CN102712925B - 通过抑制sirtuin(sirt)的天然反义转录物来治疗sirtuin(sirt)相关性疾病 - Google Patents

通过抑制sirtuin(sirt)的天然反义转录物来治疗sirtuin(sirt)相关性疾病 Download PDF

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Abstract

本发明涉及调节Sirtuin(SIRT)的表达和/或功能，特别是通过靶向Sirtuin(SIRT)的天然反义多核苷酸进行调节的反义寡核苷酸。本发明还涉及所述反义寡核苷酸的鉴别和其在治疗与Sirtuin(SIRT)的表达有关的疾病和病症中的用途。

Description

通过抑制SIRTUIN(SIRT)的天然反义转录物来治疗SIRTUIN (SIRT)相关性疾病
技术领域
本申请要求2009年7月24日提交的美国临时专利申请No.61/228,392、2009年11月6日提交的美国临时专利申请No.61/259,072、2009年12月2日提交的PCT专利申请No.PCT/US09/66445、2010年3月3日提交的PCT专利申请No.PCT/US10/26119和2010年5月3日提交的美国临时专利申请No.61/330,427的优先权。
本发明的实施方案包括调节Sirtuin(SIRT)的表达和/或功能的寡核苷酸和相关分子。
背景技术
DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于多个方面的核酸功能(包括DNA复制、转录和翻译)是重要的。杂交还是检测特定核酸或改变其表达的多种技术的关键。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交，由此干扰RNA拼接、转录、翻译和复制来扰乱基因表达。反义DNA还具有DNA-RNA杂交体充当核糖核酸酶H(一种存在于大部分细胞类型中的活性)消化的底物的附加特征。反义分子可递送到细胞中，如同在寡脱氧核苷酸(ODN)的情况下，或者其可由内源性基因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药物VITRAVENETM(用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎)，反映反义分子具有治疗效用。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供通过使用靶向天然反义转录物的任何区的反义寡核苷酸来抑制天然反义转录物的作用，从而使相应有义基因得到上调的方法。本文中还预期，抑制天然反义转录物可利用siRNA、核酶和小分子达成，这些分子视为在本发明的范围内。
一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与包含以下序列内5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50％序列同一性：SEQ ID NO：5的核苷酸1至1028或SEQ ID NO：6的核苷酸1至429或SEQ ID NO：7的核苷酸1至156或SEQ ID NO：8的核苷酸1至593、SEQ ID NO：9的1至373、SEQ ID NO：10的1至1713、SEQ ID NO：11的1至660、SEQ ID NO：12的1至589、SEQID NO：13的1至428和SEQ ID NO：14的1至4041，由此在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。
在另一实施方案中，寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸(例如SEQ ID NO：5至14中所述的核苷酸)的天然反义序列和其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO：15至94所述。
另一实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的反义分子的反向互补序列具有至少50％序列同一性；由此在体内或体外调节所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。
另一实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与Sirtuin(SIRT)反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％序列同一性；由此在体内或体外调节所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。
在一个实施方案中，组合物包含一种或多种结合有义和/或反义Sirtuin(SIRT)多核苷酸的反义寡核苷酸。
在另一实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个经过修饰或取代的核苷酸。
在另一实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个经过修饰的键。
在另一实施方案中，经过修饰的核苷酸包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-O-甲基、氟-或碳、亚甲基或其它锁核酸(locked nucleic acid；LNA)分子的修饰碱基。经过修饰的核苷酸优选为锁核酸分子，包括α-L-LNA。
在另一实施方案中，寡核苷酸是皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内施用于患者。
在另一实施方案中，寡核苷酸是以药物组合物形式施用。治疗方案包括向患者施用至少一次反义化合物；然而，此治疗可修改为包括一段时间内的多次剂量。所述治疗可与一种或多种其它类型的疗法组合。
在另一实施方案中，寡核苷酸囊封于脂质体中或连接于载体分子(例如胆固醇、TAT肽)。
其它方面在下文进行描述。
附图说明
图1和图2示出针对SIRT反义分子CV396200设计的寡核苷酸的实时PCR结果。所述结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用一种针对sirtas设计的siRNA(sirtas_5，P＝0.01)处理48小时后显著增加。在相同样品中，sirtas RNA的水平在用sirtas_5处理后显著降低，但在用sirtas_6和sirtas_7处理后未改变，sirtas_6和sirtas_7对SIRT1mRNA水平也没有影响(图2)。sirtas_5、sirtas_6和sirtas_7分别对应于SEQ ID NO：38、39和40。
图3示出SIRT反义分子上寡核苷酸行走的结果。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用三种针对sirtas设计的反义寡核苷酸处理48小时后显著增加。CUR-0292至CUR-0309分别对应于SEQ ID NO：15至32。
图4和图5示出在HepG2(图4)和Vero76(图5)细胞中经过PS、LNA和2’O Me修饰的寡核苷酸的结果。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用针对SIRT1反义分子的经过PS、LNA、2’O Me和2’O Me混合寡聚物设计的反义寡核苷酸处理48小时后显著增加。Vero细胞中SIRT1mRNA的水平在用经过PS和LNA修饰的SIRT1反义分子的反义寡核苷酸处理48小时后也增加。表示为CUR-0245、CUR-0736、CUR 0688、CUR-0740和CUR-0664的柱条分别对应于SEQ ID NO：33至37。
图6示出猴脂肪组织活检的PCR结果。实时PCR结果表明来自给予CUR-963(一种针对SIRT1反义分子CV396200.1设计的寡核苷酸)的猴的脂肪组织活检中的SIRT1mRNA水平增加。CUR-963对应于SEQ ID NO：34。
图7示出原代猴肝细胞的PCR结果。实时PCR结果表明SIRT1mRNA水平在用针对SIRT1反义分子的寡核苷酸处理后增加。表示为CUR-0245的柱条对应于SEQ ID NO：33。
图8示出针对SIRT反义分子CV396200设计的寡核苷酸的结果。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在一种针对SIRT1反义分子CV396200设计的寡核苷酸中显著增加。表示为CUR-1230、CUR-1231、CUR-1232和CUR-1233的柱条对应于SEQ ID NO：41至44。
图9示出针对SIRT反义分子CV428275设计的寡核苷酸的结果。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在两种针对SIRT1反义分子CV428275设计的寡核苷酸中显著增加。表示为CUR-1302、CUR-1304、CUR-1303和CUR-1305的柱条对应于SEQ ID NO：45至48。
图10示出实时PCR结果。结果表明HepG2细胞中的SIRT1mRNA水平在用一种针对SIRT反义分子BE717453设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加。表示为CUR-1264、CUR1265和CUR-1266的柱条分别对应于SEQ ID NO：49至51。
图11示出实时PCR结果。结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用三种针对SIRT1反义分子AV718812设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加。表示为CUR-1294、CUR-1297、CUR-1295、CUR-1296和CUR-1298的柱条分别对应于SEQ ID NO：52至56。
图12为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000(Lipofectamine 2000)引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理HepG2细胞后SIRT1mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用两种针对SIRT1反义分子AW169958设计的寡聚物处理48小时后显著增加。表示为CUR-1381、CUR-1382、CUR-1383和CUR-1384的柱条分别对应于用SEQ ID NO：57至60处理的样品。
图13为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理3T3细胞后SIRT1mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明3T3细胞中SIRT1mRNA的水平在用三种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加。表示为CUR-0949、CUR-0842、CUR-1098和CUR-1099的柱条分别对应于用SEQID NO：67、61、71和72处理的样品。
图14为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理3T3细胞后SIRT1mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明3T3细胞中SIRT1mRNA的水平在用五种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加。表示为CUR-0948、CUR-0949、CUR-0950、CUR-0951、CUR-0846和CUR-0844的柱条分别对应于用SEQ ID NO：66至69、65和63处理的样品。
图15为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理3T3细胞后SIRT1mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用两种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加。表示为CUR-0842、CUR-0844和CUR-0845的柱条分别对应于用SEQ ID NO：61、63和64处理的样品。
图16为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理3T3细胞后SIRT1mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用两种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加。表示为CUR-0843、CUR-0846的柱条分别对应于用SEQ ID NO：62和65处理的样品。
图17为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理HepG2细胞后Sirtuin3mRNA的倍数变化+标准偏差。RT PCR结果表明HepG2细胞中的sirt3水平在用针对sirt3反义分子Hs.683117设计的硫代磷酸酯反义寡核苷酸(CUR-1545-1550)处理48小时后增加。表示为CUR-0551、CUR-1552、CUR-1555、CUR-1556、CUR-1553、CUR-1554、CUR-1545、CUR-1546、CUR-1548、CUR-1549、CUR-1550和CUR-1547的柱条分别对应于用SEQ ID NO：73至84处理的样品。
图18为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理HepG2细胞后SIRT6mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT6mRNA的水平在用一种针对SIRT6反义分子NM_133475设计的寡聚物处理48小时后显著增加。表示为CUR-0873、CUR-0869至CUR-0871、CUR-0874和CUR-0872的柱条分别对应于用SEQ ID NO：85至90处理的样品。
图19为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理HepG2细胞后SIRT6mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRT6mRNA的水平在用一种针对SIRT6反义分子bf772662设计的寡聚物处理48小时后显著增加。表示为CUR-0878、CUR-0876、CUR-0877和CUR-0875的柱条分别对应于用SEQ IDNO：91至94处理的样品。
图20为实时PCR结果的图，其示出与对照相比，在用使用脂染胺2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理DBS-FCL-1细胞后SIRT6mRNA的倍数变化+标准偏差。实时PCR结果表明DBS-FCL-1细胞中SIRT6mRNA的水平在用两种针对SIRT6反义分子bf772662设计的寡聚物和一种针对NM_133475设计的寡聚物处理48小时后显著增加。表示为CUR-0876、CUR-0878、CUR-0875和CUR-0874的柱条分别对应于用SEQ ID NO：92、91、94和89处理的样品。
序列表描述
SEQ ID NO：1：智人(Homo sapiens)sirtuin(沉默接合型信息调控2同源物)1(酿酒酵母(S.cerevisiae))(SIRT1)，mRNA(NCBI保藏编号：NM_012238.3)
SEQ ID NO：2：小家鼠(Mus musculus)sirtuin 1(沉默接合型信息调控2，同源物)1(酿酒酵母(S.cerevisiae))(SIRT1)mRNA(NCBI保藏编号：NM_001159589)
SEQ ID NO：3：智人sirtuin(沉默接合型信息调控2同源物)3(酿酒酵母)(SIRT3)，转录物变体1，mRNA(NCBI保藏编号：NM_012239.5)。
SEQ ID NO：4：智人sirtuin 6(SIRT6)，转录物变体1，mRNA(NCBI保藏编号：NM_016539)。
SEQ ID NO：5：扩增的天然反义序列(CV396200-扩增)
SEQ ID NO：6：天然反义序列(CV428275)
SEQ ID NO：7：天然反义序列(BE717453)
SEQ ID NO：8：天然反义序列(AV718812)
SEQ ID NO：9：天然SIRT1反义序列(AW169958)
SEQ ID NO：10：天然SIRT1小鼠反义序列(AK044604)
SEQ ID NO：11：天然SIRT3反义序列(Hs.683117)
SEQ ID NO：12：天然SIRT3反义序列(DA645474)
SEQ ID NO：13：天然SIRT6反义序列(BF772662)
SEQ ID NO：14：天然SIRT6反义序列(ANKRD24)
SEQ ID NO：15至94：反义寡核苷酸。*指示硫代磷酸酯键，+指示LNA且m指示2’O Me
SEQ ID NO：95至98-SEQ ID NO：95对应于SIRT1天然反义分子CV396200的外显子4，SEQ ID NO：96、97和98分别对应于正向引物序列、反向引物序列和报导序列。
SEQ ID NO：99对应于CUR 962，*指示硫代磷酸酯键且+指示LNA。
具体实施方式
本发明的若干方面在下文参考用于说明的示例性应用进行描述。应了解，阐述众多具体细节、关系和方法以提供对本发明的充分了解。然而，本领域的普通技术人员将容易认识到，本发明可在没有一个或多个所述具体细节下或利用其它方法加以实施。本发明不受作用或事件的次序限制，同样一些作用可以不同次序发生和/或与其它作用或事件同时发生。此外，并非所有作用或事件均为实施本发明的方法所需。
本文公开的所有基因、基因名称和基因产物意欲对应于来自本文公开的组合物和方法适用的任何物种的同源物。因此，所述术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应了解，当公开来自特定物种的基因或基因产物时，此公开内容意欲仅具示例性，且不欲解释为具限制性，除非其所出现的上下文中明确说明。因此，例如，对于在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列的本文公开的基因，意欲涵盖来自其它动物(包括但不限于其它哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类)的同源性和/或直系同源性基因和基因产物。在实施方案中，基因或核酸序列是人的。
定义
本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的且不欲限制本发明。如本文所用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”意欲也包括复数形式。此外，至于术语“包括(including/includes)”、“具有(having/has/with)”和其变体在详细描述和/或权利要求书中使用的程度，所述术语意欲与术语“包含(comprising)”类似的方式具有包含性。
术语“约”或“大致”意谓如本领域的普通技术人员所确定的特定值在可接受的误差范围内，所述误差范围部分取决于所述值如何测量或测定，即测量系统的限制。例如，“约”可意谓根据本领域中的实践，在1个或大于1个标准偏差以内。或者，“约”可意谓指定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％且更优选至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或方法，所述术语可意谓在值的一个数量级以内，优选在5倍以内，且更优选在2倍以内。当特定值在申请和权利要求书中描述时，除非另外规定，否则应假定术语“约”意谓在特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，术语“mRNA”意谓靶基因的当前已知的mRNA转录物和可阐明的任何其它转录物。
“反义寡核苷酸”或“反义化合物”意谓结合另一RNA或DNA(靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，那么其借助于RNA-RNA相互作用结合另一RNA标靶或改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。所述定义意欲包括从治疗、诊断或其它观点来看适用的任何外来RNA或DNA分子。所述分子包括例如反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶性RNA、治疗性编接RNA和激动与拮抗RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、替代性拼接物、引物、探针和与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物形式引入。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物或其模拟物。术语“寡核苷酸”还包括天然和/或经过修饰的单体或键联的线性或环状寡聚物，所述单体或键联包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其取代和α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过常规单体-单体相互作用模式结合靶多核苷酸，所述模式如Watson-Crick型碱基配对、或反式型碱基配对等。
寡核苷酸可为“嵌合”的，即，由不同区构成。在本发明的上下文中，“嵌合”化合物是含有两个或多个区(例如DNA区、RNA区、PNA区等)的寡核苷酸。各化学区由至少一个单体单元构成，即，在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸。这些寡核苷酸通常包括至少一个区，其中所述寡核苷酸经过修饰以便展现一种或多种所要性质。寡核苷酸的所要性质包括但不限于例如对核酸酶降解的抗性增强、细胞摄取增加和/或对靶核酸的结合亲和力增强。因此寡核苷酸的不同区可具有不同性质。本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或多种寡核苷酸、经过修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸类似物的混合结构。
寡核苷酸可由可“对齐(register)”连接的区构成，即，此时单体连续连接(如在天然DNA中)或经由间隔子连接。间隔子意欲构成区之间的共价“桥”且在一些情况下具有不超过约100个碳原子的长度。间隔子可承载不同功能，例如具有正电荷或负电荷、携带特殊核酸结合性质(嵌入剂、沟结合剂、毒素、荧光体等)、具亲脂性、诱导特殊二级结构(如诱导α-螺旋的含丙氨酸肽)。
如本文所用，“Sirtuins(SIRT)”包括所有家族成员、突变体、等位基因、片段、物种、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。
如本文所用，用词Sirtuin1、SIRT1、sirtuin、沉默接合型信息调控2同源物1、hSIR2、hSIRT1、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin-1、SIR2L1、SIR2样蛋白1在文献中视为相同的且在本申请中可互换使用。
如本文所用，用词‘Sirtuin 3’、Sirtuin3、Sirtuin-3、SIRT3、SIRT-3、hSIRT3、线粒体NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin-3、SIR2L3、SIR2样蛋白3在本申请中可互换使用。
如本文所用，用词‘Sirtuin 6’、Sirtuin6、Sirtuin-6、SIRT6、SIRT-6、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin-6、SIR2L6、SIR2样蛋白6在文献视为相同的且在本申请中可互换使用。
如本文所用，术语“对......具特异性的寡核苷酸”或“靶向......的寡核苷酸”是指具有以下序列的寡核苷酸：(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合物，或(ii)能够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体。所述复合物和双链体的稳定性可通过理论计算和/或体外测定加以确定。用于确定杂交复合物和双链体的示例性测定描述于以下实施例中。
如本文所用，术语“靶核酸”涵盖DNA、从所述DNA转录的RNA(包括前mRNA和mRNA)以及来源于所述RNA的cDNA、编码、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰所述核酸的正常功能。由与靶核酸特异性杂交的化合物对所述靶核酸的功能进行的此调节通常称为“反义”。所欲干扰的DNA的功能包括例如复制和转录。所欲干扰的RNA的功能包括所有关键功能，如RNA至蛋白质翻译位点的转位、蛋白质从所述RNA的翻译、由所述RNA产生一种或多种mRNA物质的拼接、和可作用于所述RNA或由所述RNA促进的催化活性。对靶核酸功能的所述干扰的总体效应是调节所编码产物或寡核苷酸的表达。
RNA干扰“RNAi”由对其“靶”核酸序列具有序列特异性同源性的双链RNA(dsRNA)分子介导。在本发明的某些实施方案中，介体是5-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。siRNA由称为Dicer的RNA酶对dsRNA的加工产生。siRNA双链体产物被招募到称为RISC(RNA诱导的拼接复合物)的多蛋白siRNA复合物中。不希望受任何特定理论限制，相信RISC随后被导引到靶核酸(适当地为mRNA)，在此处siRNA双链体以序列特异性方式发生相互作用以催化方式介导裂解。可根据本发明使用的小干扰RNA可以根据本领域中所熟知和本领域的普通技术人员所熟悉的程序合成和使用。用于本发明方法中的小干扰RNA适当地包含约1至约50个之间的核苷酸(nt)。在非限制性实施方式的实例中，siRNA可以包含约5至约10个nt，约5至约30个nt，约10至约30个nt，约15至约25个nt，或约20-25个核苷酸。
通过使用自动比对核酸序列并且指示同一性或同源性区的计算机程序来促进适当寡核苷酸的选择。使用所述程序比较例如通过搜索数据库(如GenBank)或对PCR产物进行测序所获得的核酸序列。比较来自多种物种的核酸序列允许选择显示适当程度的物种间同一性的核酸序列。在尚未进行测序的基因的情况下，进行DNA印迹分析以允许测定靶物种和其它物种中基因之间的同一性程度。通过如本领域中所熟知以不同程度的严谨度执行DNA印迹分析，可获得同一性的近似量度。这些程序允许选择展现与所欲控制的受试者的靶核酸序列具有高度互补性和与其它物种的相应核酸序列具有较低程度互补性的寡核苷酸。本领域的技术人员将认识到，在选择用于本发明的适当基因区时存在相当大的宽容度。
“酶性RNA”意谓具有酶促活性的RNA分子。酶性核酸(核酶)通过首先与靶RNA结合来起作用。所述结合通过酶性核酸的标靶结合部分进行，所述标靶结合部分保持与分子中起作用裂解靶RNA的酶性部分紧密邻近。因此，酶性核酸通过碱基配对首先识别并接着结合靶RNA，并且一旦与正确位点结合即起酶的作用以切割靶RNA。
“诱饵RNA”意谓模拟配体的天然结合结构域的RNA分子。因此诱饵RNA与天然结合标靶竞争特异性配体的结合。例如，已显示HIV反式活化反应(TAR)RNA的过度表达可充当“诱饵”并有效结合HIV tat蛋白，由此防止其与HIV RNA中所编码的TAR序列结合。此意欲为一个特定实例。本领域的技术人员将认识到，这仅是一个实例，并且其它实施方案可使用本领域中通常已知的技术容易地产生。
如本文所用，术语“单体”通常表示由磷酸二酯键或其类似物连接形成大小在数个单体单元(例如约3-4个)至约数百个单体单元范围内的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键联的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分描述。
术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本领域的技术人员应了解，先前视为“非天然存在”的各种核苷酸后来已在自然界中发现。因此，“核苷酸”不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且还包括杂环类似物和其互变异构体。其它类型核苷酸的说明性实例是含有以下的分子：腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6，N6-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和美国专利No.5,432,272中所述的“非天然存在”的核苷酸。术语“核苷酸”意欲涵盖每一和全部所述实例以及其类似物和互变异构体。尤其受到关注的核苷酸是含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其在涉及到人中的治疗和诊断应用时视为天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2′-脱氧和2′-羟基糖，例如如Kornberg和Baker，DNAReplication，第2版(Freeman，San Francisco，1992)中所述，以及其类似物。
提及核苷酸时的“类似物”包括具有经过修饰的碱基部分和/或经过修饰的糖部分的合成核苷酸。所述类似物包括经过设计以增强结合性质的合成核苷酸，例如双链体或三链体稳定性、特异性等。
如本文所用，“杂交”意谓寡聚化合物的实质上互补链的配对。一种配对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键，所述氢键可以是Watson-Crick、或反向氢键。例如，腺嘌呤与胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核苷酸。杂交可以在不同情形下发生。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能从而引起功能和/或活性的调节，并且存在足够程度的互补以在需要特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性处理的情况下在生理条件下，和在体外测定的情况下在执行测定的条件下)避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合时，所述反义化合物“可特异性杂交”。
如本文所用，用语“严谨杂交条件”或“严谨条件”是指本发明与其靶序列杂交但与最少数量的其它序列杂交的条件。严谨条件具有序列相关性且在不同情况下和在本发明的情形中不同，寡聚化合物与靶序列杂交的“严谨条件”由所述寡聚化合物的性质和组成以及用以对其进行研究的测定确定。一般来说，严谨杂交条件包括低浓度(＜0.15M)的具有无机阳离子(如Na++或K++)的盐(即，低离子强度)，高于寡聚化合物：靶序列复合物的Tm以下20℃-25℃的温度，和存在变性剂(如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜或清洁剂十二烷基硫酸钠(SDS))。例如，每1％甲酰胺使杂交速率降低1.1％。高严谨度杂交条件的一实例是0.1X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0.1％(w/v)SDS，60℃下30分钟。
如本文所用的“互补”是指一条或两条寡聚物链上两个核苷酸之间精确配对的能力。举例来说，如果反义化合物某一位置上的核苷碱基能够与靶核酸某一位置上的核苷碱基形成氢键，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么寡核苷酸与靶核酸之间形成氢键的位置视为互补位置。如果寡聚化合物与其它DNA、RNA或寡核苷酸分子各自中足够数量的互补位置被可彼此形成氢键的核苷酸占据，那么所述分子彼此互补。因此，“可特异性杂交”和“互补”是用于说明足够数量的核苷酸上具有足够程度的精确配对或互补使得在寡聚化合物与靶核酸之间发生稳定且特异性的结合的术语。
在本领域中应了解，寡聚化合物的序列无需与其可特异性杂交的靶核酸100％互补。然而，寡核苷酸可在一个或多个区段上杂交，使得插入或相邻区段不牵涉到杂交事件中(例如环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物与其所靶向的靶核酸序列内的靶区包含至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约99％序列互补性。例如，反义化合物的20个核苷酸中有18个与靶区互补且因此将特异性杂交的所述反义化合物将呈现90％互补性。在此实例中，其余非互补核苷酸可丛集或散布于互补核苷酸中且无需彼此或与互补核苷酸毗连。因此，长18个核苷酸且具有4(四)个非互补核苷酸侧接两个与靶核酸完全互补的区的反义化合物将与靶核酸具有77.8％总体互补性且因此将处于本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区的互补性百分比可根据常规使用本领域中已知的BLAST程序(基础局部比对搜索工具(basic localalignment search tools))和PowerBLAST程序确定。同源性、序列同一性或互补性百分比可利用例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wis.)，使用缺省设置来确定，所述程序使用Smithand Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，(1981)2，482-489)。
如本文所用，术语“热熔点(Tm)”是指在规定离子强度、pH值和核酸浓度下，平衡时与靶序列互补的寡核苷酸的50％与靶序列杂交时的温度。通常，严谨条件对于短寡核苷酸(例如10个50核苷酸)来说是在pH 7.0至8.3下盐浓度为至少约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)且温度为至少约30℃的条件。严谨条件还可通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达成。
如本文所用，“调节”意谓基因的表达增加(刺激)或减少(抑制)。
术语“变体”当在多核苷酸序列的情形中使用时可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。此定义还可包括例如“等位基因”、“拼接”、“物种”或“多态”变体。拼接变体可与参考分子具有显著的同一性，但由于在mRNA加工期间外显子的替代性拼接而具有较多或较少数量的多核苷酸。相应多肽可具有附加功能结构域或缺乏结构域。物种变体为在一个物种中与另一物种不同的多核苷酸序列。野生型基因产物的变体在本发明中特别适用。变体可由核酸序列中的至少一个突变产生，并且可产生改变的mRNA或者结构或功能可能发生改变或可能不发生改变的多肽。任何指定天然或重组基因可不具有、具有一种或多种等位基因形式。产生变体的普通突变变化通常归结于核苷酸的天然缺失、添加或取代。此等类型的变化各自在指定序列中可单独或与其它变化组合发生一次或多次。
所产生的多肽相对彼此一般将具有显著氨基酸同一性。多态变体是指定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。多态变体还可涵盖“单核苷酸多态现象”(SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列有一个碱基不同。SNP的存在可指示例如某一群体具有患一种疾病病况的倾向，即易感性与抗性。
衍生多核苷酸包括经过化学修饰的核酸，例如氢被烷基、酰基或氨基置换。衍生物(例如衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，如改变的糖部分或糖间键联。其中的示例性键联包括硫代磷酸酯和本领域中已知的其它含硫物质种类。衍生核酸还可含有标记，包括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、发色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等。
“衍生”多肽或肽是通过例如糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶合或适度福尔马林处理进行修饰的多肽或肽。衍生物还可以经过修饰以直接或间接含有可检测标记，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。
如本文所用，术语“动物”或“患者”意欲包括例如人、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、水貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形动物。
“哺乳动物”涵盖通常处于医学照料下的温血哺乳动物(例如人和驯养动物)。实例包括猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物和人，以及仅仅是人。
“治疗(Treating/treatment)”涵盖治疗哺乳动物的疾病病况，并且包括：(a)预防所述疾病病况在哺乳动物中发生，特别是当所述哺乳动物易于患上所述疾病病况但还未诊断出患上时；(b)抑制所述疾病病况，例如阻止其发展；和/或(c)缓解所述疾病病况，例如使所述疾病病况消退直至达到所要端点。治疗还包括改善疾病的症状(例如减轻疼痛或不适)，其中所述改善可能或可能不直接影响所述疾病(例如病因、传播、表达等)。
如本文所用，“癌症”是指哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘瘤或恶性肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌瘤和肉瘤。癌症本身表现为“肿瘤”或包含癌症的恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括肉瘤和癌瘤，如(但不限于)：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、韦尔姆斯氏瘤(Wilms′tumor)、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。可利用本发明所公开的组合物治疗的其它癌症包括但不限于例如何杰金病(Hodgkin′s Disease)、非何杰金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s Lymphoma)、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺部肿瘤、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、皮肤癌前病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
“神经疾病或病症”是指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或病症。“神经疾病或病症”包括涉及中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、周围神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢和周围神经系统中)的疾病或病症。神经病症的实例包括但不限于头痛、木僵和昏迷、痴呆、癫痫、睡眠障碍、外伤、感染、赘瘤、神经眼科学、运动障碍、脱髓鞘疾病、脊髓病症和周围神经、肌肉和神经肌肉接点的病症。成瘾和精神疾患包括但不限于双相型障碍和精神分裂症，也包括于神经病症的定义中。以下为可使用本发明的组合物和方法治疗的若干神经病症、症状、体征和综合症的清单：获得性癫痫性失语症；疾病播散性脑脊髓炎；肾上腺脑白质营养不良；年龄相关性黄斑退化；胼胝体发育不全；失认症；艾卡迪综合症(Aicardi syndrome)；亚历山大病(Alexander disease)；阿尔帕斯病(Alpers′disease)；交叉性肢体瘫痪；血管性痴呆；肌萎缩性侧索硬化；无脑儿；天使综合症(Angelman syndrome)；血管瘤病；缺氧症；失语症；失用症；蛛网膜囊肿；蛛网膜炎；安诺儿-基亚里畸形(Anronl-Chiari malformation)；动静脉畸形；阿斯佩各综合症(Aspergersyndrome)；共济失调性毛细血管扩张；注意力缺乏过动症；孤独症；自主机能障碍；背痛；巴腾病(Batten disease)；白塞氏病(Behcet′s disease)；贝尔氏麻痹(Bell′s palsy)；良性特发性眼睑痉挛；良性局灶性病变；肌萎缩；良性颅内高压；宾斯万格病(Binswanger′sdisease)；眼睑痉挛；布洛赫苏兹贝格综合症(Bloch Sulzberger syndrome)；臂丛神经损伤；脑脓肿；脑损伤；脑肿瘤(包括多形性成胶质细胞瘤)；脊髓肿瘤；布朗-希夸得综合症(Brown-Sequard syndrome)；卡纳万病(Canavan disease)；腕隧道综合症；灼性神经痛；中枢性疼痛综合症；脑桥中央髓鞘溶解症；头部病症；脑动脉瘤；脑动脉硬化症；脑萎缩；大脑性巨人症；脑性麻痹；夏科-玛丽-图斯病(Charcot-Marie-Tooth disease)；化学疗法诱发的神经病和神经痛；基亚里畸形(Chiari malformation)；舞蹈症；慢性炎症性脱髓鞘性多神经病；慢性疼痛；慢性区域性疼痛综合症；科芬劳里综合症(Coffin Lowry syndrome)；昏迷，包括持续性植物人状态；先天性面瘫；皮质基底退化；颅动脉炎；颅缝早闭；克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)；累积性损伤病症；库欣氏综合症(Cushing′s syndrome)；巨细胞包涵体病；巨细胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈足综合症(dancing eyes-dancing feetsyndrome)；丹迪沃克综合症(DandyWalker syndrome)；道森病(Dawson disease)；德莫西尔综合症(De Morsier′s syndrome)；德热里纳-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumke palsy)；痴呆；皮肌炎；糖尿病性肾病；弥漫性硬化症；家族性自主神经异常；书写困难；读写困难；张力障碍；早期幼儿癫痫性脑病；空蝶鞍综合征；脑炎；脑突出；脑三叉神经血管瘤病；癫痫；欧泊氏麻痹(Erb′s palsy)；特发性震颤；法布里病(Fabry′s disease)；华氏综合症(Fahr′ssyndrome)；昏厥；家族性痉挛性瘫痪；热性癫痫发作；费希尔综合症(Fisher syndrome)；弗里德里希氏共济失调(Friedreich′s ataxia)；额颞性痴呆和其它“τ蛋白病”；高歇氏病(Gaucher′s disease)；格斯特曼综合症(Gerstmann′s syndrome)；巨细胞性动脉炎；巨细胞性包涵体病；球形细胞脑白质营养不良；古巴二氏综合症(Guillain-Barre syndrome)；HTLV-1相关性脊髓病；哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)；头部损伤；头痛；半面痉挛；遗传性痉挛性截瘫；多神经炎型遗传性共济失调；耳部带状疱疹；带状疱疹；平山综合症(Hirayama syndrome)；HIV相关性痴呆和神经病(也称为AIDS的神经表现)；前脑无裂畸形；亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和其它聚谷氨酰胺重复序列疾病；水脑畸形；脑积水；皮质醇增多症；低氧症；免疫介导的脑脊髓炎；包涵体性肌炎；色素失调症；婴儿植烷酸储积症；婴儿雷夫叙姆病(infantile refsum disease)；婴儿痉挛；炎症性肌病；颅内囊肿；颅内高压；朱伯特综合症(Joubert syndrome)；基姆-赛耶综合症(Keams-Sayresyndrome)；肯尼迪病(Kennedy disease)；金斯波姆综合症(Kinsboume syndrome)；克利佩尔费尔综合症(Klippel Feil syndrome)；克拉伯病(Krabbe disease)；库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-Welander disease)；库鲁病(kuru)；拉福拉病(Lafora disease)；兰伯特-伊顿肌无力综合症(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)；兰道-克莱夫勒综合症(Landau-Kleffner syndrome)；侧髓(瓦伦贝格(Wallenberg))综合症；学习不能；利氏病(Leigh′s disease)；伦诺克斯-古斯塔特综合症(Lennox-Gustaut syndrome)；莱施-奈恩综合症(Lesch-Nyhan syndrome)；脑白质营养不良；路易体痴呆(Lewy body dementia)；无脑回畸形；闭锁综合症；里格病(Lou Gehrig′s disease)(即运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)；腰椎间盘病；莱姆病(Lyme disease)--神经后遗症；马查度-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)；巨脑；巨脑症；梅尔克逊-罗森塔尔综合症(Melkersson-Rosenthalsyndrome)；美尼尔病(Menieres disease)；脑膜炎；门克斯病(Menkes disease)；异染性脑白质营养不良；头小畸形；偏头痛；米勒费希尔综合症(Miller Fisher syndrome)；小中风(mini-strokes)；线粒体肌病；莫比鸟斯综合症(Mobius syndrome)；单肢肌萎缩；运动神经元病；烟雾病(Moyamoya disease)；粘多糖储积病；多梗塞性痴呆；多灶性运动神经病；多发性硬化症和其它脱髓鞘病症；伴有体位性低血压的多系统萎缩；肌肉萎缩症；重症肌无力；脱髓鞘性弥漫性硬化症；婴儿肌阵挛性脑病；肌阵挛；肌病；先天性肌强直；发作性睡病；神经纤维瘤病；神经抑制药恶性综合症；AIDS的神经表现；狼疮神经后遗症；神经性肌强直；神经元蜡样脂褐质沉积症；神经元迁移病症；尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)；奥沙利文-麦克劳德综合症(O′Sullivan-McLeod syndrome)；枕神经痛；隐性脊柱神经管闭合不全序列症；大田原综合症(Ohtahara syndrome)；橄榄体脑桥小脑萎缩症；斜视眼阵挛肌阵挛；视神经炎；直立性低血压；过度使用综合症；感觉异常；神经退化性疾病或病症(帕金森氏病(Parkinson′s disease)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、阿兹海默氏病(Alzheimer′s disease)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis；ALS)、痴呆、多发性硬化症和与神经元细胞死亡相关的其它疾病和病症)；先天性肌强直；副肿瘤病；阵发性发作；帕里龙贝格综合症(Parry Romberg syndrome)；佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)；周期性瘫痪；周围神经病；疼痛性神经病和神经痛；持续性植物人状态；全身性发育迟缓；光喷嚏反射；植烷酸储积病；匹克病(Pick′s disease)；神经挟捏；垂体肿瘤；多肌炎；脑穿通畸形；小儿麻痹症后综合症；疱疹后神经痛；感染后脑脊髓炎；体位性低血压；普拉德-威利综合症(Prader-Willi syndrome)；原发性侧索硬化；朊病毒疾病；进行性面部单侧萎缩；进行性多灶性白质脑病；进行性硬化性灰质营养不良；进行性核上性麻痹；假性脑瘤；拉姆齐-亨特综合症(Ramsay-Hunt syndrome)(I型和II型)；拉斯马森脑炎(Rasmussen′s encephalitis)；反射性交感神经营养不良综合症(reflexsympathetic dystrophy syndrome)；雷夫叙姆病(Refsum disease)；重复运动障碍；重复应激损伤；多动腿综合症；逆转录病毒相关性脊髓病；莱特综合症(Rett syndrome)；雷耶综合症(Reye′s syndrome)；圣维特斯舞蹈病(Saint Vitus dance)；桑德霍夫病(Sandhoffdisease)；希尔德病(Schilder′s disease)；脑裂；中隔-眼发育不良；惊吓婴儿综合症；带状疱疹；夏伊-德雷格综合症(Shy-Drager syndrome)；修格林综合症(Sjogren′ssyndrome)；睡眠呼吸暂停；索托综合症(Soto′s syndrome)；痉挛状态；脊柱裂；脊髓损伤；脊髓肿瘤；脊髓性肌萎缩；斯蒂夫-珀森综合症(Stiff-Person syndrome)；中风；斯特奇韦伯综合症(Sturge-Weber syndrome)；亚急性硬化性全脑炎；皮层下动脉硬化性脑病；西登哈姆舞蹈病(Sydenham chorea)；晕厥；脊髓空洞症；迟发性运动障碍；泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)；颞动脉炎；脊髓栓系综合症；汤姆森病(Thomsen disease)；胸出口综合症；三叉神经痛(Tic Douloureux)；托德氏麻痹(Todd′s paralysis)；图雷特综合症(Tourette syndrome)；短暂缺血发作；播散性海绵状脑病；横贯性脊髓炎；外伤性脑损伤；震颤；三叉神经痛(trigeminal neuralgia)；热带痉挛性截瘫；结节性脑硬化；血管性痴呆(多梗塞性痴呆)；血管炎，包括颞动脉炎；范希佩尔-林道病(Von Hippel-Lindaudisease)；瓦伦贝格综合症(Wallenberg′s syndrome)；韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman disease)；维斯特综合症(West syndrome)；急性颈部扭伤；威廉斯综合症(Williams syndrome)；威尔登病(Wildon′s disease)；和泽尔维格综合症(Zellwegersyndrome)。
“代谢疾病”是指内分泌系统的多种疾病和病症，包括例如胰岛素抗性、糖尿病、肥胖症、葡萄糖耐量降低、高胆固醇血症、高血糖症、血脂异常和高脂血症。
“炎症”是指全身性炎症性病状和局部与单核细胞、白细胞和/或嗜中性粒细胞的迁移和吸引相关的病状。炎症的实例包括但不限于由病原性生物体(包括革兰氏阳性细菌(gram-positive bacteria)、革兰氏阴性细菌(gram-negative bacteria)、病毒、真菌和寄生虫(如原生动物和蠕虫))感染、移植物排斥反应(包括实体器官(如肾、肝、心脏、肺或角膜)的排斥反应以及骨髓移植物的排斥反应，包括移植物抗宿主疾病(graft-versus-hostdisease；GVHD)或由局部慢性或急性自体免疫或过敏性反应引起的炎症。自体免疫性疾病包括急性肾小球肾炎；类风湿性或反应性关节炎；慢性肾小球性肾炎；炎症性肠病，如克罗恩病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；输粒细胞相关性综合症；炎症性皮肤病，如接触性皮炎、异位性皮炎、牛皮癣；全身性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus；SLE)、自体免疫性甲状腺炎、多发性硬化症和一些形式的糖尿病，或受试者自身免疫系统的攻击造成病理性组织破坏的任何其它自体免疫性病况。过敏性反应包括过敏性哮喘、慢性支气管炎、急性和迟发型超敏反应。全身性炎症性疾病病况包括与外伤、烧伤、缺血事件(例如心脏、脑、肠或周围血管中的血栓形成事件，包括心肌梗塞和中风)后再灌注、败血症、ARDS或多器官机能异常综合症相关的炎症。炎症性细胞募集也在动脉粥样硬化斑中出现。炎症包括但不限于非何杰金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s lymphoma)、韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、肝细胞癌、胸腺萎缩、慢性胰腺炎、类风湿性关节炎、反应性淋巴增生、骨关节炎、溃疡性结肠炎、乳头状癌、克罗恩病、溃疡性结肠炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宫肌腺症、子宫内膜异位、急性子宫颈炎、慢性子宫颈炎、淋巴增生、多发性硬化症、特发性血小板减少性紫癜继发的肥大、原发性IgA肾病、全身性红斑狼疮、牛皮癣、肺气肿、慢性肾盂肾炎和慢性膀胱炎。
心血管疾病或病症包括可引起缺血或由心脏再灌注引起的病症。实例包括但不限于动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、肉芽肿性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽肿性)、原发性肥厚性心肌病、周围动脉疾病(peripheral artery disease；PAD)、中风、心绞痛、心肌梗塞、由心脏停搏引起的心血管组织损伤、由心脏分流引起的心血管组织损伤、心源性休克和本领域的普通技术人员已知或者涉及心脏或血管的机能异常或组织损伤(特别是但不限于与Sirtuin3活化相关的组织损伤)的相关病状。CVS疾病包括但不限于动脉粥样硬化、肉芽肿性心肌炎、心肌梗塞、瓣膜性心脏病继发的心肌纤维化、不伴随梗塞的心肌纤维化、原发性肥厚性心肌病和慢性心肌炎(非肉芽肿性)。
多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子
标靶
在一个实施方案中，标靶包括Sirtuin(SIRT)的核酸序列，包括但不限于与Sirtuin(SIRT)相关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。
在一个实施方案中，标靶包括SIRT1的核酸序列，包括但不限于与SIRT1相关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。
在一个实施方案中，标靶包括SIRT3的核酸序列，包括但不限于与SIRT3相关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。
在一个实施方案中，标靶包括SIRT6的核酸序列，包括但不限于与SIRT6相关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。
“SIRT1蛋白”是指sirtuin脱乙酰酶的sir2家族的成员。在一个实施方案中，SIRT1蛋白包括酵母Sir2(GenBank保藏编号P53685)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)Sir-2.1(GenBank保藏编号NP_501912)、人SIRT1(GenBank保藏编号NM_012238和NP_036370(或AF083106))。
SIRT1“Sirtuin”是包括SIR2结构域的蛋白，所述SIR2结构域是定义为按Pfam家族“SIR2”-PF02146中的采样数进行计分的氨基酸序列(参见附录)。此家族在INTERPRO数据库中称为INTERPRO描述(条目IPR003000)。为鉴别蛋白质序列中“SIR2”结构域的存在和确认所关注的多肽和蛋白质具有特定特征，可使用缺省参数针对HMM的Pfam数据库(例如Pfam数据库，第9版)搜索蛋白质的氨基酸序列(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search)。SIR2结构域在Pfam中标明为PF02146并且在INTERPRO标明为INTERPRO描述(条目IPR003000)。Pfam数据库的描述可见于″The Pfam Protein Families Database″BatemanA等(2002)Nucleic Acids Research30(l)：276-280和Sonhammer等(1997)Proteins 28(3)：405-420中，而HMM的详细描述可见于例如Gribskov等(1990)Meth.Enzymol.183：146-159；Gribskov等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：4355-4358；Krogh等(1994)J.Mol.Biol.235：1501-1531；和Stultz等(1993)Protein Sci.2：305-314中。
在线粒体sirtuin中，SIRT3具有最稳固的脱乙酰酶活性。实际上，与SIRT4或SIRT5敲除动物相比，在SIRT3-裸小鼠的肝脏中检测出显著较高程度的线粒体蛋白乙酰化。然而，尽管事实上已鉴别出多种SIRT3底物和共沉淀蛋白质：乙酰辅酶A合成酶2、Ku70、FOXO3a、线粒体复合物I的亚单位9(NDUFA9)、谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶2，但对SIRT3的生理作用所知甚少。
SIRT3是主要线粒体脱乙酰酶。线粒体蛋白在SIRT3敲除小鼠中显示过度乙酰化，但在SIRT4或SIRT5敲除小鼠中并未显示过度乙酰化。乙酰辅酶A合成酶2(AceCS2)，一种将乙酸盐转化成乙酰辅酶A的线粒体酶，是第一种鉴别出来的SIRT3的线粒体底物。SIRT3使AceCS2的赖氨酸642脱乙酰化活化乙酰辅酶A合成酶活性，从而使供应至三羧酸循环中的乙酰辅酶A增加。谷氨酸脱氢酶(GDH)(能量产生中所涉及的另一种线粒体蛋白)由SIRT3脱乙酰化。GDH还可由SIRT4进行ADP-核糖基化，转而降低其酶活性。此表明SIRT3可在细胞代谢中起重要作用。SIRT3还显示参与选择性细胞凋亡路径和细胞生长控制。SIRT3和SIRT4(但非SIRT5)在调节与细胞存活相关的NAD+水平的NAD+援救路径中有所涉及。此外，hSIRT3基因的可变性与人寿命有关。
沉默信息调控因子-2基因(Sir2)编码NAD依赖性组蛋白脱乙酰酶，其在酿酒酵母中将染色质、基因组和寿命的调控联系起来。通过促进染色质沉默，Sir2抑制若干遗传基因座的转录并阻遏核糖体DNA(rDNA)重复序列处的重组。Sir2中具有突变的酵母在rDNA重组的情形中基因组不稳定性增加，此转而缩短复制寿命，其为此生物体中繁殖衰老的标志。相反，阻遏rDNA重组的Sir2的附加拷贝使复制寿命增加。Sir2的此等作用提出一种范例，其中通过染色质调节促进基因组稳定的基因可能是调控生物体寿命、衰老和年龄相关性病理学的重要促成因素。
与Sir2因子在寿命调控中的保守作用一致，多细胞生物体秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇(D.melanogaster)中Sir2蛋白的活性增加也使寿命增加。然而，所述Sir2因子可能通过不依赖于基因组稳定的机制起作用，并且其生理学分子底物仍不清楚。在哺乳动物中，存在七个Sir2家族成员SIRT1-SIRT7。SIRT作为哺乳动物寿命和衰老相关过程的候选调控因子受到极大关注。在此情形中，若干哺乳动物SIRT具有可影响衰老相关性分子路径和疾病的功能。然而，最初关于哺乳动物SIRT的研究发现与此等酶相关的生化标靶和细胞功能不同于酿酒酵母Sir2的生化标靶和分子功能。
产生缺乏哺乳动物SIRT6基因的小鼠揭示SIRT6在联系寿命、染色质和基因组稳定性的调控中的潜在作用。在此情形中，小鼠中缺乏SIRT6导致寿命显著缩短和与过早衰老病理学重叠的急性退化性表型。此外，SIRT6敲除小鼠细胞具有基因组不稳定性和DNA损伤超敏感性。在生化分级分离测定中，SIRT6蛋白优先与富含染色质的细胞部分相关。同时，此等观测结果表明SIRT6可能将染色质调控与DNA修复联系起来。染色，SIRT6在此种过程中的生理作用尚未得到证明。
在一些实施方案中，使用反义寡核苷酸来预防或治疗与Sirtuin(SIRT)家族成员相关的疾病或病症。可用由使用反义化合物获得的干细胞再生的细胞/组织治疗的示例性Sirtuin(SIRT)介导的疾病或病症包括：癌症(例如乳癌、结肠直肠癌、CCL、CML、前列腺癌)、神经退化性疾病或病症(例如阿兹海默氏病(Alzheimer′s Disease；AD)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis；ALS)、多发性硬化症和由聚谷氨酰胺聚集引起的病症)；骨骼肌疾病(例如迪谢内肌营养不良(Duchene muscular dystrophy)、骨骼肌营养不良、贝克尔氏营养不良(Becker′s dystrophy)或肌强直性营养不良)；代谢疾病或病症(例如胰岛素抗性、糖尿病、2型糖尿病、肥胖症、葡萄糖耐量降低、代谢综合症、成人发作型糖尿病、糖尿病性肾病、高血糖症、糖尿病性肾病、高胆固醇血症、血脂异常高脂血症和年龄相关性代谢疾病等)、与胰岛素水平调节异常相关的疾病或病症、神经病(例如感觉神经病、自主神经病、运动神经病、视网膜病)、与生酮病状相关的疾病或病症、与能量稳态异常相关的疾病或病症、与乙酰辅酶A合成酶2活性异常相关的疾病或病症、与代谢稳态相关的疾病或病症、脂质代谢疾病或病症、与生热作用异常相关的疾病或病症、与线粒体功能异常相关的疾病或病症、神经病(例如感觉神经病、自主神经病、运动神经病、视网膜病)、肝病(例如由于酒精滥用或肝炎、脂肪肝病等)；年龄相关性黄斑退化、骨病(例如骨质疏松症)、血液疾病(例如白血病)；肝病(例如由于酒精滥用或肝炎)；肥胖症；骨吸收、年龄相关性黄斑退化、AIDS相关性痴呆、ALS、贝尔氏麻痹(Bell′s Palsy)、动脉粥样硬化、心脏疾病(例如心律失常、慢性充血性心力衰竭、缺血性中风、冠状动脉疾病和心肌病)、慢性退化性疾病(例如心肌疾病)、慢性肾衰竭、2型糖尿病、溃疡、白内障、老花眼、肾小球肾炎、格林巴利综合症(Guillan-Barre syndrome)、出血病中风、类风湿性关节炎、炎症性肠病、SLE、克罗恩病(Crohn′s disease)、骨关节炎、骨质疏松症、慢性阻塞性肺病(Chronic ObstructivePulmonary Disease；COPD)、肺炎、皮肤衰老、尿失禁、与线粒体功能异常相关的疾病或病症(例如线粒体肌病、脑病、利伯氏病(Leber′s disease)、利氏脑病(Leighencephalopathia)、皮尔森氏病(Pearson′s disease)、乳酸性酸中毒、‘线粒体脑病、乳酸性酸中毒和中风样综合症’(mitochondrial encephalopathy，lactic acidosis andstroke like symptoms；MELAS)等)和与神经元细胞死亡相关的疾病或病症、退化性综合症、衰老、与端粒功能异常相关的疾病或病症、与染色质调控异常相关的疾病或病症、与细胞过早衰老相关的疾病或病症、与SIRT6介导的DNA修复异常相关的疾病或病症和特征在于不当细胞损失的病状。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸调节罹患与Sirtuin(SIRT)相关的疾病或病症或具有产生所述疾病或病症的风险的患者的Sirtuin(SIRT)的正常表达和/或正常功能。
在本发明的实施方案中，向需要皮肤治疗或具有发生将使得需要皮肤治疗的病状的风险的受试者提供治疗和/或美容方案和相关定制治疗。诊断可基于例如受试者的SIRT状态作出。指定组织(如皮肤)中患者的SIRT表达水平可通过本领域中已知和本文其它地方描述的方法，例如通过使用PCR或基于抗体的检测方法对组织进行分析来确定。
本发明的一优选实施方案提供用于皮肤治疗和/或美容应用的组合物，其包含SIRT反义寡核苷酸，例如以上调皮肤中SIRT的表达。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO：4至16所述。以引用的方式并入本文的美国专利No.7,544,497“Compositions formanipulating the lifespan and stress response of cells and organisms”描述通过降低Sirtuin蛋白对其底物的Km来调节Sirtuin活性的药剂的潜在美容用途。在实施方案中，在体内用本发明的寡核苷酸处理细胞以增加细胞寿命或预防细胞凋亡。例如，可通过如本文所述处理皮肤(例如上皮细胞)来防止皮肤衰老，例如产生皱纹。在一示例性实施方案中，使皮肤与包含如本文所述的SIRT反义化合物的药物或美容组合物接触。示例性皮肤疾患或皮肤病状包括与炎症、日光损伤或自然衰老有关或由其引起的病症或疾病。例如，所述组合物可用于预防或治疗接触性皮炎(包括刺激性接触性皮炎和过敏性接触性皮炎)、异位性皮炎(也称为过敏性湿疹)、光线性角化病、角质化病症(包括湿疹)、大疱性表皮松解症(包括天疱疮)、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、红斑(包括多形性红斑和结节性红斑)、由日光或其它光源引起的损伤、盘状红斑狼疮、皮肌炎、皮肤癌或自然衰老作用。
已报导Sirtuin干扰二氢睾酮诱导的雄激素受体信号转导。(参见例如Fu等，2006，“Hormonal Control of Androgen Receptor Function through SIRT1，”Molecular andCellular Biology 26(21)：8122-8135，以引用的方式并入本文。)在本发明的实施方案中，组合物包含SIRT反义寡核苷酸，例如以上调头皮中SIRT的表达和抑制雄激素受体信号转导，由此预防雄激素性秃发(脱发)。在实施方案中，向罹患秃发的患者施用局部外用或全身性制剂。
在一实施方案中，将本文所述的反义寡核苷酸并入含有通常适于局部外用药物施用的局部外用载剂并且包含本领域中已知的任何所述物质的局部外用制剂中。局部外用载剂可经选择以便提供呈所要形式的组合物，例如呈软膏、洗剂、乳膏、微乳液、凝胶、油、溶液等形式，并且可包含天然存在或合成来源的物质。所选载剂优选不会不利地影响局部外用制剂的活性剂或其它组分。本文所用的适合局部外用载剂的实例包括水、醇和其它无毒有机溶剂、甘油、矿物油、硅酮、石油膏、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯、蜡等。制剂可为无色无味软膏、洗剂、乳膏、微乳液和凝胶。
本发明的反义寡核苷酸可并入软膏中，所述软膏通常为一般基于矿脂或其它石油衍生物的半固体制剂。本领域的技术人员所了解的待使用的特定软膏基剂是将提供最优药物递送并且优选还将提供其它所要特征(例如软化性)等的基剂。同其它载剂或媒剂一样，软膏基剂应为惰性、稳定、非刺激性和非致敏性的。如Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.)中所说明，软膏基剂可归入四个类别：油性基剂；可乳化基剂；乳液基剂；和水溶性基剂。油性软膏基剂包括例如植物油、从动物获得的脂肪和从石油获得的半固体烃。可乳化软膏基剂(也称为吸收性软膏基剂)含有极少或不含水，且包括例如硫酸羟基甘油三硬脂酸酯、无水羊毛脂和亲水性矿脂。乳液软膏基剂是油包水(W/O)乳液或水包油(O/W)乳液，并且包括例如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯、羊毛脂和硬脂酸。示例性水溶性软膏基剂由具有不同分子量的聚乙二醇(PEG)制备(参见例如Remington′s，同上文)。
本发明的反义寡核苷酸可并入洗剂中，所述洗剂通常是在无摩擦下施用于皮肤表面的制剂，并且一般是液体或半固体制剂，其中固体粒子(包括活性剂)存在于水或醇基剂中。洗剂通常为固体的悬浮液，并且可包括水包油型液体油性乳液。洗剂是用于治疗大体表面积的优选制剂，因为更具流体性的组合物容易涂覆。通常需要洗剂中的不溶性物质呈细粉状。洗剂一般含有悬浮剂以产生更佳分散液，以及适用于使活性剂定位和保持与皮肤接触的化合物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。与本发明方法结合使用的一示例性洗剂制剂含有与亲水性矿脂混合的丙二醇，如可以商标AquaphorRTM从Beiersdorf，Inc.(Norwalk，Conn.)获得者。
本发明的反义寡核苷酸可并入乳膏中，所述乳膏通常为水包油型或油包水型粘性液体或半固体乳液。乳膏基剂可用水洗，且含有油相、乳化剂和水相。油相通常包含矿脂和脂肪醇(如鲸蜡醇或硬脂醇)；水相的体积通常(不过不一定)超过油相，且通常含有保湿剂。如Remington′s，同上文中所说明的乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子型、阴离子型、阳离子型或两性表面活性剂。
本发明的反义寡核苷酸可并入微乳液中，所述微乳液通常是由表面活性剂分子的界面膜稳定的两种不可混溶液体(如油和水)的热动力学稳定、各个方向上清澈的分散液(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(New York：Marcel Dekker，1992)，第9卷)。为制备微乳液，需要表面活性剂(乳化剂)、共表面活性剂(共乳化剂)、油相和水相。适合表面活性剂包括适用于制备乳液的任何表面活性剂，例如通常用于制备乳膏的乳化剂。共表面活性剂(或“共乳化剂”)通常选自聚甘油衍生物、甘油衍生物和脂肪醇的组。优选乳化剂/共乳化剂组合通常(但不一定)选自由以下组成的组：甘油单硬脂酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯；聚乙二醇和乙二醇棕榈酰硬脂酸酯；和辛酸和癸酸三酸甘油酯和油酰基聚乙二醇甘油酯。水相不仅包括水，而且通常还包括缓冲剂、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇(优选低分子量聚乙二醇，例如PEG 300和PEG 400)和/或甘油等，而油相通常包含例如脂肪酸酯、改性植物油、硅酮油、单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯的混合物、PEG的单酯和二酯(例如油酰基聚乙二醇甘油酯)等。
本发明的寡核苷酸可并入凝胶制剂中，所述凝胶制剂是由以小无机粒子构成的悬浮液(双相系统)或实质上均一分布于整个载剂液体中的大有机分子(单相凝胶)组成的半固体系统。单相凝胶可例如通过将活性剂、载剂液体和适合胶凝剂(黄芪胶(2至5％)、海藻酸钠(2-10％)、明胶(2-15％)、甲基纤维素(3-5％)、羧甲基纤维素钠(2-5％)、卡波姆(0.3-5％)或聚乙烯醇(10-20％))组合到一起并进行混合直至产生特征性半固体产物来制造。其它适合胶凝剂包括甲基羟基纤维素、聚氧乙烯-聚氧丙烯、羟乙基纤维素和明胶。尽管凝胶通常采用水性载剂液体，但也可使用醇和油作为载剂液体。
制剂(例如局部外用制剂)中可包括本领域的技术人员已知的各种添加剂。添加剂的实例包括但不限于增溶剂、皮肤渗透增强剂、遮光剂、防腐剂(例如抗氧化剂)、胶凝剂、表面活性剂(特别是非离子型和两性表面活性剂)、乳化剂、润肤剂、增稠剂、稳定剂、保湿剂、着色剂、芳香剂等。纳入增溶剂和/或皮肤渗透增强剂连同乳化剂、润肤剂和防腐剂特别优选。一局部外用制剂包含约：2wt.％至60wt.％，优选2wt.％至50wt.％增溶剂和/或皮肤渗透增强剂；2wt.％至50wt.％，优选2wt.％至20wt.％乳化剂；2wt.％至20wt.％润肤剂；和0.01至0.2wt.％防腐剂，其中活性剂和载剂(例如水)构成制剂的其余部分。
皮肤渗透增强剂用于促进治疗水平的活性剂通过合理大小面积的未破损皮肤的通过量。合理增强剂在本领域中是已知的并且包括例如：低级烷醇，如甲醇、乙醇和2-丙醇；烷基甲基亚砜，如二甲亚砜(DMSO)、癸基甲基亚砜(C10MSO)和四癸基甲基亚砜；吡咯烷酮，如2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮和N-(-羟甲基)吡咯烷酮；脲；N，N-二乙基-间-甲苯磺酰胺；C2-C6烷二醇；混杂溶剂，如二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)和四氢糠醇；和1位经过取代的氮杂环庚-2-酮，特别是1-正十二烷基环氮杂环庚-2-酮(月桂氮酮；可以商标AzoneRTM从Whitby Research Incorporated，Richmond，Va.获得)。
增溶剂的实例包括但不限于以下：亲水性醚，如二乙二醇单乙醚(乙氧基二甘醇，可以TranscutolRTM购得)和二乙二醇单乙醚油酸酯(可以SoficutolRTM购得)；聚乙烯蓖麻油衍生物，如polyoxy 35蓖麻油、polyoxy 40氢化蓖麻油等；聚乙二醇，特别是低分子量聚乙二醇，如PEG 300和PEG 400，和聚乙二醇衍生物，如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(可以LabrasolRTM购得)；烷基甲基亚砜，如DMSO；吡咯烷酮，如2-吡咯烷酮和N-甲基-2-吡咯烷酮；和DMA。许多增溶剂还可充当吸收增强剂。可将单一增强剂并入制剂中，或将增强剂的混合物并入其中。
适合乳化剂和共乳化剂包括但不限于关于微乳液制剂所述的那些乳化剂和共乳化剂。润肤剂包括例如丙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯、聚丙二醇-2(PPG-2)十四烷基醚丙酸酯等。
制剂还可包括其它活性剂，例如其它消炎剂、止痛剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抗生素、维生素、抗氧化剂和常在防晒制剂中发现的防晒剂，包括但不限于邻氨基苯甲酸盐、苯甲酮(特别是苯甲酮-3)、樟脑衍生物、肉桂酸衍生物(例如甲氧基肉桂酸辛酯)、二苯甲酰基甲烷(例如丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷)、对氨基苯甲酸(PABA)和其衍生物，和水杨酸酯(例如水杨酸辛酯)。
在一个实施方案中，寡核苷酸对包括但不限于非编码区的Sirtuin(SIRT)的多核苷酸具有特异性。Sirtuin(SIRT)标靶包括Sirtuin(SIRT)的变体；Sirtuin(SIRT)的突变体，包括SNP；Sirtuin(SIRT)的非编码序列；等位基因、片段等。所述寡核苷酸优选为反义RNA分子。
根据本发明的实施方案，靶核酸分子不仅限于Sirtuin(SIRT)多核苷酸，而是延及Sirtuin(SIRT)的同功异型物、受体、同源物、非编码区等中的任一者。
在另一实施方案中，寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)标靶的天然反义序列(编码和非编码区的天然反义分子)，包括但不限于其变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。所述寡核苷酸优选为反义RNA或DNA分子。
在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括在化合物中的一个或多个核苷酸位置存在不同碱基的变体。举例来说，如果第一核苷酸是腺嘌呤，那么可产生在此位置含有胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶或其它天然或非天然核苷酸的变体。此变异可在反义化合物的任何位置进行。
在一些实施方案中，反义化合物与标靶之间的同源性、序列同一性或互补性为约50％至约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60％至约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％至约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约80％至约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能从而引起活性降低，并且存在足够程度的互补性以在需要特异性结合的条件下避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合时，所述反义化合物可特异性杂交。所述条件包括，即，在体内测定或治疗性处理的情况下的生理条件，和在体外测定的条件下执行测定的条件。
当反义化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰所述靶DNA或RNA分子的正常功能从而引起效用降低，并且存在足够程度的互补以在需要特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性处理的情况下在生理条件下，和在体外测定的情况下在执行测定的条件下)避免反义化合物与非靶序列的非特异性结合时，所述反义化合物(无论为DNA、RNA、嵌合、经过取代的反义化合物等)可特异性杂交。
在另一实施方案中，靶向Sirtuin(SIRT)(包但不限于使用例如PCR、杂交等鉴别和扩增的反义序列，一种或多种所述序列如SEQ ID NO：5至14所述，以及类似序列)调节Sirtuin(SIRT)的表达或功能。在一个实施方案中，与对照相比，表达或功能被上调。在另一实施方案中，与对照相比，表达或功能被下调。
在另一实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO：15至94所述的核酸序列，包括使用例如PCR、杂交等鉴别和扩增的反义序列。所述寡核苷酸可包含一个或多个经过修饰的核苷酸、较短或较长的片段、经过修饰的键等。经过修饰的键或核苷酸间键联的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一实施方案中，核苷酸包含磷衍生物。可连接至本发明的经过修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经过修饰的磷酸酯基)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备和其并入到核苷酸、经过修饰的核苷酸和寡核苷酸中本质上也是已知的并且在无需在此处描述。
反义分子的特异性和敏感性也被本领域的技术人员用于治疗用途。反义寡核苷酸已经作为治疗部分用于治疗动物和人的疾病病况。反义寡核苷酸已经安全并有效地施用于人并且当前正在进行众多临床试验。因此确定寡核苷酸可以是可经过配置从而在用于治疗细胞、组织和动物(尤其是人)的治疗方案中适用的适用治疗模态。
在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物(特别是寡核苷酸)结合靶核酸分子并且调节由靶基因编码的分子的表达和/或功能。所欲干扰的DNA的功能包括例如复制和转录。所欲干扰的RNA的功能包括所有关键功能，如RNA至蛋白质翻译位点的转位、蛋白质从所述RNA的翻译、由所述RNA产生一种或多种mRNA物质的拼接、和可作用于所述RNA或由所述RNA促进的催化活性。所述功能可根据所需要的功能进行上调或抑制。
反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、替代性拼接物、引物、探针和与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物形式引入。
在本发明的情形中，反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步骤过程。所述过程通常始于鉴别欲进行功能调节的靶核酸。此靶核酸可以是例如表达与特定病症或疾病病况相关的细胞基因(或由所述基因转录的mRNA)，或感染原的核酸分子。在本发明中，靶核酸编码Sirtuin(SIRT)。
靶向过程通常还包括确定所述靶核酸中用于进行反义相互作用以使得产生所要作用(例如表达的调节)的至少一个靶区、区段或位点。在本发明的上下文中，术语“区”定义为靶核酸中具有至少一种可鉴别结构、功能或特征的部分。区段在靶核酸的区内。“区段”定义为靶核酸内的区的较小部分或子部分。如本发明中所用的“位点”定义为靶核酸内的位置。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合Sirtuin(SIRT)的天然反义序列并且调节Sirtuin(SIRT)(SEQ ID NO：1至3)的表达和/或功能。反义序列的实例包括SEQ ID NO：4至29。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸结合Sirtuin(SIRT)多核苷酸的一个或多个区段并且调节Sirtuin(SIRT)的表达和/或功能。所述区段包括Sirtuin(SIRT)有义或反义多核苷酸的至少5个连续核苷酸。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸对Sirtuin(SIRT)的天然反义序列具有特异性，其中所述寡核苷酸与Sirtuin(SIRT)的天然反义序列的结合调节Sirtuin(SIRT)的表达和/或功能。
在另一实施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO：15至94所述的序列，使用例如PCR、杂交等鉴别和扩增的反义序列。所述寡核苷酸可包含一个或多个经过修饰的核苷酸、较短或较长的片段、经过修饰的键等。经过修饰的键或核苷酸间键联的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一实施方案中，核苷酸包含磷衍生物。可连接至本发明的经过修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经过修饰的磷酸酯基)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备和其并入到核苷酸、经过修饰的核苷酸和寡核苷酸中本质上也是已知的并且在无需在此处描述。
因为如本领域中所已知，翻译起始密码子通常为5′-AUG(在所转录的mRNA分子中；在相应DNA分子中为5′-ATG)，所以翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少部分基因具有RNA序列为5′-GUG、5′-UUG或5′-CUG的翻译起始密码子；并且5′-AUA、5′-ACG和5′-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可涵盖多种密码子序列，即使在各情况下起始氨基酸通常是甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰基甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有两个或多个替代性起始密码子，其中任一者可能在特定细胞类型或组织中或在一组特定条件下潜在地用于翻译起始。在本发明的上下文中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指在体内用于起始从编码Sirtuin(SIRT)的基因转录的mRNA的翻译的密码子，而不管所述密码子的序列。基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有以下三种序列之一，即，5′-UAA、5′-UAG和5′-UGA(相应DNA序列分别是5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)。
术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指所述mRNA或基因中在从翻译起始密码子开始的任一方向上(即，5′或3′)涵盖约25至约50个连续核苷酸的部分。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指所述mRNA或基因中在从翻译终止密码子开始的任一方向上(即，5′或3′)涵盖约25至约50个连续核苷酸的部分。因此，“起始密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或“翻译终止密码子区”)是可用本发明的反义化合物有效靶向的所有区。
本领域中已知的开放阅读框(open reading frame；ORF)或“编码区”是指翻译起始密码子与翻译终止密码子之间的区，也是可有效靶向的区。在本发明的情形中，所靶向的区是涵盖基因的开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止的基因内区。
另一靶区包括5′非翻译区(5′UTR)，所述5′非翻译区在本领域中已知指mRNA中在从翻译起始密码子开始的5′方向上的部分，且因此包括mRNA的5′帽位点与翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)。另一靶区包括3′非翻译区(3′UTR)，所述3′非翻译区在本领域中已知指mRNA中在从翻译终止密码子开始的3′方向上的部分，且因此包括mRNA的翻译终止密码子与3′末端之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)。mRNA的5′帽位点包括通过5′-5′三磷酸酯键联接合至mRNA的最5′端残基的N7-甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5′帽区包括5′帽结构本身以及与帽位点相邻的前50个核苷酸。本发明的另一靶区是5′帽区。
尽管一些真核mRNA转录物直接翻译，但许多含有一个或多个称为“内含子”的区，其在转录物翻译之前从转录物切除。剩余(并且因此所翻译的)区称为“外显子”并拼接到一起形成连续mRNA序列。在一个实施方案中，靶向拼接位点(即，内含子-外显子接头或外显子-内含子接头)在疾病中牵涉到异常拼接或疾病中牵涉到特定拼接产物的过度产生的情况下特别适用。由于重排或缺失造成的异常融合接合是靶位点的另一实施方案。通过来自不同基因来源的两个(或多个)mRNA的拼接过程产生的mRNA转录物称为“融合转录物”。内含子可使用靶向例如DNA或前mRNA的反义化合物有效靶向。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码和/或非编码区并且调节靶分子的表达和/或功能。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸并且调节靶分子的表达和/或功能。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸结合有义多核苷酸并且调节靶分子的表达和/或功能。
替代性RNA转录物可由DNA的相同基因组区产生。所述替代性转录物通常称为“变体”。更具体地说，“前mRNA变体”是由相同基因组DNA产生的在起始或终止位置与由所述相同基因组DNA产生的其它转录物不同并且含有内含子与外显子序列的转录物。
在拼接期间切除一个或多个外显子或内含子区或其部分后，前mRNA变体产生较小“mRNA变体”。因此，mRNA变体是经过加工的前mRNA变体，并且各独特前mRNA变体须总是产生独特mRNA变体作为拼接的结果。所述mRNA变体也称为“替代性拼接变体”。如果不发生前mRNA变体的拼接，那么所述前mRNA变体与mRNA变体相同。
变体可通过使用替代性信号以起始或终止转录来产生。前mRNA和mRNA可具有多于一个起始密码子或终止密码子。来源于使用替代性起始密码子的前mRNA或mRNA的变体称为所述前mRNA或mRNA的“替代性起始变体”。使用替代性终止密码子的那些转录物称为所述前mRNA或mRNA的“替代性终止变体”。一种特定类型的替代性终止变体是“polyA变体”，其中所产生的多种转录物是因转录机构替代性选择“polyA终止信号”之一而产生，由此产生终止于独特polyA位点的转录物。在本发明的情形中，本文所述的变体的类型也是靶核酸的实施方案。
靶核酸上反义化合物所杂交的位置定义为活性反义化合物所靶向的靶区的至少5个核苷酸长的部分。
虽然某些示例性靶区段的具体序列在本文中阐明，但本领域的技术人员应认识到，它们是用于说明和描述本发明范围内的特定实施方案。其它靶区段可由本领域的普通技术人员根据本公开内容容易地鉴别。
包含一段至少五(5)个选自说明性靶区段内的连续核苷酸的长度为5-100个核苷酸的靶区段也视为适合于靶向。
靶区段可包括包含所述说明性靶区段之一的5′-端的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列(其余核苷酸是相同DNA或RNA中紧接于所述靶区段的5′-端上游开始的连续段并且继续直至所述DNA或RNA含有约5至约100个核苷酸)。类似地，靶区段由包含所述说明性靶区段之一的3′-端的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列表示(其余核苷酸是相同DNA或RNA中紧接于所述靶区段的3′-端下游开始的连续段并且继续直至所述DNA或RNA含有约5至约100个核苷酸)。了解本文所说明的靶区段的本领域的技术人员将能够在不进行过度实验下鉴别其它靶区段。
一旦鉴别出一个或多个靶区、区段或位点，就可选择与标靶充分互补(即，足够充分且以足够特异性杂交)以产生所要作用的反义化合物。
在本发明的实施方案中，寡核苷酸结合特定标靶的反义链。所述寡核苷酸长度为至少5个核苷酸且可合成，从而各寡核苷酸靶向重叠序列，以使得所合成的寡核苷酸涵盖靶多核苷酸的整个长度。靶标还包括编码区以及非编码区。
在一个实施方案中，特定核酸由反义寡核苷酸靶向。反义化合物靶向特定核酸是一个多步骤过程。所述过程通常始于鉴别欲进行功能调节的核酸序列。其可为例如表达与特定病症或疾病病况相关的细胞基因(或由所述基因转录的mRNA)或非编码多核苷酸，如非编码RNA(ncRNA)。
RNA可归类为(1)信使RNA(mRNA)，其翻译为蛋白质，和(2)非蛋白质编码RNA(ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反义转录物和含有高密度终止密码子且缺乏任何广泛“开放阅读框”的其它转录单元(TU)。许多ncRNA似乎始于蛋白质编码基因座的3′非翻译区(3′UTR)中的起始位点。ncRNA常较罕见并且至少一半已由FANTOM组测序的ncRNA似乎并不聚腺苷酸化。大部分研究人员出于明显的原因关注经过加工并且输出到细胞质的聚腺苷酸化mRNA。近来，已显示非聚腺苷酸化核RNA的数量可能极大，并且许多这种转录物是由基因间区产生。ncRNA可借以调控基因表达的机制是与靶转录物进行碱基配对。通过碱基配对起作用的RNA可分类为(1)顺式编码RNA，其在相同遗传位置但在其所作用的RNA的相对链上编码，并且因此显示与其标靶的完全互补，和(2)反式编码RNA，其在与其所作用的RNA不同的染色体位置编码并且通常不展现与其标靶的完全碱基配对能力。
不希望受理论束缚，本文所述的反义寡核苷酸对反义多核苷酸的扰动可改变相应有义信使RNA的表达。然而，此调控可以是不协同的(反义敲除导致信使RNA升高)或协同的(反义敲除导致伴随信使RNA降低)。在所述情况下，可使反义寡核苷酸靶向反义转录物的重叠或不重叠部分，由此导致其敲除或隔离。编码以及非编码反义分子可以相同方式靶向，并且任一策略均能够调控相应有义转录物，无论是以协同还是以不协同方式。用于鉴别新型寡核苷酸以供针对标靶使用的策略可以基于利用反义寡核苷酸或任何调节所要标靶的其它方式对反义RNA转录物的敲除。
策略1：在不协同调控的情况下，敲除反义转录物使常规(有义)基因的表达升高。如果后一基因编码已知或推定的药物标靶，那么敲除其反义对应物可能模拟受体激动剂或酶刺激物的作用。
策略2：在协同调控的情况下，一种分子可同时敲除反义和有义转录物两者，并且由此达成常规(有义)基因表达的协同降低。如果例如使用反义寡核苷酸来达成敲除，那么此策略可用于应用靶向有义转录物的一种反义寡核苷酸和靶向相应反义转录物的另一反义寡核苷酸，或同时靶向重叠有义和反义转录物的单一极对称反义寡核苷酸。
根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物(如siRNA化合物)，和与靶核酸的至少一部分杂交并且调节其功能的任何其它寡聚化合物。因此，其可为DNA、RNA、DNA样分子、RNA样分子或其混合物，或可为其中一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或发夹状寡聚化合物，并且可含有如内部或末端突起、错配或环等结构元件。反义化合物通常制备为线性，但可联接或以其它方式制备为环状和/或分支状。反义化合物可包括以下构筑体，如杂交以形成完全或部分双链化合物的两条链，或具有足够自身互补性从而允许杂交且形成完全或部分双链化合物的单一链。所述两条链可内部连接从而留下游离3′或5′末端，或可连接形成连续发夹结构或环。发夹结构可在5′或3′末端含有悬突，从而产生具有单链特征的延伸。双链化合物任选地可在末端上包括悬突。其它修饰可包括连接于一个末端、所选核苷酸位置、糖位置或一个核苷间键联的偶联基团。或者，两条链可通过非核酸部分或连接子基团连接。当由仅一条链形成时，dsRNA可采取自身回折形成双链体的自我互补发夹型分子的形式。因此，dsRNA可为完全或部分双链。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来达成，然而在一些实施方案中，基因表达或功能受到上调。当由两条链或采取自身回折形成双链体的自我互补发夹型分子形式的单一链形成时，所述两条链(或单一链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式进行碱基配对的互补RNA链。
引入系统中后，本发明的化合物可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用从而实现靶核酸的裂解或其它修饰，或可通过占位机制起作用。一般来说，核酸(包括寡核苷酸)可描述为“DNA样分子”(即，一般具有一个或多个2′-脱氧糖并且一般具有T而非U碱基)或“RNA样分子”(即，一般具有一个或多个2′-羟基或2′-修饰糖并且一般具有U而非T碱基)。核酸螺旋可采用多于一种类型的结构，最通常是A型和B型。认为具有B型样结构的寡核苷酸一般是“DNA样分子”而具有A型样结构的寡核苷酸一般是“RNA样分子”。在一些(嵌合)实施方案中，反义化合物可兼有A型和B型区。
在另一实施方案中，所要寡核苷酸或反义化合物包括以下至少一者：反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经过修饰的键联的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因活化(RNAa)；小活化RNA(saRNA)，或其组合。
dsRNA也可活化基因表达，此机制称为“小RNA诱导的基因活化”或RNAa。dsRNA靶向基因启动子诱导相关基因的有效转录活化。RNAa已在人细胞中使用称为“小活化RNA”(saRNA)的合成dsRNA得到证明。
已发现小双链RNA(dsRNA)(如小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA))触发称为RNA干扰(RNAi)的进化上保守的机制。RNAi总是导致基因沉默。然而，在以下实施例部分详细描述的情况下，显示寡核苷酸增加Sirtuin(SIRT)多核苷酸和其编码产物的表达和/或功能。dsRNA还可充当小活化RNA(saRNA)。不希望受理论束缚，通过靶向基因启动子中的序列，saRNA将在称为dsRNA诱导的转录活化(RNAa)的现象中诱导靶基因表达。
在另一实施方案中，本文中鉴别的“靶区段”可用于筛选调节Sirtuin(SIRT)多核苷酸的其它化合物。“调节剂”是减少或增加编码Sirtuin(SIRT)的核酸分子的表达并且至少包含与靶区段互补的5个核苷酸的部分的化合物。筛选方法包括以下步骤：使编码Sirtuin(SIRT)的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的靶区段与一种或多种候选调节剂接触，和选择减少或增加编码Sirtuin(SIRT)多核苷酸的核酸分子(例如SEQ ID NO：15至94)的表达的一种或多种候选调节剂。一旦显示候选调节剂能够调节(例如减少或增加)编码Sirtuin(SIRT)多核苷酸的核酸分子的表达，那么就可将所述调节剂用于Sirtuin(SIRT)多核苷酸功能的进一步调查性研究中，或者用作本发明的研究试剂、诊断剂或治疗剂。
靶向天然反义序列调节靶基因的功能。例如Sirtuin(SIRT)(例如保藏编号NM_012238.3、NM_001159589、NM_012239、NM_016539)。在一实施方案中，标靶是Sirtuin(SIRT)的反义多核苷酸。在一实施方案中，反义寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸(例如保藏编号NM_012238.3、NM_001159589、NM_012239、NM_016539)的有义和/或天然反义序列、其变体、等位基因、同功异型物、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。所述寡核苷酸优选是反义分子且标靶包括反义和/或有义Sirtuin(SIRT)多核苷酸的编码和非编码区。
本发明的靶区段还可以与本发明的其相应互补反义化合物组合以形成稳定的双链(双链体)寡核苷酸。
在本领域中已证实所述双链寡核苷酸部分调节标靶表达并且通过反义机制调控翻译以及RNA加工。然而，可对所述双链部分进行化学修饰。举例来说，已显示所述双链部分通过双链体的反义链与标靶进行经典杂交，由此触发标靶的酶促降解来抑制标靶。
在一实施方案中，反义寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸(例如保藏编号NM_012238.3、NM_001159589、NM_012239、NM_016539)、其变体、等位基因、同功异型物、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。所述寡核苷酸优选为反义分子。
根据本发明的实施方案，靶核酸分子不仅限于Sirtuin(SIRT)，而是延及Sirtuin(SIRT)分子的同功异型物、受体、同源物等中的任一者。
在另一实施方案中，寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸(例如SEQ ID NO：5至14中所述的多核苷酸)的天然反义序列和其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO：15至94所述。
在一个实施方案中，寡核苷酸与Sirtuin(SIRT)反义分子的核酸序列(包括但不限于与Sirtuin(SIRT)多核苷酸相关的非编码有义和/或反义序列)互补或结合并且调节Sirtuin(SIRT)分子的表达和/或功能。
在另一实施方案中，寡核苷酸与如SEQ ID NO：5至14所述的Sirtuin(SIRT)天然反义分子的核酸序列互补或结合并且调节Sirtuin(SIRT)分子的表达和/或功能。
在一实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：15至94中至少5个连续核苷酸的序列并且调节Sirtuin(SIRT)分子的表达和/或功能。
多核苷酸标靶包括Sirtuin(SIRT)，包括其家族成员、Sirtuin(SIRT)的变体；Sirtuin(SIRT)的突变体，包括SNP；Sirtuin(SIRT)的非编码序列；Sirtuin(SIRT)的等位基因；物种变体、片段等。所述寡核苷酸优选为反义分子。
在另一实施方案中，靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸的寡核苷酸包括：反义RNA、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因活化(RNAa)；或小活化RNA(saRNA)。
在另一实施方案中，靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸(例如SEQ ID NO：5至14)调节这些标靶的表达或功能。在一个实施方案中，与对照相比，表达或功能被上调。在另一实施方案中，与对照相比，表达或功能被下调。
在另一实施方案中，反义化合物包括如SEQ ID NO：15至94所述的序列。所述寡核苷酸可包含一个或多个经过修饰的核苷酸、较短或较长的片段、经过修饰的键等。
在另一实施方案中，SEQ ID NO：15至94包括一个或多个LNA核苷酸。
所要靶核酸的调节可以本领域中已知的若干种方式进行。例如，反义寡核苷酸、siRNA等。酶性核酸分子(例如核酶)是能够催化多种反应中的一种或多种的核酸分子，包括能够以核苷酸碱基序列特异性方式重复裂解其它独立核酸分子。所述酶性核酸分子可用于例如靶向几乎任何RNA转录物。
由于其序列特异性，因此反式裂解酶性核酸分子显示有望用作人疾病的治疗剂。酶性核酸分子可设计成裂解细胞RNA背景内的特定RNA标靶。此种裂解事件使得mRNA变得无功能并且消除所述RNA的蛋白质表达。以此方式，可选择性抑制与疾病病况有关的蛋白质的合成。
一般来说，具有RNA裂解活性的酶性核酸通过首先与靶RNA结合来起作用。所述结合通过酶性核酸的标靶结合部分进行，所述标靶结合部分保持与分子中起作用裂解靶RNA的酶性部分紧密邻近。因此，酶性核酸通过互补碱基配对首先识别并接着结合靶RNA，并且一旦与正确位点结合即起酶的作用以切割靶RNA。此种靶RNA的全面裂解将破坏其直接合成所编码蛋白质的能力。在酶性核酸已结合并裂解其RNA标靶后，其从所述RNA释放以搜寻另一标靶并且可重复结合和裂解新标靶。
已使用若干方法(如体外选择(进化)策略)来进化能够催化多种反应(如裂解和连接磷酸二酯键和酰胺键)的新型核酸催化剂。
开发催化活性最佳的核酶将显著促成采用RNA裂解核酶用于调控基因表达目的的任何策略。锤头核酶例如在饱和(10mM)浓度的Mg2+辅因子存在下以约1min-1的催化速率(kcat)起作用。已显示人工“RNA连接酶”核酶以约100min-1的速率催化相应自我修饰反应。另外，已知某些具有由DNA形成的底物结合臂的经过修饰的锤头核酶以接近100min-1的多种周转率催化RNA裂解。最后，以某些核苷酸类似物置换锤头催化核心内的特定残基得到显示催化速率提高多达10倍的经过修饰的核酶。这些研究结果证明，核酶可以显著大于大多数自我裂解核酶在体外显示的催化速率的催化速率促进化学转化。因此有可能将某些自我裂解核酶的结构优化以得到最大催化活性，或者可制备显示显著更快RNA磷酸二酯裂解速率的全新RNA基元。
适合“锤头”模型的RNA催化剂对RNA底物的分子间裂解首先在1987年得到证明。回收所述RNA催化剂并使其与多种RNA分子反应，证明其确实具有催化性。
基于“锤头”基元设计的催化性RNA已通过在所述催化性RNA中进行适当碱基变化以维持与靶序列的必需碱基配对来用于裂解特定靶序列。此举允许使用催化性RNA来裂解特定靶序列，并且表明根据“锤头”模型设计的催化性RNA可能在体内裂解特定底物RNA。
RNA干扰已成为用于调节哺乳动物和哺乳动物细胞中的基因表达的有力工具。此方法需要使用表达质粒或病毒和欲加工成小干扰RNA(siRNA)的小发夹RNA的编码序列递送小干扰RNA(siRNA)(以RNA本身形式或以DNA形式)。此系统能够将前siRNA有效转运至细胞质中，在细胞质中其具有活性并且允许使用调控启动子和组织特异性启动子以进行基因表达。
在一个实施方案中，寡核苷酸或反义化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物，或其模拟物、嵌合体、类似物或同源物。此术语包括由天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间(主链)键联构成的寡核苷酸以及具有起类似物作用的非天然存在部分的寡核苷酸。此等经过修饰或取代的寡核苷酸通常因具有合乎需要的性质(如细胞摄取增强、对靶核酸的亲和力增强和在核酸酶存在下的稳定性增强)而优于天然形式。
根据本发明，寡核苷酸或“反义化合物”包括反义寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模拟物、嵌合体、类似物或同源物)、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物(如siRNA化合物)、saRNA、aRNA，和与靶核酸的至少一部分杂交并且调节其功能的任何其它寡聚化合物。因此，其可为DNA、RNA、DNA样分子、RNA样分子或其混合物，或可为其中一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或发夹状寡聚化合物，并且可含有如内部或末端突起、错配或环等结构元件。反义化合物通常制备为线性，但可联接或以其它方式制备为环状和/或分支状。反义化合物可包括以下构筑体，如杂交以形成完全或部分双链化合物的两条链，或具有足够自身互补性从而允许杂交且形成完全或部分双链化合物的单一链。所述两条链可内部连接从而留下游离3′或5′末端，或可连接形成连续发夹结构或环。发夹结构可在5′或3′末端含有悬突，从而产生具有单链特征的延伸。双链化合物任选地可在末端上包括悬突。其它修饰可包括连接于一个末端、所选核苷酸位置、糖位置或一个核苷间键联的偶联基团。或者，两条链可通过非核酸部分或连接子基团连接。当由仅一条链形成时，dsRNA可采取自身回折形成双链体的自我互补发夹型分子的形式。因此，dsRNA可为完全或部分双链。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来达成。当由两条链或采取自身回折形成双链体的自我互补发夹型分子形式的单一链形成时，所述两条链(或单一链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式进行碱基配对的互补RNA链。
引入系统中后，本发明的化合物可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用从而实现靶核酸的裂解或其它修饰，或可通过占位机制起作用。一般来说，核酸(包括寡核苷酸)可描述为“DNA样分子”(即，一般具有一个或多个2′-脱氧糖并且一般具有T而非U碱基)或“RNA样分子”(即，一般具有一个或多个2′-羟基或2′-修饰糖并且一般具有U而非T碱基)。核酸螺旋可采用多于一种类型的结构，最通常是A型和B型。认为具有B型样结构的寡核苷酸一般是“DNA样分子”而具有A型样结构的寡核苷酸一般是“RNA样分子。”在一些(嵌合)实施方案中，反义化合物可兼有A型和B型区。
根据本发明的反义化合物可包含长约5至约80个核苷酸(即，约5至约80个连接的核苷)的反义部分。这是指反义化合物的反义链或部分的长度。换句话说，本发明的单链反义化合物包含约5至约80个核苷酸，并且本发明的双链反义化合物(举例来说，如dsRNA)包含长约5至约80个核苷酸的有义和反义链。本领域的普通技术人员应了解，此包括长度为5、6、7，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的反义部分，或其中的任何范围。
在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有长10至50个核苷酸的反义部分。本领域的普通技术人员应了解，此包括具有长10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的反义部分的寡核苷酸，或其中的任何范围。在一些实施方案中，寡核苷酸长15个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的反义或寡核苷酸化合物具有长12或13至30个核苷酸的反义部分。本领域的普通技术人员应了解，此包括具有长12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的反义部分的反义化合物，或其中的任何范围。
在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括在化合物中的一个或多个核苷酸位置存在不同碱基的变体。举例来说，如果第一核苷酸是腺嘌呤，那么可产生在此位置含有胸腺嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶的变体。此变异可在反义或dsRNA化合物的任何位置进行。接着使用本文所述的方法测试这些化合物以测定其抑制靶核酸表达的能力。
在一些实施方案中，反义化合物与标靶之间的同源性、序列同一性或互补性为约40％至约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60％至约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％至约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约80％至约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸(如SEQ ID NO：4至29中所述的核酸分子)包含一个或多个取代或修饰。在一个实施方案中，核苷酸被锁核酸(LNA)取代。
在另一实施方案中，寡核苷酸靶向与Sirtuin(SIRT)和如SEQ ID NO：1至14所述的序列相关的编码和/或非编码序列的有义和/或反义核酸分子的一个或多个区。也使寡核苷酸靶向SEQ ID NO：1至14的重叠区。
本发明的某些寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本发明的情形中，“嵌合寡核苷酸”或“嵌合体”是含有两个或多个各自由至少一个核苷酸构成的化学上不同的区的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常含有至少一个赋予一种或多种有益性质(如核酸酶抗性增强、细胞摄取增加、对标靶的亲和力增强)的修饰核苷酸的区和作为能够裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物的区。举例来说，RNA酶H是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。因此，RNA酶H的活化导致RNA标靶裂解，由此大大增强基因表达的反义调节的效率。因此，当使用嵌合寡核苷酸时，相较于与相同靶区杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸，通常用较短寡核苷酸可获得类似结果。RNA标靶的裂解通常可利用凝胶电泳和(必要时)本领域中已知的相关核酸杂交技术进行检测。在一个实施方案中，嵌合寡核苷酸包含至少一个经过修饰以增强标靶结合亲和力的区和通常充当RNA酶H的底物的区。寡核苷酸对其标靶的亲和力(在此情况下为编码ras的核酸)通常通过测量寡核苷酸/标靶对的Tm进行测定，所述Tm是寡核苷酸与标靶解离时的温度；解离利用分光光度法进行检测。Tm越高，寡核苷酸对标靶的亲和力也就越强。
本发明的嵌合反义化合物可形成为两种或多种寡核苷酸、经过修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸类似物的复合结构。所述化合物在本领域中也称为杂交体或间隙聚合物(gapmer)。教示所述杂交结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。
在另一实施方案中，寡核苷酸中经过修饰的区域包含至少一个在糖的2′位置经过修饰的核苷酸，最优选为经过2′-O烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟修饰的核苷酸。在另一实施方案中，RNA修饰包括嘧啶的核糖上的2′-氟、2′-氨基和2′O-甲基修饰、无碱基残基或位于RNA的3′末端的倒转碱基。所述修饰通常并入寡核苷酸中并且已显示所述寡核苷酸针对指定标靶具有比2′-脱氧寡核苷酸高的Tm(即，较高标靶结合亲和力)。所述亲和力增加的效应为大大增强RNAi寡核苷酸对基因表达的抑制。RNA酶H是裂解RNA：DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶；因此活化此酶导致RNA标靶裂解，并且因此可大大增强RNAi抑制的效率。RNA的裂解通常通过凝胶电泳来证实。在另一实施方案中，嵌合寡核苷酸也经过修饰以增强核酸酶抗性。细胞含有多种可降解核酸的核酸外切酶和核酸内切酶。已显示多种核苷酸和核苷修饰使得其所并入的寡核苷酸对核酸酶消化的抗性比天然寡脱氧核苷酸强。核酸酶抗性通常通过将寡核苷酸与细胞提取物或分离的核酸酶溶液一起孵育并且通常利用凝胶电泳测量随时间保留的完整寡核苷酸的程度进行测量。经过修饰以增强核酸酶抗性的寡核苷酸保持完整的时间比未经过修饰的寡核苷酸长。多种寡核苷酸修饰已证明增强或赋予核酸酶抗性。含有至少一个硫代磷酸酯的寡核苷酸在当前是更优选的。在一些情况下，增强标靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也能够独立地增强核酸酶抗性。一些可取修饰可见于DeMesmaeker等(1995)Acc.Chem.Res.，28：366-374中。
本发明所设想的一些寡核苷酸的特定实例包括包含经过修饰的主链的寡核苷酸，所述经过修饰的主链例如为硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键联或短链杂原子或杂环糖间键联。大多数为具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链(特别是CH2--NH--O--CH2、CH，--N(CH3)--O--CH2[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2和O--N(CH3)--CH2--CH2主链)的寡核苷酸，其中天然磷酸二酯主链表示为O--P--O--CH，)。由De Mesmaeker等(1995)Acc.Chem.Res.28：366-374公开的酰胺主链也是优选的。具有吗啉基主链结构的寡核苷酸同样优选(Summerton和Weller，美国专利No.5,034,506)。在其它实施方案中，如肽核酸(PNA)主链，寡核苷酸的磷酸二酯主链被置换为聚酰胺主链，核苷酸直接或间接结合于所述聚酰胺主链的氮杂氮原子。寡核苷酸还可包含一个或多个经过取代的糖部分。寡核苷酸在2′位置包含以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)nCH3，其中n为1至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、经过取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O--、S--或N-烷基；O--、S--或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；经过取代的硅烷基；RNA裂解基团；报导基团；插入剂；用于改良寡核苷酸的药物动力学性质的基团；或用于改良寡核苷酸和具有类似性质的其它取代基的药效学性质的基团。修饰包括2′-甲氧基乙氧基[2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)]。其它修饰包括2′-甲氧基(2′-O--CH3)、2′-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)和2′-氟(2′-F)。类似修饰还可在寡核苷酸上的其它位置进行，特别是3′端核苷酸上的糖的3′位置和5′端核苷酸的5′位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物(如环丁基)以替代戊呋喃糖基。
寡核苷酸还可另外或替代地包括核苷碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”核苷酸包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核苷酸包括在天然核酸中仅很少或短暂存在的核苷酸，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶(特别是5-甲基胞嘧啶，也称为5-甲基-2′脱氧胞嘧啶并且在本领域中常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成核苷酸，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它经过杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。可包括本领域中已知的“通用”碱基，例如肌苷。已显示5-Me-C取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃。(Sanghvi，Y.S.，于Crooke，S.T.和Lebleu，B.编著，AntisenseResearch and Applications，CRC出版社，Boca Raton，1993，第276-278页中)并且是正处于研究中的碱基取代。
本发明寡核苷酸的另一修饰涉及使寡核苷酸化学连接于一个或多个增强寡核苷酸的活性或细胞摄取的部分或偶联物。所述部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分、胆固醇基部分、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇基)、硫代胆固醇、脂肪族链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵)、聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸。包含亲脂性部分的寡核苷酸和制备所述寡核苷酸的方法在本领域中是已知的，例如美国专利No.5,138,045、5,218,105和5,459,255。
不必在指定寡核苷酸中的所有位置上均一修饰，并且实际上可将多于一个上述修饰并入单一寡核苷酸中或者甚至并入寡核苷酸内的单一核苷中。本发明还包括作为如上文所定义的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。
在另一实施方案中，使本发明的核酸分子与另一部分偶联，所述另一部分包括但不限于无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质或聚烃化合物。本领域的技术人员将认识到，这些分子可连接至构成核酸分子的任何核苷酸中一者或多者的糖、碱基或磷酸酯基上的若干位置。
根据本发明使用的寡核苷酸可通过已知的固相合成技术便利地常规制备。用于所述合成的设备由包括Applied Biosystems在内的若干家供应商销售。还可采用用于所述合成的任何其它方式；寡核苷酸的实际合成完全在本领域的普通技术人员的技能范围内。使用类似技术来制备其它寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是熟知的。还熟知使用类似技术和市售经过修饰的酰胺酸酯和控制孔径玻璃(controlled-pore glass；CPG)产品(经过生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素修饰的酰胺酸酯和/或CPG(可从Glen Research，Sterling VA获得)来合成经过荧光标记、生物素化或其它修饰的寡核苷酸，如经过胆固醇修饰的寡核苷酸。
根据本发明，使用修饰(如使用LNA单体)来增强效能、特异性和持续时间并且拓宽寡核苷酸的施用途径包括当前化学，如MOE、ANA、FANA、PS等。此可通过将当前寡核苷酸中的一些单体用LNA单体取代来达成。经过LNA修饰的寡核苷酸可具有与亲本化合物类似的大小或者可较大或优选较小。即，所述经过LNA修饰的寡核苷酸含有少于约70％，更优选少于约60％，最优选少于约50％的LNA单体并且其大小在约5与25个核苷酸之间，更优选在约12与20个核苷酸之间。
经过修饰的寡核苷酸主链包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键联的硼代磷酸酯、其2′-5′连接类似物和具有反转极性者，其中相邻核苷单元对为3′-5′至5′-3′连接或为2′-5′至5′-2′连接。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
教示上述含磷键联的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。
其中不包括磷原子的经过修饰的寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键联、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键联或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键联形成的主链。所述主链包括具有以下的主链：吗啉基(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链、亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲亚氨基和亚甲基肼基主链；酰胺主链；和具有混合N、O、S和CH2组成部分的其它主链。
教示上述寡核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。
在其它寡核苷酸模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键联两者(即，主链)均被新颖基团置换。维持碱基单元以便与适当核酸标靶化合物杂交。一种所述寡聚化合物，即已显示具有极佳杂交性质的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被置换为含有酰胺的主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链。保留核苷碱基并且与主链的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。教示PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。关于PNA化合物的其它教示可见于Nielsen等(1991)Science 254，1497-1500中。
本发明的另一实施方案为具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，并且所述杂原子主链特别是上文所提及的美国专利no.5,489,677的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯主链表示为-O-P-O-CH2-)，和上文所提及的美国专利no.5,602,240的酰胺主链。具有上文所提及的美国专利no.5,034,506的吗啉基主链结构的寡核苷酸也为本发明的实施方案。
经过修饰的寡核苷酸还可含有一个或多个经过取代的糖部分。寡核苷酸在2′位置包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可经过取代或未被取代；C至CO烷基或C2至CO烯基和炔基。特别是O(CH2)nOmCH3、O(CH2)n、OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2nON(CH2)nCH3)2，其中n和m可为1至约10。其它寡核苷酸在2′位置包含以下之一：C至CO、(低级烷基、经过取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经过取代的硅烷基、RNA裂解基团、报导基团、插入剂、用于改良寡核苷酸的药物动力学性质的基团或用于改良寡核苷酸的药效学性质的基团，和具有类似性质的其它取代基。一种修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)，即烷氧基烷氧基。另一修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE，如本文以下实施例中所描述，和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其它修饰包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。类似修饰还可在寡核苷酸上的其它位置进行，特别是3′端核苷酸上或2′-5′连接型寡核苷酸中的糖的3′位置和5′端核苷酸的5′位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物(如环丁基部分)以替代戊呋喃糖基糖。教示所述修饰糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，所述美国专利各自引用的方式并入本文。
寡核苷酸还可包含核苷碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”核苷酸包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核苷酸包括其它合成和天然核苷酸，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤基尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇基、8-硫烷基、8-羟基和其它8位取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其它5位取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基喹啉和7-甲基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
此外，核苷酸包括美国专利No.3,687,808中公开的核苷酸；‘The ConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering’，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编著John Wiley & Sons，1990中公开的核苷酸；Englisch等，‘Angewandle Chemie，International Edition’，1991，30，第613页公开的核苷酸；和Sanghvi，Y.S.，第15章，‘Antisense Research and Applications’，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编著，CRC出版社，1993公开的核苷酸。某些这些核苷酸特别适用于增强本发明的寡聚化合物的结合亲和力。其包括5位取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6和O-6位取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编著，‘AntisenseResearch and Applications’，CRC出版社，Boca Raton，1993，第276-278页)并且是正处于研究中的碱基取代，甚至更特别在与2′-O甲氧基乙基糖修饰组合时。
教示上述修饰核苷酸以及其它修饰核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692，和5,681,941，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。
本发明寡核苷酸的另一修饰涉及使寡核苷酸化学连接于一个或多个增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或偶联物。
所述部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇基)、硫代胆固醇、脂肪族链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵)、聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。
教示所述寡核苷酸偶联物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。
药物发现：本发明的化合物还可应用于药物发现和标靶验证的领域。本发明包括在药物发现中使用本文中鉴别的化合物和靶区段以试图阐明Sirtuin(SIRT)多核苷酸与疾病病况、表型或病状之间存在的关系。这些方法包括检测或调节(SIRT)多核苷酸，其包括使样品、组织、细胞或生物体与本发明的化合物接触，在处理后的一些时间测量Sirtuin(SIRT)多核苷酸的核酸或蛋白质水平和/或相关表型或化学端点，和任选地比较所测得的值与未处理样品或用本发明的另一化合物处理的样品。这些方法还可平行或与其它实验组合进行以确定未知基因的功能以便用于标靶验证过程，或者确定特定基因产物作为治疗或预防特定疾病、病状或表型的标靶的效力。
评估基因表达的上调或抑制：
外源性至宿主细胞或生物体中的转移可通过直接检测所述核酸在所述细胞或生物体中的存在来评估。所述检测可通过本领域中熟知的若干种方法来达成。例如，外源性核酸的存在可通过DNA印迹或聚合酶链反应(PCR)技术使用特异性扩增与所述核酸相关的核苷酸序列的引物进行检测。外源性核酸的表达还可使用包括基因表达分析在内的常规方法进行测量。例如，由外源性核酸产生的mRNA可使用RNA印迹和逆转录PCR(RT-PCR)进行检测和定量。
RNA从外源性核酸的表达还可以通过测量酶活性或报导蛋白活性进行检测。例如，反义调节活性可通过作为外源性核酸产生效应RNA的指示的靶核酸表达的减少或增加进行间接测量。基于序列保守性，可设计引物并用于扩增靶基因的编码区。最初，可使用来自各基因的表达量最高的编码区来建立模型对照基因，不过可使用任何编码或非编码区。通过将各编码区插入报导编码区与其聚(A)信号之间组装各对照基因。这些质粒将产生在基因的上游部分中具有报导基因且在3′非编码区中具有潜在RNAi标靶的mRNA。将通过调节报导基因来测定个别反义寡核苷酸的有效性。适用于本发明方法中的报导基因包括乙酰羟酸合成酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合成酶(NOS)、章鱼碱合成酶(OCS)和其衍生物。可使用多种赋予对氨苄青霉素(ampicillin)、博来霉素(bleomycin)、氯霉素(chloramphenicol)、庆大霉素(gentamycin)、潮霉素(hygromycin)、卡那霉素(kanamycin)、林肯霉素(lincomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、草丁磷(phosphinothricin)、嘌呤霉素(puromycin)和四环素(tetracycline)的抗性的可选择标记。测定报导基因的调节的方法在本领域中是熟知的，并且包括但不限于荧光测定法(例如荧光光谱学、荧光活化细胞拣选(Fluorescence Activated Cell Sorting；FACS)、荧光显微法)、抗生素抗性测定。
可使用本领域的技术人员已知和本文其它地方描述的方法来测定SIRT1、SIRT3和SIRT6蛋白以及mRNA的表达。例如，可使用如ELISA等免疫测定来测量蛋白质水平。用于ELISA的Sirtuin(SIRT)抗体可购得，例如从R&D Systems(Minneapolis，MN)，Abcam，Cambridge，MA购得。
在实施方案中，通过与对照样品中的Sirtuin(SIRT)表达进行比较来评估使用本发明的反义寡核苷酸处理的样品(例如体内或体外细胞或组织)中的SIRT1、SIRT3和SIRT6表达(例如mRNA或蛋白质)。例如，蛋白质或核酸的表达可使用本领域的技术人员已知的方法与模拟处理或未处理样品中的表达进行比较。或者，可根据所要信息与用对照反义寡核苷酸(例如，具有改变的或不同序列的寡核苷酸)处理的样品进行比较。在另一实施方案中，可将处理与未处理样品中Sirtuin(SIRT)蛋白或核酸的表达差异同处理样品与未处理样品中不同核酸(包括研究者视为适当的任何标准物，例如持家基因)的表达差异进行比较。
观测到的差异可根据需要例如以比率或分数形式表示，以用于与对照进行比较。在实施方案中，用本发明的反义寡核苷酸处理的样品中Sirtuin(SIRT)mRNA或蛋白质的水平相对于未处理样品或用对照核酸处理的样品增加或减少约1.25倍至约10倍或更多倍。在实施方案中，Sirtuin(SIRT)mRNA或蛋白质的水平增加或减少至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍或至少约10倍或更多倍。
试剂盒、研究试剂、诊断学和治疗学
本发明的化合物可用于诊断、治疗和预防，以及用作研究试剂和试剂盒组分。此外，能够以强特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸通常由本领域的普通技术人员用于阐明特定基因的功能或区分生物路径的不同成员的功能。
关于在试剂盒和诊断学以及各种生物系统中的使用，单独或与其它化合物或治疗剂组合的本发明化合物适用作用于阐明在细胞或组织内表达的基因的一部分或全部互补序列的表达模式的差异和/或组合分析中的工具。
如本文所用，术语“生物系统”或“系统”定义为表达或能够表达Sirtuin(SIRT)的产物的任何生物体、细胞、细胞培养物或组织。其包括但不限于人、转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物和其组合。
作为一个非限制性实例，将用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织内的表达模式与未用反义化合物处理的对照细胞或组织相比较，并且因为所产生的模式与例如所考查基因的疾病相关性、信号转导路径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能有关，所以分析所产生模式中基因表达的差异水平。这些分析可利用经过刺激或未刺激的细胞并且在影响表达模式的其它化合物存在或不存在下进行。
本领域中已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo，(2000)FEBS Lett.，480，17-24；Celis等，(2000)FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE(基因表达的系列分析(serial analysis of gene expression))(Madden等，(2000)DrugDiscov.Today，5，415-425)、READS(经过消化的cDNA的限制酶扩增(restriction enzymeamplification of digested cDNA))(Prashar和Weissman，(1999)Methods Enzymol.，303，258-72)、TOGA(总基因表达分析(total gene expression analysis))(Sutcliffe等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，1976-81)、蛋白质阵列和蛋白质组学(Celis等，(2000)FEBS Lett.，480，2-16；Jungblut等，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、表达序列标签(expressed sequence tag；EST)测序(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson等，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消减RNA指纹(subtractive RNAfingerprinting；SuRF)(Fuchs等，(2000)Anal.Biochem.286，91-98；Larson等，(2000)Cytometry 41，203-208)、消减克隆、差异展示(differential display；DD)(Jurecic和Belmont，(2000)Curr.Opin.Microbiol.3，316-21)、比较基因组杂交(Carulli等，(1998)J.Cell Biochem.Suppl.，31，286-96)、FISH(荧光原位杂交(fluorescent in situhybridization)技术(Going和Gusterson，(1999)Eur.J.Cancer，35，1895-904)和质谱方法(To，Comb.(2000)Chem.High Throughput Screen，3，235-41)。
因为本发明化合物与编码Sirtuin(SIRT)的核酸杂交，所以所述化合物适用于研究和诊断。举例来说，在如本文所公开使得寡核苷酸成为有效Sirtuin(SIRT)调节剂的效率和条件下杂交的寡核苷酸在有利于基因扩增或检测的条件下分别是有效的引物或探针。这些引物和探针适用于需要特异性检测编码Sirtuin(SIRT)的核酸分子的方法中和适用于扩增所述核酸分子以供检测或在其它Sirtuin(SIRT)研究中使用。本发明的反义寡核苷酸(特别是引物和探针)与编码Sirtuin(SIRT)的核酸的杂交可利用本领域中已知的方式进行检测。所述方式可包括使酶与寡核苷酸偶联、放射性标记寡核苷酸或任何其它适合检测方式。还可制备使用所述检测方式检测样品中的Sirtuin(SIRT)水平的试剂盒。
反义分子的特异性和敏感性也被本领域的技术人员用于治疗用途。反义化合物已经作为治疗部分用于治疗动物(包括人)的疾病病况。反义寡核苷酸药物已经安全并有效地施用于人并且当前正在进行众多临床试验。因此确定反义化合物可以是可经过配置从而在用于治疗细胞、组织和动物(尤其是人)的治疗方案中适用的适用治疗模态。
对于治疗，可通过根据本发明施用反义化合物来治疗怀疑患有可通过调节Sirtuin(SIRT)多核苷酸的表达治疗的疾病或病症的动物(优选是人)。例如，在一个非限制性实例中，所述方法包括向需要治疗的动物施用治疗有效量的Sirtuin(SIRT)调节剂的步骤。本发明的Sirtuin(SIRT)调节剂有效调节Sirtuin(SIRT)的活性或调节Sirtuin(SIRT)蛋白的表达。在一个实施方案中，动物中Sirtuin(SIRT)的活性或表达与对照相比被抑制约10％。优选地，动物中Sirtuin(SIRT)的活性或表达被抑制约30％。更优选地，动物中Sirtuin(SIRT)的活性或表达被抑制50％或更多。因此，寡聚化合物调节Sirtuin(SIRT)mRNA的表达使其与对照相比改变至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施方案中，动物中Sirtuin(SIRT)的活性或表达与对照相比增加约10％。优选地，动物中Sirtuin(SIRT)的活性或表达增加约30％。更优选地，动物中Sirtuin(SIRT)的活性或表达增加50％或更多。因此，寡聚化合物调节Sirtuin(SIRT)mRNA的表达使其与对照相比改变至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
例如，Sirtuin(SIRT)表达的减少可在动物的血清、血液、脂肪组织、肝或任何其它体液中测量。优选地，所分析的所述流体、组织或器官内所含的细胞含有编码Sirtuin(SIRT)肽的核酸分子和/或Sirtuin(SIRT)蛋白本身。
本发明的化合物可通过将有效量的化合物添加至药学上可接受的适合稀释剂或载剂中而以药物组合物形式利用。使用本发明的化合物和方法还可适用于预防。
偶联物：本发明寡核苷酸的另一修饰涉及使寡核苷酸化学连接于一个或多个增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或偶联物。这些部分或偶联物可包括共价结合于如一级或二级羟基等官能团的偶联物基团。本发明的偶联物基团包括插入剂、报导分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团和增强寡聚物的药物动力学性质的基团。典型偶联物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明(rhodamine)、香豆素和染料。在本发明的情形中增强药效学性质的基团包括改良摄取、增强降解抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的情形中增强药物动力学性质的基团包括改良本发明化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性偶联物基团公开于1992年10月23日提交的国际专利申请No.PCT/US92/09196和美国专利No.6,287,860中，所述文献以引用的方式并入本文。偶联物部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇基)、硫代胆固醇、脂肪族链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H膦酸三乙铵)、聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。本发明的寡核苷酸还可偶联至活性药物，例如阿司匹林(aspirin)、华法林(warfarin)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬((S)-(+)-pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹酰基肌氨酸(dansylsarcosine)、2，3，5-三碘苯甲酸、氟灭酸(flufenamic acid)、亚叶酸(folinic acid)、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸盐(barbiturate)、头孢菌素(cephalosporin)、磺胺药、抗糖尿病剂、抗菌剂或抗生素。
教示所述寡核苷酸偶联物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；和5,688,941。
制剂：本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物混合物(如例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部外用或其它制剂)混合、囊封、偶联或以其它方式缔合，以促进摄取、分布和/或吸收。教示所述摄取、分布和/或吸收促进制剂的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,165；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。
尽管反义寡核苷酸无需在载体的情形中施用以便调节标靶表达和/或功能，但本发明的实施方案涉及包含启动子、杂交启动子基因序列的用于表达反义寡核苷酸的表达载体构筑体，并且具有强组成性启动子活性或者可在所要情况下诱导的启动子活性。
在一实施方案中，本发明实践涉及利用适合核酸递送系统施用至少一种前述反义寡核苷酸。在一个实施方案中，所述系统包括可操作地连接于多核苷酸的非病毒载体。所述非病毒载体的实例包括单独寡核苷酸(例如SEQ ID NO：15至94中的任一者或多者)或与适合蛋白质、多糖或脂质制剂组合的寡核苷酸。
另外适合的核酸递送系统包括病毒载体，通常为来自以下至少一者的序列：腺病毒、腺相关病毒(AAV)、辅助病毒依赖性腺病毒、逆转录病毒，或日本凝血病毒-脂质(HVJ)复合物。病毒载体优选包含可操作地连接于多核苷酸的强真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。
另外，载体包括病毒载体、融合蛋白和化学偶联物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia viruses)和基于HIV的病毒。一个基于HIV的病毒载体包含至少两个载体，其中gag和pol基因是来自HIV基因组而env基因是来自另一病毒。优选DNA病毒载体。这些载体包括痘病毒载体(如正痘病毒或禽痘病毒载体)、疱疹病毒载体(如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体)、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
本发明的反义化合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐，或施用至动物(包括人)时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残基的任何其它化合物。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即，保留亲本化合物的所要生物活性并且不导致不当毒物学作用的盐。对于寡核苷酸来说，药学上可接受的盐和其使用的实例进一步描述于美国专利No.6,287,860中，所述美国专利以引用的方式并入本文。
本发明还包括包含本发明的反义化合物的药物组合物和制剂。本发明的药物组合物根据需要局部治疗抑或全身性治疗以及所欲治疗的区域可以多种方式施用。施用可以是局部外用(包括眼用和施用至粘膜，包括阴道和直肠递送)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括利用喷雾器)、气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
对于治疗中枢神经系统中的组织，可通过例如注射或输注至脑脊髓液中来进行施用。将反义RNA施用至脑脊髓炎中描述于例如美国专利申请公布No.2007/0117772“Methodsfor slowing familial ALS disease progression”中，所述文献以引用的方式整体并入本文。
当本发明的反义寡核苷酸意欲施用至中枢神经系统中的细胞中时，可利用一种或多种能够促进本发明的反义寡核苷酸渗透穿过血脑屏障的药剂来进行施用。可在例如内嗅皮质或海马体中进行注射。通过将腺病毒载体施用至肌肉组织中的运动神经元中来递送神经营养因子描述于例如美国专利No.6,632,427“Adenoviral-vector-mediated genetransfer into medullary motor neurons”中，所述美国专利以引用的方式并入本文。将载体直接递送至脑(例如纹状体、丘脑、海马体或黑质)中在本领域中已知且描述于例如美国专利No.6,756,523“Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes intocells of the central nervous system particularly in brain”中，所述美国专利以引用的方式并入本文。施用可为快速的(当利用注射进行时)或经历一段时间进行(当利用缓慢输注或施用缓慢释放制剂时)。
本发明的反义寡核苷酸还可与提供合乎需要的药学或药效学性质的药剂连接或偶联。例如，反义寡核苷酸可偶联至本领域中已知促进渗透或转运穿过血脑屏障的任何物质，如转铁蛋白(transferrin)受体抗体，并且通过静脉内注射进行施用。反义化合物可与例如使得所述反义化合物更有效和/或增加所述反义化合物转运穿过血脑屏障的病毒载体连接。渗透性血脑屏障分布还可通过例如输注糖或氨基酸来达成，所述糖包括但不限于内消旋赤藻糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、卫矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露糖醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纤维二糖、D(+)麦芽糖、D(+)棉籽糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、D(-)核糖、核糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)海藻糖、L(-)海藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖，所述氨基酸包括但不限于谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增强血脑屏障渗透的方法和材料描述于例如美国专利No.4,866,042“Method for the delivery of geneticmaterial across the blood brain barrier”、6,294,520“Material for passagethrough the blood-brain barrier”和6,936,589“Parenteral delivery systems”中，所述所有美国专利均以引用的方式整体并入本文。
本发明的化合物可与其它分子、分子结构或化合物混合物(例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部外用或其它制剂)混合、囊封、偶联或以其它方式缔合，以促进摄取、分布和/或吸收。例如，制剂中可纳入阳离子性脂质以促进寡核苷酸摄取。一种显示促进摄取的所述组合物为LIPOFECTIN(可从GIBCO-BRL，Bethesda，MD获得)。
认为具有至少一个2′-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸特别适用于口服施用。用于局部外用施用药物组合物可包括透皮贴片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。可能必需或需要常规药用载剂、水性、粉末或油性基剂、增稠剂等。经过涂布的避孕套、手套等也可能适用。
通常可以单位剂型提供的本发明的药物制剂可根据制药行业中熟知的常规技术制备。所述技术包括使活性成分与药用载剂或赋形剂缔合的步骤。一般来说，通过使活性成分与液体载剂或细粉状固体载剂或两者均一且紧密地缔合，且必要时接着使产物成型来制备所述制剂。
本发明的组合物可配制为多种可能剂型(如，但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂)中任一者。本发明的组合物还可配制为水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可进一步含有增加所述悬浮液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。所述悬浮液还可含有稳定剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳液、泡沫体和含脂质体制剂。本发明的药物组合物和制剂可包含一种或多种渗透增强剂、载剂、赋形剂或其它活性或非活性成分。
乳液通常为一种液体以直径通常超过0.1μm的小液滴形式分散于另一液体中的异质系统。乳液除分散相和可能以水相、油相中的溶液形式或本身以单独相存在的活性药物外还可含有其它组分。包括微乳液作为本发明的一实施方案。乳液和其使用在本领域中是熟知的并且进一步描述于美国专利No.6,287,860中。
本发明的制剂包括脂质体制剂。如本发明中所用，术语“脂质体”意谓由以球形双层形式排列的两性脂质构成的囊泡。脂质体是具有由亲脂性材料形成的膜和含有所欲递送的组合物的水性内部的单层或多层囊泡。阳离子性脂质体是相信与带负电荷DNA分子相互作用形成稳定复合物的带正电荷脂质体。认为pH值敏感性或带负电荷的脂质体囊封DNA而非与其复合。阳离子性脂质体与非阳离子性脂质体均用于将DNA递送至细胞中。
脂质体还包括“空间上稳定”的脂质体，所述术语在本文中使用时是指包含一种或多种特殊脂质的脂质体。当并入脂质体中时，这些特殊脂质产生相对于缺乏所述特殊脂质的脂质体具有增加的循环寿命的脂质体。空间稳定脂质体的实例是脂质体的囊泡形成脂质部分中的一部分包含一种或多种糖脂或者利用一种或多种亲水性聚合物(如聚乙二醇(PEG)部分)衍生化的脂质体。脂质体和其使用进一步描述于美国专利No.6,287,860中。
本发明的药物制剂和组合物还可包括表面活性剂。表面活性剂在药品、制剂和乳液中的使用在本领域中是熟知的。表面活性剂和其使用进一步描述于美国专利No.6,287,860中，所述美国专利以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，本发明采用各种渗透增强剂来实现核酸(特别是寡核苷酸)的有效递送。除帮助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜外，渗透增强剂还增强亲脂性药物的渗透性。渗透增强剂可归类为属于以下物种广泛类别中的一种：即，表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。渗透增强剂和其使用进一步描述于美国专利No.6,287,860中，所述美国专利以引用的方式并入本文。
本领域的技术人员应认识到，制剂通常根据其预定用途(即，施用途径)进行设计。
用于局部外用施用的制剂包括本发明的寡核苷酸与局部外用递送剂(如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)混合的制剂。脂质和脂质体包括中性(例如二油酰基-磷脂酰基DOPE乙醇胺、二豆蔻酰基磷脂酰基胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰基胆碱)、阴性(例如二豆蔻酰基磷脂酰基甘油DMPG)和阳离子性(例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基-磷脂酰基乙醇胺DOTMA)。
对于局部外用或其它施用，本发明的寡核苷酸可囊封于脂质体中或可与其(特别是与阳离子性脂质体)形成复合物。或者，可使寡核苷酸与脂质(特别是阳离子性脂质)复合。脂肪酸和其酯、药学上可接受的盐以及其使用进一步描述于美国专利No.6,287,860中。
用于口服施用的组合物和制剂包括散剂或颗粒剂、微粒、纳米颗粒、于水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、药囊、片剂或小片剂。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂。口服制剂是本发明的寡核苷酸与一种或多种渗透增强剂、表面活性剂和螯合剂联合施用的制剂。表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。胆汁酸/盐和脂肪酸和其使用进一步描述于美国专利No.6,287,860中，所述美国专利以引用的方式并入本文。同样描述渗透增强剂(例如脂肪酸/盐)与胆汁酸/盐组合的组合。一种特别的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其它渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明的寡核苷酸可以颗粒形式(包括喷雾干燥粒子)口服递送，或进行复合以形成微米或纳米粒子。寡核苷酸复合剂和其使用进一步描述于美国专利No.6,287,860中，所述美国专利以引用的方式并入本文。
用于胃肠外、鞘内或脑室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可含有缓冲剂、稀释剂和其它适合添加剂，如但不限于渗透增强剂、载剂化合物和其它药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明的某些实施方案提供含有一种或多种寡聚化合物和一种或多种通过非反义机制起作用的其它化学治疗剂的药物组合物。所述化学治疗剂的实例包括但不限于癌症化学治疗药物，如柔红霉素(daunorubicin)、道诺霉素(daunomycin)、更生霉素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、依索比星(esorubicin)、博来霉素(bleomycin)、马磷酰胺(mafosfamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、双氯乙基-亚硝基脲(bischloroethyl-nitrosurea)、白消安(busulfan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、放线菌素D(actinomycin D)、光神霉素(mithramycin)、泼尼松(prednisone)、羟孕酮(hydroxyprogesterone)、睾酮(testosterone)、他莫昔芬(tamoxifen)、达卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴嗪(procarbazine)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、五甲蜜胺(pentamethylmelamine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氨吖啶(amsacrine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、甲基环己基亚硝基脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥(nitrogenmustards)、美法仑(melphalan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氮胞嘧啶(5-azacytidine)、羟基脲(hydroxyurea)、脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、4-羟基过氧环磷酰胺(4-hydroxyperoxycyclo-phosphoramide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil；5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine；5-FUdR)、甲氨蝶呤(methotrexate；MTX)、秋水仙碱(colchicine)、紫杉醇(taxol)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide；VP-16)、三甲曲沙(trimetrexate)、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、吉西他滨(gemcitabine)、替尼泊苷(teniposide)、顺铂(cisplatin)和二乙基乙烯雌酚(diethylstilbestrol；DES)。当与本发明化合物一起使用时，所述化学治疗剂可个别使用(例如5-FU和寡核苷酸)、依序使用(例如5-FU和寡核苷酸使用一段时间，接着使用MTX和寡核苷酸)或与一种多种其它所述化学治疗剂组合使用(例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或者5-FU、放射性疗法和寡核苷酸)。本发明的组合物中还可组合消炎药(包括但不限于非类固醇消炎药和皮质类固醇)以及抗病毒药(包括但不限于病毒唑(ribivirin)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(ganciclovir))。反义化合物与其它非反义药物的组合也在本发明的范围内。两种或多种组合的化合物可一起使用或依序使用。
在另一相关实施方案中，本发明的组合物可含有一种或多种靶向第一核酸的反义化合物(特别是寡核苷酸)和一种或多种靶向第二核酸标靶的其它反义化合物。例如，第一标靶可以是Sirtuin(SIRT)的特定反义序列，而第二标靶可以是另一核苷酸序列的区。或者，本发明的组合物可以含有两种或多种靶向相同Sirtuin(SIRT)核酸标靶的不同区的反义化合物。反义化合物的众多实例在本文中说明，而其它可从本领域中已知的适合化合物中选择。两种或多种组合的化合物可一起使用或依序使用。
给药：
认为治疗组合物的配制和其后续施用(给药)在本领域的技术人员的技能范围内。给药取决于所欲治疗的疾病病况的严重性和反应性，其中治疗过程持续若干天至若干个月，或者直至实现治愈或达成疾病病况的减少。最佳给药时程可从患者体内药物积累的测量值计算出来。本领域的普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据个别寡核苷酸的相对效力而改变，且通常可基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50进行估算。一般来说，剂量是每公斤体重0.01μg至100g，并且可以每天、每周、每个月或每年给予一次或多次，或者甚至每2至20给予一次。本领域的普通技术人员可以根据所测得的药物在体液或组织中的滞留时间和浓度容易地估算出给药的重复率。成功治疗后，可能需要对患者进行维持疗法以防止疾病病况复发，其中寡核苷酸以维持剂量施用，所述维持剂量在每公斤体重0.01μg至100g范围内，每天一次或多次至每20年一次。
在实施方案中，患者用一定剂量的药物治疗，所述剂量是每公斤体重至少约1mg、至少约2mg、至少约3mg、至少约4mg、至少约5mg、至少约6mg、至少约7mg、至少约8mg、至少约9mg、至少约10mg、至少约15mg、至少约20mg、至少约25mg、至少约30mg、至少约35mg、至少约40mg、至少约45mg、至少约50mg、至少约60mg、至少约70mg、至少约80mg、至少约90mg或至少约100mg。反义寡核苷酸的某些注射剂量描述于例如美国专利No.7,563,884“Antisensemodulation of PTP1B expression’中，所述美国专利以引用的方式整体并入本文。
尽管上文已描述了本发明的各种实施方案，但应了解，其仅是以举例的方式呈示而不具限制性。可在不悖离本发明的精神和范围的情况下根据本文的公开内容对所公开的实施方案进行各种改变。因此，本发明的宽度和范围不应受任何上述实施方案限制。
本文提及的所有文献以引用的方式并入本文。本申请中引用的所有出版物和专利文献出于所有目的以引用的方式并入本文，程度就仿佛各个别出版物或专利文献是同样个别地指示一般。尽管在本文件中对各种参考文献进行了引用，但申请人并不承认任何特定参考文献是本发明的“先前技术”。本发明组合物和方法的实施方案在以下实施例中说明。
实施例
以下非限制性实施例用于说明本发明的所选实施方案。应了解，所示比例变化和组分要素的替代对于本领域的技术人员来说是显而易知的并且在本发明的实施方案的范围内。
实施例1：设计对Sirtuin(SIRT)的反义核酸分子和/或Sirtuin(SIRT)多核苷酸的有义链具有特异性的反义寡核苷酸
如上文所指出，术语“对......具特异性的寡核苷酸”或“靶向......的寡核苷酸”是指具有以下序列的寡核苷酸：(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合物，或(ii)能够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体。
通过使用自动比对核酸序列并且指示同一性或同源性区的计算机程序来促进适当寡核苷酸的选择。使用所述程序比较例如通过搜索数据库(如GenBank)或对PCR产物进行测序所获得的核酸序列。比较来自多种物种的核酸序列允许选择显示适当程度的物种间同一性的核酸序列。在尚未进行测序的基因的情况下，进行DNA印迹分析以允许测定靶物种和其它物种中基因之间的同一性程度。通过如本领域中所熟知以不同程度的严谨度执行DNA印迹分析，可获得同一性的近似量度。这些程序允许选择展现与所欲控制的受试者的靶核酸序列具有高度互补性和与其它物种的相应核酸序列具有较低程度互补性的寡核苷酸。本领域的技术人员将认识到，在选择用于本发明的适当基因区时存在相当大的宽容度。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能从而引起功能和/或活性的调节，并且存在足够程度的互补以在需要特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性处理的情况下在生理条件下，和在体外测定的情况下在执行测定的条件下)避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合时，所述反义化合物“可特异性杂交”。
可通过本领域中已知的一种或多种体外测定来确定本文所述的寡核苷酸的杂交性质。例如，可通过使用熔解曲线测定确定靶天然反义分子与潜在药物分子之间的结合强度来获得本文所述的寡核苷酸的性质。
靶天然反义分子与潜在药物分子(分子)之间的结合强度可使用测量分子间相互作用的任何已确立方法(例如熔解曲线测定)进行评估。
熔解曲线测定确定天然反义分子/分子复合物发生从双链到单链构象的快速转变时的温度。此温度广泛公认为两个分子之间相互作用强度的可靠指标。
熔解曲线测定可使用实际天然反义RNA分子的cDNA拷贝或对应于分子的结合位点的合成DNA或RNA核苷酸进行。可获得多种含有进行此测定所必需的所有试剂的试剂盒(例如Applied Biosystems Inc.MeltDoctor试剂盒)。这些试剂盒包括含有一种双链DNA(dsDNA)结合染料(如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO等)的适合缓冲溶液。dsDNA染料的性质使得其在呈游离形式时几乎不发射荧光，但在结合于dsDNA时发射强荧光。
为进行测定，将cDNA或相应寡核苷酸与分子以由特定制造商方案规定的浓度混合。将混合物加热至95℃以使所有先前形成的dsDNA复合物解离，接着缓慢冷却至室温或由试剂盒制造商规定的其它较低温度以允许DNA分子退火。接着将新形成的复合物缓慢加热至95℃，同时连续收集由反应产生的荧光量的数据。荧光强度与反应中存在的dsDNA的量成反比。可使用与试剂盒相容的实时PCR仪器(例如ABI的StepOne Plus实时PCR系统或LightTyper仪器，Roche Diagnostics，Lewes，UK)收集数据。
通过使用适当软件(例如LightTyper(Roche)或SDS Dissociation Curve(ABI))针对温度(x轴)在y轴上绘示荧光相对于温度的负导数(-d(荧光)/dT)构建熔解峰。分析数据以鉴别dsDNA复合物快速转变成单链分子时的温度。此温度称为Tm且与两个分子之间相互作用的强度成正比。通常，Tm将超过40℃。
实施例2：SIRT多核苷酸的调节
用反义寡核苷酸处理HepG2细胞
使来自ATCC的HepG2细胞(目录号HB-8065)在生长培养基(MEM/EBSS(Hyclone目录号SH30024或Mediatech目录号MT-10-010-CV)+10％FBS(Mediatech目录号MT35-011-CV)+青霉素/链霉素(Mediatech目录号MT30-002-CI))中在37℃和5％CO2下生长。实验前一天，将细胞以1.5×105/ml的密度重涂铺于6孔盘中且在37℃和5％CO2下孵育。实验当天，将6孔盘中的培养基更换为新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸稀释为20μM的浓度。将2μl此溶液与400μl Opti-MEM介质(Gibco目录号31985-070)和4μl转染胺2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen目录号11668019)在室温下一起孵育20分钟并施加到具有HepG2细胞的6孔盘的各孔中。包括2μl水替代寡核苷酸溶液的类似混合物用作模拟转染对照。在37℃和5％CO2下孵育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。添加反义寡核苷酸48小时后，移除培养基并使用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)或来自Qiagen的RNeasy总RNA分离试剂盒(目录号74181)按照制造商的说明从细胞提取RNA。将600ng RNA添加至使用来自Thermo Scientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)或高容量cDNA逆转录试剂盒(目录号4368813)如制造商的方案中所述执行的逆转录反应中。使用来自此逆转录反应的cDNA通过使用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI设计的引物/探针(Applied Biosystems Taqman基因表达测定：Hs00202021_m1、Hs00202030_m1和Hs00213036_m1，AppliedBiosystems Inc.，Foster City CA)进行的实时PCR监测基因表达。使用以下PCR循环：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)，使用StepOne Plus实时PCR机(Applied Biosystems)。
基于处理组与模拟转染样品之间经过18S正规化的dCt值的差异计算用反义寡核苷酸处理后基因表达的变化倍数。
结果：
实时PCR结果表明，HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用SIRT1反义分子CV396200的一些反义寡核苷酸处理48小时后显著增加(图3、4)。
实时PCR结果表明，HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在一种针对SIRT1反义分子CV396200设计的寡核苷酸中显著增加(图8)。
实时PCR结果表明，HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在两种针对SIRT1反义分子CV428275设计的寡核苷酸中显著增加(图9)。
结果表明，HepG2细胞中的SIRT1mRNA水平在用一种针对SIRT反义分子BE717453设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加。(图10)。
结果表明，HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用三种针对SIRT1反义分子AV718812设计的寡核苷酸处理48小时后分别显著增加(图11)。
实时PCR结果表明，HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用两种针对SIRT1反义分子AW169958设计的寡聚物处理48小时后显著增加(图12)。
RT PCR结果表明，HepG2细胞中的sirt3水平在用针对sirt3反义分子Hs.683117设计的硫代磷酸酯反义寡核苷酸(CUR-1545-1550)处理48小时后增加(图17)。
实时PCR结果表明，HepG2细胞中SIRT6mRNA的水平在用一种针对SIRT6反义分子NM133475设计的寡聚物处理48小时后显著增加(图18)。
实时PCR结果表明，HepG2细胞中SIRT6mRNA的水平在用一种针对SIRT6反义分子bf772662设计的寡聚物处理48小时后显著增加(图19)。
用反义寡核苷酸处理3T3细胞
使来自ATCC的3T3细胞(目录号CRL-1658)在生长培养基(MEM/EBSS(Hyclone目录号SH30024或Mediatech目录号MT-10-010-CV)+10％FBS(Mediatech目录号MT35-011-CV)+青霉素/链霉素(Mediatech目录号MT30-002-CI))中在37℃和5％CO2下生长。实验前一天，将细胞以1.5×105/ml的密度重涂铺于6孔盘中且在37℃和5％CO2下孵育。实验当天，将6孔盘中的培养基更换为新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸稀释为20μM的浓度。将2μl此溶液与400μl Opti-MEM介质(Gibco目录号31985-070)和4μl转染胺2000(Invitrogen目录号11668019)在室温下一起孵育20分钟并施加到具有3T3细胞的6孔盘的各孔中。包括2μl水替代寡核苷酸溶液的类似混合物用作模拟转染对照。在37℃和5％CO2下孵育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。添加反义寡核苷酸48小时后，移除培养基并使用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)或来自Qiagen的RNeasy总RNA分离试剂盒(目录号74181)按照制造商的说明从细胞提取RNA。将600ng RNA添加至使用来自ThermoScientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)或高容量cDNA逆转录试剂盒(目录号4368813)如制造商的方案中所述执行的逆转录反应中。使用来自此逆转录反应的cDNA通过使用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI设计的引物/探针(AppliedBiosystems Taqman基因表达测定：Hs00202021_m1，Applied Biosystems Inc.，FosterCity CA)进行的实时PCR监测基因表达。使用以下PCR循环：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)，使用StepOne Plus实时PCR机(Applied Biosystems)。
基于处理组与模拟转染样品之间经过18S正规化的dCt值的差异计算用反义寡核苷酸处理后基因表达的变化倍数。
结果：
实时PCR结果表明，3T3细胞中SIRT1mRNA的水平在用三种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加(图13)。
实时PCR结果表明，3T3细胞中SIRT1mRNA的水平在用五种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加(图14)。
实时PCR结果表明，3T3细胞中SIRT1mRNA的水平在用两种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加(图15)。
实时PCR结果表明，3T3细胞中SIRT1mRNA的水平在用两种针对SIRT1小鼠反义分子AK044604设计的寡核苷酸处理48小时后显著增加(图16)。
用反义寡核苷酸处理Vero76细胞：
使来自ATCC的Vero76细胞(目录号CRL-1587)在生长培养基(MEM/EBSS(Hyclone目录号SH30024或Mediatech目录号MT-10-010-CV)+10％FBS(Mediatech目录号MT35-011-CV)+青霉素/链霉素(Mediatech目录号MT30-002-CI))中在37℃和5％CO2下生长。实验前一天，将细胞以1.5×105/ml的密度重涂铺于6孔盘中且在37℃和5％CO2下孵育。实验当天，将6孔盘中的培养基更换为新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸于水中稀释为20μM的浓度。将2μl此溶液与400μl Opti-MEM介质(Gibco目录号31985-070)和4μl转染胺2000(Invitrogen目录号11668019)在室温下一起孵育20分钟并施加到具有Vero76细胞的6孔盘的各孔中。包括2μl水替代寡核苷酸溶液的类似混合物用作模拟转染对照。在37℃和5％CO2下孵育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。添加反义寡核苷酸48小时后，移除培养基并使用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)或来自Qiagen的RNeasy总RNA分离试剂盒(目录号74181)按照制造商的说明从细胞提取RNA。将600ng RNA添加至使用来自ThermoScientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)如制造商的方案中所述执行的逆转录反应中。使用来自此逆转录反应的cDNA通过使用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI设计的引物/探针(Applied Biosystems Taqman基因表达测定：Hs00202021ml，Applied Biosystems Inc.，Foster City CA)进行的实时PCR监测基因表达。使用以下PCR循环：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)，使用StepOne Plus实时PCR机(Applied Biosystems)。基于处理组与模拟转染样品之间经过18S正规化的dCt值的差异计算用反义寡核苷酸处理后基因表达的变化倍数。
结果：实时PCR结果表明，Vero细胞中SIRT1mRNA的水平在用SIRT1反义分子CV396200的反义寡核苷酸处理48小时后显著增加(图5)。
用反义寡核苷酸处理DBS细胞
使来自DBS的Vero76细胞(目录号CCL-161)在生长培养基(MEM/EBSS(Hyclone目录号SH30024或Mediatech目录号MT-10-010-CV)+10％FBS(Mediatech目录号MT35-011-CV)+青霉素/链霉素(Mediatech目录号MT30-002-CI))中在37℃和5％CO2下生长。实验前一天，将细胞以1.5×105/ml的密度重涂铺于6孔盘中且在37℃和5％CO2下孵育。实验当天，将6孔盘中的培养基更换为新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸稀释为20μM的浓度。将2μl此溶液与400μl Opti-MEM介质(Gibco目录号31985-070)和4μl转染胺2000(Invitrogen目录号11668019)在室温下一起孵育20分钟并施加到具有3T3细胞的6孔盘的各孔中。包括2μl水替代寡核苷酸溶液的类似混合物用作模拟转染对照。在37℃和5％CO2下孵育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。添加反义寡核苷酸48小时后，移除培养基并使用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)或来自Qiagen的RNeasy总RNA分离试剂盒(目录号74181)按照制造商的说明从细胞提取RNA。将600ng RNA添加至使用来自ThermoScientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)或高容量cDNA逆转录试剂盒(目录号4368813)如制造商的方案中所述执行的逆转录反应中。使用来自此逆转录反应的cDNA通过使用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI设计的引物/探针(AppliedBiosystems Taqman基因表达测定：Hs00213036_m1，Applied Biosystems Inc.，FosterCity CA)进行的实时PCR监测基因表达。使用以下PCR循环：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)，使用StepOne Plus实时PCR机(Applied Biosystems)。
基于处理组与模拟转染样品之间经过18S正规化的dCt值的差异计算用反义寡核苷酸处理后基因表达的变化倍数。
结果：实时PCR结果表明，DBS细胞中SIRT6mRNA的水平在用两种针对SIRT6反义分子bf772662设计的寡聚物和一种针对NM_133475设计的寡聚物处理48小时后显著增加(图20)。
实施例3：SIRT基因表达的调节
材料和方法
用裸反义寡核苷酸处理HepG2细胞：
使来自ATCC的HepG2细胞(目录号HB-8065)在生长培养基(MEM/EBSS(Hyclone目录号SH30024或Mediatech目录号MT-10-010-CV)+10％FBS(Mediatech目录号MT35-011-CV)+青霉素/链霉素(Mediatech目录号MT30-002-CI))中在37℃和5％CO2下生长。实验前一天，将细胞以0.5×105/ml的密度重涂铺于6孔盘中且在37℃和5％CO2下孵育。实验当天，将6孔盘中的培养基置换为每孔1.5ml的新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸于水中稀释为20μM的浓度。将2μl此溶液与400μl Opti-MEM介质(Gibco目录号31985-070)和4μl转染胺2000(Invitrogen目录号11668019)在室温下一起孵育20分钟并施加到具有HepG2细胞的6孔盘的各孔中。包括2μl水替代寡核苷酸溶液的类似混合物用作模拟转染对照。在37℃和5％CO2下孵育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。添加反义寡核苷酸72小时后，细胞如上文所述重新给药。第二次给予反义寡核苷酸48小时后，移除培养基并使用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)或来自Qiagen的RNeasy总RNA分离试剂盒(目录号74181)按照制造商的说明从细胞提取RNA。将600ng RNA添加至使用来自Thermo Scientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)如制造商的方案中所述执行的逆转录反应中。使用来自此逆转录反应的cDNA通过使用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI设计的引物/探针(Applied Biosystems Taqman基因表达测定：Hs00202021_m1、Hs00202030_m1和Hs00213036_m1，Applied Biosystems Inc.，Foster City CA)进行的实时PCR监测基因表达。使用以下PCR循环：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)，使用StepOne Plus实时PCR机(Applied Biosystems)。基于处理组与模拟转染样品之间经过18S正规化的dCt值的差异计算用反义寡核苷酸处理后基因表达的变化倍数。
用于外显子4的定制设计Taqman测定的引物和探针：AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA(SEQ ID NO：95)SIRT1天然反义分子CV396200。
正向引物序列CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA(SEQ ID NO：96)
反向引物序列ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA(SEQ ID NO：97)
报导序列CAGAGTTTCAATTCCC(SEQ ID NO：98)
结果：
结果表明，HepG2细胞中SIRT1mRNA的水平在用一种针对sirtas设计的siRNA(sirtas_5，P＝0.01)处理48小时后显著增加。在相同样品中，sirtas RNA的水平在用sirtas_5处理后显著降低，但在用sirtas_6和sirtas_7处理后未改变，sirtas_6和sirtas_7对SIRT1mRNA水平也没有影响(图2)。sirtas_5、sirtas_6和sirtas_7分别对应于SEQ IDNO：38、39和40。
处理原代猴肝细胞
原代猴肝细胞由RxGen Inc.引入培养物中并涂铺于6孔盘中。将其如下用寡核苷酸处理。将6孔盘中的培养基更换为由补充有5％FBS、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素、4μg/ml胰岛素、1μM地塞米松(dexamethasone)、10μg/ml菌纤维素(Fungin)(InVivogen，SanDiego CA)的威廉姆氏培养基E(William’s Medium E)(Sigma目录号W4128)组成的新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸稀释为20μM的浓度。将2μl此溶液与400μl Opti-MEM介质(Gibco目录号31985-070)和4μl转染胺2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen目录号11668019)在室温下一起孵育20分钟并施加到具有细胞的6孔盘的各孔中。包括2μl水替代寡核苷酸溶液的类似混合物用作模拟转染对照。在37℃和5％CO2下孵育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。添加反义寡核苷酸48小时后，移除培养基并使用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)或来自Qiagen的RNeasy总RNA分离试剂盒(目录号74181)按照制造商的说明从细胞提取RNA。将600ng RNA添加至使用来自ThermoScientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)如制造商的方案中所述执行的逆转录反应中。使用来自此逆转录反应的cDNA通过使用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI设计的引物/探针(Applied Biosystems Taqman基因表达测定：Hs00202021_m1、Hs00202030_m1和Hs00213036_m1，Applied Biosystems Inc.，FosterCity CA)进行的实时PCR监测基因表达。使用以下PCR循环：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)，使用Mx4000热循环仪(Stratagene)。基于处理组与模拟转染样品之间经过18S正规化的dCt值的差异计算用反义寡核苷酸处理后基因表达的变化倍数。
结果：结果于图7中示出。实时PCR结果表明，SIRT1mRNA水平在用针对SIRT1反义分子的寡核苷酸处理后增加。
实施例4：CUR 963于非洲绿猴中的作用功效和持续时间研究
本研究的目标是评估和比较在非人灵长类动物模型中静脉内施用后调控SIRT1基因的不协同非编码反义序列的反义敲除作用。设计用于抑制SIRT1调控序列的反义寡核苷酸测试物品命名为CUR 963。
CUR 963：+G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A(SEQ ID NO：34)。
CUR 962(对照)：+G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G(SEQ ID NO：99)。
测试规范指导原则
本研究是根据公认的毒物学原理进行设计并且遵守国际协调会议(International Conference of Harmonization；ICH)协调三方指导原则(Non-ClinicalSafety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for PharmaceuticalsICH M3(m)，2000年11月9日)和用于测试治疗剂的普遍公认程序。
测试和对照物品
测试物品身份和制备
测试物品CUR-963是化学稳定的反义寡核苷酸。用于静脉内递送的媒剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
媒剂表征
PBS媒剂的组成、批号、有效期和储存条件(温度和光/暗)是从供应商获得。
测试物品储存和处理
测试物质和媒剂相应地根据赞助商和制造商供应的公认储存条件储存。
测试物品制剂的分析
测试物品制剂的样品将进行冷冻保存以供分析测试物质制剂的浓度、稳定性和均质性。
测试系统基本原理
灵长类动物是管理当局可接受用作潜在危害指示物并且可获得广泛背景数据的适合非啮齿动物物种。非洲绿猴特别是多种人生理和疾病病况的高度临床相关的模型。
静脉内施用途径对应于可能的人治疗途径。测试物品的剂量是基于先前在非洲绿猴中进行的类似化合物的剂量发现研究的结果。
选择非洲绿猴作为所选灵长类动物，因为测试物质的靶序列在灵长类动物中的所有物种间以100％的同源性保守。另外，测试物质是合成寡核苷酸。因此，灵长类动物中的给药允许较好地评估这些化合物的功效，与任何其它物种相比，其将更能够反映可能在人中见到的摄取。
动物
物种：绿猴(Chlorocebus sabaeus)，非人灵长类动物
品种：圣基茨(St.Kitts)本土非洲绿猴。
来源：西印度群岛(West Indies)，圣基茨，Lower Bourryeau，RxGen
预期年龄：测试动物已成年。
预期体重：猴重约3-4kg。实际范围可变化，但将在数据中记录。
性别：测试动物为成年雌性。
动物数量：筛选十只动物以确保鉴别8只适于参与研究的动物。
研究数量：雌性：8
研究数量的正当性：此研究设计成使用可能最少数量的动物，与评估测试物品在非洲绿猴中的治疗功效的主要目标以及在此物种全身性施用此类型寡核苷酸的先前研究一致。
动物规格：研究中使用十只体重在3至4kg范围内的成年非洲绿猴。猴是从栖息于岛上的野生群体以人道方式捕捉的未经过药物处理的成年动物。所捕捉的猴用抗蠕虫药处理以去除任何可能的肠道寄生虫负载并且在筛选以供参加研究前在检疫隔离期中观察最少4周。所捕捉猴的年龄通过体形和牙齿进行估算，其中从研究中排除年老动物。参加研究前，对各猴进行临床检查，包括评估行动性和敏捷度。获取血样并送至Antech Diagnostics(Memphis，TN)进行综合临床化学分析以及完全血液计数和脂质型态分析(关于说明请参见第9.2节和319567928)。通过与圣基茨群落中猴的已确立正常范围相比较，将具有异常实验室值的猴从研究中排除。为鉴别8只满足此准则的猴，筛选10只猴，其中需要时再筛选其它猴。研究开始前，将所选猴转移至个别笼中以适应个别圈养一周的时间。仅认为适于实验的动物参加研究。研究开始时的实际(或估算)年龄和体重范围将在原始数据和最终报导中详细说明。
动物健康和福利：遵照动物福利的最高标准并遵守圣基茨农业部(St.KittsDepartment of Agriculture)和美国健康与公共服务部(U.S.Department of Health andHuman Services)规定的准则。所有研究都将根据这些要求以及护理和圈养实验室动物的所有适用实施章程进行。NIH动物护理和使用指南(NIH Guide for the Care and Use ofAnimals)中含有所有兽医护理、操作和回顾的所有适用标准。圣基茨管理当局主张动物研究委员会根据指南需要时审查方案和检查设施。基金会根据指南需要具有实验室动物福利办公室(Office of Laboratory Animal Welfare)签发的核准担保#A4384-01(Axion研究基金会(Axion Research Foundation)/圣基茨生物医学基金会(St.Kitts BiomedicalFoundation))。本研究中指定的研究不产生特殊非人灵长类动物兽医护理问题和生物危害问题。
圈养和环境：为允许检测任何治疗相关的临床体征，在手术和手术后直至处死前将动物个别圈养。安放个别笼的灵长类动物建筑物完全用环境光照明，所述环境光是近似美国D.H.H.S准则中所推荐的北纬17度12小时：12小时光暗循环。RxGen灵长类动物建筑物完全与外界通风。利用吊扇确保额外空气运动以维持圣基茨全年通常23-35℃的恒定目标温度。每天测量24小时温度极值和相对湿度(其也不加控制)。在研究期间，笼子定期清洁。
饮食和水：各动物每天提供约90克标准猴饲料(TekLad，Madison，WI)。记录饮食的特定营养组成。定期分析水的微生物纯度。储备饮食和水源中污染物的可接受水平的标准是在由饮食制造商定期设施水评估分别确立的分析规格范围内。水满足认定为可接受用于人引用所必需的所有标准。
实验设计
动物鉴别和随机化：基于体重和血浆胆固醇型态借助于分层随机化程序进行分配。在分组分配之前和之后，各动物通过在腹部进行纹身加以标识。对所有集群动物进行纹身作为在常规健康检查过程中进行鉴别的方式。可拟定一份笼计划以鉴别其中圈养的个体，且个别猴进一步通过粘帖在其相应笼子上的标记标签进行标识。
组大小、剂量和鉴别号：动物分配至2个治疗组，各组中包含4只猴。根据设施编号系统对各猴提供特定动物鉴别号。此系统将各猴唯一标识为字母后接三个数字，例如Y032。
施用途径和频率：动物在第1、3、5天通过历经约10分钟借助于手动输注静脉内递送每天给药一次。输注速率为24mL/kg/h。动物在给药程序之前和期间用克他命(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)镇静。将静脉导管(Terumo小型静脉输注套组，20号针，或类似适当输注套组)插入隐静脉中。各猴中的给药在8:00a.m.与10:00a.m.之间在动物醒来之后和进食之前不久进行。在临每次输注之前收集血样用于如以下血液化学章节中所述评估血浆胆固醇和其它脂质水平。在每次取样期中，血液收集在进食之前进行以使膳食对胆固醇测量值的影响最小。
临床观察：在每天给药时记录对治疗的反应所有可见体征。另外，每周至少一次检查动物的身体属性，如外貌和一般状况。
体重：在治疗期和治疗后期其中以一周的时间间隔记录体重。
食物消耗：未定量个别食物消耗。然而，监测了进食方式并且记录了任何明显变化。
死亡率和发病率：记录死亡率和发病率。任何关于提前处死的决定都在同研究负责人和可能时同赞助商的科学家监理商量后作出。发现死亡或提前杀死的动物进行尸检，其中收集肝、肾、心脏和脾肺组织用于进行组织病理学分析。在提前处死的情况下，还将获取血样(可能时)并测定参数。正常工作时间后发现死亡的动物将冷藏过夜并在下一工作日开始时进行尸检。如果动物的情况需要提前处死，那么将通过静脉内给予过量剂量的戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)对其实施安乐死。所有研究服从动物使用原则(Principles for Use of Animals)。法律要求RxGen遵从美国健康与公共事业部关于灵长类动物设施的标准，其规定本研究中说明为轻度的程序必须遵守的严重性的水平。
临床实验室研究
脂肪活检：在研究第26天通过在脐下作出1cm中线切口提取组织对除Y775以外的所有研究猴进行皮下脂肪活检。活检体立即浸入含有2ml RNAlater(Qiagen)的经过标记的冷冻管中并在4℃下孵育过夜，随后抽吸出RNAlater并将样品管在液氮中速冻。在液氮中转运后，分离总RNA用于进行靶基因的实时qPCR。
结果：实时PCR结果表明，与给予CUR-962(SEQ ID NO.：99)(一种在体外对SIRT1表达没有影响的寡核苷酸(针对ApoA1反义分子DA327409设计，数据未展示))的猴相比，来自给予CUR-963(一种针对SIRT1反义分子CV396200.1设计的寡核苷酸)的猴的脂肪活检中的SIRT1mRNA水平增加。mRNA水平通过实时PCR进行测定(图6)。
实施例5：利用反义DNA寡核苷酸对Sirtuin(SIRT)进行体内调节
用反义DNA寡核苷酸(ASO)进行处理：向喂食高脂肪饮食12周以诱发肥胖症和糖尿病的C57Bl/6J小鼠施用对SIRT1AS具有特异性的反义寡核苷酸(ASO)。(Purushotham A.等，(2009)Cell Metabolism 9，第327-338页)。在实施高脂肪饮食时开始用ASO处理小鼠。小鼠每周一次腹膜内注射在生理盐水中制备的浓度为5mg/kg的ASO。
测量体重和食物摄入：每周两次在腹膜内注射ASO前测量小鼠的体重和食物摄入。
血糖测量：每周通过从尾静脉获取血液样品测量进食和空腹血糖浓度。
葡萄糖耐受性测试(GTT)：每只小鼠总共进行两次GTT，分别在高脂肪饮食的整个饮食的半程(第4周)和接近结束时(第10周)。GTT使我们了解小鼠的葡萄糖耐受性，所述葡萄糖耐受性是从血流快速清除葡萄糖大剂量的能力。其为糖尿病的指标。使小鼠禁食过夜16小时。向小鼠腹膜内注射2g/kg葡萄糖。对于重30g的小鼠，此将转变成0.2ml 30％(w/v)葡萄糖溶液的最终体积。在葡萄糖注射前和注射后5、15、30、60、90和120分钟时获取葡萄糖测量值。在腹膜内注射葡萄糖前通过在异氟醚(isoflurane)麻醉下距尾部末端1mm切下尾尖来测量葡萄糖。将血滴吸入条带中并用血糖仪测量葡萄糖浓度。每只小鼠总共进行两次GTT，分别在高脂肪饮食的整个饮食的半程(第4周)和接近结束时(第10周)。GTT使我们了解小鼠的葡萄糖耐受性，所述葡萄糖耐受性是从血流快速清除葡萄糖大剂量的能力。其为糖尿病的指标。
胰岛素耐受性测试(ITT)：小鼠从上午9点至下午3点禁食6小时。接着向小鼠腹膜内注射每公斤0.5-1U胰岛素。对胰岛素浓度进行调整使得最终注射体积为0.1-0.15ml。在注射前和注射后5、15、30、45和60分钟时获取血糖测量值。完全如在GTT下所述收集血液。除监测葡萄糖水平外，在ITT期间还对小鼠的行为进行持续观察。血糖过低可表现为行为改变，其中动物变得极其安静并且显示不适。为防止血糖过低，在血糖浓度降至低于50mg/ml或观察到不适征象时立即以0.1-0.15ml的最终体积腹膜内注射葡萄糖(1g/kg)。
通过面静脉穿刺收集血液：在颈背和尾根约束住小鼠，通过拉紧颈部皮肤上的发夹轻微按压颈部血管。取样点在下颌角稍前方的下巴上。用18G针或柳叶刀以90度刺穿取样点处的皮肤直至针/柳叶刀的尖端恰恰穿过皮肤。使用微量血细胞比容管收集血样。收集血液后，松开颈部上的发夹并在插入点用叠片纱布施加压力以确保止血。利用此方法收集0.05-0.2ml血液。此程序将在高脂肪饮食第5周内仅进行一次并且在心脏内穿刺未成功的情况下(参见下文)最终在第12周内进行一次。使用市售ELISA试剂盒测量调控葡萄糖和脂质代谢的血液激素(如胰岛素、脂联素和瘦素)。(例如R&D Systems，Minneapolis，MN，AssayPro St.Charles，MO，Mabtech，Mariemont，OH)
心脏内穿刺：在12周高脂肪饮食结束时，通过连续吸入异氟醚使小鼠麻醉。通过将小鼠置入供应异氟醚和氧气的诱导箱中诱导麻醉。小鼠在其颈部进行约束。心脏用27G针穿刺。放血后，斩下头部以确保死亡。收集组织(肝、胰腺、白色和棕色脂肪组织以及骨骼肌)以供进一步研究(RNA和蛋白质测量以及组织学)。获得约0.5-1ml血液并用于测定葡萄糖和脂质代谢的若干关键参数(葡萄糖、胰岛素、胆固醇、三酸甘油酯、游离脂肪酸、瘦素、脂肪细胞激素、皮质类固醇、甲状腺素)。如果在此方法中存在困难，那么我们将改为通过在异氟醚麻醉下进行面静脉穿刺来收集血液(参见上文)。
尽管已关于一个或多个实施例对本发明进行了说明和描述，但本领域的其它技术人员在阅读和理解了本说明书和附图后可进行等效的改变和修改。另外，虽然已关于若干实施例中的仅一个公开了本发明的一个特定特征，但所述特征可与其它实施例的一个或多个其它特征进行组合，对于任何指定或特定应用来说同样是需要和有利的。
本发明的摘要将允许读者快速弄清技术公开内容的性质。同时应了解，其并不用于解释或限制以上权利要求书的范围或含义。

Claims (9)

1.一种特异靶向Sirtuin(SIRT)天然反义转录物的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸增加Sirtuin(SIRT)的表达，其中所述Sirtuin(SIRT)选自Sirtuin3(SIRT3)或Sirtuin6(SIRT6)，其中所述寡核苷酸包括SEQ ID NO:80,82-84,89,和91-92中的至少一个序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中：
a.所述寡核苷酸是siRNA化合物；
b.所述寡核苷酸是单链。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述Sirtuin(SIRT)的表达增加至少10％。
4.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸还包括一种或多种修饰，所述修饰包括：
a.至少一个经过修饰的核苷酸间键联，其选自：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯和其组合；
b.至少一个经过修饰的核苷酸，其选自：肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)、和其组合；或
c.至少一个经过修饰的糖部分，其选自：经过2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、经过2'-甲氧基修饰的糖部分、经过2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分和其组合。
5.一种体外增加细胞或组织中Sirtuin(SIRT)表达的方法，所述方法包括：使所述细胞或组织与特异靶向Sirtuin(SIRT)天然反义转录物的寡核苷酸接触，从而增加Sirtuin(SIRT)的表达，其中所述Sirtuin(SIRT)选自Sirtuin3(SIRT3)或Sirtuin6(SIRT6)，其中所述寡核苷酸包括SEQ ID NO:80、82-84、89和91-92中的至少一个序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中：
a.所述寡核苷酸是siRNA化合物；
b.所述寡核苷酸是单链。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述Sirtuin(SIRT)的表达增加至少10％。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述寡核苷酸还包括一种或多种修饰，所述修饰包括：
d.至少一个经过修饰的核苷酸间键联，其选自：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯和其组合；
e.至少一个经过修饰的核苷酸，其选自：肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)、和其组合；或
f.至少一个经过修饰的糖部分，其选自：经过2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、经过2'-甲氧基修饰的糖部分、经过2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分和其组合。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1至4任一项所述的至少一种寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
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