ES2392478T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9 - Google Patents

Abstract

Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, comprendiendo dicho ARNbc al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en el que una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9, y en el que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud e inhibiendo dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho PCSK9, la expresión de dicho gen PCSK9, en el que: (a) dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1229 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1230; o (b) dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1227 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1228.

Description

Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9

5 Campo de la invención

Esta invención se refiere a ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), y a su uso en la mediación de la interferencia por ARN para inhibir la expresión del gen PCSK9 y al uso del ARNbc para tratar procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de CSK9, tal como hiperlipidemia.

Antecedentes de la invención

La proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) es un miembro de la familia de subtilisina serina proteasa. Las otras ocho subtilisina proteasas de mamíferos, PCSK1-PCSK8 (también denominadas PC1/3, PC2, furina, PC4, 15 PC5/6, PACE4, PC7 y S1P/SKI-1) son proproteína convertasas que procesan una amplia variedad de proteínas en la ruta secretora y desempeñan papeles en diversos procesos biológicos (Bergeron F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9. 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N. A., (2003) FASEB J 17, 1215-1227, y Zhou, A., (1999) J. Biol, Chem 274, 20745-20748). Se ha propuesto que PCSK9 desempeña un papel en el metabolismo del colesterol. La expresión de ARNm de PCSK9 está regulada por disminución por el colesterol de la dieta con la que se alimentan ratones (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119), regulado por incremento por estatinas en células HepG2 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459) y regulado por incremento en ratones transgénicos para la proteína de unión al elemento regulador de esterol (SREBP) (Horton, J. D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032), similar a las enzimas biosintéticas del colesterol y el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR). Además, se ha

25 encontrado que mutaciones de cambio de sentido de PCSK9 están asociadas con una forma de hipercolesterolemia dominante autosómica (Hchola3) (Abifadel, M. et al, (2003) Nat, Genet. 34, 154-156, Timms, K. M., (2004) Hum, Genet: 114, 343-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet, 65, 419-422). PCSK9 también puede desempeñar un papel en la determinación de los niveles de colesterol de LDL en la población general porque se han asociado polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con los niveles de colesterol en una población japonesa (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114).

Las hipercolesterolemias dominantes autosómicas (ADH) son enfermedades monogénicas en las que los pacientes presentan niveles de colesterol de LDL y total elevados, xantomas en tendones y aterosclerosis prematura (Rader,

D. J., (2003) J. Clin, Invest. 111, 1795-1803). La patogénesis de las ADH y una forma recesiva, hipercolesterolemia

35 recesiva autosómica (ARH) (Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14; 121-127), se debe a defectos en la captación de LDL por el hígado. La ADH puede estar provocada por mutaciones de LDLR, que impiden la captación de LDL, o por mutaciones en la proteína en LDL, apolipoproteína B, que se une al LDLR. La ARH está provocada por mutaciones en la proteína de ARH que son necesarias para la endocitosis del complejo LDLR-LDL mediante su interacción con clatrina. Por tanto, si mutaciones de PCSK9 son agentes causantes en familias con Hchola3, parece probable que PCSK9 desempeñe un papel en la captación de LDL mediada por receptores.

Estudios de sobreexpresión apuntan a un papel de PCSK9 en el control de los niveles de LDLR y, por tanto, la captación de LDL por el hígado (Maxwell, K. N. (2004) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem, 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J, Biol. Chem. 279, 50630-50638). La

45 sobreexpresión mediada por adenovirus de PCSK9 humano o de ratón durante 3 ó 4 días en ratones da como resultado niveles de colesterol de LDL y total elevados; este efecto no se observa en animales deficientes en LDLR (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48863-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). Además, la sobreexpresión de PCSK9 da como resultado una grave reducción en proteína de LDLR hepática, sin afectar a los niveles de ARNm de LDLR, los niveles de proteína SREBP o la razón de proteína SREBP nuclear con respecto a citoplasmática. Estos resultados indican que PCSK9, o bien directa o bien indirectamente, reduce los niveles de proteína de LDLR mediante un mecanismo postranscripcional.

Se han diseñado mutaciones de pérdida de función en PCSK9 en modelos de ratón (Rashid et al., (2005) PNAS,

55 102, 5374-5379), y se han identificado en individuos humanos (Cohen et al., (2005), Nature Genetics., 37, 161-165). En ambos casos, la pérdida de la función de PCSK9 conduce a una disminución del colesterol de LDLc y total. En un estudio de desenlace retrospectivo a lo largo de 15 años, se mostró que la pérdida de una copia de PCSK9 disminuía LDLc y conducía a una protección con riesgo-beneficio aumentada frente al desarrollo de cardiopatía cardiovascular (Cohen et al., 2006 N. Engl. J. Med., 354., 1264-1372). Claramente, las pruebas hasta la fecha indican que la disminución de los niveles de PCSK9 disminuirá LDLc.

Recientemente, se ha mostrado que moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia por ARN (iARN). El documento WO 99/32619 (Fire et al.) describe el uso de ARNbc de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de 65 genes en C. elegans. Se ha mostrado también que ARNbc degrada ARN diana en otros organismos, incluyendo plantas (véase, por ejemplo, el documento WO 99/53050, Waterhouse et al., y el documento WO 99/61631, Heifetz

et al.), Drosophila (véase, por ejemplo, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200) y mamíferos (véase el documento WO 00/44895, Limmer; y el documento DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.). Este mecanismo natural se ha convertido en el centro del desarrollo de una nueva clase de agentes farmacéuticos para tratar trastornos que están provocados por la regulación aberrante o no deseada de un gen.

5 A pesar de avances significativos en el campo de iARN y avances en el tratamiento de procesos patológicos que pueden estar mediados por la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, sigue habiendo una necesidad de agentes que puedan inhibir la expresión del gen PCSK9 y que puedan tratar enfermedades asociadas con la expresión del gen PCSK9 tales como hiperlipidemia.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones.

15 La invención proporciona una solución al problema de tratar enfermedades que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) usando ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para silenciar la expresión de PCSK9.

La invención proporciona ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) tal como se define en las reivindicaciones, así como composiciones y métodos in vitro para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula usando tal ARNbc. La invención también proporciona tal ARNbc para su uso en el tratamiento de estados patológicos que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, tales como hiperlipidemia. El ARNbc de la invención comprende una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que tiene menos de nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, y es sustancialmente complementaria a al

25 menos parte de un transcrito de ARNm del gen PCSK9.

En una realización, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del gen PCSK9. El ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí. El ARNbc comprende una hebra sentido que comprende una primera secuencia y una hebra antisentido que comprende una segunda secuencia. La hebra antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria a al menos parte de un ARNm que codifica para PCSK9, y la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud. El ARNbc, tras hacer que contacte con una célula que expresa la PCSK9, inhibe la expresión del gen PCSK9 en al menos el 40%.

35 Según la invención, la primera secuencia del ARNbc es la secuencia de SEQ ID NO: 1229 o 1227 y la segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1230 o 1228, respectivamente. Las moléculas de ARNbc de la invención pueden estar compuestas por nucleótidos que se producen de manera natural o pueden estar compuestas de al menos un nucleótido modificado, tal como un nucleótido modificado con 2’-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5’-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo. Alternativamente, el nucleótido modificado puede elegirse del grupo de: un nucleótido modificado con 2’-desoxi-2’-flúor, un nucleótido modificado con 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2’-amino, nucleótido modificado con 2’-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural. Generalmente, tal secuencia modificada se basará en una primera secuencia de dicho ARNbc y una

45 segunda secuencia tal como se definió anteriormente.

En otra realización, la invención proporciona una célula aislada que comprende uno de los ARNbc de la invención. La célula es generalmente una célula de mamífero, tal como una célula humana.

En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un organismo, generalmente un sujeto humano, que comprende uno o más de los ARNbc de la invención y un vehículo de administración o portador farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la invención proporciona un método in vitro para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una 55 célula, que comprende las siguientes etapas:

(a)

introducir en la célula un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), siendo el ARNbc tal como se define en las reivindicaciones; y

(b)

mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del trascrito de ARNm del gen PCSK9, inhibiendo de ese modo la expresión del gen PCSK9 en la célula.

En otra realización, la invención proporciona el ARNbc definido en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento, la prevención o la gestión de procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de

65 la expresión del gen PCSK9, por ejemplo hiperlipidemia. Se describe por consiguiente la administración a un paciente que necesita tal tratamiento, prevención o gestión de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de

uno o más de los ARNbc de la invención.

En otra realización, la invención proporciona vectores para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, que comprende una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para al 5 menos una hebra de uno de los ARNbc de la invención.

En otra realización, la invención proporciona una célula que comprende un vector para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula. El vector comprende una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una hebra de uno de los ARNbc de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la estructura del lípido ND-98.

15 La figura 2 muestra los resultados de la selección in vivo de 16 ARNic de PCSK9 específicos de ratón (AL-DP-9327 hasta AL-DP-9342) dirigidos contra diferentes regiones de ORF del ARNm de PCSK9 (que tienen el primer nucleótido correspondiente a la posición de ORF indicada en el gráfico) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). Se obtuvo el promedio de la razón de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de GAPDH en lisados de hígado a lo largo de cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo control tratado con PBS o un grupo control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación sanguínea).

La figura 3 muestra los resultados de la selección in vivo de 16 ARNic de PCSK9 que reaccionan de manera cruzada con ser humano/ratón/rata (AL-DP-9311 hasta AL-DP-9326) dirigidos contra diferentes regiones de ORF del ARNm de PCSK9 (que tienen el primer nucleótido correspondiente a la posición de ORF indicada en el gráfico) en ratones

25 C57/BL6 (5 animales/grupo). Se calculó el promedio de la razón de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de GAPDH en lisados de hígado a lo largo de cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo control tratado con PBS o un grupo control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación sanguínea).

El silenciamiento del ARNm de PCSK9 dio como resultado una disminución de los niveles de colesterol sérico total.

Los ARNic más eficaces en cuanto a la inactivación del mensaje de PSCK9 mostraron el efecto hipocolesterolemiante más pronunciado (aproximadamente el 20-30%).

La figura 4 muestra los resultados de la selección in vivo de 16 ARNic de PCSK9 específicos de ratón (AL-DP-9327

35 hasta AL-DP-9342) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). Se calcularon los promedios de los niveles de colesterol sérico total a lo largo de cada grupo de tratamiento y se compararon con un grupo control tratado con PBS o un grupo control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación sanguínea).

La figura 5 muestra los resultados de la selección in vivo de 16 ARNic de PCSK9 que reaccionan de manera cruzada con ser humano/ratón/rata (AL-DP-9311 hasta AL-DP-9326) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). Se calcularon los promedios de los niveles de colesterol sérico total a lo largo de cada grupo de tratamiento y se compararon con un grupo control tratado con PBS o un grupo control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación sanguínea).

45 La figura 6 muestra una comparación de los resultados in vitro e in vivo para el silenciamiento de PCSK9.

La figura 7A y la figura 7B muestras los resultados in vitro para el silenciamiento de PCSK9 usando hepatocitos de mono primarios.

La figura 8 muestra la actividad in vivo de ARNbc formulados con LNP-01 frente a pcsk-9.

La figura 9 muestra la actividad in vivo de moléculas originales 9314 y 10792 modificadas químicamente formuladas con LNP-01 a diferentes tiempos. Claramente, versiones modificadas de 10792 presentan actividad de silenciamiento in vivo.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona una solución al problema del tratamiento de enfermedades que pueden modularse mediante la regulación por disminución del gen PCSK9, usando ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para silenciar el gen PCSK9, proporcionando así tratamiento para enfermedades tales como hiperlipidemia.

La invención proporciona ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) como se define en las reivindicaciones, así como composiciones y métodos in vitro para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula usando el ARNbc. La invención también proporciona tales ARNbc para su uso en el tratamiento de enfermedades y estados patológicos 65 que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9. ARNbc dirige la degradación específica de secuencia de ARNm a través de un proceso conocido como interferencia por ARN

(iARN).

El ARNbc de la invención comprende una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, y es sustancialmente complementaria a 5 al menos parte de un transcrito de ARNm del gen PCSK9. El uso de estos ARNbc permite la degradación seleccionada como diana de un ARNm que está implicado en el transporte de sodio. Usando ensayos en animales y basados en células, los presentes inventores han demostrado que dosificaciones muy bajas de estos ARNbc pueden mediar específica y eficazmente la iARN, dando como resultado una inhibición significativa de la expresión del gen PCSK9. Por tanto, las composiciones de la invención que comprenden estos ARNbc son útiles para tratar procesos

10 patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de PCSK9, tal como en el tratamiento de hiperlipidemia.

La siguiente descripción detallada da a conocer cómo preparar y usar el ARNbc y las composiciones que contienen ARNbc para inhibir la expresión del gen PCSK9 diana, así como composiciones y métodos para tratar enfermedades

15 que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la expresión de PCSK9, tal como hiperlipidemia. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un ARNbc que tiene una hebra antisentido que comprende una región de complementariedad que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, y es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARN del gen PCSK9, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

20 Por consiguiente, ciertos aspectos de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el ARNbc de la invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable, métodos in vitro de uso de las composiciones para inhibir la expresión del gen PCSK9 y ARNbc de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la expresión de PCSK9.

I. Definiciones

Por conveniencia, el significado de ciertos términos y frases usados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se proporcionan a continuación. Si hay una discrepancia aparente entre el uso de un

30 término en otras partes de esta memoria descriptiva y su definición proporcionada en esta sección, la definición en esta sección prevalecerá.

“G,” “C,” “A” y “U” representan cada una generalmente un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como base, respectivamente. Sin embargo, se entenderá que el término “ribonucleótido” o “nucleótido” puede

35 referirse también a un nucleótido modificado, tal como se detalla adicionalmente a continuación, o un resto de reemplazamiento sustituto. El experto es muy consciente de que la guanina, citosina, adenina y uracilo pueden reemplazarse por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que lleva tal resto de reemplazamiento. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede producir apareamiento de bases con nucleótidos que

40 contienen adenina, citosina o uracilo. Por tanto, pueden reemplazarse nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina en las secuencias de nucleótidos de la invención por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Secuencias que comprenden tales restos de reemplazamiento son realizaciones de la invención.

Tal como se usa en el presente documento, “PCSK9” se refiere a la proteína o el gen de proproteína convertasa

45 subtilisina kexina 9 (también conocida como FH3, HCHOLA3, NARC-1, NARC1). Se proporcionan secuencias de ARNm para PCSK9 como de ser humano: NM_174936; ratón: NM_153565 y rata: NM_199253.

Tal como se usa en el presente documento, “secuencia diana” se refiere a una parte contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción del gen PCSK9, incluyendo ARNm que es

50 un producto de procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “hebra que comprende una secuencia” se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia usando la nomenclatura de nucleótidos convencional.

55 Tal como se usa en el presente documento, y a menos que se indique lo contrario, el término “complementario”, cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar una estructura de dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o

60 polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, tal como entenderá el experto. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, pudiendo incluir las condiciones rigurosas: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas seguido por lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes que pueden encontrarse dentro de un organismo. El experto podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de

65 complementariedad de dos secuencias según la aplicación final de los nucleótidos hibridados.

Esto incluye el apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos con el oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de toda la longitud de la primera y segunda secuencia de nucleótidos. Tales secuencias pueden denominarse “completamente complementarias” entre sí en el presente documento. Sin embargo, cuando una primera secuencia

5 se denomina “sustancialmente complementaria” con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias puede ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 4, 3 ó 2 pares de bases apareados de manera errónea tras la hibridación, mientras que conservan la capacidad para hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación final. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos están diseñados para formar, tras su hibridación uno o más proyecciones monocatenarias, tales proyecciones no deben considerarse apareamientos erróneos con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, puede denominarse aún “completamente complementario” para los fines de la invención.

15 Las secuencias “complementarias”, tal como se usa en el presente documento, pueden incluir también, o estar formadas enteramente por, pares de bases no Watson-Crick y/o pares de bases formados por nucleótidos no naturales y modificados, siempre que se satisfagan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse.

Los términos “complementario”, “completamente complementario” y “sustancialmente complementario” en el presente documento pueden usarse con respecto a la coincidencia de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNbc, o entre la hebra antisentido de un ARNbc y una secuencia diana, tal como se entenderá a partir del contexto de su uso.

25 Tal como se usa en el presente documento, un polinucleótido que es “sustancialmente complementario a al menos parte de” un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una parte contigua del ARNm de interés (por ejemplo, que codifica para PCSK9). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de PCSK9 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una parte no interrumpida de un ARNm que codifica para PCSK9.

El término “ARN bicatenario” o “ARNbc”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura de dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, tal como se definió anteriormente. Las dos hebras que forman la 35 estructura de dúplex pueden ser diferentes partes de una molécula de ARN mayor, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando son moléculas de ARN separadas, tales ARNbc se denominan a menudo en la bibliografía ARNic (“ARN de interferencia corto”). Cuando las dos hebras son parte de una molécula mayor, y por tanto están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3’ de una hebra y el extremo 5’ de la otra hebra respectiva que forman la estructura de dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina “bucle en horquilla”, “ARN de horquilla corto” o “ARNhc”. Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios distintos de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3’ de una hebra y el extremo 5’ de la otra hebra respectiva que forman la estructura de dúplex, la estructura de conexión se denomina “ligador”. Las hebras de ARN pueden tener el mismo o un número diferentes de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNbc menos cualquier proyección que esté presente en el

45 dúplex. Además de la estructura de dúplex, un ARNbc puede comprender una o más proyecciones de nucleótidos. Además, tal como se usa en esta memoria descriptiva, “ARNbc” puede incluir modificaciones químicas en ribonucleótidos, incluyendo modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos e incluyendo todos los tipos de modificaciones dadas a conocer en el presente documento o conocidas en la técnica. Cualquiera de tales modificaciones, tal como se usa en una molécula de tipo ARNic, se abarca mediante “ARNbc” para los fines de esta memoria descriptiva y reivindicaciones.

Tal como se usa en el presente documento, una “proyección de nucleótidos” se refiere al nucleótido o nucleótidos desapareados que sobresalen de la estructura de dúplex de un ARNbc cuando un extremo 3’ de una hebra del ARNbc se extiende más allá del extremo 5’ de la otra hebra, o viceversa. “Romo” o “extremo romo” significa que no

55 hay nucleótidos desapareados en el extremo del ARNbc, es decir, no hay proyección de nucleótidos. Un ARNbc con “extremos romos” es un ARNbc que es bicatenario a lo largo de toda su longitud, es decir, sin proyección de nucleótidos en cualquier extremo de la molécula. Por claridad, caperuzas químicas o restos químicos distintos de nucleótidos conjugados al extremo 3’ o extremo 5’ de un ARNbc no se consideran en la determinación de si un ARNbc tiene una proyección o tiene extremos romos.

El término “hebra antisentido” se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana. Tal como se usa en el presente documento, el término “región de complementariedad” se refiere a la región en la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo una secuencia diana, tal como se define en el presente documento. Cuando la región de 65 complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los apareamientos erróneos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, están generalmente en una región o regiones

terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos del extremo 5’ y/o 3’ terminal.

El término “hebra sentido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra antisentido.

5 “Introducir en una célula”, cuando se hace referencia a un ARNbc, significa facilitar la captación o absorción en la célula, tal como entienden los expertos en la técnica. La absorción o captación de ARNbc puede producirse a través de procesos celulares activos o de difusión espontánea, o mediante dispositivos o agentes auxiliares. El significado de este término no se limita a células in vitro; también puede “introducirse en una célula” un ARNbc cuando la célula es parte de un organismo vivo. En tal caso, la introducción en la célula incluirá la administración al organismo. Por ejemplo, para administración in vivo, puede inyectarse ARNbc en un sitio tisular o administrarse de manera sistémica. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica tales como electroporación y lipofección.

15 El término “silencio” y la expresión “inhibe la expresión de”, siempre que se refieran al gen PCSK9, en el presente documento se refieren a la supresión al menos parcial de la expresión del gen PCSK9, tal como se manifiesta mediante una reducción de la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen PCSK9 que puede aislarse a partir de una primera célula o grupo de células en las que el gen PCSK9 se transcribe y que se ha o han tratado de manera que se inhibe la expresión del gen PCSK9, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no se ha o han tratado así (células control). El grado de inhibición se expresa habitualmente en términos de:

(ARNm en celulas control)-(ARNm en celulas tratadas)• 100%(ARNm en celulas control)

25 Alternativamente, el grado de inhibición puede facilitarse en cuanto a reducción de un parámetro que está vinculado funcionalmente a la transcripción del gen PCSK9, por ejemplo la cantidad de proteína codificada por el gen PCSK9 que se secreta por una célula, o el número de células que presentan un cierto fenotipo, por ejemplo apoptosis. En principio, puede determinarse el silenciamiento del gen PCSK9 en cualquier célula que exprese la diana, o bien de manera constitutiva o bien mediante ingeniería genómica, y mediante cualquier ensayo apropiado. Sin embargo, cuando se necesita una referencia con el fin de determinar si un ARNbc dado inhibe la expresión del gen PCSK9 en un cierto grado y por tanto está abarcado por la presente invención, el ensayo proporcionado en los ejemplos a continuación servirá como tal referencia.

Por ejemplo, en ciertos casos, la expresión del gen PCSK9 se suprime en al menos aproximadamente el 20%, el

35 25%, el 35% o el 50% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. En alguna realización, el gen PCSK9 se suprime en al menos aproximadamente el 60%, el 70% o el 80% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. En algunas realizaciones, el gen PCSK9 se suprime en al menos aproximadamente el 85%, el 90% o el 95% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. Las tablas 1, 2 proporcionan un amplio intervalo de valores para la inhibición de la expresión obtenida en un ensayo in vitro usando diversas moléculas de ARNbc de PCSK9 a diversas concentraciones.

Tal como se usa en el presente documento en el contexto de la expresión de PCSK9, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares se refieren al alivio o la paliación de procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución del gen PCSK9. En el contexto de la presente invención, en lo que se refiere a cualquiera

45 de los otros estados mencionados en el presente documento a continuación (distintos de procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución del gen PCSK9), los términos “tratar”, “tratamiento” y similares significan calmar o aliviar al menos un síntoma asociado con tal estado, o ralentizar o revertir la evolución de tal estado. Por ejemplo, en el contexto de hiperlipidemia, el tratamiento implicará una disminución en los niveles de lípidos séricos.

Tal como se usa en el presente documento, las frases “cantidad terapéuticamente eficaz” y “cantidad profilácticamente eficaz” se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, la prevención o la gestión de procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución del gen PCSK3 o un síntoma manifiesto de procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por

55 disminución del gen PCSK9. La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz puede determinarse fácilmente por un profesional médico habitual, y puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución del gen PCSK9, la edad e historia del paciente, el estadio de los procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9 y la administración de otros procesos antipatológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9.

Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un ARNbc y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, “cantidad farmacológicamente eficaz”, “cantidad terapéuticamente eficaz” o simplemente “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de un ARN eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo previsto. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera eficaz cuando hay al menos una reducción del 25% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o trastorno es la cantidad necesaria

5 para efectuar al menos una reducción del 25% en ese parámetro.

La expresión “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos y se describen en más detalle a continuación. La expresión

10 excluye específicamente medio de cultivo celular.

Tal como se usa en el presente documento, una “célula transformada” es una célula en la que se ha introducido un vector a partir del cual puede expresarse una molécula de ARNbc.

15 II. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc)

En una realización, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula o mamífero, comprendiendo el ARNbc una hebra antisentido que comprende una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado 20 en la expresión del gen PCSK9, y en el que la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, e inhibiendo dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho gen PCSK9, la expresión de dicho gen PCSK9 en al menos el 40%. El ARNbc comprende dos hebras de ARN que son suficientemente complementarias como para hibridarse para formar una estructura de dúplex. Una hebra del ARNbc (la hebra antisentido) comprende una región de complementariedad que es sustancialmente 25 complementaria, y en general completamente complementaria, a una secuencia diana, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión del gen PCSK9, la otra hebra (la hebra sentido) comprende una región que es complementaria a la hebra antisentido, de manera que las dos hebras se hibridan y forman una estructura de dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Generalmente, la estructura de dúplex tiene entre 15 y 30, más generalmente entre 18 y 25, aún más generalmente entre 19 y 24, y lo más generalmente entre 19 y 21 pares 30 de bases de longitud. De manera similar, la región de complementariedad con la secuencia diana tiene entre 15 y 30, más generalmente entre 18 y 25, aún más generalmente entre 19 y 24, y lo más generalmente entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. El ARNbc de la invención puede comprender además una o más proyecciones de nucleótidos bicatenarias. El ARNbc puede sintetizarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica tal como se comenta adicionalmente a continuación, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN

35 automático, tal como están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En una realización preferida, el gen PCSK9 es el gen PCSK9 humano. Las secuencias de hebra sentido y antisentido son tal como se definieron anteriormente.

El experto es muy consciente de que ARNbc que comprenden una estructura de dúplex de entre 20 y 23, pero

40 específicamente 21, pares de bases se han considerado como particularmente eficaces en la inducción de la interferencia por ARN (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han encontrado que ARNbc más cortos o más largos pueden ser eficaces también. En las realizaciones descritas anteriormente, en virtud de la naturaleza de las secuencias de oligonucleótidos proporcionadas en las tablas 1 y 2, los ARNbc de la invención pueden comprender al menos una hebra de una longitud de como mínimo 21 nt. Puede esperarse razonablemente

45 que ARNbc más cortos que comprenden una de las secuencias de las tablas 1 y 2 menos sólo unos cuantos nucleótidos en uno o ambos extremos puedan ser similarmente eficaces en comparación con los ARNbc descritos anteriormente. Por tanto, la invención contempla ARNbc que comprenden una secuencia parcial de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de las tablas 1 y 2, y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un ensayo de FACS tal como se describe en el presente

50 documento a continuación en no más del 5, 10, 15, 20, 25 ó 30% de inhibición con respecto a un ARNbc que comprende la secuencia completa. Pueden prepararse fácilmente ARNbc adicionales que escinden dentro de la secuencia diana proporcionada en las tablas 1 y 2 usando la secuencia de PCSK9 y la secuencia diana proporcionada.

55 Además, los agentes de iARN proporcionados en las tablas 1 y 2 identifican un sitio en el ARNm de PCSK9 que es susceptible de escisión basada en iARN. Se describen agentes de iARN adicionales que seleccionan como diana dentro de la secuencia seleccionada como diana por uno de los agentes de la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, se dice que un segundo agente de iARN selecciona como diana dentro de la secuencia de un primer agente de iARN si el segundo agente de iARN escinde el mensaje en cualquier lugar dentro del ARNm

60 que es complementario a la hebra antisentido del primer agente de iARN. Un segundo agente de este tipo consistirá generalmente en al menos 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1 y 2 acoplados a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en el gen PCSK9. Por ejemplo, los últimos 15 nucleótidos de SEQ ID NO:1 (menos las secuencias AA añadidas) combinados con los siguientes 6 nucleótidos del gen PCSK9 diana producen un agente de hebra única de 21

65 nucleótidos que se basa en una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1 y 2.

También se describe un ARNbc que contiene uno o más apareamientos erróneos con la secuencia diana. El ARNbc puede contener no más de 3 apareamientos erróneos. Si la hebra antisentido del ARNbc contiene apareamientos erróneos con una secuencia diana, es preferible que la zona de apareamiento erróneo no esté ubicada en el centro de la región de complementariedad. Si la hebra antisentido del ARNbc contiene apareamientos erróneos con la

5 secuencia diana, es preferible que el apareamiento erróneo se restrinja a 5 nucleótidos de cualquier extremo, por ejemplo 5, 4, 3, 2 ó 1 nucleótido del extremo o bien 5’ o bien 3’ de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una hebra de ARNbc de 23 nucleótidos que es complementaria a una región del gen PCSK9, el ARNbc generalmente no contiene ningún apareamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos pueden usarse para determinar si un ARNbc que contiene un apareamiento erróneo con una secuencia diana es eficaz en la inhibición de la expresión del gen PCSK9. La consideración de la eficacia de los ARNbc con apareamientos erróneos en la inhibición de la expresión del gen PCSK9 es importante, especialmente si se sabe que la región de complementariedad particular en el gen PCSK9 tiene una variación de secuencia polimórfica dentro de la población.

15 Al menos un extremo del ARNbc puede tener una proyección de nucleótidos monocatenaria de 1 a 4, generalmente 1 ó 2 nucleótidos. ARNbc que tienen al menos una proyección de nucleótidos tienen propiedades inhibidoras inesperadamente mejores que sus homólogos de extremos romos. Además, los presentes inventores han descubierto que la presencia de sólo una proyección de nucleótidos refuerza la actividad de interferencia del ARNbc, sin afectar a su estabilidad global. ARNbc que tiene sólo una proyección ha demostrado ser particularmente estable y eficaz in vivo, así como en una variedad de células, medios de cultivo celular, sangre y suero. Generalmente, la proyección monocatenaria está ubicada en el extremo 3’ terminal de la hebra antisentido o, alternativamente, en el extremo 3’ terminal de la hebra sentido. El ARNbc puede tener también un extremo romo, generalmente ubicado en el extremo 5’ de la hebra antisentido. Tales ARNbc tienen actividad inhibidora y estabilidad mejoradas, permitiendo así su administración a dosificaciones bajas, es decir, menos de 5 mg/kg de peso corporal del receptor al día.

25 Generalmente, la hebra antisentido del ARNbc tiene una proyección de nucleótidos en el extremo 3’, y el extremo 5’ es romo. Uno o más de los nucleótidos en la proyección puede reemplazarse por un nucleósido tiofosfato.

El ARNbc puede modificarse químicamente para potenciar la estabilidad. Los ácidos nucleicos de la invención pueden sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en “Current protocols in nucleic acid chemistry”. Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU., que se incorpora por el presente documento en el presente documento como referencia. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero sin limitarse a modificaciones 2’, modificaciones en otros sitios del azúcar o la base de un oligonucleótido, introducción de bases no naturales en la cadena oligonucleotídica, unión covalente a un ligando

o resto químico y reemplazamiento de enlaces fosfato internucleotídicos por enlaces alternativos tales como 35 tiofosfatos. Puede emplearse más de una modificación de este tipo.

La unión química de las dos hebras de ARNbc separadas puede lograrse mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo introduciendo enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrófobas, interacciones de van der Waals o de apilamiento; por medio de coordinación de metal-ión, o a través del uso de análogos de purina. Generalmente, los grupos químicos que pueden usarse para modificar el ARNbc incluyen, sin limitación, azul de metileno; grupos bifuncionales, generalmente bis-(2-cloroetil)amina; N-acetil-N’-(pglioxilbenzoil)cistamina; 4-tiouracilo; y psoraleno. El ligador puede ser ligador de hexaetilenglicol. En este caso, los ARNbc se producen mediante síntesis en fase sólida y el ligador de hexaetilenglicol se incorpora según métodos convencionales (por ejemplo, Williams, D.J., y K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670). En una realización

45 particular, el extremo 5’ de la hebra antisentido y el extremo 3’ de la hebra sentido se unen químicamente mediante un ligador de hexaetilenglicol. Al menos un nucleótido del ARNbc puede comprender grupos fosforotioato o fosforoditioato. El enlace químico en ambos extremos del ARNbc se forma generalmente mediante enlaces de triple hélice. Las tablas 1 y 2 proporcionan ejemplos de agentes de iARN modificados.

Los nucleótidos en una o ambas de las dos hebras individuales pueden modificarse para impedir o inhibir las actividades de degradación de enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, ciertas nucleasas. Se conocen en la técnica técnicas para inhibir la actividad de degradación de enzimas celulares contra ácidos nucleicos incluyendo, pero sin limitarse a, modificaciones de 2’-aminoazúcar, modificaciones de 2’-F-azúcar, modificaciones de 2’-F, modificaciones de 2’-alquil-azúcar, modificaciones de estructura principal no cargada, modificaciones de

55 morfolino, modificaciones de 2’-O-metilo y fosforamidato (véase, por ejemplo, Wagner, Nat. Med. (1995) 1; 1116-8). Por tanto, al menos un grupo 2’-hidroxilo de los nucleótidos en un ARNbc se reemplaza por un grupo químico, generalmente por un grupo 2’-amino o un grupo 2’-metilo. Además, al menos un nucleótido puede modificarse para formar un nucleótido bloqueado. Tal nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno que conecta el oxígeno 2’ de la ribosa con el carbono 4’ de la ribosa. Se describen oligonucleótidos que contienen el nucleótido bloqueado en Koshkin. A.A, et al., Tetrahedron (1998), 54:3607-3630) y Obika, S, et al., Tetrahedron Lett, (1998), 39: 5401-5404). La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad por secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fusión en varios grados (Braasch, D.A. y D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).

65 La conjugación de un ligando a un ARNbc puede potenciar su absorción celular así como su direccionamiento a un tejido particular o captación por tipos específicos de células tales como células hepáticas. En ciertos casos, se

conjuga un ligando hidrófobo con el ARNbc para facilitar la permeación directa de la membrana celular y/o la captación a través de las células hepáticas. Alternativamente, el ligando conjugado con el ARNbc es un sustrato para la endocitosis mediada por receptor. Estos enfoques se han usado para facilitar la permeación celular de oligonucleótidos antisentido así como agentes de ARNbc. Por ejemplo, se ha conjugado colesterol con diversos oligonucleótidos antisentido dando como resultado compuestos que son sustancialmente más activos en comparación con sus análogos no conjugados. Véase M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103. Otros compuestos lipófilos que se han conjugado con oligonucleótidos incluyen ácido 1pirenobutírico, 1,3-bis-O-(hexadecil)glicerol y mentol. Un ejemplo de un ligando para la endocitosis mediada por receptor es ácido fólico. El ácido fólico entra en la célula mediante endocitosis mediada por receptor de folato. Compuestos de ARNbc que llevan ácido fólico se transportarían eficazmente al interior de la célula mediante la endocitosis mediada por receptor de folato. Li y colaboradores notifican que la unión de ácido fólico al extremo 3’ terminal de un oligonucleótido dio como resultado un aumento de 8 veces en la captación celular del oligonucleótido. Li, S.; Deshmukh, H.M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540. Otros ligandos que se han conjugado con oligonucleótidos incluyen polietilenglicoles, agrupaciones de hidratos de carbono, agentes de reticulación, conjugados de porfirina, péptidos de administración y lípidos tales como colesterol.

En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico con oligonucleótidos da como resultado resistencia mejorada a nucleasas. Ejemplos representativos de ligandos catiónicos son propilamonio y dimetilpropilamonio. De manera interesante, se notificó que oligonucleótidos antisentido conservan su alta afinidad de unión a ARNm cuando el ligando catiónico se dispersaba por todo el oligonucleótido. Véase M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 y referencias citadas en el mismo.

El ARNbc conjugado con ligando de la invención puede sintetizarse mediante el uso de un ARNbc que lleva una funcionalidad reactiva colgante, tal como la derivada de la unión de una molécula de unión sobre el ARNbc. Este oligonucleótido reactivo puede reaccionar directamente con ligandos disponibles comercialmente, ligandos que se sintetizan que llevan cualquiera de una variedad de grupos protectores, o ligandos que tienen un resto de unión unido a los mismos. Los métodos de la invención facilitan la síntesis de ARNbc conjugado con ligando mediante el uso de, en algunas realizaciones preferidas, monómeros de nucleósido que se han conjugado apropiadamente con ligandos y que pueden unirse adicionalmente con un material de soporte sólido. Tales conjugados de ligandonucleósido, opcionalmente unidos a un material de soporte sólido, se preparan según algunas realizaciones preferidas de los métodos de la invención mediante la reacción de un ligando de unión a suero seleccionado con un resto de unión ubicado en la posición 5’ de un nucleósido u oligonucleótido. En ciertos casos, se prepara un ARNbc que lleva un ligando de aralquilo unido al extremo 3’ terminal del ARNbc uniendo covalentemente en primer lugar un elemento estructural de monómero a un soporte de vidrio de poro controlado mediante un grupo aminoalquilo de cadena larga. Entonces, se unen nucleótidos mediante técnicas de síntesis en fase sólida convencionales al elemento estructural de monómero unido al soporte sólido. El elemento estructural de monómero puede ser un nucleósido u otro compuesto orgánico que es compatible con la síntesis en fase sólida.

El ARNbc usado en los conjugados de la invención puede prepararse de manera conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para tal síntesis lo venden varios proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Puede emplearse adicional o alternativamente cualquier otro medio para tal síntesis conocido en la técnica. También se sabe usar técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados.

Pueden encontrarse enseñanzas referentes a la síntesis de oligonucleótidos modificados particulares en las siguientes patentes de EE.UU.: patentes de EE.UU. n. os 5.138.045 y 5.218.105, que describen oligonucleótidos conjugados con poliamina; la patente de EE.UU. n.º 5.212.295, que describe monómeros para la preparación de oligonucleótidos que tienen enlaces de fósforo quirales; patentes de EE.UU. n.os 5.378.825 y 5.541.307, que describen oligonucleótidos que tienen estructuras principales modificadas; la patente de EE.UU. n.º 5.386.023, que describe oligonucleótidos de estructura principal modificada y la preparación de los mismos a través de acoplamiento reductor; la patente de EE.UU. n.º 5.457.191, que describe nucleobases modificadas basadas en el sistema de anillos de 3-desazapurina y métodos de síntesis de los mismos; la patente de EE.UU. n.º 5.459.255, que describe nucleobases modificadas basadas en purinas N-2 sustituidas; la patente de EE.UU. n.º 5.521.302, que describe procedimientos para preparar oligonucleótidos que tienen enlaces de fósforo quirales; la patente de EE.UU. n.º 5.539.082, que describe ácidos nucleicos peptídicos; la patente de EE.UU. n.º 5.554.746, que describe oligonucleótidos que tienen estructuras principales de β-lactama; la patente de EE.UU. n.º 5.571.902, que describe métodos y materiales para la síntesis de oligonucleótidos; la patente de EE.UU. n.º 5.578.718, que describe nucleósidos que tienen grupos alquiltio, en la que tales grupos pueden usarse como ligadores con otros restos unidos en cualquiera de una variedad de posiciones del nucleósido; las patentes de EE.UU. n.os 5.587.361 y 5.599.797, que describen oligonucleótidos que tienen enlaces fosforotioato de alta pureza quiral; la patente de EE.UU. n.º 5.506.351, que describe procedimientos para la preparación de 2’-O-alquil-guanosina y compuestos relacionados, incluyendo compuestos de 2,6-diaminopurina; la patente de EE.UU. n.º 5.587.469, que describe oligonucleótidos que tienen purinas N-2 sustituidas; la patente de EE.UU. n.º 5.587.470, que describe oligonucleótidos que tienen 3-desazapurinas; la patente de EE.UU. n.º 5.223.618 y la patente de EE.UU. n.º 5.608.046, que describen ambos análogos de nucleósidos de 4’-desmetilo conjugados; las patentes de EE.UU. n.os

5.602.240 y 5.610,289, que describen análogos de oligonucleótidos de estructura principal modificada; las patentes de EE.UU. n.os 6.262.241 y 5.459.255, que describen, entre otros, métodos de síntesis de 2’-fluoro-oligonucleótidos.

En el ARNbc conjugado con ligando y los nucleósidos unidos específicos de secuencia que llevan molécula de ligando de la invención, los oligonucléotidos y oligonucleósidos pueden ensamblarse en un sintetizador de ADN

5 adecuado utilizando precursores de nucleótidos o nucleósidos, o precursores de conjugados de nucleótidos o nucleósidos que ya llevan el resto de unión, precursores de conjugados de ligando-nucleótido o nucleósido que ya llevan la molécula de ligando, o elementos estructurales que llevan ligando no nucleosídico.

Cuando se usan precursores de conjugados de nucleótidos que ya llevan un resto de unión, la síntesis de los nucleósidos unidos específicos de secuencia se completa normalmente, y la molécula de ligando se hace reaccionar entonces con el resto de unión para formar el oligonucleótido conjugado con ligando. Se han descrito previamente conjugados de oligonucleótidos que llevan una variedad de moléculas tales como esteroides, vitaminas, lípidos y moléculas indicadoras (véase Manoharan et al., solicitud PCT WO 93/07883). En una realización preferida, los oligonucleótidos o nucleósidos unidos de la invención se sintetizan mediante un sintetizador automático usando

15 fosforamiditas derivadas de conjugados de ligando-nucleósido además de las fosforamiditas convencionales y fosforamiditas no convencionales que están disponibles comercialmente y se usan de manera rutinaria en la síntesis de oligonucleótidos.

La incorporación de un grupo 2’-O-metilo, 2’-O-etilo, 2’-O-propilo, 2’-O-alilo, 2’-O-aminoalquilo o 2’-desoxi-2’-flúor en nucleósidos de un oligonucleótido confiere propiedades de hibridación potenciadas al oligonucleótido. Además, oligonucleótidos que contienen estructuras principales de fosforotioato tienen una estabilidad frente a nucleasas potenciada. Por tanto, nucleósidos unidos, funcionalizados de la invención pueden aumentarse para incluir cualquiera o tanto una estructura de fosforotioato como un grupo 2’-O-metilo, 2’-O-etilo, 2’-O-propilo, 2’-Oaminoalquilo, 2’-O-alilo o 2’-desoxi-2’-flúor. Se encuentra un resumen que enumera algunas de las modificaciones de

25 oligonucleótidos conocidas en la técnica en, por ejemplo, la publicación PCT WO 200370918.

En algunas realizaciones, se preparan secuencias de nucleósidos funcionalizados de la invención que poseen un grupo amino en el extremo 5’ terminal usando un sintetizador de ADN, y entonces se hacen reaccionar con un derivado de éster activo de un ligando seleccionado. Los expertos en la técnica conocen bien derivados de éster activo. Los ésteres activos representativos incluyen ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres tetrafluorofenólicos, ésteres pentafluorofenólicos y ésteres pentaclorofenólicos. La reacción del grupo amino y el éster activo produce un oligonucleótido en el que el ligando seleccionado se une a la posición 5’ a través de un grupo de unión. El grupo amino en el extremo 5’ terminal puede prepararse utilizando un reactivo C6 modificador de amino 5’. En una realización, pueden conjugarse moléculas de ligando con oligonucleótidos en la posición 5’ mediante el uso de una

35 fosforamidita de ligando-nucleósido en la que el ligando se une al grupo 5’-hidroxilo directa o indirectamente mediante un ligador. Tales fosforamiditas de ligando-nucleósido se usan normalmente al final de un procedimiento de síntesis automático para proporcionar un oligonucleótido conjugado con ligando que lleva el ligando en el extremo 5’ terminal.

Los ejemplos de estructuras principales o enlaces internucleosídicos modificados incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos incluyendo fosfonatos de 3’-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3’aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que tienen enlaces 3’-5’ normales, análogos de éstos unidos en 2’-5’ y

45 aquéllos que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están unidos de 3’-5’ a 5’-3’ o de 2’-5’ a 5’-2’. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Patentes de EE.UU. representativas que se refieren a la preparación de los enlaces que contienen átomos de fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. n.os, 3.687.808, 4.469.863, 4.476.301, 5.023.243, 5.177.196, 5.188.897, 5.264.423, 5.276.019, 5.278.302, 5.286.717, 5.321.131, 5.399.676, 5.405.939, 5.453.496, 5.455.233, 5.466.677, 5.476.925, 5.519.126, 5.536.821, 5.541.306, 5.550.111, 5.563.253, 5.571.799, 5.587.361, 5.625.050 y 5.697.248, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia.

Ejemplos de estructuras principales o enlaces internucleosídicos modificados que no incluyen un átomo de fósforo

55 en los mismos (es decir, oligonucleósidos) tienen estructuras principales que se forman mediante enlaces interazúcar de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces interazúcar de alquilo o cicloalquilo y heteroátomos mezclados, o uno o más enlaces interazúcar heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Éstos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otras que tienen partes de componentes de N, O, S, CH2 mezclados.

65 Las patentes de EE.UU. representativas que se refieren a la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. n.os. 5.034.506, 5.166.315, 5.185.444, 5.214.134, 5.216.141, 5.235.033,

5.264.562, 5.264.564, 5.405.938, 5.434.257, 5.466.677, 5.470.967, 5.489.677, 5.541.307, 5.561.225, 5.596.086, 5.602.240, 5.610.289, 5.602.240, 5.608.046, 5.610.289, 5.618.704, 5.623.070, 5.663.312, 5.633.366, 5.677.437 y 5.677.439, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia.

5 En ciertos casos, el oligonucleótido puede modificarse mediante un grupo que no es un ligando. Se han conjugado varias moléculas que no son ligandos con oligonucleótidos con el fin de potenciar la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido, y procedimientos para realizar tales conjugaciones están disponibles en la bibliografía científica. Tales restos que no son ligandos han incluido restos lipídicos, tales como colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manolaran et al.,

15 Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido adamantanacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys, Acta, 1995, 1246:229), o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de oligonucleótidos se han enumerado anteriormente. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de oligonucleótidos que llevan un aminoligador en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino se hace reaccionar entonces con la molécula que está conjugándose usando reactivos de activación o acoplamiento apropiados. La reacción de conjugación puede realizarse o bien con el oligonucleótido todavía unido al soporte sólido o bien tras la escisión del oligonucleótido en fase de disolución. La purificación del conjugado de

25 oligonucleótido mediante HPLC proporciona normalmente el conjugado puro. El uso de un conjugado de colesterol se prefiere particularmente puesto que un resto de este tipo puede aumentar el direccionamiento a células hepáticas, un sitio de expresión de PCSK9.

Agentes de iARN codificados por vectores

El ARNbc de la invención también puede expresarse a partir de vectores virales recombinantes de manera intracelular in vivo. Los vectores virales recombinantes de la invención comprenden secuencias que codifican para el ARNbc de la invención y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias de ARNbc. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras de ARN pol III U6 o H1 y el promotor de

35 citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia en la técnica. Los vectores virales recombinantes de la invención también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNbc en un tejido particular o en un entorno intracelular particular. El uso de vectores virales recombinantes para administrar ARNbc de la invención a células in vivo se comenta en más detalle a continuación.

El ARNbc de la invención puede expresarse a partir de un vector viral recombinante o bien como dos moléculas de ARN separadas, complementarias, o bien como una única molécula de ARN con dos regiones complementarias.

Puede usarse cualquier vector viral que pueda aceptar las secuencias codificantes para la(s) molécula(s) de ARNbc que va(n) a expresar(se), por ejemplo vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociado (VAA); retrovirus

45 (por ejemplo, lentivirus (LV), rabdovirus, virus de la leucemia murina); virus del herpes, y similares. El tropismo de los vectores virales puede modificarse mediante pseudotipado de los vectores con proteínas de la envuelta u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápsida viral, según sea apropiado.

Por ejemplo, pueden pseudotiparse vectores lentivirales de la invención con proteínas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VEV), rabia, Ebola, Mokola, y similares. Pueden prepararse vectores de VAA de la invención para seleccionar como diana diferentes células modificando mediante ingeniería genética los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápsida. Por ejemplo, un vector de VAA que expresa una cápsida de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina VAA 2/2. Este gen de la cápsida de serotipo 2 en el vector VAA 2/2 puede reemplazarse por un gen de la cápsida de serotipo 5 para producir un vector VAA 2/5. Técnicas para construir

55 vectores de VAA que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápsida están dentro de la experiencia en la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz J .E et al. (2002), J Virol 76:791-801, cuya descripción completa se incorpora en el presente documento como referencia.

La selección de vectores virales recombinantes adecuados para su uso en la invención, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNbc en el vector, y métodos de administración del vector viral a las células de interés están dentro de la experiencia en la técnica. Véase, por ejemplo, Domburg R (1995); Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1:5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; y Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33; 401-406, cuya descripción completa se incorpora en el presente documento como referencia.

65 Vectores virales preferidos son los derivados de AV y VAA. En una realización particularmente preferida, el ARNbc de la invención se expresa como dos moléculas de ARN monocatenario separadas, complementarias a partir de un vector de VAA recombinante que comprende, por ejemplo, o bien los promotores de ARN U6 o H1, o bien el promotor de citomegalovirus (CMV).

5 Un vector de AV adecuado para la expresión del ARNbc de la invención, un método para construir el vector de AV recombinante, y un método para administrar el vector al interior de las células diana se describen en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010.

Vectores de VAA adecuados para expresar el ARNbc de la invención, métodos para construir el vector de AV recombinante, y métodos para administrar los vectores al interior de células diana se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-523; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; patente de EE.UU. n.º 5.252.479; patente de EE.UU. n.º 5.139.941; solicitud de patente internacional n.º WO 94/1388 y solicitud de patente internacional n.º WO 93/24641, cuyas descripciones completas se incorporan en el presente documento como referencia.

III. Composiciones farmacéuticas que comprenden ARNbc

En una realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un ARNbc, tal como se describe en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que comprende el ARNbc es útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad del gen PCSK9, tal como procesos patológicos que pueden mediarse por la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, tales como hiperlipidemia. Tales composiciones farmacéuticas se formulan basándose en el modo de administración. Un ejemplo son composiciones que se formulan para su administración al hígado mediante administración parenteral.

25 Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión del gen PCSK9. Los presentes inventores han encontrado que, debido a su eficacia mejorada, las composiciones que comprenden el ARNbc de la invención pueden administrarse a dosificaciones sorprendentemente bajas. Una dosificación de 5 mg de ARNbc por kilogramo de peso corporal del receptor al día es suficiente para inhibir o suprimir la expresión del gen PCSK9 y puede administrarse de manera sistémica al paciente.

En general, una dosis adecuada de ARNbc estará en el intervalo de 0,01 a 5,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, generalmente en el intervalo de 1 microgramo a 1 mg por kilogramo de peso corporal al día. La composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o el ARNbc puede administrarse como dos,

35 tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo de todo el día o incluso usando infusión continua o administración a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNbc contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño con el fin de lograr la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede componerse para su administración a lo largo de varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona liberación sostenida del ARNbc a lo largo de un periodo de varios días. Se conocen bien en la técnica formulaciones de liberación sostenida.

El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y programación requeridas para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad el sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto

45 con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos. Pueden hacerse estimaciones de dosificaciones eficaces y semividas in vivo para los ARNbc individuales abarcados por la invención usando metodologías convencionales o basándose en pruebas in vivo usando un modelo animal apropiado, tal como se describe en otra parte en el presente documento.

Avances en la genética del ratón han generado varios modelos de ratón para el estudio de diversas enfermedades humanas, tales como procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9. Tales modelos se usan para pruebas in vivo de ARNbc, así como para determinar una dosis terapéuticamente eficaz

55 Puede usarse cualquier método para administrar un ARNbc de la presente invención a un mamífero. Por ejemplo, la administración puede ser directa; oral; o parenteral (por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intraventricular, intramuscular o intraperitoneal, o mediante goteo intravenoso). La administración puede ser rápida (por ejemplo, mediante inyección), o puede producirse a lo largo de un periodo de tiempo (por ejemplo, mediante infusión lenta o administración de formulaciones de liberación lenta).

Normalmente, cuando se trata un mamífero con hiperlipidemia, las moléculas de ARNbc se administran de manera sistémica por medios parenterales. Pueden administrarse por vía intravenosa a un paciente, por ejemplo, ARNbc conjugados o no conjugados o formulados con o sin liposomas. Para ello, puede formularse una molécula de ARNbc en composiciones tales como disoluciones acuosas, disoluciones no acuosas estériles y no estériles en disolventes 65 comunes tales como alcoholes, o disoluciones en bases de aceite líquidas o sólidas. Tales disoluciones pueden contener también tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Para administración parenteral, intratecal, o

intraventricular, puede formularse una molécula de ARNbc en composiciones tales como disoluciones acuosas estériles, que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados (por ejemplo, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores farmacéuticamente aceptables).

5 Además, pueden administrarse moléculas de ARNbc a un mamífero mediante medios biológicos o abiológicos tal como se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 6.271.359. Puede lograrse la administración abiológica mediante una variedad de métodos incluyendo, sin limitación, (1) cargar liposomas con una molécula de ARNbc proporcionada en el presente documento y (2) complejar una molécula de ARNbc con lípidos o liposomas para formar complejos de ácido nucleico-lípido o ácido nucleico-liposoma. El liposoma puede estar compuesto por lípidos catiónicos y neutros comúnmente usados para transfectar células in vitro. Pueden complejarse lípidos catiónicos (por ejemplo, asociados a carga) con ácidos nucleicos cargados negativamente para formar liposomas. Los ejemplos de liposomas catiónicos incluyen, sin limitación, lipofectina, lipofectamina, lipofectace y DOTAP. Se conocen bien en la técnica procedimientos para formar liposomas. Pueden formarse composiciones de liposomas, por ejemplo, a partir de fosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilglicerol o

15 dioleoilfosfatidiletanolamina. Están disponibles comercialmente numerosos agentes lipófilos, incluyendo Lipofectin.RTM. (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif) y Effectene.TM. (Qiagen, Valencia, Calif.). Además, pueden optimizarse los métodos de administración sistémica usando lípidos catiónicos disponibles comercialmente tales como DDAB o DOTAP, cada uno de los cuales puede mezclarse con un lípido neutro tal como DOPE o colesterol. En algunos casos, pueden usarse liposomas tales como los descritos por Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997)). En otras realizaciones, pueden usarse policationes tales como polietilenimina para lograr la administración in vivo y ex vivo (Boletta et al., J. Am Soc, Nephrol. 7: 1 1728 (1996)). Puede encontrarse información adicional referente al uso de liposomas para administrar ácidos nucleicos en la patente de EE.UU. n.º 6.271.359, publicación PCT WO 96/40964 y Morrissey, D. et al. 2005. Nat Biotechnol. 23(8):1002-7.

25 Puede lograrse la administración biológica mediante una variedad de métodos incluyendo, sin limitación, el uso de vectores virales. Por ejemplo, pueden usarse vectores virales (por ejemplo, vectores de adenovirus y virus del herpes) para administrar moléculas de ARNbc a células hepáticas. Pueden usarse técnicas de biología molecular convencionales para introducir uno o más de los ARNbc proporcionados en el presente documento en uno de los muchos vectores virales diferentes desarrollados para administrar ácido nucleico a células. Estos vectores virales resultantes pueden usarse para administrar el uno o más ARNbc a células mediante, por ejemplo, infección.

Pueden formularse ARNbc de la presente invención en un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Un “portador farmacéuticamente aceptable” (también denominado en el presente documento “excipiente”) es un agente de suspensión, disolvente farmacéuticamente aceptable o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte.

35 Portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos, sólidos y pueden seleccionarse teniendo en cuenta la manera de administración planeada para proporcionar la consistencia, el volumen deseado y otras propiedades químicas y de transporte pertinentes. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación: agua; solución salina, agentes de unión (por ejemplo, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, gelatina o sulfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, almidón, polietilenglicol o acetato de sodio); disgregantes (por ejemplo, almidón o glicolato sódico de almidón); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio).

Además, el ARNbc que selecciona como diana el gen PCSK9 puede formularse en composiciones que contienen el ARNbc mezclado, encapsulado, conjugado, o asociado de otra manera con otras moléculas, estructuras

45 moleculares, o mezclas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, una composición que contiene uno o más agentes de ARNbc que seleccionan como diana el gen PCSK9 pueden contener otros agentes terapéuticos tales como otros agentes hipolipemiantes (por ejemplo, estatinas).

Métodos para tratar enfermedades que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la expresión de PCSK9

Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento pueden usarse para tratar enfermedades y estados que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar la hiperlipidemia y otras

55 formas de desequilibrio de lípidos tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y los estados patológicos asociados con estos trastornos tales como enfermedades circulatorias y cardiacas.

Métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9

También se describe un método para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un mamífero. El método comprende administrar una composición de la invención al mamífero de manera que la expresión del gen PCSK9 diana se silencie. Debido a su alta especificidad, los ARNbc de la invención seleccionan como diana específicamente ARN (primarios o procesados) del gen PCSK9 diana. Pueden realizarse composiciones y métodos para inhibir la expresión de estos genes PCSK9 usando ARN tal como se describe en otra parte en el presente documento.

65 El método puede comprender administrar una composición que comprende un ARNbc, en el que el ARNbc comprende un secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN del gen PCSK9 del mamífero que va a tratarse. Cuando el organismo que va a tratarse es un mamífero tal como un ser humano, la composición puede administrarse mediante cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a vías orales o parenterales, incluyendo administración intravenosa, intramuscular, subcutánea,

5 transdérmica, a las vías respiratorias (aerosol). En realizaciones preferidas, las composiciones se administran mediante inyección o infusión intravenosa.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica y las pruebas de la invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Ejemplos

15 Paseo génico del gen PCSK9

Se llevó a cabo el diseño de ARNic para identificar en dos selecciones separadas

a) ARNic que seleccionan como diana ARNm de PCSK9 o bien de ratón o bien de rata y humano, y

b) todos los ARNic reactivos humanos con especificidad pronosticada con el gen diana PCSK9.

Se usaron secuencias de ARNm para PCSK9 de ser humano, ratón y rata: Se usó la secuencia humana 25 NM_174936.2 como secuencia de referencia durante el procedimiento de selección de ARNic completo.

Se identificaron tramos de 19 meros conservados en ser humano y ratón, y secuencias de ARNm de PCSK9 de ser humano y rata en la primera etapa, dando como resultado la selección de ARNic que reaccionan de manera cruzada con dianas de ser humano y ratón, y ARNic que reaccionan de manera cruzada con dianas de ser humano y rata

Se identificaron en una segunda selección de ARNic que seleccionan como diana específicamente PCSK9 humano. Se extrajeron todas las posibles secuencias de 19 meros de PCSK9 humano y se definieron como secuencias diana candidatas. Se enumeran todas las secuencias que reaccionan de manera cruzada con ser humano, mono y las que reaccionan de manera cruzada con ratón, rata, ser humano y mono en las tablas 1 y 2. También se enumeran

35 versiones químicamente modificadas de esas secuencias y su actividad en ensayos tanto in vitro como in vivo en las tablas 1 y 2 y los ejemplos facilitados en las figuras 2-8.

Con el fin de clasificar secuencias diana candidatas y sus ARNic correspondientes y seleccionar las apropiadas, se tomó su potencial pronosticado para interaccionar con dianas irrelevantes (potencial inespecífico) como parámetro de clasificación. Se definieron ARNic con potencial inespecífico bajo como preferibles y se supuso que eran más específicos in vivo.

Para pronosticar el potencial inespecífico específico de ARNic, se hicieron las siguientes suposiciones:

45 1) las posiciones 2 a 9 (contando de 5’ a 3’) de una hebra (región semilla) pueden contribuir más al potencial inespecífico que el resto de la secuencia (región de sitio de escisión y no semilla)

2) las posiciones 10 y 11 (contando de 5’ a 3’) de una hebra (región de sitio de escisión) pueden contribuir más al potencial inespecífico que la región no semilla

3) las posiciones 1 y 19 de cada hebra no son relevantes para las interacciones inespecíficas

4) puede calcularse una puntuación inespecífica para cada gen y cada hebra, basándose en la complementariedad de la secuencia de la hebra de ARNic en la secuencia del gen y la posición de apareamientos erróneos

55 5) deben considerarse el número de efectos inespecíficos pronosticados así como la puntuación inespecífica más alta para determinar el potencial inespecífico

6) las puntaciones inespecíficas deben considerarse más relevantes para el potencial inespecífico que los números de efectos inespecíficos

7) suponiendo una posible supresión de la actividad de la hebra sentido por las modificaciones internas introducidas, sólo será relevante el potencial inespecífico de la hebra antisentido.

65 Para identificar posibles genes inespecíficos, se sometieron secuencias candidatas de 19 meros a una búsqueda de homología frente a secuencias de ARNm humanas públicamente disponibles.

Se extrajeron las siguientes propiedades inespecíficas para cada secuencia de entrada de 19 meros para cada gen inespecífico para calcular la puntuación inespecífica:

5 Número de apareamientos erróneos en la región no semilla

Número de apareamientos erróneos en la región semilla

Número de apareamientos erróneos en la región de sitio de escisión

10 Se calculó la puntuación inespecífica considerando las suposiciones 1 a 3 tal como sigue:

Puntuación inespecífica = número de apareamientos erróneos semilla * 10

15 + número de apareamientos erróneos del sitio de escisión * 1,2

+ número de apareamientos erróneos no semilla * 1

Se definió el gen inespecífico más relevante para cada ARNic correspondiente a la secuencia de 19 meros de

20 entrada como el gen con la menor puntuación inespecífica. Por consiguiente, se definió la menor puntuación inespecífica como la puntuación inespecífica relevante para cada ARNic.

Síntesis de ARNbc

25 Fuente de reactivos

Cuando la fuente de un reactivo no se facilita específicamente en el presente documento, tal reactivo puede obtenerse de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular con una calidad/pureza convencional para su aplicación en biología molecular.

30 Síntesis de ARNic

Se produjeron ARN monocatenarios mediante síntesis en fase sólida en una escala de 1 μmol usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio de poro 35 controlado (CPG, 500 Å, Proligo Biochemic GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. Se generaron ARN y ARN que contenía nucleótidos de 2’-O-metilo mediante síntesis en fase sólida empleando las correspondientes fosforamiditas y fosforamiditas de 2’-O-metilo, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Se incorporaron estos elementos estructurales en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena oligorribonucleotídica usando química de fosforamidita de nucleósidos convencional tal como se describe en Current

40 protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al, (Edrs), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU. Se introdujeron enlaces de fosforotioato mediante el reemplazamiento de la disolución de oxidante de yodo por una disolución del reactivo de Beaucage (Cruachem Ltd, Glasgow, GB) en acetonitrilo (1%). Se obtuvieron reactivos auxiliares adicionales de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).

45 Se llevó a cabo la desprotección y purificación de los oligorribonucleótidos brutos mediante HPLC de intercambio aniónico según procedimientos establecidos. Se determinaron los rendimientos y las concentraciones mediante la absorción de UV de una disolución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm usando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleissheim, Alemania). Se generó ARN bicatenario mezclando una disolución equimolar de hebras complementarias en tampón de apareamiento (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8;

50 cloruro de sodio 100 mM), se calentó en un baño de agua a 85 – 90ºC durante 3 minutos y se enfrió hasta temperatura ambiente a lo largo de un periodo de 3 - 4 horas. Se almacenó la disolución de ARN apareado a -20ºC hasta su uso.

Para la síntesis de ARNic conjugados con colesterol en 3’ (denominados en el presente documento -Col-3’), se usó

55 un soporte sólido apropiadamente modificado para la síntesis de ARN. Se preparó el soporte sólido modificado tal como sigue:

Dietil-2-azabutano-1,4-dicarboxilato AA Se añadió una disolución acuosa 4,7 M de hidróxido de sodio (50 ml) en una disolución enfriada con hielo, con agitación de clorhidrato de glicinato de etilo (32,19 g, 0,23 mol) en agua (50 ml). Entonces, se añadió acrilato de etilo (23,1 g, 0,23 mol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente hasta que se determinó el final de la reacción mediante CCF. Tras 19 h, se repartió la disolución con diclorometano (3 x 100 ml). Se secó la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó. Se destiló el residuo produciendo AA (28,8 g, 61%).

Éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB

10 Se disolvió ácido Fmoc-6-amino-hexanoico (9,12 g, 25,83 mmol) en diclorometano (50 ml) y se enfrió con hielo. Se añadió diisopropilcarbodiimida (3,25 g, 3,99 ml, 25,83 mmol) a la disolución a 0ºC. Entonces a esto le siguió la adición de dietil-azabutano-1,4-dicarboxilato (5 g, 24,6 mmol) y dimetilaminopiridina (0,305 g, 2,5 mmol). Se llevó la disolución a temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante 6 h. Se determinó la finalización de la reacción

15 mediante CCF. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y se añadió acetato de etilo para precipitar la diisopropilurea. Se filtró la suspensión. Se lavó el filtrado con ácido clorhídrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio al 5% y agua. Se secó la fase orgánica combinada sobre sulfato de sodio y se concentró proporcionando el producto bruto que se purificó mediante cromatografía en columna (EtOAC al 50%/hexano) produciendo 11,87 g (88%) de AB.

20 Éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC

Se disolvió éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}

25 propiónico AB (11,5 g, 21,3 mmol) en piperidina al 20% en dimetilformamida a 0ºC. Se continuó agitando la disolución durante 1 h. Se concentró la mezcla de reacción a vacío, se añadió agua al residuo y se extrajo el producto con acetato de etilo. Se purificó el producto bruto mediante conversión en su sal de clorhidrato.

Éster etílico del ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro30 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}etoxicarbonilmetil-amino)-propiónico AD

Se llevó la sal de clorhidrato del éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC

35 (4,7 g, 14,8 mmol) a diclorometano. Se enfrió la suspensión hasta 0ºC sobre hielo. A la suspensión se le añadió diisopropiletilamina (3,87 g, 5,2 ml, 30 mmol). A la disolución resultante se le añadió cloroformiato de colesterilo (6,675 g, 14,8 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante la noche. Se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con ácido clorhídrico al 10%. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida (10,3 g, 92%).

Éster etílico del ácido 1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidin-3-carboxílico AE

Se suspendió t-butóxido de potasio (1,1 g, 9,8 mmol) en 30 ml de tolueno seco. Se enfrió la mezcla hasta 0ºC sobre

10 hielo y se añadieron lentamente 5 g (6,6 mmol) de diéster AD con agitación en el plazo de 20 min. Se mantuvo la temperatura por debajo de 5ºC durante la adición. Se continuó la agitación durante 30 min. a 0ºC y se añadió 1 ml de ácido acético glacial, seguido inmediatamente por 4 g de NaH2PO4H2O en 40 ml de agua. Se extrajo dos veces la mezcla resultante con 100 ml de diclorometano cada una y se lavaron dos veces los extractos orgánicos combinados con 10 ml de tampón fosfato cada una, se secaron y se evaporaron hasta sequedad. Se disolvió el

15 residuo en 60 ml de tolueno, se enfrió hasta 0ºC y se extrajo con tres porciones de 50 ml de tampón carbonato a pH 9,5 frío. Se ajustaron los extractos acuosos hasta pH 3 con ácido fosfórico, y se extrajeron con cinco porciones de 40 ml de cloroformo que se combinaron, se secaron y se evaporaron hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna usando acetato de etilo al 25%/hexano produciendo 1,9 g de b-cetoéster (39%).

20 Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1Hciclopenta[a]fenantren-3-ílico del ácido [6-(3-hidroxi-4-hidroximetil-pirrolidin-1-il)-6-oxo-hexil]-carbámico AF

25 Se añadió gota a gota metanol (2 ml) a lo largo de un periodo de 1 h a una mezcla a reflujo de b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 mmol) y borohidruro de sodio (0,226 g, 6 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml). Se continuó la agitación a temperatura de reflujo durante 1 h. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se añadió HCl 1 N (12,5 ml), se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 x 40 ml). Se secó la fase de acetato de etilo combinada sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a vacío produciendo el producto que se purificó mediante cromatografía en columna (MeOH

30 al 10%/CHCl3) (89%).

Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1Hciclopenta[a]fenantren-3-ílico del ácido (6-{3-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidroxi-pirrolidin-1-il}-6-oxohexil)-carbámico AG

35 Se secó diol AF (1,25 g 1,994 mmol) evaporando con piridina (2 x 5 ml) a vacío. Se añadieron piridina anhidra (10 ml) y cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (0,724 g, 2,13 mmol) con agitación. Se llevó a cabo la reacción a temperatura

5 ambiente durante la noche. Se extinguió la reacción mediante la adición de metanol. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y al residuo se le añadió diclorometano (50 ml). Se lavó la fase orgánica con bicarbonato de sodio acuoso 1 M. Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró. Se eliminó la piridina residual evaporando con tolueno. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna (MeOH al 2%/cloroformo, Rf = 0,5 en MeOH al 5%/CHCl3) (1,75 g, 95%).

10 Éster mono-(4-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]hexanoil}pirrolidin-3-ílico) del ácido succínico AH

Se mezcló el compuesto AG (1,0 g, 1,05 mmol) con anhídrido succínico (0,150 g, 1,5 mmol) y DMAP (0,073 g, 0,6 mmol) y se secó a vacío a 40ºC durante la noche. Se disolvió la mezcla en dicloroetano anhidro (3 ml), se añadió trietilamina (0,318 g, 0,440 ml, 3,15 mmol) y se agitó la disolución a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón

20 durante 16 h. Entonces se diluyó con diclorometano (40 ml) y se lavó con ácido cítrico acuoso enfriado con hielo (al 5% en peso, 30 ml) y agua (2 X 20 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró hasta sequedad. Se usó el residuo como tal para la siguiente etapa.

CPG derivatizado con colesterol AI 25

Se disolvió succinato AH (0,254 g, 0,242 mmol) en una mezcla de diclorometano/acetonitrilo (3:2, 3 ml). A esa disolución se le añadieron sucesivamente DMAP (0,0296 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (1,25 ml), 2,2’-ditio-bis(55 nitropiridina) (0,075 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1,25 ml). A la disolución resultante se le añadió trifenilfosfina (0,064 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (0,6 ml). La mezcla de reacción se volvió de color naranja brillante. Se agitó brevemente la disolución usando un agitador con movimiento de muñeca (5 min.). Se añadió alquilamina de cadena larga-CPG (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM). Se agitó la suspensión durante 2 h. Se filtro el CPG a través de un embudo sinterizado y se lavó con acetonitrilo, diclorometano y éter sucesivamente. Se enmascararon

10 los grupos amino sin reaccionar usando anhídrido acético/piridina. Se midió la carga lograda del CPG tomando la medición de UV (37 mM/g).

Se realizó la síntesis de ARNic que portan un grupo bisdecilamida del ácido 5’-12-dodecanoico (en el presente documento denominado “5’-C32-”) o un grupo derivado de 5’-colesterilo (en el presente documento denominado “5’

15 Col-”) tal como se describe en el documento WO 2004/065601, excepto porque, para el derivado de colesterilo, se realizó la etapa de oxidación usando el reactivo de Beaucage con el fin de introducir un enlace fosforotioato en el extremo 5’ del oligómero de ácido nucleico.

Se representan a continuación secuencias de ácido nucleico usando nomenclatura convencional, y específicamente 20 las abreviaturas de la tabla 1-2.

Tabla 1-2: Abreviaturas de monómeros de nucleótidos usadas en la representación de secuencias de ácido nucleico. Debe entenderse que estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están unidos mutualmente por enlaces 5’-3’-fosfodiéster.

Abreviaturaa

Nucleótido(s)

A, a

2’-desoxi-adenosin-5’-fosfato, adenosin-5’-fosfato

C, c

2’-desoxi-citidin-5’-fosfato, citidin-5’-fosfato

G, g

2’-desoxi-guanosin-5’-fosfato, guanosin-5’-fosfato

T, t

2’-desoxi-timidin-5’-fosfato, timidin-5’-fosfato

U, u

2’-desoxi-uridin-5’-fosfato, uridin-5’-fosfato

N, n

cualquier 2’-desoxi-nucleótido/nucleótido (G, A, C, o T, g, a, c o u)

Am

2’-O-metiladenosin-5’-fosfato

Cm

2’-O-metilcitidin-5’-fosfato

Gm

2’-O-metilguanosin-5’-fosfato

Tm

2’-O-metil-timidin-5’-fosfato

Um

2’-O-metiluridin-5’-fosfato

Af

2’-fluoro-2’-desoxi-adenosin-5’-fosfato

Cf

2’-fluoro-2’-desoxi-citidin-5’-fosfato

Gf

2’-fluoro-2’-desoxi-guanosin-5’-fosfato

Tf

2’-fluoro-2’-desoxi-timidin-5’-fosfato

Uf

2’-fluoro-2’-desoxi-uridin-5’-fosfato

A, C, G, T, U, a, c, g, t, u

subrayado; nucleósido-5’-fosforotioato

am, cm, gm, tm, um

subrayado: 2-O-metil-nucleósido-5’-fosforotioato

aletras mayúsculas representan 2’-desoxirribonucleótidos (ADN), letras minúsculas representan ribonucleótidos (ARN)

La selección de ARNic de PCSK9 en HuH7, HepG2, Hela y hepatocitos de mono primarios descubre secuencias 5 altamente activas

Se obtuvieron células HuH-7 del banco de células de la JCRB (”Japanese Collection of Research Bioresources”) (Shinjuku, Japón, n.º de cat.; JCRB0403). Se cultivaron células en MEM de Dulbecco (Biochrom AG, Berlín. Alemania, n.º de cat. F0435) complementado para contener un 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Biochrom AG, 10 Berlín, Alemania, n.º de cat. S0115), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 og/ml (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.º de cat. A2213) y L-glutamina 2 mM (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.º de cat. K0282) a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO2 en una incubadora humidificada (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania). Se obtuvieron células HepG2 y Hela de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD, n.º de cat. HB-8065) y se cultivaron en MEM (Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, n.º de cat. 21090-022)

15 complementado para contener un 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.º de cat., S0115), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 og/ml (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.º de cat. A2213), aminoácidos no esenciales 1x (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.º de cat. K-0293) y piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.º de cat. L-0473) a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO2 en una incubadora humidificada (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania).

20 Para la transfección con ARNic, se sembraron células HuH7, HepG2 o Hela a una densidad de 2,0 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se transfectaron directamente. Se llevó a cabo la transfección de ARNic (30 nM para la selección de dosis única) con lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, n.º de cat. 11668-019) tal como se describe por el fabricante.

25 24 horas tras la transfección, se lisaron las células HuH7 y HspG2 y se cuantificaron los niveles de ARNm de PCSK9 con el kit Quantigene Explore (Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, EE.UU., n.º de cat. QG-000-02) según el protocolo. Se normalizaron los niveles de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de GAP-DH. Para cada ARNic se recogieron los ocho puntos de datos individuales. Se usaron dúplex de ARNic no relacionados con el gen PCSK9

30 como control. Se expresó la actividad de un dúplex de ARNic específico para PCSK9 dado como el porcentaje de concentración de ARNm de PCSK9 en células tratadas con respecto a concentración de ARNm de PCSK9 en células tratadas con el dúplex de ARNic control.

Se obtuvieron hepatocitos de mono Cynomolgus primarios (crioconservados) de In vitro Technologies, Inc. 35 (Baltimore, Maryland, EE.UU., n.º de cat. M00305) y se cultivaron en medio In vitroGRO CP (n.º de cat. Z99029) a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO2 en una incubadora humidificada.

Para la transfección con ARNic, se sembraron células de mono Cynomolgus primarias sobre placas recubiertas con colágeno (Fisher Scientific, n.º de cat. 08-774-5) a una densidad de 3,5 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos

40 y se transfectaron directamente. Se llevó a cabo la transfección de ARNic (ocho series de dilución de dos veces partiendo de 30 nM) por duplicado con lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, n.º de cat. 11668019) tal como se describe por el fabricante.

16 horas tras la transfección, se cambió el medio por medio In vitroGRO CP nuevo con mezcla de antibióticos 45 Torpedo (In vitro Technologies, Inc, n.º de cat. Z99000) añadida.

24 horas tras el cambio del medio, se lisaron las células de mono Cynomolgus primarias y se cuantificaron los niveles de ARNm de PCSK9 con el kit Quantigene Explore (Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, EE.UU., n.º de cat. QG-000-02) según el protocolo. Se normalizaron los niveles de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de

50 GAPDH. Entonces se compararon las razones de PCSK9/GAPDH normalizadas con la razón de PCSK9/GAPDH de lipofectamine 2000 sólo control.

Las tablas 1-2 (y la figura 6) resumen los resultados y proporcionan ejemplos de exámenes in vitro en diferentes líneas celulares a diferentes dosis. Se expresó el silenciamiento del transcrito de PCSK9 como el porcentaje de 55 transcrito restante a una dosis dada. Secuencias altamente activas son aquéllas con menos del 70% de transcrito restante tras el tratamiento con un ARNic dado a una dosis inferior o igual a 100 nm. Secuencias muy activas son aquéllas que tienen menos del 60% de transcripto restante tras el tratamiento con una dosis inferior o igual a 100 nM. Secuencias activas son aquéllas que tienen menos del 85% de transcripto restante tras el tratamiento con una dosis alta (100 nM). También se seleccionaron ejemplos de ARNic activos in vivo en ratón en formulaciones de

60 lipidoides tal como se describe a continuación. Las secuencias activas in vitro también eran generalmente activas in vivo (véase la figura 6 por ejemplo).

Examen de eficacia in vivo de ARNic de PCSK9 Procedimiento de formulación

Se usaron el lipidoide LNP-01·4HCl (PM 1487) (figura 1), colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-ceramida C16 (Avanti

5 Polar Lipids) para preparar nanopartículas de lípido-ARNic. Se prepararon disoluciones madre de cada uno en etanol: LNP-01, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramida C16, 100 mg/ml. Entonces se combinaron las disoluciones madre de LNP-01, colesterol y PBG-ceramida C16 en una razón molar de 42:48:10. Se mezcló rápidamente la disolución de lípidos combinada con ARNic acuoso (en acetato de sodio pH 5) de manera que la concentración en etanol final era del 35-45% y la concentración en acetato de sodio final era de 100-300 mM. Se

10 formaron nanopartículas de lípido-ARNic espontáneamente tras el mezclado. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseada, se extruyó la mezcla de nanopartículas resultante en algunos casos a través de una membrana de policarbonato (100 nm de corte) usando una prensa extrusora de termobarril (Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc). En otros casos, se omitió la etapa de extrusión. Se logró la eliminación del etanol y el intercambio de tampón simultáneo mediante o bien diálisis o bien filtración de flujo tangencial. Se intercambió el tapón por solución

15 salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2.

Caracterización de formulaciones

Las formulaciones preparadas mediante el método o bien convencional o bien libre de extrusión se caracterizan de

20 una manera similar. En primer lugar, se caracterizan las formulaciones mediante inspección visual. Deben ser disoluciones translúcidas blanquecinas libres de agregados o sedimento. Se miden el tamaño de partícula y la distribución de tamaño de partícula de nanopartículas de lípidos mediante dispersión de luz dinámica usando un instrumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EE.UU.). Las partículas deben tener 20-300 nm, e idealmente, 40100 nm de tamaño. La distribución del tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración de ARNic total en la

25 formulación, así como la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de tinte. Se incuba una muestra del ARNic formulado con el tinte de unión a ARN Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de un tensioactivo que altera la formulación, Triton-X100 al 0,5%. Se determina el ARNic total en la formulación mediante la señal de la muestra que contiene el tensioactivo, en relación con una curva patrón. Se determina la fracción atrapada restando el contenido en ARNic “libre” (tal como se mide mediante la señal en la ausencia de

30 tensioactivo) del contenido en ARNic total. El porcentaje de ARNic atrapado es normalmente >85%.

Dosificación en bolo

Se realizó la dosificación en bolo de ARNic formulados en ratones C57/BL6 (5/grupo, 8-10 semanas de edad,

35 Charles River Laboratories, MA) mediante inyección en la vena de la cola usando una aguja 27G. Se formularon los ARNic en LNP-10 (y entonces se dializaron contra PBS) a una concentración de 0,5 mg/ml permitiendo la administración de la dosis de 5 mg/kg en 10 ol/g de peso corporal. Se mantuvieron los ratones bajo una lámpara infrarroja durante aproximadamente 3 min. antes de la dosificación para facilitar la inyección.

40 48 horas tras la dosificación, se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO2. Se recogieron 0,2 ml de sangre mediante hemorragia retroorbital y se extrajo el hígado y se congeló en nitrógeno líquido. Se almacenaron el suero y los hígados a -80ºC.

Se trituraron los hígados congelados usando un triturador criogénico 6850 Freezer/Mill (SPEX CentriPrep, Inc) y se 45 almacenaron los polvos a -80ºC hasta el análisis.

Se detectaron los niveles de ARNm de PCSK9 usando el kit basado en tecnología de ADN ramificado del sistema de reactivos QuantiGene (Genospectra) según el protocolo. Se lisaron 10-20 mg de polvos de hígado congelado en 600 ul de proteinasa K 0,16 ug/ml (Epicentre, n.º MPRK092) en disolución de lisis celular y tisular (Epicentre, n.º 50 MTC096H) a 65ºC durante 3 horas. Entonces se añadieron 10 ul de los lisados a 90 ul de reactivo de trabajo de lisis (1 volumen o mezcla de lisis madre en dos volúmenes de agua) y se incubaron a 52ºC durante la noche sobre placas de captura Genospectra con conjuntos de sondas específicas para PCSK9 de ratón y GAPDH de ratón o ciclofilina B. Se seleccionaron secuencias de ácido nucleico para las sondas de extensor de captura (CE), extensor de marcador (LE) y bloqueante (BL) a partir de las secuencias de ácido nucleico de PCSK9, GAPDH y ciclofilina B

55 con la ayuda del software QuantiGene ProbeDesigner 2.0 (Genospectra, Fremont, CA, EE.UU., n.º de cat. QG-00202). Se leyó la quimioluminescencia en un instrumento Victor2-Light (Perkin Elmer) como unidades de luz relativas. Se calculó el promedio de la razón de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de GAPDH o de ciclofilina B en lisados de hígado en cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo control tratado con PBS o un grupo control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación sanguínea).

60 Se midió el colesterol sérico total en suero de ratón usando el kit StanBio Cholesterol LiquiColor (StanBio Laboratoriy, Boerne, Texas, EE.UU.) según instrucciones del fabricante. Se tomaron las mediciones en un contador multimarcador Victor2 1420 (Perkin Elmer) a 495 nm.

65 Ejemplos

Se sometieron a prueba 32 ARNic de PCSK9 formulados en liposomas de LNP-01 in vivo en un modelo de ratón. Se realizó el experimento a una dosis de ARNic de 5 mg/kg y al menos 10 ARNic de PCSK9 mostraron más del 40% de inactivación de ARNm de PCSK9 en comparación con un grupo control tratado con PBS, mientras que el grupo control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación sanguínea) no tuvo ningún efecto (figuras 25 5). El silenciamiento del transcrito de PCSK9 también se correlacionaba con una reducción del colesterol en estos animales (figuras 4-5). Además, había una fuerte correlación entre las moléculas que eran activas in vitro y las activas in vivo (figura 6). También se seleccionaron secuencias que contenían diferentes modificaciones químicas in vitro (tablas 1 y 2) e in vivo. Como ejemplo, se sometieron a prueba las secuencias menos modificadas 9314 y 9318, y versiones más modificadas de esta secuencia 9314-(10792,10793 y 10796); 9318-(10794,10795, 10797) tanto in vitro (en hepatocitos de mono primarios) como in vivo (9314 y 10792) formuladas en LNP-01. La figura 7 (véanse también las tablas 1 y 2) muestra que las moléculas originales 9314 y 9318 y las versiones modificadas son todas activas in vitro. La figura 8 como ejemplo muestra que tanto las secuencias originales 9314 como las más altamente modificadas 10792 son activas in vivo presentando un 50-60% de silenciamiento de PCSK9 endógeno en ratones. La figura 9 muestra adicionalmente a modo de ejemplo la actividad de otras versiones químicamente modificadas de

15 las originales 9314 y 10792.

Vectores de expresión de ARNbc

En otro aspecto de la invención, se expresan moléculas de ARNbc específicas para PCSK9 que modulan la actividad de expresión del gen PCSK9 a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A, et al., TTG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., publicación PCT internacional n.º WO 00/22113, Conrad, publicación PCT internacional n.º WO 00/22114, y Conrad, patente de EE.UU. n.º 6.054.299). Estos transgenes pueden introducirse como un constructo lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede incorporarse y heredarse como un transgén integrado en el genoma del huésped. El transgén también

25 puede construirse para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1995) 92:1292).

Las hebras individuales de un ARNbc pueden transcribirse mediante promotores en dos vectores de expresión separados y transferirse conjuntamente en una célula diana. Alternativamente, cada hebra individual del ARNbc puede transcribirse mediante promotores, ambos de los cuales se ubican en el mismo plásmido de expresión. En una realización preferida, se expresa un ARNbc como una repetición invertida unida por una secuencia de polinucleótido ligadora de manera que el ARNbc tiene una estructura de tallo y bucle.

Los vectores de expresión de ARNbc recombinantes son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales.

35 Pueden construirse vectores virales que expresan ARNbc basándose en, pero sin limitarse a, virus adenoasociados (para una revisión, véase Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), y Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)); o alfavirus así como otros conocidos en la técnica. Se han usado retrovirus para introducir una variedad de genes en muchos diferentes tipos de células, incluyendo células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85:3014-3018, Armentano et al., 1990, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene

45 Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc, NatI. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993. J. Immunol. 150:4104-4115; patente de EE.UU. n.º 4.868.116; patente de EE.UU. n.º 4.980.286; solicitud PCT WO 89/071 36; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; y solicitud PCT WO 92/07573). Pueden producirse vectores retrovirales recombinantes que pueden transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula transfectando el genoma retroviral recombinante en líneas celulares de empaquetamiento adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991. Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 81:6349). Pueden usarse vectores adenovirales recombinantes para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), y también tienen la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para la infección.

55 El promotor que dirige la expresión de ARNbc en o bien un plásmido de ADN o bien un vector viral de la invención puede ser una ARN polimerasa I eucariota (por ejemplo promotor de ARN ribosómico); ARN polimerasa II (por ejemplo promotor temprano de CMV o promotor de actina o promotor de ARNnp de UI) o generalmente el promotor de ARN polimerasa III (por ejemplo promotor de ARNnp de U6 o ARN de 7SK) o un promotor procariota, por ejemplo el promotor de T7, siempre que el plásmido de expresión también codifique para polimerasa de ARN de T7 requerida para la transcripción de un promotor de T7. El promotor también puede dirigir la expresión transgénica en el páncreas (véase, por ejemplo la secuencia reguladora de insulina para el páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. NatI. Acad Sci, USA 83:2511-2515)).

Además, la expresión del transgén puede regularse de manera precisa, por ejemplo, usando una secuencia

65 reguladora inducible y sistemas de expresión tales como una secuencia reguladora que es sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa circulante, u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J.

8:20-24). Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión transgénica en células o en mamíferos, incluyen regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (EPTG). Un experto en la técnica podría elegir la secuencia reguladora/promotora apropiada basándose en el uso previsto del transgén de ARNbc.

5 Generalmente, se administran vectores recombinantes que pueden expresar moléculas de ARNbc tal como se describe a continuación, y persisten en células diana. Alternativamente, pueden usarse vectores virales que proporcionan la expresión transitoria de moléculas de ARNbc. Tales vectores pueden administrarse repetidamente según sea necesario. Una vez expresados, los ARNbc se unen al ARN diana y modulan su función o expresión. La

10 administración de vectores que expresan ARNbc puede ser sistémica, tal como mediante administración intravenosa

o intramuscular, mediante administración a células diana explantadas del paciente seguido por reintroducción en el paciente, o mediante cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.

Normalmente, se transfectan plásmidos de ADN de expresión de ARNbc en células diana como un complejo con

15 portadores de lípidos catiónicos (por ejemplo oligofectamina) o portadores a base de lípidos no catiónicos (por ejemplo Transit-TKOTM). La invención también contempla transfecciones de lípidos múltiples para inactivaciones mediadas por ARNbc que seleccionan como diana diferentes regiones de un gen PCSK9 individual o múltiples genes PCSK9 a lo largo de un periodo de una semana o más. La introducción satisfactoria de los vectores de la invención en células huésped puede monitorizarse usando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, puede

20 señalizarse la transfección transitoria con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP). La transfección estable de células ex vivo puede garantizarse usando marcadores que proporcionan a las células transfectadas resistencia a factores medioambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como resistencia a higromicina B.

25 Las moléculas de ARNbc específicas para PCSK9 también pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de terapia génica para pacientes humanos. Pueden administrarse vectores de terapia génica a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase la patente de EE.UU. 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente

30 aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que el vehículo de administración génica está incrustado. Alternativamente, cuando el vector de administración génica completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración génica.

35 Los expertos en la técnica están familiarizados con métodos y composiciones además de los específicamente expuestos en la presente descripción que les permitirán poner en práctica esta invención en el alcance completo de las reivindicaciones adjuntas a continuación en el presente documento.

Se describen además los siguientes puntos:

1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, comprendiendo dicho ARNbc al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en el que una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9, y en el que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud e inhibiendo dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho PCSK9, la expresión de dicho gen PCSK9.

5 2. El ARNbc según el punto 1, en el que dicha primera secuencia se selecciona del grupo que consiste en las tablas 1 y 2 y dicha segunda secuencia se selecciona del grupo que consiste en las tablas 1 y 2.

3. El ARNbc según el punto 1, comprendiendo dicho ARNbc al menos un nucleótido modificado.

10 4. El ARNbc según el punto 2, comprendiendo dicho ARNbc al menos un nucleótido modificado.

5. El ARNbc según el punto 3, en el que dicho nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2’-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5’-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico.

6. El ARNbc según el punto 3, en el que dicho nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2’-desoxi-2’-flúor, un nucleótido modificado con 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2’-amino, nucleótido modificado con 2’-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, comprendiendo dicho ARNbc al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en el que una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9, y en el que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud e inhibiendo dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho PCSK9, la expresión de dicho gen PCSK9, en el que:

   (a)

   dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1229 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1230; o

   (b)

   dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1227 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1228.

2. 2.

   ARNbc según la reivindicación 1, comprendiendo dicho ARNbc al menos un nucleótido modificado.

3. 3.

   ARNbc según la reivindicación 2, en el que dicho nucleótido modificado se elige del grupo de un nucleótido modificado con 2’-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5’-fosforotioato, un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleótido modificado con 2’-desoxi-2’flúor, un nucleótido modificado con 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2’-amino, nucleótido modificado con 2’-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.

4. 4.

   Composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un organismo, que comprende un ARNbc y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que el ARNbc es según la reivindicación 1.

5. 5.

   Método in vitro para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, comprendiendo el método:

   (a)

   introducir en la célula un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), siendo el ARNbc tal como se define en la reivindicación 1; y

   (b)

   mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del trascrito de ARNm del gen PCSK9, inhibiendo de ese modo la expresión del gen PCSK9 en la célula.

6. 6.

   ARNbc para tratar, prevenir o gestionar procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, siendo el ARNbc según la reivindicación 1.

7. 7.

   Vector para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, comprendiendo dicho vector una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una hebra de un ARNbc, en el que dicho ARNbc es según la reivindicación 1.

8. 8.

   Célula aislada que comprende el ARNbc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector según la reivindicación 7.

9. 9.

   Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para reducir el nivel de expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, siendo dicho ARNbc según la reivindicación 1.

10. 10.

    ARNbc según la reivindicación 9, en el que dicho contacto reduce el nivel de expresión de dicho gen PCSK9.

11. 11.

    ARNbc según la reivindicación 9, en el que dicho contacto se realiza in vitro a 30 nM o menos.

12. 12.

    Composición farmacéutica para reducir el nivel de expresión del gen PCSK9 en un organismo, que comprende el ARNbc según la reivindicación 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. 13.

    ARNbc según la reivindicación 9, para tratar un trastorno asociado a PCSK9.

14. 14.

    ARNbc según la reivindicación 13, en el que dicho trastorno asociado a PCSK9 es hiperlipidemia.