ES2348247T3 - Potentes oligonucleotidos de lna para la inhibicion de hif-1a. - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido de LNA que consiste en una secuencia que es: 5'-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3' (SEC ID Nº: 1). en la que las letras mayúsculas indican un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA, las letras minúsculas designan un 2-desoxinucleótido, el subíndice "s" designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de HIF1-a. En particular, esta invención se refiere a oligonucleótidos de LNA que pueden hibridar específicamente con ácidos nucleicos que codifican HIF-1a. Se ha mostrado que los oligonucleótidos de LNA modulan la expresión de HIF-1a, y se desvelan preparaciones farmacéuticas de los mismos y su uso como tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades oculares. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los tumores sólidos tienen que establecer un suministro de sangre y tienen un metabolismo de glucosa aumentado para crecer más allá de unos pocos milímetros. Cómo detectan la hipoxia y responden mediante la activación de genes inducibles por hipoxia y la secreción de factores angiogénicos para establecer un sistema sanguíneo es fundamental para la biología del cáncer. Muchos tumores contienen microentornos hipóxicos, que se han asociado con progresión maligna, metástasis y resistencia a radioterapia y quimioterapia.

El descubrimiento del factor-1 inducible por hipoxia (HIF-1) proporcionó nuevas percepciones de la regulación de genes inducibles por hipoxia (documentos US 5.882.914 y WO 96/39426; WO 99/48916). HIF-1 se compone de dos subunidades HIF-1a (HIF-1alfa; denominada en el presente documento “HIF-1a o HIF-1α”) y HIF-1β y se une a elementos de respuesta a hipoxia-1 (HRE) en potenciadores de genes que codifican factores angiogénicos tales como VEGF y proteínas relacionadas con la glicolisis tales como enzimas glicolíticas y el transportador de glucosa 1 y 3 (GLU-1 y 3).

Se ha demostrado que la regulación negativa obtenida por ingeniería genética de HIF1a por transferencia de genes intratumorales de un plásmido de HIF-1a antisentido conduce a la regulación negativa de VEGA y a la reducción de la densidad de microvasos en el tumor (documento WO 00/76497, Sun X y col, Gene Therapy (2001) 8, 638-645). El plásmido contenía un fragmento de ADNc de 320 pb que codificaba el extremo 5’ de HIF-1a (nucleótidos 152-454; Genebank AF003698).

El documento WO 2003/085110 muestra oligonucleótidos antisentido de LNA que regulan negativamente la expresión de HIF-1a humano. Un compuesto se denomina CUR813 (SEC D Nº: 11).

La presente invención desvela un oligonucleótido de LNA, que es más potente que CUR813 (SEC ID Nº: 11). Además, los oligonucleótidos de LNA específicos de acuerdo con la invención inducen la apoptosis e inhiben la proliferación. Además, los oligonucleótidos de LNA que tienen una identidad de secuencia del 100% con HIF-1a de ratón regulan negativamente la expresión de HIF-1a en el hígado, colon y riñón en ratones. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de HIF-1a. El oligonucleótido de LNA de la invención es un potente inhibidor de la expresión de ARNm de HIF-1α y de los niveles de la proteína.

Más particularmente, la presente invención proporciona un oligonucleótido de LNA que consiste en una secuencia que es 5’-TsGsGscsasgscsastscscsTsGsTsa-3’ (SEC ID Nº: 1). en la que las letras mayúsculas indican un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA, las letras minúsculas indican un 2-desoxinucleótido, y el subíndice “s” indica un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el oligonucleótido de LNA de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1A muestra una mayor estabilidad de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 5 en plasma de rata (NtacSD macho, Li-Heparine (Taconic, M&B)) en comparación con la SEC ID

N: 6. Los oligonucleótidos se incubaron a concentraciones 20 µM a 37ºC durante 0, 4 ó 24 horas. No pueden detectarse fragmentos de degradación de la SEC ID Nº: 1 incluso después de 24 horas de digestión.

La Figura 1B muestra la Estabilidad de la SEC ID Nº: 1 de Longitud Completa y la SEC ID Nº: 13, un fosforotioato e isosecuencial a la SEC ID Nº: 1, en suero de rata y humano. Se añadieron oligonucleótidos a suero humano o de rata a una concentración final de 20 µM. La figura muestra la estabilidad del oligonucleótido de LNA hasta 1-96 horas en suero humano y de rata respectivamente a 37ºC. Para el suero de rata, el penúltimo panel en la Figura 1B demuestra una actividad enzimática sostenida incluso después de 48 horas y 96 horas. El último panel funciona como control negativo que demuestra la ausencia de degradación de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 13 cuando se incuban a 37ºC sin añadir plasma.

La Figura 1C muestra una estabilidad extremadamente prolongada de la SEC ID Nº: 1 en plasma humano y de rata. El oligonucleótido se incubó en plasma humano o de rata durante 1-96 horas y se procesó en un gel de desnaturalización. Después de teñir con SyBr Gold, se midió la cantidad de producto de longitud completa usando un Phosphorimager y se representó frente al tiempo.

La Figura 2A muestra la regulación negativa de la proteína HIF-1a en células U373 transfectadas con oligonucleótidos de LNA. Se transfectaron células U373 con compuesto 2 ó 10 nM o se transfectaron de forma simulada, se incubaron en condiciones de hipoxia y se analizaron con respecto a la regulación negativa de la proteína HIF-1a por transferencia de

Western. La expresión de tubulina se analizó como control de carga igual.

La Figura 2B muestra la regulación negativa de la proteína HIF-1alfa después del tratamiento con la SEC ID Nº: 1 en líneas de células cancerosas de glioblastoma U373. La expresión de pan-actina se analizó como control de carga igual. Se transfectaron células con concentraciones 0,2, 1 y 10 nM de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 10, que es un mm 2 bp con respecto a la SEC ID Nº: 1. El panel inferior es una cuantificación del gel.

La Figura 2C muestra la regulación negativa de la expresión de HIF-1a 24 horas después del tratamiento con el oligonucleótido de LNA que se dirige a HIF-1a, SEC ID Nº: 1, y un LNA que contiene oligonucleótidos de control mezclados de la SEC ID Nº: 8 en células U373. La expresión de HIF se correlaciona con GAPDH o Beta-actina y se relaciona con un control no transfectado (simulado). Después de la purificación del ARN, se cuantifica la expresión de ARNm por QPCR.

Las Figuras 3A y 3B muestran la inducción de apoptosis medida como un perfil cinético de la actividad de la Caspasa 3/7 inducida después de un tratamiento de 24-72 horas con oligonucleótidos de LNA en la línea celular de glioblastoma U373 en condiciones de normoxia o hipoxia. Se muestra que la SEC ID Nº: 1 es un potente inductor de una apoptosis temprana.

Figura 4A: Inducción de fase celular apoptótica temprana medida por análisis de citometría del flujo con PI y Anexina V-FITC después de 48 horas. Las células U373 tratadas con el oligonucleótido de LNA de la SEC ID Nº: 1 se clasificaron como más “apoptóticas tempranas” en comparación con las células tratadas de forma simulada y tratadas con la SEC ID Nº: 12.

Figura 4B: Cuantificación de la inducción de la apoptosis temprana en células U373 después del tratamiento con la SEC ID Nº: 1. Porcentaje de células forzadas a entrar en apoptosis temprana 48 horas después del tratamiento de la SEC ID Nº: 1 en diferentes dosificaciones. Se transfectaron células U373 con la SEC ID Nº: 1 o dos oligonucleótidos de control mezclados diferentes de la SEC ID Nº: 8 y la SEC ID Nº: 12. Después de la recolección e incubación con ab de Anexina V y PI, se midió el número de células con apoptosis temprana por citometría de flujo.

Las Figuras 5A y 5B muestran células de la línea celular de glioblastoma U373 transfectadas con compuestos 24-72 horas después de la transfección e incubación en condiciones de hipoxia o normoxia. Se muestra que la SEC ID Nº: 1 es un potente inhibidor de la proliferación como se mide por ensayo MTS.

La Figura 6A y la Figura 6B muestran la regulación negativa de la diana en hígado endógena in vivo de dos regímenes de administración usando la SEC ID Nº: 1. La medición de los niveles de ARNm de HIF-1α así como el VEGF diana aguas abajo muestra que la SEC ID Nº: 1 también es un inhibidor eficaz de dicha diana. Figura 6A: inyecciones ip diariamente en ratones con pelo durante 14 días. Figura 6B: inyecciones ip dos veces por semana en ratones con pelo durante 14 días.

La Figura 6C muestra HIF-1α de riñón endógeno in vivo después de la regulación negativa por inyecciones ip administradas diariamente en ratones con pelo durante regímenes de 14 días de la SEC ID Nº: 1.

La Figura 7A muestra que la SEC ID Nº: 1 es un potente inhibidor medido por regulación negativa de la expresión in vivo de HIF-1a en hígado después de la administración de la SEC ID Nº: 1. Se dosificaron diferentes versiones tioladas de SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6) y SEC ID Nº: 1 respectivamente a ratones con pelo a 18 ó 3,6 mg/kg diariamente durante 14 días y se sacrificaron. La expresión de HIF-1a se midió a nivel del ARNm por QPCR y se normalizó para la beta-actina como se describe en M&M.

La Figura 7B muestra que la SEC ID Nº: 1 también es un potente inhibidor medido por regulación negativa de la expresión in vivo de HIF-1a en hígado después de la administración de la SEC ID Nº: 1. Se dosificaron diferentes versiones tioladas de SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6) y SEC ID Nº: 1 respectivamente a ratones con pelo a 50, 10 ó 2 mg/kg dos veces por semana durante 14 días y se sacrificaron. La expresión de HIF-1a se midió a nivel del ARNm por QPCR y se normalizó para la beta-actina.

La Figura 7C muestra la regulación negativa de la expresión in vivo de HIF-1a en riñón después de la administración de la SEC ID Nº: 1. Se dosificaron diferentes versiones tioladas de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6) a ratones con pelo a 18 ó 3,6 mg/kg al día durante 14 días y se sacrificaron. La expresión de HIF-1a se midió a nivel del ARNm por QPCR y se normalizó para la beta-actina.

La Figura 8A muestra una eficacia superior in vivo usando la SEC ID Nº: 1 en comparación con la SEC ID Nº: 11 y la SEC ID Nº: 12 (un control mezclado) medida por el peso tumoral de tumores U373 procedentes de xenoinjerto. La SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 11 y SEC ID Nº: 12 se dosificaron a 50 mg/kg dos veces por semana durante una semana en ratones con xenoinjertos de U373 implantados en los ovarios. Dos días después de la última dosis los animales se sacrificaron. En el sacrificio, se pesaron los tumores y se calculó y representó el peso de tumor individual más el peso de tumor medio (rojo). Se encontró una diferencia estadística significativa (P=0,005) entre el grupo de control (un control mezclado, SEC ID Nº: 12) y los ratones tratados con la SEC ID Nº: 1.

La Figura 8B muestra la densidad de vasos en tumores U373 procedentes de xenoinjertos tratados con SEC ID Nº: 1. La SEC ID Nº: 1 se dosificó a 50 mg/kg dos veces por semana durante una semana en ratones con xenoinjertos de U373 implantados en los ovarios.

Dos días después de la última dosis, los animales se sacrificaron. La densidad de vasos se calculó después de la tinción con CD31 y se relacionó con el área total. Se encontró una diferencia estadística significativa (P=0,005) entre el grupo tratado con solución salina y los ratones tratados con un control mezclado (SEC ID Nº: 12).

La Figura 8C muestra la tinción de CD31 en secciones de tumores U373 implantados en los ovarios y tratados con la SEC ID Nº: 1 como se describe para la Figura 8B.

La Figura 8D muestra la expresión de HIF-1α cuantificada por PCR en tiempo real y normalizada para GADPH en tumores U373 implantados en los ovarios y tratados con la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12 y PBS como se describe para la Figura 8B.

La Figura 9A muestra la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) más la regulación negativa de la diana (% de inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1a correlacionada con la expresión de β-actina) de ratones con pelo después de una dosis i.v. de la SEC ID Nº: 1 de 25 mg/kg. La SEC ID Nº: 1 tiene una semivida de aproximadamente 46 horas en riñón y 66 horas en el hígado. La Figura 9B, panel superior, muestra la SEC ID Nº: 1 dosificada a 50 mg/kg una vez i.p. en ratones con pelo. Cinco animales tratados con la SEC ID Nº: 1 a 50 mg/kg se sacrificaron 1, 3, 4, 5 y 8 días después del tratamiento y se analizó la expresión de HIF-1a y se normalizó para la Beta-actina. La expresión del HIF-1a se midió a nivel del ARNm por QPCR y se normalizó para la beta-actina como se describe en el ejemplo 8. En el panel inferior, la SEC ID Nº: 1 se dosificó a 25 ó 50 mg/kg una vez i.v. en ratones con pelo. Cinco animales tratados con la SEC ID Nº: 1 a 25 ó 50 mg/kg se sacrificaron 1, 2, 3, 4, 5 y 8 días después del tratamiento y se analizaron con respecto a la SEC ID Nº: 1 de longitud completa por procedimientos de HPLC como se describe en el ejemplo 13. Los datos se presentan como µg de SEC ID Nº: 1/gramo de tejido.

La Figura 9C muestra la expresión de HIF-1α cuantificada por PCR en tiempo real y normalizada para GAPDH en hígado de ratón en ratones que recibieron una dosis de 50 mg/kg

i.p. de SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 16 y sacrificados el día 1 y 10.

La Figura 10A muestra la duración de la acción de la SEC ID Nº: 1 que inhibe la expresión de HIF-1a en ratones con xenoinjertos dosificados con 25 mg/kg durante 7 días y sacrificados 1 ó 5 días después de la última dosis.

La Figura 10B muestra la captación en riñón, tumor cutáneo e hígado in vivo de la versión marcada con fam de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 7) a 25 mg/kg/día durante siete días y sacrificados 5 después del último tratamiento.

La Figura 10C muestra la regulación negativa de la diana (% de inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1a correlacionada con la expresión de GAPDH) más la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) de la SEC ID Nº: 7 en el hígado de ratones con xenoinjertos tratados con 5 mg/kg/día de SEC ID Nº: 7, control mezclado de SEC ID Nº: 20 o solución salina

i.p. los días 7, 10, 13 y 17 después del trasplante como se describe en el ejemplo 17.

La Figura 10D muestra la regulación negativa de la diana (% de inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1a correlacionada con la expresión de β-actina) después del tratamiento con la SEC ID Nº: 7 o el control mezclado de la SEC ID Nº: 20 más la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) de la SEC ID Nº: 7 en colon de ratón tratado como se describe en el ejemplo 17.

La Figura 10E muestra la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) de la SEC ID Nº: 7 en tumores de xenoinjerto HT29 y PC3 tratados como se describe en el ejemplo 17.

La Figura 11 muestra la regulación negativa de la diana en hígado endógena in vivo del ARNm de HIF-1a y VEGF después de 5 dosis de 30 mg/kg un día sí y dos no de la SEC ID Nº: 1 en comparación con un control de desacoplamiento de la SEC ID Nº: 9.

La Figura 12A, Figura 12B, Figura 12C y Figura 12D muestran la expresión de VEGFA y MMP-2 después del tratamiento con el oligonucleótido de LNA que se dirige a HIF-1a, de la SEC ID Nº: 1, y un control mezclado de la SEC ID Nº: 8 en células U373. Se observa una regulación negativa dependiente de la dosis en la expresión de VEGFA y MMP-2 (secreción) 48 horas después del tratamiento con la SEC ID Nº: 1 o un control mezclado (SEC ID Nº: 8) en células U373. La expresión de VEGFA (Figuras 12A, 12B y 12C) y MMP-2 (Figuras 12D y 12E) está relacionada con el número de células y normalizada con respecto a la simulación. En las Figuras 12A, 12C y 12D la expresión de VEGFA y MMP-2 se mide 48 horas después del tratamiento, mientras que en las Figuras 12B y 12E la secreción de VEGFA y MMP-2 se cuantifica 24-120 horas después de la transfección.

La Figura 13 muestra la regulación negativa de la proteína HIF-1a medida por transferencia de western y la alteración de la formación de tubos de células HUVEC tratadas con la SEC ID Nº: 1 a 1 y 5 nM en comparación con la SEC ID Nº: 8 y el control no tratado.

Figura 14A. Radioluminogramas de cuerpo entero que muestran la distribución de radiactividad 5 minutos a), 4 horas b), 24 horas c) y 18 días d) después de una sola 3H

administración intravenosa de la SEC ID Nº: 1 marcada con en ratones pigmentados hembra.

La Figura 14B muestra la distribución de radiactividad a los 5 minutos y 7 días y que se observa una retención muy pronunciada del compuesto de la SEC ID Nº: 1 marcado con 3H en médula ósea, riñón, hígado, pulmón, piel, bazo, orina, mucosa gástrica, ganglio linfático, úvea del ojo y útero después de 7 días.

La Figura 15 muestra la captación de una versión marcada con FAM de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 7) en diferentes tipos celulares dentro de médula ósea, bazo y sangre periférica 1 hora después de la administración de la SEC ID Nº: 7 en comparación con células no tratadas medida por análisis de FACS.

La Figura 16A muestra la expresión de HIF-1α medida por PCR en tiempo real y normalizada para ARN 18S en el hígado y riñón de monos cynomolgus tratados con 40, 10 y 6 mg/kg de SEC ID Nº: 1 dos veces por semana durante 4 semanas. La Figura 16B muestra la captación de la SEC ID Nº: 1 en hígado y riñón de monos cynomolgus un día después de la última dosis o 4 semanas después de la última dosis (animales de recuperación) tratados como se ha descrito anteriormente junto con datos sobre los animales de recuperación (R) que se dejaron sin tratar durante 4 semanas después del final del tratamiento. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención emplea un oligonucleótido de LNA particular para uso en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican HIF-1a. La modulación finalmente es un cambio en la cantidad de HIF-1a producida. En una realización, esto se consigue proporcionando un oligonucleótido de LNA antisentido que hibrida específicamente con ácidos nucleicos que codifican HIF-1a. La modulación preferentemente es una inhibición de la expresión de HIF-1a, que conduce a una reducción en el número de proteínas HIF-1a funcionales producidas. Los oligonucleótidos de LNA

Más particularmente, la presente invención proporciona un oligonucleótido de LNA que consiste en una secuencia que es 5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’ (SEC ID Nº: 1) en la que las letras mayúsculas indican un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA, las letras minúsculas indican un 2-desoxinucleótido, y el subíndice “s” indica un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

Las expresiones “oligonucleótido de LNA definido en el presente documento”, “oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención” y similares, se refieren al “oligonucleótido de LNA” definido anteriormente así como a las realizaciones, variantes, sales, profármacos, etc., proporcionados en lo siguiente.

Al menos por conveniencia en la preparación de los oligonucleótidos de LNA, con frecuencia se prefiere que la secuencia se extienda por una unidad de 2-desoxinucleótido en el extremo 3’, véanse, por ejemplo, las SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2 mostradas más adelante.

Como se ha mencionado anteriormente, el subíndice “s” indica un enlace fosforotioato (O-P(O,S)-O-) entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

Las unidades de nucleótidos en la secuencia están unidas por un grupo fosforotioato.

En el presente contexto, el término “nucleósido” se usa en su significado normal, es decir, contiene una unidad de 2-desoxirribosa o ribosa que está unida a través de su átomo de carbono

número uno a una de las bases nitrogenadas adenina (A), citosina, (C), timina (T), uracilo (U) o guanina (G). De una forma similar, el término “nucleótido” significa una unidad de 2-desoxirribosa o ribosa que está unida a través de su átomo de carbono número uno a una de las bases

5 nitrogenadas adenina (A), citosina, (C), timina (T), uracilo (U) o guanina (G), y que está unida a través de su átomo de carbono número cinco a un grupo fosfato internucleosídico o a un grupo terminal.

La expresión “ácido nucleico” se define como una molécula formada por un enlace covalente de dos o más nucleótidos. Las expresiones “ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan 10 indistintamente en el presente documento. La expresión “análogo de ácido nucleico” se refiere a

un compuesto de unión a ácido nucleico no natural.

La expresión “monómero de LNA” típicamente se refiere a un análogo de nucleósido bicíclico, como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 99/14226 y solicitudes posteriores, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO

15 2002/094250 y WO 03/006475 todas incorporadas en el presente documento por referencia. Beta-D-oxi-LNA es el análogo de nucleótido de LNA usado en el oligonucleótido de LNA de la presente invención y la estructura del monómero (nucleósido) se muestra en el Esquema 1.

imagen1

Beta-D-oxi-LNA

20

Esquema 1

En el Esquema 1, Z* y Z indican la posición de un enlace internucleotídico con un nucleósido vecino o un grupo terminal (es decir, un grupo 5’ terminal o un grupo 3’ terminal).

25 Un ejemplo particular de monómero de beta-D-oxi-LNA es el monómero de LNA (análogo de nucleósido de LNA) de timidina (1S, 3R, 4R, 7S)-7-hidroxi-1-hidroximetil-5-metil-3-(timin-1-il)2,5-dioxa-biciclo[2:2:1]heptano, es decir T-beta-D-oxi-LNA.

El término “oligonucleótido” se refiere, en el contexto de la presente invención, a un oligómero (también denominado oligo) o polímero de ácido nucleico (por ejemplo, ácido 30 ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN)) o análogo de ácido nucleico de los conocidos en la técnica, preferentemente ácido nucleico cerrado (LNA), o una mezcla de los

mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos por nucleobases naturales, azúcares y enlaces internucleosídicos (esqueleto), así como oligonucleótidos que no tienen partes naturales que funcionan de forma similar o con funciones específicas mejoradas. Con frecuencia se prefieren oligonucleótidos parcial o totalmente modificados o sustituidos a las formas nativas debido a varias propiedades deseables de dichos nucleótidos tales como, por ejemplo, la capacidad de atravesar la membrana celular, buena resistencia a nucleasas extra-e intracelulares, y alta afinidad y especificidad por el ácido nucleico diana. El oligonucleótido de LNA de la invención presenta las propiedades mencionadas anteriormente.

Por los términos “unidad” y “unidad de nucleótido” se entiende un monómero, es decir, un 2-desoxinucleótido o análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA.

La expresión “al menos uno” comprende los números enteros mayores o iguales a 1, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y así sucesivamente.

El término “un”, cuando se usa en relación con un nucleósido, un análogo de nucleósido, una SEC ID Nº, etc., pretende significar uno o más. En particular, la expresión “un componente (tal como un nucleósido, un análogo de nucleósido, una SEC ID Nº o similar) seleccionado entre el grupo que consiste en ...” pretende hacer referencia a que pueden seleccionarse uno o más de los componentes citados. De esta manera, expresiones tales como “un componente seleccionado entre el grupo que consiste en A, B y C” pretende incluir todas las combinaciones de A, B y C, es decir, A, B, C, A+B, A+C, B+C y A+B+C.

A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de ninguno otro elemento, entero o etapa o grupo de elementos, enteros o etapas. Preparación de los oligonucleótidos de LNA

Los bloques de construcción de análogos de nucleótidos de LNA (β-D-oxi-LNA) pueden prepararse siguiendo procedimientos publicados y referencias citadas en el presente documento, véase, por ejemplo, el documento WO 03/095467 A1; D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808; y el documento WO 2004/069991 A2.

Los oligonucleótidos de LNA pueden prepararse como se describe en los Ejemplos y en los documentos WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 y WO 03/006475. De esta manera, los oligonucleótidos de LNA pueden producirse usando las técnicas de oligomerización de la química de ácidos nucleicos bien conocidas para una persona de experiencia habitual en la técnica de la química orgánica. En general, se usan ciclos de oligomerización convencionales del enfoque de fosforamidita (S. L.

Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223) pero, por ejemplo, también pueden usarse la química de H-fosfonato y la química de fosfotiéster.

Para algunos monómeros, puede ser necesario o beneficioso un tiempo de acoplamiento mayor y/o acoplamientos repetidos y/o el uso de reactivos de acoplamiento más concentrados.

Las fosforamiditas empleadas típicamente se asocian con rendimientos por etapas satisfactorios >95%. La oxidación del fósforo (III) a fósforo (V) normalmente se realiza, por ejemplo, con yodo/piridina/H2O. Esto se produce después de la desprotección del enlace internucleosídico de fosforodiéster nativo. En caso de que se prepare un enlace internucleosídico de fosforotioato, se realiza una etapa de tiolación cambiando la oxidación normal, por ejemplo, con yodo/piridina/H2O, usada para la síntesis de enlaces internucleosídicos de fosforodiéster, por una oxidación usando el reactivo ADTT (hidruro de xantano (0,01 M en acetonitrilo:piridina 9:1, v/v)). También es posible usar otros reactivos de tiolación, tales como Beaucage y PADS. Los oligonucleótidos de LNA de fosforotioato se sintetizaron eficazmente con rendimientos de acoplamiento por etapas ≥98%.

La purificación de los oligonucleótidos de LNA puede realizarse usando cartuchos de purificación de fase inversa disponibles y/o HPLC de fase inversa y/o precipitación en etanol o butanol. Se usaron electroforesis en gel capilar, HPLC de fase inversa, MALDI-EM y IEN-EM para verificar la pureza de los oligonucleótidos de LNA sintetizados. Sales

El oligonucleótido de LNA puede emplearse en una diversidad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en el presente documento, el término se refiere a sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido de LNA y presentan efectos toxicológicos indeseados mínimos. Pueden formarse ejemplos no limitantes de dichas sales con aminoácidos orgánicos y pueden formarse sales de adición de bases con cationes metálicos tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión formado a partir de amoníaco, N,Ndibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina; o combinaciones, por ejemplo, una sal tanato de cinc o similares.

Dichas sales se forman a partir del oligonucleótido de LNA que posee un grupo fosforodiéster y/o grupos fosforotioato y son, por ejemplo, sales con bases adecuadas. Estas sales incluyen, por ejemplo, sales de metales no tóxicas que proceden de metales de los grupos Ia, Ib, IIa y IIb del Sistema Periódico de los elementos, en particular sales de metales alcalinos adecuadas, por ejemplo sales de litio, sodio o potasio, o sales de metales alcalinotérreos, por ejemplo sales de magnesio o calcio. Además incluyen sales de cinc y amonio y también sales que se forman con aminas orgánicas adecuadas, tales como mono-, di-o tri-alquilaminas no sustituidas o sustituidas con hidroxilo, en particular, mono-, di-o tri-alquilaminas, o con compuestos de amonio cuaternario, por ejemplo, con N-metil-N-etilamina, dietilamina, trietilamina, mono-, bis-o tris-(2-hidroxi-alquil inferior)aminas, tales como mono-, bis-o tris-(2hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina o tris(hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquil inferior-N(hidroxi-alquil inferior)aminas, tales como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-amina o tri-(2hidroxietil)amina, o N-metil-D-glucamina, o compuestos de amonio cuaternario tales como sales de tetrabutilamonio. Se prefieren las sales de litio, sales de sodio, sales de magnesio, sales de cinc o sales de potasio, siendo particularmente preferidas las sales de sodio.

Profármacos

En una realización, el oligonucleótido de LNA puede estar en forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son iones cargados negativamente de forma natural. Debido a la naturaleza lipófila de las membranas celulares, la captación celular de oligonucleótidos está reducida en comparación con equivalentes neutros o lipófilos. Este “impedimento” por la polaridad puede evitarse usando el enfoque de profármacos (véase, por ejemplo, Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Alemania, vol. 131, pág. 103-140). En este enfoque, los oligonucleótidos de LNA se preparan de una manera protegida de forma que los oligonucleótidos de LNA sean neutros cuando se administren. Los grupos de protección se diseñan de tal forma que puedan retirarse y después el oligonucleótido de LNA se capta por las células. Son ejemplos de dichos grupos de protección S-acetiltioetilo (SATE) o S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE). Estos grupos de protección son resistentes a nucleasas y se retiran de forma selectiva intracelularmente. Conjugados

Otro aspecto de la invención se refiere a un conjugado que comprende un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente a dicho oligonucleótido de LNA.

En un aspecto relacionado de la invención, el oligonucleótido de LNA de la invención se une a ligandos para formar un conjugado, estando destinados dichos ligandos a aumentar la captación celular del conjugado con respecto a los oligonucleótidos antisentido.

En el presente contexto, el término “conjugado” pretende indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un oligonucleótido de LNA como se describe en el presente documento (es decir, un oligonucleótido de LNA que comprende una secuencia de nucleósidos y análogos de nucleósidos de LNA) a uno o más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos.

De esta manera, los oligonucleótidos de LNA pueden conjugarse o formar quimeras, por

ejemplo, con restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos incluyendo Ácidos Péptido Nucleicos (APN), proteínas (por ejemplo, anticuerpos para una proteína diana), macromoléculas, sustancias farmacéuticas de bajo peso molecular, cadenas de ácidos grasos, restos de azúcar, glicoproteínas, polímeros (por ejemplo, polietilenglicol), grupos formadores de micelas, anticuerpos, carbohidratos, grupos de unión a receptores, esteroides tales como colesterol, polipéptidos, agentes intercalantes tales como un derivado de acridina, un alcohol de cadena larga, un dendrímero, un fosfolípido y otros grupos lipófilos o combinaciones de los mismos, etc., ya que los oligonucleótidos de LNA se pueden disponer en estructuras diméricas o dendríticas. Los oligonucleótidos de LNA o conjugados de la invención también pueden conjugarse o conjugarse adicionalmente con sustancias farmacéuticas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un agente antibacteriano, un agente quimioterapéutico o un antibiótico.

De esta manera, la conjugación puede conferir propiedades ventajosas con respecto a las características farmacocinéticas de los oligonucleótidos de LNA. En particular, la conjugación de esta forma consigue una mayor captación celular.

En una realización, un oligonucleótido de LNA está unido a ligandos para formar un conjugado, estando destinados dichos ligandos a aumentar la captación celular del conjugado con respecto a los oligonucleótidos de LNA antisentido. Esta conjugación puede tener lugar en las posiciones terminales 5’/3’-OH, pero los ligandos también pueden tener lugar en los azúcares y/o las bases. En particular, el factor de crecimiento con el que puede conjugarse el oligonucleótido de LNA antisentido puede comprender transferrina o folato. Pueden prepararse complejos de transferrina-polilisina-oligonucleótido o complejos de folato-polilisina-oligonucleótido para la captación por células que expresan altos niveles de receptor de transferrina o folato. Otros ejemplos de conjugados/ligandos son restos de colesterol, intercaladores de dúplex tales como acridina, poli-L-lisina, “protección terminal” con uno o más grupos de unión resistentes a nucleasa tal como fosforomonotioato y similares.

La preparación de complejos de transferrina como vehículos de la captación de oligonucleótidos en las células se describe por Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). La liberación celular de conjugados de folato-macromolécula por medio de endocitosis por receptor de folato, incluyendo la liberación de un oligonucleótido antisentido, se describe por Low y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.108.921. Véase también, Leamon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991). Composición farmacéutica

Un aspecto particularmente interesante de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o un conjugado como se define en el presente documento, y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica preferentemente es adecuada para inyección, para administración tópica o para administración intraocular (véase adicionalmente más adelante).

Pueden encontrarse instrucciones para la preparación de composiciones farmacéuticas en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” por Alfonso R. Gennaro y en lo siguiente.

Los diluyentes, vehículos o adyuvantes farmacéuticamente aceptables forman parte de la composición farmacéutica. Las cápsulas, comprimidos y píldoras, etc., pueden contener, por ejemplo, los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; y diversos agentes edulcorantes o aromatizantes. En el caso de las cápsulas, la unidad de dosificación puede contener un vehículo líquido tal como aceites grasos. De forma similar, pueden formar parte de la unidad de dosificación recubrimientos de azúcar o agentes entéricos. La composición farmacéutica también puede ser una emulsión de los principios activos farmacéuticos (incluyendo el oligonucleótido de LNA) y un lípido que forma una emulsión micelar.

Un oligonucleótido de LNA puede mezclarse con cualquier material que no perjudique a la acción deseada, o con un material que suplemente la acción deseada. Éstos podrían incluir otros fármacos, incluyendo otros compuestos oligonucleosídicos.

Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril (por ejemplo, agua), tampón (tampones), reguladores de la tonicidad e intensidad iónica y antibacterianos. El oligonucleótido de LNA activo puede prepararse con vehículos que facilitan la captación, protegen frente a la degradación o protegen frente a la eliminación inmediata por el cuerpo, incluyendo implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para la administración intravenosa, los vehículos preferidos son solución fisiológica salina (al 0,9%) o solución salina tamponada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato).

En una realización preferida, las inyecciones o infusiones del oligonucleótido de LNA se administran en o cerca del sitio de neovascularización. Por ejemplo, el oligonucleótido de LNA de la invención puede administrarse a células epiteliales del pigmento de la retina en el ojo. Preferentemente, el oligonucleótido de LNA se administra tópicamente en el ojo, por ejemplo en forma líquida o de gel en el párpado inferior del ojo o en el fondo de saco conjuntival, como está dentro de la experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, Acheampong AA y col, 2002, Drug Metabol. and Disposition 30: 421-429, cuya divulgación entera se incorpora en el presente documento por referencia).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de

varias formas dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistémico y el área a tratar. La administración puede ser (a) oral, (b) pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante un nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica incluyendo epidérmica, transdérmica, oftálmica y en las membranas mucosas, incluyendo administración vaginal y rectal; o d) parenteral, incluyendo inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular. En una realización, el oligonucleótido de LNA activo se administra por vía intravenosa, intraperitoneal, oral, tópica o como una inyección en embolada o se administra directamente en el órgano diana.

Actualmente se cree que la forma de administración más apropiada es por infusiones intravenosas u oral.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizaciones, supositorios, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos o guantes revestidos y similares. Las formulaciones tópicas preferidas incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención están en mezcla con un agente de liberación tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen, pero sin restricción, polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitación, potenciadores de la penetración, compuestos de vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una diversidad de componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. La liberación del fármaco en el tejido tumoral puede mejorarse mediante la liberación mediada por vehículos que incluyen, pero sin limitación, liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1): 3-27).

Una vía de administración parenteral particularmente preferida es la administración

intraocular. Se entiende que la administración intraocular del oligonucleótido de LNA de la presente invención puede realizarse por inyección o administración directa (por ejemplo, tópica) en el ojo, siempre que la vía de administración permita que los oligonucleótidos de LNA entren en el ojo. Además de las vías tópicas de administración en el ojo descritas anteriormente, las vías de administración intraoculares adecuadas incluyen la administración intravítrea, intrarretiniana, subrretiniana, subtenon, peri-y retro-orbital, transcorneal y transescleral.

Para la administración intraocular, la composición farmacéutica puede administrarse tópicamente, por ejemplo, mediante un parche o por aplicación directa en el ojo, o por iontoforesis. Las pomadas, pulverizaciones o líquidos en gotas pueden suministrarse por sistemas de liberación ocular conocidos en la técnica tales como aplicadores o cuantagotas oftálmicos. Las composiciones pueden administrarse directamente en la superficie del ojo o en el interior del párpado. Estas composiciones pueden incluir mucomiméticos tales como ácido hialurónico, sulfato de condroitina, dihidroxipropil metilcelulosa o poli(alcohol vinílico), conservantes tales como ácido sórbico, EDTA o cloruro de bencil cromo, y las cantidades habituales de diluyentes y/o vehículos.

El oligonucleótido de LNA de la invención puede proporcionarse en composiciones de liberación sostenida, tales como las descritas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº

5.672.659 y 5.595.760. El uso de composiciones de liberación inmediata o sostenida depende de la naturaleza de la afección que se está tratando. Si la afección consiste en un trastorno agudo o fulminante, se preferirá el tratamiento con una forma de liberación inmediata con respecto a la composición de liberación prolongada. Como alternativa, para ciertos tratamientos preventivos o a largo plazo, puede ser apropiada una composición de liberación sostenida.

Un oligonucleótido de LNA puede inyectarse en el interior del ojo, tal como con una aguja u otro dispositivo de liberación.

En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden un oligonucleótido de LNA de la invención (por ejemplo, del 0,1 al 90% en peso) o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, mezclado con un medio de vehículo fisiológicamente aceptable. Son medios de vehículo fisiológicamente aceptables preferidos agua, agua tamponada, solución salina normal, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden comprender excipientes y/o aditivos farmacéuticos convencionales. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen estabilizantes, antioxidantes, agentes para ajustar la osmolalidad, tampones y agentes para ajustar el pH. Los aditivos adecuados incluyen tampones fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato de trometamina), adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o DTAPA-bisamida) o complejos de quelato cálcico (tales como, por ejemplo, DTPA cálcico, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro cálcico, ascorbato cálcico, gluconato cálcico o lactato cálcico). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden envasarse para uso en forma líquida o pueden liofilizarse.

En el caso de las composiciones sólidas, pueden usarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales; por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sádica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

Preferentemente, un oligonucleótido de LNA se incluye en una formulación unitaria tal como en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz sin producir efectos secundarios graves en el paciente tratado.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que convenientemente pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Estas técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el vehículo (vehículos) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas farmacéuticas posibles tales como, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

En realizaciones preferidas de las composiciones farmacéuticas, el oligonucleótido de LNA se formula en un vehículo acuoso, en particular un vehículo acuoso que comprende un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5, y que tiene una intensidad iónica de 202000 mM.

La expresión “vehículo acuoso” significa que la composición farmacéutica en cuestión está en forma líquida, y que el vehículo líquido predominantemente está compuesto por agua, es decir, al menos un 80% (p/p) o al menos un 90% (p/p) o incluso al menos un 95% (p/p) del vehículo consiste en agua. También pueden usarse otros ingredientes líquidos, por ejemplo, etanol, DMSO, etilenglicol, etc.

El vehículo acuoso preferentemente comprende solución salina o un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5. Preferentemente, el tampón mantendrá el pH en el intervalo de 5,0-8,0, tal como en el intervalo de 6,0-7,5, tal como solución salina tamponada, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato (PBS).

También es importante la intensidad iónica/tonicidad de la composición farmacéutica. De esta manera, típicamente, la composición farmacéutica líquida tiene una intensidad iónica en el intervalo de 20-2000 mM, tal como el intervalo de 50-1500 mM, o en el intervalo de 100-1000 mM. Fármacos de combinación

Debe entenderse que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención opcionalmente comprende otros compuestos antisentido, agentes quimioterapéuticos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales, compuestos citostáticos, compuestos antiangiogénicos, compuestos antiproliferativos, compuestos pro-apoptóticos, moduladores de la transducción de señales, inhibidores de quinasa y/o compuestos inmunomoduladores. Actualmente se cree que es particularmente interesante combinar el oligonucleótido de LNA con al menos un agente quimioterapéutico.

Como se ha indicado, la composición farmacéutica de la invención puede comprender además al menos un agente quimioterapéutico. El compuesto quimioterapéutico típicamente se selecciona entre el grupo que consiste en adrenocorticosteroides tales como prednisona, dexametasona o decadron; altretamina (hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (ethyol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidex); andrógenos, tales como testosterona; asparaginasa (elspar); Avastin; bacilo Calmette-Guérin; bicalutamida (casodex); bifosfanato; bleomicina (blenoxane); bortezomib; busulfán (myleran); carboplatino (paraplatin); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribine, leustatin); cisplatino (platinol); ciclofosfamida; arabinósido de citosina (cytarabine); dacarbacina (DTIC); dactinomicina (actinomycin-D, cosmegen); daunorrubicina (cerubidine); docetaxel (taxotere); doxorrubicina (adriamycin); epirrubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, tales como dietilestilbestrol (DES); etopósido (VP-16, VePesid, etopophos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); S-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hydrea); idarrubicina (idamycin); ifosfamida; IL-2 (proleukin, aldesleukin); interferón alfa (intron A, roferon A); irinotecán (camptosar); leuprolida (lupron); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza nitrogenada); melfalán (alkeran); mercaptopurina (purinethol, 6-MP); metotrexato (mexate); 2-metoxiestradiol (2ME2, Panzem); mitomicina-C (mutamucin); mitoxantrona (novantrone); octreótido (sandostatin); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mithramycin, mithradn); procarbazina (matulane) estreptozocina; tamoxifeno (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipósido (vumon, VM-26); Talidomida; tiotepa; topotecán (hycamtin); tretinoína (vesanoid, ácido retinoico todo trans); vinblastina (valban); vincristina (oncovin) y vinorelbina (navelbine).

Para el tratamiento del mieloma múltiple, se prefieren agentes quimioterapéuticos tales como melfalán, ciclofosfamida, prednisona, vincristina, doxorrubicina, carmustina, dexametasona, talidomida, bortezomib y bifosfanato.

Para el tratamiento del carcinoma renal, se prefieren agentes quimioterapéuticos tales como gemcitabina, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina, paclitaxel, carboplatino, ifosfamida, doxorrubicina, vinblastina, IFN-alpha, e IL-2.

En una variante, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más oligonucleótidos de LNA y (b) uno o más compuestos quimioterapéuticos distintos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Cuando se usan con los oligonucleótidos de LNA, dichos compuestos quimioterapéuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo mitramicina y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de otro agente y oligonucleótido) o en combinación con uno o más compuestos quimioterapéuticos distintos o en combinación con radioterapia. Todos los compuestos quimioterapéuticos conocidos por un experto en la materia incluyendo los mencionados explícitamente anteriormente se incorporan en el presente documento como tratamientos de combinación con un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención.

En una realización, la composición farmacéutica se administra en combinación con un compuesto de taxano.

La expresión “compuesto de taxano” pretende incluir paclitaxel (Taxol®), derivados de paclitaxel, docetaxel, taxotere, taxanos modificados y análogos de taxoide. El paclitaxel (Taxol®) es un diterpeno aislado a partir de la corteza del tejo occidental (del Pacífico), Taxus brevifolia y es representante de una clase de agentes terapéuticos que tienen un sistema de anillo de taxano. Se han producido paclitaxel y sus análogos por síntesis parcial a partir de 10desacetilbacatina III, un precursor obtenido a partir de agujas y pequeñas ramas de tejo, y por síntesis total. Véase Holton, y col., J. Am. Chem. Soc. 116: 1597-1601 (1994) y Nicolaou, y col., Nature 367: 630 (1994). El paclitaxel ha demostrado eficacia en varios tumores humanos en ensayos clínicos. Véase McGuire, y col., Ann. Int. Med. 111: 237-279 (1989); Holmes, y col., J. Natl. Cancer Inst. 83: 1797-1805 (1991); Kohn y col., J. Natl. Cancer Inst. 86:18-24 (1994); y Kohn, y col., American Society for Clinical Oncology 12 (1993). Los análogos de taxoide o taxano modificados son los compuestos que tienen un anillo de taxano que lleva cadenas laterales modificadas. Varios de estos análogos tienen propiedades mejoradas, tales como una mayor solubilidad en agua y estabilidad que el paclitaxel natural. Estos análogos se conocen por los expertos en la materia y se desvelan, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.278.324; 5.272.171; 5.254.580; 5.250.683; 5.248.796 y 5.227.400, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia. El paclitaxel y taxotere pueden prepararse por los procedimientos de los documentos WO 93/18210, EP 0 253 739, EP 0 253 739 y WO 92/09589, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia. En realizaciones particulares, el compuesto de taxano es paclitaxel o taxotere.

La relación de pesos entre el compuesto o compuestos de taxano y el oligonucleótido de LNA en dicha composición típicamente está en el intervalo de 50:1 a 1:25, tal como en el intervalo de 25:1 a 1:25, o en el intervalo de 10:1 a 1:25, o en el intervalo de 1:1 a 1:25, o en el intervalo de

50:1 a 1:10, o en el intervalo de 1:1 a 1:50, o en el intervalo de 25:1 a 1:10.

En otra realización, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener uno o más oligonucleótidos de LNA y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a una segunda diana de ácido nucleico. Dos o más compuestos combinados pueden usarse conjunta o secuencialmente.

En las composiciones de la invención también pueden combinarse fármacos antiinflamatorios, incluyendo pero sin limitación antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, fármacos antivirales y fármacos inmunomoduladores. Dos o más compuestos combinados pueden usarse conjunta o secuencialmente.

Además, las composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos de LNA pueden usarse en combinación con radioterapia, etc. Tratamiento médico

Los oligonucleótidos de LNA de la invención son útiles para varias aplicaciones terapéuticas como se indica en el presente documento. En general, los procedimientos terapéuticos de la invención incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido modificado de LNA a un mamífero, particularmente un ser humano.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o un conjugado como se define en el presente documento para uso como un medicamento.

La dosificación depende de la gravedad y capacidad de respuesta del estado de enfermedad a tratar, y el curso del tratamiento dura desde varios días a varios meses, o hasta que se realice una curación o se consiga una disminución del estado de enfermedad. Los programas de dosificación óptimos también pueden evaluarse midiendo el fármaco en el cuerpo del paciente o por marcadores sustitutos.

Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales. Generalmente, pueden estimarse basándose en el valor de CE50 considerado eficaz en modelos animales in vivo e in vitro. En general, la dosificación es de 0,01 µg a 1 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una o más veces al día, por semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 a 10 años o mediante infusión continua durante horas hasta varios meses. Las proporciones de repetición para la dosificación pueden estimarse basándose en los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del fármaco en fluidos corporales o tejidos. Después de un tratamiento satisfactorio, puede ser deseable que se mantenga la terapia del paciente para prevenir la reaparición del estado de enfermedad. Actualmente se cree que las dosis más relevantes son de 0,01 mg a 100 mg, tal como de 0,1 mg a 40 mg o de 0,5 mg a 10 mg por kg de peso corporal. Dichas dosis pueden administrarse una vez al día, pero más preferentemente con menos frecuencia, por ejemplo 1-3 veces por semana, durante un periodo de 1-4 semanas. La terapia de mantenimiento puede continuarse, por ejemplo, 1-4 veces al mes o incluso con menos frecuencia, tal como 1-10 veces al año.

Un experto en la materia apreciará que los oligonucleótidos de LNA pueden usarse para combatir enfermedades asociadas con HIF-Ia por muchos principios diferentes, que de esta manera están dentro del espíritu de la presente invención.

Como se usan en el presente documento, la expresión “ácido nucleico diana” incluye ADN que codifica el HIF-Ia, ARN (incluyendo pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN.

Como se usa en el presente documento, el término “gen” significa el gen que incluye exones, intrones, regiones 5’ y 3’ no codificantes y elementos reguladores y todas las variantes conocidas actualmente del mismo y cualquier variante adicional, que pueda esclarecerse.

Como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido de LNA” se refiere a un oligonucleótido que puede inducir un efecto terapéutico deseado en seres humanos por medio de, por ejemplo, la unión mediante la formación de enlaces de hidrógeno a un gen diana “Chimeraplast” y “TFO”, al transcrito o transcritos de ARN del gen diana “inhibidores antisentido”, “ARNip”, “miARN”, “ribozimas” y “oligozimas” o a la proteína o proteínas que se codifican por el gen diana “aptámero”, “spiegelmer” o “señuelo”.

Como se usa en el presente documento, el término “ARNm” significa el transcrito o transcritos de ARNm actualmente conocidos de un gen diana, y cualquier transcrito adicional, que pueda identificarse.

Como se usa en el presente documento, el término “modulación” significa un aumento (estimulación) o una reducción (inhibición) en la expresión de un gen. En la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión del gen y el ARNm es una diana

preferida.

Como se usa en el presente documento, el término “dirección” de un compuesto antisentido a un ácido nucleico diana particular significa proporcionar el oligonucleótido antisentido a la célula, animal o ser humano de tal forma que el compuesto antisentido pueda unirse y modular la función de su diana deseada.

Los oligonucleótidos de LNA pueden diseñarse como ARNip que son moléculas de ARN bicatenario pequeñas que se usan por las células para silenciar genes endógenos o exógenos específicos por un mecanismo “de tipo antisentido” poco entendido hasta ahora.

La eficacia clínica de los oligonucleótidos antisentido depende en una medida significativa de su farmacocinética, por ejemplo, absorción, distribución, captación celular, metabolismo y excreción. A su vez, estos parámetros se guían significativamente por la química subyacente y el tamaño y la estructura tridimensional del oligonucleótido.

La modulación de las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención puede conseguirse adicionalmente usando la unión de una diversidad de restos diferentes. Por ejemplo, la capacidad de los oligonucleótidos de atravesar la membrana celular puede mejorarse por la unión, por ejemplo, de restos de lípidos tales como un resto de colesterol, un tioéter, una cadena alifática, un fosfolípido o una poliamina al oligonucleótido. De forma similar, la captación de oligonucleótidos de LNA en las células puede mejorarse por conjugación de restos con el oligonucleótido que interacciona con moléculas en la membrana, que medía el transporte al citoplasma.

Las propiedades farmacodinámicas de acuerdo con la invención pueden mejorarse con grupos que mejoran la captación del oligonucleótido de LNA, mejoran la bioestabilidad tal como mejorando la resistencia del oligonucleótido de LNA a la degradación y/o aumentan la especificidad y afinidad de las características de hibridación de los oligonucleótidos con secuencias diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede usarse para el tratamiento de muchas enfermedades diferentes. Al igual que las células cancerosas, las células del endotelio vascular en proliferación son sensibles a la regulación negativa de la expresión de HIF-Ia. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención, por lo tanto, puede usarse en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una enfermedad anormal que causa angiogénesis. Son ejemplos de dichas enfermedades cánceres en general y arteriosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica y sarcoma de Kaposi.

En general, un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece o es susceptible de padecer una enfermedad producida por una angiogénesis anormal, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido de LNA o un conjugado como se define en el presente documento.

Además, la invención también se refiere a un procedimiento para inhibir la angiogénesis, que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o un conjugado como se define en el presente documento o una composición farmacéutica como se define en el presente documento.

Un aspecto interesante de la invención se refiere al uso de un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o como un conjugado como se define en el presente documento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre arteriosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación e inflamación cutánea u otras enfermedades relacionadas con la piel.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede usarse en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, inflamaciones tales como inflamaciones cutáneas u otras enfermedades o trastornos de la piel, por ejemplo, psoriasis, y artritis reumatoide.

De forma similar, otro aspecto interesante de la invención se refiere a un procedimiento para tratar una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en arteriosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación e inflamación cutánea, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o un conjugado como se define en el presente documento o una composición farmacéutica como se define en el presente documento a un paciente que lo necesita.

Son particularmente interesantes enfermedades angiogénicas que incluyen retinopatía diabética, degeneración macular, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino y otras enfermedades inflamatorias. Estas enfermedades se caracterizan por la destrucción del tejido normal por vasos sanguíneos recién formados en el área de neovascularización. Por ejemplo, en la degeneración macular, la coroides se invade y destruye por capilares. La destrucción dirigida por la angiogénesis de la coroides en la degeneración macular finalmente conduce a una ceguera parcial o total.

Los procedimientos de la invención preferentemente se emplean para el tratamiento o profilaxis de enfermedades producidas por cáncer, particularmente para el tratamiento de cáncer como el que puede aparecer en tejidos tales como cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, páncreas, hígado, tiroides, riñón, cerebro, testículos, estómago, intestino, médula espinal, senos, vejiga, tracto urinario u ovarios.

Además, la invención descrita en el presente documento incluye un procedimiento para

prevenir o tratar cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido de LNA que modula HIF-Ia incluyendo, pero sin limitación, altas dosis del oligonucleótido de LNA, a un ser humano que necesita dicha terapia. La invención además más incluye el uso de un período corto de administración de un oligonucleótido de LNA que modula HIF-la. Las células normales no cancerosas se dividen a una frecuencia característica para el tipo celular particular. Cuando una célula se ha transformado en un estado canceroso, se produce una proliferación celular incontrolada y se reduce la muerte celular, y por lo tanto, una división celular o crecimiento celular promiscuo es un signo característico de un tipo celular canceroso.

Los ejemplos de tipos de cáncer incluyen, pero sin limitación, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda, tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple), carcinoma de colon, carcinoma rectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, cáncer cervical, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cánceres de sitio primario desconocido, neoplasmas, cánceres del sistema nervioso periférico, cánceres del sistema nervioso central, tumores (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma y retinoblastoma), enfermedad de cadena pesada, metástasis o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado o anormal.

Se entiende que el término “carcinoma” indica un tumor maligno de origen epitelial. El tejido epitelial cubre o reviste las superficies corporales en el interior y exterior del cuerpo. Son ejemplos de tejido epitelial la piel y la mucosa y serosa que revisten las cavidades corporales y los órganos internos, tales como intestinos, vejiga de la orina, útero, etc. El tejido epitelial también puede extenderse a capas de tejido más profundas para formar glándulas tales como glándulas secretoras de moco.

Se entiende que el término “sarcoma” indica un tumor maligno que crece a partir de tejido

conectivo, tal como cartílago, grasa, músculos, tendones y huesos.

Se entiende que el término “glioma”, cuando se usa en el presente documento, incluye un tumor maligno que procede de células gliales.

En el uso de un oligonucleótido de LNA de la invención o como conjugado de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, dicho cáncer puede estar convenientemente en forma de un tumor sólido. Además, dicho cáncer convenientemente también es un carcinoma. El carcinoma típicamente se selecciona entre el grupo que consiste en melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma de ovario, carcinoma de mama, cáncer pulmonar no microcítico, carcinoma de células renales, carcinoma de vejiga, cáncer de vejiga superficial recurrente, carcinoma de estómago, carcinoma prostático, carcinoma pancreático, carcinoma de pulmón, carcinoma cervical, displasia cervical, papilomatosis laríngea, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides. Más típicamente, dicho carcinoma se selecciona entre el grupo que consiste en melanoma maligno, cáncer microcítico de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de colon y carcinoma de células renales. El melanoma maligno típicamente se selecciona entre el grupo que consiste en melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, léntigo maligno melanoma, melanoma acral, melanoma amelanótico y melanoma desmoplásico.

Como alternativa, el cáncer convenientemente puede ser un sarcoma. El sarcoma típicamente está en una forma seleccionada entre el grupo que consiste en osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma y sarcoma de Kaposi.

Como alternativa, el cáncer puede ser un glioma.

También se cree que los oligonucleótidos de LNA y conjugados definidos en el presente documento son particularmente útiles para el tratamiento de una enfermedad cancerosa seleccionada entre el grupo que consiste en mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer cerebral y cáncer de mama.

El oligonucleótido de la invención puede usarse en un procedimiento para tratar cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o un conjugado como se define en el presente documento o una composición farmacéutica como se define en el presente documento a un paciente que lo necesita. En una variante, el cáncer está en forma de un tumor sólido. El cáncer sólido convenientemente puede ser un carcinoma o un sarcoma o un glioma, como se ha analizado anteriormente.

Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o como conjugado como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que dicho medicamento comprende además un agente quimioterapéutico seleccionado entre los definidos anteriormente bajo el título “Fármacos de combinación”. Convenientemente, el agente quimioterapéutico adicional se selecciona entre taxanos tales como Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.

Como alternativa, el oligonucleótido de la invención puede usarse en un procedimiento para tratar cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento, o un conjugado como se define en el presente documento o una composición farmacéutica como se define en el presente documento a un paciente que lo necesita y que comprende además la administración de un agente quimioterapéutico adicional. Dicha administración adicional puede ser tal que el agente quimioterapéutico adicional esté conjugado con el oligonucleótido de LNA de la invención, esté presente en la composición farmacéutica o se administre en una formulación separada.

En una realización preferida, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más agentes quimioterapéuticos distintos que previenen la despolimerización de microtúbulos y la formación de tensión en los cinetocoros de cromátidas hermanas, pero no la unión de los microtúbulos a los cinetocoros. Dichos agentes quimioterapéuticos incluyen taxanos como se han definido anteriormente, en particular caso, Taxol, Paclitaxel o Docetaxel. Cuando se usan con los oligonucleótidos de LNA de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos deben usarse secuencialmente empezando con el tratamiento con oligonucleótido durante un periodo de tiempo que sensibiliza a las células diana al co-tratamiento posterior con el agente quimioterapéutico reduciendo el nivel de proteína HIF-Ia en las células tumorales y células endoteliales en proliferación del sistema vascular del tumor.

En otra realización preferida, el tratamiento médico usando un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la presente invención se combina con radioterapia. Cuando se usa con los oligonucleótidos de LNA de la invención, la radioterapia debe usarse secuencialmente empezando con el tratamiento con oligonucleótido durante un periodo de tiempo que sensibiliza a las células diana a la radioterapia adicional posterior reduciendo el nivel de proteína HIF-Ia en las células tumorales y células endoteliales en proliferación del sistema vascular del tumor.

Los oligonucleótidos de LNA de la presente invención también pueden utilizarse como reactivos de investigación para diagnóstico, terapia y profilaxis. En investigación, los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para inhibir específicamente la síntesis de genes de HIF-Ia en células y animales experimentales facilitando de esta manera el análisis funcional de la diana o una apreciación de su utilidad como diana para intervención terapéutica. En diagnóstico, los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para detectar y cuantificar la expresión de HIF-Ia en células y tejidos por transferencia de Northern, hibridación in situ o técnicas similares. Para terapia, un animal o ser humano que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse por modulación de la expresión de HIF-Ia, se trata mediante la administración de oligonucleótidos de LNA antisentido de acuerdo con la presente invención. El oligonucleótido de la invención puede usarse en procedimientos de tratamiento de un animal, en particular ratón y rata, y de tratamiento de un ser humano, que se sospecha que tiene o que es propenso a padecer una enfermedad o afección asociada con la expresión de HIF-Ia, mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los oligonucleótidos de LNA antisentido o conjugados o composiciones farmacéuticas de la invención.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para inducir apoptosis que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento, un conjugado como se define en el presente documento o una composición farmacéutica como se define en el presente documento. La inducción de apoptosis es in vitro. La inducción puede realizarse en un ensayo celular o dentro de una muestra de tejido.

Un aspecto relacionado de la invención se refiere a un procedimiento para prevenir la proliferación celular que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o un conjugado como se define en el presente documento o una composición farmacéutica como se define en el presente documento. La prevención de la proliferación es in vitro. La prevención puede realizarse en un ensayo celular o dentro de una muestra de tejido. Además, los oligonucleótidos de la invención pueden usarse en un procedimiento para tratar una enfermedad angiogénica que comprende la administración de un oligonucleótido de LNA como se define en el presente documento o un conjugado como se define en el presente documento o una composición farmacéutica como se define en el presente documento, de tal forma que se inhibe la angiogénesis asociada con la enfermedad angiogénica.

En una realización, la enfermedad angiogénica comprende un tumor asociado con un cáncer; véase también anteriormente. El cáncer preferentemente se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral cáncer abdominal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer de hígado, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilms, mieloma múltiple, cáncer de piel, linfoma y cáncer sanguíneo. Como alternativa, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer cerebral y cáncer de mama.

La enfermedad angiogénica también puede seleccionarse entre el grupo que consiste en retinopatía diabética, degeneración macular y enfermedades inflamatorias. Particularmente, la enfermedad angiogénica es una enfermedad inflamatoria seleccionada entre enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y artritis reumatoide.

¿Se cree que el tratamiento de la degeneración macular es particularmente relevante con los oligonucleótidos de LNA de la invención? Kits

Si la composición farmacéutica en forma líquida tiene riesgo de someterse a condiciones que comprometerán la estabilidad del oligonucleótido de LNA, puede preferirse producir el producto terminado que contiene el oligonucleótido de LNA en una forma sólida, por ejemplo, como un material liofiliado, y almacenar el producto en dicha forma sólida. El producto después puede reconstituirse (por ejemplo, disolverse o suspenderse) en una solución salina o en una solución salina tamponada lista para uso antes de la administración.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un kit que comprende

(a)

un primer componente que contiene un oligonucleótido de LNA o un conjugado como se define anteriormente en el presente documento en forma sólida, y

(b)

un segundo componente que contiene solución salina o una solución tampón (por ejemplo, solución salina tamponada) adaptada para la reconstitución (por ejemplo, disolución o suspensión) de dicho oligonucleótido de LNA.

Preferentemente, dicha solución salina o solución salina tamponada tiene un pH en el intervalo de 4,0-8,5, y una molaridad de 20-2000 mM. En una realización preferida, la solución salina o la solución salina tamponada tiene un pH de 6,0-8,0 y una molaridad de 100-500 mM. En una realización más preferida, la solución salina o solución salina tamponada tiene un pH de 7,08,0 y una molaridad de 120-250 mM.

Para dicho kit, el oligonucleótido de LNA es la SEC ID Nº: 1.

La invención se ilustra adicionalmente de una forma no limitante mediante los siguientes ejemplos. PARTE EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Síntesis de monómero

Se prepararon los bloques de construcción de monómero de LNA y derivados de los mismos siguiendo procedimientos publicados y referencias citadas en los mismos, véanse, por ejemplo, el documento WO 03/095467 A1 y D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.

Ejemplo 2: Síntesis de oligonucléotidos

Se sintetizaron oligonucleótidos usando el enfoque de fosforamidita en un sintetizador

Expedite 8900/MOSS (Multiple Oligonucleotide Synthesis System) a una escala de 1 µmol o 15 µmol. Para la síntesis a mayor escala se usó un Akta Oligo Pilot. Al final de la síntesis (DMT-on), los oligonucleótidos se escindieron del soporte sólido usando amoníaco acuoso durante 1-2 horas a temperatura ambiente y se desprotegieron adicionalmente durante 4 horas a 65ºC. Los oligonucleótidos se purificaron por HPLC de fase inversa (RP-HPLC). Después de retirar el grupo de DMT, los oligonucleótidos se caracterizaron por AE-HPLC, RP-HPLC y CGE y la masa molecular se confirmó adicionalmente por IEN-EM. Para más detalles véase más adelante. Preparación del soporte sólido de LNA: Preparación del succinil hemiéster de LNA

Se disolvieron monómero de 5’-O-Dmt-3’-hidroxi-LNA (500 mg), anhídrido succínico (1,2 eq.) y DMAP (1,2 eq.) en DCM (35 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después de las extracciones con NaH2PO4 0,1 M, pH 5,5 (2x) y salmuera (1x), la capa orgánica se secó adicionalmente con Na2SO4 anhidro, se filtró y se evaporó. El derivado de hemiéster se obtuvo con un rendimiento del 95% y se usó sin ninguna purificación adicional. Preparación del soporte de LNA

El derivado de hemiéster preparado anteriormente (90 µmol) se disolvió en una cantidad mínima de DMF, se añadieron DIEA y pyBOP (90 µmol) y se mezclaron conjuntamente durante 1 min. Esta mezcla preactivada se combinó con LCAA-CPG (500 Å, tamaño de malla 80-120, 300 mg) en un sintetizador manual y se agitó. Después de 1,5 horas a temperatura ambiente, el soporte se retiró por filtración y se lavó con DMF, DCM y MeOH. Después del secado, se determinó que la carga era de 57 µmol/g (véase Tom Brown, Dorcas J.S. Brown. Modem machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. En: F. Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14). Elongación del oligonucleótido

El acoplamiento de fosforamiditas (A(bz), G(Ibu), 5-metil-C(bz)) o T-β-cianoetilfosforamidita) se realiza usando una solución de una concentración 0,1 M de la amidita protegida con 5’-O-DMT en acetonitrilo y DCI (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0,25 M) como activador. La tiolación se realiza usando cloruro de xantano (0,01 M en acetonitrilo:piridina al 10%). El resto de los reactivos son los usados típicamente para la síntesis de oligonucleótidos. El protocolo proporcionado por el proveedor se optimizó convenientemente.

Purificación por RP-HPLC

Columna:

Xterra RP18

Caudal:

3 ml/min

Tampones:

Acetato amónico 0,1 M pH 8 y acetonitrilo

Abreviaturas:

DMT: Dimetoxitritilo

DCI: 4,5-Dicianoimidazol

DMAP: 4-Dimetilaminopiridina

5 DCM: Diclorometano

DMF: Dimetilformamida

THF: Tetrahidrofurano

DIEA: N,N-diisopropiletilamina

PyBOP: Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio 10 Bz: Benzoílo

Ibu: Isobutirilo

Ejemplo 3: Diseño del oligonucleótido de LNA

Tabla 1 -Oligonucleótidos de LNA

SEC ID Nº: 1

5’-TsGsGsCsasasgsCsastscscsTsGsTsa-3’

SEC ID Nº: 2

5’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3’

SEC ID Nº: 3

5’-(Tx)GxGxCsasasgscsastscscsTxGx(T)-3’

SEC ID Nº: 4

5’-(Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTx(A)-3’

SEC ID Nº: 5

5’-TGGcsasasgscsastscscsTGTa-3’

SEC ID Nº: 6

5’-TGGcaagcatccTGTa-3’

SEC ID Nº: 7

FAM-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’

SEC ID Nº: 8

5’-CsGsTscsasgstsastsgscsgsAsAsTsc-3’

SEC ID Nº: 9

5’-TsGsGscsasasascsastscscsTsGsTsa-3’

SEC ID Nº: 10

5’-TsGsAscsasasgscsastscscsAsGsTsa-3’

SEC ID Nº: 11

5’-TGGTgsasgsgscstsgstsCCGA-3’

SEC ID Nº: 12

5’-TTGCgsgsascstscsgsgsATGG-3’

SEC ID Nº: 13

5’-tsgsgscsasasgscsastscscstsgstsa-3’

SEC ID Nº: 14

5’-TsTs mCscstsastsgscstsgstsAsTs mCsc-3’

SEC ID Nº: 15

5’-TsGsGsCsasasgscsastscscsTsGsT-3’

SEC ID Nº: 16

5’-GsGscsasasgscsastscscsTsGst-3’

SEC ID Nº: 17

5’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAs-3’

SEC ID Nº: 18

5’-TsTsascstsgscscststscsTsTsa-3’

SEC ID Nº: 19

5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGst-3’

SEC ID Nº: 20

FAM-CsGsTscsasgstsastsgscsgsAsAsTs-3’

5

10

15

20

25

30

30

En la Tabla 1, las letras mayúsculas indican un análogo de β-D-oxi-nucleótido de LNA (βD-oxi-LNA), las letras minúsculas indican un 2-desoxinucleótido, el subrayado indica un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA o un 2-desoxinucleótido y el subíndice “s” indica un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos, y la ausencia de subíndice entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos indica un enlace fosforodiéster, y el subíndice “x” indica un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos, y las unidades de nucleótidos en un paréntesis, por ejemplo, (TX) o (GX), respectivamente, representan una unidad opcional. Todos los monómeros de LNA-C son 5-metil-C (MeC).

Medición de la temperatura de fusión Tm de los compuestos:

Una solución 3 µM de la SEC ID Nº: 1 en fosfato sódico 10 mM/NaCl 100 mM/EDTA 0,1 nM, pH 0,7 se mezcló con su ADN/ARN complementario 3 µM en fosfato sódico 10 nM/NaCl 100 mM/EDTA 0,1 nM, pH 7,0 a 90ºC durante un minuto y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después se determinó la Tm del dúplex aumentando la temperatura 1ºC/min de 25 a 95ºC. La Tm de la SEC ID Nº: 1 se muestra en la Tabla 2 a continuación:

Tabla 2

Secuencia/Tm

ADN ARN

SEC ID Nº: 1 TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa

64,2ºC 68,4ºC

Ejemplo 4: Estabilidad de oligonucleótidos de LNA en plasma humano o de rata

Se ensayó la estabilidad de oligonucleótidos de LNA en plasma procedente de seres humanos o ratas (también podría ser plasma de ratón, mono o perro). En 45 µl de plasma, se añaden 5 µl de oligonucleótido de LNA (una concentración final de 20 µM). Los oligonucleótidos de LNA se incuban en plasma durante tiempos que varían de 0 a 96 horas a 37ºC (el plasma se ensaya con respecto a la actividad nucleasa hasta 96 horas y no muestra diferencias en el patrón de escisión por nucleasa). En el momento indicado, la muestra se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. Se diluyeron 2 µl (que equivalen a 40 pmol) de oligonucleótido de LNA en plasma añadiendo 15 µl de agua y 3 µl de colorante de carga 6x (Invitrogen). Como marcador se usa un marcador de peso molecular (ladder) de 10 pb (Invitrogen 10821-015). A 1 µl de marcador de peso molecular se le añade 1 µl de carga 6x y 4 µl de agua. Las muestras se mezclan, se calientan a 65ºC durante 10 min y se cargan en un gel de preprocesamiento (acrilamida al 16%, UREA 7 M, TBE 1x, preprocesamiento a 50 vatios durante 1 hora) y se procesa a 50-60 vatios durante 2,5 horas. Posteriormente, el gel se tiñe con SyBR gold 1x (Molecular Probes) en TBE 1x durante 15 min. Las bandas se visualizaron usando un phosphorimager de Biorad. (Véase la

Figura 1A en plasma de rata y la Figura 1B en plasma humano y de rata).

La estabilidad del oligonucleótido de LNA se ensayó en plasma de ser humano (también podría ser de plasma de rata, ratón, mono o perro). Se añadió una concentración final de 20 µM (entre 1 ó 5 µl) de oligonucléotido de LNA a un volumen total de 20 µl de plasma y se incubó durante tiempos que variaban de 0 a 24 horas (que podrían ser de hasta 72 horas -el plasma se ha ensayado con respecto a la actividad nucleasa hasta 72 horas y no hay diferencia en el patrón de escisión). En el momento indicado, la muestra se almacenó a -80ºC. Se diluyó 1 µl (equivale a 20 pmol) de oligonucleótidos de LNA en plasma 10 x en agua y se procesó en un gel de acrilamida al 16% y UREA 7 M con un marcador de peso molecular de 10 pb (de Invitrogen (nº cat. 10821-015)). El gel se procesó a aproximadamente a 40 vatios durante 2-3 horas antes de teñirse con SyBR gold 1x (molecular probes) en TBE 1x durante 15 min. Las bandas se visualizaron usando un phosphorimager de Biorad. (Véase la Figura 1). Ejemplo 5: Modelo in vitro: Cultivo celular

El efecto de oligonucleótidos de LNA sobre la expresión de ácidos nucleicos diana puede ensayarse en cualquiera de una diversidad de tipos celulares siempre que el ácido nucleico diana esté presente en niveles medibles. La diana puede expresarse endógenamente o por transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica dicho ácido nucleico.

El nivel de expresión del ácido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando, por ejemplo, análisis de transferencia de Northern, PCR Cuantitativa y ensayos de protección de Ribonucleasa. Los siguientes tipos celulares se proporcionan con fines ilustrativos, pero pueden usarse rutinariamente otros tipos celulares, siempre que la diana se exprese en el tipo celular elegido.

Se cultivaron células en el medio apropiado como se describe más adelante y se mantuvieron a 37ºC a una humedad del 95-98% y un 5% de CO2. Cuando se cultivaron en condiciones de hipoxia o anoxia, los niveles de O2 se mantuvieron al 1-2% o 0-0,5%, respectivamente. Las células rutinariamente se sometieron a pases 2-3 veces por semana.

15PC3: La línea celular de cáncer de próstata humano 15PC3 se donó amablemente por Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, Países Bajos y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal (FBS) al 10% + Glutamax I + gentamicina.

PC3: La línea celular de cáncer de próstata humano PC3 se adquirió en la ATCC y se cultivó en Coon’s F12 con glutamina (Gibco) + FBS al 10% + gentamicina.

518A2: La línea celular cancerosa de melanoma humano 518A2 se donó amablemente por Dr. B. Jansen, Section of experimental Oncology, Molecular Pharmacology, Department of Clinical Pharmacology, University of Vienna y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal (FBS) al 10% + Glutamax I + gentamicina.

U373: Las células de glioblastoma U373 se cultivaron en EMEM (Sigma) que contenía suero bovino fetal al 10% más Glutamax I, NEAA, Piruvato Sódico y gentamicina a 37ºC, con una humedad del 95% y un 5% de CO2.

HeLa: La línea celular de carcinoma cervical HeLa se cultivo en MEM (Sigma) que contenía suero bovino fetal al 10%, gentamicina a 37ºC, una humedad del 95% y un 5% de CO2.

MPC-11: La línea celular de mieloma múltiple murino MPC-11 se adquirió en la ATCC y se mantuvo en DMEM con Glutamax 4 mM + Suero de Caballo al 10%.

DU-145: La línea celular de cáncer de próstata humano DU-145 se adquirió en la ATCC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + FBS al 10%.

RCC-4 +/-VHL: La línea celular de cáncer renal humano RCC4 transfectada de forma estable con plásmido que expresaba VHL o plásmido vacío se adquirió en la ECACC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

786-0: La línea celular de carcinoma de células renales humano 786-0 se adquirió en la ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

HUVEC: La línea de células endoteliales de vena umbilical humana HUVEC se adquirió en Camcrex y se mantuvo en medio EGM-2.

K562: La línea celular de leucemia mielógena crónica humana K562 se adquirió en la ECACC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + FBS al 18%.

U87MG: La línea celular de glioblastoma humano U87MG se adquirió en la ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

B16: La línea celular de melanoma murino B16 se adquirió en la ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

LNCap: La línea de células cancerosas de próstata humana LNCap se adquirió en la ATCC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + FBS al 10%. Ejemplo 6: Modelo in vitro: Tratamiento con oligonucleótido antisentido

Cultivo celular y transfecciones: se sembraron células U373 o HeLa en placas de 12 pocillos a 37ºC (con un 5% de CO2) en medio de crecimiento D suplementado con FBS AL 10%, Glutamax I y Gentamicina. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 60-70%, se transfectaron por duplicado con diferentes concentraciones de oligonucleótidos (0,2 -100 nM) usando Lipofectamine 2000 (2,5 -5 µg/ml). Las transfecciones se realizaron esencialmente como se describe por Dean y col. (1994, JBC 269: 16416-16424). En resumen, las células se incubaron durante 10 min con Lipofectamine en OptiMEM seguido de la adición de oligonucleótido a un volumen total de 0,5 ml de mezcla de transfección por pocillo. Después de 4 horas, la mezcla de transfección se retiró, y las células se lavaron y se desarrollaron a 37ºC durante aproximadamente 20 horas (análisis de ARNm y análisis de proteínas) durante condiciones de normoxia o hipoxia en el medio de crecimiento apropiado. Después, las células se recogieron para el análisis de proteínas y de ARN.

Ejemplo 7: Modelo in vitro: Extracción de ARN y síntesis de ADNc

Aislamiento de ARN Total

Se aisló ARN total usando el mini kit RNeasy (Qiagen nº cat. 74104) o usando el reactivo Trizol (Life technologies nº cat. 15596).

Para el aislamiento del ARN total usando el mini kit RNeasy (Qiagen), las células se lavaron con PBS y se añadió directamente a los pocillos Tampón de Lisis Celular (RTL, Qiagen) suplementado con mercaptoetanol al 1%. Después de unos pocos minutos, las muestras se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las muestras de tejido se homogeneizaron usando un homogeneizador Retsch 300 MM y el ARN total se aisló usando el reactivo Trizol o el mini kit RNeasy como se describe por el fabricante. Síntesis de primera cadena

La síntesis de la primera cadena se realizó usando el kit de Transcriptasa Inversa OmniScript o la transcriptasa Inversa M-MLV (esencialmente descrita por el fabricante (Ambion)) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Cuando se usó Transcriptasa Inversa OmniScript, 0,5 µg de ARN total de cada muestra se ajustaron a 12 µl y se mezclaron con 0,2 µl de poli(dT)12-18 (0,5 µg/µl) (Ufe Technologies), 2 µl de mezcla de dNTP (5 mM de cada uno), 2 µl de tampón RT 10x, 0,5 µl de Inhibidor de RNasa RNAguard™ (33 unidades/ml, Amersham) y 1 µl de Transcriptasa Inversa OmniScript seguido de incubación a 37ºC durante 60 min e inactivación térmica a 93ºC durante 5 min.

Cuando la síntesis de la primera cadena se realizó usando decámeros aleatorios y Transcriptasa Inversa M-MLV (esencialmente descrita por el fabricante (Ambion)), 0,25 µg de ARN total se cada muestra se ajustaron a 10,8 µl en H2O. Se añadieron 2 µl de decámeros y 2 µl de mezcla de dNTP (2,5 mM de cada uno). Las muestras se calentaron a 70ºC durante 3 min y se enfriaron inmediatamente en agua enfriada con hielo y se añadieron 3,25 µl de una mezcla que contenía (2 µl de tampón RT 10x; 1 µl de Transcriptasa Inversa M-MLV y 0,25 µl de inhibidor de RNAasa). El ADNc se sintetiza a 42ºC durante 60 min seguido de una etapa de inactivación por calentamiento a 95ºC durante 10 min y finalmente se enfría a 4ºC. Ejemplo 8: Modelo in vitro e in vivo: Análisis de Inhibición por Oligonucleótido de la Expresión de HIF-1a por PCR en tiempo real

La modulación antisentido de la expresión de HIF-1a puede ensayarse de una diversidad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de HIF-1a pueden cuantificarse, por ejemplo, por análisis de transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva, ensayo de protección de Ribonucleasa (RPA) o PCR en tiempo real. Actualmente se prefiere la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en el ARN celular total o en el ARNm.

Los procedimientos de aislamiento de ARN y análisis de ARN tales como análisis de transferencia de Northern son rutinarios en la técnica y se enseñan, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

La (PCR) cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el Sistema de Detección de PCR en Tiempo Real iQ Multi-Color disponible en BioRAD. Análisis de PCR Cuantitativa en tiempo real de los Niveles de ARNm de HIF-1a

La cuantificación de los niveles de ARNm se determinó por PCR cuantitativa en tiempo real usando el Sistema de Detección de PCR en Tiempo Real iQ Multi-Color (BioRAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La PCR Cuantitativa en Tiempo Real es una técnica bien conocida en este campo y se enseña, por ejemplo, en Held y col. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.

Se obtuvo una mezcla maestra de PCR 2x Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG de Invitrogen, nº cat. 11730. Se obtuvieron cebadores y sondas TaqMan® en MWG-Biotech AG, Ebersberg, Alemania.

Como control endógeno para normalizar cualquier variación en la preparación de la muestra se usó una cantidad de ARNm de β-actina, ARN 18S o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH).

El contenido en la muestra de ARNm de GAPDH humana se cuantificó usando el Reactivo de Ensayo TaqMan Pre-Revelado GAPDH ABI Prism humano (Applied Biosystems, nº cat. 4310884E) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para HIF-1a humano, los cebadores de PCR fueron: cebador directo: 5’CTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTT -3’ (SEC ID Nº: 21) (concentración final en el ensayo: 0,9 µM), cebador inverso: 5’ -GCTTTCTCTGAGCATTCTGCAAAGC-3’ (SEC ID Nº: 22) (concentración final en el ensayo: 0,9 µM) y la sonda de PCR fue: 5’ FAM CCTCAGGAACTGTAGTTCTTTGACTCAAAGCGACA-TAMRA 3’ (SEC ID Nº: 23) (concentración final en el ensayo: 0,1 µM).

Para HIF-1a cynomolgus, los cebadores de PCR fueron: cebador directo: 5’GCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTG -3’ (concentración final en el ensayo: 0,9 µM) (SEC ID Nº: 24), cebador inverso: 5’ -GAACCATAACAAAACCATCCAAGGC-3’ (SEC ID Nº: 25) (concentración final en el ensayo: 0,9 µM) y la sonda de PCR fue: 5’ FAM TCATCTTCAATATCCAAATCACCAGCATCCAGAAG-TAMRA 3’ (SEC ID Nº: 26) (concentración

final en el ensayo: 0,1 µM).

Para la cuantificación del ARN ribosómico 18S, se usó en reactivo de Control Endógeno de ARNr 18S Eucariótico TaqMan, (PARTE Nº 4310875, Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para la cuantificación del ARNm de GADPH de ratón se diseñaron los siguientes

cebadores y sondas:

cebador

con sentido 5’-AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3’ (SEC ID Nº: 27)

(concentración final 0,3 µM),

cebador

antisentido 5’-GTCAGATCCACGACGGACACATT-3’ (SEC ID Nº: 28)

(concentración final 0,6 µM),

Sonda TaqMan 5’-FAM-GAAGCTCACTGGCATGGCATGGCGTTCCGTGTTC-TAMRA-3 (SEC ID Nº: 29) (concentración final 0,2 µM). PCR en tiempo real usando sondas Taqman

El ADNc de la síntesis de la primera cadena realizada como se describe en el ejemplo 6 se diluyó 2-20 veces, y se analizó por PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores y la sonda se mezclaron con Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG 2x (nº de cat. 11730, Invitrogen) y se añadieron a 3,3 µl de ADNc hasta un volumen final de 25 µl. Cada muestra se analizó por triplicado. El ensayo de diluciones de 2 veces de un ADNc que se había preparado sobre material purificado a partir de una línea celular que expresaba el ARN de interés generó curvas patrón para los ensayos. Se usó H2O estéril en lugar de ADNc para el control sin molde. Programa de PCR: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95ºC, 15 segundos, 60ºC, 1 minuto.

Las cantidades relativas de la secuencia de ARNm diana se determinaron a partir del ciclo Threshold calculado usando el software del Sistema de Detección en Tiempo Real iCycler iQ. (Véase la Figura 2). PCR en Tiempo Real SyBR Green

Para determinar el nivel relativo de ARNm de HIF1α de ratón, se usó ADNc en el análisis de PCR cuantitativo usando un iCycler de BioRad.

A8 µl de ADNc diluido 5 veces, se añadieron 52 µl de una mezcla que contenía 29,5 µl de Platinum qPCR.

Supermix-UDG (Invitrogen), 1030 nM de cada cebador, SYBR Green 0,57 X (Molecular probes) y Fluoresceína 11,4 nM (Molecular probes).

Se usaron duplicados de 25 µl para Q-PCR: 50ºC durante 120 s, 95ºC durante 120 s y 40 ciclos [95ºC durante 30 s y 60ºC durante 60 s].

La expresión de ARNm de HIF1α se normalizó para el ARNm de β-actina de ratón que se

cuantificó de forma similar usando Q-PCR:

Cebadores:

mHIF1a:

5’-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3’ (SEC ID Nº: 30) y 5’

GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3’ (SEC ID Nº: 31)

mβ-actina:

5’ CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3’ (SEC ID Nº: 32) y 5’

GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3’ (SEC ID Nº: 33)

mVEGF:

5’-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3’ (SEC ID Nº: 34) y 5’

GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3’ (SEC ID Nº: 35)

BCL-2:

directo: 5’-gccctgtggatgactgagta-3’ (SEC ID Nº: 36) e inverso: 5’

cagccaggagaaatcaaacag-3’ (SEC ID Nº: 37)

Se usaron diluciones de 2 veces del ADNc sintetizado a partir de fibroblastos de ratón no tratados (células Ltk) (diluido 5 veces y que expresaba tanto HIF1α como β-actina) para preparar curvas patrón para los ensayos. Las cantidades relativas del ARNm de HIF1α se determinaron a partir del ciclo Threshold calculado usando el software del Sistema de Detección en Tiempo Real iCycler iQ. Ejemplo 9: análisis in vitro: análisis de transferencia de Western de niveles de proteína HIF-1a

El efecto in vitro de oligonucleótidos de LNA de HIF-1a sobre niveles de proteína HIF-1a en células sometidas a transfección se determinó por Transferencia de Western.

Se recogieron células y se lisaron en Tris HCl 50 mM, pH 6,8, glicerol al 10%, SDS al 2,5%, DTT 5 mM y urea 6 M suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche). Las concentraciones totales de proteína se midieron usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). 20-100 µg de proteína total se procesaron en geles Bis-Tris al 10-12% en tampón MOPS o en geles de Tris-Acetato al 3-8% y se transfirieron a membranas de PVDF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Después de una incubación durante una noche en tampón de bloqueo (PBS-T suplementado con un 5% de leche en polvo de bajo contenido de grasa), las membranas se incubaron durante una noche con un anticuerpo anti-HIF-1a, anticuerpo Bd-2 y anticuerpo de VEGF o anticuerpos que detectaban otros metabolitos aguas abajo de HIF-1a. Como control de carga, se detectaron tubulina o actina usando anticuerpos monoclonales de Neomarker. Después, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios y se visualizó el HIF-1a usando un kit de inmunodetección cromogénico (Invitrogen)

o un kit de detección de quimioluminiscencia ECL+ (Amersham). (Véase la Figura 2A y la Figura 2B).

Ejemplo 10: Análisis in vitro: Inhibición Antisentido de Expresión de HIF-1a Humano usando oligonucleótidos antisentido y su efecto sobre dianas aguas abajo VEGFA y MMP-2

Los oligonucleótidos de LNA también tienen un efecto sobre las dianas aguas abajo

VEGFA y MMP-2 en medios de células U373. Se siembras células U373 a 0,3 x 106 células en matraces T25 (estudio en el momento) o 0,6 x 106 células en matraces T80 (estudio de conc. en 48 horas). Las células U373 se ponen a 37ºC (5% de CO2) en medio de crecimiento suplementado con FBS al 10%, Glutamax I y Gentamicina. El día después de sembrar las células, se transfectaron con oligonucleótidos de LNA por duplicado o triplicado usando diferentes concentraciones de oligonucleótidos (0,2 -10 nM) usando Lipofectamine 2000 (2,5 µg/ml). Las transfecciones se realizaron esencialmente como se describe por Dean y col. (1994, JBC 269:16416-16424). En resumen, las células se incubaron durante 10 min con Lipofectamine en OptiMEM seguido de la adición de oligonucleótido. Después de 4 horas, la mezcla de transfección se retiró, las células se lavaron y se desarrollan a 37ºC durante aproximadamente 20 horas (análisis de ARNm y análisis de proteínas) durante las condiciones de normoxia o hipoxia en el medio de crecimiento apropiado. Se recogió el sobrenadante de las células en el momento indicado. La adición de inhibidores de proteasa se realizó antes del almacenamiento a -80ºC. Se usaron sistemas elisa de VEGFA humano (nº de cat. DVE-00) y elisa de MMP-2 (nº de cat. DMP200) de RD Systems de acuerdo con el fabricante. Dependiendo del momento de recolección, el sobrenadante se diluyó de 5 a 50 veces antes de la medición. Véanse las Figuras 12A-E.

Ejemplo 11: Inducción de apoptosis por oligonucleótidos de LNA

Cultivo de células

La línea celular de glioblastoma U373 (ATCC) se cultivó en MEM (Sigma) suplementado con suero bovino fetal al 10%, Glutamax I, NEAA, Piruvato Sódico y gentamicina a 37ºC, con un 95% de humedad y un 5% de CO2. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 60-70%, se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (2,5 µg/ml).

La línea celular de carcinoma cervical HeLa se cultivó en MEM (Sigma) que contenía suero bovino fetal al 10% con gentamicina a 37ºC, con un 95% de humedad y un 5% de CO2. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 60-70%, se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (5 µg/ml). Medición de la actividad de Caspasa 3/7 activa

Se sembraron células U373 a una densidad de 7000 células por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos (Nunc 136101) en MEM completo el día antes de la transfección. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en optiMEM precalentado seguido de la adición de 72 µl de OptiMEM que contenía 2,5 µg/ml de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de la adición de 18 µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La concentración final de oligonucleótido variaba de 0,2 nM a 100 nM. Después de 6 horas de tratamiento, las células se lavaron el OptiMEM y se añadieron 100 µl de DMEM que contenía suero. Se cultivaron placas similares de 96 pocillos con células U373 tratadas en condiciones de normoxia o Hipoxia/anoxia poniendo las placas de 96 pocillos en bolsas Anaerocult (Merck) hasta el momento de recolección. Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 min en el momento indicado. Se añadieron directamente 100 µl del Reactivo Caspase 4/7 GloTM (Promega) altamente sensible a las células en las placas de 96 pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora/min antes de registrar la luminiscencia (actividad luciferasa) en un instrumento Luminoskan Ascent de Thermo Labsystems después de 1 min como periodo de retraso. La actividad luciferasa se mide como Unidades Relativas de Luz por segundo (URL/s). Los datos se procesaron en el software Ascent 2.4.2. y los gráficos de la inducción en veces con respecto a la simulación se representaron en Excel.

Se usaron células transfectadas incubadas con el inhibidor de caspasa 3/7, que bloquea la actividad de la caspasa 3/7 activa, para demostrar la especificidad de la respuesta apoptótica. Además, células inducidas con Estaurosporina, camptotecina o taxol sirvieron como control positivo. (Véase la Figura 3A y la Figura 3B). Análisis de citometría de flujo de Anexina V-FITC

Se sembraron 1 x 106 células HeLa en matraces T75 un día antes de la transfección. El día de la transfección, las células se lavaron una vez en OptiMEM a 37ºC seguido de la adición de 7 ml de OptiMEM que contenía 2,5 µg/ml de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de la adición de 1700 µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM a una concentración final de 1-25 nM. Las células transfectadas de forma simulada sirvieron como control. Después de 4 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añadieron 10 ml de medio de cultivo. Después del tratamiento con oligonucleótidos, las células se dejaron recuperar durante 24-72 horas antes de recogerse por raspado y lavarse dos veces en PBS. 2 x 105 células se incubaron con 5 µl de Anexina V-FITC y 10 µl de yoduro de propidio (PI10 mg/ml) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La incubación de las células transfectadas con Anexina V recombinante purificada (10 µg) antes de la adición de Anexina V-FITC se usó para demostrar la especificidad y selectividad de la tinción. Además, se usaron células HeLa inducidas con TRAIL (Apo2L) (0,5 µg/ml) como control positivo.

Se sembraron 0,6 x 106 células U373 en matraces T75 un día antes de la transfección. El día de la transfección, las células se lavaron una vez en OptiMEM a 37ºC seguido de la adición de 7 ml de OptiMEM que contenía 2,5 µg/ml de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de añadir 1700 µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM a una concentración final de 1-25 nM. Como control sirvieron células transfectadas de forma simulada. Después de 6 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añadieron 10 ml de medio cultivo. Después del tratamiento con oligonucléotido, se dejó que las células se recuperaran durante 24-48 horas antes de recogerse por raspado y lavarse dos veces en PBS. 2 x 105 células se incubaron con 5 µl de Anexina V-FITC y 10 µl de yoduro de propidio (PI-10 mg/ml) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La incubación de células transfectadas con Anexina V recombinante purificada (10 µg) antes de la adición de Anexina V-FITC se usó para demostrar la especificidad y selectividad de la tinción. Además, como control positivo se usaron células U373 inducidas con Estaurosporina (0,2 µM). (Véase la Figura 4A y 4B).

Ejemplo 12: Inhibición de la proliferación por oligonucleótidos de LNA

Se trataron células de acuerdo con el ejemplo 11. Medición de la proliferación de células viables (ensayo MTS)

Se sembraron células U373 a una densidad de 7000 células por pocillo en una placa transparente de 96 pocillos (Scientific Orange nº 1472030100) en DMEM el día antes de la transfección. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en OptiMEM precalentado seguido de la adición de 72 µl de OptiMEM que contenía 2,5 µg/ml de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de la adición de 18 µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La una concentración final de oligonucleótido variaba de 5 nM a 100 nM. Después de 6 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añadieron 100 µl de DMEM que contenía suero. Placas de 96 pocillos similares con células U373 tratadas se cultivaron en condiciones de normoxia o hipoxia/anoxia poniendo las placas de 96 pocillos en bolsas Anaerocult (Merck) hasta el momento de la recolección. Las células viables se midieron a los tiempos indicados añadiendo 20 µl del compuesto de tetrazolio [3-(4,5-dimetil-2-il)-5-(3carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones (etosulfato de fenazina; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Las células viables se midieron a 490 nm y 650 nm en un Powerwave (Biotek Instruments).

La inhibición de la velocidad de crecimiento ΔDO (490-650 nm)/h se representó frente a la concentración de oligonucleótido de LNA con respecto a una simulación, que se fijó como el 100% (Véase la Figura 5A y la Figura 5B). Ejemplo 13: Captación in vivo y regulación negativa de la diana por oligonucleótidos de LNA

Se trataron ratones con pelo diariamente o dos veces por semana (5 veces) durante un periodo de 14 días por inyección i.p con solución salina o SEC ID Nº: 1 y diferentes versiones tioladas de la misma. La SEC ID Nº: 5 está parcialmente tiolada (en el hueco) mientras que la SEC ID Nº: 6 tiene un esqueleto de fosfodiéster. Los ratones se trataron con una dosis total de 10 mg/kg/14 días, 50 mg/kg/14 días o 250 mg/kg/14 días administrados una vez al día o dos veces por semana.

Purificación de ARN y síntesis de ADNc a partir del tejido

Se homogenizaron aproximadamente 10 mg de tejido en 400 µl de tampón RTL (Qiagen) suplementado con mercaptoetanol al 1%. El ARN total se aisló usando el mini kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La síntesis de la primera cadena se realizó usando decámeros aleatorios y Transcriptasa Inversa M-MLV (esencialmente como se describe por el fabricante (Ambion)). Para cada muestra, se ajustaron 0,25 µg de ARN total a 10,8 µl en H2O. Se añadieron 2 µl de decámeros y 2 µl de mezcla de dNTP (a 2,5 mM cada uno). Las muestras se calentaron a 70º durante 3 min y se enfriaron inmediatamente en agua enfriada con hielo y se añadieron 3,25 µl de una mezcla que contenía (2 µl de tampón RT 10x; 1 µl de Transcriptasa Inversa M-MLV; 0,25 µl de inhibidor de RNAasa). El ADNc se sintetiza a 42ºC durante 60 min seguido de una etapa de inactivación por calentamiento a 95ºC durante 10 min y finalmente se enfría a 4ºC. Análisis Cuantitativo de PCR en tiempo real

Para determinar el nivel relativo de ARNm de HIF1α de ratón en muestras tratadas y no tratadas, se usó el ADNc generado en un análisis de PCR cuantitativo usando un iCycler de BioRad.

A8 µl de ADNc diluido 5 veces se les añadieron 52 µl de una mezcla que contenía 29,5 µl de Platinum qPCR Supermix-UDF (Invitrogen), una concentración 1030 nM de cada cebador, SYBR Green 0,57 X (Molecular probes) y Fluoresceína 11,4 nM (Molecular probes).

Se usaron duplicados de 25 µl para Q-PCR: 50ºC durante 120 s, 95ºC durante 120 s y 40 ciclos [95ºC durante 30 s y 60ºC durante 60 s].

La expresión del ARNm de HIF1α se normalizó para el ARNm de Gapdh y/o de β-actina

de ratón que se cuantificó de forma similar usando Q-PCR:

Cebadores:

mHIF1α:

5’-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3’ (SEC ID Nº: 30) y 5’

GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3 ’ (SEC ID Nº: 31)

mβ-actina:

5’ CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3’ (SEC ID Nº: 32) y 5’

GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3’ (SEC ID Nº: 33)

mVEGF:

5’-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3’ (SEC ID Nº: 34) y 5’

GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3’ (SEC ID Nº: 35)

mGAPDH:

5’ AGCCTCGTCCCGTAGACAAAAT-3’ (SEC ID Nº: 38) y 5’

GTTGATGGCAACAATCTCCACTTT-3’ (SEC ID Nº: 39)

mBcl-2:

directo: 5’-gccctgtggatgactgagta-3’ (SEC ID Nº: 36) e inverso: 5’

cagccaggagaaatcaaacag-3’ (SEC ID Nº: 37)

Se usaron diluciones de 2 veces de ADNc sintetizado a partir de fibroblastos de ratón no

tratados (células Ltk) (diluido 5 veces y que expresaba tanto HIF1α como β-actina) para preparar curvas patrón para los ensayos. Las cantidades relativas del ARNm de HIF1α se determinaron a partir del ciclo Threshold calculado usando el software del Sistema de Detección en Tiempo Real iCycler iQ. Extracción de oligonucleótido de LNA a partir de tejido

Se homogeneizaron aproximadamente 100 mg de tejido mecánicamente en 500 µl de tampón de extracción (Igepal CA-630 al 0,5%, Tris 25 mM pH 8,0, EDTA 25 mM, NaCl 100 mM que contenía 1 mg/ml de ARNasa A) y se incubaron durante una noche a 37ºC. Se añadieron 500 ml con oligonucleótido de referencia y se realizó una extracción por la adición de 1 ml de fenol-isoamil-cloroformo (25:1:24 (v/v/v)). La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y se sometió a extracción de nuevo. Cuando fue necesario, el extracto se liofilizó. Análisis de HPLC de intercambio iónico (IEX-HPLC) de oligonucleótidos de LNA extraídos

Se separó un volumen de muestra de 50 µl sobre una columna DNAPac PA-100 (2x250 mm, Dionex) equipada con una columna auxiliar DNAPac PA-100 (2x250 mm, Dionex). Las columnas se calentaron a 40ºC. El caudal fue de 0,25 ml/min y la longitud de onda de detección de 260 nm. Gradiente de las fases móviles A: TRIS (20 mM), EDTA (1 mM) y perclorato sódico (10 mM) pH: 7,6, B: TRIS (20 mM), EDTA (1 mM) y perclorato sódico (1M) pH: 7,6, (0-13 min, A: 20%, B: 20%; 14-18 min, A: 40%, B: 60%; 22-28 min, A 0%, B: 100%; 33-38 min, A: 80%, B: 20%).

La Figura 6A y la Figura 6B muestran la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) más la regulación negativa de la diana (% de inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1a correlacionada con la expresión de β-actina con respecto a ratones tratados con solución salina después de la administración i.p. de la SEC ID Nº: 1 una vez al día o dos veces por semana durante 14 días (como se ha descrito anteriormente)).

La Figura 6C muestra la regulación negativa de la diana en riñón endógena in vivo mediante inyecciones ip. administradas diariamente en ratones con pelo durante regímenes de 14 días de SEC ID Nº: 1.

La Figura 7A muestra que la SEC ID Nº: 1 es un potente inhibidor en el hígado medido por Q-PCR sobre la expresión de HIF-1a cuando se administra diariamente.

La Figura 7B muestra que la SEC ID Nº: 1 también es un potente inhibidor en el hígado medido por Q-PCR sobre la expresión de HIF-1a cuando se administra dos veces por semana.

La Figura 7C muestra que la SEC ID Nº: 1 es un potente inhibidor en el riñón medido por Q-PCR sobre la expresión de HIF-1a cuando se administra diariamente. Ejemplo 14: Eficacia in vivo de la SEC ID Nº: 1 en ratones que llevan tumores de xenoinjerto de U373

El efecto del tratamiento con oligonucleótidos sobre el crecimiento de xenoinjertos tumorales en ratones desnudos puede medirse usando diferentes líneas de células tumorales. Son ejemplos de dichas líneas de células líneas celulares de tumor humano U87 (glioblastoma), U373 (glioblastoma), 15PC3 (cáncer de próstata), PC3 (cáncer de próstata), DU145 (cáncer de próstata), LNCap (cáncer de próstata) y línea celular de tumor murino B16 (melanoma).

Tratamiento de xenoinjertos de tumor subcutáneos en ratones desnudos usando oligonucleótidos de LNA. Se implantaron células tumorales por vía subcutánea y después se sometieron a pases seriados por tres trasplantes consecutivos. Se implantaron fragmentos tumorales de 1 mm por vía subcutánea con una aguja trocar en ratones desnudos NMRI. Como alternativa, se inyectaron por vía subcutánea células cancerosas, típicamente de 106 a 107 células suspendidas en 300 µl de matrigel (BD Bioscience), en los costados de ratones desnudos NMRI. Los ratones se trataron por inyecciones intraperitoneales de 5 mg/kg/día. El tratamiento individual de los ratones empezó cuando el volumen tumoral alcanzó 50 mm3. El tratamiento con PBS se inició cuando el volumen tumoral medio del grupo de control (tratado con solución salina) alcanzó 50 mm3. El experimento se terminó cuando los tumores de cualquier grupo alcanzaron los tamaños máximos permitidos. Los tamaños de los tumores de todos los ratones se midieron diariamente por medio de calibres. El efecto del tratamiento se midió como tamaño del tumor y velocidad de crecimiento del tumor.

En otro estudio usando la SEC ID Nº: 1, se trasplantan piezas vitales de tumor de ratones donantes U373 en el tejido adiposo de los ovarios (día 0) de ratones desnudos. El día cuatro y nueve después del trasplante, los ratones se tratan con oligonucleótido de LNA a 50 mg/kg (i.p.). Los ratones se sacrifican 2 días después de la última dosis (día 11), y se realiza el peso del tumor más la tinción de los tumores con ab CD-31 (véanse las Figuras 8A y 8C).

Las Figuras 8B y 8C muestran la densidad vascular en tumores U373 de xenoinjertos tratados con SEC ID Nº: 1. La Figura 10D muestra la expresión de ARNm de HIF-1α en tumores de U373 medida por QPCR.

La SEC ID Nº: 1 se dosificó a 50 mg/kg dos veces por semana durante una semana en ratones con xenoinjertos de U373 implantados en los ovarios. 2 días después de la última dosis, los animales se sacrificaron. La densidad de vasos se calculó después de la tinción con CD31 y se relacionó con el área total. Se encontró una diferencia estadística significativa (P=0,005) entre el grupo tratado con solución salina y los ratones tratados con un control mezclado (SEC ID Nº: 12). Ejemplo 15: Semivida en tejido y reducción de la expresión de la diana en hígado y riñón por la SEC ID Nº: 1

60 ratones NMRI hembra (de aproximadamente 25 g) se dividieron en grupos de 5 y se

dosificaron con 30 mg/kg de SEC ID Nº: i.p. (10 ml/kg 2,5 mg/ml) los días 0, 3, 7, 10 y 14. Los grupos se deshicieron el día 14. Los grupos de control se dosificaron con solución salina al 0,9%. Se tomaron muestran de tejido y se prepararon en RNA-later.

La Figura 11 muestra la captación in vivo (en µg por gramo de tejido) más la regulación negativa de la diana (% de inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1a y VEGF correlacionada con la expresión de β-actina) de los ratones después de 5 dosis i.p. de SEC ID Nº: 1 de 30 mg/kg. Ejemplo 16: Duración de la acción y captación de oligonucleótido de LNA in vivo

Duración de la Acción: 20 ratones Balb/cA-nu hembra (de aproximadamente 25 g), con la línea celular de cáncer de próstata PC3 (ECACC nº 90112714) se dividieron en grupos de 5 y se dosificaron con 25 mg/kg de SEC ID Nº 7, i.p. (10 ml/kg 2,5 mg/ml) todos los días desde el día 7 al día 13. Los grupos se deshicieron uno y 5 días después de la dosificación. Los grupos de control se dosificaron con solución salina al 0,9%. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en RNA-later. La Figura 10A muestra la duración de la acción de la expresión del ARNm 1 y 5 días después del tratamiento.

Captación de oligonucleótido de LNA: Después de la fijación con formalina, los tejidos se incluyeron en parafina. El tejido se puso en solución de Hoit (30 g de sacarosa, 1 g de goma arábiga, 15 mg de timol, agua destilada a 100 ml) durante una noche y se congeló. Se montaron criosecciones a 4 my's en vidrio revestido y se pusieron en solución de DAPI. El fluorocromo se visualizó con microscopía de fluorescencia. La Figura 10B muestra resultados histológicos del tejido del hígado, riñón y tumor, procedente de ratones tratados con una versión marcada con fam de la SEC ID Nº: 1 a 25 mg/kg/día durante siete días y sacrificados 5 días después del último tratamiento. Las imágenes de la piel proceden de ratones tratados de la misma forma pero sacrificados el día después del último tratamiento y sobreexpuestos para ver la tinción débil de las células basales de la piel (la línea azul inferior). Estos datos sugieren lo siguiente:

Hígado: La tinción en hepatocitos se localiza principalmente en el citoplasma.

Riñón: Tinción muy intensa de los túbulos proximales y menos tinción de los túbulos

distales.

Tumor: Células endoteliales, los macrófagos están teñidos (células de ratón).

Piel: Una tinción intensa de la dermis (células endoteliales y macrófagos) y en el

citoplasma de la capa basal de la epidermis. Ejemplo 17: Captación de oligonucleótido de LNA y eficacia in vivo

En el día 0, 3 x 106 células (PC3 y HT29) se mezclaron con 300 µl de matrixgel y se implantaron en ratones Balb/cA-nu hembra (de aproximadamente 25 g). El día 7, 10, 13 y 17, los ratones se trataron por inyecciones intraperitoneales con 5 mg/kg/día con solución salina, una versión marcada con fam de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 7) o una versión marcada con fam de la SEC ID Nº: 8 (SEC ID Nº: 20). Tres días (día 20) o 10 días (día 27) después de la última dosis, los animales se sacrificaron. El grupo de control con solución salina se dosificó con solución salina al 0,8%. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en RNA-later hasta la medición del contenido de oligonucleótido de LNA por análisis de HPLC o análisis de la regulación negativa del ARNm de HIF-1a (véanse las Figuras 10C-E).

Visualización de la captación de oligonucleótido de LNA: Después de la fijación con formalina, los tejidos se incluyeron en parafina. El tejido se puso en solución de Holt (30 g de sacarosa, 1 g de goma arábiga, 15 mg de timol, agua destinada como 100 ml) durante una noche y se congeló. Se montaron criosecciones a 4 my’s en vidrio revestido y se pusieron en solución de DAPI. El fluorocromo se visualizó con microscopía de fluorescencia (demostrando los datos la misma biodistribución que en la Figura 10B -datos no mostrados). Ejemplo 18: estudio de especificidad de oligonucleótido de LNA in vivo para HIF-1α y VEGF.

Estudio de desacoplamiento: se dividieron 15 ratones NMRI hembra (de aproximadamente 25 g) en grupos de 5 y se dosificaron con 30 mg/kg de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 9 i.p. (10 ml/kg, 3,0 mg/ml) durante 30 s los días 0, 3, 7, 10 y 14. Los grupos de control se dosificaron con solución salina al 0,9%. Los grupos se deshicieron 3-4 horas después de la última inyección. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en RNA-later.

La Figura 11 muestra la regulación negativa de la diana en hígado endógena in vivo del ARNm de HIF-1a y VEGF después de 5 dosis de 30 mg/kg un día sí y dos no de la SEC ID Nº: 1 en comparación con un control de desacoplamiento de la SEC ID Nº: 9. Ejemplo 19: Potencia in vivo de la versión de la SEC ID Nº: 1 con 14 unidades

Se trataron ratones NMRI hembra (0,025 kg) por inyecciones intraperitoneales con 5 mg/kg/día de la SEC ID Nº: 1. Los animales tratados con solución salina sirvieron como animales de control y se dosificaron con solución salina al 0,9%. Cinco animales se sacrificaron 1 día o 10 días después de la dosificación. Se tomaron muestras de tejido y se prepararon en RNA-later hasta la medición de la expresión del ARNm del HIF-1a por QPCR y se normalizaron para la beta-actina como se describe en M&M. Ejemplo 20: Preparación de cultivos tridimensionales de anillo aórtico

Se estudió la angiogénesis cultivando anillos de aorta de ratón en geles de colágeno tridimensionales con algunas modificaciones del procedimiento presentado originalmente para la aorta de rata (Masson y col., 2002 Biol Preoced Online 4(1) p. 24-31). Se trataron ratones con pelo una vez i.v. con oligonucleótidos de LNA a una dosis que variaba de (10 mg/kg a 50 mg/kg). Tres días después de la dosificación, se extrajeron las aortas torácicas de los ratones, sacrificados por dislocación cervical, y se transfirieron inmediatamente a una placa de cultivo que contenía Medio RMPI (Invitrogen) en hielo que contenía Suero Bovino Fetal al 10%. El tejido fibroadiposo periaórtico se retiró cuidadosamente con pinzas de microdisección finas y tijeras de iridectomía prestando una atención especial para no dañar la pared aórtica. Se seccionaron anillos aórticos de un milímetro de longitud (aproximadamente 15 por aorta -un máximo de 1,5 cm de la aorta) y se aclararon extensivamente en 3 lavados consecutivos de RPMI con FBS. Después se incluyeron explantes con forma de anillo de aorta de ratón en 60 µl de matrigel (BD biosciences -Matrixgel: 356234) en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de la inserción de la aorta, se añaden otros 40 µl de matrigel y se dejan a 37ºC durante 10 min para solidificar. A los pocillos se les añaden 100 µl de EGM2 (Cambrix) con y sin factores de crecimiento. Como control, adicionalmente se cubren anillos de aorta con medio de EGM2 que contiene Ciplatin 10 µM. El medio se cambió un día sí y otro no.

Ejemplo 21: Estudio cuantitativo de autorradiografía de cuerpo entero en ratones después de una sola administración Intravenosa de SEC ID Nº: 1 marcada con 3H

Nueve ratones C57B1/6J hembra (de 8 semanas, Taconic, DK) recibieron 50 mg/kg de cada artículo de ensayo por vía intravenosa en la vena de la cola, 1,5 mCi/kg de 3H-SEC ID Nº: 1. La 3H-SEC ID Nº: 1 tenía una actividad específica de 155 µCI/ml.

El volumen administrado a cada animal fue de 10 ml/kg de la formulación de ensayo. Se sacrificaron ratones individuales a 5 min, 15 min, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 2 días, 4 días, 7 días y 18 días de la administración de cada artículo de ensayo.

Para la autorradiografía de cuerpo entero, los ratones se anestesiaron por isoflurano y después se sumergieron inmediatamente en hexano enfriado con hielo seco a -80ºC, ABR-SOP0130/04. Los cuerpos congelados se incluyeron en un gel de carboximetilcelulosa (CMC) acuosa, se congelaron en etanol, se enfriaron con hielo seco (-80ºC) y se seccionaron sagitalmente para la autorradiografía de cuerpo entero, de acuerdo con el procedimiento convencional ABR-SOP0131/04. A partir de cada animal, se cortaron secciones de 20 µm a diferentes niveles con un criomicrotomo (Leica CM 3600) a una temperatura de aproximadamente -20ºC. Las secciones obtenidas se cogieron en una cinta (Minnesota Mining and Manufacturing Co., Nº 810) y se numeraron consecutivamente con tinta radiactiva. Después de liofilizarse a -20ºC durante aproximadamente 24ºC, las secciones seleccionadas se cubrieron con una capa fina de polvo de talco y se pusieron en placas de formación de imágenes (Fuji, Japón).

Se eligieron secciones para formar imágenes con el Phosphorimager para representar mejor los tejidos y órganos de interés. Junto con una serie de patrones de calibración de 3H, las secciones se cubrieron con una capa fina de polvo de talco y se pusieron en placas de formación de imágenes. Debido a la baja energía de 3H, se usó polvo de talco en lugar de una lámina de plástico para proteger a la placa de formación de imágenes. Las placas de formación de imágenes se expusieron durante 3-7 días a temperatura ambiente, encerradas en casetes herméticos a la luz en una caja de protección de plomo para proteger frente a la radiación ambiental.

Después de la exposición, las placas de formación de imágenes se exploraron a un tamaño de píxel de 50 µm usando BAS 2500 (Fuji Film Sverige AB, Suecia). Los tejidos y órganos de interés se cuantificaron usando AIDA, versión 2.43 (Raytest, Alemania).

Una solución de ensayo patrón soluble en agua de radiactividad de 3H se mezcló con sangre entera y se usó para la producción de la escala de calibración. La serie patrón consistía en 10 diluciones de 65,44 a 0,30 nCi/mg. Para la cuantificación, se supuso que todos los tejidos tenían una densidad y características de inactivación similares a los de la sangre entera. La densidad del tejido se fijó a 1 g/ml. El límite de cuantificación se definió como el valor de concentración medio de ocho mediciones para el nivel de fondo más tres veces el valor de desviación típica de estas mediciones.

Los diversos tejidos y órganos se identificaron en los autorradiogramas o en las secciones de tejido correspondientes. El término úvea usado en este estudio incluye el epitelio del pigmento de la retina que representa estructuras que contienen melanina, la coroides y la esclerótica del ojo (véanse las Figuras 14A y 14B). Ejemplo 22: Transferencia de Western de células HUVEC transfectadas con la SEC ID Nº: 1

Se cultivaron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) normales en medio Cambrix-EGM2 como se describe en el ejemplo usando SEC ID Nº: 1 2 y 5 nM o SEC ID Nº: 8 5 nM. Después de la transfección, las células se expusieron a hipoxia (1% de Oxígeno) durante 16 horas. En la recolección, las células se lavaron en PBS y se lisaron en tampón de lisis que contenía SDS (como se describe en el ejemplo). Se cargaron 50 µg en geles de Tris-Acetato y se procesaron a 150 V durante 1 hora. Se realizó una transferencia de Western como se describe en el ejemplo y la mancha de transferencia se incubó en anti-HIF-1a humano (1:500) antes de la visualización por aumento de quimioluminiscencia. Se observa una potente regulación negativa por la SEC ID Nº: 1, mientras que la SEC ID Nº: 8 de control mezclada no regula negativamente la expresión de HIF-1a en células HUVEC. Ejemplo 23: Ensayo de Formación de Estructuras de Tipo Capilar/Formación de Tubos in vitro

Se realizó una inducción de tubulogénesis usando Matrigel (Venetsanakos E, Mirza A, Fanton C. y col. Induction of tubulogenesis in telomerase-immortalized human microvascular endothelial cells by glioblastoma cells. Exp Cell Res 2002; 273: 21-33). Se descongeló Matrigel en hielo para impedir la polimerización prematura; se pusieron alícuotas de 50 µl en pocillos individuales de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Nunc) y se dejaron polimerizar a 37ºC durante al menos 30 minutos. Las células HUVEC transfectadas se retiraron por tratamiento con tripsina al 0,05%-EDTA. Las células se lavaron en medio que contenía suero y después se resuspendieron a 2-x105 células/ml. En cada pocillo de cultivo, se añadieron 100 µl de suspensión de células HUVEC transfectadas o no transfectadas en medio de cultivo con factores de crecimiento (VEGF, hFGF-B, R3-IGF-1, hEGF con FBS (2%)) y heparina (n=10). Como controles se usaron células no tratadas y transfectadas de forma simulada, así como células HUVEC transfectadas con oligo de control mezclado (SEC ID Nº: 8). La dosis de compuesto de control o de compuesto de ensayo se ensayó en 6-10 pocillos individuales y los experimentos se realizaron al menos tres veces. Para la cuantificación de la formación de los tubos, los pocillos se fotografiaron. (Véase la Figura 13).

Ejemplo 24: Análisis de FACS de la captación en células de bazo, médula ósea y sangre periférica

Se trataron ratones NMRI hembra (0,025 kg) con una versión marcada con fam de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 7 (50 mg/kg) o un número equivalente de moléculas de la Fam amidita (a 3 mg/kg) o solución salina al 0,9%. Las células se sacrificaron 1 hora después de la inyección y se recogieron células de bazo, sangre periférica (1 ml al que se añade 1 ml de PBS que contiene azida sódica al 0,1% + 50 ml de sulfato de heparina -puesto en hielo) o médula ósea. Bazo

Poner el bazo en una malla metálica y humedecer con 1 ml de R10 (medio de cultivo de tejidos R10 que contiene FCS al 10%) que contiene azida. Presionar el tejido a través de la malla y lavar con un total de 4 ml de R10 + Azida. Retirar 0,5 ml de suspensión de tejido y desechar el resto. Los glóbulos rojos se lisan en la suspensión añadiendo 50 ml de Tampón de Lisis de Glóbulos Rojos y dejando a TA durante 10 min. Centrifugar a 2000 rpm durante 10 min. Si es necesario retirar los glóbulos rojos residuales, repetir este proceso. Contar y bloquear las células.

Centrifugar las células y resuspender en 1,0 ml de tampón de FACS que contiene azida. Asumir números de células de 5 × 106 por bazo para el bloqueo y añadir 5 µl de CD16/CD32 murino por millón de células (se añaden 25 µl de Bloqueo). Sangre Periférica

Los glóbulos rojos se lisan añadiendo 50 ml de Solución de Lisis de Glóbulos Rojos. Las células se centrifugan y el proceso se repite si es necesario. Las células se lavan una vez con PBS, se resuspenden y se cuentan. La unión de anticuerpo no específica se bloquea añadiendo CD16/CD32 murino a una proporción de 5 µl por millón de células. Dejar a TA durante 10 min y después continuar las tinciones de linajes. Médula Ósea

Cortar el hueso tan cerca de cada extremo como sea posible usando tijeras estériles. Extraer 1 ml de PBS estéril en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja 25 G. Insertar la aguja en un extremo del hueso -normalmente lo más fácil es hacerlo en la rodilla -e introducir una cantidad abundante de PBS a través del hueso. Repetir hasta que el hueso esté limpio. Extraer la médula ósea en la aguja varias veces para romper la médula ósea. Si preocupa el número de glóbulos rojos, puede usarse una etapa de lisis como se ha indicado anteriormente.

Contar las células y bloquear como anteriormente. Poner 150.000 células en un tubo eppendorf estéril en hielo para los Cultivos de Médula Ósea. Tinciones FACS

Las tinciones de los linajes se realizan usando marcadores específicos. Como se describe: Tinciones

1.

CD4 APC, CD8 PE FITC, 7AAD linfocitos T

2.

Gr-1 PE, f4/80 APC neutrófilos, macrófagos

3.

Gr-1 PE, Mac-1APC mielo-monocítico

4.

CD34 PE linaje APC células madre

5.

B220 APC, CD19 PE B linfocitos B

6. CD11b PE, CD11c APC células dendríticas Isotipos

7.

IgG1 APC de hámster americano CD11c

8.

IgG2a APC Rata CD4, B220

9.

IgG2a PE de Rata cd8a, CD19, CD34

10.

IgG2b de Rata PE Gr-1 CD11b

Las tinciones se realizan en 96 pocillos y se tiñen un número de total de 100 µl de células bloqueadas con 100 µl de mezcla de tinción (controles de isotipo o marcadores de linaje específicos). Las tinciones se realizan en hielo y se dejan durante 30 min. Las células se centrifugan a 2000 rpm durante 2 min. El sobrenadante se aspira y las células se lavan con 200 µl de tampón de FACS y se repite la etapa de centrifugación. Lavar un total de tres veces. Al final, las células se resuspenden en 200 µl de tampón de FACS y se añaden a un tubo FACS que ya contiene 200 µl de FACS + 5 µl de 7AAD.

El análisis de FACS se realizó usando Becton Dickinson FACS Calibur (véase la Figura 15).

Se mostró que las células endoteliales, granulocitos y linfocitos CD4+ y macrófagos de sangre periférica y células dendríticas y granulocitos de la médula ósea y granulocitos del bazo se teñían de forma positiva para el marcaje con FAM cinco días después de la administración de la SEC ID Nº: 7.

Ejemplo 25. Contenido de oligonucleótido y Hif-1α de la SEC ID Nº: 1 en tejidos de mono

cynomolgus

En el estudio de toxicidad principal en tejidos de mono cynomolgus incluyendo hígado y riñón, se congelaron inmediatamente muestras y se almacenaron a -70ºC para un análisis posterior (véase la Figura 16A y 16B). Los monos se habían tratado con una inyección intravenosa de 0, 6, 10 y 40 mg/kg/ocasión dos veces por semana durante cuatro semanas. En el grupo de los animales que recibieron 0, 10 ó 40 mg/kg/ocasión, algunos animales se siguieron durante un periodo de recuperación de 4 semanas sin tratamiento.

Se extrajo ARN de las muestras como se describe en el Ejemplo 13 y se midió el contenido de ARNm de HIF-1a como se describe en el Ejemplo 8 (véase la Figura 16A). El contenido de oligonucleótidos se midió como se describe más adelante (véase la Figura 16B). Preparación de muestra: Extracción de tejidos de hígado y riñón

Productos químicos/reactivos:

Proteinasa K (25,1 mg/ml): Sigma P4850.

Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1 (v/v/v), saturado con Tris 10 mM, pH: 8,0,

EDTA 1 mM: Sigma P2069

Igepal CA-630: Sigma, 18896

Tampón de extracción: Igepal CA-630 al 0,5%, Tris 25 mM pH 8,0, EDTA 25 mM, NaCl

100 mM, pH 8,0 (ajustado con NaOH 1 N)

1 mg/ml de Proteinasa K en tampón de extracción: Preparado antes de cada extracción. Se retira un peso específico de tejido (-100 mg) (el tejido se mantiene en hielo seco antes y después de la pesada). Se añaden 500 µl de tampón de extracción que contiene proteinasa K (1 mg/ml). El tejido se homogeneiza mecánicamente y el homogeneizado se incuba durante una noche a 37ºC.

Se preparan muestras de referencia disolviendo la SEC ID Nº: 2 en tampón de extracción al intervalo de concentraciones relevante. Se retiran exactamente 100 mg pesados de tejido hepático de animales no tratados (se mantiene en hielo antes y después de la pesada). Se añade tampón de extracción (con proteinasa K, 1 mg/ml) que contiene el material de referencia a las muestras de tejido hasta un volumen total de 0,5 ml. El tejido se homogeneiza mecánicamente y se incuba durante una noche a 37ºC. La señal de detección de la SEC ID Nº: 2 de estas muestras se usa para preparar una curva patrón que incluye las concentraciones mínima y máxima encontradas en los animales tratados.

Se transfieren muestras de tejido a microtubos de 2 ml con tapas a rosca. Se añade 1 ml de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1 (v/v/v)) y después se agita vigorosamente durante 5 min. Se consigue la separación de fases por centrifugación a 4000 RPM durante 15 min. La fase acuosa (fase superior) se transfiere a un nuevo tubo (compatible con el evaporador) y se añaden 500 µl de Milli-Q-H2O a la fase orgánica (residual de la primera extracción). Los tubos se agitan vigorosamente de nuevo durante 5 min, después de la centrifugación a 4000 RPM durante 15 min (SAN039 en la sala 115). Las fases acuosas (fases de agua de extracción 1 y lavado) se reúnen y evaporan a sequedad (80ºC en una atmósfera de nitrógeno). El residuo se reconstituye en 200 µl de agua Milli-Q después de la centrifugación a 4000 RPM durante 15 min. Las muestras se transfieren a viales de HPLC para el análisis.

Análisis de HPLC de oligonucléotido en tejidos de hígado y riñón. Después de la extracción, la SEC ID Nº: 2 se analiza por HPLC de intercambio iónico:

Columna: DNA pac PA 100: 2 x 50 mm (auxiliar), 2 x 250 mm (analítica)

Temp. de la columna: 42ºC

Vol. de inyección: 50 µl

Disolvente de lavado: H2O Milli-Q

Disolvente de purga: H2O Milli-Q

Detección: UV, 260 nm Disolventes:

Tampón A: EDTA 1 mM, TRIS-CI 20 mM, NaClO4 10 mM, pH: 7,6 (NaOH 1 N) Tampón B: EDTA 1 mM, TRIS-CI 20 mM, NaClO4 1 M, pH: 7,6 (NaOH 1 N)

Ejemplo 26: Duración de la acción del tratamiento in vivo usando la SEC ID Nº:1

Se trataron ratones con pelo con una inyección i.p. de 50 mg/kg de SEC ID Nº: 1. 5 animales de cada grupo se sacrificaron los días 1 y 10 después de la dosificación (véase la Figura 9C) o los días 1, 2, 3, 4, 5 y 10 después de la dosificación (véase la Figura 9B). La expresión del ARNm de HIF-1α se analizó por QPCR en tiempo real y se normalizó para GAPDH. Ejemplo 27: Modelo de córnea de enfermedad oftálmica in vivo

Ratones y anestesia. Ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad. Los ratones se anestesiaron usando una mezcla de ketamina y xilazina (120 mg/kg de peso corporal y 20 mg/kg de peso corporal, respectivamente).

Modelo de ratón de neovascularización de la córnea inflamatoria inducida por sutura. El modelo de ratón de neovascularización de la córnea (NVC) inflamatoria inducida por sutura se usó como se ha descrito previamente por Streilein JW, Bradley D, Sano Y, Sonoda Y. Immunosuppressive properties of tissues obtained from eyes with experimentally manipulated corneas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996; 37: 413-424. En resumen, se puso un trépano corneal de 2 mm de diámetro suavemente en la córnea central de ratones anestesiados únicamente para marcar el área central de la córnea. Después se pusieron tres suturas 11-0 intraestromáticamente con dos incursiones estromáticas que se extendían, cada una, sobre 120º de la circunferencia de la córnea. El punto exterior de la colocación de la sutura elegido estaba a medio camino entre el limbo y la línea perfilada por el trépano de 2 mm; el punto de sutura interno estaba a la misma distancia de la línea del trépano de 2 mm para obtener respuestas angiogénicas estandarizadas. Las suturas se dejaron durante 7 días. Los ratones se sacrificaron y se escindieron la córnea y el limbo, y se realizó inmunohistoquímica doble de montura plana. La presencia de células inflamatorias en córneas normales y su reclutamiento en córneas 1 semana después de la colocación de la sutura se cuantificó en secciones seriadas teñidas con hematoxilina y eosina de córneas incluidas en plástico fijadas en paraformaldehído al 10% después de la enucleación. Además, para la caracterización adicional de las células inflamatorias reclutadas en la córnea, se realizó una inmunohistoquímica doble sobre monturas enteras de córnea y secciones congeladas con los marcadores de macrófagos CD11b. Además, en las secciones se tiñeron las células endoteliales (vasos por CD31), marcadores para VEGF y VEGFR.

Ejemplo 28: Ensayo de microcavidades de córnea

El ensayo de microcavidades de córnea se realizó como se ha descrito previamente (Cao Y, y col. Vascular endotelial growth factor C induces angiogenesis in vivo. Proc. Natl. Acad Sci. U.

S. A. 1998; 95: 14389-14394). En resumen, se crearon microcavidades de córnea usando una cuchillete de von Graefe modificado, y se implantó un microgránulo (0,4 x 0,4 mm) de sacarosa y sulfato de aluminio recubierto con polímero Hydron que contenía 200 ng de VEGF-A164 (R&D) o 200 ng de bfgf recombinante (RDI, Flanders, New Jersey, USA) en cada cavidad. El gránulo se puso a una distancia de 0,6-0,8 mm del limbo y el sitio se cubrió con pomada antibiótica (eritromicina) y se dejó durante 10 días (n>5-10 ratones cada uno). Las respuestas hemangiogénicas y linfangiogénicas se cuantificaron como se ha descrito anteriormente usando inmunotinción doble con CD31/LYVE-1. El grado máximo de crecimiento de vasos sanguíneos frente a vasos linfáticos entre el limbo subyacente y el gránulo se calificó semicuantitativamente en cuatro categorías para los dos tipos de vasos: 0, sin crecimiento; 1, crecimiento menor de 1/3 de la distancia del limbo-gránulo; 2, crecimiento entre 1/3 y 2/3 de la distancia del limbo-gránulo; 3, vaso que alcanza el gránulo.

Ejemplo 29: Modelo de psoriasis in vivo Quimera de Piel Humana/Ratón SCID in vivo

Se trasplantaron ortotópicamente xenoinjertos de piel humana en ratones SCID de 7 a 8 semanas de edad (Taconic, DK) siguiendo procedimientos descritos previamente por Wrone-Smith T, Nickoloff BJ: Dermal injection of immunocytes induces psoriasis. J Clin Invest 1996, 98: 1878-1887. En resumen, se suturaron xenoinjertos de piel humana que medían 1,5 x 1,5 x 0,5 cm en el costado de ratones SCID con sutura Vicryl Rapide 5-0 absorbible (Ethicon, Somerville, NJ) y se cubrieron con vendas Xeroform (Kendall, Co., Mansfield, MA). Las vendas se retiraron 1 semana después y los animales se mantuvieron sin patógenos a lo largo de todo el estudio. Los ratones se trataron con la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 7 dos veces por semana a 50 mg/kg de una a tres semanas después del trasplante. Las quimeras de piel humana/ratón SCID se sacrificaron después 2-3 semanas de tratamiento y se obtuvieron biopsias por punción de 4 mm (Baker’s Biopsy Punch, Cummins Derm, Miami, FL) a partir de cada xenoinjerto. Las biopsias se fijaron en formalina tamponada neutra para la inclusión en parafina y/o se montaron en goma de tragacanto (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), se congelaron inmediatamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Inmunotinción

Se tiñeron secciones de criostato de piel para el marcador relevante incluyendo células endoteliales (CD31/CD34), macrófagos (cd11b) VEGF, VEGFR o HIF-la. Las secciones se sometieron a tinción de contraste con hematoxilina y eosina (como se ha descrito previamente). Todos los portaobjetos se examinaron y fotografiaron. LISTA DE SECUENCIAS

<110> Santaris Pharma A/S

<120> POTENTES OLIGONUCLEÓTIDOS DE LNA PARA LA INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE HIF-1A

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<170> PatentIn versión 3.3

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Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un oligonucleótido de LNA que consiste en una secuencia que es: 5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’ (SEC ID Nº: 1). en la que las letras mayúsculas indican un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA, las

   letras minúsculas designan un 2-desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

2. 2.

   Un conjugado que comprende un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la reivindicación 1 y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente a dicho oligonucleótido de LNA.

3. 3.

   Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2, y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

4. 4.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende un vehículo acuoso, comprendiendo dicho vehículo un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5 y que tiene una intensidad iónica de 20-2000 mM.

5. 5.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, que está adaptada para administración intraocular.

6. 6.

   La composición farmacéutica de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende además al menos un agente quimioterapéutico.

7. 7.

   El oligonucleótido de LNA como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2 para uso como un medicamento.

8. 8.

   Uso del oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

9. 9.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho cáncer está en forma de un tumor sólido.

10. 10.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en hepatoma y cáncer de cabeza y cuello, mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer cerebral y cáncer de mama.

    5 11. Uso de un oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en arteriosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación e inflamación cutánea.

    10

11. 12.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la enfermedad se selecciona entre enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y artritis reumatoide.

12. 13.

    Un kit que comprende

    15 (a) un primer componente que contiene un oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación o un conjugado como se define en la reivindicación 2 en forma sólida, y

    (b) un segundo componente que contiene solución salina o tampón adaptada para la reconstitución de dichos oligonucleótidos de LNA.

    20