NO341878B1

NO341878B1 - LNA oligonukleotid eller konjugat derav for hemming av HIF-1A ekspresjon, en farmasøytisk sammensetning inneholdende dette, samt anvendelse derav som et medikament

Info

Publication number: NO341878B1
Application number: NO20072933A
Authority: NO
Inventors: Henrik Frydenlund Hansen; Frank Winther Rasmussen; Majken Westergaard; Charlotte Albæk Thrue
Original assignee: Roche Innovation Ct Copenhagen As
Priority date: 2004-11-09
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2018-02-12
Also published as: EP1833840B9; BRPI0515726A; DE602005022768D1; US7589190B2; US20090286859A1; JP4825807B2; JP2014098027A; WO2006050734A2; AU2005304112B2; CA2587173C; US20060252721A1; JP2011229540A; CA2587173A1; EA014097B1; MX2007005558A; BRPI0515726A8; JP2008518608A; NO20072933L; KR101176245B1; US7939507B2

Abstract

Foreliggende beskrivelse angår et LNA oligonukleotid som består av en sekvens valgt fra gruppen bestående av 5'-(Tx)GxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3 og 5-GxTxTxascstsgscscststscsTxTxA-3 der store bokstaver betegner en beta-D-oksy-LNA nukleotid analog, små bokstaver betegner en 2-deoksynukleotid, understreket betegner enten en beta-D-oksy-LNA nukleotid analog eller en 2-deoksynukleotid, nedsenket skrift "s" betegner en fosfortioat binding mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotid analoger, og nedsenket skrift "x" betegner enten en fosfortioat binding eller en fosfordiester binding mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotid analoger, og der sekvensen eventuelt er utvidet med opp til fem 2-deoksynukleotid enheter. LNA oligonukleotider er nyttige for modulering av ekspresjon av hypoksi-induserbar faktorla (HIF- la), for eksempel i behandling av cancer sykdommer, hemming av angiogenese, indusering av apoptose, forhindring av cellular proliferasjon, eller behandling av en angiogen sykdom, for eksempel diabetisk retinopati, makulær degenerasjon (ARMD), psoriasis, reumatoid artritt og andre inflammatoriske sykdommer.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelsen skaffer til veie sammensetninger og fremgangsmåter for modulering av ekspresjon av HIF-1a. Særlig angår denne oppfinnelsen LNA oligonukleotider, hvilke er spesifikt hybridiserbare med nukleinsyrer som koder for HIF-1a. LNA oligonukleotidene har blitt vist å modulere ekspresjon av HIF-1a og farmasøytiske preparater derav og deres anvendelse i behandling av cancer sykdommer, inflammatoriske sykdommer og øyesykdommer er beskrevet.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Faste tumorer må etablere en blodtilførsel og har forsterket glukose metabolisme for å vokse utover noen få millimeter. Hvordan de senser hypoksi, og responderer ved aktivering av hypoksi-induserbare gener og sekrerer angiogene faktorer for å etablere et blodsystem er sentralt innen cancer biologi. Mange tumorer inneholder hypoksiske mikromiljøer, hvilke har blitt forbundet med ondartet utvikling, metastase og resistens mot radioterapi og kjemoterapi.

Oppdagelsen av hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) ga noe insikt i regulering av hypoksi-induserbare gener (US 5882 914 og WO 96/39426; WO 99/48916). HIF-1 er sammensatt av to subenheter HIF-1α (HIF-1alfa; referert til her som “HIF-1a”, eller “HIF-1 α”) og HIF-1β og den binder - 1 hypoksi-respons elementer (HREs) i enhancere av gener som koder for angiogene faktorer slik som VEGF og glykolyse-relaterte proteiner slik som glykolytiske enzymer og glukose transporter 1 og 3 (GLU-1 og 3).

Det har blitt demonstrert at konstruert ned-regulering av HIF-1a ved intratumoral gen overføring av et antisense HIF-1a plasmid fører til ned-regulering av VEGA og senket tumor microvessel densitet (WO 00/76497, Sun X et al, Gene Therapy (2001) 8, 638-645). Plasmidet inneholder et 320-bp cDNA fragment som koder for 5'-enden av HIF-1a (nukleotider 152 - 454; Genebank AF003698).

WO 2003/085110 viser LNA antisens oligonukleotider som ned-regulerer human HIF-1a ekspresjon. En forbindelse er navngitt CUR813 (SEQ ID NO.11).

US2004220393 beskriver sammensetninger og fremgangsmåter for modulering av ekspresjonen av HIF1 α og hypoksiinduserbar faktor 2 α (HIF2 α).

SHATROV V.A.ET AL.:"Oxidized low-density lipoprotein (ox LDL) triggers hypoxiainducible factor-1alpha (HIF-1alpha)accumulation via redox-dependent mechanism", BLOOD, vol.101,no.12, 15.june 2003, s 4847-4971, beskriver effekten av oxLDL på HIF 1 α-akkumulering i humane makrofager.

Foreliggende oppfinnelse beskriver LNA oligonukleotider, hvilke er mer potente enn CUR813 (SEQ ID NO.11). Også de spesifikke LNA oligonukleotidene, i følge oppfinnelsen, induserer apoptose og hemmer proliferasjon. LNA oligonukleotidene som også har en 100 % sekvensidentitet til mus HIF-1a, ned-regulerer HIF-1a ekspresjon i lever, tarm og nyrer i mus.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelsen skaffer til veie sammensetninger og fremgangsmåter for modulering av ekspresjon av HIF-1a. LNA oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen er potente hemmere av HIF-1α mRNA ekspresjon og proteinnivåer.

Mer spesifikt fremskaffer foreliggende oppfinnelsen et LNA oligonukleotid som består av en sekvens sin er

5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’ (SEQ ID NO.1),

der store bokstaver betegner en beta-D-oksy-LNA nukleotid analog, små bokstaver betegner et 2-deoksynukleotid, senket skrift “s” betegner en fosfortioat binding mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotidanaloger.

Oppfinnelsen fremskaffer også et konjugat som omfatter LNA oligonukleotidet ovenfor, samt minst en ikke-nukleotid eller ikke-polynukleotid del kovalent festet til nevnte LNA oligonukleotid.

Videre fremskaffer foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning omfattende LNA oligonukleotid eller et konjugat som definert ovenfor, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer eller adjuvant.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en anvendelse av LNA oligonukleotidet eller et konjugat som angitt ovenfor, for anvendelse som et medikament, foruten et sett omfattende et LNA oligonukleotid eller konjugat som angitt ovenfor, og andre andre komponent tilpasset for kekonsitusjon av nevnte LNA oligonukleotider.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1A viser en øket stabilitet av SEQ ID NO.1 og SEQ ID NO.5 i rotte plasma (NtacSD hann, Li-Heparine (Taconic, M&B)) sammenliknet med SEQ ID NO.6.

Oligonukleotidene ble inkubert ved 20 μM konsentrasjoner ved 37 ̊C i 0-, 4-, eller 24-timer. Ingen degraderingsfragmenter fra SEQ ID NO.1 kan bli detektert selv etter 24 timers digestion.

Figur 1B viser Stabilitet av Full lengde SEQ ID NO.1 og SEQ ID NO.13, et fosfortioat og iso-sekvensiell til SEQ ID NO.1, i rotte og human serum. Oligonukleotider ble tilsatt til human eller rotte serum ved en slutt konsentrasjon på 20 µM. Figuren viser LNA oligonukleotid stabilitet opp til 1 - 96 timer i respektivt humant og rotteserum ved 37 ºC. For rotte serum, demonstrerer det andre siste panelet i Figur 1B vedvarende enzym aktivitet selv etter 48 timer og 96 timer. Det siste panelet fungerer som en negativ kontroll som ikke demonstrerer noe degradering av SEQ ID NO.1 og SEQ ID NO. 13 når inkubert ved 37 °C uten tilsatt plasma.

Figur 1C viser ekstrem lang stabilitet av SEQ ID NO.1 i human og rotte plasma.

Oligonukleotidet ble inkubert i human eller rotte plasma i 1 - 96 timer og kjørt på en denaturingsgel. Etter farging med SyBr gull, ble mengden av fullengde produkt målt ved anvendelse av en phosphorimager og plottet mot tiden.

Figur 2A viser HIF-1a protein ned-regulering i LNA oligonukleotider transfekterte U373 celler. U373 celler ble transfektert med 2 eller 10 nM forbindelse eller mock transfektert, inkubert ved hypoksi og analysert for HIF-1a protein ned-regulering med Western blotting. Tubulin ekspresjon ble analysert som kontroll av lik ladning.

Figur 2B viser HIF-1alfa protein ned-regulering etter behandling med SEQ ID NO.1 i U373 glioblastoma cancer cellelinjer. Pan-actin ekspresjon ble analysert som kontroll av lik ladning. Celler ble transfektert med 0,2, 1 og 10 nM SEQ ID NO.1 eller SEQ ID NO. 10, som er et 2 bp mm til SEQ ID NO.1. Det nedre panelet er en kvantifisering av gelen.

Figur 2C viser ned-regulering av HIF-a ekspresjon 24 timer etter behandling med HIF-1a målrettet LNA oligonukleotid, SEQ ID NO.1, og et LNA inneholdende scrambled kontroll oligonukleotid SEQ ID NO.8 i U373 celler. HIF ekspresjon er korrelert til enten GAPDH eller Beta-actin og relatert til en utransfektert kontroll (mock). Etter RNA rensing, ble mRNA ekspresjon kvantifisert med QPCR.

Figur 3A og 3B viser induction av apoptose målt som en kinetisk profil av indusert Caspase 3/7 aktivitet etter 24 - 72 timers behandling med LNA oligonukleotider i glioblastom cellelinjen U373 ved normoksi eller hypoksi. SEQ ID NO.1 er vist å være en potent inducer av tidlig apoptose.

Figur 4A: Induksjon av tidlig-apoptotisk celletrinn målt med Annexin V-FITC og PI flow cytometri analyse etter 48 timer. U373 cellene behandlet med LNA oligonukleotid SEQ ID NO.1 ble klassifisert som mer “tidlig apoptotisk” sammenliknet med mock og SEQ ID NO.12 behandlede celler.

Figur 4B: Kvantifikasjon av induksjon av tidlig apoptose i U373 celler etter behandling med SEQ ID NO.1. Prosentdel av celler tvunget inn i tidlig apoptose 48 timer etter behandling av SEQ ID NO.1 ved forskjellige doseringer. U373 celler ble transfektert med SEQ ID NO.1 eller til forskjellige blandede kontroll oligonukleotider SEQ ID NO.

8 og SEQ ID NO.12. Etter innhøsting og inkubasjon med Annexin V ab og PI, ble anall celler i tidlig apoptose målt ved Flow cytometri.

Figur 5A og 5B viser forbindelser transfektert glioblastoma cellelinje U373 celler 24 -72 timer etter transfeksjon og inkubasjon ved enten hypoksi eller normoksi. SEQ ID NO. 1 er vist å være en potent hemmer av proliferasjon som målt ved MTS analyse.

Figur 6A og Figur 6B viser in vivo endogene lever mål ned-regulering av to administrasjonssystemer ved anvendelse av SEQ ID NO.1. Måling av mRNA nivåer av HIF-1α så vel som nedstrøms mål VEGF viser at SEQ ID NO.1 også er en effektiv hemmer av nevnte mål. Figur 6A: ip injeksjoner daglig i hårbevokste mus i 14 dager. Figur 6B: ip injeksjoner to ganger i uken i hårbevokste mus i 14 dager.

Figur 6C viser in vivo endogen nyre HIF-1α etter ned-regulering administrerte ip injeksjoner daglig i hårbevokste mus i 14 dagers kur av SEQ ID NO.1.

Figur 7A viser at SEQ ID NO.1 er en potent hemmer målt ved ned-regulering av in vivo ekspresjon av HIF-1a i lever etter administrasjon av SEQ ID NO.1. Forskjellig thiolerte versioner av SEQ ID NO.1 (SEQ ID NO.5 og SEQ ID NO.6) og SEQ ID NO. 1 ble respektivt dosert til hårbevokste mus ved 18 eller 3,6 mg/kg daglig i 14 dager og tatt livet av. Ekspresjon av HIF-1a ble målt på mRNA nivå ved QPCR og normalisert til beta-actin som beskrevet i M&M.

Figur 7B viser at SEQ ID NO.1 også er en potent hemmer målt ved ned-regulering av in vivo ekspresjon av HIF-1a lever etter administrasjon av SEQ ID NO.1. Forskjellige tiolerte versjoner av SEQ ID NO.1 (SEQ ID NO.5 og SEQ ID NO.6) og SEQ ID NO.

1 ble respektivt dosert til hårbevokste mus ved 50, 10 eller 2 mg/kg to ganger per uke i 14 dager og tatt livet av. Ekspresjon av HIF-1a ble målt på mRNA nivå med QPCR og normalisert til beta-actin.

Figur 7C viser ned-regulering av in vivo ekspresjon av HIF-1a i nyre etter administrasjon av SEQ ID NO.1. Forskjellige thiolerte versjoner av SEQ ID NO.1 (SEQ ID NO.5 og SEQ ID NO.6) ble dosert til hårbevokste mus ved 18 eller 3,6 mg/kg daglig i 14 dager og tatt livet av. Ekspresjon av HIF-1a ble målt på mRNA nivå ved QPCR og normalisert til beta-actin.

Figur 8A viser overlegen in vivo effekt ved anvendelse av SEQ ID NO.1 sammenliknet med SEQ ID NO.11 og SEQ ID NO.12 (en blandet kontroll) målt ved tumor-vekt av U373 tumorer fra xenograft. SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.11 og SEQ ID NO.12 ble dosert ved 50 mg/kg til ganger per uke for en uke i U373 xenograft mus implantert ved ovariene. 2 dager etter siste dose ble dyrene tatt livet av. Ved avliving ble tumorer oppveid og den individuelle tumor vekt pluss den gjennomsnittlige tumor vekt (rød) ble beregnet og plottet. En statistisk signifikant forskjell (P = 0,005) ble funnet mellom Kontroll gruppen (en blandet kontroll SEQ ID NO.12) og mus behandlet med en SEQ ID NO.1.

Figur 8B viser vessel densitet i U373 tumorer fra xenograft behandlet med SEQ ID NO.

1. SEQ ID NO.1 ble dosert ved 50 mg/kg to ganger per uke i en uke i U373 xenograft mus implantert ved ovariene.2 dager etter siste dose, ble dyrene tatt livet av. Vesseldensitet ble beregnet etter CD31 farging og relatert til det totale arealet. En statistisk signifikant forskjell (P = 0,005) ble funnet mellom saltoppøsningsgruppen og mus behandlet med en blandet kontroll (SEQ ID NO.12).

Figur 8C viser farging av CD 31 i snitt fra U373 tumorer implantert ved ovariene og behandlet med SEQ ID NO.1 som beskrevet i Figur 8B.

Figur 8D viser HIF-1α ekspresjon kvantifisert ved sann-tid PCR og normalisert til GAPDH i U373 tumorer implantert ved ovariene og behandlet med SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12 og PBS som beskrevet for Figur 8B.

Figur 9A viser in vivo opptak (i μg per gram vev) pluss mål ned-regulering (% hemming av HIF-1a mRNA ekspresjon korrelert til β-actin ekspresjon) av hårbevokste mus etter en i.v. dose med SEQ ID NO.1 av 25mg/kg. SEQ ID NO.1 har en halveringstid på tilnærmet 46 timer i nyrene og 66 timer i leveren.

Figur 9B øvre panel viser SEQ ID NO.1 dosert ved 50 mg/kg en gang i.p. i hårbevokste mus. Fem dyr behandlet med SEQ ID NO.1 ved 50 mg/kg were tatt livet av etter 1, 3, 4, 5 og 8 dager etter behandling og HIF-1a ekspresjon ble analysert og normalisert til Beta-actin. Ekspresjon av HIF-1a ble målt på mRNA nivå med QPCR og normalisert til beta-actin som beskrevet i eksempel 8. I det nedre panel SEQ ID NO.1 ble dosert ved 25 eller 50 mg/kg en gang i.v. i hårbevokste mus. Fem dyr behandlet med SEQ ID NO.

1 ved 25 eller 50 mg/kg ble tatt livet av etter 1, 2, 3, 4, 5 og 8 dager etter behandling og ble analysert for fulllengde SEQ ID NO.1 med HPLC fremgangsmåter som beskrevet i eksempel 13. Data er presentert som μg SEQ ID NO.1/gram vev.

Figur 9C viser HIF-1α ekspresjon kvantifisert ved sanntid PCR og normalisert til GAPDH i muselever i mus som mottok en dose 50 mg/kg i.p. av SEQ ID NO.1 og SEQ ID NO.16 og tatt livet av på dag 1 og 10.

Figur 10A viser virkningsvarighet av SEQ ID NO.1 hemming av HIF-1a ekspresjon i xenograft mus dosert 25 mg/kg i 7 dager og tatt livet av 1 eller 5 dager etter siste dose.

Figur 10B viser in vivo lever, hud tumor og nyre opptak av fam-merket versjon av SEQ ID NO.1 (SEQ ID NO.7) ved 25 mg/kg/dag i syv dager og tatt livet av 5 dager etter siste behandling.

Figur 10C viser mål ned-regulering (% hemming av HIF-1a mRNA ekspresjon korrelert til GAPDH ekspresjon) pluss in vivo opptak (i μg per gram vev) av SEQ ID NO.7 i leveren av xenograft mus behandlet med 5 mg/kg/dag SEQ ID NO.7, blandet kontroll SEQ ID NO.20 eller saltoppløsning i.p. på dagene 7, 10, 13 og 17 etter transplantasjon som beskrevet i eksempel 17.

Figur 10D viser mål ned-regulering (% hemming av HIF-1a mRNA ekspresjon korrelert til β-actin ekspresjon) etter behandling med SEQ ID NO.7 eller blandet kontroll SEQ ID NO.20 pluss in vivo opptak (i μg per gram vev) av SEQ ID NO.7 i musecolon behandlet som beskrevet i eksempel 17.

Figur 10E viser in vivo opptak (in μg per gram tissue) av SEQ ID NO.7 i xenograft tumorer HT29 og PC3 behandlet som beskrevet i eksempel 17.

Figur 11 viser in vivo endogen lever mål ned-regulering av HIF-1a og VEGF mRNA etter 5 doser på 30 mg/kg hver 3. dag av SEQ ID NO.1 sammenliknet med den ene mismatch kontroll SEQ ID NO.9.

Figur 12A, Figur 12B, Figur 12C og Figur 12D viser ekspresjon av VEGFA og MMP-2 etter behandling med HIF-1a målrettet LNA oligonukleotid, SEQ ID NO.1, og en blandet kontroll SEQ ID NO.8 i U373 celler. En dose-avhengig ned-regulering i VEGFA og MMP-2 ekspresjon (sekresjon) blir observert 48 timer etter behandling med SEQ ID NO.1 eller en blandet kontroll (SEQ ID NO.8) i U373 celler. VEGFA (Figurer 12A, 12B og 12C) og MMP-2 (Figurer 12D og 12E) ekspresjon er relatert til celletall og normalisert til mock. I Figurene 12A, 12C og 12D VEGFA og MMP-2 ekspresjon er målt 48 timer etter behandling, mens i Figurene 12 B og 12E er sekresjon av VEGFA og MMP-2 kvantifisert 24 - 120 timer etter tranfeksjon.

Figur 13 viser ned-regulering av HIF-1α protein målt ved western blot og brudd i rør formasjon av HUVEC celler behandlet med SEQ ID NO.1 ved 1 og 5 nM sammenliknet med SEQ ID NO.8 og ubehandlet kontroll.

Figur 14A Hel legeme radioluminogram som viser distribusjon av radioaktivitet ved 5 minutter a), 4 timer b), 24 timer c) og 18 dager d) etter en enkel intravenøs administrasjon av<3>H- merket SEQ ID NO.1 hos hunnlige pigmenterte mus.

Figur 14B viser fordelingen av radioaktivitet ved 5 minutter og 7 dager og at en meget sterk retensjon av<3>H- merket SEQ ID NO.1 forbindelse blir observert i benmarg, nyre, lever, lunge, hud, milt, urin, gastrisk mukosa, lymfe knuter, uvea i øye og uterus etter 7 dager.

Figur 15 viser opptak av en FAM-merket versjon av SEQ ID NO.1 (SEQ ID NO.7) i forskjellige celletyper i benmarg, milt og perifert blod, 1 time etter administrasjon av SEQ ID NO.7 sammenliknet med ubehandlede celler målt med FACS analyse.

Figur 16A viser HIF-1α ekspresjon målt ved sanntid PCR og normalisert til 18S RNA i leveren og nyrer fra cynomolgus aper behandlet med 40, 10 og 6mg/kg SEQ ID NO.1 to ganger per uke for 4 uker. Figur 16B viser opptak av SEQ ID NO.1 i lever og nyrer fra cynomolgus aper en dag etter siste dose eller 4 uker etter siste dose (recovery dyr) behandlet som beskrevet over, sammen med data på recovery dyr (R), som fikk være ubehandlet i 4 uker etter avslutning av behandlingen.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelsen benytter spesielle LNA oligonukleotid for anvendelse i modulering av funksjon av nukleinsyre molekyler som koder for HIF-1a. Moduleringen er til sist en endring i mengden av produsert HIF-1a. Ifølge en utførelseform, blir dette oppnådd ved tilveiebringelse av et antisense LNA oligonukleotid, som spesifikt hybridiserer med nukleinsyrer som koder for HIF-1a. Moduleringen er fortrinnsvis en hemming av ekspresjon av HIF-1a, hvilken leder til en nedgang i antall med funksjonelle HIF-1a proteiner fremstilt.

LNA oligonukleotider

Mer spesifikt skaffer foreliggende oppfinnelse til veie et LNA oligonukleotid som består av en sekvens som er

5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’ (SEQ ID NO.1),

der store bokstaver betegner en beta-D-oksy-LNA nukleotid analog, små bokstaver betegner et 2-deoksynukleotid, senket skrift “s” betegner en fosfortioat binding mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotid analoger.

Betegnelsene “LNA oligonukleotid definert her”, “LNA oligonukleotid i følge oppfinnelsen”, og liknende refererer til “LNA oligonukleotid” definert over så vel som utførelsesformer, varianter, salter, promedikamenter, etc. tilveiebragt i det etterfølgende.

I det minste av hensiktsmessige grunner i preparering av LNA oligonukleotidene, er det ofte foretrukket at sekvensen blir utvidet med en 2-deoksynukleotid enhet i 3’-ende, kfr., for eksempel SEQ ID NO.1 og SEQ ID NO.2 under.

Som nevnt over, betegner den senkede indeksen “s” en fosfortioat (-O-P(O,S)-O-) binding mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotid analoger.

Nukleotidenhetene i sekvensen er bundet via en fosfortioat gruppe.

I foreliggende sammenheng, blir betegnelsen "nukleosid" anvendt i sin normale betydning, det vil si den inneholder en 2-deoksyribose eller ribose enhet som er bundet gjennom sitt antall et karbonatomer til en av de nitrogenholdige basene adenin (A), cytosin (C), tymin (T), uracil (U) eller guanin (G).

På en tilsvarende måte, menes det med betegnelsen "nukleotid" en 2-deoksyribose eller ribose enhet som er bundet gjennom dets antall et karbon atom til en av de nitrogenholdige basene adenin (A), cytosin (C), thymin (T), uracil (U) eller guanin (G), og som er bundet gjennom dens antall fem karbon atom til en internukleosid fosfat gruppe, eller til en terminal gruppe.

Betegnelsen "nukleinsyre” er definert som et molekyl dannet ved kovalent binding av to eller flere nukleotider. Betegnelsen "nukleinsyre" og "polynukleotid" blir anvendt omvekslende her. Betegnelsen "nukleinsyre analog" refererer til en ikke-naturlig nukleinsyre bindende forbindelse.

Betegnelsen “LNA monomer” refererer typisk til en bicyclisk nukleosid analog, som beskrevet i International Patentsøknad WO 99/14226 og etterfølgende søknader, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 og WO 03/006475 alle innbefattet her med referense.

Beta-D-oksy-LNA er LNA nukleotid analog som anvendes i LNA oligonukleotidene i foreliggende oppfinnelse, og monomer strukturen (nukleosidet) er vist i Skjema 1.

Beta-D-oksy-LNA

Skjema 1

I Skjema 1 indikerer Z* og Z posisjonen til en internukleotid binding til et nabostilt nukleosid eller en terminal gruppe (det vil si enten en 5’-terminal gruppe eller en 3’-terminal gruppe).

Et spesielt eksempel på beta-D-oksy-LNA monomer er tymidin LNA monomeren (LNA nukleosid analog) (1S,3R, 4R, 7S)-7-hydroksy-1-hydroksymetyl-5-metyl-3-(tymin-1yl)-2,5-dioksa-bicyclo[2:2:1]heptan, det vil si T-beta-D-oksy-LNA.

Betegnelsen “oligonukleotid” refererer, i sammenheng med foreliggende oppfinnelsen, til en oligomer (også kalt oligo) eller nukleinsyre polymer (for eksempel ribonukleinsyre (RNA) eller deoksyribonukleinsyre (DNA)) eller nukleinsyre analog for de som er kjent innen fagområdet, fortrinnsvis Locked Nukleinsyre (LNA), eller en blanding derav. Denne betegnelsen inkluderer oligonukleotider som er sammensatt av naturlig forekommende nukleobaser, sukkere og internukleosid (ryggrad) bindinger så vel som oligonukleotider som har ikke-naturlig-forekommende deler som fungerer liknende eller med spesifikke forbedrede funksjoner. Fullstendig eller delvis modifiserte eller substituerte oligonukleotider er ofte foretrukkede over native former på grunn av flere ønskede egenskaper til slike oligonukleotider slik som for eksempel, evnen til å penetrere en cellemembran, god resistens mot ekstra- og intracellulære nukleaser, høy affinitet og spesifisitet for nukleinsyre målet. LNA oligonukleotidene fra oppfinnelsen utviser de ovenfor-nevnte egenskapene.

Med betegnelsenene "enhet" og “nukleotid enhet” er det underforstått med en monomer, det vil si en 2-deoksynukleotid eller en beta-D-oksy-LNA nukleotid analog.

Betegnelsen "minst en" omfatter de hele tallene som er større enn eller lik 1, slik som 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 og så videre.

Betegnelsen “en” eller ”et” som blir anvendt om et nukleosid, en nukleosid analog, en SEQ ID NO, etc. har til hensikt å bety en, et eller flere. Særlig er uttrykket “en komponent (slik som et nukleosid, en nukleosid analog, en SEQ ID NO eller liknende) utvalgt fra gruppen betsående av …” har til hensikt å bety at en eller flere av de siterte komponentene kan være valgt. Uttrykk som “en komponent utvalgt fra gruppen som består av A, B og C” har til hensikt å inkludere alle kombinasjoner av A, B og C det vil si A, B, C, A+B, A+C, B+C og A+B+C.

Gjennom denne beskrivelsen, vil ordet “omfatte”, eller variasjoner slik som “omfatter” ”omfattende” eller “som omfatter”, være forstått å medføre inkludering av et bestemt element, heltall eller trinn, eller gruppe av elementer, heltall eller trinn, men ikke utelukkelse av et hvilket som helst annet element, heltall eller trinn, eller gruppe av elementer, heltall eller trinn.

Fremstilling av LNA oligonukleotider

LNA nukleotid analog byggeblokker (β-D-oksy-LNA) kan bli fremstilt etter publiserte prosedyrer og referenser sitert der, se for eksempel WO 03/095467 A1; D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802 - 808; og WO 2004/069991 A2.

LNA oligonukleotidene kan bli fremstilt som beskrevet i Eksemplene og i

WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 og WO 03/006475. LNA oligonukleotidene kan bli produsert ved anvendelse av oligomerisasjonsteknikker fra nukleinsyrekjemi velkjent for en person med ordinær kunnskap innen fagområdet organisk kjemi. Generelt blir standard oligomerisasjons cykuser fra fosforamiditt tilnærmelsen (S. L. Beaucage og R.

P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage og R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223) anvendt, men for eksempel kan H-fosfonat kjemi, fosfotriester kjemi også bli anvendt.

For noen monomerer, kan lengre koplingstid, og/eller gjentatte koplinger og/eller anvendelse av mer konsentrerte koplingsreagenser være nødvendig eller fordelaktig.

Fosforamidittene som benyttes kobles typisk med tilfredsstillende >95 % trinn-vise utbytter. Oksidasjon av fosfor(III) til fosfor(V) blir normalt gjort for eksempel med iod/pyridin/H2O. Dette gir etter avbeskyttelse den native fosfordiester internukleosid binding. I det tilfellet at en fosfortioat internukleosid binding blir fremstilt, blir et thiolation trinn gjennomført ved skifting av det normale, for eksempel iod/pyridin/H2O, oksidasjonen anvendt for syntese av fosfordiester internukleosid bindinger med en oksidasjon ved avendelse ADTT reagens (xantan hydrid (0,01 M i acetonitril:pyridin 9:1; v/v)). Andre tioleringsreagenser er også mulig å anvende, slik som Beaucage og PADS. Fosfortioat LNA oligonukleotider ble effektivt syntetisert med trinnvise koblings utbytter >= 98 %.

Rensing av LNA oligonukleotider kan bli gjennomført ved anvendelse av engangs revers fase rensekasetter og/eller reversert fase HPLC og/eller utfelling fra etanol eller butanol. Kapillær gel elektroforese, revers fase HPLC, MALDI-MS, og ESI-MS blir anvendt til å verifsere renheten av de syntetiserte LNA oligonukleotidene.

Salter

LNA oligonukleotidet kan bli benyttet i et antall farmasøytisk akseptable salter. Som brukt her, refererer betegnelsen til salter som beholder den ønskede biologiske aktiviteten til LNA oligonukleotid og utviser minimale uønskede toksikologiske effekter. Ikke-begrensende eksempler på slike salter kan bli dannet med organiske aminosyre og base addisjonsalter dannet med metall kationer slik som sink, kalsium, vismuth, barium, magnesium, aluminum, kopper, kobolt, nikkel, kadmium, natrium, kalium, og liknende, eller med et kation dannet fra ammoniakk, N,N-dibenzyletylendiamin, D-glucosamin, tetraetylammonium eller etylendiamin; eller kombinasjoner, for eksempel et sink tannat salt eller liknende.

Slike salter blir dannet fra LNA oligonukleotid som innehar fosfordiester gruppe og/eller fosfortioat grupper, og er for eksempel salter med passende baser. Disse saltene inkluderer, for eksempel, ikketoksiske metal salter som er avledet fra metaller fra gruppene Ia, Ib, IIa og IIb i Elementenes Periodiske System, særlig velegnet alkali metal salter, for eksempel litium, natrium eller kalium salter, eller jordalkali metall salter, for eksempel magnesium eller kalsium salter. De inkluderer videre sink og ammonium salter og også salter som er dannet med passende organiske aminer, slik som usubstituert eller hydroksyl-substituert mono-, di- eller tri-alkylaminer, særlig mono-, di- eller tri-alkylaminer, eller med kvaternære ammonium forbindelser, for eksempel med N-metyl-N-etylamin, dietylamin, trietylamin, mono-, bis- eller tris-(2-hydroksy-lower alkyl)aminer, slik som mono-, bis- eller tris-(2-hydroksyetyl)amin, 2-hydroksy-tert-butylamin eller tris(hydroksymetyl)metylamin, N,N-di-lower alkyl-N-(hydroksy-lower alkyl)aminer, slik som N,N-dimetyl-N-(2-hydroksyetyl)amin eller tri-(2-hydroksyetyl)amin, eller N-metyl-D-glucamin, eller kvaternære ammonium forbindelser slik som tetrabutylammonium salter. Litium salter, natrium salter, magnesium salter, sink salter eller kalium salter er foretrukket, med natrium salter som spesielt foretrukket.

Promedikamenter

I en utførelsesform kan LNA oligonukleotidet være i form av et pro-medikament.

Oligonukleotider er i kraft negativt ladde ioner. På grunn av den lipofile naturen til cellemembranene, er det cellulære opptaket av oligonukleotider redusert sammenliknet med nøytrale eller lipofile ekvivalenter. Denne polaritets “hindringen” kan bli unngått ved anvendelse av pro-medikament tilnærmelsen (se for eksempel Crooke, R. M. (1998) i Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp.103-140). I denne tilnærmelsen blir LNA oligonukleotider fremstilt på en beskyttet måte slik at LNA oligonukleotider er nøytrale når de blir administrert. Disse beskyttelsesgruppene er utformet på en slik måte at de kan bli fjernet når LNA oligonukleotid blir tatt opp i cellene. Eksempler på slike beskyttende grupper er Sacetyltioetyl (SATE) eller S-pivaloylthioetyl (t-butyl-SATE). Disse beskyttelsesgruppene er nuklease resistente og blir selektivt fjernet intracellulært.

Konjugater

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen angår et konjugat som omfatter et LNA oligonukleotid som definert her, minst et ikke-nukleotid eller ikke-polynukleotid del kovalent knyttet til nevnte LNA oligonukleotid.

I et beslektet trekk ved oppfinnelsen, blir LNA oligonukleotid fra oppfinnelsen bundet til ligander for å danne et konjugat, nevnte ligander har til hensikt å øke det cellulære opptaket av konjugatet relativt til antisens oligonukleotidene.

I denne sammenheng, har betegnelsen "konjugat" til hensikt å angi et heterogent molekyl dannet ved den kovalente tilknytningen til et LNA oligonukleotid som beskrevet her (det vil si et LNA oligonukleotid som omfatter en sekvens av nukleosider og LNA nukleosid analoger) til en eller flere ikke-nukleotid eller ikke-polynukleotid deler.

LNA oligonukleotidene kan således, for eksempel være konjugert eller danne chimera med ikke-nukleotid eller ikke-polynukleotid deler som inkluderer Peptid Nukleinsyrer (PNA), proteiner (for eksempel antistoffer for et mål protein), makromolekyler, lav molekyl vekt medikament substanser, fettsyre kjeder, sukker residier, glycoproteiner, polymerer (for eksempel polyetylen glycol), micelle-dannende grupper, antistoffer, karbohydrater, reseptor-bindende grupper, steroider slik som kolesterol, polypeptider, intercalaterende midler slik som et acridin derivat, en lang-kjedet alkohol, en dendrimer, et fosfolipid og andre lipofile grupper eller kombinasjoner derav, etc., akkurat som LNA oligonukleotidene kan være arrangert i dimeriske eller dendritiske strukturer. LNA oligonukleotider eller konjugater fra oppfinnelsen kan også være konjugert eller ytterligere konjugert til aktive medikament substanser, for eksempel, aspirin, ibuprofen, et sulfa medikament, et antidiabetisk middel, et antibakterielt middel, et chemoterapøytisk middel eller et antibiotikum.

Konjugering på denne måten kan gi fordelaktige egenskaper med hensyn til de farmakokinetiske egenskapene til LNA oligonukleotider. Spesielt kan konjugering på denne måten oppnå øket cellulært opptak.

I en utførelsesform blir et LNA oligonukleotid bundet til ligander for å danne et konjugat, nevnte ligander er beregnet for å øke det cellulære opptaket av konjugat relativt til antisens LNA oligonukleotidene. Denne konjugasjonen kan finne sted ved de terminale posisjonene 5’/3’-OH men ligandene kan også finne sted ved sukkere og/eller basene. Særlig kan vekstfaktoren til hvilken antisense LNA oligonukleotid kan være konjugert, omfatte transferrin eller folat. Transferrin-polylysin-oligonukleotid komplekser eller folat-polylysin-oligonukleotid komplekser kan bli fremstilt for opptak av celler som uttrykker høye nivåer av transferrin eller folat reseptor. Andre eksempler på konjugater/ligander er kolesterol deler, dupleks intercalatorer slik som acridin, poly-L-lysin, "ende-capping" med en eller flere nuklease-resistente bindingsgrupper slik som fosformonotioat og liknende.

Fremstilling av transferrin komplekser som bærere av oligonukleotid opptak i celler er beskrevet av Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Cellulær avlevering av folat-makromolekyl konjugater via folat receptor endocytose, inkludert avlevering av et antisense oligonukleotid, er beskrevet av Low et al., U.S. Patent 5,108,921. Se også, Leamon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.88, 5572 (1991).

Farmasøytisk sammensetning

Et spesielt interessant trekk ved oppfinnelsen er rettet mot en farmasøytisk sammensetning som omfatter et LNA oligonukleotid som definert her, eller et konjugat som definert her, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer eller adjuvans. Den farmasøytiske sammensetningen er fortrinnsvis velegnet for injeksjon, for topisk administrasjon, eller for intraoculær administrasjon (se videre under).

Retningslinjer for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger kan bli funnet i “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” by Alfonso R. Gennaro, og i det etterfølgende.

Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler, bærere eller adjuvanter er deler av den farmasøytiske sammensetningen. Kapsler, tabletter og piller etc. kan for eksempel inneholde de følgende forbindelsene: microkrystallinsk cellulose, gummi eller gelatin som bindemidler; stivelse eller laktose som eksipienter; stearater som smøremidler; forskjellige søtningstoffer eller aroma midler. For kapsler kan doseringsenheten inneholde en flytende bærer som fett oljer. Likeledes kan belegg av sukker eller enteriske midler være en del av doseringsenheten. Den farmasøytiske sammensetningen kan også være emulsjoner av de aktive farmasøytiske ingrediensene (inkludert LNA oligonukleotidet) og et lipid som danner en micellulær emulsjon.

Et LNA oligonukleotid kan bli blandet med et hvilket som helst materiale som ikke svekker den ønskede virkningen, eller med materiale som supplerer den ønskede virkningen. Disse kan inkludere andre medikamenter inkludert andre oligonukleosid forbindelser.

For parenteral, subkutan, intradermal eller topisk administrasjon, kan formuleringen inkludere et sterilt fortynningsmiddel (for eksempel vann), buffer(e), regulatorer av tonisitet og ionisk stryrke og antibakterielle midler. Det aktive LNA oligonukleotidet kan bli fremstilt med bærere som forenkler opptak, beskytter mot degradering eller beskytter mot umiddelbar eliminering fra kroppen, inkludert implantater eller mikrokapsler med kontrollerte frigjøringsegenskaper. For intravenøs administrasjon er de foretrukkede bærerne fysiologisk saltoppløsning (0,9 %) eller buffret saltoppøsning (for eksempel fosfat bufret saltoppløsning).

I en foretrukket utførelsesform, blir injeksjoner eller infusjoner av LNA oligonukleotidene gitt ved eller nær stedet for neovaskularisering. For eksempel kan LNA oligonukleotidene fra oppfinnelsen bli avlevert til retinale pigment epitelceller i øyet. LNA oligonukleotider blir fortrinnsvis administrert topisk til øyet, for eksempel i flytende eller gel form til det nedre øye lokk eller konjunktival cul-de-sac, hvilket er kjent kunnskap innen fagområdet (se for eksempel Acheampong AA et al, 2002, Drug Metabol. and Disposition 30: 421- 429, idet hele beskrivelsen av denne med dette er inkorporert ved referanse).

De farmasøytiske sammensetningene fra foreliggende oppfinnelsen kan bli administrert på et antall måter avhengig av om lokal eller systemisk behandling er ønsket og hvilket område som skal bli behandlet. Administrasjonen kan være (a) oral, (b) pulmonær, for eksempel ved inhalering eller innblåsing av pulvere eller aerosoler, inkludert ved forstøving; intratrakeal, intranasal, (c) topisk inkludert epidermal, transdermal, oftalmisk og til mukos membraner inkludert vaginal og rektal avgivelse; eller (d) parenteral inkludert intravenøs, intraarterielt, subkutan, intraperitoneal eller intramuskulær injeksjon eller infusjon; eller intrakranialt, for eksempel intratekal eller intraventrikulær administrasjon. I en utførelsesform blir det aktive LNA oligonukleotidet administrert intravenøst, intraperitonalt, oralt, topisk eller som en bolus injeksjon eller administert direkte inn i målorganet.

Det er for tiden antatt at den mest passende administrasjonsformen er ved intravenøse infusjons eller oralt.

Farmasøytiske sammensetninger og formuleringer for topisk administrasjon kan inkludere transdermale lapper, salver, hudkremer, kremer, geler, drops, sprayer, suppositorier, væsker og pulvere. Konvensjonelle farmasøytiske bærere, vandige, pulver eller oljeholdige baser, tykningsmidler og liknende kan være nødvendig eller ønskelig. Belagte kondomer, hansker og liknende kan også være nyttige. Foretrukkede topiske formuleringer inkluderer de der oligonukleotider fra oppfinnelsen er i blanding med et topisk avleveringsmiddel slik som lipider, liposomer, fettsyrer, fettsyre estere, steroider, chelaterende midler og overflateaktive midler. Sammensetninger og formuleringer for oral administrasjon inkluderer, men er ikke begrenset til pulvere eller granuler, micropartikkelformer, nanopartikkelformer, suspensjoner eller oppløsninger i vann eller ikke-vandige medier, kapsler, gel kapsler, poser, tabletter eller minitabletter.

Sammensetninger og formuleringer for parenteral, intratecal eller intraventrikulær administrasjon kan inkludere sterile vandige oppløsninger som også kan inneholde buffere, fortynningsmidler og andre passende additiver slik som, men ikke begrenset til, penetrasjons forbedrere, bærer forbindelser og andre farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienter.

Farmasøytiske sammensetninger fra foreliggende oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, oppløsninger, emulsjoner, og liposom-inneholdende formuleringer. Disse sammensetningene kan bli generert fra et antall komponenter som inkluderer, men er ikke begrenset til, fordannede væsker, selv- emulgerende faste stoffer og selvemulgerende halvfaste stoffer. Avgivelse av medikament til tumour vev kan bli forbedret med bærer-mediert avgivelse som innbefatter, men ikke begrenset til, kationiske liposomer, cyclodekstriner, porfyrin derivativer, forgrende kjede dendrimerer, polyetylenimin polymerer, nanopartikler og microsfærer (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1): 3 - 27).

En særlig foretrukket parenteral administrasjonsvei er intraokulær administrasjon. Det er underforstått at intraokulær administrasjon av foreliggende LNA oligonukleotider kan bli gjennomført ved injeksjon eller direkte (for eksempel topisk) administrasjon til øyet, så lenge som administrasjonsveien tillater at LNA oligonukleotidene kommer inn i øyet. I tillegg til de topiske veiene for administrasjon til øyet som beskrevet over, inkluderer passende intraokulære veier for administrasjon intravitreal, intraretinal, subretinal, subtenon, peri- og retro-orbital, trans-corneal og trans-scleral administrasjon.

For intraoculær administrasjon, kan de farmasøytiske sammensetningen bli administrert topisk, for eksempel, med lapp eller ved direkte påføring på øyet, eller ved iontoforese. Salver, sprayer, eller dryppbare væsker kan bli levert ved okulare avleveringssystemer som er kjent innen fagområdet slik som applikatorer eller eyedrypp. Sammensetningene kan bli administrert direkte til overflaten av øyet eller til innsiden av øyelokket. Slike sammensetninger kan inkludere mucomimetikere slik som hyaluronsyre, chondroitin sulfat, hydroksypropyl metylcellulose eller poly(vinyl alcohol), preservativer slik som sorbinsyre, EDTA eller benzylkronium klorid, og de vanlige mengdene av fortynningsmidler og/eller bærere.

LNA oligonukleotidet fra oppfinnelsen kan bli skaffet tilveie i vedvarende frigjøringssammensetninger, slik som de som er beskrevet i, for eksempel U.S. Patent Nr. 5, 672,659 og 5,595,760. Anvendelse av umiddelbar eller vedvarende frigjøring sammensetninger avhenger av egenskapene til tilstanden som blir behandlet. Dersom tilstanden består av en akutt eller over-akutt forstyrrelse, vil behandling med en umiddelbar frigjøringsform form være foretrukket over en forlenget frigjøringssammensetning. Alternativt for visse preventive eller lang-tids behandlinger, kan en vedvarende frigjøringssammensetning være passende.

LNA oligonukleotidet kan bli injisert inn i det indre av øyet, slik som med en nål eller annen avleveringsinnretning.

I en utførelsesform omfatter de farmasøytiske sammensetningene et LNA oligonukleotid fra oppfinnelsen (for eksempel 0,1 til 90 vekt- %), eller et fysiologisk akseptabelt salt derav, blandet med et fysiologisk akseptabelt bærer medium.

Foretrukkede fysiologisk akseptable bærer medier er vann, buffret vann, normal saltoppløsning, 0,4 % saltoppløsning, 0,3 % glycin, hyaluronsyre og liknende.

Farmasøytiske sammensetninger fra oppfinnelsen kan også omfatte konvensjonelle farmasøytiske eksipienter og/eller additiver. Passende farmasøytiske eksipienter inkluderer stabilisatorer, antioksidanter, osmolalitet justerende midler, buffere, og pH justerende midler. Passende additiver inkluderer fysiologisk biokompatible buffere (for eksempel, trometamin hydroklorid), addisjoner av chelanter (slik som for eksempel, DTPA eller DTPA- bisamid) eller kalsium chelat komplekser (som for eksempel kalsium DTPA, CaNaDTPA-bisamid), eller eventuelt tilsetninger av kalsium eller natrium salter (for eksempel, kalsium klorid, kalsium ascorbat, kalsium glukonat eller kalsium laktat). Farmasøytiske sammensetninger fra oppfinnelsen kan bli pakket for anvendelse i flytende form, eller kan bli lyofilisert.

For fast stoff sammensetninger, kan konvensjonelle ikke-toksiske faste bærere bli anvendt; for eksempel, farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesium stearat, natrium sakkarin, talkum, cellulose, glukose, sukrose, magnesium karbonat og liknende.

Et LNA oligonukleotid blir fortrinnsvis inkludert i en enhetsformulering slik som i en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel i en mengde som er tilstrekkelig til å avlevere til en pasient en terapeutisk effektiv mngde uten å forårsake alvorlige sideeffekter hos pasienten som blir behandlet.

De farmasøytiske formuleringer fra foreliggende oppfinnelsen, hvilke hensiktsmessig kan bli presentert i enhet doseringsform, kan bli fremstilt i henhold til konvensjonelle teknikker som er velkjente innen den farmasøytiske industrien. Slike teknikker inkluderer trinnet med å bringe i forbindelse de aktive ingrediensene i kontakt med de(n) farmasøytiske bæreren(e) eller eksipienten(e). Generelt blir formuleringer fremstilt ved jevnt og grundig å bringe i forbindelse de aktive ingrediensene i kontakt med flytende bærere eller finfordelte fast stoff bærere eller begge deler, og deretter om nødvendig, forming av produktet.

Sammensetningene fra foreliggende oppfinnelsen kan bli formulert til en hvilken som helst av mange mulige doseringsformer slik som, men ikke begrenset til tabletter, kapsler, gelkapsler, flytende siruper, myke geler og suppositorier. Sammensetningene fra foreliggende oppfinnelsen kan også bli formulert som suspensjoner i vandige, ikkevandige eller blandede medier. Vandige suspensjoner kan videre inneholde substanser som øker viskositeten til suspensjonen, og innbefatter for eksempel natrium karboksymetylcellulose, sorbitol og/eller dekstran. Suspensjonen kan også inneholde stabilisatorer.

I foretrukkede utførelsesformer av de farmasøytiske sammensetningene, blir LNA oligonukleotid formulert i en vandig bærer, særlig en vandig bærer som omfatter en buffer for å holde pH i området fra 4,0 – 8,5, og som har en ionisk styrke på 20 - 2000 mM.

Betegnelsen “vandig bærer” menes at den aktuelle farmasøytiske sammensetning er i flytende form, og at den flytende bæreren hovedsakelig består vann, det vil si at minst 80 % (v/v), eller minst 90 % (v/v), eller til og med minst 95 % (v/v), av bæreren består av vann. Andre flytende ingredienser kan også bli anvendt, for eksempel etanol, DMSO, etylen glycol, etc.

Den vandige bæreren omfatter fortrinnsvis saltvann eller en buffer for å holde pH i området fra 4,0 – 8,5. Bufferen vil fortrinnsvis holde pH i området fra 5,0 – 8,0, slik som i området fra 6,0 – 7,5, slik som buffret saltvann, for eksempel fosfat buffret saltvann (PBS).

Ionisk styrke/tonisitet til den farmasøytiske sammensetningen er også av viktighet. Den flytende farmasøytiske sammensetningen har således typisk en ionisk styrke i området fra 20 - 2000 mM, slik som i området fra 50 - 1500 mM, eller i området fra 100 - 1000 mM.

Kombinasjonsmedikamenter

Det skal være underforstått at den farmasøytiske sammensetning i følge oppfinnelsen eventuelt omfatter yterligere antisens forbindelser, kjemoterapeutiske midler, antiinflammatoriske forbindelser, antivirale forbindelser, cytostatisk forbindelser, antiangiogenetiske forbindelser, anti-proliferative forbindelser, pro-apoptotiske forbindelser, signal transduksjon modulatorer, kinase hemmere og/eller immunomodulerende forbindelser. Det er for tiden antatt at det er spesielt interessant å kombinere LNA oligonukleotidet med minst et kjemoterapeutisk middel.

Som fastslått kan den farmasøytiske sammensetning fra oppfinnelsen videre omfatte minst et kjemoterapeutisk middel. Den kjemoterapeutiske forbindelsen blir typisk valgt fra gruppen som består av adrenocorticosteroider, slik som prednison, dexamethason eller decadron; altretamin (hexalen, hexametylmelamin (HMM)); amifostin (etyol); aminoglutethimid (cytadren); amsacrin (M-AMSA); anastrozol (arimidex); androgener, slik som testosteron; asparaginas (elspar); Avastin; bacillus calmette-gurin; bicalutamid (casodex); bifosfanat; bleomycin (blenoxan); bortezomib; busulfan (myleran); carboplatin (paraplatin); carmustine (BCNU, BiCNU); chlorambucil (leukeran); klordeoksyadenosin (2-CDA, cladribin, leustatin); cisplatin (platinol); cyclophosphamid; cytosin arabinosid (cytarabin); dacarbazin (DTIC); dactinomycin (actinomycin-D, cosmegen); daunorubicin (cerubidin); docetaxel (taxotere); doxorubicin (adriomycin); epirubicin; estramustin (emcyt); østrogener, slik som dietylstilbestrol (DES); etoposid (VP-16, VePesid, etopophos); fludarabin (fludara); flutamid (eulexin); 5-FUDR (floxuridin); 5-fluorouracil (5-FU); gemcitabin (gemzar); goserelin (zodalex); herceptin (trastuzumab); hydroksyurea (hydrea); idarubicin (idamycin); ifosfamid; IL-2 (proleukin, aldesleukin); interferon alpha (intron A, roferon A); irinotecan (camptosar); leuprolid (lupron); levamisol (ergamisole); lomustin (CCNU); mechlorathamin (mustargen, nitrogen mustard); melphalan (alkeran); mercaptopurine (purinethol, 6-MP); methotrexat (mexate); 2-metoksyestradiol (2ME2, Panzem); mitomycin-C (mutamucin); mitoxantron (novantrone); octreotid (sandostatin); pentostatin (2-deoksycoformycin, nipent); plicamycin (mithramycin, mithracin); prorocarbazin (matulane); streptozocin; tamoxifin (nolvadex); taxol (paclitaxel); teniposid (vumon, VM-26); Thalidomide; thiotepa; topotecan (hycamtin); tretinoin (vesanoid, all-trans retinoin syre); vinblastin (valban); vincristin (oncovin) og vinorelbin (navelbine).

For behandling av multippel myelom, er kjemoterapeutiske midler som melphalan, cyclophosphamid, prednison, vincristin, doxorubicin, carmustin, dexamethason, thalidomid, bortezomib, og bifosfanat foretrukket.

For behandling av renal carcinom, er kjemoterapeutiske midler som gemcitabin, 5-fluorouracil (5-FU), 5-fluorodeoksyuridin, paclitaxel, carboplatin, ifosfamid, doxorubicin, vinblastin, IFN-alpha og IL-2 foretrukket.

I en variant skaffer foreliggende oppfinnelse til veie farmasøytiske sammensetninger inneholdende (a) et eller flere LNA oligonukleotider og (b) en eller flere andre kjemoterapeutiske forbindelser som fungerer ved en ikke-antisense mekanisme. Når anvendt med LNA oligonukleotider, kan slike kjemoterapeutiske forbindelser bli anvendt individuelt (for eksempel mithramycin og oligonukleotid), sekvensielt (for eksempel mithramycin og oligonukleotid i en tidsperiod etterfulgt av et annet middel og oligonukleotid), eller i kombinasjon med en eller flere andre slike kjemoterapeutiske forbindelser eller i kombinasjon med radioterapi. Alle kjemoterapeutiske forbindelser som er kjent for en person med kunnskap innen fagområdet, inkluderer de som eksplisitt er nevnt over, er her inkorporert som kombinasjonsbehandlinger med et LNA oligonukleotid i følge oppfinnelsen.

I en utførelsesform blir den farmasøytiske sammensetning administrert i kombinasjon med en taxan forbindelse.

Betegnelsen “taxan forbindelse” har til hensikt å innbefatte paclitaxel (Taxol<®>), paclitaxel derivater, docetaxel, taxoter, modifiserte taxaner, og taxoid analoger.

Paclitaxel (Taxol<®>) er et diterpen isolert fra barken av Western (Pacific) barlind, Taxus brevifolia og er representativ for en klasse med terapeutiske midler som har et taxan ring system. Paclitaxel og dens analoger har blitt fremstilt ved partiell syntese fra 10-deacetylbaccatin III, en forløper oppnådd fra barlind nåler og grener, og ved total syntese. Se Holton, et al., J. Am. Chem. Soc.116:1597 - 1601 (1994) og Nicolaou, et al., Nature 367: 630 (1994). Paclitaxel har demonstrert effekt i flere humane tumorer i kliniske forsøk. Se McGuire, et al., Ann. Int. Med.111: 237 - 279 (1989); Holmes, et al., J. Natl. Cancer Inst.83: 1797 - 1805 (1991); Kohn et al., J. Natl. Cancer Inst.86:18-24 (1994); og Kohn, et al., American Society for Clinical Oncology 12 (1993). De modifiserte taxan eller taxoid analogene er de forbindelsene som har en taxan ring som bærer modifiserte side kjeder. Et antall av disse analogene har forbedrede egenskaper, slik som større vannoppløslighet og stabilitet enn det til naturlig forekommende paclitaxel. Disse analogene er kjent for de med kunnskap innen fagområdet og er for eksempel beskrevet i U.S. Pat. Nr.5,278,324; 5,272,171; 5,254,580; 5,250,683;

5,248,796; og 5,227,400, idet beskrivelsene i disse er inkorporert her med referanse. Paclitaxel og taxotere kan bli fremstilt ved fremgangsmåtene i WO 93/18210, EP 0253 739, EP 0253 739, og WO 92/09589, beskrivelsene i disse er inkorporert her med referanse. I spesielle utførelsesformer, er taxane forbindelse paclitaxel eller taxotere.

Vektforholdet mellom taxane forbindelsen(e) og LNA oligonukleotid i nevnte sammensetning er typisk i området fra 50:1 til 1:25, slik som i området fra 25:1 til 1:25, eller i området fra 10:1 til 1:25, eller i området fra 1:1 til 1:25, eller i området fra 50:1 til 1:10, eller i området fra 1:1 til 1:50, eller i området fra 25:1 til 1:10.

I en ytterligere utførelsesform kan farmasøytiske sammensetninger fra oppfinnelsen inneholde en eller flere LNA oligonukleotider og en eller flere ytterligere antisens forbindelser målrettet til et andre nukleinsyre mål. To eller flere kombinerte forbindelser kan bli anvendt sammen eller i rekkefølge.

Anti-inflammatoriske medikamenter, inkludert men ikke begrenset til ikke-steroidale anti-inflammatoriske medikamenter og corticosteroider, antiviral medikamenter, og immun-modulerende medikamenter kan også bli kombinert til sammensetninger fra oppfinnelsen. To eller flere kombinerte forbindelser kan bli anvendt sammen eller i rekkefølge.

De farmasøytiske sammensetningene som omfatter LNA oligonukleotidene kan bli anvendt i kombinasjon med radioterapi, etc.

Medisinsk behandling

LNA oligonukleotider fra oppfinnelsen er nyttige for et antall of terapeutiske anvendelser som angitt her. Generelt inkluderer de terapeutiske fremgangsmåtene fra oppfinnelsen, administrasjon av en terapeutisk effektiv mengde av et LNA-modifisert oligonukleotid til et pattedyr, særlig et menneske.

Foreliggende oppfinnelsen angår således også et LNA oligonukleotid som definert her eller et konjugat som definert her for anvendelse som et medikament.

Dosering er avhengig av alvorlighet og mottagelighet av sykdomstilstanden som skal bli behandlet, og forløpet på behandlingen som vare fra flere dager til flere måneder, eller inntil en helbredelse er gjennomført eller en reduksjon av sykdomstilstanden er oppnådd. Optimale doseringsskjemaer kan også bli bestemt ved målinger av medikament i kroppen til pasienten eller ved surrogat markører.

Optimale doseringer kan variere avhengig av den relative potensen til de individuelle oligonukleotidene. Generelt kan det bli estimert basert på EC50s funnet å være effektive i in vitro og in vivo dyremodeller. Generelt er doseringen fra 0,01 µg til 1 g per kg kroppsvekt, og kan bli gitt en gang eller flere ganger daglig, ukentlig, månedlig eller årlig, eller til og med en gang hvert 2 til 10 år eller ved kontinuerlig infusjon i timer opp til several måneder. Repeterende mengder for dosering kan bli estimert basert på målte oppholdstider og konsentrasjoner av medikamentet i kroppsfluider eller vev. Etter vellykket behandling, kan det være ønskelig å la pasienten gjennomgå vedlikeholds terapi for å hindre tilbakefall av sykdomstilstanden. Det er for tiden antatt at de mest relevante dosene er 0,01 mg til 100 mg, slik som 0,1 mg til 40 mg, eller 0,5 mg til 10 mg, per kg kroppsvekt. Slike doser kan bli gitt en gang daglig, men mer foretrukket mindre hyppig, for eksempel 1 - 3 ganger per uke, i en periode på 1 - 4 uker.

Vedlkeholdsterapi kan bli fortsatt, for eksempel 1 - 4 ganger per måned, eller til og med mindre hyppig slik som 1 - 10 ganger per år.

En person med kunnskap innen fagområdet vil være kjent med at LNA oligonukleotider kan bli anvendt til å bekjempe HIF-1a forbundede sykdommer via mange forskjellige prinsipper, som således faller innenfor oppfinnelsestanken til foreliggende oppfinnelse.

Som brukt her vil betegnelsen "mål nukleinsyre" innbefatte DNA som koder for HIF-1a, RNA (inkludert pre-mRNA og mRNA) transkribert fra slik DNA, og også cDNA avledet fra slik RNA.

Som brukt her, vil betegnelsen "gen" mene genet inkludert exoner, introner, ikkekodende 5 ́and 3 ́regioner og regulatoriske elementer og alle for tiden kjente varianter derav og en hvilken som helst annen ytterligere variant, som kan bli klarlagt.

Som brukt her, vil betegnelsen “LNA oligonukleotid” referere til et oligonukleotid som kan indusere en ønsket terapeutisk effekt i mennesker gjennom for eksempel binding med hydrogen binding til enten et målgen “Chimeraplast” og “TFO”, til RNA transkript(er) av målgenet “antisens hemmere”, “siRNA”, “miRNA”, “ribozymer” og oligozymer” eller til proteinet(ene) som er kodet av målgenet “aptamer”, spiegelmer” eller “decoy”.

Som brukt her vil betegnelsen “mRNA” mene de for tiden kjente mRNA transkript(er) til et målgen, og en hvilken som helst av ytterligere transkripter, som kan bli identifisert.

Som brukt her vil betegnelsen "modulasjon" mene enten en økning (stimulering) eller en nedgang (hemming) i ekspresjon av et gen. I foreliggende oppfinnelse, er hemming den foretrukkede formen for modulering av genekspresjon og mRNA er et foretrukket mål.

Som brukt her betyr betegnelsen "målretting" en antisense forbindelse til en spesiell mål nukleinsyre, tilveiebringelse av antisense oligonukleotidet til cellen, dyret eller mennesket på en slik måte at antisense forbindelsen er i stand til å binde til og modulere funksjonen til dens tilsiktede mål.

LNA oligonukleotider kan bli utformet som siRNA ́s som er små dobbeltrådede RNA molekyler som blir anvendt av cellene til stille spesifikke endogene eller exogene gener, ved en fremdeles dårlig forstått “antisens-liknende” mekanisme.

Den kliniske effektiviteten til antisens oligonukleotider avhenger i en signifikant grad av deres farmakokinetikk, for eksempel absorpsjon, distribusjon, cellulært opptak, metabolisme og ekspresjon. I sin tur blir disse parametrene styrt signifikant av den underliggende kjemien og størrelsen og tre-dimensjonal struktur på oligonukleotidet.

Modulering av de farmakokinetiske egenskapene til et LNA oligonukleotid i følge oppfinnelsen kan videre bli oppnådd gjennom tilknytning til et antall forskjellige deler. For eksempel kan evnen til oligonukleotider å passere cellmembranen bli forbedret ved tilknytning for eksempel lipid deler slik som en kolesterol del, en tioeter, en alifatisk kjede, et fosfolipid eller et polyamin til oligonukleotidet. På liknende vis kan opptak av LNA oligonukleotider inn i cellene, bli frobedret ved konjugerende deler til oligonukleotidet som samreagerer med molekylene i membranen, hvilken formidler transport inn i cytoplasma.

De farmakodynamiske egenskapene kan i følge oppfinnelsen bli forbedret med grupper som forbedrer LNA oligonukleotid opptak, forbedrer biostabilitet slik som forbedret LNA oligonukleotid resistens mot degradering, og/eller økning av spesifisitet og affinitet av oligonukleotid hybridisering egenskaper med målsekvens for eksempel en mRNA sekvens.

Den farmasøytiske sammensetningen i følge oppfinnelsen kan bli anvendt for behandling av mange forskjellige sykdommer. Som cancer celler som proliferer, er vaskulære endotele celler sensitive mot ned-regulering av HIF-1a ekspresjon. Den farmasøytiske sammensetning i følge oppfinnelsen kan derfor bli anvendt ved behandling av sykdommer kjennetegnet ved unormal sykdom som forårsaker angiogenese. Eksempler på slike sykdommer er generell cancer og arterosclerose, psoriasis, diabetisk retinopati, maculær degenerering, reumatoid artritt, astma, inflammatorisk tarm sykdom, vorter, allergisk dermatitt og Karposis sarcom.

Generelt er et trekk ved oppfinnelsen rettet mot en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr som lider av eller er utsatt for en sykdom forårsaket av unormal angiogenese, og omfatter administrering til pattedyret av en terapeutisk effektive mengde med et LNA oligonukleotid eller et konjugat som definert her.

Videre angår også oppfinnelsen en fremgangsmåte for hemming av angiogenese og omfatter administrasjon av et LNA oligonukleotid som definert her, eller et konjugat som definert her, eller en farmasøytisk sammensetning som definert her.

Et interessant trekk ved oppfinnelsen er rettet mot anvendelsen av et LNA oligonukleotid som definert her, eller som konjugat som definert her for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom valgt fra arterosclerose, psoriasis, diabetisk retinopati, macular degenerering, reumatoid artritt, astma, inflammatorisk tarm sykdom, vorter, allergisk dermatitt, inflammasjon, og hud inflammasjon, eller andre hud beslektede sykdommer.

De farmasøytiske sammensetningene i følge oppfinnelsen kan også bli anvendt i behandling av inflammatorisk sykdom, inflammasjoner slik som hud inflammasjoner eller andre hudsykdommer eller forstyrrelser, for eksempel psoriasis og reumatoid arthritt.

Et annet interessant trekk ved oppfinnelsen er rettet mot en fremgangsmåte for behandling av en sykdom valgt fra gruppen som består av arterosklerose, psoriasis, diabetisk retinopati, reumatoid arthritt, astma, inflammatorisk tarm sykdom, vorter, allergisk dermatitt, inflammasjon, og hud inflammasjon, idet nevnte fremgangsmåte omfatter administrering av et LNA oligonukleotid som definert her eller et konjugat som definert her eller en farmasøytisk sammensetning som definert her til en pasient med behov for dette.

Spesielt interessant er angiogene sykdommer inkludert diabetisk retinopati, maculær degenerasjon, psoriasis, reumatoid artritt inflammatorisk tarm sykdom, og andre inflammatoriske sykdommer. Disse sykdommene er kjennetegnet ved destruksjon av normalt vev av nylig dannede blodkar i området med neovaskularisering. I maculær degenerering, blir for eksempel, choroiden invadert og ødelagt av kapillarier. Den angiogenese-drevne destruksjonen av choroiden i maculær degenerering fører eventuelt til delvis eller full blindhet.

Fremgangsmåtene fra oppfinnelsen blir fortrinnsvis benyttet for behandling eller profylakse mot sykdommer forårsaket av cancer, særlig for behandling av cancer som kan forekomme i vev slik som lunge, bryst, colon, prostata, pancreas, lever, thyroid, nyre, hjerne, testis, mage, intestin, tarm, ryggrad, sinuser, blære, urinrør eller ovarie cancer.

Oppfinnelsen som er beskrevet her innbefatter videre en fremgangsåte for forhindring eller behandling av cancer og omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et HIF-1a modulerende LNA oligonukleotid, inkludert men ikke begrenset til høye doser av LNA oligonukleotidet, til et menneske med behov for slik behandling. Oppfinnelsen innbefatter videre anvendelse i en kort periode med administrasjon av et HIF-1a modulerende LNA oligonukleotid. Normale, ikke-cancerholdige celler deles ved en frekvens som er karakteristisk for den spesielle celletypen. Når en celle har blitt omdannet til en cancertilstand, resulterer det i ukontrollert celleproliferasjon og redusert celledød, og derfor er promiskøs celledeling eller cellevekst et kjennemerke på en cancerartet celletype.

Eksempler på cancer typer inkluderer men er ikke begrenset til, ikke-Hodgkin's lymfom, Hodgkin's lymfom, leukemi (for eksempel akutt leukemi slik som akutt lymfocytisk leukemi, akutt myelocytisk leukemi, kronisk myeloid leukemi, kronisk lymfocytisk leukemi, multippel myelom), colon karsinom, rektal karsinom, pankreatisk cancer, bryst cancer, ovarie cancer, prostata cancer, renal celle karsinom, hepatom, galle kanal karsinom, koriokarsinom, cervikal cancer, testikulær cancer, lunge karsinom, blære karsinom, melanom, hode og nakke cancer, hjerne cancer, cancere av ukjent primær sted, neoplasmer, cancere i det perifere nerve systemet, cancere i det central nervesystemet, tumorer (for eksempel fibrosarcom, myxosarcom, liposarcom, chondrosarcom, osteogent sarcom, chordom, angiosarcom, endoteliosarcom, lymfangiosarcom, lymfangioendoteliosarcom, synoviom, mesoteliom, Ewing's tumor, leiomyosarcom, rhabdomyosarcom, squamous celle karsinom, basal celle karsinom, adenokarsinom, svette kjetel karsinom, fettkjertel karsinom, papillært karsinom, papillære adenokarsinomer, cystadenokarsinom, medullært karsinom, bronkogent karsinom, seminom, embryonal karsinom, Wilms' tumor, små celle lunge karsinom, epitel karsinom, gliom, astrocytom, medulloblastom, craniopharyngiom, ependymom, pinealom, hemangioblastom, akustisk neurom, oligodendrogliom, meningiom, neuroblastom, og retinoblastom), tung kjedet sykdom, metastaser, eller en hvilken som helst sykdom eller forstyrrelse kjennetegnet ved ukontrollert eller unormal cellevekst.

Betegnelsen “karcinom” har til hensikt å indikere en ondartet tumor av epitel opprinnelse. Epitel vev dekker eller bekler kroppsoverflatene på innsiden og outsiden av kroppen. Eksempler på epitel vev er hud og mukosa og serosa som bekler kroppens hulrom og indre organer, slik som tarmene, urinblære, uterus, etc. Epitel vev kan også strekke seg inn i dypere vev lag for å danne kjertler, slik som mukus-utskillende kjertler.

Betegnelsen “sarkom” har til hensikt å angi en ondartet tumor som vokser fra bindevev, slik som brusk, fett, muskler, sener og ben.

Betegnelsen “gliom”, når den blir brukt her, har til hensikt å dekke en ondartet tumor som har opprinnelse fra gliale celler.

Ved anvendelse av et LNA oligonukleotid fra oppfinnelsen eller som konjugat av oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av cancer, kan nevnte cancer passende være i form av en fast stoff tumor. Videre er nevnte cancer også et passende karcinom. Karcinomet blir typisk valgt fra gruppen som består av ondartet melanom, basalt celle karsinom, ovarie karsinom, bryst karsinom, non-small celle lunge cancer, renal celle karsinom, blære karsinom, periodisk overflate blærecancer, mage karsinom, prostatisk karsinom, pancreatisk karsinom, lunge karsinom, cervical karsinom, cervical dysplasi, laryngal papillomatose, colon karsinom, colorectal karsinom og carcinoide tumorer. Mer typisk blir nevnte karsinom valgt fra gruppen bestående av malignant melanom, ikke-ubetydelig celle lungecancer, bryst karsinom, colon karsinom og renal cellekarsinom. Det ondartede melanomet blir typisk valgt fra gruppen bestående av overfladisk spredende melanom, nodulært melanom, lentigo maligna melanom, acral melagnom, amelanotisk melanom og desmoplastisk melanom.

Alternativt kan cancer passende være et sarkom. Sarkomet er typisk i en form valgt fra gruppen bestående av osteosarkom, Ewing’s sarkom, chondrosarkom, malignant fibrøst histiocytom, fibrosarkom og Kaposi’s sarkom.

Alternativt kan canceren være et gliom.

LNA oligonukleotider og konjugater definert her er også antatt å være særlig nyttige for behandling av en cancer sykdom utvalgt fra gruppen som består av multippel myelom, renal cancer, cervical cancer, hjernecancer, og brystcancer.

Oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet i en fremgangsmåte for behandling av cancer, idet nevnte fremgangsmåte omfatter administrering av et LNA oligonukleotid som definert her, eller et konjugat som definert her, eller en farmasøytisk sammensetning som definert her til en pasient med behov for dette. I en variant er canceren i form av en fast stoff tumor. Fast stoff cancer kan passende være et karsinom eller et sarkom eller et gliom, som diskutert over.

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen er således rettet mot anvendelse av et LNA oligonukleotid som definert her eller som konjugat som definert her for fremstilling av et medikament for behandling av cancer, der nevnte medikament videre omfatter et kjemoterapeutisk middel valgt fra de som er definert foran under “Kombinasjonsmedikamenter”. Det er passende at det ytterligere kjemoterapeutiske midlet blir valgt fra taxaner slik som Taxol, Paclitaxel eller Docetaxel.

Alternativt angitt kan oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen bli benyttet i en fremgangsmåte for behandling av cancer, idet nevnte fremgangsmåte omfatter administrering av et LNA oligonukleotid som definert her, eller et konjugat som definert her eller en farmasøytisk sammensetning som definert her, til en pasient med behov for dette, og som videre omfatter administrasjon av et ytterligere kjemoterapeutisk agent. Nevnte ytterligere administrasjon kan være slik at det ytterligere kjemoterapeutiske midlet blir konjugert til LNA oligonukleotidet i oppfinnelsen, er til stede i den farmasøytiske sammensetningen, eller blir administrert i en separat formulering.

I en foretrukket utførelsesform skaffer foreliggende oppfinnelsen til veie farmasøytiske sammensetninger som inneholder (a) en eller flere antisens forbindelser og (b) et eller flere andre kjemoterapeutiske midler som forhindrer microtubul depolymerisasjon og spenning som dannes ved kinetochorer i søster chromatider, men ikke festing av microtubuler til kinetochorene. Slike kjemoterapeutiske midler inkluderer taxaner som definert over, særlig Taxol, Paclitaxel og Docetaxel. Når anvendt med LNA oligonukleotidene fra oppfinnelsen, bør kjemoterapeutiske midler bli anvendt i rekkefølge ved å starte med oligonukleotid behandling i en tidsperiode som sensitiserer målcellene for etterfølgende co-behandling med det kjemoterapeutiske midlet ved redusering av nivået med HIF-1a protein i tumorceller og proliferering av endotele celler i tumor vaskulaturen.

I en annen foretrukket utførelsesform, blir den medisinske behandlingen som anvender et LNA oligonukleotid i følge foreliggende oppfinnelsen kombinert med strålingsbehandling. Når anvendt med LNA oligonukleotider i oppfinnelsen, bør strålingsbehandlingen bli anvendt i rekkefølge, ved å starte med oligonukleotid behandling i en tidsperiode som sensitiserer målcellene til etterfølgende ytterligere radioterapi ved redusering av nivået av HIF-1a protein i tumorceller og proliferering av endotele celler i tumor vaskulaturen.

LNA oligonukleotidene fra foreliggende oppfinnelsen kan også bli utnyttet som forskningsreagenser for diagnostikk, terapeutiske midler og profylakse. I forskning kan antisens oligonukleotider bli anvendt til spesifikt å hemme syntese av HIF-1a gener i celler og forsøksdyr forenkler derved funksjonell analyse av mål eller en vurdering av den nytte som et mål for terapeutisk intervensjon. I diagnostikk kan antisens oligonukleotider bli anvendt til å detektere og kvantitere HIF-1a ekspresjon i celler og vev ved Northern blotting, in-situ hybridisering eller liknende teknikker. For terapeutiske midler, kan et dyr eller et menneske, mistenkt for å ha en sykdom eller forstyrrelse, som kan bli behandlet ved modulering av ekspresjon av HIF-1a, bli behandlet ved administering antisense LNA oligonukleotider i følge denne oppfinnelsen. Oligonukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet i fremgangsmåter for behandling av et dyr, særlig mus og rotte og behandling av et menneske, mistenkt for ha eller har tendens til en sykdom eller tilstand, assosiert med ekspresjon av HIF-1a ved administering av en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av en eller flere av antisens LNA oligonukleotidene eller konjugatene eller de farmasøytiske sammensetningene fra oppfinnelsen.

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen er rettet mot en fremgangsmåte for indusering av apoptose som omfatter administrasjon av et LNA oligonukleotid som her, et konjugat som definert her eller en farmasøytisk sammensetning som definert her. Induksjon av apoptose er in vitro. Induksjon kan bli gjort på en cellulær analyse eller i en vevprøve.

Et beslektet trekk ved oppfinnelsen er rettet mot en fremgangsmåte til forhindring av cellulær proliferasjon og omfatter administrasjon av et LNA oligonukleotid som definert her eller et konjugat som definert her eller en farmasøytisk sammensetning som definert her. Forhindring av proliferasjon er in vitro. Forhindring kan bli gjort på en cellulær analyse eller i en vevsprøve.

Videre kan oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen bli benyttet i en fremgangsmåte for behandling av en angiogen sykdom som omfatter administrasjon av et LNA oligonukleotid som definert her eller et konjugat som definert her eller en farmasøytisk sammensetning som definert her, slik at angiogenese forbundet med den angiogene sykdomen blir hemmet.

I en utførelsesform omfatter den angiogene sykdommen en tumor forbundet med en cancer; se også over. Cancer blir fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av brystcancer, lungecancer, hodecancer og nakkecancer, hjernecancer, abdominal cancer, colon cancer, colorectal cancer, øsofagus cancer, gastrointestinal cancer, gliom, lever cancer, tunge cancer, neuroblastom, osteosarcom, ovariecancer, pankreatisk cancer, prostata cancer, retinoblastom, Wilm's tumor, multippel myelom, hudcancer, lymfom, og blodcancer. Alternativt blir cancer valgt fra gruppen bestående av multippel myelom, renal cancer, cervical cancer, colon cancer, hjernecancer, og brystcancer.

Den angiogene sykdommen kan også bli valgt fra gruppen bestående av diabetisk retinopati, maculær degenerasjon, og inflammatoriske sykdommer. Særlig er angiogene sykdommer en inflammatorisk sykdom valgt fra inflammatorisk tarm sykdom, psoriasis og reumatoid artritt.

Behandling av maculær degenerasjon er antatt å være særlig relevant med LNA oligonukleotider ifølge oppfinnelsen.

Sett

Dersom den farmasøytiske sammensetningen i flytende form er under risiko for å være utsatt for forhold som vil kompromittere stabiliteten til LNA oligonukleotidet, kan det være foretrukket å produsedre det ferdige produktet inneholdende LNA oligonukleotidet i en fast form, for eksempel som et frysetørket materiale, og lagre produktet i slik fast form. Produktet kan deretter bli rekonstituert (for eksempel oppløst eller suspendert) i en saltoppløsning eller i en buffret saltoppløsning klar for anvendelse forut for administrasjon.

Foreliggende oppfinnelsen også skaffer således til veie et sett som omfatter

(a) en første komponent som inneholder et LNA oligonukleotid eller et konjugat som definert over i fast stoff form, og

(b) en andre komponent som inneholder saltoppløsning eller en buffer oppløsning (for eksempel buffret saltoppløsning) tilpasset for rekonstitusjon (for eksempel oppløsning eller suspensjon) av nevnte LNA oligonukleotid.

Nevnte saltoppløsning eller bufret saltoppløsning har en pH i området fra 4,0 – 8,5, og en molaritet på 20 - 2000 mM. I en foretrukket utførelsesform har saltoppløsningen eller den buffrede saltoppløsningen en pH på 6,0 – 8,0 og en molaritet på 100 - 500 mM. I en mest foretrukket utførelsesform har saltoppløsningen eller den buffrede saltoppløsningen en pH på 7,0 – 8,0 og en molaritet på 120 – 250 mM

For et slikt sett, LNA oligonukleotidet har SEQ ID NO.1.

Oppfinnelsen blir ytterligere illustrert på en ikke-begrensende måte ved hjelp av eksemplene.

EKSPERIMENTELT

Eksempel 1: Monomer syntese

LNA monomer byggeblokker og derivater derav ble fremstilt etter publiserte prosedyrer og referanses som er sitert der, se for ekempel WO 03/095467 A1 og D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.

Eksempel 2: Oligonukleotid syntese

Oligonukleotider ble syntetisert ved anvendelse av fosforamiditt tilnærmelsen på en Expedite 8900/MOSS synthesizer (Multiple Oligonukleotid Synthesis System) ved 1 μmol eller 15 μmol skala. For større skala syntese ble en Äkta Oligo Pilot anvendt. På slutten av syntesen (DMT-on), ble oligonukleotidene kløyvet fra fast stoff bæreren ved anvendelse av vandig ammoniakk i 1 - 2 timer ved romtemperatur, og videre avbeskyttet i 4 timer ved 65 °C. Oligonukleotidene ble renset ved revers fase HPLC (RP-HPLC). Etter fjerning av DMT-gruppen, ble oligonukleotidene karakterisert ved AE-HPLC, RP-HPLC, og CGE og den molekylære massen ble ytterligere bekreftet ved ESI-MS. Se under for mer detaljer.

Preparering av LNA-fast stoff bæreren:

Preparering av LNA succinyl hemiester

5’-O-Dmt-3’-hydroksy-LNA monomer (500 mg), suksinisk anhydride (1,2 ekv.) og DMAP (1,2 ekv) ble oppløst i DCM (35 mL). Reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur over natten. Etter ekstraksjoner med NaH2PO40,1 M pH 5,5 (2x) og saltoppløsning (1x), ble det organiske laget tørket videre med vannfri Na2SO4filtret og inndampet. Hemiester derivatet ble oppnådd i 95 % utbytte og ble anvendt uten noe ytterligere rensing.

Preparering av LNA-bæreren

Det ovenfor preparerte hemiester derivatet (90 μmol) ble oppløst i en minimum mengde av DMF, DIEA og pyBOP (90 μmol) ble tilsatt og blandet sammen i 1 min. Denne preaktiverte blandingen ble kombinert med LCAA-CPG (500 Å, 80-120 mesh størrelse, 300 mg) i en manuell syntetiserer og omrørt. Etter 1,5 timer ved romtemperatur, ble bæreren filtrert av og vasket med DMF, DCM og MeOH. Etter tørking, ble ladning bestemt til å være 57 μmol/g (se Tom Brown, Dorcas J.S.Brown. Modern machineaided methods of oligodeoksyribonukleotides synthesis. I: F. Eckstein, editor.

Oligonukleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13 -14).

Elongering av oligonukleotid

Kopling av fosforamiditene (A(bz), G(ibu), 5-metyl-C(bz)) eller T-β-cyanoetylphosphoramidite) blir utformet ved anvendelse av en oppløsning med 0,1 M av 5’-O-DMT-beskyttet amiditt i acetonitril og DCI (4,5–dicyanoimidazol) i acetonitril (0,25 M) som aktivator. Tiolering blir gjennomført ved anvenelse av xantan klorid (0,01 M i acetonitril:pyridin 10 %). Resten av reagensene er de som typisk blir anvendt for oligonukleotid syntese. Protokollen som var tilveiebragt fra leverandøren ble hensiktsmessig optimalisert.

Rensing ved RP-HPLC:

Kolonne: Xterra RP18

Strømningshastighet: 3 mL/min

Buffere: 0,1 M ammonium acetat pH 8 og acetonitril

Forkortelser

DMT: Dimetoksytrityl

DCI: 4,5-Dicyanoimidazol

DMAP: 4-Dimetylaminopyridin

DCM: Diklorometan

DMF: Dimetylformamid

THF: Tetrahydrofuran

DIEA: N,N-diisopropyletylamin

PyBOP: Benzotriazol-1-yl-oksy-tris-pyrrolidino-fosfonium hexafluorfosfat Bz: Benzoyl

Ibu: Isobutyryl

Eksempel 3: Design av LNA oligonukleotidet

Tabell 1 – LNA oligonukleotider

I Tabell 1 betegner store bokstaver en β-D-oksy-LNA nukleotid analog (β-D-oksy-LNA), små bokstaver betegner et 2-deoksynukleotid, understreket betegner enten en beta-D-oksy-LNA nukleotid analog eller en 2-deoksynukleotid, senket indeks “s” betegner en fosfortioat binding mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotid analoger, og ingen indeks mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotid analoger betegner en fosfordiester binding, og indeks “x” betegner enten en fosfortioat binding eller en fosfordiester binding mellom nabostilte nukleotider/LNA nukleotid analoger, og nukleotid enheter i en parentes, respektivt for eksempel (TX) eller (Gx), representerer en valgfri enhet. Alle LNA-C monomerer er 5-metyl-C (<Me>C).

Måling av smeltetemperatur (Tm) til forbindelsene:

En 3 µM oppløsning med SEQ ID NO.1 i 10 mM natrium fosfat/100 mM NaCl/ 0,1 nM EDTA, pH 7,0 ble blandet med sitt komplement DNA/RNA 3 µM i 10 mM natrium fosfat/100 mM NaCl/ 0,1 nM EDTA, pH 7,0 ved 90<o>C i et minutt og fikk anledning til å avkjøles til romtemperatur. Tmtil dupleks ble deretter bestemt ved økning av temperaturen 1°C/min. fra 25 til 95 ºC. Tmtil SEQ ID NO.1 er vist i Tabell 2 under:

Tabell 2

Eksempel 4: Stabilitet of LNA oligonukleotids i human eller rotte plasma

LNA oligonukleotid stabilitet ble testet i plasma fra menneske eller rotter (det kunne også være mus, ape eller hundeplasma). I 45 µl plasma, blir 5 µl LNA oligonukleotid tilsatt (en sluttkonsentrasjon på 20 μM). LNA oligonukleotidene blir inkubert i plasma i tidsperioder som er i området fra 0 til 96 timer ved 37 ºC (plasma blir testet for nuklease aktivitet i opptil 96 timer og viser ingen forskjell i nuklease kløyve-mønster). Ved den angitte tiden ble prøven hurtigfrosset i flytende nitrogen.2 μl (lik 40 pmol) LNA oligonukleotid i plasma ble fortynnet ved tilsetning av 15 μl vann og 3 μl 6x ladning farge (Invitrogen). Som markør blir en 10 bp ladder (In vitrogen 10821-015) benyttet. Til 1 µl ladder blir1 µl 6x ladning og 4 µl vann tilsatt. Prøvene blir blandet, oppvarmet til 65 ºC i 10 min og ladet på en forbehandlet gel (16 % acrylamid, 7 M UREA, 1x TBE, forbehandlet ved 50 Watt for 1 h) og kjørt ved 50 - 60 Watt for 21⁄2 timer. Deretter ble gelen farget med 1x SyBR gull (molekylær prober) i 1x TBE i 15 min. Båndene ble visualisert ved anvendelse av en phosphoimager fra Biorad. (Se Figur 1A i rotte plasma & Figur 1B human og rotte plasma.)

LNA oligonukleotidstabilitet ble testet i plasma fra mennesker (det kunne også være rotte, mus, ape eller hundeplasma). En slutt konsentrasjon på 20 μM (mellom 1 eller 5 μL) LNA oligonukleotid ble satt til et totalvolum på 20 μL plasma og inkubert i tidsperioder som strekker seg fra 0 til 24 timer (den kunne være opp til 72 timer -plasma har blitt testet for nuklease aktivitet opp til 72 timer og det er ingen forskjell i kløyve-mønsteret). På det angitte tidspunktet ble prøven lagret ved -80 °C.1 μl (lik s 20 pmol) LNA oligonukleotider i plasma ble fortynnet 10 x i vann og kjørt på en 16 % acrylamid, 7 M UREA gel med en 10 bp ladder (fra In vitrogen (kat nr.10821-015)). Gelen ble kjørt ved tilnærmet 40 Watt i 2-3 timer før den ble farget med 1x SyBR gull (molekylære prober) i 1x TBE for 15 min. Båndene ble visualisert ved anvendelse av phosphoimager fra Biorad. (Se Figur 1).

Eksempel 5: In vitro model: Cellekultur

Effekten av LNA oligonukleotider på mål nukleinsyre ekspresjon kan bli testet i et hvilket som helst av et antall celletyper forutsatt at mål nukleinsyren er tilstede ved målbare nivåer. Mål kan bli uttrykt endogent eller ved transient eller stabil transfeksjon av en nukleinsyre som koder for nevnte nukleinsyre.

Ekspresjonsnivået av mål nukleinsyre kan rutinemessig bli bestemt ved anvendelse av for eksempel, Northern blot analyse, kvantitativ PCR, Ribonuclease beskyttelsesprøver. De etterfølgende celletypene blir tilveiebragt av illustrative hensikter, men andre celletyper kan rutinemessig bli anvendt, forutsatt at målet blir uttrykt i den valgte celletypen.

Celler ble dyrket i passende medium som beskrevet under og opprettholdt ved 37 ºC ved 95 – 98 % fuktighet og 5 % CO2. Når dyrket under hypoksi eller anoxi, ble O2nivåene holdt ved henholdsvis 1 – 2 % eller 0 – 0,5 %. Celler ble rutinemessig gjennomgått 2 - 3 ganger ukentlig.

15PC3: Den humane prostata cancer cellelinjen 15PC3 ble velvillig donert av Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, Nederland og ble dyrket i DMEM (Sigma) 10 % føtalt bovint serum (FBS) Glutamax I gentamicin.

PC3: Den humane prostata cancer cellelinjen PC3 ble innkjøpt fra ATCC og ble dyrket i F12 Coon’s med glutamin (Gibco) 10 % FBS gentamicin.

518A2: Den humane melanom cancer cellelinjen 518A2 ble velvillig donert av Dr. B. Jansen, Section of experimental Oncology, Molecular Pharmacology, Department of Clinical Pharmacology, University of Vienna og ble dyrket i DMEM (Sigma) 10 % føtalt bovint serum (FBS) Glutamax I gentamicin.

U373: U373 glioblastom celler ble dyrket i EMEM (Sigma) inneholdende 10 % føtalt bovint serum pluss Glutamax I, NEAA, Natrium Pyruvat og gentamicin ved 37 ºC, 95 % fuktighet og 5 % CO2.

HeLa: Den cervicale karsinom cellelinjen HeLa ble dyrket i MEM (Sigma) inneholdende 10 % føtalt bovint serum gentamicin ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2.

MPC-11: Den murine multiple myelom cellelinjen MPC-11 ble innkjøpt fra ATCC og opprettholdt i DMEM med 4mM Glutamax 10 % Horse Serum.

DU-145: Den humane prostata cancer cellelinjen DU-145 ble innkjøpt fra ATCC og opprettholdt i RPMI med Glutamax 10 % FBS.

RCC-4 /- VHL: Den humane renale cancer cellelinjen RCC4 stabilt transfektert med plasmid som uttrykker VHL eller tomt plasmid ble innkjøpt fra ECACC og opprettholdt i henhold til produsentenes instruksjoner.

786-0: Den humane renale cellekarsinom cellelinjen 786-0 ble innkjøpt fra ATCC og opprettholdt i henhold til produsentenes instruksjoner.

HUVEC: Den humane umbilicale vene endotele cellelinjen HUVEC ble innkjøpt fra Camcrex og opprettholdt i EGM-2 medium.

K562: Den humane kroniske myelogene leukemi cellelinjen K562 var innkjøpt fra ECACC og opprettholdt i RPMI med Glutamax 10 % FBS.

U87MG: Den humane glioblastom cellelinjen U87MG var innkjøpt fra ATCC og opprettholdt i henhold til produsentenes instruksjoner.

B16: Den murine melanom cellelinjen B16 var innkjøpt fra ATCC og opprettholdt i henhold til produsentenes instruksjoner.

LNCap: Den humane prostata cancer cellelinjen LNCap var innkjøpt fra ATCC og opprettholdt i RPMI med Glutamax 10 % FBS

Eksempel 6: In vitro modell: Behandling med antisens oligonukleotid Celledyrking og transfeksjoner: U373 eller HeLa celler ble sådd i 12-brønner plater ved 37 °C (5 % CO2) i D vekst media supplert med 10 % FBS, Glutamax I og Gentamicin. Når cellene var 60 – 70 % konfluente, ble de transfektert i duplikater ved forskjellige konsentrasjoner av oligonukleotider (0,2 – 100 nM) ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (2,5 - 5 µg/ml). Transfeksjoner ble gjennomført hovedsakelig som beskrevet av Dean et al. (1994, JBC 269: 16416 - 16424). I korte trekk ble celler inkubert i 10 min. med Lipofectamin i OptiMEM etterfulgt av tilsetning av oligonukleotid til et totalvolum på 0,5 ml transfeksjon mix per brønn. Etter 4 timer ble transfeksjonsmiksen fjernet, celler ble vasket og dyrket ved 37 °C i tilnærmet 20 timer (mRNA analyse og protein analyse) under enten normoxi eller hypoksi i passende vekst medium. Celler ble deretter høstet for protein og RNA analyse.

Eksempel 7: In vitro modell: Ekstraksjon av RNA og cDNA syntese

Total RNA Isolasjon

Total RNA ble isolert enten ved anvendelse av RNeasy mini kit (Qiagen cat. no.74104) eller ved anvendelse av Trizol reagens (Life technologies cat. no.15596).

For total RNA isolasjon ved anvendelse av RNeasy mini kit (Qiagen), ble celler vasket med PBS, og Cell Lysis Buffer (RTL, Qiagen) supplert med 1 % mercaptoetanol ble tilsatt direkte til brønnene. Etter noen få minutter ble prøvene prosessert i henhold til produsentens instruksjoner.

Vevsprøver ble homogenisert ved anvendelse av Retsch 300MM homogenisator og total RNA isolated ved anvendelse the Trizol reagens eller the RNeasy mini kit som beskrevet av produsenten.

Første tråd syntese

Første tråd syntese ble gjennomført ved anvendelse av enten OmniScript Reverse Transcriptase kit eller M-MLV Reverse transkriptase (hovedsakelig beskrevet av produsenten (Ambion)) i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen). Når det anvendes OmniScript Reverse Transcriptase ble 0,5 µg total RNA hver prøve, justert til 12 µl og blandet med 0,2 µl poly (dT)12-18(0,5 µg/µl) (Life Technologies), 2 µl dNTP miks (5 mM hver), 2 µl 10 x RT buffer, 0,5 µl RNAguard<TM>RNase Hemmer (33 enheter/ml, Amersham) og 1 µl OmniScript Reverse Transcriptase etterfulgt av inkubasjon ved 37 °C i 60 min. og varme inaktivering ved 93 °C i 5 min.

Når første tråd syntese var gjennomført ved anvendelse av random decamer og M-MLV-Revers Transcriptase (hovedsakelig som beskrevet av produsent (Ambion)) ble 0,25 µg total RNA av hver prøve justert til 10,8 µl i H2O.2 µl decamer og 2 µl dNTP miks (2,5 mM hver) ble tilsatt. Prøver ble oppvarmet til 70 °C i 3 min. og avkjølt umiddelbart i isvann og tilsatt 3,25 µl av en blanding inneholdende (2 µl 10 x RT buffer; 1 µl M-MLV Revers Transcriptase; 0,25 µl RNAase hemmer). cDNA blir syntetisert ved 42 °C i 60 min etterfulgt av oppvarming inaktiveringstrinn ved 95 ºC i 10 min og tilslutt avkjølt til 4 ºC.

Eksempel 8: In vitro og in vivo modell: Analyse av Oligonukleotid Hemming av HIF-1a Ekspresjon med sann-tids PCR

Antisens modulering av HIF-1a ekspresjon kan bli analysert i et antall måter som er kjent innen fagområdet. For eksempel kan HIF-1a mRNA nivåer bli kvantifisert ved, for eksempel Northern blot analyse, kompetitiv polymerase kjede reaksjon (PCR), Ribonuclease beskyttelse analyse (RPA) eller sann-tid PCR. Sann-tid kvantitativ PCR er for tiden foretrukket. RNA analyse kan bli gjennomført på total cellulær RNA eller mRNA.

Fremgangsmåter for RNA isolasjon og RNA analyse slik som Northern blot analyse er rutine innen fagområdet og blir for eksempel beskrevet i, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

Sann-tid kvantitativ (PCR) kan konvensjonelt bli utført ved anvendelse av det kommersielt tilgjengelige iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System tilgjengelig fra BioRAD.

Sann-tid Kvantitativ PCR Analyse av HIF-1a mRNA nivåer

Kvantifisering av mRNA nivåer ble bestemt ved sann-tids kvantitativ PCR ved anvendelse av iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System (BioRAD) i følge produsentens instruksjoner.

Sann-tid Quantitative PCR er en teknikk som er velkjent innen fagområdet og er beskrevet for eksempel i Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986 - 994.

Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG 2x PCR master miks ble oppnådd fra Invitrogen cat# 11730. Primere og TaqMan® prober ble oppnådd fra MWG-Biotech AG, Ebersberg, Tyskland.

Glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 18S RNA eller β-actin mRNA kvantitet ble anvendt som en endogen kontroll for normalisering av en hvilken som helst varians i prøve preparering.

Prøveinnhold av human GAPDH mRNA ble kvantifisert ved anvendelse av human GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat. no. 4310884E) i henhold til produsentens instruksjoner.

For human HIF-1a, var PCR primerne: forward primer: 5'-CTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTT -3' (SEQ ID NO.21) (slutt konsentrasjon i analysen; 0,9 µM) revers primer: 5' –GCTTTCTCTGAGCATTCTGCAAAGC-3' (SEQ ID NO.22) (slutt konsentrasjon i analysen; 0,9 µM) og PCR proben var: 5' FAM -CCTCAGGAACTGTAGTTCTTTGACTCAAAGCGACA -TAMRA 3' (SEQ ID NO.

23) (sluttkonsentrasjon i analysen; 0,1 µM).

For cynomolg HIF-1a, var PCR primerne: I forward primer: 5'-GCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTG -3' (slutt konsentrasjon i analysen; 0,9 µM) (SEQ ID NO.24) reverse primer: 5' – GAACCATAACAAAACCATCCAAGGC -3' (SEQ ID NO.25) (slutt konsentrasjon i analysen; 0,9 µM) og PCR proben var: 5' FAM -TCATCTTCAATATCCAAATCACCAGCATCCAGAAG -TAMRA 3' (SEQ ID NO.

26) (slutt konsentrasjon i analysen; 0,1 µM).

For kvantifisering av 18S ribosomal RNA, ble TaqMan Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Kontroll reagens, (PART# 4310875, Applied Biosystems) anvendt i følge produsentens instruksjoner.

For kvantifisering av mus GAPDH mRNA ble de følgende primerne og probene designed: Sens primer 5’-AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3’ (SEQ ID NO.27) (0,3 μM slutt konsentrasjon),

antisens primer 5’-GTCAGATCCACGACGGACACATT-3 ́ (SEQ ID NO.28) (0,6 μM slutt konsentrasjon),

TaqMan probe 5’-FAM-GAAGCTCACTGGCATGGCATGGCCTTCCGTGTTC-TAMRA-3 ́ (SEQ ID NO.29) (0,2 μM slutt konsentrasjon).

Sanntids PCR som anvender Taqman prober

cDNA fra den første tråd syntesen gjennomført som beskrevet i eksempel 6 ble fortynnet 2 - 20 ganger, og analyse ved sann tid kvantitativ PCR. Primerne og proben ble blandet med 2 x Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG (kat. # 11730, Invitrogen) og satt til 3,3 μl cDNA til et sluttvolum på 25 μl. Hver prøve ble analysert i triplikater. Analysering av 2 ganger fortynninger av en cDNA som hadde blitt preparert på materiale renset fra en cellelinje som uttrykker RNA av interesse genererte standard kurver for analysene. Sterilt H2O ble anvendt isteden for cDNA for ingen templat kontroll. PCR program: 50 °C i 2 minutter, 95 °C i 10 minutter etterfulgt av 40 cykluser ved 95 °C, 15 sekunder, 60 °C, 1 minutt.

Relative mengder av mål mRNA sekvens ble bestemt fra det beregnede Terskel cyklus ved anvendelse av iCycler iQ Real-time Detection System software. (Se Figur 2).

SyBR Green Real Time PCR

For å bestemme det relative mus HIF1α mRNA nivå cDNA ble anvendt i kvantitativ PCR analyse ved bruk av en iCycler fra BioRad.

Til 8 µl av 5-ganger fortynnet cDNA ble tilsatt 52 µl av en mix inneholdende 29,5 µl Platinum qPCR

Supermix-UDG (in-vitrogen), 1030 nM for hver primer, 0,57 X SYBR Green (Molekylære prober) og 11,4 nM Fluorescein (Molekylære prober).

Duplikater av 25 µl ble anvendt for Q-PCR: 50 °C i 120 s, 95 °C for 120 s og 40 cykluser [95 °C i 30 s og 60 °C for 60 s].

HIF1α mRNA ekspresjon ble normalisert til mus β-actin mRNA hvilken tilsvarende ble kvantifisert ved anvendelse av Q-PCR.

Primere:

mHIF1α: 5 ́-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3 ́ (SEQ ID NO.30) og

5 ́-GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3 ́ (SEQ ID NO.31)

mβ-actin: 5 ́- CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3 ́(SEQ ID NO.32) og 5 ́-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3 ́ (SEQ ID NO.33)

mVEGF: 5 ́-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3 ́ (SEQ ID NO.34) og 5 ́-GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3 ́ (SEQ ID NO.35)

BCL-2: forward: 5’-gccctgtggatgactgagta-3’ (SEQ ID NO.36) og revers: 5’-cagccaggagaaatcaaacag-3’ (SEQ ID NO.37)

2-ganger fortynninger av cDNA syntetisert fra ubehandlede mus fibroblaster (Ltk cells) (fortynnet 5 ganger og som uttrykker både HIF1α og β-actin) ble anvendt til å fremstille standard kurver for analysene. Relative mengder av HIF1α mRNA ble bestemt fra den beregnede terskel cyklus ved anvendelse av iCycler iQ Real Time Detection System software.

Eksempel 9: In vitro analyse: Western blot analyse av HIF-1a protein nivåer

In vitro effekten av HIF-1a LNA oligonukleotider på HIF-1a protein nivåer i transfekterte celler ble bestemt ved Western Blotting.

Celler ble høstet og lysert i 50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 % glycerol, 2,5 % SDS, 5 mM DTT og 6 M urea supplert med protease hemmer cocktail (Roche). Totale protein konsentrasjoner were målt ved anvendelse av et BCA protein analyse kit (Pierce).20 -100 µg total protein ble kjørt på 10 - 12 % Bis-Tris geler i MOPS buffer eller på 3 – 8 % Tris Acetat geler og blottet på a PVDF membraner i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). Etter inkubasjon over natten i blokkerende buffer (PBS-T supplert med 5 % lav fett melk pulver), ble membranene inkubert over natten med et anti-HIF-1a antistoff, Bcl-2 antistoff VEGF antistoff eller antistoffer som detekterer andre nedstrøms for HIF-1a. Som kontroll på ladning, ble tubulin eller actin detektert ved anvendelse av monoklonale antistoffer fra Neomarker. Membraner ble deretter inkubert med sekundære antistoffer og HIF-1a ble visualisert ved anvndelse av et kromogen immunodeteksjonskit (Invitrogen) eller et kjemiluminescens ECL<+>deteksjonskit (Amersham). (Se Figur 2A og Figur 2B).

Eksempel 10: In vitro analyse: Antisens Hemming av Human HIF-1a Ekspresjon ved anvendelse av antisens oligonukleotider og deres effekt på nedstrøms målene VEGFA og MMP-2

LNA oligonukleotider har også en effekt på nedstrøms målene VEGFA og MMP-2 i media fra U373 celler. U373 celler blir sådd til 0,3 x 10<6>celler i T25 flasker (tidsstudie) eller 0,6 x 10<6>celler i T80 flasker (48 timers kons. studie). U373 celler blir plassert ved 37 °C (5 % CO2) i vekst media supplert med 10 % FBS, Glutamax I og Gentamicin. Dagen etter utsåing av celler ble transfektert med LNA oligonukleotider i duplikater eller triplikater ved anvendelse av forskjellige konsentrasjoner av oligonukleotider (0,2 – 10 nM) ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (2,5 µg/ml). Transfeksjoner ble gjennomført hovedsakelig som beskrevet av Dean et al. (1994, JBC 269: 16416 -16424). I korte trekk ble celler inkubert i 10 min. med Lipofectamin i OptiMEM etterfulgt av addisjon av oligonukleotid. Etter 4 timer ble transfeksjonsblandingen fjernet, celler ble vasket og dyrket ved 37 °C i tilnærmet 20 timer (mRNA analyse og protein analyse) under normoxi eller hypoksi i passende vekstmedium. Supernatant fra celler ble innhøstet ved det angitte tidspunkt. Addisjon av protease hemmere ble tilsatt før lagring ved -80°C. Human VEGFA elisa (Cat #DVE-00) og MMP-2 elisa (cat # DMP-200) fra RD systems ble anvendt i henhold til produsenten. Avhengig av tid for innhøsting ble supernatanten fortynnet 5 - 50 ganger forut for måling. Se Figurene 12A-E.

Eksempel 11: Apoptose induksjon av LNA oligonukleotider

Dyrking av celler

Glioblastom cellelinjen U373 (ATCC) ble dyrket i MEM (Sigma) supplert med 10 % føtalt bovint serum, Glutamax I, NEAA, natrium pyruvat og gentamicin ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2. Når celler nådde 60 – 70 % konfluens, ble cellene transfektert ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (2,5 µg/ml).

Cervical karsinom cellelinjen HeLa ble dyrket i MEM (Sigma) inneholdende 10 % føtalt bovint serum gentamicin ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2. Når cellen nådde 60 – 70 % konfluens, ble cellene transfektert ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (5 µg/ml).

Måling av aktiv Caspase 3/7 aktivitet

U373 celler ble sådd til en tetthet på 7000 celler per brønn i hvit 96 brønners plate (Nunc 136101) i komplett MEM dagen før transfeksjon. Neste dag ble cellene vasket en gang i foroppvarmet OptiMEM etterfulgt av tilsetning av 72 µl OptiMEM inneholdende 2,5 µg/ml Lipofectamin2000 (In vitrogen). Celler ble inkubert i 7 min før tilsetning av 18 µl oligonukleotider fortynnet i OptiMEM. The slutt var oligonukleotid konsentrasjon i området fra 0,2 nM til 100 nM. Etter 6 timers behandling, ble cellene vasket i OptiMEM og 100 µl DMEM inneholdende serum ble tilsatt. Liknende 96 brønners plater med behandlede U373 celler ble dyrket under normoxi eller under Hypoksi/anoxi ved plassering i 96 brønners plater i anaerocult bager (Merck) inntil det var tid for innhøsting. Plater ble ekvilibrert til romtemperatur i 15 min ved det angitte tidspunkt.

100 µl den meget sensitive Caspase 3/7-GloTM Reagent (Promega) ble tilsatt direkte til cellene i 96 brønner og plater ble inkubert i 1 time min før registrering av luminescens (luciferase aktivitet) i Luminoskan Ascent instrument fra Thermo Labsystem etter ytterligere 1 min latensperiode. Luciferase aktivitet blir målt som Relative Light Enheter per sekund (RLU/s). Data ble prosessert i Ascent software 2.4.2. og grafer av ganger induksjon relativt til mock ble trukket i excel.

Transfekterte celler inkubert med caspase 3/7 hemmer, hvilken blokkerer aktiv caspase 3/7 aktivitet ble anvendt for å demonstrere spesifisitet til apoptotisk respons. Videre tjente Staurosporine, camptothecine eller taxol induserte celler som positiv kontroll. (Se Figur 3A og Figur 3B.)

Annexin V-FITC flow cytometri analyse

1 x 106 HeLa celler ble sådd i T75 flasker en dag før transfeksjon. På dagen med transfeksjon, ble cellene vasket en gang i 37 ºC OptiMEM etterfulgt av addisjon av 7 ml OptiMEM inneholdende 2,5 μg/ml Lipofectamin2000 (In vitrogen). Celler ble inkubert i 7 min før tilsetning av 1700 μl oligonukleotider fortynnet i OptiMEM til en sluttkonsentrasjon på 1- 25 nM. Mock transfekterte celler tjente som kontroll. Etter 4 timers behandling, ble cellene vasket i OptiMEM og 10 ml dyrkningsmedium ble tilsatt. Etter oligonukleotid behandling fikk cellene anledning til å recover i 24 - 72 timer før de ble innhøstet ved skraping og vasket to ganger i PBS.2 x 105 celler ble inkubert med 5 μl Annexin V-FITC og 10 μl propidium iodid (PI- 10 mg/ml) og inkubert i 15 min ved romtemperatur i mørket. Inkubasjon av transfekterte celler med renset rekombinant Annexin V (10 µg) prior til tilsetning Annexin V-FITC ble anvendt for å demonstrere spesifisitet og selektivitet i fargingen. Videre ble TRAIL (Apo2L) induserte HeLa celler (0,5 μg/ml) anvendt som positiv kontroll.

0,6 x 106 U373 celler ble sådd i T75 flasker en dag før transfeksjon. På dagen med transfeksjon, ble cellene vasket en gang i 37 ºC OptiMEM etterfulgt av tilsetning av 7 ml OptiMEM inneholdende 2,5 μg/ml Lipofectamin2000 (In vitrogen). Celler ble inkubert i 7 min før tilsetning av 1700 μl oligonukleotider fortynnet i OptiMEM til en sluttkonsentrasjon på 1- 25 nM. Mock transfekterte celler tjente som kontroll. Etter 6 timers behandling, ble cellene vasket i OptiMEM og 10 ml dyrkningsmedium ble tilsatt.

Etter oligonukleotid behandling fikk cellene anledning til recover i 24 - 48 timer før de were høstet ved skraping og vasket to ganger i PBS.2 x 105 celler ble inkubert med 5 μl Annexin V-FITC og 10 μl propidium iodid (PI- 10 mg/ml) og inkubert i 15 min ved romtemperatur i mørke. Inkubasjon av transfekterte celler med renset rekombinant Annexin V (10 µg) forut for tilsetning Annexin V-FITC ble brukt til å demonstrere spesifisitet og selektivitet i fargingen. Videre ble Staurosporin (0,2 µM) induserte U373 celler anvendt som positiv kontroll. (Se Figur 4A og 4B.).

Eksempel 12: Proliferasjonshemming av LNA oligonukleotider

Celler ble behandlet i henhold til eksempel 11.

Måling av proliferering av levedyktige celler (MTS analyse)

U373 celler ble sådd til en tetthet på 7000 celler per brønn i klare 96 brønners plate (Scientific Orange no. 1472030100) i DMEM dagen før transfeksjon. Neste dag ble cellene vasket en gang i forhåndsoppvarmet OptiMEM etterfulgt av tilsetning av 72 µl OptiMEM inneholdende 2,5 µg/ml Lipofectamin2000 (Invitrogen). Celler were inkubert i 7 min før tilsetning av 18 µl oligonukleotider fortynnet i OptiMEM. Slutt oligonukleotid konsentrasjonen var i området fra 5 nM til 100 nM. Etter 6 timers behandling, ble cellene vasket i OptiMEM og 100 µl serum inneholdende DMEM ble tilsatt. Tilsvarende 96 brønners plater med behandlede U373 celler ble dyrket under normoxi eller under Hypoksi/anoxi ved plassering av 96 brønners plater i anaerocult bager (Merck) inntil det var tid for høsting. Levedyktige celler ble målt ved de angitte tidspunktene ved tilsetning av 20 µl tetrazolium forbindelse [3-(4,5-dimetyl-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS] og et elektron koplingsmiddel (phenazin ethosulfat; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Levedyktige celler ble målt ved 490 nm og 650 nm i en Powerwave (Biotek Instruments).

Hemming av vekst hastighet ΔOD (490 - 650 nm)/h ble plottet mot LNA oligonukleotid konsentrasjon relativ til mock, hvilken ble satt til 100 %. (Se Figur 5A og Figur 5B).

Eksempel 13: In-vivo opptak og mål ned-regulering av LNA oligonukleotider Hårbevokste mus ble behandlet enten daglig eller to ganger per uke (5 ganger) i løpet av en 14 dagers periode i.p. injeksjon med saltoppløsning eller SEQ ID NO.1 og forskjellige tiolerte versjoner herav. SEQ ID NO.5 er delvis tiolert (i spalten) mens SEQ ID NO.6 har en fosfodiester ryggrad. Mus ble behandlet med en total dose på 10 mg/kg/14 dager, 50 mg/kg/14dager, eller 250 mg/kg/14 dager gitt enten daglig eller to ganger i uken.

RNA rensing og cDNA syntese fra vev

Tilnærmet 10 mg vev ble homogenisert i 400 µl RTL buffer (Qiagen) supplert med 1 % mercaptoetanol. Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy mini kit (Qiagen) I henhold til produsentens instruksjoner.

Første tråd syntese ble gjennomført ved anvendelse av random decamerer og M-MLV-Reverse Transcriptase (hovedsakelig som beskrevet av produsenten (Ambion)). For hver prøve, ble 0,25 µg total RNA justert til 10,8 µl i H2O.2 µl decamerer og 2 µl dNTP blanding (2,5 mM hver) ble tilsatt. Prøver ble oppvarmet til 70 ºC i 3 min. og avkjølt umiddelbart i isvann og tilsatt 3,25 µl av en blanding inneholdende (2 µl 10x RT buffer; 1 µl M-MLV Revers Transcriptase; 0,25 µl RNAase hemmer). cDNA blir syntetisert ved 42 ºC i 60 min etterfulgt av oppvarming inaktiveringstrinn ved 95 °C i 10 min og tilslutt avkjølt til 4 °C.

Kvantitativ Sann Tid PCR analyse

For å bestemme det relative mus HIF1α mRNA nivå i behandlede og ubehandlede prøver, ble generert cDNA anvendt i kvantitativ PCR analyse ved anvendelse av en iCycler fra BioRad.

Til 8 µl 5-ganger fortynnet cDNA ble tilsatt 52 µl av en miks inneholdende 29,5 µl Platinum qPCR

Supermiks-UDG (in-vitrogen), 1030 nM av hver primer, 0,57 X SYBR Green (Molekylære prober) og 11,4 nM Fluorescein (Molekylære prober).

Duplikater av 25 µl ble anvendt for Q-PCR: 50 °C i 120 s, 95 °C for 120 s og 40 cykler [95 °C i 30 s og 60 °C i 60 s].

HIF1α mRNA ekspresjon var normalisert til mus β-actin og/eller Gapdh mRNA hvilken var tilsvarende kvantifisert ved anvendelse av Q-PCR.

mHIF1α: 5 ́-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3 ́(SEQ ID NO.30) og

5 ́-GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3 ́(SEQ ID NO.31)

mβ-actin: 5 ́- CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3 ́(SEQ ID NO.32) og

5 ́-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3 ́ (SEQ ID NO.33)

mVEGF: 5 ́-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3 ́ (SEQ ID NO.34) og

5 ́-GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3 ́ (SEQ ID NO.35)

mGAPDH: 5 ́- AGCCTCGTCCCGTAGACAAAAT-3 ́(SEQ ID NO.38) og

5 ́-GTTGATGGCAACAATCTCCACTTT-3 ́ (SEQ ID NO.39)

mBcl-2: forward: 5’-gccctgtggatgactgagta-3’ (SEQ ID NO.36) og reverse: 5’-cagccaggagaaatcaaacag-3’ (SEQ ID NO.37)

2-ganger fortynninger av cDNA syntetisert fra ubehandlede musefibroblaster (Ltk celler) (fortynnet 5 ganger og som uttrykker både HIF1α og β-actin) ble anvendt til å preparere standard kurver til analysene. Relative mengder av HIF1α mRNA ble bestemt fra den beregnede terskel cyklusen ved anvendelse av iCycler iQ Real Time Detection System software.

Ekstraksjon av LNA oligonukleotid fra vev

Tilnærmet 100 mg vev ble homogenisert mekanisk i 500 µl Ekstraksjonsbuffer (0,5 % Igepal CA-630, 25 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 100 mM NaCl inneholdende 1 mg/ml RNAse A) og inkubert over natten ved 37 º C.500 ml ble spiked med referanse oligonukleotid og ekstrahert ved tilsetning 1 ml fenol-isoamyl-kloroform (25 : 1 : 24 (v/v/v)). Den vandige fasen ble overført til et nytt rør og ekstrahert igjen. Om nødvendig ble ekstraktet lyofilisert.

IEX HPLC analyse av ekstraherte LNA oligonukleotider

Et prøvevolum på 50 uL ble separert over en DNAPac PA-100 (2x250 mm, Dionex) kolonne utstyrt med en beksyttelse kolonne DNAPac PA-100 (2 x 50 mm, Dionex). Kolonnene ble oppvarmet til 40 °C. Strømningshastigheten var 0,25 mL/min. og deteksjon bølgelengde 260 nm. En gradient av de mobile fasene A: TRIS (20 mM), EDTA (1 mM) og natriumperklorat (10 mM) pH: 7.6, B: TRIS (20 mM), EDTA (1 mM) og natriumperklorat (1M) pH: 7,6, (0 - 13 min., A: 20 %, B: 20 %; 14-18 min., A: 40 %, B: 60 %; 22 - 28 min., A 0 %, B: 100 %; 33 - 38 min., A: 80 %, B: 20 %).

Figur 6A og Figur 6B viser in vivo opptak (i μg per gram vev) pluss mål ned-regulering (% hemming av HIF-1a mRNA ekspresjon korrelert til β-actin ekspresjon relativ til saltoppløsning behandlede mus etter i.p. administrasjon av SEQ ID NO.1 enten daglig eller to ganger per uke i 14 dager (som beskrevet over)).

Figur 6C viser in vivo endogen nyre mål ned-regulering administrert ip injeksjoner daglig i hårbevokste mus i 14 dager kurer med SEQ ID NO.1.

Figur 7A viser at SEQ ID NO.1 er en potent hemmer i leveren målt ved Q-PCR på HIF-1a ekspresjon ved daglig administrasjon.

Figur 7B viser that SEQ ID NO.1 også er en potent hemmer i leveren målt ved Q-PCR på HIF-1a ekspresjon ved administrasjon to ganger per uke.

Figur 7C SEQ ID NO.1 er en potent hemmer i nyren målt ved Q-PCR på HIF-1a ekspresjon ved daglig administrasjon.

Eksempel 14: In vivo effekt av SEQ ID NO.1 i mus som bærer U373 xenograft tumorer Effekt av oligonukleotid behandling på vekst av tumour xenografter på nakne mus kan bli målt ved anvendelse av forskjellige tumor cellelinjer. Eksempler på slike cellelinjer er humane tumor cellelinjer U87 (glioblastom), U373 (glioblastom), 15PC3 (prostata cancer), PC3 (prostata cancer), DU145 (prostata cancer), LNCap (prostata cancer og murin tumour cellelinje B16 (melanom).

Behandling av subkutane tumour xenografter på nakne mus ved anvendelse av LNA oligonukleotider. Tumor celler ble implantert subkutant og gjennomgikk deretter i serie tre etterfølgende transplantasjoner. Tumour fragmenter på 1 mm ble implantert subkutant med en krocar nål i NMRI nakne mus. Alternativt ble cancer celler typisk 10E6 til 10E7 celler suspendert i 300 μL matrigel (BD Bioscience), subkutant injisert inn i flankene til NMR1: nakne mus. Mus ble behandlet ved intra-peritoneale injeksjoner 5 mg/kg/dag. Individuell behandling av musen startet når tumor volum nådde 50 mm<3>. Behandling med PBS ble initiert når gjennomsnitlig tumor volum av kontrollen (saltoppløsning behandlet) gruppe nådde 50 mm<3>. Eksperimentet ble avsluttet når tumorer av en hvillken som helst gruppe nådde maksimum tillatte størrelser. Tumour størrelsene fra alle musene ble målt daglig ved calliper målinger. Effekten av behandlingen ble målt som tumor størrelse og tumor vekst rate.

I en annen studie som anvender SEQ ID NO.1, ble vitale tumor stykker fra U373 donor mus transplantert på fettvev av ovariene (dag 0) fra nakne mus. På dag fire og ni etter transplantatsjon, blir mus behandlet med LNA oligonukleotid ved 50 mg/kg (i.p). Mus blir tatt livet av 2 dager etter siste dose (dag 11) og tumor vekt pluss farging av tumorer med CD-31 ab ble gjennomført (Se Figurene 8A og 8C).

Figurene 8B og 8C viser vessel densitet i U373 tumorer fra xenograft behandlet med SEQ ID NO.1. Figur 10D viser HIF-1α mRNA ekspresjon i U373 tumours målt by QPCR.

SEQ ID NO.1 ble dosert ved 50 mg/kg to ganger per uke i en uke i U373 xenograft mus implantert ved ovariene.2 dager etter siste dose ble dyrene tatt livet av. Vesseldensitet ble beregnet etter CD31 farging og relatert til det totale arealet. En statistisk signifikant forskjell (P = 0,005) ble funnet mellom saltoppløsningsgruppen og mus behandlet med en scrambled kontroll (SEQ ID NO.12).

Eksempel 15: Vev halverings-tid og mål knockdown i lever og nyre til SEQ ID NO.1 60 NMRI hunnlige mus, (tilnærmet 25g) ble splittet i grupper på 5 og dosert 30 mg/kg SEQ ID NO.1, i.p. (10 mL/kg 2,5 mg/ml) ved dag 0, 3, 7, 10 og 14. Gruppene ble tatt ned på dag 14. Kontroll gruppene ble dosert med 0,9 % saltoppløsning. Vevsprøver ble tatt og preparert i RNA-senere.

Figur 11 viser in vivo opptak (i μg per gram vev) plus mål ned-regulering (% hemming av HIF-1a og VEGF mRNA ekspresjon korrelert til β-actin ekspresjon) av mus etter 5 i.p. doser med SEQ ID NO.130 mg/kg.

Eksempel 16: Varighet av virkning og LNA oligonukleotid opptak in vivo Varighet av virkning: 20 Balb/cA-nu, hunnlige mus, (tilnærmet 25 g) PC3, prostata cancer cellelinjen (ECACC#90112714) ble splittet i grupper på 5 og dosert 25 mg/kg SEQ ID NO.7, i.p. (10 mL/kg 2.5 mg/ml) hver dag fra dag 7 til dag 13. Gruppene ble tatt ned en og 5 dager etter dosering. Kontroll grupper ble dosert med 0,9 % saltoppløsning. Vevsprøver ble tatt og preparert i RNA-senere. Figur 10A viser virkningsvarighet av mRNA ekspresjon 1 og 5 dager etter behandling.

LNA oligonukleotid opptak: Etter formalin fiksering, ble vevene innlagt i paraffin. Vevet ble plassert i Holt`s løsning (30 g sakkarose, 1 g acacia gummi, 15 mg tymol, distilllert vann ved 100 ml) over natten og frosset. Cryosnitt ved 4 my ́s montert på dekkglass og plassert i DAPI oppøsning. Fluorokrom ble visualisert i flourescens mikroskopi. Figur 10B viser histologiske resultater av vev fra lever, nyre og tumor er fra mus behandlet med en fam-merket versjon SEQ ID NO.1 ved 25 mg/kg/dag i syv dager og tatt livet av den 5. dagen etter siste behandling. Bildet av huden er fra mus behandlet på samme måte, men imidlertid tatt livet av dagen etter siste behandling og overeksponert for å se den svake fargingen av de basale cellene av huden (den nedre blå linjen). Disse data antyder det følgende:

Lever: fargingen i hepatocytter er hovedsakelig lokalisert i cytoplasma.

Nyre: Meget intensiv farging av de proksimale tubuli og mindre farging av de distale tubuli.

Tumor: Endotele celler, macrofager blir farget (museceller).

Hud: En intens farging av dermis (endotele celler og makrofager) og i cytoplasma av det basale laget av epidermis.

Eksempel 17: LNA oligonukleotid opptak og effekt in vivo

På dagen ble 0,3 x 10<-6>celler (PC3 og HT29) blandet med 300 l matriksgel og implantert på Balb/cA-nu, hunnlige mus, (tilnærmet 25 g). På dag 7, 10, 13, 17 ble mus behandlet med intra-peritoneale injeksjoner av 5 mg/kg/dag med enten saltoppløsning, en fam merket versjon av SEQ ID NO.1 (SEQ ID NO.7) eller en fam merket versjon av SEQ ID NO.8 (SEQ ID NO.20). Tre dager (dag 20) eller 10 dager (dag 27) etter siste dose, ble dyrene tatt livet av. Saltoppløsning kontroll gruppen ble dosert med 0,9 % saltoppløsning. Vevsprøver ble tatt og preparert i RNA-later inntil måling av LNA oligonukleotid innhold ved HPLC analyse eller analyse av HIF-1a mRNA nedregulering. (se Figurene 10C-E).

Visualisering av LNA oligonukleotid opptak: Etter formalin fiksering ble vevene støpt i paraffin. Vevet ble plassert i Holt`s løsning (30 g sakkarose, 1 g acacia gummi, 15 mg thymol, destillert vann som 100 ml) over natten og frosset. Frysesnitt på 4 my ́s montert på dekglass og plassert i DAPI oppløsning. Fluorochrome ble visualisert i flourescens mikroscopi (data demonstrerer den samme biodistribusjon som i Figur 10B - data ikke vist).

Eksempel 18: In vivo LNA oligonukleotid spesifisitet studie av HIF-1α og VEGF Feiltilpasningsstudie: 15 NMRI hunnlige mus, (tilnærmet 25 g) ble splittet i grupper på 5 og dosert 30 mg/kg SEQ ID NO.1 eller SEQ ID NO.9 i.p. (10 mL/kg, 3,0 mg/ml) over 30 s dag 0, 3, 7, 10, 14. Kontrollgrupper ble dosert med 0,9 % saltoppløsning.

Gruppene ble tatt ned 3 - 4 timer etter siste injeksjon. Vevsprøver ble tatt og preparert i RNA-later.

Figur 11 viser in vivo endogene lever mål ned-regulering av HIF-1a og VEGF mRNA etter 5 doser på 30 mg/kg hver 3. dag av SEQ ID NO.1 sammenliknet med den ene feiltilpasningskontrollen SEQ ID NO.9.

Eksempel 19: In vivo potens til en 14 mer-version av SEQ ID NO.1.

NMRI hunnlige mus (0,025 kg) ble behandlet ved intra-peritoneale injeksjoner 5 mg/kg/dag med SEQ ID NO.1. Saltoppløsningsdyr tjente som kontrolldyr og ble dosert med 0,9 % saltoppløsning. Fem dyr ble tatt livet av 1 dag eller 10 dager etter dosering. Vevsprøve ble tatt og preparert i RNA-later inntil målinger av HIF-1a mRNA ekspresjon ved QPCR og normalisert til beta-actin som beskrevet i M&M.

Eksempel 20: Preparering av de tre-dimensionale aortiske ring kulturene Angiogenese ble studert ved dyrking av ringer av museaorta i tre-dimensionale kollagen geler med noen modifikasjoner i metoden som originalt reportert for rotte aorta (Masson et al., 2002 Biol Preoced Online 4(1) p.24-31). Hårbevokste mus ble behandlet en gang i.v. med LNA oligonukleotider ved en dose i området fra (10 mg/kg til 50 mg/kg). Tre dager etter dosering ble torakisk aorta fjernet fra musen, tatt livet av ved cervical dislokasjon og umiddelbart overført til en dyrkingskål inneholdende RPMI Medium (Invitrogen) inneholdende 10 % Føtalt kalveserum. Peri-aortisk fibroadipose vev ble forsiktig fjernet med fin microdissekering pinsett og iridektom sakser ved å ha spesiell oppmerksomhet mot ikke å skade den aortiske veggen. En millimeter lange aortiske ringer (tilnærmet 15 per aorta – et maksimum på 1,5 cm aorta) ble snittet og grundig skylt i 3 etterfølgende vask av RPMI med FBS. Ring-formede eksplantater av aorta fra mus ble deretter innelukket i 60 μL av matrigel (BD biosciences - Matrixgel: 356234) i en brønn på en 96 brønners plate. Etter innsetting av aorta, ble en annen 40 μL av matrigel tilsatt og fikk stå ved 37 °C i 10 min til størkning. 100 μL av EGM2 (Cambrix) med og uten vekstfaktorer blir tilsatt brønnene. Som en kontroll, blir aorta ringer i tillegg dekket med EGM2 media inneholdende 10 μM Ciplatin. Mediet ble skiftet hver andre dag.

Eksempel 21: Kvantitativ hel legeme autoradiografi studie i mus etter enkel intravenøs administrasjon av<3>H-merket SEQ ID NO.1

Ni hunnlige C57B1/6J (8 uker Taconic, DK) mus ble gitt 50 mg/kg av hvert test element intravenøst i en halevene 1,5 mCi/kg<3>H-SEQ ID NO.1.

<3>H-SEQ ID NO.1 hadde en spesifikk aktivitet på 155 μCi/mL.

Volumet gitt til hvert dyr var 10 ml/kg av test formuleringen. Individuelle mus ble drept ved 5 min, 15 min, 1 time, 4 timer, 24 timer, 2 dager, 4 dager, 7 dager og 18 dager etter administrasjon av hvert testelement.

For full kropp autoradiografi, ble mus anestesert med isofluran, og deretter umiddelbart nedsenket i heksan avkjølt med tørris til -80 °C, ABR-SOP-0130/04. De frosne døde dyreskrottene ble innstøpt i en gel av vandig karboksymetyl cellulose (CMC), frosset i etanol, avkjølt med tørris (-80 °C) og snittet avsaget for full kropp autoradiografi, i henhold til standard metoden, ABR-SOP-0131/04. Fra hvert dyr, ble 20 µm snitt kuttet ved forskjellige nivåer med en cryomicrotom (Leica CM 3600) ved en temperatur på ca -20 °C. De oppnådde snittene ble fanger på tape (Minnesota Mining og Manufacturing Co., No.810) og nummerert i rekkefølge med radioaktivt blekk. Etter å ha blitt frysetørket ved -20 °C i ca 24 timer, ble utvalgte snitt dekket med et tynt lag av talkum pulver og lagt på avbildings plater (Fuji, Japan).

Snitt ble valgt for fosfor avbilding for best å representere vev og organer av interesse. Sammen med et sett av<3>H kalibreringsstandarder, ble snittene dekket med et tynt lag av talkum pulver og lagt på avbildingsplater. På grunn av den lave energien i<3>H, ble talkum pulver anvendt isteden for plast folie for å beskytte bildeplaten.

Avbildingsplatene ble eksponert for 3-7 dager ved rom temperatur, innelukket i lette tette kassetter i en blybeskyttet boks for beskyttelse mot miljø stråling.

Etter eksponering ble bildeplatene scannet ved en pixel størrelse på 50 μm ved anvendelse av BAS 2500 (Fuji Film Sverige AB, Sweden). Vevene og organene av interesse ble kvantifisert ved anvendelse av AIDA, versjon 2.43 (Raytest, Germange). En vann-oppløselig standard test oppløsning av<3>H radioaktivitet ble blandet med fullblod og anvendt for produksjon av kalibreringsskalaen. Standard seriene bestod av 10 fortynninger fra 65,44 til 0,30 nCi/mg. I den hensikt med kvantifikasjon, ble det antatt at alt vev hadde liknende tetthet og stopp egenskaper som den til fullblod. Vevs tettheten ble satt til 1 g/ml. Grense for kvantifikasjon ble definert som den gjennomsnittlige konsentrasjonsverdien av åtte målinger for bakgrunn pluss tre ganger standard avvik verdi til disse målingene.

De forskjellige vev og organer ble identifisert enten på autoradiogrammer eller på de tilsvarende vevssnitt. Betegnelsen uvea anvendt i denne studien inkluderer det retinale pigment epithelium som representerer melanin inneholdende strukturer, choroider og sclera fra øyet. (se Figurene 14A og 14B).

Eksempel 22: Western blot av HUVEC celler transfektert med SEQ ID NO.1 Normale Humane Umbilical Vein Endothelial (HUVEC) celler ble dyrket i Cambrix-EGM2 medium og ble transfektert som beskrevet i eksempel ved anvendelse av 2 og 5 nM SEQ ID NO.1 eller 5 nM SEQ ID NO.8. Etter transfeksjon ble celler eksponert hypoksi (1 % Oksygen) i 16 timer. Ved høsting ble celler vasket i PBS og lysert i en SDS inneholdende lyseringsbuffer (som beskrevet i eksempel). 50 µg ble ladet på Tris-Acetat geler og kjørt ved 150 V i 1 time. Western blotting ble utført som beskrevet i eksempel og blottet ble inkubert i anti-human-HIF-1a (1: 500) før visualisering ved forbedret kjemiluminescens. En potent ned-regulering ved SEQ ID NO.1 blir sett, mens scrambled kontroll SEQ ID NO.8 ned-regulerer ikke HIF-1a ekspresjon i HUVEC celler.

Eksempel 23: In vitro Rørdannelse/Kapillær-Liknende Struktur Dannelse Analyse Induksjon av tubulogenesis ble gjennomført ved anvendelse av Matrigel (Venetsanakos E, Mirza A, Fanton C et al. Induction of tubulogenesis in telomerase-immortalized human microvascular endotelial cells by glioblastoma cells. Exp Cell Res 2002; 273: 21 – 33). Matrigel ble tint på is for å hindre prematur polymerisasjon; alikvoter med 50 µl ble pletert i individuelle brønner på 96-brønners vevsdyrkeplater (Nunc) og fikk anledning til å polymerisere ved 37 °C i minst 30 minutter. Transfekterte HUVEC celler ble fjernet ved behandling med trypsin 0,05 % -EDTA. Celler ble vasket i seruminneholdende medium og deretter resuspended til 2-x 10E5 celler/ml. I hver dyrkingsbrønn ble 100-µl transfektert eller u-transfektert HUVEC cellesuspensjon i dyrkingsmedia med vekst faktorer (VEGF, hFGF-B, R3-IGF-1,hEGF med FBS (2 %)) og heparin tilsatt (n = 10). Ubehandlet, mock-transfektert så vel som HUVEC celler transfektert med en scrambled kontroll oligo (SEQ ID NO.8) ble anvendt som kontroller. Dosen av kontroll eller test forbindelse ble analysert i 6 - 10 individuelle brønner og eksperimentene ble gjennomført minst tre ganger. For kvantifikasjon av rør dannelse ble brønnene fotografert. (Se Figur 13).

Eksempel 24: FACS analyse av opptak i celler til milt, benmarg og perifert blod.

NMRI hunnlige mus (0,025 kg) ble behandlet med en fam merket versjon av SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.7 (50 mg/kg) eller et ekvivalent antall molekyler av Fam amiditt (ved 3 mg/kg) eller 0,9 % saltoppløsning. Celler ble tatt livet av 1 time etter injeksjon og celler fra milt, Perifert Blod (1 ml til hvilket 1 ml PBS inneholdende 0,1 % natrium azid 50 ml heparin sulfat ble tilsatt- plassert på is) eller benmarg blir høstet.

Milt

Plasser milt i et metal nett, og fukt med 1ml R10 (R10 vevs dyrkingsmedium inneholdende 10 % FCS) inneholdende azid. Press vevet gjennom nettet og skyll gjennom med totalt 4ml R10 Azid. Fjern 0,5 ml av vevssuspensjonen og kast det gjenværende. De røde blodcellene blir lysert i suspensjonen ved tilsetning av 50 ml Red Cell Lysis buffer blanding og la den stå ved RT i 10 min. Spinn ved 2000 rpm i 10 minutter. Om nødvendig for fjerning av resterende røde celler, gjenta denne processen. Tell og blokker celler.

Spinn celler ned og resuspender i 1,0 ml FACS buffer inneholdende azid. Anta celle tall 5 x 10<6>celler per milt for blokkering og tilsett 5 µl av murin CD16/CD32 per million celler (25 µl Blokkering er tilsatt).

Perifert Blod

De røde cellene blir lysert ved tilsetning av 50 ml Red Cell Lysis Solution. Celler blir spunnet ned og prosessen blir gjentatt om nødvendig. Celler blir vasket en gang med PBS, resuspender og tell opp. Ikke-spesifikk antistoff binding blir blokkert ved tilsetning av murin CD16/CD32 ved hastigheten 5µl per million celler. La det være ved RT i 10 min, fortsett deretter til linje farging.

Benmarg

Kutt benet så tett til hver ende som mulig ved anvendelse av sterile sakser. Trekk opp 1ml steril PBS- inn i 1ml sprøyte utstyrt med en 25G nål. Innsett nålen inn i en ende av benet – vanligvis enklest ved kneet – og skyll PBS gjennom benet. Gjenta inntil benet er klart. Trekk benmargen opp og inn nålen flere ganger til oppbryting av margen. Dersom det er bekymring om antall røde celler, kan et lyseringstrinn bli anvendt som over.

Tell cellene og blokker som over. Plasser 150000 celler i et sterilt eppendorf rør på is for Benmarg kulturer.

FACS farger

Linje farger blir gjennomført ved anvendelse av spesifikke markører. Som beskrevet: Farger

1. CD4 APC, CD8 PE FITC, 7AAD T-celler

2. Gr-1 PE, f4/80 APC neutrofiler, makrofager

3. Gr-1 PE, Mac-1APC myelo-monocytiske

4. CD34 PE linje APC stamceller

5. B220 APC, CD19 PE B celler

6. CD11b PE, CD11c APC dendritiske celler

Isotyper

7. Amerikansk hamster IgG1 APC CD11c

8. Rotte IgG2a APC CD4, B220

9. Rotte IgG2a PE cd8a, CD19, CD34

10. Rotte IgG2b PE Gr-1 CD11b

Fargingen blir gjennomført i 96 brønner og et totalt antall med 100 µl blokkerte celler blir farget med 100 µl farge miks (enten isotype kontroller eller spesifikke linje markører). Fargingen blir gjennomført på is og får stå i 30 min. Cellene blir spunnet ved 2000 rpm i 2 min. Supernatant blir suget av og cellene blir vasket med 200 µl FACS buffer og sentrifugeringstrinnet blir gjentatt. Vask totalt tre ganger. På slutten blir cellene suspendert på nytt i 200 µl FACS buffer og tilsatt til et FACS rør som allerede inneholder 200 µl FACS 5 µl 7AAD.

FACS analyse ble utført ved anvedelse av Becton Dickinson FACS Calibur (se Figur 15).

Endotele celler, granulocytter og CD4+ lymfocytter og macrofager av perifert blod og dendritiske celler og granulocytter av benmargen og granulocytter av milten ble vist å farge positiv for FAM-merking fem dager etter administrasjon av SEQ ID NO.7.

Eksempel 25: Hif-1 α og oligonukleotid innhold av SEQ ID NO.1 i cynomolgus ape vev I hovedtoksisitet studien i cynomolgus apevev som inkluderer lever og nyre prøver, ble hurtig frosset og lagret ved -70 °C for etterfølgende analyse. (se Figur 16A og 16B) Apene hadde blitt behandlet med intravenøs injeksjon av 0, 6, 10 og 40 mg/kg/anledning to ganger ukentlig i fire uker i gruppen med dyr som mottok 0, 10 eller 40 mg/kg/anledning, ble noen dyr fulgt i en recovery periode på 4 uker uten behandling.

RNA ble ekstrahert fra prøvene som beskrevet i Eksempel 13 og HIF-1a mRNA innhold ble målt som beskrevet i Eksempel 8 (se Figur 16A). Oligonukleotid innhold ble målt som beskrevet under (se Figur 16B).

Prøve preparering: Ekstraksjon fra lever og nyre vev

Kjemikaler/reagenser:

Proteinase K(25,1 mg/ml): Sigma P4850.

Fenol-kloroform-isoamyl-alkohol (25 : 24 : 1(v/v/v), mettet med 10mM Tris, pH: 8,0, 1mM EDTA: Sigma P2069

Igepal CA-630: Sigma, I8896

Ekstraksjonsbuffer: 0,5 % Igepal CA-630, 25 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8,0 (justert med 1 N NaOH).

1 mg/ml av Proteinase K i ekstraksjonsbuffer: Preparert før hver ekstraksjon.

Vev (~100 mg) ble veid av (vev blir holdt på tørr-is før og etter veiing). 500µl ekstraksjonsbuffer inneholdende proteinase K (1 mg/ml) ble tilsatt. Vevet ble homogenisert mekanisk og homogenatet inkubert over natten ved 37 °C.

Referanse prøver ble fremstilt ved oppløsning av SEQ ID NO.2 i ekstraksjonsbuffer ved det relevante konsentrasjonsområde. Nøyaktig 100 mg lever vev fra ubehandlede dyr ble veid av (holdt på tørr-is før og etter veiing). Ekstraksjonsbuffer (med proteinase K, 1 mg/ml) inneholdende referansematerial blir tilsatt til vevsprøvene til et total volum på 0,5 ml. Vevet ble mekanisk homogenisert og inkubert overnatten ved 37 °C.

Deteksjonssignalet av SEQ ID NO.2 fra disse prøvene ble anvendt til å preparere en standard kurve som dekker de laveste og høyeste konsentrasjonene som finnes i de behandlede dyrene.

Vevs prøver blir overført til 2 ml microrør med skrulokk.1 ml fenol-kloroformisoamyl-alkohol (25 : 24 : 1 (v/v/v)) ble tilsatt etter kraftig risting i 5 min. Fase separasjon ble oppnådd ved sentrifugering ved 4000 RPM i 15 min. Den vandige fasen (øvre-fase) blir overført til et nytt rør (kompatibelt med evaporator) og 500 μl Milli-Q-H2O ble tilsatt til den organiske fasen (rest fra den første ekstraksjonen). Rørene ble omrørt kraftig igjen i 5 min, etter sentrifugering at 4000 RPM for 15 min (SAN039 i rom 115). Den vandige fasene (vann phases fra 1. ekstraksjon og wash) blir samlet og inndampet til tørrhet (80 ºC, under nitrogen). Det resterende blir rekonstitutert i 200 µl Milli-Q-Vann etter sentrifugering ved 4000 RPM for 15 min. Prøvene ble overført til HPLC-glass for analyse.

HPLC analyse av oligonukleotid i lever og nyre vev: Etter ekstraksjon blir SEQ ID NO.

2 analysert ved ionebytte HPLC:

Kolonne: Dionex, DNA pac PA 100: 2 x 50 mm (beskyttelse), 2 x 250 mm (analytisk) Kolonne temp: 42 °C

Injeksjonsvol.: 50 µl

Vask-oppløsningsmiddel: Milli-Q-H2O

Rense-oppløsningsmiddel: Milli-Q-H2O

Deteksjon:UV, 260 nm

Oppløsningsmidler:

Buffer A: 1 mM EDTA, 20 mM TRIS-Cl, 10 mM NaClO4,pH: 7,6 (1 N NaOH) Buffer B: 1 mM EDTA, 20 mM TRIS-Cl, 1 M NaClO4,pH: 7,6 (1 N NaOH)

Eksempel 26: Varighet på virkning av in vivo behandling ved anvendelse av SEQ ID NO.1

Hårbevokste mus ble behandlet med en i.p. injeksjon av 50mg/kg SEQ ID NO.1. 5 dyr i hver gruppe ble tatt livet av på dagene 1 og 10 etter dosering (se Figur 9C) eller etter dagene 1, 2, 3, 4, 5 og 10 etter dosering (se Figur 9B). HIF-1α mRNA ekspresjon ble analysert ved sann-tid QPCR og normalisert til GAPDH.

Eksempel 27: In vivo øye sykdom corneal modell

Mus og anestesi. BALB/c mus 6 – 8 ukers alder. Mus ble anestesert ved anvendelse av en blanding av ketamin og xylazin (henholdsvis 120 mg/kg kroppsvekt og 20 mg/kg kroppsvekt).

Musemodell av sutur-indusert, inflammatorisk corneal neovaskularisering.

Musemodellen av sutur-indusert inflammatorisk corneal neovaskularisering (CNV) ble anvendt som tidligere beskrevet av Streilein JW, Bradley D, Sano Y, Sonoda Y.

Immunosuppressive properties of tissues obtained from eyes with experimentally manipulated corneas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.1996; 37: 413 – 424. I korte trekk ble en 2-mm-diameter corneal trephine plassert forsiktig på den sentrale cornea til anestetiserte mus, ene og alene for å markere det sentrale corneale området. Tre 11-0 suturer ble deretter plassert intrastromalt med to stromale incursjoner som hver strekker seg over 120° av den corneale omkretsen. Det ytre punktet til sutur plasseringen som ble valgt, var halvveis mellom limbus og linjen markert med 2-mm trephine; det indre suture punktet var i den samme avstanden fra 2-mm trephine linje for å oppnå standardiserte angiogene responser. Suturer fikk være på stedet i 7 dager. Mus ble eutanisert og cornea med limbus ble snittet ut, og flat-mount dobbel-immunohistokjemi ble gjennomført. Tilstedeværelse av inflammatoriske celler i normal cornea og deres rekruttering i cornea 1 uke etter suture plassering, ble kvantifisert i hematoksylin og eosin–fargede seri snitt av plast-innstøpte cornea fiksert i 10 % paraformaldehyd etter enucleation. I tillegg for ytterligere karakterisering av inflammatoriske celler rekruttert til cornea, ble dobbel immunohistokjemi gjennomført på corneal hele objektglass og frosset snitt med makrogfag markører CD11b. Snittene ble videre farget for endotele celler (vessel ved CD31), markører for VEGF, og VEGFR ́s.

Eksempel 28: Corneal microlomme analyse

Corneal mikrolomme analyse ble gjennomført som tidliger beskrevet (Cao Y, et al. Vascular endothelial growth factor C induces angiogenesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.1998; 95: 14389 – 14394 ). I korte trekk ble corneal microlommer skapt ved anvendelse av en modifisert von Graefe kniv, og en micropellet (0,4 × 0,4 mm) med sukrose aluminum sulfat belagt med hydron polymer inneholdende 200 ng VEGF-A164(R&D) eller 200 ng med rekombinant bfgf (RDI, Flanders, New Jersey, USA) ble implantert i hver lomme. Pelleten var posisjonert 0,6 – 0,8 mm fra limbus og stedet ble dekket med antibiotisk salve (erythromycin) og ble holdt på stedet i 10 dager (n > 5-10 mus hver). Hemangiogene og lymfangiogene responser ble kvantifisert som beskrevet over ved å anvende dobbel immunofarging med CD31/LYVE-1. Maksimal grad av blod versus lymfe kar utvekst mellom underliggende limbus og pellet ble gradert semikvantitativt i fire kategorier for begge vevstyper: 0, ingen utvekst; 1, utvekst mindre enn 1/3 av limbus-pellet avstand; 2, utvekst mellom 1/3 og 2/3 av limbus-pellet avstand; 3, kar som når pellet.

Eksempel 29: In vivo psoriasis modell

In vivo Human hud/SCID Mus Chimera

Humane hud xenografter ble ortotopisk transplantert på 7- til 8-uker gamle SCID mus (Taconic, DK) ved å følge tidligere beskrevne prosedyrer til Wrone-Smith T, Nickoloff BJ: Dermal injection of immunocytes induces psoriasis. J Clin Invest 1996, 98: 1878 1887. I korte trekk, ble humane hud xenografter som måler 1,5 x 1,5 x 0,5 cm suturbehandlet til flanken av SCID mus med absorberbar 5–0 Vicryl Rapide sutur (Ethicon, Somerville, NJ) og dekket med Xeroform forbindinger (Kendall Co., Mansfield, MA). Forbindingene ble fjernet 1 uke senere og dyrene ble holdt patogen-frie gjennom studien. Mus ble behandlet med SEW ID NO.1 og SEQ ID NO.7 to ganger per uke ved 50 mg/kg en-tre uker etter transplantasjonen. Human hud/SCID mus chimera ble drept etter 2 - 3 ukers behandling og 4-mm utstansede biopsier (Baker's Biopsy Punch, Cummins Derm, Miami, FL) ble oppnådd fra hver xenograft. Biopsier ble fiksert i nøytral-bufret formalin for paraffin innstøping og/eller montert på gummi tragacant (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), hurtig-frosset i flytende nitrogenavkjølt isopentan, og lagret ved -80 °C.

Immunfarging

Cryostat snitt av hud ble farget for relevant markør som inkluderer endotele celler (CD31/CD34), macrofager (cd11b) VEGF, VEGFR eller HIF-1a. Snittene ble motfarget med hematoksylin og eosin (som beskrevet tidligere). Alle slidene ble undersøkt og fotografert.