CN103874486A - 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病 - Google Patents

用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病 Download PDF

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Abstract

提出了调节电压门控钠通道α亚基(SCNxA)的表达和/或功能的小化合物。还提出了含有此类小分子的药物组合物和它们在治疗与SCNxA的表达相关的疾病和病症中的用途。

Description

用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
发明领域
本申请要求2011年9月6日提交的美国临时专利申请No.61/531,361的优先权，其通过引用整体并入本文。
本发明的实施方案包括调节电压门控钠通道的α亚基和相关分子的表达和/或功能的小分子。
背景
提供使用药剂在生物系统中低表达的蛋白质是一种有前景的治疗或潜在地治疗多种疾病状态的方法。医疗和制药界已通过多种机理和手段着手这种类型的疾病形态的治疗。在一种方法中，对应于特定靶蛋白的mRNA的天然反义转录物(NAT)已被选择作为靶。寡核苷酸和/或修饰的寡核苷酸已被设计用来靶向NAT并且“上调”靶mRNA和蛋白的表达。因为要求或需要新和/或一线药物治疗的许多疾病状态和疾患，所以对调节蛋白表达或低表达的新方法和药物有明显的需求。
现有技术一般包括基因疗法、反义技术、siRNA技术以及使用小分子以调控蛋白表达。大多数反义技术和siRNA技术及相关专利或专利申请涉及使用此类“药物”以缓和(下调)蛋白表达。治疗靶通常为编码特定蛋白或编码翻译成所关注蛋白的RNA的mRNA或DNA。下面提供来自专利文献的各种公开的实例。
美国专利No.5739119要求保护对蕈毒碱2型乙酰胆碱受体mRNA有特异性的反义寡核苷酸。施用导致记忆和学习的增加。
美国专利No.5985663要求保护白介素-15表达的反义抑制。
美国专利No.6165712要求保护以转录方式调节基因的表达和增加重组蛋白的产生的分子。该参考公开了蛋白的上调。调节分子可包括反义核酸。调节分子可结合到编码致癌基因或肿瘤抑制基因的编码序列的上游的启动子区。
美国专利No.6165990要求保护编码反义核苷酸的表达载体的用途，所述反义核苷酸靶向与结肠癌-胃泌素基因相关的mRNA。
美国专利No.6303374要求保护半胱天冬酶3表达的反义调节。反义核苷酸靶向编码半胱天冬酶3的核酸用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s)、帕金森病(Parkinson’s)、ALS等。
美国专利No.6376541要求保护通过“上调”前列腺素的产生而治疗青光眼的方法，即通过用导致前列腺素上调的试剂治疗患者-所述试剂包括白介素-1、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、血小板源性生长因子、左旋咪唑等。该专利公开了药物上调小分子而不是蛋白的表达的用途的实例。
美国专利No.6444464公开了靶向到编码转录因子E2F的核酸的反义核苷酸。
美国专利No.6617122要求保护多肽、表达此类多肽的核酸分子和治疗具有低HDL的人的方法，所述方法包括向这种人施用ABC1多肽或其胆固醇调节片段。ABC-1多肽是野生型ABC-1或具有增加其稳定性或其生物活性的突变。该专利也公开了调节(增加)所述蛋白的表达水平的候选化合物。公开了ABC-1蛋白的cDNA的反义核苷酸。该参考公开了使用化合物抑制遏抑ABC1的转录因子预期将导致ABC1的上调并且因此升高HDL水平。该转录因子为蛋白。
美国专利No.6710174公开了血管内皮生长因子的反义抑制。
美国专利No.7144999公开了靶向缺氧诱导因子1α(aHIF)表达的寡核苷酸以及用于治疗与此类蛋白的表达相关的疾病的方法。该专利公开了与HIF-1α的3’非翻译区互补且与人疾病(非乳头状透明细胞肾癌)相关的aHIF的天然反义转录物的过表达。
美国专利No.7148204公开了BCL-X表达的反义调节剂。调节诱导细胞凋亡。
美国专利No.7199107公开了驱动蛋白样1(Kinesin-like1)表达的反义调节剂。
美国专利No.7202357公开了用于调节酰基CoA胆固醇酰基转移酶-2的表达的反义化合物、组合物和方法。该化合物为靶向到编码酰基CoA胆固醇酰基转移酶-2的核酸的反义寡核苷酸。
美国专利No.7229976公开了靶向到编码叉头框O1A的核酸以调节其表达的反义寡聚物。
美国专利No.7235534公开了靶向编码哺乳动物雌激素受体(ER)α和/或β的基因和mRNA并且调节受体响应的反义寡核苷酸。该治疗提高斑块稳定性和血管愈合以及血管损伤后的内皮细胞恢复。
美国专利No.7285288公开了与Bcl-2核酸杂交的寡核苷酸，该基因产物已知与肿瘤发生蛋白Bcl-2相互作用。
美国专利No.7335764公开了酰基coA胆固醇酰基转移酶-2表达的反义调节剂。
美国专利No.7402574公开了用于治疗癌症的反义组合物和方法。反义组合物包含实质上未荷电的具有核酸酶抗性主链的反义化合物，所述反义化合物能够被受试者中的靶癌症细胞摄取，含有10-40个核苷酸碱基并且具有有效地与加工的或预加工的具有特异序列IDNO:21的人SNAIL RNA转录物的区域杂交的碱基序列。
美国专利No.7420050公开了抑制TGF-β的表达的反义分子。肾病。
美国专利No.7425545公开了C-反应蛋白表达的调节。
美国专利No.7456154公开了针对人乙酰胆碱酯酶的反义寡核苷酸及其用途。
美国专利No.7598227公开了载脂蛋白C-III表达的调节。
美国专利No.7662948公开了用于治疗疼痛的针对VR1(辣椒素受体)的反义寡核苷酸。
美国专利No.7674895公开了对VEGF和VEGF受体基因有特异性的siRNA。
美国专利No.7687617公开了具有锁定和非锁定核苷酸的交替区段的寡核苷酸。
美国专利No.7691995公开了小干扰RNA的体内产生。
美国专利No.7709546公开了靶向到染色体DNA的寡聚物对基因表达的调节。
美国专利No.7709630公开了结缔组织生长因子表达的反义调节。
美国专利No.7723508公开了载脂蛋白(A)表达的调节。
美国专利No.7732422公开了用于治疗癌症的TRPM-2反义疗法。
美国专利No.7732590公开了二酰基甘油酰基转移酶2表达的调节。
美国专利No.7737265公开了HIF-1的RNAi调节及其治疗用途。
美国专利No.7741305公开了apo A1表达的调节。
US2003/0191075公开了使用修饰的寡核苷酸-亲脂性寡核苷酸缀合物将基因疗法(反义核苷酸)靶向到特定器官的方法。
US2004/0033480公开了白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式-二苯乙烯)上调载脂蛋白A1的表达的用途。
US2004/0137423公开了用于鉴定通过增加ABCA1基因表达而调节动物的HDL水平的试剂的组合物和方法。
US2004/0175803公开了干扰素-α诱导的(上调的)基因。
本发明人已发现已知小分子引起对SCNA基因家族及其变体表达的调节的新用途。
概述
提供本概述以简要地指出本发明的性质和实质。提交本概述应理解的是，其不会用来解释或限制权利要求书的范围或含义。
在一个实施方案中，本发明包括调节编码电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)的基因的表达的方法，所述方法包括向需要其的患者施用选自利尿剂、非典型抗精神病药、钾通道开放剂、钙通道阻滞剂、抗真菌剂、抗氧化剂、PDE5抑制剂、雌激素激动剂(甾族或非甾族)、抗抑郁剂、质子泵抑制剂、5HT1D受体激动剂、催眠药、抗溃疡药物、5HT4激动剂、GABA激动剂、抗组胺剂或同化类固醇的至少一种活性成分以用于治疗SCNxA相关病症或疾病。
在另一个实施方案中，本发明包括调节SCNxA基因的表达的方法，其包括施用选自以下的至少一种小分子：米那普仑(milnacipran)、托拉塞米(torsemide)、利培酮(risperidone)、吡那地尔(pinacidil)、贝尼地平(benidipine)、酮康唑(ketoconazole)、依布硒(ebselen)、他达拉非(tadalafil)、折仑诺(zeranol)、萘发扎酮(nefazadone)、洛美利嗪(lomerizine)、淫羊藿苷(icariin)、奥美拉唑(omeprazole)、L-694,247、尼群地平(nitrendipine)、尼美西泮(nimetazepam)、氨来呫诺(amlexanox)、莫沙必利(mosapride)、舍曲林(sertraline)或司坦唑醇(stanozolol)或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药。
在一个实施方案中，该方法包括针对具有SCNxA基因表达系统的生物系统筛选小分子的化合物文库，其中所述筛选导致上调SCNxA表达产物和/或基因产物的表达的推定击中(putative hit)。优选的表达产物靶为SCN1A。
在另一个实施方案中，本发明包括干扰SCNxA RNA功能的方法，其中所述干扰导致SCNxA基因产物的上调，所述方法包括施用选自以下的小分子：米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药，其中待干扰的RNA功能包括至少一种重要功能，诸如，例如所述RNA的转录、RNA向蛋白翻译位点的移位、自RNA翻译蛋白、剪接RNA以产生一种或多种mRNA种类、以及可能由酶促RNA参与或促进的催化活性。
一个实施方案提供调节生物系统中SCNxA多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述系统与选自以下的小分子接触：米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药，从而调节生物系统中SCNxA多核苷酸的功能和/或表达。
一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中SCNxA多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述细胞或组织与选自以下的小分子接触：米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药，从而体内或体外调节患者细胞或组织中SCNxA多核苷酸的功能和/或表达。
在另一个实施方案中，选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药的小分子修饰SCNxA多核苷酸例如SEQ ID NO:1中列出的核苷酸，及其任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及互补序列的表达。
另一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中SCN1A多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述细胞或组织与选自以下的小分子接触：米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药，从而体内或体外调节患者细胞或组织中SCN1A多核苷酸的功能和/或表达。
在一个实施方案中，本发明包含药物组合物，其包含选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药的小分子和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物调节SCNxA多核苷酸的表达。
在另一个实施方案中，将小分子口服、皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用给患者。
治疗方案包括向患者施用小分子至少一次；然而，可修改该治疗以包括经一段时间的多个剂量。该治疗可与一种或多种其它类型的疗法联合。
在另一个实施方案中，将小分子封装在脂质体中或连接于载体分子(例如胆固醇、TAT肽)或靶向的纳米粒子和/或涂敷抗体的囊泡中，这取决于具体选择的小分子的物理和/或化学性质。
在一个实施方案中，本发明包括调节SCNxA家族成员及其变体的任何一个同种型的表达，其包括向需要其治疗的患者施用药学有效量的本文所述的至少一种化合物，其中所述调节导致与SCNxA基因或由其产生的表达产物中的至少一种相关的疾病的治疗。
其它方面在以下描述。
附图简述
序列表描述
图1显示在用1uM浓度的小化合物治疗后携带有Dravet相关突变的原代皮肤成纤维细胞(阴影条柱)和成年原代角化细胞(中空条柱)中的SCN1A mRNA水平的增加。
SEQ ID NO:1：智人电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)，转录物变体1，mRNA(NCBI登记号：NM_001165963)。
SEQ ID NO:2：智人电压门控钠通道II型α亚基(SCN2A)，转录物变体1，mRNA(NCBI登记号：NM_021007.2)。
SEQ ID NO:3：智人电压门控钠通道III型α亚基(SCN3A)，转录物变体1，mRNA(NCBI登记号：NM_006922.3)。
SEQ ID NO:4：智人电压门控钠通道IV型α亚基(SCN4A)，mRNA(NCBI登记号：NM_000334.4)。
SEQ ID NO:5：智人电压门控钠通道V型α亚基(SCN5A)，转录物变体1，mRNA(NCBI登记号：NM_198056.2)。
SEQ ID NO:6：智人电压门控钠通道VII型α(SCN7A)，mRNA(NCBI登记号：NM_002976.3)
SEQ ID NO:7：智人电压门控钠通道VIII型α亚基(SCN8A)，转录物变体1，mRNA(NCBI登记号：NM_014191.2)
SEQ ID NO:8：智人电压门控钠通道IX型α亚基(SCN9A)，mRNA(NCBI登记号：NM_002977.3)
SEQ ID NO:9：智人电压门控钠通道X型α亚基(SCN10A)，mRNA(NCBI登记号：NM_006514.2)
SEQ ID NO:10：智人电压门控钠通道XI型α亚基(SCN11A)，mRNA(NCBI登记号：NM_014139.2)
SEQ ID NO:11：智人电压门控钠通道α亚基SCN12A(SCN12A)mRNA(NCBI登记号：AF109737.1)。所有情况中提供的序列表实际上是RNS转录物的cDNA形式。
详述
下面参考用于示例的实例应用来描述本发明的多个方面。应理解的是，列出许多具体细节、关联和方法以提供对本发明的完全理解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到，可没有一种或多种具体细节地实践本发明或以其它方法实践本发明。本发明不限于行为或事件的顺序，因为一些行为可以不同顺序进行和/或与其它行为或事件同时进行。而且，并非所有列举的行为或事件都是实施根据本发明的方法所需的。
本文公开的所有基因、基因名称和基因产物预期对应来自本文公开的组合物和方法可适用的任何物种的同系物。因此，这些术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，这一公开仅旨在示例，不应解释为限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，对于本文公开的基因，其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列，预期涵盖来自其它动物的同源和/或直系同源基因和基因产物，所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼、两栖类、爬行动物和鸟类。在实施方案中，基因或核酸序列是人的。
定义
本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明。除非上下文另外清楚地指明，否则本文所用的单数形式"一个/一种(a)"、"一个/一种(an)"和"该(the)"预期包括复数形式。而且，就详述和/或权利要求书中使用术语"包括(including)"、"包括(includes)"、"具有(having)"、"具有(has)"、"带有(with)"或其变化形式来说，这些术语预期以类似于术语"包含(comprising)"的方式被包括。
术语"约"或"大约"是指在由本领域普通技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该数值，即，测量系统的限度。例如，按照本领域中的实践，"约"可表示在1个或多于1个标准差内。可选地，"约"可表示给定数值的达20%、优选地达10%、更优选地达5%、仍更优选地达1%的范围。可选地，尤其是有关生物系统或方法，术语可表示在数值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定数值时，除非另外指明，否则应假设术语"约"表示在特定数值可接受的误差范围内。
本文所用的术语"mRNA"是指靶基因的目前已知的mRNA转录物和可能说明的任何进一步的转录物。
本文所用的"SCNxA"和"电压门控钠通道α亚基"包括所有家族成员、突变体、等位基因、同种型、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。SCNxA基因家族由11个已知成员(SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN7A(也称为SCN6A)、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A和SCN12A)组成。
本文所用的词语‘电压门控钠通道I型α亚基’、SCN1A、FEB3、FEB3A、GEFSP2、HBSCI、NAC1、Nav1.1、SCN1、SMEI、钠通道蛋白脑I亚基α、钠通道蛋白型1亚基α和电压门控钠通道亚基αNav1.1被认为在文献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。
术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本领域技术人员应清楚的是，此前被认为是"非天然存在的"各种核苷酸后来已在自然界中发现。因此，"核苷酸"不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，还包括其杂环类似物和互变异构体。其它类型的核苷酸的示例性实例是含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6,N6-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷的分子以及Benner等，美国专利No.5,432,272中描述的"非天然存在的"核苷酸。术语"核苷酸"预期涵盖这些实例的每一种和所有以及其类似物和互变异构体。尤其关注的核苷酸是包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它们被认为是与在人的治疗和诊断应用有关的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2'-脱氧糖和2'-羟基糖，例如在Kornberg和Baker,DNA Replication,第2版.(Freeman,San Francisco,1992)中描述的，以及它们的类似物。
本文所用的"调节"是指基因表达的增加(刺激)或减少(抑制)。术语“调节表达”进一步意指通过干扰RNA的表达或翻译来增强或降低给定蛋白的表达。在增强的蛋白表达的情况下，药物可阻滞导致蛋白产物的下调或低表达的抑制基因例如，抑癌基因或任何其它基因产物或突变基因的表达。在降低的蛋白表达的情况下，药物可直接阻滞给定基因的表达或促成由该基因转录的RNA的加速分解。
术语"变体"当在多核苷酸序列的上下文中使用时，可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。这一定义还可包括，例如，"等位"、"剪接"、"物种"或"多态"变体。剪接变体可与参考分子具有显著的同一性，但由于在mRNA加工期间外显子的可选剪接通常将具有更大数目或更小数目的多核苷酸。相应的多肽可具有另外的功能结构域或缺少结构域。物种变体是在物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可来源于核酸序列中至少一种突变，并可产生改变的mRNA或产生结构或功能可能改变或可能不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可具有0种、一种或多种等位基因形式。产生变体的常见突变改变通常归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。在给定序列中，这些类型改变的每一种可单独发生，或组合其它类型改变发生一次或多次。
所得的多肽通常将具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体还可涵盖"单核苷酸多态性"(SNP)或其中多核苷酸序列差异为一个碱基的单碱基突变。SNP的存在可指示，例如，具有疾病状态的倾向的某一群体，所述倾向相比于耐受性为易感性。
"衍生物"多肽或肽是例如通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶合或适度福尔马林处理修饰的多肽或肽。还可修饰衍生物以直接或间接包含可检测的标记，包括但不限于，放射性同位素、荧光和酶标记。
本文所用的术语"动物"或"患者"意为包括，例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。
"哺乳动物"涵盖通常处于医疗护理下的温血哺乳动物(例如，人和驯养的动物)。实例包括猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物和人，以及仅仅人。
"治疗"或"处理"涵盖治疗哺乳动物的疾病状态，并包括：(a)防止疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当所述哺乳动物倾向于疾病状态但还未被诊断为患有其的时候；(b)抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或(c)缓解疾病状态，例如导致疾病状态消退，直到达到期望端点。治疗还包括疾病症状的改善(例如，减轻疼痛或不适)，其中所述改善可或不可直接影响疾病(例如起因、传染、表达等)。
"神经系统疾病或病症"是指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或病症。"神经系统疾病或病症"包括牵涉中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、外周神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢神经系统和外周神经系统两者中)的疾病或病症。神经系统病症的实例包括但不限于头痛、木僵和昏迷、痴呆、癫痫发作、睡眠障碍、创伤、感染、肿瘤、神经眼科学疾病、运动障碍、脱髓鞘病、脊髓病症及外周神经、肌肉和神经肌肉接点的病症。成瘾和精神病包括但不限于双相性精神障碍和精神分裂症，而且还包括在神经系统病症的定义中。下面是可使用根据本发明的小分子、药学组合物和方法治疗的若干神经系统病症、症状、体征和综合征的列表：获得性癫痫样失语症；急性播散性脑脊髓炎；脑白质肾上腺萎缩症；年龄相关的黄斑变性；胼胝体发育不全；失认症；艾卡迪综合征；亚力山大病；阿尔佩斯病；交替性偏瘫；血管性痴呆；肌萎缩性侧索硬化；无脑；Angelman综合征；血管瘤病；缺氧症；失语症；失用症；蛛网膜囊肿；蛛网膜炎；阿-基氏脑畸形；动静脉畸形；阿斯佩各综合征；共济失调毛细血管扩张；注意力缺乏过动症；孤独症；自主神经失调；背痛；巴藤病；白塞病；贝耳麻痹；良性自发性睑痉挛；良性局灶性肌萎缩；良性颅内高压；宾斯旺格氏病；睑痉挛；Bloch Sulzberger综合征；臂丛损伤；脑脓肿；脑损伤；脑肿瘤(包括多形性胶质母细胞瘤)；脊髓肿瘤；布朗-塞卡尔综合征；卡纳万病；腕管综合症；灼痛；中枢性疼痛综合症；脑桥中部髓鞘溶解；头部障碍；脑动脉瘤；脑动脉硬化；脑萎缩；大脑性巨人症；大脑性麻痹；夏-马-图三氏病；化疗引起的神经病和神经性疼痛；基氏脑畸形；舞蹈症；慢性炎症性脱髓鞘多神经病；慢性痛；慢性局部疼痛综合征；科-勒二氏综合征；昏迷，包括持续性植物人状态；先天性面瘫；皮质基底节变性；颅动脉炎；颅缝早闭；克雅氏病；积累性损伤错乱；柯兴综合征；巨细胞包涵体病；巨细胞病毒感染；眼舞蹈-足舞蹈综合征；丹-沃二氏综合征；Dawson病；德摩西埃氏综合征；下臂丛麻痹；痴呆；皮肌炎；糖尿病性神经病；弥漫性硬化症；Dravetts、家族性自主神经异常；书写困难；阅读困难；张力障碍；早期幼儿癫痫性脑病；空蝶鞍综合征；脑炎；脑膨出；脑三叉神经血管瘤病；癫痫；欧勃氏麻痹；特发性震颤；法布里氏病；法尔氏综合征；昏厥；家族性痉挛麻痹症；热性癫痫发作；菲希尔综合征；弗里德赖希氏共济失调；额颞痴呆和其它"tau病变"；高歇病；格斯特曼氏综合征；巨细胞性动脉炎；巨细胞性包涵体病；球样细胞脑白质营养不良；格-巴二氏综合征；HTLV-1相关的骨髓病；哈-斯二氏病；头部损伤；头痛；半面痉挛；遗传性痉挛性截瘫；多神经炎型遗传性共济失调；耳部带状疱疹；带状疱疹；Hirayama综合征；HIV相关的痴呆和神经病(也是AIDS的神经系统表现)；前脑无裂畸形；亨延顿氏舞蹈病和其它多谷氨酰胺重复序列病；积水性无脑畸形；脑积水；皮质醇过多症；低氧；免疫介导的脑脊髓炎；包涵体肌炎；色素失调症；婴儿植烷酸贮积病；婴儿雷夫叙姆病；婴儿痉挛；炎性肌病；颅内囊肿；颅内高压；Joubert综合征；卡恩斯-塞尔综合征；Kennedy病；金斯布林纳综合征；克-费二氏综合征；克拉贝病；库-韦二氏病；库鲁病；拉福拉病；Lambert-Eaton肌无力综合征；Landau-Kleffner综合征；侧髓(瓦伦伯格氏)综合征；学习障碍；利氏病；Lennox-Gustaut综合征；莱-萘二氏综合征；脑白质病变；路易体痴呆；无脑回症；闭锁综合征；Lou Gehrig病(即，运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)；椎间盘退变；莱姆病-神经系统后遗症；Machado-Joseph病；巨头；巨脑；梅-罗二氏综合征；美尼尔症；脑膜炎；门克斯病；异染性脑白质营养不良；头小畸形；偏头痛；MillerFisher综合征；小中风；线粒体肌病；默比厄斯氏综合征；单肢肌萎缩；运动神经元病；Moyamoya病；粘多糖贮积症；多发梗塞性痴呆；多灶性运动神经病；多发性硬化和其它脱髓鞘病症；伴有体位性低血压的多系统萎缩症；肌肉萎缩症；重症肌无力；脑脱髓鞘弥散性硬化；婴儿肌阵挛性脑病；肌阵挛；肌病；先天性肌强直；嗜睡病；神经纤维瘤病；抗精神病药的恶性综合征；AIDS的神经系统表现；狼疮的神经系统后遗症；神经性肌强直；神经元蜡样脂褐质沉积症；神经元移行异常；尼-皮二氏病；O'Sullivan-McLeod综合征；枕神经痛；隐性脊柱神经管闭合不全序列征；大田原综合征；橄榄体脑桥小脑萎缩；眼阵挛-肌阵挛；视神经炎；直立性低血压；过度使用综合征；感觉异常；神经变性疾病或病症(帕金森病、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆、多发性硬化和与神经元细胞死亡相关的其它疾病和病症)；先天性肌强直病；副肿瘤性疾病；突发性癫痫；帕-罗二氏综合征；佩-梅氏病；周期性麻痹；外周神经病；痛性神经病和神经性疼痛；持续性植物人状态；全身性发育迟缓；光喷嚏反射；植烷酸贮积病；皮克氏病；神经挟捏；垂体肿瘤；多肌炎；孔洞脑；小儿麻痹症后期综合症；带状疱疹后神经痛；感染后脑脊髓炎；体位性低血压；帕-魏二氏综合征；原发性脊髓侧索硬化；朊病毒病；进行性面偏侧萎缩症；进行性多灶性白质脑病；进行性硬化性灰质萎缩；进行性核上性麻痹；假性脑瘤；Ramsay-Hunt综合征(I型和II型)；Rasmussen脑炎；反射性交感神经营养不良综合征；雷夫叙姆病；重复性运动损伤；重复性压力损伤；多动腿综合征；逆转录病毒相关的脊髓病；Rett综合征；雷依氏综合征；圣维特斯舞蹈病；桑德霍夫病；谢耳德氏病；脑裂；视隔发育不全；婴儿严重肌阵挛性癫痫；摇晃婴儿综合症；带状疱疹；希-德二氏综合征；斯耶格伦氏综合征；睡眠窒息；Soto综合征；僵直；脊柱裂；脊髓损伤；脊髓肿瘤；脊髓性肌萎缩；僵人综合征；中风；斯特奇-韦伯综合征；亚急性硬化全脑炎；动脉硬化性皮层下脑病；西德纳姆舞蹈；晕厥；脊髓空洞症；迟发性运动障碍；泰-萨二氏病；颞动脉炎；脊髓拴系综合征；肌强直性白内障；胸部出口综合征；三叉神经痛；托德氏麻痹；图雷特综合症；暂时性缺血性发作；传染性海绵状脑病；横贯性脊髓炎；外伤性脑损伤；震颤；三叉神经痛；热带痉挛性轻截瘫；结节性脑硬化；血管性痴呆(多发梗塞性痴呆)；血管炎(包括颞动脉炎)；希-林二氏病；瓦伦伯格氏综合征；韦-霍二氏病；韦斯特综合征；鞭抽式损伤(whiplash)；威廉斯综合征；Wildon病和泽韦格综合征。
心血管疾病或病症包括可导致缺血或由心脏再灌注引起的那些病症。实例包括但不限于动脉硬化、冠状动脉病、肉芽肿性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽肿性)、原发性肥大型心肌病、外周动脉病(PAD)、周围血管疾病、静脉血栓栓塞、肺栓塞、中风、心绞痛、心肌梗塞、心搏停止造成的心血管组织损伤、心脏旁路造成的心血管组织损伤、心源性休克和本领域技术人员已知的相关疾患或包括心脏或脉管系统的功能障碍或组织损伤的相关疾患，尤其是但不限于，SCN1A活化相关的组织损伤。CVS疾病包括但不限于，动脉硬化、肉芽肿性心肌炎、心肌梗塞、瓣膜性心脏病继发性心肌纤维化、无梗塞的心肌纤维化、原发性肥大性心肌病和慢性心肌炎(非肉芽肿性)。
与钠通道功能障碍相关的疾病或病症的实例包括但不限于恶性高热、肌无力、周期性共济失调(episodic ataxia)、神经病性和炎症性疼痛、阿尔茨海默氏病、帕金森病、精神分裂症、过度惊骇、SMEI、FEB3、家族性偏瘫型偏头痛3型、肌强直例如低血糖和血糖过低的周期性瘫痪、先天性副肌强直和钾加重性肌强直以及心律失常例如长QT综合征。
靶：在一个实施方案中，用于调节的靶包括电压门控钠通道α亚基家族成员(SCNxA)的核酸序列，包括但不限于与SCNxA转录和/或翻译和/或调节相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列以及蛋白序列。优选的靶为SCN1A通道。
电压敏感性离子通道是为细胞兴奋性和通过离子生成性膜电位传输信息的能力提供基础的一类跨膜蛋白。电压门控钠通道在大多数电可兴奋性细胞(包括神经元、心细胞和肌肉)中负责动作电位的产生和传导。电活性通过膜的去极化触发，其打开对钠离子具有高选择性的跨膜通道。然后通过电化学梯度细胞内驱使离子穿过开放通道。尽管不同组织中基于钠的动作电位是类似的，但是电生理学研究已证明，存在多个结构上且功能上不同的钠通道，并且编码钠通道的很多基因已被克隆。SCN1A基因属于电压门控钠通道的基因家族(SCNxA家族)。
电压门控钠通道在神经细胞和肌肉中动作电位的产生中起重要的作用。α亚基(SCNxA)是通道的主要组分，并且当在细胞中体外表达时将足以产生离子流。然而，实质上电压门控钠通道包括两个额外的调控β亚基。这些亚基的作用将用于修改钠通道定位和密度以及动力学性质，主要通过影响钠电流的失活来进行。SCN1B基因中的突变与GEFS+、Brugada综合征和非特异性心脏传导缺陷相关。SCN3B中的突变也与Brugada综合征相关，而SCN4B中的突变导致长QT综合征-10。
在一个实施方案中，选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药的小分子用于预防或治疗与SCNxA家族成员相关的疾病或病症。示例性的可用药物和/或用由使用化合物获得的干细胞再生的细胞/组织治疗的电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)介导的疾病和病症包括：神经系统疾病或病症、抽搐、疼痛(包括慢性疼痛)、涉及钠通道功能障碍的受损电兴奋性、与钠通道功能障碍相关的疾病或病症、与电压门控钠通道α亚基活性失调相关的疾病或病症(例如，麻痹、高钾性周期性麻痹、先天性副肌强直、钾加重性肌强直、长Q-T综合征3、运动终板疾病、共济失调等)、由于肠神经系统功能障碍引起的胃肠道疾病(例如，大肠炎、回肠炎、炎症性肠综合征等)、心血管疾病或病症(例如，高血压、充血性心力衰竭等)；涉及交感神经和副交感神经支配的泌尿生殖道的疾病或病症(例如，良性前列腺增生、阳痿)；与神经肌肉系统相关的疾病或病症(例如，肌营养不良症、多发性硬化、癫痫、自闭症、偏头痛(例如，散发性和家族性偏瘫型偏头痛等)、小儿重度肌阵挛型癫痫(SMEI)或Dravet综合征、全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)等)和SCN1A相关性癫痫病症。
在一个实施方案中，所述小分子上调SCN1A的多核苷酸。SCN1A靶包含SCN1A的变体；SCN1A的突变体，包括SNP；SCN1A的非编码序列；等位基因、同种型、片段和类似物。优选所述小分子选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药。
根据本发明的实施方案，靶核酸分子不限于仅SCN1A多核苷酸，还延伸到SCN1A(例如SCNxA家族)的任何同种型、受体、同系物、非编码区和类似物。
在另一个实施方案中，小分子调节SCN1A靶，SCN1A靶包括但不限于其变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。
在一个实施方案中，所述小分子调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的表达并且调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)(SEQID NO:1)的表达和/或功能。
可从DNA的相同基因组区域产生可选RNA转录物。这些可选转录物通常称为"剪接变体"。更具体地，"前体mRNA变体"是从基因组DNA产生的包含内含子序列和外显子序列两者的转录物。
在剪接期间切除一个或多个外显子或内含子区域或其部分后，前体mRNA变体产生更小的"mRNA变体"。这些mRNA变体还称为"可选剪接变体"。如果不进行前体mRNA变体的剪接，则前体mRNA变体与mRNA变体相同。
变体可经由使用可选信号产生以起始或终止转录。前体mRNA和mRNA可具有多于一个起始密码子或终止密码子。来源于使用可选起始密码子的前体mRNA或mRNA的变体称为该前体mRNA或mRNA的"可选起始变体"。使用可选终止密码子的那些转录物称为该前体mRNA或mRNA的"可选终止变体"。一种特定类型的可选终止变体是"聚腺苷酸变体"，其中产生的多个转录物由"聚腺苷酸终止信号"之一被转录机制可选选择所致，从而产生在独特聚腺苷酸位点终止的转录物。在本发明范畴中，本文所述的变体类型也是靶核酸的实施方案。
尽管本文列出了某些示例性靶区段的具体序列，但是本领域技术人员将理解这些用于阐释和描述于本发明范围中的具体实施方案。本领域普通技术人员考虑到本公开内容可容易地鉴定另外的靶区段。
在进一步的实施方案中，本文鉴定的"优选的靶区段"可用于筛选调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)多核苷酸表达的另外的化合物。"调节剂"是减少或增加编码电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)或其相应蛋白的核酸分子表达的那些化合物。筛选方法包括以下步骤：将编码电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)或其相应蛋白的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选的靶区段与一种或多种候选调节剂接触，并选择减少或增加编码电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)多核苷酸或其相应蛋白的核酸分子的表达的一种或多种候选调节剂。显示一种或多种候选调节剂能够调节(例如，减少或增加)编码电压门控钠通道α亚基(SCNxA)多核苷酸的核酸分子的表达后，随后调节剂可用于电压门控钠通道α亚基(SCNxA)多核苷酸功能的进一步研究性研究，或用作根据本发明的研究剂、诊断剂或治疗剂。
根据本发明使用的小分子可方便和常规地通过公知的合成方法制备。也可采用用于此类合成的任何其它手段；小分子的实际合成完全在本领域普通技术人员的才能范围内或此类分子可获自商业供应商或供货商。优选的在本发明方法中使用的分子的每一种均为已知的药物产品并且可购自或获自活性药学成分制造商。此外，此类药物已公布合成方法并且合成化学领域普通技术人员可经由已知路径合成此类药物或者本领域普通技术人员可设计新的合成方法。这些药物及其物理和盐形式可通过标准化学手段制备前药来修饰。此类前药包括酯和/或其它化学衍生物和/或修饰，其中在施用时，剂型(药物产品)中的前药分裂成已知的活性药学成分。转而，这些药物可被代谢成已知的活性代谢产物并且此类代谢产物包括在本发明范围内。本发明还包括药物产品的对映异构体和/或非对映异构体、包括钠盐和钾盐的各种盐形式以及此类产品的水合物和溶剂化物。本发明还包括呈任何适合剂型的非晶形式的每种药物产品或其盐的用途。如果特定药物产品含有胺部分，则本发明还包括此类产品的酸式盐，其中抗衡离子选自卤盐诸如氯化物或溴化物等。重结晶方法及其它已知纯化方法可用来制备此类活性药学成分的晶体形式。
小分子至宿主细胞或生物体的转移和对其对RNA或蛋白上调或下调的作用的确定可通过本领域公知的数种方法来评估。例如，选择SCN1A成纤维细胞和/或角化细胞或所需的其它细胞类型并使它们生长，用于本文的特异性测定。实验前一天，将细胞以约4×104个/孔的密度铺板到24孔板中的生长培养基中并且在37℃和5%CO2下孵育过夜。第二天，将24孔板中的培养基更换为新鲜生长培养基(1ml/孔)并且将小化合物给予细胞。在DMSO中制备1mM浓度的化合物储液。实验时将1mM储液在生长培养基中稀释至1uM的浓度。将DMSO的1:1000稀释液用于对照孔。在37℃和5%CO2孵育24-48h后，去除培养基且利用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)按照制造商的说明书从细胞提取RNA。将600ng经纯化的总RNA加入到利用来自Invitrogen的SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(目录号11754-250)如制造商的方案所述进行的逆转录反应中。利用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI(对于人SCN1A的测定Hs00374696_m1、Hs00897350_m1或Hs00897341_m1)设计的引物/探针，通过实时PCR用得自这一逆转录反应的cDNA来监测基因表达。使用StepOne Plus Real Time PCR系统(AppliedBiosystems)使用以下PCR循环：50℃持续2min、95℃持续10min、40个循环的(95℃持续15秒、60℃持续1min)。对于18S的测定由ABI(目录号4319413E)制备。用化合物治疗后的基因表达倍数变化基于经化合物治疗的和媒介物治疗的样品之间18S-标准化的dCt值的差异来计算。
添加小分子后RNA的表达还可通过测量酶促活性或报告蛋白活性来检测。例如，来自基因的编码区域可用于通过将基因和其聚(腺苷酸)信号之间的报告基因编码区域插入到自我复制质粒中来构建模型对照基因，从而总是以相同水平表达该基因和报道基因。单独小分子的效果将通过观察报告基因的调节来测定。可用于本发明方法的报告基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)及其衍生物。赋予对氨苄西林、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四环素抗性的多种选择标记是可得的。确定报告基因的调节的方法是本领域公知的，包括但不限于，荧光方法(例如，荧光光谱学、荧光激活细胞分选术(FACS)、荧光显微镜检术)、抗生素抗性确定。
SCNxA蛋白和mRNA表达可使用本领域技术人员已知的和本文他处描述的方法来测定。例如，可使用诸如免疫组织化学的测定来评价蛋白水平。为了达到这个目的，将使用适合的生长条件使细胞在24孔板中生长。在添加小化合物后48小时，除去培养基并且将细胞用不含钙和镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲的盐水(Dulbecco’sphosphate-buffered saline)(PBS)(Mediatech目录号21-031-CV)洗涤3次。然后弃去PBS，并且在-20℃使用300μl100%甲醇将细胞固定于24孔板中15min。除去甲醇并用PBS洗涤后，在21℃将细胞与3%过氧化氢(Fisher Chemical目录号H325-100)孵育5min。将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后在21℃与300μl在PBS中0.1%浓度的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma目录号A-9647)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃与300μl抗生物素蛋白溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS短暂地漂洗三次，然后在21℃与生物素溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次，然后在4℃与300μl/孔以1:250稀释于PBS/BSA0.1%中的对应于大鼠Scn1a(Abcam目录号ab24820；已知识别大鼠Scn1a、人SCN1A和小鼠Scn1a)的C端氨基酸1491-1508的抗合成肽(EEQKKYYNAMKKLGSKKP)的兔抗体孵育过夜。在21℃平衡板5min后，将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃与以1:200以稀释于PBS/BSA0.1%中的山羊抗兔抗体孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后与300μl Vectastain Elite ABC试剂A+B溶液(Vector Laboratories目录号PK-6101)孵育30min；在21℃制备Vectastain Elite ABC试剂A+B溶液，30min后通过将2滴试剂A和2滴试剂B相继添加并混合至5ml PBS与细胞一起孵育。在21℃将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后与二氨基联苯胺(DAB)过氧化物酶底物溶液(Vector Laboratories目录号SK-4105)孵育直至细胞被染色；将DAB过氧化物酶底物溶液复原，之后其通过将1ml ImmPACTTMDABDiluent与30μl ImmPACTTMDAB Chromogen浓缩液混合而加入至细胞中。此时，将细胞用PBS短暂地洗涤三次并且将300μl PBS留在每个孔中。使用配置有与Dell Latitude D630膝上型电脑的屏幕上的Nikon Digital-Sight装置耦接的Nikon DS-Ri1照相机的倒置NikonEclipse TS100显微镜，在24孔板的各孔内直接分析细胞的染色。使用由Nikon照相机提供的软件NIS-Elements D3.0制得各孔的照片。
此外，SCN1A蛋白可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量。为了达到这个目的，将使用适合的生长条件使细胞在24孔板中生长。在添加小化合物后48小时，除去培养基并且将细胞用不含钙和镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(Mediatech目录号21-031-CV)洗涤3次。然后弃去PBS，并且在-20℃使用100μl100%甲醇将细胞固定于24孔板中15min。除去甲醇并用PBS洗涤后，在21℃将细胞与3%过氧化氢(Fisher Chemical目录号H325-100)孵育5min。将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后在21℃与100μl PBS中的0.1%浓度的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma目录号A-9647)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃用300μl抗生物素蛋白溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS短暂地漂洗三次，然后在21℃与生物素溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次，然后在4℃与100μl/孔以1:250稀释于PBS/BSA0.1%中的对应于大鼠Scn1a(Abcam目录号ab24820；已知至少识别大鼠Scn1a、人SCN1A和小鼠Scn1a)的C端氨基酸1491-1508的抗合成肽(EEQKKYYNAMKKLGSKKP)的兔抗体孵育过夜。在21℃平衡板5min后，将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃与以1:200以稀释于PBS/BSA0.1%中的山羊抗兔抗体孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后与300μl Vectastain Elite ABC试剂A+B溶液(VectorLaboratories目录号PK-6101)孵育30min；在21℃制备Vectastain EliteABC试剂A+B溶液，30min后通过将2滴试剂A和2滴试剂B相继添加并混合至5ml PBS与细胞一起孵育。在21℃将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后与四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物溶液(Thermo Scientific目录号N301)孵育直至细胞被染色。在上清液变成蓝色后，将其转移至新96孔ELISA板(Greiner bio one目录号65121)并加入1M硫酸。使用Multiskan Spectrum分光光度计(ThermoScientific)在450nm对吸光度读数。背景信号，即用作为一抗的兔抗-小鼠IgG(Abcam目录号ab6709)染色的孔的读数，从所有SCN1A和肌动蛋白读数扣除。使用来自Abcam的兔抗肌动蛋白抗体(目录号ab1801)。然后对于每种条件将SCN1A信号对肌动蛋白信号标准化并且将比较每个实验变型的标准化值。
在实施方案中，利用本发明小分子治疗的样品(例如，体内或体外的细胞或组织)中的SCN1A表达(例如，mRNA或蛋白)通过与对照样品中的SCN1A表达比较来评价。例如，蛋白或核酸的表达可利用本领域技术人员已知的方法与模拟处理或未处理样品中的蛋白或核酸的表达比较。可选地，取决于期望的信息，可与以对照非活性分子处理的样品进行比较。在另一实施方案中，处理样品与未处理样品中SCN1A蛋白或核酸的表达差异可与处理样品与未处理样品中不同核酸(包括研究者认为适当的任何标准，例如，看家基因)的表达差异比较。
观察到的差异可如期望地表示，例如，以比率或分数的形式，用于与对照比较。在实施方案中，以本发明反义寡核苷酸处理的样品中SCN1A mRNA或蛋白的水平相对于未处理样品或以对照核酸处理的样品增加或减少约1.25倍至约10倍或更多。在实施方案中，SCN1AmRNA或蛋白的水平增加或减少至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、或至少约10倍或更多。
除SCN1A蛋白或mRNA表达的变化之外，可定量Nav1.1通道的功能的变化。例如，可在解离的海马中间神经元中测量通过用小化合物上调SCN1A而诱导的钠流幅值的变化。为了达到这个目的，将通过在持续用95%O2和5%CO2充氧的缓冲液中用链霉蛋白酶和接着用嗜热菌蛋白酶消化，从11至16天龄大鼠中解离海马GAD阳性双极细胞(GABAergic中间神经元)。将经解离的细胞铺板于组织培养皿中并且用选择的小化合物处理24h，之后将进行电生理记录。使用全细胞膜片钳技术用EPC-9膜片钳放大器(HEKA)记录电流。使用P-97型Flaming-Brown微量吸管拉长器(Sutter Instrument)制备膜片吸量管。使用PULSE程序(7.5版；HEKA Elektronik)进行刺激和数据获取。对于电压钳实验，使用蠕动泵将含有以mm计的19.1NaCl、19.1四乙基氯化铵、0.95BaCl2、1.90MgCl2、52.4CsCl、0.1CdCl2、0.95CaCl2、9.52HEPES、117葡萄糖(pH7.35)的灌注缓冲液恒定地灌注到细胞上。膜片吸量管将含有以mm计的157N-甲基-d-葡糖胺、126HCl、0.90NaCl、3.60MgCl2、9.01EGTA、1.80ATP-Na2、9.01HEPES、4.50肌酸-磷酸盐(pH7.2)。将细胞保持在-100mV并且从-60mV至-15mV的去极化步骤以5mV增量施加。确定最大电流密度并在经处理的和未经处理的神经元之间进行比较。
此外，可评估通过海马中间神经元中的SCN1A上调而诱导的钠流特征的变化。将通过在持续用95%O2和5%CO2充氧的缓冲液中用链霉蛋白酶和接着用嗜热菌蛋白酶消化，从11至16天龄大鼠中解离海马GAD阳性双极细胞(GABAergic中间神经元)。将经解离的细胞铺板于组织培养皿中并且用选择的小化合物处理24h，之后将进行电生理记录。使用全细胞膜片钳技术用EPC-9膜片钳放大器(HEKA)记录电流。使用P-97型Flaming-Brown微量吸管拉长器(SutterInstrument)制备膜片吸量管。使用PULSE程序(7.5版；HEKAElektronik)进行刺激和数据获取。对于电压钳实验，使用蠕动泵将含有以mm计的19.1NaCl、19.1四乙基氯化铵、0.95BaCl2、1.90MgCl2、52.4CsCl、0.1CdCl2、0.95CaCl2、9.52HEPES、117葡萄糖(pH7.35)的灌注缓冲液恒定地灌注到细胞上。膜片吸量管将含有以mm计的157N-甲基-d-葡糖胺、126HCl、0.90NaCl、3.60MgCl2、9.01EGTA、1.80ATP-Na2、9.01HEPES、4.50肌酸-磷酸盐(pH7.2)。将细胞保持在-100mV并且从-60mV至-15mV的去极化步骤以5mV增量施加。根据g=INa/(V-ENa)由电流/电压关系计算激活曲线(电导/电压关系)，其中INa表示在电势V测量的峰钠流，且ENa表示平衡电势。将波兹曼函数拟合成标准化的激活曲线和失活曲线并且将确定曲线特征。失活时间常数将通过用单指数函数拟合电流衰减来评价。将激活和失活特性在经处理的和未经处理的神经元之间比较以确定治疗是否改变电流特征。对于电流钳实验，将细胞保持在-80mV，并且在以10pA的增量施加的800毫秒脉冲后记录它们的放电模式。电极缓冲液将含有以mm计的135葡萄糖酸钾、20KCl、2MgCl2、2ATPNa2、0.3GTP-Na和10HEPES、0.2EGTA（pH7.3）。灌注缓冲液将含有以mm计的140NaCl、5KCl、2CaCl2、1MgCl2、10HEPES和10葡萄糖，pH用NaOH调节至7.4。将测量输入-输出关系(动作电势数量/所注入pA)、动作电势半宽度、峰值幅值和峰值衰减并且在经处理的和未经处理的海马抑制性中间神经元之间比较。使用与如上文对于全细胞膜片记录所述相同的溶液和方案在内面向外式膜片构型(outside/outpatch configuration)中进行单通道电流记录。
通过用小化合物处理而诱导的SCN1A上调也可影响细胞内钠水平。可在下列实验中评估此类变化。使细胞在96孔板中生长并且将不同浓度的小化合物给予细胞。48h后，将细胞用Locke缓冲液(8.6mM HEPES、5.6mM KCl、154mM NaCl、5.6mM葡萄糖、1.0mMMgCl2、2.3mM CaCl2、0.0001mM甘氨酸(pH7.4))洗涤。在将染料加载到细胞内之前测量荧光本底。通过在37℃利用10μM SBFI-AM(与Na+结合的染料),0.04%Pluronic F-127分子探针，OR,USA)和2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(50μl/孔)孵育细胞与染料1h，从而将染料加载到细胞内。此时，将细胞用2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(150μl/孔)洗涤2次。将含有加载细胞的板放置在诸如FLEXstationTM II(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)的读数仪内。加载有染料的细胞在340nm和380nm激发；在505nm记录发射信号。此时测量信号基线。在测量信号基线后，将莫能菌素(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号475895)或短杆菌肽(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号368020-25MG)添加至含有作为阳性对照的细胞的单独孔。TTX(1uM)处理用作阴性对照。然后将建立在用活性化合物预处理的细胞中的质膜处的活性SCN1A相比于媒介物对照的相对表达。使用Excel软件将信号计算成在505nm与340nm/380nm处的发射比率。
也可评估单细胞中SCN1A上调对钠水平的影响。使细胞在盖玻片上或在96孔板中生长并且给予不同浓度的小化合物。48h后，将细胞用Locke缓冲液(8.6mM HEPES、5.6mM KCl、154mM NaCl、5.6mM葡萄糖、1.0mM MgCl2、2.3mM CaCl2、0.0001mM甘氨酸(pH7.4))洗涤。在将染料加载到细胞内之前测量荧光本底。通过在37℃利用10μM SBFI-AM(与Na+结合的染料),0.04%普朗尼克酸F-127和2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(50μl/孔)孵育细胞与染料1h，从而加载染料。此时，将细胞用2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(150μl/孔)洗涤2次。将在96孔板中或在盖玻片上的细胞放置在装备有Hg灯和适于激发和发射的滤光器的落射荧光显微镜(得自OmegaOptical Inc,Brattleboro,VT,USA目录号组X-F04-2或得自ChromaTechnology Corp,Bellows Falls,VT,USA,目录号79001)下。用染料加载的细胞在340nm和380nm激发；在505nm处记录发射信号。在测量信号基线后，将莫能菌素(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号475895)或短杆菌肽(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号368020-25MG)添加至含有作为阳性对照的细胞的单独孔。为了建立质膜处的活性SCN1A的相对上调，将用活性化合物预处理的细胞与赋形剂媒介物相比较。数据用与落射荧光显微镜连接的照相机收集并且使用适合的软件定量。通过使用Excel软件计算505nm发射与340nm/380nm的比率来处理原始信号。
除细胞测定之外，可利用特定疾病状态的动物模型。在每种情况下，根据特定靶疾病或疾患来选择动物。已知动物表达或能够表达SCN1A多肽或其变体。本发明的化合物可用于诊断、治疗和预防，及作为研究试剂和试剂盒的成分。而且，能够调节基因表达的化合物通常被本领域技术人员用来阐明特定基因的功能或区分生物途径的不同成员的功能。该化合物在制造用于治疗本文所述的任何疾病的药物中的用途是所要求保护的发明的特征。
对于在试剂盒和诊断和不同生物系统中使用，本发明的化合物，单独地或与其它化合物或治疗组合地用作差异和/或组合分析中的工具来阐明细胞和组织中表达的基因的一部分或完全互补序列的互助表达模式。
本文所用的术语"生物系统"或"系统"定义为表达或使成为感受态以表达基因的电压门控钠通道α亚基(SCNxA)家族的产物的任何生物体、细胞、细胞培养物或组织。这些包括但不限于，人、转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物及其组合。
作为一个非限制性实例，将以一种或多种化合物处理的细胞或组织中的表达模式与未被此类化合物处理的对照细胞或组织比较，并按照其属于所检查的基因的例如疾病关联、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能分析所产生的模式的基因表达差异水平。这些分析可对刺激或未刺激的细胞进行，并在影响表达模式的其它化合物存在或不存在下。
本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列、SAGE(基因表达系列分析)、READS(消化的cDNA的限制性酶扩增)、TOGA(总基因表达分析)、蛋白阵列和蛋白质组学、表达的序列标签(EST)测序、消减RNA指纹技术(SuRF)、消减克隆、差异展示(DD)、比较基因组杂交、FISH(荧光原位杂交)技术和质谱方法。
对于治疗，通过施用根据本发明的化合物来治疗怀疑患有可通过调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)多核苷酸或蛋白的表达来治疗的疾病或病症的动物，优选地人。例如，在一个非限制性实施方案中，方法包括向需要治疗的动物施用治疗有效量的电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)调节剂的步骤。本发明的电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)调节剂有效地调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的活性或调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)蛋白的表达。在一个实施方案中，与对照相比，动物中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的活性或表达被抑制约10%。优选地，动物中SCN1A的活性或表达被抑制约30%。更优选地，动物中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的活性或表达被抑制50%或更多。因此，与对照相比，小化合物调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)mRNA或蛋白的表达至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。
在一个实施方案中，与对照相比，动物中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)和/或的活性或表达增加约10%。优选地，动物中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的活性或表达增加约30%。更优选地，动物中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的活性或表达增加50%或更多。因此，与对照相比，该化合物调节电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)mRNA的表达至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%或更多。
例如，可测量动物的血液、脂肪组织、肝脏或任何其它体液、组织或器官中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)表达的减少或增加。优选地，待分析的所述体液、组织或器官中包含的细胞包含编码电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)肽和/或电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)蛋白本身的核酸分子。
本发明的化合物可用于药物组合物，通过向适当的药学上可接受的稀释剂或载体加入有效量的本发明化合物。本发明的化合物和方法的用途还可以是预防上有用的。
为了辅助摄取、分布和/或吸收，本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其它方式关联，例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其它制剂。教导这种摄取、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包括但不限于，美国专利No.5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,165、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756，其每一个通过引用并入本文。
在一个实施方案中，发明实践包括向需要其治疗的患者至少一种下述化合物：米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、埃索美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药。
本发明的化合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐、或当施用于动物(包括人)时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物的任何其它化合物或其残留物。
术语"药学上可接受的盐"是指本发明化合物的生理上和药学上可接受的盐：即，保留亲本化合物的期望生物活性且不对其赋予不期望的毒物学作用的盐。
本发明还包括包含本发明化合物的药物组合物和制剂。取决于期望局部还是系统治疗和待治疗的区域，本发明的药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部的(包括眼睛和向粘膜，包括阴道和直肠递送)、肺部，例如通过吸入或喷入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内的施用。
对于治疗中枢神经系统中的组织，施用可通过例如注射或输注到脑脊液中来进行。
当预期本发明的化合物将被施用于中枢神经系统中的细胞时，可以与能够促进本发明的化合物跨越血脑屏障的渗透的一种或多种试剂施用。施用可以是快速的，如通过注射，或经一段时间进行，如通过缓慢输注或施用缓释制剂。
本发明的化合物可还与提供期望的药物或药效学特性的试剂连接或缀合或组合。例如，该化合物可偶联于本领域已知的促进跨血脑屏障渗透或运输的任何物质，例如转铁蛋白受体的抗体，并通过静脉内注射施用。渗透血脑屏障破坏还可通过例如输注以下物质来实现：糖包括但不限于，赤藓糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、卫矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纤维二糖、D(+)麦芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、D(-)核糖、侧金盏花醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)岩藻糖、L(-)岩藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖，或氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增强血脑屏障渗透的方法和材料描述于，例如，美国专利No.4,866,042“Method for the delivery of genetic material across theblood brain barrier”，美国专利No.6,294,520“Material for passagethrough the blood-brain barrier”和美国专利No.6,936,589“Parenteraldelivery systems”，都通过引用整体并入本文。
为了帮助摄取、分布和/或吸收，本发明化合物可与其它分子、分子结构或化合物混合物，例如，脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其它制剂混合、包封、缀合或以其它方式关联。例如，阳离子脂质可被包括在制剂中以促进化合物摄取。显示促进摄取的一种这样的组合物是LIPOFECTIN(可从GIBCO-BRL,Bethesda,MD获得)。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括经皮贴片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体、水性、粉状或油性基质、增稠剂和类似物可以是必需或期望的。涂覆的避孕套、手套和类似物也是可用的。
可方便地以单位剂型呈现的本发明的药物制剂可按照制药工业中公知的常规技术制备。这种技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂关联的步骤。通常，制剂通过以下制备：均匀且密切地将活性成分与液态载体或磨碎的固态载体或两者关联，然后，如果需要，将产品成型。
本发明的组合物可配制为任何的许多可能剂型，例如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可配制为在含水、不含水或混合介质中的悬浮剂。含水悬浮剂可进一步包含增加悬浮剂粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮剂还可包含稳定剂。
本发明的药物组合物包括但不限于，溶液、乳液、泡沫剂和含脂质体制剂。本发明的药物组合物和制剂可包括一种或多种渗透促进剂、载体、赋形剂或其它活性或无活性配料。
乳剂通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的液滴形式分散在另一液体中的异质系统。除了分散相和可作为以水相、油相或本身作为单独相的溶液存在的活性药物以外，乳剂可包含另外的成分。包括微乳剂作为本发明的实施方案。乳剂及其用途是本领域公知的，进一步描述于美国专利No.6,287,860。
本发明的制剂包括脂质体制剂。本发明所用的术语"脂质体"是指包括以一个或多个球形双层排列的两亲性脂质的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡，具有从亲脂性材料形成的膜和包含待递送的组合物的含水内部。
脂质体还包括"空间上稳定的"脂质体，本文所用的该术语是指包括一种或多种特化的脂质的脂质体。当被并入脂质体时，这些特化的脂质产生相对于松散这种特化脂质的脂质体具有增强的循环生命周期的脂质体。空间上稳定的脂质体的实例是其中脂质体的形成囊泡的脂质部分的部分包括一种或多种糖脂或以一种或多种亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的脂质体。脂质体及其用途进一步描述于美国专利No.6,287,860中。
本发明的药物制剂和组合物还可包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳剂中的使用是本领域公知的。表面活性剂及其用途进一步描述于美国专利No.6,287,860中，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，本发明采用多种渗透促进剂来实现小分子的有效递送。除了帮助非亲脂性药物跨细胞膜的扩散，渗透促进剂还增强亲脂性药物的渗透性。渗透促进剂可分为属于五个大类之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆酸、螯合剂和非螯合非表面活性剂。渗透促进剂及其用途进一步描述于美国专利No.6,287,860中，其通过引用并入本文。
本领域技术人员将认识到，制剂常规地根据其预期用途即施用途径来设计。
用于局部施用的优选的制剂包括其中用于本文所述的用途的本发明的化合物与局部递送剂例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的制剂。优选的脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰基-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基-磷脂酰乙醇胺DOTMA)。
对于局部或其它施用，可将本发明的化合物封装于脂质体中或可与其形成复合体，尤其是阳离子脂质体。可选地，化合物可与脂质，尤其是阳离子脂质复合。优选的脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐及其用途进一步描述于美国专利No.6,287,860中。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉末剂或颗粒剂、微颗粒、纳米颗粒、水或非水介质中的悬浮剂或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或小片剂。增稠剂、芳香剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。优选的口服制剂是其中本发明的化合物连同一种或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂一起施用的那些。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。优选的胆酸/盐和脂肪酸及其用途进一步描述于美国专利No.6,287,860中，其通过引用并入本文。还优选的是渗透促进剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆酸/盐的组合。尤其优选的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。进一步的渗透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本发明的化合物可口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的粒状形式或复合以形成微颗粒或纳米颗粒。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括还可包含缓冲剂、稀释剂和其它适当的添加剂(例如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂)的无菌水溶液。
本发明的某些实施方案提供包含一种或多种化合物和一种或多种其它活性药学成分的药物组合物。这种活性药学成分的实例包括但不限于对于治疗需要用本发明的化合物进行治疗的患者的疾患有用的任何活性成分。两种或更多种组合的化合物可一起或顺序地使用。
在另一相关实施方案中，本发明的组合物可包含靶向第一核酸靶的一种或多种化合物，和靶向第二核酸靶的一种或多种另外的化合物。例如，第一靶可以是电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的特定反义序列，第二靶可以是来自另一核苷酸序列的区域。可选地，本发明的组合物可包含调节同一电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)核酸或蛋白靶的不同区域的两种或更多种化合物。两种或更多种组合的化合物可一起或顺序地使用。
认为治疗性组合物的配制及其随后的施用(给药)在本领域技术人员的能力范围内。给药依赖于待治疗的疾病状态的严重度和响应性，治疗的时期持续数天到数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。最佳给药计划可从患者体内药物积累的测量来计算。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据单独活性药学成分的相对效力而变化，并且通常可基于在有效的体外和体内动物模型中有效的EC50来估算并且也可由每一种经批准且上市的药物的处方信息来确定。通常，剂量是每kg体重从0.01μg至100mg，可每天、每周或每月一次或多次提供。本领域普通技术人员可基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度容易地估算重复率。在成功治疗之后，可能期望对患者进行维持疗法以阻止疾病状态复发，其中该化合物以维持剂量施用，范围从每kg体重0.01μg至100mg，每天一次或多次。
在实施方案中，患者以至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90或至少约100mg/kg体重的药物剂量治疗。
尽管以上已经描述了本发明多种实施方案，应理解的是，它们仅以示例而非限制的方式呈现。可根据本公开内容对公开的实施方案进行多种改变而不偏离本发明的主旨或范围。因此，本发明的宽度和范围不应限于任何上述的实施方案。
本文提及的所有文件通过引用并入本文。本申请中提及的所有出版物和专利文件为了所有目的通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物或专利文件被单独地提及。通过在本文件中提及多个参考文献，申请人不承认任何特定参考文献是本发明的"现有技术"。本发明组合物和方法的实施方案在以下实施例中阐述。
实施例
以下非限制性实施例用于阐述本发明的选定实施方案。应理解的是，所示组分的成分的比例和其它选择方面的改变对于本领域技术人员是明显的，并且在本发明实施方案范围中。使用下列化合物来评估SCN1A mRNA水平的调节：
a)盐酸米那普仑(1R(S),2S(R)[-2-(氨基甲基)-N,N-二乙基-1-苯基环丙烷甲酰胺盐酸盐)；
b)托拉塞米(1-异丙基-3-[(4-间甲苯氨基-3-吡啶基-磺酰基]脲)；
c)利培酮(3-[2-[4-(6-氟-1,2-苯并异噁唑-3-基)-1-哌啶基]-乙基]-6,7,8,9-四氢-2-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮)；
d)吡那地尔(N-氰基-N’吡啶-4-基-N’’-(1,2,2-三甲基丙基)胍)；
e)盐酸贝尼地平(5-O甲基-3O-[(3R)-1-(苯基甲基)-哌啶-3-基]2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸盐)；
f)酮康唑(1-[4-(4-{[(2R,4S)-2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-咪唑-1-基甲基)-1,3-二氧戊环-4-基]甲氧基}苯基)哌嗪-1-基]乙-1-酮)；
g)依布硒(2-苯基-1,2-苯并硒唑-3-酮)；
h)他达拉非((6R-反式)-6-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2,3,6,7,12,12a-六氢-2-甲基-吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮)；
i)折仑诺((3S,7R)-7,14,16-三羟基-3-甲基-3,4,5,6,7,8,9,10,11,12-十氢-1H-2-苯并氧杂环十四因-1-酮)；
j)盐酸萘发扎酮(2-[3-[4-(3-氯苯基)-1-哌嗪基]丙基]-5-乙基-2,4-二氢-4-(2-苯氧基乙基)-3H-1,2,4-三唑-3-酮单盐酸盐；
k)二盐酸洛美利嗪(1-[双(4-氟苯基)甲基]-4-[2,3,4-三甲氧基苯基甲基]二盐酸盐)；
l)淫羊藿苷(5-羟基-2-(4-甲氧基苯基)-8-(3-甲基丁-2-烯基)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)噁烷-2-基]氧基-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基噁烷-2-基]氧基色烯-4-酮)；
m)奥美拉唑镁(6-甲氧基-2-((4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基亚磺酰基)-1H-苯并[d]咪唑Mg)；
n)埃索美拉唑镁((S)-6-甲氧基-2-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基亚磺酰基)-1H-苯并[d]咪唑Mg)；
o)L-694,247(甲烷磺酰胺，N-[4-[[5-[3-(2-氨基乙基)-1H-吲哚-5-基]-1,2,4-噁二唑-3-基]甲基]苯基]；
p)尼群地平((RS)-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸乙基甲基酯)；
q)尼美西泮(2-甲基-9-硝基-6-苯基-2,5-二氮杂双环并[5.4.0]十一碳-5,8,10,12-四烯-3-酮)；
r)氨来呫诺(2-氨基-7-异丙基-5-氧代-5H-色烯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸)；
s)柠檬酸莫沙必利(4-氨基-5-氯-2-乙氧基-N-[[4-[(4-氟苯基)甲基]-2-吗啉基]甲基]-苯甲酰胺2-羟基-1,2,3-丙烷三羧酸盐)；
t)盐酸舍曲林((1S,4S)-4-(3,4-二氯苯基)-N-甲基-1,2,3,4-四氢萘-1-胺)和
u）司坦唑醇(17β-羟基-17-甲基-5α-雄甾烷并[3,2-c]-吡唑)。
实施例1.在用小化合物处理后携带Dravet相关突变的原代人成纤维细胞中SCN1A mRNA的上调
在实施例1中，用1uM最终浓度的小化合物处理携带Dravet相关SCN1A突变的原代人皮肤成纤维细胞。下面数据显示在24-48h处理后这些化合物能够上调SCN1A mRNA。
材料和方法
用小化合物处理携带Dravet相关突变的原代人成纤维细胞。
在37℃和5%CO2下使由N.Kenyon博士(University of Miami)引入培养基的携带Dravet相关SCN1A突变的原代人皮肤成纤维细胞在由a-MEM(Gibco,目录号12561-056)+10%FBS(Mediatech,目录号35-015CV)+1%抗真菌剂-抗生素(Gibco,目录号15240-062)组成的生长培养基中生长。实验前一天，将细胞以约4×104个/孔的密度铺板到24孔板中的生长培养基中并且在37℃和5%CO2下孵育过夜。第二天，将24孔板中的培养基更换为新鲜生长培养基(1ml/孔)并且将小化合物给予细胞。所有化合物获自商业来源。在DMSO中制备1mM浓度的化合物储液。实验时将1mM储液在生长培养基中稀释至1uM浓度。将DMSO的1:1000稀释液用于对照孔。在37℃和5%CO2孵育24-48h后，去除培养基且利用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)按照制造商的说明书从细胞提取RNA。将600ng经纯化的总RNA加入到利用来自Invitrogen的SuperScript VILOcDNA合成试剂盒(目录号11754-250)如制造商的方案所述地进行的逆转录反应中。利用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI(对于人SCN1A的测定Hs00374696_m1、Hs00897350_m1或Hs00897341_m1)设计的引物/探针，通过实时PCR用得自这一逆转录反应的cDNA来监测基因表达。使用所有三种测定获得的结果非常类似(数据未示出)。使用StepOne Plus Real Time PCR系统(AppliedBiosystems)使用以下PCR循环：50℃持续2min、95℃持续10min、40个循环的(95℃持续15秒、60℃持续1min)。对于18S的测定由ABI(目录号4319413E)制备。以化合物处理后的基因表达倍数变化基于经化合物处理的和媒介物处理的样品之间18S-标准化的dCt值的差异来计算。
结果
结果显示不同化学特性的小化合物能够将携带Dravet相关突变的原代皮肤成纤维细胞中SCN1A mRNA上调2-4倍(表1)。
实施例2.在用小化合物处理后成年原代人角化细胞中SCN1AmRNA的上调
在实施例2中，用1uM最终浓度的小化合物处理原代人角化细胞。下面数据显示在24-48h处理后这些化合物能够上调SCN1AmRNA。
材料和方法
用小化合物处理原代人角化细胞。
在37℃和5%CO2下使得自PromoCell(Heidelberg,Germany,目录号C-12003)或LifeLine Cell Technology(Frederick,MD,目录号FC-0025)的成年原代人角化细胞在由制造商供应的生长培养基中生长。实验前一天，将细胞以约4×104个/孔的密度铺板到24孔板中的生长培养基中并且在37℃和5%CO2下孵育过夜。第二天，将24孔板中的培养基更换为新鲜生长培养基(1ml/孔)并且将小化合物给予细胞。所有化合物获自商业来源。在DMSO中制备1mM浓度的化合物储液。实验时将1mM储液在生长培养基中稀释至1uM浓度。将DMSO的1:1000稀释液用于对照孔。在37℃和5%CO2孵育24-48h后，去除培养基且利用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)按照制造商的说明书从细胞提取RNA。将600ng经纯化的总RNA加入到利用来自Invitrogen的SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(目录号11754-250)如制造商的方案所述地进行的逆转录反应中。利用ABI Taqman基因表达混合物(目录号4369510)和由ABI(对于人SCN1A的测定Hs00374696_m1、Hs00897350_m1或Hs00897341_m1)设计的引物/探针，通过实时PCR用得自这一逆转录反应的cDNA来监测基因表达。使用所有三种测定获得的结果非常类似(数据未示出)。使用StepOne Plus Real Time PCR系统(Applied Biosystems)使用以下PCR循环：50℃持续2min、95℃持续10min、40个循环的(95℃持续15秒、60℃持续1min)。对于18S的测定由ABI(目录号4319413E)制备。以化合物处理后的基因表达倍数变化基于经化合物处理的和媒介物处理的样品之间18S-标准化的dCt值的差异来计算。
结果
结果显示不同化学特性的小化合物能够将成年原代角化细胞中SCN1A mRNA上调2-5倍(表1)。
表1显示在用1uM浓度的小化合物处理后携带Dravet相关突变的原代皮肤成纤维细胞(第1列)和成年原代角化细胞(第2列)中SCN1A mRNA水平的倍数增加。Avg-平均上调；STE-平均标准误差。
表1：
Figure BDA0000489409050000411
实施例3：通过免疫组织化学定量SCN1A蛋白
该实验的目的在于使用称为免疫组织化学的技术根据其上调不同细胞中SCN1A蛋白表达的能力对化合物进行排列。材料和方法。细胞内的SCN1A蛋白通过免疫组织化学来检测。为了达到这个目的，将使用适合的生长条件使细胞在24孔板中生长。在添加小化合物后48小时，除去培养基并且将细胞用不含钙和镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(Mediatech目录号21-031-CV)洗涤3次。然后弃去PBS，并且在-20℃使用300μl100%甲醇将细胞固定于24孔板中15min。除去甲醇并用PBS洗涤后，在21℃将细胞用与3%过氧化氢(Fisher Chemical目录号H325-100)孵育5min。将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后在21℃用与300μl在PBS中0.1%浓度的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma目录号A-9647)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃用与300μl抗生物素蛋白溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS短暂地漂洗三次，然后在21℃用与生物素溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次，然后在4℃用与300μl/孔以1:250稀释于PBS/BSA0.1%中的对应于大鼠Scn1a(Abcam目录号ab24820；已知至少识别大鼠Scn1a、人SCN1A和小鼠Scn1a)的C端氨基酸1491-1508的抗合成肽(EEQKKYYNAMKKLGSKKP)的兔抗体孵育过夜。在21℃平衡板5min后，将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃用以与以1:200以稀释于PBS/BSA0.1%中的山羊抗兔抗体孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后用与300μl Vectastain Elite ABC试剂A+B溶液(VectorLaboratories目录号PK-6101)孵育30min；在21℃制备Vectastain EliteABC试剂A+B溶液，30min后通过将2滴试剂A和2滴试剂B相继添加并混合至5ml PBS与细胞一起孵育。在21℃将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后用与二氨基联苯胺(DAB)过氧化物酶底物溶液(Vector Laboratories目录号SK-4105)孵育直至细胞被染色；将DAB过氧化物酶底物溶液复原，之后其通过将1ml ImmPACTTMDABDiluent与30μl ImmPACTTMDAB Chromogen浓缩液混合而加入至细胞中。此时，将细胞用PBS短暂地洗涤三次并且将300μl PBS留在每个孔中。使用配置有与Dell Latitude D630膝上型电脑的屏幕上的Nikon Digital-Sight装置耦接的Nikon DS-Ri1照相机的倒置NikonEclipse TS100显微镜，在24孔板的各孔内直接分析细胞的染色。使用由Nikon照相机提供的软件NIS-Elements D3.0制得各孔的照片。
实施例4：通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量SCN1A蛋白
该实验的目的在于使用称为酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术根据其上调不同细胞中SCN1A蛋白表达的能力对化合物进行排列。
材料和方法：由细胞产生的SCN1A蛋白的量将通过ELISA定量。为了达到这个目的，将使用适合的生长条件使细胞在24孔板中生长。在添加小化合物后48小时，除去培养基并且将细胞用不含钙和镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(Mediatech目录号21-031-CV)洗涤3次。然后弃去PBS，并且在-20℃使用100μl100%甲醇将细胞固定于24孔板中15min。除去甲醇并用PBS洗涤后，在21℃将细胞与3%过氧化氢(Fisher Chemical目录号H325-100)孵育5min。将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后在21℃与100μl PBS中的0.1%浓度的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma目录号A-9647)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃与300μl抗生物素蛋白溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS短暂地漂洗三次，然后在21℃与生物素溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次，然后在4℃与100μl/孔以1:250稀释于PBS/BSA0.1%中的对应于大鼠Scn1a(Abcam目录号ab24820；已知至少识别大鼠Scn1a、人SCN1A和小鼠Scn1a)的C端氨基酸1491-1508的抗合成肽(EEQKKYYNAMKKLGSKKP)的兔抗体孵育过夜。在21℃平衡板5min后，将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃与以1:200以稀释于PBS/BSA0.1%中的山羊抗兔抗体孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后与300μl Vectastain Elite ABC试剂A+B溶液(VectorLaboratories目录号PK-6101)孵育30min；在21℃制备Vectastain EliteABC试剂A+B溶液，30min后通过将2滴试剂A和2滴试剂B相继添加并混合至5ml PBS与细胞一起孵育。在21℃将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后与四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物溶液(Thermo Scientific目录号N301)孵育直至细胞被染色。在上清液变成蓝色后，将其转移至新96孔ELISA板(Greiner bio one目录号65121)并加入1M硫酸。使用Multiskan Spectrum分光光度计(ThermoScientific)在450nm对吸光度读数。背景信号，即用作为一抗的兔抗-小鼠IgG(Abcam目录号ab6709)染色的孔的读数，从所有SCN1A和肌动蛋白读数扣除。使用来自Abcam的兔抗肌动蛋白抗体(目录号ab1801)。然后对于每种条件将SCN1A信号对肌动蛋白信号标准化并且将比较每个实验变型的标准化值。
实施例5：ACTIN mRNA的定量
该实验的目的在于使用称为实时PCR的技术确认上调SCN1AmRNA的化合物中没有一种对不同细胞中的肌动蛋白mRNA产生任何影响。
材料和方法。收获来自在适合培养条件中生长的细胞的总RNA。为了达到这个目的，在添加小化合物后48h，去除培养基且利用来自Promega的SV总RNA分离系统(目录号Z3105)或来自Qiagen的Rneasy总RNA分离试剂盒(目录号74181)按照制造商的说明书从细胞提取RNA。将600ng经纯化的总RNA加入到利用来自ThermoScientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)或来自Invitrogen的高容量cDNA逆转录试剂盒(目录号4368813)或SuperScript VILOcDNA合成试剂盒(目录号11754-250)如制造商的方案所述地进行的逆转录反应中。使用ABI Taqman基因表达混合物(Applied BiosystemsInc.,Foster City CA,目录号4369510)和由ABI(人肌动蛋白目录号Hs99999903_m1*，猴肌动蛋白目录号Rh03043379_gH或小鼠肌动蛋白目录号Mm00607939_s1*的Applied Biosystems Taqman Gene ExpressionAssay)设计的肌动蛋白的特异性引物/探针，通过实时PCR用得自这一逆转录反应的cDNA来监测基因表达。使用StepOne Plus Real TimePCR仪器(Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)使用以下PCR循环：50℃持续2min、95℃持续10min、40个循环的(95℃持续15秒、60℃持续1min)。以反义寡核苷酸治疗处理后的基因表达倍数变化基于经处理治疗的和模拟转染的样品之间18S-标准化的dCt值的差异来计算。
实施例6：通过免疫组织化学定量ACTIN蛋白
该实验的目的在于确认通过免疫组织化学观察的上调SCN1A的化合物中没有一种对在相同条件下检测的肌动蛋白产生任何影响。如果上调SCN1A的化合物未使ACTIN蛋白的量发生变化，则我们将假定肌动蛋白可在SCN1A蛋白的ELISA定量中用作用于标准化的对照。材料和方法。细胞内的肌动蛋白将通过免疫组织化学来检测。为了达到这个目的，在添加小化合物后48小时，除去培养基并且将细胞用不含钙和镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(Mediatech目录号21-031-CV)洗涤3次。然后弃去PBS，并且在-20℃使用300μl100%甲醇将细胞固定于24孔板中15min。除去甲醇并用PBS洗涤后，在21℃将细胞与3%过氧化氢(Fisher Chemical目录号H325-100)孵育5min。将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后在21℃与300μl在PBS中0.1%浓度的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma目录号A-9647)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃与300μl抗生物素蛋白溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS短暂地漂洗三次，然后在21℃与生物素溶液(Vector Laboratories目录号SP-2001)孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次，然后在4℃与300μl/孔以1:250稀释于PBS/BSA0.1%中的由人肌动蛋白(Abcam目录号ab1801；已知识别β和γ人、小鼠和大鼠肌动蛋白)的残基350-450衍生的抗合成肽的兔抗体孵育过夜。在21℃平衡板5min后，将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后在21℃与以1:200以稀释于PBS/BSA0.1%中的山羊抗兔抗体孵育30min。将细胞用PBS洗涤三次(每次洗涤5min)，然后与300μl Vectastain Elite ABC试剂A+B溶液(Vector Laboratories目录号PK-6101)孵育30min；在21℃制备Vectastain Elite ABC试剂A+B溶液，30min后通过将2滴试剂A和2滴试剂B相继添加并混合至5mlPBS与细胞一起孵育。在21℃将细胞用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)，然后与二氨基联苯胺(DAB)过氧化物酶底物溶液(VectorLaboratories目录号SK-4105)孵育直至细胞被染色；将DAB过氧化物酶底物溶液复原，之后其通过将1ml ImmPACTTMDAB Diluent与30μl ImmPACTTMDAB Chromogen浓缩液混合而加入至细胞中。此时，将细胞用PBS短暂地洗涤三次并且将300μl PBS留在每个孔中。使用配置有与Dell Latitude D630膝上型电脑的屏幕上的NikonDigital-Sight装置耦接的Nikon DS-Ri1照相机的倒置Nikon EclipseTS100显微镜，在24孔板的各孔内直接分析细胞的染色。使用由Nikon照相机提供的软件NIS-Elements D3.0制得各孔的照片。
实施例7：通过海马锥体细胞中的SCN1A上调而诱导的钠流幅值的变化
该实验的目的在于确认通过小化合物上调的SCN1A蛋白使海马GABAergic中间神经元(显示其在Dravet综合征中受影响)中钠流的幅值增加。
材料和方法。将通过在持续用95%O2和5%CO2充氧的缓冲液中用链霉蛋白酶和接着用嗜热菌蛋白酶消化，从11至16天龄大鼠中解离海马GAD阳性双极细胞(GABAergic中间神经元)。将经解离的细胞铺板于组织培养皿中并且用选择的小化合物处理24h，之后将进行电生理记录。使用全细胞膜片钳技术用EPC-9膜片钳放大器(HEKA)记录电流。使用P-97型Flaming-Brown微量吸管拉长器(SutterInstrument)制备膜片吸量管。使用PULSE程序(7.5版；HEKAElektronik)进行刺激和数据获取。
对于电压钳实验，使用蠕动泵将含有以mm计的19.1NaCl、19.1四乙基氯化铵、0.95BaCl2、1.90MgCl2、52.4CsCl、0.1CdCl2、0.95CaCl2、9.52HEPES、117葡萄糖(pH7.35)的灌注缓冲液恒定地灌注到细胞上。膜片吸量管将含有以mm计的157N-甲基-d-葡糖胺、126HCl、0.90NaCl、3.60MgCl2、9.01EGTA、1.80ATP-Na2、9.01HEPES、4.50肌酸-磷酸盐，pH7.2。将细胞保持在-100mV并且从-60mV至-15mV的去极化步骤以5mV增量施加。确定最大电流密度并在经处理的和未经处理的神经元之间进行比较。
实施例8：通过海马锥体细胞中的SCN1A上调而诱导的钠流特征的变化
该实验的目的在于确认通过小化合物上调的SCN1A蛋白使海马GABAergic中间神经元(显示其在Dravet综合征中受影响)中钠流的特征未发生变化。
材料和方法。将通过在持续用95%O2和5%CO2充氧的缓冲液中用链霉蛋白酶和接着用嗜热菌蛋白酶消化，从11-至16天龄大鼠中解离海马GAD阳性双极细胞(GABAergic中间神经元)。将经解离的细胞铺板于组织培养皿中并且用选择的小化合物治疗处理24h，之后将进行电生理记录。使用全细胞膜片钳技术用EPC-9膜片钳放大器(HEKA)记录电流。使用P-97型Flaming-Brown微量吸管拉长器(SutterInstrument)制备膜片吸量管。使用PULSE程序(7.5版；HEKAElektronik)进行刺激和数据获取。对于电压钳实验，使用蠕动泵将含有以mm计的19.1NaCl、19.1四乙基氯化铵、0.95BaCl2、1.90MgCl2、52.4CsCl、0.1CdCl2、0.95CaCl2、9.52HEPES、117葡萄糖，(pH7.35)的灌注缓冲液恒定地灌注到细胞上。膜片吸量管将含有以mm计的157N-甲基-d-葡糖胺、126HCl、0.90NaCl、3.60MgCl2、9.01EGTA、1.80ATP-Na2、9.01HEPES、4.50肌酸-磷酸盐，(pH7.2)。将细胞保持在-100mV并且从-60mV至-15mV的去极化步骤以5mV增量施加。根据g=INa/(V-ENa)由电流/电压关系计算激活曲线(电导/电压关系)，其中INa表示在电势V测量的峰钠流，且ENa表示平衡电势。将波兹曼函数拟合成标准化的激活曲线和失活曲线并且将确定曲线特征。失活时间常数将通过用单指数函数拟合电流衰减来评价。将激活和失活特性在经治疗处理的和未经处理的神经元之间比较以确定治疗是否改变电流特征。
对于电流钳实验，将细胞保持在-80mV，并且在以10pA的增量施加的800毫秒脉冲后记录它们的放电模式。电极缓冲液将含有以mm计的135葡萄糖酸钾、20KCl、2MgCl2、2ATPNa2、0.3GTP-Na和10HEPES、0.2EGTA(pH7.3)。灌注缓冲液将含有以mm计的140NaCl、5KCl、2CaCl2、1MgCl2、10HEPES和10葡萄糖，pH用NaOH调节至7.4。将测量输入-输出关系(动作电势数量/所注入pA)、动作电势半宽度、峰值幅值和峰值衰减并且在经处理的和未经处理的海马抑制性中间神经元之间比较。
使用与如上文对于全细胞膜片记录所述相同的溶液和方案在内面向外式膜片构型中进行单通道电流记录。
实施例9：SCN1A上调对细胞内钠水平的影响
该实验的目的是检查细胞中SCN1A蛋白的上调是否引起细胞内钠水平的变化。使在给予小化合物后表达不同量的SCN1A的细胞加载有对Na+具有特异性的染料。作为细胞内Na+浓度变化的阳性对照，将使用为Na+离子载体的莫能菌素和短杆菌肽。
材料和方法。使细胞在96孔板中生长并且将不同浓度的小化合物给予细胞。48h后，将细胞用Locke缓冲液(8.6mM HEPES、5.6mMKCl、154mM NaCl、5.6mM葡萄糖、1.0mM MgCl2、2.3mM CaCl2、0.0001mM甘氨酸(pH7.4))洗涤。在将染料加载到细胞内之前测量荧光本底。通过在37℃利用10μM SBFI-AM(与Na+结合的染料),0.04%Pluronic F-127分子探针，OR,USA)和2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(50μl/孔)孵育细胞与染料1h，从而将染料加载到细胞内。此时，将细胞用2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(150μl/孔)洗涤2次。将含有加载细胞的板放置在诸如FLEXstationTM II(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)的读数仪内。加载有染料的细胞在340nm和380nm激发；在505nm记录发射信号。此时测量信号基线。在测量信号基线后，将莫能菌素(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号475895)或短杆菌肽(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号368020-25MG)添加至含有作为阳性对照的细胞的单独孔。TTX(1uM)处理用作阴性对照。然后将建立在用活性化合物预处理的细胞中的质膜处的活性SCN1A相比于媒介物对照的相对表达。使用Excel软件将信号计算成在505nm与340nm/380nm处的发射比率。
实施例10：SCN1A上调对单细胞中钠水平的影响
该实验的目的是检查细胞中SCN1A蛋白的上调是否引起单独细胞中钠的细胞内水平的变化。使在给予小化合物后表达不同量的SCN1A的细胞加载有对Na+具有特异性的染料。作为细胞内Na+浓度变化的阳性对照，将使用为Na+离子载体的莫能菌素和短杆菌肽。材料和方法。使细胞在盖玻片上或在96孔板中生长并且给予不同浓度的小化合物。48h后，将细胞用Locke缓冲液(8.6mM HEPES、5.6mM KCl、154mM NaCl、5.6mM葡萄糖、1.0mM MgCl2、2.3mMCaCl2、0.0001mM甘氨酸(pH7.4))洗涤。在将染料加载到细胞内之前测量荧光本底。通过在37℃利用10μM SBFI-AM(与Na+结合的染料),0.04%普朗尼克酸F-127和2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(50μl/孔)孵育细胞与染料1h，从而加载染料。此时，将细胞用2.5mM在Locke缓冲液中的丙磺舒(150μl/孔)洗涤2次。将在96孔板中或在盖玻片上的细胞放置在装备有Hg灯和适于激发和发射的滤光器的落射荧光显微镜(得自Omega Optical Inc,Brattleboro,VT,USA目录号组X-F04-2或得自Chroma Technology Corp,Bellows Falls,VT,USA,目录号79001)下。用染料加载的细胞在340nm和380nm激发；在505nm记录发射信号。在测量信号基线后，将莫能菌素(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号475895)或短杆菌肽(EMD,Gibbstown,NJ,USA,目录号368020-25MG)添加至含有作为阳性对照的细胞的单独孔。为了建立质膜处的活性SCN1A的相对上调，将用活性化合物预处理的细胞与媒介物对照相比较。数据用与落射荧光显微镜连接的照相机收集并且使用适合的软件定量。通过使用Excel软件计算505nm发射与340nm/380nm的比率来处理原始信号。
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Claims (16)

1.一种调节生物系统中一种或多种电压门控钠通道α亚基(SCNxA)多核苷酸或蛋白的功能和/或表达的方法，所述方法包括：将所述系统与选自以下的至少一种化合物接触：利尿剂、非典型抗精神病药、钾通道开放剂、钙通道阻滞剂、抗真菌剂、抗氧化剂、PDE5抑制剂、雌激素激动剂(甾族或非甾族)、抗抑郁剂、质子泵抑制剂、5HT1D受体激动剂、催眠药、抗溃疡药物、5HT4激动剂、GABA激动剂、抗组胺剂或同化类固醇，从而调节所述生物系统中电压门控钠通道X型α亚基(SCNxA)多核苷酸的功能和/或表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种化合物选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、埃索美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药。
3.一种体内或体外调节患者细胞或组织中一种或多种电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)多核苷酸或蛋白的功能和/或表达的方法，所述方法包括：
将所述细胞或组织与选自以下的至少一种化合物接触：利尿剂、非典型抗精神病药、钾通道开放剂、钙通道阻滞剂、抗真菌剂、抗氧化剂、PDE5抑制剂、雌激素激动剂(甾族或非甾族)、抗抑郁剂、质子泵抑制剂、5HT1D受体激动剂、催眠药、抗溃疡药物、5HT4激动剂、GABA激动剂、抗组胺剂或同化类固醇，从而体内或体外调节患者细胞或组织中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)多核苷酸的功能和/或表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种化合物选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药，从而体内或体外调节患者细胞或组织中电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)多核苷酸的功能和/或表达。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)的功能和/或表达相对于对照在体内或体外增加。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述表达在体内增加。
7.一种药物组合物，其包含调节一种或多种电压门控钠通道I型α亚基(SCNxA)多核苷酸的表达的一种或多种化合物，所述多核苷酸包含反义序列、互补序列、等位基因、同系物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或其组合及药学上可接受的赋形剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述化合物选自利尿剂、非典型抗精神病药、钾通道开放剂、钙通道阻滞剂、抗真菌剂、抗氧化剂、PDE5抑制剂、雌激素激动剂(甾族或非甾族)、抗抑郁剂、质子泵抑制剂、5HT1D受体激动剂、催眠药、抗溃疡药物、5HT4激动剂、GABA激动剂、抗组胺剂或同化类固醇。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述化合物选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、埃索美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药。
10.一种预防或治疗与至少一种电压门控钠通道I型α亚基(SCNxA)多核苷酸和/或其至少一种编码的产物相关的疾病的方法，所述方法包括：
向患者施用治疗有效剂量的调节至少一种电压门控钠通道α亚基(SCNxA)多核苷酸的表达的至少一种化合物，从而治疗与至少一种电压门控钠通道α亚基(SCNxA)多核苷酸和/或其至少一种编码的产物相关的疾病。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病是神经系统疾病或病症。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病是心血管疾病或病症。
13.如权利要求10所述的方法，其中与所述至少一种电压门控钠通道I型α亚基(SCN1A)多核苷酸相关的所述疾病选自：抽搐、疼痛(包括慢性疼痛)、涉及钠通道功能障碍的受损电兴奋性、与钠通道功能障碍相关的疾病或病症、与电压门控钠通道α亚基活性失调相关的疾病或病症(例如，麻痹、高钾性周期性麻痹、先天性副肌强直、钾加重性肌强直、长Q-T综合征3、运动终板疾病、共济失调等)、由于肠神经系统功能障碍引起的胃肠道疾病(例如，大肠炎、回肠炎、炎症性肠综合征等)；高血压或充血性心力衰竭；涉及交感神经和副交感神经支配的泌尿生殖道的疾病或病症(例如，良性前列腺增生、阳痿)；与神经肌肉系统相关的疾病或病症(例如，肌营养不良症、多发性硬化、癫痫、自闭症、偏头痛(例如，散发性和家族性偏瘫型偏头痛等)、小儿重度肌阵挛型癫痫(SMEI或Dravet综合征)、全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)等)和SCN1A相关性惊厥病症。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病或病症选自小儿重度肌阵挛型癫痫(SMEI或Dravet综合征)、家族性偏瘫型偏头痛、全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)。
15.一种鉴定和选择至少一种化合物作为用于体内施用的推定击中的方法，所述方法包括：选择与疾病状态相关的靶SCNxA多核苷酸；运行包括所述靶多核苷酸针对选自以下的至少一种化合物的表达系统的细胞筛选：利尿剂、非典型抗精神病药、钾通道开放剂、钙通道阻滞剂、抗真菌剂、抗氧化剂、PDE5抑制剂、雌激素激动剂(甾族或非甾族)、抗抑郁剂、质子泵抑制剂、5HT1D受体激动剂、催眠药、抗溃疡药物、5HT4激动剂、GABA激动剂、抗组胺剂或同化类固醇；以及鉴定调节所述靶多核苷酸的mRNA和/或蛋白相对于对照的表达的所述化合物(“推定击中”)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述推定击中选自米那普仑、托拉塞米、利培酮、吡那地尔、贝尼地平、酮康唑、依布硒、他达拉非、折仑诺、萘发扎酮、洛美利嗪、淫羊藿苷、奥美拉唑、埃索美拉唑、L-694,247、尼群地平、尼美西泮、氨来呫诺、莫沙必利、舍曲林或司坦唑醇或其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、同种型、多晶型物、水合物、溶剂化物或前药。
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