXL mRNA, was examined.
  • natural miR-34a As in Example 2 was used for natural miR-34a (PH-0036, PH-0038 and PH-0066) in which the additional sequence is 0, 3 or 5 bases in length.
  • natural miR-34a having a modified non-nucleotide structure in the linker region was synthesized.
  • [K] is the non-nucleotide structure of the lysine derivative
  • [TP] is the non-nucleotide structure of the terephthalic acid derivative
  • [Gly] is the non-nucleotide structure of the glycine derivative
  • [GlyGly] is the glycylglycine derivative.
  • Each non-nucleotide structure is shown.
  • the 5 ′ region of each linker is an X region, and in the X region, the underlined portion is a guide strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3 ′ region of each linker is Y
  • the lower case letters in the Y region are passenger strand sequences.
  • Example 7 Various natural miRNAs of the present invention that differ in the non-nucleotide structure of the linker region and the base length of the additional sequence in the X region based on the sequence information (miRBase Accession No. MI0000060) of the guide strand and passenger strand of mature let-7a was introduced into cultured cells, and the effect of suppressing the expression of the target gene, HMGA2 mRNA, was examined.
  • [P] is the non-nucleotide structure of the proline derivative
  • [K] is the non-nucleotide structure of the lysine derivative
  • [TP] is the non-nucleotide structure of the terephthalic acid derivative
  • [Gly] is the non-nucleotide structure of the glycine derivative.
  • the structure [GlyGly] indicates the non-nucleotide structure of the glycylglycine derivative.
  • each linker is an X region, and in the X region, the underlined portion is the guide strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3′-side region of each linker is Y region, where the lower case letter is the passenger strand sequence.
  • Example 8 Various natural miRNAs of the present invention, which differ in the non-nucleotide structure of the linker region and the base length of the additional sequence in the X region, based on the sequence information (miRBase Accession No. MI0000105) of the guide strand and passenger strand of mature miR-29b was synthesized and introduced into cultured cells, and the effect of suppressing the expression of the target gene COL1A1 mRNA was examined.
  • [P] is the non-nucleotide structure of the proline derivative
  • [K] is the non-nucleotide structure of the lysine derivative
  • [TP] is the non-nucleotide structure of the terephthalic acid derivative
  • [Gly] is the non-nucleotide structure of the glycine derivative.
  • the structure [GlyGly] indicates the non-nucleotide structure of the glycylglycine derivative.
  • the 5 ′ region of each linker is an X region, and in the X region, the lower case letter is the passenger strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3 ′ region of each linker is the Y region.
  • the underlined portion in the Y region is the guide strand sequence.
  • PH-0040 (SEQ ID NO: 28) 5'-gcugguuucauauggugguuuaga- [P] -UC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' PH-0042 (SEQ ID NO: 29) 5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC- [P] -GGAUC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' PH-0108 (SEQ ID NO: 33) 5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG- [P] -CCGGAUC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' KH-0008 (SEQ ID NO: 28) 5'-gcugguuucauauggugguuuaga- [K] -UC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -3 ' KH-0022 (SEQ ID NO
  • Example 9 Based on the sequence information (miRBase Accession No. MI0000268) of the guide and passenger strands of mature miR-34a, various X-region additional sequences (0, 3, 5 or 7 bases in length) differ in the base sequence. Natural miRNA was synthesized and introduced into cultured cells, and the effect of suppressing the expression of the target gene, AXL mRNA, was examined.
  • an asterisk indicates a base that is non-complementary to the corresponding guide strand base.
  • the number after “spacer” indicates the base length of the additional sequence in the X region.
  • the underlined portion is the guide strand sequence, and the lower case letters are the passenger strand sequence.
  • [P] represents the non-nucleotide structure of the proline derivative.
  • PH-0036 (SEQ ID NO: 14) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU- [P] -Acaaucagcaaguauacugcccu-3 ' PH-0038 (SEQ ID NO: 15) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UCC- [P] -GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 ' PH-0058 (SEQ ID NO: 34) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UAA- [P] -UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3 ' PH-0059 (SEQ ID NO: 35) 5'- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU UGG- [P] -UUAAcaaucag
  • Example 10 Based on the sequence information (miRBase Accession No. MI0000105) of the guide and passenger strands of mature miR-29b, various X-region additional sequences (0, 3, 5 or 7 bases in length) differ in the base sequence. Natural miRNA was synthesized and introduced into cultured cells, and the effect of suppressing the expression of the target gene COL1A1 mRNA was examined.
  • the number after “spacer” indicates the base length of the additional sequence in the X region.
  • the 5 ′ side region of the linker is the X region, and in the X region, the lower case letter is the passenger strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3 ′ side region of the linker is the Y region, In the Y region, the underlined portion is the guide strand sequence.
  • [P] represents the non-nucleotide structure of the proline derivative.
  • Example 11 Based on the sequence information of the miR-29b guide strand and passenger strand (miRBase Accession No. MI0000105), the non-nucleotide structure of the linker region and the base sequence of the additional sequence (0, 4 or 5 bases in length) of the X region differ Various natural miRNAs of the present invention were synthesized and introduced into cultured cells, and the effect of suppressing the expression of the target gene COL1A1 mRNA was examined.
  • [P] represents the non-nucleotide structure of the proline derivative
  • [GlyGly] represents the non-nucleotide structure of the glycylglycine derivative.
  • the 5 ′ region of each linker is an X region, and in the X region, the lower case letter is the passenger strand sequence, the other is the additional sequence, and the 3 ′ region of each linker is the Y region.
  • the underlined portion in the Y region is the guide strand sequence.
  • the natural miRNA of the present invention can be easily synthesized at low cost, and the translation of the protein encoded by the gene can be suppressed. Since the natural miRNA of the present invention can suppress the expression of the target gene as described above, it is useful, for example, as a research tool for pharmaceuticals, diagnostic agents, agricultural chemicals, agriculture, medicine, life sciences and the like.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2014-266918 (filing date: December 27, 2014) and Japanese Patent Application No. 2015-130696 (filing date: June 29, 2015) filed in Japan. To be included in the document.

Abstract

　本発明は、Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、 前記Ｘ領域の３'末端と前記Ｙ領域の５'末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域を介して連結し、 前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡの（ａ）ガイド鎖配列または（ｂ）パッセンジャー鎖配列を含み、 （ａ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、 （ｂ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、 前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列とが、二重鎖構造を形成することを特徴とする、天然型ｍｉＲＮＡを提供する。

Description

遺伝子発現制御のための天然型ｍｉＲＮＡおよびその用途
　本発明は、遺伝子発現を抑制する天然型ｍｉＲＮＡおよびその用途に関する。
　マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内において、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリ（Ａ）を有するｍｉＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ（Ｄｒｏｓｈａ）により切断され、ｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このＰｒｅ－ｍｉＲＮＡは、核外に移動した後、細胞質のＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により分解され、３’末端に１～４塩基のオーバーハングを有する、二本鎖のｍｉＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）が切り出される。この二本鎖のｍｉＲＮＡのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、ＲＮＡ　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に類似した複合体に結合する。このｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによって、前記ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳が抑制される。
　ｍｉＲＮＡは、分化、細胞増殖、アポトーシス等の生命現象やウイルス感染症、ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが明らかになってきている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。このことから、特に医療分野における応用が期待されている。
ＷＯ　２０１０／０５６７３７　Ａ２
Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60 Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
　前記ｍｉＲＮＡを応用するにあたっては、例えば、二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡやｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを使用する方法等がある。しかし、前者の場合、使用に先立って、二本の一本鎖核酸分子をアニーリングする必要があり、また、二本鎖を認識するＴＬＲ３等によって自己免疫を発生する可能性がある。一方、後者の場合は、ヌクレオチド数が大きくなるため、合成が容易ではなくコスト面で不利であるばかりでなく、細胞内移行性や薬物動態の問題も存在する。
　そこで、本発明は、成熟ｍｉＲＮＡの構造を利用した、新たな天然型ｍｉＲＮＡの提供を目的とする。
　尚、本明細書において、「天然型ｍｉＲＮＡ」とは、天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とパッセンジャー鎖とを含み、かつ該成熟ｍｉＲＮＡと同質の活性（即ち、標的遺伝子の発現抑制活性）を有する一本鎖核酸分子を意味し、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖以外の部分に人工の構成要素を含むことを妨げない。
　前記目的を達成するために、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域を介して連結し、
前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡの（ａ）ガイド鎖配列または（ｂ）パッセンジャー鎖配列を含み、
（ａ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、
（ｂ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列とが、二重鎖構造を形成することを特徴とする。
　本発明の組成物は、遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
　本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
　本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。
　本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。
図１は、天然型ｍｉＲＮＡの一例を示す概略図である。 図２は、実施例１におけるＡＸＬ　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図３は、実施例２におけるＡＸＬ　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図４は、実施例３におけるＡＸＬ　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図５は、実施例４におけるＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図６は、実施例５におけるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図７は、実施例６におけるＡＸＬ　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図８は、実施例７におけるＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図９は、実施例８におけるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１０は、実施例９におけるＡＸＬ　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１１は、実施例１０におけるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１２は、実施例１１におけるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１３は、実施例１１におけるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。
　本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
（１）天然型ｍｉＲＮＡ
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域を介して連結し、
前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡの（ａ）ガイド鎖配列または（ｂ）パッセンジャー鎖配列を含み、
（ａ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、
（ｂ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列とが、二重鎖構造を形成することを特徴とする。
　前記Ｘ領域がガイド配列を含むか（ａ）、パッセンジャー鎖配列を含むか（ｂ）は、必ずしも制限されないが、好ましくは、ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列とは、天然に存在するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと同じ方向（即ち、5’→3’方向もしくは3’→5’方向）に配置される。即ち、天然に存在するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが5’方向からガイド鎖－ループ領域－パッセンジャー鎖の順序で配置されている場合、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前記Ｘ領域にガイド鎖配列を含むことが好ましく、逆に、天然に存在するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが3’方向からガイド鎖－ループ領域－パッセンジャー鎖の順序で配置されている場合、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前記Ｘ領域にパッセンジャー鎖配列を含むことが好ましい。
　後述の実施例でいえば、ｍｉＲ－３４ａやｌｅｔ－７ａは前記Ｘ領域にガイド鎖配列を含むことが好ましく、ｍｉＲ－２９ｂは前記Ｘ領域にパッセンジャー鎖配列を含むことが好ましい。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。さらに、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、自己免疫に関与するＴＬＲ３、ＲＩＧ-Ｉ、ＭＤＡ５等に認識されることも回避できる。
　また、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列とが、非ヌクレオチド構造のリンカー分子を介して連結されているため、比較的長いヌクレオチドループを有するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをもとにした一本鎖核酸分子に比べ、合成が容易かつ安価に提供でき、薬物動態や細胞内移行性にも優れる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおける前記Ｘ領域および前記Ｙ領域の配置関係の概略を、図１に示す。なお、図１は、概略であって、例えば、各領域の長さ、形状等は、制限されない。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、図１に示すように、５’側に前記Ｘ領域が配置され、３’側に前記Ｙ領域が配置され、前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域（図において「Ｐ」で表す）を介して連結している。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域は、任意の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列またはパッセンジャー鎖配列を含み、前記Ｘ領域が前記ガイド鎖配列を含む場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、前記Ｘ領域が前記パッセンジャー鎖配列を含む場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含むので、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とは、前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列との間で、分子内アニーリング（自己アニーリングともいう）する。即ち、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前記分子内アニーリングした領域において、二重鎖構造を形成する。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、その５’末端と３’末端とが未連結である、線状一本鎖核酸分子である。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、両末端の未結合の維持のため、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域は、前述のように、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列（パッセンジャー鎖配列）を含む。一方、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列（ガイド鎖配列）を含む。成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖配列は、例えば、各種データベースに登録されている（例えば、http://www.mirbase.org/等）。したがって、例えば、これらの公知の成熟ｍｉＲＮＡの情報に基づいて、前記Ｘ領域および前記Ｙ領域を設定できる。前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とは、RNA-induced　silencing　complex（ＲＩＳＣ）のArgonaute（Ａｇｏ）タンパク質に取り込まれ、ターゲットのｍＲＮＡに結合する鎖であり、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とは、最終的にＲＩＳＣから除かれる、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖に相補的な鎖である。通常、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、完全相補的ではなく、それぞれに１ないし数個の対形成しない塩基を含む。
　以下の説明では、前記Ｘ領域が前記ガイド鎖配列を含む場合を例にとって詳述するが、当業者であれば、以下の記載から、前記Ｘ領域が前記パッセンジャー鎖配列を含む態様における本発明の天然型ｍｉＲＮＡの構成を容易に理解することができる。
　前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列のみからなってもよいし、さらに付加配列を有してもよい。後者の場合、前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列と前記付加配列とからなり、前記付加配列は、例えば、前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー配列とをアライメントした際、ガイド鎖の３’末端側にオーバーハングを有する場合、前記Ｙ領域は、前記パッセンジャー鎖の５’末端側に前記オーバーハングの配列に相補的な配列を含む。また、前記Ｘ領域が付加配列を含む場合、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とをアライメントした際、前記Ｘ領域の付加配列と相補的な配列を含む。前記Ｘ領域の付加配列が前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している場合、前記相補的な配列は、前記パッセンジャー鎖配列の５’末端に連結している。前記相補的な配列は、前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー配列との二重鎖に連続する二重鎖構造を形成し得る限り、完全相補的でなくてもよいが、完全相補的であることが望ましい。前記Ｙ領域は、前記パッセンジャー配列と前記Ｘ領域の付加配列に相補的な配列とのみからなってもよいし、さらに前記Ｘ領域とは対形成しないオーバーハングを有してもよい。すなわち、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有してもよい。ここで、前記Ｙ領域のオーバーハングとは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした場合に、前記Ｙ領域が前記Ｘ領域よりも過剰に有する末端の塩基である。オーバーハングの長さ（Ｏ）は、例えば、下記式で表すことができる。
オーバーハングの長さ（Ｏ）＝［Ｙ領域の全長の塩基数（Ｙ）］－［Ｘ領域の全長の塩基数（Ｘ）］
　但し、多くの成熟ｍｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖の３’末端に、ガイド鎖と対形成しないオーバーハングを有しているので、前記Ｙ領域において、前記パッセンジャー鎖の３’末端側に、さらに人工のオーバーハングを付加する必要がない場合が多い。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、各領域の長さは、特に制限されない。以下に、条件を例示するが、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、これらの記載には限定されない。また、本発明において、塩基の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１～４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記Ｘ領域において、前記ガイド鎖配列の長さは、特に制限されず、例えば、報告されている成熟ｍｉＲＮＡにおけるガイド鎖配列の長さが例示できる。具体例として、下限が、例えば、１９塩基長、２０塩基長であり、上限が、例えば、２５塩基長、２４塩基長であり、範囲が、例えば、１９～２５塩基長、２０～２４塩基長である。
　前記Ｘ領域における前記付加配列の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長、２塩基長であり、上限が、例えば、７塩基長、５塩基長、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０～７塩基長、０～５塩基長、１～５塩基長、１～４塩基長、２～３塩基長、３～５塩基長である。前記付加配列の長さの範囲は、３～７塩基長が好ましく、３～５塩基長がより好ましい。
　前記Ｘ領域における前記付加配列の塩基配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さが３塩基長の場合、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＧ、ＵＣＣ、ＣＡＡ、ＣＧＧ、ＣＣＣ等が挙げられる。前記付加配列の長さが４塩基長の場合、例えば、ＵＡＡＵ、ＵＵＡＡ、ＵＵＧＧ、ＵＵＵＵ等が挙げられる。前記付加配列の長さが５塩基長の場合、例えば、ＵＡＡＵＵ、ＵＣＣＧＧ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＡ、ＵＵＵＡＵ、ＵＵＡＵＵ、ＵＡＵＵＵ、ＵＵＵＡＡ、ＵＵＡＵＡ、ＵＡＵＵＡ、ＵＵＡＡＵ、ＵＡＵＡＵ、ＵＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡ、ＵＡＡＵＡ、ＵＡＡＡＵ、ＵＡＡＡＡ、ＵＵＵＧＧ、ＡＵＵＡＡ、ＡＵＵＵＵ、ＣＵＵＡＡ、ＣＵＵＵＵ、ＧＵＵＡＡ、ＧＵＵＵＵ等が挙げられる。前記付加配列の長さが７塩基長の場合、例えば、ＵＡＡＵＵＡＡ、ＵＣＣＧＧＣＣ等が挙げられる。前記付加配列の塩基配列および前記付加配列と相補的な配列の塩基配列は、ＡＵリッチであることが好ましい。
　前記Ｘ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３５塩基長、３０塩基長、２８塩基長、２６塩基長であり、範囲が、例えば、１９～３５塩基長、１９～３０塩基長、２１～２８塩基長、２３～２６塩基長である。
　前記Ｙ領域における前記オーバーハング（前記パッセンジャー鎖自体がオーバーハングを有する場合はそれを含む）の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長であり、上限が、例えば、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０～４塩基長、１～３塩基長、２塩基長である。
　前記オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、ＴＴとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。
　前記Ｙ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３７塩基長、３２塩基長、３０塩基長、２８塩基長であり、範囲が、例えば、１９～３７塩基長、１９～３２塩基長、２１～３７塩基長、２１～３０塩基長、２３～２８塩基長である。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡの全長（Ｔ）は、特に制限されず、下限が、例えば、３８塩基長、４２塩基長、４６塩基長であり、上限が、例えば、７２塩基長、６２塩基長、５８塩基長、５４塩基長であり、範囲が、例えば、３８～７２塩基長、４０～６８塩基長、３８～６２塩基長、４２～５８塩基長、４６～５４塩基長である。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記成熟ｍｉＲＮＡの種類は、特に制限されず、標的とする遺伝子の種類に応じて、適宜選択できる。
　前記成熟ｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ（miRBase Accession No. MI0000268）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ（miRBase Accession No. MI0000060）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ（miRBase Accession No. MI0000067）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０（miRBase Accession No. MI0000479）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ（miRBase Accession No. MI0000105）等の成熟ｍｉＲＮＡがあげられる。
ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ（配列番号１／配列番号２）
　　　UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU ／CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ（配列番号３／配列番号４）
　　　UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU ／CUAUACAAUCUACUGUCUUUC
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ（配列番号５／配列番号６）
　　　UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU ／CUAUACAAUCUAUUGCCUUCCC
ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０（配列番号７／配列番号８）
　　　UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG ／CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG
ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ（配列番号１０／配列番号９）
　　　GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA ／UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
　ここで、各ヌクレオチド配列は、ガイド鎖配列／パッセンジャー配列（ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂのみパッセンジャー鎖配列／ガイド鎖配列）の順で、それぞれ5’→3’方向に記載している。
　ｍｉＲ－３４ａのガイド鎖は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＴ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＳＩＲＴ１、ＣＣＮＤ１、ＳＩＲＴ１、ＢＣＬ－２等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。
　ｌｅｔ－７ａのガイド鎖は、例えば、ＨＭＧＡ２（high　mobility　group　AT-hook　2）、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＴＬＲ４等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。
　ｌｅｔ－７fのガイド鎖は、例えば、ＨＭＧＡ２（high　mobility　group　AT-hook　2）、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＴＬＲ４等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。
　ｍｉＲ－１５０のガイド鎖は、例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ４、ＳＭＡＤ２、ＳＰ１等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺線維症、肝線維症等の疾患を予防または治療できる。
　ｍｉＲ－２９ｂのガイド鎖は、例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＣＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦｂ３等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、肺線維症、肝線維症等の疾患を予防または治療できる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡの構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１個もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。本発明の天然型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。
　前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
　前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
　前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等があげられる。
　前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記非ヌクレオチド構造のリンカー領域は、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含むことが好ましい。前記リンカー領域は、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基以外の残基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。例えば、前記リンカー領域は、ポリカルボン酸残基、テレフタル酸残基またはアミノ酸残基のいずれかを含むものであってよい。
　本発明において、「ポリアミン」は、アミノ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。前記「アミノ基」は、－ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（－ＮＨ－）も含む。本発明において、前記ポリアミンは、特に限定されないが、例えば、１，４－ジアミノベンゼン、１，３－ジアミノベンゼン、１，２－ジアミノベンゼン等が挙げられる。また、本発明において、「ポリカルボン酸」は、カルボキシ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。本発明において、前記ポリカルボン酸は、特に限定されないが、例えば、１，４－ジカルボキシベンゼン（テレフタル酸）、１，３－ジカルボキシベンゼン（イソフタル酸）、１，２－ジカルボキシベンゼン（フタル酸）等が挙げられる。また、本発明において、「アミノ酸」は、後述するように、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、－ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（－ＮＨ－）も含む。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記アミノ酸残基は、複数のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。なお、本発明において、複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基とは、例えば、ペプチド構造を含む残基をいう。より具体的には、前記複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基は、例えば、後述する化学式（Ｉ）のアミノ酸残基において、後述する化学式（Ｉａ）がペプチド（例えば、グリシン二量体またはグリシン三量体等）であるアミノ酸残基をいう。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記アミノ酸残基は、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基、プロリン残基またはリシン残基であってもよい。また、前記アミノ酸残基は、修飾アミノ酸残基またはアミノ酸の誘導体であってもよい。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー領域は、例えば、下記化学式（Ｉ－０）で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
前記化学式（Ｉ－０）中、
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記リンカー残基に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ－０）であり、
Ａは、任意の原子団である。
　前記Ｘ領域および前記Ｙ領域と、－ＯＲ１－および－ＯＲ２－との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
　前記Ｘ領域は、－ＯＲ２－を介して、前記Ｙ領域は、－ＯＲ１－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
　前記Ｘ領域は、－ＯＲ１－を介して、前記Ｙ領域は、－ＯＲ２－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
　前記化学式（Ｉ－０）において、例えば、Ｑ１１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ１がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１１がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。また例えば、Ｑ１２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ２がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１２がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。
　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２は、例えば、それぞれカルボニル基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表されることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　前記化学式（Ｉα２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄにおいて例示する後述の置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表されることがさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　なお、Ｑ１１およびＱ１２がカルボニル基であり、かつＱ１およびＱ２がイミノ基である場合、前記化学式（Ｉ－０）のリンカー残基は、カルボン酸アミド残基であるということもできるが、カルボン酸残基であるということもできる。例えば、後述の実施例における「TPA」構造は、テレフタル酸アミド残基であるということもできるが、前記化学式（Ｉα３）で表されるテレフタル酸の残基であるということもできる。
　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉβ）の構造が、下記化学式（Ｉβ２）で表されることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　前記化学式（Ｉβ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えば、前記化学式（Ｉα２）中のＲ１００と同様である。また、前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表されることがさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー残基が、アミノ酸残基である場合、前記アミノ酸残基は、例えば、下記化学式（Ｉ）で表わされる。なお、下記化学式（Ｉ）の構造は、前記化学式（Ｉ－０）で表される構造の一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　前記式（Ｉ）中、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１およびＬ２は、前記と同様である。
　前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　前記化学式（Ｉ）、（Ｉα）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、芳香族性原子団、ヘテロ芳香族性原子団、およびヘテロ脂環式原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。前記ヘテロ芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリール、縮環系ヘテロアリール、縮環系ヘテロアリールアルキル、縮環系アルキルヘテロアリール等が挙げられる。また、前記化学式（Ｉ）、（Ｉα）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
　本発明において、「アミノ酸」は、前述のとおり、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、－ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（－ＮＨ－）も含む。例えば、プロリン、ヒドロキシプロリン等は、分子中に－ＮＨ２基を含まず、イミノ基（－ＮＨ－）を含むが、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。本発明において、前記「アミノ酸」は、後述するとおり、天然アミノ酸でもよいし、人工アミノ酸でもよい。例えば、後述する化学式（Ｉａ２）または（Ｉａ３）で表される化合物も、分子中にアミノ基およびカルボキシ基を含むため、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。したがって、例えば、前記化学式（Ｉ）において、原子団Ａが、後述の化学式（Ａ２）または化学式（Ａ２ａ）で表される構造は、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、例えば、後述の実施例における「TPA」構造も、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、本発明において、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡの前記アミノ酸残基において、前記アミノ酸は、例えば、前述のとおり、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４－ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β－アラニン、１－アミノ－２－カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記化学式（Ｉａ）のペプチドでないアミノ酸に、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　前記化学式（Ｉａ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式（Ｉａ２）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉａ３）であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　なお、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ２）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２）で表される。下記化学式（Ａ２）中のＲ１００は、前記化学式（Ｉａ２）中のＲ１００と同じである。また、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ３）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２ａ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　前記化学式（Ｉ）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－７）が例示でき、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－７）において、ｎおよびｍは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　前記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－７）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（Ｉ－１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２、または、ｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ－４）においてｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ－６）において、ｎ＝４およびｍ＝４と、前記化学式（１－７）においてｎ＝５およびｍ＝４とがあげられる。その構造を、下記化学式（Ｉ－１ａ）、（Ｉ－１ｂ）、（Ｉ－４ａ）、（Ｉ－６ａ）および（Ｉ－７ａ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　あるいは、本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー領域は、例えば、下記式（ＩＩ）で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　前記式（ＩＩ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５またはＣ－６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素－炭素二重結合または炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（ＩＩ）である。
　前記式（ＩＩ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（ＩＩ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
　前記式（ＩＩ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
　前記式（ＩＩ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素－炭素二重結合または炭素－窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
　前記式（ＩＩ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５またはＣ－６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
　置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
　Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
　前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J.　F.　W.　McOmie,　「Protecting　Groups　in　Organic　Chemistry」　Prenum　Press,　London　and　New　York,　1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１－（２－シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２－シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
　前記式（ＩＩ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
　前記式（ＩＩ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
　Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記非ヌクレオチド構造の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０～３０が好ましく、より好ましくは０～２０であり、さらに好ましくは０～１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０～３０であり、好ましくは０～２０であり、より好ましくは０～１５である。
　Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
　前記式（ＩＩ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
　前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、例えば、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（ＩＩ）の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（ＩＩ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（ＩＩ）の構造の場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、前記式（ＩＩ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（ＩＩ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、前記式（ＩＩ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
　前記Ｘ領域および前記Ｙ領域と、－ＯＲ１－および－ＯＲ２－との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
　前記Ｘ領域は、－ＯＲ２－を介して、前記Ｙ領域は、－ＯＲ１－を介して、前記式（ＩＩ）の構造と結合する。
条件（２）
　前記Ｘ領域は、－ＯＲ１－を介して、前記Ｙ領域は、－ＯＲ２－を介して、前記式（ＩＩ）の構造と結合する。
　前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、下記式（ＩＩ－１）～式（ＩＩ－９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（ＩＩ）と同じである。下記式において、ｑは、０～１０の整数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　前記式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（ＩＩ－１）において、ｎ＝８、前記（ＩＩ－２）において、ｎ＝３、前記式（ＩＩ－３）において、ｎ＝４または８、前記（ＩＩ－４）において、ｎ＝７または８、前記式（ＩＩ－５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（ＩＩ－６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（ＩＩ－７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（ＩＩ－８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（ＩＩ－９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（ＩＩ－４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（ＩＩ－４ａ）に、前記式（ＩＩ－８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（ＩＩ－８ａ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１～３０であり、好ましくは、１～６であり、より好ましくは、１～４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
　本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２～８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１，３－ブタジエニル、３－メチル－２－ブテニル等があげられる。
　本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２～８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
　本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル、２－アントリル、９－アントリル、１－フェナントリル、２－フェナントリル、３－フェナントリル、４－フェナントリル、９－フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１－ナフチルおよび２－ナフチル等のナフチル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２－フリル、３－フリル）、チエニル（例：２－チエニル、３－チエニル）、ピロリル（例：１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル）、イミダゾリル（例：１－イミダゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１－ピラゾリル、３－ピラゾリル、４－ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４－トリアゾール－１－イル、１，２，４－トリアゾール－３－イル、１，２，４－トリアゾール－４－イル）、テトラゾリル（例：１－テトラゾリル、２－テトラゾリル、５－テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、５－オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３－イソキサゾリル、４－イソキサゾリル、５－イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３－イソチアゾリル、４－イソチアゾリル、５－イソチアゾリル）、ピリジル（例：２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル）、ピリダジニル（例：３－ピリダジニル、４－ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２－ピリミジニル、４－ピリミジニル、５－ピリミジニル）、フラザニル（例：３－フラザニル）、ピラジニル（例：２－ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）、ベンゾフリル（例：２－ベンゾ［ｂ］フリル、３－ベンゾ［ｂ］フリル、４－ベンゾ［ｂ］フリル、５－ベンゾ［ｂ］フリル、６－ベンゾ［ｂ］フリル、７－ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２－ベンゾ［ｂ］チエニル、３－ベンゾ［ｂ］チエニル、４－ベンゾ［ｂ］チエニル、５－ベンゾ［ｂ］チエニル、６－ベンゾ［ｂ］チエニル、７－ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１－ベンゾイミダゾリル、２－ベンゾイミダゾリル、４－ベンゾイミダゾリル、５－ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、６－キノキサリニル）、シンノリニル（例：３－シンノリニル、４－シンノリニル、５－シンノリニル、６－シンノリニル、７－シンノリニル、８－シンノリニル）、キナゾリル（例：２－キナゾリニル、４－キナゾリニル、５－キナゾリニル、６－キナゾリニル、７－キナゾリニル、８－キナゾリニル）、キノリル（例：２－キノリル、３－キノリル、４－キノリル、５－キノリル、６－キノリル、７－キノリル、８－キノリル）、フタラジニル（例：１－フタラジニル、５－フタラジニル、６－フタラジニル）、イソキノリル（例：１－イソキノリル、３－イソキノリル、４－イソキノリル、５－イソキノリル、６－イソキノリル、７－イソキノリル、８－イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２－プテリジニル、４－プテリジニル、６－プテリジニル、７－プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１－アクリジニル、２－アクリジニル、３－アクリジニル、４－アクリジニル、９－アクリジニル）、インドリル（例：１－インドリル、２－インドリル、３－インドリル、４－インドリル、５－インドリル、６－インドリル、７－インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１－フェナジニル、２－フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１－フェノチアジニル、２－フェノチアジニル、３－フェノチアジニル、４－フェノチアジニル）等があげられる。
　本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３～１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
　本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１－アダマンチル、２－アダマンチル等があげられる。
　本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
　本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３～７個である。前記シクロアルケニルは、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
　本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２－フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２－ヒドロキシエチル等があげられる。
　本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル－Ｏ－基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ－ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２－アミノエチル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１－ピロリニル、２－ピロリニル、３－ピロリニル、１－ピロリジニル、２－ピロリジニル、３－ピロリジニル、ピロリジノン、１－イミダゾリニル、２－イミダゾリニル、４－イミダゾリニル、１－イミダゾリジニル、２－イミダゾリジニル、４－イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１－ピラゾリニル、３－ピラゾリニル、４－ピラゾリニル、１－ピラゾリジニル、３－ピラゾリジニル、４－ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－ピペリジニル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニル、ピペラジノン、２－モルホリニル、３－モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２－ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン－３－イルメチル等があげられる。
　本発明において、「シリル」は、化学式Ｒ３Ｓｉ－で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
　本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
　本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ－メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明の天然型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を有する場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等のがん、肺線維症、肝線維症等の疾患があげられる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡの使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記天然型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
　前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏでもｉｎ　ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
　本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記成熟ｍｉＲＮＡを選択すればよい。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡの使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡの合成方法は、特に制限されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ－ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
（２）組成物
　本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
　本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
　また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
　本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
　本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を選択すればよい。
　本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記天然型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
　前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏでもｉｎ　ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
　前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
　本発明の組成物は、例えば、本発明の天然型ｍｉＲＮＡのみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
　本発明の組成物において、前記天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記天然型ｍｉＲＮＡを効率よくデリバリーすることができる。
　前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
　前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
（３）発現抑制方法
　本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
　本発明の発現抑制方法において、前記標的遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、成熟ｍｉＲＮＡによる発現抑制があげられる。
　本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記天然型ｍｉＲＮＡを投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記天然型ｍｉＲＮＡを接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏでもｉｎ　ｖｉｔｒｏでもよい。
　本発明の発現抑制方法は、例えば、前記天然型ｍｉＲＮＡを単独で投与してもよいし、前記天然型ｍｉＲＮＡを含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
（４）治療方法
　本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
　本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
（５）天然型ｍｉＲＮＡの使用
　本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡの使用である。
　本発明の一本鎖核酸は、疾患の治療に使用するための一本鎖核酸であって、前記一本鎖核酸は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡであり、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする。
　以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
　成熟ｍｉＲ－３４ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000268）に基づいて、付加配列（スペーサー）の塩基長の異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号１）およびパッセンジャー鎖（配列番号２）からなる、二本鎖のヒト成熟ｍｉＲ－３４ａ（ＮＩ－０２０８）、並びに、前記ガイド鎖と前記パッセンジャー鎖とを、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３４ａのループ領域の配列を介して連結した一本鎖の天然型ｍｉＲ－３４ａ（ＮＭ－０００４）を合成した。
　また、ネガティブコントロールとして、核酸データベース上で登録されているすべての配列に相補性を有さない配列とそれに相補的な配列とからなる二本鎖ＲＮＡ（ＮＩ－００００）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。
　下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＮＭ－０００４（配列番号１１）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＮＩ－０２０８（配列番号１／配列番号２）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’/5’-caaucagcaaguauacugcccu-3’
ＮＩ－００００（配列番号１２／配列番号１３）
　5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’/5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’
　実施例の天然型ｍｉＲＮＡとして、前記ガイド鎖（配列番号１）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、前記パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、下記式のプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している天然型ｍｉＲ－３４ａを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、下記式のプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造は、Ｌ－プロリンジアミドアミダイト（ＷＯ２０１２／０１７９１９参照）を使用することにより導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」の後の数字は、前記Ｘ領域の付加配列の塩基長を示す。
　下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。また、［P］は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＰＨ－００３６（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００３８（配列番号１５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６６（配列番号１６）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６８（配列番号１７）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGGCC-[P]-GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡを、２μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
　細胞は、Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ　１６４０（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
　まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ＲＮＡを（Ａ）トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（Ｃ）は、２μｍｏｌ／Ｌ　前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＡＸＬ遺伝子の発現量および内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。前記ＡＸＬ遺伝子の発現量は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。
　前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　I　Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＡＸＬ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＡＸＬ遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
　　（配列番号１８）　5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’
　　（配列番号１９）　5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
　　（配列番号２０）　5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
　　（配列番号２１）　5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ 
　なお、コントロール１として、前記培養液に前記（Ｂ）液１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（－）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
　補正後のＡＸＬ遺伝子の発現量について、コントロール（－）の細胞における発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
（３）結果
　図２に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ－３４ａは、ポジティブコントロールの成熟ｍｉＲ－３４ａやｐｒｅ－ｍｉＲ－３４ａ改変体と同程度に、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列の塩基長を変化させても、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例２）
　次に、実施例１の天然型ｍｉＲ－３４ａ（ＰＨ－００３６）において、リンカー領域の非ヌクレオチド構造を改変して、同様にＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　以下に示すように、ＰＨ－００３６のリンカー領域を、
下記式のリシン誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＫＨ－０００６）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
下記式のグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＸＨ－００１１）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
下記式のグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＸＨ－００１３）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
前記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙは、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）で表される原子団であり、ただし、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端のカルボニル炭素は、上記化学式（Ｇ２）中のＮ原子に結合しており、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端の窒素原子は、上記化学式（Ｇ２）のカルボニル炭素に結合している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
並びに、下記式のテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＸＨ－００１５）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
をそれぞれ合成した。前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造は、Ｌ－リシンアミドアミダイト（ＷＯ２０１３／１０３１４６参照）を、前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造は、グリシンアミドアミダイト（ＷＯ２０１３／１０３１４６参照）を、前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造は、グリシルグリシンアミドアミダイト（ＷＯ２０１３／１３３２２１参照）を、前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造は、テレフタル酸アミダイト（ＷＯ２０１３／１３３２２１参照）を、それぞれ使用することにより導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　下記配列において、[K]は前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]は前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]は前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＫＨ－０００６（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００１１（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００１３（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００１５（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
　実施例１と同様に、ポジティブコントロールとして、ＮＭ－０００４およびＮＩ－０２０８を、ネガティブコントロールとして、ＮＩ－００００を用いた。
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
　実施例１と同様の方法により、前記各ＲＮＡでＨ１２９９細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトし、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現量を求めた。
（３）結果
　図３に示すように、リンカー領域の非ヌクレオチド構造を改変しても、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例３）
　次に、実施例２で用いた、テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造のリンカー領域を有するＸＨ－００１５について、Ｘ領域に付加配列を導入した場合の効果について調べた。使用した天然型ｍｉＲ－３４ａの構造および配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」は、前記Ｘ領域が付加配列を含むことを示す。
　下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。また、［TP］は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＸＨ－００１５（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００２４（配列番号１５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
　実施例１と同様の方法により、前記各ＲＮＡでＨ１２９９細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトし、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現量を求めた。
　その結果、図４に示すように、Ｘ領域に付加配列を加えても、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例４）
　成熟ｌｅｔ－７ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000060）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造の異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を有するリンカーを用いたものについては、Ｘ領域に付加配列を導入したものも合成した。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号３）およびパッセンジャー鎖（配列番号４）からなる、二本鎖のヒト成熟ｌｅｔ－７ａ（ＮＩ－０２０５）、並びに、前記ガイド鎖と前記パッセンジャー鎖とを、ｐｒｅ－ｌｅｔ－７ａのループ領域の配列を介して連結した一本鎖の天然型ｌｅｔ－７ａ（ＮＭ－０００３）を合成した。
　また、ネガティブコントロールとして、前記ＮＩ－００００を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。
　下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＮＭ－０００３（配列番号２２）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＮＩ－０２０５（配列番号３／配列番号４）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’/5’-cuauacaaucuacugucuuuc-3’
　以下に示すように、前記ガイド鎖（配列番号３）と付加配列（０、３塩基長）とからなるＸ領域と、前記パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、前記プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、グリシン誘導体（[Gly]）、グリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）またはテレフタル酸誘導体（[TP]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｌｅｔ－７ａを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　前記配列において、「spacer」は、前記Ｘ領域が付加配列を含むことを示す。
　下記配列において、[P]は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]は前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]は前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]は前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＰＨ－００１１（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ－０００３（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－０００２（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－０００４（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－０００６（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＰＨ－００１４（配列番号２４）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
（２）ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡを、０．２μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
　細胞は、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
　まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ＲＮＡを（Ａ）トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（Ｃ）は、０．２μｍｏｌ／Ｌ　前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、０．１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量および内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。前記ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。
　前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　I　Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＨＭＧＡ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＨＭＧＡ２遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
　　（配列番号２５）　5’-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3’
　　（配列番号２６）　5’-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3’
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
　　（配列番号２０）　5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
　　（配列番号２１）　5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ 
　なお、コントロール１として、前記培養液に前記（Ｂ）液１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（－）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
　補正後のＨＭＧＡ２遺伝子の発現量について、コントロール（－）の細胞における発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
（３）結果
　図５に示すように、実施例の天然型ｌｅｔ－７ａは、ポジティブコントロールの成熟ｌｅｔ－７ａやｐｒｅ－ｌｅｔ－７ａ改変体と同程度に、ＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例５）
　成熟ｍｉＲ－２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造の異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を有するリンカーを用いたものについては、Ｘ領域に付加配列を導入したものも合成した。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号９）およびパッセンジャー鎖（配列番号１０）からなる、二本鎖のヒト成熟ｍｉＲ－２９ｂ（ＮＩ－０２１０）、並びに、前記ガイド鎖と前記パッセンジャー鎖とを、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２９ｂのループ領域の配列を介して連結した一本鎖の天然型ｍｉＲ－２９ｂ（ＮＭ－０００５）を合成した。
　また、ネガティブコントロールとして、前記ＮＩ－００００を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。
　下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＮＭ－０００５（配列番号２７）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAAAUAGUGAUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＮＩ－０２１０（配列番号１０／配列番号９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-3’/5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
　以下に示すように、前記パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、３塩基長）とからなるＸ領域と、前記ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、前記プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、グリシン誘導体（[Gly]）、グリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）またはテレフタル酸誘導体（[TP]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｍｉＲ－２９ｂを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」は、前記Ｘ領域が付加配列を含むことを示す。
　下記配列において、[P]は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]は前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]は前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]は前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。
ＰＨ－００４０（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ－０００８（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００１７（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００１９（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００２１（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－００４２（配列番号２９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
　また、ネガティブコントロールとして、実施例１で合成したＮＩ－００００を使用した。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡを、２μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
　細胞は、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
　まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ＲＮＡを（Ａ）トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（Ｃ）は、２μｍｏｌ／Ｌ　前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量および内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。前記ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。
　前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　I　Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＣＯＬ１Ａ１遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
　　（配列番号３０）　5’-CCCAAGGACAAGAGGCATGT-3’
　　（配列番号３１）　5’-CCGCCATACTCGAACTGGAA-3’
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
　　（配列番号２０）　5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
　　（配列番号２１）　5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ 
　なお、コントロール１として、前記培養液に前記（Ｂ）液１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（－）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
　補正後のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量について、コントロール（－）の細胞における発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
（３）結果
　図６に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ－２９ｂは、ポジティブコントロールの成熟ｍｉＲ－２９ｂやｐｒｅ－ｍｉＲ－２９ｂ改変体と同程度に、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例６）
　成熟ｍｉＲ－３４ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000268）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列の塩基長が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　実施例１と同様の方法により、ガイド鎖（配列番号１）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している天然型ｍｉＲ－３４ａ（ＰＨ－００３６、ＰＨ－００３８、ＰＨ－００６６およびＰＨ－００６８）を合成した。
　また、上記天然型ｍｉＲ－３４ａのうち、付加配列が０、３または５塩基長である天然型ｍｉＲ－３４ａ（ＰＨ－００３６、ＰＨ－００３８およびＰＨ－００６６）において、実施例２と同様の方法により、リンカー領域の非ヌクレオチド構造を改変した天然型ｍｉＲ－３４ａを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　下記配列において、[K]はリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]はテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]はグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部はガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字はパッセンジャー鎖配列である。
ＫＨ－０００６（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＫＨ－００１８（配列番号１５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[K]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＫＨ－００１９（配列番号１６）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[K]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００１５（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００２４（配列番号１５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００４２（配列番号１６）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[TP]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００１１（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００４３（配列番号１５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[Gly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００４４（配列番号１６）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[Gly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００１３（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００４５（配列番号１５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[GlyGly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ－００４６（配列番号１６）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[GlyGly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
　また、ポジティブコントロールとして、実施例１のＮＩ－０２０８を用いた。
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡの最終濃度が２ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例１と同様の方法により、ＡＸＬ遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
　図７に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ－３４ａは、ポジティブコントロールのｐｒｅ－ｍｉＲ－３４ａ改変体と同程度に、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例７）
　成熟ｌｅｔ－７ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000060）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列の塩基長が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　実施例４と同様の方法により、ガイド鎖（配列番号３）と付加配列（０、３または５塩基長）とからなるＸ領域と、パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、テレフタル酸誘導体（[TP]）、グリシン誘導体（[Gly]）またはグリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｌｅｔ－７ａを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　下記配列において、[P]はプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]はリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]はテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]はグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＰＨ－００１１（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＰＨ－００１４（配列番号２４）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＰＨ－０１０７（配列番号３２）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[P]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ－０００３（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ－００２０（配列番号２４）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[K]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ－００２１（配列番号３２）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[K]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－０００６（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－００４７（配列番号２４）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[TP]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－００４８（配列番号３２）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[TP]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－０００２（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－００４９（配列番号２４）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[Gly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－００５０（配列番号３２）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[Gly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－０００４（配列番号２３）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－００５１（配列番号２４）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[GlyGly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ－００５２（配列番号３２）
　5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[GlyGly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
　また、ポジティブコントロールとして、実施例４のＮＩ－０２０５を用いた。
（２）ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡを導入する細胞がＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ）である点、および前記各ＲＮＡの最終濃度が０.２ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例４と同様の方法により、ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
　図８に示すように、実施例の天然型ｌｅｔ－７ａは、ポジティブコントロールのｐｒｅ－ｌｅｔ－７ａ改変体と同程度に、ＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＨＭＧＡ２　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例８）
　成熟ｍｉＲ－２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列の塩基長が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　実施例５と同様の方法により、パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、３または５塩基長）とからなるＸ領域と、ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、テレフタル酸誘導体（[TP]）、グリシン誘導体（[Gly]）またはグリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｍｉＲ－２９ｂを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　下記配列において、[P]はプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]はリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]はテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]はグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。
ＰＨ－００４０（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－００４２（配列番号２９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１０８（配列番号３３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ－０００８（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ－００２２（配列番号２９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[K]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ－００２３（配列番号３３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[K]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００２１（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００５３（配列番号２９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[TP]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００５４（配列番号３３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[TP]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００１７（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００５５（配列番号２９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[Gly]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００５６（配列番号３３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[Gly]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００１９（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００５７（配列番号２９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[GlyGly]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００５８（配列番号３３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[GlyGly]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
　また、ポジティブコントロールとして、実施例５のＮＩ－０２１０を用いた。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡの最終濃度が０．５ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例５と同様の方法により、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
　図９に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ－２９ｂは、ポジティブコントロールのｐｒｅ－ｍｉＲ－２９ｂ改変体と同程度に、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例９）
　成熟ｍｉＲ－３４ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000268）に基づいて、Ｘ領域の付加配列（０、３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　実施例１と同様の方法により、ガイド鎖（配列番号１）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に相補的な配列（完全相補的または部分相補的な配列）を有するＹ領域とが、プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している天然型ｍｉＲ－３４ａを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」の後の数字は、前記Ｘ領域の付加配列の塩基長を示す。
　下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。また、［P］は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＰＨ－００３６（配列番号１４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００３８（配列番号１５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００５８（配列番号３４）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAA-[P]-UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００５９（配列番号３５）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P]-UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６０（配列番号３６）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCGG-[P]-CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６１（配列番号３７）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCAA-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６２（配列番号３８）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCGG-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６３（配列番号３９）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P]-CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６４（配列番号４０）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAA-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６５（配列番号４１）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６６（配列番号１６）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６７（配列番号４２）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAAUU-[P]-AAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６８（配列番号１７）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGGCC-[P]-GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ－００６９（配列番号４３）
　5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAAUUAA-[P]-UUAAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
　また、ポジティブコントロールとして、実施例１のＮＩ－０２０８を用いた。
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
　実施例１と同様の方法により、ＡＸＬ遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
　図１０に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ－３４ａは、ポジティブコントロールのｐｒｅ－ｍｉＲ－３４ａ改変体と同程度に、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列（３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる場合も、ＡＸＬ　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例１０）
　成熟ｍｉＲ－２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、Ｘ領域の付加配列（０、３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　実施例５と同様の方法により、パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、前記ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に相補的な配列（完全相補的または部分相補的な配列）を有するＹ領域とが、プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している種々の天然型ｍｉＲ－２９ｂを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　前記配列中、「spacer」の後の数字は、前記Ｘ領域の付加配列の塩基長を示す。
　下記配列において、リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。また、[P]は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＰＨ－００４０（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－００４２（配列番号２９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１０９（配列番号４４）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]-UUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１０（配列番号４５）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-UUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１１（配列番号４６）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]-CCGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１２（配列番号４７）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaCAA-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１３（配列番号４８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１４（配列番号４９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-CCGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１５（配列番号５０）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１６（配列番号５１）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１０８（配列番号３３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１７（配列番号５２）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]-AAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１８（配列番号５３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGGCC-[P]-GGCCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１９（配列番号５４）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUUAA-[P]-UUAAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
　また、ポジティブコントロールとして、実施例５のＮＩ－０２１０を用いた。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡの最終濃度が０．５ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例５と同様の方法により、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
　図１１に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ－２９ｂは、ポジティブコントロールのｐｒｅ－ｍｉＲ－２９ｂ改変体と同程度に、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列（３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる場合も、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例１１）
　成熟ｍｉＲ－２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列（０、４または５塩基長）の塩基配列が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
　実施例５と同様の方法により、パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、４または５塩基長）とからなるＸ領域と、前記ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に相補的な配列（完全相補的または部分相補的な配列）を有するＹ領域とが、プロリン誘導体（[P]）またはグリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｍｉＲ－２９ｂを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　下記配列において、[P]はプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。
ＰＨ－００４０（配列番号２８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１１７（配列番号５２）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]-AAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２０（配列番号５５）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]-AAAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２１（配列番号５６）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUA-[P]-UAAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２２（配列番号５７）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAU-[P]-AUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２３（配列番号５８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAUU-[P]-AAUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２４（配列番号５９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUU-[P]-AAAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２５（配列番号６０）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２６（配列番号６１）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAUA-[P]-UAUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２７（配列番号６２）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUA-[P]-UAAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２８（配列番号６３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAU-[P]-AUUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１２９（配列番号６４）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUAU-[P]-AUAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３０（配列番号６５）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAA-[P]-UUUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３１（配列番号６６）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUAA-[P]-UUAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３２（配列番号６７）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUA-[P]-UAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３３（配列番号６８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAU-[P]-AUUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３４（配列番号６９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAA-[P]-UUUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３５（配列番号７０）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUGG-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３６（配列番号７１）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３７（配列番号７２）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaAUUAA-[P]-UUAAUUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３８（配列番号７３）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaAUUUU-[P]-AAAAUUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１３９（配列番号７４）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaCUUAA-[P]-UUAAGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１４０（配列番号７５）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaCUUUU-[P]-AAAAGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１４１（配列番号７６）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaGUUAA-[P]-UUAACUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１４２（配列番号７７）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaGUUUU-[P]-AAAACUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１４３（配列番号７８）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAU-[P]-AUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１４４（配列番号７９）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAA-[P]-UUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１４５（配列番号８０）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUGG-[P]-UUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ－０１４６（配列番号８１）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUU-[P]-UUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ－００５９（配列番号６０）
　5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[GlyGly]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
　また、ポジティブコントロールとして、実施例５のＮＩ－０２１０を用いた。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
　前記各ＲＮＡの最終濃度が０．５ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例５と同様の方法により、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
　図１２及び図１３に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ－２９ｂは、ポジティブコントロールと同程度に、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列（４または５塩基長）の塩基配列が異なる場合も、ＣＯＬ１Ａ１　ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本発明の天然型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
　本出願は、日本でされた特願２０１４-２６６９１８（出願日２０１４年１２月２７日）及び特願２０１５-１３０４９６（出願日２０１５年６月２９日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (54)

  1. 　Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
    前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域を介して連結し、
    前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡの（ａ）ガイド鎖配列または（ｂ）パッセンジャー鎖配列を含み、
    （ａ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、
    （ｂ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
    前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列とが、二重鎖構造を形成することを特徴とする、天然型ｍｉＲＮＡ。
  2. 　前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有する、請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  3. 　前記オーバーハングが、０～４塩基長である、請求項２記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  4. 　前記Ｘ領域が、前記ガイド鎖またはパッセンジャー鎖配列と付加配列とからなり、前記付加配列が、前記ガイド鎖またはパッセンジャー鎖配列の３’末端に連結している、請求項１から３のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  5. 　前記Ｘ領域における前記付加配列の長さが、０～７塩基長である、請求項４記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  6. 　前記Ｘ領域の長さが、１９～３５塩基長である、請求項１から５のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  7. 　前記Ｙ領域の長さが、２１～３７塩基長である、請求項１から６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  8. 　全長が、４０～６８塩基長である、請求項１から７のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  9. 　前記リンカー領域が、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含む請求項１から８のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  10. 　前記リンカー領域が、ポリカルボン酸残基を含む、請求項９に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  11. 　前記ポリカルボン酸残基が、テレフタル酸残基である、請求項１０に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  12. 　前記リンカー領域が、アミノ酸残基を含む、請求項９に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  13. 　前記アミノ酸残基が、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基、プロリン残基またはリシン残基である、請求項１２に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  14. 　前記アミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものである、請求項１２または１３に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  15. 　前記複数のアミノ酸残基が連結したものが、グリシン二量体または三量体の残基である、請求項１４に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  16. 　前記リンカー残基が、下記化学式（Ｉ－０）で表される請求項１から１５のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     前記化学式（Ｉ－０）中、
    Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
    Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
    前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記リンカー残基に結合し、
    ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ－０）であり、
    Ａは、任意の原子団である。
  17. 　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれカルボニル基である請求項１６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  18. 　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基である請求項１７記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  19. 　下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表される請求項１７または１８に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     前記化学式（Ｉα２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  20. 　前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表される請求項１４記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  21. 　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基である請求項１６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  22. 　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基である請求項２１記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  23. 　下記化学式（Ｉβ）の構造が、下記化学式（Ｉβ２）で表される請求項１６または１７記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     前記化学式（Ｉβ２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  24. 　前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表される請求項２３記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  25. 　前記リンカー領域が、アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基が、下記化学式（Ｉ）で表される請求項１から３および６から１０のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     前記化学式（Ｉ）中、
    Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
    前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
    ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
    Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  26. 　前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、天然アミノ酸および人工アミノ酸の少なくとも一方である請求項１から３、６から１０および２０のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  27. 　前記天然アミノ酸が、タンパク質を構成するアミノ酸である請求項２６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  28. 　前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、グリシン、α－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４－ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β－アラニン、１－アミノ－２－カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であり、前記アミノ酸は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項１から９、１２から１５、２５および２６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     前記化学式（Ｉａ２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  29. 　前記化学式（Ｉａ２）の構造が、下記化学式（Ｉａ３）で表される請求項２８記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  30. 　前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造が、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－７）であり、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－７）において、ｎは、０～３０の整数、ｍは、０～３０の整数である、請求項１６または２５記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  31. 　前記化学式（Ｉ－１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２、またはｎ＝５およびｍ＝４である、請求項３０記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  32. 　前記化学式（Ｉ－４）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項３０記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  33. 　前記化学式（Ｉ－６）において、ｎ＝４およびｍ＝４である、請求項３０記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  34. 　前記化学式（Ｉ－７）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項３０記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  35. 　前記リンカー領域の非ヌクレオチド構造が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む、請求項１から９、１２および１３のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  36. 　前記非ヌクレオチド構造が、下記式（ＩＩ）で表わされる、請求項１から８のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     前記式中、
    Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５またはＣ－６に結合する水素原子または置換基であり；
    Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｌは、１または２であり；
    ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
    環Ａは、前記環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
    前記環Ａ内に、炭素－炭素二重結合または炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
    前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合し、
    ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
  37. 　前記Ｘ領域は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４またはｈｓａ－ｌｅｔ－７の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  38. 　前記成熟ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａである、請求項３７記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  39. 　ヌクレオチド配列が、配列番号１４～１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項３８記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  40. 　ヌクレオチド配列が、配列番号３４～４３からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項３８記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  41. 　前記成熟ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａである、請求項３７記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  42. 　ヌクレオチド配列が、配列番号２３または２４のヌクレオチド配列である、請求項４１記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  43. 　ヌクレオチド配列が、配列番号３２のヌクレオチド配列である、請求項４１記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  44. 　前記Ｘ領域は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂの成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  45. 　ヌクレオチド配列が、配列番号２８または２９のヌクレオチド配列である、請求項４４記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  46. 　ヌクレオチド配列が、配列番号３３および４４～８１からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項４４記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  47. 　標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
    請求項１から４６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
  48. 　請求項１から４６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、薬学的組成物。
  49. 　標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
    請求項１から４６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする、発現抑制方法。
  50. 　前記天然型ｍｉＲＮＡを、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項４９記載の発現抑制方法。
  51. 　前記天然型ｍｉＲＮＡを、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで投与する、請求項４９または５０記載の発現抑制方法。
  52. 　前記天然型ｍｉＲＮＡを、非ヒト動物に投与する、請求項４９または５０記載の発現抑制方法。
  53. 　疾患の治療方法であって、
    請求項１から４６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、
    前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする、治療方法。
  54. 　疾患の治療に使用するための一本鎖核酸であって、
    前記一本鎖核酸は、請求項１から４６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡであり、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする、一本鎖核酸。
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ES15873343T ES2872527T3 (es) 2014-12-27 2015-12-25 miARN natural para controlar la expresión génica y uso del mismo
CN201580071374.5A CN107109415B (zh) 2014-12-27 2015-12-25 控制基因表达的天然型miRNA及其用途
MX2017008587A MX2017008587A (es) 2014-12-27 2015-12-25 Mirna natural para controlar la expresion de gen y uso del mismo.
BR112017013664-3A BR112017013664A2 (ja) 2014-12-27 2015-12-25 Naturally occurring type miRNA for gene expression control, and its use
SG11201705223XA SG11201705223XA (en) 2014-12-27 2015-12-25 NATURALLY OCCURING miRNA FOR CONTROLLING GENE EXPRESSION, AND USE OF SAME
IL252880A IL252880B (en) 2014-12-27 2017-06-13 Natural micro-RNA for controlling gene expression, and its use
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018143475A1 (ja) 2017-02-06 2018-08-09 日産化学工業株式会社 一本鎖オリゴヌクレオチド
WO2018182008A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 株式会社ボナック 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子
WO2019074110A1 (ja) 2017-10-13 2019-04-18 株式会社ボナック 一本鎖核酸分子およびその製造方法
WO2019156020A1 (ja) * 2018-02-09 2019-08-15 住友化学株式会社 核酸分子の製造方法
WO2019182037A1 (ja) 2018-03-20 2019-09-26 国立大学法人東京工業大学 毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチド

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105899663B (zh) 2013-12-26 2019-07-26 学校法人东京医科大学 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途
CN106068324B (zh) 2013-12-27 2020-12-29 株式会社博纳克 控制基因表达的人工匹配型miRNA及其用途
JP6602847B2 (ja) 2015-03-27 2019-11-06 株式会社ボナック デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006137941A2 (en) * 2004-11-12 2006-12-28 Ambion, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
WO2012017919A1 (ja) * 2010-08-03 2012-02-09 株式会社ボナック 含窒素脂環式骨格を有する一本鎖核酸分子
WO2012106591A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of mir-34
WO2013077446A1 (ja) * 2011-11-26 2013-05-30 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
WO2013103146A1 (ja) * 2012-01-07 2013-07-11 株式会社ボナック アミノ酸骨格を有する一本鎖核酸分子
JP2013153736A (ja) * 2012-01-07 2013-08-15 Bonac Corp ペプチド骨格を有する一本鎖核酸分子
WO2013133221A1 (ja) * 2012-03-04 2013-09-12 株式会社ボナック microRNA阻害剤
WO2015093495A1 (ja) * 2013-12-16 2015-06-25 株式会社ボナック ＴＧＦ－β１遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE873543C (de) 1942-10-28 1953-04-16 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von hydroxyl- bzw. sulfhydryl-gruppenhaltigen Dicarbaminsaeureestern
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4550163A (en) 1979-02-05 1985-10-29 Abbott Laboratories Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates
US20030232355A1 (en) 1992-05-22 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded peptide nucleic acids
US5631148A (en) 1994-04-22 1997-05-20 Chiron Corporation Ribozymes with product ejection by strand displacement
GB9621367D0 (en) 1996-10-14 1996-12-04 Isis Innovation Chiral peptide nucleic acids
US6197557B1 (en) 1997-03-05 2001-03-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for analysis of nucleic acids
EP1013770A1 (en) 1998-12-23 2000-06-28 Université Louis Pasteur de Strasbourg Non-viral transfection vector
FR2790757B1 (fr) 1999-03-09 2003-08-01 Bioalliance Pharma Oligonucleotides contenant une sequence antisens stabilises par une structure secondaire et compositions pharmaceutiques les contenant.
US6852334B1 (en) 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US6962906B2 (en) 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US7256275B2 (en) 2001-03-09 2007-08-14 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to combination oligomers and libraries for their preparation
EP1627061B1 (en) 2001-05-18 2009-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
CA2465129A1 (en) 2001-10-29 2003-05-08 Mcgill University Acyclic linker-containing oligonucleotides and uses thereof
AU2003219900A1 (en) 2002-02-22 2003-09-09 James R. Eshleman Antigene locks and therapeutic uses thereof
AU2003224725A1 (en) 2002-03-20 2003-10-08 Brigham And Women's Hospital, Inc. Hiv therapeutic
EP2258847B2 (en) 2002-08-05 2020-07-01 Silence Therapeutics GmbH Futher novel forms of interfering RNA molecules
US20040058886A1 (en) 2002-08-08 2004-03-25 Dharmacon, Inc. Short interfering RNAs having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop
US6936651B2 (en) 2002-12-17 2005-08-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compatibility improvement in crystalline thermoplastics with mineral fillers
WO2004090108A2 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals Irna conjugates
CA2528958A1 (en) 2003-06-12 2004-12-23 Applera Corporation Combinatorial nucleobase oligomers comprising universal base analogues and methods for making and using same
US8106180B2 (en) 2003-08-07 2012-01-31 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and products for expression of micro RNAs
CN1860228B (zh) 2003-09-30 2010-04-28 安琪士摩奇株式会社 订书钉型寡核苷酸及包含该订书钉型寡核苷酸的药物
JP2007508030A (ja) 2003-10-14 2007-04-05 カーネル・バイオファーマ・インコーポレイテッド 血液脳関門を介してｐｎａを送達するための２相ｐｎａ結合体
US20050209141A1 (en) 2003-10-17 2005-09-22 Silver Randi B Mast cell-derived renin
US7615618B2 (en) 2004-06-30 2009-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
PL1781787T3 (pl) 2004-08-23 2018-01-31 Sylentis Sau Leczenie zaburzeń oka charakteryzowanych przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe przy użyciu siRNA
WO2006022325A1 (ja) 2004-08-26 2006-03-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ガラクトース誘導体、薬物担体及び医薬組成物
WO2006024880A2 (en) 2004-08-31 2006-03-09 Sylentis S.A.U. Methods and compositions to inhibit p2x7 receptor expression
JP2008522585A (ja) 2004-10-12 2008-07-03 ザ ロックフェラー ユニバーシティー マイクロｒｎａ
BRPI0519690A2 (pt) 2004-12-30 2009-03-03 Todd M Hauser composiÇÕes e mÉtodos para modular a expressço de genes usando oligonucleotÍdeos autoprotegidos
DE602007004463D1 (de) 2006-03-01 2010-03-11 Nippon Shinyaku Co Ltd Galactosederivat, arzneimittelträger und medizinische zusammensetzung
WO2007134014A2 (en) 2006-05-05 2007-11-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of gcgr
EP2700638A1 (en) 2006-05-31 2014-02-26 The Regents Of the University of California Purine analogs
EP1890152A1 (en) 2006-08-14 2008-02-20 Charite Universitätsmedizin-Berlin Determination of renin/prorenin receptor activity
JP2008220366A (ja) 2007-02-16 2008-09-25 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 修飾型ｐｎａ／ｒｎａ複合体
JP5145557B2 (ja) 2007-03-01 2013-02-20 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 マイクロｒｎａを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤、および癌治療用医薬組成物
CA2681323A1 (en) 2007-03-21 2008-09-25 Brookhaven Science Associates, Llc Combined hairpin-antisense compositions and methods for modulating expression
CN101121934B (zh) 2007-04-11 2011-12-07 哈尔滨医科大学 多靶点miRNA反义核苷酸的制备方法
WO2008137862A2 (en) 2007-05-03 2008-11-13 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of using mir34 as a biomarker for tp53 functional status
JP5296328B2 (ja) 2007-05-09 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
US20090123501A1 (en) 2007-05-17 2009-05-14 Baylor College Of Medicine Inhibition of the sh2-domain containing protein tyr-phosphatase, shp-1, to enhance vaccines
JP5637533B2 (ja) 2007-05-23 2014-12-10 ジーイー ヘルスケア ダーマコン，インク． マイクロ−ｒｎａスキャホールドおよび非天然存在型マイクロ−ｒｎａ
DK2164967T3 (en) 2007-05-31 2015-10-19 Univ Iowa Res Found Reduction of off-target rna interferenstoksicitet
WO2009000520A1 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Universität Duisburg-Essen Screening-method for polymorphic markers in htra1 gene in neurodegenerative disorders
CN101842381A (zh) * 2007-08-27 2010-09-22 波士顿生物医药公司 作为微小rna模拟物或抑制剂的不对称rna双链体的组合物
US8283331B2 (en) * 2007-10-09 2012-10-09 Children's Medical Center Corporation Methods to regulate miRNA processing by targeting Lin-28
EP2944694B1 (en) 2007-10-12 2018-07-11 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the other members of Board, of the College of Holy and Undiv. Trinity of Queen Elizabeth near Dublin Method for opening tight junctions
TW200927177A (en) 2007-10-24 2009-07-01 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Lipid-modified double-stranded RNA having potent RNA interference effect
TW200930405A (en) 2007-11-15 2009-07-16 Alcon Res Ltd Low density lipoprotein receptor-mediated siRNA delivery
EP2233573B1 (en) 2007-11-29 2013-10-23 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd A complex molecule interfering the expression of target genes and its preparing methods
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
US20110159586A1 (en) 2007-12-07 2011-06-30 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression using asymmetrically-active precursor polynucleotides
US20110055965A1 (en) 2008-02-15 2011-03-03 Hiroshi Abe Cycle single-stranded nucleic acid complex and method for producing the same
KR20100131509A (ko) 2008-03-31 2010-12-15 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 Ｒｎａ 간섭 효과가 높은 2본쇄 지질 수식 ｒｎａ
US20110172295A1 (en) 2008-04-11 2011-07-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE REGULATION OF microRNA PROCESSING
WO2009143619A1 (en) 2008-05-27 2009-12-03 Chum Methods of treating or preventing obesity and obesity-related hypertension
US20100179213A1 (en) 2008-11-11 2010-07-15 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and Compositions Involving miRNAs In Cancer Stem Cells
WO2010058824A1 (ja) * 2008-11-19 2010-05-27 国立大学法人岐阜大学 間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用
US8426581B2 (en) 2009-03-27 2013-04-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of the FCεR1α gene
ES2804764T3 (es) 2009-06-01 2021-02-09 Halo Bio Rnai Therapeutics Inc Polinucleótidos para la interferencia de ARN multivalente, composiciones y métodos de uso de los mismos
EP2454371B1 (en) 2009-07-13 2021-01-20 Somagenics, Inc. Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression
US20120258104A1 (en) 2009-07-22 2012-10-11 Cenix Bioscience Gmbh Delivery System and Conjugates For Compound Delivery Via Naturally Occurring Intracellular Transport Routes
US9096850B2 (en) 2009-08-24 2015-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. Segmented micro RNA mimetics
US20110052666A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Medtronic, Inc. Compositions, Methods, and Systems for SIRNA Delivery
EP2496268A4 (en) 2009-11-06 2013-06-19 Univ Chung Ang Ind GENE DELIVERY SYSTEMS BASED ON NANOPARTICLES
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
SG181904A1 (en) 2009-12-23 2012-07-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
JP2013515697A (ja) 2009-12-23 2013-05-09 マックスプランク−ゲセルシャフト・ツール・フェーデルング・デル・ヴィッセンシャフテン・エー・ファウ インフルエンザ標的
EP3560503B1 (en) 2010-03-24 2021-11-17 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in dermal and fibrotic indications
CN101845071B (zh) 2010-03-25 2012-02-01 北京欧凯纳斯科技有限公司 一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及应用
JP5555940B2 (ja) 2010-04-14 2014-07-23 国立大学法人佐賀大学 増殖糖尿病網膜症の検出方法および予防・治療剤のスクリーニング方法
JP5892608B2 (ja) 2010-04-19 2016-03-23 国立研究開発法人理化学研究所 機能性核酸の安定化法
SI2561078T1 (sl) 2010-04-23 2019-01-31 Cold Spring Harbor Laboratory Nove strukturno oblikovane shRNA
HUE037500T2 (hu) 2010-07-08 2018-08-28 Bonac Corp Egyszálú nukleinsav molekula a génexpresszió szabályozására
US8785121B2 (en) 2010-07-08 2014-07-22 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
WO2012012676A2 (en) 2010-07-22 2012-01-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of mir-29 for cell protection
US8691782B2 (en) 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
EP3406730B1 (en) 2010-08-31 2022-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides
CA2819944A1 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Daiichi Sankyo Company, Limited Modified single-stranded polynucleotide
CN102559666B (zh) 2010-12-18 2013-12-25 中国科学院上海生命科学研究院 抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途
CN102784398B (zh) 2011-05-16 2014-06-18 南京大学 内皮抑素作为递送系统和化学合成的rna干扰分子组成的组合物及应用
JP6011945B2 (ja) 2011-05-20 2016-10-25 公一 中城 マイクロｒｎａ又はその発現系を含む組成物
EP2527440A1 (en) 2011-05-27 2012-11-28 Institut Curie Cancer treatment by combining DNA molecules mimicking double strand breaks with hyperthermia
JP2013055913A (ja) 2011-09-09 2013-03-28 Bonac Corp 遺伝子発現制御のための一本鎖ｒｎａ分子
AR090905A1 (es) 2012-05-02 2014-12-17 Merck Sharp & Dohme Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica
WO2013180038A1 (ja) 2012-05-26 2013-12-05 株式会社ボナック デリバリー機能を有する遺伝子発現制御用の一本鎖核酸分子
US9856218B2 (en) * 2013-03-15 2018-01-02 Ohio State Innovation Foundation Inhibitors of PRMT5 and methods of their use
SG11201510565TA (en) 2013-05-22 2016-01-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
CN105899663B (zh) 2013-12-26 2019-07-26 学校法人东京医科大学 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途
CN106068324B (zh) 2013-12-27 2020-12-29 株式会社博纳克 控制基因表达的人工匹配型miRNA及其用途
JP6492014B2 (ja) 2013-12-27 2019-03-27 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための人工マッチ型ｍｉＲＮＡおよびその用途
WO2015161255A1 (en) * 2014-04-18 2015-10-22 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Methods for enhancing or decreasing the levels of mir124 and mir29 in subjects with muscular dystrophy
JP6602847B2 (ja) 2015-03-27 2019-11-06 株式会社ボナック デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子
WO2017115872A1 (ja) 2015-12-29 2017-07-06 国立大学法人北海道大学 プロレニン遺伝子またはプロレニン受容体遺伝子の発現を抑制する一本鎖核酸分子およびその用途

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006137941A2 (en) * 2004-11-12 2006-12-28 Ambion, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
WO2012017919A1 (ja) * 2010-08-03 2012-02-09 株式会社ボナック 含窒素脂環式骨格を有する一本鎖核酸分子
WO2012106591A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of mir-34
WO2013077446A1 (ja) * 2011-11-26 2013-05-30 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
WO2013103146A1 (ja) * 2012-01-07 2013-07-11 株式会社ボナック アミノ酸骨格を有する一本鎖核酸分子
JP2013153736A (ja) * 2012-01-07 2013-08-15 Bonac Corp ペプチド骨格を有する一本鎖核酸分子
WO2013133221A1 (ja) * 2012-03-04 2013-09-12 株式会社ボナック microRNA阻害剤
WO2015093495A1 (ja) * 2013-12-16 2015-06-25 株式会社ボナック ＴＧＦ－β１遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3239297A4 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018143475A1 (ja) 2017-02-06 2018-08-09 日産化学工業株式会社 一本鎖オリゴヌクレオチド
WO2018182008A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 株式会社ボナック 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子
WO2019074110A1 (ja) 2017-10-13 2019-04-18 株式会社ボナック 一本鎖核酸分子およびその製造方法
WO2019156020A1 (ja) * 2018-02-09 2019-08-15 住友化学株式会社 核酸分子の製造方法
JPWO2019156020A1 (ja) * 2018-02-09 2020-06-25 住友化学株式会社 核酸分子の製造方法
JP2020182461A (ja) * 2018-02-09 2020-11-12 住友化学株式会社 核酸分子の製造方法
WO2019182037A1 (ja) 2018-03-20 2019-09-26 国立大学法人東京工業大学 毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチド

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