KR101320916B1 - Ｐｃｓｋ9 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드이고 PCSK9 유전자의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 안티센스 쇄를 포함하는, PCSK9 유전자(PCSK9 유전자)의 발현을 억제하기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 dsRNA와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물; 당해 약제학적 조성물을 사용하여 PCSK9 유전자 발현 및 PCSK9 유전자의 발현에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＣＳＫ9 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene}

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2006년 5월 11일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/799,458호; 2006년 6월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/817,203호; 2006년 8월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/840,089호; 2006년 10월 18일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/829,914호 및 2007년 2월 13일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/901,134호를 우선권으로 청구한다. 이들 모든 가특허 출원의 내용은 전문이 본원에서 참조로 인용된다.

본 발명은 이본쇄 리보핵산(dsRNA), 및 RNA 간섭을 매개하여 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는데 있어서의 이의 용도 및 PCSK9을 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정, 예를 들면, 고지혈증을 치료하기 위한 dsRNA의 용도에 관한 것이다.

프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(Proprotein Convertase Subtilisin Kexin 9; PCSK9)은 서브틸리신 세린 프로테아제 계열의 구성원이다. 다른 8종의 포유동물 서브틸리신 프로테아제, PCSK1 내지 PCSK8 (PC1/3, PC2, 푸린, PC4, PC5/6, PACE4, PC7 및 S1P/SKI-1로도 지칭됨)은 분비 경로에서 광범위한 단백질을 프로세싱하고 다양한 생물학적 과정에 관여하는 프로단백질 컨버타제이다[참조: Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 122, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9, 1117, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 4562, Taylor, N. A., (2003) FASEB J. 17, 1215-1227, 및 Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20745-20748]. PCSK9는 콜레스테롤 대사작용에 관여하는 것으로 제안되었다. PCSK9 mRNA 발현은 마우스에서 식이 콜레스테롤 공급에 의해 햐향 조절되고[참조: Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119], HepG2 세포에서 스타틴에 의해 상향 조절되고[참조: Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459], 콜레스테롤 생합성 효소 및 저밀도 지단백질 수용체(LDLR)와 유사하게 스테롤 조절성 요소 결합 단백질(SREBP) 유전자이식된(transgenic) 마우스에서 상향 조절된다[참조: Horton, J. D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032]. 또한, PCSK9 미스센스(missense) 돌연변이는 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(Hchola3)과 관련된 것으로 확인되었다[참조: Abifadel, M., et al. (2003) Nat. Genet. 34, 154-156, Timms, K. M., (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet. 65, 419-422]. PCSK9는 또한, 단일 뉴클레오타이드 다형성(Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)이 일본인 집단의 콜레스테롤 수준과 관련되었기 때문에 총인구의 LDL 콜레스테롤 수준을 결정하는데도 관여할 수 있는 것으로 확인되었다[참조: Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114].

상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH)은 환자가 상승된 전체 및 LDL 콜레스테롤 수준, 건 황색종 및 조기 아테롬성동맥경화증을 나타내는 단일유전자 질환이다[참조: Rader, D. J., (2003) J. Clin. Invest. 111, 1795-1803]. ADH 및 열성형, 상염색체 열성 고콜레스테롤혈증(ARH)의 발병기전[참조: Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14, 121-127]은 간에 의한 LDL 흡수의 결함에 기인한다. ADH는 LDL 흡수를 방지하는 LDLR 돌연변이에 의해 유발되거나 LDLR에 결합하는, LDL상의 단백질인 아포지단백질 B내의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. ARH는 클라트린과의 상호작용을 통한 LDLR-LDL 복합체의 세포내이입작용(endocytosis)에 필수적인 ARH 단백질내의 돌연변이에 의해 유발된다. 그러므로, PCSK9 돌연변이가 Hchola3 계열의 원인인 경우, PCSK9는 수용체-매개된 LDL 흡수와 관련이 있는 것으로 보인다.

과발현 연구는 LDLR 수준 및 이에 따른 간에 의한 LDL 흡수를 조절하는데 있어 PCSK9의 역할을 지적한다[참조: Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638]. 마우스에서 3일 또는 4일 동안의 마우스 또는 사람 PCSK9의 아데노바이러스-매개 과발현은 전체 및 LDL 콜레스테롤 수준을 상승시켰고, 이러한 효과는 LDLR 녹아웃(knockout) 동물에서는 나타나지 않는다[참조: Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638]. 또한, PCSK9 과발현은 LDLR mRNA 수준, SREBP 단백질 수준 또는 SREBP 단백질 핵 대 세포질 비율에 영향을 주지 않으면서 간의 LDLR 단백질의 심각한 감소를 초래한다. 이러한 결과들은 PCSK9가 직접적이든 또는 간접적이든 전사후 기전에 의해 LDLR 단백질 수준을 감소시킴을 나타낸다.

PCSK9의 기능 상실 돌연변이가 마우스 모델에서 고안되었고[참조; Rashid et.al., (2005) PNAS, 102, 5374-5379], 사람 개체에서 동정되었다[참조: Cohen et al., (2005), Nature Genetics., 37, 161-165]. 두 경우 모두에서 PCSK9 기능의 상실은 전체 및 LDLc 콜레스테롤의 저하를 유도한다. 15년에 걸친 후향 결과 연구에서, PCSK9의 1개 카피의 상실은 LDLc를 보다 저하시키고 심혈관 질환의 발병으로부터의 위험-이익 보호를 증가시키는 것으로 나타났다[참조: Cohen et.al., 2006 N. Engl. J. Med., 354., 1264-1272.]. 명백하게, 현재까지의 데이터는 PCSK9의 저하가 LDLc를 저하시킬 수 있음을 나타낸다.

최근, 이본쇄 RNA 분자(dsRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로서 알려진 고도로 보존된 조절 기전으로 유전자 발현을 차단하는 것으로 나타났다. 국제 공개공보 제WO 99/32619호(Fire 등)에는 씨.엘레간스(C. elegans)에서 유전자 발현을 억제하기 위한, 길이가 25개 뉴클레오타이드 이상인 dsDNA의 용도가 개시되어 있다. dsRNA는 또한 식물[참조: WO 99/53050, Waterhouse et al.; 및 WO 99/61631, Heifetz et al.], 드로소필라(Drosophila)[참조: Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200] 및 포유동물[참조: WO 00/44895, Limmer; 및 DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.]을 포함하는 기타 유기체에서 표적 RNA를 분해시키는 것으로 나타났다. 이러한 천연 기전은 현재 유전자의 비정상적 또는 원치않는 조절에 의해 유발되는 장애를 치료하기 위한 신규 약제 부류의 개발을 위한 초점이 되고 있다.

RNAi 분야의 상당한 진보와 PCSK9 유전자 발현을 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 치료에서의 진보에도 불구하고, PCSK9 유전자 발현을 억제할 수 있고 고지혈증과 같은 PCSK9 유전자 발현과 관련된 질환을 치료할 수 있는 제제가 여전히 요구되고 있다.

발명의 개요

본 발명은 PCSK9 발현을 사일런싱(silencing)시키는 이본쇄 리보핵산(dsRNA)을 사용함으로써, 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9)을 하향 조절함에 의해 조정될 수 있는 질환을 치료하기 위한 과제에 대한 해결책을 제공한다.

본 발명은 이본쇄 리보핵산(dsRNA) 뿐만 아니라 이러한 dsRNA를 사용하여 세포 또는 포유동물에서의 PCSK9 유전자 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 PCSK9 유전자의 발현을 하향 조절함에 의해 조정될 수 있는 병리학적 상태, 예를 들면, 고지혈증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 dsRNA는 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드이고 PCSK9 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 갖는 RNA 쇄(안티센스 쇄)를 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA) 분자를 제공한다. 당해 dsRNA는 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함한다. 당해 dsRNA는 제1 서열을 포함하는 센스 쇄와 제2 서열을 포함하는 안티센스 쇄를 포함한다. 안티센스 쇄는 PCSK9를 암호화하는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상보성 영역은 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드이다. 당해 dsRNA는, PCSK9를 발현하는 세포와 접촉시, PCSK9 유전자의 발현을 40% 이상 억제한다.

예를 들면, 본 발명의 dsRNA 분자는 표 1 및 표 2의 센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 dsRNA의 제1 서열과 표 1 및 표 2의 안티센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 dsRNA 분자는 천연 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있거나 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들면, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 대안으로, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 록트(locked) 뉴클레오타이드, 무염기(abasic) 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트 및 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 이러한 변형된 서열은 표 1 및 표 2의 센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 dsRNA의 제1 서열과 표 1 및 표 2의 안티센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 서열에 기초할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 중 하나 이상을 포함하는 세포를 제공한다. 당해 세포는 일반적으로 사람 세포와 같은 포유동물 세포이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 하나 이상과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 전달 비히클을 포함하는, 유기체, 일반적으로 사람 피험체에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하여, 세포에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 방법을 제공한다:

(a) 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함하는 이본쇄 리보핵산(dsRNA)을 세포 내로 도입하는 단계. 당해 dsRNA는 제1 서열을 포함하는 센스 쇄와 제2 서열을 포함하는 안티센스 쇄를 포함한다. 안티센스 쇄는 PCSK9를 암호화는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 포함하고, 당해 상보성 영역은 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드이며, 당해 dsRNA는, PCSK9를 발현하는 세포와 접촉시, PCSK9 유전자의 발현을 40% 이상 억제한다.

(b) 상기 단계(a)에서 생성된 세포를 PCSK9 유전자의 mRNA 전사체가 분해되는데 충분한 시간 동안 유지시켜, 당해 세포에서의 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 단계.

다른 양태에서, 본 발명은 PCSK9 유전자 발현을 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정, 예를 들면, 고지혈증의 치료, 예방 또는 관리가 필요한 환자에게 본 발명의 하나 이상의 dsRNA의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 투여함을 포함하여, 당해 병리학적 과정을 치료, 예방 또는 관리하는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 중 하나의 하나 이상의 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 세포에서의 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 세포에서의 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 당해 벡터는 본 발명의 dsRNA 중 하나의 하나 이상의 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다.

도 1은 ND-98 지질의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 C57/BL6 마우스(5마리 동물/그룹)에서 PCSK9 mRNA의 상이한 ORF 영역(그래프에 표시된 ORF 위치에 상응하는 제1 뉴클레오타이드를 가짐)에 대해 지시된 16개의 마우스 특이적(AL-DP-9327 내지 AL-DP-9342) PCSK9 siRNA의 생체내 스크리닝의 결과를 도시한 것이다. 간 용해물 중의 GAPDH mRNA에 대한 PCSK9 mRNA의 비를 각 처리군에 걸쳐서 평균치를 구하고, PBS로 처리된 대조군 또는 비관련 siRNA(혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.
도 3은 C57/BL6 마우스(5마리 동물/그룹)에서 PCSK9 mRNA의 상이한 ORF 영역(그래프에 표시된 ORF 위치에 상응하는 제1 뉴클레오타이드를 가짐)에 대해 지시된 16개의 사람/마우스/랫트 교차반응성(AL-DP-9311 내지 AL-DP-9326) PCSK9 siRNA의 생체내 스크리닝의 결과를 도시한 것이다. 간 용해물 중의 GAPDH mRNA에 대한 PCSK9 mRNA의 비를 각 처리군에 걸쳐서 평균치를 구하고, PBS로 처리된 대조군 또는 비관련 siRNA(혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.
PCSK9 mRNA의 사일런싱은 총 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시켰다.
PSCK9 메시지를 녹다운시키는데 있어 가장 효과가 있는 siRNA는 가장 현저한 콜레스테롤 저하 효과(대략 20 내지 30%)를 나타냈다.
도 4는 C57/BL6 마우스(5마리 동물/그룹)에서 16개의 마우스 특이적(AL-DP-9327 내지 AL-DP-9342) PCSK9 siRNA의 생체내 스크리닝의 결과를 도시한 것이다. 총 혈청 콜레스테롤 수준을 각 처리군에 걸쳐서 평균치를 구하고, PBS로 처리된 대조군 또는 비관련 siRNA(혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.
도 5는 C57/BL6 마우스(5마리 동물/그룹)에서 16개의 사람/마우스/랫트 교차반응성(AL-DP-9311 내지 AL-DP-9326) PCSK9 siRNA의 생체내 스크리닝의 결과를 도시한 것이다. 총 혈청 콜레스테롤 수준을 각 처리군에 걸쳐서 평균치를 구하고, PBS로 처리된 대조군 또는 비관련 siRNA(혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.
도 6은 PCSK9의 사일런싱에 대한 시험관내 결과와 생체내 결과의 비교를 도시한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 원숭이 1차 간세포를 사용하였을 때의 PCSK9의 사일런싱에 대한 시험관내 결과를 도시한 것이다.
도 8은 LNP-01 제형화된 siRNA의 pcsk-9에 대한 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 9는 상이한 시간에서 LNP-01 제형화된 화학적으로 변형된 9314 및 10792 모(母) 분자의 생체내 활성을 도시한 것이다. 명백히, 10792의 변형된 버젼은 생체내 사일런싱 활성을 나타낸다.

본 발명은 PCSK9 유전자를 사일런싱시키는 이본쇄 리보핵산(dsRNA)를 사용하여 고지혈증과 같은 질환에 대한 치료법을 제공함으로써, PCSK9의 하향 조절에 의해 조정될 수 있는 질환을 치료하고자 하는 과제에 대한 해결책을 제공한다.

본 발명은 이본쇄 리보핵산(dsRNA) 뿐만 아니라 이러한 dsRNA를 사용하여 세포 또는 포유동물에서의 CSK9 유전자 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 PCSK9 유전자의 발현을 하향 조절함에 의해 조정될 수 있는 병리학적 상태 및 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. dsRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로서 공지된 과정을 통해서 mRNA의 서열-특이적 분해를 지시한다.

본 발명의 dsRNA는 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드이고 PCSK9 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 갖는 RNA 쇄(안티센스 쇄)를 포함한다. 이러한 dsRNA를 사용하여 나트륨 수송에 관여하는 mRNA의 표적화된 분해를 가능케할 수 있다. 세포-기반 분석법 및 동물 분석법을 사용하여, 본 발명의 발명자들은 이들 dsRNA의 매우 적은 용량이 RNAi를 특이적이고 효율적으로 매개하여 PCSK9 유전자 발현의 현저한 억제를 초래할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이들 dsRNA를 포함하는 본 발명의 방법 및 조성물은 PCSK9를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 치료, 예를 들면, 고지혈증의 치료에서 유용하다.

다음의 상세한 설명은 표적 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA, 및 dsRNA를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법 뿐만 아니라 PCSK9의 발현을 하향 조절함에 의해 조정될 수 있는 질환, 예를 들면, 고지혈증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드이고 PCSK9 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 포함하는 안티센스 쇄를 갖는 dsRNA와 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

따라서, 본 발명의 특정 측면은 본 발명의 dsRNA와 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물, 당해 조성물을 사용하여 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법 및 PCSK9 유전자의 발현을 하향 조절함에 의해 조정될 수 있는 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 사용 방법을 제공한다.

I. 정의

편의상, 본원 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 특정 용어와 어구의 의미를 하기 제공한다. 본원 명세서의 다른 부분의 용어의 용법과 본 단락에 제공된 정의 간에 명백한 차이가 있다면, 본 단락의 정의가 우선한다.

"G," "C," "A" 및 "U"는 각각 일반적으로 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실을 각각 함유하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 그러나, "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"란 용어는 하기에서 추가로 설명하는 바와 같이 변형된 뉴클레오타이드 또는 대용 치환 잔기를 지칭할 수도 있다. 당업자라면 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 이러한 치환 잔기를 보유하는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않으면서 다른 잔기로 치환될 수 있음을 잘 인지하고 있다. 예를 들면, 제한 없이, 이의 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌, 시토신 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오타이드는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열내에서 예를 들면 이노신을 함유하는 뉴클레오타이드로 치환될 수 있다. 이러한 치환 잔기를 포함하는 서열은 본 발명의 양태이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "PCSK9"는 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9 유전자 또는 단백질(FH3, HCHOLA3, NARC-1, NARC1로도 공지됨)을 지칭한다. PCSK9에 대한 mRNA 서열은 사람: NM_174936; 마우스: NM_153565 및 랫트: NM_199253으로서 제공된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 서열"은 1차 전사 생성물의 RNA 프로세싱 산물인 mRNA를 포함하여 PCSK9 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 연속적 부분을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "서열을 포함하는 쇄"란 용어는 표준 뉴클레오타이드 명명법을 사용하여 언급되는 서열로서 기술되는 뉴클레오타이드의 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, "상보적"이란 용어는 제1 뉴클레오타이드 서열을 제2 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 기술하기 위해 사용되는 경우에, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 특정 조건하에 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하여 듀플렉스(duplex) 구조를 형성할 수 있는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다. 이러한 조건은 예를 들면, 엄중한 조건(stringent condition)일 수 있으며, 여기서 엄중한 조건은 50℃ 또는 70℃에서 12시간 내지 16시간 동안 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA에 뒤이은 세척을 포함할 수 있다. 유기체 내부에서 직면할 수 있는 생리학적으로 관련된 조건과 같은 다른 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 하이브리드화된 뉴클레오타이드의 궁극적 적용에 따라서 두 서열의 상보성 시험에 가장 적절한 조건의 세트를 결정할 수 있을 것이다.

이는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸친, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대한 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 염기쌍 형성을 포함한다. 이러한 서열들은 본원에서 서로에 대해 "완전히 상보적인" 것으로 언급될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원에서 제2 서열에 대해서 "실질적으로 상보적인" 것으로 언급되는 경우에, 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 하이브리드화시 이들의 궁극적 적용과 가장 관련된 조건하에 하이브리드화하는 능력을 유지하면서 하나 이상, 그러나 일반적으로 4개, 3개 또는 2개 이하의 미스매치(mismatch)된 염기 쌍을 형성할 수 있다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화시 하나 이상의 일본쇄 오버행(overhang)을 형성하도록 고안한 경우, 이러한 오버행은 상보성 결정과 관련하여 미스매치로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들면, 길이가 21개 뉴클레오타이드인 하나의 올리고뉴클레오타이드와 길이가 23개 뉴클레오타이드인 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 보다 긴 올리고뉴클레오타이드가 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드와 완전히 상보적인 21개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 dsRNA는 본 발명의 목적상 여전히 "완전히 상보적인" 것으로서 언급될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "상보적" 서열은, 하이브리드화하는 능력과 관련하여 상기한 요건이 충족되는 한, 비-왓슨-크릭 염기 쌍 및/또는 비-천연 및 변형된 뉴클레오타이드로부터 형성된 염기 쌍을 또한 포함할 수 있거나 전적으로 이러한 염기 쌍으로부터만 형성될 수 있다.

본원에서 "상보적인", "완전히 상보적인" 및 "실질적으로 상보적인"이란 용어는 이의 사용 범주로부터 이해될 수 있는 바와 같이 dsRNA의 센스 쇄와 안티센스 쇄 사이 또는 dsRNA의 안티센스 쇄와 표적 서열 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 메신저 RNA(mRNA)의 적어도 일부분과 "실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오타이드는 관심대상의 mRNA(예를 들면, PCSK9를 암호화하는 mRNA)의 연속적 부분과 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는 당해 서열이 PCSK9를 암호화하는 mRNA의 비-방해된 부분에 대해 실질적으로 상보적인 경우에 PCSK9 mRNA의 적어도 일부분에 대해 상보적이다.

"이본쇄 RNA" 또는 "dsRNA"란 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 정의한 바와 같은 실질적으로 상보적인 2개의 역평행 핵산 쇄를 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 이러한 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 쇄는 하나의 큰 RNA 분자의 서로 다른 부분일 수 있거나, 별개의 RNA 분자일 수 있다. 별개의 RNA 분자인 경우, 이러한 dsRNA는 문헌에서 흔히 siRNA("짧은 간섭 RNA")로서 지칭된다. 2개의 쇄가 하나의 큰 분자의 일부분이고 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 쇄의 3'-말단과 각각의 다른 쇄의 5'-말단 사이에서 연속된 뉴클레오타이드 사슬에 의해 연결되어 있는 경우, 이러한 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프(hairpin loop)", "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"로서 지칭된다. 2개의 쇄가 하나의 쇄의 3'-말단과 각각의 다른 쇄의 5'-말단 사이에서 연속된 뉴클레오타이드 사슬 이외의 수단에 의해 공유 연결되어 듀플렉스 구조를 형성하는 경우, 이러한 연결 구조는 "링커"로서 지칭된다. RNA 쇄는 동일하거나 상이한 개수의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 염기쌍의 최대 개수는 dsRNA의 가장 짧은 쇄 중의 뉴클레오타이드의 개수에서 듀플렉스 중에 존재하는 임의의 오버행의 개수를 감산한 수이다. 듀플렉스 구조 이외에, dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오타이드 오버행을 포함할 수 있다. 또한, 본원 명세서에서 사용되는 바와 같이, "dsRNA"는 다수의 뉴클레오타이드에서의 실질적 변형 및 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 모든 종류의 변형을 포함하는 리보뉴클레오타이드에 대한 화학적 변형을 포함할 수 있다. siRNA 유형 분자에서 사용되는 바와 같이 이러한 임의의 변형은 본원 명세서 및 청구의 범위의 목적상 "dsRNA"에 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오타이드 오버행"은 dsRNA의 1개 쇄의 3'-말단이 다른 쇄의 5'-말단 너머로 뻗어있거나 또는 그 반대의 경우에 dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출된, 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들을 지칭한다. "평활한(blunt)" 또는 "평활 말단(blunt end)"은 dsRNA의 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드가 없음, 즉 뉴클레오타이드 오버행이 없음을 의미한다. "평활 말단" dsRNA는 이의 전체 길이에 걸쳐서 이본쇄인, 즉 분자의 전체 말단에 뉴클레오타이드 오버행이 없는 dsRNA이다. 명확성을 위해, siRNA의 3' 말단 또는 5' 말단에 접합된 화학적 캡 또는 비-뉴클레오타이드 화학적 잔기는 siRNA가 오버행을 갖는지 또는 평활 말단인지를 결정하는데 있어 고려되지 않는다.

"안티센스 쇄"란 용어는 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 쇄를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "상보성 영역"이란 용어는 서열, 예를 들면, 본원에서 정의한 바와 같은 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적인 안티센스 쇄 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 대해 완전히 상보적이지 않은 경우, 미스매치는 말단 영역에서 가장 많이 허용되며, 존재하는 경우, 일반적으로 말단 영역 또는 예를 들면, 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 3 또는 2개 뉴클레오타이드 내의 영역에 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "센스 쇄"란 용어는 안티센스 쇄의 영역에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 쇄를 지칭한다.

"세포 내로의 도입"은 dsRNA를 지칭하는 경우에, 당업자가 이해하는 바와 같이 세포 내로의 섭취 또는 흡수를 용이하게 함을 의미한다. dsRNA의 흡수 또는 섭취는 자발적인 확산성 또는 능동적인 세포 과정을 통해 또는 보조 제제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. 당해 용어의 의미는 시험관내 세포로 제한되는 것은 아니며, dsRNA는 살아있는 유기체의 일부분인 "세포 내로 도입"될 수도 있다. 이러한 경우에, 세포 내로의 도입은 유기체로의 전달을 포함할 수 있다. 예를 들면, 시험관내 전달을 위해, dsRNA는 조직 부위로 주사될 수 있거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 전기천공 및 리포펙션(lipofection)과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다.

"사일런싱시키다" 또는 "~의 발현을 억제하다"란 용어는, 본원에서 이들 용어가 PCSK9 유전자를 지칭하는 한, PCSK9 유전자가 전사되고 PCSK9 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 제1 세포 또는 세포 그룹으로부터 분리될 수 있는 PCSK9 유전자로부터 전사된 mRNA 양이 상기 제1 세포 세포 또는 세포 그룹과 실질적으로 동일하지만 이러한 처리를 받지 않은 제2 세포 또는 세포 그룹(대조군 세포)와 비교하여 감소된 것으로 나타나는 PCSK9 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제를 지칭한다. 억제 정도는 일반적으로 다음 식으로 표현된다:

대안으로, 억제 정도는 PCSK9 유전자 전사와 기능적으로 연관된 파라미터, 예를 들면, 세포에 의해 분비되는 PCSK9 유전자에 의해 암호화된 단백질의 양 또는 특정 표현형(예: 아폽토시스(apoptosis))을 나타내는 세포의 수의 감소로 표현될 수 있다. 원칙적으로, PCSK9 유전자 사일런싱은 표적을 구성적으로(constitutively) 발현하거나 게놈 조작(genomic engineering)에 의해 표적을 발현하는 어떠한 세포에서라도 어떠한 적절한 분석법에 의해서도 측정할 수 있다. 그러나, 소정의 dsRNA가 PCSK9 유전자의 발현을 어느 정도까지 억제하는지를 측정하기 위해 참조가 요구되고 따라서 이것이 본 발명에 포함되는 경우, 하기 실시예에 제공된 분석법이 이러한 참조가 될 것이다.

예를 들면, 특정 경우에 PCSK9 유전자의 발현은 본 발명의 이본쇄 올리고뉴클레오타이드의 투여에 의해 약 20%, 25%, 35% 또는 50% 이상 억제된다. 일부 양태에서, PCSK9 유전자는 본 발명의 이본쇄 올리고뉴클레오타이드의 투여에 의해 약 60%, 70% 또는 80% 이상 억제된다. 일부 양태에서, PCSK9 유전자는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드의 투여에 의해 약 85%, 90% 또는 95% 이상 억제된다. 표 1 및 2는 다양한 농도에서 다양한 PCSK9 dsRNA 분자를 사용한 시험관내 분석법에서 수득된 발현의 억제에 대한 광범위한 값을 제공한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 PCSK9 발현과 관련하여, "치료하다", "치료"란 용어 등은 PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 경감 또는 완화를 지칭한다. 본 발명의 범주에서 하기에 언급된 다른 임의의 상태(PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정이 아닌 과정)와 관련되는 한, "치료하다", "치료"란 용어 등은 이러한 상태와 연관된 하나 이상의 증상을 경감 또는 완화시키거나 이러한 상태의 진행을 늦추거나 역전시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 고지혈증의 범주에서, 치료는 혈청 지질 수준의 감소와 관련될 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료학적 유효량" 및 "예방학적 유효량"이란 어구는 PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정 또는 PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 명백한 징후의 치료, 예방 또는 관리에 있어 치료학적 이익을 제공하는 양을 지칭한다. 치료학적으로 유효한 구체적 양은 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있거나 당업계에 공지된 요인들, 예를 들면, PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 종류, 환자의 병력 및 연령, PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 병기 및 PCSK9 유전자 발현을 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 다른 항-병리학적 과정의 실시에 따라서 달라질 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적 조성물"은 약리학적 유효량의 dsRNA와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약리학적 유효량" "치료학적 유효량" 또는 단순히 "유효량"은 의도하는 약리학적, 치료학적 또는 예방학적 결과를 발생하기에 유효한 RNA의 양을 지칭한다. 예를 들면, 질환 또는 장애와 관련된 측정가능한 파라미터가 25% 이상 감소될 때에 소정의 임상적 치료가 유효한 것으로 고려된다면, 당해 질환 또는 장애 치료용 약물의 치료학적 유효량은 당해 파라미터의 25% 이상의 감소를 야기하는데 필요한 양이다.

"약제학적으로 허용되는 담체"란 용어는 치료제의 투여를 위한 담체를 지칭한다. 이러한 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로오즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 배합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니며, 하기에서 보다 상세히 기술된다. 당해 용어는 특별히 세포 배양 배지를 배제한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환된 세포"는 벡터가 도입되어 dsRNA 분자가 발현될 수 있는 세포이다.

II. 이본쇄 리보핵산 (dsRNA)

하나의 양태에서, 본 발명은 PCSK9 유전자의 발현시에 형성된 mRNA의 적어도 일부분에 대해 상보적이고 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드인 상보성 영역을 포함하는 안티센스 쇄를 포함하고, 상기 PCSK9 유전자를 발현하는 세포와 접촉시, 상기 PCSK9 유전자의 발현을 40% 이상 억제하는, 세포 또는 포유동물에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA) 분자를 제공한다. 당해 dsRNA는 하이브리드화하여 듀플렉스 구조를 형성할 수 있을 정도로 충분히 상보적인 2개의 RNA 쇄를 포함한다. 당해 dsRNA의 하나의 쇄(안티센스 쇄)는 PCSK9 유전자의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래된 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적인, 일반적으로는 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함하고, 나머지 쇄(센스 쇄)는 당해 안티센스 쇄에 상보적인 영역을 포함하고, 이에 따라 상기 2개의 쇄는 적합한 조건하에 배합되는 경우에 하이브리드화하고 듀플렉스 구조를 형성한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 길이가 15 내지 30개, 보다 일반적으로는 18개 내지 25개, 보다 더욱 일반적으로는 19 내지 24개, 가장 일반적으로는 19개 내지 21개의 염기 쌍이다. 마찬가지로, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 15 내지 30개, 보다 일반적으로는 18개 내지 25개, 보다 더욱 일반적으로는 19개 내지 24개, 가장 일반적으로는 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 dsRNA는 하나 이상의 일본쇄 뉴클레오타이드 오버행(들)을 추가로 포함할 수 있다. dsRNA는 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이 당업게에 공지된 표준 방법, 예를 들면, 자동화 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.로부터 시판)를 사용하여 합성할 수 있다. 바람직한 양태에서, PCSK9 유전자는 사람 PCSK9 유전자이다. 구체적 양태에서, dsRNA의 안티센스 쇄는 표 1 및 2의 센스 서열로부터 선택된 쇄 및 표 1 및 2의 안티센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 서열을 포함한다. 표 1 및 2에 제공된 표적 서열 내 어느 다른 곳을 표적화하는 대안적 안티센스 서열은 표적 서열 및 측면(flanking) PCSK9 서열을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.

추가의 양태에서, dsRNA는 표 1 및 2에 제공된 서열의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 양태에서, dsRNA는 상기 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 서열을 포함하며, 이때 2개 이상의 서열 중 하나는 2개 이상의 서열 중 나머지 하나에 대해 상보적이며, 2개 이상의 서열 중 하나는 PCSK9 유전자의 발현시에 생성된 mRNA의 서열에 대해 실질적으로 상보적이다. 일반적으로, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 이때 하나의 올리고뉴클레오타이드는 표 1 및 2에서 센스 쇄로서 기술되며, 제2 올리고뉴클레오타이드는 표 1 및 2에서 안티센스 쇄로서 기술된다.

당업자는 20 내지 23개, 그러나 구체적으로는 21개의 염기쌍의 듀플렉스 구조를 포함하는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 인식되었음을 잘 인지하고 있다[참조: Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888]. 그러나, 다른 이들은 보다 짧거나 긴 dsRNA도 마찬가지로 효과적일 수 있음을 발견하였다. 상기한 양태에서, 표 1 및 2에 제공된 올리고뉴클레오타이드 서열의 성질 덕택에, 본 발명의 dsRNA는 길이가 최소 21nt인 하나 이상의 쇄를 포함할 수 있다. 표 1 및 2의 서열 중 하나를 포함하고 한쪽 또는 양쪽 말단에서 오직 수개의 뉴클레오타이드만이 없는 보다 짧은 dsRNA가 상기한 dsRNA와 비교해 유사하게 효과적일 수 있음이 합리적으로 예상될 수 있다. 따라서, 표 1 및 2의 서열 중 하나로부터의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연속적 뉴클레오타이드의 부분적 서열을 포함하고 PCSK9 유전자의 발현을 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하의 억제율로 낮게 억제하는 능력에 있어 전체 서열을 포함하는 dsRNA와 상이한 dsRNA가 본 발명에 의해 의도된다. 추가로, 표 1 및 2에 제공된 표적 서열 내부를 절단하는 dsRNA는 PCSK9 서열 및 제공된 표적 서열을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다.

또한, 표 1 및 2에 제공된 RNAi 제제는 RNAi 기반 절단에 민감한 PCSK9 mRNA 내의 부위를 인식한다. 이와 같이 본 발명은 본 발명의 제제 중 하나에 의해 표적화되는 서열 내부를 표적화하는 RNAi 제제를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 제2 RNAi 제제는 당해 제2 RNAi 제제가 제1 RNAi 제제의 안티센스 쇄에 대해 상보적인 mRNA 내의 어딘가에 있는 메시지라도 절단하는 경우에 제1 RNAi 제제의 서열 내부를 표적화한다고 언급된다. 이러한 제2 제제는 일반적으로 PCSK9 유전자 내의 선택된 서열에 인접한 영역으로부터 취해진 추가의 뉴클레오타이드 서열에 커플링된 표 1 및 2에 제공된 서열 중 하나로부터의 15개 이상의 연속적 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 표적 PCSK9 유전자로부터의 그 다음 6개 뉴클레오타이드와 조합된 서열번호 1의 마지막 15개 뉴클레오타이드(부가된 AA 서열이 없음)는 표 1 및 2에 제공된 서열 중 하나에 기초하는 21개 뉴클레오타이드의 일본쇄 제제를 생성한다.

본 발명의 dsRNA는 표적 서열에 대한 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 dsRNA는 3개 이하의 미스매치를 함유한다. dsRNA의 안티센스 쇄가 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치 부위가 상보성 영역의 중심에 위치하지 않는 것이 바람직하다. dsRNA의 안티센스 쇄가 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치는 어느 한 말단으로부터의 5개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 상보성 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터의 5, 4, 3, 2 또는 1개의 뉴클레오타이드로 제한되는 것이 바람직하다. 예를 들면, PCSK9 유전자의 영역에 대해 상보적인 23개 뉴클레오타이드 dsRNA 쇄의 경우에, dsRNA는 중심의 13개 뉴클레오타이드 내에 어떠한 미스매치도 함유하지 않는다. 본 발명에서 기술되는 방법을 사용하여 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 dsRNA가 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지를 결정할 수 있다. 특히 PCSK9 유전자 내의 특정 상보성 영역이 집단내에서 다형성 서열 변이를 갖는 것으로 공지되어 있는 경우에, PCSK9 유전자의 발현을 억제하는데 있어 미스매치를 함유하는 dsRNA의 효능을 고려하는 것이 중요하다.

하나의 양태에서, dsRNA의 하나 이상의 말단은 1 내지 4개, 일반적으로 1 또는 2개의 뉴클레오타이드의 일본쇄 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. 하나 이상의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는 dsRNA는 이의 평활 말단 대상체보다 예상외의 우수한 억제 특성을 갖는다. 게다가, 본 발명자들은 오직 1개의 뉴클레오타이드 오버행의 존재가 dsRNA의 전반적 안정성에 영향을 주지 않으면서 dsRNA의 간섭 능력을 강화시킴을 발견하였다. 오직 1개의 오버행만을 갖는 dsRNA는 생체내 뿐만 아니라 다양한 세포, 세포 배양 배지, 혈액 및 혈청 중에서 특히 안정하고 효과적인 것으로 입증되었다. 일반적으로, 일본쇄 오버행은 안티센스 쇄의 3'-말단에 위치하거나, 또는 센스 쇄의 3'-말단에 위치한다. dsRNA는 또한 일반적으로 안티센스 쇄의 5'-말단에 위치하는 평활 말단을 가질 수도 있다. 이러한 dsRNA는 개선된 안정성 및 억제 활성을 가짐으로써 적은 용량, 즉 1일당 5mg/kg 체중 미만으로 투여할 수 있도록 한다. 일반적으로, dsRNA의 안티센스 쇄는 3'-말단에 뉴클레오타이드 오버행을 갖고 5'-말단은 평활 말단이다. 다른 양태에서, 오버행내의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.

또 다른 양태에서, dsRNA는 안정성을 향상시키기 위해 화학적으로 변형된다. 본 발명의 핵산은 당업계에 익히 확립된 방법, 예를 들면, 문헌[참조: "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA; 이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기술된 방법에 의해 합성하고/하거나 변형시킬 수 있다. 화학적 변형은 2' 변형, 올리고뉴클레오타이드의 다른 당 또는 염기 부위에서의 변형, 올리고뉴클레오타이드 쇄 내로의 비-천연 염기의 도입, 리간드 또는 화학적 잔기에의 공유적 부착, 및 뉴클레오타이드내 포스페이트 연결의 티오포스페이트와 같은 다른 대안적 연결로의 대체를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 변형 중 하나 이상이 사용될 수 있다.

2개의 개별적 dsRNA 쇄의 화학적 연결은 임의의 널리 공지된 기술, 예를 들면, 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합의 도입; 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 적층 상호작용(stacking interaction); 금속-이온 배위에 의해 또는 푸린 유사체의 사용을 통해 달성할 수 있다. 일반적으로, dsRNA를 변형시키는데 사용될 수 있는 화학 그룹에는 제한없이, 메틸렌 블루; 이작용성 그룹, 일반적으로 비스-(2-클로로에틸)아민; N-아세틸-N'-(p-글리옥실벤조일)시스타민; 4-티오우라실; 및 프소랄렌이 포함된다. 하나의 양태에서, 링커는 헥사-에틸렌 글리콜 링커이다. 이러한 경우, dsRNA는 고체 상 합성에 의해 생성되며, 헥사-에틸렌 글리콜 링커는 표준 방법에 따라 혼입된다[참조: Williams, D.J., and K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670]. 특정한 양태에서, 안티센스 쇄의 5'-말단 및 센스 쇄의 3'-말단이 헥사에틸렌 글리콜 링커를 통해 화학적으로 연결된다. 다른 양태에서, dsRNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 그룹을 포함한다. dsRNA에서의 화학 결합은 일반적으로 삼중-나선 결합에 의해 형성된다. 표 1 및 2는 본 발명의 변형된 RNAi 제제의 예를 제공한다.

또 다른 양태에서, 2개의 단일 쇄 중 하나 또는 둘다에 있는 뉴클레오타이드를 변형시켜, 예를 들면, 제한 없이 특정 뉴클레아제와 같은 세포 효소의 분해 활성을 방지 또는 억제할 수 있다. 2'-아미노 변형, 2'-아미노 당 변형, 2'-F 당 변형, 2'-F 변형, 2'-알킬 당 변형, 비하전 골격 변형, 모르폴리노 변형, 2'-O-메틸 변형 및 포스포르아미데이트를 포함하여 핵산에 대한 세포 효소의 분해 활성을 억제하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다[참조: Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8]. 따라서, dsRNA 상의 뉴클레오타이드의 하나 이상의 2'-하이드록실 그룹은 화학 그룹, 일반적으로 2'-아미노 또는 2'-메틸 그룹으로 치환된다. 또한, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 변형시켜 록트 뉴클레오타이드를 형성시킬 수 있다. 이러한 록트 뉴클레오타이드는 리보오스의 2'-산소를 리보오스의 4'-탄소와 연결시키는 메틸렌 브릿지를 함유한다. 록트 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 문헌[참조: Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630 및 Obika, S. et al., Tetrahedron Lett.(1998), 39: 5401-5404]에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오타이드 내로의 록트 뉴클레오타이드의 도입은 상보적 서열에 대한 친화성을 개선시키고 융점을 몇도 정도 상승시킨다[참조: Braasch, D.A. and D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7].

dsRNA에 대한 리간드의 접합은 세포 흡수 뿐만 아니라 특정 조직으로의 표적화 또는 간 세포와 같은 특정 유형의 세포에 의한 흡수를 향상시킬 수 있다. 특정한 경우에, 소수성 리간드를 dsRNA에 접합시켜 세포 막의 직접적 투과 또는 간 세포를 통과하는 흡수를 촉진시킨다. 대안으로, dsRNA에 접합된 리간드는 수용체-매개된 세포내이입작용에 대한 기질이다. 이러한 접근법은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라 dsRNA 제제의 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용되었다. 예를 들면, 콜레스테롤을 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 접합시켜 비-접합된 유사체와 비교해 실질적으로 보다 활성적인 화합물을 수득하였다[참조: M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103]. 올리고뉴클레오타이드에 접합된 다른 친지성 화합물에는 1-피렌 부티르산, 1,3-비스-O-(헥사데실)글리세롤 및 메탄올이 포함된다. 수용체-매개된 세포내이입작용에 대한 리간드의 한 예는 엽산이다. 엽산은 폴레이트-수용체-매개된 세포내이입작용에 의해 세포내로 진입한다. 엽산을 보유한 dsRNA 화합물은 폴레이트-수용체-매개된 세포내이입작용을 통해서 세포내로 효율적으로 수송될 수 있다. 리(Li)와 동료들은 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 엽산이 부착되면 상기 올리고뉴클레오타이드의 세포성 흡수가 8배 증가함을 보고하고 있다[참조: Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540]. 올리고뉴클레오타이드에 접합된 다른 리간드에는 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물 클러스터, 가교결합제, 포르피린 접합체, 전달 펩타이드 및 콜레스테롤과 같은 지질이 포함된다.

특정 경우에, 올리고뉴클레오타이드에 대한 양이온성 리간드의 접합은 뉴클레아제에 대한 내성을 개선시킨다. 양이온성 리간드의 대표적 예에는 프로필암모늄 및 디메틸프로필암모늄이 있다. 흥미롭게도, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 양이온성 리간드가 올리고뉴클레오타이드 전반에 분산되어 있는 경우에 mRNA에 대한 높은 결합 친화성을 유지하는 것으로 보고되었다[참조: M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 및 당해 문헌의 참조문헌].

본 발명의 리간드-접합된 dsRNA는 dsRNA 상으로의 연결 분자의 부착으로부터 유도된 것과 같은 펜던트(pendant) 반응성 작용기를 보유하는 dsRNA의 사용에 의해 합성할 수 있다. 이러한 반응성 올리고뉴클레오타이드는 시판되는 리간드, 다양한 보호 그룹 중 어느 하나를 보유하도록 합성된 리간드 또는 부착된 연결 잔기를 갖는 리간드와 쉽게 반응할 수 있다. 본 발명의 방법은 일부 바람직한 양태에서 리간드와 적절히 접합되었고 고체-지지체 물질에 추가로 부착될 수 있는 뉴클레오타이드 단량체의 사용에 의해 리간드-접합된 dsRNA의 합성을 촉진한다. 임의로 고체-지지체 물질에 부착된 이러한 리간드-뉴클레오사이드 접합체는 선택된 혈청-결합 리간드와 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5' 위치상에 위치하는 연결 잔기와의 반응을 통해서 본 발명의 방법의 일부 바람직한 양태에 따라서 제조된다. 특정 경우에, dsRNA의 3'-말단에 부착된 아르알킬 리간드를 보유하는 dsRNA는 먼저 단량체 빌딩 블록을 장쇄 아미노알킬 그룹을 통해서 제어된-기공-유리 지지체에 공유 부착시켜 제조한다. 이어서, 뉴클레오타이드를 표준 고체 상 합성 기술을 통해서 고체 지지체에 결합된 단량체 빌딩-블록에 결합시킨다. 단량체 빌딩 블록은 고체 상 합성과 상용성인 뉴클레오사이드 또는 기타 유기 화합물일 수 있다.

본 발명의 접합체에서 사용되는 dsRNA는 널리 공지된 고체-상 합성 기술을 통해서 편리하고 통상적으로 제조할 수 있다. 이러한 합성용 장치는 예를 들면, Applied Biosystems (Foster City, CA)를 포함하는 몇몇 판매사들에 의해 시판되고 있다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 기타 수단은 추가로 또는 대안적으로 사용할 수 있다. 또한, 유사한 기술을 사용하여 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 기타 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 것도 또한 공지되어 있다.

특정한 변형된 올리고뉴클레오타이드의 합성에 관한 기술은 다음 미국 특허에서 찾아볼 수 있다: 폴리아민 접합된 올리고뉴클레오타이드에 관한 미국 특허 제5,138,045호 및 제5,218,105호; 키랄 인 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 제조를 위한 단량체에 관한 미국 특허 제5,212,295호; 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드에 관한 미국 특허 제5,378,825호 및 제5,541,307호; 골격-변형된 올리고뉴클레오타이드 및 반응성 커플링을 통한 이의 제조에 관한 미국 특허 제5,386,023호; 3-데아자푸린 환 시스템에 기초한 변형된 뉴클레오염기 및 이의 합성방법에 미국 특허 제5,457,191호; N-2 치환된 푸린에 기초한 변형된 뉴클레오염기에 관한 미국 특허 제5,459,255호; 키랄 인 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 제조에 관한 미국 특허 제5,521,302호; 펩타이드 핵산에 관한 미국 특허 제5,539,082호; 락탐 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드에 관한 미국 특허 제5,554,746호; 올리고뉴클레오타이드의 합성을 위한 방법 및 물질에 관한 미국 특허 제5,571,902호; 알킬티오 그룹이 뉴클레오사이드의 다양한 위치중 어느 한 위치에 부착된 다른 잔기에 대한 링커로서 사용될 수 있는 알킬티오 그룹을 갖는 뉴클레오사이드에 관한 미국 특허 제5,578,718호; 높은 키랄 순도의 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드에 관한 미국 특허 제5,587,361호 및 제5,599,797호; 2,6-디아미노푸린 화합물을 포함하는 2'-O-알킬 구아노신 및 관련 화합물의 제조에 관한 미국 특허 제5,506,351호; N-2 치환된 푸린을 갖는 올리고뉴클레오타이드에 관한 미국 특허 제5,587,469호; 3-데아자푸린을 갖는 올리고뉴클레오타이드에 관한 미국 특허 제5,587,470호; 접합된 4'-데스메틸 뉴클레오사이드 유사체에 관한 미국 특허 제5,223,168호 및 미국 특허 제5,608,046호; 골격-변형된 올리고뉴클레오타이드 유사체에 관한 미국 특허 제5,602,240호 및 제5,610,289호; 특히 2'-플루오로-올리고뉴클레오타이드의 합성 방법에 관한 미국 특허 제6,262,241호 및 제5,459,255호.

본 발명의 서열-특이적 연결된 뉴클레오사이드를 보유한 리간드-접합된 dsRNA 및 리간드-분자에서, 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드는 표준 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 전구체, 또는 이미 연결 잔기를 보유하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 접합체 전구체, 리간드 분자를 이미 보유하는 리간드-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드-접합체 전구체 또는 비-뉴클레오사이드 리간드-보유 빌딩 블록를 사용하여 적합한 DNA 합성기에서 어셈블리할 수 있다.

이미 연결 잔기를 보유하는 뉴클레오타이드-접합체 전구체를 사용하는 경우, 서열-특이적 연결된 뉴클레오사이드의 합성을 통상적으로 종결시키고 이어서 리간드 분자를 연결 잔기와 반응시켜 리간드-접합된 올리고뉴클레오타이드를 형성시킨다. 스테로이드, 비타민, 지질 및 리포터 분자와 같은 다양한 분자를 보유하는 올리고뉴클레오타이드 접합체는 이미 기술된 바 있다[참조: Manoharan et al., PCT 출원 제WO 93/07883호]. 바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 연결된 뉴클레오사이드는 시판되고 있고 올리고뉴클레오타이드 합성에서 통상적으로 사용되는 표준 포스포르아미다이트 및 비-표준 포스포르아미다이트에 추가하여 리간드-뉴클레오사이드 접합체로부터 유도된 포스포르아미다이트를 사용하여 자동화 합성기에 의해 합성한다.

올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드 내의 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-알릴, 2'-O-아미노알킬 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 그룹의 혼입은 올리고뉴클레오타이드에 향상된 하이브리드화 특성을 제공한다. 또한, 포스포로티오에이트 골격을 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 향상된 뉴클레아제 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 작용화된 연결된 뉴클레오사이드를 포스포로티오에이트 골격 또는 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-아미노알킬, 2'-O-알릴 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 그룹중 하나 또는 둘다를 포함하도록 증대시킬 수 있다. 당업계에 공지된 올리고뉴클레오타이드 변형중 일부의 요약 목록은 예를 들면, PCT 공보 제WO 200370918호에서 찾아볼 수 있다.

일부 양태에서, 5'-말단에 아미노 그룹을 지니는 본 발명의 작용화된 뉴클레오사이드 서열은 DNA 합성기를 사용하여 제조한 다음, 선택된 리간드의 활성 에스테르 유도체와 반응시킨다. 활성 에스테르 유도체는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 대표적 활성 에스테르에는 N-하이드로석신이미드 에스테르, 테트라플루오로페놀성 에스테르, 펜타플루오로페놀성 에스테르 및 펜타클로로페놀성 에스테르가 포함된다. 아미노 그룹과 활성 에스테르의 반응은 선택된 리간드가 연결 그룹을 통해서 5'-위치에 부착되어 있는 올리고뉴클레오타이드를 생성시킨다. 5'-말단에 있는 아미노 그룹은 5'-아미노-변형제 C6 시약을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 양태에서, 리간드 분자는 리간드-뉴클레오사이드 포스포로아미다이트의 사용에 의해 5'-위치에서 올리고뉴클레오타이드에 접합시킬 수 있으며, 이때 리간드는 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 5'-하이드록시 그룹에 연결된다. 이러한 리간드-뉴클레오사이드 포스포로아미다이트는 5'-말단에 리간드를 보유하는 리간드-접합된 올리고뉴클레오타이드를 제공하기 위해 통상적으로 자동화 합성 공정의 말기에 사용된다.

변형된 뉴클레오사이드내 연결 또는 골격의 예에는, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸, 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포로아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 표준 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 뉴클레오사이드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반대 극성을 갖는 것들이 포함된다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다.

상기 인-원자 함유 연결의 제조와 관련된 대표적 미국 특허에는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 및 제5,697,248호[각각 본원에서 참조로 인용된다]가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 뉴클레오사이드내 연결 또는 골격(즉,올리고뉴클레오사이드)의 예는 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당상호간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 당상호간 연결 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 당상호간 연결에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결(부분적으로 뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 형성됨); 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH₂ 성분 부분을 갖는 기타 것들을 포함한다.

상기한 올리고뉴클레오타이드의 제조와 관련된 대표적 미국 특허에는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호[각각은 본원에서 참조로 인용된다]가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

특정한 경우에, 올리고뉴클레오타이드를 비-리간드 그룹에 의해 변형시킬 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해 많은 비-리간드 분자를 올리고뉴클레오타이드에 접합시킬 수 있으며, 이러한 접합을 수행하기 위한 방법은 과학 문헌에서 입수할 수 있다. 이러한 비-리간드 잔기는 콜레스테롤[참조: Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553], 콜산[참조: Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053], 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올[참조: Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765], 티오콜레스테롤[참조: Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533], 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기[참조: Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49], 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트[참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777], 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄[참조: Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969] 또는 아다만탄 아세트산[참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651], 팔미틸 잔기[참조: Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229] 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 잔기[참조: Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923]와 같은 지질 잔기를 포함하였다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 접합체의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 상기 기재한 바 있다. 통상적 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에 아미노링커를 보유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성을 포함한다. 이어서, 아미노 그룹을 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합시킬 분자와 반응시킨다. 접합 반응은 여전히 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행하거나 용액 상에서 올리고뉴클레오타이드를 절단한 후에 수행할 수 있다. HPLC에 의한 올리고뉴클레오타이드 접합체의 정제는 통상적으로 순수한 접합체를 제공한다. 이러한 잔기는 PCSK9의 발현 부위인 간 세포로의 표적화를 증가시킬 수 있기 때문에 콜레스테롤 접합체의 사용이 특히 바람직하다.

벡터 암호화된 RNAi 제제

본 발명의 dsRNA는 또한 재조합 바이러스 벡터로부터 생체내 세포내에서 발현시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 본 발명의 dsRNA를 암호화하는 서열 및 dsRNA 서열을 발현시키기 위한 임의의 적합한 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터에는, 예를 들면, U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 사이토메갈로바이러스 프로모터가 포함된다. 다른 적합한 프로모터의 선택은 당업계의 기술 범위내에 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 또한 특정한 조직 또는 특정한 세포내 환경 내에서 dsRNA를 발현시키기 위한 유도성 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명의 dsRNA를 생체내 세포로 전달하기 위한 재조합 바이러스 벡터의 사용은 하기에서 보다 상세히 논의한다.

본 발명의 dsRNA는 2개의 개별적인 상보적인 RNA 분자로서 또는 2개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로서 재조합 바이러스 벡터로부터 발현시킬 수 있다.

발현될 dsRNA 분자(들)에 대한 암호화 서열을 수용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스(AV); 아데노-관련된 바이러스(Adeno-Associated Virus; AAV); 레트로바이러스(예를 들면, 렌티바이러스(LV), 라브도바이러스, 쥐 백혈병 바이러스); 헤르페스 바이러스 등으로부터 유도된 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터의 향성(tropism)은 벡터를 외피 단백질 또는 다른 바이러스로부터의 다른 표면 항원으로 슈도타이핑(pseudotyping)하거나 또는 상이한 바이러스 캡시드 단백질을 경우에 맞게 치환시킴으로써 변형시킬 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 광견병, 에볼라, 모콜라(Mokola) 등으로부터의 표면 단백질로 슈도타이핑할 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 당해 벡터를 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 조작하여 상이한 세포를 표적화하도록 만들 수 있다. 예를 들면, 혈청형 2 게놈상의 혈청형 2 캡시드를 발현하는 AAV 벡터는 AAV 2/2라 불린다. AAV 2/2 벡터 내의 이러한 혈청형 2 캡시드 유전자를 혈청형 5 캡시드 유전자로 대체시켜 AAV 2/5 벡터를 제조할 수 있다. 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하는 AAV 벡터를 작제하기 위한 기술은 당업계의 기술 범위내에 있다[참조: Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, 이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다].

본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터의 선별, dsRNA를 발현하기 위한 핵산 서열을 벡터내로 삽입하기 위한 방법 및 바이러스 벡터를 관심대상의 세포로 전달하기 위한 방법은 당업계의 기술 범위내에 있다[참조: Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; 및 Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406, 이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다].

바람직한 바이러스 벡터는 AV 및 AAV로부터 유도된 벡터이다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 dsRNA는 예를 들면, U6 또는 H1 RNA 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함하는 재조합 AAV 벡터로부터 2개의 개별적인 상보적 일본쇄 RNA 분자로서 발현시킨다.

본 발명의 dsRNA를 발현시키기에 적합한 AV 벡터 및 당해 벡터를 표적 세포로 전달시키는 방법은 문헌[참조: Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010]에 기재되어 있다.

본 발명의 dsRNA를 발현시키기에 적합한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 작제하는 방법 및 당해 벡터를 표적 세포로 전달시키는 방법은 문헌[참조: Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 미국 특허 제5,252,479호; 미국 특허 제5,139,941호; 국제 특허출원 제WO 94/13788호; 및 국제 특허출원 제WO 93/24641호; 이들의 전문은 본원에서 참조로 인용된다]에 기재되어 있다.

III. dsRNA를 포함하는 약제학적 조성물

하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 dsRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 당해 dsRNA를 포함하는 약제학적 조성물은 PCSK9 유전자 발현을 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정과 같은 PCSK9 유전자의 발현 또는 활성과 연관된 질환 또는 장애, 예를 들면, 고지혈증을 치료하는데 유용하다. 이러한 약제학적 조성물은 전달 방식에 기초하여 제형화한다. 한가지 예는 비경구 전달을 통한 간으로의 전달을 위해 제형화되는 조성물이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 투여된다. 본 발명자들은, 본 발명의 dsRNA를 포함하는 조성물이, 이의 개선된 효능으로 인해서 놀랍게도 낮은 용량으로 투여될 수 있음을 발견하였다. 1일당 수용자의 체중 kg당 5mg dsRNA의 용량이 PCSK9 유전자의 발현을 억제 또는 저해하는데 충분하고 환자에게 전신 투여될 수 있다.

일반적으로, dsRNA의 적합한 용량은 1일당 수용자의 체중 kg당 0.01 내지 5.0 mg의 범위, 일반적으로 1일당 체중 1kg당 1㎍ 내지 1mg의 범위일 수 있다. 약제학적 조성물은 1일 1회 투여될 수 있거나, dsRNA는 하루 전체에 걸쳐서 적절한 간격으로 2회, 3회 또는 세부-용량으로 투여될 수 있거나, 제어된 방출 제형을 통해서 연속 주입 또는 전달을 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 총 1일 용량을 달성하기 위해 각 세부-용량에 함유된 dsRNA는 상응하게 보다 작아야 한다. 또한, 예를 들면, 수일에 걸쳐서 dsRNA의 서방출을 제공하는 통상의 서방형 제형을 사용하여 수일에 걸쳐서 전달하기 위해 용량 단위를 제조할 수 있다. 서방형 제형은 당업계에 널리 공지되어 있다.

당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료법, 피험체의 전반적 건강 및/또는 연령 및 존재하는 기타 질환을 포함하는 특정한 요인들이 피험체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 용량 및 시기에 영향을 줄 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 치료학적 유효량의 조성물을 이용한 피험체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 개개의 dsRNA에 대한 유효량 및 생체내 반감기는 통상의 방법론을 사용하거나 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 적절한 동물 모델을 사용한 생체내 시험에 기초하여 추산할 수 있다.

마우스 유전학의 진보는 PCSK9 유전자 발현을 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정과 같은 다양한 사람 질환에 대한 연구를 위한 수많은 마우스 모델을 생성시켰다. 이러한 모델은 dsRNA의 생체내 시험 뿐만 아니라 치료학적 유효량을 측정하기 위해 사용된다.

본 발명의 dsRNA를 포유동물에게 투여하기 위해 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 예를 들면, 투여는 직접; 경구; 또는 비경구 투여(예를 들면, 피하, 뇌실내, 근육내 또는 복강내 주사 또는 정맥내 점적에 의해)일 수 있다. 투여는 신속할 수 있거나(예를 들면, 주사에 의해) 시간에 걸쳐서 일어날 수 있다(예를 들면, 느린 주입 또는 서방형 제형의 투여에 의해).

통상적으로, 고지혈증을 앓는 포유동물을 치료할 경우에, 당해 dsRNA 분자는 비경구 수단을 통해서 전신 투여된다. 예를 들면, 접합되거나 비접합되거나 리포좀과 함께 또는 리포좀 없이 제형화된 dsRNA가 환자에게 정맥내 투여될 수 있다. 이를 위해, dsRNA 분자는 알코올과 같은 통상의 용매 중의 멸균 및 비-멸균 수용액, 비수성 용액 또는 액체 또는 고체 오일 기제 중의 용액과 같은 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 용액은 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 비경구, 수막강내(intrathecal) 또는 뇌실내 투여의 경우, dsRNA 분자는 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제(예를 들면, 투과 증진제, 담체 화합물 및 기타 약제학적으로 허용되는 담체)를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액과 같은 조성물로 제형화될 수 있다.

또한, dsRNA 분자는 미국 특허 제6,271,359에 기재된 바와 같은 생물학적 또는 비생물학적 수단으로서 포유동물에게 투여될 수 있다. 비생물학적 전달은, 제한없이 (1) 리포좀에 본원에 제공된 dsRNA 산 분자를 로딩함 및 (2) dsRNA 분자와 지질 또는 리포좀을 복합체화시켜 핵산-지질 또는 핵산-리포좀 복합체를 형성함을 포함하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 리포좀은 시험관내에서 세포를 형질감염시키는데 통상적으로 사용되는 양이온성 및 중성 지질로 이루어질 수 있다. 양이온성 지질은 음 하전된 핵산과 복합체화(예를 들면, 전하-결합)되어 리포좀을 형성할 수 있다. 양이온성 리포좀의 예에는, 제한없이, 리포펙틴, 리포펙타민, 리포펙트에이스 및 DOTAP가 포함된다. 리포좀의 형성 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 리포좀 조성물은 예를 들면, 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤 또는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민으로부터 형성될 수 있다. 리포펙틴^RTM(제조원: Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) 및 에펙텐^TM(제조원: Qiagen, Valencia, Calif.)을 포함하는 수많은 친지성 제제들이 시판되고 있다. 또한, 각각이 DOPE 또는 콜레스테롤과 같은 중성 지질과 혼합될 수 있는 DDAB 또는 DOTAP와 같은 시판되는 양이온성 지질을 사용하여 전신적 전달 방법을 최적화시킬 수 있다. 일부 경우에, 문헌[참조: Templeton et al., Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997)]에 기술된 바와 같은 리포좀을 사용할 수 있다. 다른 양태에서, 폴리에틸렌이민과 같은 폴리양이온을 사용하여 생체내 및 생체외 전달을 달성할 수 있다[참조: Boletta et al., J. Am Soc. Nephrol. 7: 1728 (1996)]. 핵산을 전달하기 위한 리포좀의 사용에 관한 추가 정보는 미국 특허 제6,271,359호, PCT 공보 제WO 96/40964호 및 문헌[Morrissey, D. et al. 2005. Nat Biotechnol. 23(8):1002-7]에서 찾아볼 수 있다.

생물학적 전달은, 제한없이 바이러스 벡터의 사용을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터(예를 들면, 아데노바이러스 및 헤르페르바이러스 벡터)를 사용하여 dsRNA 분자를 간 세포로 전달할 수 있다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 본원에 제공된 하나 이상의 dsRNA를 핵산을 세포로 전달하기 위해 이미 개발된 다수의 상이한 바이러스 벡터 중 하나로 도입시킬 수 있다. 이러한 수득된 바이러스 벡터를 사용하여, 예를 들면, 감염에 의해 하나 이상의 dsRNA를 세포로 전달하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 dsRNA는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중에서 제형화할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"(본원에서 "부형제"로서도 지칭됨)는 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁화제 또는 임의의 기타 약리학적 불활성 비히클이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 액체 또는 고체일 수 있고 목적하는 부피, 경도 및 기타 지속적 수송 및 화학적 특성을 제공하도록 계획된 투여 방식으로 선택할 수 있다. 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체에는, 예를 들면, 제한없이, 물; 식염 용액; 결합제(예: 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈); 충전재(예: 락토오즈 및 기타 당, 젤라틴 또는 황산칼슘); 윤활제(예: 전분, 폴리에틸렌 글리콜 또는 나트륨 아세테이트); 붕해제(예: 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 및 습윤제(예: 나트륨 라우릴 설페이트)가 포함된다.

또한, PCSK9 유전자를 표적화하는 dsRNA를 다른 분자, 분자 구조 또는 핵산의 혼합물과 혼합된, 캡슐화된, 접합된 또는 그밖에 연합된 dsRNA를 함유하는 조성물로 제형화할 수 있다. 예를 들면, PCSK9 유전자를 표적화하는 하나 이상의 dsRNA 제제를 함유하는 조성물은 기타 지질 저하제(예: 스타틴)와 같은 다른 치료제를 함유할 수 있다.

PCSK9의 발현을 햐항 조절함에 의해 조정될 수 있는 질환의 치료 방법

본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여, PCSK9의 발현을 햐항 조절하여 조정될 수 있는 질환 및 상태를 치료할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 조성물을 사용하여 고지혈증 및 다른 형태의 지질 불균형, 예를 들면, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증 및 이들 장애와 연관된 병리학적 상태, 예를 들면, 심장 및 순환계 질환을 치료할 수 있다.

PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법

또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 본 발명의 조성물을 포유동물에게 투여하여, 표적 PCSK9 유전자의 발현이 사일런싱되도록 함을 포함한다. 본 발명의 dsRNA는 이의 높은 특이성으로 인하여 표적 PCSK9 유전자의 표적 RNA(1차 또는 프로세싱됨)를 특이적으로 표적화한다. dsRNA를 사용하여 이들 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.

하나의 양태에서, 당해 방법은 치료될 포유동물의 PCSK9 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부분에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 치료될 유기체가 사람과 같은 포유동물인 경우, 당해 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸) 투여를 포함하는 경구 또는 비경구 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여할 수 있다. 바람직한 양태에서, 당해 조성물은 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질을 하기 기술한다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허원, 특허 및 기타 참조문헌은 전문이 본원에서 참조로 인용된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본원 명세서에 의해 조정될 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며 제한하기 위함이 아니다.

PCSK9 유전자의 유전자 워킹(gene walking)

siRNA 고안을 수행하여 2가지 개별적 선별물을 동정하였다.

a) PCSK9 사람 및 마우스 또는 랫트 mRNA를 표적화하는 siRNA; 및

b) 표적 유전자 PCSK9에 대한 예측된 특이성을 갖는 모든 사람 반응성 siRNA.

사람, 마우스 및 랫트 PCSK9에 대한 mRNA 서열을 사용하였다: 사람 서열 NM_174936.2를 완전한 siRNA 선별 과정 동안 참조 서열로서 사용하였다.

사람과 마우스 PCSK9 mRNA 서열 및 사람과 랫트 PCSK9 mRNA 서열에 보존된 19량체 서열을 제1 단계에서 동정하여 사람 및 마우스 표적에 대해 교차반응성인 siRNA 및 사람과 랫트 표적에 대해 교차반응성인 siRNA의 선별물을 수득하였다.

사람 PCSK9를 특이적으로 표적화하는 siRNA를 두번째 선별에서 동정하였다. 사람 PCSK9의 모든 가능한 19량체 서열을 추출하고 후보 표적 서열로서 정의하였다. 사람 및 원숭이에 대해 교차반응성인 서열 및 마우스, 랫트, 사람 및 원숭이에 대해 교차반응성인 서열은 모두 표 1 및 2에 기재되어 있다. 이들 서열의 화학적으로 변형된 버젼 및 시험관내 및 생체내 분석법에서의 이들의 활성도 또한 표 1 및 2에 기재되어 있으며 예는 도 2 내지 8에 기재되어 있다.

후보 표적 서열 및 이의 상응하는 siRNA를 등급화하고 적절한 것을 선별하기 위해, 이들이 비관련 표적과 상호작용할 예측되는 잠재성(오프-타겟 잠재성(off-target potential))을 등급화 파라미터로서 취하였다. 오프-타겟 잠재성이 낮은 siRNA를 바람직한 것으로 정의하였으며 생체내에서 보다 특이적인 것으로 가정하였다.

siRNA-특이적 오프-타겟 잠재성을 예측하기 위해, 다음과 같이 가정하였다:

1) 쇄의 위치 2 내지 9(5'부터 3'으로 계수함)(핵심 영역(seed region))는 서열의 나머지(비-핵심 및 절단 부위 영역)보다 더욱 오프-타겟 잠재성에 기여할 수 있다.

2) 쇄의 위치 10 및 11(5'부터 3'으로 계수함)(절단 부위 영역)은 비-핵심 영역보다 더욱 오프-타겟 잠재성에 기여할 수 있다.

3) 각 쇄의 위치 1 및 19는 오프-타겟 상호작용과 관련되지 않는다.

4) 오프-타겟 스코어는 유전자의 서열 및 미스매치 위치에 대한 siRNA 쇄 서열의 상보성에 기초하여 각 유전자 및 각 쇄에 대해 계산할 수 있다.

5) 예측되는 오프-타겟의 수와 최고 오프-타겟 스코어가 오프-타겟 잠재성을 위해 고려되어야 한다.

6) 오프-타겟 스코어는 오프-타겟의 수보다 오프-타겟 잠재성과 더욱 관련되는 것으로 고려된다.

7) 내부 변형에 의한 센스 쇄 활성의 잠재적 중지를 가정할 때, 안티센스 쇄의 오프-타겟 잠재성만이 관련될 것이다.

잠재적 오프-타겟 유전자를 동정하기 위해, 19량체 후보 서열의 상동성을 공개적으로 입수가능한 사람 mRNA 서열과 대조하면서 조사하였다.

각 19량체 입력 서열에 대한 다음의 오프-타겟 특성을 각 오프-타겟 유전자에 대해 추론하여 오프-타겟 스코어를 계산하였다:

비-핵심 영액 내의 미스매치의 수

핵심-영역 내의 미스매치의 수

절단 부위 영역 내의 미스매치의 수

가정 1 내지 3을 고려하기 위해 오프-타겟 스코어를 다음과 같이 계산하였다:

오프-타겟 스코어 = 핵심 미스매치의 수 * 10

+ 절단 부위 미스매치의 수 * 1.2

+ 비-핵심 미스매치의 수 * 1

입력 19량체 서열에 상응하는 각 siRNA에 대한 가장 관련되는 오프-타겟 유전자를 오프-타겟 스코어가 최저인 유전자로서 정의하였다. 따라서, 최저 오프-타겟 스코어를 각 siRNA에 대한 관련되는 오프-타겟 스코어로서 정의하였다.

dsRNA 합성

시약 공급원

시약 공급원을 본원에서 구체적으로 기재하지 않는 경우, 이러한 시약은 분자생물학에서의 적용에 표준인 품질/순도에서 어떠한 분자생물학용 시약 공급업자로부터도 입수할 수 있다.

siRNA 합성

일본쇄 RNA를 Expedite 8909 합성기(제조원: Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany) 및 고체 지지체로서 제어된 기공 유리(CPG, 500Å, 제조원: Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)를 사용하여 1μmole의 규모로 고체상 합성에 의해 제조하였다. RNA 및 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 함유하는 RNA를 각각 상응하는 포스포르아미다이트 및 2'-O-메틸 포스포르아미다이트(제조원: Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)를 사용하여 고체상 합성에 의해 생성시켰다. 이들 빌딩 블록을 문헌[참조: Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재된 바와 같은 표준 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 올리고리보뉴클레오타이드 사슬의 서열 내의 선별된 부위에 혼입시켰다. 요오드 산화제 용액을 아세토니트릴(1%) 중의 뷰케이지(Beaucage) 시약(판매원: Chruachem Ltd, Glasgow, UK)으로 대체시켜 포스포로티오에이트 연결을 도입시켰다. 추가의 보조 시약은 말린크로트 베이커(Mallinckrodt Baker, Griesheim, Germany)로부터 입수하였다.

조(crude) 올리고리보뉴클레오타이드를 확립된 과정에 따라서 음이온 교환 HPLC에 의해 탈보호시키고 정제하였다. 수율 및 농도를 스펙트럼 광도계(DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleiheim, Germany)를 사용하여 260 nm의 파장에서 각각의 RNA의 용액의 UV 흡수에 의해 측정하였다. 이본쇄 RNA를 어닐링(annealing) 완충액(20mM 인산나트륨, pH 6.8; 100 mM 염화나트륨) 중의 상보적 쇄의 등몰 용액을 혼합하여 생성시키고 85 내지 90℃의 수조에서 3분 동안 가열하고 3 내지 4시간에 걸쳐서 실온으로 냉각시켰다. 어닐링된 RNA 용액을 사용할 때까지 20℃에서 저장하였다.

3'-콜레스테롤-접합된 siRNA(본원에서 -Chol-3'로서 지칭됨)의 합성을 위해, 적절히 변형된 고체 지지체를 RNA 합성을 위해 사용하였다. 변형된 고체 지지체를 다음과 같이 제조하였다:

디에틸-2-아자부탄-1,4-디카복실레이트 (화학식 AA)

[화학식 AA]

수산화나트륨의 4.7M 수용액(50 mL)을 물(50 mL) 중의 에틸 글리시네이트 하이드로클로라이드(32.19 g, 0.23 mole)의 교반된 빙냉 용액에 부가하였다. 이어서, 에틸 아크릴레이트(23.1 g, 0.23 mole)를 부가하고, 혼합물을 반응의 완료를 TLC로 확인할 때까지 실온에서 교반하였다. 19시간 후, 용액을 디클로로메탄(3 x 100 mL)으로 분배하였다. 유기 상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 증발시켰다. 잔사를 증류시켜 AA (28.8 g, 61%)를 수득하였다.

3-{에톡시카보닐메틸-[6-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐-아미노)-헥사노일]-아미노}-프로피온산 에틸 에스테르 (화학식 AB)

[화학식 AB]

Fmoc-6-아미노-헥산산(9.12 g, 25.83 mmol)을 디클로로메탄(50 mL)에 용해시키고 얼음으로 냉각시킨다. 디이소프로필카보디이미드(3.25 g, 3.99 mL, 25.83 mmol)를 0℃에서 용액에 부가하였다. 이어서, 여기에 디에틸-아자부탄-1,4-디카복실레이트(5 g, 24.6 mmol) 및 디메틸아미노 피리딘(0.305 g, 2.5 mmol)을 부가하였다. 용액을 실온이 되도록 하고 6시간 동안 추가로 교반하였다. 반응의 완결을 TLC로 확인하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축시키고 에틸 아세테이트를 부가하여 디이소프로필 우레아를 침전시켰다. 현탁액을 여과하였다. 여액을 5% 수성 염산, 5% 중탄산나트륨 및 물로 세척하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 농축시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(50% EtOAC/헥산)로 정제하여 11.87g(88%)의 AB를 수득하였다.

3-[(6-아미노-헥사노일)-에톡시카보닐메틸-아미노]-프로피온산 에틸 에스테르 (화학식 AC)

[화학식 AC]

3-{에톡시카보닐메틸-[6-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥사노일]-아미노}-프로피온산 에틸 에스테르 AB(11.5 g, 21.3 mmol)를 0℃에서 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘에 용해시켰다. 용액을 1시간 동안 계속해서 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축시키고, 물을 잔사에 부가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조 생성물을 이의 하이드로클로라이드 염으로 전환시켜 정제하였다.

3-({6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시카보닐아미노]-헥사노일}에톡시카보닐메틸-아미노)-프로피온산 에틸 에스테르 (화학식 AD)

[화학식 AD]

3-[(6-아미노-헥사노일)-에톡시카보닐메틸-아미노]-프로피온산 에틸 에스테르 AC의 하이드로클로라이드 염(4.7 g, 14.8 mmol)을 디클로로메탄에 용해시켰다. 현탁액을 빙상에서 0℃까지 냉각시켰다. 현탁액에 디이소프로필에틸아민(3.87 g, 5.2 mL, 30 mmol)을 부가하였다. 수득된 용액에 콜레스테릴 클로로포르메이트(6.675g, 14.8 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석시키고 10% 염산으로 세척하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (10.3 g, 92%).

1-{6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시카보닐아미노]-헥사노일}-4-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에틸 에스테르 (화학식 AE)

[화학식 AE]

칼륨 t-부톡사이드(1.1 g, 9.8 mmol)를 무수 톨루엔 30 mL 중에 슬러리화시켰다. 혼합물을 빙상에서 0℃까지 냉각시키고, 디에스테르 AD 5g(6.6 mmol)을 교반하면서 20분 이내에 천천히 부가하였다. 부가 동안에 온도는 5℃ 미만으로 유지하였다. 0℃에서 30분 동안 계속해서 교반하고, 빙초산 1 mL를 부가한 직후에 물 40 mL 중의 NaH₂PO₄·H₂O 4g을 부가하였다. 수득된 생성물을 디클로로메탄 각각 100mL으로 2회 추출하고, 합한 유기 추출물을 포스페이트 완충액 각각 10mL으로 2회 세척하고, 증발 건조시켰다. 잔사를 톨루엔 60 mL에 용해시키고, 0℃까지 냉각시키고, 냉각된 pH 9.5 카보네이트 완충액의 3개의 50 mL 분획으로 추출하였다. 수성 추출물을 인산을 이용하여 pH 3으로 조정하고 클로로포름의 5개의 40 mL 분획으로 추출하고, 이를 합하고 건조시키고 증발 건조시켰다. 잔사를 25% 에틸아세테이트/헥산을 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 b-케토에스테르 1.9 g (39%)을 수득하였다.

[6-(3-하이드록시-4-하이드록시메틸-피롤리딘-1-일)-6-옥소-헥실]-카밤산 17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 에스테르 (화학식 AF)

[화학식 AF]

메탄올(2 mL)을 1시간에 걸쳐서 테트라하이드로푸란(10 mL) 중의 b-케토에스테르 AE(1.5 g, 2.2 mmol) 및 수소화붕소나트륨(0.226 g, 6 mmol)의 환류 혼합물에 적가하였다. 환류 온도에서 1시간 동안 계속해서 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 1N HCl(12.5 mL)을 부가하고, 혼합물을 에틸아세테이트(3 x 40 mL)로 추출하였다. 합한 에틸아세테이트 층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 진공하에 농축시켜 생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(10% MeOH/CHCl₃)로 정제하였다(89%).

(6-{3-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시메틸]-4-하이드록시-피롤리딘-1-일}-6-옥소-헥실)-카밤산 17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 에스테르 (화학식 AG)

[화학식 AG]

디올 AF(1.25 gm 1.994 mmol)를 진공하에 피리딘(2 x 5mL)으로 증발시켜 건조시켰다. 무수 피리딘(10 mL) 및 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(0.724 g, 2.13 mmol)를 교반하면서 부가하였다. 반응을 실온에서 밤새 수행하였다. 메탄올을 부가하여 반응을 퀀칭(quenching)시켰다. 반응 혼합물을 진공하에 농축시키고 잔류 디클로로메탄(50 mL)에 부가하였다. 유기 층을 1M 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 농축시켰다. 잔류 피리딘을 톨루엔으로 증발시켜 제거하였다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(2% MeOH/클로로포름, Rf = 5% MeOH/CHCl₃ 중에서 0.5)로 정제하였다 (1.75 g, 95%).

석신산 모노-(4-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시메틸]-1-{6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H 사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시카보닐아미노]-헥사노일}-피롤리딘-3-일) 에스테르 (화학식 AH)

[화학식 AH]

화합물 AG(1.0 g, 1.05 mmol)를 석신산 무수물(0.150 g, 1.5 mmol) 및 DMAP(0.073 g, 0.6 mmol)와 혼합하고 진공하에 40℃에서 밤새 건조시켰다. 혼합물을 무수 디클로로에탄(3 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민(0.318 g, 0.440mL, 3.15 mmol)을 부가하고, 용액을 실온에서 아르곤 대기하에 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 이를 디클로로메탄(40 mL)으로 희석시키고 빙냉 수성 시트르산(5중량%, 30 mL) 및 물(2 X 20 mL)로 세척하였다. 유기 상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 농축 건조시켰다. 잔사를 다음 단계에서 그대로 사용하였다.

콜레스테롤 유도체화된 CPG (화학식 AI)

[화학식 AI]

석시네이트 AH(0.254 g, 0.242 mmol)를 디클로로메탄/아세토니트릴(3:2, 3 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 상기 용액에 아세토니트릴(1.25 mL) 중의 DMAP(0.0296 g, 0.242 mmol), 아세토니트릴/디클로로에탄(3:1, 1.25 mL) 중의 2,2'-디티오-비스(5-니트로피리딘)(0.075 g, 0.242 mmol)을 연속적으로 부가하였다. 수득된 용액에 아세토니트릴(0.6 ml) 중의 트리페닐포스핀(0.064 g, 0.242 mmol)을 부가하였다. 반응 혼합물은 색상이 밝은 오렌지색으로 변하였다. 용액을 팔 달린 진탕기(wrist-action shaker)를 사용하여 잠시동안 진탕하였다(5분). 장쇄 알킬 아민-CPG(LCAA-CPG)(1.5 g, 61mM)를 부가하였다. 현탁액을 2시간 동안 진탕하였다. CPG를 소결 깔때기를 통해 여과하고 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 에테르로 연속적으로 세척하였다. 미반응한 아미노 그룹을 아세트산 무수물/피리딘을 사용하여 차단시켰다. 달성된 CPG의 로딩을 UV 측정(37 mM/g)을 실시하여 측정하였다.

5'-12-도데칸산 비스데실아미드 그룹(본원에서 "5'-C32-"로 지칭함) 또는 5'-콜레스테릴 유도체 그룹(본원에서 "5'-Chol-"로 지칭함)을 보유한 siRNA의 합성을 WO 2004/065601에 기술된 바와 같이 실시하되, 단 콜레스테릴 유도체의 경우, 핵산 올리고머의 5'-말단에 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해 산화 단계는 뷰케이지 시약을 사용하여 실시하였다.

핵산 서열은 표준 명명법 및 구체적으로는 표 A의 약어를 사용하여 하기에 나타낸다.

[표 A]

HuH7, HepG2, Hela 및 1차 원숭 간세포에서의 PCSK9 siRNA 스크리닝에 의해 고도로 활성인 서열을 찾아낸다.

HuH-7 세포를 JCRB 세포 은행(Japanese Collection of Research Bioresources)(일본 신주쿠, 카탈로그 번호: JCRB0403)으로부터 입수하였다. 세포를 37℃에서 5% CO₂를 함유한 대기하에 가습된 항온배양기(Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany) 내에서 10% 태아 송아지 혈청(FCS)(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: S0115), 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: A2213) 및 2mM L-글루타민(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: K0282)을 함유하도록 보충된 둘베코(Dulbecco) MEM(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: F0435)에서 배양하였다. HepG2 및 Hela 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Rockville, MD, 카탈로그 번호: HB-8065)으로부터 입수하고, 37℃에서 5% CO₂를 함유한 대기하에 가습된 항온배양기(Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany) 내에서 10% 태아 송아지 혈청(FCS)(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: S0115), 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: A2213), 1x 비필수 아미노산(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: K-0293) 및 1mM 나트륨 피루베이트(Biochrom AG, Berlin, Germany, 카탈로그 번호: L-0473)을 함유하도록 보충된 MEM(Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Germany, 카탈로그 번호: 21090-022)에서 배양하였다.

siRNA로 형질감염시키기 위해, HuH7, HepG2 또는 Hela 세포를 96웰 플레이트에 2.0 x 10⁴개 세포/웰의 밀도로 접종하고 직접 형질감염시켰다. siRNA(단일 용량 스크리닝의 경우 30nM)의 형질감염을 제조업자에 의해 기술된 바와 같이 리포펙타민 2000(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, 카탈로그 번호: 11668-019)으로 실시하였다.

형질감염 24시간 후에 HuH7 및 HepG2 세포를 용해시키고 PCSK9 mRNA 수준을 프로토콜에 따라서 Quantigene Explore 키트(Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, 카탈로그 번호: QG-000-02)로 정량하였다. PCSK9 mRNA 수준을 GAP-DH mRNA에 대해 표준화하였다. 각 siRNA에 대해 8개의 개별적 데이터포인트가 수집되었다. PCSK9 유전자와 관련되지 않은 siRNA 듀플렉스를 대조군으로서 사용하였다. 소정의 PCSK9 특이적 siRNA 듀플렉스의 활성을 대조군 siRNA 듀플렉스로 처리된 세포 내의 PCSK9 mRNA에 대한 처리된 세포 내의 % PCSK9 mRNA 농도로서 표현하였다.

1차 사이노몰거스 원숭이 간세포(냉동보존됨)를 In vitro Technologies, Inc.(Baltimore, Maryland, USA, 카탈로그 번호 M00305)로부터 입수하고 37℃에서 5% CO₂를 함유한 대기하에 가습된 항온배양기 내에서 InVitroGRO CP 배지(카탈로그 번호 Z99029)에서 배양하였다.

siRNA로 형질감염시키기 위해, 1차 사이노몰거스 원숭이 세포를 96웰 플레이트내에서 3.5 x 10⁴개 세포/웰의 밀도로 콜라겐 피복된 플레이트에 접종시키고 직접 형질감염시켰다. siRNA(30nM로부터 출발하여 8개의 2배 희석액 시리즈)를 제조업자에 의해 기술된 바와 같이 리포펙타민 2000(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, 카탈로그 번호: 11668-019)으로 실시하였다.

형질감염 16시간 후에 배지를 Torpedo 항생제 혼합물(In vitro Technologies, Inc, 카탈로그 번호: Z99000)이 새로운 신선한 InVitroGRO CP 배지로 교환하였다.

배지 교환 24시간 후에 1차 사이노몰거스 세포를 용해시키고, PCSK9 mRNA 수준을 프로토콜에 따라서 Quantigene Explore 키트(Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, 카탈로그 번호: QG-000-02)로 정량하였다. PCSK9 mRNA 수준을 GAPDH mRNA에 대해 표준화하였다. 이어서, 표준화된 PCSK9/GAPDH 비를 리포펙타민 2000 단독 대조군의 PCSK9/GAPDH 비와 비교하였다.

표 1 및 2(및 도 6)은 당해 결과를 요약한 것이며 상이한 용량에서 상이한 세포주에서의 시험관내 스크리닝의 예를 제공한다. PCSK9 전사체의 사일런싱은 소정의 용량에서의 잔류하는 전사체의 비율(%)로서 표현하였다. 고도로 활성인 서열은 100nm 이하의 용량에서 소정의 siRNA로 처리한 후 잔류하는 전사체가 70% 미만인 서열이다. 매우 활성인 서열은 100nM 이하의 용량으로 처리한 후 잔류하는 전사체가 60% 미만인 서열이다. 활성 서열은 높은 용량(100nM)으로 처리한 후 잔류하는 전사체가 85% 미만인 서열이다. 활성 siRNA의 예가 또한 하기 기술하는 리피도이드 제형 중에서 마우스에서 생체내 스크리닝되었다. 시험관내에서 활성인 서열은 일반적으로 생체내에서도 활성이었다(도 6 참조).

PCSK9 siRNA의 생체내 효율 스크리닝

제형화 과정

리피도이드 LNP-01·4HCl(MW 1487)(도 1), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich) 및 PEG-세라마이드 C16(Avanti Polar Lipids)를 사용하여 지질-siRNA 나노입자를 제조하였다. 에탄올 중의 각각의 모액을 제조하였다: LNP-01, 133 mg/mL; 콜레스테롤, 25 mg/mL, PEG-세라마이드 C16, 100 mg/mL. 이어서, LNP-01, 콜레스테롤 및 PEG-세라마이드 C16 모액을 42:48:10 몰비로 배합하였다. 배합된 지질 용액을 수성 siRNA(나트륨 아세테이트 중, pH 5)와 신속하게 혼합하여 최종 에탄올 농도가 35 내지 45%가 되도록 하고, 최종 나트륨 아세테이트 농도가 100 내지 300 mM이 되도록 하였다. 지질-siRNA 나노입자는 혼합시 자발적으로 형성되었다. 목적하는 입자 크기 분포에 따라, 수득된 나노입자 혼합물을 일부 경우에 써모배럴 압출기(thermobarrel extruder)(Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc)를 사용하여 폴리카보네이트 막(100 nm 컷-오프)을 통해서 압출시켰다. 다른 경우에는 압출 단계가 생략되었다. 에탄올 제거 및 동시적 완충액 교환을 투석 또는 접선류(tangential flow) 여과에 의해 달성하였다. 완충액을 포스페이트 완충된 염수(PBS)(pH 7.2)로 교체하였다.

제형의 특성 규명

표준 방법 또는 비압출(extrusion-free) 방법으로 제조된 제형을 유사한 방식으로 특성 규명한다. 제형을 먼저 육안 조사로 특성 규명한다. 제형은 응집물 또는 침강물이 없는 담백색의 반투명 용액이여야 한다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, USA)를 사용하여 동적광산란법으로 측정한다. 입자는 크기가 20 내지 300 nm이고, 이상적으로는 40 내지 100 nm여야 한다. 입자 크기 분포는 단봉형이여야 한다. 제형 중의 총 siRNA 농도 뿐만 아니라 포획된 분획을 염료 배제 분석법으로 추산한다. 제형화된 siRNA의 샘플을 제형 붕괴 계면활성제 0.5% Triton-X100의 존재 또는 부재하에 RNA-결합 염료 리보그린(Ribogreen)(Molecular Probes)과 함께 항온처리한다. 제형 중의 총 siRNA를 표준 곡선과 비교하여, 계면활성제를 함유하는 샘플로부터의 시그날로 측정한다. 포획된 분획을 총 siRNA 함량으로부터 "유리" siRNA 함량(계면활성제의 부재하의 시그날로 측정됨)을 감산하여 측정한다. 포획된 siRNA %는 통상적으로 85% 초과이다.

일시 투여

C57/BL6 마우스(5마리/그룹, 8 내지 10주령, Charles River Laboratories, MA)에서의 제형화된 siRNA의 일시 투여를 27G 바늘을 사용하여 꼬리 정맥에 주사하여 실시하였다. siRNA를 0.5 mg/ml 농도로 LNP-01 중에 제형화하여(이어서 PBS에 대해 투석한다) 10㎕/체중g 중에 5mg/kg 용량이 전달될 수 있도록 한다. 주사를 용이하게 하기 위해, 마우스를 투여 전 약 3분 동안 적외선 램프하에 유지시켰다.

투여한지 48시간 후에 마우스를 CO₂-질식에 의해 희생시켰다. 혈액 0.2ml를 안와후 출혈에 의해 채혈하고 간을 수거하여 액체 질소 중에서 동결시켰다. 혈청 및 간을 -80℃에서 저장하였다.

동결된 간을 6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder(SPEX CentriPrep, Inc)를 사용하여 분쇄시키고 분말을 분석할 때까지 80℃에서 저장하였다.

PCSK9 mRNA 수준을 프로토콜에 따라서 QuantiGene Reagent System (Genospectra)로부터의 키트에 기초하는 분지-DNA 기술을 사용하여 검출하였다. 동결된 간 분말 10 내지 20mg을 65℃에서 3시간 동안 조직 및 세포 용해 용액(Epicentre, #MTC096H) 중의 600㎕의 0.16㎍/ml 프로테이나제 K(Epicentre, #MPRK092) 중에 용해시켰다. 이어서, 용해물 10㎕을 용해 작업 시약(Lysis Working Reagent) 90㎕(물 2용적 중의 스톡 용해 혼합물 1용적)에 부가하고 마우스 PCSK9 및 마우스 GAPDH 또는 사이클로필린 B에 대해 특이적인 프로브 셋트를 갖는 Genospectra 포획 플레이트상에서 52℃에서 밤새 항온처리하였다. 캡처 익스텐더(CE; Capture Extender), 라벨 익스텐더(LE; Label Extender) 및 블로킹(BL; blocking) 프로브에 대한 핵산 서열을 QuantiGene ProbeDesigner 소프트웨어 2.0(Genospectra, Fremont, CA, USA, 카탈로그 번호: QG-002-02)을 사용하여 PCSK9, GAPDH 및 사이클로필린 B의 핵산 서열로부터 선별하였다. 화학발광을 Victor2-Light(Perkin Elmer)에서 상대적 광 단위로서 판독하였다. 간 용해물 중의 PCSK9 mRNA 대 GAPDH 또는 사이클로필린 B mRNA의 비를 각 처리군에 대해서 평균치를 구하고 PBS로 처리된 대조군 또는 비관련 siRNA(혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군과 비교하였다.

마우스 혈청 중의 총 혈청 콜레스테롤을 제조업자의 지시에 따라서 StanBio Cholesterol LiquiColor 키트(StanBio Laboratoriy, Boerne, Texas, USA)를 사용하여 측정하였다. 측정은 495 nm에서 Victor2 1420 Multilabel 계수기(Perkin Elmer)에서 수행하였다.

실시예

LNP-01 리포좀에 제형화된 32개의 PCSK9 siRNA를 마우스 모델에서 생체내 시험하였다. 실험은 5mg/kg siRNA 용량에서 실시하였으며, 10개 이상의 PCSK9 siRNA는 PBS로 처리된 대조군과 비교한 경우 40% 초과의 PCSK9 mRNA 녹다운(knock down)을 나타낸 반면에, 비관련 siRNA(혈액 응고 인자 VII)로 처리된 대조군은 효과가 없었다(도 2 내지 5). PCSK9 전사체의 사일런싱은 이들 동물에서 콜레스테롤의 저하와도 상관관계가 있었다(도 4 및 5). 또한, 시험관내에서 활성인 분자와 생체내에서 활성인 분자 사이에 강력한 상관관계가 있었다(도 6). 상이한 화학적 변형을 함유하는 서열을 또한 시험관내(표 1 및 2) 및 생체내에서 스크리닝하였다. 예로서, 덜 변형된 서열 9314 및 9318, 및 서열 9314-(10792, 10793 및 10796); 9318-(10794, 10795, 10797)의 보다 변형된 버젼을 LNP-01 중에서 제형화하여 시험관내(1차 원숭 간세포에서) 또는 생체내(9314 및 10792) 둘다에서 시험하였다. 도 7(표 1 및 2를 또한 참조)은 모 분자 9314 및 9318와 변형된 버젼이 모두 시험관내에서 활성임을 보여준다. 예로서 도 8은 모 9314 및 보다 고도로 변형된 10792 서열 둘다가 생체내에서 활성이며 마우스에서 내인성 PCSK9의 50 내지 60% 사일런싱을 나타냄을 보여준다. 도 9는 추가로 모 9314 및 10792의 다른 화학적으로 변형된 버젼의 활성을 예시한다.

dsRNA 발현 벡터

본 발명의 다른 측면에서, PCSK9 유전자 발현 활성을 조정하는 PCSK9 특이적 dsRNA 분자는 DNA 또는 RNA 벡터 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다[참조: Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., 국제 PCT, 공보 제WO 00/22113호, Conrad, 국제 PCT 공보 제WO 00/22114호, 및 Conrad, 미국 특허 제6,054,299호]. 이들 전이유전자(transgene)는 선형 작제물, 환형 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 도입시킬 수 있으며, 이는 숙주 게놈내로 통합된 전이유전자로서 혼입되고 유전될 수 있다. 전이유전자는 또한 이것이 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 작제할 수도 있다[참조: Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292].

dsRNA의 개별적 쇄는 2개의 별도의 발현 벡터상에서 프로모터에 의해 전사되어 표적 세포로 공동 형질감염될 수 있다. 또는, dsRNA의 각 개별적 쇄는 이와 동일한 발현 플라스미드상에 위치하는 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 바람직한 양태에서, dsRNA는 링커 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 연결된 역 반복체로서 발현되어, 당해 dsRNA는 스템-루프(stem and loop) 구조를 갖게 된다.

재조합 dsRNA 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. dsRNA 발현 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스[참조: Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)]; 아데노바이러스[참조: 예를 들면, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616, Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434, 및 Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155]; 또는 알파바이러스 및 당업계에 공지된 기타 바이러스에 기초하여 작제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 레트로바이러스는 시험관내 및/또는 생체내에서 상피 세포를 포함하는 많은 상이한 세포 유형 내로 다양한 유전자를 도입시키는데 사용되어 왔다[참조: Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferryet al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; 미국 특허 제4,868,116호; 미국 특허 제4,980,286호; PCT 출원 제WO 89/07136호; PCT 출원 제WO 89/02468호; PCT 출원 제WO 89/05345호; 및 PCT 출원 제WO 92/07573호]. 세포의 게놈내로 삽입된 유전자를 형질도입하고 발현할 수 있는 재조합 레트로바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 게놈을 PA317 및 Psi-CRIP와 같은 적합한 패키징 세포주 내로 형질감염시켜 생산할 수 있다[참조: Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349]. 재조합 아데노바이러스 벡터는 감수성 숙주(예: 랫트, 햄스터, 개 및 침팬지)에서 광범위한 세포 및 조직을 감염시키는데 사용될 수 있고[참조: Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769], 또한 감염을 위해 유사분열 면에서 활성인 세포를 요구하지 않는다는 이점을 갖고 있다.

본 발명의 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터에서의 dsRNA 발현을 구동하는 프로모터는 진핵성 RNA 폴리머라제 I(예: 리보솜 RNA 프로모터), RNA 폴리머라제 II(예: CMV 조기발현 프로모터 또는 액틴 프로모터 또는 U1 snRNA 프로모터) 또는 일반적으로 RNA 폴리머라제 III 프로모터(예: U6 snRNA 또는 7SK RNA 프로모터) 또는 원핵성 프로모터, 예를 들면, T7 프로모터일 수 있으며, 단 발현 플라스미드는 T7 프로모터로부터의 전사를 위해 요구되는 T7 RNA 폴리머라제를 암호화한다. 프로모터는 또한 전이유전자 발현을 췌장으로 지시할 수도 있다[예를 들면, 췌장에 대한 인슐린 조절성 서열 (참조: Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)].

또한, 전이유전자의 발현은 예를 들면, 특정 생리학적 조절인자, 예를 들면, 순환 글루코오즈 수준 또는 호르몬에 대해 민감성인 조절 서열과 같은 유도성 조절 서열 및 발현 시스템을 사용하여 정확하게 조절할 수 있다[참조: Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24]. 세포 또는 포유동물에서의 전이유전자 발현의 조절에 적합한 이러한 유도성 발현 시스템은 엑디손, 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라사이클린, 이량체화의 화학적 유도제 및 이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노사이드(EPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자라면 dsRNA 전이유전자의 의도된 사용에 기초하여 적절한 조절/프로모터 서열을 선택할 수 있을 것이다.

일반적으로, dsRNA 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 하기와 같이 전달되며 표적 세포에서 유지된다. 또는, dsRNA 분자의 일시적 발현을 제공하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 필요에 따라 반복 투여될 수 있다. 일단 발현되면, dsRNA는 표적 RNA에 결합하고 이의 기능 또는 발현을 조정한다. dsRNA 발현 벡터의 전달은 정맥내 또는 근육내 투여, 환자로부터 체외이식된 표적 세포로 투여한 후의 환자로의 재도입 또는 목적 표적 세포로 도입되도록 하는 임의의 다른 수단에 의한 것과 같은 전신적 전달일 수 있다.

dsRNA 발현 DNA 플라스미드는 통상적으로 양이온성 지질 담체(예: 올리고펙타민) 또는 비양이온성 지질-기반 담체(예: Transit-TKO^TM)와의 복합체로서 표적 세포내로 형질감염된다. 1주 이상의 기간에 걸쳐서 단일 PCSK9 유전자 또는 다수의 PCSK9 유전자의 상이한 영역을 표적화하는 dsRNA-매개된 녹다운을 위한 다수의 지질 형질감염도 또한 본 발명에서 고려된다. 숙주 세포내로의 본 발명의 벡터의 성공적 도입은 다양한 공지된 방법을 사용하여 모니터할 수 있다. 예를 들면, 일시적 형질감염은 리포터, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 마커를 사용하여 감지할 수 있다. 생체외 세포의 안정한 형질감염은 형질감염된 세포에 하이그로마이신 B 내성과 같이 특이적 환경 인자(예: 항생제 및 약물)에 대한 내성을 제공하는 마커를 사용하여 확인할 수 있다.

PCSK9 특이적 dsRNA 분자는 또한 벡터내로 삽입되어 사람 환자용 유전자 요법 벡터로서 사용될 수도 있다. 유전자 요법 벡터는 예를 들면, 정맥내 주사, 국소 투여[참조: 미국 특허 제5,328,470호] 또는 정위 주사(stereotactic injection)[참조: Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057]에 의해 피험체에게 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약제학적 제제는 허용되는 희석제 중에 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 요법 비히클이 매립되어진 서방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 또는, 완전한 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 온전한 상태로 생산될 수 있는 경우, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.

당업자는 본원 명세서에서 구체적으로 제시한 것들 이외에 이하 첨부된 전체 청구의 범위까지 본 발명을 실시할 수 있도록 하는 방법 및 조성물을 잘 알고 있다.

[표 1a]

[표 1b]

[표 1c]

[표 1d]

[표 1e]

[표 1f]

[표 1g]

[표 1h]

[표 1i]

[표 1j]

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[표 1n]

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[표 1q]

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[표 1s]

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[표 1u]

[표 1v]

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[표 1x]

[표 1y]

[표 1z]

[표 1za]

[표 1zb]

[표 1zc]

[표 1zd]

[표 1ze]

[표 1zf]

[표 2a]

[표 2b]

[표 2c]

[표 2d]

서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

1. 세포에서 사람 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현을 억제하기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA)으로서,
   상기 dsRNA가 서로 상보적인 2개 이상의 서열로 이루어지고, 센스 쇄가 제1 서열로 이루어지고, 안티센스 쇄가 PCSK9를 암호화하는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 상보적인 상보성 영역을 포함하는 제2 서열로 이루어지며, 상기 상보성 영역이 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만이고, 상기 dsRNA가, 상기 PCSK9를 발현하는 세포와 접촉시, 상기 PCSK9 유전자의 발현을 억제하고,
   여기서,
   (a) 상기 제1 서열이 서열번호 1229의 서열이고 상기 제2 서열이 서열번호 1230의 서열이거나,
   (b) 상기 제1 서열이 서열번호 1227의 서열이고 상기 제2 서열이 서열번호 1228의 서열이거나,
   (c) PCSK9을 암호화하는 상기 mRNA의 일부분이 데이타베이스 엔트리 NM_174936의 mRNA 서열의 3530번 내지 3548번 위치의 서열인,
   세포에서 사람 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
3. 제2항에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 그룹에 연결된 말단 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 록드(locked) 뉴클레오타이드, 무염기(abasic) 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트 및 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 리간드에 접합되거나 탄수화물 클러스터 리간드에 접합되는 것인, 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 리포좀 제형 또는 양이온성 리포좀 제형 내에 있는 것인, 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 리간드 또는 탄수화물 클러스터 리간드에 접합되고 dsRNA가 리포좀 제형 또는 양이온성 리포좀 제형 내에 있는 것인, 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 유기체에서 고지혈증을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
8. 제4항에 따른 dsRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 유기체에서 고지혈증을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
9. 제5항에 따른 dsRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 유기체에서 고지혈증을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
10. 제7항에 있어서, 조성물이 정맥내 투여되는 것인 약제학적 조성물.
11. 제8항에 있어서, 조성물이 정맥내 투여되는 것인 약제학적 조성물.
12. 제9항에 있어서, 조성물이 정맥내 투여되는 것인 약제학적 조성물.
13. (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA를 세포내로 도입하는 단계, 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 생성된 세포를 PCSK9 유전자의 mRNA 전사체가 분해되는데 충분한 시간 동안 유지시켜, 당해 세포에서의 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 단계
    를 포함하는, 세포에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 시험관내 방법.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PCSK9 유전자 발현을 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정을 치료하거나 예방하거나 관리하기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
15. 제1항의 (c)에서 정의된 dsRNA의 하나 이상의 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 세포에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터.
16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA 또는 제15항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 사람 PCSK9 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA).
    

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