CN112779253B - 一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-rna制剂 - Google Patents

一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-rna制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米‑RNA制剂。本发明首次采用神经肽NPF1a基因设计引物并合成了dsRNA，再结合纳米载体透皮传递dsRNA系统，采用喷雾法对梨小食心虫的NPF1a基因进行RNA干扰。采用本发明所提供的纳米‑RNA制剂可以显著降低梨小食心虫的四龄幼虫和初孵幼虫的NPF1a表达量、身体尺寸和蛀果率，并显著增加初孵幼虫的死亡率。且dsRNA不会产生功能蛋白，也减少了对非目标生物的影响，为今后果园直接喷施RNA制剂来防治梨小食心虫的应用性研究打下基础。

Description

一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-RNA制剂
技术领域
本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及神经肽NPF1a基因的dsRNA及其在防治梨小食心虫中的应用。
背景技术
梨小食心虫是一种世界性广泛的蛀果害虫。其幼虫喜欢钻蛀和取食一些蔷薇科植物的果实，比如桃、梨、苹果等，这造成果园大面积果实脱落和质量下降及巨大的经济损失。因此有效防控梨小食心虫幼虫的爆发具有重要的研究意义。
梨小食心虫的初孵幼虫是最开始钻蛀取食果实的为害对象，这个为害阶段是实际控制梨小食心虫大爆发的关键时期，因此开展梨小食心虫幼虫取食行为的神经调控研究，既能有助于研发防控梨小食心虫幼虫的潜在靶标分子的RNA制剂，又能对果园害虫的防治有着十分重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-RNA制剂。为实现上述目的，本发明首次公开了一种梨小食心虫神经肽NPF1a基因的dsRNA，所述dsRNA在与纳米颗粒结合后，经透皮作用进入到昆虫体内，起到抑制NPF1a基因表达的作用，进而抑制梨小食心虫的生长发育及取食行为。
本发明的第一方面公开一种dsRNA，本发明提供的NPF1a基因的dsRNA的核苷酸序列：
GAACAAGAACUUCGCCAUCGCUGUAGCCGUUGUGCUGGCUUGCGUGUGCCUCGCCGAGGCGCGCGAGGAGAGUCCGCACGACAUGUCGGAGGCGCUUCGCAUGCUUCAGGAGUUGGAUCGCUACUACACUCAGGCUGCUAGACCCAGGUUCGGCAAACGCUCUGAUGCCUUCACAAACUGGGCUAAGGAUCUC，如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供的NPF1a基因的dsRNA由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物扩增得到，本发明得到的dsRNA以神经肽NPF1a为靶标分子，结合纳米载体构建透皮双链RNA传递系统，通过室内行为学技术研究证明神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂对幼虫取食行为的调控作用。
本发明第二方面提供使用上述dsRNA制备得到的生物材料，如表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
本发明的第三方面公开一种防治梨小食心虫的产品，其活性成分为上述的dsRNA或上述dsRNA制备得到的生物材料。
这种防治梨小食心虫产品的配方含有纳米颗粒和/或表面活性剂；优选所防治的梨小食心虫为四龄幼虫或初孵幼虫。
通过对配方进一步筛选，发现神经肽NPF1a的纳米-RNA配方为1-5μg/μL纳米载体(Nanocarriers)、1-5μg/μL dsNPF1a、10-3-10-4表面活性剂(detergent)对初孵幼虫生存率和蛀果率均有抑制效果。
在使用dsRNA进行昆虫防治时，多采用透皮法或饲喂法导入昆虫体内，均没有提供可在田间应用纳米-RNA制剂的实施方式。
本发明的第四方面提供一种防治梨小食心虫的方法，采用喷雾法喷施含有抑制梨小食心虫神经肽NPF1a基因表达的物质。可进一步推广神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂在田间的应用，如：为治理果园中的梨小食心虫，在果园的土壤、树木、果实表面喷施含有抑制梨小食心虫神经肽NPF1a基因表达的物质。
将dsNPF1a应用到梨小食心虫的田间防治时，首先需要解决dsRNA的大量合成的问题。在本发明提供的喷雾法防治梨小食心虫的方法中，通过构建NPF1a-pET30-BL21(DE3)RNaseIII-系统，大量合成dsNPF1a。
具体地，本发明提供的喷雾法防治梨小食心虫的方法包括：
设计NPF1a的左右片段的上下游引物(如SEQ ID NO.6-9所示)，用EcoRⅠ-XbaI酶消化186bp PCR产物生成NPF1a-L，用XbaⅠ-XhoⅠ酶消化213bp PCR产物生成NPF1a-R。NPF1a-R末端有一个27bp DNA序列形成茎环结构。
NPF1a-L和NPF1a-R的片段克隆到pET-30a载体上，生成重组pET30-NPF1a表达载体。重组表达载体pET30-NPF1a转入BL21(DE3)RNase III表达感受态细胞中。经单克隆摇菌、摇床培养、菌液80℃孵育、离心、乙醇溶解菌株后，8000转下离心10min，150mM NaCl悬浮离心所得沉淀、再次离心，所得上清液为粗提取的dsRNA，纯化后得dsNPF1a如SEQ ID NO.10所示，其与SEQ ID NO.5仅有少数碱基的差异。
在本发明中，优选梨小食心虫为四龄幼虫或初孵幼虫。
根据本领域技术人员的理解，SEQ ID NO.5所示的dsRNA或由SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示引物扩增得到的dsRNA，以及由该dsRNA制备得到的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在抑制梨小食心虫中NPF1a基因表达、减少梨小食心虫蛀果率、减少梨小食心虫的取食量、增加梨小食心虫死亡率、制备果树农药、制备拮抗梨小食心虫的药物的应用，也是本发明保护的范围。
本发明的有益效果在于：
(1)本研究表明神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂能抑制梨小食心虫幼虫的取食行为，减少初孵幼虫蛀果率和存活率。
(2)基于己有的研究表明靶标分子的dsRNA能在大肠杆菌中大批量生产，并且基于纳米载体的dsRNA可以以喷洒的方式进行田间害虫的防治。
(3)本发明得到的神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂可以作为潜在的生物药剂用来防治果园害虫，且对田间害虫的防治有着重大应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂对四龄幼虫取食行为的影响；其中(A)是纳米载体,dsRNA和助剂三者的配方示意图；(B)是纳米-RNA制剂处理48h后四龄幼虫的取食量检测结果图；(C)是纳米-RNA制剂处理48h后四龄幼虫取食选择测试结果图；(D)是四龄幼虫在处理纳米-RNA制剂后24h、48h和72h处的蛀果率结果图。
图2为本发明实施例3中神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂对初孵幼虫蛀果率和死亡率的影响；其中(A)是初孵幼虫在处理纳米-RNA制剂后的蛀果率；(B)是初孵幼虫在处理纳米-RNA制剂后的死亡率。
图3为本发明实施例4中神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂喷雾法对梨小食心虫的影响；其中(A)是梨小食心虫喷雾处理48h后的取食选择测试结果图；(B)是是梨小食心虫四龄幼虫喷雾处理后的蛀果率结果图；(C)是梨小食心虫初孵幼虫喷雾处理后的死亡率结果图；(D)是梨小食心虫初孵幼虫喷雾处理后的蛀果率结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所有的统计均用SPSS 22.0软件进行分析。两者间的差异统计利用apairwise Student’s t检验(P*<0.05,P**<0.01,P***<0.001).对于基因干扰实验中幼虫选择吃食物的数量的比较采用卡方检验(P***<0.001)。
供试梨小食心虫的幼虫，来自中国农业大学植物保护学院昆虫系IPM实验室人工饲养的种群，选取生活力较强的梨小食心虫幼虫，当天使用。梨小食心虫的成虫饲养在一次性透明的塑料盒中，雌虫产卵在盒壁上，然后塑料盒剪成不同的卵卡放在装有苹果的新的透明塑料盒中，饲养在设置光周期为14h光照：10h黑暗，温度为25±2℃和70％相对湿度的人工气候培养箱中(PXZ-430B，中国宁波江南仪器厂)。
实施例1 dsRNA的合成
合成NPF1a和EGFP(对照)的dsRNA的引物显示在表1中。依据MEGAscriptTM T7高转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司，维尔纽斯，立陶宛)说明书分别合成两个基因的dsRNA。用NanoDrop 2000测dsRNA的浓度，并用DEPC水稀释到终浓度5μg/μL，置于-80℃下备用。
表1合成GmolNPF1a双链RNA的引物
Figure GDA0003612048570000051
实施例2神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂局部点滴对四龄幼虫取食行为的影响
纳米微粒nanocarrier SPc的原料已经商业化和低成本，并且其合成简便(Li etal.2019)。本实施例选择了一种星状阳离子聚合物Li4纳米载体，将其与合成的dsRNA以1:1比例轻轻混合，使其终浓度为2.5μg/μL，然后加入1％容积的助剂-洗涤剂(表面活性剂)到配方中，活性剂可以降低亲水纳米复合物的表面张力，帮助纳米复合物快速附着于幼虫表皮(Bernhard et al.1997；Veldhuizen and Haagsman 2000)。使用本发明提供的dsNPF1a、纳米载体(nanocarriers)和表面活性剂(detergent)三者的配方以局部滴加的方法处理四龄幼虫，每头四龄幼虫滴加1μL配方(2.5μg dsNPF1a)。使用dsEGFP/nanocarriers/detergent处理的四龄幼虫作为实验的对照组。神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂的配方示意图见图1的A。
(1)取食量的检测。用dsNPF1a/nanocarriers/detergent配方和dsEGFP/nanocarriers/detergent配方分别处理40头四龄幼虫后，放在15g新鲜的人工饲料(Chubbet al.2012)上继续饲养，48h后分别测其取食饲料量。再取15g新鲜的人工饲料作为蒸发计算的对照组。每个实验做三次生物学重复。
与对照组相比(平均值为2.62±0.26g)，处理神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂48h的四龄幼虫的取食量(1.38±0.13g)(图1的B)显著下降了1.24±0.28g(P<0.05)。
(2)不同时间下四龄幼虫蛀果率的检测。用dsNPF1a/nanocarriers/detergent配方和dsEGFP/nanocarriers/detergent配方分别处理40头四龄幼虫后，放在梨果上饲养，处理后24h，48h和72h分别记录其蛀果的幼虫数量。实验设置为三次生物学重复。蛀果率(％)＝蛀果幼虫数量/总幼虫数量*100。
与对照组相比，处理神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂的四龄幼虫的蛀果率下降了50.44±5.73％(24h)、59.89±3.18％(48h)、69.33±2.18％(72h)(图1的D)(P<0.05)。
(3)行为实验检测。用dsNPF1a/nanocarriers/detergent配方和dsEGFP/nanocarriers/detergent配方分别处理40头四龄幼虫，放在梨果上饲养，48h后进行取食行为测试。四片梨果实(1cm x 1cm x 1cm)放在一个9cm直径的培养皿的四个等角上，一头四龄幼虫放在培养皿的中心，然后记录在5分钟内，四龄幼虫寻找到梨果实的时间及选择吃果实的数量。每个实验三次生物学重复并三次平行重复。所有的实验均在温度为25±2℃的行为室里进行。
行为实验检测发现，与对照组相比，处理组选择不吃梨果的幼虫数量显著增加了一倍(P<0.0001)(图1的C)。
实施例3神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂局部点滴对初孵幼虫的影响
1、神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂对初孵幼虫蛀果和死亡率的影响
选择5μg/μL dsNPF1a(dsEGFP)与5μg/μL nanocarriers 1:1混和，然后加入1‰容积的detergent的混合配方进行初孵幼虫的相关实验。每60头初孵幼虫分别被处理dsNPF1a/nanocarriers/detergent和dsEGFP/nanocarriers/detergent配方，三次生物学重复，处理后用梨果实进行饲养，统计0h,12h,24h,36h,48h和60h处的初孵幼虫NPF1a的死亡率和蛀果率。[蛀果率(％)＝(总初孵幼虫数量-没有钻果初孵幼虫数量-初孵幼虫死亡数量)/总初孵幼虫数量×100]。
如图2所示，与对照组初孵幼虫(5μg/μL Nanocarriers/5μg/μL dsEGFP/10- 3detergent)相比，处理5μg/μL Nanocarriers/5μg/μLdsNPF1a/10-3detergent后60h内初孵幼虫的蛀果率下降了66.34-74.70％(P<0.0001)(图2的A)，而初孵幼虫的死亡率显著增加到66.67％(P<0.001)(图2的B)。
实施例4神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂喷雾法对幼虫的影响
1、pET30-BL21(DE3)RNaseIII-系统批量生产dsNPF1a
为了进一步推广神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂在田间的应用，本发明首次构建NPF1a-pET30-BL21(DE3)RNaseIII-系统，解决dsRNA的大量合成。设计NPF1a的左右片段的上下游引物，如SEQ ID NO.6-9所示。
Figure GDA0003612048570000071
Figure GDA0003612048570000081
用EcoRⅠ-XbaI酶消化186bp PCR产物生成NPF1a-L，用XbaⅠ-XhoⅠ酶消化213bp PCR产物生成NPF1a-R。NPF1a-R末端有一个27bp DNA序列形成茎环结构。
NPF1a-L和NPF1a-R的片段克隆到pET-30a载体(TIANDZ,China)上，生成重组pET30-NPF1a表达载体。重组载体pET30-NPF1a再转入BL21(DE3)RNase III表达感受态细胞(来源中国农业大学植物保护学院)，通过单克隆摇菌，当OD值达到0.6时加入1mM IPTG诱导剂，37℃，220转下摇床里培养8h。菌液进行80℃孵育20min，8000转下离心5min，然后菌株用1xPBS配置的75％乙醇进行溶解，然后8000转下离心10min，150mM NaCl悬浮离心所得沉淀5min，最后离心15min，上清液为粗提取的dsRNA-NPF1a(粗提取的dsRNA-NPF1a的序列如SEQID NO.10所示)。最后用1U RQ1 RNase-Free DNase(Promega)和适量RNase A Solution(2ng/μL)(Promega)进行纯化。
粗提取的dsRNA-NPF1a的序列如SEQ ID NO.10所示：AUGCUGAACAAGAACUUCGCCAUCGCUGUAGCCGUUGUGCUGGCUUGCGUGUGCCUCGCCGAGGCGCGCGAGGAGAGUCCGCACGACAUGUCGGAGGCGCUUCGCAUGCUUCAGGAGUUGGAUCGCUACUACACUCAGGCUGCUAGACCCAGGUUCGGCAAACGCUCUGAUGCCUU CACAAACUGG(下划线所示碱基为形成茎环的27bp碱基)。
2、神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂喷雾法对四龄幼虫取食和蛀果影响
选择4μg/μL dsNPF1a与4μg/μL nanocarriers 1:1混和，然后加入1％容积的助剂detergent的混和配方进行四龄幼虫的相关实验。每120头四龄幼虫分别喷雾法处理dsNPF1a/nanocarriers/detergent和nanocarriers/detergent和ddH2O，三次生物学重复，处理后用梨果实进行饲养。一个梨果实放在一个透明的长方形的塑料盒(25cm x 15cm x15cm)的一个夹角，处理后的四龄幼虫放在梨果的对面，为了便于统计，每个长方形塑料盒里放入40头幼虫。(1)统计0h,12h,24h,36h和48h处四龄幼虫蛀果率[死亡率(％)＝四龄幼虫死亡数/总四龄幼虫数量x 100]；[蛀果率(％)＝(总四龄幼虫数量-没有钻果四龄幼虫数量–四龄幼虫死亡数量)/总四龄幼虫数量×100]；(2)统计48h处四龄幼虫选择吃与不吃梨果的数量。
如图3所示，与对照组四龄幼虫(ddH2O和Nanocarriers/detergent)相比，处理dsNPF1a/Nanocarriers/detergent后48h内四龄幼虫选择不吃梨果的概率达到62.50％(图3的A)；蛀果率24h下降了63.33％,48h下降了54.44％(图3的B)。
3、神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂喷雾法对初孵幼虫蛀果和存活影响
选择4μg/μL dsNPF1a与4μg/μL nanocarriers 1:1混和，然后加入1‰容积的detergent的混合配方进行初孵幼虫的相关实验。每120头初孵幼虫分别喷雾法处理dsNPF1a/nanocarriers/detergent和nanocarriers/detergent和ddH2O，三次生物学重复，处理后用梨果实进行饲养，统计0h,12h,24h,36h和48h处的初孵幼虫的死亡率和蛀果率。[死亡率(％)＝初孵幼虫死亡数/总初孵幼虫数量x 100]；[蛀果率(％)＝(总初孵幼虫数量-没有钻果初孵幼虫数量-初孵幼虫死亡数量)/总初孵幼虫数量×100]。
如图3所示，与对照组初孵幼虫(ddH2O和Nanocarriers/detergent)相比，处理dsNPF1a/Nanocarriers/detergent后48h内初孵幼虫的蛀果率下降了58.89％(图3的D)，而初孵幼虫的死亡率显著增加到60％(P<0.05)(图3的C)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure GDA0003612048570000111
Figure GDA0003612048570000121
Figure GDA0003612048570000131
Figure GDA0003612048570000141

Claims (9)

1.一种dsRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的dsRNA，其特征在于，由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物扩增得到。
3.含有权利要求1所述dsRNA的生物材料，所述生物材料为表达盒或重组载体。
4.一种防治梨小食心虫的产品，其活性成分为权利要求1-2任一项所述的dsRNA。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，还含有纳米载体和表面活性剂。
6.根据权利要求4-5任一项所述的产品，其特征在于，配方为5μg/μL纳米载体、5μg/μLdsRNA和1‰容积的表面活性剂。
7.一种防治梨小食心虫的方法，其特征在于，采用喷雾法喷施含有抑制梨小食心虫神经肽NPF1a基因表达的物质；所述物质包含dsRNA-NPF1a、纳米载体和表面活性剂；
所述dsRNA-NPF1a是使用包含重组表达载体的工程菌生产获得，包括：
用EcoRⅠ-XbaI酶消化以SEQ ID NO.6-7作为引物合成的PCR产物，生成NPF1a-L；
用XbaⅠ-XhoⅠ酶消化以SEQ ID NO.8-9作为引物合成的PCR产物，生成NPF1a-R；
将NPF1a-L和NPF1a-R的片段克隆到pET-30a载体上，生成重组pET30-NPF1a表达载体；重组载体pET30-NPF1a再转入BL21(DE3)RNase III表达感受态细胞，获得如SEQ ID NO.10所示dsRNA-NPF1a。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述梨小食心虫为四龄幼虫或初孵幼虫。
9.权利要求1-2任一项所述的dsRNA或权利要求3所述的生物材料或权利要求4-6任一项所述的产品或权利要求7-8任一项所述的方法的以下任一种应用：
(1)抑制梨小食心虫中NPF1a基因表达；
(2)减少梨小食心虫蛀果率；
(3)减少梨小食心虫的取食量；
(4)增加梨小食心虫死亡率；
(5)制备果树农药；
(6)制备拮抗梨小食心虫的药物。
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