MX2007005558A

MX2007005558A - Oligonucleotidos de lna potentes para la inhibicion dela expresion de hif-1a.

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Publication number: MX2007005558A
Application number: MX2007005558A
Authority: MX
Inventors: Majken Westergaard; Frank Winther Rasmussen; Henrik Frydenlund Hansen; Charlotte Albaek Thrue
Original assignee: Santaris Pharma As
Priority date: 2004-11-09
Filing date: 2005-11-09
Publication date: 2008-01-31
Also published as: NZ555644A; EP1833840A2; WO2006050734A2; CA2587173C; JP2011229540A; US7939507B2; US20090286859A1; IL183054A0; EA014097B1; US8410071B2; US7589190B2; DK1833840T3; US20110183931A1; ATE476441T1; DE602005022768D1; CA2587173A1; NO20072933L; AU2005304112A1; BRPI0515726A; AU2005304112B2

Abstract

La presente exposicion se relaciona con un oligonucleotido de LNA que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de 5??-(Tx GxGxcsasasasgscsastscscsTxGx T-3?? y 5??-(Gx ) TxTxascstsgscscststscsTxTx A-3??, en donde las mayusculas designan un analogo del nucleotido beta-D-oxina-LNA, las minusculas designan un 2-desoxinucleotido, lo subrayado designa ya sea un analogo del nucleotido beta-D-oxina-LNA, o un 2-desoxinucleotido, el subindice "s" designa un enlace de fosforotioato entre los analogos de nucleotidos contiguos/nucleotido de LNA, y el subindice `x?? designa ya sea un enlace de fosforotioato o un enlace de fosforodiester entre los analogos de nucleotidos contiguos/nucleotido de LNA, y en donde la secuencia se extiende opcionalmente por hasta cinco unidades de 2-deoxinucleotido. Los oligonucleotidos de LNA son utiles para modular la expresion del fator-1a inducible por hipoxia (HIF-1a), por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades por cancer, para inhibir la angiogenesis, para inducir la apoptosis, para evitar la proliferacion celular, o para tratar una enfermedad angiogenica, por ejemplo, retinopatia diabetica, degeneracion macular (ARMD), psoriasis, artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias.

Description

0LIG0NUCLE0TID0S DE LNA POTENTES PARA LA INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE HIF-1A CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de HIF-la. En particular, esta invención se relaciona con oligonucleótidos de LNA, que se pueden hibridar específicamente con ácidos nucleicos que codifican para el HIF-la. Se ha mostrado que los oligonucleótidos de LNA modulan la expresión de HIF-la y se exponen las preparaciones farmacéuticas de los mismos y su utilización para el tratamiento de enfermedades cancerígenas, enfermedades inflamatorias y enfermedades oculares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tumores sólidos deben establecer un suministro de sangre y haber mejorado el metabolismo de la glucosa para desarrollarse más allá de unos cuantos milímetros. La forma en que detectan la hipoxia, y responden al activar los genes inducibles por hipoxia y al secretar factores angiogénicos para establecer un sistema sanguíneo es fundamental para la biología del cáncer. Muchos tumores contienen microentornos hipóxicos, que se han asociado con progresión maligna, metástasis y resistencia a la radioterapia y quimioterapia. El descubrimiento del factor-1 inducible por hipoxia (HIF-1) proporcionó alguna idea sobre la regulación de los genes inducibles por hipoxia (US 5,882,914 y WO 96/39426; WO 99/48916). HIF-1 se compone de dos subunidades HIF-lc. (HIF-lalfa; denominado en la presente como "HIF-la") y HIF-lß y une a -1 elementos de respuesta a hipoxia (HREs) en reforzadores de genes que codifican para factores angiogénicos tales como por ejemplo, VEGF y proteínas glucólisis-relacionadas tales como por ejemplo, enzimas glucolíticas y el transportador 1 y 3 de glucosa (GLU-1 y 3) . Se ha demostrado que la sub-regulación por ingeniería de HIF-la mediante transferencia de genes intratumorales de un plásmido HIF-la antisentido conduce a la sub-regulación de VEGA y la densidad disminuida de microvasos tumorales (WO 00/76497, Sun X et al, Gene Therapy (2001) 8, 638-645) . El plásmido contuvo un fragmento de ADNc de 320 pares de bases que codifica para el extremo 5' de HIF-la (nucleótidos 152-454; Genebank AF003698).

La WO 2003/085110 muestra oligonucleótidos antisentido de LNA que sub-regula la expresión de HIF-la humana. Un compuesto se denomina CUR813 (SEQ ID NO. 11) . La presente invención expone oligonucleótidos de LNA, que son más potentes que CUR813 (SEQ ID NO. 11) . También los oligonucleótidos de LNA específicos, de acuerdo con la invención, inducen apoptosis e inhiben la proliferación. También, los oligonucleótidos de LNA que tienen una identidad de secuencia del 100% con el HIF-la de ratón sub-regula la expresión de HIF-la en el hígado, colon y riñon en ratones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de HIF-la. En particular, esta invención se relaciona con oligonucleótidos de LNA sobre 2 motivos específicos que se dirigen a HIF-la. Estos motivos se exponen como las SEQ ID NO. 3 y 4. Los oligonucleótidos de LNA específicamente preferidos son la SEQ ID NO . 1 y la SEQ ID NO. 2. Los oligonucleótidos de LNA de la invención son inhibidores potentes de los niveles de expresión y proteínicos del ARNm de HIF-la. Más particularmente, la presente invención proporciona un oligonucleótido de LNA que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de 5' - (Tx) GxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3 ' (SEQ ID NO . 3) y 5' - (Gx) TxTxasCstsgsCsCststsCsTxTxA-3' (SEQ ID NO . 4) en donde las mayúsculas designan un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, las minúsculas designan un 2-desoxinucleótido, lo subrayado designa ya sea un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, o un 2-desoxinucleótido, el subdíndice "s" designa un enlace de fósforotioato entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y el subíndice "x" designa ya sea un enlace de fósforotioato o un enlace de fosforodiéster entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y en donde las unidades nucleotídicas entre paréntesis, (Tx) , (T) o (Gx) , (A) , respectivamente, representan unidades opcionales, y en donde la secuencia se extiende opcionalmente hasta cinco unidades de 2 -deoxinucleótido . También se proporcionan las composiciones farmacéuticas que comprenden el oligonucleótido de LNA de la invención. Además se proporcionan los métodos para modular la expresión de HIF-la en células o tejidos que comprenden poner en contacto las células o tejidos con uno o más de los oligonucleótidos de LNA o las composiciones de la invención. También se exponen los métodos para tratar a un animal o un ser humano, en sospecha de tener o que esté propenso a una enfermedad o condición, asociada con la expresión de HIF-la al administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los oligonucleótidos de LNA o las composiciones de la invención. Además, se proporcionan los métodos para utilizar los oligonucleótidos de LNA para la inhibición de la expresión de HIF-la y para el tratamiento de las enfermedades asociadas con la actividad de HIF-la.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura ÍA muestra una estabilidad aumentada de la SEQ ID. NO. 1 y la SEQ ID NO . 5 en plasma de rata (macho NtacSD, Li-Heparina (Taconic, M&B) ) en comparación con la SEQ ID NO. 6. Los oligonucleótidos se incubaron a concentraciones de 20µM a 37°C durante 0, 4, o 24 horas. No se pueden detectar fragmentos de degradación de la SEQ ID NO. 1 incluso después de 24 horas de digestión. La Figura IB muestra la estabilidad de la SEQ NO. 1 y la SEQ ID NO. 13 de longitud total, un fósforotioato e ISO-secuencial para la SEQ ID NO. 1, en suero de rata y humano. Se agregaron oligonucleótidos a suero humano o de rata a una concentración final de 20µM. La figura muestra la estabilidad de los oligonucleótidos de LNA hasta 1-96 horas en suero humano y de rata respectivamente a 37°C. Para suero de rata, el segundo panel de la Figura IB demuestra una actividad enzimática sostenida incluso después de 48 horas y 96 horas. El último panel funciona como un control negativo que no demuestra ninguna degradación de la SEQ ID NO. 1 ni la SEQ ID NO. 13 cuando se incuban a 37°C sin plasma agregado . La Figura 1C muestra una estabilidad extremadamente grande de la SEQ ID NO. 1 en plasma humano y de rata. El oligonucleótido se incubó en plasma humano o de rata durante 1-96 horas y se hizo pasar en un gel desnaturalizante. Después de la tinción SyBr dorado, se midió la cantidad de producto de longitud total al utilizar un formador de imágenes con fósforo y se gráfico contra el tiempo. La Figura 2A muestra la sub-regulación de la proteína HIF-la en los oligonucleótidos de LNA transfectados en células U373. La célula U373 se transfectó con el compuesto 2 o 10 nM o una imitación transfectada, incubada en hipoxia y analizada para la sub-regulación de la proteína HIF-Ia mediante transferencia Western. La expresión de Tubulina se analizó como el control de carga igual. La Figura 2B muestra la sub-regulación de la proteína HIF-lalfa después del tratamiento con la SEQ ID NO. 1 en líneas celulares de cáncer del glioblastoma U373. La expresión de Pan-actina se analizó como el control de carga igual. Las células se transfectaron con la SEQ ID NO. 1 o la SEQ ID NO. 10 0.2, 1 y 10 nM., que tiene 2 pares de bases con la SEQ ID NO . 1. El panel inferior es una cuantificación del gel. La Figura 2C muestra la sub-regulación de la expresión de HIF-a 24 horas después del tratamiento con el HIF-la que se dirige al oligonucleótido de L?A, la SEQ ID ?O . 1, y una SEQ ID ?O . 8 del oligonucleótido control mezcladas que contiene LNA en células U373. La expression del HIF se correlaciona ya sea con GAPDH o Beta-actina y se relaciona con un control (imitación) sin transfectar. Después de la purificación del ARN, la expresión del ARNm se cuantifica mediante QPCR. La Figura 3A y 3B muestra la inducción de apoptosis medida como un perfil cinético de la actividad de Caspasa 3/7 inducida después de 24-72 horas de tratamiento con los oligonucleótidos de LNA en la línea celular de glioblastoma U373 en normoxia o hipoxia. Se muestra que la SEQ ID NO. 1 será un inductor potente de la apoptosis temprana. Figura 4A: Inducción de la etapa celular apoptótica temprana medida mediante análisis citométrico de flujo con Annexina V-FITC y Pl después de 48 horas. Las células U373 tratadas con la SEQ ID NO. 1 del oligonucleótido de LNA se clasificaron como más "apoptóticas tempranas" en comparación con la imitación y las células tratadas con la SEQ ID 12. Figura 4B: Cuantificación de la inducción de la apoptosis temprana en células U373 después del tratamiento con la SEQ ID NO. 1. Un porcentaje de células se forzó en apoptosis temprana 48 horas después del tratamiento de la SEQ ID NO. 1 en diferentes dosificaciones. Las células U373 se transfectaron con la SEQ ID NO. 1 o dos diferentes SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 12 de oligonucleótidos control mezclados. . Después de la recolección y la incubación con Annexina V ab y Pl, mediante citometría de flujo se midió el número de células en apoptosis temprana. La Figura 5A y 5B muestra compuestos transfectados en células de la línea celular U373 de glioblastoma 24-72 horas después de la transfección e incubación ya sea en hipoxia o normoxia. Se muestra que la SEQ ID NO . 1 será un inhibidor potente de la proliferación según se mide mediante análisis MTS. La Figura 6A y la Figura 6B muestran la sub-regulación endógena blanco en hígado in vivo de dos regímenes de administración utilizando la SEQ ID NO. 1. La medición de los niveles ARNm de HIF-l así como también, el VEGF blanco en la dirección 3' muestra que la SEQ ID NO. 1 también es un inhibidor eficaz del blanco. Figura 6A: inyecciones ip diarias en ratones peludos durante 14 días. Figura 6B : inyecciones ip dos veces a la semana en ratones peludos durante 14 días. La Figura 6C muestra el HIF-IOÍ de riñon endógeno in vivo después de la sub-regulación administrada mediante inyecciones ip diarias en ratones peludos para regímenes de 14 días de la SEQ ID NO. 1. La Figura 7A muestra que la SEQ ID NO. 1 es un inhibidor potente medido por la sub-regulación de la expresión in vivo del HIF-la en hígado después de la administración de la SEQ ID NO. 1. Diferentes versiones tratadas con tiol de la SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6) y la SEQ ID NO . 1 se dosificaron respectivamente a los ratones peludos a 18 o 3.6 mg/kg diariamente durante 14 días y se sacrificaron. La expresión del HIF-la se midió al nivel del ARNm mediante QPCR y se normalizó a beta-actina según se describe en M&M. La Figura 7B muestra que la SEQ ID NO . 1 también es un inhibidor potente medido mediante la sub-regulación de la expresión in vivo del HIF-la en hígado después de administración de la SEQ ID NO. 1. Diferentes versiones tratadas con tiol de la SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6) y la SEQ ID NO. 1 se dosificaron respectivamente a los ratones peludos a 50, 10 o 2 mg/kg dos veces a la semana durante 14 días y se sacrificaron. La expresión del HIF-la se midió al nivel del ARNm mediante QPCR y se normalizó a beta-actina.

La Figura 7C muestra la sub-regulación de la expresión in vi vo del HIF-la en riñon después de administración de la SEQ ID NO. 1. Diferentes versiones tratadas con tiol de la SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6) se dosificaron a los ratones peludos en 18 ó 3.6 mg/kg diariamente durante 14 días y se sacrificaron. La expresión del HIF-la se midió al nivel del ARNm mediante QPCR y se normalizó a beta-actina . La Figura 8A muestra una eficacia superior in vivo al utilizar la SEQ ID NO. 1 en comparación con la SEQ ID NO. 11 y la SEQ ID NO. 12 (un control mezclado) medida por el peso del tumor de tumores U373 provenientes de xenoinjerto. La SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 11 y la SEQ ID NO. 12 se dosificaron a 50 mg/kg dos veces en una semana durante una semana en ratones con xenoinjerto U373 implantado en los ovarios. 2 días después de la última dosificación los animales se sacrificaron. Después del sacrificio, los tumores se pesaron y el peso individual del tumor más el peso medio del tumor (rojo) se calculó y se gráfico. Se encontró una diferencia estadística significativa (P=0.005) entre el grupo control (una SEQ ID NO. 1 control mezclada) y los ratones tratados con una SEQ ID NO. 1.

La Figura 8B muestra la densidad capilar en los tumores U373 provenientes del xenoinjerto tratado con la SEQ ID NO. 1. La SEQ ID NO. 1 se dosificó a 50 mg/kg dos veces en una semana durante una semana en ratones con el xenoinjerto U373 implantado en los ovarios. 2 días después la última dosificación, los animales se sacrificaron. La densidad capilar se calculó después de la tinción con CD31 y se relacionó con el área total. Se encontró una diferencia estadística significativa (P=0.005) entre el grupo salino y los ratones tratados con un control mezclado (SEQ ID NO. 12) . La Figura 8C muestra la tinción de CD 31 en secciones provenientes de tumores U373 implantados en los ovarios y tratados con la SEQ ID NO. 1 según se describe para la Figura 8B. La Figura 8D muestra la expresión del HIF-la cuantificada mediante PCR en tiempo real y se normalizó a GAPDH en tumores U373 implantados en los ovarios y tratados con la SEQ ID NO . 1, la SEQ ID NO. 11, la SEQ ID NO. 12 y PBS según se describe para la Figura 8B . La Figura 9A muestra la captación in vi vo (en µg por gramo de tejido) más la sub-regulación blanco (% de inhibición de la expresión de ARNm del HIF-la correlacionada con la expresión de ß-actina) de ratones peludos después una dosis i.v. de la SEQ ID NO. 1 de 25mg/kg. La SEQ ID NO . 1 tuvo una media vida de aproximadamente 46 horas en riñon y de 66 horas en el hígado. El panel superior de la Figura 9B muestra la SEQ ID NO. 1 dosificada a 50 mg/kg una vez i.p. en ratones peludos. Cinco animales tratados con la SEQ ID NO. 1 a 50 mg/kg se sacrificaron después de 1, 3, 4, 5 y 8 días después del tratamiento y la expresión del HIF-la se analizó y se normalizó a beta-actina. La expresión del HIF-la se midió al nivel del ARNm mediante QPCR y se normalizó a beta-actina según se describe en el ejemplo 8. En el panel inferior la SEQ ID NO. 1 se dosificó a 25 ó 50 mg/kg una vez i.v. en ratones peludos. Cinco animales tratados con la SEQ ID NO. 1 a 25 ó 50 mg/kg se sacrificaron después de 1, 2, 3, 4, 5 y 8 días después del tratamiento y se analizaron para la SEQ ID NO. 1 de longitud total mediante los métodos para HPLC según se describe en el ejemplo 13. Los datos se presentan como µg de la SEQ ID NO. 1/gramo de tej ido . La Figura 9C muestra la expresión del HIF-l cuantificada mediante PCR en tiempo real y se normalizó a GAPDH en hígado de ratón en ratones que recibieron una dosis de 50 mg/kg i.p. de la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 16 y se sacrificaron en el día 1 y 10. La Figura 10A muestra la duración de la acción de la SEQ ID NO . 1 para inhibir la expresión del HIF-la en ratones con xenoinjerto dosificados con 25 mg/kg durante 7 días y se sacrificaron 1 ó 5 días después de la última dosificación. La Figura 10B muestra un hígado in vivo, un tumor cutáneo y la captación por parte del riñon de la versión marcada con fam de la SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 7) a 25 mg/kg/día durante siete días y se sacrificaron 5 días después del último tratamiento. La Figura 10C muestra la sub-regulación blanco (% de inhibición de la expresión de ARNm del HIF-la correlacionada con la expresión de GAPDH) más la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) de la SEQ ID NO. 7 en el hígado de ratones con xenoinjerto tratados con 5 mg/kg/día de la SEQ ID NO. 7, la SEQ ID NO. 20 del control mezclado o solución salina i.p. el los días 7, 10, 13 y 17 después del trasplante según se describe en el ejemplo 17. La Figura 10D muestra la sub-regulación blanco (% de inhibición de la expresión de ARNm del HIF-la correlacionada con la expresión de ß-actina) después del tratamiento con la SEQ ID NO. 7 o la SEQ ID NO. 20 control mezclado más la captación in vi vo (en µg por gramo de tejido) de la SEQ ID NO . 7 en colon de ratón tratado como se describe en el ejemplo 17. La Figura 10E muestra la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) de la SEQ ID NO. 7 en tumores con xenoinjerto HT29 y PC3 tratados como se describe en el ejemplo 17. La Figura 11 muestra la sub-regulación endógena blanco en hígado in vivo del HIF-la y el ARNm de VEGF después de 5 dosis de 30 mg/kg cada 3er. día de la SEQ ID NO . 1 en comparación con la única SEQ ID NO. 9 control con malapareamiento . La Figura 12A, la Figura 12B, la Figura 12C y la Figura 12D muestran la expresión de VEGFA y de MMP-2 después del tratamiento con el oligonucleótido de LNA que se dirige al HIF-la, la SEQ ID NO . 1, y una SEQ ID NO. 8 de control mezclado en las células U373. Se observa una sub-regulación dependiente de la dosis en la expresión de VEGFA y MMP-2 (secreción) 48 horas después del tratamiento con la SEQ ID NO. 1 o un control mezclado (SEQ ID NO. 8) en células U373. La de expresión VEGFA (Figuras 12A, 12B y 12C) y MMP-2 (Figuras 12D y 12E) se relaciona con el número de células y se normaliza para la imitación. En las Figuras 12A, 12C y 12D se mide la expresión de VEGFA y MMP-2 48 horas después del tratamiento, mientras que en las Figuras 12B y 12E se cuantifica la secreción de VEGFA y de MMP-2 24-120 horas después de la tranfección. La Figura 13 muestra la sub-regulación de la proteína del HIF-la medida mediante transferencia Western y la interrupción de la formación tubular de las células HUVEC tratadas con la SEQ ID NO . 1 en 1 y 5 nM en comparación con la SEQ ID NO. 8 y el control sin tratar. La Figura 14A muestra radioluminogramas corporales enteros que muestran la distribución de radiactividad a 5 minutos a) , 4 horas b) , 24 horas c) y 18 días d) después de una administración intravenosa única de la SEQ ID NO. 1 marcada con 3H en ratones pigmentados hembra. La Figura 14B muestra la distribución de radiactividad a 5 minutos y 7 días y se observa una retención muy fuerte del compuesto de la SEQ ID NO. 1 marcada con 3H en médula ósea, riñon, hígado, pulmón, piel, bazo, orina, mucosa gástrica, ganglio linfático, úvea ocular y útero después de 7 días.

La Figura 15 muestra la captación de una versión marcada con FAM de la SEQ ID NO . 1 (SEQ ID NO. 7) en diferentes tipos celulares dentro de la médula ósea, bazo y sangre periférica 1 hora después de la administración de la SEQ ID NO. 7 en comparación con las células sin tratar medida mediante análisis FACS. La Figura 16A muestra la expresión del HIF-la medida mediante PCR en tiempo real y normalizada a 18S ARN en el hígado y riñon de monos cynomolgus tratados con 40, 10 y 6mg/kg de la SEQ ID NO. 1 dos veces a la semana durante 4 semanas. La Figura 16B muestra la captación de la SEQ ID NO. 1 en el hígado y riñon de monos cynomolgus un día después de la última dosificación o 4 semanas después la última dosificación (animales en recuperación) tratados como se describió anteriormente junto con los datos sobre animales en recuperación (R) , que se dejaron sin tratar durante 4 semanas después de finalizar el tratamiento.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención emplea oligonucleótídos de LNA particulares, a saber oligonucleótidos de LNA que comprenden la SEQ ID NO . 3 y la SEQ ID NO . 4, para utilizarse en la modulación de la función de las moléculas de ácido nucleico que codifican para el HIF-la. Por último la modulación es un cambio en la cantidad del HIF-la producido. En una modalidad, esto se alcanza al proporcionar oligonucleótidos de LNA antisentido, que se hibridan específicamente con ácidos nucleicos que codifican para el HIF-la. La modulación de preferencia es una inhibición de la expresión del HIF-la, que conduce a una disminución en el número de proteínas producidas del HIF-la funcional .

Los oligonucleótidos de LNA De manera más particular, la presente invención proporciona un oligonucleótido de LNA que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste 5' - (Tx)GxG?CsasasgscsastscscsTxGx(T) -3' (SEQ ID NO . 3) Y 5' - (Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTx(A) -3' (SEQ ID NO. 4) en donde las mayúsculas designan un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, las minúsculas designan un 2 -desoxinucleótido, lo subrayado designa ya sea un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, o un 2-desoxinucleótido, el subdíndice "s" designa un enlace de fósforotioato entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y el subíndice "x" designa ya sea un enlace de fósforotioato o un enlace de fosforodiéster entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y en donde las unidades nucleotídicas entre paréntesis, (T_x) , (T) o (Gx) , (A), respectivamente, representan unidades opcionales, y en donde la secuencia se extiende opcionalmente hasta cinco unidades de 2 -deoxinucleótido . Los términos "oligonucleótido de LNA definido en la presente", "oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención", y lo semejante, se refieren al "oligonucleótido de LNA" definido anteriormente así como también, las modalidades, variantes, sales, profármacos, etc. proporcionados en lo siguiente. Los oligonucleótidos de LNA definidos anteriormente con base en la SEQ ID NO. 3 y la SEQ ID NO. 4 tienen una longitud de 13-20 unidades nucleotídicas. La longitud de secuencia mínima de 13 se obtiene si las unidades nucleotídicas entre paréntesis, (T_x) , (T) o (Gx) , (A), respectivamente, están ausentes, y la longitud de secuencia máxima de 20 se obtiene si las unidades nucleotídicas entre paréntesis, (T_x) , (T) o (Gx) , (A), respectivamente, están presentes y si la SEQ ID NO. 3 o la SEQ ID NO. 4 se extiende por cinco unidades de 2-desoxinucleótido . En una modalidad, las unidades nucleotídicas entre paréntesis, (Tx) , (T) o (Gx) , (A) , respectivamente, están ausentes, y en otra modalidad actualmente más preferida, la unidad nucleotídica entre paréntesis, (Tx) , (T) o (Gx) , (A), respectivamente, están presentes. También son modalidades interesantes aquellas en donde la unidad opcional 5' -terminal, (Tx) o (Gx) , respectivamente, está presente y donde la unidad opcional 3' -terminal, (T) o (A) , respectivamente, está ausente, y las modalidades donde la unidad opcional 5' -terminal, (Tx) o (Gx) , respectivamente, está ausente y donde la unidad opcional 3' -terminal, (T) o (A), respectivamente, está presente. La selección de un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA o un 2 -desoxinucleótido para las unidades nucleotídicas subrayadas en la SEQ ID NO. 3 anterior y la SEQ ID NO. 4 aparece ser menos crítica.

Sin embargo, en una modalidad, ambas unidades nucleotídicas subrayadas designan un 2-desoxinucleótido . En otra modalidad actualmente más preferida, una o ambas de las unidades nucleotídicas subrayadas designan un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA. En una variante, la unidad del nucleótido 5'-terminal entre paréntesis, (T_x) o (Gx) , respectivamente, está ausente, y la 3' -terminal distinta de la unidad nucleotídica subrayada, (T_) o (A) , respectivamente, designa un 2-desoxinucleótido, o de mayor preferencia, un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA. En otra variante, la unidad del nucleótido 5' -terminal entre paréntesis, (Tx) o (Gx) , respectivamente, designa un 2 -desoxinucleótido, o, de mayor preferencia, un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, y la 3 '-terminal distinta de la unidad nucleotídica subrayada, (T) o (A), respectivamente, está ausente. En otra variante, las unidades nucleotídicas entre paréntesis están presentes, y una o ambas de las unidades nucleotídicas subrayadas designan un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, es decir (i) el nucleótido subrayado 5' -terminal designa un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA y las unidades del nucleótido 3' -terminal subrayadas designan un 2-desoxinucleótido, o (ii) el nucleótido 3' -terminal subrayado designa un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA y las unidades del nucleótido 5' -terminal subrayadas designan un 2-desoxinucleótido, o (iii) la 3 '-terminal así como también, los nucleótidos 5'-terminal subrayados designan un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA. En una variante adicional, las unidades nucleotídicas entre paréntesis, (T_x) o (Gx) , respectivamente, están presentes, y ambas unidades nucleotídicas subrayadas designan un 2-desoxinucleótido . Aunque las secuencias denominadas como la SEQ ID NO. 3 y la SEQ ID NO. 4 (y más particularmente las secuencias denominadas como la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 2 (véase más adelante)) se cree que representan substancialmente la funcionalidad total de los oligonucleótidos de LNA definidos, la extensión de la SEQ ID NO. 3 y la SEQ ID NO . 4 con hasta cinco unidades del 2 -desoxinucleótido, por ejemplo, 1 unidad, 2 unidades, 3 unidades, 4 unidades, o incluso 5 unidades, se cree que son posibles sin efectos perjudiciales sobre las propiedades benéficas de las secuencias base, la SEQ ID NO. 3 y la SEQ ID NO . 4. En otras palabras, la secuencia se puede extender en el extremo 3'-terminal, el extremo 5' -terminal 3 o en el extremo 3 '-terminal así como también, en el extremo 5'-terminal, con la condición de que el número total de las unidades del 2 -desoxinucleótido no exceda 5. Por lo tanto, en una modalidad (que se puede combinar con las anteriores) el oligonucleótido de LNA consiste de 15, 16, 17, 18, 19 o 20 unidades nucleotídicas seleccionadas de los 2-desoxinucleótidos y los análogos del nucleótido beta-D-oxi-LNA, en particular el oligonucleótido de LNA consiste de 16 unidades nucleotídicas seleccionadas de los 2 -desoxinucleótidos y los análogos del nucleótido beta-D-oxi-LNA. En otras modalidades (que se pueden combinar con las anteriores) el oligonucleótido de LNA consiste de 13, 14, 15, o 16 unidades nucleotídicas seleccionadas de los 2-desoxinucleótidos y los análogos del nucleótido beta-D-oxi-LNA, en particular el oligonucleótido de LNA consiste de 14 ó 15 unidades nucleotídicas seleccionadas de los 2 -desoxinucleótidos y los análogos del nucleótido beta-D-oxi-LNA.

Al menos por conveniencia para la preparación de los oligonucleótidos de LNA, es a menudo se prefiere que la secuencia se amplié por una unidad de 2-desoxinucleótido en el extremo 3', véase, por ejemplo, la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 2 más adelante. De mayor preferencia, la SEQ ID NO. 3 se extiende por una unidad de 2 -desoxinucleótido de adenosina en el extremo 3', y la SEQ ID NO. 4 se extiende por un 2-desoxinucleótido de citosina en el extremo 3 ' . Como se mencionó anteriormente, el subíndice "s" designa un enlace de fósforotioato ( -O-P (O, S) -0- ) entre los análogos de nucleótidos vecinos/nucleótidos de LNA, y el subíndice "x" designa ya sea un enlace de fósforotioato ( -0-P (O, S ) -O- ) o un enlace de fosforodiéster ( -O-P (O) 2-0- ) entre los análogos de nucleótidos vecinos/nucleótidos de LNA. Esto da por resultado que cualquiera de los 2 -desoxinucleótidos mediante los cuales la secuencia se extiende, se pueden enlazar mediante cualquiera de ya sea un enlace de fósforotioato ( -O-P (0, S) -0- ) o un enlace de fosforodiéster ( -O-P (0) 2-0- ) . Se observa que la subsecuencia csa?asgscsastscscsT de la SEQ ID NO. 3 y la subsecuencia ascstsgscsc?tstscsT de la SEQ ID NO. 4 se indican como tratadas totalmente con fósforotiolato, véase, el subíndice "s" . Aunque no se prefiere actualmente, se cree que uno, y posiblemente también dos, de los enlaces de fósforotioato se puedan reemplazar por otros enlaces, en particular enlaces de fosforodiéster , sin comprometer seriamente la estabilidad del oligonucleótido de LNA. De esta forma, estas variantes donde uno o dos de los enlaces de fósforotioato se substituyen, por ejemplo, por enlaces de fosforodiéster también quedan dentro del alcance pretendido de la presente invención. En una modalidad actualmente preferida, sin embargo, todas las unidades nucleotídicas en la secuencia se enlazan mediante un grupo fósforotioato . Un subgrupo de oligonucleótidos de LNA particularmente interesantes son aquellos seleccionados el grupo que consiste de: 5' -TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3' (SEQ ID NO. 1), 3 — swsVJsCs?-s^.S^S^'S^-st.S^'S^'S-^S^JS-*- "" -^ (SEQ ID NO. 15) 5' -GsGscsasasgscsastsc?csTsGst-3 ' (SEQ ID NO. 16) Entre aquellas, 5' -TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3 ' (SEQ ID NO. 1) , actualmente es la más preferida. Otro subgrupo de oligonucleótidos de LNA particularmente interesantes son aquellos seleccionados el grupo que consiste de: 5' -GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3' (SEQ ID NO. 2) , 5' -GsTsTsascstsgscscststscsTsTsA-3 ' (SEQ ID NO. 17) , y 5' -TsTsascstsgscscst?tscsTsTsa-3' (SEQ ID NO. 18) .

Entre aquellas 5' -GsTsTsasc?tsgscscststscsTsTsAsc-3 ' (SEQ ID NO. 2) actualmente es la más preferida. En el contexto presente, el término "nucleósido" se utiliza en su significado normal, es decir, contiene una unidad de 2-desoxirribosa o ribosa que se une a través de su número único de átomos de carbono para una de las bases nitrogenadas de adenina (A) , citosina (c) , timina (T) , uracilo (U) o guanina (G) .

De una manera similar, el término "nucleótido" significa un unidad de 2 -desoxirribosa o ribosa que se une a través de su número único de átomos de carbono con una de las bases nitrogenadas de adenina (A) , citosina (C) , timina (T) , uracilo (U) o guanina (G) , y que se une a través de su número de cinco átomos de carbono a un grupo fosfato de internucleósidos , o un grupo terminal. El término "ácido nucleico" se define como una molécula formada mediante el enlace covalente de dos o más nucleótidos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan indistintamente en la presente. El término "análogo de ácido nucleico" se refiere a un compuesto de unión con ácido nucleico no natural. El término "monómero de LNA" se refiere típicamente a un análogo de nucleósido bicíclico, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/14226 y las solicitudes posteriores, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 y WO 03/006475 incorporadas todas en la presente como referencia . El beta-D-oxi-LNA es el análogo del nucleótido de LNA para utilizarse en los oligonucleótidos de LNA de la presente invención, y la estructura del monómero (nucleósido) se muestra en el esquema 1.

En el esquema 1, Z* y Z indican la posición de un enlace internucleotídico con un nucleósido vecino o un grupo terminal (es decir, ya sea un grupo 5' -terminal o un grupo 3' -terminal) . Un ejemplo particular del monómero beta-D- oxi-LNA es el monómero de timidina LNA (análogo del nucleósido de LNA) (ÍS, 3R, 4R, 7S )- 7 -hidroxi- 1- hidroximetil-5-metil-3- (timin-lil) -2, 5 -dioxa- biciclo [2 : 2 : 1] heptano, es decir, T-beta-D-oxi-LNA. El término "oligonucleótido" se refiere, en el contexto de la presente invención, a un oligómero (también denominado oligo) o polímero de ácido nucleico (por ejemplo, ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) ) o el análogo de ácido nucleico de aquellos conocidos en la técnica, de preferencia Ácido Nuleico Bloqueado (LNA) , o una mezcla de los mismos. Este término incluye los oligonucleótidos integrados por nucleobases que se presentan en la naturaleza, azúcares y enlaces de internucleósido (columna vertebral) así como también, los oligonucleótidos que tienen porciones que no se presentan en la naturaleza, que funcionan de manera similar o con funciones mejoradas específicas. Los oligonucleótidos total o parcialmente modificados o substituidos a menudo se prefieren sobre las formas naturales debido a diversas propiedades convenientes de estos . oligonucleótidos tales como por ejemplo, la capacidad para penetrar una membrana celular, una buena resistencia a nucleasas extra- e intracelulares, una alta afinidad y especificidad para el blanco del ácido nucleico. Los oligonucleótidos de LNA de la invención exhiben las propiedades mencionadas anteriormente. Por los términos "unidad" y "unidad nucleotídica" se debe entender un monómero, es decir, un 2-desoxinucleótido o un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA. El término "al menos uno" comprende los números enteros mayores a o iguales a 1, tales como por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y así sucesivamente. El término "uno" según se utiliza significa un nucleósido, un análogo de nucleósido, una SEQ ID NO., etc. se debe entender que significa uno o más. En particular, la expresión "un componente (tal como por ejemplo, un nucleósido, un análogo de nucleósido, una SEQ ID NO. o lo semejante) seleccionado del grupo que consiste de..." se debe entender que uno o más de los componentes citados se puede seleccionar. De esta forma, las expresiones similares a "un componente seleccionado del grupo que consiste de A, B y C" se debe entender que incluyen todas las combinaciones de A, B y C, es decir, A, B, C, A+B, A+C, B+C y A+B+C. A lo largo de esta especificación, la palabra "comprenden", o variaciones tales como por ejemplo, "comprende" o "que comprende" , se debe entender que implican la inclusión de un elemento, número entero o paso establecidos, o un grupo de elementos, números enteros o pasos, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

Preparación de los oligonucleótidos de LNA Los bloques para la constitución de los análogos del nucleótido de LNA ( ß -D-oxi-LNA) se pueden preparar siguiendo los procedimientos publicados y las referencias citadas en la presente, véanse, por ejemplo, WO 03/095467; Al; D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808; y WO 2004/069991 A2. Los oligonucleótidos de LNA se pueden preparar como se describe en los ejemplos y en WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 y WO 03/006475. De esta forma, los oligonucleótidos de LNA se pueden producir utilizando las técnicas de oligomerización de la química de ácidos nucleicos bien conocida para alguien con experiencia ordinaria en la técnica de la química orgánica. En general, se utilizan ciclos de oligomerización estándar del procedimiento con fosforamidita (S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Te trahedron , 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Te trahedron , 1992, 48, 2223), aunque por ejemplo, también se puede utilizar la química de H-fosfonato o la química de fosfotriéster .

Para algunos monómeros, puede se necesario o benéfico un mayor tiempo de acoplamiento, y/o acoplamientos repetidos y/o la utilización de más reactivos de acoplamiento concentrados . Las fosforamiditas empleaas se acoplan típicamente con rendimientos por pasos del >95% satisfactorios. La oxidación del fósforo (III) a fósforo (V) se realiza normalmente por ejemplo con yodo/piridina/H20. Esto produce después de la desprotección el enlace natural del internucleósido de fosforodiéster . En caso de que un enlace de internucleósido de fósforotioato esté preparado, un se realiza paso de tiolación al intercambiar la oxidación normal, por ejemplo, yodo/piridina/H20, utilizada para la síntesis de los enlaces del internucleósido de fosforodiéster con una oxidación utilizando el reactivo ADTT (hidruro de xantano (0.01 M en acetonitrilo :piridina 9:1; v/v)) . También es posible utilizar otros reactivos de tiolación, por ejemplo Beaucage y PADS. Los oligonucleótidos de LNA con fósforotioato se sintetizaron eficientemente con el acoplamiento por pasos para producir >= 98%. La purificación de los oligonucleótidos de LNA se puede lograr utilizando cartuchos de purificación en fase inversa desechables y/o HPLC en fase inversa y/o precipitación a partir de etanol o butanol. Para verificar la pureza de los oligonucleótidos de LNA sintetizados se utilizaron electroforesis en gel capilar, HPLC inversa, MALDI-MS, y ESI-MS.

Sales El oligonucleótido de LNA se puede emplear en una variedad de sales farmacéuticamente aceptables . En el sentido en que se utiliza en la presente, el término se refiere a sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido de LNA y exhiben efectos toxicológicos no deseados mínimos. Ejemplos no limitantes de estas sales se pueden formar con aminoácido orgánico y sales de adición base formadas con cationes metálicos tales como por ejemplo, zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio, y lo semejante, o con un catión formado a partir de amoníaco, N, N- dibenci letilen- diamina , D-glucosamina, tetraetilamonio, o etilendiamina; o combinaciones, por ejemplo, una sal de tanato y zinc o lo semejante. Estas sales se forman, a partir del oligonucleótido de L?A que posee un grupo fosforodiéster y/o grupos fósforotioato , y son, por ejemplo, sales con bases adecuadas. Estas sales incluyen, por ejemplo, sales metálicas no tóxicas que se derivan de los metales de los grupos la, Ib, lia y Ilb de la Tabla Periódica de los Elementos, en particular sales de metal alcalino adecuadas, por ejemplo sales de litio, sodio o potasio, o las sales de metal alcalinotérreo, por ejemplo sales de magnesio o calcio. Además incluyen sales de zinc y amonio y también las sales que se forman con aminas orgánicas adecuadas, tales como por ejemplo, mono, di, o tri-alquilaminas sin sustituir o hidroxilo substituidas, en particular mono, di- o trialquilaminas, o con compuestos de amonio cuaternario, por ejemplo con, N-metil-N-etilamina, dietilamina, trietilamina, mono, bis- o tris- (2-hidroxi-alquilo inferior), tales como por ejemplo, mono, bis- o tris-(2-hidroxietil) amina, 2 -hidroxi- ter-butilamina o tris (hidroximetil) metilamina, N, N- di -alquilo inferior-?- (hidroxi-alquilo inferior) aminas , tales como por ejemplo, N, N- dimeti l -?- (2-hidroxietil) -amina o tri- (2 -hidroxietil) amina, o ?-metil-D-glucamina, o compuestos de amonio cuaternario, tales como por ejemplo, sales del tetrabutilamonio. Se prefieren las sales de litio, las sales de sodio, las sales de magnesio, las sales de zinc o las sales de potasio, con las sales de sodio que se prefieren en particular .

Profármacos En una modalidad, el oligonucleótido de LNA puede estar bajo la forma de un pro-fármaco. Los oligonucleótidos son por virtud iones cargados negativamente. Debido a la naturaleza lipofílica de las membranas celulares, la captación celular de los oligonucleótidos se reduce en comparación con los equivalentes neutrales o lipofílicos. Este "obstáculo" de polaridad se puede evitar utilizando el procedimiento para pro-fármacos (véase, por ejemplo, Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Appli cation . Springer-Verlag, Berlin, Alemania, vol. 131, pp . 103-140) . En este procedimiento, los oligonucleótidos de LNA se preparan de una manera protegida de modo que los oligonucleótidos de LNA sean neutrales cuando se administran. Estos grupos de protección se diseñan de tal forma que se puedan retirar luego de que el oligonucleótido de LNA se absorba por las células. Los ejemplos de estos grupos de protección son S-acetiltioetilo (SACIE) o S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE) . Estos grupos de protección son nucleasa resistente y se retiran selectivamente de manera intracelular .

Conjugados Un aspecto adicional de la invención se relaciona con un conjugado que comprende un oligonucleótido de LNA según se define en la presente al menos una entidad no nucleotídica o no polinucleotídica unida covalentemente al oligonucleótido de LNA. En un aspecto relacionado de la invención, el oligonucleótido de LNA de la invención se enlaza a ligandos para formar un conjugado, los ligandos se destinan a aumentar la captación celular del conjugado con relación a los oligonucleótidos antisentido . En el presente contexto, el término "conjugado" se pretende que indique una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un oligonucleótido de LNA como se describe en la presente (es decir, un oligonucleótido de LNA que comprende una secuencia de nucleósidos y análogos de nucleósidos de LNA) para una o más entidades no nucleotídicas o no polinucleotídicas.

De esta forma, los oligonucleótidos de LNA por ejemplo se pueden conjugar o formar quimeras con entidades no nucleotídicas o no polinucleotídicas incluyendo Ácidos Nucleicos Peptídicos (PNA) , proteínas (por ejemplo, anticuerpos para una proteína blanco), macromoléculas, sustancias de fármaco con bajo peso molecular, cadenas de ácido graso, residuos de azúcar, glucoproteínas, polímeros (por ejemplo, polietilenglicol), grupos formadores de micelas, anticuerpos, carbohidratos, grupos para unión de receptores, esteroides tales como por ejemplo, colesterol, polipéptidos, agentes intercalantes tales como por ejemplo, un derivado de acridina, un alcohol de cadena larga, un dendrímero, un fosfolípido y otros grupos lipofílicos o combinaciones de los mismos, etc., exactamente cuando los oligonucleótidos de LNA se puedan disponer en estructuras diméricas o dendríticas. Los oligonucleótidos de LNA o conjugados de la invención también se pueden conjugar o conjugar adicionalmente a sustancias de fármaco activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco de sulfa, un antidiabético, un agente antibacteriano, un agente quimioterapéutico o un antibiótico .

El conjugado de esta manera puede conferir propiedades ventajosas con respecto a las propiedades farmacocinéticas de los oligonucleótidos de LNA. En particular, el conjugado de esta manera alcanza captación celular aumentada. En una modalidad, un oligonucleótido de LNA se enlaza a ligandos para formar un conjugado, los ligandos se destinan a aumentar la captación celular del conjugado con relación a los oligonucleótidos de LNA antisentido. Esta conjugación puede tener lugar en las posiciones terminales 5'/3'-OH aunque los ligandos también pueden tener lugar en los azúcares y/o bases. En particular, el factor de crecimiento con el cual el oligonucleótido de LNA antisentido se puede conjugar, puede comprender transferrina o folato. Los complejos de Transferrina-polilisina-oligonucleótido o los complejos de folato-polilisina-oligonucleótido se pueden preparar para captación por las células que expresan altos niveles de transferrina o el receptor de folato. Otros ejemplos de conjugados/ligandos son las entidades de colesterol, intercaladores dobles tales como por ejemplo, acridina, poli-L-lisina, "remate extremo" con uno o más grupos de enlace resistentes a nucleasa tales como por ejemplo, fosforomonotioato, y lo semej ante . La preparación de los complejos de transferrina como portadores de la captación de oligonucleótidos en células se describe por Wagner et al., Proc . Na t . Acad . Sci . USA 87, 3410-3414 (1990). El suministro celular de los conjugados macromoleculares de folato vía la endocitosis del receptor de folato, incluyendo el suministro de un oligonucleótido antisentido, se describe por Low et al., patente de los Estados Unidos 5,108,921. También véase, Leamon et al., Proc . Na t . Acad . Sci . 88, 5572 (1991) .

Composición farmacéutica Un aspecto particularmente interesante de la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de LNA según se define en la presente o un conjugado según se define en la presente, y un diluyente, portador o coadyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica de preferencia es adecuada para inyección, para administración tópica, o para administración intraocular (véase más adelante) .

Las indicaciones para la preparación de las composiciones farmacéuticas se pueden encontrar en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" por Alfonso R. Gennaro, y en lo siguiente. Los diluyentes, portadores o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables son parte de la composición farmacéutica. Las cápsulas, tabletas y pildoras etc. pueden contener por ejemplo los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; diversos agentes emulsionantes o aromáticos. Para cápsulas, la unidad de dosificación puede contener un portador líquido similar a aceites grasos. Asimismo, los recubrimientos de azúcar o agentes entéricos pueden ser parte de la unidad de dosificación. La composición farmacéutica también puede ser emulsiones de los ingredientes farmacéuticos activos (incluyendo el oligonucleótido de LNA) y un lípido para formar una emulsión micelar. Un oligonucleótido de LNA se puede mezclar con cualquier material que no deteriore la acción deseada, o con material que suplemente la acción deseada. Éstos podrían incluir otros fármacos incluyendo otros compuestos de oligonucleósido .

Para administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril (por ejemplo, agua), tampones, reguladores de tonicidad y resistencia iónica y antibacterianos. El oligonucleótido de LNA activo se puede preparar con portadores que faciliten la captación, protección contra la degradación o protección contra la eliminación inmediata del cuerpo, incluyendo implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para administración intravenosa, los portadores preferidos son solución salina fisiológica (0.9%) o solución salina amortiguada (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato) . En una modalidad preferida, las inyecciones o infusiones de los oligonucleótidos de LNA se proporcionan en el sitio neovascularización o cerca del mismo. Por ejemplo, los oligonucleótidos de L?A de la invención se pueden suministrar a células epiteliales con pigmento retiniano en el ojo. De preferencia, los oligonucleótidos de L?A se administran tópicamente al ojo, por ejemplo, en forma de líquido o gel al párpado inferior del ojo o al cul-de-sac conjuntival, como queda dentro de la experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, Acheampong AA et al, 2002, Drug Metabol . and Disposition 30: 421-429, la exposición total del mismo se incorpora en la presente como referencia) . Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en diversas formas dependiendo de si se desea o no tratamiento local o sistémico y sobre el área que será tratada. La administración puede ser (a) oral, (b) pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica incluyendo epidérmica, transdérmica, oftálmica y a las membranas mucosas incluyendo suministro vaginal y rectal; o (d) parenteral incluyendo inyección intravenosa, intrarterial , subcutánea, intraperitoneal o intramuscular o infusión; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular. En una modalidad, el oligonucleótido de LNA activo se administra intravenosa, intraperitonal , oral, tópicamente o como inyección en bolo o se administra directamente en el órgano blanco. Actualmente se cree que la forma de administración más adecuada se realiza mediante infusiones intravenosas u orales.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, aerosoles, supositorios, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o convenientes portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y lo semejante. También pueden ser útiles condones revestidos, guantes y lo semejante. Las formulaciones tópicas preferidas incluyen aquellas en las cuales los oligonucleótidos de la invención estén en combinación con un agente para suministro tópico tal como por ejemplo, lípidos, liposomas, ácidos grasos, esteres de ácido graso, esteroides, agentes quelantes y surfactantes. Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen de manera enunciativa: polvos o granulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensiones o soluciones en medios acuosos o no acuosos, cápsulas, cápsulas en gel, sobres, tabletas o los minitabletas . Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como por ejemplo de manera enunciativa: intensificadores de penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen de manera enunciativa: soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyan de manera enunciativa: líquidos preformados, sólidos auto-emulsionantes y semisólidos auto-emulsionantes. El suministro del fármaco a tejido tumoral se puede realzar mediante el suministro dependiente del portador incluyendo de manera enunciativa: liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietiienimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27). Una vía de administración parenteral particularmente preferida es la administración intraocular. Se debe entender que la administración intraocular de los presentes olígonucleótidos de LNA se puede llevar a cabo mediante inyección o administración directa (por ejemplo tópica) al ojo, siempre y cuando la vía de administración permita que los oligonucleótidos de LNA entren al ojo. Además de las vías de administración tópicas al ojo descritas anteriormente, las vías de administración intraoculares adecuadas incluyen la administración intravitreal , intrarretinal , subretinal, subtenon, peri- y retro-orbital, trans-corneal y trans-escleral . Para administración intraocular, la composición farmacéutica se puede administrar tópicamente, por ejemplo, mediante parche o mediante la aplicación directa al ojo, o mediante iontoforesis . Los ungüentos, aerosoles, o líquidos para goteo se pueden suministrar mediante sistemas para suministro ocular conocidos en la técnica tales como por ejemplo, aplicadores o goteros para ojos. Las composiciones se pueden administrar directamente a la superficie del ojo o al interior del párpado. Estas composiciones pueden incluir mucomiméticos tales como por ejemplo, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, hidroxipropil metilcelulosa o poli (alcohol vinílico) , conservadores tales como por ejemplo, ácido sórbico, EDTA o cloruro de bencilcromio, y las cantidades usuales de diluyentes y/o portadores. El oligonucleótido de LNA de la invención se puede proporcionar en composiciones para liberación sostenida, tales como aquellas descritas en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,672,659 y 5,595,760. La utilización las composiciones para liberación inmediata o sostenida depende de la naturaleza de la condición que será tratada. Si la condición consiste de un trastorno agudo o más que agudo, el tratamiento con una forma de liberación inmediata se preferirá sobre una composición de liberación prolongada. Alternativamente, para ciertos tratamientos preventivos o a largo plazo, puede ser adecuada una composición de liberación sostenida. Un oligonucleótido de LNA se puede inyectar en el interior del ojo, tal como por ejemplo con una aguja u otro dispositivo para suministro. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas comprenden un oligonucleótido de LNA de la invención (por ejemplo, 0.1 a 90% por peso), o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, mezclada con un medio portador fisiológicamente aceptable. Los medios portadores fisiológicamente aceptables preferidos son agua, agua amortiguada, solución salina normal, solución salina al 0.4%, glicina al 0.3%, ácido hialurónico y lo semejante.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden comprender excipientes y/o aditivos farmacéuticos convencionales. Los excipientes farmacéuticos adecuadas incluyen estabilizantes, antioxidantes, agentes para ajustar la osmolalidad, tampones, y agentes para ajustar el pH. Los aditivos adecuadas incluyen tampones fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato trometamina) , adiciones de quelantes (tales como por ejemplo, DTPA o de DTPA-bisamida) o complejos de quelato de calcio (como por ejemplo DTPA de calcio, CaNaDTPA-bisamida) , u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio o lactato de calcio) . Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden envasar para utilizarse en forma líquida, o se pueden liofilizar. Para composiciones sólidas, se pueden utilizar portadores sólidos no tóxicos convencionales; por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y lo semejante. De preferencia, se incluye un oligonucleótido de LNA en una formulación unitaria tal como en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable en cantidad suficiente para suministrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz sin provocar efectos secundarios serios en el paciente tratado. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar adecuadamente en forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Estas técnicas incluyen el paso de poner en asociación los ingredientes activos con los portadores o excipientes farmacéuticos. En general las formulaciones se preparan al poner uniforme e íntimamente en asociación los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, conformar el producto. Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como por ejemplo de manera enunciativa: tabletas, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles suaves y supositorios. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mezclados. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión incluyendo por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. En modalidades preferidas de las composiciones farmacéuticas, el oligonucleótido de LNA se formula en un portador acuoso, en particular un portador acuoso que comprende una solución tampón para mantener el pH en la variación de 4.0-8.5, y tiene una resistencia iónica de 20-2000 mM . El término "portador acuoso" significa que la composición farmacéutica en cuestión está en forma líquida, y que el portador líquido está compuesto predominante de agua, es decir, al menos en un 80% (p/p) / o al menos un 90% (p/p) , o incluso al menos un 95% (p/p), del portador consiste de agua. También se pueden utilizar otros ingredientes líquidos, por ejemplo, etanol, DMSO, etilenglicol, etc. El portador acuoso de preferencia comprende solución salina o una solución tampón para mantener el pH en la variación de 4.0-8.5. De preferencia, la solución tampón mantendrá el pH en la variación de 5.0-8.0, tal como por ejemplo en la variación de 6.0-7.5, tal como por ejemplo, solución salina amortiguada con, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . También es importante la resistencia iónica/tonicidad de la composición farmacéutica. De esta forma, típicamente, la composición farmacéutica líquida tuvo una resistencia iónica en la variación de 20-2000 mM, tal como por ejemplo, en la variación de 50-1500 M, o en la variación de 100-1000 mM .

Combinación de fármacos Se debe entender que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende opcionalmente compuestos antisentido adicionales, agentes quimioterapéuticos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales, compuestos citostáticos, compuestos anti-angiogenéticos , compuestos antiproliferativos, compuestos pro-apoptóticos, moduladores para transducción de señal, inhibidores de cinasa y/o compuestos inmunomoduladores . Se cree actualmente que es particularmente interesante combinar el oligonucleótido de LNA con al menos uno de los agentes quimioterapéuticos . Como se establece, la composición farmacéutica de la invención puede comprender además al menos un agente quimioterapéutico. El compuesto quimioterapéutico se selecciona típicamente del grupo que consiste de adrenocorticoesteroides , tales como por ejemplo, prednisona, dexametasona o decadrón altretamina (hexalen, hexametilmelamina (HMM) ) amifostina (etiol) ; aminoglutetimida (citadren) amsacrina (M-AMSA) ; anastrozol (arimidex) andrógenos, tales como por ejemplo, testosterona asparaginasa (elspar) ; Avastin; bacilo calmette-gurin; bicalutamida (casodex); bifosfanato; bleomicina (blenoxano) ; bortezomib; busulfan (mueran) ; carboplatina (paraplatina) ; carmustina (BCNU, BiCNU) ; clorambucilo (leukeran) ; clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina) ; cisplatina (platinol) ; ciclofosfamida; citosina arabinósido (citarabina) ; dacarbazina (DTIC) dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen) daunorrubicina (cerubidina) ; docetaxel (taxótero) doxorrubicina (adriomicina) ; epirubicin; estramustina (emcyt) ; estrógenos, tales como por ejemplo, dietilestilbestrol (DES); etopósido (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexina); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5- FU) ; gemcitabina (gemzar) ; goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab) ; hidroxiurea (hydrea) ; idarubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina) ; interferón alfa (intron A, roferon A) ; irinotecano (camptosar) ; leuprólido (lupron) ; levamisol (ergamisol) ; lomustina (CCNU) mecloratamina (mustárgeno, mostaza de nitrógeno) melfalan (alkeran) ; mercaptopurina (purinetol, 6-MP) metotrexato (mexato) ; 2-metoxiestradiol (2ME2, Panzem) ; mitomicina-C (mutamucina) ; mitoxantrona (novantrona) ; octreótido (sandostatina); pentostatina (2 -desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina) ; prorocarbazina (matulano) ; estreptozocina; tamoxifin (nolvadex) ; taxol (paclitaxel); tenipósido (vumon, VM-26); Talidomida; tiotepa; topotecana (hicamtina) ; tretinoina (vesanoide, ácido all-trans retinoico); vinblastina (valban) ; vincristina (oncovina) y vinorelbina (navelbina) . Para el tratamiento de mieloma múltiple, se prefieren agentes quimioterapéuticos similares a melfalán, ciclofosfamida, prednisona, vincristina, doxorrubicina, carmustina, dexametasona, talidomida, bortezomib, y bifosfanato. Para el tratamiento de carcinoma renal, se prefieren agentes quimioterapéuticos similares a gemcitabina, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina, paclitaxel, carboplatina, ifosfamida, doxorrubicina, vinblastina, IFN-alfa, e IL-2. En una variante, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (A) uno o más oligonucleótidos de LNA y (b) uno o más de otros compuestos quimioterapéuticos que funcionan mediante un mecanismo no antisentido. Cuando se utilizan con oligonucleótidos de LNA, estos compuestos quimioterapéuticos se pueden utilizar individualmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido por otro agente y oligonucleótido) , o en combinación con uno o más de otros de estos compuestos quimioterapéuticos o en combinación con radioterapia. Todos los compuestos quimioterapéuticos conocidos por alguien con experiencia en la técnica incluyendo aquellos mencionados explícitamente anteriormente se incorporan como tratamientos de combinación con un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención. En una modalidad, la composición farmacéutica se administra en combinación con un compuesto de taxano .

El término "compuesto de taxano" se debe entender que abarca paclitaxel (Taxol®) , derivados de paclitaxel, docetaxel, taxótero, taxanos modificados, y análogos de taxoide. Paclitaxel (Taxol®) es un diterpeno aislado de la corteza de tejo del oeste (pacífico) , Taxus brevifolia y es representativo de una clase de agentes terapéuticos que tienen un sistema de anillo con taxano. Paclitaxel y sus análogos se han producido mediante la síntesis parcial de 10 -desacetilbaccatina III, un precursor obtenido de agujas y ramas de tejo, y mediante síntesis total. Véase Holton, et al., J. Am . Chem. Soc. 116:1597-1601 (1994) y Nicolaou, et al., Nature 367:630 (1994) . Paclitaxel ha demostrado eficacia en varios tumores humanos en ensayos clínicos. Véase McGuire, et al., Ann. Int. Med. 111:237-279 (1989); Holmes, et al., J. Nati. Cáncer Inst. 83: 1797-1805 (1991); Kohn et al., J. Nati. Cáncer Inst . 86: 18-24 (1994); y Kohn, et al., American Society for Clinical Oncology 12 (1993). El taxano modificado o los análogos de taxoide son aquellos compuestos que tienen cadenas laterales modificadas que portan un anillo de taxano. Varios de estos análogos tienen propiedades mejoradas, tales como por ejemplo, mayor solubilidad y estabilidad en agua de la del paclitaxel natural. Estos análogos son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se exponen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,278,324; 5,272,171; 5,254,580; 5,250,683; 5,248,796; y 5,227,400, las exposiciones de las mismas se incorporan en la presente como referencia. Paclitaxel y taxótero se pueden preparar mediante los métodos en la WO 93/18210, EP 0 253 739, EP 0 253 739, y la WO 92/09589, las exposiciones de las mismas se incorporan en la presente como referencia. En modalidades particulares, el compuesto de taxano es paclitaxel o taxótero. La proporción en peso entre los compuestos de taxano y el oligonucleótido de LNA en la composición está típicamente en la variación de 50:1, a 1:25, tal como por ejemplo, en la variación de 25:1 a 1:25, o en la variación de 10:1 a 1:25, o en la variación de 1:1 a 1:25, o en la variación de 50:1 a 1:10, o en la variación de 1:1 a 1:50, o en la variación de 25:1 a 1:10. En una modalidad adicional, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener uno o más oligonucleótidos de LNA y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo blanco de ácido nucleico. Se pueden utilizar dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente. En las composiciones de la invención también se pueden combinar fármacos anti-inflamatorios, incluyendo de manera enunciativa: fármacos antiinflamatorios no esteroidales y corticoeesteroides , fármacos antivirales, y fármacos inmunomoduladores. Se pueden utilizar conjunta o secuencialmente dos o más compuestos combinados. Además, las composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos de LNA se pueden utilizar en combinación con radioterapia, etc.

Tratamiento médico Los oligonucleótidos de LNA de la invención son útiles para diversas de aplicaciones terapéuticas como se indica en la presente. En general, los métodos terapéuticos de la invención incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido modificado con LNA a un mamífero, en particular un ser humano. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o un conjugado como se define en la presente para utilizarse como un medicamento.

La dosificación depende de la gravedad y sensibilidad del estado de la enfermedad que será tratada, y el curso de tratamiento que dura de varios días a varios meses, o hasta que se efectúe una curación o se alcance una disminución del estado de la enfermedad. Los horarios de dosificación óptimos también se pueden determinar mediante mediciones del fármaco en el cuerpo paciente o mediante marcadores sustitutos . Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales. En general, se puede estimar con base en los EC50 encontrado que son eficaces en modelos animales in vi tro e in vivo . En general la dosificación es de O.Olµ g a 1 g por kilogramo de peso corporal, y se puede administrar una o más veces al día, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 a 10 años o mediante infusión continua durante horas hasta varios meses. Los índices de repetición para la dosificación se pueden estimar con base en los tiempos de residencia y concentraciones medidos del fármaco en fluidos o tejidos corporales. Después de un tratamiento exitoso, puede ser conveniente tener al paciente bajo una terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado de enfermedad. Actualmente se cree que las dosis más relevantes son 0.01 mg a 100 mg, tales como por ejemplo, 0.1 mg a 40 mg, o 0.5 mg a 10 mg, por kilogramo de peso corporal. Estas dosis se pueden administrar una vez al día, aunque de mayor preferencia con menor frecuencia, por ejemplo, 1-3 veces a la semana, durante un periodo de 1-4 semanas. La terapia de mantenimiento se puede continuar, por ejemplo, 1-4 veces al mes o incluso con menor frecuencia tal como por ejemplo, 1-10 veces al año. Alguien con experiencia en la técnica apreciará que los oligonucleótidos de LNA se pueden utilizar para combatir enfermedades vinculadas al HIF-la por muchos diferentes principios, que de esta forma quedan dentro del espíritu de la presente invención. En el sentido en que se utiliza en la presente, los términos "ácido nucleico blanco" comprenden el ADN que codifica para el HIF-la, el ARN (que incluye el pre-ARNm y el ARNm) transcrito de ese ADN, y también el ADNc derivado de ese ARN. En el sentido en que se utiliza en la presente, el término "gen" significa el gen incluyendo exones, intrones, regiones 5' y 3' y elementos reguladores y todas las variantes conocidas actualmente de los mismos y cualesquiera variantes adicionales, que se pueden aclarar. En el sentido en que se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido de LNA" se refiere a un oligonucleótido que pueda inducir un efecto terapéutico deseado en seres humanos a través de por ejemplo por la unión mediante enlace de hidrógeno a ya sea un gen blanco "Chimeraplast" y "TFO" , a las transcripciones de ARN de los "inhibidores antisentido" del gen blanco, "siARN", "miARN" , "ribozimas" y oligozimas" o a las proteínas que codifican para el gen blanco "aptámero" , "spiegelmer" o "decoy" . En el sentido en que se utiliza en la presente, el término "ARNm" significa las transcripciones de ARNm actualmente conocidas de un gen dirigido, y cualesquiera transcripciones adicionales, que se puedan identificar. En el sentido en que se utiliza en la presente, el término "modulación" significa ya sea un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) en la expresión de un gen. En la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión génica y el ARNm es un blanco preferido.

En el sentido en que se utiliza en la presente, el término "que se dirige a" un compuesto antisentido a un ácido nucleico blanco particular significa proporcionar el oligonucleótido antisentido a la célula, al animal o ser humano de tal forma que el compuesto antisentido sea capaz de unirse a la función de su blanco pretendido y modular la misma. Los oligonucleótidos de LNA se pueden diseñar como los siARN que son pequeñas moléculas de ARN de doble cadena que se utilizan por las células para lentificar los genes endógenos o exógenos específicos mediante un mecanismo hasta la fecha muy poco comprendido "similar a antisentido" . La eficacia clínica de los oligonucleótidos antisentido depende a un grado significativo sobre su farmacocinética por ejemplo, absorción, distribución, captación celular, metabolismo y excreción. A su vez, estos parámetros se guían significativamente por la química subyacente, el tamaño y la estructura tridimensional de los oligonucleótidos. La modulación de las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención se puede alcanzar adicionalmente a través de la unión de una variedad de diferentes entidades. Por ejemplo, la capacidad de los oligonucleótidos de atravesar la membrana celular se puede mejorar mediante la unión por ejemplo las entidades del lípido tales como por ejemplo, una entidad de colesterol, un tioéter, una cadena alifática, un fosfolípido o una poliamina al oligonucleótido. Asimismo, la captación de los oligonucleótidos de LNA en células se puede mejorar al conjugar las entidades para el oligonucleótido que interactúa con las moléculas en la membrana, que depende del transporte en el citoplasma. Las propiedades farmacodinámicas de acuerdo con la invención se pueden mejorar con grupos que mejoren la captación del oligonucleótido de LNA, que mejoren la bioestabilidad tales como por ejemplo, para mejorar la resistencia del oligonucleótidos de LNA a la degradación, y/o para aumentar la especificidad y afinidad de las características de hibridación de los oligonucleótidos con la secuencia blanco por ejemplo, una secuencia de ARNm. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede utilizar para el tratamiento de muchas enfermedades diferentes. Al igual que las células cancerígenas que proliferan en células endoteliales vasculares son sensibles a la sub-regulación de la expresión del HIF-la. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención por lo tanto se puede utilizar en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una enfermedad anormal que provoca angiogénesis. Los ejemplos de estas enfermedades son cánceres en general y arterosclerosis , psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica y sarcoma de Karposi. Como se señala en general, un aspecto de la invención se dirige a un método para tratar a un mamífero que padece o es susceptible a una enfermedad provocada por angiogénesis anormal, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido de LNA o de un conjugado como se define en la presente. Además, la invención también se relaciona con un método para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o un conjugado como se define en la presente o una composición farmacéutica como se define en la presente. Un aspecto interesante de la invención se dirige al uso de un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o como un conjugado como se define en la presente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de arterosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación, e inflamación de la piel, u otras enfermedades relacionadas con la piel. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también se puede utilizar en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, inflamaciones tales como por ejemplo, inflamaciones de la piel u otras enfermedades o trastornos de la piel, por ejemplo, psoriasis y artritis reumatoide. De manera similar, otro aspecto interesante de la invención se dirige a un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de arterosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación, e inflamación de la piel, el método comprende administrar un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o un conjugado como se define en la presente o una composición farmacéutica como se define en la presente a un paciente que necesita del mismo. Son particularmente interesantes las enfermedades angiogénicas que incluyen retinopatía diabética, degeneración macular, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino por artritis reumatoide, y otras enfermedades inflamatorias. Estas enfermedades se caracterizar por la destrucción de tejido normal por vasos sanguíneos recién formados en el área de la neovascularización. Por ejemplo, en la degeneración macular, coroides se invade y se destruye por capilares. La destrucción conducida por angiogénesis de la coroides en la degeneración macular conduce con el tiempo a ceguera parcial o total . Los métodos de la invención de preferencia se emplean para el tratamiento o profilaxis contra las enfermedades provocadas por el cáncer, en particular para el tratamiento de cáncer como se puede presentar en tejidos tales como por ejemplo, pulmón, mama, colon, próstata, páncreas, hígado, tiroides, riñon, cerebro, testículos, estómago, intestino, tubo digestivo, médula ósea espinal, senos, vejiga, tracto urinario o cáncer ovárico.

Además, la invención descrita en la presente abarca un método para prevenir o tratar el cáncer que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido de LNA para la modulación del HIF-la, incluyendo de manera enunciativa: altas dosis de los oligonucleótidos de LNA, a un ser humano que necesita de esa terapia. La invención abarca además la utilización de un período corto de administración de un oligonucleótido de LNA para la modulación del HIF-la. Las células no-cancerosas, normales se dividen a una frecuencia característica para el tipo celular particular. Cuando una célula se haya transformado en un estado canceroso, esto da por resultado en una proliferación sin control de la célula y muerte reducida de la célula, y por lo tanto, la división celular promiscua o crecimiento celular es un sello de un tipo celular canceroso. Los ejemplos de tipos de cáncer, incluyen de manera enunciativa: linfoma que no es de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple) , carcinoma de colon, carcinoma rectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer prostático, carcinoma celular renal, hepatoma, carcinoma hepático, coriocarcinoma, cáncer cervical, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, melanoma, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer del cerebro, cánceres de un sitio primario desconocido, neoplasmas, cánceres del sistema nervioso periférico, cánceres del sistema nervioso central, tumores (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, carcinoma pulmonar de célula pequeña, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma, y retinoblastoma) , enfermedad de cadena pesada, metástasis, o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por crecimiento celular sin control o anormal . El término "carcinoma" se pretende que indique un tumor maligno o de origen epitelial. El tejido epitelial cubre o rellena las superficies corporales dentro y fuera del cuerpo. Los ejemplos de tejido epitelial son la piel y la mucosa y serosa que rellenan las cavidades corporales y órganos internos, tales como por ejemplo, intestinos, vejiga urinaria, útero, etc. El tejido epitelial también se puede extender en capas más profundas de tejido para formar glándulas, tales como por ejemplo, glándulas para la secreción de moco. El término "sarcoma" se pretende que indique un tumor maligno que crece a partir de tejido conjuntivo, tal como por ejemplo, cartílago, grasa, músculos, tendones y huesos. El término "glioma" , cuando se utiliza en la presente, se pretende que cubra un tumor maligno o que se origina de células gliales. En la utilización de un oligonucleótido de LNA de la invención o como un conjugado de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer, el cáncer puede estar adecuadamente bajo la forma de un tumor sólido.

Además, el cáncer también es adecuadamente un carcinoma. El carcinoma típicamente se selecciona del grupo que consiste de melanoma maligno, carcinoma de célula basal, carcinoma ovárico, carcinoma de mama, cáncer pulmonar de célula no pequeña, carcinoma celular renal, carcinoma de la vejiga, cáncer superficial recurrente de la vejiga, carcinoma del estómago, carcinoma prostático, carcinoma pancreático, carcinoma pulmonar, carcinoma cervical, displasia cervical, papilomatosis laríngea, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal y tumores carcinoide. Más típicamente, el carcinoma se selecciona del grupo que consiste de melanoma maligno, cáncer pulmonar de célula no pequeña, carcinoma de mama, carcinoma de colon y carcinoma celular renal. El melanoma maligno típicamente se selecciona del grupo que consiste de melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular, melanoma de lentigo maligno, melanoma acral, melanoma amelanótico y melanoma desmoplásico . Alternativamente, el cáncer puede ser adecuadamente un sarcoma. El sarcoma se selecciona típicamente en la forma seleccionada del grupo que consiste de osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma y sarcoma de Kaposi.

Alternativamente, el cáncer puede ser un glioma. Los oligonucleótidos de LNA y conjugados definidos en la presente también se cree que son particularmente útiles para el tratamiento de una enfermedad cancerosa seleccionada del grupo que consiste de mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer del cerebro, y cáncer de mama. La invención también proporciona un método para tratar el cáncer, el método comprende administrar un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o conjugado como se define en la presente o una composición farmacéutica como se define en la presente a un paciente que necesita del mismo. En una variante, el cáncer está en la forma de un tumor sólido. El cáncer sólido puede ser adecuadamente un carcinoma o un sarcoma o un glioma, como se analizó anteriormente. Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención se dirige al uso de un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o como un conjugado como se define en la presente para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el medicamento comprende además un agente quimioterapéutico seleccionado de aquellos definidos anteriormente bajo "combinación de fármacos". Adecuadamente, el agente quimioterapéutico adicional se selecciona de taxanos tales como por ejemplo, Taxol, Paclitaxel o Docetaxel. Como se establece alternativamente, la invención además se dirige a un método para tratar el cáncer, el método comprende administrar un oligonucleótido de LNA como se define en la presente, o un conjugado como se define en la presente o una composición farmacéutica como se define en la presente a un paciente que necesita del mismo y además comprende la administración de un agente quimioterapéutico adicional. La administración además puede ser tal que el agente quimioterapéutico adicional conjugado con el oligonucleótido de LNA de la invención, esté presente en la composición farmacéutica, o se administre en una formulación por separado . En una modalidad preferida, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que eviten la despolimerización microtubular y la tensión que se forma en los cinetocoros de los cromátides hermanos, aunque no la unión de microtúbulos a los cinetocoros . Estos agentes quimioterapéuticos incluyen taxanos como se definieron anteriormente, en particular Taxol, Paclitaxel y Docetaxel. Cuando se utilizan con los oligonucleótidos de LNA de la invención, estos agentes quimioterapéuticos se deben utilizar secuencialmente iniciando con el tratamiento de Oligonucleótidos durante un periodo de tiempo que sensibiliza a las células blanco para un co-tratamiento posterior con el agente quimioterapéutico al reducir el nivel de la proteína HIF-la en células tumorales y la proliferación de células endoteliales de la vasculatura tumoral. En una modalidad adicional preferida, el tratamiento médico utilizando un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la presente invención se combina con radioterapia. Cuando se utiliza con los oligonucleótidos de LNA de la invención, la radioterapia se debe utilizar secuencialmente iniciando con un tratamiento de oligonucleótidos durante un periodo de tiempo que sensibilice a las células blanco a la radioterapia adicional posterior al reducir el nivel de la proteína HIF-la en células tumorales y la proliferación de células endoteliales de la vasculatura tumoral.

Los oligonucleótidos de LNA de la presente invención también se pueden utilizar como reactivos de investigación para diagnóstico, terapéutica y profilaxis. En la investigación, los oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar para inhibir específicamente la síntesis de los genes del HIF-la en células y animales experimentales facilitando con esto el análisis funcional del blanco o una valoración de su utilidad como blanco para la intervención terapéutica. En diagnóstico, los oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar para detectar y cuantificar la expresión del HIF-la en células y tejidos mediante transferencia Northern, hibridación in-situ o técnicas similares. Para la terapéutica, un animal o un ser humano, con sospecha de tener una enfermedad o un trastorno, que se pueda tratar mediante la modulación de la expresión del HIF-la se trata al administrar los oligonucleótidos de LNA antisentido de acuerdo con esta invención. Se proporcionan además los métodos para tratar a un animal en particular un ratón y una rata y para tratar a un ser humano, en sospecha de tener o que estén propensos a una enfermedad o condición, asociada con la expresión del HIF-la al administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los oligonucleótidos de LNA antisentido o conjugados o composiciones farmacéuticas de la invención. Un aspecto adicional de la invención se dirige a un método para inducir apoptosis que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como en la presente, un conjugado como se define en la presente o una composición farmacéutica como se define en la presente. La inducción de la apoptosis se puede realizar in vi tro o in vivo . La inducción se puede realizar en un análisis celular o dentro de una muestra del tejido o en el interior de un mamífero vivo. Un aspecto relacionado de la invención es un método dirigido para prevenir la proliferación celular que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o un conjugado como se define en la presente o una composición farmacéutica como se define en la presente. La prevención de la proliferación se puede realizar in vi tro o in vivo . La prevención se puede realizar en un análisis celular o dentro de una muestra de tejido o en el interior de un mamífero vivo .

Incluso adicionalmente, la invención también se relaciona con un método para tratar una enfermedad angiogénica que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en la presente o un conjugado como se define en la presente o una composición farmacéutica como se define en la presente, de tal forma que se inhiba la angiogénesis asociada con la enfermedad angiogénica. En una modalidad, la enfermedad angiogénica comprende un tumor asociado con un cáncer; véase también lo anterior. El cáncer de preferencia se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de la cabeza y cuelo, cáncer del cerebro, cáncer abdominal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer hepático, cáncer lingual, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer prostático, retinoblastoma, tumor de Wílm, mieloma múltiple, cáncer de la piel, linfoma, y leucemia. Alternativamente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer del cerebro, y cáncer de mama.

La enfermedad angiogénica también se puede seleccionar del grupo que consiste de retinopatía diabética, degeneración macular, y enfermedades inflamatorias. En particular, la enfermedad angiogénica es una enfermedad inflamatoria seleccionada de la enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y artritis reumatoide. El tratamiento de la degeneración macular se cree que es particularmente relevante con los oligonucleótidos de LNA de la invención.

Equipos Si la composición farmacéutica en forma líquida está bajo el riesgo de ser sometida a condiciones que comprometerán la estabilidad del oligonucleótido de LNA, se puede preferir proporcionar el producto terminado que contenga el oligonucleótido de LNA en una forma sólida, por ejemplo, como un material liofilizado, y el almacenamiento del producto se realiza en esa forma sólida. El producto entonces se puede reconstituir (por ejemplo, disuelto o suspendido) en una solución salina o en una solución salina amortiguada lista para utilizarse antes de la administración.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un equipo que comprende (a) un primer componente que contiene un oligonucleótido de LNA o un conjugado como se definió anteriormente en forma sólida, y (b) un segundo componente que contiene solución salina o una solución amortiguada (por ejemplo, solución salina amortiguada) adaptada para la reconstitución (por ejemplo, disolución o suspensión) de los oligonucleótidos de LNA. Se preferencia, la solución salina o solución salina amortiguada tiene un pH en la variación de 4.0-8.5, y un molaridad de 20-2000 mM . En una modalidad preferida, la solución salina o solución salina amortiguada tiene un pH de 6.0-8.0 y una molaridad de 100-500 mM . En una modalidad más preferida, la solución salina o solución salina amortiguada tiene un pH de 7.0-8.0 y una molaridad de 120-250mM Para este equipo, el oligonucleótido de LNA de preferencia se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO . 2, la SEQ ID NO. 15, la SEQ ID NO. 16, la SEQ ID NO. 17, y la SEQ ID NO. 18. Más particularmente, el oligonucleótido de LNA se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO . 2. La invención se ilustra más a fondo de una manera no limitante mediante los siguientes ejemplos.

EXPERIMENTOS Ejemplo 1: Síntesis de monómeros Los bloques para la constitución del monómero de LNA y los derivados del mismo se prepararon siguiendo los procedimientos publicados y las referencias citadas en la presente, véanse, por ejemplo, WO 03/095467 Al y D. S. Pedersen, C.

Rosenboh , T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.

Ejemplo 2; Síntesis de oligonucleótidos Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando el procedimiento de fosforamidita en un sintetizador Expedite 8900/MOSS (Múltiple, Oligonucleotide Synthesis System [Sistema Múltiple para la Síntesis de Oligonucleótidos] ) a una escala de 1 µmol o 15 µmol. Para la síntesis a escala mayor, se utilizó un Ákta Oligo Pilot. Al término de la síntesis (DMT-on) , los oligonucleótidos se escindieron a partir del soporte sólido utilizando amoníaco acuoso durante 1-2 horas a temperatura ambiente, y se desprotegió adicionalmente durante 4 horas a 65°C. Los oligonucleótidos se purificaron mediante HPLC en fase inversa (RP-HPLC) . Después del retiro del grupo DMT, los oligonucleótidos se caracterizaron mediante AE-HPLC, RP-HPLC, y CGE y la masa molecular se confirmó adicionalmente mediante ESI-MS. Véase más adelante para más detalles.

Preparación del soporte sólido de LNA: Preparación del hemiéster succinílico de LNA En DCM (35 ml) se disolvieron el monómero de 5 ' -O-Dmt-3 ' -hidroxi-LNA (500 mg) , anhídrido succínico (1.2 eq) y DMAP (1.2 eq.) . La reacción se mezcló a temperatura ambiente durante la noche. Después de extracciones con NaH2P04 0.1 M pH 5.5 (2x) y salmuera (Tx) , la capa orgánica se secó adicionalmente con Na2S0 anhidro, se filtró y se evaporó. El derivado de hemiéster se obtuvo en un rendimiento del 95% y se utilizó sin ninguna purificación adicional.

Preparación del soporte de LNA El derivado del hemiéster preparado anteriormente (90µmol) se disolvió en una cantidad mínima de DMF, se agregaron IDEA y pyBOP (90µmol) y se mezclaron juntos durante 1 Min. Esta mezcla pre-activada se combinó con LCAA-CPG (500 A, tamaño de tamiz 80-120, 300 mg) en un sintetizador manual y se agitó. Después de 1.5 horas a temperatura ambiente, el soporte se extrajo por filtración y se lavó con DMF, DCM y MeOH. Después de secar, la carga se determinó para ser 57µmol/g (véase a Tom Brown, Dorcas J. S. Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In : F.Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14).

Alargamiento del oligonucleótido El acoplamiento de fosforamiditas (A(bz), G(ibu), 5 -metil-C (bz) ) o Tß-cianoetil-fosforamidita) se realizó al utilizar una solución de 0.1 M de la amidita 5 ' -O-DMT-protegida en acetonitrilo y DCI (4 , 5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0.25 M) como activador. La tiolación se llevó a cabo utilizando el cloruro de xantano (0.01 M en acetonitrilo :piridina al 10%) . El resto de los reactivo son los que se utilizan típicamente para la síntesis de oligonucleótidos. El protocolo proporcionado por el proveedor se optimizó convenientemente.

Purificación mediante RP-HPLC: Columna: Xterra RP?8 Caudal : 3 mL/min Tampones: Acetato de amonio 0.1 M pH 8 y acetonitrilo Abreviaturas DMT: Dimetoxitritilo DCI : , 5-Dicianoimidazol DMAP: 4-Dimetilaminopiridina DCM: Diclorometano DMF: Dimetilformamida THF: Tetrahidrofurano DIEA: N, N-diisopropiletilamina PyBOP: Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi- tris -pirrolidino- fosfonio Bz: Benzoilo Ibu: Isobutirilo Ejemplo 3: Diseño del oligonucleótido de LNA Tabla l-01igonucleótidos de LNA En la Tabla 1, las mayúsculas designan un análogo del nucleótido ß-D-oxi-LNA ( ß -D-oxi-LNA) , las minúsculas designan un 2 -desoxinucleótido, lo subrayado designa ya sa un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA o un 2 -desoxinucleótido , el subíndice "s" designa un enlace de fosforotioato entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y ningún subíndice entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA designa un enlace de fosforodiéster , y el subíndice "x" designa ya sea un enlace de fósforotioato o un enlace de fosforodiéster entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y las unidades nucleotídicas entre paréntesis, por ejemplo, (Tx) , o (Gx) , respectivamente, representan una unidad opcional. Todos los monómeros de LNA-C son 5-metil-C (MeC) .

Medición de la temperatura de fusión (Tm) de los compuestos : Una solución 3µM de la SEQ ID NO . 1 en fosfato de sodio 10 mM /NaCl 100 mM /EDTA 0.1 nM, pH 7.0 se mezcló con su ADN/ARN complementario 3µM en fosfato de sodio 10 mM/NaCl 100 mM/EDTA 0.1 nM, pH 7.0 a 90°C durante un minuto y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La Tm del dúplex luego se determinó al aumentar la temperatura a l°C/min. de 25 a 95°C. La Tm de la SEQ ID NO. 1 se muestra en la siguiente Tabla 2 : Tabla 2 Ejemplo 4: Estabilidad de los oligonucleótidos de LNA en plasma humano o de rata La estabilidad del oligonucleótido de LNA se probó en plasma proveniente de humano o de ratas (también podría ser plasma de ratón, mono o perro) .

En 45µl de plasma, se agregaron 5µl del oligonucleótido de LNA (una concentración final de 20µM) . Los oligonucleótidos de LNA se incubaron en plasma durante tiempos que varían de 0 a 96 horas a 37°C (el plasma se probó para la actividad de nucleasa hasta 96 horas y no mostró ninguna diferencia en el patrón para la escisión de nucleasa) . En el tiempo indicado las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. 2µl (igual a 40 pmol) del oligonucleótido de LNA en plasma se diluyeron al agregar 15µl de agua y 3µl de tinte de carga 6x (Invitrogen) . Como marcador se utiliza una sucesión de 10 pares de bases (Invitrogen 10821-015) . A lµl de la sucesión se agregaron lµl de carga 6x y 4µl de agua. Las muestras se mezclaron, se calentaron a 65°C durante 10 min y se cargaron a un gel de pre-ej ecución (acrilamida al 16%, UREA 7 M, lx TBE, pre-ej ecución a 50 watt durante 1 h) y ejecución a 50-60 watt durante 2% horas. Posteriormente el gel se tiñó con lx SyBR dorado (sondas moleculares) en lx TBE durante 15 min. Las bandas se visualizaron utilizando un formador de imágenes con fósforo de Biorad. (Véase la Figura ÍA en plasma de rata y la Figura IB en plasma humano y de rata . ) La estabilidad del oligonucleótido de LNA se probó en plasma humano (también podría ser plasma de rata, ratón, mono o perro) . Una concentración final de 20µM (entre 1 o 5µL) del oligonucleótido de LNA se agregó a un volumen total de 20µl plasma y se incubó durante tiempos que varían de 0 a 24 horas (podría ser de hasta 72 horas - el plasma se había probado para la actividad de nucleasa hasta 72 horas y no hubo diferencia en el patrón de escisión) . Al tiempo indicado la muestra se almacenó a -80°C. lµl (igual a 20 pmol) de oligonucleótidos de LNA en plasma se diluyó 10 x en agua y se ejecutó en acrilamida al 16%, gel de UREA 7 M con una sucesión de 10 pares de bases (de Invitrogen (no. de cat. 10821-015)). El gel se ejecutó a aproximadamente 40 watt durante 2-3 horas antes de que se tiñera con lx de SyBR dorado (sondas moleculares) en lx TBE durante 15 min. Las bandas se visualizaron utilizando un formador de imágenes con fósforo de Biorad. (Véase la Figura 1) .

Ejemplo 5: Modelo in vi tro : Cultivo celular El efecto de los oligonucleótidos de LNA sobre la expresión del ácido nucleico blanco se puede probar en cualquiera de una variedad de tipos celulares con la condición de que el ácido nucleico blanco esté presente a niveles mensurables. El blanco se puede expresar endógenamente o mediante la transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica para el ácido nucleico. El nivel de expresión del ácido nucleico blanco se puede determinar rutinariamente utilizando, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, PCR cuantitativa, análisis de protección con Ribonucleasa. Se proporcionan los siguientes tipos celulares para fines ilustrativos, aunque se pueden utilizar rutinariamente otros tipos celulares, con la condición de que el blanco se exprese en el tipo celular seleccionado. Las células se cultivaron en el medio adecuado como se describirá más adelante y se mantuvieron a 37°C en humedad al 95-98% y C02 al 5%. Cuando se cultivaron bajo hipoxia o anoxia, los niveles de 02 se mantuvieron a 1-2% o 0-0.5%, respectivamente. Las células se subcultivaron rutinariamente 2-3 veces a la semana. 15PC3 : La línea celular de cáncer prostático humano 15PC3 se donó amablemente por el Dr. F. Bas, Laboratorio de Neurozintuigen, AMC, Los Países Bajos y se cultivó en DMEM (sigma) + suero fetal vacuno al 10% (FBS) + Glutamax I + gentamicina. PC3 : La línea celular de cáncer prostático humano PC3 se adquirió de ATCC y se cultivó en F12 Coon's con glutamina (Gibco) + 10% de FBS + gentamicina . 518A2 : La línea celular de cáncer de melanoma humano 518A2 se donó amablemente por el Dr. B. Jansen, sección de Oncología experimental, Farmacología Molecular, Departamento de Farmacología Clínica, Universidad de Viena y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero fetal vacuno al 10% (FBS) + Glutamax I + gentamicina. U373 : Las células de glioblastoma U373 se cultivaron en EMEM (Sigma) que contenía suero fetal vacuno al 10% más Glutamax I, NEAA, Piruvato de sodio y gentamicina a 37°C, humedad al 95% y C02 al 5%. HeLa : La línea celular de carcinoma cervical HeLa se cultivó en MEM (Sigma) que contenía suero fetal vacuno al 10% gentamicina a 37°C, humedad al 95% y C02 al 5%. MPC-11 : La línea celular de mieloma múltiple murino MPC-11 se adquirió de ATCC y se mantuvo en DMEM con Glutamax 4mM + Suero de Cabalo al 10%. DU-145 : La línea celular de cáncer prostático humano DU-145 se adquirió de ATCC y se mantuvo en RPMl con Glutamax + 10% de FBS. RCC-4 +/- VHL : La línea celular de cáncer renal humano RCC4 se transfectó establemente con el plásmido que expresa VHL o el plásmido vacío se adquirió de ECACC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes . 786- 0 : La línea celular de carcinoma celular renal humano 786-0 se adquirió de ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes .

HUVEC: La línea celular endotelial de la vena umbilical humana HUVEC se adquirió de Camcrex y se mantuvo en medio EGM-2. K562 : La línea celular de leucemia mielógena crónica humana K562 se adquirió de ECACC y se mantuvo en RPMl con Glutamax + 10% de FBS. U87MG: La línea celular de glioblastoma humano U87MG se adquirió de ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. B16 : La línea celular de melanoma murino B16 se adquirió de ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. LNCap : La línea celular de cáncer prostático humano LNCap se adquirió de ATCC y se mantuvo en RPMl con Glutamax + 10% de FBS Ejemplo 6: Modelo in vi tro z Tratamiento con el oligonucleótido antisentido Cultivo celular y transfecciones: U373 de células HeLa se sembraron en placas de 12 cavidades a 37°C (C02 al 5%) en medio de crecimiento D suplementado con 10% de FBS, Glutamax I y Gentamicina. Cuando las células fueron 60-70% confluentes, las mismas se transfectaron por duplicado con diferentes concentraciones de oligonucleótidos (0.2-100 nM) utilizando Lipofectamina 2000 (2.5 -5µg/ml ) . Las transfecciones se llevaron a cabo esencialmente como se describe por Dean et al. (1994, JBC 269:16416- 16424). En pocas palabras, las células se incubaron durante 10 min. con Lipofectamina en OptiMEM seguido por la adición del oligonucleótido a un volumen total de la mezcla de transfección por cavidad de 0.5 ml . Después de 4 horas, la mezcla del transfección se retiró, las células se lavaron y se desarrollaron a 37 °C durante aproximadamente 20 horas (análisis de ARNm y análisis proteínico) durante ya sea normoxia o hipoxia en el medio de crecimiento adecuado. Las células luego se recolectaron para el análisis proteínico y de ARN.

Ejemplo 7: Modelo in vi tra Extracción del ARN y síntesis del ADNc Aislami ento del ARN total El ARN total se aisló ya sea utilizando el equipo RNeasy mini (Qiagen. no. de cat. 74104) o utilizando el reactivo Trizol (Life technologies no. de cat. 15596) . Para el aislamiento del ARN total utilizando el equipo RNeasy mini (Qiagen) , las células se lavaron con PBS, y solución tampón para lisis celular (RTL, Qiagen) suplementado con mercaptoetanol al 1% se agregó directamente a las cavidades . Después de unos cuantos minutos, las muestras se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de tejido se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Retsch 300MM y el ARN total se aisló utilizando el reactivo Trizol o el equipo RNeasy mini como se describe por el fabricante .

Primera síntesis de filamentos La primera síntesis de filamentos se llevó a cabo utilizando ya sea el equipo de Transcriptasa Inversa OmniScript o Transcriptase inversa M-MLV (esencialmente descrito por el fabricante (Ambion) ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen) . Cuando se utiliza Transcriptasa Inversa OmniScript 0.5µg de ARN total de cada muestra, se ajustó a 12µl y se mezcló con 0.2µl de poly (dT)?2.18 (0.5µg/µl) (Life Technologies), 2µl de mezcla de dNTP (5 mM cada uno), 2µl lOx RT tampón, 0.5µl de RNAguardMR Inhibidor de RNasa (33 unidades/ml, Amersham) y lµl de Transcriptasa Inversa OmniScript seguido por incubación a 37°C durante 60 min. e inactivación térmica a 93°C durante 5 min.

Cuando se llevaron a cabo la primera síntesis de filamentos utilizando decámeros aleatorios y M-MLV-Transcriptasa Inversa (esencialmente como se describe por el fabricante (Ambion)) 0.25µ de ARN total de cada muestra se ajustó a 10.8µl en H20. Se agregaron 2µl de decámeros y 2µl de mezcla de dNTP (2.5 mM cada uno) . Las muestras se calentaron a 70°C durante 3 min. y se enfriaron inmediatamente en agua helada y se agregaron 3.25µl de una mezcla que contuvo (2µl lOx RT tampón; lµl M-MLV Transcriptasa Inversa; 0.25µl del inhibidor de ARNasa). El ADNc se sintetizó a 42°C durante 60 minutos seguido por el paso de inactivación mediante calentamiento a 95°C durante 10 minutos y por último se enfrió a 4°C.

Ejemplo 8: Modelo in vi tro e in vi vo : Análisis para la inhibición de oligonucleótidos de la expresión del H F-la mediante PCR en tiempo real La modulación antisentido de la expresión del HIF-la se puede analizar en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm del HIF-la se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de polímeroasa (PCR) , anlálisis para protección de Ribonucleasa (RPA) o PCR en tiempo real. Actualmente se prefiere PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede llevar a cabo en ARN o ARNm celular total. Los métodos para aislamiento de ARN y el análisis de ARN tal como por ejemplo, análisis de transferencia Northern son rutinarios en la técnica y se enseñan en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons. El cuantitativo en tiempo real (PCR) se puede llevar a cabo convenientemente utilizando el Sistema para Detección de la PCR en Tiempo Real Multi-Color disponible comercialmente de BioRAD.

Análisis PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm del HIF-la La cuantificación de niveles de ARNm se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el Sistema para Detección PCR en Tiempo Real Multi-Color iQ (BioRAD) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La PCR cuantitativa en tiempo real es una técnica conocida en este campo y se enseña por ejemplo en Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.

La mezcla maestra de la PCR Cuantitativa en Platino SuperMix UDG 2x se obtuvo de Invitrogen cat# 11730. Los cebadores y las soluciones de ensayo TaqMan® se obtuvieron de MWG-Biotech AG, Ebersberg, Alemania. La gliceraldehído-3 - fosfato deshidrogenasa (GAPDH) , el 18S ARN o la cantidad de ARNm de la ß-actina se utilizaron como un control endógeno para normalizar cualquier variación en la preparación de la muestra. El contenido de la muestra de ARNm de la GAPDH humana se cuantificó utilizando el Reactivo para Análisis TaqMan Pre-Desarrollado GAPDH ABI Prism (Applied Biosystems cat. no. 4310884E) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el HIF-la humano, los cebadores fueron: cebador directo: 5 ' -CTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTT-3 ' (SEQ ID NO. 21) (concentración final en el análisis; 0.9µM) cebador inverso: 5 ' -GCTTTCTCTGAGCATTCTGCAAAGC-3' (SEQ ID NO. 22) (concentración final en el análisis; 0.9µM) y la solución de ensayo para PCR fue: 5' FAM-CCTCAGGAACTGTAGTTCTTTGACTCAAAGCGACA TAMRA 3' (SEQ ID NO. 23) (concentración final en el análisis; 0. lµM) .

Para el HIF-la de cynomolgus, los cebadores de PCR fueron: I cebador directo : 5'-GCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTG-3 ' (concentración final en el análisis; 0.9µM) (SEQ ID NO. 24) cebador inverso: 5' -GAACCATAACAAAACCATCCAAGGC-3' (SEQ ID NO. 25) (concentración final en el análisis; 0.9µM) y la solución de ensayo para PCR fue: 5' FAM-TCATCTTCAATATCCAAATCACCAGCATCCAGAAG-TAMRA 3' (SEQ ID NO. 26) (concentración final en el análisis; 0. lµM) . Para la cuantificación de ARN ribosomal 18S, se utilizó el Reactivo Control Endógeno de 18S ARNr TaqMan Eukaryotic, (PARTE# 4310875, Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes . Para la cuantificación de ARNm de la GAPDH de ratón se diseñaron los siguientes cebadores y soluciones de ensayo: Cebador sentido 5'-AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3' (SEQ ID NO. 27) (0.3µM de concentración final) , cebador antisentido 5'- GTCAGATCCACGACGGACACATT-3' (SEQ ID NO. 28) (0.6µM de concentración final) , Solución de ensayo TaqMan 5'-FAM-GAAGCTCACTGGCATGGCATGGCCTTCCGTGTTC-TAMRA-3' (SEQ ID NO. 29) (0.2µM de concentración final) .

PCR en tiempo real utilizando soluciones de ensayo Taqman El ADNc proveniente de la primera síntesis de filamentos llevada a cabo como se describe en el ejemplo 6 se diluyó 2-20 veces, y se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores y la solución de ensayo se mezclaron con 2 x Platinum Quantiative PCR SuperMix UDG (cat. # 11730, Invitrogen) y se agregó a 3.3µl de ADNc a un volumen final de 25µl. Cada muestra se analizó por triplicado. El análisis de diluciones dobles de un ADNc que se había preparado sobre material purificado a partir de una línea celular que expresaba el ARN de interés generó curvas estándar para los análisis. Se utilizó H20 estéril en lugar de ADNc para el control sin plantilla. Programa PCR: 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos seguido por 40 ciclos de 95°C, 15 segundos, 60°C, 1 minuto. Las cantidades relativas de la secuencia de ARNm blanco se determinaron a partir del ciclo calculado Umbral utilizando el iCycler iQ Real-time Detection System software. (Véase La Figura 2.) PCR en Tiempo Real de SyBR Green Para determinar el nivel relativo de ARNm del HIFl de ratón, se utilizó ADNc, en análisis de PCR cuantitativa utilizando un iCycler de BioRad. A 8µl de ADNc diluido cinco veces se agregaron 52µl de una mezcla que contenía 29.5µl de Platinum qPCR. Supermix-UDG ( in-vitrogen) , 1030 nM de cada cebador, 0.57 X SYBR Green (soluciones de ensayo moleculares) y Fluoresceína 11.4 nM (soluciones de ensayo moleculares) . Se utilizaron duplicados de 25µl para Q-PCR: 50°C durante 120 seg, 95°C durante 120 seg. y 40 ciclos [95°C durante 30 seg. y 60°C durante 60 seg.] . La expresión de ARNm del HIFla se normalizó al ARNm de ß-actina de ratón que se cuantificó de manera similar utilizando Q-PCR.

Cebadores : mHIFla: 5 ' -TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3 ' (SEQ ID NO. 30) y 5' -GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3 ' (SEQ ID NO. 31) mß-actina: 5 ' -CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3 ' (SEQ ID NO. 32) y 5' -GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3' (SEQ ID NO . 33) VEGF: 5 ' -CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3 ' (SEQ ID NO. 34) y 5' -GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3 ' (SEQ ID NO. 35) BCL-2: directo: 5 ' -gccctgtggatgactgagta-3 ' (SEQ ID NO. 36) e inverso: 5 ' -cagccaggagaaatcaaacag-3 ' (SEQ ID NO. 37) 2 diluciones dobles de ADNc sintetizado a partir de fibroblastos de ratón sin tratar (células Ltk) (diluido 5 veces y que expresa tanto HIFla como ß-actina) se utilizaron para preparar curvas estándar para los análisis. Las cantidades relativas de ARNm del HIFla se determinaron a partir del ciclo Umbral calculado utilizando el software iCycler iQ Real Time Detection System.

Ejemplo 9: Análisis in vi tro : Análisis de transferencia Western de los niveles de la proteína del HIF-la El efecto in vi tro de los o'ligonucleótidos de LNA del HIF-la sobre los niveles de proteína del HIF-en células transfectadas se determinó mediante transferencia Western. Las células se recolectaron y se lisaron en Tris-HCl 50 mM pH 6.8, glicerol al 10%, SDS al 2.5%, DTT 5 mM y urea 6 M suplementados con un cóctel del inhibidor de protease (Roche) . Las concentraciones totales de proteína se midieron utilizando un equipo para análisis proteínico de BCA (Pierce) . 20-100µ de proteína total se corrieron sobre 10-12% de geles Bis-Tris en tampón MOPS o sobre 3-8% de geles de Tris Acetato y se transfirieron sobre una de las membranas PVDF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . Después de la incubación durante la noche en tampón de bloqueo (PBS-T suplementado con leche en polvo con bajo contenido de grasa al 5%) , las membranas se incubaron durante la noche con un anticuerpo anti-HIF-la, un anticuerpo VEGF del anticuerpo Bcl-2 o los anticuerpos que detectan otra dirección 3' del HIF-la. Al igual que el control de carga, se detectaron la tubulina o la actina al utilizar anticuerpos monoclonales provenientes de Neomarker. Las membranas luego se incubaron con anticuerpos secundarios y HIF-la, se visualizaron utilizando un equipo para inmunodetección cromogénica (Invitrogen) o un equipo para detección ECL+ de quimioluminiscencia (Amersham) . (Véanse la Figura 2A y la Figura 2B) .

Ejemplo 10: Análisis in vitro: Inhibición antisentido de la expresión del HIF-la humano utilizando oligonucleótidos antisentido y su efecto sobre los blancos VEGFA y MMP-2 en la dirección 3# Los oligonucleótidos de LNA también tienen un efecto sobre los blancos en VEGFA y MMP-2 en la dirección 3' en medios proveniente de las células U373. Las células U373 se sembraron a 0.3 x 106 células en matraces T25 (tiempo del estudio) o 0.6 x 106 células en matraces T80 (estudio de conc. a 48 horas) . Se colocaron células U373 a 37°C (C02 al 5%) en medios de crecimiento suplementados con 10% de FBS, Glutamax I y Gentamicina. Al día después del sembrado, las células se transfectaron con los oligonucleótidos de LNA por duplicado o triplicado utilizando diferentes concentraciones de oligonucleótidos (0.2-10 nM) utilizando Lipofectamina 2000 (2.5µg/ml). Las transfecciones se llevaron a cabo esencialmente como se describe por Dean et al. (1994, JBC 269: 16416-16424). En resumen, las células se incubaron durante 10 min. con Lipofectamina en OptiMEM seguido por la adición de los oligonucleótidos. Después de 4 horas, la mezcla de transfección se retiró, las células se lavaron y se desarrollaron a 37°C durante aproximadamente 20 horas (análisis de ARNm y análisis proteínico) durante normoxia o hipoxia en el medio de crecimiento adecuado. Los sobrenadantes de las células se recolectaron en el momento indicado. Se agregaron inhibidores de proteasa antes del almacenamiento a -80°C. Se utilizaron elisa de VEGFA humano (cat #DVE-00) y elisa MMP-2 (cat # DMP-200) a patir de sistemas RD de acuerdo con el fabricante. Dependiendo del tiempo, el sobrenadante recolectado se diluyó 5-50 veces antes de la medición. Véanse las figuras 12A-E.

Ejemplo 11: Inducción de apoptosis mediante los oligonucleótidos de LNA Cul tivo de cél ulas La línea celular U373 de glioblastoma (ATCC) se cultivó en MEM (Sigma) suplementado con suero fetal vacuno al 10%, Glutamax I, NEAA, Piruvato de sodio y gentamicina a 37°C, humedad al 95% y C02 al 5%. Cuando las células alcanzaron 60-70% de confluencia, las células se transfectaron utilizando Lipofectamina 2000 (2.5µg/ml). La línea celular HeLa de carcinoma cervical se cultivó en MEM (Sigma) que contenía gentamicina con suero fetal vacuno al 10% a 37°C, humedad al 95% y C02 al 5%. Cuando las células alcanzaron 60-70% de confluencia, las células se transfectaron utilizando Lipofectamina 2000 (5µg/ml) .

Medición de la actividad de Caspase 3/7 activa Se sembraron células U373 a una densidad de 7000 células por cavidad en una placa blanca de 96 cavidades (Nunc 136101) en MEM completo al día antes de la transfección. Al siguiente día, las células se lavaron una vez en OptiMEM precalentado seguido por la adición de 72µl de OptiMEM que contenía 2.5µg/ml de Lipofectamina2000 (In vitrogen) . Las células se incubaron durante 7 minutos antes de agregar 18µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La concentración final de oligonucleótidos varió de 0.2 nM a 100 nM. Después de 6 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se agregaron lOOµl de DMEM que contenía suero. Se cultivaron placas de 96 cavidades similares con células U373 tratadas bajo normoxia o bajo Hipoxia/anoxia al colocar las placas de 96 cavidades en bolsas para cultivo anaeróbico (Merck) hasta el momento de la recolección. Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos en el momento indicado. lOOµl del reactivo de Caspasa 3/7-GloTM (Promega) altamente sensible se agregaron directamente a las células en placas de 96 cavidades y se incubaron durante 1 hora como mínimo antes de registrar la luminiscencia (actividad de luciferasa) en el instrumento Luminoskan Ascent de Thermo Labsystems después de 1 período adicional 1 minuto. La actividad de luciferasa se midió como Unidades de Luz Relativa por segundos (RLU/s) . Los datos se procesaron en el software AFCENT 2.4.2. y las gráficas del número de inducciones con relación a la imitación se extrajeron en excel. Las células transfectadas incubadas con el inhibidor de caspasa 3/7, que bloquean la actividad de caspasa activa 3/7 se utilizaron para mostrar la especificidad de la respuesta apoptótica. Además, se indujo que las células de Staurosporina, camptotecina o taxol sirvieran como control positivo. (Véanse la Figura 3A y la Figura 3B.) Análisis de ci tometría de flujo con Annexina V-FITC Células HeLa 1 x 106 se sembraron en matraces T75 un día antes de la transfección. En el día de la transfección, las células se lavaron una vez en OptiMEM a 37°C seguido por la adición de 7 ml de OptiMEM que contenía 2.5µg/ml de Lipofectamina2000 (In vitrogen) . Las células se incubaron durante 7 minutos antes de agregar 1700µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM a una concentración final de 1-25nM. Las células transfectadas de imitación sirvieron como control. Después de 4 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se agregaron 10 ml del medio de cultivo. Después del tratamiento con el oligonucleótido, las células se dejaron recuperar durante 24-72 horas antes de la recolección mediante raspado y se lavaron dos veces en PBS. 2 x 105 células se incubaron con 5µl de Annexina V-FITC y lOµl de yoduro de propidio (PI-10 mg/ml) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La incubación de células transfectadas con Annexina V recombinante purificada (lOµg) antes de agregar Annexina V FITC se utilizaron para demostrar la especificidad y selectividad de la tinción. Además, las células HeLa inducidas con TRAIL (Apo2L) (0.5µg/ml) se utilizaron como control positivo. 0.6 x 106 células U373 se sembraron en matraces T75 un día antes de la transfección. En el día de la transfección, las células se lavaron una vez en OptiMEM a 37°C seguido por la adición de 7 ml de OptiMEM que contenía 2.5µg/ml de Lipofectamina2000 (In vitrogen) . Las células se incubaron durante 7 minutos antes de agregar 1700µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM a una concentración final de 1-25 nM. Las células transfectadas de imitación sirvieron como control. Después de 6 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se agregaron 10 ml del medio de cultivo. Después del tratamiento con oligonucleótidos, las células se dejaron recuperar durante 24-48 horas antes de que se recolectaran mediante raspado y se lavaron dos veces en PBS. 2 x 105 células se incubaron con 5µl de Annexina V-FITC y lOµl de yoduro de propidio (Pl- 10 mg/ml) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La incubación de células transfectadas con Annexina V recombinante purificada (lOµg) antes de agregar Annexina V-FITC se utilizaron para demostrar la especificidad y selectividad de la tinción. Además, las células U373 inducidas con Staurosporina (0.2µM) se utilizaron como control positivo. (Véanse las Figuras 4A y 4B.) Ejemplo 12: Inhibición de la proliferación mediante los oligonucleótidos de LNA Las células se trataron de acuerdo con el ejemplo 11.

Medición de la proliferación de células viables (análisis de MTS) Células U373 se sembraron a una densidad de 7000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades clara (Scientific Orange no. 1472030100) en DMEM el día antes de la transfección. Al siguiente día, las células se lavaron una vez en OptiMEM precalentado seguido por la adición de 72µl de OptiMEM que contenía 2.5µg/ml de Lipofectamina2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 minutos antes de agregar 18µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La concentración final de oligonucleótidos varió de 5 nM a 100 nM. Después de 6 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se agregaron lOOµl de suero que contenía DMEM. Placas de 96 cavidades similares con células U373 tratadas se cultivaron bajo normoxia o bajo Hipoxia/anoxia al colocar las placas de 96 cavidades en bolsas para cultivo anaeróbico (Merck) hasta el momento de la recolección. Las células viables se midieron en los momentos indicados al agregar 20µl del compuesto de tetrazolio [3- (4 , 5-dimetil-2 -il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H- tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento electrónico (etosulfato de fenacina; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) . Las células viables se midieron a 490 nM y 650 nM en un Powerwave (Biotek Instruments) . La inhibición del índice de crecimiento ?OD (490-650 nm) /h se gráfico contra la concentración de oligonucleótidos de LNA con relación a la imitación, que se ajustó a 100%. (Véanse la Figura 5A y la Figura 5B) .

Ejemplo 13: Captación in vi vo y sub-regulación blanco de los oligonucleótidos de LNA Ratones peludos se trataron ya sea diario o dos veces a la semana (5 veces) durante un periodo de 14 días con inyección i.p con solución salina o la SEQ ID NO. 1 y diferentes versiones tratadas con tiol de la misma. La SEQ ID NO . 5 se trató parcialmente con tiol (en el intervalo) mientras que la SEQ ID NO. 6 tuvo una estructura de fosfodiéster. Los ratones se trataron con una dosis total de 10 mg/kg/14 días, 50 mg/kg/14 días, o 250 días mg/kg/14 días administradas ya sea diario o dos veces a la semana.

Purificación de ARN y síntesis de ADNc a partir del tej ido Se homogeneizaron aproximadamente 10 mg de tejido en 400µl de tampón RTL (Qiagen) suplementado con mercaptoetanol al 1%. El ARN total se aisló utilizando el mini equipo RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La primera síntesis de filamentos se llevó a cabo utilizando decámeros aleatorios y M-MLV-Transcriptasa Inversa (esencialmente como se describe por el fabricante (Ambion) ) . Para cada muestra, 0.25µg de ARN total se ajustó a 10. dµl en H20. Se agregaron 2µl de decámeros y 2µl de la mezcla dNTP (2.5 mM cada uno) . Las muestras se calentaron a 70°C durante 3 min. y se enfriaron inmediatamente en agua helada y se agregaron 3.25µl de una mezcla que contenía (2µl de tampón lOx RT; lµl de M-MLV Transcriptasa Inversa; 0.25µl del inhibidor de ARNasa) . ADNc se sintetizó a 42°C durante 60 minutos seguido por un paso de inactivación mediante calentamiento a 95°C durante 10 minutos y por último se enfrió a 4°C.

Análisis PCR en Tiempo Real Cuantitativo Para determinar el nivel relativo de ARNm del HIFla de ratón en muestras tratadas y sin tratar, el ADNc generado se utilizó en al análisis de PCR cuantitativa utilizando un iCycler de BioRad. A 8µl de ADNc diluido cinco veces, se agregaron 52µl de una mezcla que contenía 29.5µl de Platinum qPCR Supermix-UDG (in-vitrogen) , 1030 nM de cada cebador, 0.57 X SYBR Green (soluciones de ensayo moleculares) y Fluoresceína de 11.4 nM (soluciones de ensayo moleculares) . Se utilizaron duplicados de 25µl para Q-PCR: 50°C durante 120 seg, 95°C durante 120 seg. y 40 ciclos [95°C durante 30 seg. y 60°C durante 60 seg.] . La expresión de ARNm del HIFla se normalizó a ß-actina de ratón y/o ARNm de Gapdh que se cuantificó de manera similar utilizando Q-PCR. mHIFla: 5 ' -TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3 ' (SEQ ID NO. 30) y 5' -GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3' (SEQ ID NO . 31) mß-actina: 5 ' -CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3 ' (SEQ ID NO. 32) y 5' -GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3' (SEQ ID NO . 33) mVEGF: 5' - CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC- 3 ' (SEQ ID NO. 34) y 5' -GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3' (SEQ ID NO . 35) mGAPDH: 5 ' -AGCCTCGTCCCGTAGACAAAAT- 3 ' (SEQ ID NO. 38) y 5' -GTTGATGGCAACAATCTCCACTTT-3' (SEQ ID NO . 39) mBcl-2: directo: 5 ' -gccctgtggatgactgagta- 3 ' (SEQ ID NO. 36) e inverso: 5 ' -cagccaggagaaatcaaacag-3 ' (SEQ ID NO. 37) 2 diluciones dobles de ADNc sintetizado a partir de fibroblastos de ratón sin tratar (células Ltk) (diluido 5 veces y que expresa tanto HIFl como ß-actina) se utilizaron para preparar curvas estándar para los análisis. Las cantidades relativas de ARNm del HIFlc- se determinaron a partir del ciclo Umbral calculado utilizando el software iCycler iQ Real Time Detection System.

Extracción del oligonucleótido de LNA a partir de te ido Aproximadamente 100 mg de tejido se homogeneizaron mecánicamente en 500µl de tampón para extracción (0.5% de Igepal CA-630, Tris 25 M pH 8.0, EDTA 25 mM, NaCl 100 mM que contenía 1 mg/ml de ARNsa A) y se incubó durante la noche a 37°C. 500 ml se descartaron con el oligonucleótido de referencia y se extrajeron al agregar 1 ml de fenol-isoamil-cloroformo (25:1:24 (v/v/v)). La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo nuevamente. Si fuera necesario el extracto se liofilizó.

Análisis mediante HPLC de IEX de los oligonucleótidos de LNA extraídos Un volumen para muestra de 50 uL se separó sobre una columna ADNPac PA-100 (2x250 mM, Dionex) equipada de una columna protectora ADNPac PA-100 (2x50 mM, Dionex) . Las columnas se calentaron a 40°C. El caudal fue de 0.25 mL/min. y una detección de longitud de onda de 260 nM . Un gradiente de las fases móviles A: TRIS (20 mM) , EDTA (1 mM) y perclorato de sodio (10 mM) pH : 7.6, B: TRIS (20 mM) , EDTA (1 mM) y perclorato de sodio (ÍM) pH : 7.6, (0-13 min., A:20%, B:20%; 14-18 min., A:40%, B:60%; 22-28 min., A 0%, B: 100%; 33-38 min., A: 80%, B: 20%). La Figura 6A y la Figura 6B muestran la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) más la sub-regulación blanco (% de inhibición de la expresión de ARNm del HIF-la correlacionada con la expresión de ß-actina con relación a ratones tratados con solución salina después de la administración i.p. de la SEQ ID NO. 1 ya sea diario o dos veces a la semana durante 14 días (como se describió anteriormente) ) .

La Figura 6C muestra la sub-regulación endógena blanco in vivo en riñon, administrada diariamente con inyecciones ip en ratones peludos durante regímenes de 14 días de la SEQ ID NO. 1. La Figura 7A muestra que la SEQ ID NO . 1 es un inhibidor potente en el hígado medida mediante Q-PCR sobre la expresión del HIF-la en administración diaria . La Figura 7B muestra que la SEQ ID NO . 1 también es un inhibidor potente en el hígado medida mediante Q-PCR sobre la expresión del HIF-la en administración dos veces en una semana. La Figura 7C muestra que la SEQ ID NO . 1 es un inhibidor potente en el riñon medida mediante Q-PCR sobre la expresión del HIF-la en administración diaria .

Ejemplo 14: Eficacia in vi vo de la SEQ ID NO. 1 en ratones que portan tumores con el xenoinjerto U373 El efecto del tratamiento con oligonucleótidos sobre el crecimiento de xenoinjertos en tumores en ratones desnudos se puede medir utilizando diferentes líneas celulares tumorales. Los ejemplos de estas líneas celulares son líneas de células tumorales humanas U87 (glioblastoma), U373 (glioblastoma) , 15PC3 (cáncer prostático) , PC3 (cáncer prostático) , DU145 (cáncer prostático) , LNCaP (cáncer prostático y línea celular tumoral murina B16 (melanoma) .

Tratamiento de xenoinjertos subcutáneos tumorales en ratones desnudos utilizando los oligonucleótidos de LNA . Se implantaron subcutáneamente células tumorales y luego se subcultivaron en serie mediante tres trasplantes consecutivos. Los fragmentos del tumor de 1 mm se implantaron subcutáneamente con una aguja Krocar en ratones desnudos ?MRI . Alternativamente, se suspendieron células cancerígenas típicamente células 10E6 a 10E7 en 300µl de matrigel (BD Bioscience) , se inyectaron subcutáneamente en los flancos de ?MR1 : ratones desnudos . Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales de 5 mg/kg/día. El tratamiento individual de los ratones se inició cuando el volumen tumoral alcanzó 50 mm3. El tratamiento con PBS se inició cuando el volumen tumoral promedio del grupo control (tratado con solución salina) alcanzó 50 mm3. La experimento se terminó cuando los tumores de cualquier grupo alcanzaron dimensiones máximas permitidas. Las dimensiones tumorales de todos los ratones se midieron diariamente mediante mediciones con calibrador. El efecto del tratamiento se midió como la dimensión del tumor y la velocidad de crecimiento del tumor. En otro estudio utilizando la SEQ ID NO. 1, porciones tumorales vitales provenientes de ratones donadores U373 se trasplantaron sobre el tejido grasoso de los ovarios (día 0) de ratones desnudos. En el día cuatro y nueve luego del trasplante los ratones se trataron con el oligonucleótido de LNA a 50 mg/kg (i.p) . Los ratones se sacrificaron 2 días después de la última dosificación (día 11) y se llevó a cabo el peso del tumor más la tinción de los tumores con CD-31 ab (véanse las Figuras 8A y 8C) . Las Figuras 8B y 8C muestran la densidad capilar en tumores U373 con xenoinjerto tratado con la SEQ ID NO. 1. La Figura 10D muestra la expresión de ARNm del HIF-la en tumores U373 medida mediante QPCR. La SEQ ID NO. 1 se dosificó a 50 mg/kg dos veces durante una semana en ratones con el xenoinjerto U373 implantado en los ovarios. 2 días después de la última dosificación, los animales se sacrificaron. La densidad capilar se calculó después de la tinción con CD31 y se relacionó con el área total. Se encontró una diferencia estadística significativa (P=0.005) entre el grupo con solución salina y los ratones se trataron con un control mezclado (SEQ ID NO. 12) .

Ejemplo 15: Vida media del tejido y precipitación blanco en hígado y riñon de la SEQ ID NO. 1 60 ratones hembra NMRl, (ap. 25g) se dividieron en grupos de 5 y se dosificaron 30mg/kg de la SEQ ID NO. 1, i.p. (10 mL/kg 2.5 mg/ml) en el día 0, 3, 7, 10 y 14. Los grupos se retiraron en el día 14. Los grupos control se dosificaron con 0.9% de solución salina. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en ARN más tarde. La Figura 11 muestra la captación in vi vo (en µg por gramo) más la sub-regulación blanco (% de inhibición de la expresión de ARNm del HIF-la y VEGF correlacionado con la expresión de la ß-actina) de ratones después de 5 dosificaciones i.p. de la SEQ ID NO. 1 30mg/kg.

Ejemplo 16: Duración de la acción y captación de los oligonucleótidos de LNA in vi vo Duración de la acción: 20 ratones hembra, Balb/cA-nu, (ap. 25g) PC3 , línea celular de cáncer prostático (ECACC#90112714) se dividieron en grupos de 5 y se dosificaron con 25 mg/kg de la SEQ ID NO. 7, i.p. (10 mL/kg 2.5 mg/ml) diario del día 7 hasta el día 13. Los grupos se tomaron en los días 1 y 5 después de la dosificación. Los grupos control se dosificaron con 0.9% de solución salina. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en ARN más tarde. La Figura 10A muestra la duración de acción de la expresión de ARNm 1 y 5 días después del tratamiento. Captación de oligonucleótidos de LNA: Después de la fijación con formalina, los tejidos se incorporaron con parafina. Los tejidos se colocaron en solución Holt (30 g de sacarosa, 1 g de goma arábiga, 15mg de timol, agua destilada en 100 ml) durante la noche y se congeló. Criosecciones en 4 my's se montaron sobre cristal revestido y se colocaron en solución de DAPI. El fluorocromo se visualizó en microscopia de flourescencia . La Figura 10B muestra los resultados histológicos del tejido proveniente del hígado, riñon y tumor son de ratones tratados con una versión marcada con fam SEQ ID NO. 1 a 25 mg/kg/día durante siete días y se sacrificaron a los 5 días después del último tratamiento. La representación de la piel es de ratones tratados de la misma manera, sin embargo, se sacrificaron el día después del último tratamiento y se sobreexpusieron con el fin de observar la débil tinción de las células básales de la piel (la línea azul inferior) . Estos datos sugieren lo siguiente: Hígado: la tinción en hepatocitos se ubica principalmente en el citoplasma Riñon: la tinción muy intensa de túbulos próximos y menos tinción de los túbulos distales. Tumor: se tiñeron células endoteliales, macrófagos (células de ratón) . Piel: una tinción intensa de la dermis (células endoteliales y macrófagos) y en el citoplasma de la capa basal de la epidermis.

Ejemplo 17: Captación y eficacia del oligonucleótidos de LNA in vi vo Al día se agiraron células 0.3xl0"6 (PC3 y HT29) con 300µl de matrixgel y se implantaron en ratones hembra, Balb/cA-nu, (ap. 25g) . En el día 7, 10, 13, 17 los ratones se trataron mediante inyecciones intraperitoneales de 5 mg/kg/día ya sea con solución salina, una versión marcada con fam de la SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 7) o una versión marcada con fam de la SEQ ID NO. 8 (SEQ ID NO. 20) . Tres días (día 20) o 10 días (día 27) después de la última dosificación, los animales se sacrificaron. El grupo control de solución salina se dosificó con 0.9% de solución salina. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en ARN más tarde hasta la medición del contenido del oligonucleótido de LNA mediante el análisis de HPLC o el análisis de la sub-regulación de ARNm del HIF-la, (véanse las Figuras 10C-E) . Visualización de la captación del oligonucleótido de LNA: Después de la fijación con formalina, los tejidos se incorporaron con parafina. El tejido se colocó en solución de Holt (30 g de sacarosa, lg de goma arábiga 15 mg de timol, agua destilada como 100 ml) durante la noche y se congeló. Criosecciones a 4 my's se montaron sobre cristal revestido y se colocaron en solución DAPI . El fluorocromo se visualizó en microscopia por fluorescencia (los datos que demuestran la misma biodistribución que en la Figura lOB-datos no mostrados) .

Ejemplo 18: Estudio de la especificidad de los oligonucleótidos de LNA in vivo del HIF-la y VEGF Estudio de malapareamiento : 15 ratones hembra NMRl, (ap. 25g) se dividieron en grupos de 5 y se dosificaron con 30 mg/kg de la SEQ ID NO. 1 o la SEQ ID NO. 9 i.p. (10 mL/kg, 3.0 mg/ml) durante 30 segundos en el día 0, 3, 7, 10, 14. Los grupos control se dosificaron con 0.9% de solución salina. Los grupos se extrajeron 3-4 horas después de la última inyección. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en ARN más tarde . La Figura 11 muestra la sub-regulación blanco endógena in vi vo en hígado de ARNm del HIF-la y de VEGF después de 5 dosis de 30 mg/kg cada 3er. día de la SEQ ID NO. 1 en comparación con un malapareamiento de la SEQ ID NO . 9 control.

Ejemplo 19: Potencia in vi vo de una 14 mer-versión de la SEQ ID NO. 1 Los ratones hembra de NMRl (0.025 kg) se trataron por inyecciones intra-peritoneales de 5 mg/kg/día con la SEQ ID NO. 1. Los animales con solución salina sirvieron como animales control y se dosificaron con 0.9% de solución salina. Cinco animales se sacrificaron 1 día o 10 días después de la dosificación. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en ARN más tarde hasta la medición de la expresión de ARNm del HIF-la mediante QPCR y se normalizaron a beta-actina como se describe en M&M.

Ejemplo 20: Preparación de cultivos en anillo aórtico tridimensional La angiogénesis se estudió al cultivar anillos de la aorta de ratón en geles tridimensionales de colágeno con algunas modificaciones del método reportado originalmente para la aorta de rata (Masson et al., 2002 Biol Preoced Online 4(1) p.24-31). Ratones peludos se trataron una vez i.v. con los oligonucleótidos de LNA a una dosificación que varía de (10 mg/kg a 50 mg/kg) . Tres días después de la dosificación las aortas torácicas se retiraron de los ratones, se sacrificaron mediante dislocación cervical y se transfirieron inmediatamente a un disco para cultivo que contenía Medio RPMl en hielo (Invitrogen) conteniendo suero fetal de becerro al 10%. El tejido fibroadiposo peri-aórtico se retiró cuidadosamente con pinzas finas para microdisección y tijeras para iridectomía prestando atención especial para no dañar la pared aórtica. Anillos aórticos de 1 milímetro de largo (aproximadamente 15 por aorta - un máximo de 1.5 cm de la aorta) se seccionaron y se enjuagaron a fondo en 3 lavados consecutivos de RPMl con FBS. Los explantes de forma anular de la aorta de ratón luego se incorporaron en 60µl de matrigel (BD biosciences -Matrixgel: 356234) en una cavidad de una placa de 96 cavidades. Después de la inserción de la aorta se agregaron 40µl adicionales de matrigel y se dejaron a 37°C durante 10 minutos hasta solidificar. Se agregaron a las cavidades lOOµl de EGM2 (Cambrix) con y sin los factores de crecimiento. Como un control, los anillos de la aorta se cubrieron adicionalmente con los medios EGM2 que contenían Ciplatina lOµM. El promedio se cambió cada segundo día.

Ejemplo 21: Estudio autorradiográfico cuantitativo corporal total en ratones después de una sola administración intravenosa de la SEQ ID NO. 1 marcada con 3H Nueve ratones hembra CS7B1/6J (8 semanas Taconic, DK) se les administraron 50 mg/kg de cada artículo de prueba intravenosamente en una vena de la cola 1.5 mCi/kg 3H-SEQ ID NO. 1. La 3H-SEQ ID NO. 1 tuvo una actividad específica de 155µCi/mL El volumen administrado a cada animal fue de 10 mL/kg de la formulación de prueba. Los ratones individuales se sacrificaron a los 5 minutos, 15 minutos, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 2 días, 4 días, 7 días y 18 días después de la administración de cada artículo de prueba. Para la autorradiografía corporal total, los ratones se anestesiaron con isoflurano, y luego se sumergieron inmediatamente en hexano enfriado con hielo seco a -80°C, ABR-SOP- 0130/04. Los animales muertos congelados se incorporaron en un gel de carboximetil celulosa acuosa (CMC) , congelada en etanol, enfriada con hielo seco (-80°C) y se dividieron sagitalmente para la autorradiografía corporal total, de acuerdo con el método estándar, ABR-SOP-0131/04. De cada animal, se cortaron secciones de 20µm a diferentes niveles con un criostato (Leica CM 3600) a una temperatura de aproximadamente -20°C. Las secciones obtenidas se sostuvieron en cinta (Minnesota Mining and Manufacturing Co . , No. 810) y se numeraron consecutivamente con tinta radioactiva. Después de liofilizarse a -20°C durante aproximadamente 24 horas, las secciones seleccionadas se cubrieron con una capa fina de polvo de talco y se colocaron en placas para formación de imágenes (Fuji, Japón) . Las secciones se seleccionaron para la formación de imágenes con fósforo que representen lo mejor posible los tejidos y órganos de interés.

Junto con un conjunto de estándares de calibración con 3H, las secciones se cubrieron con una capa fina de polvo de talco y se colocaron en placas para formación de imágenes. Debido a la baja energía de 3H, se utilizó polvo de talco en lugar de una hoja plástica para proteger la placa de la imagen. Las placas para formación de imágenes se expusieron durante 3-7 días a temperatura ambiente, encerradas en casetes a prueba de luz en una caja con blindaje de plomo para protegerlas de la radiación ambiental. Después de la exposición, las placas para formación de imágenes se exploraron a un tamaño de pixel de 50µM utilizando BAS 2500 (Fuji Film Svrige AB, Suecia) . Los tejidos y órganos de interés fueron se cuantificaron utilizando AÍDA, versión 2.43 (Raytest, Alemania) . Una solución de prueba estándar soluble en agua con radiactividad de 3H se mezcló con sangre entera y se utilizó para la producción de la escala de calibración. La serie estándar consistió de 10 diluciones de 65.44 a 0.30 nCi/mg. Para fines de cuantificación, se asumió que todos los tejidos tuvieron una densidad similar y las características de inactivación como las de la sangre entera. La densidad del tejido se fijó a 1 g/ml. El límite de cuantificación se definió como el valor promedio de concentración de ocho mediciones para el antecedente más tres veces el valor de desviación estándar de estas mediciones. Los diversos tejidos y órganos se identificaron ya sea sobre autorradiogramas o sobre secciones de tejido correspondientes. El término úvea utilizado en este estudio incluye el epitelio de pigmento retiniano que representa las estructuras que contienen melanina, los coroides y al esclerótica del ojo. (Véanse las figuras 14A y 14B.) Ejemplo 22: Transferencia Western de células HUVEC transfectadas con la SEQ ID NO. 1 Se cultivaron células endoteliales de la vena umbilical humana normal (HUVEC) en medio Cambrix-EGM2 , se transfectaron como se describe en el ejemplo utilizando la SEQ ID NO. 1 2 y 5 nM o la SEQ ID NO. 8 5 nM . Después de la transfección, las células se expusieron a hipoxia (oxígeno al 1%) durante 16 horas. En la recolección, las células se lavaron en PBS y se lisaron en una solución tampón de lisis que contuvo SDS (como se describe en el ejemplo) . 50µg se cargaron a geles de Tris-Acetato y se ejecutaron a 150 V durante 1 hora. La transferencia Western se llevó a cabo como se describe en el ejemplo y la transferencia se incubó en HIF-la anti-humano (1:500) antes de la visualización mediante quimioluminiscencia mejorada. Se observa una sub-regulación potente mediante la SEQ ID NO. 1, mientras que la SEQ ID NO. 8 para control mezclado no sub-regula la expresión del HIF-la en células HUVEC.

Ejemplo 23: Análisis para la formación de estructuras in vi tro similares a tuboformación/capilares La inducción de tubulogénesis se llevó a cabo utilizando Matrigel (Venetsanakos E, Mirza A, Fanton C et al. La inducción de tubulogénesis en células endoteliales microvasculares humanas inmortalizadas con telomerasa mediante células de glioblastoma. Exp Cell Res 2002; 273:21-33) . Matrigel se descongeló sobre hielo para evitar la polimerización prematura; alícuotas de 50µl se colocaron en placas en cavidades individuales de placas para cultivo de tejido de 96 cavidades (Nunc) y se dejaron polimerizar a 37°C durante al menos 30 minutos. Las células HUVEC transfectadas se retiraron mediante tratamiento con tripsina 0.05%-EDTA. Las células se lavaron en medio que contenía suero, luego se volvieron a suspender a 2-X10E5 células/ml. En cada cavidad para cultivo se transfectaron 100-µl o la suspensión celular HUVEC sin transfectar en medio de cultivo con factores de crecimiento (VEGF, hFGF-B, R3-IGF-1, hEGF con FBS (2%)) y se agregó heparina (n=10). Se utilizaron como controles células de imitación-transfectadas sin tratar, así como también, HUVEC transfectadas con un oligo control mezclado (SEQ ID NO. 8) . La dosis del compuesto control o prueba se analizó en 6-10 cavidades individuales y los experimentos se realizaron al menos tres veces. Para la cuantificación de la formación tubular se fotografiaron las cavidades. (Véase La Figura 13.) Ejemplo 24: Análisis FACS de la captación en células de bazo, médula ósea y sangre periférica Ratones hembra de NMRl (0.025 kg) se trataron con una versión marcada con fam de la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 7 (50 mg/kg) o un número equivalente de moléculas de la Fam amidita (a 3 mg/kg) o 0.9% de solución salina. Las células se sacrificaron [sic] 1 hora después de la inyección y las células provenientes del bazo, se recolectó sangre periférica (1 ml para la cual se agregó 1 ml de PBS que contenía azida de sodio al 0.1% + 50 ml de sulfato de heparina, colocados en hielo) o la médula ósea.

Bazo Colocar el bazo en un tamiz metálico, y mojar con lml de RIO (medio para cultivo tejidos RIO que contiene FCS al 10%) conteniendo azida. Empujar el tejido a través del tamiz y limpiar con chorro de agua con un total de 4ml de RIO + Azida. Retirar 0.5 ml de suspensión de tejido y desechar el resto. Los glóbulos rojos se lisaron en la suspensión al agregar 50 ml de mezcla tampón para lisis de glóbulos rojos y dejar a RT durante 10 min. Centrifugar a 2000 RPM 10 minutos. Si es necesario retirar los glóbulos rojos residuales y repetir este proceso. Contar y bloquear las células . Las células sometidas a centrifugación se dejaron asentar y se volvieron a suspender en 1.0 ml de solución tampón con FACS que contenía azida. Asumir números celulares 5xlOe células por bazo para bloqueo y agregar 5µl de CD16/CD32 murino por millón de células (se agregan 25µl de bloqueo) .

Sangre periférica Los glóbulos rojos se lisaron al agregar 50 ml de solución para lisis de glóbulos rojos. Las células se sometieron a centrifugación y el proceso se repitió si es necesario. Las células se lavaron una vez con PBS, se suspendieron nuevamente y se contaron. La unión de anticuerpos no específicos se bloqueó al agregar CD16/CD32 murino al índice de 5µl por millón de células. Dejar a RT durante 10 minutos, luego proceder a la tinción del linaje.

Médula ósea Cortar el hueso tan cerca a cada extremo como sea posible utilizando tijeras estériles. Extraer hasta lml de PBS estéril en una jeringa de lml ajustada con una aguja 25G. Insertar la aguja en un extremo del hueso -usualmente más fácil en la rodilla- y hacer fluir el PBS a través del hueso. Repetir hasta que el hueso se aclare. Extraer la médula ósea en la aguja varias veces hasta romper la médula. Si se afecta el número de glóbulos rojos se puede utilizar como anteriormente un paso de lisis. Contar las células y bloquear como anteriormente. Colocar 150,000 células en un tubo eppendorf estéril sobre hielo para los cultivos de médula ósea.

Tinciones FACS Se llevaron a cabo tinciones de linaj e utilizando marcadores específ icos . Según se describe : Tinciones 1. CD4 APC, CD8 PE FITC, 7AAD Linfocitos T 2. Gr-1 PE, f4/80 APC neutrófilos macrófagos 3. Gr-1 PE, Mac- IAPC mielo-monocíticos 4. CD34 PE linaje APC hemocitoblastos 5. B220 APC, CD19 PE linfocitos B 6. CDllb PE, CDllc APC células dendriticas Isotipos 7. IgGl APC de hámster americano CDllc 8. IgG a APC de rata CD4 , B220 9. IgG2a PE de rata cd8a, CD19 , CD34 10. IgG2b PE de rata Gr-1 CDllb Las tinciones se llevaron a cabo en 96 cavidades y un número total de lOOµl de células bloqueadas se tiñeron con lOOµl de mezcla de tinción (ya sea controles de isotipo o marcadores específicos de linaje) . Las tinciones se llevaron a cabo sobre hielo y se dejaron durante 30 min. Las células se sometieron a centrifugación a 2000 RPM durante 2 min. El sobrenadante se aspiró y las células se lavaron con 200µl de tampón FACS y se repitió el paso de centrifugación. Lavar un total de tres veces. Al final, las células se volvieron a suspender en 200µl de solución tampón FACS y agregaron a un tubo FACS que ya contenía 200µl de FACS + 5µl de 7AAD . El análisis FACS se llevó a cabo utilizando Becton Dickinson FACS Calibur (véase la Figura 15) . Se muestra que las células endoteliales, granulocitos y linfocitos CD4+ y macrófagos de sangre periférica y células dendríticas y granulocitos de la médula ósea y granulocitos del bazo tuvieron tinción positiva para el mareaje FAM cinco días después de la administración de la SEQ ID NO. 7.

Ejemplo 25: Contenido del HIF-la y oligonucleótidos de la SEQ ID NO. 1 en tejidos de mono cynomolgus En el extudio de toxicidad principal en tejidos de monos cynomolgus incluyendo muestras de hígado y riñon, se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -70°C para análisis posteriores.

(Véanse las Figuras 16A y 16B) . Los monos se habían tratado con inyección intravenosa de 0 , 6, 10 y 40 mg/kg/ocasión dos veces a la semana durante cuatro semanas. En los grupos de animales que recibieron 0, 10 o 40 mg/kg/ocasión algunos animales se siguieron durante un periodo de recuperación de 4 señabas sin tratamiento. El ARN se extrajo de las muestras como se describe en el Ejemplo 13 y el contenido de ARNm del HIF-la se midió como se describe en el Ejemplo 8 (véase la figura 16A) . El contenido de oligonucleótidos se midió como se describirá más adelante (véase la Figura 16B) .

Preparación de la muestra: Extracción a partir de tejidos de hígado y riñon Productos químicos / reactivos : Proteinasa K (25.1 mg/ml): Sigma P4850. Fenol -cloroformo- isoamilo- alcohol (25 : 24 : 1 (v/v/v) , saturado con Tris lOmM, pH : 8.0, EDTA lmM: Sigma P2069 Igepal CA-630: Sigma, 18896 Tampón de extracción: 0.5% de Igepal CA-630, Tris 25 mM pH 8.0, EDTA 25 mM, NaCl 100 mM, pH 8.0 (ajustado con NaOH ÍN) 1 mg/ml de Proteinasa K en tampón de extracción: Preparado antes de cada extracción. Los tejidos (-100 mg) se extrajeron por peso (el tejido se mantuvo en hielo seco antes y después de pesarse) . Se agregaron 500µl de tampón de extracción que contenía proteinasa K (1 mg/ml) . El tejido se homogeneizó mecánicamente y el homogenado se incubó durante la noche a 37°C. Las muestras de referencia se prepararon al disolver la SEQ ID NO. 2 en tampón de extracción a la variación de concentración relevante. Exactamente 100 mg de tejido de hígado de animales sin tratar se pesaron (mantenido en hielo seco antes y después de pesarse) . El tampón de extracción (con la proteinasa K, 1 mg/ml) que contenía el material de referencia se agregó a las muestras de tejido a un volumen total de 0.5 ml . El tejido se homogeneizó mecánicamente y se incubó durante la noche a 37 °C. La señal de detección de la SEQ ID NO. 2 proveniente de estas muestras se utilizó para preparar una curva estándar que cubre las concentraciones más bajas y las más altas encontradas en los animales tratados. Las muestras de tejido se transfirieron a microtubos de 2 ml con tapas de rosca. Se agregó 1 ml de fenol-cloroformo-isoamil-alcohol (25:24:1 (v/v/v) ) después de agitar vigorosamente durante 5 min. La separación de fases se alcanzó mediante centrifugación a 4000 RPM durante 15 min. La fase acuosa (fase superior) se transfirió a un tubo nuevo (compatible con el evaporador) y se agregaron 500µl de Milli-Q-H20 a la fase orgánica (residual de la primera extracción) . Los tubos se agitaron vigorosamente nuevamente durante 5 minutos, después de la centrifugación a 4000 RPM durante 15 minutos (SAN039 en el cuarto 115) . Las fases acuosas (fases acuosas de 1. extracción y lavado) se reunieron y se evaporaron a sequedad (80°C, bajo nitrógeno) . El residuo se reconstituyó en 200µl de Milli'-Q-Agua después de la centrifugación a 4000 RPM durante 15 min. Las muestras se transfieren a viales para análisis mediante HPLC. Análisis mediante HPLC del oligonucleótido en en tejidos de hígado y riñon: Después de la extracción, la SEQ ID NO. 2 se analizó mediante HPLC de intercambio iónico: Columna: Dionex, ADN pac PA 100: 2 x 50 mm (protector) , 2 x 250 mm (analítico) Temperatura de la columna: 42 °C Vol. de inyección: 50µl Solvente para lavado: Milli-Q-H20 Solvente para purga: Milli-Q-H20 Detección: UV, 260 nm Solventes : Tampón A: EDTA 1 mM, TRIS-C1 20 mM, NaC104 10 mM, pH : 7.6 (NaOH 1 N) Tampón B: EDTA 1 mM, TRIS-C1 20 mM, NaC104 1 M, pH : 7.6 (NaOH 1 N) Ejemplo 26: . Duración de la acción del tratamiento in vivo utilizando la SEQ ID NO. 1 Ratones peludos se trataron con una inyección i.p. de 50mg/kg de la SEQ ID NO. 1. 5 animales en cada grupo se sacrificaron en los días 1 y 10 después de la dosificación (véase la Figura 9C) o en los días 1, 2, 3, 4, 5 y 10 después de la dosificación (véase la Figura 9B) . La expresión de ARNm del HIF-la se analizó mediante QPCR en tiempo real y se normalizó a GAPDH.

Ejemplo 27: Modelo de córnea con enfermedad ocular in vivo Ratones y anestesia. Ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad. Los ratones se anestesiaron utilizando una mezcla del ketamina y del xilazina (120 mg/kg de peso corporal y 20 mg/kg de peso corporal, respectivamente) . Modelo de ratón de neovascularización inflamatoria de córnea sutura-inducida. El modelo de ratón de neovascularización inflamatoria de córnea sutura-inducida (CNV) se utilizó como se describió anteriormente por Streilein JW, Bradley D, Sano Y, Sonoda Y. Immunosuppressive properties of tissues obtained from eyes with experimentally manipulated corneas. Invest . Ophthalmol . Vis . Sci . 1996;37:413-424. En resumen, una trefina corneal de 2 mm de diámetro se colocó suavemente en la córnea central de ratones anestesiados únicamente para marcar el área corneal central. Luego se colocaron tres suturas 11-0 intraestromalmente con dos incursiones estromales cada una que se extendía sobre 120° de la circunferencia córnea. El punto externo de la colocación de la sutura seleccionada fue en la parte intermedia entre el limbo y la línea contorneada mediante la trefina de 2 mm; el punto interno de la sutura estuvo a la misma distancia de la línea de la trefina de 2 mm para obtener respuestas angiogénicas estandardizadas. Las suturas luego se dejaron en su lugar durante 7 días. Los ratones se sacrificaron y se extirpó la córnea con el limbo, y se realizó inmunohistoquímica doble montada en placas. La presencia de células inflamatorias en córneas normales y su reclutamiento en las córneas 1 semana después de la colocación de la sutura se cuantificaron en hematoxilina y las secciones en serie teñidas con eosina de las córneas incorporadas en plástico fijadas en paraformaldehído al 10% después de la enucleación. Además, para una caracterización adicional de las células inflamatorias reclutadas para la córnea, se llevó a cabo una inmunohistoquímica doble sobre montajes totales córneos y las secciones congeladas con marcadores CDllb de macrófagos. Las secciones además se tiñeron para células endoteliales (recipientes por CD31) , marcadores para VEGF, y VEGFR' s.

Ejemplo 28: Análisis córneo microbolsa El análisis córneo microbolsa se llevó a cabo como describió anteriormente (Cao Y, et al. Vascular endothelial growth factor C induces angiogenesis in vivo. Proc . Nati . Acad . Sci . ü. S . A . 1998;95: 14389- 14394) . En resumen, las microbolsas córneas se crearon utilizando un cuchillo von Graefe modificado, y un microgránulo (0.4 x 0.4 mm) de sulfato de sacarosa aluminio recubierto con el polímero hidron que contenía 200 ng de VEGF-A164 (R&D) o 200 ng de bfgf recombinante (RDI, Flandes, New Jersey, USA) implantado en cada bolsa. El granulo se colocó 0.6-0.8 mM del limbo y del sitio se cubrió con ungüento antibiótico (eritromicina) y se dejó en el lugar durante 10 días ( n 5-10 ratones cada uno) . Las respuestas hemangiogénicas y linfangiogénicas se cuantificaron como se describió anteriormente utilizando inmunotinción doble con CD31/LYVE-1. El grado máximo de sangre contra el crecimiento de vasos linfáticos entre el limbo y el granulo subyacentes se calificó semicuantitativamente en cuatro categorías para ambos tipos de vasos: 0, ningún crecimiento; 1, crecimiento menor a 1/3 de la distancia del limbo-gránulo ; 2, crecimiento entre 1/3 y 2/3 de la distancia del limbo-gránulo; 3, recipiente hasta llegar al granulado.

Ejemplo 29: Modelo de psoriasis in vi vo Quimera in vivo de piel humana/ratón SCID Los xenoinjertos de piel humana se trasplantaron ortotópicamente sobre ratones SCID de 7 a 8 semanas de edad (Taconic, DK) siguiendo los procedimientos descritos anteriormente por Wrone-Smith T, Nickoloff BJ: Dermal injection of immunocytes induces psoriasis. J Clin Invest 1996, 98: 1878-1887. En resumen, los xenoinjertos de piel humana que medían 1.5 x 1.5 x 0.5 cm se suturaron en el flanco de ratones SCID con una sutura absorbible 5-0 Vicril Rapide (Ethicon, Somerville, NJ) y se cubrieron con vendajes Xeroform (Kendall Co . , Mansfield, MA) . Los vendajes se retiraron 1 semana después y los animales se mantuvieron libres de patógenos a lo largo del estudio. Los ratones se trataron con la SEQ ID NO. 7 dos veces en una semana a 50 mg/kg de una a tres semanas después del trasplante. Las quimeras de piel humana/ratón SCID se exterminaron después de 2-3 semanas del tratamiento y de cada xenoinjerto se obtuvieron biopsias mediante sacabocados de 4 mm (sacabocados para biopsia de Baker, Cummins Derm, Miami, FL) . Las biopsias se fijaron en formalina amortiguada neutra para la incorporación de parafina y/o montadas sobre goma de tragacanto (Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) , congeladas instantáneamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80°C.

Inmunotinción Secciones criostáticas de piel se tiñeron para un marcador relevante incluyendo células endoteiales (CD31/CD34) , macrófagos (cdllb) VEGF, VEGFR o HIF-la. Las secciones se contra- tiñeron con hematoxilina y eosina (como se describió anteriormente) . Todos los portaobjetos se examinaron y se fotografiaron.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un oligonucleótido de LNA que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de 5' - (Tx) G?G?CsasasgscsastsCsCsT?Gx(T) -3' (SEQ ID NO . 3) 5 ' - (Gx) T?T?agCstsgscscstst?CsT?T? (A) -3 ' (SEQ ID NO. 4) en donde las mayúsculas designan un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, las minúsculas designan un 2 -desoxinucleótido, lo subrayado designa ya sea un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA, o un 2-desoxinucleótido, el subdíndice "s" designa un enlace de fósforotioato entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y el subíndice "x" designa ya sea un enlace de fósforotioato o un enlace de fosforodiéster entre los análogos de nucleótidos contiguos/nucleótido de LNA, y en donde las unidades nucleotídicas entre paréntesis, y en donde la secuencia se extiende opcionalmente por hasta cinco unidades de 2-desoxihucleótido .
2. El oligonucleótido de LNA según la reivindicación 1, en donde la unidad nucleotídica entre paréntesis, (T_x) o (Gx) , respectivamente, está presente .
3. El oligonucleótido de LNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde una o ambas de las unidades nucleotídicas subrayadas designan un análogo del nucleótido beta-D-oxi-LNA.
4. El oligonucleótido de LNA según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el oligonucleótido de LNA consiste de 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 unidades nucleotídicas seleccionadas de los 2 -desoxinucleótidos y los análogos del nucleótido beta-D-oxi-LNA.
5. El oligonucleótido de LNA según la reivindicación 4, en donde el oligonucleótido de LNA consiste de 16 unidades nucleotídicas seleccionadas de los 2 -desoxinucleótidos y los análogos del nucleótido beta-D-oxi-LNA.
6. El oligonucleótido de LNA según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia se extiende por una unidad de 2-desoxinucleótido en el extremo 3' .
7. El oligonucleótido de LNA según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde todas las unidades nucleotídicas en la secuencia se enlazan mediante un grupo f ósf orotioato .
8. El oligonucleótido de LNA según la reivindicación 1, el cual se selecciona el grupo que consiste de 5' -TsGsGscsasasgsCsastscsCsTsGsTsa-3' (SEQ ID NO. 1) , 5' -TsGsGsCsasasgscsastsCsCsTsGsT-3 ' (SEQ ID NO. 15) , y 5' -GsGscsasasgscsastscscsTsGst-3 ' (SEQ ID NO. 16) .
9. El oligonucleótido de LNA según la reivindicación 8, el cual es 5' -TsG?Gscsasasgscsast?c?csTsG?Tsa-3' (SEQ ID NO. 1) .
10. El oligonucleótido de LNA según la reivindicación 1, el cual se selecciona del grupo que consiste de 5' -GsTsTsascstsgscscststscsT?TsAsc-3' (SEQ ID NO. 2) , 5' -GsTsTsascstsgscscststscsTsTsA-3 ' (SEQ ID NO. 17) , y 5' -TsTsascstsgsCscststscsTsTsa-3 ' (SEQ ID NO. 18) .
11. El oligonucleótido de LNA según la reivindicación 10, el cual es 5' -GsTsTsascstsg?cscststscsTsTsAsc-3' (SEQ ID NO. 2) .
12. Un conjugado que comprende un oligonucleótido de LNA según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y al menos una entidad sin nucleótido o sin polinucleótido unida covalentemente al oligonucleótido de LNA.
13. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable .
14. La composición farmacéutica según la reivindicación 13, que comprende un portador acuoso, el portador comprende una solución tampón para mantener el pH en la variación de 4.0-8.5 y tiene una resistencia iónica de 20-2000 mM .
15. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, la cual se adapta para administración intraocular.
16. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 que comprende además al menos un agente quimioterapéutico .
17. Un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 para utilizarse como un medicamento.
18. El uso de un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer.
19. El uso según la reivindicación 18, en donde el cáncer está en la forma de un tumor sólido.
20. El uso según la reivindicación 18, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer del cerebro, y cáncer de mama .
21. Un método para tratar el cáncer, el método comprende administrar un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-16 a un paciente que necesita del mismo .
22. El método según la reivindicación 21, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer del cerebro, y cáncer de mama .
23. El uso de un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de arterosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación, e inflamación de la piel.
24. El uso según la reivindicación 23, en donde la enfermedad se selecciona de la enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y artritis reumatoide .
25. Un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de arterosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación, e inflamación de la piel, el método comprende administrar un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-16 a un paciente que necesita del mismo .
26. El método según la reivindicación 25, en donde la enfermedad se selecciona de la enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y artritis reumatoide .
27. Un método para tratar un mamífero que padece o es susceptible a una enfermedad provocada por angiogénesis anormal, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12.
28. Un método para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-16.
29. Un método para inducir apoptosis celular que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-16.
30. Un método para prevenir la proliferación celular que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-16.
31. Un método para tratar una enfermedad angiogénica que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un conjugado como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-16, de tal forma que se inhiba la angiogénesis asociada con la enfermedad angiogénica.
32. El método según la reivindicación 31, en donde la enfermedad angiogénica se selecciona del grupo que consiste de retinopatía diabética, degeneración macular, y enfermedades inflamatorias.
33. El método según la reivindicación 32, en donde la enfermedad angiogénica es una enfermedad inflamatoria seleccionada de enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y artritis reumatoide.
34. El método según la reivindicación 32, en donde la enfermedad angiogénica es degeneración macular y retinopatía diabética.
35. Un equipo que comprende (a) un primer componente que contiene un oligonucleótido de LNA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o de un conjugado como se define en la reivindicación 12 en forma sólida, y (b) un segundo componente que contiene solución salina o una solución tampón adaptado para la reconstitución de los oligonucleótidos de LNA.