JP4825807B2 - HIF−1a発現阻害のための強力なLNAオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
本発明は、HIF−1aの発現調節のための組成物と方法を提供する。特に本発明は、HIF−1aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能なLNAオリゴヌクレオチドに関する。LNAオリゴヌクレオチドはHIF−1aの発現を調節することが示されており、その医薬的な製剤と癌疾患、炎症性疾患、および眼疾患の治療としての使用を開示する。
固形腫瘍は数ミリメートル以上に成長するために、血液供給を確立し、グルコース代謝を増強していなければならない。固形腫瘍がどのように低酸素を感知し、低酸素誘導性遺伝子の活性化と血液系を確立するために血管新生因子の分泌に反応するかは、癌生物学の中心を成している。多くの腫瘍は、悪性化、転移、放射線療法と化学療法への耐性に関与した低酸素微小環境を含んでいる。
本発明は、HIF−1aの発現調節のための組成物と方法を提供する。特に本発明は、二つ以上の特異的なモチーフがHIF−1aを標的としているLNAオリゴヌクレオチドに関する。これらのモチーフは、配列番号3と4として開示される。特に好ましいLNAオリゴヌクレオチドは、配列番号1と配列番号2である。本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、HIF−1αmRNAの発現とタンパク質レベルの強力な阻害剤である。
5’−(T x)GxGxcsasasgscsastscscsTxGx T−3’(配列番号3)
および
5’−(G x)TxTxascstsgscscststscsTxTx A−3’(配列番号4)
からなる群から選択される配列からなるLNAオリゴヌクレオチドを提供し、
ここで、大文字はβ−D−オキシ−LNAヌクレオチドアナログを示し、小文字は2−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−D−オキシ−LNAヌクレオチドアナログまたは2−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「s」は隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「x」は隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、(T x)、(T)、または(G x)、(A)はそれぞれ任意のユニットを表し、また、
ここで、配列は任意で2−デオキシヌクレオチド5ユニットまで延長される。
本発明は、特定のLNAオリゴヌクレオチド、すなわち、HIF−1aをコードする核酸分子の機能調節に用いる配列番号3と配列番号4の配列を含むLNAオリゴヌクレオチドを採用する。その調節は、最終的にHIF−1a産物の量の変化である。ある実施形態では、HIF−1aをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンスLNAオリゴヌクレオチドを提供することでこれは達成される。調節は、好ましくは生成される機能的なHIF−1aタンパク質の数の減少を引き起こすHIF−1aの発現阻害である。
より具体的には、本発明は
5’−(T x)GxGxCsasasgscsastscscsTxGx(T)−3’(配列番号3)
および
5’−(G x)TxTxascstsgscscststscsTxTx(A)−3’(配列番号4)
からなる群から選択される配列からなるLNAオリゴヌクレオチドを提供し、
ここで、大文字はβ−D−オキシ−LNAヌクレオチドアナログを示し、小文字は2−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−D−オキシ−LNAヌクレオチドアナログまたは2−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「s」は隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「x」は隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、(T x)、(T)、または(G x)、(A)はそれぞれ任意のユニットを表し、また、
ここで、配列は任意で2−デオキシヌクレオチド5ユニットまで延長される。
5’−TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa−3’(配列番号1)
5’−TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsT−3’(配列番号15)、および
5’−GsGscsasasgscsastscscsTsGst−3’(配列番号16)
からなる群から選択され、これらのなかでは、
5’−TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa−3’(配列番号1)
が現在のところ最も望ましい。
5’−GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc−3’(配列番号2)
5’−GsTsTsascstsgscscststscsTsTsA−3’(配列番号17)、および
5’−TsTsascstsgscscststscsTsTsa−3’(配列番号18)
からなる群から選択され、これらのなかでは、
5’−GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc−3’(配列番号2)
が現在のところ最も望ましい。
LNAヌクレオチドアナログ結合ブロック(β−D−オキシ−LNA)は、公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製可能である。例えば、国際公開第03/095467 A1号、D.S.Pedersen,C.Rosenbohm,T.Koch(2002)Preparation of LNA Phosphoramidites,Synthesis 6,802−808、および国際公開第2004/069991 A2号を参照。
LNAオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能な様々な塩が使用され得る。本明細書で使用される場合、その用語はLNAオリゴヌクレオチドの生物学的活性を保持し、最低限の望ましくない毒性効果を示す塩を指す。当該塩の限定されない実施例は、有機アミノ酸、および、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミ、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンで形成された、あるいはアンモニア、N,N−ジベンジルエチレン−ジアミン、D−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、またはエチレンジアミンから形成されるカチオンで形成される塩基添加塩、あるいは、例えば亜鉛タンニン酸などの組合せで形成され得る。
ある実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドはプロドラッグの形である場合がある。オリゴヌクレオチドは、陰性に荷電したイオンである。細胞膜の親油性のため、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の相当物と比較して低くなる。この極性の「障害物」は、プロドラッグ手法(例えば、Crooke,R.M.(1998)in Crooke,S.T.Antisense research and Application.Springer−Verlag,Berlin,Germany,vol.31,pp.103−140を参照)の利用によって回避可能である。この手法で、LNAオリゴヌクレオチドは投与した際に中性であるように保護された方法で調製される。これらの保護基はLNAオリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれた後に除去され得る方法で設計される。当該保護基の例は、S−アセチルチオエチル(SATE)またはS−ピバロイルチオエチル(t−ブチル−SATE)である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
本発明のさらなる局面は、少なくとも一つの非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分が共有的に前述のLNAオリゴヌクレオチドと結合している、と本明細書で定義されるLNAオリゴヌクレオチドを含む結合体に関する。
本発明の特に関心がある特徴は、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはアジュバントを含む薬学的組成物を対象にしている。薬学的組成物は、好ましくは注入、局所投与、または眼内投与に適切である(下記参照)。
本発明に従う薬学的組成物は任意でさらにアンチセンス化合物、化学療法剤、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達調節因子、キナーゼ阻害剤および/または免疫調節化合物を含むということを理解する必要がある。現在、LNAオリゴヌクレオチドと一つ以上の化学療法剤の組合せが特に関心を引くと考えられる。
本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の多くの治療上の応用に有用である。一般的に、本発明の治療方法は治療有効量のLNA修飾オリゴヌクレオチドのほ乳類、特にヒトへの投与を含む。
本明細書で使用される場合「調節」という用語は、遺伝子発現における増加(刺激)または減少(阻害)のどちらかを意味する。本発明では阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、mRNAが好ましい標的である。
薬学的組成物が液体である場合、LNAオリゴヌクレオチドの安定性を妥協する状況の対象になる危険があり、例えば凍結乾燥した原料として固形のLNAオリゴヌクレオチドを含む最終製品を製造し、当該固形状態で製品を保存するのが所望され得る。製品は投与前に、食塩水中または緩衝食塩水中で再構成され(例えば溶解されるかまたは懸濁される)、使用できる状態にされ得る。
(a)本明細書の上記に記載の、固形状態のLNAオリゴヌクレオチドまたは結合体を含む第一の構成要素、および
(b)当該LNAオリゴヌクレオチドの再構成(例えば、溶解または懸濁)に適した食塩水または緩衝液(例えば、緩衝食塩)を含む第二の構成要素、
を備えるキットも提供する。
(実施例1:モノマー合成)
LNAモノマーの基礎ユニットとその派生物は、以下の公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製された。例として、国際公開第03/095467号、およびD.S.Pedersen,C.Rosenbohm,T.Koch(2002)Preparation of LNA Phosphoramidites,Synthesis 6,802−808を参照。
オリゴヌクレオチドは、Expedite 8900/MOSS合成機(Multiple Oligonucleotide Synthesis System)でホスホルアミダイト手法を用いて1μmolまたは15μmolスケール合成した。より大規模な合成には、Aekta Oligo Pilotを用いた。合成の最後(DMT−on)に、アンモニア水で1〜2時間室温で処理してオリゴヌクレオチドを固形支持体から解離させ、さらに65℃で4時間脱保護を行った。オリゴヌクレオチドを逆相HPLC(RP−HPLC)で精製した。DMT基の除去後、オリゴヌクレオチドは、AE−HPLC、RP−HPLCおよびCGEの性質を持ち、分子量をさらにESI−MSで確認した。詳細は下記参照のこと。
(LNAスクシニルヘミエステルの調製)
5’−O−Dmt−3’−ヒドロキシ−LNAモノマー(500mg)、無水スクシニル(1.2等量)、およびDMAP(1.2等量)をDCM(35ml)中に溶解した。反応は、撹拌して室温で一晩行った。0.1MのNaH2PO4 pH5.5(2回)とブライン(1回)で抽出後、有機層を無水Na2SO4でさらに乾燥させ、濾過して蒸発させた。ヘミエステル誘導体が95%の収量で得られ、さらなる精製なしに使用した。
上記で調製されたヘミエステル誘導体(90μmol)を最低量のDMF中に溶解し、DIEA、およびpyBOP(90μmol)を添加して1分間混合した。この前活性化混合液を手動合成機中でLCAA−CPG(500A、80〜120メッシュサイズ、300mg)と混合し、撹拌した。室温で1.5時間後、支持体を濾過し、(残留物を)DMF、DCMおよびメタノールで洗浄した。乾燥後、ローディングは57μmol/gであると測定された(Tom Brown,Dorcas J.S.Brown.Modern mechine−aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis.In:F.Eckstein編Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach.Oxford:IRL press,1991:13−14を参照)。
ホスホルアミダイトのカップリング(A(bz)、G(ibu)、5−メチル−C(bz))またはT−β−シアノエチル−ホスホルアミダイト)を、0.1Mの5’−O−DMTで保護されたアミダイトのアセトニトリル溶液と活性剤としてDCI(4,5−dicyanoimidazole)のアセトニトリル溶液(0.25M)で行う。チオール化は、塩化キサンタン(アセトニトリル:ピリジン10%の0.01M溶液)を用いることで行われる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に一般的に用いられるものである。供給業者が提供するプロトコルを都合良く至適化した。
カラム:Xterra RP18
流速:3ml/分
緩衝液:0.1M酢酸アンモニウム、pH8およびアセトニトリル。
DMT:ジメトキシトリチル
DCI:4,5−ジシアノイミダゾール
DMAP:4−ジメチルアミノピリジン
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
THF:テトラヒドロフラン
DIEA:N,N−ジイソプロピルエチルアミン
PyBOP:ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェイト
Bz:ベンゾイル
Ibu:イソブチリル。
3μMの配列番号1の10mMリン酸ナトリウム/100mMのNaCl/0.1nMのEDTA溶液、pH7.0を、配列番号1と相補的なDNA/RNA 3μMの10mMリン酸ナトリウム/100mMのNaCl/0.1nMのEDTA溶液、pH7.0を、90℃、1分で混合し、室温まで冷却させる。二本鎖のTmは、1℃/分の25から95℃までの温度上昇で測定した。配列番号1のTmを下の表2に示す。
LNAオリゴヌクレオチドの安定性をヒトまたはラットの血漿(マウス、サル、またはイヌの血漿である可能性もある)で試験した。45μlの血漿に5μlのLNAオリゴヌクレオチドを加える(終濃度20μM)。LNAオリゴヌクレオチドを血漿中で0から96時間の範囲で37℃でインキュベートする(血漿は、ヌクレアーゼ活性を96時間までテストしてヌクレアーゼ開裂パターンに違いがないことが示された)。指示された時間に、試料を液体窒素中で急速凍結した。血漿中の2μl(40pmol相当)のLNAオリゴヌクレオチドを水15μlと3μlの6xloading dye(Invitrogen)を加えることで希釈した。マーカーとして、10bpラダー(Invitrogen 10821−015)を用いる。1μlのラダーに対して1μlの6xloading dyeと4μlの水を添加する。試料を混合し、65℃で10分間加熱し、プレランゲル(16%アクリルアミド、7M尿素、1xTBE、50ワットで1時間プレラン)にローディングし、50〜60ワットで2時間半泳動する。その後、ゲルを1xTBE中の1xSyBR gold(Molecular Probes)で15分間染色する。バンドは、BioRadのホスホイメージャーで可視化した。(ラット血漿は図1Aを、ヒトとラット血漿は図1Bを参照)。
標的核酸の発現に対するLNAオリゴヌクレオチド作用は、標的核酸が測定可能な濃度で存在するなら、様々な任意の細胞タイプで試験可能である。標的は当該核酸をコードする各線の内因的、あるいは一時的または安定な形質移入で発現させることができる。
15PC3:ヒト前立腺癌細胞株15PC3は、オランダ、AMC、Neurozintuigen研究室のDr.F.Baasのご好意で提供され、10%ウシ胎仔血清(FBS)、Glutamax I、ゲンタマイシンを加えたDMEM(Sigma)培地中で培養した。
PC3:ヒト前立腺癌細胞株PC3をATCCから購入し、グルタミン(Gibco)と10%FBS、ゲンタマイシンを加えたF12 Coonの培地で培養した。
518A2:ヒトメラノーマ癌細胞株518A2を、ウィーン大学の臨床薬学部、分子薬学、実験腫瘍学部門のDr.B.Jansenのご好意で提供され、10%ウシ胎仔血清(FBS)、Glutamax I、ゲンタマイシンを加えたDMEM(Sigma)培地中で培養した。
U373:膠芽腫細胞U373を、10%ウシ胎仔血清とGlutamax I、NEAA、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシンを含むEMEM(Sigma)培地中で、37℃、95%の湿度、5%CO2で培養した。
HeLa:子宮頸癌細胞株Helaを、10%ウシ胎仔血清とゲンタマイシンを含むMEM(Sigma)培地中で、37℃、95%の湿度、5%CO2で培養した。
MPC−11:マウス多発性骨髄腫細胞株MPC−11をATCCより購入し、4mMのGlutamaxと10%ウマ血清を加えたDMEM培地で維持した。
DU−145:ヒト前立腺癌細胞株DU−145をATCCより購入し、Glutamaxと10%FBSを加えたRPMI培地で維持した。
RCC−4+/−VHL:VHLを発現するプラスミドまたは空のプラスミドで安定に形質移入したヒト腎臓癌細胞株RCC4をECACCから購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
786−0:ヒト腎臓癌細胞株786−0をATCCより購入し、製造会社の取扱説明に従って細胞を維持した。
HUVEC:ヒト臍静脈内皮細胞株HUVECをCamcrexから購入し、EGM−2培地で維持した。
K562:ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562をECACCより購入し、Glutamaxと10%FBSを加えたRPMI培地で、維持した。
U87MG:ヒトグリア芽細胞腫細胞株U87MGをATCCより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
B16:マウス黒色腫細胞株B16はATCCより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
LNCap:ヒト前立腺癌細胞株LNCapはATCCより購入し、Glutamaxと10%FBSを加えたRPMI培地で維持した。
細胞培養と形質移入:U373またはHeLa細胞を12穴プレートに、10%FBSとGlutamax I、ゲンタマイシンを添加したD培地中に37℃(5%のCO2)で播種した。細胞が60〜70%コンフルエントの時に、Lipofectamine 2000(2.5〜5μg/ml)を用いて様々な濃度のオリゴヌクレオチド(0.2〜100nM)で二組みで形質移入した。形質移入は、基本的にDaan et al.(1994,JBC 269:16416−16424)に記載のとおりに行った。つまり、細胞をOptiMEM中のLipofectamineで10分間インキュベートし、ウェル当たり総量0.5mLの形質移入混合液にオリゴヌクレオチド添加した。4時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、正常酸素または低酸素のいずれかの間に37℃で約20時間(mRNA解析とタンパク質解析)増殖させた。
(全RNAの単離)
全RNAは、RNeasy mini kit(Qiagen、カタログno.74104)を用いるか、Trizol試薬(Life technologies、カタログno.15596)を用いて単離した。
一本鎖合成は、OmniScript Reverse Transcriptase kit またはM−MLV Reverse Transcriptase(基本的に、製造会社(Ambion)の記載どおり)のいずれかを用いて、製造会社の取扱説明(Qiagen)に従って行った。OmniScript Reverse Transcriptaseを使用する場合、各試料あたり0.5μgの全RNAを12μlに調節し、0.2μlのポリ(dT)12−18(0.5μg/μl)(Life Technologies)、2μlのdNTPミックス(各5mM)、2μlの10xRT緩衝液、0.5μlのRNAguardTM RNase Inhibitor(33unit/ml、Amersham)、および1μlのOmniScript Reverse Transcriptaseと混合し、次いで37℃で60分インキュベートし、93℃で5分間の加熱不活性化を行った。
HIF−1a発現のアンチセンス調節は、当該技術分野に周知の様々な方法でアッセイ可能である。例えば、HIF−1a mRNA濃度は、例えば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法(RPA)、またはリアルタイムPCRで定量可能である。リアルタイム定量PCRが現在好ましい。RNA解析は、細胞の全RNAまたはmRNAを対象に行うことができる。
mRNA濃度の定量は、iQ Multi−Color Real Time PCR Detection System(BioRAD)を用いたリアルタイム定量PCRで製造会社の取扱説明書に従って測定した。
アンチセンスプライマー:5’−GTCAGATCCACGACGGACACATT−3’(配列番号28)(アッセイでの終濃度、0.6μM)、
TaqManプローブ:5’FAM−GAAGCTCACTGGCATGGCATGGCCTTCCGTGTTC−TAMRA−3’(配列番号29)(アッセイでの終濃度、0.2μM)だった。
実施例6の記載どおりに行われた一本鎖合成のcDNAは、2〜20倍に希釈し、リアルタイム定量PCRで解析した。プライマーとプローブを2x Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG(カタログno.11730、Invitrogen)と混合し、3.3μlのcDNAに最終量25μlになるよう添加した。各試料を3つ組で解析した。対象のRNAを発現している細胞株から精製した材料で調製したcDNAの2倍希釈物のアッセイで、アッセイの標準曲線を作成した。鋳型を用いないコントロールではcDNAの代わりに滅菌水を用いた。PCRプログラム:50℃で2分、95℃で10分、次いで95℃で15秒を40サイクル、60℃で1分。
マウスHIF1α mRNAの相対レベルを決定するため、cDNAをBioRADのiCyclerを用いた定量PCR解析に用いた。
mHIF1a:5’−TGGGACTTTCTTTTACCATGC−3’(配列番号30)、および5’−GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG−3’(配列番号31)
mβ−アクチン:5’−CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA−3’(配列番号32)、および5’−GCTCAGGAGGAGCAATGATCT−3’(配列番号33)
mVEGF:5’−CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC−3’(配列番号34)、および5’−GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT−3’(配列番号35)
BCL−2:フォワード:5’−gccctgtggatgactgagta−3’(配列番号36)、およびリバース:5’−cagccaggagaaatcaaacag−3’(配列番号37)
無処理のマウス線維芽細胞(Ltk細胞)(5倍に希釈され、HIF1αとβ−アクチンの両方を発現している)から合成したcDNAの2倍希釈物を、アッセイのための標準曲線の作成に用いた。HIF1α mRNAの相対量は、iCycler iQ Real Time Detection Systemソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した。
形質移入した細胞におけるHIF−1a LNAオリゴヌクレオチドのHIF−1aタンパク質レベルに対するインビトロ作用をウェスタンブロットで測定した。
(実施例10:インビトロ解析:アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒトHIF−1a発現のアンチセンス阻害とその下流標的のVEGFAとMMP−2への作用)
LNAオリゴヌクレオチドは、U373細胞由来の培地中の下流標的VEGFAおよびMMP−2への作用もある。U373細胞はT25フラスコ中0.3×106細胞で(時間実験)またはT80フラスコ中0.6×106細胞で(48時間濃縮実験)播種した。U373細胞を10%FBS、Glutamax Iおよびゲンタマイシンを添加した増殖培地中で37℃(5%のCO2)に置く。播種の翌日、様々な濃度のオリゴヌクレオチド(0.2〜10nM)を用い、Lipofectamin 2000(2.5μg/ml)を用いて、二組または三つ組みで細胞にLNAオリゴヌクレオチドを形質移入した。形質移入は、基本的にDean et al.(1994,JBC 269:16416−16424)の記載どおりに行った。つまり、細胞をOptiMEM中のLipofectamineで10分間インキュベートし、次いでオリゴヌクレオチド添加した。4時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、酸素欠乏または低酸素のいずれかの間に37℃で約20時間(mRNA解析とタンパク質解析)増殖させた。示された時間に細胞の上清を回収した。プロテアーゼ阻害剤の添加を、−80℃での保存前に加えた。RD systemsのヒトVEGFA ELISA(カタログno.DVE−00)およびMMP−2 ELISA(カタログno.DMP−200)を製造会社に従って用いた。回収時間によって、上清を測定前に5〜50倍に希釈した。図12A−Eを参照。
(細胞培養)
膠芽細胞腫細胞株U373(ATCC)は、10%ウシ胎仔血清、Glutamax I、NEAA、ピルビン酸ナトリウム、およびゲンタマイシンを添加したMEM培地(Sigma)で、37℃、湿度95%、5%CO2で培養した。細胞が60〜70%コンフルエントに達した時、細胞をLipofectamine 2000(2.5μg/ml)を用いて形質移入した。
形質移入の前日に、96穴プレート(Nunc 136101)にウェルあたり7000細胞の密度でMEM完全培地中にU373細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたOptiMEMで1回洗浄し、次にLipofectamine 2000(Invitrogen)2.5μg/mlを含む72μlのOptiMEMを加えた。OptiMEMで希釈した18μlのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を7分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、0.2nMから100nMの範囲だった。処理6時間後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含む100μlのDMEMを加えた。処理済みのU373細胞の同様の96穴プレートを、回収時間までAnaerocultバッグ(Merck)中に96穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧/酸素欠乏下で培養した。プレートを示した時間に15分間室温に平衡化させた。100μlの高感度Caspase 3/7−GloTM試薬(Promega)を直接96穴中の細胞に添加し、プレートを1時間インキュベートし、Thermo LabsystemsのLuminoskan Ascent機でさらに1分の誘導期間後にルミネセンス(ルシフェラーゼ活性)を記録した。ルシフェラーゼ活性は、秒あたりの相対光ユニット(RLU/s)として測定する。データをAscent ソフトウェア2.4.2.で処理し、誘導倍率のグラフをコントロールに対する相対値としてエクセルで描いた。
(アネキシンV−FITCフローサイトメトリー解析)
1×106のHeLa細胞を形質移入前日にT75フラスコに播種した。形質移入当日、細胞を37℃のOptiMEMで1回洗浄し、次に2.5μg/mlのLipofectamine 2000(Invitrogen)を含むOptiMEM 7mlを加えた。細胞を7分間インキュベートし、OptiMEMで終濃度1〜25nMに希釈した1700μlのオリゴヌクレオチドを添加した。模擬形質移入細胞をコントロールとした。処理4時間後、細胞をOptiMEMで洗浄し、10mLの培地を加えた。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を24〜72時間回復させ、次に細胞をかき取って回収し、PBSで2回洗浄した。2×105細胞を5μlのアネキシンV−FITCと10μlのヨウ化プロピジウム(ヨウ化プロピジウム−10mg/ml)で15分間室温の暗所でインキュベートした。染色の特異性と選択性を示すために、アネキシンV−FITC添加前の精製した組み換えアネキシンV−FITC(10μg)での形質移入細胞のインキュベーションを用いた。さらに、TRAIL(Apo2L)を誘導したHeLa細胞(0.5μg/ml)をポジティブコントロールとして用いた。
(実施例12:LNAオリゴヌクレオチドによる増殖阻害)
細胞を、実施例11に従って処理した。
形質移入の前日に、透明な96穴プレート(Scientific Orange no.1472030100)にウェルあたり7000細胞の密度でDMEM培地中にU373細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたOptiMEMで1回洗浄し、次にLipofectamine 2000(Invitrogen)2.5μg/mlを含む72μlのOptiMEMを加えた。OptiMEMで希釈した18μlのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を7分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、5nMから100nMの範囲だった。処理6時間後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含む100μlのDMEMを加えた。処理済みのU373細胞の同様の96穴プレートを、回収時間までAnaerocultバッグ(Merck)中に96穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧/酸素欠乏下で培養した。生細胞は、示された時間に20μlのテトラゾリウム化合物[3−(4,5−ジメチル−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、内塩、MTS]と電子結合試薬(フェナジンエトサルフェート、PES)(CellTiter 96(登録商標)Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega)を加えることで測定した。生細胞は、Powerwave(Biotek Instruments)で490nmと650nmで測定した。
(実施例13:LNAオリゴヌクレオチドのインビボでの取り込みと標的の下方調節)
有毛マウスを14日間の期間中、毎日または週2回(5回)のいずれかで、食塩水または配列番号1またはその様々なチオール化物を腹腔内注入した。配列番号5は部分的にチオール化されており(ギャップ内)、一方、配列番号6はホスホジエステル骨格がチオール化されている。マウスを所定の毎日または毎週2回、総用量10mg/kg/14日、50mg/kg/14日、または250mg/kg/14日で処置した。
約10mgの組織を1%のメルカプトエタノールを添加した400μlのRTL緩衝液(Qiagen)中でホモジナイズした。全RNAはRNeasy mini kit(Qiagen)を用いて製造会社の取扱説明書に従って単離した。
処置済みおよび無処置のマウスのHIF1α mRNAの相対濃度を決定するため、cDNAをBioRADのiCyclerを用いた定量PCR解析に用いた。
mβ−アクチン:5’−CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA−3’(配列番号32)、および5’−GCTCAGGAGGAGCAATGATCT−3’(配列番号33)
mVEGF:5’−CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC−3’(配列番号34)、および5’−GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT−3’(配列番号35)
mGAPDH:5’−AGCCTCGTCCCGTAGCAAAAT−3’(配列番号38)、および5’−GTTGATGGCAACAATCTCCACTTT−3’(配列番号39)
BCL−2:フォワード:5’−gccctgtggatgactgagta−3’(配列番号36)、およびリバース:5’−cagccaggagaaatcaaacag−3’(配列番号37)。
約100mgの組織を500μlの抽出緩衝液(1mg/mlのRNase Aを含む、0.5%のIGEPAL CA−630、25mMトリスpH8.0、25mMのEDTA、100mMのNaCl)中で機械的にホモジナイズし、37℃で一晩インキュベートした。500μlに基準オリゴヌクレオチドを加え、フェノール−イソアミル−クロロホルム(25:1:24(v/v/v))1mlを加えて抽出した。水層を新しいチューブに写し、再度抽出した。必要であれば、抽出物を凍結乾燥した。
試料50μlをguard column DNAPac PA−100(2×250mm、Dionex)を備えたDNAPac PA−100(2×50mm、Dionex)カラムにかけて分離した。カラムを40℃に加熱した。流速は0.25mL/分で、検出波長は260nmだった。移動相の勾配は、A:トリス(20mM)、EDTA(1mM)および過塩素酸ナトリウム(10mM)pH7.6。B:トリス(20mM)、EDTA(1mM)および過塩素酸ナトリウム(1M)pH7.6。(0−13分、A:20%、B:20%。14−18分、A:40%、B:60%。22−28分、A:0%、B:100%。33−38分、A:80%、B:20%)。
ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するオリゴヌクレオチド治療の作用は、様々な腫瘍細胞株を用いて可能である。当該細胞株の例は、ヒト腫瘍細胞株U87(膠芽細胞腫)、U373(膠芽細胞腫)、15PC3(前立腺癌)、PC3(前立腺癌)、DU145(前立腺癌)、LNCap(前立腺癌)およびマウス腫瘍細胞株B16(黒色腫)である。
メスのNMRIマウス60匹(約25g)を5群に分け、30mg/kgの配列番号1(10ml/kg、2.5g/ml)を0、3、7、10および14日目に腹腔内投与した。14日目に群を屠殺した。コントロール群には0.9%食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日RNAを調製した。
作用の持続時間:メスのBalb/cA−nuマウス20匹(約25g)、前立腺癌細胞株PC3(ECACC#90112714)を5群に分け、25mg/kgの配列番号7(10ml/kg、2.5g/ml)を7から13日目まで毎日、腹腔内投与した。投与1日後と5日目に群を屠殺した。コントロール群には0.9%食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日RNAを調製した。図10Aは、処置後1日目と5日目のmRNA発現の作用持続時間を示す。
肝臓:肝細胞の染色は主に細胞質に局在した。
腎臓:近位細管の非常に強い染色と遠位尿細管のより弱い染色。
腫瘍:内皮細胞、マクロファージが染色された(マウス細胞)。
皮膚:真皮(内皮細胞およびマクロファージ)、ならびに表皮の基底層の細胞質に強い染色。
当日、0.3×10−6細胞(PC3とHT29)を300μlのMatrigelと混合し、メスのBalb/cA−nuマウス(約25g)に移植した。7、10、13、17日目、食塩水、fam標識した配列番号1(配列番号7)、またはfam標識した配列番号8(配列番号20)を5mg/kg/日でマウスに腹膜注射した。最後の投与の3日後(20日目)または10日後(27日目)、動物を屠殺した。食塩水コントロール群には0.9%食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日RNAを調製し、HPLC解析によるLNAオリゴヌクレオチド含量の測定またはHIF−1a mRNAの下方調節を解析した(図10C−Eを参照)。
ミスマッチの検討:メスのNMRIマウス15匹(約25g)を5群に分け、30mg/kgの配列番号1または配列番号9(10ml/kg、3.0g/ml)を0、3、7、10および14日目に30秒にわたって腹腔内投与した。コントロール群には0.9%食塩水を投与した。最後の注入の3〜4時間後、群を屠殺した。組織試料を採取し、後日RNAを調製した。
メスのNMRIマウス(0.025kg)を5mg/kg/日の配列番号1で腹腔内注射により処置した。5群に分け、食塩水動物はコントロール動物の役目を果たし、0.9%食塩水を投与した。投与1日後と10日目に5匹を屠殺した。方法と材料の記載どおりに、組織試料を採取し、後日RNAを調製し、QPCRによりHIF−1a mRNA発現を測定してβ−アクチンで正規化した。
新脈管形成は、当初ラットの大動脈で報告された方法(Masson et al.,2002 Biol Preoced Online 4(1)p.24−31)を改変して、マウスの大動脈の輪を3次元コラーゲンゲル中で培養することで検討した。有毛マウスを10mg/kgから50mg/kgの範囲の用量のLNAオリゴヌクレオチドで1回静脈投与した。投与後3日目に、マウスから胸大動脈を除去し、頸椎脱臼により屠殺し、直ちに、10%ウシ胎仔血清を含む氷冷したRPMI培地(Invitrogen)を入れた培養皿に移した。精密な顕微解剖用鉗子と虹彩切除用の剪刀を用いて、大動脈壁を損傷しないよう特別の注意を払って大動脈周辺の線維脂肪組織を注意深く除去した。1mm長の大動脈の輪(大動脈あたり約15、最大大動脈の1.5cm)を薄切し、FBSを含むRPMIの3回の連続洗浄で広範囲に洗浄した。次に、マウス大動脈のリング形の移植片を96穴プレートのウェル内の60μlのmatrigel(BD Biosciences、Matrigel:356234)に埋め込んだ。大動脈を挿入後、さらに40μlのmatrigelを加え、37℃で10分間おいて凝固させた。成長因子を含む、また含まない100μlのEGM2(Cambrix)をウェルに加える。コントロールとして、大動脈の輪を10μMのシスプラチンを含むさらにEGM2培地で覆った。培地は、2日ごとに交換した。
メスのC57B1/6Jマウス9匹(8週、Taconic,DK)に1.5mCi/kgの3H−配列番号1を50mg/kgで各試験品目を尾静脈に静脈内投与した。
(実施例22:配列番号1を形質移入したHUVEC細胞のウェスタンブロット)
正常なヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、Cambrix−EGM2培地中で培養し、実施例の記載どおりに2nMまたは5nMの配列番号1あるいは5nMの配列番号8を形質移入した。形質移入後、細胞を低酸素(1%酸素)に16時間曝した。(実施例の記載どおり)回収時に細胞をPBSで洗浄し、SDSを含む溶解緩衝液中で溶解した。50μgをトリス−酢酸ゲルにローディングし、150Vで1時間泳動した。ウェスタンブロットを実施例の記載どおりに行い、ブロットを抗ヒトHIF−1a(1:500)中でインキュベートし、高感度化学発光で可視化した。配列番号1による強力な下方調節が見られたが、一方スクランブルコントロールの配列番号8は、HUVEC細胞においてHIF−1a発現を下方調節しなかった。
Matrigelを用いて、管形成の誘導を行った(Venetsanakos E,Mirza A,Fanton C et al.,Induction of tubulogenesis in telomerase−immortalizaed human microvascular endothelial cells by glioblastoma cells.Exp Cell Res 2002;273:21−33)。早過ぎる重合を防ぐためにMatrigelを氷上で解凍し、50μlの小分注を96穴の組織培養プレート(Nunc)の個別のウェルに入れ、37℃で少なくとも30分間重合させた。形質移入したHUVEC細胞をトリプシン0.05%−EDTA処理で剥離した。細胞を血清を含む培地で洗浄し、次いで2−×105細胞/mlに再懸濁した。各培養ウェルに形質移入した、または形質移入されていない100μlのHUVEC細胞懸濁液を増殖因子(FBS(2%)と共にVEGF、hFGF−B、R3−IGF−1、hEGF)およびヘパリンを含む培養液に加えた(n=10)。スクランブルコントロールオリゴ(配列番号8)で形質移入したHUVEC細胞だけでなく、無処理の偽形質移入細胞をコントロールとして用いた。コントロールまたは試験化合物の用量は、6〜10の個別のウェルでアッセイし、実験は少なくとも3回行った。管形成の定量のため、ウェルの写真を撮影した。(図13参照)
(実施例24:脾臓、骨髄および末梢血の細胞への取り込みのFACS解析)
メスのNMRIマウス(0.025kg)をFam標識した配列番号1、配列番号7(50mg/kg)または同等の分子数のFamアミダイト(3mg/kg)で、または0.9%食塩水で処置した。細胞を注射1時間後に殺し、脾臓、末梢血(0.1%アザイドナトリウムと50mlヘパリン硫酸を含む1mlのPBSに1mlを添加し、氷上に置く)、または骨髄由来の細胞を回収した。
脾臓を金属メッシュ上に置き、アザイドを含む1mlのR10(10%FCSを含むR10組織培養培地)で湿らせる。組織をメッシュに押しつけ、合計4mlのR10+アザイドで洗い流す。0.5mlの組織懸濁液を取り、残りを廃棄する。50mlの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて室温で10分間放置して赤血球を溶解させる。2000rpmで10分遠心。必要であれば、残りの赤血球を除去するために、この工程を反復する。細胞を数え、ブロッキングする。
50mlの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて赤血球を溶解させる。細胞を遠心沈殿させ、必要であれば工程を反復する。細胞をPBSで1回洗浄し、再懸濁して細胞数を数える。非特異的な抗体の結合は、細胞100万個あたり5μlの割合でマウスCD16/D32を加えることによりブロックする。室温に10分間放置し、次に染色を続けて行った。
滅菌した剪刀を用いて、できるだけ各端に近いところで骨を切断する。1mlの滅菌PBSを25ゲージの針を付けた1mlシリンジに吸い上げる。針を骨の一端に挿入する。通常、膝で最も容易である。PBSを骨の中に勢いよく流し入れる。骨がきれいになるまで繰り返す。髄を粉砕するために、骨髄を針で数回吸い上げる。赤血球の数が気になる場合は、上述の様に溶解の工程を用いることが出来る。
特異的マーカーを用いて系統染色を行う。以下に記載の通り:
染色
1.CD4APC、CD8 PE FITC、7AAD T細胞
2.Gr−1 PE、f4/80 APC 好中球、マクロファージ
3.Gr−1 PE、Mac−1 APC 脊髄単球
4.CD34 PE 系統APC 幹細胞
5.B220 APC、CD19 PE B細胞
6.CD11b PE、CD11c APC 樹状細胞
アイソタイプ
7.アメリカンハムスター IgG1 APC CD11c
8.ラット IgG2a APC CD4、B220
9.ラット IgG2a PE cd8a、CD19、CD34
10.ラットIgG2g PE Gr−1 CD11b。
肝臓、腎臓を含むカニクイザル組織における主要な毒性研究では、試料を急速凍結し−70℃でその後の解析のために保存した。(図16Aと16Bを参照)サルは、0、6、10、40mg/kg/回で週2回4週間、静脈注射で処置された。0、10、40mg/kg/回の投与を受ける動物の群では、一部の動物はその後に4週間の処置なしの回復期間を設けた。
化学薬品と試薬:
プロテイナーゼK(25.1mg/ml):Sigma P4850。
カラム温度:42℃
注入量:50μl
洗浄用溶媒:ミリQ水
パージ用溶媒:ミリQ水
検出UV:260nm。
緩衝液A:1mMのEDTA,20mMのトリス塩酸、10mMのNaClO4,pH7.6(1N NaOH)
緩衝液B:1mMのEDTA,20mMのトリス塩酸、1MのNaClO4,pH7.6(1NのNaOH)
(実施例26:配列番号1を用いたインビボでの処置の作用持続時間)
有毛マウスを50mg/kgの配列番号1で単回腹腔内注射で処置した。各群5匹の動物を投与後1日目と10日目(図9C参照)、または投与後1、2、3、4、5、10日目(図9Bを参照)に屠殺した。HIF−1a mRNA発現をリアルタイムQPCRで解析し、GAPDHAで正規化した。
マウスおよび麻酔:BALB/cマウス、6〜8週齢。ケタミンとキシラジンの混合物(それぞれ、120mg/体重kgと20mg/体重kg)を用いてマウスを麻酔した。
過去に記載の(Cao Y,et al.,Vascular endothelial growth factor C induces angiogenesis in vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998;95:14389−14394)で、角膜マイクロポケットアッセイを行った。簡潔に、角膜マイクロポケットは、改良型von Graefeナイフを用いて作成し、200ngのVEGF−A164(R&D)または200ngの組み換えbfgf(RDI,Flanders,New Jersey,USA)を含むヒドロンポリマーで被覆したスクロースアルミニウム硫酸のマイクロペレット(0.4×0.4mm)を各ポケットに埋め込んだ。ペレットは、縁から0.6〜0.8mmの場所に置き、抗生剤軟膏(エリスロマイシン)でその部位を覆い、そのままの場所で10日間放置した(それぞれ、n>5〜10マウス)。新脈管形成反応とリンパ管形成反応は、上述のCD31/LYVE−1の二重免疫染色を用いて定量した。下部の縁とペレットの間の血管対リンパ管の伸長は、両方の管のタイプに対して半定量的に4つのカテゴリーに等級付けした。0:管の伸長なし、1:下部の縁とペレットの間の距離の1/3未満の伸長、2:下部の縁とペレットの間の距離の1/3と2/3の間の伸長、3:管がペレットに達している。
(インビボでのヒト皮膚/SCIDマウスキメラ)
ヒトの皮膚の異種移植片は、以前Wrone−Smith T,Nickoloff BJ:Dermal Injection of immunocytes induces psoriasis.J Clin.Invest.1996,98:1878−1887で記載の方法に従って、7〜8週齢のSCIDマウス(Taconic,DK)に同所的に移植した。簡潔に、1.5×1.5×0.5cmサイズのヒトの皮膚異種移植片をSCIDマウスの脇腹に吸収性5−0 Vicryl Rapide縫合糸(Ethicon,Somerville,NJ)で縫合し、Xeroform包帯剤(Kendall Co.,Mansfield,MA)で覆った。付帯剤は1週間後にとりのぞき、動物は研究を通じて病原体なしで維持した。マウスは移植1〜3週間後に配列番号1と配列番号7で50mg/kgで週2回、処置を行った。ヒト皮膚/SCIDマウスキメラは、2〜3週間の処置後屠殺し、4mmのパンチ生検(Bakerのパンチ生検、Commins Derm,Miami,FL)を各異種移植片から得た。生検は中性に緩衝されたホルマリンで固定し、パラフィン包埋および/またはトラガカントゴム(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)上にマウントし、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結し、−80℃で保存した。
皮膚のクリオスタット切片を、内皮細胞(CD31/CD34)、マクロファージ(cd11b)、VEGF、VEGFRまたはHIF−1aなどの適切なマーカーで染色した。(前述の)切片をヘマトキシリン−エオジンで逆染色した。全てのスライドを検鏡し、写真撮影を行った。
Claims (25)
- 配列:5’−TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa−3’(配列番号1)からなるLNAオリゴヌクレオチドであって、
大文字はβ−D−オキシ−LNAヌクレオチドアナログを示し、小文字は2−デオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「s」は隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示す、LNAオリゴヌクレオチド。 - 結合体であって、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチド、および該LNAオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも一つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む、結合体。
- 請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項2に記載の結合体と、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはアジュバントとを含む、薬学的組成物。
- 水性キャリアを含む、請求項3に記載の薬学的組成物であって、該水性キャリアが、pHを4.0〜8.5の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ20〜2000mMのイオン強度を有する、薬学的組成物。
- 眼内投与に適合した、請求項3および4のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも一つの化学療法剤をさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項2に記載の結合体。
- 癌の処置のための医薬の製造のための、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項2に記載の結合体の使用。
- 前記癌が固形腫瘍の形態にある、請求項8に記載の使用。
- 前記癌が、頭頸部癌、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、請求項8に記載の使用。
- 癌を処置するための組成物であって、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドもしくは請求項2に記載の結合体を含むか、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、組成物。
- 前記癌が、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、請求項11に記載の組成物。
- アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための医薬の製造のための、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項2に記載の結合体の使用。
- 前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチからなる群から選択される、請求項13に記載の使用。
- アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための組成物であって、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドもしくは請求項2に記載の結合体を含むか、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、組成物。
- 前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される、請求項15に記載の組成物。
- 異常な新脈管形成によって引き起こされる疾患を患っているかまたは該疾患に罹患しやすい哺乳動物を処置するための組成物であって、治療有効量の請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項2に記載の結合体を含む、組成物。
- 新脈管形成を阻害するための組成物であって、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドもしくは請求項2に記載の結合体を含むか、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、組成物。
- 細胞のアポトーシスを誘導するための組成物であって、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドもしくは請求項2に記載の結合体を含むか、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、組成物。
- 細胞増殖を予防するための組成物であって、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドもしくは請求項2に記載の結合体を含むか、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、組成物。
- 新脈管形成疾患の処置のための組成物であって、請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドもしくは請求項2に記載の結合体を含むか、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物であり、新脈管形成疾患に関連した新脈管形成が、該組成物の投与によって阻害される、組成物。
- 前記新脈管形成疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性症および炎症性疾患からなる群から選択される、請求項21に記載の組成物。
- 前記新脈管形成疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される炎症性疾患である、請求項22に記載の組成物。
- 前記新脈管形成疾患が、黄斑変性症および糖尿病性網膜症である、請求項22に記載の組成物。
- キットであって、
(a)固形形態の請求項1に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項2に記載の結合体を含む第一の構成要素、および
(b)該LNAオリゴヌクレオチドの再構成に適した食塩水または緩衝液を含む第二の構成要素
を備える、キット。
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