CN111212649A - 用于适体驱动地表面形成自形成多核苷酸纳米颗粒的方法和组合物 - Google Patents

用于适体驱动地表面形成自形成多核苷酸纳米颗粒的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于自形成多核苷酸纳米颗粒的适体驱动的表面形成的组合物和方法，以及这种部分包覆的纳米颗粒复合物用于多种生物体中的用途。

Description

用于适体驱动地表面形成自形成多核苷酸纳米颗粒的方法和 组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求在2017年7月14日提交的美国临时申请62/532,913的权益，其全部内容通过引用并入本文。在通过引用并入本文的文献与本申请的内容不一致的情况下，以本申请的内容为准。
技术领域
本发明一般涉及通过形成源自结合选择的部分(moieties)的壳状表面来控制多核苷酸纳米颗粒核的表面性质的组合物和方法。更具体地，本发明提供了用于在单链多核苷酸内利用多个适体或INTRAMER序列的方法和组合物，所述单链多核苷酸自形成致密的球形或饼形核心纳米颗粒，其中，所述适体和/或 INTRAMER选择性地将特定的有机或无机部分募集到所述多核苷酸纳米颗粒核的表面上。所得的部分包覆的纳米颗粒核表现出改变的表面性质的任意组合：电荷、尺寸、疏水性，以及改变的功能性质的任意组合：稳定性、细胞摄取、细胞移动性、细胞识别、或作用模式，优于单独的自形成多核苷酸纳米颗粒核本身。本发明的适体驱动的表面形成方法使得能够在不使用标准的外壳蛋白的情况下在细胞内、或细胞外、或体外可控地形成自形成多核苷酸纳米颗粒核。
背景技术
相关技术的描述
将多核苷酸安全且有效地递送至靶细胞仍然是限制基于多核苷酸的药物和农产品的潜力的主要障碍。在生物体中存在多种发展障碍，包括降解挑战、免疫识别、细胞特异性和一旦有效载荷到达细胞时就穿过脂质双层。
在过去的三十年中，医学和农业领域的研究人员已经开发了许多改进多核苷酸的非病毒递送的解决方案，其中医学领域主要领先于该途径。除了化学修饰之外，大多数非病毒递送方法可以被概括为包封或非包封的，以及脂质或非脂质载体。
最主要的包封溶液，并且是研究最多的一种，是脂质包裹的递送载体，目前称为脂质纳米颗粒(LNP)。LNP已被报道成功地将有效的多核苷酸有效载荷递送至许多不同的细胞，例如人肝细胞、实体瘤细胞和吞噬细胞。还报道了在动物、昆虫和植物中的其它用途，结果不同。
LNP专利文献包括美国专利7,745,651、7,799,565、8,058,069和7,901,708。 '651专利教导和要求保护具有一个或两个亚麻酰基(lineoyl group)的阳离子含氮脂质，其可用于包封siRNA脂质体纳米颗粒-增加它们的"促融合性 (fusogenicity)"或纳米颗粒与细胞膜融合的能力。
'565专利教导了包封干扰RNA并将其递送到细胞中的血清稳定性核酸-脂质颗粒("SNALP")。SNALP的实例包括干扰RNA、非阳离子脂质、阳离子含氮脂质和双层稳定组分，如缀合的脂质或聚乙二醇("PEG")-脂质缀合物。
与'565专利类似，'069专利描述并且还要求保护血清稳定性核酸-脂质颗粒。这种'069粒子包含核酸、阳离子脂质、由磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物组成的非阳离子脂质、和缀合的脂质。'708专利要求保护一种生产包封治疗剂的脂囊泡的方法，该方法通过将来自一个储库的核酸的水溶液与来自第二个储库的有机脂质溶液混合，以瞬时产生脂囊泡。
虽然这种方法是目前外源性多核苷酸制剂中的金标准，但它缺乏本发明技术方案提供的总表面组成控制、作用模式补充、细胞特异性和生物体特异性。最重要的是，它不能够进行本发明提供的多核苷酸纳米颗粒表面的细胞内形成。
另外的包封溶液涉及聚集多聚物(polyplexes)的形成。已经使用多种材料(即阳离子脂质、聚合物：天然和合成的以及肽)来制备非病毒递送系统[POLY.1]，其在安全性、制备的容易性、再现性、携带大核酸构建体的能力和稳定性方面具有若干优点[POLY.2]。不幸的是，用于基因递送的阳离子脂质和高分子量阳离子聚合物可能在体外和体内引起毒性作用。例如，脂复合物(lipoplexes)引起细胞的几种变化，包括细胞收缩、有丝分裂数目减少和细胞质的空泡化[POLY.3]。阳离子聚合物，即，聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺基胺(PAMAM)、聚丙烯亚胺(PPI)、聚-L-赖氨酸(PLL)、阳离子葡聚糖、聚丙烯胺(PAA)、基于葡聚糖-寡胺的缀合物和壳聚糖[POLY.4]，是制备非病毒载体的优选材料，这是由于它们的长期安全性和生物相容性。PLL、PAA和许多其它的由于其低转染效率和较高的细胞毒性而被放弃。与基于PEI、树状聚体等的其它阳离子载体相比，基于葡聚糖-寡胺的转染在大多数细胞系中是非常低的。其中，PEI是最成功和广泛研究的基因递送聚合物之一，因为其膜去稳定潜力、高电荷密度(核苷酸缩合能力)和保护核苷酸免于酶促降解的能力，因此能够将核苷酸有效转移到细胞中[POLY.5]。支化 PEI含有比例为1:2:1的伯、仲和叔胺，pKa值在生理pH附近，提供了显著的缓冲能力。尽管该系统的高电荷密度增加了转染效率，但它同时导致细胞毒性增强。
由于生物相容性、生物可降解性、有利的物理化学性质和化学修饰的容易性，基于壳聚糖的多聚物已成为非病毒多核苷酸递送发展潜力大的候选物。与 PEI类似，胺基正电荷的存在使壳聚糖适于改变其物理化学和生物学性质，并使其能够通过胞吞作用和膜失稳定性将多核苷酸转运到细胞中。迄今为止的大多数研究表明，高分子量(100-400kDa)和中等分子量(～50kDa)的壳聚糖表现出聚集、在生理条件下的低溶解度、在用于体内递送的浓度下的高粘度和缓慢的解离或降解。然而，小于10kDa的壳聚糖，也称为低壳聚糖，已知与多核苷酸形成弱复合物，产生物理上不稳定的多聚物，具有低转染效率。
已经表明基于壳聚糖的纳米颗粒在植物、昆虫、动物和人中递送多核苷酸时有一定的效果。
然而，不管用于形成基于聚集体的多聚物的阳离子材料的类型是什么，都没有述及本发明提供的受控表面部分取向、表面部分组成、降低的氮/磷比 (Nitrogen/Phosphateratio)或细胞内表面形成的优点。
最近也已经公开了球形核酸(SNA)纳米颗粒缀合物[POLY.6]，其显示围绕金颗粒球形排列的缀合siRNA。金纳米颗粒提供活性核酸分子的共价和非共价连接。该排列是围绕金颗粒中心堆叠的。虽然由于核酸的球形排列和细胞渗透，该方法被证明是有效的，但是它仍然是合成的(无机的)递送载体，并且不能控制表面组成。
MV-RNA多核苷酸纳米颗粒最近被证明是自形成的，并且是触发基因沉默的有效因子[Hauser，PCT/US2016/048492]。这种MV-RNA多核苷酸纳米颗粒成功地既作为活性成分又作为球形结构支架。Hauser证明了使用的适体通过配体介导的胞吞作用以及通过病毒外壳蛋白的包封靶向某些细胞。
然而，本发明的组合物和方法以PCT/US2016/048492未预料到的方式大大扩展了适体或INTRAMER的用途；从而产生纳米颗粒表面形成的新范例。在增加本发明的多核苷酸纳米颗粒的特征的情况下，史无前例的细胞内形成变得可能。另外，本发明提供了对纳米颗粒表面电荷、极性、表面组成、疏水性、稳定性、作用模式、细胞特异性、细胞识别和PCT/US2016/048492之外的其它细胞摄取途径的控制；在没有被病毒外壳蛋白包封的情况下。
病毒外壳蛋白或衣壳蛋白在核酸的运输和保护中起作用。半个世纪前就已经证明，螺旋对称的感染性病毒颗粒在混合外壳蛋白和RNA的水溶液时发生自组装[VLP.1]。在大多数情况下，这种保护层是由于存在多个拷贝的外壳蛋白，其自组装成围绕核酸的典型棒状物或球状物。尽管许多关于自发的自组装过程的细节仍然不清楚，但最近的数据表明至少蛋白质-蛋白质相互作用和核酸特征决定了最终的结构。在MS2 VLP的例子中，外壳蛋白的组装通常需要短的茎- 环RNA发夹以启动包装，其通常是其基因组RNA的一部分，这导致随后的外壳蛋白组装成衣壳[VLP.3]。在豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)的例子中，证据表明直径受核苷酸长度的控制。研究人员确定，当以6:1的蛋白质/RNA质量比结合时，小于3000nt的长度产生～24-26nm的外壳蛋白(CP)直径，大于4,500nt的长度产生～30nm的外壳蛋白(CP)直径。
尽管已经证明在VLP中使用CP体外和体内封装核酸，但是这种RNA长度对CP的依赖性对于长dsRNA使用是无效的，并且对于没有预包装(即脂质)或封装的短RNAi触发物是不可能的。
另外，CP是有限的结构蛋白群，其通常刺激免疫应答，并且不能满足除CP 性质本身之外的有效纳米颗粒表面形成的各种需要。
抗微生物的肽和蛋白质(AMP)是普遍存在的一类天然存在的分子，它们是多细胞生物体中免疫应答的一部分。昆虫和植物主要产生AMP以防止病原体侵入。总的来说，抗微生物的肽对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌[AMP.13-19]、一些原生动物寄生虫[AMP.20]和病毒[AMP.21]表现出直接的杀微生物活性。植物防御素是一组小AMP(45-54个氨基酸)，是高度碱性的富含半胱氨酸的肽，其在整个植物界中明显普遍存在，并表现出抗细菌和抗真菌活性。迄今为止，来自不同植物物种的超过80种不同植物防御素基因的序列是可获得的[AMP.36， AMP.53-56]，并且这些的分离最近已经获得专利(US6911577、US6770750和 EP1849868)。与防御作用一致，它们在种子中特别丰富，但也发现存在于叶、荚、块茎、果实和花组织中[AMP.17，57]。
已经鉴定了超过7000种天然存在的肽，并且这些肽通常在人生理学中具有关键作用，包括作为激素、神经递质、生长因子、离子通道配体或抗感染药的作用[THER.1-THER.4]。肽被认为是高度选择性和有效的，同时相对安全且耐受性良好。因此，在药物研究和开发(R&D)中对肽的兴趣增加，并且目前在临床试验中正在评价大约140种肽治疗剂。然而，天然存在的肽通常不直接适合用作方便的治疗剂，因为它们具有内在的弱点，包括差的化学和物理稳定性，和短的循环血浆半衰期。
而显然肽是许多生物体免疫防御的重要部分，并且在医学和农业应用中是有用的。表面结合肽的用途在本领域中尚未报道为细胞内纳米颗粒包覆部分-也没有研究天然存在的化合物在纳米颗粒的表面几何结构上的受控结合作为补充这种传统的免疫系统的活性和生物利用度的手段。
尽管纳米颗粒递送和肽、蛋白质和适体作为生物分子的用途已经开发了几十年，但是仍然需要研究具有受控的表面特征(影响尺寸、电荷、组成、疏水性、核酸酶稳定性、作用模式、细胞特异性、细胞摄取和总体生物利用度)的多核苷酸核心纳米颗粒的方法和组合物；-其可以在体外、或细胞外、或细胞内产生。本发明满足了这种需要，并在人、动物、植物、昆虫、细菌和真菌中具有新的用途。
发明内容
本发明的适体驱动的表面形成方法通过能够在一定范围的环境内对功能性和非功能性表面特征进行组成控制而提供了可用于递送这种经包覆的多核苷酸纳米颗粒的新型组合物。本发明的这种适体驱动的表面形成方法使得能够对表面结合部分进行组成控制，例如；肽、前体蛋白质、聚合物、代谢物、离子、小分子、寡糖或其它有机或无机部分，可以在体外、或胞外、或胞内的。
本发明的适体驱动的表面形成方法以产生新的纳米颗粒表面形成的方式将特定的多核苷酸纳米结构与多个单价或多价适体/INTRAMER组合。这种新的适体/INTRAMER驱动的表面形成方法使得能够产生包覆的生物分子复合物，其在各种情况下具有优于分离的多核苷酸纳米颗粒、适体、肽或蛋白质的新优点。
本发明的适体驱动的表面形成方法能够控制影响粒径、表面ζ电位、疏水性、功能、细胞摄取、生物体特异性、细胞特异性、核酸酶降解抗性、受体识别、易位、药物指数、毒性和甚至活性模式的表面特征-不同于不使用本发明的多核苷酸纳米颗粒的表面特征(图8)。
本发明的适体驱动的表面形成方法与其它形成方法不同，因为纳米颗粒自形成球形结构用作核心支架[Hauser，PCT/US2016/048492]。该球形核心仅需要最小的部分包覆来显著改变表面和性能特征，从而使得能够实现适体 /INTRAMER驱动的形成方法。相反，大多数纳米颗粒形成方法通过聚集形成纳米颗粒-这需要更大且显著更多的组分。比较而言，需要以指数方式减少的数量的表面单元来改变本发明的表面特性。例如，本发明的氮/磷比比典型siRNA形成技术低几个数量级[POLY.8，图16]。此外，本发明的预先形成的适体驱动的表面形成方法的核使得能够使用低分子量线性基质，其比更大的非线性等价物 [POLY.8]具有更低的细胞毒性，并且使得能够使用多类型的小的有机或无机部分作为新的包覆基质。
本发明的进一步特征在于自形成单链多核苷酸内的多个单价或多价适体和/ 或INTRAMER的设置和定向，其使纳米颗粒表面上的适体和/或INTRAMER定向，并通过以所需组成和摩尔浓度非共价结合至多核苷酸表面上的选定部分而发生特异性募集(recruit)。这种设置促使表面部分(surface moieties)的可设计组成以控制表面区域的功能、电荷、疏水性等(即模拟其它颗粒表面性质(图10))。
重要的是，本发明能够募集表面部分，所述募集不仅依赖于在生物pH下游离部分和分离的适体/INTRAMER典型的非特异性和/或较弱的静电结合。由于在紧密的、高度阴离子性的多核苷酸纳米颗粒核的表面上定向的单个和多价的 INTRAMER/适体，本发明的应用能够实现特异性部分结合和更高的长程结合力。
本发明的另一特征在于，自形成单链多核苷酸内的多个适体或INTRAMER 的定向，其使所述纳米颗粒表面上的适体和/或INTRAMER定向，并通过在生理pH下非共价结合特定的中性、阴离子或阳离子部分而选择性募集到多核苷酸表面上。
本发明提供了分离的多核苷酸纳米颗粒核内的特征的独特组合，所述核具有自形成的球状直径，并且还具有部分或完全专用于将特定部分募集到纳米颗粒表面上的表面定向的适体和/或INTRAMER。这使得为了改变单独的多核苷酸纳米颗粒核的功能性和/或非功能性表面特征，所需的表面部分的数量极低。本发明的特征的组合使得能够实现史无前例的细胞内自动形成方法，从而在农业和医学中产生新的功能。
在某些实施方式中，多核苷酸纳米颗粒核由2、3、6、9、12、15、27或更多个单独的MV-RNA、siRNA、RNA或DNA发夹分子组成，MV-RNA、siRNA、 RNA或DNA发夹分子通过连接核苷酸组合成单链自形成多核苷酸盘状或球状纳米颗粒结构。
在优选的实施方式中，形成表面的适体和/或INTRAMER形成MV-RNA、 shRNA、miRNA、RNA或DNA发夹分子的环，MV-RNA、shRNA、miRNA、 RNA或DNA发夹分子通过连接核苷酸组合成单链自形成多核苷酸盘状或球状纳米颗粒结构。
在其它优选的实施方式中，形成表面的适体和/或INTRAMER发夹位于通过连接核苷酸连接成单链自形成多核苷酸盘状或球状纳米颗粒结构的每个 MV-RNA、shRNA、miRNA、RNA或DNA发夹分子之间。
在某些实施方式中，单独的表面形成的多核苷酸纳米颗粒具有多个MV-RNA、shRNA、miRNA、RNA或DNA发夹分子，其具有(图2a-c)任一图中所示的一般结构。
在某些实施方式中，确定单独的表面形成的多核苷酸纳米颗粒具有约20nm、30nm、40nm、40-100nm、100-200nm、200-600nm，理想地小于200nm的多核苷酸直径。
在其它具体实施方式中，多核苷酸纳米颗粒包含天然或合成的RNA或DNA，优选RNA。
在其它具体实施方式中，多核苷酸纳米颗粒包含天然或合成的RNA或DNA、 2'修饰的核苷酸、锁定或未锁定的核苷酸(locked or unlocked nucleotides)。
根据本发明的另一方面，提供了组合物，其包含一种或多种如本文任何实施方式中所述的单独的适体驱动的表面形成方法，以及生理学上可接受的赋形剂。
根据本发明的再一方面，提供了用于将两种或更多种RNA分子递送至靶细胞的方法，包括使靶细胞与本文所述的单独的多核苷酸纳米颗粒组合物接触。
在优选的实施方式中，通过实验选择单链多核苷酸纳米颗粒中的适体和/或INTRAMER的单个或组，以便通过与来自SELEX或其它适体/部分结合测定结果的肽、蛋白质、小分子、代谢物、有机或无机化学物质特异性结合来募集表面部分。
在某些实施方式中，用于给定靶部分的随机化的适体和/或INTRAMER的单个或组在SELEX或其它适体/部分结合分析中使用的单链自形成多核苷酸纳米颗粒中转录。
在其它实施方式中，用于SELEX或其它适体/部分结合分析的随机化的适体和/或INTRAMER的单个或组被单独转录；然后与多核苷酸纳米颗粒序列组合以产生最终的表面形成的多核苷酸纳米颗粒。
在某些实施方式中，单链多核苷酸纳米颗粒内的分离的适体和/或 INTRAMER被设计成通过特异性结合细胞内、细胞外、体外、体内或其任何组合的部分来募集表面部分。
在某些实施方式中，单链多核苷酸纳米颗粒中的分离的适体和/或 INTRAMER被设计为通过特异性结合内源、外源或其任意组合的部分来募集表面部分。
在其它具体实施方式中，在选自人细胞或动物细胞或植物细胞或酵母细胞或昆虫细胞或细菌细胞的宿主细胞内，或通过体外转录，表达和表面形成表面形成的多核苷酸纳米颗粒。
在某些具体实施方式中，表面形成多核苷酸纳米颗粒通过启动子(转基因)、病毒(瞬时)的细胞内转录产生，或在图1-2、4中任一图中所示的一般结构中体外转录后局部施用(外源)。
在某些优选的实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是选自宿主生物体多肽组(peptidome)的肽或蛋白质前体。
在某些其他实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是选自靶生物体多肽组的肽或蛋白质前体。
在其它优选的实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是在宿主生物体内瞬时或转基因表达的肽、蛋白质前体或蛋白质。
在其它具体实施方式中，本发明的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的细胞或膜渗透速率增加。
在其它实施方式中，本发明的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的内体逃逸率增加。
在某些实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒核靶向昆虫、或病毒、或真菌、或动物或人、或宿主植物(图8a)、其他植物、或其任何组合的基因；并且表面部分通过使用(图8b)任一项中所示的通用结构靶向昆虫、或病毒、或细菌、或真菌、或动物、或人、或宿主植物、或其任意组合。
在某些实施方式中，在结合靶表面部分时，添加分离的多核苷酸纳米颗粒的另外的作用模式(图3b，9，10，11)。
在具体的实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒在结合靶表面部分后改变表面电荷、核酸酶抗性、蛋白酶抗性、作用模式和分子量(图3b，10，11)。
在其它具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒的表面电荷在结合靶表面部分时变得阴离子、中性或阳离子性较弱(图3b，10，11)。
在其它具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒靶向生物体中除宿主基因以外的基因。生物特异性可以通过多核苷酸与靶基因的互补性和细胞摄取信号如适体、配体、连接核苷酸、环、长dsRNA、ssRNA末端、结合的表面部分的功能或其组合来确定(图9)。
在具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是通过RNAi调节的基因，但包覆的表面部分是抗微生物的、抗真菌的或两者(图9，11b-c)。
在具体的其它实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是通过RNAi进行基因调节的，但包覆的表面部分是毒性蛋白、肽、化学物质或其组合。
在其它具体实施方式中，在靶表面部分与分离的多核苷酸纳米颗粒结合时，靶表面部分的作用模式变弱。
在其他具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是用抗微生物肽、抗真菌肽、毒性蛋白或其组合包覆的单个多核苷酸纳米颗粒。(图8-11)。
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒提高分离的表面部分的活性。
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒降低分离的表面部分的活性。
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒提高核心多核苷酸纳米颗粒的活性。
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒降低核心多核苷酸纳米颗粒的活性。
附图说明
图1，图1a显示了PCT/US2016/048492的自形成单链纳米颗粒核的'切面图 '实例。图1b显示了由PCT/US2016/048492的自形成单链纳米颗粒形成的并且本发明使用的"切面视角"表面区域。图1c显示了作为本发明亚单元的单个表面定向的、结合部分的适体/INTRAMER。图1d显示了作为本发明亚单元的不同的单一表面定向的、结合部分的适体/INTRAMER。
图2，图2a显示了PCT/US2016/048492的优选～40nm直径的自形成单链纳米颗粒核的'切面图'实例。图2b表示本发明涵盖的另外优选的～20nm直径的超小型自形成单链RNAi纳米颗粒核的"切面图"实例。图2c显示了用作非本发明纳米颗粒核的非优选～40-200nm直径的多种经典dsRNA、shRNA或miRNA的 "切面图"实例。
图3，图3a显示(1)PCT/US2016/048492的自形成单链纳米颗粒核的'切面图 '实例，(2)如本发明所述的专用于将部分募集到纳米颗粒表面上的适体 /INTRAMER阵列，和(3)在形成(部分-结合)之前具有突出的适体/INTRAMER的多核苷酸核心纳米颗粒的阴离子表面。图3b显示了(1)PCT/US2016/048492的自形成单链纳米颗粒核的"切面图"实例，(2)如本发明所述的专用于将部分募集到纳米颗粒表面上的适体/INTRAMER阵列，和(3)作为本发明的适体/INTRAMER 阵列的结果，通过选择性结合部分形成的改变的纳米颗粒外壳特性(电荷、尺寸、组成)的实例。
图4，图4a显示了纳米颗粒表面如何通过用适体/INTRAMER序列取代一些或所有多核苷酸纳米颗粒核环("的环")而构成的部分二级结构实例。图4b显示了如何通过将含有茎的适体/INTRAMER序列置于一些或所有多核苷酸纳米颗粒核亚单位之间("之间")来组成纳米颗粒表面的部分二级结构实例。
图5，图5a-d显示了一种方法，其中PCT/US2016/048492中描述的序列形式可以与成组的形成表面的适体/INTRAMER组合以形成适体/INTRAMER簇，和(b)另外的适体/INTRAMER簇以将部分(c)募集到特定表面区域上，并将部分(d) 募集到分开的表面区域上。图5e显示了整合3向连接适体/INTRAMER的实例，其由单个MV-RNA的二级结构构建，用于增加在较少阳离子部分的较宽pH范围下的结合亲和力和/或增加对选择部分的特异性。
图6显示了含有细胞核、生物pH下的细胞质但可能缺乏细胞核的非限制性细胞内环境。图6a显示了胞内环境中含有的未结合的非蛋白质部分。图6b显示了胞内环境中含有的未结合的蛋白质部分。图6c显示了具有在细胞内转录的本发明的表面定向的适体/INTRAMER的示例性多核苷酸纳米颗粒核。图6d显示了具有在细胞内转录的本发明的表面定向的适体/INTRAMER的示例性多核苷酸纳米颗粒核。
图7显示了如何使用多核苷酸纳米颗粒核复合物的体外形成来选择性地形成跨越pH梯度的纳米颗粒表面。图7a显示了在生物pH下结合到表面适体 /INTRAMER上的部分。图7b显示了在酸性pH范围部分与表面适体/INTRAMER 的静电结合强度的增加。
图8显示了由本发明形成的纳米颗粒核壳的活性谱的增加。图8a显示了典型的多核苷酸纳米颗粒核的典型活性谱。图8b显示了由于本发明形成的官能化的壳，多核苷酸纳米颗粒在细菌、古生菌、真核生物中的额外的活性谱。
图9显示了多核苷酸纳米颗粒核和本发明产生的壳之间的功能关系。对于每种生物体，列出了功能性壳"包覆材料"部分的非限制性实例。
图10显示了适体/INTRAMER集聚以模拟功能性ABE毒素性质的方式在多核苷酸核的表面上形成募集的部分簇的概念图；活性、结合、进入或其它集聚的表面组件。图10a显示了其中适体/INTRAMER集聚以募集特异性"活性"部分 (即毒性肽)簇的结构域。图10b显示了其中适体/INTRAMER集聚以募集特异性" 结合"部分(即受体结合肽或蛋白质)簇的结构域。图10c显示了其中适体 /INTRAMER集聚以募集特异性"进入"部分，即膜破裂、内体裂解肽的簇的结构域。
图11显示了本发明所实现的多模型、功能化多核苷酸核/壳纳米颗粒的非限制性模型。图11a显示了靶向昆虫基因的多核苷酸纳米颗粒核，其具有由功能簇中的表面适体/INTRAMER形成的功能化壳，所述功能簇将内源植食性反应肽 (Herbivory ResponsePeptide)、植物蛋白和细胞结合肽募集到所述多核苷酸纳米颗粒核的表面上。图11b显示了靶向真菌基因的多核苷酸纳米颗粒核，其具有由功能簇中的表面适体/INTRAMER形成的功能化壳，所述功能簇将内源植食性反应肽、抗真菌肽和细胞结合肽募集到所述多核苷酸纳米颗粒核的表面上。图11c显示了靶向人基因的多核苷酸纳米颗粒核，其具有由功能簇中的表面适体 /INTRAMER形成的功能化壳，所述功能簇将一种类型的内源性抗菌肽、另一种类型的抗菌肽和细胞结合肽募集到所述多核苷酸纳米颗粒核的表面上。
图12示出了导致最终适体驱动的表面组成和摩尔浓度的有效发展阶段。图12a示出了使用阳离子添加剂对候选表面部分进行处理，以引起与阴离子多核苷酸纳米颗粒的络合，作为筛选潜在物质的有限"第一步"。图12b示出了使用假适体氨基酸序列加入候选表面部分以使具有多核苷酸纳米颗粒的等价适体 /INTRAMER的特异性和可设计复合物作为筛选潜在物质位置、功能和摩尔浓度的"有用步骤"。图12c示出了本发明的优选实施方式，其中为预期的表面部分开发了特异性适体。图12d显示了作为共折叠输出的候选多核苷酸纳米颗粒的正确折叠的RNA图。
图13显示了在图16提供的ITC分析中用于ECB-2和ECB-3(实施例1)之间等摩尔结合比较的形成计算。图13a显示了实施例1的在ECB-2上适体驱动地结合肽TAT-NP的形成计算表。图13a显示了实施例1的在ECB-3上适体驱动地结合肽TAT-NP的形成计算表。
图14，图14a显示了自形成球形多核苷酸纳米颗粒结构的有效氮/磷(N/P) 比。凝胶移位分析提供了在给定的摩尔比或N/P比下阴离子多核苷酸纳米颗粒转变为阳离子的可视证据。表面Zeta电位测量提供了在给定N/P比下多核苷酸核心纳米颗粒的电荷转换的第二种测量。使用线性聚乙烯亚胺2kDa、线性细胞- 抑制肽2kDa或85％脱乙酰化的低分子量壳聚糖测试基于静电的结构。图14b显示了使用适体驱动的结合的实施例2的FAW-2之间的凝胶移位分析。另外，肝素被证明是TAT适体结合TAT-NPF肽的有效拮抗剂，并且分解了复合物。
图15显示了单独的多核苷酸纳米颗粒、单独的表面部分物质和当二者组合时的流体动力学壳的Zeta Sizer测量结果。图15a显示了单独的FAW-3(实施例 2)纳米颗粒、单独的聚集的TAT-LYCO表面部分物质的流体动力学壳的Zeta Sizer 测量结果，以及当在相同条件下将两者组合时的尺寸转变。图15b显示了单独的FAW-3(实施例2)纳米颗粒、单独的单体CM-TAT表面部分物质的流体动力学壳的Zeta Sizer测量结果，以及当在相同条件下将两者组合时的尺寸转变。
图16提供了工业中使用的静电驱动结合vs.本发明中描述的作为纳米颗粒表面形成的优选方法的适体驱动结合的比较等温滴定比色法分析结果。图16a提供了等摩尔ITC分析的输出，其描绘了肽CM-TAT与ECB-3的结合，本发明与ECB-2组合的多核苷酸纳米颗粒。数据代表本发明的适体驱动的表面形成在结合中30-300倍的改善的优势。图16a提供了等摩尔ITC分析的输出，其描绘了肽CM-TAT在ECB-2上的静电驱动结合，不使用本发明的多核苷酸纳米颗粒。
图17提供了使用三组多核苷酸/肽联合的结合数据；1)非特异性阳离子肽/ 具有非特异性适体的纳米颗粒，2)特异性阳离子肽/具有特异性适体的纳米颗粒， 3)特异性阳离子肽/在H2O和两种缓冲溶液中的非特异性纳米颗粒。数据表明通过利用本专利的设计和方法促进了结合。
具体实施方式
尽管已经参照以上说明书描述了本发明，但本文中优选实施方式的描述和说明不意味着以限制的意义来解释。应当理解，本发明的所有方面不限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。在参考本发明的内容时，本发明的实施方式的形式和细节上的各种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，可以预期，所附权利要求书还将覆盖任何这样的修改、变化和等同方式。
除非另有说明，本发明的各种实施方式的实施采用免疫学、生物化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等编，(1987))；METHODSIN ENZYMOLOGY丛书(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995)),Harlow和Lane编， (1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL和ANIMAL CELL CULTURE (R.I.Freshney编(1987))。如在说明书和权利要求书中所使用的，单数形式"一"、 "一个"和"该"包括复数指代，除非上下文另外清楚地规定。例如，术语"细胞"包括多个细胞，包括其混合物。
根据本发明的实施方式，本文提供了自形成多核苷酸纳米颗粒。一种自形成多核苷酸纳米颗粒，包括多核苷酸核(或多核苷酸纳米颗粒核)和部分结合区域。多核苷酸核包括一个或多个彼此连接的多价RNA(MV-RNA)分子。多价RNA (MV-RNA)代表不是经典dsRNA的连接类RNA分子，但其具有与上述基于 dsRNA的RNAi分子相似的作用模式。独特地，MV-RNA表现出同时切割相同或不同基因上的多个位点以及利用与dsRNAi不同的预加工途径的能力(美国专利公开文本2011/0159586和PCT公开文本WO2012/014155)(图15)。在Hauser 的国际公开文本PCT/US2016/048492中详细描述了其他实施方式和关于可以根据本文所述实施方式使用的多核苷酸核结构的信息，该专利申请的全部内容并入本文，如同在本文中完全阐述一样。
形成本文所述的多核苷酸纳米颗粒核的MV-RNA分子可以包括能够结合部分结合区域内的一个或多个表面部分的一个或多个适体或INTRAMER。换句话说，本文所述的自形成多核苷酸纳米颗粒的多核苷酸纳米颗粒核的MV-RNA分子被设计为具有适体驱动的(或INTRAMER驱动的)结合。
本发明的适体驱动的表面形成(即设计)方法提供了通过能够在一系列环境中进行功能性和非功能性表面特征的组成控制而用于递送多核苷酸纳米颗粒的新型组合物和方法。本发明的适体驱动的表面形成方法使得能够对表面结合部分进行组成控制，例如；肽、前体蛋白质、聚合物、代谢物、离子、小分子、寡糖或其它有机或无机部分，可以是在体外、或胞外、或胞内的。
本发明的适体驱动的表面形成方法以导致新的纳米颗粒表面形成的方式将多核苷酸纳米结构与多个单或多价适体/INTRAMER组合。这种适体 /INTRAMER驱动的表面形成方法使得能够产生包覆的生物分子复合物，其在各种情况下具有优于单独的多核苷酸纳米颗粒、适体、肽或蛋白质的新优点。
本发明的适体驱动的表面形成方法能够控制影响粒径、表面ζ电位、极性、疏水性、功能、细胞摄取、细胞识别、生物体特异性、细胞特异性、降解抗性、受体识别、易位、药物指数、毒性和甚至活性模式的表面特征-不同于不使用本发明的多核苷酸纳米颗粒的表面特征(图8)。
本发明的适体驱动的表面形成方法与其它形成方法不同，因为纳米颗粒自形成球形结构用作核心支架[Hauser，PCT/US2016/048492]。这种"预先形成的" 球状核仅需要最小的部分包覆来显著改变表面和性能特征，从而使得本发明的适体/INTRAMER驱动的形成方法成为可能。相反，大多数纳米颗粒形成方法(多聚物)通过聚集-优选非线性和更高摩尔浓度的阳离子材料来形成可用的纳米颗粒而形成纳米颗粒。比较而言，需要指数减少数量的表面单元来改变核心支架的表面特性(图8)。例如，本发明的表面形成纳米颗粒的氮/磷比比典型siRNA 形成技术的低几个数量级[POLY.8，图16]。此外，本发明的预先形成的适体驱动的表面形成方法中的核使得能够使用低分子量线性基质，其比较大的非线性等价物[POLY.8]具有更低的细胞毒性，并且使得能够使用多类型的小的有机或无机部分作为新的包覆基质，这在使用过去的形成方法中是不可能的。
本发明的适体驱动的表面形成的特征在于自形成单链多核苷酸内的多个单或多价适体和/或INTRAMER的设置和定向，其使最终纳米颗粒表面上的适体和/或INTRAMER定向，并通过非共价适体驱动结合至多核苷酸表面上以所需组成和摩尔浓度特异性募集选择的部分。这种设置促使表面部分的可设计的组成以控制表面区域的功能、电荷、疏水性等(即甚至能够模拟其它颗粒表面性质 (图10))。
重要的是，本发明能够募集表面部分，否则将是非特异性的和/或具有不足以在不使用本发明的情况下可靠地表面结合到纳米颗粒上的静电性质。另外，本发明的方法能够开发自形成纳米结构内的适体/INTRAMER序列，其导致游离部分和分离的适体/INTRAMER在生物pH下结合。由于在紧密的、高度阴离子性的多核苷酸纳米颗粒核的表面上定向的单个和多价的(多个)INTRAMER/适体，本发明的应用使得能够实现特异性部分结合和更高的长程结合力。在SELEX过程中用纳米结构包埋适体/INTRAMER的这种方法允许鉴定尤其可用于细胞内环境的结合表面部分的适体序列。
本发明的另一特征在于，在自形成单链多核苷酸内多个适体或INTRAMER 的定向，其在宽pH范围(包括生理pH)下使所述纳米颗粒表面上的适体和/或 INTRAMER定向并选择性地将特异性适体靶向的中性、阴离子或阳离子部分募集到多核苷酸表面上。
本发明提供了在分离的多核苷酸纳米颗粒核内的特征的独特组合，所述核具有自形成的球状直径，和部分或完全专用于将特定部分募集到纳米颗粒表面上的表面定向的适体和/或INTRAMER。这使改变单独的多核苷酸纳米颗粒核的功能性和/或非功能性表面特征所需的表面部分的数量极低。本发明的特征的组合使得能够实现史无前例的细胞内自动形成方法，从而在农业和医学中产生新的功能。
纳米颗粒核组合物
根据一些实施方式，多核苷酸核包含两个或更多个连接的MV-RNA，每个由一个或多个核苷酸分隔，在内切核酸酶生物发生后产生至少一个生物活性 MV-RNA分子。通过Dicer或Dicer样核酸酶切割从纳米颗粒中去除的每个 MV-RNA能够加载到下游沉默复合物中，包括但不限于RNA诱导的沉默复合物 (RISC)和miRNA诱导的沉默复合物(miRISC)。去除的MV-RNA也可以在下游免疫刺激事件中起作用。在单个纳米颗粒中基因抑制和免疫刺激特征的可能性提供了抑制某些癌症中免疫监视的拮抗剂同时刺激对该特定细胞的免疫应答的能力。以这种方式，本文提供的多核苷酸纳米颗粒作为用于RNA干扰、miRNA 干扰或免疫治疗的独特单链和纯RNA纳米颗粒前体，其可以含有高度可扩展的活性触发摩尔浓度。
在某些实施方式中，多核苷酸纳米颗粒核由2、3、6、9、12、15、27或更多个单独的MV-RNA、siRNA、RNA或DNA发夹分子组成，MV-RNA、siRNA、 RNA或DNA发夹分子通过连接核苷酸组合成单链自形成多核苷酸盘状或球状纳米颗粒结构。
在优选的实施方式中，MV-RNA、siRNA、RNA或DNA发夹分子中的一种或多种包括形成每个发夹分子的环的适体和/或INTRAMER。在某些方面，多个 MV-RNA、siRNA、RNA或DNA发夹分子包括形成每个发夹分子的环的适体和 /或INTRAMER。适体和/或INTRAMER可以置换发夹分子的环区，并且可以选择为靶向特定的表面部分，或者可以随机化以用于选择测定如SELEX，如下文进一步描述的。因此，适体和/或INTRAMER能够靶向并结合部分结合区域中的表面部分。
在其它优选的实施方式中，形成表面的适体和/或INTRAMER形成MV-RNA、 shRNA、miRNA、RNA或DNA发夹分子的环，MV-RNA、shRNA、miRNA、 RNA或DNA发夹分子通过连接核苷酸组合成单链自形成多核苷酸盘状或球状纳米颗粒结构。
在其它优选的实施方式中，形成表面的适体和/或INTRAMER发夹位于通过连接核苷酸组合成单链自形成多核苷酸盘状或球状纳米颗粒结构的每个 MV-RNA、shRNA、miRNA、RNA或DNA发夹分子之间。
在某些实施方式中，单独的表面形成的多核苷酸纳米颗粒具有多个 MV-RNA、shRNA、miRNA、RNA或DNA发夹分子，其具有(图2a-c)任一图中所示的一般结构。
在某些实施方式中，确定单独的表面形成的多核苷酸纳米颗粒具有约20nm、30nm、40nm、40-100nm、100-200nm、200-600nm，理想地小于200nm的多核苷酸直径。
在其它具体实施方式中，多核苷酸纳米颗粒包含天然或合成的RNA或DNA，优选RNA。
在其它具体实施方式中，多核苷酸纳米颗粒包含天然或合成的RNA或DNA、 2'修饰的核苷酸、锁定或未锁定的核苷酸。
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒降低分离的表面部分的活性。
在其他具体实施方式中，在适体驱动地结合靶表面部分与分离的多核苷酸纳米颗粒核后，靶表面部分的作用模式降低。
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒提高核心多核苷酸纳米颗粒的活性。
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒降低核心多核苷酸纳米颗粒的活性。
INTRAMER/适体
基于核酸的适体是由～20至100个核苷酸组成的单链寡核苷酸。DNA，尤其是RNA适体，表现出显着的构象灵活性和多功能性[APT.1]，它们独特的三维结构赋予了对靶的特异性，范围从小有机分子，例如氨基酸[APT.2]，到大蛋白质(通过小的结合区域)，到纳米尺寸结构，例如脂质体[APT.3]。另外，细胞RNA 适体(也称为INTRAMER)可以作为自我剪接rRNA内含子上的氨基酸的结合位点[APT.4]、核糖开关上的深结合结构域[APT.5，6]或甚至作为细胞内表达拮抗剂。
这种适体可以通过公知的体外"SELEX"(通过指数富集的配体的系统进化) 组合方法[APT.7，8]进行实验选择(参见Tuerk和Gold，Science 249(1990)，505-510；Ellington和Szostak，Nature 346(1990)818-822)。成功用于选择的随机区域的最小大小为17nt(精氨酸RNA适体)[APT.9]，并且通过截断从SELEX程序获得的适体，可以工程化非常短的适体：短至15nt(凝血酶DNA-适体)[APT.10]或13nt (茶碱RNA-适体)[APT.11]。适体以高亲和力(KD在皮-纳摩尔范围内)与靶结合，具有异常的特异性。
然而，分离的适体与低摩尔浓度和低分子量的部分的长期结合可能受限于高盐环境之外。本发明的方法克服了分离的适体与在许多环境中处于低摩尔浓度和分子量的游离部分的典型结合限制，并且使得能够实现用于自形成多核苷酸纳米颗粒的史无前例的适体驱动的表面形成。
在优选的实施方式中，通过实验选择单链多核苷酸纳米颗粒中的适体和/或INTRAMER的个体或组，以便通过以比分离的适体或分离的适体组低的KD与来自SELEX或其它适体/部分结合分析结果的特定肽、蛋白质、小分子、代谢物、有机或无机化学品特异性结合来募集表面部分。
在某些实施例中，用于给定靶部分的随机化的适体和/或INTRAMER的单个或组在SELEX或其它适体/部分结合分析中使用的单链自形成多核苷酸纳米颗粒中转录。
在其它某些实施方式中，给定靶部分的随机化的适体和/或INTRAMER区域的单个或组位于RNAi触发模板的环区域内，并在SELEX或其它适体/部分结合分析中使用的单链自形成多核苷酸纳米颗粒内转录。
在某些实施方式中，给定靶部分的随机化的适体和/或INTRAMER区域的单个或组在MV-RNA RNAi引发或其它3向连接模板的环区域内，并在SELEX 或其它适体/部分结合分析中使用的单链自形成多核苷酸纳米颗粒内转录。
在其它实施方式中，用于SELEX或其它适体/部分结合分析的随机化的适体和/或INTRAMER的单个或组被单独转录；然后与多核苷酸纳米颗粒序列组合以产生最终的表面形成的多核苷酸纳米颗粒。
在某些实施方式中，单链多核苷酸纳米颗粒内的分离的适体和/或 INTRAMER被设计成通过特异性结合细胞内、细胞外、体外、体内或其任何组合的部分来募集表面部分。
在某些实施方式中，单链多核苷酸纳米颗粒中的分离的适体和/或 INTRAMER被设计为通过特异性结合内源、外源或其任意组合的部分来募集表面部分。
在优选的实施方式中，本发明使用的适体和/或INTRAMER序列是使用 SELEX或其它适体结合分析方法，以上述包括具有每个随机化的含适体转录物的自形成多核苷酸纳米颗粒的方式，通过实验测定的。
在其它优选的实施方式中，可用于本发明的适体和/或INTRAMER序列选自数千种已知的适体序列(即http://aptamer.icmb.utexas.edu)，然后整合到本发明的自形成纳米颗粒中。这种适体的实例示于下表1中。
表1
代表性的适体和/或INTRAMER
Figure BDA0002405074700000181
在其它具体实施方式中，表达表面形成多核苷酸纳米颗粒，然后将肽募集到其表面上，其逃避免疫识别。许多这样的肽可以在给定的肽中被发现。然而，甚至一些合成肽已被鉴定为能够逃避人免疫识别，例如下表2中所示的那些(P.L. Rodriguez等，“Minimal‘self’peptides that inhibit phagocytic clearance and enhance delivery ofnanoparticles,”Science,339:971-74,2013.)。
表2
代表性的肽
Figure BDA0002405074700000191
细胞内表面形成
本发明使得能够在细胞内产生包覆有存在于细胞环境中的部分的多核苷酸纳米颗粒。此类部分通常是内源、转基因或甚至外源引入到生物体的，用于在所述细胞内表达的多核苷酸纳米颗粒核的此类细胞内表面形成。本发明能够实现细胞内生产和形成的多种用途。
在一些实施方式中，在表达多核苷酸纳米颗粒的生物体口服摄取后，活性由于本发明产生的表面性质而发生改变。一些这样的用途在本申请的其它地方描述，但包括用于抗RNAi的害虫的植物内生物杀虫剂生产，杀菌剂或杀真菌剂的细胞内生产，甚至人或动物药物。
在某些实施方式中，在选自人细胞或动物细胞或植物细胞或酵母细胞或昆虫细胞或细菌细胞的宿主细胞内，或通过体外转录，表达表面形成多核苷酸纳米颗粒并对其进行部分包覆。
在某些具体实施方式中，表面形成多核苷酸纳米颗粒通过启动子(转基因)、病毒(瞬时)的细胞内转录产生，或在体外转录后以图1-2、4中任一图所示的一般结构局部施用(外源)。
在口服摄取后，植物细胞中的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒通常被保护免于胃中的酸和酶降解，但随后被消化植物细胞壁的人和动物中的微生物释放到肠腔中。在一些昆虫害虫中，例如某些半翅目和鳞翅目，唾液中存在植物细胞降解酶，并且本发明的部分包覆的纳米颗粒直接提供核酸酶保护和理想的生物利用度特性，从而使得多核苷酸纳米颗粒核的活性提高。
在任一情况下，靶生物体肠的大粘膜区域提供了用于基于口服纳米颗粒的药物递送的理想系统。当某些部分如受体结合肽、细胞穿透肽、内体肽用作多核苷酸纳米颗粒的包覆物时，可以获得生物体和细胞特异性。本发明的适体驱动的表面形成方法提供了允许可设计特征的部分特异性，所述可设计特征可以提供额外的生物体选择性，仅穿过靶生物体的肠上皮。当选择其中设计用于多核苷酸纳米颗粒核的表面形成的适体的表面部分候选物时，预期本发明的使用者使用护理。例如，许多特异于人或非人细胞、穿过上皮、血脑屏障或视网膜屏障的独特部分是本领域已知的，并且可以应用于本发明，但是在特定用途中将仅需要选择的组。
在一些实施方式中，本发明的细胞内产生的部分包覆的纳米颗粒在癌症、代谢紊乱、神经变性或感染性疾病的治疗中具有治疗目的，但不限于这些治疗。
在其它实施方式中，本发明的细胞内产生的部分包覆的纳米颗粒在治疗由细菌或真菌引起的感染性疾病中具有治疗目的，并且所述治疗是局部、口服施用含有所述发明的细胞。
在其他实施方式中，细胞内产生用于制造具有特异性受控的纳米颗粒表面特征的多核苷酸纳米颗粒以用于医疗用途。
尽管FDA已经批准植物用于溶液培养生产和包封基于蛋白质的药物，但是本领域尚未显示具有用于药物用途的优化表面特性的多核苷酸纳米颗粒的植物内生产。本发明的方法提供了一个平台，在该平台中，可以在细胞内完成具有理想药学性质的未来多核苷酸纳米颗粒药物生产，而不依赖于病毒外壳蛋白包封或dsRNA结合域载体。
植物提供了传统制造系统的理想替代方案。植物不是人病原体的宿主。木质素和纤维素填充的植物细胞壁为用于人类用途的多核苷酸纳米颗粒提供了常规的天然保护，因为人不能够破坏植物细胞壁的糖苷键。在人类中，肠道细菌消化植物细胞壁并将其内容物释放到肠腔中。(INPLANTA.13，14)
此外，植物细胞具有与哺乳动物细胞相似的生产蛋白质药物的能力(INPLANTA.15)，并且还可以用于通过利用本发明的方法生产基于部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的药物。基于蛋白质的药物生产已在烟草植物(INPLANTA.16) 和胡萝卜细胞悬浮培养物(INPLANTA.17)中显示，并且无限制地可用于利用本发明的方法生产药物。
与哺乳动物、昆虫、真菌和细菌细胞相似，植物细胞可以从根本上促进基于RNA的结构的表达、折叠和自形成。用本发明方法设计的转基因稳定转化的植物可以容易地由种子进行繁殖。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)用于将这样的转基因递送至细胞核；而颗粒递送系统用于转化对农杆菌介导的转化顽抗的植物(IN-PLANTA.24)。
在一些实施方式中，叶绿体基因组用于转化本发明的转基因。
自1990年代早期，叶绿体就已经被用于稳定转化许多异源基因 (IN-PLANTA.27-30)。叶绿体基因组具有高拷贝数(＞10,000/细胞)，使得转基因能够以高达70％的总叶含量表达(IN-PLANTA.31)。在靶位点的双同源重组和转基因整合消除了位置效应。此外，将多个基因工程改造进入叶绿体基因组是通过单个转化事件(IN-PLANTA.32-35)实现的，所述转化事件可用于促进多核苷酸纳米颗粒核甚至是用于表面结合自形成多核苷酸核转录物的转基因部分的表达。叶绿体还隔离转基因产物和该区室中的复合物(IN-PLANTA.21，36)
肽表面部分
多肽组是由特定基因组编码的或存在于特定细胞类型或生物体内的完整的一组肽，并且提供了与本发明相关的表面部分候选物的巨大资源。公共储存库的实例可以在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/peptidome/)或Peptide Atlas(peptideatlas.com)等中找到。可以搜索肽资源以定位感兴趣的候选表面部分，其中根据本发明的方法设计用于多核苷酸纳米颗粒核的表面形成的适体 /INTRAMER。
肽作为本发明的表面部分具有广泛的应用，并且在几乎所有生物体中在基因调节和免疫中具有普遍存在的作用。已知肽响应刺激直接在细胞内表达，或作为蛋白质降解过程的一部分大量存在于细胞中。
在本发明的优选实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是选自宿主生物体多肽组的肽或蛋白质前体。
在本发明的某些实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是选自靶生物体多肽组的肽或蛋白质前体。
在本发明的某些实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是结合不被多核苷酸纳米颗粒的适体/INTRAMER靶向的二级肽或蛋白的肽或蛋白前体。
在其它实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是在宿主生物中瞬时或转基因表达的肽、蛋白质前体或蛋白质。
在其它实施方式中，靶表面部分表达由外部刺激物诱导，所述外部刺激物例如病原体、害虫、生物应激(bio-stress)或化学手段或其它；这导致分离的多核苷酸纳米颗粒的可诱导的表面包覆。
在本发明的某些实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是肽，其对靶生物体是细胞穿透的、或抗微生物的、或抗真菌的、或内体破坏性的、或内体逃脱的、易位的、细胞信号传导的、受体结合的、或有毒的、或其任何混合。
为了计算肽残基性质，例如给定pH下的亲水性、MW、等电点和净电荷，在线工具(http://pepcalc.com)提供了给定肽序列的数据和图形分布。对于本发明，重要的是理解当选择其中开发特异性结合适体/INTRAMER的候选表面部分时这些基本的肽特征。
在本发明的某些实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是疏水的、或亲水的、或阳离子的、或阴离子的、或降解抗性的、或其任何混合的肽。
在本发明的优选实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是具有6或更长的线性残基长度的肽。
在本发明的其它优选实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是在pH7 下具有-20、-14、-9、-6、-2、中性、+1、+4、+6、+14或更高的净电荷的肽。
在本发明的某些实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是由于宿主的免疫应答而产生的肽。
在本发明的其它某些实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分为不是宿主的内源肽的肽。
在本发明的其它某些实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是从细胞分泌的肽，包括但不限于下表3中所示的那些。
表3
代表性的肽
Figure BDA0002405074700000221
表3
Figure BDA0002405074700000231
核酸酶降解抗性
在本发明的某些方面，由于在靶生物体的血液或血淋巴、唾液或肠中的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的稳定性增强，实现了生物利用度的总体改善。
在优选的实施方式中，在适体驱动的四个或更多个靶表面部分的结合后，分离的多核苷酸纳米颗粒核的核酸酶降解抗性的增强是明显的。
在本发明的其他方面，核酸酶稳定性可以通过增加多核苷酸纳米颗粒核序列内适体/INTRAMER的数目来进行调节，以控制结合的表面部分的数量和类型。例如，可以增加某些存在显著酶活性的鳞翅目昆虫的表面部分的数量。相反，当使用本发明转染细胞培养物时，可能需要较低滴定的表面部分。在所有情况下，人们希望通过使用本发明的方法赋予多核苷酸纳米颗粒核稳定性，但是希望避免分离的多核苷酸核由于过量结合能够阻碍分离的多核苷酸纳米颗粒核的活性的表面部分而过度稳定。
在其它优选的实施方式中，在适体驱动地结合4、6、12、24、64或128个靶表面部分以及之间的所有数量的靶表面部分后，赋予了分离的多核苷酸纳米颗粒核适当的核酸酶降解抗性。
细胞穿透肽(CPP)
CPP代表具有不同生化特征的大肽家族(Laufer等，2012；Milletti，2012； El-Sayed和Harashima，2013)。
在本发明的具体实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是长度为6-30 个氨基酸的细胞穿透肽。
通常，CPP是阳离子的、部分疏水的、或部分两亲的、或周期性的肽(periodicpeptide)，其可以易位穿过细胞膜。在本领域中存在许多不同的CPP，其具有在用阳离子CPP处理的动物细胞模型(Ziegler等，2005；Tünnemann等，2006； Rinne等，2007；Kosuge等，2008；Tanaka等，2012；Liu等，2013)和昆虫细胞(Cermenati等，2011；Chen等，2012；Pan等，2014；Zhou等，2015)中显示有效的各种特征。本发明的方法进一步增强了CPP在宽pH范围和细胞摄取形式中的应用，其中适体驱动的结合与这些阳离子肽的静电吸引相结合。
CPP的合成相当昂贵，并且当达到动物或人类研究所需的规模时，成本是个问题。
本发明的方法允许内源性或转基因CPP的细胞内生产，并自动配制到可用于医学用途的自形成多核苷酸纳米颗粒的表面上。
在本发明的其他具体实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是细胞穿透肽，其与多核苷酸纳米颗粒核一起在细胞内表达。
其次，肽CPP不具有任何口服生物利用度，且迄今为止已经通过局部或静脉内应用进行临床递送。
在本发明的方面，当CPP用作表面部分时其生物利用度增加。
第三，本发明的方法克服了涉及阳离子和疏水性CPP的非特异性摄取的问题，因为它们可以与多核苷酸纳米颗粒核表面上的其它受体靶向肽程序化地分配；增加CPP的膜易位特征的特异性功能。
在其它具体实施方式中，本发明的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的细胞或膜渗透速率由于含有特定取向的细胞渗透肽的受控表面组成而增加。
在本发明的某些方面，细胞穿透肽通过适体/INTRAMER结合至多核苷酸纳米颗粒核。
在本发明的某些方面，使用多个适体驱动的CPP结合使结合的CPP部分的疏水和/或阳离子部分的呈递聚簇，以将纳米颗粒表面的一部分改变为疏水和/或阳离子；因此使用本发明的方法提供了可设计的细胞膜破坏特征。
在本发明的优选实施方式中，适体/INTRAMER的靶表面部分是有效特异性穿透靶细胞的细胞穿透肽，例如下表4中所示的那些。
表4
代表性的肽
Figure BDA0002405074700000241
表4
Figure BDA0002405074700000251
内体逃逸
除了CPP之外，根据一些实施方式，本发明可以进一步提高部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的内体逃逸的速率，其使用内体溶解剂(endosomolytic)，或网格蛋白-小窝结合(clathrin-pit binding)，或一系列不同等电点的肽，以产生响应早期和晚期内体或其混合的pH梯度的表面。
在本发明的某些实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是内体裂解肽。
在本发明的某些实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是网格蛋白-小窝内体受体结合肽。
在本发明的具体实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是具有不同等电点的肽，在形成后产生两性多核苷酸纳米颗粒表面。
通过利用本发明的方法提供了多种摄取途径。通常，表面组成可以极大地影响摄取速率和经由胞吞作用、微胞吞作用或大胞饮作用的摄取途径。更重要的是，纳米颗粒直径与表面特性的组合显著地有助于囊泡形成期间的摄取效率。低于60nm的纳米颗粒直径促使有效摄取，而不耗尽对细胞健康关键的有限膜受体。本发明的组合物和方法提供了具有适用于特定细胞屏障的可设计表面特征的理想纳米颗粒直径。通过使用本发明产生的可调的表面特征促使在囊泡成熟期间调节内体运输，在胞吞作用期间进入晚期内体，在此时pH变成高度酸性 (EI-Sayed和Harashima，2013)。
在本发明的某些实施方式中，当优选胞吞作用或微胞吞作用时，细胞内部分包覆的多核苷酸纳米颗粒被有效地吞入直径低于200nm的囊泡中。
在本发明的其它实施方式中，当优选大胞饮时，细胞外部分包覆的多核苷酸纳米颗粒被吞入直径大于200nm的囊泡中。
在其它实施方式中，使用本发明的方法产生的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的内体逃逸率比分离的多核苷酸纳米颗粒核要高，例如在下表5中所示的那些。
表5
代表性的肽
Figure BDA0002405074700000261
多模态(multimodality)
在某些实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒核靶向昆虫、或病毒、或真菌、或动物或人、或宿主植物(图8a)、其他植物、或其任何组合的基因；并且表面部分通过使用任一项中所示的通用结构靶向昆虫、或病毒、或细菌、或真菌、或动物、或人、或宿主植物、或其任意组合(图8b)。
在某些实施方式中，在适体驱动的结合靶表面部分或多个靶表面部分后，添加另外的作用模式。(图3b、9、10、11)。
在本发明的具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是通过RNAi调节的基因，但部分包覆的表面增加了作为抗微生物剂、抗真菌剂、杀虫剂或两者的额外功能(图9，11b-c)。
在其它具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是用抗微生物肽、抗真菌肽、毒性肽或毒性蛋白质或其组合包覆的单个多核苷酸纳米颗粒。(图8-11)。
在具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒在适体驱动结合靶表面部分或多个靶表面部分后改变了表面电荷、核酸酶抗性、蛋白酶抗性、作用模式和分子量(图3b，10，11)。
在其它具体实施方式中，在适体驱动的靶表面部分与靶表面部分(一个或多个)结合时，分离的多核苷酸纳米颗粒的表面电荷变得阴离子、中性、阳离子或其混合较少(图3b，10，11)。
受体肽
在其它具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒靶向生物体中除宿主基因以外的基因。生物体特异性可以通过多核苷酸与靶基因的互补性和细胞摄取信号如适体、配体、连接核苷酸、环、长dsRNA、ssRNA末端、结合的表面部分的功能或其组合来确定(图9)。
在某些实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是针对细胞或生物体特异性受体的肽。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是长度为6-12 个氨基酸的细胞或生物体特异性受体的肽。
在其它优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是长度为 6-30个氨基酸的细胞或生物体特异性受体的肽。
在其它实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是长于30个氨基酸的细胞或生物体特异性受体的肽，例如下表6中所示的那些。
表6
代表性的肽
Figure BDA0002405074700000271
表6
Figure BDA0002405074700000281
表6
Figure BDA0002405074700000291
适体驱动的部分簇
在优选的实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒通过将部分集聚到多核苷酸纳米颗粒核的表面区域上来提高分离的表面部分的活性。
靶向细胞膜的致病细菌毒素具有类似的功能结构，称为ABE模型。在已充分表征的毒素如霍乱和志贺氏菌中已经观察到，"B"结构域在与细胞表面受体结合中发挥功能，而"A"或活性结构域发挥毒素的特异生物活性(ABE.68， ABE.52)。A和B结构域可以一起合成或分别合成。另外的疏水性独立区域称为 "E"(进入结构域)，并在受体结合后在促进毒素插入中起作用(ABE.68)。
本发明的方法允许模拟指示毒素结构的ABE模型。这种ABE模型可以类似于Cry1Ac的结构域，并且使用本发明的方法模拟该模型提供了用于创建灵活的杀虫剂模式的有用工具，而不需要繁琐地寻找另外的细菌毒素。
基于这种理解，可以利用本发明通过在多核苷酸转录物中聚集适体以便疏水呈递定位在最终的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的特定区域内来模拟表面极性(图10)。
为了确定潜在地以这种方式使用的候选肽的疏水性，在线工具例如 (http:pepcalc.com)可以提供疏水性的初步计算。
在某些实施方式中，本发明所实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒通过将特定部分结合到多核苷酸纳米颗粒核的特定区域上来模拟蛋白质表面特征，例如，在下表7中所示的那些。
表7
代表性的ABE肽集
Figure BDA0002405074700000292
表7
Figure BDA0002405074700000301
在某些实施方式中，通过本发明实现的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒通过将阳离子部分结合到结合的阴离子部分或分离的阴离子多核苷酸纳米颗粒核本身的相对末端上而产生极性纳米颗粒。
抗微生物肽
本发明的方法使得可设计的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒具有优于分离的抗微生物肽的新的第二代抗微生物作用模式。
迄今为止，已经表征了来自不同生物体的抗微生物肽(AMP)。AMP是长度通常小于55个氨基酸残基的小分子量肽，并且具有针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、病毒和真菌(AMP.1)的广谱抗微生物活性。这些内源性多肽由多细胞生物体产生，以保护宿主免受病原微生物的侵害，所述病原微生物在先天免疫应答中发挥重要作用(AMP.1，2)。
一般而言，AMP折叠进入膜环境，呈现一个带正电荷的一侧(主要是由于赖氨酸和精氨酸残基)，而另一侧具有相当比例的疏水残基(AMP.1，AMP.3，4)。它们的阳离子性质引起与微生物膜的负电荷表面的选择性相互作用，导致AMP 在膜表面上积累。疏水部分似乎负责与膜的疏水组分的相互作用。这些相互作用和结构结合可能是由于肽-脂质特异性相互作用的形成，并导致跨膜易位，或最常见的机制，即膜溶解效应(AMP.2，3)。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向的表面部分是抗微生物肽。
在其它优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是以簇或组的形式多个结合至多核苷酸纳米颗粒核的单个抗微生物肽。
在医学中，AMP被认为是一类潜在的抗生素，因为它们与常规抗生素相比具有广谱活性和不同的作用机制。尽管AMP作为新一代抗生素具有相当大的益处，但是它们的临床和商业开发仍然具有一些局限性，例如生物利用度差、潜在毒性、对蛋白酶的敏感性和生产成本高。
本发明的组合物和方法克服了在药物中有效使用AMP的障碍。重要的是，通过使用这些低分子量多肽作为较大多核苷酸纳米颗粒核上的表面部分，增加了它们的一般生物利用度。
然而，本发明的其它优点是通过将特定类型AMP适体驱动的集聚到多核苷酸纳米粒子核的表面上以补充AMP在易位和/或膜破裂中的作用机制来获得的。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是针对特定微生物靶谱专门选择的抗微生物肽。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是抗微生物肽，其变得在细胞外(即，局部)结合到多核苷酸纳米颗粒核表面。
在本发明的方面，可以引入具有适体驱动的与细胞外或局部环境中存在的 AMP的结合的多核苷酸纳米颗粒核，以便促进靶AMP部分结合到纳米颗粒表面上，从而能够获得最终的部分包覆的纳米颗粒的益处。在非限制性的例子中，这些方法通过补充存在于各种环境中的AMP的作用机制，可用于治疗或预防皮肤、眼睛、膀胱、血液的感染。
由病毒、细菌和真菌引起的植物病害影响作物，并且对农产品(AMP.5)的质量和安全性的显著损失或降低具有影响。为了减少产量损失，迫切需要开发新的作物保护策略。长期以来，已知植物表现出使它们能够检测和防御微生物攻击的机制。植物对微生物攻击的反应激活了一系列复杂的反应，引起了局部和全身诱导广谱抗微生物防御(AMP.6)。
凯萨林菌素(Cathelicidins)、防御素和硫堇素是人类和植物中表皮AMP的三个主要类别。植物AMP在结构上和功能上是多样的，并且可以针对其他生物体，如植食性昆虫。已经在转基因植物中表达了几种抗微生物肽以赋予疾病保护。内源抗微生物肽是可以开发用于植物疾病控制的有前途的化合物，并且符合关于疾病控制安全性的严格规定。已经证明各种来源的AMP在一系列基因工程植物物种中赋予了对真菌和细菌病原体的抗性，所述植物物种包括拟南芥 (AMP.7)、烟草(AMP.8，9，10)、大白菜(AMP.11)、水稻(AMP.12，13)、番茄(AMP.14)、棉花(AMP.15)、马铃薯(AMP.16)、梨(AMP.17)、香蕉(AMP.8)和杂交白杨(AMP.18)。
在本发明的一些方面，内源性AMP具有新的生物利用度特性，并以新的组合物提供给那些已经逐渐习惯于通过进化或商业应用分离的AMP的害虫。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是抗微生物肽，其在细胞内结合至多核苷酸纳米颗粒核表面。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是抗微生物肽，其变得在细胞外(即，局部)结合到多核苷酸纳米颗粒核表面。
肽理论的抗微生物潜力可以基于序列用特定的AMPA软件 (http://tcoffee.crg.cat/apps/ampa/do)[AMP.41]进行预测。对于AMPA分析，最小推荐参数是；阈值：0.225，窗口大小：7个氨基酸，错分类：<5％。
另外的AMP可以在出版物或数据库中在线获得，例如APD3 (http://aps.unmc.edu/AP/)。这一数据库目前聚焦于具有确定序列和活性的天然抗微生物肽(AMP)。它包括总共2619个AMP，具有261个细菌素来自细菌，4个 AMP来自古菌，7个来自原生生物，13个来自真菌，321个来自植物和1972个动物宿主防御肽。APD3含有2169抗菌肽、172抗病毒肽、105抗HIV肽、959 抗真菌肽、80抗寄生虫肽和185抗癌肽。新注释的是具有抗生物膜、抗疟、抗原生生物、杀虫、杀精子、趋化性、伤口愈合、抗氧化和蛋白酶抑制特性的AMP。该数据库中几乎所有AMP都可用于本发明的适体驱动的表面形成方法，例如，下表8和9中所示的那些。
表8
代表性的抗菌肽
Figure BDA0002405074700000321
表9
代表性的抗菌肽
Figure BDA0002405074700000322
表9
Figure BDA0002405074700000331
防御素
防御素是近似2-6kDa的阳离子杀微生物肽，其对许多革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌和包膜病毒具有活性。防御素在植物中组成型地和/或响应于微生物产物、促炎细胞因子或植食性反应而产生。防御素杀死和/或灭活微生物的机制尚未完全了解。
目前，通常认为功能是由于微生物膜的破坏。与ABE蛋白毒素相似，防御素通常表现出极性拓扑结构，具有分开的带电区域和疏水区域。这种本质上共同的主题可能有助于插入磷脂膜中，使得它们的疏水区域被包埋在脂质膜内部，并且它们的带电(主要是阳离子)区域与阴离子磷脂头部基团和水相互作用。
另外，一些防御素可以聚集以形成"通道样"孔；其它的可以以"地毯状"方式结合并覆盖微生物膜。无论哪种方式，结果都是膜完整性的破坏。
生物杀虫剂(biopesticides)
已证明RNAi具有控制昆虫害虫的商业潜力。然而，RNAi的效率在不同的昆虫目之间可有很大的不同。在许多RNAi顽拗昆虫物种中，基因敲低(gene knockdown)在低浓度下是低的或无效的(Huvenne和Smagghe，2010；Li等， 2013)。
昆虫中肠上皮细胞对RNA的有效摄取是使用RNAi有效进行植物内保护的基础。除鞘翅目(Baum等，2007；Zhu等，2011；Bolognesi等，2012；Rangasamy 和Siegfried，2012)外，在克服两个最大障碍方面几乎没有进展：口服生物利用度和细胞摄取。
本发明的适体驱动的表面形成方法利用细胞内和体外生产来解决：目前抗植物掺入保护剂(PIP)的昆虫的口服生物利用度、核酸酶稳定性、多模态活性和细胞摄取挑战。
在本发明的方法中，含有嗜热作用响应肽的植物自身多肽组可用于克服核酸酶降解，提供多模式活性，优化表面电荷以稳定或诱导的方式增加向围食膜基质中的渗透。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向表面部分是衍生自宿主的多肽组的肽。
在优选的实施方式中，适体/INTRAMER的适体靶向的表面部分在细胞内或细胞外、体内或体外结合。
在具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是通过RNAi进行基因调节的，但包覆表面部分是非毒性肽、毒性肽或其组合。
在具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是通过RNAi进行基因调节的，但包覆表面部分含有损伤相关的微生物模式、微生物相关的分子模式或其组合。
在具体实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是通过RNAi进行基因调节的，但包覆表面部分是毒性蛋白、化学物质或其组合。
在具体的其它实施方式中，分离的多核苷酸纳米颗粒是通过RNAi进行基因调节的，但包覆表面部分是毒性蛋白、化学物质或其组合。
MAMP的来源是昆虫毒液。这些化合物对其它昆虫有毒，并且可以提供农业害虫的生物防治。特别地，蜘蛛毒液是新的昆虫特异性肽毒素的潜在来源。
一个例子是来自狼蜘蛛(Lycosa carolinensis)的小的两亲性
Figure BDA0002405074700000342
±螺旋肽糖苷毒素-1(Lyt-1或LCTX)。亲水侧的正电荷与带负电荷的原核细胞膜相互作用，疏水侧与膜脂双层结合以使其渗透。昆虫的外骨骼表面是高度疏水的，两亲性化合物提供了一种强的方法来使其渗透。
本发明的方法促使增加生物利用度、可设计的疏水性呈递，促使以较低的摩尔浓度使用毒素。
在某些实施方式中，在由植食性刺激触发的含有DAMP或MAMMP的肽(例如，下表10中所示的那些)的结合后，细胞内诱导部分表面形成和最终的生物利用度。
表10
代表性的肽
Figure BDA0002405074700000341
表10
Figure BDA0002405074700000351
本发明的病原体包括但不限于病毒或类病毒、细菌、昆虫、线虫、真菌等。病毒包括任何植物、动物或人类病毒，例如，烟草或黄瓜花叶病毒、HIV、HBV、 HSV、HPV、环斑病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等。主要作物的特定真菌和病毒病原体包括：黄豆：巨大疫霉(Phytophthora megasperma f.sp.glycinea)、壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、菌核病菌(Selerotinia sclerotiorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、菜豆茎溃疡病菌大豆变种(Diaporthe phaseolorum var.sojae)(拟茎点菌，Phospomsis sojae)，菜豆茎溃疡病菌花椰菜变种(Diaporthe phaseolorumvar.caulivora)、齐整小核菌 (Sclerotium rolfsii)、大豆紫斑病菌(Cercosporakikuchii)、大豆灰斑病菌 (Cercospora sojina)、灰斑病菌(Peronospora manshurica)、黑线炭疽菌 (Colletotrichum dematium)(大豆炭疽病菌，Colletotrichum truncatum)、棒孢菌 (Corynespora cassiicola)、甘氨酸葡萄球菌(Septoria glycines)、大豆生叶点霉 (Phyllosticta sojicola)、互隔交链孢霉(Alternaria alternata)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)、油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrisp.v.phaseoli)、扩散叉丝壳(Microsphaera diffusa)、半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)、大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆花叶病毒、甘氨酸小丛壳菌(Glomerella glycines)、烟草环斑病毒、烟草条纹病毒、豆薯层锈菌 (Phakopsorapachyrhizi)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、终极腐霉菌 (Pythium ultimum)、德巴利腐霉菌(Pythium debaryanum)、番茄斑萎病毒、大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)、腐皮镰孢霉菌(Fusarium solani)；油菜 (Canola)：菜白锈病菌(Albugocandida)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculans)、立枯丝核菌、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、布拉丝可拉球腔菌(Mycosphaerella brassiccola)、终极腐霉菌、寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、互隔交链孢霉；苜蓿(Alfalfa):密歇根分支杆菌内脏亚种(Clavibacter Michigan's subsp. insidiosum)、终极腐霉菌、畸雌腐霉菌(Pythiumirregulare)、华丽腐霉菌(Pythium splendens)、德巴利腐霉菌、瓜果腐霉菌、巨大疫霉、三叶草霜霉菌(Peronospora trifoliorum)、苜蓿茎点霉(Phoma medicaginisvar.medicaginis)、苜蓿尾孢 (Cercospora medicaginis)、苜蓿假盘菌(Pseudopezizamedicaginis)、苜蓿雷氏菌(Leptotrochila medicaginis)、镰刀菌(Fusarium spp.)、苜蓿黄单胞菌 (Xanthomonas campestris p.v.alfalfae)、根腐丝囊霉(Aphanomyceseuteiches)、草茎点柄霉(Stemphylium herbarum)、苜蓿柄霉(Stemphylium alfalfae)；小麦：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae p.v.atrofaciens)、冰草条黑粉菌(Urocystisagropyri)、小麦黄单胞菌(Xanthomonas campestris p.v.translucens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae p.v.syringae)、互隔交链孢霉、腊叶芽枝霉 (Cladosporiumherbarum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、燕麦镰孢 (Fusarium avenaceum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、小麦散黑粉菌 (Ustilago tritici)、小麦壳二孢(Ascochyta tritici)、麦类条斑病菌(Cephalosporium gramineum)、禾生盘根霉(Collotetrichum graminicola)、小麦白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、禾柄锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)、隐匿柄锈菌 (Puccinia reconditaf.sp.tritici)、条形柄锈菌(Puccinia striiformis)、偃麦草核腔菌(Pyrenophoratritici-repentis)、壳针孢(Septoria nodorum)、小麦壳针孢 (Septoria tritici)、燕麦壳针孢(Septoria avenae)、小麦基腐病菌 (Pseudocercosporella herpotrichoides)、立枯丝核菌、谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminisvar.tritici)、瓜果腐霉菌、多雄腐霉(Pythium arrhenomanes)、终极腐霉菌、终极腐霉菌(Bipolaris sorokiniana)、大麦黄矮病毒、布罗姆花叶病毒(Brome Mosaic Virus)、土传小麦花叶病毒(Soil Borne Wheat Mosaic Virus)、小麦条斑花叶病毒(Wheat StreakMosaic Virus)、小麦纺锤纹病毒(Wheat Spindle Streak Virus)、美洲小麦条斑病毒(American Wheat Striate Virus)、麦角菌(Claviceps purpurea)、小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici)、光滑腥黑粉菌(Tilletia laevis)、小麦印度腥黑粉菌(Tilletiaindica)、格米可乐腐霉菌(Pythium gramicola)、高地平原病毒(High Plains Virus)、欧洲小麦纹状病毒(European wheat striate virus)；向日葵：健壮氏单轴霉菌(Plasmophora halstedii)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黄化病(AsterYellows)、向日葵褐斑病菌(Septoria helianthi)、向日葵茎溃疡病菌(Phomopsishelianthi)、向日葵黑斑病菌(Alternaria helianthi)、百日草链格孢菌(Alternariazinniae)、葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、向日葵茎点霉菌(Phoma macdonaldii)、壳球孢菌、二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、向日葵柄锈菌 (Pucciniahelianthi)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、软腐欧文氏菌(Erwinia carotovorump.v.carotovora)、顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)、隐地疫霉(Phytophthoracryptogea)、白锈菌(Albugo tragopogonis)；玉米：串珠镰刀菌亚黏团变种(Fusariummoniliforme var.subglutinans)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、玉米赤霉(Gibberella zeae，禾谷镰刀菌)、黑粉狭壳柱孢(Stenocarpella maydis，玉米黑粉菌(Diplodia maydis))、畸雌腐霉菌、德巴利腐霉菌、禾生腐霉菌(Pythium graminicola)、华丽腐霉菌、终极腐霉菌、瓜果腐霉菌、黄曲霉(Aspergillus flavus)、玉米小斑病菌O、T小种(Bipolaris maydis O、T，异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus))、玉米圆斑病菌I、II&III(Helminthosporium carbonumI、II&III，炭色孢腔菌 (Cochliobolus carbonum))、玉米大斑病菌I、II&III(Exserohilumturcicum I、II& III)、角果胡椒长蠕孢霉(Helminthosporium pedicellatum)、玉蜀黍节壶菌 (Physoderma maydis)、玉米黄叶枯病菌(Phyllosticta maydis)、玉米球梗孢菌(Kabatiella maydis)、高粱紫斑病(Cercospora sorghi)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)、玉米锈病菌(Puccinia sorghi)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)、壳球孢菌、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、黑孢霉(Nigrospora oryzae)、腊叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、不等弯孢霉(Curvulariainaequalis)、苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)、密歇根枝杆菌内布拉斯加变种(Clavibacter michiganense subsp.nebraskense)、绿色木霉 (Trichoderma viride)、玉米矮小花叶病毒A&B、小麦条斑花叶病毒、玉米褪绿矮缩病毒(Maize Chlorotic DwarfVirus)、高尔基麦角菌(Claviceps sorghi)、燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi p.v.zea)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、玉米矮螺原体(Corn stunt spiroplasma)、大孢色二孢(Diplodia macrospora)、大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)、玉蜀黍指霜霉(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉 (Peronosclerospora philippinensis)、玉米指霜霉(Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)、丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)、玉米疫霉(Physopella zeae)、玉米头孢霉(Cephalosporium maydis)、顶头孢霉、玉米枯黄斑点病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)、高地平原病毒玉米花叶病毒、玉米雷亚多非纳病毒(Maize Rayado Fino Virus)、玉米条纹病毒(Maize Streak Virus)、玉米斑纹病毒(Maize Stripe Virus)、玉米粗缩病毒(Maize Rough Dwarf Virus)；高粱：玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola，禾生小丛壳(Glomerella graminicola))、高粱尾孢菌(Cercospora sorghi)、高粱胶尾孢(Gloeocercospora sorghi)、高粱壳二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae p.v.syringae)、油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrisp.v.holcicola)、产雄异枝假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)、紫柄锈菌(Pucciniapurpurea)、壳球孢菌、买罗病菌(Periconia circinata)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、互隔交链孢霉、高粱生平脐蠕孢(Bipolaris sorghicola)、高粱长蠕孢霉(Helminthosporium sorghicola)、新月弯孢霉、蚕豆茎点霉菌(Phoma insidiosa)、燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae，沉淀假单胞菌(Pseudomonas alboprecipitans))、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、蜀黍座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachara sacchari)、丝轴黑粉菌 (Sporisorium reilianum，丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana))、十字花轴黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、高粱孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、甘蔗花叶病 H(Sugarcane mosaic H)、玉米矮小花叶病毒A&B、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、立枯丝核菌、笔直顶孢霉(Acremonium strictum)、大孢指疫霉(Sclerophthona macrospora)、玉蜀黍指霜霉、菲律宾指霜霉、禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、多雄腐霉、禾生腐霉菌等。
线虫包括寄生线虫，例如根结、囊肿和病变线虫，包括异皮线虫和球异皮线虫(Globodera spp.)、特别是大豆囊肿线虫(Globodera rostochiensis)和派利达线虫(Globodera pailida，土豆囊肿线虫(potato cyst nematodes))、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii，beet cyst nematode)和禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae，cereal cystnematode)。其它的线虫包括：大豆胞囊线虫(Heterodera cajani)、车轴草异皮线虫(Heterodera trifolii)、稻旁叶螨异皮线虫(Heterodera oryzae)、烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、山茶根结线虫(Meloidogyne javonica)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、标记剑线虫(Xiphinema index)、意大利剑线虫(Xiphinemaitaliae)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、异尾剑线虫(Xiphinemadiversicaudatum)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、索内短体线虫(Pratylenchus thornei)、斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、弯曲短体线虫(Pratylenchus curvitatus)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、多管螺旋线虫(Helicotylenchus multicintus)、肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis)、刺线虫(Belonolaimus spp.)、海葵拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、毛刺线虫(Trichodorus spp.)、原始线虫(Primitivus spp.)、小麦粒线虫(Anguina tritici)、燕麦线虫(Bider avenae)、辐射棱角线虫(Subanguina radicicola)、矮化线虫(Tylenchorhynchus spp.)、塞氏纽带线虫(Haplolaimus seinhorsti)、半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)、无心菜鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、狼尾菇刺线虫(Belonolaimus langicaudatus)、拟毛刺剑线虫(Paratrichodorus xiphinema)、克丽丝蒂拟毛刺线虫(Paratrichodorus christiei)、椰子细杆刃线虫 (Rhadinaphelenchuscocophilus)、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、帽状纽带线虫(Hoplolaimusgaleatus)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、小环线虫(Criconemella spp.)、针线虫(Paratylenchus spp.)、异常珍珠线虫 (Nacoabbus aberrans)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)、稻茎线虫 (Ditylenchus angustus)、潜根线虫(Hirchmaniella spp.)、盾线虫(Scutellonema spp.)、金谷半轮线虫(Hemicriconemoideskanayaensis)、克莱顿矮化线虫 (Tylenchorynchus claytoni)和瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)。
昆虫害虫包括选自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鞘翅目和鳞翅目的昆虫。本发明的用于主要作物的昆虫害虫包括：玉米：Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotisipsilon，小地老虎；Helicoverpa zea，棉铃虫； Spodoptera frugiperda，秋粘虫；Diatraea grandiosella，西南玉米螟；Elasmopalpus lignosellus，小玉米杆螟；Diatraeasaccharalis，甘蔗螟；Diabrotica virgifera，西方玉米根虫；Diabrotica longicornisbarberi，北方玉米根虫；Diabrotica undecimpunctata howardi，南方玉米根虫；Melanotus spp.，铁线虫；Cyclocephala borealis，北方独角仙(蛴螬)；Cyclocephalaimmaculata，南方蒙面金龟子(蛴螬)； Popilla japonica，日本丽金龟；Chaetocnemapulicaria，玉米跳甲；Sphenophorus maidis，玉米象虫；Rhopalosiphum maidis，玉米叶蚜虫；Anuraphis maidiradicis，玉米根蚜；Blissus leucopterus，麦长蝽(chinch bug)；Melanoplus femurrubrum，红腿蝗(redlegged grasshopper)；Melanoplus sanguinipes，迁飞蝗虫；Hylemya platura，种蝇；Agromyza parvicornis，玉米斑潜叶蝇；Anaphothripsobscrurus，草蓟马；Solenopsis milesta，窃叶蚁；Tetranychus urticae，二斑叶螨；高粱：Chilo partellus，高粱螟虫；Spodoptera frugiperda，秋粘虫；Helicoverpa zea，棉铃虫；Elasmopalpus lignosellus，小玉米杆螟；Feltia subterranea，粒肤地老虎(granulatecutworm)；Phyllophaga crinita，蛴螬；Eleodes、Conoderus和Aeolus spp.，铁线虫；Oulema melanopus，谷类叶甲虫；Chaetocnema pulicaria，玉米跳甲； Sphenophorusmaidis，玉米胆粉虫(maize bilibug)；Rhopalosiphum maidis，玉米叶蚜虫；Sipha flava，甘蔗黄蚜；Blissus leucopterus，麦长蝽；Contarinia sorghicola，高粱瘿蚊；Tetranychus cinnabarinus，朱砂叶螨；Tetranychus urticae，二斑叶螨；小麦：Pseudaletia unipunctata，军蠕虫(army worn)；Spodoptera frugiperda，秋粘虫；Elasmopalpus lignosellus，小玉米杆螟；Agrotis orthogonia，西方夜蛾； Elasmopalpuslignosellus，小玉米杆螟；Oulema melanopus，谷类叶甲虫；Hypera punctata，车轴草叶象虫；Diabrotica undecimpunctata howardi，南方玉米根虫；俄罗斯麦蚜；Schizaphisgraminum，麦二叉蚜；Macrosiphum avenae，英国谷蚜； Melanoplus femurrubrum，红腿蝗；Melanoplus differentialis，长额负蝗；Melanoplus sanguinipes，迁飞蝗虫；Mayetioladestructor，小麦瘿蚊；Sitodiplosis mosellana，小麦吸浆虫；Meromyza americana，麦秆蝇；Hylemya coarctata，小麦球茎蝇； Frankliniella fusca，烟草蓟马；Cephus cinctus，小麦茎锯叶蝇；Aceria tulipae，小麦卷须(wheat curl mite)；向日葵：Suleimahelianthana，向日葵芽蛾； Homoeosoma electellum，向日葵蛾；Zygogrammaexclamationis，向日葵甲虫； Bothyrus gibbosus，胡萝卜甲虫；Neolasiopteramurtfeldtiana，葵花籽瘿蚊；棉花： Heliothis virescens，棉铃虫；Helicoverpa zea，棉铃虫；Spodoptera exigua，甜菜夜蛾；Pectinophora gossypiella，棉红铃虫；Anthonomusgrandis，棉铃象鼻虫； Aphis gossypii，棉蚜；Pseudatomoscelis seriatus，棉花盲蝽(cotton fleahopper)； Trialeurodes abutilonea，温室白粉虱(bandedwingedwhitefly)；Lygus lineolaris，牧草盲蝽；Melanoplus femurrubrum，红腿蝗；Melanoplusdifferentialis，长额负蝗；Thrips tabaci，洋葱蓟马；Franklinkiella fusca，烟草蓟马；Tetranychus cinnabarinus，朱砂叶螨；Tetranychus urticae，二斑叶螨；水稻：Diatraeasaccharalis，甘蔗螟；Spodoptera frugiperda，秋粘虫；Helicoverpa zea，棉铃虫；Colaspis brunnea，葡萄肖叶甲；Lissorhoptrus oryzophilus，稻水象甲；Sitophilusoryzae，稻象甲； Nephotettix nigropictus，稻叶蝉；Blissus leucopterus，麦长蝽；Acrosternum hilare，绿蝽；大豆：Pseudoplusia includens，大豆夜蛾；Anticarsiagemmatalis，绒毛菜蛾(velvetbean caterpillar)；Plathypena scabra，绿叶蛾；Ostrinianubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；Spodoptera exigua，甜菜夜蛾；Heliothis virescens，棉铃虫；Helicoverpa zea，棉铃虫；Epilachna varivestis，墨西哥豆瓢虫；Myzus persicae，桃蚜；Empoasca fabae，马铃薯叶蝉；Acrosternum hilare，绿蝽；Melanoplus femurrubrum，红腿蝗；Melanoplus differentialis，长额负蝗； Hylemyaplatura，种蝇；Sericothrips variabilis，大豆蓟马；Thrips tabaci，洋葱蓟马；Tetranychus turkestani，土耳其斯坦叶螨；Tetranychus urticae，二斑叶螨；大麦：Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；Schizaphis graminum，麦二叉蚜；Blissus leucopterus，麦长蝽；Acrosternum hilare，绿蝽； Euschistus servus，褐臭椿；Delia platura，种蝇；Mayetiola destructor，小麦瘿蚊； Petrobia latens，褐麦螨；油菜：Brevicoryne brassicae，甘蓝蚜虫；Phyllotreta cruciferae，跳甲；Mamestraconfigurata，披肩粘虫；Plutella xylostella，小菜蛾； Delia spp.，根蛆。
调节基因表达的方法
靶基因可以是已知的靶基因，或者，靶基因可以是未知的，即，可以使用随机序列。在某些实施方式中，一种或多种，优选两种或多种靶mRNA的靶 mRNA水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％。
在本发明的一个实施方式中，靶基因表达(即mRNA表达)的抑制水平为至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或几乎100％，因此细胞或生物体将有效地具有等同于所谓的基因"敲除"的表型。然而，在一些实施方式中，可能优选仅实现部分抑制，使得表型等同于所谓的基因"敲低"。这种敲低基因表达的方法可以用于治疗或研究(例如，产生疾病状态的模型，检查基因的功能，评估试剂是否作用于基因，验证药物发现的靶标)。
在某些实施方式中，使用本领域广泛可用的技术，使用本发明的组合物和方法的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒被合成为自形成的多核苷酸纳米颗粒核，然后当存在多核苷酸纳米颗粒核的适体靶向的表面部分时，体外或细胞外自动表面形成。
在其它实施方式中，使用适当的和广泛已知的技术在体外或体内表达，然后在相同的环境中进行表面形成。因此，在某些实施方式中，本发明包括体外和体内表达载体或序列，其包含含有适体的自形成多核苷酸纳米颗粒的序列，以及用于本发明的候选表面部分。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有编码自形成多核苷酸纳米颗粒的序列、表面部分以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。例如，在Sambrook,J等(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY和Ausubel，F.M.等(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，NY中描述了这些技术。
表达载体通常包括调节序列，其调节自形成多核苷酸纳米颗粒的表达。表达载体中存在的调节序列包括载体的那些非翻译区，例如增强子、启动子、5' 和3'非翻译区，其与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可以不同。根据所用的载体系统和细胞，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。另外，也可以使用组织或细胞特异性启动子。
对于在哺乳动物细胞中的表达，通常优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。此外，通常可获得许多基于病毒的表达系统。例如，在腺病毒用作表达载体的情况下，编码感兴趣多肽的序列可以连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体中。在病毒基因组的非必需E1或 E3区中的插入可用于获得能在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan，J 和Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659)。此外，转录增强子，如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子，可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
在某些实施方式中，本发明提供了候选表面部分多核苷酸纳米颗粒的条件性表达。多种条件表达系统是本领域已知的并且可用于细胞、植物、昆虫和动物，并且本发明考虑使用任何这样的条件表达系统来调节候选靶表面部分的表达或活性。在本发明的一个实施方式中，例如，使用各种诱导型或组织优选的或发育调节的启动子实现靶表面部分的诱导型表达。
许多启动子可用于本发明的实践中。可以基于期望的结果选择启动子。核酸可与组成型、组织优选的、诱导型或其它启动子组合以在宿主生物体中表达。
用于在植物中表达的DNA构建体
本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。所公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
编码自形成多核苷酸纳米颗粒核的多核苷酸，具有或不具有另外的靶表面部分序列元件，或在某些实施方式中用于所公开的方法和组合物中，可以提供在用于在目的植物或生物体中表达的表达盒中。在该实施方式中，认识到每个纳米颗粒核或表面部分可以由单个或单独的表达盒、DNA构建体或载体编码。如所讨论的，提供这些元件的任何手段都是可以预期的。植物或植物细胞可用包含编码一个或多个元件的DNA的单个表达盒转化，或可使用编码单个元件的单独的表达盒转化植物或植物细胞或宿主细胞。同样，用一种组分转化的植物可以随后用第二组分转化。编码单个元件的一个或多个DNA构建体也可以通过有性杂交而结合在一起。也就是说，使包含一种组分的第一种植物与包含第二种组分的第二种植物杂交。杂交的后代植物将包含两种组分。
表达盒可以包括与本发明的多核苷酸可操作地连接的5'和3'调节序列。"可操作地连接"是指两个或多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作连接是允许本文公开的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是邻接的或不邻接的。当用于指两个蛋白质编码区的连接时，通过可操作地连接，意味着编码区在相同的阅读框中。表达盒可以另外含有至少一个另外的多核苷酸以共转化到生物体中。或者，可以在多个表达盒上提供额外的多肽。表达盒可以具有多个限制性位点和/或重组位点，用于插入多核苷酸以处于调节区的转录调节之下。表达盒可以另外含有选择性标记基因。
表达盒可以在转录的5'-3'方向上包括转录和翻译起始区(即启动子)、编码单独含有靶向部分的适体的多核苷酸纳米颗粒核或具有转基因候选表面部分的多核苷酸(如本发明的方法和组合物中所用的)，以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。
本文公开的调节区(即，启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞或对于彼此可以是天然的/类似的。或者，本文公开的调节区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此可以是异源的。如本文所用，关于序列的"异源" 是源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过蓄意的人为干预，在组成和/或基因组基因座方面从其天然形式被大幅修饰。例如，与异源多核苷酸有效连接的启动子来自与该多核苷酸所来源的物种不同的物种，或者如果来自相同/类似的物种，则一个或两个从它们的原始形式和/或基因组基因座上被大幅修饰，或者该启动子不是有效连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用，嵌合基因包含与转录起始区可操作连接的编码序列，所述转录起始区与所述编码序列异源。
终止区可以与转录起始区来源相同(native)，可以与编码本发明的多核苷酸纳米颗粒组合物的可操作地连接的多核苷酸来源相同，可以与植物宿主来源相同，或可以源自启动子、编码本发明的多核苷酸组合物的多核苷酸、植物宿主或其任何组合的另一来源(即，外源或异源)。方便的终止区可从根癌农杆菌的 Ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也可参见Guerineau等(1991) Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等 (1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等(1990)PlantCell 2:1261-1272；Munroe 等(1990)Gene 91:151-158；Ballas等(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903；和Joshi等(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列和其它可能对基因表达有害的这类充分表征的序列的消除。序列的G-C含量可以调整到给定细胞宿主的平均水平，如参照宿主细胞中表达的已知基因而计算的。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以便提供适当定位的DNA序列，并且，如果合适，在适当的阅读框中。为此，可以使用衔接子或接头连接 DNA片段，或者可以涉及其它操作以提供方便的限制性位点、除去多余的DNA、除去限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制性、退火、再取代，例如转换和颠换。
这样的组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子和WO99/43838 和美国专利6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell 等(1985)Nature 313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen 等(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet. 81:581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其它组成型启动子包括，例如，美国专利5,608,149；5,608,144； 5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；以及6,177,611。
根据所需结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。也可使用诱导型启动子，例如病原体诱导型启动子。这些启动子包括来自发病相关蛋白(PR蛋白) 的启动子，其在病原体感染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如，Redolfi等(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254； Uknes等(1992)Plant Cell 4:645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:11 1-1 16。也可参见WO99/43819。
另外，由于病原体通过创伤或昆虫损害进入植物，创伤诱导型启动子可用于本发明的构建。这种创伤诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因 (Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449；Duan等(1996)Nature Biotechnology 14:494-498)；wunl和wun2,美国专利5,428,148；winl和win2 (Stanford等(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)；系统素(McGurl等(1992) Science 225:1570-1573)；WIP 1(Rohmeier等(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792； Eckelkamp等(1993)FEBS Letters 323:73-76)；MPI基因(Corderok等(1994) Plant J.6(2):141-150)等。
另外，病原体诱导型启动子可用于实施方式的方法和核苷酸构建体中。这种病原体诱导型启动子包括来自发病相关蛋白(PR蛋白)的那些启动子，其在病原体感染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如，Redolfi等(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254；Uknes等(1992) Plant Cell 4:645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:1 1 1-1 16。也可参见 WO99/43819。
感兴趣的是在病原体感染部位或其附近局部表达的启动子。参见，例如，Marineau等(1987)Plant Mol.Biol.9:335-342；Matton等(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331；Somsisch等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83:2427-2430；Somsisch等(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98；和Yang (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972-14977。也可参见Chen等(1996)Plant J.10:955-966；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507-251 1；Warner 等(1993)Plant J.3:191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1:961-968；美国专利 5,750,386(线虫诱导的)。特别感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰孢菌(Fusariummoniliforme)诱导(参见，例如，Cordero等 (1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200)。
化学调节的启动子可用于通过施用外源化学调节剂来调节基因在植物中的表达。根据目的，启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学物质的应用诱导基因表达，或化学阻抑型启动子，其中化学物质的应用阻抑基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子、由用作芽前除草剂的疏水性亲电子化合物激活的玉米GST启动子和由水杨酸激活的烟草PR-la启动子。其它感兴趣的化学调节启动子包括类固醇反应性启动子(参见，例如，Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见，例如，Gatz等(1991) Mol.Gen.Genet.227:229-237，和美国专利5,814,618和5,789,156)。
组织优选的启动子可用于靶向特定植物组织内增强的表达。组织优选的启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343； Russell等(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol. 112(3):1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.1 12(2):525-535； Canevascini等(1996)PlantPhysiol.1 12(2):513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196； Orozco等(1993)Plant Mol Biol.23(6):1 129-1 138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J. 4(3):495-505。如果需要，可以修饰这些启动子以实现弱表达。
叶优选的启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto等(1997)Plant J. 12(2):255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105:357-67；Yamamoto等(1994) Plant CellPhysiol.35(5):773-778；Gotor等(1993)Plant J.3:509-18；Orozco等 (1993)PlantMol.Biol.23(6):1 129-1 138；和Matsuoka等(1993)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590。
根优选的启动子是已知的，并且可以选自许多可从文献中获得的启动子或从各种相容物种中重新分离的启动子。参见，例如，Hire等(1992)Plant Mol.Biol. 20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991) Plant Cell 3(10)：1051-1061(法国菜豆GRP1.8基因中的根特异性控制元件)； Sanger等(1990)PlantMol.Biol.14(3)：433-443(根癌农杆菌甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。也可参见Bogusz 等(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了两个从固氮非豆科作物(nonlegume) 植物糙叶山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科作物托莫萨山麻黄(Trema tomesa)的血红蛋白基因中分离的根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报道基因连接，并被引入非豆科作物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科莲藕(legume Lotus corniculatus)中，在这两种情况下都保留了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了它们对发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们得出结论，增强子和组织优选的DNA决定簇在这些启动子中解离。Teeri等(1989)使用基因融合lacZ，结果表明编码章鱼碱合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖表皮中特别有活性，TR2'基因在完整植物中是根部特异性的，并通过叶组织受到损伤而被刺激，这是与杀虫或杀幼虫基因一起使用的特别理想的特征组合(见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptll(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1'基因显示相似的特征。其它根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等(1995)Plant Mol.Biol.29(4)： 759-772)；和rolB启动子(Capana等(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691，也可参见美国专利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。
种子优选的"启动子包括"种子特异性"启动子(在种子发育期间有活性的启动子，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及"种子萌发"启动子(在种子萌发期间有活性的启动子)。参见Thompson等(1989)BioEssays 10:108。这样的种子优选的启动子包括但不限于Ciml(细胞分裂素诱导的信使)；cZ19B l(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见美国专利6,225,529，通过引用并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白和球蛋白-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆-菜豆蛋白、油菜籽蛋白(napin)、伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质蛋白(waxy)、皱缩蛋白1(shrunken 1)、皱缩2、球蛋白1等。也可参见WO00/12733，其中公开了来自endl和end2基因的种子优选启动子。在特定组织中具有"优选"表达的启动子在该组织中的表达程度高于在至少一种其它植物组织中的表达程度。一些组织优选的启动子几乎只在特定组织中显示表达。
在一个实施方式中，植物表达的启动子是维管特异性启动子，例如韧皮部特异性启动子。本文所用的"血管特异性"启动子是至少在血管细胞中表达的启动子，或在血管细胞中优先表达的启动子。血管特异性启动子的表达不必只在血管细胞中，在其它细胞类型或组织中的表达也是可能的。本文所用的"韧皮部特异性启动子"是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，或优选在韧皮部细胞中表达的启动子。
韧皮部特异性启动子的表达不必仅在韧皮部细胞中，在其它细胞类型或组织例如木质部组织中的表达是可能的。在本发明的一个实施方式中，韧皮部特异性启动子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，其中在非韧皮部细胞中的表达比在韧皮部细胞中的表达更有限(或不存在)。根据本发明的合适的血管特异性或韧皮部特异性启动子的实例包括但不限于选自以下组中的启动子：SCSV3、SCSV4、SCSV5和SCSV7启动子(Schunmann等(2003)Plant Functional Biology 30:453-60；发根农杆菌的rolC基因启动子(Kiyokawa等(1994) Plant Physiology 104:801-02；Pandolfini等(2003)BioMedCentral(BMC) Biotechnology 3:7，(www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；Graham等(1997)Plant Mol.Biol.33:729-35；Guidvac'h等(1996)；Almon等(1997)Plant Physiol. 115:1599-607；发根农杆菌的rolA基因启动子(Dehio等(1993)Plant Mol.Biol. 23:1199-210)；根癌农杆菌T-DNA基因5的启动子(Korber等(1991)EMBO J. 10:3983-91)；稻蔗糖合酶RSs I基因启动子(Shi等(1994)J.Exp.Bot.45:623-31)； CoYMV或鸭跖草黄色斑驳病毒启动子(Medberry等(1992)Plant Cell 4:185-92； Zhou等(1998)Chin.J.Biotechnol.14:9-16)；CFDV或椰子叶腐病毒启动子 (Rohde等(1994)Plant Mol.Biol.27:623-28；Hehn和Rhode(1998)J.Gen.Virol. 79:1495-99)；RTBV或水稻杆状病毒启动子(Yin和Beachy(1995)Plant J. 7:969-80；Yin等(1997)Plant J.12:1 179-80)；豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因 (Edwards等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3459-63；Brears等(1991)PlantJ.1:235-44)；马铃薯蔗糖酶基因的inv CD 1 1 1和inv CD 141启动子(Hedley 等(2000)J.Exp.Botany 51:817-21)；从拟南芥分离的在烟草中具有韧皮部特异性表达的启动子(Kertbundit等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5212-16) VAHOX 1启动子区域(Tornero等(1996)Plant J.9:639-48)；豌豆细胞壁转化酶基因启动子(Zhang等(1996)Plant Physiol.1 12:1 11 1-17)；美国公开的专利申请 20030106097的与几丁质酶相关的内源棉花蛋白的启动子、来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenz等(1993)The Plant J.4:545-54)；硫酸盐转运蛋白基因Sultrl的启动子3(Yoshimoto等(2003)Plant Physiol.131:151 1-17)；蔗糖合酶基因的启动子(Nolte和Koch(1993)PlantPhysiol.101:899-905)和烟草蔗糖转运蛋白基因的启动子(Kuhn等(1997)Science 275-1298-1300)。
可能的启动子还包括黑樱桃洋李甙水解酶(Prunasin Hydrolase)启动子(PHDL1.4 PRO)(美国专利6,797,859)、来自黄瓜和水稻的硫氧还蛋白H启动子 (Fukuda A等(2005)Plant Cell Physiol.46(11)：1779-86)、水稻(RSs I)(Shi，T Wang 等(1994)J.Exp.Bot.45(274)：623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(Yang，N-S等 (1990)PNAS 87:4144-4148)、来自南瓜的PP2启动子(Guo，H等(2004)Transgenic Research 13：559-566)、At SUC2启动子(Truernit，E等(1995)Planta 196(3)：564-70、 At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge KV等(1996)Plant Cell.Physiol. 37(8)：1108-1115)和水稻Tungro杆状病毒(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasi 等(1993)Plant J.4(l)：71-79)。
当需要低水平表达时，将使用弱启动子。通常，本文所用的术语"弱启动子 "是指驱动编码序列以低水平表达的启动子。意图以约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平低水平表达。或者，应认识到术语 "弱启动子"也包括仅在少数细胞中驱动表达而在其它细胞中不驱动表达以产生总体低水平的表达的启动子。当启动子驱动不可接受的高水平表达时，可以缺失或修饰部分启动子序列以降低表达水平。
这种弱组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838 和美国专利6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其它组成型启动子包括，例如，美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680； 5,268,463；5,608,142；以及6,177,611。
表达盒还可以包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物(例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D))的抗性的基因。其它选择标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP) (Su等(2004)Biotechnol Bioeng 55:610-9and Fetter等(2004)Plant Cell 7 (5:215-28),cyan florescent protein(CYP)(Bolte等(2004)J.Cell Science 777:943-54和Kato等(2002)Plant Physiol 729:913-42)和黄色荧光蛋白 (Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte等(2004)J.Cell Science 777:943-54)。对于其它选择标记，一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-51 1；Christopherson al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6314-6318；Yao等(1992) Cell71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley等(1980)in TheOperon,pp.177-220；Hu等(1987)Cell 48:555-566；Brown等(1987)Cell 49:603-612；Figge等(1988)Cell 52:713-722；Deuschle等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 86:5400-5404；Fuerst等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549-2553； Deuschle等(1990)Science 248:480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Reines等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1917-1921；Labow等 (1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:3952-3956；Baim等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072-5076； Wyborski等(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989) Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162；Degenkolb等(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等(1988)Biochemistry 27:1094-1104； Bonin(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Gossen等(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89:5547-5551；Oliva等(1992)Antimicrob.Agents Chemother. 36:913-919；Hlavka ei/.(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology,Vol.78 (Springer-Verlag,Berlin)；Gill等(1988)Nature334:721-724。上述选择标记基因的列表不意味着限制。任何选择标记基因可与本文所述的组合物和方法一起使用。
该系统的其它组件和使用该系统控制基因表达的方法在文献中有详细记载，表达四环素控制的反式激活蛋白(tTA)或反向tTA(rtTA)的载体可商购获得(例如 pTet-off、pTet-on和ptTA-2/3/4载体、Clontech、Palo Alto、CA)。例如，在美国专利5650298、6271348、5922927和相关专利中描述了这种系统，这些专利的全部内容通过引用并入本文。
在一个具体实施方式中，表面形成多核苷酸纳米颗粒使用包含pSUPER载体骨架和对应于待表达的自形成多核苷酸纳米颗粒的额外序列的载体系统表达。 pSUPER载体系统已显示可用于表达siRNA试剂和下调基因表达(Brummelkamp， T.T.等，Science 296:550(2002)和Brummelkamp，T.R.等，Cancer Cell，在线公开时间：2002-8-22)。PSUPER载体可从OligoEngine，西雅图，WA商购获得。
本发明的适体驱动的表面形成多核苷酸纳米颗粒可用于多种目的，所有这些目的通常与其将多核苷酸纳米颗粒有效递送至靶细胞中以抑制或减少靶基因表达的能力相关。因此，本发明提供了减少一种或多种靶基因表达的方法，包括将本发明的自形成多核苷酸纳米颗粒引入含有靶基因或其同源物、变体或直系同源物的细胞中。此外，自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒可用于间接降低表达。例如，可以使用自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒来减少驱动第二基因表达的反式激活蛋白的表达，从而减少第二基因的表达。类似地，自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒可用于间接增加表达。例如，可以使用自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒来减少抑制第二基因表达的转录阻遏物的表达，从而增加第二基因的表达。
在各种实施方式中，靶基因是源自其中待引入自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的细胞的基因、内源基因、外源基因、转基因或在其转染后存在于细胞中的病原体的基因。根据特定靶基因和递送到细胞中的自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的量，本发明的方法可以引起靶基因表达的部分或完全抑制。含有靶基因的细胞可以来自或包含在任何生物体(例如，植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌)中。
靶基因表达的抑制可以通过以下方法证实，包括但不限于，使用本领域技术人员已知的技术，观察或检测靶基因编码的蛋白质和/或来自靶基因的mRNA 产物和/或与基因表达相关的表型的水平的不存在或可观察到的降低。
可以检测细胞特征的实例，以确定由本发明的自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的引入所引起的效应，包括细胞生长、凋亡、细胞周期特征、细胞分化和形态学。
可以将自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒直接引入细胞(即，细胞内)，或细胞外引入到腔、间隙空间、生物体的循环中，口服引入，通过摄入表达宿主，通过将生物体浸浴在含有自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的溶液中，或通过足以将自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒递送到细胞中的一些其他方式。
此外，可以将工程化以表达自形成多核苷酸纳米颗粒的载体引入细胞，其中载体表达自形成多核苷酸纳米颗粒，从而将其引入细胞。将表达载体转移到细胞中的方法是本领域广泛已知的且可获得的，包括例如转染、脂转染、刮擦加载(scrape loading)、电穿孔、显微注射、感染、基因枪和逆转录。通常，本领域技术人员基于载体类型和细胞类型以及本领域广泛可用的教导内容，容易确定将载体引入细胞的合适方法。感染因子可以通过本领域容易获得的多种方法引入，包括例如鼻吸入。
使用本发明的自形成部分包覆的多核苷酸纳米颗粒抑制基因表达的方法可以与其它敲低和敲除方法组合，例如基因靶向、反义RNA、核酶、双链RNA(例如shRNA和siRNA)以进一步降低靶基因的表达。
在不同的实施方式中，本发明的靶细胞是原代细胞、细胞系、永生化细胞或转化细胞。靶细胞可以是体细胞或生殖细胞。靶细胞可以是非分裂细胞，例如神经元，或者它可以能够在合适的细胞培养条件下在体外增殖。靶细胞可以是正常细胞，或者它们可以是患病细胞，包括含有已知基因突变的那些。本发明的真核靶细胞包括哺乳动物细胞，例如人细胞、鼠细胞、啮齿动物细胞和灵长类动物细胞。在一个实施方式中，本发明的靶细胞是干细胞，其包括例如胚胎干细胞，如鼠胚胎干细胞。
本发明的自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒和方法可用于调节植物中的基因，例如，通过提供用于基因的系统性或非系统性调节的RNA。
本发明的自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒和方法可用于调节植物害虫或病原体的内源基因。
本发明的自形成壳的多核苷酸纳米颗粒和方法可用于治疗多种疾病或病症中的任一种，包括但不限于炎性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤、脱髓鞘疾病、消化系统疾病、内分泌系统疾病、生殖系统疾病、血液和淋巴疾病、免疫疾病、精神障碍、肌肉骨骼疾病、神经疾病、神经肌肉疾病、代谢疾病、性传播疾病、皮肤和结缔组织疾病、泌尿疾病和感染。
在某些实施方式中，所述方法在动物上实施，在具体实施方式中，在哺乳动物上实施，并且在某些实施方式中，在人上实施。
因此，在一个实施方式中，本发明包括使用自形成壳的多核苷酸纳米颗粒用于治疗或预防与基因失调、过表达或突变相关的疾病的方法。例如，可以将自形成多核苷酸纳米颗粒引入癌细胞或肿瘤，从而抑制维持致癌/致瘤表型所需或相关的基因的表达。为了预防疾病或其它病理，可以选择例如疾病/病理的起始或维持所需的靶基因。治疗可以包括改善与疾病相关的任何症状或与病理相关的临床适应症。
此外，本发明的自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒用于治疗与基因突变相关的疾病或病症。在一个实施方式中，自形成多核苷酸纳米颗粒用于调节突变基因或等位基因的表达。在这样的实施方式中，突变的基因是自形成多核苷酸纳米颗粒的靶标，其将包含与突变的基因的区域互补的区域。该区域可以包括突变，但这不是必需的，因为基因的其它区域也可以被靶向，导致突变基因或 mRNA的表达降低。在某些实施方式中，该区域包含突变，并且在相关实施方式中，所得自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒特异性抑制突变mRNA或基因的表达，而不抑制野生型mRNA或基因的表达。这种自形成多核苷酸纳米颗粒在例如一个等位基因突变而另一个等位基因未突变的情况下特别有用。然而，在其它实施方式中，该序列不一定包含突变，因此可以仅包含野生型序列。这种自形成多核苷酸纳米颗粒在例如所有等位基因都突变的情况下特别有用。本领域已知多种疾病和病症与基因突变有关或由基因突变引起，且本发明包括用自形成多核苷酸纳米颗粒治疗任何这样的疾病或病症。
在某些实施方式中，病原体的基因被靶向用于抑制。例如，该基因可直接引起宿主的免疫抑制，或者对于病原体的复制、病原体的传播或感染的维持是必需的。此外，靶基因可以是病原体基因或宿主基因，其负责病原体进入其宿主、病原体或宿主的药物代谢、病原体基因组的复制或整合、宿主中感染的建立或传播、或下一代病原体的组装。预防(即防止或降低感染风险)以及降低与感染相关的症状的频率或严重性的方法包括在本发明中。例如，通过引入本发明的自形成多核苷酸纳米颗粒，可以靶向治疗具有病原体感染风险的细胞或已经感染的细胞，特别是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
在其它具体实施方式中，本发明用于治疗或开发任何类型癌症的治疗。可以使用本文所述的方法治疗的肿瘤的实例包括但不限于成神经细胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、脑瘤、乳腺癌、白血病、淋巴瘤等。
自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒和表达载体(包括病毒载体和病毒)可以在体外或离体导入细胞，然后置于动物中以影响治疗，或者它们可以通过体内给药直接导入患者。因此，在某些实施方式中，本发明提供了基因治疗的方法。本发明的组合物可以以多种方式中的任一种施用给患者，包括肠胃外、静脉内、全身、局部、口服、肿瘤内、肌内、皮下、腹膜内、吸入或任何此类递送方法。在一个实施方式中，组合物经肠胃外施用，即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用。在一个具体的实施方式中，脂质体组合物通过静脉输注或通过快速浓注(bolus injection)腹膜内给药。
本发明的组合物可以配制成适于递送至受试者的药物组合物。本发明的药物组合物通常还包含一种或多种缓冲剂(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如氢氧化铝)、使制剂与接受者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。或者，本发明的组合物可以配制成冻干物。
施用于患者的自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒的量可以由医师基于多种因素容易地确定，所述因素包括例如疾病和从所使用的载体(在施用载体的情况下)表达的自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒的水平。每剂量的给药量通常选择为高于最小治疗剂量但低于毒性剂量。每剂量的量的选择将取决于许多因素，例如患者的病史、其它疗法的使用和疾病的性质。此外，在整个治疗过程中，根据患者对治疗的反应和任何治疗相关副作用的存在或严重程度，可以调整给药量。
本发明还包括鉴定生物体中基因功能的方法，包括使用自形成多核苷酸纳米颗粒抑制先前未知功能的靶基因的活性。取代通过传统的遗传筛选费时费力地分离突变体，功能基因组学设想通过采用本发明来确定未表征的基因的功能，以减少靶基因活性的量和/或改变靶基因活性的时间。本发明可用于确定药物的潜在靶标，了解与发育相关的正常和病理事件，确定造成出生后发育/衰老的信号传导途径等。提高了从基因组和表达基因来源获得核苷酸序列信息的速度，包括酵母、黑腹果蝇(D.melanogaster)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)基因组的全部序列，可与本发明偶联以确定在生物体(例如线虫)中的基因功能。不同生物体使用特定密码子的偏好性，搜索序列数据库以寻找相关的基因产物，将遗传性状的连锁图谱与获得核苷酸序列的物理图谱相关联，以及人工智能方法可以用来从在此类测序项目中获得的核苷酸序列来定义推定的开放阅读框。
在一个实施方式中，基于可从表达序列标签(EST)获得的部分序列，使用自形成多核苷酸纳米颗粒来抑制基因表达，例如，以便确定基因的功能或生物活性。生长、发育、代谢、疾病抗性或其它生物过程的功能改变将指示EST的基因产物的正常作用。
将自形成多核苷酸纳米颗粒导入含有靶基因的完整细胞/生物体的容易性使得本发明可用于高通量筛选(HTS)。例如，可以将含有能够抑制不同表达基因的自形成多核苷酸纳米颗粒的溶液置于作为有序阵列的微量滴定板上的单独孔中，并且可以测定每个孔中的完整细胞/生物体由于抑制靶基因活性而引起的行为或发育的任何变化或修饰。当基因活性被抑制时，靶基因的功能可以从其对细胞/ 生物体的影响来测定。在一个实施方式中，本发明的自形成壳形成的多核苷酸纳米颗粒用于化学基因组学筛选，即测试化合物通过使用本发明的自形成多核苷酸纳米颗粒降低基因表达而逆转模拟的疾病的能力。
如果通过RFLP或QTL分析确定了生物体的特征与多态性遗传连锁，则本发明可用于获得关于该遗传多态性是否可能直接负责该特征的见解。例如，可以扩增限定遗传多态性的片段或这种遗传多态性附近的序列以产生RNA，可以将自形成多核苷酸纳米颗粒引入生物体，并且可以确定特征的改变是否与抑制相关。
本发明还可用于允许抑制必需基因。这些基因可能是仅在发育或细胞区室的特定阶段细胞或生物体生存所需的。当靶基因的活性不是生存所必需的时侯或在靶基因的活性不是生存所必需的部位，可通过抑制靶基因的活性来产生条件性突变的功能等同物。本发明允许在生物体中的特定发育时间和位置添加自形成多核苷酸纳米颗粒，而不将永久突变引入到目标基因组中。类似地，本发明考虑使用仅在需要时表达自形成多核苷酸纳米颗粒的诱导型或条件性载体。
本发明还涉及验证基因产物是否是药物发现或开发的靶标的方法。将靶向对应于待降解基因的mRNA的自形成多核苷酸纳米颗粒引入细胞或生物体。将细胞或生物体维持在发生mRNA降解的条件下，导致基因表达降低。确定基因表达的降低是否对细胞或生物体有影响。如果基因表达的降低具有影响，那么基因产物是药物发现或开发的靶标。
设计部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的方法
根据某些实施方式，本文提供了用于设计部分包覆的多核苷酸纳米颗粒的方法。设计纳米颗粒核心单元，选择和产生表面部分材料，设计纳米颗粒核心，表征模拟的纳米颗粒，确定每个表面部分的适体的数量，组装最终的纳米颗粒序列，验证纳米颗粒与最终适体的折叠，和产生纳米颗粒。
步骤I：设计纳米颗粒核心单元。所述方法的第一步是根据美国专利 9,200,276中的方法设计和筛选有效的MV-RNA。使用"RNAi Cloud"软件设计用于任何数量的基因靶的所有MV-RNA候选物。或者，当仅需要表面MOA时，设计发夹或MV-RNA结构，同时筛选或不筛选RNAi活性。在某些实施方式中，建议使用最少2种不同的MV-RNA结构来形成多核苷酸纳米颗粒核-不包括任选地置于每个核心单元之间的适体。
步骤II：选择并产生表面部分材料。所述方法的第二步是确定作为纳米颗粒的表面包覆层所需的外源或内源部分的组成，所述外源或内源部分例如特定的肽、蛋白质、聚合物、代谢物、离子、小分子、寡糖或其它有机或无机部分—其非限制性实例在上文提供。此确定方法可以根据以下子步骤进行：
1.计算每种候选部分的MW，在最终所需pH下的净电荷。
2.相应地产生表面部分材料用于下游SELEX或其它适体选择实验。
3.产生模拟材料以测定适体的优化摩尔浓度/数量，如下步骤4-5。
4.如果是肽，则相应地产生额外的预筛选表面肽，具有用于模拟的N或C 端修饰；
(a)静电N端添加；
组氨酸/赖氨酸共聚物：“KHKHKHKHKHKHKHKHKH”
精氨酸片段：“RRRRRRRRR”
(b)假适体N或C端添加；
任何已知适体(即Tat、BIV、Rev1、Rev2)的特异性肽片段
5.如果是蛋白质，则产生另外的具有TAG的预筛选表面蛋白用于适体结合修饰以进行模拟；
(a)假适体N或C端添加；
任何已知适体(即Tat、Rev1、BIV、Rev2)的特异肽片段
步骤III：设计纳米颗粒核。所述方法的第三步是使用步骤I的结果，根据 PCT/US16/48492的纳米颗粒核设计纳米颗粒核。在某些实施方式中，可以使用发夹代替MV-RNA，但是含有MV-RNA或3向连接的构建体是优选的实施方式，以容纳多个部分结合适体。对于使用假适体或具有特异性设计为直接结合部分而无额外aa的适体的模拟形式，可将适体/INTRAMER序列插入纳米颗粒序列中以根据图4的组合物模拟纳米颗粒。
步骤iv：模拟的纳米颗粒的表征。所述方法的第四步是测试和表征每个潜在表面部分的功能。例如，在预期的环境中运行每个潜在表面部分的滴定 (titrations)和测试功能是基本原则。一种测定最终表面部分组成和适体 /INTRAMER数量的方法是使用静电或假适体模型，如步骤II，子步骤4-5中所示。由于当适体驱动的结合力用于表面形成时利用了本专利的优点，使用假适体优于单独使用静电结合。以下子步骤可以用于表征模拟的纳米颗粒：
1.设置滴定以测试在最类似于最终盐组成和pH的缓冲液中的各种浓度或 N/P比下的表面变化。当模拟表面部分的混合物时，对于任何单个表面部分或整个混合，根据本文所述实施方式的摩尔比的一个起点是4、8、16、32、64和128。在测量前，每个反应应在室温下静置～30分钟或更长时间。
2.测量每次滴定和组合物的ζ电势。
3.凝胶移位或荧光团抑制测定是容易确认结合和表面电荷变化的方法。
4.测量每次滴定的纳米颗粒尺寸和PI。
5.测试每次滴定和组合物的活性/功能。
步骤V：测定每个表面部分的适体的数量。基于步骤IV中的表征，建议每个纳米颗粒的特定表面部分和每个部分的量。结果可以表明在纳米颗粒转录物中应该有多少MV-RNA以及达到期望特征所需的适体的数量。(即如果需要24 个表面单位以获得期望结果，则在纳米颗粒转录物中必须包括最少12个 MV-RNA或3向连接的适体。
步骤VI：组装最终的纳米颗粒序列。对于所述方法的第六步，来自步骤4 的适体序列排列在步骤2的纳米结构的环内或作为茎环(图4)，优选集聚或不集聚(图5)。
步骤VII：用最终适体验证纳米颗粒折叠。一旦使用图5的模式之一设计了每个MV-RNA的全序列并将其定向为具有适体/INTRAMER序列的纳米结构，就在计算机程序如Cofold中重折叠RNA。基于热力学的折叠软件可能不能提供与基于共折叠转录的折叠一样精确的结果。或者，可以使用″RNAi Cloud″软件自动设计MV-RNA单元，从适体文库中选择用于假或直接结合部分的适体，并验证所得的纳米颗粒的二级结构。
所得到的折叠符号或图形将游离核苷酸表示为″.″，而结合核苷酸表示为″(″或″)″。相对自由能和解链温度也将给出关于精确转录物的稳定性的指示。可以查看代表精确结构化转录物的结果图形。图12d、14中所示的序列的示例性共折叠符号如下所示：
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步骤VIII：纳米颗粒的制备。对于第八步，准备将序列并入适当的转录设置中。本领域技术人员将理解如何选择合适的转录启动子和终止基序用于体外或细胞内制备。
在某些实施方式中，这些方法包括确定或预测步骤(b)中选择的序列所采用的二级结构，例如，以便确定它们能够采用茎环或3向连接结构。
类似地，这些方法可以包括验证步骤，其包括测试设计的多核苷酸序列抑制靶基因表达的能力，例如在体内或体外测试系统中。
本发明还考虑使用计算机程序基于本文所述的互补性特征来选择纳米颗粒的MV-RNA序列。因此，本发明提供了用于选择多核苷酸纳米颗粒序列的计算机软件程序和包含所述软件程序的计算机可读介质，以及含有本发明的程序之一的计算机。
在某些实施方式中，用户向计算机提供关于靶基因的序列、位置或名称的信息。计算机在本发明的程序中使用该输入来鉴定MV-RNA形式中待靶向的靶基因的一个或多个合适区域，并输出或提供互补序列以用于根据本文所述的实施方式组装本发明的多核苷酸纳米颗粒。通常，程序将选择不与基因组序列互补的一系列序列，包括靶基因或与靶基因互补的多核苷酸纳米颗粒的区域。当需要时，程序还提供GAP区序列、折叠符号和折叠图形。在选择了合适的 MV-RNA方向、多个适体、环、连接、打开/关闭序列、克隆位点和必需的转录元件后，计算机程序将该信息输出或提供给使用者。
本发明的程序可进一步使用关于含有靶基因的生物体的基因组序列的输入，例如，公共或私人数据库，以及预测特定序列的二级结构和/或杂交特征的其它程序，以确保多核苷酸纳米颗粒采用正确的二级结构(即，mFold、RNAfold、 Cofold、RNAi Cloud)且不与非靶基因杂交(BLASTn)。
本发明部分基于令人惊讶的发现，即仅需要非常少量的表面材料即可显著改变这些多核苷酸纳米颗粒核的表面测量，并且这种表面材料可通过适体 /INTRAMER结合以足够低的水平控制，以实现如本文所述的细胞内形成，并且在扩展多核苷酸纳米颗粒的效用方面极其有效。本发明所得的部分包覆的多核苷酸纳米颗粒提供了优于先前描述的技术的显著优点，包括控制表面组成、表面电荷、N/P比、稳定性、细胞摄取、转运、作用模式的史无前例的细胞内形成方法。此外，本发明的核/壳多核苷酸纳米颗粒通过潜在地利用数千个包覆部分，在对于给定用途可调的几乎无限的组合物的混合物中，提供了优于传统生物分子的额外优点，产生了新型极性或非极性或两亲性分子-具有细胞内、细胞外、体外或体内的多峰和多价作用模式。
本发明的实施将采用细胞生物学、分子生物学、微生物学和重组DNA的各种常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分描述。参见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch, 和Maniatis编(Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1989)和DNA Cloning,第 I和II卷(D.N.)。
操作实施例
以下实施例旨在说明本发明的各种实施方式。因此，所讨论的具体实施例不应被解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的范围的情况下，可以进行各种等同、改变和修改，并且应当理解，这些等同的实施例将被包括在这里。此外，本发明中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文，如同在本文中完全阐述一样。
实施例1：适体驱动的表面改变多核苷酸纳米颗粒靶向害虫的药效学
在某些实施方式中，本文提供的方法和组合物可以用于农业目的。如本文所述，本发明可应用于以高度特异性方式有助于另外的作用模式、细胞识别和/ 或摄取的多核苷酸纳米颗粒。对于农业应用，例如作物保护，所述方法不仅是改善多核苷酸纳米颗粒的生物利用度的有用策略，而且是提供另外的作用模式的有用策略。
本实施例描述了根据本发明的适体驱动的纳米颗粒表面序列的组装。可设计表面组合物通过多个为靶向部分低摩尔的结合到多核苷酸纳米颗粒表面上而特别设计的INTRAMER/适体序列实现。单链自形成多核苷酸纳米颗粒核递送一系列在欧洲玉米钻心虫中触发靶向基因的活性RNAi。在加入本发明的情况下，核心多核苷酸序列补充有多个适体/INTRAMER序列，所述适体/INTRAMER序列将靶向部分结合到纳米颗粒核的表面上，形成壳状表面。所形成的表面呈现多核苷酸的非典型特征和/或额外功能。
该非限制性实施例阐述了作为纳米颗粒表面的肽昆虫毒素的结合，以及使用假肽/适体[图12b]关系加速适体驱动的表面的开发以用于测定的方法。
多核苷酸纳米颗粒序列的制备
在该纳米颗粒核的实例中，靶向两个基因：(1)几丁质酶，和(2)神经肽。根据[Hauser，PCT/US2016/048492]，用各种RNAi触发群组装多个纳米颗粒核序列。ECB靶基因如下所示：
＞GU329524.1玉米螟(Ostrinia nubilalis)几丁质酶(cht)mRNA，完整的 cds
Figure BDA0002405074700000601
>ENA|HM159463|HM159463.1玉米螟神经肽F1(NPF1)mRNA，完整的cds.: 位点:1..894
Figure BDA0002405074700000611
个别MV-RNA设计来源于名为"ECB神经肽F1(NPF1)"的软件应用"RNAi Cloud"Projects#P01059和名为"ECB几丁质酶"的软件应用#P01058。
基于RNAi Cloud软件中的置信度等级选择一些MV-RNA设计。然后将 MV-RNA集合进行分组并按指示连接。结果如下：
几丁质酶二价物MV-RNA：
Figure BDA0002405074700000621
作为ssRNA连接的几丁质酶组：
Figure BDA0002405074700000622
Figure BDA0002405074700000631
NPF1二价物MV-RNA：
Figure BDA0002405074700000632
作为ssRNA连接的NPF1组：
Figure BDA0002405074700000633
Figure BDA0002405074700000641
然后将各组共折叠以检查结构偏差，如下所示：
Figure BDA0002405074700000642
用本发明改变序列
所得到的序列设计和二级结构符合[Hauser，PCT/US2016/048492]提供的指导。在本申请中使用本发明的设计和方法，通过用适体/INTRAMER基序取代许多或所有含有各种环(BOLD)的序列，可以改变序列以形成适体驱动的表面[图 4a]。或者，如下所示，可以在每个MV-RNA连接(下划线)之间添加新的适体 /INTRAMER结构[图4b]。
连接的ECB MV-RNA的阵列：
Figure BDA0002405074700000643
Figure BDA0002405074700000651
设计新的或将预先存在的适体/INTRAMER序列插入MV-RNA环中
使用SELEX，本领域技术人员可以设计对表面部分特异性的适体 /INTRAMER序列。然而，这可能是昂贵且耗时的。提供了允许使用充分研究的来自公共结构域的具有合适pK的适体快速测试大量候选表面物质的临时设计 [图12]。适体序列和表面物质序列不是本发明的主题，但是本发明提供了一种有用的工具，用于制备可设计的纳米颗粒表面，无论是来源于已知的还是新的适体/部分关系。选择TAT适体作为具有足够解离常数(＜600nM)的合适适体以驱动表面组装，然后使用本发明的方法和设计进行调整。TAT适体序列如下所示：
HIV-1Tat，CCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGG(SEQ ID NO：)
Figure BDA0002405074700000652
实例HIV-1 TAT环序列用于替代许多MV-RNA环，以便将形成表面的适体 /INTRAMER呈递到纳米颗粒核的表面上。如下面的示例性序列所示，具有7NT 环的十二(12)个MV'S被TAT适体序列(适体加下划线)替代。
Figure BDA0002405074700000661
使用上述序列制备含有表面适体(ECB-3)的12单位纳米颗粒和不含适体的 12单位纳米颗粒(ECB-2)。为了完成纳米颗粒序列设计，将茎置于候选序列之前和之后以稳定地连接5'至3'末端。在5'端，加入T7转录基序，并在3'端加入Rho 终止序列，以支持在大肠杆菌中的体外或细胞内产生。转录物的启动子和终止子可以交换生产和细胞类型(即泛素启动子/PIN2终止子)。在转录物的3'加入链霉亲和素适体，以进行亲和力下降试验。进一步改变该实施例的序列以支持克隆到pBluescript KS+中的策略。完整的序列如下所示： >ECB-2；12MV'S,无TAT适体942nt
Figure BDA0002405074700000671
Figure BDA0002405074700000681
>ECB-3；12 MV'S,具有TAT适体1111nt
Figure BDA0002405074700000682
Figure BDA0002405074700000691
Figure BDA0002405074700000701
设计新的或在MV-RNA环之间插入预先存在的适体/INTRAMER序列
为了支持本发明中使用的多个适体，设计了一组适当长度的交替的单TAT- 茎环[图4b]，以减少由序列复制引起的潜在二级结构偏差。单TAT-茎如下所示。
单-TAT适体茎组1：
Figure BDA0002405074700000702
Figure BDA0002405074700000703
(单-TAT适体茎1a；SEQ ID NO:)
Figure BDA0002405074700000704
Figure BDA0002405074700000705
(单-TAT适体茎1b；SEQ ID NO:)
Figure BDA0002405074700000706
Figure BDA0002405074700000707
(单-TAT适体茎1c；SEQ ID NO:)
单-TAT适体茎组2：
Figure BDA0002405074700000708
Figure BDA0002405074700000709
(单-TAT适体茎2a；SEQ ID NO:)
Figure BDA00024050747000007010
Figure BDA0002405074700000711
(单-TAT适体茎2b；SEQ ID NO:)
Figure BDA0002405074700000712
Figure BDA0002405074700000714
(单-TAT适体茎2c；SEQ ID NO:)
示例性单-TAT适体茎的结构如下所示：
Figure BDA0002405074700000713
另外，还设计了一组具有可变和保守(红，橙)区域的双TAT 3向接头。双 TAT适体支持纳米颗粒核/表面茎比、结合复数、和解离常数的预期。双TAT 3 向接头如下所示。
双TAT适体茎组1：
Figure BDA0002405074700000721
双TAT适体茎组2(具有不同的茎组成)
Figure BDA0002405074700000722
示例性双TAT适体茎的结构如下所示：
Figure BDA0002405074700000723
>ECB-1；12MV'S重复两次，每3mV放置两个适体
Figure BDA0002405074700000731
Figure BDA0002405074700000741
Figure BDA0002405074700000751
实施例2：适体驱动的多部分纳米颗粒表面靶向
草地夜蛾(秋粘虫)
如本文所述，本发明可应用于具有可设计组成的有助于多部分表面的多核苷酸纳米颗粒，所述可设计组成以高度特异性方式提供作用模式、细胞识别和/ 或摄取。对于生物医学和农业用途，这是改善多核苷酸纳米颗粒的生物利用度和功能的有用方法。
本实施例描述了根据本发明的多部分适体驱动的纳米颗粒表面序列的组装。可设计表面组合物通过多个特异性设计以将靶向部分募集到纳米颗粒表面的限制区域上的INTRAMER/适体序列实现。单链自形成多核苷酸纳米颗粒核递送一系列触发秋粘虫中的靶向基因的活性RNAi。除了本发明之外，核心多核苷酸序列补充有多个适体/INTRAMER序列，其产生受控地理表面部分。所形成的表面表现出多核苷酸的特征和/或功能非典型性。
该非限制性实施例说明了肽的结合基团在纳米颗粒表面上作为控制细胞穿透的手段，并且保护无论在体外还是在细胞内产生的部分的益处。
多核苷酸纳米颗粒序列的制备
在该纳米颗粒核的实例中，靶向三个基因：vATPase-A，(2)COPIβ'和(3)COPI 亚β'的化合物。根据[Hauser，PCT/US2016/048492]，用各种RNAi触发群组装多个纳米颗粒核序列。FAW靶基因：(具有Monsanto专利申请US20170183683A1 公开的BOLD区域)如下所示。
草地夜蛾1v-ATPase A
Figure BDA0002405074700000761
草地夜蛾2COPI衣被蛋白β亚基
Figure BDA0002405074700000762
Figure BDA0002405074700000771
Figure BDA0002405074700000781
草地夜蛾3 COPI包被蛋白β'亚基
Figure BDA0002405074700000782
Figure BDA0002405074700000791
Figure BDA0002405074700000801
单独的MV-RNA设计来源于软件应用程序"RNAi Cloud"项目# P01034，名称为"FAWCOPIbp/vATPa/COPIb"，项目#P01033，名称为" FAW COPI Beta prime"，项目#P01032，名称为"FAW vATPase-A"，以及项目#P01031，名称为"FAW COPI Sub beta"。
基于RNAi Cloud软件中的置信度等级选择一些MV-RNA设计。然后将每组MV-RNA分组并按指示进行连接。结果如下
对于vATPase靶向：
二价vATPa_545/303
Figure BDA0002405074700000811
二价vATPa_542/388
Figure BDA0002405074700000812
二价vATPa_320/501
Figure BDA0002405074700000813
对于COPI亚-β靶向：
三价COPI_亚_β_521/731/216，
Figure BDA0002405074700000814
二价COPI_SB_1419/1240
Figure BDA0002405074700000815
二价COPI_SB_1241/1108
Figure BDA0002405074700000816
对于COPIβ'靶向：
二价COPI_BP_1525/1323
Figure BDA0002405074700000817
二价COPI_BP_1532/1446
Figure BDA0002405074700000818
二价COPI_BP_1448/1490
Figure BDA0002405074700000819
包括上述MV-RNA的连接组如下所示。使用本发明要替换的环(下划线)：
Figure BDA0002405074700000821
设计新的或将预先存在的适体/INTRAMER序列插入MV-RNA环中
使用SELEX，本领域技术人员可以设计对表面部分特异性的适体 /INTRAMER序列。然而，这可能是昂贵且耗时的。提供了允许使用充分研究的具有来自公共结构域的合适pK的适体快速测试大量候选表面物质的临时设计 [图12]。适体序列和表面物质序列不是本发明的主题，但是本发明提供了一种有用的工具，用于制备可设计的纳米颗粒表面，无论是来源于已知的还是新的适体/部分组合。选择BIV和TAT适体作为具有足够解离常数(＜60nM&＜600nM) 的合适适体以驱动表面组装，然后使用本发明的方法和设计进行调适。TAT和 BIV适体序列如下所示。
HIV-1Tat，CCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGG(SEQ ID NO：结构如下所示)
Figure BDA0002405074700000831
BIV TAR，GAGGCGGUGAACUUGGAAUCCCACAAGGGCG(SEQ ID NO：结构如下所示)
Figure BDA0002405074700000832
然后，在MV之间加入每种适体的混合的16bp茎。本实施例的TAT-适体茎如下所示：
TAT适体茎组1：
Figure BDA0002405074700000833
Figure BDA0002405074700000834
(TAT适体茎1a；SEQ ID NO：)
Figure BDA0002405074700000835
Figure BDA0002405074700000836
(TAT适体茎1b；SEQ ID NO：)
Figure BDA0002405074700000837
Figure BDA0002405074700000847
(TAT适体茎1c；SEQ ID NO：)
TAT适体茎组2(具有不同的茎组成)
Figure BDA0002405074700000841
Figure BDA0002405074700000842
(TAT适体茎2a；SEQ ID NO：)
Figure BDA0002405074700000843
Figure BDA0002405074700000844
(TAT适体茎2b；SEQ ID NO：)
Figure BDA0002405074700000845
Figure BDA0002405074700000846
(TAT适体茎2c；SEQ ID NO：)
本实施例的BIV-适体茎如下所示：
BIV-适体茎组1：
AGCCGGGCAGCUCCGAGAGGCGGUGAACUUGGAAUCCCACAAGGGC GUCGGAGCUGCCCGGCUuu(BIV适体茎1a；SEQ ID NO：)
CAGGGAGCUGCGGCGUGAGGCGGUGAACUUGGAAUCCCACAAGGGC GACGCCGCAGCUCCCUGuu(BIV适体茎1b；SEQ ID NO：)
GACCCCGCCGUAGCCAGAGGCGGUGAACUUGGAAUCCCACAAGGGC GUGGCUACGGCGGGGUCuu(BIV适体茎1c；SEQ ID NO：)
BIV-适体茎组2(具有不同的茎组成)：
CGACGGGCAGCUCGGAGAGGCGGUGAACUUGGAAUCCCACAAGGGC GUCCGAGCUGCCCGUCGuu(BIV适体茎2a；SEQ ID NO；)
GACGGAUCUGCGGCGUGAGGCGGUGAACUUGGAAUCCCACAAGGGC GACGCCGCAGAUCCGUCuu(BIV适体茎2b；SEQ ID NO；)
GCCAUUGCCGUAGCCAGAGGCGGUGAACUUGGAAUCCCACAAGGGC GUGGCUACGGCAAUGGCuu(BIV适体茎2c；SEQ ID NO；)
得到的TAT适体纳米颗粒如下所示：
＞FAW-4(20MV's)，3个靶基因，1860nt转录物
Figure BDA0002405074700000851
Figure BDA0002405074700000861
结构如下所示)
Figure BDA0002405074700000862
将适体/INTRAMER发明添加到MV-RNA环序列中
为了支持本发明所用的多个适体，适体直接掺入每个MV-RNA中[图4a]。在这组中的9个MV-RNA中，前3个接受TAT适体，其余9个接受BIV适体，总计18个适体，如下所示。
Figure BDA0002405074700000871
结构如下所示)
Figure BDA0002405074700000881
SEQ ID NO：的示例性共折叠符号如下所示：
(((((((((((((((((((((((((...((((......)))))))))))))))))))...(((((.((((((((...((((......)))))))))).)) )))))..))))))))))..((((((((((.((((((((((((((...((((......)))))))))))))))))).((((((..(((((((...((((......))))))))))).. )))))).))))))))))..((((((((((.((((((((((((((...((((......))))))))))))))))))..(((((((..((((((...((((.....))))))))))..))))))))))))))))).(((((((((((((((((((.((.......((..((((........))))..)))).))))))))((((((((((..(.(..((....(((....)))))..).).)))))))))).))))))))))).(((((((((((..(((((.((((((((((...(((((..(((....)))..)))))))))).))))).)))))....((((..((((........))))..).)))......)))))))))))..((((((.(((((((((((((....((....))......(((....))))))))))))))))....((((...))))....((((( (((..((((......))))..))).)))))))))))..(((((((((((..((((((.(.(((.(((..((((........))))..)))..)))....).))))))..((((((.((( ..((((........))))..)))....)))))))))))))))))..((((((((((.(((((((((.......)))))))))..((((((.....(((.((...((((........)))).)).)))))))))..))))))))))..((((((((((...(((((......))))).((..(....((((.(.(((.((....)).))).).)))))..))...((.(((((.(...(( (....)))).)))).).))...))))))))))..
Figure BDA0002405074700000891
用于产生具有1/3至2/3适体比例的多部分表面的原始构建体。
制备所得序列用于克隆到pBluescript中，并可用于体外转录、胞内大肠杆菌生产或转运到不同的生物体，如下所示。
>FAW-5(9MV's),(6TAT-适体,11BIV-适体),3个靶基因，nt转录物
Figure BDA0002405074700000892
增加MV-RNA的多元性以满足更高的适体比。
为了支持本发明所用的多个适体，适体直接掺入每个MV-RNA中[图4a]。在这组中的9个MV-RNA中，前3个接受TAT适体，其余11个接受BIV适体，总共22个适体(6个TAT-适体/22个BIV-适体)
1X TAT-适体区：
Figure BDA0002405074700000901
2X BIV-适体区：
Figure BDA0002405074700000902
Figure BDA0002405074700000911
Figure BDA0002405074700000912
用于产生具有1/3至2/3适体比的多部分表面的最终构建体。
制备所得序列用于克隆到pBluescript中，并可用于体外转录、胞内大肠杆菌生产或转运到不同的生物体。
1/3TAT-适体&2/3BIV-适体纳米颗粒：(6TAT-适体，22BIV-适体)
＞FAW-6(20MV's)，3个靶基因
Figure BDA0002405074700000913
Figure BDA0002405074700000921
Figure BDA0002405074700000922
天然来源或在落粘虫中具有特定功能的表面部分。
作为非限制性实例，这些BIV或TAT适应性多肽中的任何两种可作为多部分纳米颗粒表面使用本发明实例的设计和方法用于测试。
植物来源的表面多肽：
TAT_玉米_RIP2_N
Figure BDA0002405074700000931
TAT_玉米_RIP2_C
Figure BDA0002405074700000932
BIV_RIP2_N
Figure BDA0002405074700000933
BIV_RIP2_C
Figure BDA0002405074700000934
TAT_SNOW_LECTIN
Figure BDA0002405074700000935
BIV-SNOW-LECTIN
Figure BDA0002405074700000941
TAT-玉米mir1
Figure BDA0002405074700000942
肠受体多肽：
TAT_CRY2
Figure BDA0002405074700000943
内体逃逸多肽：
CM-TAT
Figure BDA0002405074700000944
E5-TAT
Figure BDA0002405074700000945
昆虫病毒多肽：
BIV_DENSO-VP4
Figure BDA0002405074700000951
TAT_DENSO-VP4
Figure BDA0002405074700000952
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Claims (17)

1.一种自形成多核苷酸纳米颗粒，包括：
多核苷酸核，包括：
通过一种或多种核苷酸彼此连接的多个多价RNA(MV-RNA)分子，
能够结合表面部分的一个或多个适体或INTRAMER，其中，每个适体或INTRAMER形成多个MV-RNA分子中的一个的环区；以及
部分结合区，其中，一个或多个表面部分能够结合所述一个或多个适体或INTRAMER。
2.根据权利要求1所述的自形成多核苷酸纳米颗粒，其中，所述一个或多个适体或INTRAMER中的每一种选自肽、或小分子、或代谢物、或有机化学品、或无机化学品、前体蛋白、或除病毒外壳蛋白以外的蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的自形成多核苷酸纳米颗粒，其中，所述一个或多个适体或INTRAMER是至少四个适体或INTRAMER。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的自形成多核苷酸纳米颗粒，其中，所述自形成多核苷酸纳米颗粒的直径为约30-60nm、约60-200nm或约60-300nm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的自形成多核苷酸纳米颗粒，其中，所述多核苷酸核的直径为约20nm、约40nm或约40-200nm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的自形成多核苷酸纳米颗粒，其中，所述多核苷酸纳米颗粒包括天然或合成的RNA或DNA。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的自形成多核苷酸纳米颗粒，其中，所述多核苷酸纳米颗粒在宿主细胞中表达，所述宿主细胞选自植物细胞或酵母细胞或细菌细胞、或人细胞、或动物细胞，或体外转录。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的自形成多核苷酸纳米颗粒，其中，所述多核苷酸纳米颗粒在宿主细胞中表达，并靶向宿主以外的基因。
9.一种多核苷酸-部分复合物，包括：
根据权利要求1-8中任一项所述的自形成多核苷酸纳米颗粒；以及
与所述一个或多个适体或INTRAMER结合的一个或多个表面部分。
10.根据权利要求9所述的复合物，其中，在生理pH下的表面电荷不同于权利要求1的分离的多核苷酸纳米颗粒。
11.根据权利要求9所述的复合物，其中，在生理pH下的分子量不同于权利要求1的分离的多核苷酸纳米颗粒。
12.根据权利要求9所述的复合物，其中，在生理pH下的尺寸不同于权利要求1的分离的多核苷酸纳米颗粒。
13.根据权利要求9所述的复合物，其中，在生理pH下的疏水性不同于权利要求1的分离的多核苷酸纳米颗粒。
14.根据权利要求9所述的复合物，其中，作用模式不同于权利要求1的分离的多核苷酸纳米颗粒。
15.根据权利要求9所述的复合物，其中，核酸酶降解抗性不同于权利要求1的分离的多核苷酸纳米颗粒。
16.根据权利要求9所述的复合物，其中，部分的作用模式被拮抗。
17.根据权利要求9所述的复合物，其中，部分的作用模式被激发。
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