ES2804764T3 - Polinucleótidos para la interferencia de ARN multivalente, composiciones y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un complejo de ARNip multivalente que consiste en: (a) un primer polinucleótido que es total o parcialmente complementario a una primera secuencia diana, en donde el primer polinucleótido es de 15-30 nucleótidos de longitud y en donde el primer polinucleótido es capaz de dirigirse a y reducir la expresión de la primera secuencia diana; (b) un segundo polinucleótido que es total o parcialmente complementario a una segunda secuencia diana, en donde el segundo polinucleótido es de 15-30 nucleótidos de longitud y en donde el segundo polinucleótido es capaz de dirigirse a y reducir la expresión de la segunda secuencia diana; y (c) un tercer polinucleótido que es o (i) total o parcialmente complementario y capaz de dirigirse a y reducir la expresión de una tercera secuencia diana o (ii) no específico para ninguna secuencia diana, y en donde el tercer polinucleótido es de 15-30 nucleótidos de longitud, en donde una región 5' del primer polinucleótido es complementaria a una región 3' del tercer polinucleótido, en donde una región 3' del primer polinucleótido es complementaria a una región 5' del segundo polinucleótido y en donde una región 3' del segundo polinucleótido es complementaria a una región 5' del tercer polinucleótido; en donde los tres polinucleótidos separados se hibridan a través de sus regiones 3' y 5' complementarias para formar un complejo polinucleotídico con una primera, una segunda y una tercera región bicatenaria; y en donde la primera, la segunda y la tercera regiones bicatenarias son de 5-12 pares de nucleótidos de longitud.

Description

DESCRIPCIÓN

Polinucleótidos para la interferencia de ARN multivalente, composiciones y métodos de uso de los mismos Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio según 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos n.° 61/183.011, presentada el 1 de junio de 2009.

DECLARACIÓN ACERCA DEL LISTADO DE SECUENCIAS

Hay un listado de secuencias asociado con la presente solicitud.

Antecedentes

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a moléculas polinucleotídicas estructuradas con precisión y a métodos de uso de las mismas para interferencia de ARN multivalente y el tratamiento de enfermedades.

Descripción de la técnica relacionada

El fenómeno de silenciamiento génico, o inhibición de la expresión de un gen, es bastante prometedor para fines terapéuticos y de diagnóstico, así como para el estudio de la función génica en sí misma. Los ejemplos de este fenómeno incluyen tecnología antisentido y formas de ARNbc de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) que se ha popularizado en forma de interferencia de ARN (iARN).

Las estrategias antisentido para silenciamiento génico han atraído mucha atención en los últimos años. El concepto subyacente es sencillo pero, en principio, eficaz: ácidos nucleicos (AN) antisentido forman pares de bases con un ARN diana, lo que da lugar a la inactivación del ARN diana. El reconocimiento de ARN diana por ARN o ADN antisentido puede considerarse una reacción de hibridación. Ya que la diana se une mediante complementariedad de secuencia, esto implica que una elección adecuada de AN antisentido debería garantizar alta especificidad. Se puede producir inactivación del ARN diana a través de diferentes rutas, dependiendo de la naturaleza del AN antisentido (ya sea ADN o ARN modificado o sin modificar o un híbrido de los mismos) y de las propiedades del sistema biológico en el que se va a producir la inhibición.

La supresión de genes basada en iARN es un método ampliamente aceptado en el que un ARN con sentido y uno antisentido forman ARN bicatenario (ARNbc), p. ej., como una doble cadena de ARN larga, una doble cadena de 19­ 24 nucleótidos o como una doble cadena de ARNbc en horquilla corto (ARNhc), que está implicado en la modulación génica al implicar maquinaria compleja de enzimas y/o proteínas. La doble cadena de ARN largo y la doble cadena de ARNhc son precursores que se procesan en ARN interferente pequeño (ARNip) por la endorribonucleasa descrita como Dicer. Se cree que el ARNip procesado o ARNip introducido directamente se une con el complejo proteico RISC para orientación hacia un gen complementario, que es escindido por el complejo RISC/ARNip.

Sin embargo, muchos problemas persisten en el desarrollo de tecnologías eficaces antisentido y de iARN. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido de ADN presentan solo eficacia a corto plazo y son habitualmente tóxicos a las dosis requeridas; de manera similar, el uso de ARN antisentido también ha resultado ineficaz debido a problemas de estabilidad. Además, se ha demostrado que el ARNip usado en iARN da lugar a supresión significativa fuera de diana debido a la posible implicación de complejos de escisión guiados por hebras en rutas reguladoras endógenas. Se han empleado diversos métodos en intentos de mejorar la estabilidad antisentido mediante la reducción de la sensibilidad a la nucleasa y se han utilizado modificaciones químicas de ARNip. Estas incluyen modificación de la cadena principal normal de fosfodiéster, p. ej., usando fosforotioatos o metilfosfonatos, incorporando nucleótidos 2'-OMe, usando ácidos nucleicos peptídicos (Peptide Nucleic Acids, PNA) y usando caperuzas 3'-terminales, tales como modificaciones de 3'-aminopropilo o enlaces 3'-3' terminales. Sin embargo, estos métodos pueden ser costosos y requerir etapas adicionales. Además, el uso de nucleótidos y modificaciones de origen no natural impide la capacidad de expresar las secuencias antisentido o de ARNip in vivo, por lo que es necesario que se sinteticen y administren a continuación.

Además, la doble cadena de ARNip presenta eficacia primaria para un solo gen y fuera de diana para un gen secundario. Este efecto no pretendido es negativo y no es una multivalencia de iARN fiable.

El documento WO 2007/091269 enseña compuestos que comprenden moléculas de ARN interferente pequeño (ARNip) con una cadena antisentido y una cadena con sentido; los compuestos de ARNip que se enseñan incluyen dos o más moléculas de ARNip bicatenario que están unidas entre sí mediante uno o más conectores. El documento WO 2010/090452 desvela complejos de ARNip que pueden inhibir la expresión de múltiples genes, en donde el complejo está formado por "ARNip múltiple" y un vehículo celular. El documento US 2005/196781 describe compuestos (ácidos nucleicos interferentes cortos, tales como ARNip) para la inhibición por iARN de, p. ej., el gen de STAT3.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de métodos y composiciones eficaces y sostenidos para la inhibición directa, dirigida, de la función génica in vitro e in vivo, en particular en células de vertebrados superiores, incluyendo un complejo de una única molécula con capacidad de inhibición génica multivalente.

Breve sumario

La presente invención proporciona composiciones y métodos novedosos, que incluyen oligonucleótidos estructurados con precisión que son útiles en la regulación específica de la expresión génica de uno o más genes simultáneamente cuando la secuencia del sitio diana de nucleótidos de cada uno no es idéntica a la otra.

En determinadas realizaciones, la presente invención incluye un complejo polinucleotídico tricatenario estructurado con precisión y aislado que comprende una región que tiene una secuencia complementaria a un gen diana o secuencia en múltiples sitios o complementaria a múltiples genes en sitios individuales como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

En determinadas realizaciones, la presente invención incluye un polinucleótido estructurado con precisión y aislado que comprende una región que tiene una secuencia complementaria a un gen diana o secuencia en múltiples sitios o complementaria a múltiples genes en sitios individuales; teniendo cada uno regiones parcialmente autocomplementarias como se especifica adicionalmente en las reivindicaciones adjuntas. En realizaciones particulares, el oligonucleótido comprende dos o más regiones autocomplementarias. Los polinucleótidos de la presente invención comprenden ARN.

Determinadas realizaciones se refieren a complejos polinucleotídicos de al menos tres polinucleótidos separados, que comprenden (a) un primer polinucleótido que comprende una región específica de diana que es complementaria a una primera secuencia diana, una región 5' y una región 3'; (b) un segundo polinucleótido que comprende una región específica de diana que es complementaria a una segunda secuencia diana, una región 5' y una región 3'; y (c) un tercer polinucleótido que comprende una región nula o una región específica de diana que es complementaria a una tercera secuencia diana, una región 5' y una región 3', en donde cada una de las regiones específicas de diana del primer, el segundo y el tercer polinucleótidos son complementarias a una secuencia diana diferente, en donde la región 5' del primer polinucleótido es complementaria a la región 3' del tercer polinucleótido, en donde la región 3' del primer polinucleótido es complementaria a la región 5' del segundo polinucleótido y en donde la región 3' del segundo polinucleótido es complementaria a la región 5' del tercer polinucleótido, y en donde los tres polinucleótidos separados se hibridan a través de sus regiones complementarias 3' y 5' para formar un complejo polinucleotídico con una primera, segunda y tercera región monocatenaria, y una primera, segunda y tercera región autocomplementaria, en donde el primer, el segundo y/o el tercer polinucleótido comprende aproximadamente 15-30 nucleótidos. En determinadas realizaciones, el primer, el segundo y/o el tercer polinucleótido comprende aproximadamente 17-25 nucleótidos. En determinadas realizaciones, una o más de las regiones autocomplementarias comprenden aproximadamente 5-10 pares de nucleótidos. En determinadas realizaciones, una o más de las regiones autocomplementarias comprenden aproximadamente 7-8 pares de nucleótidos.

En determinadas realizaciones, cada una de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en el mismo gen, ADNc, ARNm o microARN. En determinadas realizaciones, al menos dos de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en diferentes genes, ADNc, ARNm o microARN.

En determinadas realizaciones, toda o una parte de la región 5' y/o 3' de cada polinucleótido también es complementaria a la secuencia diana para ese polinucleótido. En determinadas realizaciones, una o más de las regiones autocomplementarias comprenden un saliente 3'.

Determinadas realizaciones se refieren a moléculas polinucleotídicas autohibridantes, que comprenden (a) una primer secuencia de nucleótidos que comprende una región específica de diana que es complementaria a una primera secuencia diana, una región 5' y una región 3', (b) una segunda secuencia de nucleótidos que comprende una región específica de diana que es complementaria a una segunda secuencia diana, una región 5' y una región 3'; y (c) una tercera secuencia de nucleótidos que comprende una región nula o una región específica de diana que es complementaria a una tercera secuencia diana, una región 5' y una región 3', en donde las regiones específicas de diana de cada una de la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos son complementarias a una secuencia diana diferente, en donde la región 5' de la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la región 3' de la tercera secuencia de nucleótidos, en donde la región 3' de la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la región 5' de la segunda secuencia de nucleótidos y en donde la región 3' de la segunda secuencia de nucleótidos es complementaria a la región 5' de la tercera secuencia de nucleótidos, y en donde cada de las regiones 5' hibrida con sus regiones 3' complementarias para formar una molécula polinucleotídica autohibridante con una primera, segunda y tercera región monocatenaria, y una primera, segunda y tercera región autocomplementaria.

**En determinados aspectos, la primera, la segunda o la tercera secuencias polinucleotídicas comprenden aproximadamente 15-60 nucleótidos. En determinadas realizaciones, la región específica de diana comprende aproximadamente 15-30 nucleótidos. En determinados aspectos, una o más de las regiones autocomplementarias comprenden aproximadamente 10-54 nucleótidos. En determinadas realizaciones, una o más de las regiones autocomplementarias comprenden un saliente 3'. En determinadas realizaciones, una o más de las regiones autocomplementarias forman una estructura de tallo-bucle. En determinadas realizaciones, una o más de las regiones autocomplementarias comprenden una secuencia proximal de dinucleótidos AG/UU que está fuera de la región específica de diana. En determinadas realizaciones, una o más de las regiones autocomplementarias comprenden una secuencia distal de 4 nucleótidos que está fuera de la región específica de diana, en donde el tercer nucleótido de la secuencia distal no es una G. También se incluyen vectores que codifican una molécula polinucleotídica autohibridante, como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, cada una de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en el mismo gen, ADNc, ARNm o microARN. En determinadas realizaciones, al menos dos de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en diferentes genes, ADNc, ARNm o microARN.

En determinadas realizaciones, una región autocomplementaria comprende una estructura de tallo-bucle compuesta por un bibucle, tetrabucle o bucle mayor. En determinadas realizaciones, la secuencia complementaria a una secuencia del gen diana comprende al menos 17 nucleótidos o de 17 a 30 nucleótidos, incluyendo todos los números enteros entre ellos.

En determinadas realizaciones, la región autocomplementaria (o región bicatenaria) comprende al menos 5 nucleótidos, al menos 6 nucleótidos, al menos 24 nucleótidos o de 12 a 54 o 60 nucleótidos, incluyendo todos los números enteros entre ellos.

En determinadas realizaciones, una región de bucle de una estructura de tallo-bucle comprende al menos 1 nucleótido. En determinadas realizaciones, la región de bucle comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 nucleótidos.

En realizaciones adicionales, una región de bucle de una estructura de tallo-bucle comprende una secuencia específica de tetrabucle NGNN o AAGU o UUUU o UUGA o GUUA, donde estas secuencias son de 5' a 3'.

En una realización adicional, la presente invención incluye un vector de expresión capaz de expresar un polinucleótido de la presente invención. En diversas realizaciones, el vector de expresión es un vector constitutivo o inducible.

El presente incluye además una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polinucleótido de la presente invención.

También se desvela un método para reducir la expresión de un gen, que comprende introducir un complejo polinucleotídico o molécula de la presente invención en una célula. En diversas realizaciones, la célula es vegetal, animal, protozoaria, vírica, bacteriana o fúngica. En una realización, la célula es de mamífero.

En algunas realizaciones, el complejo polinucleotídico o la molécula se introduce directamente en la célula, mientras que, en otras realizaciones, el complejo polinucleotídico o la molécula se introduce de manera extracelular por un medio suficiente para administrar el polinucleótido aislado a la célula.

También se desvela un método para tratar una enfermedad, que comprende introducir un complejo polinucleotídico o molécula de la presente invención en una célula, en donde la sobreexpresión del gen diana está asociada con la enfermedad. En una realización, la enfermedad es un cáncer.

También se desvela un método para tratar una infección en un paciente, que comprende introducir en el paciente un complejo polinucleotídico o molécula de la presente invención, en donde el polinucleótido aislado media en la entrada, replicación, integración, transmisión o mantenimiento de un agente infeccioso.

También se desvela un método para identificar una función de un gen, que comprende introducir en una célula un complejo polinucleotídico o molécula de la presente invención, en donde el complejo polinucleotídico o molécula inhibe la expresión del gen, y determinar el efecto de la introducción del complejo polinucleotídico o molécula en una característica de la célula, determinando de este modo la función del gen diana. En un aspecto, el método se realiza usando exploración de alto rendimiento.

También se desvela un método para diseñar una secuencia polinucleotídica que comprende dos o más regiones autocomplementarias para la regulación de la expresión de un gen diana, que comprende: (a) seleccionar las tres primeras secuencias de guía de 17 a 25 nucleótidos de longitud y complementarias a un gen diana o múltiples genes diana; (b) seleccionar una o más secuencias adicionales de 4 a 54 nucleótidos de longitud, que comprende regiones autocomplementarias y que no son completamente complementarias a la primera secuencia; y opcionalmente (c) definir el motivo de secuencia en (b) para que sea complementario, no complementario o replique una secuencia génica que no sea complementaria a la secuencia seleccionada en la etapa (a).

En otra realización, el gen mutado es un gen expresado a partir de un gen que codifica un polipéptido p53 mutante. En otra realización, el gen es vírico y puede incluir uno o más genes víricos diferentes. En realizaciones específicas, el gen es un gen del VIH, tal como gag, pol, env o tat, entre otros descritos en el presente documento y conocidos en la técnica. En otras realizaciones, el gen es ApoB.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Las figuras 1 a 6 ilustran ejemplos de estructuras polinucleotídicas de la presente invención.

La figura 1 muestra un complejo polinucleotídico de tres moléculas polinucleotídicas separadas. (A) indica la región que comprende la secuencia complementaria a un sitio en un gen diana (sombreado); (B) indica la región que comprende la secuencia complementaria a un segundo sitio en el gen diana o un sitio en un gen diferente (sombreado cruzado); (C) indica la región que comprende la secuencia complementaria a un tercer sitio en el gen diana o un sitio en un gen diferente (rellenado en negro). Los números 1, 2 y 3 indican el extremo 3' de cada oligonucleótido que guía el silenciamiento génico; (A) carga en la dirección de 1, (B) en la dirección 2 y (C) en la dirección 3. Las regiones 3' y 5' de cada molécula, que se hibridan entre sí para formar sus respectivas regiones autocomplementarias o bicatenarias, se indican mediante barras de conexión. Cada polinucleótido comprende un saliente 3' de dos nucleótidos.

La figura 2 muestra un único polinucleótido autohibridante de la invención, que tiene tres regiones monocatenarias y tres regiones autocomplementarias, que es un precursor para procesar a una molécula central. Las regiones específicas de diana están oscurecidas. (D) indica una región de tallo-bucle autocomplementaria (rellenada en blanco) cubierta con un tetrabucle de cuatro nucleótidos; (D) también indica una región de tallo-bucle que tiene un sitio de escisión de 14/16 nucleótidos dentro de la estructura de tallo-bucle; la escisión puede producirse mediante RNasa III para eliminar los nucleótidos de tallo-bucle mostrados en blanco); (E) indica una secuencia distal en donde el tercer nucleótido determinado de 5' a 3' no es una G, ya que se cree que la presencia de una G bloquearía la escisión por RNasa III necesaria para la eliminación de la región de tallo-bucle; (F) indica una secuencia proximal de dinucleótidos AG/UU, que es un determinante in vivo del reconocimiento de RNasa III y la unión de RNasa III (Nichols 2000); (G) indica un tetrabucle. La molécula polinucleotídica mostrada en la figura 2 es un ARN de transcrito más largo que se 'procesa previamente' en la célula por RNasa III. La estructura de ARN resultante es idéntica a la estructura representada en la figura 1.

La figura 3 representa un oligonucleótido monocatenario de autoconformación con formatos de tetrabucle. (H) indica un tetrabucle; (I) indica un tribucle que conecta dos cadenas centrales cuando la cadena adelantada incorpora un saliente de 2 nucleótidos. En esta estructura, se usan tetrabucles para imitar lo que sería un hidroxilo 3'/fosfato 5' de los salientes en la estructura mostrada en la figura 1 y actúan más directamente que los de la estructura mostrada en la figura 2. Como se ha demostrado en el ejemplo 2, este formato corto de tetrabucle guía el silenciamiento directamente sin procesamiento previo. Se cree que el bucle GUUA tuerce los nucleótidos en el bucle y expone los hidrógenos (véase, p. ej., Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, n.° 3, fig. 6, página 1094). Esta estructura es compatible con PAZ o RISC.

La figura 4 representa un oligonucleótido monocatenario de autoconformación para uso divalente. (J) indica un bucle mayor que conecta dos cadenas centrales; (K) indica la cadena clave que completa la formación del complejo, pero "nula" para un gen diana, es decir, inespecífica para un gen diana. Las dos regiones específicas de diana están sombreadas. Esta estructura es una composición para uso 'divalente' cuando se trabaja con transcritos de ARN. Ya que no son posibles modificaciones químicas, la estructura determina de manera asimétrica la actividad de carga y silenciamiento. Los primeros 19 nucleótidos de la molécula son la cadena PRIMARIA, (K) indica una cadena CLAVE que está desactivada y la cadena SECUNDARIA son los últimos 21 nucleótidos de la molécula. La primera prioridad de carga en RISC y funcionamiento es la cadena SECUNDARIA por extremos expuestos 5'/3'. La siguiente prioridad es la cadena PRIMARIA, que se expone después de procesamiento previo por RNasa III en la célula. El extremo 3' de la cadena CLAVE anulada no es funcional, ya que el bucle grande no se procesa ni es compatible con la carga en el RISC en sí mismo.

La figura 5 representa un complejo polinucleotídico de la presente invención que tiene bases de ARN modificadas. (L), (M) y (N) ilustran regiones (definidas por líneas discontinuas) en las que la Tm puede incrementarse gradualmente mediante el uso de ARN modificado (p. ej., 2'-O-metil ARN o 2'-fluoro ARN en lugar de 2'-OH ARN) para dar preferencia al orden de hibridación y/o silenciamiento de los extremos 1, 2 o 3.

La figura 6 representa dos realizaciones de complejos oligonucleotídicos de la presente invención. (O) ilustra una cadena de ADN de extremos romos que desactiva la función silenciadora de esta cadena; y (P) ilustra un extremo que puede utilizarse para la conjugación de una química de administración, ligando, anticuerpo u otra carga útil o molécula dirigida.

La figura 7 muestra los resultados de la supresión de la expresión de GFP por moléculas de ARNip multivalente de la invención, en comparación con moléculas de ARNhc convencionales (véase ejemplo 1). La figura 7A muestra mayor supresión de GFP por el clon MV largo I (108 %) y el clon MV largo II (119 %), en relación con el control de ARNhc (establecido en 100 %). La figura 7B muestra mayor supresión de expresión de GFP por ARNip-MV GFP I sintético (127%), en relación con el control de ARNhc (establecido en 100%), que se reduce ligeramente cuando una de las cadenas del complejo sintético de ARNip-MV se reemplaza por una cadena de ADN (ADN de ARNip-MF GFP I (116 %)).

La figura 8 muestra regiones de direccionamiento ilustrativas (subrayadas) para la secuencia de codificación de GFP (SEQ ID NO: 8). La figura 8A muestra las regiones que fueron diana de las moléculas de ARNip-MV de las tablas 1 y 2 en el ejemplo 1. Las figuras 8B y 8C muestran regiones de direccionamiento ilustrativas adicionales.

La figura 9 muestra los efectos inhibidores de moléculas de ARNip-MV en la replicación de VIH, en el que un ARNip-MV divalente dirigido tanto a gag como a tat tiene un efecto inhibidor significativamente mayor sobre la replicación del VIH que un ARNip dirigido solo a gag. El ARNip-MV divalente presentó 56,89 % de inhibición a los 10 días y 60,02% de inhibición a los 40 días, en comparación con el ARNip dirigido a gag solo, que presentó 19,77% de inhibición a los 10 días y 32,43 % de inhibición a los 40 días.

La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos de un genoma de VIH ilustrativo (SEQ ID NO: 9), que puede dirigirse según las moléculas de ARNip-MV de la presente invención. Esta secuencia se extiende desde la figura 10A hasta la figura 10D.

La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de env (SEQ ID NO: 4), procedente de la secuencia genómica del VIH de la figura 10.

La figura 12 proporciona secuencias de VIH adicionales. La figura 12A muestra la secuencia de nucleótidos del gen de gag (SEQ ID NO: 2) y la figura 12B muestra la secuencia de nucleótidos del gen de tat (SEQ ID NO: 3), ambas procedentes de la secuencia genómica del VIH de la figura 10.

La figura 13 muestra la secuencia codificante de la apolipoproteína B murina (ApoB) (SEQ ID NO: 10), que puede ser diana usando determinados ARNip-MV proporcionados en el presente documento. Esta secuencia se extiende desde la figura 13A hasta la figura 13E.

La figura 14 muestra la secuencia de ARNm de la apolipoproteína B humana (apoB) (SEQ ID NO: 1), que puede ser diana usando determinados ARNip-MV proporcionados en el presente documento. Esta secuencia se extiende desde la figura 14A hasta la figura 14E.

Descripción detallada

La presente invención proporciona composiciones y métodos novedosos para inhibir la expresión de un gen en múltiples sitios diana o para inhibir la expresión de múltiples genes en uno o más sitios diana, sitios que no tienen secuencias de nucleótidos equivalentes, en eucariotas in vivo e in vitro. En particular, la presente invención proporciona complejos polinucleotídicos y moléculas polinucleotídicas que comprenden dos, tres o más regiones que tienen secuencias complementarias a regiones de uno o más genes diana, que son capaces de dirigirse a y reducir la expresión de los genes diana. En diversas realizaciones, las composiciones y los métodos de la presente invención se pueden usar para inhibir la expresión de un solo gen diana dirigiéndose a múltiples sitios dentro del gen diana o su ^a Rⁿ expresado. Como alternativa, se pueden usar para dirigirse a dos o más genes diferentes al dirigirse a sitios dentro de dos o más genes diferentes o sus ARN expresados.

La presente invención ofrece ventajas significativas con respecto a moléculas de ARNip tradicionales. En primer lugar, cuando los complejos polinucleotídicos o las moléculas de la presente invención se dirigen a dos o más regiones dentro de un solo gen diana, son capaces de lograr mayor inhibición de la expresión génica del gen diana, en comparación con un agente de iARN que se dirige solo a una región dentro de un gen diana. Además, los complejos polinucleotídicos o moléculas de la presente invención que se dirigen a dos o más genes diana diferentes pueden usarse para inhibir la expresión de múltiples genes diana asociados con una enfermedad o un trastorno usando un único complejo polinucleotídico o molécula. Asimismo, los complejos polinucleotídicos y las moléculas de la presente invención no requieren la cadena adicional no dirigida presente en agentes de iARN bicatenarios convencionales, de modo que no tienen efectos fuera de diana provocados por la cadena no dirigida. En consecuencia, los complejos polinucleotídicos y las moléculas de la presente invención ofrecen ventajas sorprendentes con respecto a los inhibidores polinucleotídicos de la técnica anterior, incluyendo ARN antisentido y moléculas de interferencia de ARN, incluyendo mayor potencia y mayor eficacia contra uno o más genes diana. La presente invención también se basa en el reconocimiento de la estructura polinucleotídica que guía un complejo proteico para escisión usando solo una, dos o tres de las cadenas guía, que son complementarias a una, dos o tres secuencias nucleicas distintas de los genes diana. Esta función multivalente da lugar a una inhibición notablemente más amplia y potente de un gen diana o un grupo de genes diana que la del ARNbc, utilizando al mismo tiempo muchos de los mismos mecanismos endógenos.

Determinadas realizaciones de la presente invención también se basan en el reconocimiento de la estructura polinucleotídica direccionalmente mediante la presentación de los salientes 3' y el fosfato 5' que dan como resultado un complejo sin cadena con sentido, que contribuye a mayor especificidad que la del ARNip basado en ARNbc. Dada su eficacia, las composiciones de la presente invención pueden administrarse a una célula o un sujeto con una garantía de especificidad adjunta predicha por la cadena de guía única complementaria al gen diana o múltiples genes diana.

ARNip multivalentes

La presente invención incluye complejos y moléculas polinucleotídicos que comprenden dos o más regiones de direccionamiento complementarias a regiones de uno o más genes diana. Los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención pueden denominarse ARNip multivalentes (ARNip-mv), ya que comprenden al menos dos regiones de direccionamiento complementarias a regiones de uno o más genes diana. En consecuencia, las composiciones y los métodos de la presente invención se pueden usar para inhibir o reducir la expresión de uno o más genes diana, ya sea dirigiéndose a dos o más regiones dentro de un solo gen diana o dirigiéndose a una o más regiones dentro de dos o más genes diana.

En determinadas realizaciones, los complejos polinucleotídicos de la presente invención comprenden tres o más oligonucleótidos separados, cada uno con un extremo 5' y 3', comprendiendo dos o más de los oligonucleótidos una región de direccionamiento, hibridando dichos oligonucleótidos entre sí como se describe en el presente documento para formar un complejo. Cada una de las cadenas se denomina en el presente documento "cadena guía". En otras realizaciones, las moléculas polinucleotídicas de la presente invención son un solo polinucleótido que comprende tres o más cadenas guía, comprendiendo dos o más de las cadenas guía una región de direccionamiento, hibridándose dicho polinucleótido consigo mismo a través de regiones autocomplementarias para formar una estructura descrita en el presente documento. La estructura resultante puede procesarse después, p. ej., intracelularmente, para eliminar estructuras de bucle que conectan las diversas cadenas guía. Cada cadena guía, que puede estar presente en diferentes oligonucleótidos o dentro de un único polinucleótido, comprende regiones complementarias a otras cadenas guía.

En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona complejos y moléculas polinucleotídicos que comprenden al menos tres cadenas guía, al menos dos de las cuales comprenden regiones que son complementarias a diferentes secuencias dentro de uno o más genes diana. En diversas realizaciones, los complejos polinucleotídicos de la presente invención comprenden dos, tres o más polinucleótidos separados, comprendiendo cada uno una o más cadenas guía, que pueden hibridarse entre sí para formar un complejo. En otras realizaciones, las moléculas polinucleotídicas de la presente invención comprenden un único polinucleótido que comprende tres o más cadenas guía dentro de diferentes regiones del polinucleótido único.

Determinadas realizaciones de la presente invención están dirigidas a complejos polinucleotídicos o moléculas que tienen al menos tres cadenas guía, dos o más de los cuales son parcial o totalmente complementarias a uno o más genes diana; y teniendo cada una de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 o preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, nucleótidos en cada extremo que son complementarios entre sí (es decir, complementarios a una región de otra cadena guía), lo que permite la formación de un complejo polinucleotídico (véase, p. ej., figura 1). Por ejemplo, cada extremo de una cadena guía puede comprender nucleótidos que son complementarios a nucleótidos en un extremo de otro de las cadenas guía del complejo polinucleotídico o molécula. Determinadas realizaciones pueden incluir complejos polinucleotídicos que comprenden 4, 5, 6 o más moléculas polinucleotídicas individuales o cadenas guía.

En determinadas realizaciones, un complejo polinucleotídico de la presente invención comprende al menos tres polinucleótidos separados, que incluyen: (1) un primer polinucleótido que comprende una región específica de diana que es complementaria a una primera secuencia diana, una región 5' y una región 3'; (2) un segundo polinucleótido que comprende una región específica de diana que es complementaria a una segunda secuencia diana, una región 5' y una región 3'; y (3) un tercer polinucleótido que comprende una región nula o una región específica de diana que es complementaria a una tercera secuencia diana, una región 5' y una región 3', en donde cada una de las regiones específicas de diana del primer, el segundo y el tercer polinucleótidos son complementarias a una secuencia diana diferente, en donde la región 5' del primer polinucleótido es complementaria a la región 3' del tercer polinucleótido, en donde la región 3' del primer polinucleótido es complementaria a la región 5' del segundo polinucleótido y en donde la región 3' del segundo polinucleótido es complementaria a la región 5' del tercer polinucleótido, y en donde los tres polinucleótidos separados se hibridan a través de sus regiones complementarias 3' y 5' para formar un complejo polinucleotídico con una primera, segunda y tercera región monocatenaria, y una primera, segunda y tercera región autocomplementaria.

Como se ha descrito anteriormente, en realizaciones particulares, un complejo polinucleotídico de la presente invención comprende al menos tres oligonucleótidos separados, teniendo cada uno un extremo 5' y un extremo 3'.

Como se muestra en la figura 1, una región en el extremo 5' del primer oligonucleótido híbrida con una región en el extremo 3' del tercer oligonucleótido; una región en el extremo 5' del tercer oligonucleótido hibrida con una región en el extremo 3' del segundo oligonucleótido; y una región en el extremo 5' del segundo oligonucleótido hibrida con una región en el extremo 3' del primer oligonucleótido. Si están presentes oligonucleótidos adicionales en el complejo, después se hibridan con otros oligonucleótidos del complejo de manera similar. Las regiones en los extremos de los oligonucleótidos que hibridan entre sí pueden incluir los últimos nucleótidos en uno o ambos extremos 5' y/o 3'. Cuando las regiones de los extremos de hibridación 3' y 5' incluyen los últimos nucleótidos de los oligonucleótidos, la región bicatenaria resultante tiene extremos romos. En realizaciones particulares, la región en el extremo 3' que hibrida no incluye los últimos y/o penúltimos nucleótidos, lo que da como resultado una región bicatenaria que tiene un saliente 3' de uno o dos nucleótidos.

En determinadas realizaciones, las cadenas guía están presentes en una única molécula polinucleotídica y se hibridan para formar un solo polinucleótido autohibridante con tres regiones monocatenarias y tres regiones autocomplementarias (o regiones bicatenarias) y al menos dos regiones específicas de diana (véase, p. ej., figura 2). En realizaciones relacionadas, una sola molécula puede comprender al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 cadenas guía y forma un solo polinucleótido autohibridante con al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 regiones autocomplementarias (o regiones bicatenarias) y al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 regiones específicas de diana, respectivamente. En realizaciones particulares, este único polinucleótido autohibridante es una molécula precursora que puede ser procesada por la célula para eliminar las regiones de bucle y, opcionalmente, una cantidad de región bicatenaria proximal, lo que da lugar a una molécula activa de ARNip-mv (véase, p. ej., figura 2).

Por tanto, en realizaciones particulares, la presente invención incluye una molécula polinucleotídica autohibridante, que comprende: (1) una primera secuencia de nucleótidos que comprende una región específica de diana que es complementaria a una primera secuencia diana, una región 5' y una región 3', (2) una segunda secuencia de nucleótidos que comprende una región específica de diana que es complementaria a una segunda secuencia diana, una región 5' y una región 3'; y (3) una tercera secuencia de nucleótidos que comprende una región nula o una región específica de diana que es complementaria a una tercera secuencia diana, una región 5' y una región 3', en donde las regiones específicas de diana de cada una de la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos son complementarias a una secuencia diana diferente, en donde la región 5' de la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la región 3' de la tercera secuencia de nucleótidos, en donde la región 3' de la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la región 5' de la segunda secuencia de nucleótidos y en donde la región 3' de la segunda secuencia de nucleótidos es complementaria a la región 5' de la tercera secuencia de nucleótidos, y en donde cada de las regiones 5' hibrida con sus regiones 3' complementarias para formar una molécula polinucleotídica autohibridante con una primera, segunda y tercera región monocatenaria, y una primera, segunda y tercera región autocomplementaria.

En realizaciones particulares, un solo polinucleótido autohibridante de la presente invención puede comprender uno o más nucleótidos escindibles en los bucles monocatenarios que se forman cuando el polinucleótido se hibrida consigo mismo. Una vez que el único polinucleótido autohibridante se hibrida consigo mismo, los nucleótidos escindibles pueden escindirse para dar lugar a un complejo polinucleotídico que comprende tres o más oligonucleótidos separados. Los ejemplos de nucleótidos escindibles que pueden usarse según la presente invención incluyen, pero sin limitación, nucleótidos fotoescindibles, tales como pcSpacer (Glen Research Products, Sterling, VA, Estados Unidos), o nucleótidos de fosforamidita.

Como se usa en el presente documento, los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención incluyen polinucleótidos aislados que comprenden tres regiones monocatenarias, al menos dos de las cuales son complementarias a dos o más secuencias diana, cada secuencia diana ubicada dentro de uno o más genes diana, y que comprenden al menos dos o tres regiones autocomplementarias que interconectan los extremos 5' o 3' de las regiones monocatenarias, formando una región bicatenaria, tal como una estructura de tallo-bucle. Los polinucleótidos también pueden denominarse en el presente documento oligonucleótidos.

En determinadas realizaciones, los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención comprenden dos o más regiones de secuencia complementarias a un gen diana. En realizaciones particulares, estas regiones son complementarias a los mismos genes o genes diana, mientras que, en otras realizaciones, son complementarias a dos o más genes o genes diana diferentes.

En consecuencia, la presente invención incluye uno o más polinucleótidos autocomplementarios que comprenden una serie de secuencias complementarias a uno o más genes o genes diana. En realizaciones particulares, estas secuencias están separadas por regiones de secuencia que no son complementarias o semi-complementarias a una secuencia de genes diana y no son complementarias a una región autocomplementaria. En otras realizaciones del polinucleótido que comprende múltiples secuencias que son complementarias a genes o genes diana, el polinucleótido comprende una región autocomplementaria en el extremo 5', extremo 3' o ambos extremos de una o más regiones de secuencia complementarias a un gen diana. En una realización particular, un polinucleótido comprende dos o más regiones de secuencia complementarias a uno o más genes diana, con regiones autocomplementarias ubicadas en el extremo 5' y 3' de cada cadena guía que es complementaria a un gen diana. En determinadas realizaciones, todas o una parte de estas regiones 3' y 5' pueden ser complementarias a la secuencia diana, además de ser complementarias a sus regiones 3' o 5' correspondientes.

El término "complementario" se refiere a secuencias de nucleótidos que son total o parcialmente complementarias entre sí, según las normas convencionales de formación de pares de bases. La expresión "parcialmente complementario" se refiere a secuencias que tienen una complementariedad inferior a la completa, pero todavía tiene un número suficiente de pares de nucleótidos complementarios para sustentar la unión o hibridación dentro del tramo de nucleótidos en condiciones fisiológicas.

En realizaciones particulares, la región de una cadena guía complementaria a un gen diana (es decir, la región de direccionamiento) puede comprender uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos en comparación con el gen diana. Opcionalmente, el o los nucleótidos desapareados en la cadena guía pueden sustituirse con un ácido nucleico desbloqueado (Unlocked Nucleic Acid, UNA) o un ácido nucleico de fosforamidita (p. ej., rSpacer, Glen Research, Sterling, VA, Estados Unidos), para permitir la formación de pares de bases, p. ej., formación de pares de bases de Watson-Crick, de los nucleótidos desapareados con el gen diana.

Como se usa en el presente documento, la expresión "autocomplementario" o "región autocomplementaria" puede referirse a una región de una molécula polinucleotídica de la invención que se une o hibrida con otra región de la misma molécula para formar pares de hibridación A-T(U) y G-C, formando de este modo una región bicatenaria; y/o puede referirse a una región de una primera molécula de nucleótidos que se une con una región de una segunda o tercera molécula de nucleótidos para formar un complejo polinucleotídico de la invención (es decir, un complejo polinucleotídico de iARN), en donde el complejo tiene capacidad de actividad de interferencia de iARN contra dos o más sitios diana. Las dos regiones que se unen entre sí para formar la región autocomplementaria pueden ser contiguas o estar separadas por otros nucleótidos. Además, como en un complejo polinucleotídico de iARN, las dos regiones pueden estar en moléculas de nucleótidos separadas.

En determinadas realizaciones, una "región autocomplementaria" comprende una "región 3'" de una primera secuencia de nucleótidos definida que está unida o hibridada con una "región 5'" de una segunda o tercera secuencia de nucleótidos definida, en donde la segunda o tercera secuencia definida está dentro de la misma molécula, para formar una molécula polinucleotídica autohibridante. En determinadas realizaciones, una "región autocomplementaria" comprende una "región 3'" de una primera molécula polinucleotídica que está unida o hibridada con una "región 5'" de una molécula polinucleotídica separada, para formar un complejo polinucleotídico. Estas regiones 3' y 5' se definen normalmente en relación con sus respectivas regiones específicas de diana, porque las regiones 5' están en el extremo 5' de la región específica de diana y las regiones 3' están en el extremo 3' de la región específica de diana. En determinadas realizaciones, una o ambas de estas regiones 3' y 5' no solo hibridan con sus regiones 3' o 5' correspondientes para formar una región autocomplementaria, sino que pueden estar diseñadas para contener también la complementariedad total o parcial de su secuencia diana respectiva, formando parte de este modo de la región específica de diana. En estas realizaciones, la región específica de diana contiene tanto una región monocatenaria como una región autocomplementaria (es decir, bicatenaria).

En determinadas realizaciones, estas "regiones autocomplementarias" comprenden aproximadamente 5-12 pares de nucleótidos, preferentemente 5-10 o 7-8 pares de nucleótidos, incluyendo todos los números enteros entre ellos. De manera análoga, en determinadas realizaciones, cada región 3' o región 5' comprende aproximadamente 5-12 nucleótidos, preferentemente 5-10 o 7-8 nucleótidos, incluyendo todos los números enteros entre ellos.

La expresión "no complementario" indica que en un tramo particular de nucleótidos, no hay nucleótidos dentro que se alineen con una diana para formar hibridaciones A-T(U) o G-C. La expresión "semicomplementario" indica que, en un tramo de nucleótidos, hay al menos un par de nucleótidos que se alinea con una diana para formar hibridaciones A-T(U) o G-C, pero no hay un número suficiente de pares de nucleótidos complementarios para sustentar la unión dentro del tramo de nucleótidos en condiciones fisiológicas.

El término "aislado" se refiere a un material que carece, al menos parcialmente, de componentes que normalmente acompañan al material en el estado nativo del material. El aislamiento connota un grado de separación de una fuente o entorno original. Aislado, como se usa en el presente documento, p. ej., en relación con ADN, se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente alejado de otras secuencias codificantes o no codificantes y que la molécula de ADN puede contener grandes partes de ADN codificante no relacionado, tales como fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes de polipéptidos. Por supuesto, esto se refiere a la molécula de ADN como se aisló originalmente y no excluye genes o regiones codificantes añadidas posteriormente al segmento artificialmente.

En diversas realizaciones, un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención comprende moléculas de ARN. Además, un polinucleótido puede comprender ácidos nucleicos modificados, o derivados o análogos de ácidos nucleicos. Los ejemplos generales de modificaciones de ácido nucleico incluyen, pero sin limitación, marcaje de biotina, marcaje fluorescente, modificadores de amino que introducen una amina primaria en el polinucleótido, grupos fosfato, desoxiuridina, nucleósidos halogenados, fosforotioatos, análogos de 2'-O-metil ARN, análogos quiméricos de ARN, grupos oscilantes, bases universales y desoxiinosina.

Una "subunidad" de un polinucleótido u oligonucleótido se refiere a una unidad de nucleótido (o análogo de nucleótido). El término puede referirse a la unidad de nucleótido con o sin el enlace intersubunitario adjunto, aunque, cuando hace referencia a una "subunidad con carga", la carga reside normalmente dentro del enlace intersubunitario (p. ej., un enlace de fosfato o fosforotioato o un enlace catiónico). Un ARNip-MV sintético dado puede utilizar uno o más tipos diferentes de subunidades y/o enlaces intersubunitarios, principalmente para alterar su estabilidad, Tm, sensibilidad a RNasa u otras características, según se desee. Por ejemplo, determinadas realizaciones pueden emplear subunidades de ARN con una o más subunidades de 2'-O-metil ARN.

Las subunidades cíclicas de un polinucleótido o un oligonucleótido pueden estar basadas en ribosa u otro azúcar pentosa o, en determinadas realizaciones, grupos alternos o modificados. Los ejemplos de cadenas principales de oligonucleótidos modificados incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos, incluyendo 3'-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, fosforodiamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos unidos 2'-5' de estos y los que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están unidos 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se contemplan ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), 2'-O-metil oligonucleótidos (2'-OMe), 2'-metoxietoxi oligonucleótidos (MOE), entre otros oligonucleótidos conocidos en la técnica.

El resto de formación de pares de bases de purina o pirimidina es normalmente adenina, citosina, guanina, uracilo, timina o inosina. También se incluyen bases tales como piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimel 15toxibenceno, 3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (p. ej., 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (p. ej., ribotimidina), 5-halouridina (p. ej., 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (p. ej., 6-metiluridina), propino, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, wibutosina, wibutoxosina, 4-acetiltidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, p-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, p-D-manosilqueosina, ácido uridin-5-oxiacético, 2-tiocitidina, derivados de treonina y otros (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman y Peyman, mencionado anteriormente). Por "bases modificadas" en este aspecto se entienden bases de nucleótidos distintas de adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), como se ha ilustrado anteriormente; dichas bases pueden usarse en cualquier posición en la molécula antisentido. Los expertos en la materia apreciarán que, dependiendo de los usos o la química de los oligómeros, T y U son intercambiables. Por ejemplo, con otras químicas antisentido tales como 2'-O-metil oligonucleótidos antisentido que son más similares al ARN, las bases T pueden mostrarse como U.

Como se ha indicado anteriormente, determinados polinucleótidos u oligonucleótidos desvelados en el presente documento incluyen una o más subunidades de ácido nucleico peptídico (PNA). Los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) son análogos de ADN en los que la cadena principal es estructuralmente homomorfa con una cadena principal de desoxirribosa, que consiste en unidades de N-(2-aminoetil)glicina con las que se unen bases de pirimidina o purina. Los PNA que contienen bases de pirimidina y purina naturales hibridan con oligonucleótidos complementarios que cumplen las normas de formación de pares de bases de Watson-Crick e imitan el ADN con respecto a reconocimiento de pares de bases (Egholm, Buchardt et al. 1993). La cadena principal de los PNA está formada por enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster, haciéndolos muy adecuados para aplicaciones antisentido (véase la estructura a continuación). Una cadena principal hecha completamente de ^p N^a no tiene carga, lo que da como resultado dobles cadenas de PNA/ADN o ^p N^a /ARN que presentan estabilidad térmica mayor de la normal. Los PNA no son reconocidos por nucleasas o proteasas.

Los PNA pueden producirse de manera sintética usando cualquier técnica conocida en este campo. PNA es un análogo de ADN en el que una cadena principal de poliamida reemplaza el anillo tradicional de ribosa de fosfato del ADN. A pesar de un cambio estructural radical en la estructura natural, el PNA tiene capacidad de unión específica de secuencia en forma de hélice con ADN o ARN. Las características del PNA incluyen una alta afinidad de unión con ADN o ARN complementario, un efecto desestabilizador provocado por un emparejamiento erróneo de una sola base, resistencia a nucleasas y proteasas, hibridación con ADN o ARN independiente de la concentración de sal y formación de triple hélice con ADN de homopurina. Panagene™ ha desarrollado sus monómeros patentados de PNA Bts (Bts; grupo benzotiazol-2-sulfonilo) y proceso de oligomerización patentado. La oligomerización de PNA usando monómeros de PNA Bts se compone de ciclos repetitivos de desprotección, acoplamiento y recubrimiento. Las patentes de Panagene para esta tecnología incluyen los documentos US 6969766, US 7211668, US 7022851, US 7125994, US 7145006 y US 7179896. Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero sin limitación, patentes de los Estados Unidos n.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Se puede encontrar más enseñanzas sobre compuestos de PNA en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497.

También se desvelan subunidades de "ácido nucleico bloqueado" (Locked Nucleic Acid, LNA). Las estructuras de los LNA son conocidas en la técnica: por ejemplo, Wengel, et al., Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54, 3607 y Accounts of Chem. Research (1999) 32, 301); Obika, et al., Tetrahedron Letters (1997) 38, 8735; (l998) 39, 5401 y Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16, 9230.

Los polinucleótidos y oligonucleótidos pueden incorporar uno o más LNA; en algunos casos, los compuestos pueden estar compuestos únicamente de LNA. Se conocen en la técnica métodos para la síntesis de subunidades de nucleósidos de LNA individuales y su incorporación en oligonucleótidos: patentes de los Estados Unidos 7.572.582; 7.569.575; 7.084.125; 7.060.809; 7.053.207; 7.034.133; 6.794.499; y 6.670.461. Los conectores intersubunitarios habituales incluyen restos de fosfodiéster y fosforotioato; como alternativa, se pueden emplear conectores que no contienen fósforo. Una realización incluye un compuesto que contiene LNA donde cada subunidad de LNA está separada por un ARN o una subunidad de ADN (es decir, un nucleótido de desoxirribosa). Los compuestos ilustrativos adicionales pueden estar compuestos por subunidades alternantes de LNA y ARN o ADN donde el conector intersubunitario es fosforotioato.

Determinados polinucleótidos u oligonucleótidos pueden comprender subunidades basadas en morfolino que portan restos de formación de pares de bases, unidos por enlaces sin carga o sustancialmente sin carga. Las expresiones "oligómero de morfolino" o "PMO" (oligómero de morfolino fosforamidato o fosforodiamidato) se refieren a un análogo de oligonucleótido compuesto por estructuras de subunidades de morfolino, donde (i) las estructuras están unidas entre sí por enlaces que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, preferentemente dos átomos de longitud y preferentemente sin carga o catiónicos, que unen el nitrógeno morfolino de una subunidad con un carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente y (ii) cada anillo morfolino porta una purina o pirimidina o un resto equivalente de formación de pares de bases eficaz para unirse, mediante enlace de hidrógeno específico de base, con una base en un polinucleótido.

Se pueden realizar variaciones de este enlace siempre que no interfieran con la unión o la actividad. Por ejemplo, el oxígeno unido a fósforo puede estar sustituido con azufre (tiofosforodiamidato). El oxígeno 5' puede estar sustituido con amino o amino sustituido con alquilo inferior. El nitrógeno colgante unido a fósforo puede estar sin sustituir, monosustituido o disustituido con alquilo inferior (opcionalmente sustituido). El resto de formación de pares de bases de purina o pirimidina es normalmente adenina, citosina, guanina, uracilo, timina o inosina. La síntesis, las estructuras y las características de unión de oligómeros de morfolino se detallan en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063 y 5.506.337, y las solicitudes PCT. n.° PCT/US07/11435 (enlaces catiónicos) y el documento US08/012804 (síntesis mejorada).

En un aspecto de la invención, ARNip-MV comprende al menos un ligando unido a una nucleobase alterada o no natural. Se incluyen moléculas de carga útil y moléculas de direccionamiento. Un gran número de compuestos puede actuar como la base alterada. La estructura de la base alterada es importante en la medida en que la base alterada no debe impedir sustancialmente la unión del oligonucleótido a su diana, p. ej., ARNm. En determinadas realizaciones, la base alterada es difluorotolilo, nitropirrolilo, nitroimidazolilo, nitroindolilo, naftalenilo, antrancenilo, piridinilo, quinolinilo, pirenilo o el radical divalente de una cualquiera de las nucleobases no naturales descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, la nucleobase no natural es difluorotolilo, nitropirrolilo o nitroimidazolilo. En determinadas realizaciones, la nucleobase no natural es difluorotolilo.

Se conocen en la técnica una amplia diversidad de ligandos y estos son susceptibles a la presente invención. Por ejemplo, el ligando puede ser un esteroide, ácido biliar, lípido, ácido fólico, piridoxal, B12, riboflavina, biotina, compuesto aromático, compuesto policíclico, éter de corona, intercalador, molécula de escisión, agente de unión a proteínas o carbohidrato. En determinadas realizaciones, el ligando es un esteroide o un compuesto aromático. En determinados casos, el ligando es colesterilo.

En otras realizaciones, el polinucleótido u oligonucleótido está unido con un ligando con el fin de mejorar el direccionamiento y la captación celular. Por ejemplo, un agente de ARNip-MV puede estar unido a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Como ejemplo adicional, un agente ARNip-MV puede estar unido a una molécula de unión a ligando específica, tal como un polipéptido o fragmento polipeptídico que se une específicamente a un receptor particular de la superficie celular, o que en general mejora la captación celular, tal como un péptido rico en arginina.

El término "análogo" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula, un compuesto o una composición que conserva la misma estructura y/o función (p. ej., que se une con una diana) como un polinucleótido en el presente documento. Los ejemplos de análogos incluyen compuestos peptidomiméticos y orgánicos o inorgánicos pequeños y grandes.

El término "derivado" o "variante", como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleótido que difiere de un polinucleótido de origen natural (p. ej., secuencia del gen diana) por una o más supresiones, adiciones, sustituciones o modificaciones de cadenas laterales de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, las variantes tienen al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con una región de una secuencia de un gen diana. Por tanto, por ejemplo, en determinadas realizaciones, un oligonucleótido de la presente invención comprende una región que es complementaria a una variante de una secuencia de un gen diana.

Los complejos polinucleotídicos y las moléculas de la presente invención comprenden una región de secuencia o dos o más regiones de secuencia, cada una de las cuales es complementaria, y en realizaciones particulares completamente complementarias, de una región de un gen diana o secuencias polinucleotídicas (o una variante de las mismas). En realizaciones particulares, un gen diana es un gen de mamífero, p. ej., un gen humano o un gen de un microorganismo que infecta a un mamífero, tal como un virus. En determinadas realizaciones, un gen diana es una diana terapéutica. Por ejemplo, un gen diana puede ser un gen cuya expresión o sobreexpresión está asociada con una enfermedad o un trastorno humano. Esto puede ser un gen mutante o un gen de tipo silvestre o normal. Se han identificado diversos genes diana terapéuticos y cualquiera de estos puede ser diana de complejos polinucleotídicos y moléculas de la presente invención. Los genes diana terapéuticos incluyen, pero sin limitación, oncogenes, genes de factores de crecimiento, translocaciones asociadas con enfermedades tales como leucemias, genes de proteínas inflamatorias, genes de factores de transcripción, genes de receptores de factores de crecimiento, genes antiapoptóticos, interleucinas, genes de canales de sodio, genes de canales de potasio, tales como, pero sin limitación, los siguientes genes o genes que codifican las siguientes proteínas: apolipoproteína B (ApoB), apolipoproteína B-100 (ApoB-100), miembros de la familia bcl, incluyendo bcl-2 y bcl-x, MLL-AF4, gen de Huntington, gen de fusión de AML-MT68, IKK-B, Aha1, PCSK9, Eg5, factor de crecimiento transformante beta (TGFbeta), Nav1 .8, RhoA, HIF-1 alfa, Nogo-L, Nogo-R, receptor 9 de tipo toll (TLR9), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), SNCA, beta-catenina, CCR5, c-myc, p53, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-12, interleucina-6, interleucina-17a (IL-17a), interleucina-17f (IL-17f), gen de osteopontina (OPN), gen de psoriasis y gen del factor de necrosis tumoral.

En realizaciones particulares, los complejos o moléculas polinucleotídicos de la presente invención comprenden cadenas guía o regiones específicas de diana que se dirigen a dos o más genes, p. ej., dos o más genes asociados con una enfermedad o un trastorno en particular. Por ejemplo, pueden incluir cadenas guía complementarias al gen o ARNm de interleucina-1 y del gen o ARNm del factor de necrosis tumoral; complementarias al gen o ARNm de interleucina-1 y del gen o ARNm de interleucina-12; o complementario al gen o ARNm de interleucina-1, gen o ARNm de interleucina-12 y gen o ARNm de factor de necrosis tumoral, para el tratamiento de la artritis reumatoide. En una realización, incluyen cadenas guía complementarias al gen o ARNm de osteopontina y del gen o ARNm de TNF.

Otros ejemplos de genes diana terapéuticos incluyen genes y ARNm que codifican proteínas víricas, tales como proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), proteínas del virus HTLV, proteínas del virus de la hepatitis C (VHC), proteínas del virus del Ébola, proteínas del virus JC, proteínas del virus del herpes, proteínas del virus del polioma humano, proteínas del virus de la gripe y proteínas del virus del sarcoma de Rous. En realizaciones particulares, los complejos polinucleotídicos o moléculas de la presente invención incluyen cadenas guía complementarias a dos o más genes o ARNm expresados por un virus en particular, p. ej., dos o más genes de proteínas del VIH o dos o más genes de proteínas del virus del herpes. En otras realizaciones, incluyen cadenas guía que tienen complementariedad con dos o más genes o ARNm del virus del herpes simple, p. ej., el gen o ARNm de UL29 y el gen o ARNm de nectina-1 del VHS-2, para reducir la expresión, replicación o actividad del VHS-2. En una realización, los complejos polinucleotídicos o moléculas que tienen regiones que se dirigen a dos o más genes o ARNm del VHS-2 están presentes en una formulación para administración tópica.

En realizaciones particulares, los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención comprenden una, dos, tres o más cadenas guía o regiones específicas de diana que se dirigen a un gen o ARNm de la apolipoproteína B (ApoB), p. ej., el gen o ARNm de ApoB humana o el gen o ARNm de ApoB de ratón. En consecuencia, en realizaciones particulares, comprenden una, dos, tres o más regiones que comprenden una región complementaria a una región de la secuencia de ApoB humana expuesta en la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, comprenden una, dos, tres o más regiones que comprenden una región complementaria a una región de la secuencia de ApoB de ratón expuesta en la SEQ ID NO: 10. En realizaciones particulares, comprenden dos o más secuencias guía que tienen las secuencias específicas expuestas en los ejemplos adjuntos.

En determinadas realizaciones, los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención comprenden una, dos, tres o más cadenas o regiones guía que se dirigen a genes del VIH. En realizaciones particulares, se dirigen a uno, dos, tres o más genes o ARNm de VIH que codifican una o más proteínas seleccionadas de proteínas gag de VIH, tat de VIH, env de VIH, gag-pol de VIH, vif de VIH y nef de VIH. En consecuencia, en realizaciones particulares, comprenden una, dos, tres o más regiones complementarias a una región de la secuencia de gag del VIH expuesta en la SEQ ID NO: 2; una, dos, tres o más regiones complementarias a una región de la secuencia de tat del VIH expuesta en la SEQ ID NO: 3, una, dos, tres o más regiones complementarias a una región de la secuencia de env del VIH expuesta en la SEQ ID NO: 4, una, dos, tres o más regiones complementarias a una región de la secuencia de gag-pol del VIH expuesta en la SEQ ID NO: 5, una, dos, tres o más regiones que comprenden una región complementaria a una región de la secuencia de vif del VIH expuesta en la SEQ ID NO: 6, una, dos, tres o más regiones que comprenden una región complementaria a una región de la secuencia de nef del VIH expuesta en la SEQ ID NO: 7. En realizaciones particulares, comprenden dos o más secuencias guía que tienen las secuencias del VIH específicas expuestas en los ejemplos adjuntos.

En determinadas realizaciones, la selección de una región de secuencia complementaria a un gen diana (o gen) se basa en el análisis de la secuencia diana elegida y la determinación de la estructura secundaria, Tm, energía de unión y estabilidad relativa y especificidad celular. Dichas secuencias pueden seleccionarse en función de su incapacidad relativa para formar dímeros, horquillas u otras estructuras secundarias que reducirían la integridad estructural del polinucleótido o impedirían la unión específica con el gen diana en una célula hospedadora.

Las regiones diana preferidas del gen o ARNm diana pueden incluir las regiones en o cerca del codón de inicio de la traducción AUG y las secuencias que son sustancialmente complementarias a regiones 5' del gen o ARNm. Se pueden realizar estos análisis de estructura secundaria y consideraciones de selección del sitio diana, por ejemplo, usando la versión 4 del software de análisis de cebadores OLIGO y/o el software de algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25 (17): 3389-402) u Oligoengine Workstation 2.0.

En una realización, los sitios diana preferentemente no se ubican dentro de las regiones no traducidas (Untranslated Region, UTR) 5' y 3' o regiones cercanas al codón de inicio (a una distancia de aproximadamente 75 bases), ya que las proteínas que se unen a regiones reguladoras pueden interferir con la unión del polinucleótido. Además, los posibles sitios diana pueden compararse con una base de datos genómica adecuada, tal como BLASTN 2.0.5, disponible en el servidor de NCBI en www.ncbi.nlm, y las posibles secuencias diana con homología significativa con otras secuencias codificantes eliminadas.

En otra realización, los sitios diana se ubican dentro de la región no traducida (UTR) 5' o 3'. Además, la región autocomplementaria al polinucleótido puede estar compuesta por una secuencia en particular que se encuentra en el gen de la diana.

El gen diana puede ser de cualquier especie, incluyendo, por ejemplo, vegetal, animal (p. ej., mamífero), protozoaria, vírica (p. ej., VIH), bacteriana o fúngica. En determinadas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención pueden comprender o ser complementarios a las secuencias de GFP en el ejemplo 1, las secuencias de VIH en el ejemplo 2 o las secuencias de ApoB en el ejemplo 3.

Como se ha indicado anteriormente, la secuencia del gen diana y la región complementaria al polinucleótido pueden ser complementos completos entre sí o pueden no ser completamente complementarios, siempre que las hebras hibriden entre sí en condiciones fisiológicas.

Los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención comprenden al menos una, dos o tres regiones complementarias a uno o más genes diana, así como una o más regiones autocomplementarias y/o bucles de interconexión. Normalmente, la región complementaria a un gen diana tiene de 15 a 17 a 24 nucleótidos de longitud, incluyendo valores enteros dentro de estos intervalos. Esta región puede tener al menos 16 nucleótidos de longitud, al menos 17 nucleótidos de longitud, al menos 20 nucleótidos de longitud, al menos 24 nucleótidos de longitud, entre 15 y 24 nucleótidos de longitud, entre 16 y 24 nucleótidos de longitud o entre 17 y 24 nucleótidos de longitud, incluidos los valores finales, incluyendo cualquier valor entero dentro de estos intervalos.

La región autocomplementaria tiene normalmente entre 2 y 54 nucleótidos de longitud, al menos 2 nucleótidos de longitud, al menos 16 nucleótidos de longitud o al menos 20 nucleótidos de longitud, incluyendo cualquier valor entero dentro de cualquiera de estos intervalos. Por lo tanto, en una realización, una región autocomplementaria puede comprender aproximadamente 1-26 pares de nucleótidos. Una región monocatenaria puede tener aproximadamente 3-15 nucleótidos, incluyendo todos los números enteros entre ellos. Una región nula se refiere a una región que no es específica para ningún gen diana, al menos intencionadamente. Se puede usar una región o cadena nula en lugar de una región específica de diana, tal como en el diseño de un complejo polinucleotídico bivalente o molécula de la invención (véase, p. ej., figura IV (K)).

En determinadas realizaciones, una región autocomplementaria es suficientemente larga para formar una estructura bicatenaria. En determinadas realizaciones, una región 3' y una región 5' pueden hibridarse para formar una región autocomplementaria (es decir, una región bicatenaria) que comprende una estructura de tallo-bucle. En consecuencia, en una realización, la secuencia primaria de una región autocomplementaria comprende dos tramos de secuencia complementarios entre sí separados por una secuencia adicional que no es complementaria o es semicomplementaria. Aunque es menos óptima, la secuencia adicional puede ser complementaria en determinadas realizaciones. La secuencia adicional forma el bucle de la estructura de tallo-bucle y, por lo tanto, debe ser suficientemente larga para facilitar el plegado necesario para permitir que los dos tramos complementarios se unan entre sí. En realizaciones particulares, la secuencia de bucle comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 bases. En una realización, la secuencia de bucle comprende 4 bases. Los dos tramos de secuencia complementarios entre sí (dentro de la región autocomplementaria; es decir, las regiones de tallo) son de longitud suficiente para hibridarse específicamente entre sí en condiciones fisiológicas. En determinadas realizaciones, cada tramo comprende de 4 a 12 nucleótidos; en otras realizaciones, cada tramo comprende al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 8 o al menos 10 nucleótidos, o cualquier valor entero dentro de estos intervalos. En una realización particular, una región autocomplementaria comprende dos tramos de al menos 4 nucleótidos complementarios separados por una secuencia de bucle de al menos 4 nucleótidos. En determinadas realizaciones, la totalidad o una parte de una región autocomplementaria puede ser complementaria o no de la región del polinucleótido que es complementaria al gen o gen diana.

En realizaciones particulares, las regiones autocomplementarias poseen parámetros termodinámicos adecuados para la unión de regiones autocomplementarias, p. ej., para formar una estructura de tallo-bucle.

En una realización, las regiones autocomplementarias se calculan de manera dinámica mediante el uso de ARN a través del análisis de energía libre y después se comparan con la energía contenida dentro de la "región no autocomplementaria" o región de bucle restante para garantizar que la composición energética sea adecuada para formar una estructura deseada, p. ej., una estructura de tallo-bucle. En general, se consideran diferentes secuencias de nucleótidos de la región de direccionamiento génico al determinar las composiciones de las estructuras de tallobucle para garantizar la formación de estas. La fórmula de análisis de energía libre puede alterarse de nuevo para adaptarse al tipo de nucleótido o pH del ambiente en el que se usa. Están disponibles en la técnica muchos programas de predicción de estructura secundaria diferentes y cada uno puede usarse según la invención. Los parámetros termodinámicos para las bases de ARN y ADN también están disponibles públicamente en combinación con algoritmos de selección de secuencia diana, de los que varios están disponibles en la técnica.

En una realización, el complejo o molécula polinucleotídico comprende o consiste en (a) tres oligonucleótidos que comprenden de 17 a 24 nucleótidos de longitud (incluyendo cualquier valor entero entre ellos), que son complementarios a y capaces de hibridarse en condiciones fisiológicas con al menos una parte de una molécula génica, flanqueados opcionalmente por (b) secuencias autocomplementarias que comprenden de 16 a 54 nucleótidos de longitud (incluyendo cualquier valor entero entre ellos) o (c) de 2 a 12 nucleótidos capaces de formar un bucle. En una realización, cada secuencia autocomplementaria es capaz de formar una estructura de tallo-bucle, una de las cuales está ubicada en el extremo 5' y una de los cuales está ubicada en el extremo 3' de las cadenas guía secundarias.

En determinadas realizaciones, la región autocomplementaria actúa como una estructura para reclutar la escisión enzimática de sí misma y/o unirse con regiones particulares de proteínas implicadas en el proceso catalítico de la modulación génica. Además, el bucle puede ser de una estructura determinada de 4 nucleótidos (p. ej., tetrabucle NGNN, AAGU UUGA o GUUA) para promover la escisión de la región autocomplementaria por una RNasa tal como RNasa III. Además, la región autocomplementaria se puede escindir mediante RNasa III 11/13 o 14/16 nucleótidos en la región bicatenaria dejando un extremo 3' de 2 nucleótidos. En determinadas realizaciones, el tetrabucle tiene la secuencia GNRA o GNYA, donde N indica cualquier nucleótido o nucleósido, R indica un nucleótido o nucleósido de purina; e Y indica un nucleótido o nucleósido de pirimidina.

En determinadas realizaciones, el polinucleótido autocomplementario que se ha escindido enzimáticamente como se ha descrito anteriormente se cargará en la región proteica de los complejos RISC. En determinadas realizaciones, la región autocomplementaria que contiene un bucle mayor de 4 nucleótidos puede evitar la escisión de la región autocomplementaria por RNasa tal como RNasa III. En realizaciones preferidas, el polinucleótido de la presente invención se une con y reduce la expresión de un gen diana. Un gen diana puede ser un gen diana conocido o, como alternativa, un gen diana puede no ser conocido, es decir, se puede usar una secuencia aleatoria. En determinadas realizaciones, los niveles de genes diana se reducen al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 %.

En una realización de la invención, el nivel de inhibición de la expresión del gen diana (es decir, expresión génica) es al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% y al menos 99% o es casi 100%, y por lo tanto la célula u organismo tendrá en efecto el fenotipo equivalente a la denominada "inactivación" de un gen. Sin embargo, en algunas realizaciones, puede preferirse lograr solo inhibición parcial, de modo que el fenotipo sea equivalente a la denominada "atenuación" del gen. Este método de atenuación de la expresión génica puede usarse terapéuticamente o para investigación (p. ej., para generar modelos de patologías, para examinar la función de un gen, para evaluar si un agente actúa sobre un gen, para validar dianas para el descubrimiento de fármacos).

Los complejos y moléculas polinucleotídicos de la invención pueden usarse para dirigirse a y reducir o inhibir la expresión de genes (incluyendo secuencias codificantes y no codificantes), ADNc, ARNm o microARN. En realizaciones particulares, sus cadenas guía o regiones de direccionamiento se unen con ARNm o microARN.

La invención proporciona además matrices del polinucleótido de la invención, incluyendo micromatrices. Las micromatrices son dispositivos miniaturizados normalmente con dimensiones en el intervalo de micrométrico a milimétrico para realizar reacciones químicas y bioquímicas y son particularmente adecuadas para realizaciones de la invención. Pueden construirse matrices a través de microelectrónica y/o microfabricación usando esencialmente todas y cada una de las técnicas conocidas y disponibles en la industria de semiconductores y/o en la industria bioquímica, siempre que dichas técnicas sean susceptibles a y compatibles con la deposición y/o el cribado de secuencias polinucleotídicas.

Las micromatrices de la invención son deseables en particular para análisis de alto rendimiento de múltiples polinucleótidos. Una micromatriz normalmente se construye con regiones o puntos discretos que comprenden el polinucleótido de la presente invención, comprendiendo cada punto uno o más polinucleótidos, preferentemente en ubicaciones posicionalmente direccionables en la superficie de la matriz. Las matrices de la invención pueden prepararse por cualquier método disponible en la técnica. Por ejemplo, el proceso de síntesis química dirigida por la luz desarrollado por Affymetrix (véase, patentes de los Estados Unidos n.° 5.445.934 y 5.856.174) puede usarse para sintetizar biomoléculas en superficies de chips combinando síntesis fotoquímica en fase sólida con técnicas de fabricación fotolitográfica. El enfoque de deposición química desarrollado por Incyte Pharmaceutical usa sondas de ADNc presintetizadas para deposición dirigida sobre superficies de chips (véase, p. ej., patente de los Estados Unidos n.° 5.874.554).

En determinadas realizaciones, una molécula polinucleotídica de la presente invención se sintetiza químicamente usando técnicas ampliamente disponibles en este campo y se hibrida como un complejo de tres cadenas. En una realización relacionada, las tres o más cadenas guía de un complejo polinucleotídico de la presente invención pueden sintetizarse químicamente de manera individual e hibridarse para producir el complejo polinucleotídico.

En otras realizaciones, se expresa in vitro o in vivo usando técnicas adecuadas y ampliamente conocidas, tales como vectores o construcciones plasmídicas. En consecuencia, en determinadas realizaciones, la presente invención incluye vectores de expresión in vitro e in vivo que comprenden la secuencia de un polinucleótido de la presente invención interconectada por secuencias de nucleótidos formadoras de bucles o tallo-bucle. Pueden usarse métodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polinucleótido, así como elementos adecuados de control de la transcripción y la traducción. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.

Un sistema de construcción de vector o ácido nucleico puede comprender un solo vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que contienen juntos el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se va a introducir el vector. En el presente caso, la construcción del vector o ácido nucleico es preferentemente una que es operativamente funcional en una célula de mamífero. El vector también puede incluir un marcador de selección tal como un gen de resistencia a antibióticos o fármacos, o un gen indicador (es decir, proteína verde fluorescente, luciferasa), que pueden usarse para la selección o identificación de transformantes o transfectantes adecuados. Los sistemas de administración ilustrativos pueden incluir sistemas de vectores víricos (es decir, transducción mediada por virus) incluyendo, pero sin limitación, vectores retrovíricos (p. ej., lentivíricos), vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados y vectores víricos de herpes, entre otros conocidos en la técnica.

Como se ha indicado anteriormente, determinadas realizaciones emplean vectores retrovíricos tales como vectores lentivíricos. El término "lentivirus" se refiere a un género de retrovirus complejos que son capaces de infectar células tanto en división como no en división. Los ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de la inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH de tipo 1 y VIH de tipo 2), visna-maedi, el virus de la encefalitis-artritis caprina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV) y virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV). Pueden obtenerse vectores lentivíricos de uno o más cualesquiera de estos lentivirus (véase, p. ej., Evans et al., Hum Gene Ther.10: 1479-1489, 1999; Case et al., PNAS USA 96: 2988-2993, 1999; Uchida et al., PNAS USA 95: 11939-11944, 1998; Miyoshi et al., Science 283: 682-686, 1999; Sutton et al., J Virol 72: 5781-5788, 1998; y Frecha et al., Blood. 112: 4843-52, 2008.

En determinadas realizaciones, el vector retrovírico comprende determinadas secuencias mínimas de un genoma de lentivirus, tal como el genoma del VIH o el genoma del SIV. El genoma de un lentivirus normalmente se organiza en una región de repetición terminal larga (Long Terminal Repeat, LTR) 5', el gen de gag, el gen de pol, el gen de env, los genes accesorios (p. ej., nef, vif, vpr, vpu, tat, rev) y una región LTR 3'. La LTR vírica se divide en tres regiones denominadas U3, R (repetición) y U5. La región U3 contiene los elementos potenciadores y promotores, la región U5 contiene las señales de poliadenilación y la región R separa las regiones U3 y U5. Las secuencias transcritas de la región R aparecen en los extremos tanto 5' como 3' del ARN vírico (véase, p. ej., "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, 2000); O Narayan, J. Gen. Virology. 70: 1617-1639, 1989; Fields et al., Fundamental Virology Raven Press., 1990; Miyoshi et al., J Virol. 72: 8150-7,1998; y la patente de los Estados Unidos n.° 6.013.516. Los vectores lentivíricos pueden comprender uno o más cualesquiera de estos elementos del genoma lentivírico, para regular la actividad del vector según se desee, o pueden contener supresiones, inserciones, sustituciones o mutaciones en uno o más de estos elementos, tal como para reducir los efectos patológicos de la replicación lentivírica o para limitar el vector lentivírico a un solo ciclo de infección.

Normalmente, un vector retrovírico mínimo comprende determinadas secuencias de LTR 5' y LTR 3', uno o más genes de interés (que se van a expresar en la célula diana), uno o más promotores y una secuencia de acción en cis para el empaquetamiento del ARN. Se pueden incluir otras secuencias reguladoras, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. El vector vírico normalmente se clona en un plásmido que puede transfectarse en una línea celular de empaquetamiento, tal como una célula eucariota (p. ej., 293-HEK), y también comprende normalmente secuencias útiles para la replicación del plásmido en bacterias.

En determinadas realizaciones, el vector vírico comprende secuencias de las LTR 5' y/o 3' de un retrovirus tal como un lentivirus. Las secuencias de LTR pueden ser secuencias de LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias de LTR del VIH, SIV, FIV o BIV. Preferentemente, las secuencias de LTR son secuencias de LTR del VIH.

En determinadas realizaciones, el vector vírico comprende las secuencias R y U5 de la LTR 5' de un lentivirus y una LTR 3' inactivada o "autoinactivadora" de un lentivirus. Una "LTR 3' autoinactivadora" es una repetición terminal larga (LTR) 3' que contiene una mutación, sustitución o supresión que impide que las secuencias de LTR impulsen la expresión de un gen cadena abajo. Una copia de la región U3 de la LTR 3' actúa como molde para la generación de ambas LTR en el provirus integrado. Por tanto, cuando la LTR 3' con una supresión o mutación inactivadora se integra como la LTR 5' del provirus, no es posible la transcripción a partir de la LTR 5'. Esto elimina la competencia entre el potenciador/promotor vírico y cualquier potenciador/promotor interno. Se describen LTR 3' autoinactivadoras, por ejemplo, en Zufferey et al., J Virol. 72: 9873-9880, 1998; Miyoshi et al., J Virol. 72: 8150-8157, 1998: e Iwakuma et al., Virology 261: 120-132, 1999. Pueden generarse LTR 3' autoinactivadoras por cualquier método conocido en la técnica. En determinadas realizaciones, el elemento U3 de la LTR 3' contiene una supresión de su secuencia potenciadora, preferentemente la secuencia TATA, los sitios Spl y/o NF-kappa B. Como resultado de la LTR 3' autoinactivadora, el provirus que está integrado en el genoma de la célula hospedadora comprenderá una LTR 5' inactivada.

Los vectores de expresión normalmente incluyen secuencias reguladoras, que regulan la expresión del polinucleótido. Las secuencias reguladoras presentes en un vector de expresión incluyen las regiones no traducidas del vector, p. ej., potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3', que interactúan con proteínas celulares del hospedador para llevar a cabo transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su concentración y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y la célula utilizados, se puede usar cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Además, también se pueden usar promotores específicos de tejido o célula.

Para la expresión en células de mamíferos, generalmente se prefieren promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Además, generalmente hay disponibles varios sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, se pueden ligar secuencias que codifican un polipéptido de interés en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Se puede usar inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma vírico para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células hospedadoras infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). Además, se pueden usar potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR), para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamíferos.

Determinadas realizaciones pueden emplear uno o más de los promotores de la ARN polimerasa II y III. Se puede encontrar una selección adecuada de promotores de la ARN polimerasa III, por ejemplo, en Paule y White. Nucleic Acids Research., Vol 28, págs. 1283-1298, 2000. Los promotores de la ARN polimerasa II y III también incluyen cualquier fragmento de ADN sintético o modificado por ingeniería genética que pueda dirigir la ARN polimerasa II o III, respectivamente, para transcribir sus secuencias codificantes de ARN cadena abajo. Además, el promotor o los promotores de la ARN polimerasa II o III (Pol II o III) usados como parte del vector vírico pueden ser inducibles. Se puede usar cualquier promotor de Pol II o III inducible adecuado con los métodos de la invención. Los promotores ilustrativos de Pol II o III incluyen los promotores sensibles a la tetraciclina proporcionados en Ohkawa y Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, págs. 577-585, 2000; y Meissner et al., Nucleic Acids Research, Vol. 29, págs. 1672­ 1682, 2001.

Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos que pueden usarse incluyen el promotor de ubiquitina, el promotor de CMV (véase, p. ej., Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), la p-actina (véase, p. ej., Gunning et al., PNAS USA 84: 4831-4835, 1987) y el promotor pgk (véase, p. ej., Adra et al., Gene 60: 65-74, 1987); Singer-Sam et al., Gene 32: 409-417, 1984; y Dobson et al., Nucleic Acids Res. 10: 2635-2637, 1982. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido incluyen el promotor Ick (véase, p. ej., Garvin et al., Mol. Cell Biol. 8: 3058-3064, 1988; y Takadera et al., Mol. Cell Biol. 9: 2173-2180, 1989), el promotor de miogenina (Yee et al., Genes and Development 7: 1277-1289. 1993) y el thy1 (véase, p. ej., Gundersen et al., Gene 113: 207-214, 1992).

Los ejemplos adicionales de promotores incluyen el promotor de ubiquitina-C, el promotor de la cadena pesada p humana o el promotor de la cadena pesada de Ig (p. ej., MH-b12) y el promotor de la cadena ligera k humana o el promotor de la cadena ligera de Ig (p. ej., EEK-b12), que son funcionales en linfocitos B. El promotor MH-b12 contiene el promotor de la cadena pesada p humana precedido por el potenciador iEp flanqueado por regiones de asociación de matriz y el promotor EEK-b12 contiene el promotor de la cadena ligera Kprecedido por un potenciador intrónico (ÍEk), una región asociada a la matriz y un potenciador 3' (3'Ek) (véase, p. ej., Luo et al., Blood. 113: 1422­ 1431, 2009. En consecuencia, determinadas realizaciones pueden emplear uno o más de estos elementos promotores o potenciadores.

En determinadas realizaciones, la invención proporciona la expresión condicional de un polinucleótido. Se conocen y están disponibles en la técnica diversos sistemas de expresión condicionales para su uso tanto en células como en animales y la invención contempla el uso de cualquier sistema de expresión condicional de este tipo para regular la expresión o actividad de un polinucleótido. En una realización de la invención, por ejemplo, se logra expresión inducible usando el sistema REV-TET. Están bien documentados en la bibliografía componentes de este sistema y métodos de uso del sistema para controlar la expresión de un gen y están disponibles en el mercado vectores que expresan el transactivador controlado por tetraciclina (tTA) o el tTA inverso (rtTA) (p. ej., vectores pTet-Off, pTet-On y ptTA-2/3/4, Clontech, Palo Alto, CA). Dichos sistemas se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.650.298, n.° 6.271.348, 5.922.927 y patentes relacionadas.

En determinadas realizaciones, los vectores víricos (p. ej., retrovíricos, lentivíricos) proporcionados en el presente documento están "pseudotipificadas" con una o más glucoproteínas víricas o proteínas de envoltura seleccionadas, principalmente para dirigirse a tipos celulares seleccionados. La pseudotipificación se refiere en general a la incorporación de una o más glucoproteínas víricas heterólogas en la partícula del virus de la superficie celular, lo que permite con frecuencia que la partícula vírica infecte una célula seleccionada que difiere de sus células diana normales. Un elemento "heterólogo" procede de un virus distinto del virus del que procede el genoma de ARN del vector vírico. Normalmente, las regiones codificantes de glucoproteínas del vector vírico se han alterado genéticamente, tal como mediante supresión, para evitar la expresión de su propia glucoproteína. Simplemente de manera ilustrativa, las glucoproteínas de la envoltura gp41 y/o gp120 de un vector lentivírico procedente del VIH se suprimen normalmente antes de la pseudotipificación con una glucoproteína vírica heteróloga.

Se puede lograr generación de vectores víricos usando cualquier técnica de ingeniería genética adecuada conocida en este campo, incluyendo, sin limitación, las técnicas convencionales de digestión con endonucleasas de restricción, ligamiento, transformación, purificación de plásmidos, amplificación por PCR y secuenciación de ADN, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (l997)) y "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).

Se puede usar cualquiera de diversos métodos conocidos en la técnica para producir partículas retrovíricas adecuadas cuyo genoma comprende una copia de ARN del vector vírico. Como un método, el vector vírico se puede introducir en una línea celular de empaquetamiento que empaqueta el ARN genómico vírico basado en el vector vírico en partículas víricas con una especificidad celular diana deseada. La línea celular de empaquetamiento normalmente proporciona en trans las proteínas víricas que son necesarias para empaquetar el A^rN genómico vírico en partículas víricas e infectar la célula diana, incluyendo las proteínas gag estructurales, las proteínas pol enzimáticas y las glucoproteínas de la envoltura.

En determinadas realizaciones, la línea celular de empaquetamiento puede expresar de manera estable determinadas proteínas víricas necesarias o deseadas (p. ej., gag, pol) (véase, p. ej., patente de los Estados Unidos n.° 6.218.181. En determinadas realizaciones, la línea celular de empaquetamiento puede transfectarse de manera transitoria con plásmidos que codifican determinadas proteínas víricas necesarias o deseadas (p. ej., gag, pol, glucoproteína), incluyendo las secuencias de glucoproteínas del virus del sarampión descritas en el presente documento. En una realización ilustrativa, la línea celular de empaquetamiento expresa de manera estable las secuencias de gag y pol y la línea celular se transfecta después con un plásmido que codifica el vector vírico y un plásmido que codifica la glucoproteína. Tras la introducción de los plásmidos deseados, se recogen y procesan partículas víricas de la manera correspondiente, tal como por ultracentrifugación para lograr una reserva concentrada de partículas víricas. Las líneas celulares de empaquetamiento ilustrativas incluyen las líneas celulares 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430).

En una realización particular, los polinucleótidos se expresan usando un sistema de vector que comprende una cadena principal de vector pSUPER y secuencias adicionales correspondientes al polinucleótido que se va a expresar. Se ha mostrado que el sistema de vectores pSUPER es útil para expresar reactivos de ARNhc y regular negativamente la expresión génica (Brummelkamp, T.T. et al., Science 296: 550 (2002) y Brummelkamp, T.R. et al., Cancer Cell, publicado en línea el 22 de agosto de 2002). Los vectores PSUPER están disponibles en el mercado en OligoEngine, Seattle, WA.

Métodos de regulación de la expresión génica

Los polinucleótidos de la invención se pueden usar para diversos fines, todos relacionados en general con su capacidad para inhibir o reducir la expresión de uno o más genes diana. En consecuencia, la invención proporciona métodos para reducir la expresión de uno o más genes diana que comprenden introducir un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención en una célula que comprende dichos uno o más genes diana. En realizaciones particulares, el complejo o molécula polinucleotídico comprende una o más cadenas guía que se dirigen colectivamente al uno o más genes diana. En una realización, se introduce un polinucleótido de la invención en una célula que contiene un gen diana o un homólogo, una variante o un ortólogo del mismo, diana de cualquiera de una, dos o tres de las cadenas guía o regiones de direccionamiento.

Además, los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para reducir la expresión de manera indirecta. Por ejemplo, un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención se puede usar para reducir la expresión de un transactivador que conduce la expresión de un segundo gen (es decir, el gen diana), reduciendo de este modo la expresión del segundo gen. De manera similar, se puede usar un polinucleótido para aumentar la expresión de manera indirecta. Por ejemplo, un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención se puede usar para reducir la expresión de un represor de la transcripción que inhibe la expresión de un segundo gen, aumentando de este modo la expresión del segundo gen.

En diversas realizaciones, un gen diana es un gen procedente de la célula en la que se va a introducir un polinucleótido, un gen endógeno, un gen exógeno, un transgén o un gen de un patógeno que está presente en la célula después de la transfección de la misma. Dependiendo del gen diana en particular y la cantidad del polinucleótido suministrado a la célula, el método de la presente invención puede provocar inhibición parcial o completa de la expresión del gen diana. La célula que contiene el gen diana puede obtenerse de o estar contenida en cualquier organismo (p. ej., planta, animal, protozoo, virus, bacteria u hongo). Como se usa en el presente documento, los "genes diana" incluyen genes, ARNm y microARN.

La inhibición de la expresión del gen diana puede verificarse por medios que incluyen, pero sin limitación, observación o detección de una ausencia o disminución observable del nivel de proteína codificada por un gen diana, una ausencia o disminución observable del nivel de un producto génico expresado a partir de un gen diana (p. ej., ARNm0 y/o un fenotipo asociado con la expresión del gen, usando técnicas conocidas por un experto en el campo de la presente invención.

Los ejemplos de características celulares que pueden examinarse para determinar el efecto provocado por la introducción de un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención incluyen, crecimiento celular, apoptosis, características del ciclo celular, diferenciación celular y morfología.

Un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención puede introducirse directamente en la célula (es decir, intracelularmente) o introducirse extracelularmente en una cavidad o un espacio intersticial de un organismo, p. ej., un mamífero, en la circulación de un organismo, introducirse por vía oral, introducirse bañando un organismo en una solución que contiene el polinucleótido o por algún otro medio suficiente para administrar el polinucleótido a la célula.

Además, un vector obtenido por ingeniería genética para expresar un polinucleótido puede introducirse en una célula, en donde el vector expresa el polinucleótido, introduciéndolo de este modo en la célula. Son ampliamente conocidos y están disponibles en la técnica métodos para transferir un vector de expresión a una célula, incluyendo, p. ej., transfección, lipofección, carga por raspado, electroporación, microinyección, infección, pistola génica y retrotransposición. En general, un experto en la técnica determina fácilmente un método adecuado para introducir un vector en una célula en función del tipo de vector y el tipo de célula y las enseñanzas ampliamente disponibles en la técnica. Se pueden introducir agentes infecciosos por diversos medios fácilmente disponibles en la técnica, incluyendo, p. ej., inhalación nasal.

Los métodos para inhibir la expresión génica usando los oligonucleótidos de la invención pueden combinarse con otros métodos de atenuación y supresión, p. ej., dirección génica, ARN antisentido, ribozimas, ARN bicatenario (p. ej., ARNhc y ARNip) para reducir adicionalmente la expresión de un gen diana.

En diferentes realizaciones, las células diana de la invención son células primarias, líneas celulares, células inmortalizadas o células transformadas. Una célula diana puede ser una célula somática o una célula germinal. La célula diana puede ser una célula que no se divide, tal como una neurona, o puede ser capaz de proliferar in vitro en condiciones adecuadas de cultivo celular. Las células diana pueden ser células normales o pueden ser células enfermas, incluyendo las que contienen una mutación genética conocida. Las células diana eucariotas de la invención incluyen células de mamífero, tales como, por ejemplo, una célula humana, una célula murina, una célula de roedor y una célula de primate. En una realización, una célula diana de la invención es una célula madre, que incluye, por ejemplo, una célula madre embrionaria, tal como una célula madre embrionaria murina.

Los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención pueden usarse para tratar cualquiera de una amplia diversidad de enfermedades o trastornos, incluyendo, pero sin limitación, enfermedades inflamatorias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del sistema nervioso, tumores, enfermedades desmielinizantes, enfermedades del sistema digestivo, enfermedades del sistema endocrino, enfermedades del sistema reproductivo, enfermedades hemáticas y linfáticas, enfermedades inmunológicas, trastornos mentales, enfermedades del aparato locomotor, enfermedades neurológicas, enfermedades neuromusculares, enfermedades metabólicas, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades de la piel y del tejido conectivo, enfermedades urológicas e infecciones.

El tratamiento se puede practicar en un animal, en particular, un mamífero o específicamente un ser humano.

En consecuencia, los complejos de ARNip multivalentes de la invención son útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad asociada con la desregulación, sobreexpresión o mutación génica. Por ejemplo, un complejo polinucleotídico o molécula de la presente invención puede introducirse en una célula cancerosa o tumor y de este modo inhibir la expresión de un gen necesario para o asociado con el mantenimiento del fenotipo carcinogénico/tumorigénico. Para prevenir una enfermedad u otra patología, se puede seleccionar un gen diana que sea, p. ej., necesario para el inicio o mantenimiento de una enfermedad/patología. El tratamiento puede incluir el alivio de cualquier síntoma asociado con la enfermedad o indicación clínica asociada con la patología.

Además, los polinucleótidos de la presente invención son útiles para tratar enfermedades o trastornos asociados con la mutación génica. En un aspecto, se utiliza un polinucleótido para modular la expresión de un gen o alelo mutado. En dichos aspectos, el gen mutado es una diana del complejo o molécula polinucleotídico, que comprenderá una región complementaria a una región del gen mutado. Esta región puede incluir la mutación, pero no es necesario, ya que también puede ser diana otra región del gen, lo que da como resultado una disminución de la expresión del gen o gen mutante. En determinados aspectos, esta región comprende la mutación y, en aspectos relacionados, el complejo o molécula polinucleotídico inhibe específicamente la expresión del gen o gen mutante pero no el gen o gen de tipo silvestre. Dicho polinucleótido es particularmente útil en situaciones, p. ej., donde un alelo está mutado pero otro no. Sin embargo, en otros aspectos, esta secuencia no comprendería necesariamente la mutación y puede, por lo tanto, comprender solamente una secuencia de tipo silvestre. Dicho polinucleótido es particularmente útil en situaciones, p. ej., donde todos los alelos están mutados. Se conoce en la técnica que diversas enfermedades y trastornos están asociados con o provocados por la mutación génica.

En determinados aspectos, un gen de un patógeno es diana de inhibición. Por ejemplo, el gen podría provocar inmunosupresión del hospedador directamente o ser esencial para la replicación del patógeno, transmisión del patógeno o mantenimiento de la infección. Además, el gen diana puede ser un gen del patógeno o gen del hospedador responsable de la entrada de un patógeno en su hospedador, metabolismo farmacológico por el patógeno o el hospedador, replicación o integración del genoma del patógeno, establecimiento o propagación de una infección en el hospedador o ensamblaje de la siguiente generación de patógeno. Se desvelan en el presente documento métodos de profilaxis (es decir, prevención o disminución del riesgo de infección), así como reducción de la frecuencia o gravedad de los síntomas asociados con la infección. Por ejemplo, las células en riesgo de infección por un patógeno o células ya infectadas, en particular infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), pueden ser diana de tratamiento mediante la introducción de un polinucleótido según la invención (véanse los ejemplos 1 y 2 para secuencias de direccionamiento). Por tanto, complejos o moléculas polinucleotídicos de la presente invención que se dirigen a una o más proteínas del VIH son útiles para tratar o inhibir la infección por VIH o el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

En otros aspectos específicos, la presente invención es útil en el tratamiento o desarrollo de tratamientos para cánceres de cualquier tipo. Los ejemplos de tumores que pueden tratarse usando los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, neuroblastomas, mielomas, cánceres de próstata, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón no microcítico, tumores cerebrales, cáncer de mama, leucemias, linfomas y otros.

En una realización, los complejos o moléculas polinucleotídicos de la presente invención que se dirigen a la apolipoproteína B (apoB) son útiles para tratar, reducir o inhibir la aterosclerosis o cardiopatía. ApoB es la apolipoproteína primaria de lipoproteínas de baja densidad (LDL), que es responsable de portar el colesterol a los tejidos. ApoB en la partícula de LDL actúa como un ligando para receptores de LDL y los altos niveles de ApoB pueden conducir a placas que provocan vasculopatías (ateroesclerosis), lo que conduce a cardiopatía.

Los complejos polinucleotídicos, moléculas y vectores de expresión (incluyendo vectores víricos y virus) pueden introducirse en las células in vitro o ex vivo y después colocarse en un animal para efectuar terapia o pueden introducirse directamente en un paciente mediante administración in vivo. Por tanto, se desvelan en el presente documento métodos de terapia génica. Pueden administrarse composiciones de la invención a un paciente de cualquiera de varias maneras, incluyendo parenteral, intravenosa, sistémica, local, tópica, oral, intratumoral, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, por inhalación o cualquier método similar de administración. En un aspecto, las composiciones se administran por vía parenteral, es decir, por vía intraarticular, por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea o por vía intramuscular. En un aspecto específico, las composiciones liposómicas se administran mediante infusión intravenosa o por vía intraperitoneal mediante una inyección de embolada.

Las composiciones de la invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán con frecuencia además uno o más tampones (p. ej., solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (p. ej., glucosa, manosa, sacarosa, dextrosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio), solutos que hacen que la formulación sea isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado.

La cantidad de los oligonucleótidos administrados a un paciente puede ser determinada fácilmente por un médico basándose en diversos factores, incluyendo, p. ej., la enfermedad y el nivel de los oligonucleótidos expresados a partir del vector que se use (en los casos donde se administre un vector). La cantidad administrada por dosis se selecciona normalmente para que esté por encima de la dosis terapéutica mínima pero por debajo de una dosis tóxica. La elección de la cantidad por dosis dependerá de varios factores, tales como el historial médico del paciente, el uso de otras terapias y la naturaleza de la enfermedad. Además, la cantidad administrada puede ajustarse a lo largo del tratamiento, dependiendo de la respuesta del paciente al tratamiento y la presencia o gravedad de cualquier efecto secundario asociado al tratamiento.

Métodos para determinar la función génica

La divulgación incluye además un método para identificar la función génica en un organismo que comprende el uso de un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención para inhibir la actividad de un gen diana de función previamente desconocida. En lugar del lento y laborioso aislamiento de mutantes mediante cribado genético tradicional, la genómica funcional prevé determinar la función de genes no caracterizados empleando el método desvelado para reducir la cantidad y/o alterar el ritmo de la actividad del gen diana. El método puede usarse para determinar dianas potenciales para la farmacia, entender los acontecimientos normales y patológicos asociados con el desarrollo, determinar las rutas de señalización responsables del desarrollo/envejecimiento postnatal y similares. La velocidad creciente de adquisición de información de secuencias de nucleótidos de fuentes genómicas y génicas expresadas, incluyendo secuencias totales para los genomas de levadura, D. melanogaster y C. elegans, se puede acoplar con la invención para determinar la función del gen en un organismo (p. ej., nematodo). La preferencia de diferentes organismos para usar codones particulares, búsqueda de bases de datos de secuencias para productos génicos relacionados, correlación del mapa de enlaces de rasgos genéticos con el mapa físico del que proceden las secuencias de nucleótidos y métodos de inteligencia artificial se pueden usar para definir marcos abiertos de lectura potenciales de las secuencias de nucleótidos adquiridas en dichos proyectos de secuenciación.

En un aspecto, se usa un polinucleótido de la presente invención para inhibir la expresión génica basándose en una secuencia parcial disponible a partir de un marcador de secuencia expresada (Expresed Sequence Tag, EST), p. ej., para determinar la función del gen o la actividad biológica. Alteraciones funcionales en el crecimiento, el desarrollo, el metabolismo, la resistencia a enfermedades u otros procesos biológicos serían indicativas de la función normal del producto génico de EST.

La facilidad con la que se puede introducir un polinucleótido en una célula/organismo intacto que contiene el gen diana permite que la presente invención se use en exploración de alto rendimiento (High Throughput Screening, HTS). Por ejemplo, las soluciones que contienen el polinucleótido que son capaces de inhibir diferentes genes expresados se pueden colocar en pocillos individuales situados en una placa de microtitulación como una matriz ordenada y se pueden analizar células/organismos intactos en cada pocillo para detectar cualquier cambio o modificación en el comportamiento o desarrollo debido a inhibición de la actividad del gen diana. La función del gen diana puede analizarse a partir de los efectos que tiene sobre la célula/organismo cuando se inhibe la actividad del gen. En un aspecto, los polinucleótidos de la invención se usan para exploración quimiocogenómica, es decir, probar compuestos para determinar su capacidad para revertir una enfermedad modelada por la reducción de la expresión génica usando un polinucleótido de la invención.

Si se determina que una característica de un organismo está genéticamente ligada a un polimorfismo mediante análisis de RFLP o QTL, la presente invención se puede usar para obtener información acerca de si ese polimorfismo genético podría ser directamente responsable de la característica. Por ejemplo, un fragmento que define el polimorfismo genético o las secuencias en las proximidades de dicho polimorfismo genético puede amplificarse para producir un ARN, se puede introducir un polinucleótido en el organismo y se puede determinar si una alteración en la característica está correlacionada con la inhibición.

La presente invención también es útil para permitir la inhibición de genes esenciales. Dichos genes pueden ser necesarios para la viabilidad de células u organismos solo en etapas particulares del desarrollo o compartimentos celulares. El equivalente funcional de las mutaciones condicionales puede producirse inhibiendo la actividad del gen diana cuando o donde no sea necesario para la viabilidad. La invención permite la adición de un polinucleótido en momentos específicos del desarrollo y en ubicaciones del organismo sin introducir mutaciones permanentes en el genoma diana. De manera similar, la invención contempla el uso de vectores inducibles o condicionales que expresan un polinucleótido solo cuando se desee.

La presente invención también permite un método para validar si un producto génico es una diana para el descubrimiento o desarrollo de fármacos. Se introduce un polinucleótido que se dirige al gen que corresponde al gen para la degradación en una célula u organismo. La célula u organismo se mantiene en condiciones en las que se produce la degradación del gen, lo que da lugar a una disminución de la expresión del gen. Se determina si la disminución de la expresión del gen tiene un efecto sobre la célula o el organismo. Si la disminución de la expresión del gen tiene un efecto, entonces el producto genético es una diana para el descubrimiento o desarrollo de fármacos. Métodos de diseño y producción de complejos y moléculas polinucleotídicos

Los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención comprenden un conjunto nuevo y único de secuencias funcionales, dispuestas de manera que adopten una estructura secundaria que contenga una o más regiones bicatenarias (en ocasiones unidas por estructuras de tallo-bucle o bucle), que transmite las ventajas del polinucleótido. En consecuencia, en determinadas realizaciones, la presente invención incluye métodos para diseñar los complejos y moléculas polinucleotídicos de la presente invención. Dichos métodos implican normalmente una selección adecuada de los diversos componentes de secuencia de los complejos y moléculas polinucleotídicos. Las expresiones "cadena primaria", "cadena secundaria" y "cadena clave" se refieren a las diversas cadenas guía presentes dentro de un complejo o molécula polinucleotídico de la presente invención.

En una realización, el diseño básico del complejo polinucleotídico es el siguiente:

DISEÑAR MOTIVOS:

(cadena primaria)(UU)(cadena secundaria)(UU)(cadena clave)(UU)

En consecuencia, en una realización relacionada, el polinucleótido está diseñado de la siguiente manera:

II. (cadena secundaria)(UU)(UU)(cadena clave)(UU)(cadena primaria)

III. (cadena secundaria)(UU)(bucle o tallo-bucle)(cadena clave)(UU)(bucle o tallo-bucle)(cadena primaria)(UU) ESTABLECER PARÁMETROS

Establecer el tamaño de siembra para autocomplementariedad en aproximadamente 38-43%. Para 19 dianas de nucleótidos, se prefiere un intervalo de 7 u 8 nucleótidos como SEED_SIZE.

Para cada gen, definir un gen diana PRIMARIO y SECUNDARIO.

DEFINIR CADENAS PRIMARIAS

Comenzar con una o más secuencias de genes diana. Para cada gen, elaborar una lista de secuencias diana PRIMARIAS de 17-24 motivos de nucleótidos que cumplan los criterios de contenido de G/C, especificidad y ausencia de poli-A o poli-G. Para cada uno, encontrar también una cadena SECUNDARIA y CLAVE.

ENCONTRAR CADENAS SECUNDARIAS Y CLAVE

d. Para cada secuencia diana en cada gen, alinear por clustal de base 1 a SEED_SIZE el inverso de cada secuencia al gen SECUNDARIO

Registrar la secuencia con una alineación perfecta. La secuencia diana en el gen SECUNDARIO es el inicio de la alineación, menos la longitud del motivo, más SEED_SIZE al inicio de la alineación, más SEED_SIZE. La cadena SECUNDARIA es el complemento inverso.

Para encontrar cada cadena CLAVE, definir SEED_A como base 1 a SEED_SIZE de la cadena PRIMARIA, definir SEEDJ3 como bases en la longitud del motivo menos SEED_SIZE a la longitud del motivo de la cadena SECUNDARIA. Establecer una MID_SECTION como caracteres "|" repetidos de longitud de secuencia de motivo menos longitud de SEED_A más longitud de SEED_B. Establecer la secuencia de alineación clave como SEED_A, MID_SECTION, SEED_B. Alinear por clustal con el gen diana para el segmento clave. Registrar la secuencia diana CLAVE como bases en el acierto de alineación en el gen diana clave a aciertos de alineación de bases más la longitud del motivo. La cadena CLAVE es el complemento inverso.

CONSTRUIR UN POLINUCLEÓTIDO OPCIONAL

g. Construir los tallos A y B candidatos con (4-24) nucleótidos que tengan una temperatura de fusión dominante a región de igual longitud de la diana. Las cadenas del tallo tienen complementariedad A-T, G-C entre sí. La longitud y la composición dependen de qué endorribonucleasa se elija para el preprocesamiento de la estructura de tallo-bucle. h. Construir los tallos C y D candidatos con (4-24) nucleótidos que tengan una temperatura de fusión dominante a región de igual longitud de la diana. Las cadenas del tallo tienen complementariedad A-T, G-C entre sí, pero no complementariedad con los tallos A y B. La longitud y la composición dependen de qué endorribonucleasa se elija para el preprocesamiento de la estructura de tallo-bucle.

i. Construir candidatos de bucle con (4-12) nucleótidos ricos en AT en el bucle A y B. La longitud y la composición dependen de qué endorribonucleasa se elija para el preprocesamiento de la estructura de tallo-bucle. Se han sugerido tetrabucles como se describe para tallos más largos procesados por endorribonucleasas RNasa III o Pac1 RNasa III como se muestra en la (Fig. A.). Se sugieren bucles mayores para evitar el procesamiento de RNasa III o Pací y se colocan en tallos más cortos como se muestra en (Fig. C, Fig. D).

j. Formar una secuencia contigua para cada motivo candidato.

k. Plegar la secuencia candidata usando un software con los parámetros deseados.

l. A partir del resultado, ubicar estructuras con regiones diana monocatenarias que estén flanqueadas en uno o ambos extremos con una estructura de tallo/bucle deseada.

En una realización, un método para diseñar una secuencia polinucleotídica que comprende una o más regiones autocomplementarias para la regulación de la expresión de un gen diana (es decir, un polinucleótido), incluye: (a) seleccionar una primera secuencia de 17 a 30 nucleótidos de longitud y complementaria a un gen diana; y (b) seleccionar una o más secuencias adicionales de 12 a 54 nucleótidos de longitud, que comprende regiones autocomplementarias y que no son complementarias a la primera secuencia.

Estos métodos, en determinadas realizaciones, incluyen determinar o predecir la estructura secundaria adoptada por las secuencias seleccionadas en el etapa (b), p. ej., para determinar que son capaces de adoptar una estructura de tallo-bucle.

De manera similar, estos métodos pueden incluir una etapa de verificación, que comprende probar la secuencia polinucleotídica diseñada para determinar su capacidad de inhibir la expresión de un gen diana, p. ej., en un sistema de prueba in vivo o in vitro.

La invención permite además el uso de un programa informático para seleccionar secuencias de un polinucleótido, en función de las características de complementariedad descritas en el presente documento. La divulgación, por tanto, proporciona programas de software informático y medios legibles por ordenador que comprenden dichos programas de software, para su uso para seleccionar las secuencias polinucleotídicas, así como ordenadores que contienen uno de los programas.

En determinados aspectos, un usuario proporciona a un ordenador información acerca de la secuencia, ubicación o nombre de un gen diana. El ordenador usa esta información en un programa para identificar una o más regiones adecuadas del gen diana a diana y genera o proporciona secuencias complementarias para su uso en el polinucleótido de la invención. El programa informático usa después esta información de secuencia para seleccionar secuencias de la o las regiones autocomplementarias al polinucleótido. Normalmente, el programa seleccionará una secuencia que no sea complementaria a una secuencia genómica, incluyendo el gen diana, o la región del polinucleótido que es complementaria al gen diana. Asimismo, el programa seleccionará secuencias de regiones autocomplementarias que no son complementarias entre sí. Cuando se desee, el programa también proporciona secuencias de regiones de huecos. Tras la selección de secuencias adecuadas, el programa informático genera o proporciona esta información al usuario.

Los programas pueden usar además información acerca de la secuencia genómica del organismo que contiene el gen diana, p. ej., bases de datos públicas o privadas, así como programas adicionales que predicen la estructura secundaria y/o las características de hibridación de secuencias particulares, para garantizar que el polinucleótido adopta la estructura secundaria correcta y no se hibrida con genes no diana.

La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que el polinucleótido, como se describe en el presente documento, es extremadamente eficaz para reducir la expresión del gen diana de uno o más genes. El polinucleótido ofrece ventajas significativas sobre los ARN antisentido descritos anteriormente, incluyendo mayor potencia y mayor eficacia para múltiples genes diana. Asimismo, el polinucleótido de la invención ofrece ventajas adicionales sobre las moléculas de ARNbc tradicionales usadas para ARNip, ya que el uso del polinucleótido elimina sustancialmente la supresión fuera de diana asociada con las moléculas de ARNbc y ofrece iARN multivalente.

Se entiende que las composiciones y los métodos de la presente invención pueden usarse para dirigirse a diversos genes diana diferentes. La expresión "gen diana" puede referirse a un gen, un ARNm o un microARN. En consecuencia, las secuencias diana proporcionadas en el presente documento pueden representarse como secuencias de ADN o secuencias de a Rn . Un experto en la materia apreciará que las composiciones de la presente invención pueden incluir regiones complementarias a las secuencias de ADN o ARN proporcionadas en el presente documento. Por tanto, cuando se proporcione una secuencia diana de ADN o ARN, se entiende que la secuencia diana de ARN o ADN correspondiente, respectivamente, también puede ser diana.

La práctica de la presente invención empleará diversas técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, microbiología y ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la materia. Dichas técnicas se describen completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); y DNA Cloning, volúmenes I y II (D.

N. Glover ed. 1985).

Ejemplos

Ejemplo 1

TRIVOID ANTI-GFP

Se diseñaron ARNip multivalentes contra un solo gen, la proteína verde fluorescente (GFP). Se analizó un complejo de ARN ARNip-MV sintético multivalente dirigido contra GFP para comparar la actividad de supresión en relación con la de un solo clon de ARNhc. Además, para probar el efecto de desactivar una de las cadenas del complejo sintético de ARNip-MV, una cadena se reemplazó con ADN (T1-19_C_dna); como se muestra a continuación. Este reemplazo dio lugar a un descenso relativo en la supresión de ~30 %. Además, las formas 'corta' y 'larga' de los clones autocomplementarios a ARNip-MV descritos en el presente documento se probaron y compararon con la supresión de la expresión de GFP en relación con la de un clon de ARNhc publicado.

Las secuencias oligoméricas para el ARNip-MV sintético, y la cadena de reemplazo de ADN, se muestran a continuación en la tabla 1. Las regiones diana de la secuencia codificante de GFP se ilustran en la figura 8A.

Tabla 1: Oligos para ARNip-MV sintético:_________________________________________________________

Nombre Secuencia SE

Para preparar los ARNip multivalentes (ARNip-MV) sintéticos, cada tubo de los oligos individuales anteriores se resuspendió en agua sin RNasa para obtener una concentración final de 50 pM (50 pmoles/pl). Los oligos individuales se combinaron después como (a) TI-19/7_A, TI-19/7_B y TI-19/7_C (ARNip-MV GFP I), o como (b) TI-19/7_A, TI-19/7_B y TI-19/7_C_dna (ARNip-MV GFP I ADN), y se hibridó de la siguiente manera. Se combinaron 30 pl de cada uno de los oligos reacondicionados con 10 pl de tampón de hibridación 10x (Tris-HCI 100 mM pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 10 mM), se agitaron vorticialmente, se calentaron durante 5 minutos a 94 °C y se enfriaron por etapas a 70 °C durante 30 minutos. La concentración final del ARNip-MV hibridado fue de aproximadamente 15 pM.

Para preparar los clones de ARNip multivalente y el control de ARNhc, las secuencias en la tabla 2 a continuación se clonaron en el vector pSUPER, según el manual de pSUPER. La primera secuencia para cada clon nombrado (p. ej., Tl, T1_long, TII) representa la secuencia del ARNip multivalente autocomplementario que se expresó en la célula como un transcrito de ARN (comparable a la secuencia de los ARNip -MV sintéticos en la tabla 1), y la secuencia denominada "_as" es parte de la secuencia codificante para esa molécula.

T l 2: li r l n x r n ARNi -MV:

Para probar los efectos sobre la expresión de GFP, Las moléculas de ARNip-MV hibridado (a una concentración final de 7,5 nM por pocillo) y los vectores pSUPER que contenían los clones de ARNip-MV o el control de ARNhc se transfectaron con Lipofectamine 2000 en células 293 que expresan de manera constitutiva GFP. La fluorescencia de GFP se midió mediante citometría de flujo 24 horas después de la transfección.

Los resultados para un experimento se muestran en la tabla 3 a continuación y se resumen en la figura 7A. En la figura 7A, los clones ARNip-MV largo I y largo II demuestran supresión significativamente mayor de la actividad de GFP en comparación con el control de ARNhc (denominado en esa figura "ARNip").

Tabla 3:

La figura 7B muestra los resultados de un experimento en el que el complejo sintético de ARNip-MV GFP I demostró mayor supresión de la actividad de GFP en comparación con el clon de ARNhc (denominado en esa figura "ARNip"). Sin embargo, la actividad de supresión para el complejo de ARNip-MV GFP I se redujo ligeramente cuando una cadena se reemplazó con ADN, como se muestra para el complejo de ADN sintético ARNip-MV GFP I.

Los ARNm-MV sintéticos ilustrativos dirigidos a GFP también se pueden diseñar como en la tabla 4 a continuación, en la que los 3 oligos de T1.A-C pueden hibridarse como se ha descrito anteriormente. De manera similar, los 3 oligos de T2.A-C pueden hibridarse como se ha descrito anteriormente.

Ta l 4: n n ARNi in i il r iv T1 T2.

Los clones de ARNip-MV dirigidos a GFP también se pueden diseñar como en la tabla 5 a continuación. Como se ha ilustrado anteriormente, estas secuencias se pueden clonar en el vector pSuper o en cualquier otro sistema de vector.

Tabla 5: Clones ilustrativos de ARNi -MV

Ejemplo 2

TRIVOID ANTI-VIH

Puede diseñarse ARNip multivalente contra múltiples genes en sitios no relacionados. En este ejemplo, se ensayó un ARNip-MV clonado contra el VIH.

Estos resultados muestran que una molécula de ARNip-MV divalente contra los genes Gag y Tat (hv_sB) del VIH fue significativamente más eficaz en la inhibición de la replicación del VIH que un ARNip dirigido contra Gag solo (hv_s). Los oligos mostrados en la tabla 6 se clonaron en el vector pSUPER.neo+gfp según las directrices del fabricante. El hv_s está dirigido solo a Gag y el hv_sB está dirigido tanto a Gag como a Tat.

Tabla 6: Clones de ARNi -MV anti-VIH

Las construcciones de vector que codifican los clones de ARNip-MV se transfectaron en células y los análisis se llevaron a cabo los días 10 y 40 después de la infección con VIH-1 (cepa pNL4.3) con una MOI de 1,0. La figura 9 muestra que a los 10 días después de la transfección, la inhibición de la replicación del VIH por el ARNip-MV dirigido tanto a Gag como a Tat fue aproximadamente 3 veces mayor que la inhibición por la molécula de ARNip dirigida solo a Gag.

Puede diseñarse ARNip multivalente para dirigirse a 1, 2 o 3 genes diferentes del VIH. Se proporciona la secuencia de un genoma de VIH ilustrativo en la figura 10. Se proporciona una secuencia de un gen env en la figura 11, un gen gag en la figura 12A y un gen tat en la figura 12B. Los diversos genes o regiones del VIH pueden definirse en general y ser diana por su gama de secuencia de nucleótidos de la siguiente manera: LTR 5': 1-181; GAG: 336­ 1838; POL: 1631-4642; VIF: 4587/4662-5165; VPR: 5105-5395 (incluyendo mutaciones en 5157, 5266 y 5297); TAT: 5376-7966; REV: 5515-8195; VPU: 5607-5852; ENV: 5767-8337; NEF: 8339-8959; y LTR 3': 8628-9263. En función de estos genes diana, se proporcionan secuencias de oligo MV-ARN ilustrativas para VIH en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7: Secuencias trivalentes de ARNi -MV ilustrativas

Para preparar complejos de ARNip-MV dirigidos al VIH a partir de las secuencias en la tabla 7 anterior, los oligos individuales se pueden combinar e hibridar de la siguiente manera. 1) ARNip-MV_1649/1648/1648; Hibridar las secuencias 1 y 2, y 3. 2) ARNip-MV_6259/4062/5291; Hibridar las secuencias 4 y 5, y 6. 3) ARNip-MV_7387/7387/7387; Hibridar las secuencias 7 y 8, y 9. 4) ARNip-MV_16/1630/7011; Hibridar las secuencias 10 y 11, y 12. 5) ARNip-MV_40/8585/7325; Hibridar las secuencias 13 y 14, y 15. 6) ARNip-MV_591/6988/1785; Hibridar las secuencias 16 y 17, y 18. 7) ARNip-MV_685/8481/9046; Hibridar las secuencias 19 y 20, y 21. 8) ARNip-MV_1284/6573/6311; Hibridar las secuencias 21 y 22, y 23. 9) ARNip-MV_1785/591/6988; Hibridar las secuencias 24 y 25, y 26. 10) ARNip-MV_3534/5432/2952; Hibridar las secuencias 27 y 28, y 29. 11) ARNip-MV_4872/5779/7384; Hibridar las secuencias 30 y 31, y 32. 12) ARNip-MV_5212/758/4736; Hibridar las secuencias 33 y 34, y 35. 13) ARNip-MV_5365/7544/4191; Hibridar las secuencias 36 y 37, y 38. 14) ARNip-MV_5784/8942/8158; Hibridar las secuencias 39 y 40, y 41. 15) ARNip-MV_5862/4310/499; Hibridar las secuencias 42 y 43, y 44. 16) ARNip-MV_6362/8559/6371; Hibridar las secuencias 45 y 46, y 47. 17) ARNip-MV_6973/135/158; Hibridar las secuencias 48 y 49, y 50. 18) ARNip-MV_7337/8481/8190; Hibridar las secuencias 51 y 52, y 53. 19) ARNip-MV_9044/531/7118; Hibridar las secuencias 54 y 55, y 56. 20) ARNip-MV_9081/928/7557; Hibridar las secuencias 57 y 58, y 59. 21) ARNip-MV_9097/1630/7011; Hibridar las secuencias 60 y 61, y 62. 22) ARNip-MV_9121/8585/7325; Hibridar las secuencias 63 y 64, y 65.

Ejemplo 3

TRIVOID ANTI-APOB

El ARNip multivalente puede diseñarse para suprimir genes grandes al dirigirse a 2-3 ubicaciones en un solo gen. El ARNip-MV también puede emplear químicas de ARN alternativas para mejorar la Tm durante la hibridación. En este ejemplo, como se muestra en la tabla 8 a continuación, una serie de ARNip-MV están diseñados para dirigirse al gen de la apolipoproteína B (ApoB) y la presencia de subunidades de 2'-O metil ARN opcionales se indica entre paréntesis.

Tabla 8: ARNi -MV riv l n r A B

Para preparar complejos trivalentes sintéticos de ARNip-MV a partir de las secuencias en la tabla 8 anterior, los oligos individuales se pueden combinar e hibridar de la siguiente manera.

1) ARNip-MV_268/9950/1703; Hibridar las secuencias 1 y 2, y después 3. 2) ARNip-MV_448/2288/6609; Hibridar las secuencias 4 y 5, y después 6. 3) ARNip-MV_469/458/12263; Hibridar las secuencias 7 y 8, y después 9. 4) ARNip-MV_520/4182/12548; Hibridar las secuencias 10 y 11, y después 12. 5) ARNip-MV_279/9161/9986; Hibridar las secuencias 13 y 14, y después 15. 6) ARNip-MV_278/9161/9986; Hibridar las secuencias 16 y 17, y después 18. Los ARNip multivalentes que están diseñados con potentes cadenas primarias y secundarias también pueden emplear bases oscilantes o universales para completar la complementariedad de diana o ADN con extremos romos para desactivar el silenciamiento por la cadena de cualquier diana. Se muestran oligos ilustrativos dirigidos a ApoB en la tabla 9 a continuación, en la que (*) indica una base oscilante o universal opcional.

Tabl : ARNi -MV iv l n il r iv r A B

Para preparar complejos bivalentes sintéticos de ARNip-MV a partir de las secuencias en la tabla 9 anterior, los oligos individuales se pueden combinar e hibridar de la siguiente manera. 7a) ARNip-MV_223/883/10116); Hibridar las secuencias 19, 20 y 21. 7b) ARNip-MV_223/883/10116*); Hibridar las secuencias 19, 20 y 22. 7c) ARNip-MV_223/883/nulo); Hibridar las secuencias 19, 20 y 23. 8a) ARNip-MV_483/11596/2454); Hibridar las secuencias 24, 25 y 26. 8b) ARNip-MV_483/11596/2454*); Hibridar las secuencias 24, 25 y 26. 8c) ARNip-MV_483/11596/nulo); Hibridar las secuencias 24, 25 y 26.

Los ARNip multivalentes también pueden diseñarse para suprimir genes grandes al dirigirse a 2-3 ubicaciones en un solo gen. Como se ha señalado, anteriormente, determinadas realizaciones de los presentes ARNip-MV también pueden emplear químicas de ARN alternativas para mejorar la Tm durante la hibridación. En la tabla 10 a continuación, las bases opcionales de 2'-O metil ARN 2'-fluoro se indican entre paréntesis. Entre otros ejemplos de bases alternativas, el 5-metilo también puede aumentar la Tm de la estructura de ARNip-MV, si se desea.

Tabl 1 : ARNi -MV riv l n il r iv r A B

Para preparar complejos bivalentes sintéticos de ARNip-MV a partir de las secuencias en la tabla 10 anterior, los oligos individuales se pueden combinar e hibridar de la siguiente manera. 1) ARNip-MV_268/9950/1703; Hibridar las secuencias 1 y 2, y después 3. 2) ARNip-MV_448/2288/6609; Hibridar las secuencias 4 y 5, y después 6. 3) ARNip-MV_469/458/12263; Hibridar las secuencias 7 y 8, y después 9. 4) ARNip-MV_520/4182/12548; Hibridar las secuencias 10 y 11, y después 12. 5) ARNip-MV_279/9161/9986; Hibridar las secuencias 13 y 14, y después 15. 6) ARNip-MV_278/9161/9986; Hibridar las secuencias 16 y 17, y después 18. 7) ARNip-MV_6427/8144/12831; Hibridar las secuencias 19 y 20, y después 21. 7b) ARNip-MV_6427/8144/12831; Hibridar la cadena 22, después escindir el fosfato de enlace con hidróxido de amonio. 7b) ARNip-MV_6427/8144/12831; Hibridar la cadena 22, después escindir PC Spacer con luz UV en el intervalo espectral de 300-350 nm.

En determinadas realizaciones, los ARNip multivalentes que están diseñados con potentes cadenas primarias y secundarias puede emplear tipos de bases oscilantes, espaciadoras o abásicas (los ejemplos se indican con (*) en la tabla 11 a continuación) para completar los complementos de diana o ADN con extremos romos para desactivar el silenciamiento por la cadena de cualquier diana. En algunas realizaciones, UNA, fosforamiditas conectoras, rSpacer, 5-nitroindol pueden actuar como bases abásicas eficaces en lugar de nucleótidos desapareados. Si se desea, el uso de bases abásicas puede dar lugar a una Tm debilitada y/o las pirimidinas que rodean un sitio abásico pueden utilizar bases 2'-fluoro para aumentar la Tm en aproximadamente 2 grados para cada base 2'-fluoro.

Tabla 11: ARNi -MV ilustrativo diri ido a A oB

Para preparar complejos bivalentes sintéticos de ARNip-MV a partir de las secuencias en la tabla 11 anterior, los oligos individuales se pueden combinar e hibridar de la siguiente manera. 7a) ARNip-MV_223/883/10116); Hibridar las secuencias 23, 24 y 25. 7b) ARNip-MV_223/883/10116*); Hibridar las secuencias 23, 24 y 26. 7c) ARNip-MV_223/883/nulo); Hibridar las secuencias 23, 24 y 27. 8a) ARNip-MV_483/11596/2454); Hibridar las secuencias 28, 29 y 30. 8b) ARNip-MV_483/11596/2454*); Hibridar las secuencias 28, 29 y 31. 8c) ARNip-MV_483/11596/nulo); Hibridar las secuencias 28, 29 y 32. 9) ARNip-MV_9244/1958/8005); Hibridar las secuencias 33, 34 y 35. 9b) ARNip-MV_9244/1958/8005); Hibridar las secuencias 33, 34 y 36. 10) ARNip-MV_10439/9244/2284); Hibridar las secuencias 37, 38 y 39. 10b) ARNip-MV_10439/9244/2284); Hibridar las secuencias 37, 38 y 40. 11) ARNip-MV_452/11588/9244); Hibridar las secuencias 41, 42 y 43. 11b) ARNip-MV_ 452/11588/9244); Hibridar las secuencias 41, 42 y 44.

Como se ilustra en la tabla 12 a continuación, el ARNip multivalente puede dirigirse contra ApoB humana. El ARNip-MV bivalente puede actuar con diversas tolerancias a la estructura y complementariedad de diana de cada cadena. Tabla 12: ARNi multivalente ilustrativo diri ido a A oB humana

Para preparar complejos bivalentes sintéticos de ARNip-MV a partir de las secuencias en la tabla 12 anterior, los oligos individuales se pueden combinar e hibridar de la siguiente manera. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 1, 2 y 3. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 4, 5 y 6. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 7, 8 y 9. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 10, 11 y 12. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 13, 14 y 15. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 16, 17 y 18. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 19, 20 y 21. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 22, 23 y 24. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 25, 26 y 27. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 28, 29 y 30. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 31, 32 y 33. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 34, 35 y 36. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 37, 38 y 39. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 40, 41 y 42. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 43, 44 y 45. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 46, 47 y 48. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 49, 50 y 51. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 52, 53 y 54. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 55, 56 y 57. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 58, 59 y 60. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 61, 62 y 63. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 64, 65 y 66. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 67, 68 y 69. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 70, 71 y 72. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 73, 74 y 75. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 76, 77 y 78. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 79, 80 y 81. ARNip-MV; Hibridar las secuencias 82, 83 y 84.

Se puede usar ARNip-MV dirigido a ApoB para tratar o controlar una amplia variedad de enfermedades o afecciones asociadas con la expresión de esa proteína diana, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.

Referencias:

1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E. y Mello, C. C. (1998) Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 408, 325-330.

2. Kennerdell, J. R. y Carthew, R. W. (1998) Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026.

3. Misquitta, L. y Paterson, B. M. (1999) Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1451-1456.

4. Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D. y Hannon, G. J. (2000) An RNA-directed nuclease mediates post transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404, 293-296.

5. Lohmann, J. U., Endl, I. y Bosch, T. C. (1999) Silencing of developmental genes in Hydra. Dev. Biol. 214, 211-214.

6. Wargelius, A., Ellingsen, S. y Fjose, A. (1999) Double stranded RNA induces specific developmental defects in zebrafish embyos. Biochem. Biophys. Res. Commun. 263, 156-161.

7. Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K. y Ullu, E. (1998) Double stranded RNA induces gene degradation in Trypanosoma brucei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14687-14692.

8. Montgomery, M. K., Xu, S., Fire, A. (1998) RNA as a target of double stranded RNA mediated genetic interference in Caenorhabiditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 15502-15507.

9. Bosher, J. M., Dufourcq, P., Sookhareea, S., Labouesse, M. (1999) RNA interference can target pre-gene. Consequences for gene expression in Caenorhabiditis elegans operon. Genetics. 153, 1245-1256.

10. Fire, A. (1999) RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363.

11. Sharp, P. A. (1999) RNAi and double-stranded RNA. Genes Dev. 13, 139-141.

12. Ketting, R. F., Harerkamp, T. H., van Luenen, H. G. y Plasterk, R. H. (1999) Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNase I. Cell. 99, 133­ 141.

13. Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W. G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A. y Mello, C. C. (1999) The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C.elegans. Cell. 99, 123-132.

14. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (2000) RNAi: Double stranded RNA directs the ATP dependent cleavage of gene at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 101, 25-33.

15. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M. y Hannon, G. J. (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409, 363-366.

16. Elbashir, S. Lendeckel, W. y Tuschl, T. (2001) RNA interference is mediated by 21 and 22 nucleotide RNAs. Genes and Dev. 15, 188-200.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un complejo de ARNip multivalente que consiste en:

(a) un primer polinucleótido que es total o parcialmente complementario a una primera secuencia diana, en donde el primer polinucleótido es de 15-30 nucleótidos de longitud y en donde el primer polinucleótido es capaz de dirigirse a y reducir la expresión de la primera secuencia diana;

(b) un segundo polinucleótido que es total o parcialmente complementario a una segunda secuencia diana, en donde el segundo polinucleótido es de 15-30 nucleótidos de longitud y en donde el segundo polinucleótido es capaz de dirigirse a y reducir la expresión de la segunda secuencia diana; y

(c) un tercer polinucleótido que es o (i) total o parcialmente complementario y capaz de dirigirse a y reducir la expresión de una tercera secuencia diana o (ii) no específico para ninguna secuencia diana, y en donde el tercer polinucleótido es de 15-30 nucleótidos de longitud,

en donde una región 5' del primer polinucleótido es complementaria a una región 3' del tercer polinucleótido, en donde una región 3' del primer polinucleótido es complementaria a una región 5' del segundo polinucleótido y en donde una región 3' del segundo polinucleótido es complementaria a una región 5' del tercer polinucleótido;

en donde los tres polinucleótidos separados se hibridan a través de sus regiones 3' y 5' complementarias para formar un complejo polinucleotídico con una primera, una segunda y una tercera región bicatenaria; y

en donde la primera, la segunda y la tercera regiones bicatenarias son de 5-12 pares de nucleótidos de longitud.

2. El complejo de ARNip multivalente de la reivindicación 1, en donde cada uno del primer, el segundo y el tercer polinucleótidos son total o parcialmente complementarios a una secuencia diana diferente.

3. El complejo de ARNip multivalente de la reivindicación 1, en donde:

cada una de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en el mismo gen, ADNc, ARNm o microARN, o

al menos dos de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en diferentes genes, ADNc, ARNm o microARN.

4. El complejo de ARNip multivalente de la reivindicación 1, en donde toda o una parte de la región 5' y/o 3' de cada polinucleótido también es complementaria a la secuencia diana para ese polinucleótido.

5. El complejo de ARNip multivalente de la reivindicación 1, en donde una o más de las regiones autocomplementarias comprenden un saliente 3'.

6. Una molécula de ARNip multivalente autohibridante que consiste en una molécula polinucleotídica individual, comprendiendo la molécula polinucleotídica individual

(a) una primera región específica de diana que es total o parcialmente complementaria a una primera secuencia diana, en donde la primera región específica de diana es de 15-30 nucleótidos de longitud y en donde la primera región específica de diana es capaz de dirigirse a y reducir la expresión de la primera secuencia diana;

(b) una segunda región específica de diana que es total o parcialmente complementaria a una segunda secuencia diana, en donde la segunda región específica de diana es de 15-30 nucleótidos de longitud y en donde la segunda región específica de diana es capaz de dirigirse a y reducir la expresión de la segunda secuencia diana; y

(c) una tercera región que es o (a) una región específica de diana que es total o parcialmente complementaria y capaz de dirigirse a y reducir la expresión de una tercera secuencia diana o (b) no específica para ninguna secuencia diana, y en donde la tercera región específica de diana es de 15-30 nucleótidos de longitud

en donde una región 5' de la primera región específica de diana es complementaria a una región 3' de la región específica de diana, en donde una región 3' de la primera región específica de diana es complementaria a una región 5' de la segunda región específica de diana y en donde una región 3' de la segunda región específica de diana es complementaria a una región 5' de la tercera región específica de diana;

en donde cada una de las regiones 5' se une o hibrida con otra región específica de diana de la misma molécula polinucleotídica individual a través de las regiones 3' y 5' complementarias para formar una molécula polinucleotídica autohibridante que tiene una primera, segunda y tercera región autocomplementaria, en donde la primera, la segunda y la tercera regiones autocomplementarias comprenden una primera, una segunda y una tercera región bicatenaria;

en donde las regiones específicas de diana de cada una de la primera, la segunda y la tercera secuencias de nucleótidos son complementarias a una secuencia diana diferente; y

en donde la primera, la segunda y la tercera regiones bicatenarias son de 5-12 pares de nucleótidos de longitud.

7. La molécula de ARNip multivalente autohibridante de la reivindicación 6, en donde la primera, la segunda y la tercera regiones autocomplementarias comprenden al menos una estructura de tallo-bucle que comprende la primera, la segunda o la tercera región bicatenaria y una secuencia de bucle que comprende al menos 2 nucleótidos.

8. La molécula de ARNip multivalente autohibridante de la reivindicación 6, en donde una o más de las regiones autocomplementarias comprenden un saliente 3'.

9. La molécula de ARNip multivalente autohibridante de la reivindicación 6, en donde una o más de las regiones autocomplementarias comprenden (i) una secuencia proximal de dinucleótidos AG/UU que está fuera de la región específica de diana; o

(ii) una secuencia distal de 4 nucleótidos que está fuera de la región específica de diana, en donde el tercer nucleótido de la secuencia distal no es una G.

10. La molécula de ARNip multivalente autohibridante de la reivindicación 6, en donde las regiones específicas de diana de cada una de la primera, la segunda y la tercera secuencias de nucleótidos son complementarias a una secuencia diana diferente.

11. La molécula de ARNip multivalente autohibridante de la reivindicación 6, en donde cada una de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en el mismo gen, ADNc, ARNm o microARN.

12. La molécula de ARNip multivalente autohibridante de la reivindicación 6, en donde al menos dos de dichas primera, segunda y tercera secuencias diana están presentes en diferentes genes, ADNc, ARNm o microARN.

13. Un vector que codifica una molécula de ARNip multivalente autohibridante según una cualquiera de las reivindicaciones 6-12.

14. Un método no terapéutico para reducir la expresión de un gen, que comprende introducir un complejo de ARNip multivalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, una molécula de ARNip multivalente autohibridante de una cualquiera de las reivindicaciones 6-12 o un vector de la reivindicación 13 en una célula.

15. Un complejo de ARNip multivalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, una molécula de ARNip multivalente autohibridante de una cualquiera de las reivindicaciones 6-12, un vector de la reivindicación 13 o un método de la reivindicación 14, en donde cada una de dos o más de la primera, la segunda y/o la tercera regiones específicas de diana es complementaria a una región diana diferente en un transcrito de ARNm de un gen del VIH o cada una de dos o más de la primera, la segunda y/o la tercera regiones específicas de diana es complementaria a una región diana diferente en un transcrito de ARNm de un gen de la apolipoproteína B humana (ApoB).

16. Una composición farmacéutica que comprende un complejo de ARNip multivalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una molécula de ARNip multivalente autohibridante de una cualquiera de las reivindicaciones 6-12.